Nachdem die DNA als Träger der Erbinformationidentifiziert war, mußte der Mechanismus derInformationsspeicherung, der Vermehrung und derUmsetzung in Proteine aufgeklärt werden. ChemischeAnalysen ergaben, daß immer gleichviel der BasenAdenin und Thymin bzw. Guanin und Cytosin in derDNA vorhanden waren (Chargaff 1950). Rückblickendein starker Hinweis auf die Paarung der Basen - aber dieForscher experimentierten lange mit Modellen wie einemDreifachstrang.

DNA als Erbmaterial

1953 entwickelten James Watson und Francis Crick,basierend auf Strukturuntersuchungen (Röntgenbeugungs-daten) von Rosalind Franklin, ein Strukturmodell derDNA: ein rechtsgewundener Doppelstrang, bei dem diebeiden Einzelstränge gegenläufig sind (antiparallel) undin dem jeweils Guanin (G) mit Cytosin (C) und Adenin(A) mit Thymin (T) paart („Watson-Crick-Paarung“). DieBasenpaarung erfolgt über Wasserstoffbrücken, G und Cist ein komplementäres Paar, ebenso A und T.Eine Umdrehung der Doppelhelix enthält etwa 10Basenpaare. Diese Form der DNA heißt auch „B-Form“.

Die DNA-Doppelhelix

Zur Erinnerung:die Bausteine der

DNA

Die entsprechendenNukleoside heißen-Adenosin, Guanosin*-Cytidin, Thymidin, Uridin

*Achtung, Guanidin ist etwasganz anderes (sehr basischeskleines Molekül, Teil der ASArginin)

Zur Erinnerung: dieBausteine der DNA - und

ihre Verknüpfung

Die DNA-Doppelhelix

Guanin und Cytosin sindüber drei Wasserstoff-brücken verknüpft, Adeninund Thymin nur über zwei(und damit weniger fest).

Die Basen liegen im Inneren der „Wendeltreppe“ wieflache Stufen, die übereinander liegenden Basen sinddurch elektronische Wechselwirkungen aneinandergebunden und stabilisieren so die Struktur („stackingKräfte“). Außen liegt das „Zucker-Phosphat-Rückgrat“(Backbone). Zwischen den Strängen verlaufen zweiFurchen, die kleine (minor groove) und die große (majorgroove) entlang der Doppelhelix. In diese Furchen bindenProteine, z.B. zur Genanschaltung oder zum Verpackender DNA.

Die DNA-Doppelhelix

DNA

„Aufgerollte Helix“:Zucker/Phosphat-Backbone außen,gepaarteNucleotidbasen innen

Die DNA-Doppelhelix:die B-Form der DNA

Die gleiche Struktur inverschiedenerDarstellung: links(„Drahtmodell“) wirddie Lage der flachenBasen gut sichtbar,rechts (Kalottenmodell)die Raumausfüllung

Die DNA-Doppelhelix: Länge und Verpackung

Die Länge der DNAeiner menschlichen Zelleals ausgestreckteDoppelhelix betrüge fast2 Meter! Damit dieserFaden in die Zelle paßt,muß er sehr kompaktgefaltet sein.Andererseits mußsichergestellt sein, daßdie genetischenInformationen auch zumAblesen erreichbar sind!

Die DNA-Doppelhelix: NukleosomenDie DNA ist bei Eukaryonten um einen „Core“, Kernbasischer Proteine gewickelt, den Histonen. Die dadurchgebildeten Nukleosomen sehen im elektronenmikro-skopischen Bild wie Perlen an einer Kette aus. Diehistonfreien DNA-Stücken zwischen den Perlen heißen„Linker“, Verbindungsstücke.

Die DNA-Doppelhelix: NukleosomenDurch die zweifache Umwicklung des Nukleosomenkerns(aus je 2x Histon H2A, H2B, H3, H4) ist die DNA gegenüberder gestreckten Form etwa 7fach verkürzt.

Die argininreichenHistone H3 und H4sind evolutionärhochkonserviert, dielysinreichen HistoneH2A und H2B sindvariabler.

Die DNA-Doppelhelix: NukleosomenDas extrem lysinreiche Histon H1 (das evolutionär sehrvariabel ist) „versiegelt“ das Nukleosom von außen. Bei hoherTranskriptionsaktivität (Ablesen der DNA) löst es sich ab, unddas Nukleosom faltet sich etwas auf.

Epigenetik

Die basischen Histone ziehen die negativen Ladungen derDNA an. Der dichte Komplex erschwert das Abschreiben(„Silencing“). Durch Acetylierung (Essigsäurereste an diebasischen Aminosäuren) wird die Bindung schwächer, dieDNA lockerer und besser abschreibbar. Methylierung derHistone verhindert die Acetylierung und fixiert so dasSilencing, ebenso wirkt ein Methylieren der Base Cytidin in„CG-Paaren“. Bei der DNA-Verdopplung werden auch dieseAcetylierungs- und Methylierungszustände weitergegeben,sind also quasi erblich (epigenetische Fixierung).

EpigenetikBei der Zelldifferenzierung im Embryo, wenn aus der Eizelledie Stammzellen für Organe werden, kommt es zum Silencing,um nichtbenötigte Gene auszuschalten (wozu braucht z.B. eineNervenzelle Gallensäuren).Um aus Körperzellen wieder Keimzellen zu machen(Klonschaf Dolly), müssen die epigenetischen Veränderungengelöscht werden.Ob dieseepigenetischenVeränderungenauch von Elternzu Kind oder garEnkel vererbtwird, ist umstritten.

Die DNA-Doppelhelix: SolenoideZur weiteren Verkürzung der DNA (um das5fache) ist die 10 nm dicke Nukleosomenkettehelixartig zu einer 25-30 nm dickenFibrille aufgewickelt, dem Solenoid.Histon H1 stabilisiert diese Struktur.

Die DNA-Doppelhelix: und Chromosomen

Weitere Kompaktierung istnotwendig, um auf Chromo-somengröße zu kommen (z.B.von 5 cm DNA-Helix auf 5 µm:10.000fach). Dabei werdenoffenbar ähnlich zusammen-gesetzte DNA-Bereiche (vielA+T) zusammengepackt. Wiedas geschieht, ist ungeklärt.

Die DNA-Doppelhelix und Chromosomen

Wie kompakt DNA gefaltet ist, wird aus einem Rechen-beispiel klar: Das Genom aller Menschen zusammen (also einZellkern pro Person) würde in zwei Stecknadelköpfen Platzfinden. Aufgefaltet würden die aneinandergelegtenDoppelhelices 62x von der Erde zum Mond reichen.

ChromosomenDurch diese Zusammenlagerung zeigen die Endprodukte derDNA-Faltung, die Chromosomen, ein immer gleichesBandenmuster nach Anfärbung (mit G Giemsa, Q QuinacrinAT-reiche Bereiche, mit Acridinorange GC-reiche Bereiche:„reversed bands“ R), an denen sie eindeutig zu identifizierensind (hier: die Chromosomen des Menschen). Die beidenChromatiden einesChromosoms sindam Centromerverbunden. DieLage des Centromersist ebenfallscharakteristisch.

Centromere

Liegt das Centromer in der Mitte des Chromosoms, sprichtman von einem metazentrischen Centromer, liegt es nahe derMitte, submetazentrisch, liegt es nahe einem Ende, heißt esakrozentrisch, liegt es (scheinbar) am Ende, telozentrisch(tatsächlich sitzt es nie ganz am Ende).Das Centromer hat bei der Chromosomenverteilung beiMitose und Meiose eine wichtige Rolle: dort binden dieSpindelfasern ans Chromosom, die die beiden Chromatidenauseinanderziehen. Fehler bei diesem Prozeß führen zu einerungleichen Chromosomenverteilung, der Aneuploidie.

ChromosomenDurch Auszählen der Chromosomen einer Zelle lassen sichdie Ergebnisse solcher Fehlverteilungen feststellen. Hier liegtTrisomie 21 (Chromosom 21 ist dreifach vorhanden) = Down-Syndrom vor.

Chromosomen identifizieren mit FISH

Durch Floureszenz-in-situ Hybridisierung (FISH) kann manChromosomen und Chromosomenbruchstücke leicht undeindeutig erkennen. TauchenStücke eines Chromosomsauf einem anderen auf,weist das auf schwereErbkrankheiten hin. DieZellen hier sind HeLa-Zellen,menschliche Zellen, aber seitJahrzehnten im Laborweitergezüchtet, und dadurchvoller Abnormitäten.

Bakterielle DNA

In Bakterien kommen keine Histoneund Nukleosomen vor, auch ist keineChromosomenstruktur zu erkennen.Aber auch dort ist die DNA mitbasischen Proteinen komplexiert undkompaktiert. Eine zentrale Strukturaus RNA organisiert die DNA vonE. coli in etwa 50 Schleifen, die sichnach RNAse-Verdau zu einer großenSchleife öffnen.

Denaturierung der DNA-Helix

Durch Erwärmen kann mandie DNA „aufschmelzen“,wobei sich die Wasserstoff-brücken lösen und die beidenStränge trennen. Dabei steigtdie UV-Absorption (Meß-möglichkeit). GC-reicheDNA hat einen höherenSchmelzpunkt als AT-reiche.

Renaturierung der DNA-HelixBeim Abkühlen „finden“ sich die passenden Strangpaareallmählich wieder und bilden Doppelstränge aus. Dabei findensich nicht immer perfekt passende Paarungen. Es kann aucheine Heteroduplex entstehen, die Fehlpaarungen enthält. IhrSchmelzpunkt (bei dem 50% der DNA denaturiert ist) liegttiefer als bei perfekt passenden Strängen.Im Genom gibt es große Bereiche aus hochrepetitiver DNA,bei der immer dieselbe (kurze: 5 - einige hundert Bp) Sequenzwiederholt ist, oft viele tausend Mal. Solche Bereiche renatu-rieren viel schneller als nur einmal vorkommende Sequenzen(unique sequences), weil sie viel leichter passende Partner-stränge finden. Aus der Geschwindigkeit der Renaturierungläßt sich also ablesen, ob eine DNA viele Wiederholungen(und damit wenig Information) enthält, oder nicht.

DNA-Hybridisierung

Die Fähigkeit der DNA, nach Hitzedenaturierung wieder zumDoppelstrang zusammenzufinden, wird zum Identifizieren vonDNA im „Southern-Blot“ benutzt. Dabei findet einemarkierte (z.B. radioaktiv) Sonden-DNA aus einer DNA-Mischung den passenden Partner.Auch die Ähnlichkeit verschiedener Gene (oder des gleichenGens aus verschiedenen Organismen) läßt sich durchHybridisierung ermitteln. Eine Doppelstrangbildung schon beihoher Temperatur weist auf große Sequenzähnlichkeit hin(Heteroduplex mit wenig Fehlpaarungen), bilden sich erst beiniedriger Temperatur gemischte Doppelstränge, sind dieSequenzen nicht sehr ähnlich.

Aus der Struktur der DNA als Doppelhelix mitfestgelegten Basenpaarungen ergab sich logisch die Artder Informationsspeicherung und ihre Vermehrung. DieBasen sind die Informationseinheiten, die Verdopplungerfolgt semikonservativ: die Elternstränge trennen sich,jeder der beiden kann als Matrize (engl.: template) füreinen neuen Tochterstrang dienen. Danach müßte dieneuentstandene DNA je einen alten und einen neuenStrang enthalten.

Die DNA-Doppelhelix

Die DNA-DoppelhelixTheoretisch wäre neben der semikonservativenReplikation auch eine konservative denkbar, bei der einnagelneuer Doppelstrang als Kopie des alten Originalsentspricht (Computerdaten werden konservativ vermehrt,auch ein Photokopierer arbeitet konservativ), oder einedisperse mit Zufallsmischung alter und neuer Sequenzen.

Die semikonservative Vermehrung wurde von Meselsonund Stahl 1958 nachgewiesen. Sie vermehrten E. coli inNährmedium mit schwerem Stickstoffisotop (15N stattnormalem 14N), dadurch entsteht DNA mit hoherSchwebedichte (sinkt in der Dichtegradienten-zentrifugation weiter nach unten). Züchtet man die E. coliauf normalem Medium weiter, verschwindet die sehrschwere DNA, dagegen entsteht mittelschwere DNA.Nach weiteren Generationen wird der Anteilmittelschwerer DNA immer weniger auf Kosten leichterDNA. Offenbar wurde ein leichter Strang an einenschweren neusynthetisiert, so daß die mittelschwere Formentstand.

Die DNA-Doppelhelix

Bei der Zentrifugation werden durch schnelles DrehenZentrifugalkräfte erzeugt, die ein Vielfaches derErdanziehungskraft ausmachen. Alle Teilchen imZentrifugationsgefäß (Gewebestücke, Zellen,Zellorganellen, Moleküle) werden dadurch um einVielfaches schwerer. Absetzvorgänge (Sedimentation)kleiner Teilchen, die sonst sehr lange brauchen, werdenstark beschleunigt.

Exkurs: ZentrifugationsmethodenDie gebräuchlichste Zentrifugationsmethode ist diedifferentielle Sedimentation. Drehzahl und Zentrifuga-tionszeit werden so gewählt, daß schwere Teilchen aufden Gefäßboden zentrifugiert werden, während leichtenoch in Lösung sind. So lassen sich z.B. Zellkerne(schwer) von Mitochondrien (leichter) und diese in einerweiteren, schnelleren Zentrifugation von Vesikeln des ER(klein, dadurch langsam sedimentierend) trennen. Durchvorgegossene Dichtegradienten (50% Saccharose untenim Glas, 20% in der Mitte, keine oben) läßt sich derTrennvorgang oft verbessern.Die differentielle Zentrifugation ist ein Endpunkt-verfahren, zentrifugiert man immer weiter, landen auchkleinere Partikel auf dem Boden.

Exkurs: Zentrifugationsmethoden

Einheit für die Sedimentationsgeschwindigkeit ist dasSvedberg (S). RNA-Klassen (18S-RNA, 28S-RNA)Ribosomen und Ribosomenuntereinheiten werden damitklassifiziert (70S Ribosom, 30S Untereinheit).Bei bekannter Dichte lassen sich die Molekulargewichteaus den Sedimentationsgeschwindigkeiten errechnen, z.B.von Proteinen mittels bekannter Eichproteine.

Exkurs: Zentrifugationsmethoden

Bei der Dichtegradienten-Gleichgewichtszentrifugationerfolgt die Trennung nicht nach der Sedimentationsge-schwindigkeit, sondern nach der (Schwimm-)Dichte (Massepro Volumen). Bei der Caesiumgradientenzentrifugation wirdeine CsCl-Lösung (sehr schweres Salz) sehr schnellzentrifugiert (Ultrazentrifugation, über 100.000facheSchwerkraft). Dabei entsteht ein Dichtegradient (am Bodenist die CsCl-Konzentration höher als weiter oben). DieDichten von DNA und RNA liegen im Bereich des Gradi-enten, die Moleküle sammeln sich zu Banden, die dortschweben, wo die Salzdichte ihrer Schwimmdichte ent-spricht. Die Dichtegradientenzentrifugation ist ein Gleich-gewichtsverfahren, längere Zentrifugationszeiten ändern dasErgebnis (bis auf ein schärfer Werden der Banden) nicht.

Exkurs: Zentrifugationsmethoden

Mit der CsCl-Gleichgewichtszentrifugation läßt sich DNAvon RNA, GC-reiche DNA von AT-reicher, verknäulte(supercoiled) DNA von entspannter und (wie beiMeselson und Stahl) 15N-markierte DNA vonunmarkierter trennen.

Exkurs: Zentrifugationsmethoden Semikonservative ReplikationAus „schwerer“ DNA wird „mittel-schwere“, die aus einem schwerenund einem neugebildeten leichten Strang besteht.

Taylor wies die semikonservative Replikation 1957 durchein radioaktives Isotop nach. Er züchtete Hyazinthen-zellen in 3H-Thymidin (3H superschwerer Wasserstoff =Tritium, schwerer Wasserstoff 2H = Deuterium ist nichtradioaktiv, ebenso wie normaler 1H Wasserstoff), das nurin DNA eingebaut wird. Die radioaktiven Chromosomenschwärzen photografischen Film (Autoradiographie).Nach zwei Zellverdopplungen war meist nur einChromatid eines Chromosomenpaares radioaktiv markiert.Es hatte einen Strang der ursprünglichen DNA erhalten,das andere Chromatid den in der ersten Verdopplungneugebildeten, unmarkierten Strang.

Die DNA-DoppelhelixDie DNA-

DoppelhelixManche Chromatide waren nurstückweise radioaktiv markiert.In diesen Fällen waren amanderen Chromatid gerade dieentsprechenden Bereicheunmarkiert, der Rest markiert.Offenbar hatte sich derUrsprungsstrang auf die beidenneuen Stränge verteilt. Dies warzugleich ein Nachweis derRekombination(Neukombination von Erbgut)durch „crossing over“.

Die DNA-Doppelhelix

Durch „crossing over“tauchen Fragmente desAusgangsstranges aufbeiden Strängen der neuenDNA auf.

SemikonservativeReplikation der DNA

Semikonservative Replikation der DNADie DNA-Replikation ist ein komplexer Prozess, der sich inverschiedene Abschnitte einteilen läßt und an dem vieleFaktoren mitwirken. Ab besten untersucht ist die Replikation bei E. coli.

Initiation der ReplikationDamit ein neuer Strang in Paarung mit einem alten gebildetwerden kann, muß als erstes die vorhandene Doppelhelix aneiner Stelle geöffnet werden. Dieser Ort des Replikationsstartsheißt Replikationsursprung oder Origin. Auf dem Genom vonE. coli befindet sich nur ein Origin (oriC). Das EnzymHelikase (DnaB) trennt die Stränge und verbraucht dabei proBasenpaar zwei ATP, die zu AMP abgebaut werden, also 4Energie-Einheiten!!

Die gebildeten Einzelstränge werden durch „Single-strandbinding proteins“, Einzelstrang-bindende Proteine, geschütztund stabilisiert, damit sie nicht gleich wieder paaren. Sie sinddie Matritzenstränge (template) für die folgendeReplikation.

Replikation

DNA-Polymerasen können nur vorhandene Strängeverlängern, keine neuen starten: sie brauchen einenPrimer. RNA-Polymerasen können einen neuen Strangbeginnen, daher wird zunächst von einer speziellenRNA-Polymerase, der Primase, ein kurzes RNA-Stück(4-13 Nukleotide) gebildet, das dann von der DNA-Polymerase III verlängert wird.Der Gesamtkomplex, der den Primer synthetisiert, dasPrimosom, enthält neben der Primase auch HelikaseDnaB.

Replikation

Alle matrixabhängigen DNA- und RNA-Polymerasen arbeitenin 5‘-3‘ Richtung, d.h., sie hängen das neue Nukleotid an das3‘-OH des letzten Zuckers der Kette an.

Replikation in5‘-3‘ Richtung

Das passendeNukleosid-Triphosphat (NTP)wird eingepaßt, dabeiwird Pyrophosphatabgespalten und dasNukleosid-Monophosphat (=Nucleotid) eingebaut.

*T bei DNA-Primer(synthetisch),U bei RNA

*

ReplikationAusgehend von Origin, kann einer der Stränge daherkontinuierlich neu-synthetisiert werden, er wird Leitstrang(leading strand) genannt.

Replikation

Der andere Strang müßte eigentlich „verkehrt herum“ gebildetwerden. Der Ausweg: es werden kurze Stücke in der richtigenRichtung gebildet, die bei E. coli etwa 1000 Nucleotide langsind und nach ihrem Entdecker Okazaki-Fragmente heißen.Bei Eukaryonten sind sie nur 100-200 Nukleotide lang. Jedesdieser Strängchen braucht einen eigenen RNA-Primer. Läuftdie DNA-Polymerase III auf das nächste Strangfragment auf,löst sie sich ab und wird durch die DNA-Polymerase I ersetzt.Diese baut zunächst das dortige RNA-Ende mit Hilfe ihrer 5‘-3‘ Exonukleaseaktivität ab und schließt dann die entstandeneLücke.

Replikation

Schließlich verknüpft eine DNA-Ligase die Fragmente zueinem Strang, dem „zurückbleibenden“ Strang, Folgestrang(lagging strand). (Auch beim leading strand sind am SchlußPol I und Ligase notwendig). Die Ligase spaltet bei derVerknüpfung ATP (beim Phagen T4) zu AMP und PP(Pyrophosphat) oder (bei E. coli) NAD+ in NMN+

(Nicotinamid-Mononucleotid) und AMP.

Replikationgabel Replikation

Die Struktur mit „leading“ und „lagging strand“, ausgehendvom Origin, wird Replikationsgabel genannt. Von einemOrigin kann eine Gabel starten, oder je eine in beideRichtungen (bidirektionelle Replikation).Selbst bei bidirektioneller Replikation dauert eine volleReplikationsrunde bei E. coli mindestens 40 Minuten. Umeine Generationszeit von nur 20 Minuten zu ermöglichen,startet bei guten Wachstumsbedingungen ein weitererReplikations-Zyklus, während der erste noch läuft. Man nenntdas dichotome Replikation.

DichotomeReplikation

Replikation: Termination

Wenn sich die beiden Replikationsgabeln „in der Mitte“ desChomosomenkreises treffen, beenden beide dort ihre Arbeit.Ist eine Polymerase aber verzögert (z.B. durch Reparaturen),liest die andere nicht beliebig weiter, sondern stoppt anspeziellen Terminationssequenzen kurz hinter derChomosomenhälfte. So wird verhindert, dass derReplikationskomplex mit der Transkriptionsmaschinerie(RNA-Polymerase) zusammenstößt. Das könnte für die Zelletödlich sein.Auf beiden Chromosomenhälften sind die Gene „inReplikationsrichtung“ orientiert, also so, dass sie in Richtungder Replikation transkribiert werden.

Replikation: ProzessivitätWährend DNA-Polymerase I nach wenigen Syntheserundenvon der DNA abfällt (was auch ihre Fehlerrate erhöht), kannDNA-Pol III viele tausend Nukleotide nacheinander anbauen(hohe Prozessivität). Das wird durch eine molekulareKlammer (clamp) um die DNA erreicht, an die die Pol IIIfest bindet. Die Pol III kann pro Sekunde 500-1000Nukleotide an den wachsenden DNA-Strang anfügen, Pol Inur 10.

Replikation: Prozessivität

Die molekulare Klammerumschließt den DNA-Strang.

Replikation:Koordination von leading und lagging strand

Die Synthese der beiden Stränge läuft nicht unabhängigvoneinander. An der Helikase DnaB in der Gabelung derDNA hängen die Pol IIIs für leading und lagging strand.Während die „leading“ Polymerase der voranschreitendenGabel folgt, fädelt die „lagging“ Polymerase die replizierteDNA als Schleife an sich vorbei. Trifft sie auf einenStrangbruch (den nächsten Primer), fällt ihre Klammer ab undsie verläßt den Strang. Nahe am Gabelursprung bildet sicherneut eine Klammer und fängt die Pol III wieder ein, für dasnächste Okazaki-Fragment.

Replikation:Koordination von

leading und laggingstrand

Anders als hier gezeigtsind die beiden PolIII-Untereinheiten festverbunden (über einDimer der Untereinheitτ), daher bleibt die„lagging“-PolIII an derGabel und kann sofortan die neue Klammerbinden.

Replikation: Starten eines neuen Okazaki-Fragments

Der „Klammerlader“ (Clamp Loader, DnaG) hat eine neueKlammer vorbereitet. Wenn die „lagging“-Polymerase dasvorige Okazaki-Fragment erreicht, wird die neue Klammerauf die DNA geladen und die Polymerase von der altenKlammer ab- und auf die neue Klammer aufgeladen.

Replikation: Starten eines neuen Okazaki-Fragments

Replikation bei EukaryontenEukaryonten besitzen zahlreiche Origins im Genom (das Bildzeigt die neugebildete, radioaktive DNA in mehreren„Replikons“, Replikatonseinheiten um je ein Origin).Die Origins werden nicht auf einmal aktiv. Früh wird das„Euchromatin“ repliziert, spät das repetitive und besondersdicht gepackte „Heterochromatin“. Welche Bereiche zuerstverdoppelt werden,hängt auch vomZelltyp ab.

Replikation bei EukaryontenDas haploide menschliche Genom enthält etwa 20.000 -100.000 Origins (also eventuell mehr als es Gene enthält -davon haben wir nur gut 24.000). Ihr durchschnittlicherAbstand liegt bei 15 - 30 µm, entsprechend 45.000 - 90.000Nukleotiden (45 - 90 kBp).Die Replikationsgeschwindigkeitist langsamer als bei Bakterien(E. coli 50.000 Bp/min, Hefe 3.600),durch die hohe Zahl der Origins(Hefe ca. 500) kann die Replikationaber kürzer brauchen.Die auseinanderlaufenden Replikations-gabeln bilden Replikationsblasen(bubbles).

Replikation bei EukaryontenKomponenten des eukaryontischen Replikationsapparatessind u.a.:- DNA-Polymerase α/Primase-Komplex (Primersynthese:erst 6-10 RNA-Nucleotide, dann 20 DNA-Nucleotide)- DNA-Polymerasen δ (am lagging-strand, bindet PCNA)und ε (am leading strand, ohne Klammerbindung)- PCNA (Prozessivität, Klammerstruktur)- Topoisomerasen I und II (entknoten die Elternsträngenach der Replikation)- MF1 (entfernt RNA-Primer)- DNA-Ligase I (schließt DNA-Brüche)

Anders als bei E. coli schließt die DNA-Polymerase δ auchdie Lücken der entfernten Primer.

Replikation bei Eukaryonten

Replikation bei Eukaryonten: lineare DNA

Anders als bei Bakterien, enthalten die eukaryontischenChromosomen lineare DNA-Stränge. Dadurch ergibt sichdas Problem, wie die Enden repliziert werden. Der„leading strand“ kann die Mutter-DNA bis zum letztenNucleotid lesen und verdoppeln („run off“, replizieren biszum Runterfallen). Der „äußerste“ RNA-Primer des„lagging strand“ kann aber nicht von „noch weiter außen“durch DNA ersetzt werden.

Replikation linearer DNA (und RNA) bei Viren

Das Problem stellt sich auch bei linearen Virengenomen,die unterschiedliche Lösungen dafür entwickelt haben.Bei den Phagen T4 und λ (Lambda) verknüpfen sich dieEinzelgenome zu Multimeren oder zu Ringen, dieProdukt-DNA wird später in Monomere zerteilt.Adenovirus und Poliovirus (ein RNA-Virus) benutzen einProtein als Primer, das an das 5‘-Ende des äußerstenNukleotids gehängt wird und an dem der neue Strangstartet.

Replikation bei Eukaryonten: TelomereEukaryonten schützen ihre Chromosomenenden mit einerspeziellen Struktur, den Telomeren, aus Proteinen undspezifischen DNA-Sequenzen: kurze, vielfach wiederholteMotive, z.B. CCCTAA beim Menschen und CCACACAbei Hefe.

Zum einen verhindern Telomere den Abbau der DNA vonden Enden her (durch Exonukleasen). Freie DNA-Enden(entstehen z.B. beim Zerbrechen von Chromosomen) sindaußerdem „klebrig“ und hängen das DNA-Fragment anandere Chromosomen an, Telomer-Enden sind nicht„klebrig“.

Replikation bei Eukaryonten:Telomere

Zum anderen können die DNA-Endender Telomerregion von einem Enzym„Telomerase“ wieder verlängertwerden, dürfen also bei der Replikationohne Schaden verkürzt werden. DasEnzym enthält eine RNA mit einemDuplikat des Sequenzmotivs, mit der alsMatrix verlängert sie dasChromosomenende. (Sie ist damit eine„Reverse Transkriptase“, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase).

Replikation bei Eukaryonten:Telomere, Altern und Krebs

In somatischen Zellen des Menschen ist die Telomeraseausgeschaltet, bei jeder Zellverdopplung verkürzt sichdaher die Telomerregion. Das begrenzt die Zahl dermöglichen Teilungen und ist eine Art Zähler für das Alterder Zelle. In vielen Krebszellen (die ja aus somatischenZellen entstanden sind) ist die Telomerase wieder aktiv undmacht die Zelle „unsterblich“.

Replikationsfehler und ihre Korrektur

Bei der Replikation kann es auch zum Einbau falscherNukleotide kommen. Das geschieht mit einer Wahrschein-lichkeit von 10-4, also eine von 10.000 Basen ist zunächstfehlerhaft. Die DNA-Polymerase selbst erkennt 99% dieserFehler und kann sie durch ihre 3‘-5‘ Exonukleaseaktivitätausschneiden und korrigieren. Die Restfehlerrate (10-6) wärebei E. coli noch 8 Mutationen bei jeder Verdopplung, beimMenschen 5.500!! (Nach Lewin, Genes VI, sind die Raten 10-6

ohne und 10-9 mit Korrekturlesen für Pol III.)

Replikationsfehler und ihre Korrektur

Ein Reparatursystem erkennt und repariert aber weitereFehler (= falsche Basenpaarungen). Dazu muss es alten undneuen DNA-Strang unterscheiden können. Bei Bakteriengeschieht das über die Methylierung der alten DNA, beimMenschen ist der Mechanismus noch unbekannt.

Paul Modrich: Nobelpreis 2015 für Mismatch Repair

Replikationsfehler

Die verbleibende Fehlerrate liegt beim Menschen bei 10-5 bis10-7 pro Teilung für jedes Gen (manche Gene sind dabeihäufiger betroffen als andere), also hat (bei 10-6) bei ca.25.000 Genen im haploiden Genom jede 40ste Eizelle/Spermatozoe eine Mutation, bzw. jede 20. diploideKörperzelle.Bei E. coli liegt die Mutationsrate nur bei 10-8 pro Gen, damitkommt es nur alle 33.000 Zellzyklen zu einer Mutation durchReplikationsfehler.

Fehler und Fehlerkorrektur

Außer durch Replikationsfehler entstehen Veränderungen desgenetischen Materials auch durch äußere Einwirkungen wieenergiereiche Strahlung (UV, Röntgenstrahlen etc.) undchemische Reaktionen (mutagene Substanzen). Durchverschiedene Reparatursysteme kann die Zelle einenGroßteil dieser Veränderungen wieder korrigieren. Ein kleinerTeil kann nicht repariert werden und führt daher zudauerhaften Mutationen des Erbguts.

FotoreparaturUltraviolette Strahlung schädigt DNA, insbesondere durchBildung von Thymindimeren (benachbarte Thyminrestebinden kovalent aneinander). An solchen Stellen wird dieReplikation weitgehend blockiert.Überraschenderweise fand man, dass das Überleben UV-bestrahlter Bakterien besser ist, wenn die Zellen nicht imDunkeln weitergezüchtet werden, sondern unter sichtbaremLicht. Das Reparaturenzym bindet zwar schon im Dunkeln andas Dimer, wird aber erst nach Lichteinstrahlung aktiv(fotoreaktivierendes Enzym) und spaltet das Dimer wieder indie zwei Thyminreste.Die Dimerisierungsreaktion durch UV kann mit allenPyrimidinen geschehen (also auch C-T, C-C), ist aber als T-Tam häufigsten.

Thymin-Dimeres undFotoreparatur Fotoreparatur

Entdeckt wurde diePhotoreparatur von AzizSancar (Nobelpreis 2015)bei Bakterien.Unterdessen kennt manPhotolyasen auch beiverschiedenen Tieren, beiMenschen nur dieähnlichen Cryptochrome.Also nach demSonnenbrand besser imSchatten bleiben...

UV-SchädenAndere Schäden durch UV-Licht sinddie Dimerisierung von Guaninresten >>zwischen den beiden Strängen (beiSequenzfolgen GC und CG) sowieEinzel- und Doppelstrangbrüche derDNA.

Thymindimeres>>

ExcisionsreparaturUV-Schäden (incl. Thymin-dimere) können auch ohne Licht-einfluß repariert werden. Bei derExcisionsreparatur wird dergeschädigte DNA-Strang vonEndonuclease II (bei E. coli: uvrA/uvr B/uvr C) aufgeschnittenund durch die 5‘-3‘ Exonucle-ase-Aktivität der DNA-Poly-meraseI über die geschädigte Stellehinweg abgebaut. DNA-Polymerase I füllt dann die Lückeauf und DNA-Ligase schließt denStrangbruch.

Reparatur-Noblepreis

Der Nobelpreis für Chemie ging 2015 an dreiReparaturforscher,Aziz Sancar hat sowohl die Photoreparatur als auch die„Nucleotide Excision Repair“ aufgeklärt,Paul Modrich die „Mismatch Repair“ (sieheReplikationsfehlerkorrektur) undTomas Lindahl die „Base Excision Repair“, bei der bei„gealterter“ DNA eine verlorengegangene Base ersetzt wird.

Rekombinationsreparatur

Trifft die Pol III bei der Replikation auf ein nicht-getrenntesThymin-Dimer, stoppt die Replikation für mehrere Sekunden.Dann setzt der Replikationsprozess weiter hinten auf demStrang wieder ein, es bleibt eine Lücke von ca. 1000Nucleotiden zurück. Diese wird durch Einbau der homologen(entsprechenden) Sequenz des ursprünglichen Gegenstrangesgeschlossen (Rekombinationsreparatur). Die nun imMutterstrang vorhandene Lücke wird durch Reparatursynthesevom neuen Gegenstrang durch Pol I geschlossen. DasThymindimer bleibt erhalten und muss später repariertwerden.

Rekombinationsreparatur SOS-Reparatur

Versagen alle anderen Reparatursysteme, benutzt die Zelle dasSOS-System. Dabei wird das Korrektur-Lesen der DNA-Polymerasen ausgeschaltet. So können Bereiche vollerDimere oder mit chemisch modifizierten Basen repliziertwerden, es werden dabei aber Fehler in Kauf genommen. DiesSystem wird daher auch als „error prone repair“ (zu Fehlernneigende Reparatur) genannt. Normalerweise ist diesesSystem (durch Repressor LexA) reprimiert, erst bei starkerUV-Schädigung (Notsituation) wird es ausgebildet. Dabeierkennt RecA die hohe Fehlerrate und sorgt als Co-Proteasefür den Verdau des Repressors LexA).

Replikation und ZellzyklusBei Pro- wie bei Eukaryonten ist die Verdopplung der DNAdurch Replikation Teil des Prozesses, bei dem aus einer Zellezwei werden, des Zellzyklus.Bei Prokaryonten können Replikation und Zellteilungunabhängig voneinander gestartet werden, das erlaubt derZelle, kürzere Zellteilungszyklen zu durchlaufen, als dieReplikation dauert (E. coli 20 min Zellzyklus, 40 minReplikation; >dichotome Replikation). Die Verteilung derDNA erfolgt bei Prokaryonten über eine Anheftung an dieZellmembran, durch das Längenwachstum werden die beidenDNA-Helices auseinandergezogen. Dabei liegt die Fehler-quote (Fehlverteilung, Zelle ohne Chromosom entsteht) unter1:10.000. Mutanten im Verteilungsprozeß verursachen vielhäufiger eine Fehlverteilung.

Verteilung der DNA bei der Zellteilungbei Bakterien

Replikation und Zellzyklus

Bei Eukaryonten ist die gleichmäßige Verteilung des Chromo-somensatzes, die der Teilung der Zelle vorausgeht, einkomplizierter Prozess, die Mitose. Ein spezielles Organell, dasCentrosom, dient der Ausbildung der Verteilungsmaschinerie.Es liegt außerhalb des Zellkerns, zu Beginn der Mitose(Prophase) werden aus einem Centrosomen-„Punkt“ zwei, dieauseinanderwandern, verbunden durch Bündel ausMikrotubuli. In dieser Phase kondensieren die Chromosomen.

Phasen der MitoseChromosomenstruktur und mitotische Spindel

Replikation und ZellzyklusIn der Metaphase löst sich die Kernmembran auf, und dieChromosomen wandern in eine Ebene, die Metaphaseplatte.Die Centrosomen wandern an die entgegengesetzten Seitender Zelle, so dass die sie verbindenden Mikrotubuli durch denKernbereich verlaufen. Einige der Mikrotubulibündel heftensich an die Centromere an, die Bereiche der Chromosomen,an denen die Schwesterchromatiden verbunden sind.In der Anaphase ziehen die sich verkürzenden Mikrotubulidie Chromatiden auseinander, auf die Centrosomen zu.In der Telophase werden neue Kernhüllen ausgebildet.Anschließend dekondensieren die Chromosomen wieder(>Interphasechromosomen entstehen). Es folgt die Teilung derZelle.

Replikation und Zellzyklus: Hefe

Pilze (und damit Hefen) weisen einige Besonderheiten auf.Bei ihnen löst sich die Kernhülle in der Mitose nicht auf(„geschlossene Mitose“, im Gegensatz zur „offenen“). Diespindelorganisierenden Zentren, die hier Spindelpolkörper(spindle pole bodies, SPB) genannt werden, sind in dieKernhülle eingebaut, so daß ihre Mikrotubuli die Chromo-somen trotz intakter Membran erreichen können. Nach derChromosomentrennung schnürt sich der Kern durch.