e#2 Allele#3 Allele#4 Allele#1 Allele#2 Allele#3 CH5e3 Vic ......CH5e3 Vic CH2c9 Fam CH5f6TMR...
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Anhang 1 Tabelle 2: Fragmentlängen Apfel und Informationen CH5e3 Vic CH2c9 Fam CH5f6TMR CH1H1Vic Ch1f3b Pet CH2d8 Fam CH4c7 TMR CH4e5 Hex CH1f2 Ned CH3d7 Pet GD147 TMR CH1f7a Hex Sample Sorte Sorte sicher genetisch identisch genetisch verwandt genetisch nicht identisch gleichnamige Bemerkung Allele#1 Allele#2 Allele#3 Allele#4 Allele#1 Allele#2 Allele#3 Allele#1 Allele#2 Allele#3 Allele#1 Allele#2 Allele#3 Allele#1 Allele#2 Allele#3 Allele#1 Allele#2 Allele#3 Allele#4 Allele#1 Allele#2 Allele#3 Allele#1 Allele#2 Allele#3 Allele#4 Allele#1 Allele#2 Allele#3 Allele#4 Allele#1 Allele#2 Allele#3 Allele#4 Allele#1 Allele#2 Allele#3 Allele#4 Allele#1 Allele#2 Allele#3 LfA004 Geflammter Kardinal Adersleber Kalvill Adersleber Kalvill UK, Fruitbreed; AP138: Doppelter Neuhäuser Boiken unsicher; NABU LfA32; 204 159 169 234 250 113 129 158 170 215 253 108 112 195 199 178 186 205 217 140 152 173 189 LfA071 Fraas_Sommerkavill Brauner Matapfel, Hamvas alma UK LfA15, 147 159 159 228 250 172 182 113 117 138 170 209 209 122 134 171 207 178 178 191 205 140 142 193 193 LfA030 Champagnerrenette Champagnerrenette LfA25; UK, Fruitbreed 163 165 238 240 174 178 117 129 138 182 204 253 108 108 171 213 180 180 191 225 140 150 183 191 LfA025 Champangerrenette Champagnerrenette UK LfA30; Uk, Fruitbreed 163 165 238 240 174 178 117 129 138 182 204 253 108 108 171 213 180 180 191 225 140 150 183 191 LfA010 Lord Suffield AT Fraas Sommerkalvill LfA133, 137; Fraas Sommerkalvill LfA10, 147; KOB 171 171 250 252 172 182 109 127 158 182 227 245 96 112 171 199 166 180 205 217 138 152 189 191 LfA015 Fraas Sommerkalvill Fraas Sommerkalvill LfA147, Lord Suffiled10, 133, 137; KOB LfA71 171 171 250 252 172 182 109 127 158 182 227 245 96 112 171 199 166 180 0 0 138 152 189 191 LfA133 Lord_Suffield AT Fraas Sommerkalvill LfA10, 137; Fraas Sommerkalvill LfA10, 147; KOB 171 171 250 252 172 182 109 127 158 182 227 245 96 112 171 199 166 180 185 227 138 152 189 191 LfA137 Lord_Suffield AT Fraas Sommerkalvill LfA10, 133;Fraas Sommerkalvill LfA10, 147; KOB 171 171 250 252 172 182 109 127 158 182 227 245 96 112 171 199 166 180 185 227 138 152 189 191 LfA163 Schroeppels_Gewuerzapfel AT Fraas Sommerkalvill LfA10, 133;Fraas Sommerkalvill LfA10, 147; KOB 171 171 250 252 172 182 109 127 158 182 227 245 96 112 171 199 166 180 185 227 138 152 189 191 LfA147 Fraas_Sommerkalvill Fraas_Sommerkalvill LfA15; Lord Suffueld LfA10, 133, 137; KOB LfA71 171 171 250 252 172 182 109 127 158 182 227 245 96 112 171 199 166 180 185 227 138 152 189 191 LfA237 Luikenapfel_Heunischhof AT Gewürzluiken UK, Fruitbreed LfA240 171 187 189 240 246 182 182 115 127 138 138 209 209 108 122 199 199 176 182 185 201 134 146 154 189 189 LfA039 Jakob Fischer Gravensteiner, Roter Gravensteiner LfA203; UK, DK LfA26 159 187 250 252 182 186 113 115 129 138 170 223 253 98 108 110 195 207 178 178 205 217 134 140 152 169 173 193 LfA203 Jakob_Fischer Gravensteiner, Roter Gravensteiner LfA39; UK, DK LfA26 159 187 250 252 182 186 113 115 129 138 170 223 253 98 108 110 195 207 178 178 205 217 134 140 152 169 173 193 LfA033 Grüner Stettiner Grüner oder gelber Stettiner Grüner oder gelber Stettiner UK 153 187 236 238 250 172 178 182 111 113 138 158 170 221 245 ** 171 207 166 204 201 205 225 134 142 152 173 193 LfA092 Horneburger_Pfannkuchenapfel Horneburger Pfannkuchenapfel UK 169 169 238 252 172 178 182 119 119 138 170 178 211 227 253 108 134 207 215 221 176 180 220 205 225 134 140 144 185 193 201 LfA026 Jakob Fischer Jakob Fischer NL: Jakob Fischer; LfA115 Bohntaubenapfel AT LfA39, 203 159 187 238 240 250 170 176 113 115 144 170 209 215 223 108 122 140 171 195 168 178 184 185 227 152 152 169 185 193 LfA115 Bohntauberapfel AT Jakob Fischer Jakob Fischer LFA26; NL LfA22 159 187 238 240 250 170 176 113 115 144 170 209 215 223 108 122 140 171 195 168 178 184 0 0 152 152 169 185 193 LfA061 Neumeyers_Sommerparmaene AT Kaiser Alexander, Alexander, Grande Alexandre UK, Fruitbreed 169 169 234 234 164 172 113 113 170 178 215 215 110 112 179 195 221 166 186 185 217 142 152 173 189 LfA020 Hürther Apfel Kaiser Wilhelm A3, Apf11 NABU; UK; NL LfA232 159 177 228 240 252 174 182 111 129 138 178 227 253 108 114 136 171 199 205 180 187 205 225 134 138 140 175 189 191 LfA021 Kanadarenette Kanadarenette UK, Fruit; Ap344 Kanadische Renette NABU 159 163 228 240 250 174 178 182 111 115 129 138 158 209 227 253 108 112 171 199 176 178 205 213 225 140 150 173 185 191 LfA28 Sparrige Renette AT King of Tompkins County, Beauty of Kent Uk; DK 159 159 228 250 252 164 178 182 115 117 129 138 170 209 223 227 108 114 171 171 176 178 204 205 225 140 150 154 173 185 189 LfA041 Krügers Dickstiel Krügers Dickstiel UK 169 169 236 252 164 182 117 129 178 178 209 245 122 134 171 207 176 178 191 225 134 144 173 189 LfA162 Duelmener_Rosenapfel nein!! Dülmener Rosenapfel Ap139, 214 sicher, NABU 171 171 228 248 178 182 117 129 138 170 ** 112 134 197 207 170 204 201 227 134 140 169 181 LfA168 Adersleber_Kalvill nein!! UK, Fruitbreed. 171 171 228 238 252 178 182 186 115 119 138 170 178 211 215 227 108 134 215 217 219 221 176 176 225 225 134 140 144 189 193 201 LfA201 Brauner_Matapfel AT nein!! LfA71; UK 159 159 240 252 178 182 119 129 158 178 211 253 108 114 199 215 176 178 205 225 134 140 154 185 191 LfA242 Notarisapfel Notarisapfel UK; AP147 NABU 159 169 228 246 250 172 182 115 117 129 170 178 209 211 253 108 122 134 171 207 180 186 202 191 205 217 126 134 142 154 185 191 LfA246 Orleansrenette Orleansrenette Orleanska reneta Fruitb.; Baxters Permain UK 159 159 240 252 174 182 111 129 138 178 253 253 108 114 171 199 180 180 205 225 138 140 175 191 LfA170 Landsberger_Gulderling AT Ribonde Ribonde UK, LfA186 159 169 228 250 164 178 111 127 170 170 209 221 108 122 199 217 184 190 205 205 134 142 193 195 LfA186 Landsberger_Gulderling AT Ribonde Ribonde UK; LfA170 0 0 228 250 164 178 111 127 170 170 209 221 108 122 199 217 184 190 205 205 134 142 193 195 LfA124 Kleiner_Langstiel AT Rossie Pippin Rossie Pippin UK; LfA206 Kugelapfel AT 159 189 240 252 174 174 115 125 141 170 178 223 253 255 257 108 112 134 171 207 176 184 204 185 225 227 126 134 142 169 187 189 LfA206 Kugelapfel AT Rossie Pippin Rossie Pippin UK; LfA124 Kleiner Langstiel 159 189 240 252 174 174 115 125 141 170 178 223 253 255 257 108 112 134 171 207 176 184 204 185 225 227 126 134 142 169 187 189 LfA210 Strauwalds AT Schöner aus Boskoop Schöner aus Boskoop LfA243; UK, Fruitbreed; Boskoop A15, 17, Ap182, 184, 303 NABU 159 175 195 228 244 250 164 170 182 103 125 129 138 170 178 211 223 227 108 114 171 207 180 202 201 205 126 140 189 191 193 LfA243 Schoener_aus_Boskoop Schöner aus Boskoop UK, Fruitbreed; Boskoop A15, 17, Ap182, 184, 303 NABU; LfA210 Stauwalds 159 175 195 228 244 250 164 170 182 103 125 129 138 170 178 211 223 227 108 114 171 207 180 202 201 205 126 140 189 191 193 LfA202 Charlamowsky Schöner aus Herrnhut (Haberstatké, Herrenhutske); Fruitbreed; Ap239, 242, 243 NABU 171 171 228 250 182 184 111 113 138 182 227 245 110 114 207 221 180 186 187 225 134 134 185 193 LfA042 Minister von Hammerstein Signe Tillisch UK, Fruitbreed; Signe Tillisch Ap124, 246, 287 NABU 159 169 228 234 164 170 111 117 170 178 209 215 108 112 171 195 186 204 181 185 144 152 173 191 LfA236 Pappenheimer_Kronenapfel AT Transparente aus Croncels UK, Fruitbreed, DK 159 171 234 250 252 172 174 113 129 170 176 253 253 110 114 199 221 178 198 0 0 140 150 187 189 LfA174 Zabergaeurenette Zabergaurenette UK 159 175 250 252 182 182 111 125 127 138 158 178 223 227 253 96 108 171 199 178 180 205 227 140 140 175 189 191 LfA008 Bedufteter Pupurzwiebelapfel AT 159 159 248 250 172 182 113 117 138 170 209 209 134 134 171 171 170 176 191 227 140 142 189 193 LfA129 Bedufteter_Purpurzwiebel AT 159 159 248 250 172 182 113 117 138 170 209 209 134 134 171 171 170 176 191 227 140 142 189 193 LfA022 Bohntaubenapfel AT LfA115 evtl Bohntaubenapfel 157 157 228 240 170 182 111 119 138 158 215 253 136 140 171 207 174 204 191 225 134 152 193 197 LfA180 Dunkeler_Mostapfel AT 0 0 234 240 244 160 160 101 101 200 224 232 209 211 82 82 161 179 162 174 169 169 124 124 179 187 LfA029 Edelborsdorfer LfA78, 247 Edelborsdorfer Ap176, 177, 178, 169, 266 hier muß geklärt werden, welcher der als Edelborsdorfer bezeichneten Bäume, der echte Edelborsdorfer ist. Alle sind miteinander verandt 169 187 250 250 170 174 113 113 158 170 209 223 122 134 171 171 166 184 205 227 134 152 173 185 LfA078 Edelborsdorfer LfA29, 247 169 187 250 250 170 174 113 113 158 170 209 223 122 134 171 171 166 184 205 227 134 152 173 185 LfA247 Edelborsdorfer LfA29, 78 169 187 250 250 170 174 113 113 158 170 209 223 122 134 171 171 166 184 205 227 134 152 173 185 LfA011 Falscher Edelapfel AT LfA134 159 169 240 244 170 178 182 113 119 127 138 158 170 209 215 253 112 140 199 207 166 174 178 201 225 134 134 173 193 LfA134 Falscher_Edelapfel AT LfA11 159 169 240 244 170 178 182 113 119 127 138 158 170 209 215 253 112 140 199 207 166 174 178 201 225 134 134 173 193 LfA093 Falscher_Pfirsichroter_Sommerapfel AT 157 157 246 246 170 172 113 117 138 178 209 253 108 108 171 207 202 204 225 227 150 150 185 193 LfA107 Falscher_Taffetapfel AT LfA108; Belicné Fruitbreed 169 175 228 248 182 182 111 119 170 170 215 245 112 122 171 171 166 166 185 187 134 152 181 189 LfA108 Falscher_Taffetapfel AT LfA107; Belicné Fruitbreed 169 175 228 248 182 182 111 119 170 170 215 245 112 122 171 171 166 166 185 187 134 152 181 189 LfA77 Falscher_Triumph AT 189 189 238 248 250 170 182 111 113 117 158 170 215 227 108 122 134 171 221 176 180 184 185 187 201 134 140 152 183 187 193 LfA99 Fester_Glaenzender_Morgenduft AT 159 167 238 240 252 178 182 113 117 138 170 209 215 245 108 114 171 171 176 180 204 187 191 225 126 134 138 189 191 LfA089 Frueher_Suesser_Kardinal AT 189 189 240 252 170 176 113 129 170 178 253 253 108 112 199 207 180 180 183 225 140 140 169 185 LfA171 Fuerst_Bluecher 169 169 236 250 174 178 113 117 160 160 209 253 134 134 171 207 166 176 205 225 134 142 173 185 LfA032 Geflammter Kardinal LfA4, 204 159 169 244 246 178 182 111 113 170 170 209 223 108 114 199 207 166 202 201 225 146 152 191 195 LfA204 Geflammter_Kardinal LfA4, 32 159 189 228 240 250 170 176 180 117 119 138 158 196 223 227 253 108 112 114 171 197 166 170 180 191 225 134 142 150 154 173 189 193 LfA034 Gestreifter Cousinot LfA207 173 189 234 244 172 176 111 117 144 178 209 253 108 112 199 221 168 180 185 217 134 134 187 193 LfA207 Gestreifter_Cousinot LfA34 173 189 234 244 172 176 111 117 144 178 209 253 108 112 199 221 168 180 185 217 134 134 187 193 LfA062 Goldrenette_von_Peasgood 169 169 228 244 176 178 113 117 138 158 209 209 112 122 171 207 178 220 225 225 134 146 193 193 LfA111 Gruengelber_Quittenapfel AT LfA112 159 187 240 252 182 188 117 119 138 170 209 253 98 112 195 201 180 184 187 217 140 146 191 191 LfA112 Gruengelber_Quittenapfel AT LfA111 159 187 240 252 182 188 117 119 138 170 209 253 98 112 195 201 180 184 187 217 140 146 191 191 LfA014 Grüner Fürstenapfel 177 177 228 228 170 182 111 117 158 182 209 253 108 136 171 171 202 204 191 201 134 152 193 197 LfA188 Hauxapfel AT 195 195 228 252 170 180 103 119 170 170 227 227 108 134 207 221 202 204 191 225 134 148 154 189 193 LfA232 Huerther_Apfel LfA20 171 171 240 252 182 182 115 127 138 158 209 209 96 108 171 199 182 184 185 205 134 138 154 173 189 LfA64 Kalbensteinberger_Hartapfel AT 159 169 234 250 164 182 113 129 158 170 215 253 106 112 195 199 158 168 191 205 140 152 173 189 LfA136 Kalbensteinberger_Renette AT 157 161 238 244 170 178 113 127 138 170 209 215 116 140 171 199 166 178 201 225 134 134 193 193 LfA135 Kantenstreifling AT 171 171 246 250 178 184 109 119 178 178 215 253 96 108 199 201 180 204 ** 152 158 185 193 LfA023 Knollenapfel AT LfA86 173 189 234 250 172 182 113 117 138 170 209 227 112 112 171 221 178 204 185 187 152 152 189 189 LfA086 Knollenapfel AT LfA23 173 189 234 250 172 182 113 117 138 170 112 112 171 221 178 204 185 187 152 152 189 189 LfA235 Koestlicher_Tafelapfel AT 159 169 240 244 176 180 115 127 138 158 209 253 96 112 171 199 178 204 205 225 134 134 189 193 LfA238 Krafts_Adamsapfel AT LfA240 Luikenapfel Heunischhof AT LfA237 Luikenapfel Heunischhof 169 187 189 191 240 250 252 170 174 182 111 113 117 158 170 223 253 108 122 134 171 207 166 184 191 227 140 142 154 158 169 173 193 LfA141 Kugeliger_Lebeljakob AT Jakob Lebel Ap225, A10 NABU; Uk 159 159 244 250 170 174 180 111 115 138 170 182 209 211 223 108 112 199 207 221 176 178 204 191 201 225 140 142 148 154 189 195 LfA209 Laibstaedter_Sommerkellerapfel AT 183 185 238 240 182 190 111 127 138 170 223 253 114 114 171 215 176 178 187 205 140 140 175 191 LfA013 Langer grüner Gulderling Vinné hrebickové UK 155 155 238 252 172 182 119 119 158 170 211 221 108 122 171 219 166 176 205 225 138 148 189 191 LfA98 Leckere_Goldrenette AT 157 169 234 250 172 182 113 127 158 170 215 227 96 110 195 199 166 180 205 217 140 142 173 191 LfA018 Liegender Rotapfel AT Cannamele, Cossa; Fruitbreed 159 167 169 228 250 174 182 115 129 158 170 209 211 253 96 114 171 171 180 202 191 205 134 150 154 175 191 193 LfA173 Lohrer_Rambur 159 173 232 238 168 174 103 125 144 170 221 221 96 96 171 171 180 192 191 191 146 146 181 197 LfA240 Luikenapfel_Heunischhof AT LfA238 Krafts Adamsapfel LfA237 169 187 189 191 240 250 252 170 174 182 111 113 117 158 170 223 253 108 122 134 171 207 166 184 191 227 140 142 154 158 169 173 193 LfA164 Luxemburger_Triumpf Luxemburger Triumpf, Luxemburger Renette A12, Apf8, 9, 12; Ap82, 112, 167, 274 169 169 248 250 252 170 178 182 113 115 117 170 178 221 223 245 122 134 171 171 166 170 204 191 227 134 140 171 181 185 LfA231 Mariabrunner_Hartapfel AT LfA233 155 155 252 252 172 178 113 119 138 158 209 211 108 114 171 215 176 218 220 225 225 134 140 154 185 201 LfA233 Mariabrunner_Hartapfel AT LfA231 161 189 244 250 170 172 113 117 138 138 209 221 134 134 171 207 170 180 205 205 134 140 189 189 LfA066 Meininger_Apfel AT LfA148 155 155 228 238 172 182 111 113 138 170 223 245 96 112 171 217 166 188 185 205 134 142 181 185 LfA148 Meininger_Apfel AT LfA66 244 244 164 174 99 101 200 200 ** 104 126 161 179 162 174 173 209 132 134 183 187 LfA140 Pseudo_Hammerstein AT 159 179 181 238 252 172 174 113 117 138 178 221 221 114 134 171 207 170 176 187 187 126 140 189 193 LfA175 Pseudo_Winterrambur AT 169 177 228 240 250 164 172 182 103 111 158 170 209 245 247 108 112 134 171 199 176 202 204 187 191 225 134 140 152 185 189 193 LfA165 Rosa_Kroenchenapfel AT 169 177 228 246 180 182 113 115 170 170 211 221 223 114 114 171 199 178 202 201 205 134 146 193 195 LfA219 Roter_Herbstkalvill evtl Zwiebelborsdorfer Zwiebelborsdorfer Ap179 NABU 159 159 238 252 172 182 125 127 178 178 215 221 112 134 171 195 180 180 187 187 138 140 173 189 LfA063 Roter_Jungfernapfel AT 159 159 238 250 178 182 113 115 138 170 245 245 96 118 171 207 166 176 187 225 134 148 185 185 LfA234 Roter_Walzenapfel AT 159 169 228 246 164 172 180 113 129 138 170 223 253 108 112 171 199 207 166 176 202 185 191 201 140 148 150 185 193 LfA091 Saarhofapfel AT 159 159 236 250 164 182 111 111 138 178 245 253 96 112 171 215 166 180 205 217 138 148 154 191 193 LfA167 Schoener-Limeswegapfel AT 171 189 228 234 240 172 178 109 115 121 138 182 211 223 245 108 112 122 195 199 221 180 186 204 187 205 225 134 142 152 189 189 LfA127 Schulheckenapfel AT 173 183 238 252 172 182 113 119 176 178 209 223 108 108 171 171 176 180 225 225 140 152 189 191 LfA178 Spaeter_Transparent 159 169 195 228 240 244 164 178 180 103 113 115 158 170 178 211 223 253 98 108 114 199 217 178 192 187 225 134 140 148 173 185 193 LfA218 Spitzer_Prinzenapfel AT 153 159 236 244 170 180 119 129 138 178 213 253 98 110 171 199 166 186 217 225 140 152 173 189 LfA073 Straßenkurvenapfel AT 153 159 238 250 176 182 111 111 138 138 209 221 96 108 171 171 166 176 225 225 144 146 185 189 LfA104 Strobels_Zigeuner AT 159 159 238 244 176 178 113 117 158 178 209 221 106 114 171 171 180 204 187 225 134 146 189 193 LfA123 Taeschender_Bellefleur AT 157 161 240 252 172 178 119 129 138 178 211 215 110 134 195 215 180 218 220 225 225 142 144 173 193 LfA109 Tonnenfoermiger_Kuechenapfel AT LfA138 159 159 250 250 170 182 113 127 170 178 253 253 96 108 199 207 176 178 199 227 140 140 191 193 LfA138 Tonnenfoermiger_Kuechenapfel AT LfA109 159 159 250 250 170 182 113 127 170 178 253 253 96 108 199 207 176 178 199 227 140 140 191 193
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Genetischer Fingerabdruck von regionalen und lokalen
Apfel- und Birnensorten in den Landkreisen
Weißenburg-Gunzenhausen und Ansbach
Bericht zum Auftrag
des
Landschaftspflegeverbands Mittelfranken
vertreten durch
Johanna Sieger und Diana Schmidt
Berichterstattung
Christina Mengel, Dr. Sascha Liepelt & Prof. Dr. Birgit Ziegenhagen
Philipps-Universität Marburg
Fachbereich Biologie
AG Naturschutzbiologie
Marburg, im Dezember 2019
1. Einleitung
Im Sommer 2019 erhielten wir vom Landschaftspflegeverband Mittelfranken (LPV) im Rahmen
des Glücksspirale-Projektes "Genotypisierung von Obstsorten“ 77 Apfel- und 71 Birnenblattproben von regionalen Sorten bzw. alten Sorten aus den mittelfränkischen
Landkreisen Weißenburg-Gunzenhausen und Ansbach zwecks Genotypisierung. Sorten bzw. Bäume, bei denen man sich unsicher war, ob es sich wirklich um die jeweils bezeichnete Sorte handelte, oder die nicht bestimmt werden konnten, wurden mit AT (Arbeitstitel) vermerkt. Ziel der Untersuchungen war es zum einen herauszufinden, ob es sich bei namentlich gleichen „Sorten“ wirklich um dieselbe „Sorte“ handelt. Darüber hinaus wurden die Daten in die schon in Marburg vorhandene Datenbank eingepflegt. Diese Datenbank entstand in Zusammenarbeit mit dem NABU Recklinghausen und enthält eine Vielzahl von genotypisierten Apfel- und Birnenabsammlungen nordrheinwestfälischer Streuobstwiesen. Ein Abgleich mit diesen Genotypen sollte es ermöglichen, bereits pomologisch „sicher“ zugeordnete Sorten noch einmal genetisch zu bestätigen und, herausfordernder, „unsichere“ oder fehlbestimmte Sorten im besten Falle sicher zu identifizieren. Eine erfolgreiche genetische Identifizierung bedarf zunächst eines molekulargenetischen treffsicheren Werkzeuges, welches die Erzeugung eines unverwechselbaren DNA-Fingerabdruckes ermöglicht. Auch steht und fällt die namentliche Zuordnung bzw. Identifizierung einer Sorte mittels einer in der Datenbank vorhandenen genetisch identischen Sorte deutlich mit der Anzahl vorhandener Datenbanken und darin enthaltener Daten. Die eigene Datenbank (NABU-Universität Marburg) ist mit ca. 500 Einträgen vergleichsweise klein, sodass wir in Zukunft erpicht sind, einen Abgleich mit der Deutschen Genbank Obst (DGO) in die Routine zu bringen, in welcher ca. 6000 Apfelsorten genotypisiert vorliegen. Leider ist diese Datenbank noch nicht öffentlich verfügbar, so dass wir für die Auftragsarbeiten zum gewünschten Abgabezeitpunkt des Berichtes das maximale Identifizierungspotenzial eines Abgleiches durch eine umfassende Datenbank noch nicht einsetzen konnten (siehe Ausblick). Dennoch haben wir die hierfür nötigen Voraussetzungen bereits geschaffen. Wir haben einige Marker, die von uns in den Vorjahren verwendet wurden, gegen andere Marker ausgetauscht, um die in Marburg erzeugten Daten später vor allem mit den DGO Daten abgleichen zu können. Auch ohne die noch nicht nutzbaren DGO-Daten haben wir für den hier vorgelegten Bericht für den Apfel mit den letztgültig gewählten Markern, der eigenen Datenbank und einigen offen zugänglichen Datenbanken eine bestmögliche Identifizierung erreicht. Die Birne ist genetisch vergleichsweise noch unterrepräsentiert. Die DGO wird jedoch in näherer Zukunft auch um Birnengenotypen ergänzt. Dazu hat uns das Julius Kühn Institut, Pillnitz, seine Birnen-Markerauswahl vermittelt, die wir für die vorliegende Arbeit einsetzen konnten. Damit konnten wir nicht nur eine hinreichende Identifizierung für den jetzigen Auftragszeitraum erreichen bzw. Genotypen für die Birne katalogisieren, sondern auch die Basis für einen späteren größeren Abgleich auch bei der Birne schaffen (siehe Ausblick). Wir haben darum entschieden, die LPV-Proben für Apfel und Birne aus dem Vorjahr zusätzlich noch an diesen neu ausgewählten Marker-Orten zu genotypisieren. Die Daten wurden in diesen Bericht mit aufgenommen.
Für eine bessere Lesbarkeit des Haupttextes befinden sich die Rohdaten (Genotypentabellen von Apfel und Birne) im Anhang. Dort sind auch „Mikrosatelliten-Essentials“ zu finden, die einige wesentliche Informationen zu diesem Markertyp vermitteln.
Eine Box soll zunächst den genetischen Fingerabdruck in verständlicher Weise beschreiben.
BOX: Was ist ein genetischer Fingerabdruck und wie wird er ermittelt?
Als genetischer Fingerabdruck wird ein unverwechselbares DNA-Profil eines Individuums verstanden. Die DNA wird bei Pflanzen häufig aus Blättern extrahiert und hierzu Routineprotokolle eingesetzt.
Für den genetischen Fingerabdruck werden bestimmte zwischen 100 und 300 Basenpaare lange Abschnitte/Orte auf der DNA untersucht, die jeweils Sequenzen enthalten, welche Mikrosatelliten heißen und charakteristischerweise Wiederholungseinheiten kleinster Basenabfolgen repräsentieren (in Box Abb. 1 zum Beispiel die 2-er Wiederholung „CA“). Die Variation beruht auf einer unterschiedlichen Anzahl solcher Wiederholungseinheiten und führt zu einer Längenvariation des gesamten Abschnittes (= Ort oder auch Fragment) (Box Abb. 1).
Box Abb. 1: Dieses Schema zeigt beispielhaft, wie sich drei verschiedene Apfelsorten an dem Ort A für ihre genetischen Unterschiede darstellen lassen würden. Von oben nach unten würden die Sorten (1-3) je zwei (weil diploider = zweifacher Chromosomensatz) Fragmente mit den Gesamtlängen [in Basenpaaren] 1. 177/185, 2. 177177 und 3. 185/185 tragen. Die an einem Ort zu beschreibenden genetischen Zustandsformen (hier Fragmentlängen) heißen in der Fachsprache Allele.
Um diese Orte zu untersuchen, sequenziert man diese Sequenzen in der Regel nicht, sondern es genügt, die Allele eines solchen Ortes als Fragmentlängen zu charakterisieren, d.h. ohne jede einzelne Base zu identifizieren und sie dann durchzuzählen. Stattdessen geht man indirekt
Schema eines variablen Abschnittes/Mikrosatelliten-Ortes (A)
auf einem Beispiel-Chromosom
(bei vielen Organismen in doppelter Ausführung vorhanden mit zwei Allelen)
Die eigentliche hoch variable Sequenz (der sogenannte Mikrosatellit)
ist in blauen Lettern gekennzeichnet.
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wie folgt vor. Um die Fragmente (quantitativ) besser untersuchen zu können, werden solche Abschnitte zunächst vervielfältigt über ein Verfahren, welches Polymerase-Kettenreaktion (PCR) heißt. Dazu werden über sogenannte Primer, die aus etwa 20 Basenpaaren komplementär zu den Flankenbasenpaaren des mikrosatellitentragenden Abschnittes bestehen und wie „Spürhunde“ arbeiten, die Zielfragemente angesteuert und in der Folge vervielfacht. Danach werden die Längenunterschiede über eine Gelelektrophorese ermittelt. Die Gele (zumeist aus Polyacrylamid) sind eine geleeartige Matrix mit vielen kleinsten Poren, durch welche die Fragmente wandern können, wenn ein elektrisches Spannungsfeld angelegt wird. Da die DNA negativ geladen ist, wandert sie vom Minus- zum Pluspol. Je länger ein Fragment ist, desto langsamer ist es auf „seiner Wanderung“ durch das Gel. Die „Wanderzeit“ eines Fragmentes wird gemessen, in dem die Wanderzeitdifferenz vom Start bis zum Ziel ermittelt wird. An der Ziellinie erfasst ein Laser das vorbei wandernde Fragment, welches in einer für den Laser sichtbaren fluoreszierenden Farbe leuchtet (die Farbe wird bereits während der PCR in das Fragment inkorporiert). Im messenden Gerät erfolgt ein Ausschlag (Peak) in der physikalischen Einheit „optische Dichte“, wenn der Laser „anschlägt“. Eine Umrechnung von Wanderzeit in Fragmentlängen erfolgt über einen Vergleich mit Fragmenten bekannter Sequenzlänge, die mit den „unbekannten“ Proben mitlaufen. Über geräteinterne Algorithmen wird in der Folge intrapoliert und zuletzt die Ergebnisse der Fragmentlängenanalyse als Rohdaten ausgegeben.
Die graphische Ausgabe der Rohdaten ist ein sogenanntes Elektropherogramm bzw. Fluorogramm (Box Abb. 2)
Box Abb. 2: Elektrofluorogramm der drei DNA-Sequenzen (entsprechend der drei Sorten) aus Abb. Box 1. Auf der y-Achse ist die optische Dichte abgetragen und auf der x-Achse die aus Standardlängen und Wanderzeiten umgerechneten Fragmentlängen. Zwei der fiktiven Sorten sind am Ort A gleicherbig (homozygot), d.h. sie tragen auf beiden Allelen dieselbe Sequenz und sind gleich lang. Hier fallen beide Ausschläge zu einem einzigen zusammen. Hingegen sind die beiden verschiedenen Allele für die mischerbige Sorte (heterozygote Sorte) auch deutlich mit zwei Ausschlägen zu erkennen. Die aus der Maschine kommenden intraplierten Rohdaten haben in der Regel Dezimale, die gerundet werden, so dass wir die in Box Abb. 1 und Box Tab. 1 dargestellten ganzzahligen Allellängen erhalten.
Im Weiteren werden alle für ein unverwechselbares DNA-Profil untersuchten Abschnitte/Orte in großen Tabellen zusammengestellt (siehe auch Tabellenwerke des vorliegenden Berichtes). In unserem kleinen Beispiel wäre dieses eine um drei Orte erweiterte Tabelle.
Box Tab. 1: Beispiel für DNA-Profile bzw. tabellarische genetische Fingerabdrücke diploider Individuen oder hier diploider fiktiver Sorten. Die Allellängen an den Orten B und C sind ohne obige Herleitung rein erfunden und sollen lediglich das Prinzip verdeutlichen.
Sorte DNA Marker-Ort A mit zwei Allelen – Länge in Basenpaaren
DNA Marker-Ort B mit zwei Allelen – Länge in Basenpaaren
DNA Marker-Ort C mit zwei Allelen – Länge in Basenpaaren
1 177 185 256 264 186 198
2 177 177 254 262 184 198
3 185 185 248 258 182 190
Eine sehr übliche Frage ist: Mit wie vielen Abschnitten (DNA Marker-Orten) sollte man arbeiten, um ein unverwechselbares Profil für ein x-beliebige Sorte und eine x-beliebige Zahl und Herkunft an Apfelsorten zu erhalten? Die Variation an solchen nicht-kodierenden Orten der DNA ist sehr hoch mit oft bis zu 30-40 Allelen in Populationen oder in den vielen nunmehr tausenden genotypisierten Apfelsorten.
Es wird schnell verständlich, dass mit der damit verbundenen mächtigen Kombinatorik jedwede Sorte von einer anderen zu unterscheiden ist. Ein gängiges Postulat ist, dass man an so vielen Orten wie es Chromosomen gibt, arbeiten sollte. Im Fall des Apfels wären dieses 17 Marker-Orte mit je einem Ort auf jedem der 17 Chromosomen. Dieses ist, wie wir belegen können, nicht immer notwendig. In unseren Untersuchungen erwiesen sich 10 Marker-Orte als hinreichend. Es lassen sich auf diese Weise Chemikalien und Kosten mit derselben Aussagekraft sparen. Sprachgebrauch: DNA-Mikrosatellitenmarker markieren die den Mikrosatelliten zu eigene Variation an den jeweiligen untersuchten DNA-Abschnitten (= Orten), auch DNA-Marker-Orte oder im folgenden Bericht oft auch einfach nur Genorte genannt. „Multiplexen“ ist ein Verfahren, welches es uns erlaubt, Sorten an mehreren Marker-Orten gleichzeitig zu untersuchen.
Auftrag und Arbeitsprogramm
Anfertigung eines genetischen Fingerabdruckes für regionale und lokale Apfel- und Birnensorten aus Mittelfranken für Identifizierungs- und Erhaltungsmaßnahmen mit folgenden Teilleistungen:
Untersuchung der angelieferten Blätter an 12 Mikrosatellitenorten für Apfel und 11 Mikrosatellitenorten für Birne (Markerorte = Marker-Loci)
Analyse der Daten auf genetische Identität, Synonyme und Fehlbezeichnungen
Ermittlung von genetischen Ähnlichkeiten
Vergleich der Analysenergebnisse mit den „Sorten“ aus der Literatur und Nordrhein- Westfalen (MR Datenbank)
Einspeisung der sicher zugeordneten Sorten in das in MR vorliegende Fingerabdruckkataster (MR Datenbank)
Erstellung einer „Allelischen Leiter“ für Apfel und Birne für alle von uns eingesetzten Marker, um diese an Laboratorien, die ebenfalls mit diesen Obstarten und Markern arbeiten, weiterzugeben. Damit sollen Längenverschiebungen von Allelen, die durch die Verwendung unterschiedlicher Geräte und Chemikalien zustande kommen, berechnet werden können (siehe Mikrosatelliten - Das Wesentliche in Kürze - im Anhang).
Weitere wichtige Verständnishilfen und Definitionen vorab:
Genetische und pomologisch referenzierte Datenbanken beim Apfel und deren Kennung:
MR (Marburger Datenbank): Gemeinschaftshaltung: NABU Recklinghausen und AG Ziegenhagen - die Genotypen/Sorten tragen die Probenbezeichnungen A, Apf und Ap
(https://nrw.nabu.de/natur-und-landschaft/landnutzung/streuobst/lokale-obstsorten-erhalten/23861.html)
KOB: Apfeldatenbank des Kompetenzzentrums Obstbau-Bodensee https://www.biolago.org/mitglied/kompetenzzentrum-obstbau-bodensee-kob (siehe auch Xuan 2007)
Fruitbreedomics: Eine gesamteuropäische Datenbank
(Fruitbreedomics @ PTP.html)
DK: Über Fruitbreedomics hinausgehende Genotypen aus Dänemark (Larsen et al. 2018)
NL: Über Fruitbreedomics hinausgehende Genotypen aus den Niederlanden (Van Treuren et al. 2010)
UK: Über Fruitbreedomics hinausgehende Genotypen aus dem Vereinigten Königreich (Fernandez-Fernandez 2010; Ordidge et al. 2018)
Genetische und pomologisch referenzierte Datenbanken bei der Birne:
Für die Birne wurden die folgenden Referenzen zum Vergleich herangezogen. Die mit dem NABU gemeinsam gehaltene Datenbank mit Birnen aus NRW in der Marburg Datenbank und die aus der Literatur stammenden Datenbanken von Urrestarezu et al. (2015), Queiroz (2015) sowie Sehic et al. (2012).
Wichtige Voraussetzungen/Definitionen für eine Interpretation der genotypischen Daten (Allellängen pro Ort in Basenpaaren gemessen)
Genetisch identische Proben haben an allen untersuchten Genorten dieselben Allele (dieselben Längen).
Wir verstehen zwei Proben als möglicherweise verwandt, wenn sie sich an allen untersuchten Genorten mindestens ein Allel teilen. Teilen sich die Proben an den untersuchten Genorten nicht mindestens ein Allel, so sind sie nach unserer Definition auch nicht miteinander verwandt. Auch dann nicht, wenn sie an manchen Genorten identisch sind. Unsere Interpretation einer möglichen Verwandtschaft ist immer noch nur eine Annahme, die vielfach im Zusammenhang mit pomologischen Befunden steht. Sie kann in besonders interessanten und unsicheren Fällen zu einer Diskussion mit Pomologen anregen und bei Bedarf anhand einer größeren Anzahl von Markern über alle Chromosomen überprüft werden. In den vielen Fällen, in denen eine echte Verwandtschaft (Genealogie) (noch) nicht nachgewiesen ist, wäre der Begriff „genetisch verwandt“ durch „genetisch sehr ähnlich“ zu ersetzen. Auf diese feine sprachliche Differenzierung haben wir in der Folge verzichtet.
Als fast identisch werden diejenigen Proben bezeichnet, bei denen der Basenpaarunterschied so groß bzw. so klein ist wie eine Wiederholungseinheit, in der Regel zwei Nukleotide. Hierbei könnte es sich um Rundungs- oder Detektionsfehler handeln, oder aber auch um eine somatische Mutation, die als eine Folge einer wiederholten Gewinnung von Pfropfreisern aus sehr alten Ursprungsindividuen auftreten könnte.
2. Material und Methoden
Die Proben wurden uns vom LPV nummeriert von 1-189 zugesendet. Da es die Nummerierung vom LPV 1-49 schon im Jahr 2018 gab, wurden die aus 2019 stammenden Proben 1-49 mit der Nummer 201 – 249 versehen. Der Einfachheit halber und, um Äpfel und Birnen numerisch voneinander zu trennen, wurde unsererseits vor die Probennummer bei den Äpfeln ein LfA und bei Birnen ein LfB gesetzt. Labornummer, Sorte, Herkunft und Hinweise betreffend den vom LPV gelieferten Proben sind für die Äpfel und Birnen in Tabelle 1 im Anhang aufgeführt.
DNA-Extraktion und PCR (Polymerasekettenreaktion) wurden wie im LPV Bericht vom Juni 2019 beschrieben, durchgeführt.
Tabelle 1: Apfelmarker mit Markernamen, Farbstoff (Label) und Sequenzen für forward- und reverse-Primer (aus Liebhard et al. 2002; *Hokanson et al 1998). In vorhergehenden Untersuchungen verwendete Marker. Markername Label Primer-Sequenz forward Primer-Sequenz reverse
CH01H01 Vic GAAAGACTTGCAGTGGGAGC
GGAGTGGGTTTGAGAAGGTT
CH02d08 Fam TCCAAAATGGCGTACCTCTC
GCAGACACTCACTCACTATCTCTC
CH01F02 Ned ACCACATTAGAGCAGTTGAGG
CTGGTTTGTTTTCCTCCAGC
CH05e03 Vic CGAATATTTTCACTCTGACTGGG
CAAGTTGTTGTACTGCTCCGAC
CH04e05 Vic AGGCTAACAGAAATGTGGTTTG
ATGGCTCCTATTGCCATCAT
CH02c09 Fam TTATGTACCAACTTTGCTAACCTC
AGAAGCAGCAGAGGAGGATG
CH5f6 TMR TTAGATCCGGTCACTCTCCACT
TGGAGGAAGACGAAGAAGAAAG
CH1f3b Pet GAGAAGCAAATGCAAAACCC
CTCCCCGGCTCCTATTCTAC
CH4c7 TMR GGCCTTCCATGTCTCAGAAG
CCTCATGCCCTCCACTAACA
CH3d7 Pet CAAATCAATGCAAAACTGTCA
GGCTTCTGGCCATGATTTTA
GD147* TMR TCCCGCCATTTCTCTGC
GTTTAAACCGCTGCTGCTGAAC
CH1f7a Hex CCCTACACAGTTTCTCAACCC
CGTTTTTGGAGCGTAGGAAC
All diese Marker wurden auch vom Julius-Kühne-Institut zur Genotypisierung der Äpfel verwendet. In Tabelle 2 ist aufgeführt, welche der von uns verwendeten Marker auch in anderen Datenbanken zu finden sind.
Tabelle 2: Überblick über die von uns verwendeten 12 Marker und deren Verwendung in anderen Datenbanken. Es ist günstig, wenn die Marker auf so vielen Kopplungsgruppen (Chromosomen) liegen wie möglich, da dieses die Zahl der Re-Kombinationen in die Höhe treibt, und damit die Güte des Markersets maximiert wird.
Primer Kopplungs-gruppe
DGO DK UK Europa (Fruitbreed)
Portugal KOB NL
CH2d8 11 X X X X X X X
CH1f2 12 X X X X X X
CH1H1 17 X X X X X X
CH2c9 15 X X X X X X
CH4e5 7 X X X X X
CH1f3b 9 X X X X X
CH4c7 14 X X X X X X
CH3d7 6 X X X X
CH5e3 2 X X X
GD147 4 X X X X X
CH5f6 5 X X X X
CH1f7a 10 X X
Die Birnensorten wurden mit den in Tabelle 3 aufgeführten 10 Mikrosatelliten Markern genotypisiert.
Tabelle 3: Birnenmarker mit Markernamen, Farbstoff (Label) und Sequenzen für forward- und reverse-Primer (CHxxx aus Liebhard et al. 2002, EMPcxx aus Gasi et al. 2013, GD aus Hokanson et al. 1998 und in gelb hinterlegt in vorhergehenden Untersuchungen verwendete Primer).
Primername Label Sequenz forward Sequenz reverse
CH02b10 Fam CAAGGAAATCATCAAAGATTCAAG
CAAGTGGCTTCGGATAGTTG
CH03G07 Pet AATAAGCATTCAAAGCAATCCG
TTTTTCCAAATCGAGTTTCGTT
EMPc117 Fam GTTCTATCTACCAAGCCACGCT
CGTTTGTGTGTTTTACGTGTTG
CH1f7a Hex CCCTACACAGTTTCTCAACCC
CGTTTTTGGAGCGTAGGAAC
CH1d8 Fam CTC CGCCGCTATAACACTTC
TACTCTGGAGGGTATGTCAAAG
CH3d12 Fam GCCCAGAAGCAATAAGAAACC
ATTGCTCCATGCATAAAGGG
CH04e03 Pet TTGAAGATGTTTGGCTGTGC
TGCATGTCTGTCTCCTCCAT
GD147 TMR TCCCGCCATTTCTCTGC
GTTTAAACCGCTGCTGCTGAAC
CH5c6 Hex ATTGGAACTCTCCGTATTGTGC
ATCAACAGTAGTGGTAGCCGGT
EMPC11 TMR GCGATTAAAGATCAATAAACCATA
AAGCAGCTGGTTGGTGAAAT
EmPC117, CH1f7a, CH1d8, CH3g7, CH5c6 und EMPC11 sind auch in den Genotypisierungsdatenbanken aus Portugal zu finden. Sehic et al. (2012) untersuchten an den auch von uns verwendeten 7 Marker-Orten EMPC117, CH1f7a, CH1d8, CH3d12, CH4e3, GD147, CH5c6 und EMPC11 49 europäische Birnensorten. Die in Italien untersuchten Proben überschneiden sich mit unseren Primern nur an 3 Marker-Orten: EMPC117, CH2b10 und CH3G7. Die PCR-Cocktails wurden, wie in Tabelle 4 aufgeführt, angesetzt und in einem Thermocycler (Biometra, Göttingen oder Bioer Life ECO, Biozym, Deutschland) durchgeführt.
Tabelle 4: PCR-Ansatz/Probe. X= Der PCR-Ansatz wurde mit Aqua bi-dest auf ein Gesamtvolumen von 14,6 µl aufgefüllt.
Bestandteil Menge (μl/Probe) Hersteller Aqua bi-dest X
10 x PCR-Puffer B 1,7 Projodis, Sinn, Deutschland
MgCl₂ (25 mM) 1,7 Projodis, Sinn, Deutschland
Forward-Pimer Ned, Pet, Vic (5 µM), fluoreszenzmarkiert standardisiert 0,85
Thermo Fisher Scientific, Leon Rot, Deutschland
Forward-Primer Fam (fluoreszensmarkiert); Reverse-Primer (5 µM) standardisiert 0,85 Metabion, Martinsried, Deutschland
dNTPs (je 5 mM) 1,0 Bioline, Luckenwalde, Deutschland
BSA (20 mg/ml) 0,13
Thermo-Fischer Scientific, St. Leon-Rot, Deuschland
Taq-Polymerase (5 u/μl) 0,13 Projodis, Sinn, Deutschland
DNA (10 ng/μl) 2 Probe
Mit den neu hinzugenommenen Primern wurden an jeweils 8 Proben zunächst Einzel-PCRs durchgeführt, um sie auf ihre Amplifikationsfähigkeit zu überprüfen und bei schlechter oder schwacher Amplifikation Änderungen im PCR-Ansatz (Magnesiumkonzentration, Primermenge, Anzahl Zyklen, Annealingtemperatur) vorzunehmen, die zu einer Verbesserung der Amplifikation und zu auswertbaren Ergebnissen führen sollten. Später wurden dann, um Kosten und Zeit zu sparen, Multiplex-PCRs Tests mit 8 Proben durchgeführt. Bei einer Multiplex-PCR können Primer mit gleicher Annealingtemperatur und unterschiedlicher Farbstoffmarkierung oder aber wenn sie mit dem gleichen Farbstoff markiert sind, große Unterschiede in ihren Fragmentlängen (mindestens 80 Basenpaare) aufweisen, in einer einzigen PCR zusammen angesetzt werden.
Bis auf GD147 bei Apfel wurden alle PCRs mit dem in Tabelle 5 beschriebenen PCR Programm durchgeführt. GD147 wurde mit einem Touch-down Programm durchgeführt (siehe Tabelle 6). Tabelle 5: Temperaturprogramm – Standard-PCR
Schritt Temperatur Dauer Wiederholung
°C
1 94 Pause
2 94 5 Minuten
3 94 30 sec Schritt 3-5
4
siehe unten Multiplex 45 sec
siehe unten Multiplex
5 72 30 sec
6 72 10 Minuten
7 8 Pause
Tabelle 6: Touch-down PCR für Primer GD147T MR Apfel Schritt Temperatur Dauer Wiederholung
°C
1 94 Pause
2 94 5 Minuten
3 94 30 Schritt 3-5
4 58-49 45 Pro Zyklus -1°C
5 72 30 X 10
6 94 30
7 53 45 Schritt 6-8
8 72 30 X25
9 72 10 Minuten
10 8 Pause
Apfel
Bei den Multiplex Test PCRs stellte sich heraus, dass die ansonsten standardisierte Primermenge bei einigen Primern geändert werden musste, damit die Signale im ABI nicht zu hoch oder zu niedrig werden. Die Angabe der Primermenge in µl/Probe findet sich in Klammern hinter dem Markernamen. Nachfolgend finden sich die geeigneten Multiplex PCRs.
Multiplex 1: 59 °C Annealingtemperatur, 30 Zyklen
CH5e3 Vic (0,65 µl) CH2c9 Fam (0,85 µl) CH5f6 Tamra (0,85 µl)
Multiplex 2: 56 °C Annealingtemperatur, 30 Zyklen
CH1H1 Vic (0,65 µl) CH2d8 Fam (0,85 µl) CH1f3b Pet (1,05 µl) CH4c7 Tamra (0,85 µl)
Multiplex 3: 54 °C Annealingtemperatur, 35 Zyklen
CH4e5 Vic (0,75 µl) CH1f2 Ned (0,95 µl) CH3d7 Pet (0,95 µl)
Einzel-PCRs CH1f7a Hex (0,85 µl) 58 °C Annealingtemperatur, 30 Zyklen
GD147 Tamra (0,95 µl) Touch-down PCR (siehe Tabelle 6)
Birne
Multiplex 1: 58 °C Annealingtemperatur; 35 Zyklen
CH1f7a Hex (0, 85µl) CH1d8 Fam (0, 75µl)
Multiplex 2: 55 °C Annealintemperatur, 35 Zyklen
CH3G7 Pet (0,85 µl) CH3d12 Fam (0,85 µl)
Multiplex 3: 53 °C Annealingtemperatur, 35 Zyklen
CH4e3 Pet (0,95 µl) GD147 Tamra (1,05 µl)
Multiplex 4: 59 °C Annealingtemperatur 35 Zyklen
CH5c6 Hex (0,85 µl) EMPC11 Tamra (0,85 µl)
Einzel-PCRs EMPC117 Fam (0,95 µl), 60 °C Annealingtemperatur, 35 Zyklen
CH2b10 Fam (0,85 µl), 51 °C Annealingtemperatur, 35 Zyklen
Bei allen von uns verwendeten Apfel- und Birnenmarkern handelt es sich um 2er Wiederholungsmotive, d.h. Allellängenunterschiede treten in Längenabständen entsprechend der 2er Basenpaardifferenzen auf und können minimal zwei Basenpaare betragen.
Fragmentlängenanalyse (Genotypisierung) Die PCR-Produkte zur Fragmentlängenbestimmung (Genotypisierung) wurden mit einer Kapillarelektrophorese (ABI Genetic Analyzser 3500, Thermo Fisher Scientific, Deutschland) detektiert. Damit die Fragmente von dem Laser im Gerät erkannt werden können, sind die Forward-Primer in der PCR mit einem Farbstoff markiert (gelabelt). Als Label dienten die vier Fluoreszenzfarbstoffe FAM, Ned bzw. Tamra, Pet und Vic bzw. Hex. Der fünfte Farbstoff, den das Gerät erkennen kann, ist Liz. Mit diesem ist der interne Längenstandard GENESCAN-600 LIZ (Thermo Fisher Scientific) markiert, welcher zu jedem ABI-Probenansatz gegeben wird, um den Fluoreszenzpeaks normalisierte und somit analysierbare Fragmentlängen zuweisen zu können. Durch die unterschiedlich farbstoffmarkierten Primer lassen sich mindestens vier Primer in einer ABI-Probe anwenden bzw. vier Loci untersuchen. Dadurch können Kosten für den ABI (die Chemikalienkosten für dieses Gerät sind sehr hoch) eingespart werden. Die Probenplatte wurde nach ABI Anleitung vorbereitet und analysiert. Für jede Probe wurden 10 µl Standardmix, bestehend aus 9,8 µl Hi Dye formamid und 0,2 µl Liz-Standard angesetzt und in die Höhlungen (engl. Wells) der Probenplatte, in die später dann die Probe pipettiert wurde, vorgelegt. Die Auswertung der Fragmentlängen erfolgte mit dem Programm GeneMarker (Lizenzversion für ABI). Um auswertbare Signale im ABI zu generieren, müssen alle PCR Produkte, bevor sie in die Analysenplatte pipettiert werden, verdünnt werden. Hierfür wurden alle PCRs 10 + 2 (10µl bidest + 2 µl PCR Produkt) verdünnt und 2µl der Vedünnung zu dem vorgelegten Liz Standard in die Analysenplatte pipettiert.
Beim Apfel ergaben sich 4 ABI Läufe. Die 3 Multiplexe wurden getrennt in die Analysenplatten pipettiert und die beiden Einzel-PCRs zusammen in eine Platte pipettiert und analysiert.
Bei der Birne ergaben sich 3 ABI Läufe. Hier werden die Multiplexe 1 und 2 zusammen in eine Platte, Multiplex 3 und EMPC117 Fam in eine weitere Platte und Multiplex 4 und CH2b10 Fam in die 3 Analysenplatte pipettiert und genotypisiert.
Allelische Leitern
Aus allen uns vorliegenden Proben wurden für jeden Marker und nach Apfel und Birne getrennt die Fragmentlängen ausgewählt, die das gesamte Fragmentlängenspektrum an dem jeweiligen Markerort abdecken. Um zu sehen, wie die Qualität (Peakhöhe, evtl. Stotterpeaks) der ausgesuchten Proben ist, wurden diese erneut genotypisiert. Erschienen sie als geeignet für die Allelische Leiter, wurden PCRs mit nicht farbstoffmarkierten Primern durchgeführt. Unser Ziel ist es, diese Leitern anderen Laboren, die mit diesen Primern arbeiten, zur Verfügung zu stellen, so dass maschinenbedingte Fragmentlängenunterschiede berechnet werden können. Je nachdem mit welchem Farbstoff die Labore arbeiten, würde unser Farbstoff stören, daher wurden die PCRs mit unmarkierten (ungelabelten) Primern durchgeführt. Die PCRs für die ungelabelten Primer wurden mit der Dream-Taq green Polymerase (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Der Puffer enthält einen grünen Farbstoff und 20 mM Magnesiumchlorid.
Der PCR Ansatz findet sich in nachfolgender Tabelle 7.
Tabelle 7: PCR Ansatz Dream-Taq green. Ansatz pro Probe. Gesamtvolumen 25µl
Bestandteil Menge (μl/Probe) Hersteller Aqua bi-dest X
10x PCR-Puffer green (20mM MgCL² included) 2,5
Thermo Fischer Scientific, Leon Rot, Deutschland
MgCl₂ (25 mM) 0,75 Projodis, Sinn, Deutschland
Forward-Pimer (5 µM) 1,3 Metabion, Martinsried, Deutschland
Reverse-Primer (5 µM) 1,3 Metabion, Martinsried, Deutschland
dNTPs (je 5 mM) 1,2 Bioline, Luckenwalde, Deutschland
BSA (20 mg/ml) 0,2
Thermo-Fischer Scientific, St. Leon-Rot, Deuschland
Taq-Polymerase (5 u/μl) 0,2 Projodis, Sinn, Deutschland
DNA (10 ng/μl) 3 Probe
Die PCRs wurden mit den PCR-Programmen entsprechend der Prozedur bei den markierten Primern durchgeführt. Um die Amplifikation zu überprüfen, wurden 5 µl PCR Produkt/Probe in ein 1%- iges Agarosegel aufgetragen und im 0,5 x TBE Puffer bei einer Spannung von ca. 150 Volt für ca. 60 Minuten laufen gelassen. Anschließend wurde das Gel in einem GelRed Färbebad angefärbt und unter UV Licht mit Hilfe der Geldokumentation von Biometra die Amplifikate sichtbar gemacht. Je nach Farbintensität des Fragments im Gel wurde dann für jeden Primer von jedem Fragment ein Aliquot aus dem PCR Produkt entnommen und in ein PCR Tube pipettiert, so dass ein Fragmentmix entsteht. Hierbei wurde von schwächeren Amplifikaten mehr PCR Produkt pipettiert als von starken Amplifikaten, um später dann in der allelischen Leiter möglichst gleich hohe Peaks zu bekommen. Zur Überprüfung, ob der allelische Leiter-Mix zufriedenstellend ist oder aber ob der Mix geändert werden muss, wurde dieser Mix reamplifiziert. Für die Reamplifikation wurde wiederum eine PCR mit dem gelabelten Primer durchgeführt. Hierfür kamen 1-2 µl Leitermix zum Einsatz. PCR und PCR Ansatz folgten der Prozedur, die auch bei den gelabelten Primern durchgeführt wurde. Das PCR Produkt wurde daraufhin im ABI analysiert, um zu sehen, ob der Mix geeignet oder noch verändert werden muss. Ein weiterer Schritt war, den Mikrosatelliten-Repeat-Typ, so wie er von den Primerentwicklern angegeben wurde, zu überprüfen. D.h., handelt es sich z.B. bei den angegebenen Repeat-Typ AG wirklich um diesen (in unserem Fall um unterschiedliche Wiederholungseinheiten der 2er Wiederholungen) oder verbergen sich Mutationsursachen an anderer Stelle des Markerortes hinter den Fragmentlängenunterschieden. Dafür wurden die homozygoten PCR Produkte aus den ungelabelten PCRs mit dem mi-Purification Kit der Firma Metabion nach deren Anleitung aufgereinigt und die aufgereinigten PCR Produkte zur Sequenzierung an die Firma LGC geschickt. Hierfür wurden die Proben so vorbereitet, wie es von der Firma LGC protokolliert ist. Die Sequenzierergebnisse wurden mit der Software CodonCodeAligner ausgewertet.
3. Ergebnisse
3.1 Fragmentlängen
Die Rohdaten der Fragmentlängen der LPV Proben für Apfel sind in Tabelle 2 und die für Birne in Tabelle 3 im Anhang zusammengefasst.
3. 2. Ergebnisse Apfel
3.2.1 Genetisch sicher zugeordnete Sorten (vgl. auch die Rohdaten-Tabelle 2 im Anhang) Tabelle 8: Genetisch sicher zugeordnete Sorten.
Labor Nr. Sorte sicher Bezeichnung LPV Herkunft
LfA4 Adersleber Kalvill Geflammter Kardinal Ohne Angabe LPV
LfA71 Brauner Matapfel Fraas Sommerkalvill Weimersheim Sophienhöhe
LfA25, 30 Champagnerrenette Champagnerrenette Ohne Angabe LPV
LfA10 Fraas Sommerkalvill Lord Suffield Ohne Angabe LPV
LfA15 Fraas Sommerkalvill Fraas Sommerkalvill Ohne Angabe LPV
LfA133, 137
Fraas Sommerkalvill Lord Suffield Windsfeld
LfA147 Fraas Sommerkalvill Fraas Sommerkalvill Hagenbuch
LfA163 Fraas Sommerkalvill Schröppels Gewürzapfel
Obermögersheim
LfA237 Gewürzluiken Luikenapfel Heunischof LfA39 Gravensteiner, Roter
Gravensteiner
Jakob Fischer Ohne Angabe LPV
LfA203 Gravensteiner, Roter Gravensteiner
Jakob Fischer Unbekannt
LfA33 Grüner oder gelber Stettiner
Grüner Stettiner Ohne Angabe LPV
LfA93 Horneburger Pfannkuchenapfel
Horneburger Pfannkuchenapfel
Stetten
LfA26 Jakob Fischer Jakob Fischer Ohne Angabe LPV
LfA115 Jakob Fischer Bohntaubenapfel Heunischhof WUG
LfA61 Kaiser Alexander Neumeyers Sommerparmäne
Rehlingen WUG
LfA20 Kaiser Wilhelm Hürther Apfel Ohne Angabe LPV
LfA21 Kanadarenette Kandarenette Ohne Angabe LPV
LfA124 Rossie Pippin Kleiner Langstiel Kurzenaltheim
LfA206 Rossie Pippin Kugelapfel Kattenhochstadt oder Ottmarsfeld
LfA41 Krügers Dickstiel Krügers Dickstiel Ohne Angabe LPV
LfA170 Ribonde Landsberger Gulderling
MBH
LfA186 Ribonde Landsberger Gulderling
Markt Berolzheim
LfA242 Notarisapfel Notarisapfel Weimersheim
LfA210 Schöner von Boskoop Strauwalds Spielberg
LfA243 Schöner von Boskoop Schöner aus Boskoop Burgsalach
LfA202 Schöner aus Herrnhut Charlamowsky Nagelberg bei Treuchtlingen
LfA42 Signe Tillisch Minister Hammerstein Ohne Angabe LPV
LfA236 Transparente aus Croncels
Pappenheimer Kronenapfel
Unbekannt
LfA174 Zabergaurenette Zabergäurenette Markt Berolzheim
LfA246 Orleansrenette Orleansrenette Markt Berolzheim
LfA28 King of Tompkins County; Beauty of Kent
Sparrige Renette Ohne Angabe LPV
3.2.2 Genetisch identische Sorten (vgl. Tabelle 2 im Anhang), Sortenidentität bzw. sichere Sortenzuordnung noch ausstehend Tabelle 9: Genetisch identische Sorten (Sortenidentität noch ausstehend)
Labor Nr. Genetisch identisch Bezeichnung LPV Herkunft
LfA8 LfA8, LfA129 Bedufteter Purpurzwiebelapfel
Ohne Angabe LPV
LfA129 Bedufteter Purpurzwiebelapfel
Tommetsheim
LfA109, LfA138 LfA109, LfA138 Tonnenförmiger Küchenapfel
Weilerau
LfA12 LfA12, LfA245 Wohlschmeckender Straßenapfel
Ohne Angabe LPV
LfA245 Wohlschmeckender Straßenapfel
Ettenstatt
LfA11 LfA11, LfA134 Falscher Edelapfel Ohne Angabe LPV
LfA134 Falscher Edelapfel Wachenhofen
LfA111, LfA112 LfA111, LfA112 Grüngelber Quittenapfel Obererlbach
LfA205, LfA239 LfA205, LfA239 Wettringer Taubenapfel Beide unbekannt LfA107, LfA108 LfA107, LfA108 Falscher Taffetapfel Gnotzheim
LfA238 LfA238, LfA240 Krafts Adamsapfel Holzingen
LfA240 Luikenapfel Heunischhof LfA29 LfA29, LfA78,
LfA247
Edelborsdorfer Ohne Angabe LPV
LfA78 Edelborsdorfer Weimersheimer Sophienhöhe
LfA247 Edelborsdorfer Weimersheim
LfA34 LfA34, LfA207 Gestreifter Cousinot Ohne Angabe LPV
LfA207 Gestreifter Cousinot Holzingen
LfA23 LfA23, LfA86 Knollenapfel Ohne Angabe LPV
LfA86 Knollenapfel Dittenheim
Die Edelborsdorfer LFA29, 78, 247 sind verwandt mit den Edelborsdorfer vom NABU. Hier muss aber prinzipiell pomologisch geklärt werden, welcher dieser Bäume der echte Edelborsdorfer ist.
3.2.3 LPV Bezeichnung gleich, Proben aber genetisch nicht identisch bzw. verwandt (vgl. Tabelle 2 im Anhang) Tabelle 10: Sortenname gleich, Proben aber genetisch nicht identisch bzw. verwandt.
Labor Nr Bezeichnung Herkunft Bemerkung
LfA168 Adersleber Kalvill MBH Nicht wie LfA4 sicher
LfA22 Bohntaubenapfel Ohne Angabe LPV Evtl. Bohntaubenapfel LfA115 Jakob Fischer
(Bohntaubenapfel) Heunischhof WUG Jakob Fischer
LfA201 Brauner Matapfel Andresranken bei Mariabrunn (Heidenheim)
Nicht wie Brauner Matapfel UK, LFA171
LfA162 Dülmener Rosenapfel Göhren Nicht wie Dülmener Rosenapfel NABU
LfA32, LfA204
Geflammter Kardinal Ohne Angabe LPV Nicht identisch
LfA4 Adersleber Kalvill (Geflammter Kardinal)
Ohne Angabe LPV Adersleber Kalvill sicher
LfA232 Hürther Apfel Dettenheim Evtl. dieser?
LfA20 Kaiser Wilhelm (Hürther Apfel)
Ohne Angabe LPV Kaiser Wilhelm sicher
LfA164 Luxemburger Triumph Weimersheim Nicht wie Luxemburger Triumph bzw. Renette NABU
LfA231, LfA233
Mariabrunner Hartapfel Mariabrunn bei Heidenheim
Genetisch nicht identisch
LfA66 Meininger Apfel Flüglinger Berg
LfA148 Meiniger Apfel Gunzenhausen
Klärungsbedarf zur Sortenidentität besteht bei den in Tabelle 10 aufgeführten Proben. Tabelle 10: Sortenüberprüfung
Labor Nr Bezeichnung Herkunft LfA180 Dunkler Mostapfel Markt Berolzheim
LfA77 Falscher Triumph Weimersheimer Sophienhöhe
LfA99 Fester glänzender Morgenduft Raitenbuch
LfA89 Früher süßer Kardinal Oberschwaningen
LfA171 Fürst Blücher Sammenheim oder Fischerhaus
LfA62 Goldrenette von Peasgood Holzingen
LfA14 Grüner Fürstenapfel Ohne Angabe LfA188 Hauxapfel Markt Berolzheim
LfA64 Kalbensteinberger Hartapfel Kalbensteinberg
LfA136 Kalbensteinberger Renette Igelsbach
LfA135 Kantstreifenapfel Weimersheim
LfA235 Köstlicher Tafelapfel Weinberg Schwabach
LfA141 Kugeliger Lebeljakob Grafensteinberg
LfA209 Laibstadter Sommerkellerapfel Laibstadt LfA13 Langer Grüner Gulderling Ohne Angabe
LfA98 Leckere Goldrenette Holzingen
LfA18 Liegender Rotapfel Ohne Angabe
LfA173 Lohrer Rambur Ostheim
LfA140 Pseudo Hammerstein Weiboldshausen
LfA175 Pseudo Winterrambur Markt Berolzheim
LfA165 Rosa Krönchenapfel Weimersheim
LfA219 Roter Herbstkalvill Westheim
LfA63 Roter Jungfernapfel Kalbensteinberg
LfA234 Roter Walzenapfel Flüglingerberg bei Weimersheim
LfA91 Saarhofapfel Stetten
LfA167 Schöner Limeswegapfel Burgsalach
LfA127 Schulheckenapfel Theilenhofen
LfA178 Später Transparent Markt Berolzheim
LfA218 Spitzer Prinzenapfel Westheim
LfA73 Strassenkurvenapfel Weimersheim Sophienhöhe
LfA104 Ströbels Zigeuner Schopflohe DON
LfA123 Täschender Bellefleur Sammenheim
3.3 Ergebnisse Birne
Die Daten des LPV wurden in die in Marburg vorliegende Datenbank eingespeist, um genetische Übereinstimmungen und „Verwandtschaftsverhältnisse“ aufzudecken und somit eine sichere Aussage über die Sortenbezeichnung zu treffen, oder diese zur pomologischen Überprüfung zu empfehlen.
3.3.1 Genetisch identische Proben
Genetisch identische Proben finden sich in Tabelle 11 (vgl. Tabelle 3 im Anhang). Bei fast allen Proben muss aber noch durch ergänzende pomologische Untersuchungen geklärt werden, um welche Sorte es sich wirklich handelt.
Tabelle 11: Genetisch identische Sorten
Labor Nr
Bezeichnung Gent. Identisch
Herkunft Wahrscheinliche Sorte
LfB31 Remelesbirne, Sorte echt
LfB31, LfB88 Ohne Angabe Remelesbirne
LfB88 Rostlangbirne AT Rehlingen Remelesbirne
LfB24 Sußbirne, Sorte echt LfB24, LfB75 Ohne Angabe Sußbirne
LfB75 Wahre kleine Sussbirne
Vermehrung von Herrn Weichmann
Sußbirne
LfB179 Berolzheimer Längler AT
LfB179, LfB182
Markt Berolzheim
LfB182 Champagnerbratbirne Markt Berolzheim
LfB150 Frühe Dörrbirne AT LfB150, LfB217
Gnotzheim
LfB217 Frühe Dörrbirne AT Ohne Angabe
LfB38 Lettenbirne Sorte echt
LfB38, LfB96, LfB177
Ohne Angabe Lettenbirne
LfB96 Lettenbirne Hundsdorf Lettenbirne
LfB177 Lettenbirne Lechner Markt Berolzheim Lettenbirne
LfB74 Honigbirne AT LfB74, LfB228
Weimersheim Sophienhöhe
*Klärung ob wirklich Honigbirne; genetisch nicht identisch Honig- bzw. Veldenzerbirne NABU
LfB228 Honigbirne Weimersheim Sophienhöhe
LfB36 Pseudo-Sparbirne AT LfB36, LfB130, LfB132
Ohne Angabe
LfB130 August Russelet AT Holzingen
LfB132 Speudo-Sparbirne AT Spielberg
LfB143 Steiners Eierbirne LfB143, LfB146
Gunzenhausen Evtl. Pfundbirne, s. Anmerkung Tabelle 3 Anhang
LfB146 Linkes Pfundbirne AT Gunzenhausen Evtl. Pfundbirne, s. Anmerkung Tabelle 3 Anhang
LfB212 Englische Sommerbutterbirne
LfB212, LFB214
Spielberg Evtl. Englische Sommerbutterbirne
LfB214 Storchschnabelbirne AT
Holzingen Evtl. Englische Sommerbutterbirne
LfB3, LfB7
Feuchtwanger Butterbirne
Ohne Angabe Feuchtwanger Butterbirne
LfB9 August Russelet AT LfB9, LfB131 Ohne Angabe
LfB131 August Russelet AT Holzingen
LfB37 Pseudo Muskatellerbirne AT
LfB37, LfB185
Ohne Angabe
LfB185 Schulers Butterbirne Markt Berolzheim
LfB35 Trumbirne, Sorte echt LfB35, LfB215, LfB216
Ohne Angabe Trumbirne
LfB215 Russelet von Reims Ottmarsfeld Trumbirne
LfB216 Feuchtwanger Butterbirne
Markt Berolzheim Trumbirne
LfB142 Graue Wohlschmeckerin AT
LfB142, LfB220
Göhren
LfB220 Stadtgrabenbirne Stadtgraben Weissenburg
LfB44 Rotbackige Sommerzuckerbirne AT
LFB44, LFB151
LfB151 Rotbackige Sommerzuckerbirne AT
Bubenheim/Dietfurt
LfB17# Haberbirne AT Weizenbirne NABU
Ohne Angabe Sortenklärung
*Sollte es sich bei LfB74 und LfB228 wirklich um die Honigbirne handeln, so wären die vom NABU bezeichneten Honig- bzw. Veldenzerbirnen wahrscheinlich Veldenzerbirnen. #Die Haberbirne LfB17 ist genetisch identisch mit der Weizenbirne Py152 (s. Tabelle 3 Anhang). Hier muss pomologisch geklärt werden, um welche Sorte es sich handelt. Bei der Weizenbirne war man sich auch in Nordrhein-Westfalen nicht sicher, ob es sich wirklich um diese handelt.
3.3.2 Genetisch verwandte Proben Genetisch verwandte Proben sind in Tabelle 12 aufgeführt (vgl. Tabelle 3 im Anhang).
Tabelle 12: Genetisch verwandte Proben
Labor Nr. Bezeichnung Verwandt mit Bezeichnung
LfB150, LFB217
Frühe Dörrbirne LfB225 Klemanns Dörrbirne
LfB36, LfB130, LfB132
Pseudo Sparbirne, August Russelet
LfB35, LfB215, LfB216; LfB5; LfB44, LfB151
Trumbirne; Meißners Langstielige Feigenbirne; Rotbackige Sommerzuckerbirne
LfB85 Dunkelrote Pfundbirne Evtl. verwandt: LfB146, LfB143
Linkes Pfundbirne, Steiners Eierbirne
LfB208 Rote Dachantsbirne Evtl. verwandt LfB97
Lebenders Sommerbutterbirne
LfB97 Lebenders Sommerbutterbirne
Evtl. verwandt: LfB208; LfB212
Rote Dachantsbirne; Englische Sommerbutterbirne
LfB2 Nordhäuser Winterforellenbirne
LfB43 Forellenbirne
LfB17 Haberbirne (evtl. Weizenbirne)
Py37 Rheinbirne
LfB49 Pitmaston Py132 Santa Maria
LfB40 Braune Rostbirne Py176 Julidechantsbirne
LfB19* Amanlis Butterbirne Py102-104; Py108 Amalis Butterbirne; Diels Butterbirne
LfB69 Sommerliche Kugelbirne LfB72 Brummers Birne
LfB9, LfB31 August Russelet LfB215; LfB216 Trumbirne (als Russelet von Reims, Feuchtwanger Butterbirne bezeichnet)
*Die als Amanlis Butterbirne bezeichnete Probe LfB19 liegt uns auch aus Nordrhein-Westfalen vor. Hier hatten wir drei Proben mit der als sicher geltenden Sorten Amanlis Butterbirnen (Py102-104) erhalten, die auch genetisch identisch sind. Amanlis Butterbirne LfB19 ist genetisch nicht identisch mit den aus Nordrhein-Westfalen (MR) stammenden Proben. Allerdings sind diese Sorten „verwandt“. Hier müsste pomologisch geklärt werden, bei welcher Sorte es sich um die echte Amanlis Butterbirne handelt. In www.obstsortenerhalt.de schreibt Jens Meyer, dass diese Sorte oft mit Diels Butterbirne verwechselt wird. Dies ist aber hier nicht der Fall. LfB19 ist zwar verwandt mit Diels Butterbirne Py108, aber nicht genetisch identisch. LfB19 könnte aber, so wie es genetisch aussieht, eine Kreuzung aus Amanlis Butterbirne (Py102-104) und der Diels Butterbirne (Py108) sein. (vgl. 1. Bericht 2019).
3.3.3 Proben mit gleicher Bezeichnung, aber genetisch nicht verwandt
Proben mit gleicher Bezeichnung, die aber genetisch nicht verwandt sind, finden sich in Tabelle 13 (vgl. Tabelle 3 im Anhang). Tabelle 13: Probenbezeichnung gleich, aber genetisch nicht identisch
Labor Nr. Bezeichnung Labor Nr. Bemerkung
LfB9, LfB131 August Russelet LfB130 wie LfB36, LfB132 Pseudo Sparbirne
LfB181 Berolzheimer Längler LfB179 Wie LfB182 Champagnerbratbirne
LfB40 Braune Rostbirne LfB67
LfB3, LfB7 Feuchtwanger Butterbirne
LfB216 Vgl. Tabelle 10
LfB68 Gelbe Kegelbirne LfB105; LfB126 Alle 3 nicht verwandt
LfB1 Herzogin Elsa LfB47
LfB38, LfB96, LfB177
Lettenbirne LfB187 Lettenbirne Buchleite
LfB5 Meissners Langstielige Feigenbirne
LfB176
LfB211 Metzer Bratbirne LfB213
LfB184 Schulers Butterbirne LfB185 Wie LfB37 Pseudo Muskatellerbirne
LfB230 Storchschnabelbirne LfB214 Wie LfB212 Englische Sommerbutterbirne
3. 4 Allelische Leitern
Wie schon im Teil Material und Methoden beschrieben, wurden von den Proben, die für die Allelische Leitern ausgewählt wurden, PCRs mit gelabelten und ungelabelten Primern durchgeführt. Die ungelabelten PCR-Produkte wurden auf ein Agarosegel aufgetragen. Homozygote Proben wurden sequenziert und analysiert. Aus den ungelabelten PCR Produkten wurde für jeden Marker und Sorte ein Fragmentlängenmix hergestellt und dieser reamplifiziert. Im Nachfolgenden sind Beispiele aufgeführt, wie diese Arbeiten und Ergebnisse aussahen.
Abbildung 1 zeigt die Amplifizierungsergebnisse mit ungelabelten Primern für die Marker CH1H1, CH1f2, Ch2c9, Ch2d8, Ch4e5, Ch5e3, Ch1f3b und CH4c7. Jedes Fragment kommt aus einer anderen Probe. Zu erkennen ist, dass nicht alle Primer gleich gut amplifizieren. Ch4e5 und CH5e3 hatten nur sehr schwach amplifiziert. Daher wurden durch Erhöhung der Anzahl der Zyklen in der PCR die Amplifikate verbessert. Wenn einzelne Proben wie z.B. bei CH1f2 Probe 7 nur schwach amplifiziert hatten, wurden auch von diesen Proben PCRs neu angesetzt, z.T. wurde diese dann auch durch eine andere Probe, die die gleiche Fragmentlänge hatte, ausgetauscht. Anhand des Gene Ruler Express DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific), der zwischen die einzelnen Primer pipettiert wurde, kann sehr grob die ungefähre Fragmentlänge abgelesen werden. Von unten nach oben gelesen
zeigt der Express Ruler 100, 200, 500 bp und geht dann bis 5000 bp. Wie für einen Mikrosatelliten typisch und auch im ABI detektiert, liegen die Fragmentlängen zwischen 100 und 300 bp.
Abbildung 1: Beispiel eines Gelfotos mit 8 Markern. Der Pfeil markiert den Längenstandard Express Ruler mit von oben nach unten abnehmenden Fragmentlängen. Der Stern markiert beispielhaft eine vermutlich heterozygote Sorte am Markerort CH1f3b mit zwei Fragmenten. Ein solches PCR-Produkt eignet sich kaum zum Sequenzieren und findet auch eher weniger Eingang in den Leiter-Mix (Probleme siehe unten).
Die PCR Produkte der homozygoten Proben wurden aufgereinigt und an die Firma LGC zum Sequenzieren geschickt. Mit dem Programm CodonCode Aligner wurden die Sequenzen ausgewertet. Abbildung 2 zeigt das Repeat-Motiv und die Anzahl der Repeats für Primer CH1H1. Diese Sequenzen waren sehr gut auswertbar und die Unterschiede der Fragmentlängen, die durch die verschiedene Anzahl der Repeats (hier CT CT CT …) zustande kommt, sind gut erkennbar. Nicht immer lassen sich die aus Forward- und Reverse-Primer gewonnen Sequenzen alignen (übereinanderlegen), so dass die gesamte Länge des Fragments abgedeckt wird. Bei CH1H1 ist dies der Fall. Hier konnte nur der Forward-Primer ausgewertet werden. Das macht sich dann bei Probe Ap168, die eine Länge von 129 bp hat auch deutlich bemerkbar. Während die Proben bis 117 bp nur mit dem Forward-Primer noch gut auswertbar waren, sind sie das bei 129 bp nicht mehr. Hier bricht die Sequenz ab.
Abbildung 2: Auswertung der Sequenzen mit CodonCodeAligner am Beispiel des Markers CH1H1. Von unten nach oben gelesen mit Probennahme und Anzahl der Wiederholungen des für diesen Ort charakteristischen 2er Repeats CT. 1.) LfA180 101bp = 11 repeats; 2.) LfA33 111bp = 16 repeats; 3.) Ap337 115bp = 18 repeats; 4.) LfA13 119bp = 20 repeats; 5.) Ap168 129bp = hier wird die Sequenz nach hinten hin leider schlecht.
Aus den PCR Produkten, die das in der vorliegenden Stichprobe bisher gesamte Spektrum an Fragmentlängen eines Markers abdecken, wurde dann, wie in Material und Methoden beschrieben, ein Leitermix zusammengestellt. Dieser Mix wurde dann in einer PCR, diesmal wieder mit dem gelabelten Farbstoff, reamplifiziert. Erscheint ein Fragment in dem Mix nur sehr schwach, so wird von dieser Probe nochmals PCR zu dem Ursprungsmix zugegeben. Problematisch ist dieses z.T., wenn ein Fragment aus einem heterozygoten Genotypen mit weit spannenden Allellängen z.B. 229/253 bp gewonnen wurde. Damit das optische Signal des kürzeren Allels nicht zu groß wird und damit die Signale der anderen Allele unterdrückt, muss auf die weitere Zugabe verzichtet werden. Abbildung 3 zeigt exemplarisch die Allelische Leiter für den Marker CH2d8.
Abbildung 3: Allelische Leiter des Markers CH2d8 mit Fam gelabelt. Werte unter den Peaks geben die Länge des Fragmentes an, welches in der Elektrophorese einen Peak (optisches Signal mit jeweils verschiedener optischer Dichte) erzeugt. Bis auf drei Fehlstellen ist die Allelische Leiter mit allen aufeinanderfolgenden Fragmentlängen von 229 bis 253 besetzt und liefert eine sehr gute Grundlage für eine Standardisierung der Fragmentlängenmessungen zwischen verschiedenen Laboratorien.
4. Ausblick
Schon jetzt konnten mithilfe der in Marburg vorliegenden Datenbank und veröffentlichter Datenbanken beim Apfel einige Sorte sicher zugeordnet werden. Sobald die Deutsche Genbank Obst (DGO im Julius Kühne Institut, Pillnitz) ihre Daten der Öffentlichkeit zur Verfügung stellt, werden wir die LPV Daten in diese große Datenbank einspeisen und sicher noch sehr viel mehr Sorten zuordnen können. Sobald diese Bank öffentlich zugänglich ist, werden wir die Daten mit der Marburger Datenbank (inklusive der Daten vom LVA/LPV) legitimiert zusammenführen.
Für Birnensorten finden sich in der Literatur leider nur sehr wenige Datenbanken (s. wichtige Verständnishilfen und Definitionen) und wenn, dann liegen in dieser meist keine oder nur wenige lokale Sorten genotypisiert vor. Wenn die DGO ihre Birnendatenbank veröffentlicht hat, werden wir sicher auch viele Birnensorten nachträglich zuordnen können. Auch hier werden wir dann unsere Genotypisierungsdaten und die Daten vom LPV in einer Gesamtdatenbank zusammenstellen.
Für andere Laboratorien stellen wir gerne unsere Allelische Leitern zur Verfügung, so dass Fragmentlängenunterschiede, die aufgrund unterschiedlicher Geräte zustande kommen, abgeglichen werden können und letztlich die Daten verglichen werden können. Durch eine Vernetzbarkeit dieser Art wird der sichere Abgleich durch immer größer werdende Datenbanken gewährleistet, von denen Wissenschaft und Auftraggeber aus der Praxis enorm profitieren können.
5. Danksagung
Wir danken Herrn Julius Bette, BSc Biology und Masterkandidat in der Arbeitsgruppe, für die Bereitstellung seiner Algorithmen, mit denen für die vorliegende Arbeit ein komfortablerer Abgleich zwischen Probe und Datenbankeinträgen ermöglicht wurde.
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Wertvolle Links: [email protected] (Europäische Datenbank Apfel) https://1000obstbaeume.de
www.obstarche.com
www.obstsorten.net https://www.deutsche-genbank-obst.de
https://nrw.nabu.de/natur-und-landschaft/landnutzung/streuobst/lokale-obstsorten-erhalten/23861.html
