Kolb und Allner: Eine neue Methode zur Adsorption von Rheumafaktoren 379

J. Clin. Chem. Clin. Biochem.Vol. 24, 1986, pp. 379-386© 1986 by Walter de Gruyter & Co.

Berlin · New York

Eine neue Methode zur schnellen und einfachen Adsorptionvon Rheumafaktoren aus Serum

' Von G. Kolb und R. Allner

Zentrallaboratorium (Leiter: Prof. Dr. R. Allner f ) 1 ) der Städtischen Kliniken Fulda, Akademisches Lehrkran-J kenhaus der Philipps-Universität Marburg

i

; (Eingegangen am 6. August 1985/16. Januar 1986)

Meinem verehrten Lehrer und Mentor R. Allner zum Gedenken

Zusammenfassung: Es ist bereits hinreichend bekannt, daß Autoantikörper gegen humanes Gammaglobulin,sogenannte Rheumafaktoren, immunologische Bestimmungsmethoden stören (l, 2). Insbesondere die Enzym-linked-Immunoassays (ELISA) zum Nachweis spezifischer Immunität bei frischen viralen Infektionen (z. B.Röteln, Masern etc.) zeigen falsch positive Ergebnisse, wenn die Proben IgM-Rheumafaktoren enthalten(3,4).

Die von uns entwickelte Kombination von Festphase- und Flüssigkeitsphase-Technik — eine Suspension vonGlutaraldehyd^vernetztem aggregiertem IgG — stellt eine neue Methode zur schnellen Adsorption undElimination von Rheumafaktoren aus Serumproben dar.

In einem zweiten Schritt können bei saurem pH die Rheumafaktoren wieder desorbiert werden, so daß dasAdsorptionsmaterial nach Waschen in neutralem Puffer bzw. isotoner NaCl-Lösung erneut verwandt werdenkann.

Eine Adsorption spezifischer Antikörper konnte ausgeschlossen werden.

A new methodfor rapid adsorption of rheumatoid factor from serumSummary: It is well known that äutoantibodies directed against human -globulin, the so called rheumatoidfactor (Rheumafaktor), show interference (l, 2) with immunochemical methods. Especially the enzyme-linkedimmunoassays for detecting the early immune reaction against virus-infections (e. g. rubella, measles, andothers) shöw irregulär positive results, if the tests are performed in samples containing IgM rheumatoidfactor (3, 4).We describe a new method for the rapid adsorption and elimination of rheumatoid factor from rheumatoidfactor containing serum samples, using a Suspension of glutaraldehyde-cross-linked, aggregated IgG in acombined solid- and liquid-phase technique. The bound rheumatoid factor can be subsequently desadsorbedat acid pH so that after washing in neutral-buffer or physiological saline the adsorption-material can be usedagain.

Specific antibodies were not adsorbed.

l) t 27. Januar 1986

J. Clin. Chem. Clin. Biophem. / Vol. 24,1986 / No. 6

380 Kolb und Allner: Eine neue Methode zur Adsorption von Rheumafaktoren

Einfuhrung

Die Rolle des Rheumafaktors als Störquelle bei im-munologisch-serologischen Verfahren der medizini-schen Diagnostik ist seit langem bekannt. Neben Be-einflussung der Lues-Serologie (5) kennen wir dieInterferenz mit Agglutinationstesten auf Australia-Antigen (6), Cryptococcosis (7), mit diversen Immun-fluoreszenztechniken (8) und der passiven Hämagghi-tination (9) zum Nachweis einer Toxoplasmose, Mo-nonucleose u. a.; Einflüsse auf Methoden zur Erfas-sung zirkulierender Immunkomplexe sind ebenfallsbeschrieben (10,11).

Insbesondere aber die radio- und enzymimmunologi-schen Verfahren zum Nachweis frisch stattgehabterVirusinfektionen werden durch Rheumafaktoren imSinne einer falsch positiven Reaktion beeinflußt (2, 3,12—15). In Hinblick auf Rheumafaktor-Interferenzbesonders eindringlich untersucht ist wegen der mitihm potentiell verbundenen eugenischen Problemstel-lung der Rubella-spezifischt IgM-Nachweis (1).

Das relativ häufige Vorkommen von Rheumafakto-ren auch bei Krankheiten außerhalb des rheuma-tischen Formenkreises bzw. auch klinisch Gesundenläßt die Gefahr potentieller Fehlbestimmungen durchRheumafaktor-Interferenz zu einem nicht vorherseh-baren Risiko weden.

So wird die Bestimmung von spezifischen Antikörper-titern durch das gehäufte gleichzeitige Vorkommenvon Rheumafaktoren bei akuten Infektionen mit z. B.Rubella-, Influenza-, Parainfluenza-, Resp.-Syncy-teal-, Mumps-, Herpes simplex-Virus u. a. kompliziert(4). Aber auch über den überdurchschnittlich häufi-gen Nachweis von Autoantikörpern des Rheumafak-tor-Types bei Erkrankungen wie Asthma bronchiale(15, 16), reaktiver Synovitis (17), degenerativen Ge-lenkerkrankungen (18), Morbus Basedow (19), derHepatitis B in akuter und chronischer Verlaufsform(20, 21, 22), bei lymphoproliferativen Erkrankungen(23) sowie bei Mononucleose (24) und primär undsekundär entzündlichen Erkankungen unterschied-licher Genese (25) wurde in jüngster Zeit berichtet.Das Auftreten von Rheumafaktoren in der Schwan-gerschaft (26, 27) erhält wegen der möglichen eugeni-schen Fragestellung zum Beispiel im Zusammenhangmit dem Nachweis einer akuten Rubella-Infekuoneine besondere Brisanz und unterstreicht die Wichtig-keit einer suffizienten Rheumafaktor-Adsorption insolchen Fällen.

Die bisher bekannten Rheumafaktor-Adsorptionsme-thoden (l, 6, 7,28,29) weisen eine Reihe von Nachtei-len auf, so z. B. begrenzte Bindungskapazität desAdsorptionsmittels (3, 6, 7) oder Unspezifität der

Adsorptionsphase (9,30). Auch sind Methoden, beidenen der Rheumafaktor als Immunkomplex gebun-den in der Probe verbleibt (31), kritisch einzuschät-zen.

Material und MethodenProben

1. Seren von 23 Patienten mit und ohne klinisch manifesterrheumatoider Arthritis. Die höchste Aktivität an Rheumafak-toren betrug 2,7 · 106 IE/1, die niedrigste 0,017 · 6 /1.

2. Anti-ijRi/6e//ß-IgM-haltige Seren (N = 2), Probengewinnung14 d nach Aufschießen des Röteln-Exanthems bzw. 14 d postvaccinationem.

Reagenzien und Test-Kits

Mittels lonenaustauschchromatographie (DiethylaminoethyUCellulose) isoliertes humanes IgG wurde uns freundlicherweisevon der Fa. Biotest, Pharma^GmbH, Dreieich, zur Verfügunggestellt.

Glutaraldehyd reinst, 25%ig # E 230/280 — Feinbiochemicader Fa. Serva, Heidelberg.

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung der Fa. Behringwerke AG,Marburg.

Rapi-Tex®-RF, Behringwerke AG, Marburg.

Cordia®-RF, Byk-Mallinckrodt, Dietzenbach.

Röteln-Hämagglutinationshemmtest ^ HHT, Rübe HIT®,Behringwerke AG, Marburg.

Enzygnost®-Rubella, Behringwerke AG, Marburg.

Rubazyme®-M, Abbott-Diagnostics Div., Irving, Texas, USA.

HAVAB®-M EIA, Abbott Diagnostics Div., Irving, Texas,USA.

Geräte

Quantitative Messungen wurden mit Photometer Eppendorf1101 M mit Rechner 6432 der Fa. Eppendorf Gerätebau, Ham-burg und Photometer „Quantum" mit integriertem Rechner,Fa. Abbott Diagnostics Div., Irving, Texas, USA, durchgeführt.

Allgemeine Analytik

Quantitative Proteinbestimmungen erfolgten über die Biuret-Reaktion (32), Reinheitsbeurteilungen (IgG-Präparationen) viaAcetatgel-Elektrophorese bzw. mittels Immunelektrophörese;die dazu beutzten Geräte stammten von der Fa: · BöskampGerätebau KG, Hersei bei Bonn.

Präparation des Rheumafaktoi-Adsorbeas: Glutar-aldehyd-vernetztes-aggregiertes IgGZur Herstellung des Rheumafaktor-Adsorbens wurde das Prin*zip der Vernetzung von Proteinen durch Glutaraldehyd (33)eingesetzt.

5ml einer Lösung von 50 g/l humanem IgG in 0,15 mol/1Natriumchlorid-Lösung, mit Natrium-Phosphat auf pH 7,2gepuffert, wurden zur Hitzeaggregation 20 nun bei 60 °C imWasserbad inkubiert. Nach Abkühlimg auf Raumtemperaturwurde zu dieser Lösung l ml einer 0,25 mol/1 (2,5%igen) wäßri-

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 24,1986 / No. 6

Kolb und Allner: Eine neue Methode zur Adsorption von Rheumafaktoren 381

gen Lösung von Glutaraldehyd unter ständigem Rühren lang-sam zugetropft. Das sofort bzw. nach wenigen Sekunden ent-standene Gel wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur belas-sen und anschließend durch Spateldruck bereits vorzerkleinertin 100 ml 0,1 mol/1 Phosphatpufferlösung nach Sörensen pH7,2 aufgenommen. Es folgte dann die vollständige Homogeni-sierung der Gelteilchen in einem (lose passenden) Potter-Homo-genisator (Nr. 190 S, Braun, Melsungen) bis zum Erreicheneiner guten Suspensionsphase. Es schloß sich eine ISminütigeZentrifugation bei 10000 g an. Wiederholung des Homogenisie-rens und Zentrifugierens bis das Sediment unter dem einfachenStrahl einer Pipette („Marburg-Pipette" = 1000 ) problemlosund gleichmäßig in Suspension überging. In der Regel wardieser Zustand bereits nach zwei- bis dreimaligem Wiederholender Prozedur (Homogenisieren und Zentrifugieren) erreicht.Das Sediment wurde dann in 50 ml 0,1 mol/1 Glycin-HCl-Pufier pH 2,8 überführt und zweimal im gleichen VolumenGlycin-HCl-Puffer gewaschen. Sodann erfolgte dreimaliges Wa-schen in phosphatgepufferter isotoner NaCl-Lösung pH 7,2.Eine Aufbewahrung in phosphatgepufferter isotoner NaCl-Lö-sung bei 4 °C ohne Zusatz von Stabilisatoren ist nach unserenbisherigen Erfahrungen ohne Adsorptionskapazitätsverlustüber mindestens 9 Monate möglich.

Adsorptionsvorgang, Regeneration des AdsorbensDas Verhältnis von Rheumafaktor-Adsorbens (Adsorbens) zuder in den Serumproben enthaltenen Rheumafaktor-Aktivitätentscheidet über die Vollständigkeit der Rheumafaktor-Adsorp-tion; je höher der Sedimentanteil der Adsorbens-Suspension,desto höher die Adsorptionsleistung nach Mischen mit einementsprechend gewählten Serumvolumen. Auf gute Durchmi-schung der Volumina (Serum und Adsorbenssuspension) mußgeachtet werden. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtem-peratur und mehrmaligem zwischenzeitlichen Aufschütteln derSerum-Adsorbens-Puffer-Suspension erfolgt eine Zentrifuga-tion für 5min bei 10000g. Im Sediment befindet sich dasAdsorptionsmittel mit adsorbierten Rheumafaktoren. Die sobehandelte Probe im Überstand steht dann zur weiteren spezifi-schen Analytik zur Verfügung.Durch den Adsorptionsvorgang tritt eine Serumverdünnungein; wobei das Gesamtsuspensionsvolumen (d. h. Suspensions-puffer + Adsorptionsmittel selbst, da Glutäraldehyd-vernetzt-aggregiertes Adsorbens als ein Gel wie Puffervolumen zu rech-nen ist) die Verdünnung bedingt. Bei den in der vorliegendenArbeit beschriebenen Versuchen war die genannte Rheumafak-tor-Restaktivität nach Adsorption immer auf die Ausgangsakti-vität im Ausgangsvolumen zurückbezogen (z. B. nach Rheuma-faktor-Adsorption sei die Rheumafaktor-Restaktivität 0,01 ·l O6 /lj Verdünnung durch Adsorptionsvorgang l : 4, dannbeträgt die tatsächliche Restaktivität bezogen auf das Aus-gangsvolumen 0,04 · l O6 lE/1). Bei den Experimenten zur Kapa-zitätsbeurteilung des Rheumafaktor-Adsorbens selbst wurdedie adsorbierte Rheumafaktor-Aktivität direkt auf ein Adsor-bens-Sediment-Volumen bezogen (z. B. pro Adsorbens adsor-bierte Rheumafaktor-Aktivität in IE).Zur Desörption der gebundenen Rheumafaktoren wurde dasAdsorbensTSediment, nachdem es zuvor der Adsorption gedienthatte, zunächst zweimal in einem 15fach größeren Volumen anphosphatgepüfferter isotoner NaCl-Lösung zur Entfernung vonSerumresten gewaschen. Danach Zugabe eines kleineren Volu-mens (etwa zweifaches ursprüngliches Serumvölümen) an 0,1mol/1 Essigsäure pH 2,8 zur Desorption. Nach Zentrifugationfür 5 min bei 10 000 g befindet sich die wieder desorbierte Rheu-mafaktor-Aktivität im Überstand, wo sie entsprechend nachge-wiesen werden kann.Die vollständige, schnelle Desorption der Rheumafaktoren zurRegeneration des Rheumafaktor-rAdsorbens erfolgt durch drei-maliges Waschen des zuvor zur Adsorption benutzten Adsor-

bens-Sediments in einem größeren Volumen (ca. 15 —20fachesSedimentvolumen) 0.1 mol/1 Essigsäure. Nach Äquilibrierungder Adsorbens-Suspension gegen phosphatgepufferte isotoneNaCl-Lösung pH 7.2 (z. B. durch dreimaliges Waschen in15fach größerem Volumen als Adsorbens-Sediment) war dieRegeneration beendet. Das Adsorbens stand sodann für einenerneuten Einsatz zur Verfügung.

Ergebnisse und Interpretation der Befunde

In Abbildung l ist beispielhaft der Vorgang einerRheumafaktor-Adsorption mit nachfolgender Desad-sorption und Regeneration des Rheumafaktor-Ad-sorbens dargestellt. Wie mit der dokumentierten Ver-suchsdurchführung verdeutlicht, war im adsorbiertenSerum gegenüber der noch unadsorbierten Probe(Endtiter l : 320) keine Rheumafaktor-Aktivität im

Verdünnung1:20 1 :AO 1:80 1:160

2

3

U

5

6

Q

O

1B

Abb. 1. Die Abbildung zeigt einen Adsorptions-Desorptions-vorgang (dokumentiert im Latex-Agglutinationstesl);von oben nach unten:1 = Rheumafaktor-haltiges Serum nicht adsorbiert,2 = nach Adsorption,3 = Waschflüssigkeit (phosphatgepuflferte isotone

NaCl-Lösung) nach Adsorption (es werden durchdas Waschen allein keine Rheuma faktoren abge-löst),

4 = Desorption mit 0,1 mol/I Essigsäure,5 = 2. Desorption,6 = 3. Desorption.7 zeigt nochmalige Adsorption mit demselben Adsor-

bens wie in 2 nach Regeneration.

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 24,1986 / No. 6

382 Kolb und AJlner: Eine neue Methode zur Adsorption von Rheumafaktoren

Latex-Agglutinationstest mehr nachweisbar. Die überden Adsorptionsvorgang erreichte Serumverdünnung(l : 3) war bei entsprechender ausgleichender Verdün-nung der unadsorbierten Kontrolle durch phosphat-gepufferte isotone NaCl-Lösung ausgeglichen. Wa-schen in phosphatgepufferter isotpner NaCl-Lösungalleine ist nicht in der Lage, den gebundenen Rheu-mafaktor wieder abzulösen. Erst Ansäuerung derProbe — Zugabe von 0.1 mol/1 Essigsäure zum Ad-sorbens-Sediment — führt zu seiner Desorption.Nach weiterem Waschen zunächst in 0.1 inol/1 Essig-säure, dann in phosphatgepufferter isotoner NaCl-Lösung, steht das Adsorbens zur erneuten Adsorptionzur Verfügung und hat, wie ebenfalls in Abbildungl dokumentiert, nichts von seiner Rheumafaktor-Bindungskapazität eingebüßt.

Tab. 1. Vergleich von Absorbanz und Rheumafaktor vor undnach Rheumafaktor-Adsorption mittels Rheumafak-tor-ELISA (Cordia®-RF).

Patient

GAUTSCHWEYARNRUFWERKRI*neg. Kontr.

UnadsorbiertA405nm Rheuma-

faktor

2,40001,3271,2281,1191,0680,2690,0690,070

(106 IE/1)

>0,5>0,5>0,5>0,5>0,5

0,0400

AdsorbiertA4o5nm Rheuma^

faktor

0,1660,1250,1100,1070,0900,0280,047

(106 IE/1)

0,015< 0,01< 0,01> 0,01> 0,01

00

* Seronegative rheumatoide Arthritis.

Die Effektivität der Rheumafaktor-Adsorption mitder beschriebenen Technik wird an einigen Beispielenaufgezeigt (Tab. 1). Bei einem Mischverhältnis Adsor-bensvolumen (Adsorbens-Sediment) mit Serumvolu-men wie 1 + 2 ließen sich nach einmaliger Adsorp-tion aus den Serumproben bereite total bis sübtotaldie Rheumafaktoren entfernen, wie anhand der mit-tels eines Rheumafaktor-ELISA ermittelten Rheuma-faktor-Aktivitäten (IE/1) vor und nach Rheumafak-tor-Adsorption anhand einiger Serumproben beispiel-haft dokumentiert wurde (Tab. 1). Vergleichbare Er-gebnisse erhält man auch bei Einsatz der Latex-Ag*glutination (hier nicht gesondert gezeigt).

Zur Untersuchung der Kapazität des Rheumafaktor-Adsorbens in Abhängigkeit von der jeweiligen indivi-duell vorgegebenen Rheumafaktor-Ausgangsaktivitätwurden die Rheumafaktor-Aktivitäten von 12 Serenvor und nach Adsorption in einem ELISA auf Rheu-mafaktor (Cordia®-RF, Byk-Mallinckrodt) be-stimmt. Zum Ausgleich der durch Zugabe des Adsor-bens erwirkten Serumverdünnung (Verdünnungsfak-tor hier = 2) wurden die nach Adsorption ermitteltenRheumafaktor-Werte (IE/1) rechnerisch verdoppelt.Wie in Tabelle 2 ersichtlich, erreichten wir bei dieserVersuchsanordnung Adsorptionsleistungen von min-destens 60,4% und maximal 95,3%, gemessen an denjeweiligen Rheumafaktor-Ausgangsaktivitäten. Diemittlere Adsorptionskapazität kann bei den vorgege-benen Versuchsbedingungen mit 76,8% angegebenwerden. Auffällig war, daß keine Korrelation zwi*sehen Höhe der Rheumafaktor-Ausgangsaktivitätund Vollständigkeit der Rheumafaktor-Eliminationdurch die Adsorption besteht. So wurden hohe Rheu-mafaktor-Aktivitäten teilweise vollständiger adsor-biert als niedrigere.

Tab. 2. Auswertung einer Rheumafaktor-Adsorption an 12 versch. Rheumafaktor-haltigen Seren. Angabe der Adsorptionskapazi^tat in Prozent der Gesamtaktivität des unverdünnten Serums. Verdünnung durch Adsorptionsvorgang wurde durchentsprechende Multiplikation der Rheumafaktor-Restaktivität (nach Adsorption) rechnerisch ausgeglichen.

Patient

WERREIARNWEJBICKSCHNEIBLUTSCHOHER

GAULAN

RheumafaktorLatex-Titervor Adsorption

1:1 :1:1 :1:1 :1:1:1 :1 :1:1 :

2040

160320160160320320160160640

1200

Rheumafaktoraktivitätvor nachAdsorption Adsorption(106 IE/1)

0,0170,0720,2600,2800,3000,3600,4100,4400,5600,5601,0402,700

(106 IE/1)

0,0050,0190,0800,0660,0180,1100,0680,0780,2080,2220,1700,160

adsorbiert

(106 IE/1)

0,0120,0530,1800,2140,2820,250 ,0,3420,3620,3520,3380,8702,f40

Anteil

0,7060>7420,6920,7640,9530,6940,8340,8230,6290,6040,8370,941

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 24,1986 / No. 6

Kolb und Allner: Eine neue Methode zur Adsorption von Rheumafaktoren 383

Da wir bei der Präparation unseres Rheumafaktor-Adsorbens von der Vorstellung ausgingen, daß einerelative Dichte des Gammaglobulin-Substrates, wiewir sie mit Glutaraldehydvernetzung erreichen, einewichtige Voraussetzung für eine gute Adsorptionska-pazität sein müßte, war im folgenden zu klären, obeine Beziehung auch zwischen der Adsorbens-Suspen-sionsdichte und der Adsorptionskapazität besteht.Die Klärung dieses Problems war überdies auch imHinblick auf eine gute (Routine-) handhabbarkeitvon nicht unwesentlicher Bedeutung, da dünne Sus-pensionen (z. B. mit einer Tropfpipette) einfacherProben zuzusetzen wären.

Die Adsorbens-Suspensionen bzw. die Serumverdün-nungen wurden wie folgt erstellt:

Suspension aSuspension bSuspension cSuspension d

Adsorbens

(

80808080

Phosphatgepufferteisotone NaCl-Lösung( )

4080

320640

Jeweils 100 der Suspensionen a—d wurden mit je100 Rheumafaktor-Serum vermischt; d. h. alle Se-ren waren durch die Adsorptionsprozedur l : 2 ver-dünnt, die Verdünnung des Adsorptionsmittels folgteder Reihe l : 1,5; 1:2; 1:5 und 1:9 = VolumenAdsorbens-Sediment zu Gesamtvolumen (aus Serum,Adsorbens-Sediment und phosphatgepufferter iso-toner NaCl-Lösung). Bezieht man dann die adsor-bierte Rheumafaktor-Aktivität auf die in der Probetatsächlich vorhandene Menge an Adsorptionsmittel,so erhält man eine deutliche Steigerung der Rheüma-faktor-Adsprptionskapazität mit zunehmender Ver-dünnung der Adsorbens-Suspension. Tabelle 3 gibtdie Zusammenstellung. Drückt man die gemessenenKäpazitätssteigerungen ab Adsorbens-Ausgangsvef-dünnung a (l : 1,5) als Zunahme-Faktor aus — Ta-belle 4 — so erhalt man im Vergleich aller vier Proben(BICK, TSCHO, HER, LAN) ähnliche Steigerungs-raten, ausgedrückt durch die relative Konstanz derermittelten Faktoren,

Tab. 3. Durch l Adsorbens adsorbierte Rheumafaktoren(IE) pro 100 Serum bei Adsorbens-Konzentrationena—d (vgl. Beschreibung des Versuchsaufbaus).

Patient a b c d

BICKTSCHOHERLAN

4,35,75,5

39,4

5,77,27,9

52,3

13,616,315,5

106,0

21,121,622,5

156,6

Abbildung 2 zeigt das von der Suspensionsdichte ab-hängige Rheumafaktor-Adsorptionsverhalten unse-res Adsorbens in graphischer Form. Dabei demon-striert die untere Kurve ( ) die Auftragung derAdsorptionssteigerung bezogen auf die willkürlich ge-wählte Adsorbens-Stammverdünnung a (Verd. 1,5),die obere Kurve) ( ) zeigt einen auf die unver-dünnte Suspension (reines Sediment) zurückgerech-neten (theoretischen) Verlauf als Ausdruck der allge-meingültigen Rheumafaktor-Bindungskinetik unseres

o

J 7a:

6

.

•54

l3m

1:1 1:5 1:10Verdünnung des Glutaraldehyd - vernetzten -aggregierten IgG

Abb. 2. Abhängigkeit der Rheumafaktor-Adsorptionskapazi-tät von der Suspensionsdichte des Adsorbens — Erläu-terungen s. Text, n = 4; angegeben ist nicht die Stan-dardabweichung, sondern der Bereich zwischen dengemessenen Extremwerten.

Patient

LANGAUBLUHERBICK

A405„m

0,5110,3410,2440,2180,2120,121

Rheuma-faktor[ 6 /1]

2,701,040,410,560,300,56

Korrelations-koeffizientr = 0,91t — 440,01 < p < 0,02

Tab. 4. Zunahme der Rheumafaktor-Adsorptionskapazität vonGlutaraldehyd-vernetztem-aggregiertem Immunglobu-lin ausgedrückt als Faktor bezogen auf die Ausgangs-verdünnung a.

Patient

BICKTSCHOHERLAN

a

1 =1 =1 =1 =

4,3 IE5,7 IE5,5 IE

39,4 IE

b

1,31,31,41,3

=1,325

c

3,22,92,82,7

=2,90

d

4,93,84,14,0

=4,20

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / VoL 24,1986 / No. 6

384 Kolb und Allner: Eine neue Methode zur Adsorption von Rheumafaktoren

Adsorbens. Für die weitere Beschreibung der Adsorp-tionseigenschaften war es wichtig zu klären, ob undinwieweit Lagerungsdauer und/oder Modifikationder Präparation einen Einfluß auf die Adsorptionslei-stung des Adsorbens haben.Es wurden 7 verschiedene Präparationen (Ads. 1—7;Tab. 5) an 4 Rheumafaktor-haltigen Seren getestet.Tabelle 5 gibt den Versuchsaufbau und die nach Ad-sorption gemessenen Rheumafaktor-Restaktivitäten(IE/1) wieder. „Nativ-acid" bedeutet in diesem Zu-sammenhang, daß das zur Adsorptionspräparationverwandte IgG nicht hitzeaggregiert und damit alsonativ mit Glutaraldehyd vernetzt wurde, gleichwohlaber der üblichen Behandlung mit Glycin-HCl-Puffer(„acid") unterworfen war. „Neutral" bedeutet: keineNachbehandlung mit Glycin-HCl. Im Ansatz „Ads.3" wurde erst im Anschluß an die bereits abgeschlos-sene Präparation des Adsorbens bzw. nach Suspen-dierung hitzeaggregiert. Alle anderen Chargen unter-scheiden sich lediglich durch ihre Herstellungsdatenund damit in der Lagerungsdauer; Zeitpunkt des do-kumentierten Versuchs: 01. 07. 1983.Bei Betrachtung der in Tabelle 5 zusammengefaßtenErgebnisse zeigte die Adsorbenspräparation, bei derdie Hitzeaggregation nach abgeschlossener Suspen-dierung des Glutaraldehyd-vernetzten Immunglobu-lins erfolgte, die mit Abstand schlechtesten Adsorp-

tionsleistungen; offensichtlich verändert Hitzebe-handlung nach erfolgter IgG-Vernetzung mittels Glu-taraldehyd die Antigenität zuungunsten der Affinitätdes Rheumafaktor ihm gegenüber. Umgekehrt schafftalleinige Vernetzung von IgG durch Glutaraldehydohne vorherige Hitzeaggregation <Ads. 1) ausreichenddicht beieinanderliegende antigene Determinantenzur stabilen Bindung des Rheumafaktors. Die Lage-rungszeit hatte bisher keinen Einfluß auf die Adsorp-tionsleistung.

Die Inkubationszeit der Adsorptionsreaktion hat aufBindung der Rheumafaktoren einen nachweisbarenEinfluß. Eine Inkubationsdauer von 30 Minuten er-wies sich unter den Verfahrensbedingungen im Mittelam wirkungsvollsten, gemessen an in den Probenjeweils verbleibenden Rheumafaktor-Restmengen(vgl. Tab. 6). Längere Inkubationszeiten brachten kei-nen zusätzlichen Effekt. Eine Inkubation von ledig-lich 10 Minuten wies eine deutlich schlechtere Ad-sorptionsleistung auf. Absolut unbefriedigende Er-gebnisse zeigte eine 14 h lange Inkubation bei 4 °C(Kühlschrank). Eine Zunahme der Rheumafaktor-Aktivität durch einfaches Belassen der nativen Serenfür 6 h bei Raumtemperatur war, wenn auch in relativgeringem Maße, bei zwei der drei Proben feststellbar— Dissoziationsphänomene (34) spielen dabei even-tuell eine Rolle.

Tab. 5. Dargestellt ist die Adsorptionskapazität diverser Chargen und Präparationsmodifikationen von Glutaraldehyd-vernetzten-aggregiertem-IgM: Ads. 1—7 über die Angabe der jeweiligen Rheumafaktor-Restaktivität nach Adsorption. Der dokumen-tierte Versuch wurde am 1.7. 83 durchgeführt. Das reine Adsorbens-Sediment war im. .;Völümenverhältnis l : 2 inphosphatgepufferter isotoner NaCl-Lösung suspendiert. 100 ml dieser Suspension wurden 100 Serum zugefügt. Darausresultierte eine Serumverdünnung von l : 2 und eine Verdünnung des Adsorbens wie l : 4.

vor Ads. Ads. l Ads. 2 Ads. 3 Ads. 4 Ads. 5 Ads. 6 Ads. 7

LANTSCHOBICKHER

Ads. 1Ads. 2Ads. 3Ads. 4Ads. 5Ads. 6Ads. 7

AdsorbensAdsorbensAdsorbensAdsorbensAdsorbensAdsorbensAdsorbens

2,7000,5000,2700,630

— nativ-acid— neutral

0,1460,0960,0180,140

0,1560,1020,1440,126

— nach Vernetzung hitzeaggregiert

1,4000,2200,1200,350

(vom 10. 2. 83)(vom 23. 1. 83)bei 60 °C 20 min(vom 29. 12. 82)(vom Okt. 82)(vom 14. 6. 83)(vom 10. 6. 83)

0,3800,1000,0220,160

(vom 9. 6.

0,1300,0740,0100,120

83)

0,1040,0620,0120,144

0,1500,0780,0130,190

Tab. 6. Einfluß der Inkubationszeit auf die Adsorptionskapazität von Glutaraldehyd-vernetztem-aggregiertem-IgM bei Raumtem-peratur. Angegeben sind Rheumafaktor-Restaktivitäten in l O9 IE/1. Adsorbens: Serum wie 1:4 (Ads.-Vol.: Ges.-Vol. =1:4).

Patient Vor Adsorption0 min 6 h 10 min 30 min

Nach Adsorption2h 6h 14h

ARN

LAN

0,3000,5302,700

0,3200,5303,100

0,1140,2200,140

0,0940,1860,110

0,0820,1800,130

0,0680,164

r 0,1 52

0,0840,3800,520

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 24,1986 / No. 6

Kolb und Allner: Eine neue Methode zur Adsorption von Rheumafaktoren 385

Hinweise für die praktische Nutzung

Auf die Beeinflussung immunologischer Bestimmun-gsverfahren durch entsprechende Rheumafaktor-Ak-tivität wurde eingangs bereits hingewiesen. Die Ge-fährlichkeit der Konstellation: Spezifisches IgG beigleichzeitigem Vorhandensein von IgM-Rheumafak-tor hinsichtlich falsch positiver spezifischer IgM-Titerstellt wegen eventueller eugenischer Konsequenzenbei den ELISA zum Nachweis einer frischen Röteln-Infektion einen besonderen Problemfall dar. Beach-tenswert ist dabei, daß selbst geringe Konzentratio-nen an Rheumafaktor zur Vortäuschung einer deut-lich spezifischen IgM-Antwort ausreichen (Tab. 7).Nach einmaliger, subtotaler Adsorption der Rheuma-faktoren sind zunächst falsch angezeigte hohe Anti-Rubella-IgM-Titer nicht mehr in dieser Höhe nach-weisbar. Wie in Tabelle 7 dokumentiert, folgt derAbnahme des Rheumafaktor-Titers konsequent dieentsprechende Reduktion des falsch positiven „spezi-fischen" IgM-Titers.

Auch in ihrer Aussage einfache Teste ohne quantita-tive Titerangaben wie der Rubazym®-M-Test zeigeneine Rheumafaktor-Interferenz (Abb. 3). Im „Grau-bereich" dieser Methode sind die erhaltenen Angaben(Absorbanzen) deutlich abhängig von der in derProbe enthaltenen Rheumafaktor-Aktivitäten. DieAdsorptionskapazität unseres Adsorbens war in denvon uns untersuchten Proben auch bei Einsatz nichtvorverdünnter Seren immer ausreichend hoch, um diedurch Rheumafaktoren vorgetäuschten spezifischenIgM-Titer zu eliminieren. Gleichwohl wäre es theore-tisch denkbar, daß bei extrem hohen Rheumafaktor-Konzenträtionen (Rheumafaktor-Titer > l : 2000)eine zweite Adsorption bzw. eine Vorverdünnung derProben erforderlich wäre. Da jedoch bei den meistenELISA-Verfahren zum Nachweis spezifischer IgM-

0,6

0,5

0.3

0,1

-positiv-

0 0,4 0,8 1.2 1.6 2,0 2.4 2.8Rheumafaktor-Aktivität (Cordia®-RF) C106IE/U

Abb. 3. Abhängigkeit der Indikatorreaktion (Rubazyme®-M)von der Rheumafaktor-Aktivität (IE), gemessen miteinem Rheumafaktor-ELISA (Cordia®-Rheumafak-tor).

Antikörper Probenvorverdünnung in der Regel vor-geschrieben sind, böte sich für die Praxis die Einschal-tung der Rheumafaktor-Adsorption im Rahmen derProbenverdünnung an, zumal die Adsorptionslei-stung unseres Adsorbens in dünnen, d. h. geringerkonzentrierten Adsorbenssuspensionen deutlich ge-steigert ist (vgl. Abb. 2).

Durch die Rheumafaktor-Adsorption durch unserAdsorbens kommt es nicht zum Verlust spezifischerAntikörper. Entsprechend konnten im Hämaggluti-nationshemmtest Rübe HIT® vor und nach Rheuma-faktor-Adsorption keine Titerunterschiede gefundenwerden (Tab. 8).

Tab. 7. Vprtäuschung spezifischer IgM-Antikörper gegen Rubella-Anügen durch Rheumafaktoren im Enzym-Immunoassay(ELISA — Enzygnost® ^ Rubella). Gegenübergestellt sind die vor und nach Teiladsorption der Rheumafaktorenermittelten IgM-Titer gegen Rubella und die korrespondierenden Rheumafaktor-Titer, ermittelt mit der Rheumafaktor-Latex-Agglutination (Rapi Tex®sRheumafaktor).

Patient Diagnose VorRheumafaktor-AdsorptionTiter:Rheuma-faktor

Titer:Anti-Rubella-lgU

NachRheumfaktor-AdsorptionTiter:Anti-Rubella-lgM

Titer:Rheuma-faktor

GAUTSCH

ARNRUFREIWER

PneumonieRheumatoide ArthritisRheumatoide ArthritisRheumatoide ArthritisRheumatoide ArthritisHepatitis BLebercirrhose 1.

60032016080604020

1 :6401:3201 :1601 : 801:1601 :1601 :160

1:801 :401:801:401 :801 :40t :80

1 :301 :301:201:101: 500

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 24,1986 / No. 6

386 Kolb und Allner: Eine neue Methode zur Adsorption von Rheumafaktoren

Tab. 8. Bestimmung des Immunitätsstatus gegen Rubella imHämagglutinationshemmtest (Rübe HIT®, Fa. Beh-ringwerke AG) vor und nach Adsorption der Rheuma-faktoren.

Patient Titer: Rubella HIT®vorAdsorption

nachAdsorption

GAUTSCHO

ARNRUFREIWER

1111111

12832

128164

1632

256

1111111

12832

1281641632

256

Spezifische IgM-Antikörper werden nicht adsorbiert.Ein entsprechender Beleg wurde durch die Bearbei-tung zweier Anti-jR«&£//a-IgM-haltiger Seren er-bracht. Serum „SCHAM" stammt von einem akutan Röteln erkranktem Schulkind, Serum „LIN" voneiner geimpften jungen Frau, beide waren seronegativ(kein Rheumafaktor). Die Probennahme erfolgtejeweils 14h nach Aufschießen des Exanthems bzw.

post vaccinationem. Wie in Tabelle 9 dokumentiert,hat das Adsorptionsverfahren dabei keinen Einflußauf die spezifischen Rubella-IgM-Titer. Die im Test-ansatz mitgeführten Rheumafaktor-haltigen Seren„BICK" und „LAN" dagegen zeigten, wie zu erwar-ten, einen deutlichen Titerabfall bzw. eine Eliminationder falsch positiven IgM-Titer.

Tab. 9. Kein Einfluß der Rheumafaktor-Adsorption (Adsor-beüs 4- Serum = 1 4 - 1 ) auf die anti-Rubella IgM-Titer bei SCHAM und LIN; die Rheumafaktor-SerenLAN und BICK zeigen einen deutlichen Titerabfallnach Rheumafaktor-Adsorptiqn. Kleinste Titerstufe1:40 (d.h. <1:40 = 0), Enzygaost®-Rubella.

Patient Titer: Anti-Rubella-IgMvor nachRheumafaktor- Rheumafaktor-Adsorption Adsorption

SCHAMLIN

LANBICK

1:12801: 160

1: 1601: 160

1:12801: 160

<1: 40<1: 40

Literatur

1. Meurmann, O. H. & Ziola, B. R. (1978) J. Clin. Pathol. 31,483.

2. Bütler, R. & Brunner, E. (1974) Vox Sang. 25, 466-469.3. Ziegelmaier, R. & Bieker, R. (1982) Laboratoriumsblätter

32, 35-38.4. Salonen, E. M., Vaheri, A., Suni, J. & Wager, O. (1981) J.

Infect. Dis. 142, 250-255.5. Geisen, H. P. & Seelig, H. P. (1979) Lab. Med. 3, 23-26.6. Zalan, E., Wilson, C. & Labzoffsky, N. A. (1973) Arch.

Ges. Virusforsch. 40, 1971-173.7. Gordon, M. A. & Lapa, E. W. (1974) Am, J. Clin. Pathol.

<tt, 488-494.8. Yeni, P, Segond, R, Massias, P. & Pillot, J. (1978) Lancet

/, 219-220.9. Roberts, R., Chabasse, D. & Hoque, T. P. (1980) Biomed.

Express 35, 61-65.10. Wager, O. & Lindström, P. (1982) Scand. J. Immunol. l,

319-328.11. Wager, O., Lindström, P, Räsänen, J. A., Kekomäki, R.,

Ziola, B., Salmi, A., Isomäki, H., Skrifvars, B. & Penttinen,K. (1982) J. Clin. Exp. Med. 46, 149-160.

12. Sever, J. L. (1962) J. Immunol. 88, 320 zitiert n. Bouin, O.(1973) Quantitativ-virologische Methodik, Stuttgart p. 228.

13. Yolken, R. H. & Leister, F. J. (1981) J. Clin. Microbiol. 14,427-432.

14. Leinikki, P O., Shekarchi, L, Dorsett, P. & Sever, J. L.(1978) J. Lab. Clin. Med. 92, 849-857.

15. Edgeskjold, E. M., Graudal, H., Sorensen, H. J. & Pennin,H. (1977) Lancet II, 456-457.

16. Zuraw, B. L., O'Hair, C. H., Vaughan, J. H., Mathison,D. A., Curd, J. G. & Katz, D. H. (1982) J. Clin. Invest. 68,1610-1613.

17. Hr^cir, Z., Vavrina, J., Salavec, M. & Tichy, M. (1976)Ä Rev. Czech. Med. 21, 166-170.

18. Verdier, J. M., Cassuto, J. P., Viot, G., Quaranta, J. F. &Krebs, B. P. (1981) Nouv. Presse Med. 9, 1973-1075.

19. Silverberg, J., Row, V. V. & Volpier, R. (1978) Am. Intern.Med. 88, 216-217.

20. Markenson, J. A., Daniels, C. A., Notkins, A. L., Hofna-gle, J. H., Gerety, J. & Barker, L. F. (1976) Clin. Exp.Immunol. 19, 209-217.

21. State, L, Rüncan, V., Voiculescu, M. & State, D. (1973)Rev. Roum. Med. Intern. 10, 29 — 36.

22. Kacaki, J. N., Siem, T. H. & Broüwer, R. (1977) Lancet 7,1008-1009.

23. Roberts-Thomson, P. J. & Bradley, J. (1980) Clin. Exp.Immunol. 37, 408-415.

24. Capra, J. D., Winchester, R. Jv & Kunkel, H. G. (1969)Arthr. Rheum. 12, 67-73.

25. Cohen, J., Joyce, L., Blanchard, F., Etienne, J. C., Goü-geon, J. & Dfopsy, G.E. (1982) Ann. Immünol. 132,201-210.

26. Meurmann, O. H., Terho, P. & Salmi, A. (1979) Lancet //,685-686.

27. Vejtorp, M. (1979) Lancet /, 215-216.28. Vejtprp, M. (1981) Acta Pathol. Microbiol. Scand. 89,

123-128.29. Naot, Y., Barnett, E. V. & Remington, J. S. (1981) J. Clin.

Microbiol. /4, 73-78.30. Skaug, K. & Gaarder, P. J. (1978) Acta Pathol. Microbiol.

Scand. Sect. C. Immunol. 86, 33-36.31. Ziegelmaier, R., Bieker, R., Behrens, W. & Vermeer, H.

(1983) Laboratoriumsblätter 33, 19-25.32. Weichselbaum, T. E. (1946) Am. J. Clin. Pathoi. 10, 40.

Zitiert n. W. Riek (1977) Klinische Chemie und Mikrosko-pie Berlin-Heidelberg-New York.

33. Avrameas, S. & Ternyck, T. (1969) Immunochem. 6,53-66.

34. Allen, J. & Kunkel, H. G. (1966) Arthr. Rheum. 9,758-768.

Dr. Dr. Gerald KoibKlinikum derPhilipps-Universität MarburgZentrum für Innere MedizinMed. Klinik und PoliklinikLahnbergeD*3550 Marburg ''

J. Clin, Chem. Clin. Bipchem./ Vol. 24,1986/No. 6