DNA-Analytik

2. Vorlesungsstunde:���Biochemie und Nachweis von DNA

Wie untersucht man DNA ?

5´

2´

O

OH

N

HN

O

OPO

OH

O

POPHO

OH

O

OH

O

N

N

H2N

Guanin

Unsere Tools Enzyme Enzyme sind Eiweiße die Reaktionen katalysieren. Fast der gesamte Stoffwechsel von Organismen beruht auf Enzymen. Viele Enzyme prozessieren DNA. Das sind super Tools zur DNA Analyse! Marker Nur wer DNA sieht kann sie auch analysieren. Wir können DNA sichtbar machen! Hybridisieren Ein DNA-Strang bindet an seinen homologen Gegenstrang. Super um DNA zu identifizieren !

Enzyme die DNA bearbeiten

•  DNA-Polymerasen •  RNA Polymerasen •  reverse Transkriptase •  Exonukleasen •  Endonukleasen

DNA-Polymerasen

DNA-Polymerasen bauen einen neuen Strang nach der Vorlage einer einzelsträngigen DNA auf: die Vorlage heißt TEMPLATE die Synthese erfolgt immer in 5´-3´-Richtung

Was braucht eine DNA-Polymerase

Das DNA-Template

Einen doppelsträngigen DNA-Abschnitt

Einen einzelsträngigen DNA-Abschnitt

Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) = dATP, dCTP, dGTP, dTTP

Replikation

Häufig verwendete DNA-Polymerasen

DNA-Polymerase I aus E. coli 103.000 Dalton Masse��� drei Funktionen 5´-3´-Polymerase 3´-5´-Exonuklease���5´-3´-Exonuklease DNA Reparatur und Synthese 37˚ C���

DNA-Polymerase aus Thermus ���aquticus (Taq-Pol) zwei Funktionen 5´-3´-Polymerase 5´-3´-Exonuklease���keine 3´-5´-Exo DNA Synthese 72˚ C

}Klenov- Fragment

The Polymerase Chain Reaction (PCR)is exponential

Primer annealingat 60-50°C

Melting of DNA at~95°C Polymerisation at

72°C

1. Cycle 2. Cycle

PCR and TaqMan are registered trademarks of Hoffmann La Roche and Perkin Elmer

PCR

Die reverse Transkriptase (RT)���oder ���

RNA abhängige DNA Polymerse

schreibt RNA in DNA um arbeitet wie eine DNA Polymerase, aber das Template ist RNA Funktionen: 5´-3´-DNA Polymerase

RNAse H (baut die RNA des DNA-RNA ��� Hybrides ab.

Das Produkt heißt cDNA (c = complementary)

RNA-Polymerasen RNA-Polymerasen lesen RNA von einem Stück doppelsträngiger DNA ab. RNA-Polymerasen brauchen eine sog. Promotorsequenz um aktiv zu werden. RNA-Polymerasen synthetisieren in 5´-3´-Richtung, die Sequenz der RNA entspricht der Sequenz des 5´-3´DNA Stranges (d.h. es wir der 3´-5´Strang abgelesen) die RNA-Pol. baut NTP statt dNTPs ein. Uracil ersetzt Tymidin

Exonukleasen

bauen DNA vom Ende her ab:���es gibt Exonukleasen die in���

3´-5´-Richtung vom Ende her abbauen und Exonukleasen die DNA vom

5´-3´- Ende her abbauen

Endonukleasen können mitten im DNA-Molekül schneiden manche Endonukleasen haben eine klare Erkennungs- sequenz: Restriktionsendonukleasen Typ II z.B. NNNNNGGATCCNNNNNN NNNNNCCTAGGNNNNNN

NNNNNG GATCCNNNNNN NNNNNCCTAG GNNNNNN

Palindrome

z.B. 5´ NNNNNGGCGCCNNNNNN 3´ 3´ NNNNNCCGCGGNNNNNN 5´

Die Sequenz liest sich auf beiden Strängen in 5´-3´, bzw 3´-5´-Richtung gleich.

Endonukleasen II

Es gibt Endonukleasen die unspezifisch DNA-schneiden. Manche dieser Enzyme schneiden nur einzelsträngige DNA, sog. ssDNA andere Enzyme schneiden bevorzugt doppelsträngige DNA, dsDNA

Markieren von DNA

1. Einbau von modifizierten Nukleotiden 2. Interkalierende Farbstoffe

z.B. Ethidiumbromid

3P 5¥ O

OH

N

HN

O

O

O

NH

R

3´ 5´

Fluorochromes

FITC 490 525Cy 5 649 670Cy3 575 605AMCA 345 425Europium 337 613

Interkalierende Farbstoffe