Dissertation mit Literatur - freidok.uni-freiburg.de
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Aus dem Department für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde Klinik für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie des Universitätsklinikums Freiburg im Breisgau Wirkung der antimikrobiellen photodynamischen Therapie in Kombination mit Isopropylalkohol auf mit Enterococcus faecalis infizierte Wurzelkanäle in vitro Inaugural – Dissertation zur Erlangung des Zahnmedizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2020 von Kalin Shishkov geboren in Dryanovo, Bulgarien
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Aus dem Department für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde
Klinik für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie
des Universitätsklinikums Freiburg im Breisgau
Wirkung der antimikrobiellen photodynamischen Therapie in Kombination mit Isopropylalkohol auf mit Enterococcus faecalis
infizierte Wurzelkanäle in vitro
Inaugural – Dissertation
zur
Erlangung des Zahnmedizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2020
von Kalin Shishkov
geboren in Dryanovo, Bulgarien
Dekan Prof. Dr. Norbert Südkamp
1. Gutachter Prof. Dr. Markus Altenburger
2. Gutachterin Prof. Dr. Katja Nelson
Jahr der Promotion 2021
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ............................................................................................................... 1 2. Literaturübersicht .................................................................................................. 4
2.1 Die Pulpa - Dentin Einheit ........................................................................................... 4 2.1.1 Das Dentin ............................................................................................................................. 4 2.1.2 Die Pulpa ............................................................................................................................... 5
2.2 Erkrankungen der Pulpa und des Periapex ............................................................... 7
2.3 Mikrobiologie endodontischer Infektionen ............................................................... 8 2.3.1 Enterococcus faecalis ........................................................................................................... 9
2.4 Die Desinfektion des Wurzelkanalsystems ............................................................. 12 2.4.1 Isopropylalcohol, 90 % ........................................................................................................ 13
2.5 Die antimikrobielle photodynamische Therapie ..................................................... 13 2.5.1 Wirkungsweise der antimikrobiellen photodynamischen Therapie ...................................... 14 2.5.2 Photosensibilisatoren .......................................................................................................... 16
3. Material und Methode .......................................................................................... 19 3.1 Auswahl der Zähne .................................................................................................... 19
3.2 Vorbereitung der Zähne ............................................................................................ 19 3.2.1 Maschinelle Aufbereitung .................................................................................................... 20 3.2.3 Apikaler Verschluss und Einbetten der Zähne in Kunststoff ............................................... 22
3.3. Herstellen der Bakterienlösung und Beimpfen der Zähne .................................... 24 3.3.1 Beimpfen der Versuchszähne und Anzüchten eines Biofilms ............................................. 25
3.4 Aufteilung der Gruppen ............................................................................................. 26
3.5 Probenentnahmen und antimikrobielle Therapie ................................................... 27 3.5.1 Probenentnahme zur Bestimmung der Ausgangskontamination ........................................ 27 3.5.2 Antimikrobielle Therapie ...................................................................................................... 28 3.5.3 TBO in Aqua ........................................................................................................................ 28 3.5.4 TBO in Alkohol .................................................................................................................... 29 3.5.5 TBO in Aqua + Alkohol ........................................................................................................ 30 3.5.6 Alkohol ................................................................................................................................. 30 3.5.7 Probenentnahme zur Bestimmung der Endkontamination .................................................. 30 3.5.8 Probenentnahme zur Bestimmung der Restkontamination der Dentinspäne ..................... 31
3.6 Anfertigen der Verdünnugsreihen und Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE/ml) ........................................................................................................... 31
3.8 Statistische Auswertung ........................................................................................... 33
4.Ergebnisse ............................................................................................................ 34
4.1 Darstellung der Ergebnisse ...................................................................................... 34
4.2 Statistische Auswertung der Ergebnisse ...................... Error! Bookmark not defined.
5. Diskussion ........................................................................................................... 38
5.1 Diskussion von Material und Methode .................................................................... 38 5.1.1 Verwendung extrahierter menschlicher Zähne .................................................................... 38 5.1.2 Vorbehandlung der Versuchszähne und maschinelle Aufbereitung ................................... 38 5.1.2 Enterococcus faecalis als Versuchskeim ............................................................................ 39 5.1.5 Infektions- und Desinfektionsvorgang ................................................................................. 40 5.1.3 Isopropylalkohol als Lösungs- und Desinfektionsmittel ....................................................... 41 5.1.6 Entnahme der Proben und Erfassung der koloniebildenden Einheiten/ml .......................... 43
5.2 Diskussion der Ergebnisse ....................................................................................... 44
6. Zusammenfassung .............................................................................................. 49 7. Literaturverzeichnis ............................................................................................ 50 8. Anhang ................................................................................................................. 62
8.1 Übersicht Versuchsaufbau ....................................................................................... 62
8.2 Tabellen ...................................................................................................................... 63
9. Danksagung ......................................................................................................... 70
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
°C Grad Celsius
CHX Chlorhexidindigluconat
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
E. faecalis Enterococcus faecalis
F. nucleatum Fusobacterium nucleatum
Gew.-% Gewichtsprozent
h Stunde
KBE koloniebildende Einheiten
KBE/ml Koloniebildende Einheiten pro Milliliter
min Minute
μl Mikroliter
ml Milliliter
mm Millimeter
mW Milliwatt
N Anzahl der Proben
NaOCl Natriumhypochlorit
nm Nanometer
P. anaerobius Peptostreptococcus anaerobius
PE Probenentnahme
PCR Polymerase chain reaction
PDT Photodynamische Therapie
P. oralis Prevotella oralis
PS Photosensibilisator
S. anginosus Streptococcus anginosus
Tab Tabelle
TBO Toluidinblau O
TSB Tryptic Soy Broth
1
1. Einleitung Die Endodontie beschäftigt sich mit den notwendigen Maßnahmen für die Erhaltung
der Gesundheit der Pulpa oder für deren Therapie, wenn eine Erkrankung oder
Verletzung vorliegt. Bei einer vorhandenen Entzündung innerhalb des Wurzelkanals,
zielt die endodontische Therapie auf das Erreichen von gesunden periradikulären
Verhältnissen. Wenn es nach einer Pulpitis zu einer Inflammation des periapikalen
Gewebes gekommen ist, fokussiert sich die Behandlung auf die Wiederherstellung der
physiologischen Verhältnisse im pariapikalen Raum. Die Therapiemethode der ersten
Wahl ist die Wurzelkanalbehandlung. Allerdings ist es bei gegebener Indikation
möglich weitere chirurgisch-endodontische Maßnahmen, wie zum Beispiel die
Wurzelspitzenresektion, durchzuführen. Zu den Indikationen für die
Wurzelbehandlung gehört die geschädigte oder nekrotische Pulpa, mit oder ohne
klinische und röntgenologische Anzeichen für eine periradikuläre Ausbreitung des
entzündlichen Geschehens. Eine endodontische Therapie kann auch dann indiziert
sein, wenn durch eine Devitalisierung eines Zahnes mit unsicherer Prognose, eine
Vorsorgemaßnahme vor einer geplanten prothetischen Versorgung getroffen wird.
Ferner kann eine endodontische Behandlung auch bei Gefahr einer
präparationsbedingten Pulpaeröffnung eines Pfeilerzahnes mit ungünstiger Stellung
oder bei geplanter Hemisektion vorgenommen werden (Qualitätsrichtlinien für die
endodontische Behandlung, Europäische Gesellschaft für Endodontie, 2006).
Für die Durchführung einer suffizienten endodontischen Therapie sind bestimmte
Richtlinien zu beachten. Der Wurzelkanal muss bis zu seiner apikalen Konstriktion
vollständig und in einer konisch zulaufenden Form aufbereitet werden. Das im Kanal
vorhandene Gewebe und die vorhandenen Mikroorganismen müssen vollständig
entfernt werden und die anschließende Wurzelfüllung muss das gesamte Kanalsystem
mit dessen akzessorischen Kanälen dreidimensional ausfüllen (Qualitätsrichtlinien für
die endodontische Behandlung, Europäische Gesellschaft für Endodontie, 2006).
Die vollständige Heilung eines endodontisch erkrankten Zahnes ist nach der Definition
der Deutschen Gesellschaft für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde (DGZMK) die
“klinische Symptomfreiheit und ein radiologisch durchgehend verfolgbarer
Parodontalspalt normaler Breite“. Ein endodontischer Misserfolg ist in dem Fall
2
gegeben, wenn diese Voraussetzungen nicht erfüllt sind (Definition von „erfolgreicher“
und „nicht erfolgreicher“ Wurzelkanalbehandlung, DGZMK, 2000).
Trotz einer adäquat durchgeführten endodontischen Therapie kommt es manchmal bei
wurzelbehandelten Zähnen zu einem Misserfolg der Behandlung. In diesen Fällen ist
die Ursache am häufigsten eine interradikuläre Infektion, gefolgt von der etwas
seltener vorkommenden extraradikulären Infektion. Mikroorganismen, die in den
Verzweigungen des Wurzelkanalsystems oder in akzessorischen Kanälen nicht
eliminiert worden sind, stellen die Hauptursache für diese Infektionen und dadurch
auch für den endodontischen Misserfolg dar (Siqueira, 2001).
In der Literatur werden Erfolgsquoten endodontischer Behandlungen von Zähnen mit
einem infiziertem Endodont zwischen 85 % und 95 % angegeben (Siqueira Jr et al.,
2014). Es konnten Unterschiede in den Erfolgsraten zwischen Zähnen mit und ohne
Hinweisen für periapikale Veränderungen vor der Therapie festgestellt werden. Die
Zähne mit einer Pulpanekrose und radiologischen apikalen Aufhellungen zeigten eine
Heilung in 86 % der Fälle nach 8 bis 10 Jahren. Im selben Zeitraum betrug die
Erfolgsquote von Zähnen mit einem vor der Therapie unauffälligen radiologischen
Befund 96 % (Sjögren et al., 1990). Verantwortlich dafür ist die Infektion, die sich bei
apikal entzündeten Zähnen tief in dem Wurzelkanalsystem ausgebreitet hat und somit
eine vollständige Elimination der Bakterien erschwert (Siqueira Jr et al., 2014).
Die häufigste Ursache für den Misserfolg einer Wurzelkanalbehandlung ist eine
Therapie, die nicht entsprechend den aktuellen Richtlinien in der Endodontie
durchgeführt worden ist und die Bakterien im Wurzelkanalsystem nicht ausreichend
eliminiert hat (Siqueira Jr, J.F. et al., 2014). Der Versuch, den erkrankten Zahn durch
eine Revisionsbehandlung weiterhin zu erhalten, hat laut der Literatur Erfolgsraten
zwischen 58 % und 86 % (Friedman und Mor, 2004; Sjögren et al., 1990).
Anhand der Ergebnisse aus zahlreichen Publikationen lässt sich schließen, dass das
Vorhandensein von Mikroorganismen nach Primärbehandlung der Hauptgrund eines
endodontischen Misserfolges darstellt (Lin et al., 1992; Siqueira, 2001; Sjögren et al.,
1997; Vieira et al., 2012). In dieser Hinsicht ist die Desinfektion des
Wurzelkanalsystems für den Erfolg einer endodontischen Therapie von
entscheidender Bedeutung.
Bei Zähnen mit einer persistierenden Parodontitis apicalis trotz vorausgegangener
Therapie wurde in mehreren Studien durch mikrobiologische Untersuchungen
3
Enterococcus faecalis als dominierender Keim festgestellt. Das Bakterium ist häufiger
in sekundären Infektionen (nach erfolgter Wurzelbehandlung) als in primären zu treffen
und wurde sowohl in Mono- als auch in Mischinfektionen nachgewiesen. Seine
Toleranz gegenüber ungünstigen ökologischen Bedingungen und seine Resistenz
gegenüber Calziumhydroxid, und manchen Antibiotika erlauben ihm, sich auch in
Mischinfektionen als Hauptspezies zu etablieren, wodurch dessen Therapie erschwert
wird (Love, 2001; Pinheiro et al., 2003; Portenier et al., 2003). Diese pathogenen
Eigenschaften führten dazu, dass dieses Bakterium in der Endodontie als ein
Problemkeim bezeichnet wird (Evans et al., 2002; George und Ivančaková, 2007;
McHugh et al., 2004; Stuart et al., 2006b).
Neben den endodontischen Spüllösungen und Medikamenten gibt es weitere
antimikrobielle Ansätze in der Endodontie. Die sogenannte antimikrobielle
photodynamische Therapie (aPDT) wird sowohl in der Parodontitistherapie als auch in
der Endodontologie angewendet. Mehrere Studien haben bewiesen, dass die aPDT
eine sinnvolle ergänzende Methode für die Desinfektion von kontaminierten
Wurzelkanälen darstellt (Fonseca et al., 2008; Rajesh et al., 2011; Siddiqui et al.,
2013).
In der vorliegenden in vitro Studie wurden mit Enterococcus-faecalis infizierte
Wurzelkanäle humaner Zähne therapiert. Es wurden die antibakteriellen
Eigenschaften sowie das gute Diffusionsvermögen des Isopropylalkohols mit der
keimreduzierenden Wirkung der aPDT kombiniert. Durch das Lösen des Farbstoffes
Toluidinblau in 90%igem Isopropanol wurde eine bessere Verteilung innerhalb des
Wurzelkanals sowie eine zusätzliche antibakterielle Wirkung durch das Alkohol erhofft.
Es wurden drei unterschiedliche Kombinationen von Farbstoff und Lösungsmittel
sowie eine Kontrollgruppe ausschließlich mit Isopropanol verglichen.
4
2. Literaturübersicht
2.1 Die Pulpa - Dentin Einheit 2.1.1 Das Dentin Den größten Anteil des menschlichen Zahnes bildet das Dentin. Es umfasst die Pulpa
und ist koronal von Schmelz und im Bereich der Wurzeln von Zement bedeckt. Im
Gegensatz zum Schmelz ist Dentin ein vitales, weniger stark mineralisiertes Gewebe.
Chemisch ist Dentin zu ca. 70 Gewichtsprozent (Gew. %) aus anorganischem, zu 20
Gew. % aus organischem Material und zu ca. 10 Gew. % aus Wasser
zusammengesetzt. Der organische Anteil besteht zu über 90 % aus Kollagen, der
anorganische enthält hauptsächlich Phospat- und Kalziumverbindungen, die in Form
von kristallinem Apatit beziehungsweise als amorphes Kalziumphosphat vorliegen
(Pashley, 1996)
Dentin wird von Odontoblasten gebildet. Die Odontoblastenkörper befinden sich am
äußeren Rand der Zahnpulpa und dienen der physiologischen Versorgung des
Dentinmantels. Jeder Odontoblast erstreckt sich mit einem Fortsatz in ein
Dentinkanälchen (Dentintubulus) hinein und wird dort von Dentinliquor umgeben
(Goldberg et al., 2011).
Im Längsschnitt durch den Zahn lassen sich verschiedene Schichten des Dentins
erkennen. Angrenzend an der Pulpa befindet sich das hypomineralisierte Prädentin,
das noch nicht komplett ausgereift ist. Lateral folgen das Zwischendentin, das besser
mineralisierte zirkumpulpale Dentin und das Manteldentin. Mit dem Zahnschmelz
bildet das Manteldentin eine arkadenförmige Grenzlinie und ist stark von Seitenästen
der Dentinkanälchen durchzogen (Goldberg et al., 2011).
Die Bildung von Dentin erfolgt während der gesamten Lebensdauer des Zahnes. Das
bis zum Abschluss des Wurzelwachstums gebildete Dentin wird Primärdentin genannt.
Wenn Dentin auch danach regulär gebildet wird, spricht man von Sekundärdentin.
Aufgrund eines Reizes (z. B. Karies, Attrition, Erosion) kann Tertiärdentin als
Abwehrbarriere gebildet werden (Radlanski, 2011).
Die im Dentin vorhandenen Kristalle sind deutlich kleiner und schmaler als diese im
Zahnschmelz und nicht in Form von Prismen strukturiert. Sie liegen hingegen nach Art
des Dentins mehr oder weniger dicht aneinander gepackt vor. Aufgrund seiner
besonderen tubulären Struktur, der vorhandenen Kollagenfasern und der organischen
5
Grundsubstanz ist Dentin weniger hart als der Schmelz, elastischer und verformbar.
Dazu besitzt das Dentin eine hohe Porosität und eine hohe Permeabilität (Pashley,
1996).
2.1.2 Die Pulpa Der Weichgewebekern eines Zahnes wird als Zahnpulpa bezeichnet und besteht aus
gut vaskularisiertem und gut innerviertem lockerem Bindegewebe. Der Raum, den das
Pulpagewebe ausfüllt, wird Pulpakammer genannt. Topografisch lassen sich
Kronenpulpa und Wurzelpulpa unterscheiden. Die Kronenpulpa ist vom Dentin
umgeben und ihre Ausdehnung entspricht in verkleinerter Form dem jeweiligen
Zahnumriss. Das Pulpagewebe kommuniziert mit dem Parodontium durch das
Foramen apicale, die Seitenkanäle und Pulpaperiodontalkanäle. Aufgrund ihrer Lage
kann die Pulpa vom praktisch-klinischen Standpunkt als Endorgan ohne kollaterale
Zirkulation bezeichnet werden (Gühring und Barth, 1992).
Besonders im Bereich der Kronenpulpa gliedert sich die Pulpa in verschiedene
Gewebezonen. Die Kernzone stellt den Hauptteil des Pulpagewebes dar und lässt sich
von drei peripheren Randzonen abgrenzen. Die Kernzone der Pulpa, in der zentrale
Blutgefäße und Nervenfasern verlaufen, wird von einer zellkernreichen Zone
umgeben. Diese Zone wird auch als bipolare Zone bezeichnet und ist reich an
undifferenzierten Mesenchymzellen, Fibroblasten und verschiedenen Zellen des
Immunsystems. Dort befindet sich auch ein stark verzweigtes Nervenbündel, das als
Raschkow-Plexus bezeichnet wird. Nach außen schließt sich die kernarme Weil-Zone
an. Diese Zone erscheint zellarm, enthält jedoch Nervenendigungen, Blutgefäße und
zytoplasmatische Fortsätze der in der zellkernreichen Zone lokalisierten Fibroblasten.
An die Weil-Zone schließt sich zur Pulpaperipherie hin die Schicht der Odontoblasten
an (Pashley et al., 2002).
Die charakteristischsten Zellen der Pulpa sind die dentinbildenden Odontoblasten,
neben denen sich in unterschiedlich großer Anzahl Fibroblasten, Ersatzzellen und
Abwehrzellen finden lassen. Die Odontoblasten bedecken dicht gepackt das
Prädentin. Sie synthetisieren neben Kollagen Typ I und Typ III auch nichtkollagene
Bausteine der organischen Dentinmatrix wie Proteoglykane und Glykosaminoglykane.
Somit erfüllen die Osteoblasten die formative Funktion der Pulpa, indem sie Primär-
6
und Sekundärdentin bilden. Durch die Produktion von Tertiärdentin spielen sie auch
eine wichtige Rolle bei der defensiven Funktion der Pulpa (Farges et al., 2015).
Die Fibroblasten sind der häufigste Zelltyp der Pulpa und sind für die Produktion der
Grundsubstanz und der Kollagenfasern verantwortlich. Sie sind nahezu gleichmäßig
über das gesamte Pulpagewebe verteilt. In der Pulpa befinden sich außerdem die
sogenannten Ersatzzellen, die undifferenzierte Mesenchymzellen darstellen. Aus
diesen Zellen können sich nach einem entsprechenden Reiz alle in der Zahnpulpa
vorkommenden Zelltypen entwickeln, insbesondere auch die Odontoblasten.
Neben den genannten häufig vorkommenden Zelltypen finden sich in der Pulpa stets
Zellen wie Makrophagen, T- und B- Lymphozyten, Granulozyten und dendritische
Zellen, die ein Teil des Abwehrsystems sind und somit die defensive Funktion der
Pulpa erfüllen. Wie die allgemeine immunologische Abwehrreaktion setzt sich auch
die Abwehrreaktion der Pulpa aus der zellulären und der humoralen Abwehr
zusammen (Farges et al., 2015; Jontell et al., 1998).
Die nutritive Funktion der Pulpa wird durch ein gut ausgebildetes Gefäßsystem mit
einem dichten Kapillarplexus gewährleistet. Die Odontoblasten und andere
Pulpazellen werden über ihn ausreichend mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt
(Dahl und Mjor, 1973).
Die sensorische Funktion wird durch die afferenten Nerven der Pulpa gewährleistet,
die Schmerzsensationen weiterleiten. Es kommen A-beta, A-Delta und C-Fasern vor,
der überwiegende Anteil davon sind nicht-myelinisierte Nervenfasern. Nach dem
Eintritt durch das Foramen apicale sind nur wenige Verzweigungen im Wurzelbereich
zu finden. Im Bereich der Kronenpulpa ist deren Anzahl höher. Der Raschkow‘sche-
Plexus besteht aus einer großen Anzahl nicht-myelinisierter Nervenaxone, aus denen
einige sensible Fasern die Odontoblastenschicht erreichen. Vereinzelte Faserenden
gelangen möglicherweise sogar über das mineralisierte Dentin bis zur Schmelz-
Zement-Grenze (Pashley, 1996).
Für die Schmerzempfindung im Dentin sind A-Fasern verantwortlich, die
wahrscheinlich durch eine Flüssigkeitsbewegung in den Dentintubuli aktiviert werden.
Thermische, mechanische oder chemische Reize werden von C-Fasern weitergeleitet
und diese spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Schmerzsymptomen bei
einer Pulpitis. Pulpa und Dentin sind trotz der Unterschiede in der Struktur und der
Zusammensetzung für die Dauer der gesamten Funktionsperiode unmittelbar
7
miteinander verbunden. Das Kontinuum, das von der interstitiellen Flüssigkeit der
Pulpa und der Dentintubuli gebildet wird, erstreckt sich über deren gesamten
Ausdehnung. Somit findet immer eine gemeinsame Reaktion auf physiologische und
pathologische Einflüsse statt, sodass von einer Pulpa-Dentin-Einheit zu sprechen ist.
Unterstützt wird dieses Konzept durch den gemeinsamen embryologischen Ursprung
der beiden Gewebe (Farges et al., 2015; Pashley et al., 2002).
2.2 Erkrankungen der Pulpa und des Periapex Die Pulpa-Dentin-Einheit ist bei einem intakten Zahn von Zement und Schmelz
umgeben, die ihr einen Schutz vor physikalischen, chemischen und mikrobiellen
Noxen bieten. Sollte es aufgrund verschiedener Einflüsse zu einer Zerstörung des
natürlichen Schutzes der Pulpa kommen oder Bakterien eindringen, kommt es wie
auch in anderen Bindegeweben im Körper zu einer Entzündung, der Pulpitis. Diese
Abwehrreaktion des Gewebes hat zum Ziel, den Schadfaktor zu eliminieren und
Folgeschäden zu vermeiden (Jontell et al., 1998; Pashley, 1996). Prinzipiell verläuft
eine Pulpitis nach dem gleichen Prinzip wie Entzündungen in anderen Bindegeweben
des Körpers. Allerdings verursacht die besondere Topographie und die Ummantelung
der Pulpa mit Hartgewebe charakteristische Verlaufsformen (Farges et al., 2015).
Eine Pulpitis kann verschiedene Ursachen haben. Eine tiefe Karies, traumatische
Verletzungen der Zähne, zahnärztliche restaurative Maßnahmen oder auch marginale
Parodontopathien können zu einer Entzündung der Pulpa führen. Der wichtigste
Faktor für eine Entzündung des Endodonts sind die Bakterien und deren Abbau- und
Stoffwechselprodukte. Die häufigste Ursache einer Pulpitis ist die mikrobielle Invasion
des Pulpa-Dentin-Systems als Folge einer kariösen Läsion (Farges et al., 2015).
Histologisch lässt sich eine erste Entzündungsreaktion der Pulpa schon bei einer
fortgeschrittenen Schmelzkaries nachweisen. In der Regel reagiert die Pulpa-Dentin-
Einheit aber erst dann, wenn die Karies das Dentin erreicht hat und wenn der Weg zur
Pulpa durch die Dentintubuli offen ist. Darauf reagiert die Pulpa mit einer entzündlichen
Reaktion, die auf das Gebiet des einwirkenden Reizes beschränkt ist. Die Pulpa-
Dentin-Einheit kann sich durch Sklerosierung der Dentinkanälchen und
Tertiärdentinbildung vor dem Reiz schützen (Pashley, 1996). Lokal kann eine solche
Entzündung für lange Zeit, manchmal für Jahre, bestehen, wenn der Reiz mild ist.
Nach Entfernung des Reizes, z. B. einer Karies, kann sich die Pulpa regenerieren. Bei
anhaltenden oder sehr intensiven Reizen kommt es dazu, dass sich die entzündliche
8
Reaktion über die komplette Pulpa ausbreitet. Dadurch gelangt der Prozess von der
Peripherie über die zentrale Pulpa bis hin zur Wurzelpulpa. Als Folge kann es durch
diesen fortschreitenden Entzündungsprozess zu einer vollständigen Nekrose der
Pulpa kommen (Bergenholtz, 1981; Langeland, 1987).
Sollte sich eine unbehandelte Infektion der Pulpa über den Apex hinaus in das
Parodont ausbreiten, kommt es zu einer Entzündung des apikalen Parodonts, der
Parodontitis apicalis (Nair, 2006).
Mit dem Entzündungsprozess um den Apex des Zahns versucht das Abwehrsystem,
die Infektion im Wurzelkanal lokal zu begrenzen, um das umliegende Gewebe zu
schützen. Im nekrotischen Pulpagewebe findet jedoch keine Mikrozirkulation mehr
statt, daher ist es dem Körper nicht mehr möglich, die Entzündungsursache zu
beseitigen. Wenn sich ein Gleichgewicht zwischen der bakteriellen Irritation und der
Immunabwehr einstellt, entsteht eine chronisch-entzündliche Veränderung um die
Wurzelspitze. Weder den körpereigenen Abwehrmechanismen noch systemisch
verabreichten Antibiotika ist es möglich, dass bakteriell besiedelte und stark
verzweigte Wurzelkanalsystem zu erreichen. Somit ist eine selbständige Ausheilung
der Infektion nicht möglich, was eine entsprechende professionelle Therapie des
gesamten Endodonts notwendig macht (Nair, 2004).
2.3 Mikrobiologie endodontischer Infektionen Fast 800 verschiedene Bakterienspezies sind in der Lage, die Mundhöhle zu
besiedeln. Davon konnte etwas mehr als die Hälfte in infizierten Wurzelkanälen
gefunden werden (Siqueira und Rôças, 2009). Dabei gibt es Unterschiede zwischen
den Bakterienarten, die bei einer Primärinfektion und denjenigen, die bei einer
Sekundärinfektion zu identifizieren sind (Gomes et al., 2004; Siqueira und Rôças,
2008).
Wenn Mikroorganismen das nekrotische Pulpagewebe zum ersten Mal besiedeln,
spricht man von einer Primärinfektion. Die häufigsten Bakterienarten, die bei einer
Primärinfektion zu treffen sind, sind gramnegative Spezies. Eine persistierende
Infektion kommt dann vor, wenn Bakterienspezies aus einer Primärinfektion die
desinfizierenden Maßnahmen während einer Wurzelbehandlung überstanden haben
und sich weiterhin im Wurzelkanal entwickeln konnten.
Im Gegensatz dazu ist eine sekundäre Infektion dadurch zu unterscheiden, dass dabei
Bakterienarten während oder nach einer erfolgten Wurzelbehandlung das
9
Wurzelkanalsystem besiedelt haben. Bei den persistierenden und sekundären
Infektionen werden überwiegend grampositive Bakterien nachgewiesen (Haapasalo et
al., 2003)
2.3.1 Enterococcus faecalis In klinischen Studien wurde Enterococcus faecalis mit einer Prävalenz von bis zu 90 %
bei Zähnen mit persistierenden oder sekundären Infektionen als häufigster Keim
gefunden (Kayaoglu und Ørstavik, 2004; Love, 2001).
Enterococcus faecalis ist ein grampositives, kugelförmig bis längliches, fakultativ
anaerobes Bakterium der Familie der Enterococcaceae (Abbildung 1). Aufgrund
starker Ähnlichkeiten im Aussehen und Aufbau wurde E. faecalis früher zu den
Streptokokken gezählt. Es kommt weltweit vor und ist Bestandteil der physiologischen
Darmflora zahlreicher Säugetiere, einschließlich des Menschen sowie anderer
Wirbeltiere und Wirbelloser (Ryan et al., 2004).
Abb. 1: Monoinfektion mit E. faecalis von Wurzelkanalwanddentin,
Vergrößerungsfaktor 3000 (Eigentum der Abteilung für Zahnerhaltung an der Klinik für Zahn-, Mund- und
Kieferheilkunde der Universität Freiburg)
10
Enterococcus faecalis ist ein fakultativ pathogenes Bakterium. Das bedeutet, dass
Infektionen erst bei einer verschlechterten Immunabwehr des Wirtorganismus
entstehen, wie zum Beispiel die Infektion eines immunsupprimierten Patienten
während seines Krankenhausaufenthalts.
Es verursacht unter anderem Infektionen des Gastrointestinal- und Urogenitaltraktes,
Bakteriämien und Endokarditiden. Fast 90 % der menschlichen
Enterokokkeninfektionen werden durch E. faecalis verursacht (Jett et al., 1994;
Portenier et al., 2003).
Wie andere Enterokokken zeigt E. faecalis eine intrinsische Resistenz gegen
Cephalosporine und manchmal gegen Tetrazykline. Mittel der ersten Wahl zur
Behandlung harmloser E. faecalis-Infektionen ist die Kombination von Gentamicin mit
Ampicillin oder mit Ceftriaxon (Aarestrup et al., 2000; Dubin und Pamer, 2014).
Außerhalb seines Wirtes kann der Keim mehrere Wochen überleben. Es kann eine
Temperatur von 60 °C für bis zu 30 Minuten tolerieren, sowie auch Trockenheit,
Detergenzien, Gallensalze und Ethanol (Tendolkar et al., 2003). Außerdem kann E.
faecalis bei hohen pH-Werten von bis zu 11,5 überleben. Das Bakterium ist aber nicht
im Stande Endosporen auszubilden (Evans et al., 2002; Stuart et al., 2006a).
Seit den 1970er Jahren ist es bekannt, dass E. faecalis eine große Rolle bei
nosokomialen Infektionen des Urogenitaltraktes und bei bakterieller Meningitis und
Endokarditis spielt. Es konnte nachgewiesen werden, dass das Bakterium für 80 %
der durch Enterokokken verursachten nosokomialen Infektionen in den USA
ursächlich war. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass E. faecalis die submandibulären
Lymphknoten von bakterienfreien Mäusen von dem Wurzelkanalsystem aus besiedeln
kann. Dieser Infektionsweg könnte eine Rolle in der Pathogenese opportunistischer
Infektionen spielen (Stuart et al., 2006b).
In der Mundhöhle gehört E. faecalis zur physiologischen bakteriellen Flora. Es konnte
jedoch anhand von Speichelproben nachgewiesen werden, dass Patienten, die aktuell
eine Wurzelbehandlung durchgeführt bekommen haben oder bei denen eine Revision
stattfand, eine größere Anzahl dieses Bakteriums im Speichel haben, als Patienten
ohne eine vorausgegangene endodontische Therapie (Sedgley et al., 2006). Es ist
zwar auch bei primären Infektionen des Wurzelkanalsystems zu finden, konnte aber
neun Mal häufiger in Wurzelkanälen nach einer vorausgegangenen
Wurzelbehandlung und bei periapikalen Entzündungen isoliert werden. Je nach Studie
11
schwankt die Prävalenz zwischen 24 % und 77 % (Gomes et al., 2004; Molander et
al., 1998; Stuart et al., 2006b).
E. faecalis besitzt verschiedene Virulenzfaktoren und zusätzliche Eigenschaften, die
es ihm erlauben, ungünstige Verhältnisse und äußere Einflüsse zu überdauern wie
zum Beispiel das Cytolysin, die Lipoteichonsäure und verschiedene
Aggregationssubstanzen. Außerdem kann das Bakterium die Effektivität von
Lymphozyten unterdrücken und Proteine synthetisieren, die dem Keim Vorteile
gegenüber anderen Bakterienspezies sichern. Das kollagenbindende Protein zum
Beispiel, das ihm eine Anheftung am Dentin erlaubt und zusammen mit der geringen
Größe des Bakteriums, die Invasion von Dentintubuli ermöglicht. Hinzu kommt auch
die Fähigkeit, längere Zeiten mit einem limitierten Nährstoffangebot zu überbrücken
und sich vom Serum ernähren zu können, das aus dem Alveolarknochen und aus dem
periodontalen Ligament stammt (Jett et al., 1994; Lee et al., 2004b; Love, 2001).
Kalziumhydroxid scheint als antiseptisches Medikament mit einem hohen pH-Wert
gegenüber E.faecalis ineffektiv zu sein (Gomes et al., 2003; Schäfer und Bössmann,
2005). Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass der Keim in seiner Zellmembran eine
Protonenpumpe besitzt, die Wasserstoff-Ionen ins Zellinnere hineintransportiert und
damit für ein niedriges intrazelluläres pH sorgt (Evans et al., 2002). Die in der Literatur
erwähnten maximal erreichten intrakanalären pH-Werte liegen zwischen pH 8,0 und
pH 11,1 nach Applikation von Kalziumhydroxid (Nerwich et al., 1993; Tronstad et al.,
1981). Ein Milieu, dessen pH ausreichend hoch ist, um E. faecalis zu eliminieren,
scheint demnach mit Kalziumhydroxid nicht erreichbar zu sein.
E. faecalis kann seine Virulenzfaktoren an andere Bakterienspezies weitergeben und
damit sogar deren Überlebensrate beeinflussen (Stuart et al., 2006). Die Zugabe von
E. faecalis zu einer Bakterienkolonie aus vier Stämmen (S. angiosus, P. anaerobius,
P. oralis und F. nucleatum) führte zu signifikant höheren Überlebensraten der
gesamten Population (Fabricius et al., 2006). Aufgrund eines spezifischen Proteins mit
dem Namen Enterococcal surface protein (Esp) ist E. faecalis im Stande, Biofilme aus
einer Matrix von Proteinen und Polysacchariden zu bilden und somit eine bis zu
tausendfach höhere Resistenz gegenüber Phagozytose, Antikörpern und Antibiotika
zu erreichen (Distel et al., 2002; Tendolkar et al., 2004; Toledo-Arana et al., 2001). Die
erwähnten pathogenen Eigenschaften erschweren die Therapie von E. faecalis und
klassifizieren ihn als ein Problemkeim der Endodontologie (Portenier et al., 2003).
12
2.4 Die Desinfektion des Wurzelkanalsystems Das Ziel einer Wurzelkanalbehandlung ist das vollständige Entfernen oder zumindest
die Deaktivierung der intrakanalären Mikroorganismen und deren Nebenprodukte.
Aufgrund von Verzweigungen und Seitenkanälen des Wurzelkanalsystems ist die
Beseitigung von Bakterien, die sich dort entwickelt haben, mit rein mechanischen
Maßnahmen nicht ausreichend (Barthel, 2001; Hülsmann et al., 2005; Zehnder, 2006).
Zwar wird durch das mechanische Aufbereiten des Wurzelkanalsystems eine
signifikante Reduktion der Keimzahl im Kanalsystem erreicht, allerdings ist allein
dadurch keine ausreichende Reduktion bzw. Keimfreiheit möglich (Baugh und
Wallace, 2005; Byström und Sundqvist, 1981).
Eine Wurzelkanalbehandlung beinhaltet aus diesem Grund neben der Präparation des
Wurzelkanalsystems auch die chemische Desinfektion als integralen Bestandteil
(Zehnder, 2006). Die Kombination aus einer mechanischen Instrumentierung und
einer effektiven chemischen Desinfektion ist unabdingbar, um eine ausreichende
Elimination der Bakterien aus dem Wurzelkanalsystem zu gewährleisten (Siqueira et
al., 2002).
Eine Wurzelkanalspüllösung muss daher unterschiedliche Eigenschaften aufweisen
(Basrani und Haapasalo, 2012; Gulabivala et al., 2010):
1. Antibakterielle Wirkung und Denaturation von bakteriellen Toxinen
2. Auflösung der bakteriellen Biofilme und des restlichen Pulpagewebes bis in
die Verzweigungen des Wurzelkanalsystems
3. Herausspülen der organischen und anorganischen Bestandteile, die während
der Wurzelkanalaufbereitung entstanden sind
4. Verbesserte Gleitfähigkeit der Wurzelkanalinstrumente
5. Abtransport entstandener Dentinspäne, um eine mögliche Verlegung des
Wurzelkanals zu vermeiden
6. Gute Gewebeverträglichkeit, nicht reizend für die periapikale Region
Da es keinem einzelnen Spülmittel möglich ist alle Anforderungen optimal zu erfüllen,
wird je nach der Indikation eine Kombination von Agenzien empfohlen. Als
Standardmedium hat sich Natriumhypochlorit (NaOCl) bewährt, da es die meisten der
oben erwähnten Eigenschaften besitzt (Byström und Sunvqvist, 1985; Mohammadi,
2008).
13
Zusätzlich können Spülflüssigkeiten wie Chlorhexidindigluconat (CHX),
Ethylendiamintetraacetat (EDTA) und Zitronensäure bei korrekter und vorsichtiger
Anwendung das Therapieergebnis verbessern (Basrani und Haapasalo, 2012).
2.4.1 Isopropylalkohol 90 % Isopropylalkohol oder Isopropanol ist ein Isomer des Propylalkohols, das
antibakterielle Eigenschaften besitzt. Der genaue desinfizierende Wirkmechanismus
von Isopropanol ist nicht vollständig geklärt. Es wird vermutet, dass er zelluläre
Proteine und DNS denaturiert, intrazelluläre Lipidmembranen auflöst und dadurch den
Stoffwechsel der Zelle negativ beeinflusst (Datenbank der National Cancer Institut,
Rockville, USA).
Die antibakterielle Wirkung von Isopropanol hängt stark von dessen Konzentration ab.
Am häufigsten kommen 60%ige bis 90%ige Lösungen zum Einsatz. Dabei nimmt die
bakterizide Wirkung von Isopropylalkohol bei Konzentrationen größer als 90 % ab, da
Wasser für das Eindringen des Alkohols durch die Zellmembran notwendig ist (Centers
for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA).
Als Spülung bei der Wurzelbehandlung kann Isopropylalkohol aufgrund seiner
geringen Oberflächenspannung gut in Seitenkanälchen und enge Kanalabschnitte
diffundieren. Alkohole werden als letzte Spülung bei der Wurzelkanalbehandlung
empfohlen, um dadurch eine Trocknung der Wurzelkanalwände und der
Zugangskavität und somit einen besseren adhäsiven Verschluss und Benetzung des
Sealers zu erreichen (Dias et al., 2014).
2.5 Die antimikrobielle photodynamische Therapie Der Begriff der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT) wurde bereits im
Jahr 1900 von Oskar Raab an dem pharmakologischen Institut der Universität
München erarbeitet. Er ist zu der Erkenntnis gekommen, dass der Farbstoff Acridin mit
sichtbarem Licht interagieren kann und bei ausreichender Sauerstoffkonzentration
einen antibakteriellen Effekt auf Pantoffeltierchen ausüben kann. Im Jahr 1903 erfolgte
die erste therapeutische Anwendung der PDT bei Hautkarzinomen durch Bestrahlung
des Farbstoffs Eosin mit sichtbarem Licht. Dadurch wurde zum ersten Mal der Begriff
der photodynamischen Therapie (PDT) verwendet (Pass, 1993; Wolf, 1999). Die
photodynamische Therapie wurde seitdem in verschiedenen Bereichen der Medizin
implementiert, wie zum Beispiel in der Dermatologie, in der Urologie und in der
14
Augenheilkunde. Die antimikrobielle photodynamische Therapie stellt eine alternative
Therapiemethode für Mikroorganismen dar, die Resistenzen gegenüber Antibiotika
aufweisen. In der Literatur sind zwar Fälle beschrieben worden, in denen es zu
Resistenzen der Bakterien gegenüber manchen Photosensibilisatoren kam. Diese
waren aber hauptsächlich auf Protoporphyrin IX und auf Hypericin begrenzt. Die
Resistenz scheint dabei maßgeblich vom verwendeten Photosensibilisator abhängig
gewesen zu sein (Theodossiou et al., 2017; Wei et al., 2014).
Nach der rasanten Entwicklung der PDT in der Medizin seit 1960, findet sie einige
Jahre später auch in der Zahnmedizin Anwendung. Sie wird in der Mundhöhle als
Therapiemethode für Schleimhautveränderungen wie Lichen planus und Leukoplakie
verwendet. Wenn die gerichtete Lichtstrahlung für die Eliminierung von bakteriellen
Biofilmen angewendet wird, wird von einer antimikrobiellen photodynamischen
Therapie (aPDT) gesprochen. Insbesondere für die Parodontitistherapie und für die
Endodontie ist die aPDT gut geeignet (Konopka und Goslinski, 2007) (Abbildung 2).
Abb. 2: Lichtleiter mit Endodontie-Aufsatz des ASEPTIM PLUS-Lasers
SciCan GmbH, Leutkirch
(Quelle: scican.de)
2.5.1 Wirkungsweise der antimikrobiellen photodynamischen Therapie Die zytotoxische Wirkung der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT)
beruht auf der lichtinduzierten Entstehung reaktiver Radikale und Sauerstoffspezies
aus einem Photosensibilisator, die toxisch auf Mikroorganismen wirken (De Oliveira et
al., 2014), (Abbildung 3). Dabei wird der Photosensibilisator nach Bestrahlung mit Licht
einer bestimmten Wellenlänge von seinem Grundzustand auf ein energetisch höheres
15
Niveau, Triplett-Zustand genannt, gebracht. Dabei kann der erregte
Photosensibilisator in dem neuen Zustand mit verschiedenen Biomolekülen reagieren
und freie Radikale entstehen lassen (Typ I-Reaktion) oder mit Sauerstoff reagieren
und zur Bildung von Singulett-Sauerstoff führen (Typ II-Reaktion), (Rajesh et al.,
2011).
Diese hochreaktiven Radikale und Sauerstoffspezies reagieren mit zellulären
Bestandteilen wie Plasmamembran oder Zellwand und bewirken so den Zelltod.
Mikroorganismen, die durch PDT inaktiviert werden können, sind unter anderem Viren,
Bakterien und Pilze. Die Wellenlänge der verwendeten Lichtquelle muss dem
jeweiligen Absorptionsmaximum des Photosensibilisators entsprechen, um eine hohe
Ausbeute an Radikalen und reaktiven Sauerstoffspezies zu erreichen (Rajesh et al.,
2011; Khandge et al., 2013).
Abb.3: Schematische Darstellung der Wirkungsweise der photodynamischen
Therapie
(Gursoy et al. 2012, Konopka et al. 2007)
Es gibt zwei verschiedene Mechanismen, wie die im Photosensibilisator angereicherte
Energie auf weitere Biomoleküle übertragen wird. Bei der Typ I-Reaktion wird ein
Elektron/Wasserstoff-Ion auf ein benachbartes Biomolekül übertragen und bildet
dadurch Ionen oder ein Elektron/Wasserstoff-Ion wird einem Substrat entzogen und
führt zur Entstehung freier Radikale. Die so entstandenen Radikale reagieren schnell
16
mit Sauerstoff, was die Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies (Superoxide, Hydroxyl-
Radikale und Wasserstoffperoxide) bewirkt (Trindade et al., 2015).
Die Typ II-Reaktion ist dadurch charakterisiert, dass die Energieübertragung von dem
Photosensibilisator direkt auf ein Sauerstoffmolekül stattfindet. Dadurch entsteht eine
hochreaktive Sauerstoffspezies, Singulett-Sauerstoff genannt. Diese löst in
unmittelbarer Umgebung Oxidationsprozesse aus (Cieplik et al., 2018). Während der
aPDT ist die Unterscheidung zwischen den beiden Reaktionsmechanismen schwierig.
Die beiden Reaktionswege finden parallel statt. Welcher Reaktionstyp überwiegt,
hängt vom Sauerstoffangebot im Gewebe, von der Konzentration und von der Art des
Photosensibilisators ab (Baptista et al., 2017; Cieplik et al., 2018). Methylenblau und
Toluidinblau O wirken hauptsächlich über den Typ I-Reaktionsweg. Nach Abgabe ihrer
Energie fallen die Photosensibilisatormoleküle wieder in deren energetischen
Grundzustand zurück und können prinzipiell erneut Licht absorbieren und als Ergebnis
weitere reaktive Sauerstoffspezies bilden (Alves et al., 2014; Konopka und Goslinski,
2007).
Die zytotoxischen Effekte, die von der PDT verursacht werden, betreffen
Zellorganellen, Biomoleküle und Stoffwechselprozesse der Zelle als Ganzes.
Zellbestandteile, die bei der aPDT angegriffen werden, sind unter anderem die
Zellwand, die Plasmamembran, die Mitochondrien, Lysosomen und zum Teil die
Nukleinsäuren. Es kommt ferner zu Veränderungen des Kalzium- und
Lipidstoffwechsels und dabei werden Zytokine und Stressproteine synthetisiert. Bei
der Oxidation von Aminosäuren, Nukleinsäuren und Phospholipiden entstehen
Membranschäden im Zellkern, in den Lysosomen und in den Mitochondrien. Werden
die Mitochondrien geschädigt, kann dies zur Apoptose der Zelle führen (Alves et al.,
2014; Konopka und Goslinski, 2007).
Die Lebensdauer des entstandenen Singulettsauerstoffs und der Sauerstoffradikale ist
sehr kurz und aus diesem Grund ist die erreichbare Diffusionsstrecke auf 0,01 µm bis
0,02 µm begrenzt (Moan und Berg, 1991). Somit ist der zelluläre Schaden nur auf das
Gebiet begrenzt, das eine hohe Konzentration des Photosensibilisators aufweist und
über ausreichend Licht und Sauerstoff verfügt (Rajesh et al., 2011).
2.5.2 Photosensibilisatoren Photosensibilisatoren sind Moleküle, die nach Absorption von Licht mit einer
bestimmten Wellenlänge in einen energetisch höheren Zustand übergehen und die
17
aufgenommene Energie anschließend an andere Moleküle übertragen können. Es
existieren zahlreiche Photosensibilisatoren, die sich in deren chemischen Struktur und
deren physikalischen und pharmakokinetischen Eigenschaften unterscheiden
(Konopka und Goslinski, 2007). Photosensibilisatoren, die in den letzten Jahren in der
Endodontie häufig Anwendung gefunden haben, sind Phenothiazine, kationischen
Porphyrine, Phtalocyanine sowie Chlorine. Sie sind im Stande sowohl gramnegative
als auch grampositive Bakterien zu inaktivieren (Kishen, 2010).
Der Farbstoff Toluidinblau O (TBO), der in der vorliegenden Studie eingesetzt wurde,
gehört zusammen mit Methylenblau zu der Gruppe der Phenothiazine. Diese sind die
im klinischen Gebrauch am häufigsten eingesetzten Photosensibilisatoren (Wainwright
und Crossley, 2002). Diese Farbstoffe haben eine blaue Farbe und ein
Absorptionsmaximum zwischen 625 nm und 660 nm (Calzavara-Pinton et al., 2012).
Chemisch gesehen sind die Phenothiazine kationische Moleküle, deren Kern ein
planares aromatisches trizyklisches Ringsystem darstellt (Wainwright und Giddens,
2003), (Abbildung 4).
Abb. 4: Toluidinblau (Toloniumchlorid)
(aus Montazerozohori et al., 2011)
Ein optimaler Photosensibilisator sollte folgende photo-physikalische, chemische und
biologische Eigenschaften aufweisen (Konopka und Goslinski, 2007; Wainwright und
Giddens, 2003):
1. Niedrige Toxizität gegenüber dem zu behandelnden Gewebe
2. Hohe Effektivität in der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies
3. Inaktivierung von Bakterien, Viren, Pilzen und Protozoen
4. Definiertes Absorptionsmaximum, idealerweise im Bereich zwischen 600 und
750 nm
18
5. Gute Löslichkeit in wässrigen Lösungen
6. Gute Lagerbarkeit und Lichtstabilität
Die zytotoxischen Wirkungen verschiedener Photosensibilisatoren (PS) gegenüber
grampositiven und gramnegativen Bakterien sind abhängig von deren physikalisch-
chemischen Eigenschaften. (George et al., 2009; Konopka und Goslinski, 2007).
Allerdings kommt es nicht zu einer Schädigung von körpereigenen Zellen (Lee et al.,
2004a). Die Ladung des Photosensibilisators scheint eine Rolle bei seiner Toxizität
gegenüber grampositiven oder gramnegativen Bakterien zu spielen. Neutrale oder
anionische PS binden an die Zellmembran von Gram-positiven Bakterien. Die
vergleichsweise poröse Schicht aus Peptidoglykan und Lipoteichonsäure, die die
Zellmembran der grampositiven Bakterien umschließt, erlaubt das Eindringen des
Photosensibilisators in die Zelle und deren anschließenden Inaktivierung (Konopka
und Goslinski, 2007). Die Zellwand von gramnegativen Bakterien ist reich an negativ
geladenen Lipopolysacchariden, die deren Permeabilität regulieren. Dadurch können
neutrale oder anionische Photosensibilisators die Zellwand schwer diffundieren und
ihre zytotoxische Wirkung entfalten (George et al., 2009).
Die Schwierigkeiten bei der Eliminierung von gramnegativen Bakterien konnten durch
die Anwendung von kationischen Photosensibilisators oder durch Kopplung von positiv
geladenen Molekülen an anionischen Photosensibilisators reduziert werden (George
et al., 2009). Ein weiterer Faktor, der die Effektivität der aPDT beeinflussen kann, ist
der pH-Wert der Umgebung. Es konnte nachgewiesen werden, dass kationische
Photosensibilisators wie Toluidinblau, trotz deren positiven Ladung, in einem
alkalischen Milleu eine höhere Effektivität gegenüber gramnegativen Bakterien
aufweisen (Kömerik und Wilson, 2002). Es wird vermutet, dass die basische
Umgebung die Penetration von Toluidinblau in den Zellen erleichtert (Wakayama et
al., 1980). Weiterhin konnte beobachtet werden, dass höhere pH-Werte die
Zytotoxizität von Singulett-Sauerstoff-Molekülen erhöhen, da der PS längere Zeit in
seinem erregten Triplett-Zustand verbleiben kann (Bonneau et al., 1975; Tuite und
Kelly, 1993).
19
3. Material und Methode
3.1 Auswahl der Zähne Die Ethik-Kommission der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg genehmigte diese
Studie unter der Antragsnummer 604/14 am 23. Dezember 2014. Die verwendeten
Zähne waren ausschließlich extrahierte menschliche Frontzähne und Prämolaren mit
einem Wurzelkanal. Geeignet für die Durchführung der Versuche waren nur Zähne,
die folgenden Kriterien erfüllten:
• bleibende Zähne
• Wurzelwachstum abgeschossen
• keine apikalen Resorptionen
• Wurzelkanäle bis zur Wurzelspitze aufbereitungsfähig
• keine vorausgegangene endodontische Behandlung
• Wurzelkanäle mit einem geraden Verlauf
• keine makroskopisch sichtbaren Frakturen oder Mikrorisse am Schmelz oder
am Dentin
• kariesfreie Zähne oder solche mit einer vollständig exkavierten Karies
Vor Beginn des Versuches erfolgte die Lagerung der Zähne für mindestens 24
Stunden in 0,1%iger Thymollösung. Die Lösung diente als Schutz vor Austrocknung
und vor Kontamination der Zähne. Deren desinfizierende Wirkung und Eignung als
Lagerungsmedium wurden in früheren Studien bestätigt (Botelho et al., 2007; Doderer,
2010). Während des Versuches wurde angestrebt, eine möglichst nahe
Ausgangssituation in allen Versuchszähnen zu gewährleisten. Die Aufbereitung der
Zähne erfolgte einheitlich, es wurde eine identische Nährlösung verwendet und es
wurden gleiche Inkubationszeiten und Inkubationsbedingungen festgelegt.
Abschließend wurde für die Probenentnahme ein standardisiertes Vorgehen
angewendet.
3.2 Vorbereitung der Zähne Zuerst erfolgte die Kürzung der Zahnkrone mit einem rotierenden Diamanten auf Höhe
der Schmelz-Zement-Grenze. Die gegebenenfalls noch auf der Wurzeloberfläche
vorhandenen Konkremente oder Gewebereste wurden mithilfe von Ultraschall- und
Handscaler entfernt und die Wurzeln wurden geglättet (Abbildungen 5 und 6).
20
Abb. 5: Extrahierte menschliche Zähne vor Kürzung und Reinigung
Abb. 6: Die Zähne nach Kürzung und Reinigung
Danach wurde die Länge der Versuchszähne bestimmt. Dazu wurde eine ISO 10 K-
Feile (VDW GmbH, München) verwendet, die bis zum anatomischen Apex der Wurzel
vorgeschoben wurde. Beim Sichtbarwerden der Feile am anatomischen Apex wurde
die Zahnlänge bestimmt. Als Arbeitslänge für die Aufbereitung des Wurzelkanals
wurde die Zahnlänge minus 1 mm festgelegt.
3.2.1 Maschinelle Aufbereitung Die Wurzelkanäle wurden maschinell mit dem ProTaper Universal System (Dentsply-
Maillefer, Ballaigues, Schweiz), (Abbildung 7) in Kombination mit dem Endo IT
Professional Motor aufbereitet (VDW GmbH, München), (Abbildung 8).
21
Abb. 7: SX, S1, S2 und F1-F5
ProTaper Universal Feilen
(Quelle: www.dentsplymaillefer.com)
Abb. 8: Endo IT Professional Motor
der Firma VDW
Das ProTaper Universal System besteht aus drei Shaping Feilen (SX, S1, S2) und
fünf Finishing Feilen (F1-F5) mit jeweils unterschiedlichem Durchmesser der
Instrumentenspitze und unterschiedlicher Konizität. Nach Bestimmung der Arbeitslänge wurden die Wurzelkanäle zuerst per Hand mit K-
Feilen (VDW GmbH, München) bis zur Größe ISO 15 aufbereitet. Die anschließende
maschinelle Aufbereitung mit dem ProTaper System erfolgte entsprechend den
Herstellerangaben mit dem Endo IT Professional Motor (VDW GmbH, München) bei
konstanter Rotation und einer Drehzahl von 150-350 U/min. Die Wurzelkanäle wurden
bis zur F2 Finishing-Feile aufbereitet. Das entsprach einer 8%igen Konizität im
apikalen Drittel und 0,25 mm Durchmesser an der Instrumentenspitze.
Zuerst wurde mit der SX-Feile mit bürstenden Bewegungen die koronale Aufbereitung
des Wurzelkanals durchgeführt, um einen besseren Gleitpfad für die weiteren Feilen
zu erreichen. Die ursprünglich bestimmte Arbeitslänge wurde erneut kontrolliert. Mit
der S1-Feile und der S2-Feile wurde mit bürstenden Bewegungen bis auf Arbeitslänge
aufbereitet. Die F1-Feile wurde mit passiver, nicht-bürstender Bewegung verwendet,
um schrittweise die Arbeitslänge zu erreichen. Abschließend wurde mit der F2-Feile
mit derselben passiven Bewegung der Wurzelkanal bis ISO 25 in voller Arbeitslänge
aufbereitet.
Während der Aufbereitung wurden pro Zahn ungefähr 5 ml 3 % Natriumhypochlorit
(NaOCl, Hedinger Aug. GmbH & Co. KG, Stuttgart) als Spülung verwendet. Im
Anschluss an die Instrumentierung wurde mit 3 ml 5 % Natriumthiosulfat gespült, um
die Wirkung des Natriumhypochlorits im Kanal zu neutralisieren.
22
Die weiteren Vorbereitungsschritte wurden unter der Sicherheitswerkbank (Aster
Laminaflow, Hamphshire, Großbritannien) durchgeführt, damit eine eventuelle
Kontamination der aufbereiteten und desinfizierten Zähne vermieden werden konnte.
3.2.3 Apikaler Verschluss und Einbetten der Zähne in Kunststoff Das apikale Foramen der Zähne wurde mit einem fließfähigen Füllungskomposit (x-
flow, Dentsply DeTrey GmbH, Konstanz) bakteriendicht verschlossen, damit eine
externe Kontamination von apikal während des Versuches ausgeschlossen werden
konnte. Um einem eventuellen Rückfluss des Adhäsivsystems oder des Komposits in
dem Wurzelkanal entgegenwirken zu können, wurde in den Wurzelkanal ein
Guttaperchastift (VDW GmbH, München) in der ISO Größe 25 eingebracht (Abbildung
9). Anschließend erfolgte das Konditionieren der Wurzelspitze mit 37%iger
Phosphorsäure für 15 Sekunden (Total Etch, KerrHawe SA, Bioggio, Schweiz),
(Abbildung 10). Danach wurde das Ätzgel für 5 Sekunden mit Wasser abgespült. Nach
der Trocknung der Wurzeloberfläche mit einem Luftstrom wurde ein Ein-Flaschen-
Adhäsivsystem (3M Scotchbond Universal, 3M Deutschland GmbH, Neuss) zur
Haftvermittlung verwendet (Abbildung 11). Das Adhäsivsystem wurde mit einem
Applikator (Applicator Tip, Dentsply DeTray GmbH, Konstanz) für 10 Sekunden auf die
Wurzelspitze einmassiert und danach vorsichtig luftgetrocknet. Weiter erfolgte die
Lichthärtung mit der Polymerisationslampe für 15 Sekunden (bluephase C8 LED,
Ivoclar Vivadent, Schaan, Lichtenstein).
Abb. 9: Eingebrachte ISO 25
Guttaperchastifte Abb. 10: Auftragen der Phosphorsäure
23
Abb. 11: Aufgetragenes und lichtgehärtetes Bonding
Als Verschlusskomposit wurde x-flow (Dentsply DeTrey GmbH, Konstanz) verwendet.
Mit einer Applikationspistole wurde das fließfähige Komposit auf die Wurzelspitze
aufgetragen und mit einem sterilen Heidemanspatel (Henry Schein Dental
Deutschland GmbH, Langen) so um die Wurzelspitze verteilt, dass sichergestellt
werden konnte, dass die apikale Region dicht verschlossen war. Nach
Lichtpolymerisation für 20 Sekunden wurde der Guttaperchastift entfernt. Zur besseren
Handhabung der Zähne wurden sie in Kunststoff eingebettet. Als Gussförmchen
wurden vorgefertigte Kunststoffbehälter verwendet (Cryo.sTM Einfrierröhrchen 2 ml,
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen), (Abbildung 12). Der zum Einbetten
verwendete Kunststoff (Technovit 4071, Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim) wurde mit
einem sterilen Spatel fließfähig angerührt und in die Kunststoffbehälter eingebracht.
Die Zähne wurden danach mit einer sterilen Pinzette einzeln in die mit Kunststoff
gefüllten Förmchen eingebracht. Zu beachten war, dass die Zähne mittig und gerade
in den Behältern positioniert wurden und dass sie gleichmäßig und blasenfrei von
Kunststoff bis zur Schmelz-Zement-Grenze umgeben waren (Abbildung 13).
Nach dem Aushärten des Einbettkunststoffs wurden die Kunststoffbehälter entfernt
und die eingebetteten Zähne erneut eingeschweißt und sterilisiert (StatIM 5000S
Schnellsterilisator Scican GmbH Leutkirch, 134 °C, 18 min, 304 kPa), (Abbildung 14).
24
Abb. 12: Cryo.sTM TM 2 ml
Einfrierröhrchen
Abb. 13: Bis Schmelz-Zement-Grenze
in Kunststoff eingebettete
Versuchszähne
Abb. 14: Eingeschweißte Zähne nach Sterilisation
3.3. Herstellen der Bakterienlösung und Beimpfen der Zähne Zum Beimpfen der Versuchszähne wurde das Bakterium Enterococcus faecalis
verwendet. Aus einem klinischen Isolat des Bakteriums (Lagerungsbedingungen: -80
°C, Dometic UF 756 Medical Systems, Hosingen, Luxemburg) wurden Kolonien unter
anaeroben Bedingungen bei 37°C und 5% CO2 für 24 Stunden im Brutschrank
(HERAcell 150 CO2 Inkubator, Thermo Fisher Scientific, Dreieich) auf einer Columbia-
Blut-Agarplatte (Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene des
Universitätsklinikums Freiburg, Freiburg) angezüchtet (Abbildung 15). Anschließend
wurde eine einzelne Kolonie mit einer sterilen Impföse entnommen und in 5 ml
Nährlösung (Tryptic Soy Broth (TSB), Caso-Bouillon, Merck KGaA, Darmstadt) unter
identischen Bedingungen für 24 Stunden im Brutschrank angezüchtet. Die daraus
entstandene Bakterienlösung wurde für das Beimpfen der Zähne verwendet
(Abbildung 16).
25
Abb. 15: E. faecalis Bakterienkultur auf
Blutagar-Platte
Abb. 16: Tryptic-soy-broth-Nährlösung
nach 24 Stunden Inkubation
3.3.1 Beimpfen der Versuchszähne und Anzüchten eines Biofilms Nachdem die eingeschweißten sterilisierten Zähne ausgepackt worden waren, wurde
eine Probe aus dem Wurzelkanal jedes Zahns mit jeweils drei vorher sterilisierten
Papierspitzen in ISO Größe 25 und Konizität 6% (Roeko Coltène/Whaledent GmbH &
Co. KG, Langenau) entnommen, um sie auf Keimfreiheit zu untersuchen.
Nach der Probenentnahme wurden die Papierspitzen in ein Eppendorf-Gefäß (2 ml
Eppendorf-Netheler-Hinz-GmbH, Hamburg) mit 1000 µl steriler Kochsalzlösung (0,9%
B. Braun, Melsungen AG, Melsungen) überführt und für 10 Sekunden gevortext (2400
U/min, Reax1, Heidolph Elektro GmbH & Co. KG, Kelheim). Daraus wurden 100 µl mit
einer sterilen Pipette (ratiolab GmbH, Dreieich) entnommen und auf einer Columbia-
Blut-Agarplatte mit einem sterilen Glasspatel verteilt. Die beimpften Agarplatten
wurden danach für 24 Stunden im Brutschrank unter 37 °C und 5% CO2 gelagert.
Wurden keine Kolonien nach 24 Stunden auf den Agarplatten nachgewiesen, konnte
davon ausgegangen werden, dass die Zähne vor dem Beimpfen steril waren. Bei
positiver Bakterienkultur wurde der entsprechende Zahn aus dem Versuch
herausgenommen und erneut sterilisiert.
Das Beimpfen mit Bakterienlösung erfolgte mit sterilen Einwegspritzen (Soft-Ject,
Henke-Sass, Wolf GmbH, Tuttlingen) und sterilen Einwegkanülen (V.M.K. Endoneedle
Buquet, Vedefar N.V., Dilbeek, Belgien). Die Kanülen hatten einen Durchmesser von
0,35 mm, um eine ausreichende Eindringtiefe in den Wurzelkanal zu gewährleisten,
ohne dabei mechanische Schäden der Kanalwand herbeizuführen. Die
Bakterienlösung wurde bis zur Schmelz-Zement-Grenze der Versuchszähne
eingeführt. Im Anschluss wurden die Zähne für vier Tage im Brutschrank bei 37°C und
5% CO2 gelagert.
26
Für die Dauer des Anzüchtens des Biofilms wurde das Nährmedium jede 24 Stunden
unter sterilen Bedingungen ausgewechselt. Mit einer sterilen Einmalspritze und einer
sterilen Kanüle wurde das vorhandene Medium vorsichtig aus den Kanälen
aufgesaugt. Die Kanüle wurde vorsichtig im Kanal bewegt, um eine Schädigung des
Biofilms zu vermeiden. Das neue sterile TSB-Nährmedium wurde anschließend mit
einer neuen Einmalspritze und einer neuen Kanüle analog zur ersten Beimpfung in die
Wurzelkanäle eingeführt.
3.4 Aufteilung der Gruppen Es wurden vier Versuchsgruppen mit jeweils 15 Zähnen gebildet und die Zähne
wurden in die Gruppen randomisiert aufgeteilt. Eine schematische Darstellung der vier
Therapieprotokolle ist der Tabelle 1 zu entnehmen.
In der Gruppe TBO in Aqua wurde die aPDT gemäß Herstellerangaben durchgeführt.
Dabei wurde eine Lösung des Photosensibilisators Toluidinblau O (TBO) in
destilliertem Wasser in einer Konzentration von 17 mg/l verwendet. Die Einwirkzeit des
Photosensibilisators im Kanal betrug 60 Sekunden und die anschließende
Belichtungszeit mit dem ASEPTIM Plus Gerät (SciCan GmbH, 88299 Leutkirch) 120
Sekunden.
In der Gruppe TBO in Alkohol + Alkohol wurde der Farbstoff in gleicher Konzentration
von 17 mg/l in 90 % Isopropylalkohol statt in destilliertem Wasser gelöst und daran
schloss sich die aPDT in analoger Ausführung wie in der Gruppe TBO in Aqua an.
Zusätzlich wurde in dieser Gruppe nach jeder aPDT mit 2 ml 90 % Isopropylalkohol
nachgespült.
In der Gruppe TBO in Aqua + Alkohol wurde der Photosensibilisator wie in TBO in
Aqua in destilliertem Wasser gelöst. Danach erfolgte die aPDT in der schon
beschriebenen Weise. In dieser Gruppe wurde wie in TBO in Alkohol + Alkohol nach
der Therapie mit 2 ml 90%igem Isopropylalkohol nachgespült.
Bei der Gruppe Alkohol wurden die Versuchszähne ausschließlich mit 2 ml 90%igem
Isopropylalkohol gespült.
27
Gruppe TBO in Aqua TBO in
Alkohol + Alkohol
TBO in Aqua + Alkohol Alkohol
PS Toluidinblau O Toluidinblau O Toluidinblau O -
Lösungsmittel Aqua dest 90 % Isopropanol Aqua dest -
Spülung - Isopropanol Isopropanol Isopropanol
Tab. 1: Schematische Darstellung der Therapieprotokolle für die vier Gruppen; PS = Photosensibilisator
In der Kontrollgruppe wurden die Versuchszähne nicht mit Bakterienlösung beimpft,
sondern sie verblieben vier Tage im Brutschrank und erhielten keine antimikrobielle
Therapie.
3.5 Probenentnahmen und antimikrobielle Therapie 3.5.1 Probenentnahme zur Bestimmung der Ausgangskontamination Die Probenentnahme zur Bestimmung der Ausgangskontamination fand nach vier
Tagen Inkubation der Versuchszähne und vor der antimikrobiellen Therapie statt. Alle
Manipulationen während der Probenentnahmen und der Desinfektionsvorgänge
erfolgten unter einer Sicherheitswerkbank (Aster-Laminaflow, Hamphshire, UK).
Zuerst wurde die in den Wurzelkanälen vorhandene Nährlösung mittels
Einwegspritzen (Soft-Ject, Henke-Sass, Wolf GmbH, Tuttlingen) und Einwegkanülen
(V.M.K. Endoneedle Buquet, 0,35 mm Durchmesser, Vedefar N.V., Dilbeek, Belgien)
aufgesaugt. Anschließend erfolgte die Probenentnahme mit drei nacheinander
inserierten sterilen Papierspitzen der ISO Größe 25 und 6%iger Konizität. Die drei
jeweiligen Papierspitzen wurden mittels einer sterilen Pinzette in ein steriles
Eppendorfgefäß überführt (2 ml Eppendorf-Netheler-Hinz-GmbH, Hamburg). Jedes
Gefäß war mit 1000 µl steriler physiologischer NaCl-Lösung gefüllt. Das
Eppendorfgefäß wurde danach für ungefähr zehn Sekunden gevortext (Reax1, 2400
U/min, Heidolph Elektro GmbH & Co. KG, Kelheim).
28
3.5.2 Antimikrobielle Therapie Für das Einbringen des Photosensibilisators Toluidinblau in die Wurzelkanäle wurden
in allen vier Gruppen Einwegspritzen und Einwegkanülen eingesetzt. Die Kanülen
wurden vorsichtig bis zum ersten apikalen Kontakt der Kanüle mit der Kanalwand
eingeführt und die Kanäle wurden bis zur Schmelz-Zement Grenze mit Toluidinblau
befüllt.
3.5.3 TBO in Aqua Bei den Versuchszähnen dieser Gruppe fand die aPDT gemäß Vorgaben des
Herstellers statt. Dabei wurde das ASEPTIM Plus-System verwendet (Abbildung 18).
Der Photosensibilisator Toluidinblau (Konzentration 17 mg/l, gelöst in Aqua dest)
wurde mittels einer sterilen Einwegspritze mit einer sterilen Einwegkanüle in die
Wurzelkanäle eingeführt. Nach einer Einwirkzeit von 60 Sekunden wurde der Light
Guide Endo Aufsatz (SciCan GmbH, Leutkirch) vorsichtig bis zum ersten apikalen
Kontakt in die aufbereiteten Wurzelkanäle eingeführt, (Abbildung 19 und 20). Es wurde
für 120 Sekunden belichtet (Leistung 200 mW, Wellenlänge 632-644nm). Zum
Herausspülen des Photosensibilisators wurden 2 ml sterile 0,9%ige Natriumchlorid-
Lösung (NaCl) pro Wurzelkanal benutzt (Abbildung 17).
Abb. 17: Ausspülen des Photosensibilisators mit Natriumchlorid-Lösung
29
Abb. 18: ASEPTIM Plus System
(Quelle: scican.de.com)
Abb. 19: Lichtleiter und Handstück des
ASEPTIM Plus Systems
(Quelle: scican.de.com)
Abb. 20: Einbringen des Lichtleiters in
einen Versuchszahn
3.5.4 TBO in Alkohol Bei den Versuchszähnen dieser Gruppe wurde der Photosensibilisator Toluidinblau in
einer Konzentration von 17 mg/l in 90%igem Isopropylalkohol gelöst. Danach erfolgte
die aPDT in identischer Weise. Nach der aPDT wurde bei den Versuchszähnen aus
dieser Gruppe zusätzlich mit jeweils 2 ml 90%igem Isopropylalkohol pro Versuchszahn
nachgespült. Anschließend erfolgte eine Spülung mit 2 ml 0,9 % NaCl Lösung, damit
eventuell noch vorhandene Reste des Isopropylalkohols oder des Photosensibilisators
herausgespült werden konnten.
30
3.5.5 TBO in Aqua + Alkohol In den Versuchszähnen dieser Gruppe wurde zunächst analog zur ersten Gruppe in
destilliertem Wasser gelöstes Toluidinblau in Konzentration von 17 mg/l eingebracht
und anschließend die aPDT durchgeführt.
Nach der aPDT erfolgte eine Spülung mit 2 ml 90%igem Isopropylalkohol. Auch bei
dieser Gruppe wurden die möglicherweise vorhandenen Reste des
Photosensibilisators oder des Isopropylalkohols wie oben beschreiben mit 2 ml
0,9%iger NaCl-Lösung vor der Probenentnahme herausgespült.
3.5.6 Alkohol Die Zähne dieser Gruppe wurden ausschließlich mit 2 ml 90%igem Isopropylalkohol
pro Zahn gespült. Analog zu den vorausgegangenen Gruppen wurde eine
Nachspülung mit 2 ml 0,9%iger NaCl-Lösung nach der Spülung mit Isopropanol
vorgenommen, um mögliche Reste des Alkohols zu entfernen.
3.5.7 Probenentnahme zur Bestimmung der Endkontamination Nach antimikrobieller Therapie erfolgte eine Probenentnahme mit jeweils drei sterilen
Papierspitzen in der Größe ISO 25 (Roeko Coltène/Whaledent GmbH & Co. KG,
Langenau), um die Endkontamination zu erfassen (Abbildung 21). Die Papierspitzen
wurden analog zur vorausgegangenen Ausgangsprobe in Eppendorf-Gefäße mit
jeweils 1000 µl steriler 0,9%-Kochsalzlösung überführt. Das Probengefäß wurde
danach für ungefähr zehn Sekunden gevortext (2400 U/min, Reax1, Heidolph Elektro
GmbH & Co. KG, Kelheim).
31
Abb. 21: Probenentnahme mit einer
Papierspitze nach Desinfektion
3.5.8 Probenentnahme zur Bestimmung der Restkontamination der Dentinspäne Nach dem Desinfektionsvorgang wurden Dentinspäne mit einer ProTaper F3
Handfeile (Dentsply Mailefer, Ballaigues, Schweiz) von jedem Versuchszahn durch
fünf bis sechs ziehend-schabende Bewegungen entnommen. Jede Feile wurde nach
der Entnahme der Dentinspäne in ein steriles 2 ml Eppendorfgefäß übertragen. Das
Eppendorfgefäß war mit 1000 µl steriler 0,9%iger Kochsalzlösung gefüllt. Zusätzlich
wurde eine Probe mit drei sterilen Papierspitzen der ISO Größe 25 (Roeko
Coltène/Whaledent GmbH & Co. KG, Langenau) entnommen und in dasselbe
Eppendorfgefäß überführt, um die Restkontamination zu bestimmen. Diese
Papierspitzen wurden zusammen mit der jeweiligen Feile im Eppendorfgefäß für 10
Sekunden gevortext.
3.6 Anfertigen der Verdünnungsreihen und Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE/ml) Die entnommenen Proben wurden durch die Herstellung von Verdünnungsreihen bis
auf eine Konzentration verdünnt, die das anschließende Auszählen der
koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) ermöglicht. Dafür wurden 100 µl aus
jedem ursprünglichen Eppendorf-Gefäß nach dem Vortexen entnommen und in einem
weiteren Eppendorf-Gefäß mit 900 µl steriler 0,9 % Kochsalzlösung verdünnt. Das
Vorgehen wurde wiederholt, bis eine Konzentration von 10⁻⁵ für die
32
Ausgangskontamination und von 10⁻⁴ für die Endkontamination und für die
Restkontamination der Dentinspäne erreicht wurde (Abbildung 22).
Abb. 22: Schematische Darstellung der Verdünnungsreihen
Modifikation des ursprünglichen Schemas aus:
www.cellcode.us/quotes/serial-dilution-diagram.html
In Vorversuchen konnten geeignete Verdünnungen für das Auszählen der KBE/ml
bestimmt werden. Für die Proben der Ausgangskontamination wurden aus den
Verdünnungen 10⁻³, 10⁻⁴ und 10⁻⁵ jeweils 100 µl auf Columbia-Blut-Agar Platten
(Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene des Universitätsklinikums
Freiburg, Freiburg) pipettiert und mit sterilen Glasplatten verteilt (Abbildungen 23a und
23b).
Die Proben zur Bestimmung der Endkontamination wurden bis Faktor 10⁻⁴ verdünnt.
Hierbei wurden auf identische Weise je 100 µl aus den Konzentrationen 10⁻²,10⁻³, 10⁻⁴
auf Columbia-Blut-Agar Platten ausplattiert (Abbildungen 23c und 23d). Die
Bestimmung der Restkontamination der Dentinspäne erfolgte analog zu den anderen
Proben durch Herstellung einer Verdünnungsreihe bis auf 10⁻³. Die Columbia-Blut-
Agar Platten wurden anschließend für drei Tage unter anaeroben Bedingungen bei
37°C und 5% CO2 im Brutschrank angezüchtet.
Die Auszählung der KBE/ml erfolgte computergestützt mithilfe des Gel-Doc XR (Type
T2A, Bio-Rad Laboratories Inc. Segrate, Milan, Italien), (Abbildung 24). Das
verwendete Auszählungsprogramm war Quantity-One (Bio-Rad Laboratories,
Hercules, California, USA).
Probe
33
a b a b
Abb. 23a: Anfangsprobe TBO in
Aqua Verdünnung
10⁻³
Abb. 23b: Anfangsprobe TBO in
Aqua Verdünnung
10⁻⁴
Abb. 23c: Endprobe TBO in
Aqua Verdünnung
10⁻³
Abb. 23d: Endprobe TBO in
Aqua Verdünnung
10⁻⁴
Abb. 24: Gel-Doc XR Auslesegerät mit laufendem Quantity-One Auszählprogamm
3.8 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der Daten wurde mit STATA 14.2 durchgeführt. Für eine
deskriptive Analyse wurde der Medianwert, der Mittelwert und die
Standardabweichung berechnet.
Es wurden lineare Regressionsmodelle angepasst, um die Unterschiede in der
bakteriellen Kontamination zwischen dem Ausgangswert und dem Endwert unter den
jeweiligen Behandlungsgruppen zu vergleichen. Dabei wurde nach dem
Ausgangswert adjustiert. Für das multiple Testen wurde mittels der Student-Newman-
Keuls's Methode korrigiert.
34
4.Ergebnisse
4.1 Darstellung der Ergebnisse Alle Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 4 im Anhang dargestellt. Tabelle
2 zeigt die Mittelwerte der Ausgangskontamination (AK) und der Endkontamination
(EK) jeder Gruppe in KBE/ml zusammen mit der jeweiligen prozentuellen Effektivität
der bakteriellen Eliminierung und den Werten der Restkontamination der Dentinspäne.
Gruppe AK [KBE/ml] x105
EK [KBE/ml] x105 Effektivität [%] Dentin
[KBE/ml] x105
TBO in Aqua 15,78 2,35 85,1 3,22
TBO in Alkohol + Alkohol
4,56 0,031 * 99,3 0,71
TBO in Aqua + Alkohol 8,36 0,064 * 99,2 0,75
Alkohol 15,83 0,175 * 98,8 1,20
Tab. 2: Darstellung der jeweiligen Gruppe, der durchschnittlichen Ausgangskontamination (AK), der mittleren Endkontamination (EK), der Effektivität der Therapie in jeder Gruppe in % und der Restkontamination der Dentinspäne nach Desinfektion (Dentin); Faktor 105; statistisch signifikante Unterschiede zur TBO in Aqua sind mit [*] markiert; TBO = Toluidinblau O Die höchste antibakterielle Aktivität wurde in der Gruppe TBO in Alkohol mit 99,3 %
festgestellt. Die niedrigste Effektivität konnte in der Gruppe TBO in Aqua mit 85,10 %
nachgewiesen werden. Die Gruppen Alkohol, TBO in Alkohol + Alkohol und TBO in
Aqua + Alkohol zeigten eine durchschnittliche Effektivität von 99,1%. Damit konnte
eine signifikant bessere desinfizierende Wirkung verzeichnet werden, als in der
Gruppe TBO in Aqua. Der niedrigste Wert der Restkontamination der Dentinspäne
wurde in der Gruppe TBO in Alkohol + Alkohol mit 0,71 x 105 KBE/ml bestimmt und
der höchste in der Gruppe TBO in Aqua mit 3,22 x 105 KBE/ml. Bei allen vier Gruppen
zeigte sich eine deutliche Reduktion der bakteriellen Kontamination nach der
entsprechenden Therapie (Abbildung 25 und 26).
35
Abb. 25: Vergleich der mittleren Ausgangskontamination, der Endkontamination und der Restkontamination der Dentinspäne in den vier Gruppen, Angaben in KBE/ml, Faktor 103; statistisch signifikante Unterschiede zur TBO in Aqua sind mit [*] markiert; TBO = Toluidinblau O
Abb. 26: Darstellung der Effektivität der antimikrobiellen Wirkung in den vier Gruppen zusammen mit dem Anteil an noch vorhandenen Bakterien, Angaben in Prozent; statistisch signifikante Unterschiede zur TBO in Aqua sind mit [*] markiert; TBO = Toluidinblau O
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
TBO in Aqua TBO in Alkohol TBO in Aqua dest +Alkohol
Alkohol
Vergleich der mittleren Ausgangs-, End- und Restkontamination
Ausgangskontamination Endkontamination Restkontaination
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
TBO in Aqua TBO in Alkohol TBO in Aqua +Alkohol
Alkohol
Antibakterielle Effektivität in den vier Gruppen
eliminierte Bakterien noch vorhandene Bakterien
KBE/ml [x10
3]
[*] [*] [*]
p-Wert bei [*] < 0,001
Angaben in %
[*] [*] [*]
p-Wert bei [*] < 0,001
36
Vergleich der Reduktion der Kontamination zwischen den Gruppen
Verglichene Gruppen p-Wert
TBO in Aqua / TBO in Alkohol + Alkohol 0.000
TBO in Aqua / TBO Aqua + Alkohol 0.000
TBO in Aqua / Alkohol 0.000
TBO in Aqua + Alkohol / TBO in Alkohol +
Alkohol 0.793
Alkohol / TBO in Alkohol + Alkohol 0.803
Alkohol / TBO Aqua + Alkohol 0.695 Tab. 3a: Darstellung der paarweise durchgeführten Vergleiche der Reduktion der bakteriellen Kontamination für die vier Gruppen
Tabelle 3a zeigt den Vergleich der Reduktion der Kontamination zwischen den
Isopropanol enthaltenden Gruppen und der Gruppe TBO in Aqua. Die festgestellten p-
Werte waren kleiner als das vorab festgelegte Signifikanzniveau von 0,05 (p-Wert <
0,001). Somit hatte die Gruppenzugehörigkeit einen signifikanten Einfluss auf die
Reduktion der Kontamination. Bei dem Vergleich der Reduktion der Kontamination
zwischen den Isopropanol-Gruppen untereinander waren die p-Werte größer als 0,05.
Es lagen keine signifikanten Unterschiede in der antimikrobiellen Wirkung zwischen
diesen Gruppen vor.
37
Vergleich der Restkontamination der Dentinspäne
Verglichene Gruppen p-Wert
TBO in Aqua / TBO in Alkohol + Alkohol 0.000
TBO in Aqua / TBO Aqua + Alkohol 0.000
TBO in Aqua / Alkohol 0.000
TBO in Aqua + Alkohol / TBO in Alkohol +
Alkohol 0.922
Alkohol / TBO in Alkohol + Alkohol 0.554
Alkohol / TBO Aqua + Alkohol 0.350 Tab. 3b: Darstellung der paarweise durchgeführten Vergleiche der Restkontamination der Dentinspäne in den vier Gruppen Tabelle 3b zeigt die Auswertung der Daten aus den entnommenen Dentinspänen.
Beim Vergleich zwischen der Gruppe TBO in Aqua und den anderen Gruppen waren
die p-Werte kleiner als das Signifikanzniveau von 0,05 (p < 0,001). Die
Gruppenzugehörigkeit hatte einen signifikanten Einfluss auf die Restkontamination.
Beim Vergleich der Isopropanol-Gruppen untereinander wurden p-Werte höher als
0,05 festgestellt. Einen signifikanten Unterschied der Restkontamination (p < 0,05)
zwischen den Isopropanol Gruppen konnte nicht ermittelt werden.
Da die Ausgangskontaminationen (AK) der untersuchten Zähne deutliche
Unterschiede zeigten, wurde die antibakterielle Effektivität sowohl anhand des
arithmetischen Mittels, als auch anhand des gewichteten Mittels berechnet.
(gewichtetes Mittel: (Summe (aller AK x Effektivität für jeden Zahn) / Summe aller AK)).
Bei den Versuchszähnen aus der Gruppe TBO in Aqua war die Differenz zwischen
arithmetischem und gewichtetem Mittel 0,05 %. Im Vergleich dazu betrug der
Unterschied in den Effektivitätswerten der anderen drei Gruppen 0,01.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass es zwischen der Gruppe TBO in Aqua
und den Gruppen TBO in Alkohol + Alkohol, TBO in Aqua + Alkohol und Alkohol einen
signifikanten Unterschied sowohl in der bakterienreduzierenden Wirkung, als auch in
der Restkontamination der entnommenen Dentinspäne gab (p-Werte < 0,001).
38
5. Diskussion
5.1 Diskussion von Material und Methode 5.1.1 Verwendung extrahierter menschlicher Zähne In der vorliegenden Studie wurden extrahierte humane Zähne verwendet. Die
menschlichen Zähne unterscheiden sich zwar in Form, Größe, Qualität und Alter,
jedoch liegt die Verwendung humaner Zähne der klinischen Situation deutlich näher
als die Verwendung künstlich hergestellter Proben. Angestrebt wurde eine möglichst
klinisch nahe Versuchssituation mit möglichst guter Standardisierung der
Versuchsbedingungen. Dadurch war es möglich, spezifische Eigenschaften wie
Kanalbeschaffenheit, Bildung von Biofilmen und Interaktion des Farbstoffes
Toluidinblau mit den Biofilmen zu simulieren. Es wurden Zähne mit einem Wurzelkanal
und einem geraden Kanalverlauf verwendet, um den Aufbereitungs- und
Desinfektionsprozess zu standardisieren und somit eine bessere Vergleichbarkeit der
Ergebnisse zu gewähren. Dadurch wurde auch die Gefahr einer Kontamination durch
Nachbarkanäle während der Versuchsdurchführung vermieden. Extrahierte humane
Zähne wurden in vielen früheren Studien verwendet, die sich mit ähnlichen Themen
befassten (Bergmans et al., 2008; Fimple et al., 2008; Foschi et al., 2007a; Garcez et
al., 2007; Meire et al., 2009; Soukos et al., 2006; Souza et al., 2010).
5.1.2 Vorbehandlung der Versuchszähne und maschinelle Aufbereitung Die Zähne wurden vor der Aufbereitung und der Sterilisation in 0,1%iger Thymol-
Lösung bei Raumtemperatur gelagert. So wurden sie vor Austrocknung und vor der
damit zusammenhängenden Versprödung geschützt. Durch die bakterizide Wirkung
des Thymols konnte eine mikrobielle Besiedlung gehemmt beziehungsweise
vermieden werden (Didry et al., 1994).
Durch die mechanische Aufbereitung des Wurzelkanals wird das im Kanal befindliche
Pulpagewebe zusammen mit einem Teil der eingedrungenen Mikroorganismen
entfernt. Ferner wird dadurch das Kanallumen erweitert und die Form des
Wurzelkanals für die anschließende Desinfektion und Wurzelkanalfüllung vorbereitet
(“Qualitätsrichtlinien für die endodontische Behandlung”, Europäische Gesellschaft für
Endodontie, 2006). Zusätzlich wurde durch das Aufbereiten ein besserer Zugang zum
39
Wurzelkanal für das verwendete aPDT-System (ASEPTIM Plus, SciCan GmbH,
Leutkirch) geschaffen.
Analog zu Studien mit einem ähnlichen Versuchsaufbau wurden die Versuchszähne
mit dem ProTaper System maschinell aufbereitet (Bago et al., 2013; Ghorbanzadeh et
al., 2018; Tennert et al., 2015). Dabei wurde 3%iges Natriumhypochlorit (NaOCl) als
Spüllösung verwendet, um die Bakterienlast in den Kanälen während der
Instrumentierung weiter zu reduzieren. Anschließend wurde Natriumthiosulfat als
letzte Spülung verwendet, um im Kanal verbliebenes NaOCl zu neutralisieren. Durch
die Spülungen konnten Dentinspäne, Gewebereste und die Schmierschicht (smear-
layer) ebenfalls entfernt werden. Die Schmierschicht bedeckt die Kanalwände nach
der Aufbereitung und enthält Mikroorganismen, die eine Reinfektion des Endodonts
bewirken können (Torabinejad et al., 2002).
Nach der Instrumentierung der Wurzelkanäle, wurden die Versuchszähne in Kunststoff
eingebettet und sterilisiert. Das apikale Foramen wurde vor dem Einbetten mit
Kunststoff dicht verschlossen, um ein Herausfließen der Nährlösung nach apikal sicher
vermeiden zu können. Zusätzlich konnte sichergestellt werden, dass keine Bakterien
von der äußeren Zahnoberfläche in das Kanalinnere eindringen konnten. Mit dem
Einbetten der gesamten Wurzel der Versuchszähne in Kunststoff wurden auch alle
eventuell vorhandenen lateralen Kanäle verschlossen. Außerdem wurde ein möglichst
kontaminationsfreies Arbeiten durch das Einbetten der Versuchszähne ermöglicht, da
die Wurzeloberfläche auf diese Weise geschützt war. Dieses Vorgehen wurde in
früheren Studien mit einem vergleichbaren Aufbau verwendet (Bago et al., 2013;
Tennert et al., 2015).
5.1.2 Enterococcus faecalis als Versuchskeim Das Bakterium Enterococcus faecalis wird häufig als Versuchskeim in
wissenschaftlichen Studien verwendet, da es viele Vorteile bietet. Der Keim ist
fakultativ anaerob und kann sowohl in aeroben als auch in anaeroben Verhältnissen
gut wachsen. In vitro ist er daher leicht zu züchten und zeigt ein schnelles Wachstum.
E. faecalis ist fähig den gesamten Wurzelkanal zu kolonisieren, die Dentintubuli tief zu
durchdringen und auch bei einer begrenzten Substratzufuhr zu überleben (Duggan
und Sedgley, 2007; Love, 2001; Sedgley et al., 2005; Stuart et al., 2006b).
40
Der Keim spielt eine bedeutende Rolle bei endodontischen Infektionen, da er sowohl
bei Primär- als auch bei Sekundärinfektionen isoliert werden konnte. Er ist vor allem
mit endodontischen Misserfolgen und mit der Entwicklung apikaler Parodontitiden
assoziiert (Hancock et al., 2001; Love, 2001; Rôças et al., 2004). E. faecalis konnte
häufig als dominierende Spezies bei chronischen apikalen Entzündungen isoliert
werden, was seine Fähigkeit zur Aufrechterhaltung einer periapikalen Infektion
bestätigt (Peciuliene et al., 2001; Zhang et al., 2015). Die Eliminierung von E.faecalis
aus dem Wurzelkanalsystem ist schwierig, da das Bakterium sehr effektive
Mechanismen besitzt, die es gegenüber Desinfektionsmitteln und einigen Antibiotika
widerstandsfähig machen (Evans et al., 2002). Ein solcher Mechanismus ist die
Bildung eines Biofilms, wodurch der Keim vor äußeren Einflüssen viel besser
geschützt ist. Aufgrund seiner ausgeprägten Adhärenzeigenschaften kann E. faecalis
leicht Biofilme bilden (Denotti et al., 2009; Kayaoglu et al., 2005).
Generell gilt für die Biofilme, dass sie den darin befindlichen Mikroorganismen Schutz
bieten, deren Kommunikation erleichtern und deren Anfälligkeit für antibakterielle
Substanzen reduzieren (Kishen et al., 2006). Der Biofilm wirkt als Diffusionsbarriere
und erschwert das Durchdringen von antibakteriell wirkenden Substanzen (Jhajharia
et al., 2015). Eine antibakterielle Therapie soll deswegen zum Ziel haben, den Biofilm
in seiner Struktur zu stören und im optimalen Fall zu seiner kompletten Entfernung zu
führen.
E. faecalis ist aufgrund seiner besonderen Eigenschaften ein beliebter Keim für die
Untersuchung antimikrobieller Strategien in der Endodontie geworden (Cheng et al.,
2012; Diogo et al., 2017; Garcez et al., 2015; Meire et al., 2012).
5.1.5 Infektions- und Desinfektionsvorgang In der vorliegenden Studie wurde die antimikrobielle Wirkung der aPDT auf E. faecalis
untersucht. Die Biofilmbildung dieses Bakteriums wurde in zahlreichen Studien
erforscht (Duggan und Sedgley, 2007; Jhajharia et al., 2015; Svensäter und
Bergenholtz, 2004). In einer Studie wurde schon nach zwei Tagen Inkubation ein
Biofilm nachgewiesen (Mohamed und Huang, 2007). Ferner konnte in einer anderen
Untersuchung festgestellt werden, dass die Wurzelkanaloberfläche bereits nach drei
Tagen mit E. faecalis vollständig besiedelt war (Foschi et al., 2007b). Die in der
Literatur beschriebene Eindringtiefe von E. faecalis in die Dentintubuli extrahierter
41
Zähne betrug zwischen 400 µm und 500 µm nach drei Tagen (Haapasalo und Ørstavik,
1987; Siqueira et al., 1996).
Um eine ausreichende Besiedlung des Kanallumens zu erreichen wurde die
Inkubationszeit in dieser Studie auf vier Tage festgelegt. Als Nährmedium wurde
Tryptic Soy Broth (TSB) verwendet, das auch in anderen Studien mit einem
vergleichbaren Studienaufbau eingesetzt wurde (Awawdeh et al., 2009; Jhamb et al.,
2010). Um ausreichendes Substratangebot für das bakterielle Wachstum und das
Vermehren zu gewährleisten, wurde das Nährmedium alle 24 Stunden gewechselt.
Damit sterile Arbeitsbedingungen sichergestellt werden konnten, wurde der Wechsel
der TSB-Lösung an einer Sicherheitswerkbank durchgeführt.
Die Verwendung des aPDT Systems (ASEPTIM Plus, SciCan GmbH, Leutkirch)
erfolgte in allen Gruppen gemäß Angaben des Herstellers. Weder die Belichtungszeit
(120 Sekunden), noch die Wellenlänge (637 nm) wurden verändert. Es wurde eine
Toluidinblau O Lösung in Konzentration von 17 mg/l in destilliertem Wasser hergestellt,
die identisch zu der vom Hersteller (SciCan GmbH, Leutkirch) angebotenen
Photosensibilisator-Lösung war. Das Toluidinblau O wurde in gleicher Konzentration
für die anderen drei Gruppen mit dem jeweiligen Lösungsmittel verdünnt. Die in der
Literatur für Toluidinblau erwähnten Konzentrationen betragen zwischen 15 µg/ml und
12,5 mg/ml (Siddiqui et al., 2013).
5.1.3 Isopropylalkohol als Lösungs- und Desinfektionsmittel Der genaue Wirkungsmechanismus von Isopropylalkohol ist noch nicht vollständig
geklärt. Bekannt ist, dass er leicht durch die bakterielle Zellwand diffundiert, einen
unspezifischen denaturierenden Effekt auf bakterielle Proteine und DNA ausübt und
Lipoprotein-Membranen auflöst. Ferner kommt es zur Hemmung der bakteriellen
Ribosomen und der RNA-Polymerase, wodurch die Proteinbiosynthese beeinträchtigt
wird (Boyce JM, 2018). Der bakterizide Effekt des Isopropanols scheint gegenüber
anaeroben Bakterien ausgeprägter zu sein als gegenüber aeroben Spezies (Prince et
al., 1969).
Ferner wurde vermutet, dass eine bessere Trocknung des Kanals und eine damit
verbundene verbesserte Benetzung des Sealers aufgrund der niedrigen
Oberflächenspannung und des austrocknenden Effekts von Isopropanol erreicht
werden konnten (Dias et al., 2014). Somit lässt sich vermuten, dass der
Isopropylalkohol die Oberfläche des Wurzelkanals benetzt und die Dentintubuli
42
infiltriert. Das verbesserte Erreichen der engen Kanalabschnitte, der akzessorischen
Kanäle und der Dentintubuli könnte eine Rolle in der signifikant besseren Reduktion
der bakteriellen Kontamination in den Gruppen mit Isopropanol-Spülung gespielt
haben.
In der Gruppe TBO in Alkohol + Alkohol wurde der Photosensibilisator (PS) in
90%igem Isopropylalkohol gelöst. Anhand der erwähnten Eigenschaften des
Isopropanols, kann angenommen werden, dass der PS enge Kanalabschnitte besser
erreichen und dadurch eine effektivere Wirkung der aPDT erzielen konnte. Für die
Isopropanol-Gruppen lässt sich vermuten, dass die Kombination aus der besseren
Benetzung der Kanalwände und der eigenen desinfizierenden Wirkung des
Isopropylalkohols eine Rolle bei der höheren antibakteriellen Effektivität gespielt hat.
Ferner ist es möglich, dass der Isopropanol den Biofilm zum Teil aufgelöst hat und
dadurch ein besseres Eindringen des Photosensibilisators in den Biofilm ermöglicht
hat. Diese verbesserte Diffusion könnte dem Photosensibilisator erlauben, tiefere
Schichten des Biofilms zu erreichen und nach der Lichtaktivierung seine bakterizide
Wirkung besser zu entfalten. Das könnte ein weiterer Grund für die höhere bakterielle
Elimination in den Gruppen mit Isopropanol als Lösungsmittel gewesen sein. Es liegen
allerdings nur wenige Studien vor, die die Effekte von Isopropylalkohol auf E. faecalis
– Biofilmen konkret untersucht haben. Eine Studie zeigte, dass Isopropylalkohol einen
hemmenden Effekt auf die Bildung und Haftung von Biofilmen des Staphylococcus
Warneri und Staphylococcus Sciuri in vitro hatte (Zineb et al., 2014).
Bei der Beurteilung der Ergebnisse aus den Isopropanol-Gruppen ist ein weiterer
Faktor zu beachten. Im Anschluss an der antimikrobiellen Therapie und vor der
Probenentnahme wurden die Kanäle mit 0,9 %iger NaCl Lösung gespült, um die Reste
des Isopropanols und des Photosensibilisators aus dem Wurzelkanal zu entfernen. Es
besteht die Wahrscheinlichkeit, dass Teile davon nicht komplett entfernt und von den
Papierspitzen aufgenommen wurden. Dadurch konnte sich eine weitere antibakterielle
Wirkung innerhalb der Papierspitzen entfaltet haben. Somit ist es möglich, dass eine
falsch negative Papierspitzenprobe in manchen Proben vorgetäuscht worden wäre.
43
5.1.6 Entnahme der Proben und Erfassung der koloniebildenden Einheiten/ml Die Entnahme der Proben erfolgte analog zu früheren Studien mit ähnlicher
Fragestellung mithilfe steriler Papierspitzen (Atila-Pektaş et al., 2013; Javidi et al.,
2014; Miranda et al., 2013).
Bei der antimikrobiellen Therapie der Zähne bestand die Gefahr, dass die im
Kanallumen in planktonischer Form vorhandenen Bakterien die Wirkung der aPDT auf
den wandständigen Biofilm abschwächten. Um den planktonischen Anteil der
Bakterien zu entfernen, wurde eine Spülung mit 0,9%iger Natriumchlorid Lösung vor
jedem Therapievorgang durchgeführt. Die anschließende Probenentnahme zur
Erfassung der Ausgangskontamination erfolgte mit jeweils drei Papierspitzen. Es lässt
sich mit hoher Wahrscheinlichkeit annehmen, dass eine repräsentative Anzahl der im
Biofilm vorhandenen Bakterien durch den Kontakt der Papierspitzen mit der
Kanalwand erfasst wurde.
Damit ein Vergleich zwischen den Gruppen bezüglich deren antimikrobiellen Aktivität
möglich war, wurden alle Probenentnahmen in gleicher Weise durchgeführt. Es war
weiterhin wichtig zu beachten, dass die Ausgangsprobe vorsichtig durchgeführt wurde,
um den vorhandenen Biofilm mit den Papierspitzen nicht zu beschädigen, jedoch eine
Aussage über die Kontamination im Kanal machen zu können. Unmittelbar nach der
jeweiligen Therapie erfolgte die Probenentnahme zur Bestimmung der
Endkontamination und daran schloss sich die Erfassung der Restkontamination des
Kanalwanddentins an. Somit wurde die klinische Situation direkt nach der Aufbereitung
des Wurzelkanals simuliert.
Die Probenentnahme mit Papierspitzen besitzt allerdings bestimmte Nachteile, die
beachtet werden müssen. Die Papierspitzen können trotz deren feinen
Oberflächenbeschaffenheit in die akzessorischen Kanäle oder in die Dentintubuli nicht
eindringen. Bakterien, die sich in diesen Abschnitten des Wurzelkanals befinden,
können deswegen durch die Papierspitzen nicht erfasst werden. Das hat als Folge,
dass bei einer negativen Papierspitzenprobe nicht direkt von einer Keimfreiheit im
Wurzelkanalsystem gesprochen werden kann. Aus diesem Grund wurden
Dentinspäne in der vorliegenden Studie im Anschluss an die Probenentnahme nach
der Therapie mithilfe einer ISO 25 K-Feile (VDW GmbH, München) abgetragen und es
erfolgte eine dritte Probenentnahme. Auf diese Weise konnte die Restkontamination
der Dentintubuli genauer bestimmt werden.
44
Die entnommenen Bakterienproben wurden auf Blutagar-Platten kultiviert und die
quantitative Analyse der bakteriellen Belastung erfolgte durch Bestimmung der
koloniebildenden Einheiten (KBE). Diese Methode wurde in zahlreichen früheren
Studien mit ähnlicher Thematik angewendet (Lucena et al., 2013; Madhubala et al.,
2011; Rios et al., 2011; Singla et al., 2010).
Für den Nachweis von E. faecalis existieren auch andere Techniken wie zum Beispiel
die quantitative Polymerase-Ketten-Reaktion (quantitative polymerase chain reaction,
qPCR) und die reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) die laut Studien sensibler sind,
als die Kultivierung auf Blutagar-Platten (Gomes et al., 2008; Siqueira und Rôças,
2004; Williams et al., 2006). Durch die Verwendung dieser Techniken ist es möglich,
E. faecalis in Proben nachzuweisen, bei denen die Kultivierung eine negative Probe
ergeben hätte (Williams et al., 2006). Die Verwendung der PCR zum Nachweis
bakterieller DNA bringt allerdings den Nachteil mit sich, dass dadurch zwischen der
DNA aus lebendigen und dieser aus toten Bakterien nicht unterschieden werden kann
(Brundin et al., 2010). Das hätte in der vorliegenden Studie zu falsch positiven
Ergebnissen führen können und es wäre somit nicht mehr möglich, eine Aussage über
die Anzahl von lebendigen Bakterien in einer bestimmten Probe zu treffen. Man hätte
nur noch nachweisen können, ob E. faecalis bzw. bakterielle Bestandteile des Keims
in der Probe vorhanden waren oder nicht. Ein Vergleich der antimikrobiellen Effektivität
zwischen den vier Gruppen dieser Studie wäre damit nicht mehr möglich.
5.2 Diskussion der Ergebnisse Die Wurzelkanäle der Versuchszähne wurden durch die Bakterien nachweisbar
kolonisiert. Zwischen den vier Gruppen und innerhalb der einzelnen Gruppen traten
Unterschiede in der Ausgangskontamination (AK) trotzt der möglichst gleichen
Bedingungen auf. Die festgestellten Unterschiede der bakteriellen Besiedlung
innerhalb und zwischen den Gruppen lassen sich durch verschiedene Faktoren
erklären. Zum einen war es durch die Verwendung humaner Zähne unumgänglich,
dass es Differenzen in der Anatomie der Zähne gab. Ferner gab es Variationen in den
Zahn- und Wurzellängen. Die Abweichungen in der Ausgangskontamination erlaubten
allerdings einen Vergleich der Effektivität der untersuchten Therapiemethoden bei
verschiedenen Ausgangssituationen.
45
Die Endkontamination wurde für alle Zähne direkt im Anschluss an die jeweilige
Therapie bestimmt, was einen signifikanten Vergleich der antibakteriellen Effektivität
zwischen den Gruppen ermöglichte.
Alle vier Desinfektionsmethoden zeigten eine deutliche Reduktion der bakteriellen
Kontamination innerhalb der Kanäle. Die Gruppen TBO in Alkohol + Alkohol, TBO in
Aqua + Alkohol und Alkohol, zeigten eine signifikant höhere keimreduzierende
Effektivität (p < 0,05) als die Gruppe TBO in Aqua.
In TBO in Alkohol + Alkohol konnte in 87% der Proben keine bakterielle Kultur
nachgewiesen werden. In TBO in Aqua + Alkohol waren 33% der Proben ohne positive
Bakterienkultur. In der Gruppe TBO in Aqua und in der Gruppe Alkohol konnte in keiner
der Proben eine bakterienfreie Kultur nachgewiesen werden. Eine negative
Bakterienkultur bedeutet jedoch nicht, dass eine vollständige Sterilität der
Wurzelkanäle erreicht worden ist.
Die Ergebnisse der Studie deuten darauf hin, dass die antibakterielle Effektivität des
aPDT-Verfahrens in der Gruppe TBO in Aqua den anderen unterlegen war. Dennoch
konnte für diese Gruppe eine Keimreduktion um 85% nachgewiesen werden, wodurch
eine deutliche Reduktion der im Biofilm vorhandenen Bakterien erreicht wurde. In einer
früheren Studie mit einem vergleichbaren aPDT-System (Leistung: 100mW,
Wellenlänge: 635 nm) wurde eine antibakterielle Effektivität von 88,4 % erreicht
(Bergmans et al., 2008).
Für eine effektive Photosensibilisierung muss der Farbstoff in ausreichender
Konzentration im Wurzelkanal vorhanden sein (Konopka und Goslinski, 2007). Andere
Faktoren, die einen Einfluss auf das zytotoxische Potenzial eines Farbstoffes ausüben,
sind dessen Diffusions- und Benetzungsfähigkeit, seine Penetrationstiefe innerhalb
eines Biofilms, das verwendete Lösungsmittel, die Adsorption an Membranen, die
Kontaktzeit, dessen Absorptionsmaximum und seine Fähigkeit zur Erzeugung von
reaktiven Sauerstoffspezies (Bergmans et al., 2008; Kishen, 2010; Khandge et al.,
2013).
Sollte der Photosensibilisator nur oberflächlich in den Biofilm eindringen können, oder
falls sich die Strahlen des verwendeten Licht-Systems nicht in der kompletten
Ausdehnung des Biofilms ausbreiten können, werden Bakterien in tieferen Schichten
des Biofilms nicht eliminiert (Siddiqui et al., 2013). Neben den Eigenschaften des
Photosensibilisators spielen auch die Charakteristiken des verwendeten
46
Belichtungssystems eine Rolle. Die Wellenlänge des emittierten Lichtes, die Leistung
der Lichtquelle, die Belichtungszeit und die Inkubationszeit des Farbstoffes sind
zusammen mit dem verwendeten Lichtleiter ebenfalls von entscheidender Bedeutung
(Chiniforush et al., 2016). Das in der vorliegenden Studie verwendete LED System
(ASEPTIM Plus, SciCan GmbH, Leutkirch) emittiert Licht mit einer Wellenlänge von
635 nm mit einer maximalen Leistung von 750 mW und befindet sich im Vergleich zu
den in anderen Studien verwendeten Systemen im Bereich der leistungsstärkeren
PDT-Systeme (Hecker et al., 2013; Poggio et al., 2011; Souza et al., 2010). Mit 120
Sekunden war die Belichtungsdauer der vorliegenden Studie im Vergleich zu den
anderen in der Literatur vorhandenen Untersuchungen im mittleren Bereich. Andere
Autoren berichten von Belichtungszeiten zwischen 10 Sekunden und 3 Minuten
(Bergmans et al., 2008; Gergova et al., 2016; Hecker et al., 2013; Meire et al., 2012).
In Bezug auf die Wirkung der aPDT, wurden unterschiedliche Ergebnisse je nach
Studie abhängig von der Belichtungszeit dokumentiert. In einer Studie führte zwar die
verlängerte Bestrahlung zu einer verbesserten Desinfektion, die Unterschiede waren
aber statistisch nicht signifikant (Xhevdet et al., 2014). Eine andere Untersuchung
berichtete hingegen über fast identische antibakterielle Effektivität von 99,8% bis
99,9% bei Belichtungszeiten von 1, 2 und 4 Minuten (Yildirim et al., 2013).
Zwei Studien verglichen die bakterielle Reduktion zwischen der alleinigen chemo-
mechanischen Desinfektion mit 2,5%igem Natriumhypochlorid und der Verwendung
der aPDT in Kombination mit der chemo-mechanischen Aufbereitung. Beide Studien
konnten keine signifikante bakterielle Elimination durch die kombinierte Therapie
feststellen (Miranda et al., 2013; Souza et al., 2010). Eine mögliche Erklärung dieser
Ergebnisse ist die geringe Sauerstoffkonzentration in den Wurzelkanälen,
insbesondere in den Dentintubuli und in Unregelmäßigkeiten der
Kanalwandmorphologie, wie Isthmen und Ramifikationen (Plotino et al., 2019). Unter
solchen Verhältnissen kann die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies reduziert oder
sogar unmöglich sein. Ferner ist die Diffusion des Photosensibilisators in den
Dentintubuli oder in schwer zugänglichen Biofilmen erschwert. Diese Faktoren können
einen negativen Einfluss auf die Effektivität der photodynamischen Therapie ausüben
(Plotino et al., 2019). Es wurde ferner behauptet, dass die Eliminierung von Bakterien
in etablierten Biofilmen erschwert ist (Bonsor et al., 2006; Lim et al., 2009).
Verantwortlich dafür könnte die höhere Dichte des Biofilms sein, die sowohl die
47
Lichtausbreitung hemmt, als auch die Diffusion des Photosensibilisators erschwert.
Grampositive Bakterien wie E. faecalis besitzen verschiedene Virulenzfaktoren.
Lipoteichonsäure ist ein sehr potenter Virulenzfaktor, der vom Bakterium produziert
wird (Baik et al., 2008). Nach den durchgeführten Desinfektionsvorgängen könnten
Antigene, wie Lipoteichonsäure, in den Wurzelkanälen verbleiben und somit in einem
klinischen Szenario ein potenzielles Risiko für eine refraktäre apikale Parodontitis
darstellen. Die in der Literatur beschriebenen Präparate, die gegenüber
Lipoteichonsäure wirksam sind, sind Kalziumhydroxid und Chlorhexidin (Baik et al.,
2008b; Lee et al., 2009).
Wiederholte Desinfektionsdurchläufe oder Therapien mit unterschiedlichen
Belichtungszeiten wurden in der vorliegenden Studie nicht durchgeführt, da der Fokus
auf dem Vergleich der aPDT-Wirkung zwischen den vier Gruppen unter
gleichbleibenden Bedingungen gelegt war.
Aus den vorhandenen Ergebnissen der vorliegenden Studie lässt sich schließen, dass
eine signifikante Reduktion der bakteriellen Belastung durch E. faecalis in allen vier
Gruppen erzielt werden konnte. Dabei zeigten die Gruppen TBO in Alkohol + Alkohol,
TBO in Aqua + Alkohol und Alkohol im Vergleich zur Gruppe TBO in Aqua eine
signifikant höhere bakterielle Elimination. Nach dem Vergleich der Daten aus den
Isopropanol-Gruppen konnte allerdings keinen signifikanten Einfluss der
Gruppenzugehörigkeit auf die antimikrobielle Aktivität nachgewiesen werden. Die p-
Werte waren größer als das vorab definierte Niveau von p > 0,05. Die Ergebnisse
dieser Studie deuten somit auf eine Optimierung der antibakteriellen Wirkung der
aPDT durch das Anwenden von 90 % Isopropylalkohol. Es ist möglich, dass die
bessere antimikrobielle Wirkung primär ein Resultat aus der bakteriostatischen
Aktivität des Isopropanols ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die aPDT sowohl in ihrer
Standarddurchführung als Lösung von Toluidinblau O in destilliertem Wasser, als auch
in den jeweiligen Kombinationen mit Isopropylalkohol eine statistisch signifikante
bakterielle Reduktion innerhalb der Wurzelkanäle erreichen konnte. Weitere
Untersuchungen sind notwendig, um die Wirkung von Isopropylalkohol in Kombination
mit Toluidinblau O auf die Effektivität der aPDT genauer zu untersuchen. Wie in
anderen Studien mit vergleichbarer Thematik schon beschrieben worden ist, kann die
aPDT als eine adjuvante Desinfektionsmethode zusätzlich zu den etablierten
48
Spülprotokollen während einer Wurzelbehandlung angewendet werden. (Arneiro, A.
S. et al., 2014; Bergmans et al., 2008; Bonsor et al., 2006; Soukos et al., 2006). Die
alleinige desinfizierende Wirkung der aPDT mit TBO in destilliertem Wasser hat aber
eine niedrigere antibakterielle Effektivität als Natriumhypochlorid und kann keine
suffiziente Keimfreiheit im Wurzelkanal erreichen. Die zusätzliche Anwendung von
Isopropylalkohol als Lösungsmittel für den Photosensibilisator oder als Nachspülung
lieferte in der vorliegenden Studie sehr gute Ergebnisse. Aufgrund der erwähnten
eventuellen Problematik der Papierspitzenproben muss diese Methode allerdings
weiter untersucht werden, bevor eine konkrete Aussage bezüglich deren klinischen
Anwendbarkeit getroffen werden kann.
49
6. Zusammenfassung Ziel der vorliegenden Studie war die Untersuchung der antimikrobiellen
photodynamischen Therapie (aPDT) auf E. faecalis unter Verwendung von
Isopropylalkohol als Lösungsmittel in künstlich infizierten Wurzelkanälen.
Die Wurzelkanäle von 60 extrahierten humanen Frontzähnen wurden mit dem
ProTaper Universal System (Dentsply Mailefer, Ballaigues, Schweiz) aufbereitet.
Anschließend wurden die Zähne in Methacrylat eingebettet und im Autoklav sterilisiert.
Es erfolgten sowohl die Infektion mit einem klinischen Isolat des E. faecalis als auch
die Inkubation der Zähne für vier Tage im Brutschrank. Danach wurde die
Ausgangskontamination mit Papierspitzen bestimmt. Die Zähne wurden in vier
Gruppen aufgeteilt. Bei der Gruppe TBO in Aqua wurde der Photosensibilisator (PS)
Toluidinblau O (TBO) in destilliertem Wasser gelöst und anschließend wurde die aPDT
(ASEPTIM Laser, SciCan GmbH, Leutkirch, Wellenlänge 635 nm, Belichtungszeit
120s) durchgeführt. In der Gruppe TBO in Alkohol + Alkohol wurde 90 % Isopropanol
als Lösungsmittel für den PS verwendet und anschließend an der aPDT erfolgte eine
Spülung mit 2 ml 90 % Isopropanol. Bei der Gruppe TBO in Aqua + Alkohol wurde der
PS in destilliertem Wasser gelöst und nach der aPDT erfolgte eine Spülung mit 2 ml
90 % Isopropanol. Bei der Gruppe Alkohol wurde ausschließlich mit 90%igem
Isopropylalkohol gespült. Nach der antimikrobiellen Therapie erfolgte eine
Probenahme mit sterilen Papierspitzen zur Bestimmung der Kontamination. Danach
wurde jeder Kanal mit einer sterilen Handfeile (ISO Größe 25) instrumentiert und mit
sterilen Papierspitzen wurde eine weitere Probe entnommen, um die
Restkontamination des Kanalwanddentins zu bestimmen. Die Proben wurden auf
Blutagar-Platten kultiviert und anschließend wurden die koloniebildenden Einheiten
(KBE) ausgezählt. In der Gruppe TBO in Aqua (konventionelle aPDT) konnte eine
Effektivität von 85% nachgewiesen werden. In den Gruppen TBO in Alkohol und TBO
in Aqua + Alkohol betrug die Reduktion der bakteriellen Kontamination jeweils 99%.
Die Gruppe Alkohol zeigte ebenfalls eine bakterielle Reduktion von 99%.
Die aPDT erreichte in jeder Gruppe eine statistisch signifikante Reduktion der
bakteriellen Kontamination mit E. faecalis. Die Gruppen TBO in Alkohol + Alkohol, TBO
in Aqua + Alkohol und Alkohol zeigten eine signifikant höhere Reduktion der
bakteriellen Kontamination im Vergleich zur konventionellen aPDT in der Gruppe TBO
in Aqua.
50
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Stellungnahme DGZMK V 1.0 Stand 11/00. Gemeinsame Stellungnahme der DGZMK und der DGZ
62
8. Anhang
8.1 Übersicht Versuchsaufbau 1. Entfernung von Konkrementen und Geweberesten von den Zähnen
2. Kürzung der Zahnkrone bis zur Schmelz-Zement-Grenze
3. Bestimmen der Zahnlänge und Arbeitslänge
4. Maschinelle Aufbereitung des Wurzelkanals mit ProTaper-Instrumenten
5. Dampf-Sterilisation verpackt bei 134 °C für 15 min
6. Apikaler Verschluss der Zähne mit 3M Scotchbond Universal und x-flow
7. Einbetten der Zähne in Kunststoff Technovit 4071
8. Dampf-Sterilisation der Zähne verpackt bei 134 °C für 15 min
9. Probenentnahme mit Papierspitzen zur Überprüfung der Sterilität vor Beimpfen
10. Beimpfung der Zähne mit E. faecalis in TSB Nährlösung
11. Vier Tage Biofilmbildung mit einem täglichen Wechsel des Nährmediums
12. Randomisierte Zuteilung der Versuchszähne in vier Gruppen zu je 15
Versuchszähnen
13. Probenentnahme zur Bestimmung der Ausgangskontamination
14. Durchführung der Therapie
15. Probenentnahme zur Bestimmung der Endkontamination
16. Probenentnahme zur Bestimmung der Dentinkontamination
17. Anfertigen der Verdünnungsreihen
18. Ausplattieren der Verdünnungen auf Columbia-Blut-Agarplatten
19. Anzüchten der Kolonien im Brutschrank für 3 Tage
20. Bestimmung der KBE/ml
63
8.2 Tabellen Die Aufteilung der Ergebnisse in Tabelle 4 erfolgte nach Versuchsgruppen und die
Sortierung nach aufsteigender Ausgangskontamination (AK) in KBE/ml (KBE =
koloniebildende Einheiten). KBE =
koloniebildende Einheiten
Ausgangswert der KBE Endwert der KBE
Prozentuale Verringerung der
KBE: Ausgang- zu Endwert
KBE aus Dentinspänen
Zahn Durchschnitt auf 10ˆ-3 Durchschnitt auf 10ˆ-3 Durchschnitt auf 10ˆ-3 Toluidinblau in Aqua dest. gelöst
1 1308 156 -88,07% 357 2 837 46 -94,5% 270 3 4000 534 -86,65% 235 4 629 48 -92,36% 430 5 3245 297 -90,84% 246 6 778 118 -84,83% 448 7 3238 901 -72,17% 297 8 1208 316 -73,84% 385 9 2997 256 -91,45% 271
10 876 68 -92,23% 413 11 638 195 -69,43% 336 12 1539 246 -84,01% 303 13 1180 136 -88,47% 348 14 612 178 -70,91% 276 15 589 41 -93,03% 221
Toluidinblau in 90% Isopropanol gelöst + Spülung mit 90% Isopropanol + Nachspülung mit 0,9% NaCl Lösung 1 151 0 -100% 68 2 731,5 0 -100% 5,5 3 1253 0 -100% 2,5 4 550 0 -100% 17 5 393 0 -100% 37 6 713 0 -100% 58 7 291 0 -100% 11 8 144 2 -98,66% 2 9 268 0 -100% 0
10 167 45 -73,05% 111 11 978 0 -100% 2,5 12 95 0 -100% 2,5 13 125 0 -100% 666 14 173 0 -100% 76 15 814 0 -100% 8
Toluidinblau in Aqua dest. gelöst + Spülung mit 90% Isopropanol + Nachspülung mit 0,9% NaCl Lösung 1 259 0 -100% 58 2 1545 0 -100% 9,75 3 238 0 -100% 12,3 4 833 0 -100% 3 5 1079 0 -100% 347 6 1953 0,33 -99,98% 214 7 353 0,33 -99,99% 37 8 790 8 -98,98% 50 9 870 14,6 -98,32% 7,6
10 1941 20 -98,96% 39 11 660 17 -97,42% 35 12 385 6 -98,44% 14 13 188 5 -98,44% 142 14 420 0,6 -99,85% 104 15 1039 25 -97,59% 64
Spülung ausschließlich mit 90% Isopropanol + Nachspülung mit 0,9% NaCl Lösung 1 5990 5,8 -99,9% 80 2 1233 65,3 -94,7% 214 3 1477 40 -97,29% 38 4 133,6 1,1 -99,17% 8,4 5 618,3 2,6 -99,57% 10 6 177,3 1,1 -99,06% 460 7 321 1,16 -99,63% 50 8 195,2 1,3 -99,33% 467 9 5018 4,9 -99,90% 76
10 341 1,3 -99,61% 45 11 1376 71 -94,84% 231 12 645 2,8 -99,56% 12 13 1635 58 -96,45% 43 14 167 2 -98,80% 9 15 4420 4,3 -99,90% 59
Tab. 4: Versuchsergebnisse aller Zähne aus den vier Gruppen
64
TBO in Aqua TBO in Alkohol TBO in Aqua + Alkohol Alkohol
1. Entfernen des
Nährmediums
2. Probenentnahme
Ausgangswert
3. aPDT
4. Spülung mit 2 ml
0,9% NaCl
5. Probenentnahme
Endwert
6. Probenentnahme
Dentinwert
1. Entfernen des
Nährmediums
2. Probenentnahme
Ausgangswert
3. aPDT
4. Spülung mit 2 ml
90 %
Isopropylalkohol
5. Spülung mit 2 ml
0,9 % NaCl
6. Probenentnahme
Endwert
7. Probenentnahme
Dentinwert
1. Entfernen des
Nährmediums
2. Probenentnahme
Ausgangswert
3. aPDT
4. Spülung mit 2 ml
90 %
Isopropylalkohol
5. Spülung mit 2 ml
0,9% NaCl
6. Probenentnahme
Endwert
7. Probenentnahme
Dentinwert
1. Entfernen des
Nährmediums
2. Probenentnahme
Ausgangswert
3. Spülung mit 2 ml
90 %
Isopropylalkohol
4. Spülung mit 2 ml
0,9 % NaCl
5. Probenentnahme
Endwert
6. Probenentnahme
Dentinwert Tab. 5: Schematischer Ablauf des Versuches für jede Gruppe
65
TBO in Aqua
Variable N Mittelwert [x10-3]
Standard-abweichung
[x10-3] Min [x10-3] Max [x10-3]
AK 15 1578.2 1169.8 589 4000
EK 15 235.7 225.9 41 901
Diff. (EK-AK) 15 -1342.5 -1009.3 -434 -3466
Dentin 15 322.4 72.6 221 448
Tab. 6a: Anzahl der Proben (N), Mittelwerte, Standardabweichungen, minimaler (Min),
maximaler (Max) Wert der Ausgangskontamination (AK) und Endkontamination (EK),
Differenz zwischen EK und AK, Restkontamination der Dentinspäne (Dentin) in
KBE/ml nach 10-3-facher Verdünnung für die Gruppe TBO in Aqua
TBO in Alkohol + Alkohol
Variable N Mittelwert [x10-3]
Standard-abweichung
[x10-3] Min [x10-3] Max [x10-3]
AK 15 456.4 363.2 95 1253
EK 15 3.13 11.59 0 45
Diff. (EK-AK) 15 -453.3 -366 -95 -1253
Dentin 15 71.13 168.1 0 666
Tab. 6b: Anzahl der Proben (N), Mittelwerte, Standardabweichungen, minimaler (Min),
maximaler (Max) Wert der Ausgangskontamination (AK) und Endkontamination (EK),
Differenz zwischen EK und AK, Restkontamination der Dentinspäne (Dentin) in
KBE/ml nach 10-3-facher Verdünnung für die Gruppe TBO in Alkohol
66
TBO in Aqua + Alkohol
Variable N Durchschnitt [x10-3]
Standard-abweichung
[x10-3] Min [x10-3] Max [x10-3]
AK 15 836.8 587.1 188 1953
EK 15 6.45 8.56 0 25
Diff. (EK-AK) 15 -830.4 -584.9 -183 -1952.6
Dentin 15 75.7 94.7 3 347
Tab. 6c: Anzahl der Proben (N), Mittelwerte, Standardabweichungen, minimaler (Min),
maximaler (Max) Wert der Ausgangskontamination (AK) und Endkontamination (EK),
Differenz zwischen EK und AK, Restkontamination der Dentinspäne (Dentin) in
KBE/ml nach 10-3-facher Verdünnung für die Gruppe TBO in Aqua + Alkohol
Alkohol
Variable N Durchschnitt [x10-3]
Standard-abweichung
[x10-3] Min [x10-3] Max [x10-3]
AK 15 1583.1 1934.6 133.6 5990
EK 15 17.51 26.41 1.1 71
Diff. (EK-AK) 15 -1565.6 -1934.8 -132.5 -5984.2
Dentin 15 120.1 154.9 8.4 467
Tab. 6d: Anzahl der Proben (N), Mittelwerte, Standardabweichungen, minimaler (Min),
maximaler (Max) Wert der Ausgangskontamination (AK) und der Endkontamination
(EK), Differenz zwischen EK und AK, Restkontamination der Dentinspäne (Dentin) in
KBE/ml nach 10-3-facher Verdünnung für die Gruppe Alkohol
67
Lichtquelle LED Lichtwellenlänge 635 nm Risikogruppe der Lampe 2 (IEC 62471:2006) Emissionszeit 60/120 Sekunden Ausgangsleistung 750mW max. Strahllieferung Optischer Lichtleiter Anzeige LCD Lampenaktivierung Schalter am Handstück Externe Sicherung 1.6A (T)
Stromversorgung Eingang 100 - 240V AC, 50 - 60 Hz, 0.35 A. Ausgang 16V DC, 1A
Betriebsmodus Kontinuierlich, Kurzzeitladung Geräteklasse Klasse IIa (93/42/EEC) Stromschlagschutz Klasse I (EN 60601) Gerätetyp Typ B (EN 60601) Umgebungstemperaturbereich 10-35 Grad Celsius Lager- und Transporttemperaturbereich 0-25 Grad Celsius Zul. Luftfeuchtigkeit für Lagerung und Transport 0-75%
Zul. Luftdruck für Lagerung und Transport 860-1060kPa Gehäuseschutz IP52 (EN 60529) Maße 150mmx250mmx150mm (Breite x Höhe x Tiefe) Gewicht 1.75kg
Tab. 7: Technische Daten des ASEPTIM Plus aPDT Systems (Quelle: scican.de) SX Feile Dient der Aufbereitung des koronalen Zugangs, Konizität: 3,5 – 19 %,
Durchmesser an der Instrumentenspitze 0,19 mm
S1 Feile Dient der Gleitpfaderweiterung und der weiteren Aufbereitung des koronalen Drittels, Konizität: 2 – 11 %, Durchmesser an der Instrumentenspitze 0,17 mm
S2 Feile Dient der weiteren Aufbereitung des mittleren Drittels und der beginnenden Erweiterung des koronalen Drittels, Konizität von 4 – 11,5 %, Durchmesser an der Instrumentenspitze entspricht ISO 20
F1 Feile Dient der weiteren Aufbereitung des apikalen Drittels, Konizität 7 %, Durchmesser an der Instrumentenspitze entspricht ISO 20
F2 Feile Dient der weiteren Aufbereitung des apikalen Drittels, Konizität 8 %, Durchmesser an der Instrumentenspitze entspricht ISO 25
Tab. 8: Spezifikationen der verwendeten maschinellen ProTaper Feilen (Dentsply
Maillefer, 1338 Ballaigues, Schweiz)
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Eidesstattliche Versicherung gemäß § 8 Absatz 1 Nr. 3 der Promotionsordnung der
Universität Freiburg für die Medizinische Fakultät
1. Bei der eingereichten Dissertation zu dem Thema:
Wirkung der antimikrobiellen photodynamischen Therapie in Kombination mit Isopropylalkohol auf mit Enterococcus faecalis infizierte Wurzelkanäle in vitro
handelt es sich um meine eigenständig erbrachte Leistung.
2. Ich habe nur die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt und mich keiner unzulässigen Hilfe Dritter bedient. Insbesondere habe ich wörtlich oder sinngemäß aus anderen Werken übernommene Inhalte als solche kenntlich gemacht. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
3. Die Ordnung der Albert-Ludwigs-Universität zur Sicherung der Redlichkeit in der Wissenschaft habe ich zur Kenntnis genommen und akzeptiert
4. Die Dissertation oder Teile davon habe ich (Zutreffendes bitte ankreuzen)
bislang nicht an einer Hochschule des In- oder Auslands als Bestandteil einer Prüfungs- oder Qualifikationsleistung vorgelegt.
wie folgt an einer Hochschule des In- oder Auslands als Bestandteil einer Prüfungs-
oder Qualifikationsleistung vorgelegt: Titel der andernorts vorgelegten Arbeit:
Name der betreffenden Hochschule:
Jahr der Vorlage der Arbeit:
Art der Prüfungs- oder Qualifikationsleistung:
5. Die Richtigkeit der vorstehenden Erklärungen bestätige ich.
6. Die Bedeutung der eidesstattlichen Versicherung und die strafrechtlichen Folgen einer unrichtigen oder unvollständigen eidesstattlichen Versicherung sind mir bekannt.
Ich versichere an Eides statt, dass ich nach bestem Wissen die reine Wahrheit erklärt und nichts verschwiegen habe.
Ort, Datum: Unterschrift: Frankfurt, den 08.05.2020
✔
✔
✔
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Die Seite 69 enthält persönliche Daten. Sie ist deshalb nicht Bestandteil der Veröffentlichung.
70
Danksagung
Mein Dank gilt zunächst Herrn Prof. Dr. Altenburger, meinem Doktorvater, für die Erstellung des ersten Gutachtens dieser Dissertation und für die ideenreichen Verbesserungsvorschläge.
Des Weiteren danke ich Frau Prof. Dr. Nelson für das Erstellen des zweiten Gutachtens und für die Unterstützung bei der abschließenden Gestaltung dieser Dissertation.
Ich möchte mich herzlichst bei Herrn Priv.-Doz. Dr. Christian Tennert für die Betreuung während der Durchführung des experimentellen Teils und für die endlose Geduld während der Korrektur der Dissertationsschrift bedanken. Ohne seine bereichernde und konstruktive Unterstützung wäre die Entstehung dieser Arbeit unmöglich.
Ferner danke ich Frau Kirstin Fach für die statistische Auswertung der erhobenen Daten. Dank Ihrer Hilfe war eine wissenschaftliche Beurteilung der Ergebnisse erst möglich.
Ich bedanke mich ferner bei Frau Milena Gecova für das professionelle und ideenvolle Korrekturlesen. Sie hat durch Ihr Feedback die sprachliche Qualität dieser Dissertationsschrift gewährleistet.
Zum Schluss will ich mich bei meiner Freundin Emeline und meiner Mutter Snezhana bedanken, die mit konstruktiver Kritik und stetiger moralen Unterstützung während des langen Weges bis zur Fertigstellung dieser Arbeit immer auf meiner Seite waren.
