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Ein integriertes Konzept für die katalytisch vollständige Hydrolyse

von Cellulose zu vergärbaren Zuckern

Antje C. Spiess

Fachtagung Nachhaltige Biokraftstoffe, 28. Okt. 2010

A.C. Spiess, Gelsenkirchen, 28.10.2010

2

Biokraftstoffkreislauf im Exzellenzcluster

Biomasse

Kohlendioxid

in die Atmosphäre

Sonnenenergie

& Kohlendioxid

O OH

OH

OH

HO

OH

HO2C CO2H

Itaconic Acid

O

OOH

2-Hydroxymethylfurfural (HMF)

CO2H

O

Levulinic Acid

OO Oetc.

etc.

O

O OO O O

O

OHOH O

R

etc.

MTF

KatalytischeUmwandlung

Energie-umwandlungCO2-Neutrality

MaßgeschneiderteKraftstoffe

aus Biomasse

Verfahrens-technik

http://www.fuelcenter.rwth-aachen.de


3

(Ligno-)Cellulosen als Rohstoffe

Lignocellulose

� Reichhaltigstes Biopolymer der Erde

� Widerstandsfähigkeit �� Vorbehandlung erforderlich

Cellulose

� Unlöslich in wässrigen Medien

α-Cellulose Avicel

http://genomics.doe.gov


4

Celluloseabbau durch T. reesei Cellulasen

Cellobiohydrolase

CBH II

ß-Glucosidase

Endo-glucanase

kristallin kristallinamorph

nicht-reduzierendesEnde

reduzierendesEnde

CBH I

Trichoderma

reesei

Celluclast®Novo, DK

5


� Cellulaseaktivität ist proportional zur adsorbierten Enzymmenge

Cellulaseaktivität und Adsorption

10 g/L α-Cellulose, 0,1 M Acetat-Puffer, pH 4,8, Celluclast® entsalzt, 30°C, 40 min, 1000 rpm

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.50

10

20

30

40

50

60

70

80

Ads

orbi

erte

Cel

lula

se

[mg

Cel

lula

se/g

Cel

lulo

se]

Freie Cellulasekonzentration [g/L]

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

Rea

ktio

nsge

schw

indi

gkei

t [g

/L/h

]

adsorbierte Cellulase

Anfangsreaktionsgeschwindigkeit

Helene Wulfhorst, Sachiko Wakimura

6


� Oberfläche erhöht Cellulaseaktivität bei hoher Konzentration� Kristallinität verringert Cellulaseaktivität bei geringer Konzentration

Cellulaseaktivität und Struktur der Cellulose

Sigmacell

0-15 g/L Cellulose, 0.25 g/l Celluclast, 0.1 M Acetatpuffer, pH 4.8, 200 µL, 37°C, 900 rpm, 3 mm, 96-MTP

Jäger G et al., Biotechnol. Biofuels 3:18 (2010)

Oberfläche

[m²/g]

0.05

0.09

0.25

α-Cellulose

Avicel

Kristallinität

[%]

82*

64*

0*


7

Vorbehandlung durch ionische Flüssigkeit

(Ligno-)Cellulose

GlucoseEnzymatische Hydrolysein ionischer Flüssigkeit

SelektiveFällung

Enzy

mat

isch

e

Hyd

roly

se

Lösen

in io

nisch

er

Flü

ssigkeit

Quantitative Beschreibung der homo- und heterogenen

Depolymerisation

8


Ionische Flüssigkeiten (IL)

� Bestehen meist aus organischen Ionen

� Schmelztemperatur unter 100 °C (gemäß Definition)

� Einstellbare Eigenschaften

� � Einige IL lösen Cellulose derivatisierungsfrei

Anionen

Chlorid (Cl)

Acetat (Ac)

Dimethylphosphat (DMP)

….

Kationen1-Butyl-3-methylimidazolium (BMIM)

1-Allyl-3-methylimidazolium (AMIM)

1-Ethyl-3-methylimidazolium (EMIM)

1,3-Dimethylimidazolium (MMIM) …

Cl-

Cl-

Seddon K. tce 730:33 (2002)


9

Einige ionische Flüssigkeiten lösen Holz

� Ionische Flüssigkeiten, die im Screening Cellulose lösen, lösen zumindest teilweise auch Holz

EMIM Ac,Buche,

1000 rpm,90 °C, 1 h

Zavrel M et al. Biores. Technol. 100:2580 (2009).

++0+EMIM Ac

0000MMIM DMP

0000BMIM Cl

0000EMIM Cl

++++AMIM Cl

KastanieBucheWeiß-tanne

Fichte

+ vollständiges Lösen, 0 teilweises Lösen

5 % w/w Holzpulver in IL, 1000 rpm, 90 °C

10


� Cellulosestruktur zerstört � vermutlich amorphes Material

� Vergrößerte Oberfläche

(Ligno-)Cellulose aus IL regeneriert

Mikroskopische Aufnahmen, Nikon Eclipse E600, 40X

Regenerierte Fraktion, getrocknert und zerkleinert

Ungelöster Rückstand, cellulosearme Fraktion

Fichte

50µm

Jörn Viell,AVT-PT

Avicel RegenerierteCellulose, suspendiert

Daniela Bross, Jörn Viell


11

Enzymatische Hydrolyse nach Vorbehandlung mit IL

(Ligno-)Cellulose


SelektiveFällung

Enzy

mat

isch

e

Hyd

roly

se

Lösen

in io

nisch

er

Flü

ssigkeit


Depolymerisation

12


Einfluss ionischer Flüssigkeiten auf Cellulaseaktivität

� Ionische Flüssigkeiten verringern Enzymaktivität stark� Kann Strukturveränderung den Aktivitätsverlust kompensieren?

10 g/L α-Cellulose, 10 % (v/v) IL in 50 mM NaAc, pH 4.5, 1.8 g/L Cellulase, 45 °C

NaA

c P

uff

er

[MM

IM]

[DM

P]

Merc

k

[MM

IM]

[DM

P]

IoL

iTec

[AM

IM]

[Cl]

Merc

k

[BM

IM]

[Cl]

Merc

k

[EM

IM]

[Ac]

BA

SF

[EM

IM]

[Ac]

IoL

iTec

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Rela

tive E

nzym

akti

vit

ät

(-)

Engel P et al. Green Chem. doi:10.1039/C0GC00135J.

13


� Anfängliche Aktivitätssteigerung (bis zu 20-fach),� Aber: Bei steigenden IL-Gehalten geringere Endoglucanaseaktivität

0 12 24 36 480

20

40

60

80

100

Um

satz

red

. Z

ucker

(%)

Zeit (h)

unbehandelte Cellulose reg. Cellulose; 0 % (v/v) IL reg. Cellulose; 10 % (v/v) IL reg. Cellulose; 20 % (v/v) IL reg. Cellulose; 30 % (v/v) IL

0 12 24 36 480

20

40

60

80

100

Um

satz

red

. Z

ucker

(%)

Zeit (h)

unbehandelte Cellulose reg. Cellulose; 0 % (v/v) IL reg. Cellulose; 10 % (v/v) IL reg. Cellulose; 20 % (v/v) IL reg. Cellulose; 30 % (v/v) IL

Hydrolyseverlauf mit regenerierter Cellulose

10 g/L Cellulose, MMIM DMP in 50 mM NaAc, pH 4.8, 1.8 mg/mL Cellulase, 45°C

Engel P et al. Green Chem. doi:10.1039/C0GC00135J.

14


Hydrolyseverlauf von IL-vorbehandelter Fichte

Fichte vorbehandelt mit BMIM Cl, 10 g/L Substrat, 2.5 g/L Celluclast entsalzt, 900 rpm, 45°C

0 12 24 36 48 600

2

4

6

8

10

16 %

72 %

Red

uzie

rend

e Z

ucke

r [

g/L]

Zeit [h]

42 %

0

20

40

60

80

100

Mas

senv

erlu

st S

ubst

rat

[%]

ungelöster Rückstand

regenerierte Fraktion

Holz ohne Vorbehandlung

� Effektiver Abbau des Celluloseanteils in beiden Fraktionen

Helene Wulfhorst, Anita Ogolong

15


Verständnis für Polymerabbau

(Ligno-)Cellulose


SelektiveFällung

Enzy

mat

isch

e

Hyd

roly

se

Lösen

in io

nisch

er

Flü

ssigkeit


Depolymerisation

16


� Population:=• Chemisch identische

Spezies, die sich in einerEigenschaft unterscheidet

� (homogene) Elementarreaktionen

• � großes Differentialgleichungssystem

• Implementation in Predici® (CiT Wulkow, Rastede)

Populationbilanzmodell für polymeres Substrat

Kettenlänge s

Cellulose-konzentration C

Cs


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Cellulosepolymerisationsgrad in homogener Reaktion

3 mg/mL

Endo-glucanase

15 mg/mLExo-glucanase

3 mg/mL Endo-+ 15 mg/mL Exo-glucanase

Philip Engel, Patrick Schmidt

No

rmie

rte

Gew

ich

tsko

nze

ntr

ati

on

No

rmie

rte

Gew

ich

tsko

nze

ntr

ati

on

No

rmie

rte

Gew

ich

tsko

nze

ntr

ati

on

Kettenlänge (s) Kettenlänge (s)

Kettenlänge (s)


18

Homogene enzymatische Cellulosehydrolyse

(Ligno-)Cellulose


SelektiveFällung

Enzy

mat

isch

e

Hyd

roly

se

Lösen

in io

nisch

er

Flü

ssigkeit


Depolymerisation

19


Ionische Flüssigkeit: Cellulaseaktivität vs. Celluloselöslichkeit

� �� Neue Enzyme finden, die bei hohem IL-Anteil aktiv sind!

Konzentration der ionischen Flüssigkeit

0 % 50 % 100 %

Ce

llu

lase

akti

vit

ät

Ce

llu

los

elö

slic

hk

eit

Betriebs-fenster

21


Viskositätsmessung für Cellulose

� Viskositätsmessung ist sensitiv auf Veränderungen (langer) Polymerketten

10 mg/mL α-Cellulose, 90 %(v/v) EMIM Ac, 80°C, Scherrate 100 1/s

Philip Engel, Xin Lin

23


Integrierter chemo-enzymatischer Prozess

(Ligno-)Cellulose


SelektiveFällung

Enzy

mat

isch

e

Hyd

roly

se

Lösen

in io

nisch

er

Flü

ssigkeit

Chemische

+ Geschwindigkeit- Abbauprodukte


24

Hydrolyse von Cello-Oligomeren und Cellulose

10 g/L Substrat, 0.5 % (v/v) Celluclast ®, Acetatpuffer pH 4.5, 45 °C

Unbehandelte CelluloseDPW ~ 3200

Aus IL regenerierteCelluloseDPW ~ 1600

Cellulose nachchemischer VorhydrolyseDPW ~ 700

Rinaldi R et al., ChemSusChem, 3: 1151-1153 (2010).

25


t [min] 0 2 5 7 10 12 15 30 45 60 90 120

Vergleich mit konventioneller Cellulosehydrolyse

4.5 h

50 h Konventionelle enzymatische Cellulosehydrolyse

Chemo-enzymatische Cellulosehydrolyse

Rinaldi R et al., ChemSusChem, 3: 1151-1153 (2010).

� Bisher schnellster Prozess für die selektive Umsetzung von Cellulose zu löslichen Zuckern!

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� Lösen und Fällen aus ionischen Flüssigkeiten ist eine Vorbehandlung für enzymatischen Celluloseabbau

� Verständnis der (Ligno-)Cellulosehydrolyse• Chemo-physikalische Wirkung ionischer Flüssigkeiten

• Beitrag von Endo- und Exoglucanasendurch mathematische Modellierung

� Erstmaliger Nachweis von Cellulaseaktivitätin ionischen Flüssigkeiten

� Effektiver chemo-enzymatischer Prozess für Cellulosehydrolyse

Zusammenfassung

27


Ausblick

� Verständnis für Celluloseabbau durch iteratives Wechselspiel von Modell und Experiment verbessern

� Übertragung auf verschiedene Lignocellulosen und Vorbehandlungsverfahren

� � Maßgeschneiderte Enzympräparationen für homogenen und heterogenen Abbau von Lignocellulose-haltiger Biomasse


28

Vielen Dank…

� …an alle Mitwirkenden• Benjamin Bonhage (Dipl)• Daniela Bross (BSc)• Jochen Büchs (Prof)• Efthimia Ellinidou (BSc)• Philip Engel (PhD)• Kerstin Garschhammer (BSc)• Gernot Jäger (PhD)• Martin Kunze (PhD)• Xin Lin (MSc)• Radoslav Mladenov (BSc)• Anita Ogolong (Res)• Martin Pöhnlein (BSc, Res)• Patrick Schmidt (Dipl)• Bianca Seiferheld (BSc, Res)• Sachiko Wakimura (Res)• Helene Wulfhorst (PhD)

• Michael Zavrel (PhD)• Erik Zeithammel (Res)

� … an die Kooperationspartner• Roberto Rinaldi, MPI

• Ferdi Schüth, MPI• Michele Girfoglio, IMB• Ulli Commandeur, IMB• Raffaele Cannio, CNR Napoli• Jörn Viell, AVT.PT

� … für finanzielle Unterstützung• Deutsche Forschungs-

gemeinschaftExC 236 „Tailor-madefuels from biomass“

• GK 1166 „Biocatalysis usingnon-conventional media“

• NRW Forschungsschule „BreNaRo“

� … für Ihre Aufmerksamkeit

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