Einfluss der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase auf den cGMP ... · Einfluss der NO-sensitiven...

Einfluss der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase auf den

cGMP/cAMP-Crosstalk und die Steifigkeit

der murinen Aorta

Dissertation zur Erlangung des

naturwissenschaftlichen Doktorgrades

der Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Sarah Dünnes

aus Mainz

Würzburg 2016

Eingereicht am:

………………………………………….….

Mitglieder der Promotionskommission:

Vorsitzender:

………………………………………….….

Gutachter:

………………………………………….….

Gutachter:

………………………………………….….

Tag des Promotionskolloquiums:

………………………………………….….

Doktorurkunde ausgehändigt am:

………………………………………….….

Eidesstattliche Erklärung

nach §4 Abs. 3 Satz 3, 5, 8 der Promotionsordnung der Fakultät für Biologie

Hiermit erkläre ich an Eides statt, die Dissertation: „Einfluss der NO-sensitiven

Guanylyl-Cyclase auf den cGMP/cAMP-Crosstalk und die Steifigkeit der murinen

Aorta“, eigenständig, d. h. insbesondere selbständig und ohne Hilfe eines kommerziellen Promotionsberaters, angefertigt und keine anderen, als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet zu haben.

Ich erkläre außerdem, dass die Dissertation weder in gleicher noch in ähnlicher Form bereits in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen hat.

Würzburg, den ____________

_________________________

Sarah Dünnes

Meiner geliebten Familie

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung .............................................................................................................. 1

1.1 NO/cGMP-Signalkaskade .............................................................................. 1

1.2 NO-Synthese ................................................................................................. 1

1.3 NO-sensitive Guanylyl-Cyclase ...................................................................... 4

1.4 Effektorproteine von cGMP ............................................................................ 5

1.4.1 cGMP-abhängige Phosphodiesterasen ................................................... 5

1.4.1.1 Phosphodiesterase 3 ....................................................................... 6

1.4.2 cGMP-abhängige Ionenkanäle ................................................................ 7

1.5 Effektorproteine von cAMP ............................................................................. 7

1.6 NO/cGMP-Signalkaskade im vaskulären System ........................................... 8

1.7 Das Blutgefäßsystem ....................................................................................11

1.7.1 Funktion und Aufbau der Blutgefäße ......................................................12

1.7.2 Aorta ......................................................................................................15

1.8 Extrazelluläre Matrix ......................................................................................15

1.8.1 Kollagen .................................................................................................16

1.8.2 Elastin ....................................................................................................17

1.8.3 Vaskuläres Remodelling und Pulswellengeschwindigkeit .......................17

1.9 Transgene Maus-Modelle ..............................................................................18

1.9.1 Globaler Knock-out der NO-GC ..............................................................19

1.9.2 Glattmuskelspezifischer Knock-out der NO-GC ......................................20

2 Zielsetzung ...........................................................................................................21

3 Material und Methoden .........................................................................................22

3.1 Material .........................................................................................................22

3.1.1 Chemikalien ...........................................................................................22

3.1.2 Antikörper für Western Blot ....................................................................23

3.1.3 Antikörper für Immunhistochemie ...........................................................23

3.1.4 Puffer und Lösungen ..............................................................................23

3.1.5 Geräte ....................................................................................................26

3.2 Methoden ......................................................................................................27

3.2.1 Tiere und Präparation ............................................................................27

3.2.1.1 Haltung und Zucht ...........................................................................27

3.2.1.2 Tamoxifen-Injektionen .....................................................................27

3.2.1.3 Genotypisierung ..............................................................................27

3.2.1.4 Organentnahme ..............................................................................28

3.2.2 Western Blot ..........................................................................................28

3.2.2.1 Herstellung der Western Blot-Proben ..............................................28

3.2.2.2 Bestimmung der Proteinkonzentration .............................................28

3.2.2.3 Gelelektrophorese ...........................................................................29

3.2.2.4 Blotting ............................................................................................29

3.2.3 Messung von Durchmesser und Wanddicke ..........................................30

3.2.4 Aktivitätsmessungen ..............................................................................30

3.2.4.1 Phosphodiesterase-Assay ...............................................................30

3.2.4.2 Radioimmunoassay .........................................................................32

3.2.5 Organbad ...............................................................................................34

3.2.5.1 Test zur Relaxation der Gefäße ......................................................34

3.2.5.2 Spannungs-Dehnungs-Test ............................................................35

3.2.6 Messung der Pulswellengeschwindigkeit mittels MRT ............................36

3.2.6.1 Tierpräparation und Messung .........................................................37

3.2.6.2 Auswertung .....................................................................................39

3.2.7 Biochemische Untersuchungen der Aorta ..............................................39

3.2.7.1 Elastin-Assay ..................................................................................39

3.2.7.2 Kollagen-Assay ...............................................................................40

3.2.8 Immunhistochemie .................................................................................41

3.2.9 Histologie ...............................................................................................41

3.2.9.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ............................................................41

3.2.9.2 Pikrosiriusrot-Färbung .....................................................................42

3.2.10 Statistik ..................................................................................................42

4 Ergebnisse ...........................................................................................................43

4.1 Ausschnitt der NO-GC...................................................................................43

4.1.1 Immunhistochemie der glatten Muskulatur .............................................43

4.1.2 NO-induzierte Relaxation der Gefäße ....................................................46

4.2 cAMP/cGMP-Crosstalk ..................................................................................46

4.2.1 cAMP-Signalkaskade .............................................................................49

4.2.1.1 Messung des cAMP-Spiegels mittels Radioimmunoassay ..............49

4.2.1.2 Effekt von Forskolin auf die Relaxation der Aorta ............................49

4.2.2 PDE3-vermittelter cAMP/cGMP-Crosstalk ..............................................49

4.2.2.1 PDE3-Expression in der glatten Gefäßmuskulatur ..........................53

4.2.2.2 Rolle der PDE3A bei der Relaxation der Aorta ................................55

4.2.2.3 Effekt von ODQ auf die Milrinon-induzierte Relaxation ....................55

4.2.2.4 Abnahme der PDE3A-Expression ...................................................58

4.2.2.5 PDE3A-Aktivität ..............................................................................61

4.3 Einfluss der NO-GC auf die Steifigkeit der Aorta ...........................................63

4.3.1 Messung des spezifischen Herzgewichtes .............................................63

4.3.2 Aortensteifigkeit .....................................................................................65

4.3.2.1 Spannungs-Dehnungs-Test ............................................................65

4.3.2.2 Pulswellengeschwindigkeit ..............................................................68

4.3.3 Messung der Aorten-Geometrie .............................................................68

4.3.4 Messung der ECM-Proteine ...................................................................71

4.3.5 Struktur der Aorta ...................................................................................73

5 Diskussion ............................................................................................................78

5.1 Deletion der NO-GC in den Gefäßen .............................................................78

5.2 Einfluss der NO-GC-Deletion auf den cAMP/cGMP-Crosstalk .......................79

5.3 Bedeutung der NO-GC für die Steifigkeit der Aorta .......................................83

6 Zusammenfassung ...............................................................................................89

7 Summary ..............................................................................................................90

8 Literaturverzeichnis ..............................................................................................92

9 Eigene Publikationen .......................................................................................... 103

10 Danksagung ................................................................................................... 104

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Die NO/cGMP-Signalkaskade………………………………………………….….2

Abb. 2: Signalwege in der glatten Muskulatur…………………………………………….9

Abb. 3: Aufbau einer Arterie………………………………………………………………..14

Abb. 4: Magnetresonanztomographie der Maus-Aorta………………………………….38

Abb. 5: Immunhistochemische Analyse des NO-GC-Ausschnitts in der Aorta……….44

Abb. 6: NO-GC-Ausschnitt in der Arteria carotis………………….………………….….45

Abb. 7: Verlust der NO-induzierten Relaxation in KO-Aorten…………….…………….47

Abb. 8: NO-induzierten Relaxation der Arteria carotis…………………………………..48

Abb. 9: Basal und Forskolin-stimulierte cAMP-Produktion……………………...………50

Abb. 10: Effekt von Forskolin auf die Relaxation der Aorta………………………………51

Abb. 11: Forskolin-induzierte Relaxation der Aorta……………………………………….52

Abb. 12: Expression der PDE3…………………………………..………………………….54

Abb. 13: Effekt von Milrinon auf die Relaxation der Aorta………………………….…….56

Abb. 14: Milrinon-induzierte Relaxation der Aorta……………………………….………..57

Abb. 15: Effekt von ODQ auf die Relaxation der Aorta………………………….………..59

Abb. 16: Quantifizierung der PDE3A-Expression…………………………….…………...60

Abb. 17: Zusammenhang zwischen NO-GC- und PDE3A-Expression…..……………..62

Abb. 18: cAMP-abbauende PDE3A-Aktivität…………………………………………..…..64

Abb. 19: Spezifisches Herzgewicht……………………………………………………..…..66

Abb. 20: Spannungs-Dehnungs-Diagramm……………………………………………..…67

Abb. 21: Pullswellengeschwindigkeit…………………………………..…………………...69

Abb. 22: Geometrie der Aorta………………………………………………………..……...70

Abb. 23: Biochemische Messung von Elastin und Kollagen………………………….….72

Abb. 24: Veränderte Struktur der „elastic lamellae“ in GCKO-Aorten…………………..74

Abb. 25: Struktur der „elastic lamellae“ in SMC-GCKO-Aorten……………….…………75

Abb. 26: Zusammenfassung der Ergebnisse aus Teil 4.3………………….…………….77

Abb. 27: Einfluss von Milrinon auf den PDE3A-vermittelten cAMP/cGMP-Crosstalk…82

Abkürzungsverzeichnis

α-SMA = α-Glattmuskel-Aktin ATP = Adenosintriphosphat BKCa-Kanal = Calcium-aktivierter Kaliumkanal BH4 = Tetrahydro-L-biopterin BSA = Rinderserumalbumin cAMP = zyklisches Adenosinmonophosphat cGMP = zyklisches Guanosinmonophosphat DAG = Diacylglycerol DMAB = 4-Dimethylaminobenzaldehyd DTT = Dithiothreitol EC = Endothelzellen eNOS = endotheliale NO-Synthase FAD = Flavin-Adenin-Dinucleotid FMN = Flavin-Mononucleotid GCKO = globaler knock-out der NO-GC GSNO = S-Nitrosoglutathion GTN = Glyceroltrinitrat GTP = Guanosintriphosphat iNOS = induzierbare NO-Synthase IP3 = Inositol 1,4,5,-trisphosphat KH-Lösung = Krebs-Henseleit-Lösung L-NAME = NG-Nitro-L-Arginin-Methylester MLC = Myosin-leichte-Kette MLCK = Myosin-leichte-Ketten-Kinase MLCP = Myosin-leichte-Ketten-Phosphatase MRT = Magnetresonanztomographie NADP = Nicotinaäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat nNOS = neuronale NO-Synthase NO = Stickstoffmonoxid NO-GC = NO-sensitive Guanylyl Cyclase NOS = NO-Synthase ODQ = 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]- quinoxalin-1-on PDE = Phosphodiesterase PE = Phenylephrin PIP2 = Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat PKA = Proteinkinase A PKG = cGMP-abhängige Proteinkinase PLC = Phospholipase C RT = Raumtemperatur SMC = Glattmuskelzellen SMC-GCKO = Glattmuskelzell-spezifischer knock-out der NO-GC ÜN = über Nacht VE = voll-entionisiert w/v = Gewicht pro Volumen WT = Wildtyp-Maus v/v = Volumen pro Volumen

1

1 Einleitung

1.1 NO/cGMP-Signalkaskade

Die NO/cGMP-vermittelte Signalkaskade spielt eine wichtige Rolle bei vielen

physiologischen Prozessen, wie der Blutdruckregulation, der Thrombozytenaggregation

und -adhäsion und der synaptischen Plastizität. Innerhalb der Kaskade nimmt die NO-

sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) eine Schlüsselfunktion als wichtigster Rezeptor für

das Signalmolekül Stickstoffmonoxids (NO) ein (Abb. 1). Bereits 1980 wurde von

Furchgott und Zawadzki ein im Endothel freigesetzter Faktor, der sogenannte

„endothelium derived relaxing factor“ (EDRF) entdeckt, der zur Erweiterung der

Blutgefäße führt (Furchgott & Zawadzki, 1980). Jahre später stellte sich heraus, dass es

sich bei diesem Faktor um das Radikal Stickstoffmonoxid (NO) handelt (Ignarro et al.,

1987; Palmer et al., 1987). NO wird endogen von verschiedenen Isoformen der

NO-Synthase produziert. Die Bindung von NO an die NO-GC führt zur Produktion des

sekundären Botenstoffs cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP). Dieser Botenstoff

aktiviert verschiedene Effektor-Moleküle, wie cGMP-abhängige Proteinkinasen, cGMP-

regulierte Phosphodiesterasen oder cGMP-regulierte Ionenkanäle (Lohmann et al.,

1997; Rybalkin et al., 2003). Über diese unterschiedlichen Effektoren bewirkt cGMP

letztlich eine Gefäßrelaxation (Schultz et al., 1977; Groneberg et al., 2010), die

Hemmung der Thrombozytenaggregation und -adhäsion (Bohme et al., 1974; Haslam et

al., 1978; Mellion et al., 1981; Walter & Gambaryan, 2004) sowie die Modulation der

synaptischen Plastizität (Lu et al., 1999). Durch die Relaxation der glatten Muskulatur in

Blutgefäßen trägt die NO/cGMP-vermittelte Signalkaskade wesentlich zur Regulation

des Blutdrucks bei. Phosphodiesterasen beenden das cGMP-Signal durch Abbau des

sekundären Botenstoffs.

Im Folgenden wird auf die einzelnen Komponenten des Signalwegs und deren Funktion

näher eingegangen.

1.2 NO-Synthese

NO ist ein gasförmiges freies Radikal, das aufgrund seiner geringen Größe und

Lipophilie ungehindert durch Zellmembranen diffundieren kann und somit intra- und

interzellulär als Gasotransmitter fungiert. Durch seine hohe Reaktivität und der damit

verbundenen kurzen Halbwertszeit (Palmer et al., 1987) ruft es lediglich lokale Effekte

hervor. NO wird von verschiedenen Isoenzymen der Familie der NO-Synthasen (NOS)

aus der Aminosäure L-Arginin synthetisiert. Bei dieser enzymatischen Reaktion werden

Abb. 1: Die NO/cGMP-SignalkaskadeStickstoffmonoxid (NO) wird von NO-Synthasen gebildet. Dieser Gasotransmitter

aktiviert die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC), was zur vermehrten Synthese

von cGMP führt. cGMP aktiviert im Anschluss diverse Effektorproteine, wie die

cGMP-abhängige Proteinkinase oder cGMP-abhängige Ionenkanäle.

Phosphodiesterasen (PDEs) terminieren das Signal durch den Abbau des cGMPs.

GlattmuskelrelaxationInhibition der Thrombozyten-Aggregation

Synaptische Plastizität

NO

GMPcGMP

GTP

NO-GC

Proteinkinasen

PDEs

Ionenkanäle

NO-Synthasen

2

3

Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH) und Sauerstoff zu NADP+ und Wasser

oxidiert. Des Weiteren entsteht die nicht-proteinogene Aminosäure Citrullin. Als Ko-

Enzyme dieser Reaktion werden Tetrahydrobiopterin (BH4), Flavinadenindinukleotid

(FAD), Flavinadeninmononukleotid (FMN) und Häm benötigt (Mayer et al., 1990; Klatt et

al., 1992). NO wird aufgrund seiner dilatierenden Wirkung zur Behandlung von Angina

pectoris eingesetzt. Es gibt verschiedene klinisch genutzte Nitrovasodilatoren, wobei

organische Nitratester, wie Glyceroltrinitrat, Isosorbidmononitrat und Isosorbiddinitrat,

häufig verwendet werden. Sie werden in den glatten Muskelzellen der Gefäße

enzymatisch in ihre denitrierten Metaboliten und NO gespalten (Ahlner et al., 1991; Chen

et al., 2005). Die als Homodimere vorliegenden NOS lassen sich in drei Isoenzyme

unterteilen: die induzierbare (iNOS), die neuronale (nNOS) und die endotheliale (eNOS)

NO-Synthase (Forstermann et al., 1994).

Die hauptsächlich in Makrophagen und Mikrogliazellen exprimierte iNOS produziert

hohe NO-Konzentrationen und ist damit an der unspezifischen Immunantwort beteiligt

(Stuehr et al., 1991). In vielen Entzündungsprozessen ist die iNOS durch bakterielle

Lipopolysaccharide oder Cytokine hochreguliert. Dadurch entstehen hohe NO-

Konzentrationen, die einerseits zytotoxisch auf Bakterien wirken können (Liew et al.,

1990; Nathan & Xie, 1994), andererseits jedoch auch einen starken Abfall des Blutdrucks

und damit einen septischen Schock verursachen können (Forstermann & Sessa, 2012).

In spezifischen Neuronen des zentralen Nervensystems wird die nNOS exprimiert und

ist dort verantwortlich für die Langzeitpotenzierung (Son et al., 1998) und die synaptische

Plastizität (Lu et al., 1999). Im peripheren Nervensystem wirkt das von nNOS produzierte

NO wie ein atypischer Neurotransmitter und vermittelt so die Darmperistaltik,

Vasodilatation und Erektion des Penis (Sanders et al., 1992; Forstermann & Sessa,

2012; Groneberg et al., 2013). Die nNOS wurde, neben Gehirn und neuronalem

Gewebe, auch in Epithel- (Schmidt & Walter, 1994) und glatten Muskelzellen (Loesch &

Burnstock, 1995) lokalisiert.

Die vorwiegend in Endothelzellen vorkommende eNOS konnte auch in Kardiomyozyten

und Nervenzellen (Kantor et al., 1996) nachgewiesen werden. Die Bildung von NO aus

Endothelzellen wird durch eine Vielzahl von Stoffen, wie z.B. Acetylcholin, Endothelin,

Serotonin, ADP und ATP, induziert. Das produzierte NO spielt allgemein eine wichtige

Rolle bei der Angiogenese und Apoptose, sowie bei der Leukozytenadhäsion

(Forstermann & Sessa, 2012). Im vaskulären System bewirkt die eNOS durch Produktion

von NO eine Vasodilatation und ist somit wesentlich an der Regulation des Blutdrucks

beteiligt (Groneberg et al., 2010). KO-Mäuse spezifisch für eNOS haben einen stark

erhöhten Blutdruck und weisen keine Acetylcholin-induzierte Gefäßrelaxation mehr auf

(Huang et al., 1995). Zudem deuten die Dysfunktionen in der Angio- und Arteriogenese

4

dieser KO-Tiere auf antiproliferative Effekte von endothelialem NO hin (Moroi et al.,

1998; Rudic et al., 1998; Dai & Faber, 2010).

Die beiden Isoenzyme nNOS und eNOS werden im Gegensatz zur iNOS konstitutiv

exprimiert und durch intrazelluläre Erhöhung von Ca2+ und den dadurch entstehenden

Ca2+/Calmodulin Komplex aktiviert (Forstermann & Sessa, 2012). Die iNOS ist auf

transkriptioneller Ebene induzierbar, wird also nur nach Stimulation durch z.B.

Lipopolysaccharide oder Cytokine exprimiert.

Um den Einfluss des von NOS produzierten NO zu untersuchen, können diese Enzyme

pharmakologisch mittels NG-Nitro-L-Arginin-Methylester (L-NAME) gehemmt werden.

Dieser Wirkstoff wurde in klinischen Studien zur Behandlung des septischen Schocks

getestet. Allerdings führte die Gabe des Hemmstoffes dosis-abhängig zur Erhöhung des

Gefäßwiderstandes und damit zum Anstieg des Blutdrucks (Avontuur et al., 1998).

1.3 NO-sensitive Guanylyl-Cyclase

Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) gehört zur Familie der Guanylyl-Cyclasen

(GC), welche die Umsetzung von Guanosintriphosphat (GTP) zu zyklischem

Guanosinmonophosphat (cGMP) katalysieren. Sie werden abhängig von ihren

Aktivatoren in zwei Gruppen unterteilt: die NO-sensitive Form (NO-GC), die durch NO

stimuliert wird (Schultz et al., 1977; Murad et al., 1978) und die Peptid-aktivierte Form

(pGC), die durch natriuretische Peptide aktiviert wird (Waldman et al., 1984; Winquist et

al., 1984). Während die als Homodimere vorkommende pGC membrangebunden

vorliegt, wurde die NO-GC jahrelang als lösliche oder cytosolische GC bezeichnet.

Russwurm et al. (2001) konnten jedoch nachweisen, dass auch die NO-GC Membran-

assoziiert vorliegen kann. Die NO-GC ist der wichtigste Rezeptor für das Signalmolekül

NO (Friebe & Koesling, 2003). Zur Abgrenzung von der pGC wird sie, aufgrund ihrer

Affinität zu NO, in dieser Arbeit als NO-GC bezeichnet.

Sie besitzt im Gegensatz zu anderen Häm-Proteinen, wie Hämoglobin oder Myoglobin,

eine höhere Affinität zu NO als zu Sauerstoff (Gerzer et al., 1981a). Neben NO kann

auch Kohlenstoffmonoxid an die NO-GC binden. Dies führt jedoch nur zu einer 4-fachen

Aktivierung des gereinigten Enzyms, während die Bindung von NO eine 100- bis

200-fache Aktivierung bewirkt (Gerzer et al., 1981b).

Bei der NO-GC handelt es sich um ein Heterodimer, bestehend aus einer α- und einer

ß-Untereinheit (UE). Die α-UE besteht aus den beiden Splicevarianten α1 und α2, die

beide als Dimerisierungspartner der 1-UE dienen können (Russwurm et al., 1998).

Obwohl die beiden Dimere nur geringe Sequenzhomologien in der N-terminalen Region

aufweisen, gibt es keine Unterschiede in der katalytischen Fähigkeit, NO-

Stimulierbarkeit oder Substrataktivität (Russwurm et al., 2001). Die Kombination aus α1-

5

und 1-Unterheinheit stellt jedoch das in unterschiedlichen Geweben am häufigsten

vorkommende Dimer dar (Mergia et al., 2003), während das α2 1-Herterodimer

vorwiegend in neuronalem Gewebe lokalisiert ist und ihr daher eine wichtige Rolle in der

synaptischen Transmission zugeschrieben wird (Burette et al., 2002).

Jede Untereinheit besteht aus einer C-terminalen katalytischen Domäne, einem

zentralen Teil und einer regulatorischen N-terminalen Region. Die regulatorische

Domäne enthält eine prosthetische Häm-Gruppe, die mit Hilfe des Kofaktors Mg2+ NO

bindet und somit einen NO-Fe2+-His-Komplex formt. Dies führt zur Spaltung der His-Fe2+-

Bindung, was eine Konformationsänderung bewirkt und somit zur Aktivierung der NO-

GC führt (Ignarro, 1990).

ODQ (1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1one) ist ein potenter spezifischer Inhibitor

der NO-GC und weist gleichzeitig keine Beeinflussung der membranständigen GC noch

der Adenylyl-Cyclase (AC) auf (Garthwaite et al., 1995). ODQ oxidiert das an die Häm-

Gruppe gebundene zweiwertige Eisen-Ion und verhindert so die Bindung von NO

(Schrammel et al., 1996; Zhao et al., 2000). Im Zuge dessen bleibt die Stimulation der

NO-GC aus. ODQ hemmt, abhängig von der eingesetzten NO-Donor-Konzentration, mit

einer IC50 von 0,2 bis 0,7 µM die NO-GC in vitro irreversibel (Schrammel et al., 1996). In

vivo ist die ODQ-vermittelte Hemmung der GC ab einer bestimmten NO-Konzentration

nicht mehr vollständig (Lies et al., 2013).

1.4 Effektorproteine von cGMP

1963 wurde cGMP erstmals im Rattenurin (Ashman et al., 1963) nachgewiesen. Dieser

sekundäre Botenstoff wird durch die katalytische Aktivität der GC gebildet. Die

intrazelluläre Erhöhung des cGMP-Spiegels beeinflusst unterschiedliche Effektoren, wie

cGMP-abhängige Phosphodiesterasen, cGMP-regulierte Proteinkinasen (PKG) und

cGMP-regulierte Ionenkanäle (Denninger & Marletta, 1999) und vermittelt so das

extrazelluläre Signal.

1.4.1 cGMP-abhängige Phosphodiesterasen

Die Aktivierung der NO-GC führt zu einem Anstieg der intrazellulären cGMP-

Konzentration, während die Stimulierung der Adenylyl-Cyclase durch G-Protein-

gekoppelte Rezeptoren zu einer gesteigerten cAMP-Synthese führt. Diese beiden

sekundären Botenstoffe lösen vielfältige physiologische Effekte aus, die durch die

hydrolytische Spaltung der Phosphodiesterbindung in cGMP bzw. cAMP durch

Phosphodiesterasen (PDEs) terminiert wird. Sie bauen diese zu

Guanosinmonophosphat (GMP) bzw. Adenosinmonophosphat (AMP) ab. Bereits in den

1960er Jahren führten Butcher and Sutherland (1962) erste Untersuchung zur Wirkweise

6

von „γ‘,5‘-nucleotide phosphodiesterases“ durch. Allen Säugetier-PDEs gemeinsam ist

eine etwa 270 Aminosäuren lange konservierte, katalytische Domäne im C-terminalen

Teil des Enzyms (Charbonneau et al., 1986). Dieser katalytische Kern ist für die Spaltung

der in zyklischen Nukleotiden enthaltene Phosphodiesterbindung notwendig. Die Familie

der PDEs besteht aus 11 Isoenzymen, die sich in ihrer Substratspezifität,

Gewebelokalisation und Regulation unterscheiden (Bender & Beavo, 2006). Anhand

ihrer Substratspezifität werden die PDEs in verschiedene Klassen eingeteilt: cAMP-

spezifische PDEs sind PDE4, PDE7 und PDE8, cGMP-spezifische PDEs sind PDE5,

PDE6 und PDE9. Zu den PDEs mit dualer Substratspezifität gehören PDE1, PDE2,

PDE3, PDE10 und PDE11 (Francis et al., 2001; Bender & Beavo, 2006). In dieser Arbeit

wurde die PDE3 untersucht, die im Folgenden näher beschrieben wird.

1.4.1.1 Phosphodiesterase 3

Die Phosphodiesterase 3 (PDE3) gehört zur Gruppe der PDEs mit gemischter

Substratspezifität, wobei die Bindungsaffinität für cGMP höher ist als für cAMP.

Allerdings ist die maximale Umsatzgeschwindigkeit für cAMP 10-fach höher als für

cGMP, weshalb sie auch als cGMP-inhibierte PDE bezeichnet wird. Die PDE3 ist somit

ein wichtiger Verknüpfungspunkt zwischen dem cGMP- und dem cAMP-Signalweg. Ihre

Aktivität wird mittels Phosphorylierung durch die Kinasen PKA, PKB und PKC beeinflusst

(Shakur et al., 2001). Zwei Gene kodieren für zwei PDE3-Isoenzyme: PDE3A und

PDE3B. Beide Subtypen besitzen an ihrem N-Terminus eine lange und eine kurze

hydrophobe Domäne. Die aus 195 Aminosäuren bestehende lange Domäne bildet 6

Transmembranhelices, die eine Bindung an die Membran erlauben (Shakur et al., 2001).

Während die PDE3A in Thrombozyten, in Herzmuskelzellen, Oozyten und glatter

Gefäßmuskulatur stark exprimiert wird, kommt die PDE3B vorwiegend in Hepatozyten,

Adipozyten und Nierengewebe vor (Wechsler et al., 2002). Durch Deletion der PDE3A

kommt es zu einer Fehlregulation bei der Proliferation von vaskulären Myozyten (Begum

et al., 2011). und in weiblichen Mäusen, durch fehlende Oozyten-Reifung, zur

Unfruchtbarkeit (Masciarelli et al., 2004). Der Verlust der PDE3B kann zu einer

Transdifferenzierung des weißen Fettgewebes in braune Fettzellen führen (Guirguis et

al., 2013). Durch alternatives Spleißen oder unterschiedliche Transkriptionsstartpunkte

entstehen drei verschiedene Isoformen der PDE3A (1-3), die bis auf unterschiedlich

lange N-Termini die gleiche Aminosäuresequenz besitzen (Zaccolo & Movsesian, 2007).

Hierzu gehört die membranständige PDE3A1 mit einem Molekulargewicht von etwa 136

kDa, die PDE3A2 (118 kDa), die sowohl membranständig als auch cytosolisch vorliegt,

sowie die cytosolische 94 kDa schwere PDE3A3. Die Spleißvarianten unterscheiden

sich je nach Gewebe und Herkunft in ihrem Molekulargewicht. Während in humanem

7

Herzgewebe alle drei Isoformen vorkommen, können in murinem Aortengewebe

lediglich PDE3A2 und PDE3A3 nachgewiesen werden. Das PDE3B-Gen kodiert

ausschließlich für eine Spleißvariante mit einem Gewicht von ca. 125 kDa.

Pharmakologisch kann die PDE3 durch die selektiven Inhibitoren Cilostamid (IC50 20 nM

) oder Milrinon (IC50 150 nM (Harrison et al., 1986)) gehemmt werden. Medizinisch findet

die PDE3-Blockade Anwendung in der akuten Behandlung der Herzinsuffizienz, da die

Hemmung der PDE3 durch die Akkumulation von cAMP eine positiv inotrope Wirkung

auf den Herzmuskel hat (Baim et al., 1983).

1.4.2 cGMP-abhängige Ionenkanäle

Eine weitere Gruppe von cGMP-regulierten Proteinen sind nicht-selektive Ionenkanäle

(CNG-Kanäle; „cyclic nucleotide-gated channels“), bei denen es sich um Kationenkanäle

handelt (Yu et al., 2005). Sie wurden erstmals in den Photorezeptorzellen der Retina

(Fesenko et al., 1985) und in olfaktorischen Neuronen (Nakamura & Gold, 1987)

nachgewiesen und spielen dort eine entscheidende Rolle im Seh- und Riechprozess.

CNG-Kanäle kommen zudem im Darmepithel, in der Niere, dem Gehirn und im Herzen

vor (Biel et al., 1994). Sie weisen meist eine höhere Sensitivität für cGMP als für cAMP

auf, obwohl das Maß abhängig vom Typ des CNG-Kanals ist (Hofmann et al., 2005). Sie

sind durchlässig für verschiedene Kationen, vor allem für K+ und Na+, aber auch für Ca2+

(Frings et al., 1995). Ihre Aktivität wird sowohl durch Phosphorylierung, als auch durch

die Ca2+/CaM-Bindung beeinflusst (Kaupp & Seifert, 2002). Die Bindung von

intrazellulärem cGMP im C-Terminus dieser Kanäle bewirkt einen Einstrom von Na+ und

Ca2+, die wiederum als tertiäre Botenstoffe weitere Signalkaskaden in Gang setzen (Biel

et al., 1999). Zu den CNG-Kanälen zählen auch HCN-Kanäle („hyperpolarization-

activated cyclic nucleotide-gated cation channel“), Diese Kanäle werden im Gegensatz

zu den meisten anderen spannungsabhängigen Ionenkanälen nicht durch

Depolarisation, sondern bei einem hyperpolarisierten Membranpotential aktiviert.

Außerdem leiten sie sowohl K+- als auch Na+-Ionen, so dass es bei hyperpolarisierter

Membran zu einem depolarisierenden Einstrom von Na+ kommt. Reguliert werden diese

Kanäle durch den Sympathikus, der über adrenerge Rezeptoren eine Erhöhung des

cAMP-Spiegels bewirkt. Sie sind verantwortlich für die Schrittmacheraktivität von

Neuronen oder Sinusknotenzellen im Herzen. Der durch HCN-Kanäle geleitete Strom ist

wesentlich für die diastolische Depolarisation des Sinusknotens verantwortlich.

1.5 Effektorproteine von cAMP

Das cyclische Adenosinmonophosphat (cAMP) wurde von Sutherland and Rall (1958)

entdeckt, als sie die Wirkweise von Hormonen auf die Bildung von Glykogen aus

8

Glukose in der Leber untersuchten. Das durch Adenylyl-Cyclasen (AC) gebildete cAMP

vermittelt, wie cGMP, eine Relaxation der glatten Muskulatur. In Leber- und Muskelzellen

wird die AC über ein System aus -Adrenozeptor und stimulierendem G-Protein (Gs)

aktiviert. Dabei binden verschiedene Hormone wie z.B. Adrenalin oder Noradrenalin an

den -Adrenozeptor, der wiederum an ein G-Protein gekoppelt ist. Durch diese Bindung

dissoziiert das G-Protein in seine drei Untereinheiten (α-, - und -UE). Die α-UE ersetzt

GDP durch GTP und aktiviert daraufhin die AC. Die AC katalysiert nach Aktivierung

Mg2+-abhängig die Bildung von cAMP aus 5'-Adenosintriphosphat (ATP). Dabei entsteht

zusätzlich Pyrophosphat, welches sofort in zwei anorganische Phosphate zersetzt wird

und so die Reaktion irreversibel macht. Der Haupteffektor des sekundären Botenstoffs

cAMP ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA). Sie bewirkt durch Phosphorylierung

und damit Hemmung der Kinase der Myosin- leichten Kette (MLCK) eine Relaxation der

glatten Muskelzellen. In höheren Konzentrationen bindet cAMP auch an die PKG und

reguliert somit die Ca2+-Freisetzung (Francis & Corbin, 1999). Der Botenstoff cAMP

aktiviert des Weiteren die Untergruppe der CNG-Kanäle, die HCN-Kationenkanäle.

Forskolin, ein nicht-selektiver Aktivator der AC (Hanoune & Defer, 2001), wird in der

Forschung zur Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration eingesetzt.

1.6 NO/cGMP-Signalkaskade im vaskulären System

Die NO/cGMP-Signalkaskade spielt im vaskulären System eine entscheidende Rolle, da

sie u.a. durch Kontraktion und Relaxation der Gefäße den Blutdruck reguliert und an den

Prozessen der Angio- und Arteriogenese beteiligt ist (Bettaga et al., 2015). Selbst ohne

äußere Einflüsse besitzt die glatte Muskulatur einen myogenen Basistonus der durch

den Phosphorylierungsgrad der leichten Kette des Myosins (MLC) bestimmt wird. Dies

wird entweder durch die Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Spiegels und/oder durch

Aktivierung der Rho-Kinase induziert. Das in Endothelzellen durch eNOS produzierte

NO diffundiert in die glatten Muskelzellen, inhibiert diesen Weg und führt zu einer

Relaxation des Gewebes. In Abbildung 2 sind die verschiedenen Mechanismen

dargestellt.

Zunächst wird der Ca2+-abhängige Weg beschrieben, bei dem die Bindung von

Liganden, wie z.B. Histamin oder Endothelin, an den Gq-Protein-gekoppelten-Rezeptor

eine Kontraktion der glatten Muskelzellen (SMC) bewirkt. Grund dafür ist die durch

Bindung der Liganden ausgelöste Konformationsänderung des Rezeptors, der

darauffolgend die Phospholipase C (PLC ) aktiviert (Ushio-Fukai et al., 1998; Wang et

al., 2004). PLC spaltet das Membranlipid Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in

Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG). Bei steigendem intra-

luminalem Druck werden die Botenstoffe IP3 und DAG vermehrt synthetisiert (Narayanan

http://flexikon.doccheck.com/de/ATP

Abb. 2: Signalwege in der glatten MuskulaturDie NO/cGMP-Signalkaskade spielt auch im vaskulären System eine entscheidende

Rolle, da sie u.a. durch Kontraktion und Relaxation der Gefäße den Blutdruck

reguliert. Der Phosphorylierungsgrad der Myosin-leichten-Kette (MLC) bestimmt

den myogenen Zustand. Dies wird entweder durch die Erhöhung des intrazellulären

Ca2+-Spiegels und/oder durch Aktivierung der Rho-Kinase induziert. Für weitere

Erklärungen siehe Text.

Ca2+

cGMP

GTP

NO+ Citrullin

ER

Ca2+

Ca2+-Kanal

IP3

GDPGTP

ATP

cAMP

IP3 -R

Relaxation

Kontraktion

CaMCa2+

SMC EC

G12/13

eNOS

Ca2+

ArgininNO-GC

AC

RhoGEF

RhoA

ROCK

Gs

Gq

BKCa-Kanal

Ca2+PKGI

MLCPMLCKPKA

PLC

MLC

MLC-P

RhoA

DAGPKA+

9

10

et al., 1994). DAG aktiviert die Proteinkinase Cα (Laher & Bevan, 1987; Yeon et al.,

2002), die wiederum durch Phosphorylierung die Leitfähigkeit von

spannungsgesteuerten L-Typ Ca2+-Kanälen („voltage gated calcium channels“, CaV)

erhöht (Yeon et al., 2002). Durch IP3 wird ein in der Membran des endoplasmatischen

Retikulums (ER) sitzender Ca2+-permeabler Ionenkanal, der IP3-Rezeptor, aktiviert.

Dadurch kommt es zu einem vermehrten Ausstrom von Ca2+-Ionen aus dem ER in das

Cytosol (Bootman et al., 2002; Hisatsune et al., 2005). Durch DAG und IP3 steigt somit

die intrazelluläre Ca2+-Konzentration an. Die freien Ca2+-Ionen bilden mit Calmodulin

(CaM) einen Komplex, der die CaM-abhängige Myosin-leichte-Ketten-Kinase (MLCK)

aktiviert. Diese Kinase phosphoryliert die Myosin-leichte-Kette (MLC (Somlyo & Somlyo,

2003)), was die Interaktion von Aktin und Myosin ermöglicht und so eine Kontraktion der

glatten Muskulatur bedingt (Webb, 2003; Murthy, 2006).

Eine andere Kaskade führt Ca2+-unabhängig zur Phosphorylierung von MLC und

dadurch zur Kontraktion (Klages et al., 1999). Auch hier beginnt die Signalkaskade bei

G-Proteinen. So aktivieren Hormone wie Thromboxan A2 (TXA2) die Proteine der G12/13-

Familie, was zu einer Stimulation der kleinen GTPase RhoA führt, die ihrerseits die Rho-

Kinase (ROCK) aktiviert (Somlyo & Somlyo, 2003). Daraufhin kann ROCK die MLCP

phosphorylieren und sie somit

inaktivieren. Infolge dessen steigt der Anteil des phosphorylierten Myosins, was

Ca2+-unabhängig eine Kontraktion der Muskulatur bewirkt. Diese

Kontraktionsmechanismen werden sowohl bei chemischen Stimuli, als auch bei

Druckerhöhung ausgelöst (Davis & Hill, 1999; Schubert et al., 2008), Allerdings

reagieren die großlumigen Leitgefäße wie die Aorta weitgehend passiv auf

Druckveränderungen (Davis et al., 1986). Die kleineren Widerstandsgefäße wie Arterien

und Arteriolen hingegen, besitzen einen myogenen Tonus und können durch

Veränderung ihres Gefäßdurchmessers die Druckänderung ausgleichen (Davis, 1993;

Naik et al., 2005).

Der Gegenprozess der Kontraktion, die Relaxation der glatten Muskulatur, wird durch

die sekundären Botenstoffe cAMP und cGMP vermittelt. Die AC produziert nach

Aktivierung durch ein G-Protein den sekundären Botenstoff cAMP. Dieses Molekül

aktiviert die Proteinkinase (PKA), was eine Inhibition der MLCK zur Folge hat. Dadurch

wird die Phosphorylierung von MLC verhindert und somit eine Relaxation der glatten

Muskulatur ausgelöst. Der für diese Arbeit wichtigere Botenstoff cGMP wird im

Gefäßsystem hauptsächlich von der NO-GC nach NO-Stimulation synthetisiert. cGMP

aktiviert die PKGI (Lincoln et al., 1995), was über verschiedene Mechanismen zu einer

Relaxation führen kann. Einerseits phosphoryliert die PKGI die MLCP, wodurch es zu

einer Dephosphorylierung der MLC kommt und somit die Aktin-Myosin-Interaktion

11

reduziert wird. Andererseits phosphoryliert die PKGI einen Ca2+-aktivierten Kaliumkanal,

den BKCa-Kanal, und erhöht damit dessen Offenwahrscheinlichkeit. Dadurch kommt es

zu einem vermehrten K+-Ausstrom und folglich zu einer Hyperpolarisation der

Zellmembran. Diese Hyperpolarisation hemmt spannungsabhängige L-Typ Ca2+-Kanäle,

wodurch der Ca2+-Einstrom verringert wird und infolgedessen eine Relaxation zustande

kommt (Alioua et al., 1998; Fukao et al., 1999; Sausbier et al., 2000). Einen dritten

Relaxationsmechanismus stellt die Phosphorylierung des Proteins IRAG („IP3-receptor-

associated cGMP-dependent kinase-substrate“) durch die Spleißvariante PKGIβ dar. Die

Phosphorylierung bewirkt eine Hemmung der IP3-vermittelten Ca2+-Freisetzung aus dem

ER (Schlossmann et al., 2000), wodurch die MLCK nicht aktiviert und somit keine

Kontraktion ausgelöst werden kann.

Das Absinken der intrazellulären Ca2+-Konzentration in der Zelle wird durch die Ca2+-

ATPase SERCA (sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase) verursacht. Sie ist

sowohl für die Wiederaufnahme von Ca2+ in intrazelluläre Speicher als auch für dessen

Transport in den extrazellulären Raum verantwortlich (Shull, 2000). Ausgehend von drei

Genen werden fünf verschiedene Isoformen kodiert, wobei SERCA2b in glatten

Muskelzellen und SERCA3 in Endothel- und Epithelzellen von Bedeutung bei der

Blutdruckregulation sind (Anger et al., 1994). Die sinkende Ca2+-Konzentration inaktiviert

die MLCK, wodurch es zur Dephosphorylierung der MLC durch die MLCP kommt, was

eine Relaxation der glatten Muskulatur zur Folge hat (Somlyo & Somlyo, 1994).

1.7 Das Blutgefäßsystem

Die Hauptaufgaben des Blutgefäßsystems sind die Versorgung des Körpers mit

Sauerstoff und Nährsubstraten, ebenso wie der Abtransport von Stoffwechselprodukten

und Kohlendioxid. Auch dient das zirkulierende Blut dem Hormontransport, zur

interzellulären Kommunikation und der Wärmeverteilung. Aus diesen Gründen ist eine

konstante Durchblutung für die adäquate Funktion der Organe notwendig.

Der Blutkreislauf, beginnend mit dem Herzen, wird in den großen (Körper-)Kreislauf und

den dahinter geschalteten kleinen (Lungen-)Kreislauf unterteilt. Vom linken Ventrikel des

Herzens wird sauerstoffreiches (oxygeniertes) und kohlendioxidarmes Blut pulsatil durch

Kontraktion des Herzmuskels in die Aorta und das nachgeordnete Gefäßnetz aus

Arterien, Arteriolen und schließlich Kapillaren gepumpt. In den Kapillaren der Organe

findet der Nährstoffaustausch statt. Aus dem Kapillarbett fließt das nun sauerstoffarme

(desoxygenierte) und kohlendioxidreiche Blut über Venolen und Venen zurück zum

rechten Vorhof, gelangt in den rechten Ventrikel und wird von dort durch die

Lungenarterie in die Lungenkapillaren gepumpt (Lungenkreislauf). In der Lunge,

genauer gesagt zwischen Venolen und Lungenbläschen, findet der Gasaustausch statt.

12

Das Blut wird erneut mit Sauerstoff angereichert und Kohlendioxid aus dem Blut

abgegeben. Aus dem Kapillarbett der Lunge gelangt das re-oxygenierte Blut über die

Lungenvenen zum linken Vorhof, um von dort erneut in den Körperkreislauf einzutreten.

Funktionell wird der Kreislauf in ein Hochdruck-, ein Niederdrucksystem und die

Mikrozirkulation gegliedert. Zum Hochdrucksystem zählen der linke Ventrikel in der

Systole, Aorta, Arterien und Arteriolen. Das Niederdrucksystem besteht aus der

gesamten Lungenstrombahn, d.h. den Venen, den beiden Vorhöfe und dem rechten

sowie linken Ventrikel in der Diastole. Zu den Austauschgefäßen der Mikrozirkulation

zählen die kleinen Gefäße des Kreislaufsystems: Arteriolen, Kapillaren und Venolen,

sowie die im Gewebe liegenden Lymphgefäße. In ihnen findet der Stoff- und

Gasaustausch zwischen Blut und Interstitium statt.

1.7.1 Funktion und Aufbau der Blutgefäße

Um die unterschiedlichen Anforderungen an das Herz-Kreislauf-System erfüllen zu

können, gibt es verschiedene Arten von Blutgefäßen, die sich in ihrem Aufbau und damit

ihren Eigenschaften unterscheiden (Jain, 2003). Sie werden abhängig von ihrem Aufbau

in Hauptschlagader (Aorta), Arterien, Arteriolen, Kapillaren, Venen, Venolen und die

beiden Hohlvenen unterteilt.

Das oxygenierte Blut wird durch Aorta, Arterien und Arteriolen auf die Peripherie verteilt.

Um das vom Herzen stoßweise ausgeschüttete Blut in eine kontinuierliche Strömung

umzuwandeln, besitzen die Aorta und die großen Arterien durch Einlagerung von

elastischen Fasern sehr dehnbare Gefäßwände. Indem sie durch den hohen Druck

während der Systole erweitert werden und so einen Teil des ausgeworfenen

Blutvolumens in dem vergrößerten Lumen speichern, sind sie in der Lage die Energie

der vom Herzen ausgehenden Druckpulswelle aufzunehmen. Diese

Volumendehnbarkeit wird als „Windkesselfunktion“ bezeichnet. Die als

Widerstandsgefäße bezeichneten kleinen Arterien und Arteriolen beeinflussen den

peripheren Widerstand hauptsächlich durch ihren geringen Innenradius und weniger

durch ihre Gesamtoberfläche. Der Strömungswiderstand hängt nach dem Hagen-

Poiseuille-Gesetz von der Rohrlänge, der Blutviskosität und umgekehrt proportional von

der vierten Potenz des Innenradius ab. In den nachgeschalteten Kapillaren und

postkapillaren Venolen findet der Gas- und Stoffaustausch statt. Kapillaren sind sehr

dünnwandig, was den Austausch mit dem venösen Netz erleichtert. Dies wird zusätzlich

durch die große Anzahl und die niedrige Blutgeschwindigkeit begünstigt. Kapillaren

selbst sind amuskulär, allerdings sitzen auf ihnen Perizyten, die mit ihren Fortsätzen das

Gefäß umspannen (Attwell et al., 2016). Da Perizyten kontraktil sind, können sie den

Gefäßdurchmesser der Kapillaren beeinflussen und tragen so zur Regulation des

13

Blutdrucks bei (Hall et al., 2014). Von den Kapillaren fließt das Blut in das venöse

System. Venen dienen aufgrund ihrer relativ dünnen Wand (wenige glatte Muskelzellen,

aber viele elastische Fasern) und ihres großen Fassungsvolumens als Blutreservoir. Sie

werden deshalb auch als Kapazitätsgefäße bezeichnet. Aufgrund der niedrigen Anzahl

an glatten Muskelzellen, besitzen sie allerdings nur eine geringe Kontraktionsfähigkeit.

Um dennoch den venösen Rückstrom entgegen der Schwerkraft zu gewährleisten, sind

von außen wirkende Kräfte notwendig. Auf zwei verschiedene Arten kommt es zu einem

Sog: einerseits wird durch Senkung der Ventilebene des Herzens während der Systole

und andererseits durch den nach der Inspiration entstandenen Überdruck im Brustraum

bei gleichzeitigem Unterdruck im Bauchraum das Blut nach oben gesogen. Zusätzlich

sorgt die Kontraktion der Skelettmuskulatur für eine Komprimierung der Venen, was den

Rückfluss des Blutes zum Herzen begünstigt. Die in regelmäßigen Abständen

vorkommenden Venenklappen, verhindern das Zurückfließen des Blutes in die

Peripherie.

Die Wand (Tunica) aller großen Blutgefäße ist grundsätzlich gleich aufgebaut (Abb. 3).

Sie ist ein heterogen geschichtetes Netzwerk aus verschiedenen Zelltypen wie

Endothelzellen (EC), glatten Muskelzellen und Fibroblasten, die über auto-parakrine

Interaktionen verbunden sind. Es werden drei verschieden aufgebaute Wandabschnitte

unterschieden. Der innersten Schicht (Tunica intima), die mit der Lamina elastica interna

endet, folgt die Tunica media. Diese mittlere Schicht muss der durch den Blutdruck

ausgelösten Dehnung des Gefäßes entgegenwirken und reguliert über den

Kontraktionszustand der glatten Muskelzellen den Gefäßdurchmesser. Sie besteht

hauptsächlich aus glatten Muskelzellen, ringförmig verlaufendem kollagenen

Bindegewebe, sowie elastischen Fasern. Die in der Tunica media enthaltenen

lamellaren Einheiten („elastic lamellae“) bilden die funktionelle Basis der Gefäßwand.

Sie ziehen sich

ringförmig in vielen engen Windungen durch die Gefäßwand und stehen über feine

Fasern miteinander in Verbindung. Intermediäre Kollagenfasern in der Tunica media

sind wichtig für die Zugfestigkeit der Gefäße. Nach außen wird diese mittlere Schicht

durch die Lamina elastica externa abgegrenzt. Den abschließenden Wandteil des

Blutgefäßes bildet die Tunica adventitia, die als kollagene Bindegewebsschicht das

Gefäß im umliegenden Gewebe verankert. Die EC der Intima kleiden als einschichtiges

Endothel das Gefäßlumen aus und bilden als stark Stoffwechsel-aktive Zellen die

Grundlage für die Aufrechterhaltung der vaskulären Homöostase (Davies, 1995; Chien,

2007). Durch ihre selektive Permeabilität beeinflussen sie die Diffusion von Nähr- und

Botenstoffen und treten durch die Ausschüttung von Wachstumsfaktoren sowie

stimulierenden und inhibierenden Stoffen in direkten Kontakt mit den SMC der Tunica

Abb. 3: Aufbau einer Arterie

A) Durchlichtbild eines Aortenschnitts (20 µm) gefärbt mit α-SMA-Anitkörper

B) Schematische Darstellung der Aorta. Das durch die eNOS in Endothelzellen (EC)

der Tunica intima produzierte NO diffundiert in die Glattmuskelzellen (SMC) der

Tunica media und aktiviert dort die NO-GC. Dies führt zur Produktion des

sekundären Botenstoffes cGMP, der letztlich eine Relaxation der SMC bewirkt.

Zwischen den Zellen befindet sich die extrazelluläre Matrix (ECM).

Relaxation

NO

NO-GC

cGMP

SMC

EC

GTP

endotheliale NOS

Media

Intima

Lumen

Tunica adventitia

Tunica media

Tunica intima

Lumen

Lumen

B

A

14

15

media. Dadurch kontrollieren sie die myogenen Prozesse, die Adhärenz von

Immunzellen (Wagner et al., 2011) und verschiedene Remodellierungsprozesse wie

Angiogenese und Arteriogenese (Yancopoulos et al., 2000). Im Gegensatz zu den EC

sind die SMC mehrschichtig zirkulär angeordnet und integrieren in die elastischen

Lamellen. Sie regulieren durch zirkuläre Kontraktion bzw. Dilatation den

Gefäßdurchmesser und damit den Gefäßtonus. Sie exprimieren verschiedene

Kontraktilitäts-vermittelnde Proteine, wie glattmuskuläres Aktin (SMA) oder die

glattmuskuläre schwere Kette des Myosins (SMMHC). Auch synthetisieren und

sezernieren die SMC verschiedene Proteine und Kohlenhydrate, die die extrazelluläre

Matrix bilden. Der genaue Aufbau dieser Matrix unterscheidet sich je nach Anforderung

und Lokalisation der Gefäße (Michel et al., 2012). So ist beispielsweise in die

extrazelluläre Matrix von Knochen und Zähnen Ca2+ zur Verhärtung eingebaut. Der

Elastin-Gehalt ist maßgeblich für die Dehnbarkeit der Gefäße und damit für die

Aufrechterhaltung eines konstanten Blutdrucks. So enthält die ECM der Aorta zur

Gewährleistung der Windkesselfunktion mehr Elastin als die Gefäßwand der Venen. Bei

verschiedenen Krankheiten und im Alter kann sich der Elastin-Anteil durch verschiedene

Remodellierungsprozesse reduzieren und der Kollagen-Anteil erhöhen, was zur

Versteifung der Gefäße führt (Brooke et al., 2003).

1.7.2 Aorta

Die Aorta transportiert als größte Arterie des elastischen Bautyps oxygeniertes Blut von

der linken Herzkammer in den Körper zur weiteren Versorgung aller Organe. Sie wird in

einen thorakalen und einen abdominellen Abschnitt unterteilt. Der in dieser Arbeit

untersuchte thorakale Abschnitt wird in 3 Segmente unterteilt: Aorta ascendens,

Aortenbogen und Aorta descendens. Im Verlauf der Aorta nimmt der Anteil von Kollagen

gegenüber den elastischen Fasern in der Tunica media zu, so dass der abdominale im

Vergleich zum thorakalen Abschnitt weniger stark reversibel dehnbar ist und der Druck

zunimmt. Die Aorta ist durch den hohen Teil an Elastin in der Lage, den stoßartigen

Blutstrom des Herzens in eine kontinuierlich-phasische Strömung umzuwandeln

(Windkesselfunktion). Nach Schluss der Aortenklappe geht die Gefäßwand wieder auf

ihre ursprüngliche Größe zurück und befördert dabei das Blut durch die elastischen

Rückstellkräfte kontinuierlich in den Körperkreislauf.

1.8 Extrazelluläre Matrix

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Netzwerk aus sezernierten Proteinen

und Kohlenhydraten, also der gesamte Gewebsanteil, der sich zwischen den Zellen im

interzellulären Raum befindet. Zusammen mit den eingelagerten Zellen bildet die ECM

16

das Bindegewebe. Sie ist essentiell für die Gewebsstruktur, formiert und verankert

einzelne Zellen zu Verbänden, dient als interner Wasserspeicher und vermittelt Signale

für Zell-Bewegung, -Wachstum und -Differenzierung. Im erwachsenen Organismus wird

die ECM bei verschiedenen pathologischen Prozessen, beispielsweise der

Wundheilung, Angiogenese oder Metastasierung, verändert. An diesen lokalen

Umbauprozessen sind vor allem extrazelluläre Metallo- und Serinproteasen beteiligt. Die

Komponenten der ECM werden hauptsächlich durch Fibroblasten und ihren

Nachfolgerzellen gebildet. Sie besteht aus einer Vielzahl an Makromolekülen, die sich

grob in Grundsubstanz und den darin eingebetteten Fasern einteilen lassen. Zu den

stark hydratisierten, gelartigen Grundsubstanzen zählen neben den

Glykosaminoglykanen, die kovalent an Proteine gebunden sind und Proteoglykane

bilden, auch verschiedene Adhäsionsproteine und Elektrolyte. Diese Substanzen

bedingen die Druckfestigkeit der Matrix und erlauben die Diffusion von Nährstoffen und

Hormonen zwischen Blut und den Zellen. In diese Grundsubstanz sind strukturgebende

Fasern aus Kollagen und Elastin und verschiedene adhäsive Proteine eingebettet.

Kollagen verleiht den Geweben ihre Zugfestigkeit, während Elastin die Verformbarkeit

ermöglicht. Die adhäsiven Proteine wie Fibronektin, Fibrinogen und Laminin

beeinflussen die Signaltransduktion zwischen den Gewebszellen und der ECM.

1.8.1 Kollagen

Kollagen ist mit bis zu 30% das am häufigsten vorkommende Protein im Wirbeltier-

Körper. Es zählt zu den Skleroproteinen, ist wasserunlöslich und faserig aufgebaut.

Kollagene sind organspezifisch unterschiedlich zusammengesetzt, obwohl die

Grundeinheit, das Tropokollagen, immer aus drei Peptidketten besteht. Zudem ist jede

dritte Aminosäure Glycin (Gly), das durch seine geringe Größe ideal in die engen

Windungen der rechtsgängigen Tripelhelix passt. Je nach Typ besteht jede einzelne

Helix aus 600 bis 3000 Aminosäuren, die repetitive Gly-X-Y-Sequenzen enthalten. An

Position X befindet sich häufig ein Prolin, das aufgrund seiner starren Ringstruktur die

Ausbildung von engen Windungen in der Helix unterstützt. Das 4-Hydroxyprolin, das sich

oft an Position Y befindet, stabilisiert über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen

benachbarten Polypeptidketten die Tripelhelix. Dadurch wird die Helix zu einer steifen

und zugfesten Faser von ca. 300 nm Länge und etwa 1,5 nm Dicke. Prokollagen wird

hauptsächlich von Fibroblasten, aber auch von Chondrozyten und vielen anderen Zellen

sezerniert. Die am rauen ER dieser Zellen hergestellten Kollagen-Polypeptidketten

werden zunächst an einzelnen Prolin- und Lysinresten hydroxyliert. Bei diesem Prozess

spielt Vitamin C eine entscheidende Rolle. Fehlt dieser Cofaktor, kommt es zur

fehlerhaften Biosynthese von Kollagen und dadurch zur Mangelerkrankung Skorbut.

17

Nach Hydroxylierung kommt es durch Ausbildung von Disulfidbindungen zwischen den

C-terminalen Propetiden zur Tripelhelixbildung. Das so entstandene Prokollagen wird

meist noch am Golgi-Apparat glykosyliert und anschließend durch Exozytose mittels

sekretorischer Vesikel in den Extrazellularraum entlassen. Nach diesen

Modifikationsreaktionen lagern sich die Prokollagen-Ketten zu tripelhelikalen

Tropokollagen-Molekülen zusammen. Durch diese sich periodisch wiederholenden

Tropokollagen-Moleküle, erkennt man elektronenmikroskopisch eine typische

Querbänderung mit einem Abstand von 64 nm. Im letzten Schritt wird die Gesamtstruktur

durch kovalente Quervernetzung einzelner Tropokollagen-Einheiten zu Fibrillen

zusätzlich stabilisiert. Die Anordnung der Fibrillen ist abhängig von der Funktion im

jeweiligen Gewebe. So sind sie in Sehnen zur Kraftübertragung parallel ausgerichtet,

wohingegen sich im Glaskörper des Auges ein lichtdurchlässiges Fibrillen-Netz bildet.

1.8.2 Elastin

Elastin ist ein weiteres wichtiges Strukturprotein, das den Hauptanteil der elastischen

Fasern im Bindegewebe von Wirbeltieren darstellt. Es kommt hauptsächlich in der Haut,

der Lunge und den Blutgefäßen vor und ist für deren Spannkraft und Elastizität

verantwortlich. Die Primärstruktur ist ähnlich der des Kollagens, jedoch enthält sie Valin

anstelle von Hydroxylysin. Im Gegensatz zu Kollagen ist Elastin sehr dehnbar. Die

elastischen Eigenschaften erhält dieses Protein besonders durch den hohen Anteil an

Aminosäuren mit Isopren-ähnlichen Seitenketten, also Isoleucin, Leucin und Valin. Von

größter Bedeutung für die Dehnfähigkeit des Elastins ist die Aminosäure Lysin.

Lysinreste werden durch das Enzym Lysyloxidase zu Allysin oxidiert. Drei Allysine

zusammen mit einem Lysin bilden ein ringförmiges Desmosin, das die Hitzestabilität,

Resistenz gegen viele Proteasen und Wasserunlöslichkeit des Elastins bedingt. Durch

periodische seitliche Verkettung der benachbarten Desmosine entsteht ein

gummiartiges, dehnbares und dichtes Netz. Elastin wird von den Zellen in der

wasserlöslichen Form des Tropoelastins sezerniert und sofort extrazellulär vernetzt.

1.8.3 Vaskuläres Remodelling und Pulswellengeschwindigkeit

Das Gefäß reagiert auf veränderte äußere und innere Bedingungen mit strukturellen

Veränderungen der Gefäßwand (vaskuläres Remodelling). Diese Umbauvorgänge

finden in der ECM statt und betreffen primär die Tunica media. Neben diesem

physiologischen Umbau kommt es auch zu pathologischen Veränderungen der

Wanddicke oder dem Lumen-Durchmesser. Beispielsweise kann das Gefäß auf einen

erhöhten Druck mit der Verdickung der Gefäßwand reagieren, wodurch sich der

periphere Widerstand erhöht. Bei diesen Umbauprozessen nimmt die Elastizität der

18

Gefäße immer mehr ab. Für die Aorta bedeutet dies einen Verlust der

Windkesselfunktion und daraus resultierend eine erhöhte systolische

Pulswellengeschwindigkeit (PWV). Dadurch kommt es zur erhöhten Reflexion von

Pulswellen und der Überlagerung dieser bereits in der Systole und nicht wie bei normal

elastischen Gefäßen erst in der Diastole. Dies führt zu einem Anstieg des systolischen

und Abnahme des diastolischen Blutdrucks und somit zu einer Erhöhung des Pulsdrucks

(London, 1997). Auch die Abnahme der aortalen Windkesselfunktion verursacht einen

erhöhten systolischen Blutdruck und gleichzeitig wird durch den Verlust ihrer

Retraktionskraft ein weiteres Absinken des diastolischen Blutdrucks bedingt. Der

erhöhte systolische Blutdruck führt zu einer erhöhten kardialen Nachlast und schließlich

zu einer konzentrischen Hypertrophie. Der reduzierte diastolische Blutdruck lässt das

Risiko für Ischämien durch die verschlechterte koronare Perfusion steigen (Safar &

Lacolley, 2007). Auch führen Impedanzänderungen durch Gefäßverzweigung,

Verengung der Gefäße oder abnehmende Elastizität zu Reflexionen der Pulswelle. Bei

einer Vielzahl kardiovaskulärer Krankheiten (z.B. Hypertension, Ischämie oder

Aneurysmen) kommt es zu einer Dysregulation dieser vaskulären Umbauprozesse.

Beim Alterungsprozess jedoch sind der Umbau und damit die Versteifung der Gefäße

ein natürlicher Vorgang.

Die Steifigkeit der Arterien, insbesondere der Aorta, dient als Wert für die Einschätzung

kardiovaskulärer Risikofaktoren. Kardiovaskuläre Krankheiten sind in Industrieländern

die häufigste Todesursache. Die arterielle Hypertonie trat 1995 bereits mit einer

Prävalenz von 25% auf (Burette et al., 2002). Als Maß für die Steifigkeit der zentralen

Arterien wird in Medizin und Forschung die aortale PWV bestimmt. Sie beschreibt die

Geschwindigkeit, mit der die Pulswelle nach Auswurf des Schlagvolumens durch das

Gefäßsystem wandert. Laurent et al. (2003) zeigten, dass eine erhöhte PWV bei sonst

gesunden Hypertonie-Patienten das Auftreten von Schlaganfällen vorhersagen kann. Da

sich Veränderungen der großen Arterien schnell in einer Erhöhung der PWV zeigen, stuft

die Europäische Gesellschaft für Kardiologie die PWV als signifikanten Marker für

hypertensive Endorganschäden ein. Die lokale PWV wird häufig mittels

Magnetresonanztomographie bestimmt, da diese Methode ein genaues und nicht-

invasives Verfahren darstellt.

1.9 Transgene Maus-Modelle

Genetisch veränderte Mäuse spielen bei der Untersuchung von

Signaltransduktionswegen und pathophysiologischen Mechanismen in der

medizinischen Forschung eine entscheidende Rolle. Um die Funktion eines bestimmten

Enzyms zu untersuchen, wird ein Gen gezielt im Genom verändert. Bei den transgenen

19

Tieren wird das Erbgut entweder durch das Einfügen von Fremd-DNA mittels

embryonaler Stammzell-Technik verändert oder ein bestimmtes Gen deletiert oder

deaktiviert.

Da das Mausgenom zu 99% mit dem menschlichen Genom übereinstimmt und sogar

96% der Gene in vergleichbarer Nachbarschaft liegen (Capecchi, 1994; Houdebine,

2007), eignen sich Mäuse besonders als Modellorganismen für die wissenschaftliche

und klinische Forschung. Ein weiterer Vorteil bei der Arbeit mit Mäusen ist, dass murine

embryonale Stammzellen in Kultur gehalten werden können (Capecchi, 1994). Auch hat

dieses Tiermodell viele praktische Vorzüge, wie einen geringen räumlichen Anspruch,

niedrige Kosten und schnelle Generationsfolge aufgrund der hohen Reproduktionsrate.

Um den Mechanismus und die physiologische Rolle der NO/cGMP-Signalkaskade

genauer zu erforschen, wurden verschiedene Knock-out (KO)-Mauslinien für die NO-GC

generiert. Nachfolgend wird auf die beiden in dieser Arbeit verwendeten KO-Mauslinien

eingegangen.

1.9.1 Globaler Knock-out der NO-GC

Durch Deletion der ß1-Untereinheit, wurde in unserer Arbeitsgruppe eine Mauslinie

erzeugt, bei der die NO-GC in allen Zellen (GCKO) ausgeschaltet ist. Dafür wurde das

Cre-lox-P-System verwendet; ein Rekombinationssystem, das die gezielte Deletion

einer bestimmten DNA-Sequenz erlaubt (Metzger & Feil, 1999). Zunächst wurde das

Exon 10 der ß1-UE der NO-GC mit zwei loxP-DNA-Sequenzen flankiert, die der Cre-

Rekombinase (Cre) als Erkennungssequenz dienen. Diese homozygot gefloxten Tiere

(ß1-flox/flox) wurden dann mit Mäusen gekreuzt, die ubiquitär Cre exprimieren, sodass

globale KOs der NO-GC entstanden. Bei diesen globalen KO-Tieren kommt es zu einer

starken Wachstumsretardierung und einer verminderten Lebenserwartung. 80% der

Tiere sterben innerhalb der ersten zwei Lebenstage. Die übrigen Mäuse sterben infolge

einer stark reduzierten gastrointestinalen Motilität bei der Umstellung von Muttermilch

auf Festnahrung. Durch Wechsel des Futters auf eine ballaststoffarme Diät mit

Omeprazol und Natriumbikarbonat konnte die Überlebensrate gesteigert werden (Friebe

et al., 2007). Anatomisch zeigt sich die genetische Veränderung im Gastrointestinaltrakt

durch ein stark vergrößertes Caecum und eine erweiterte Gallenblase. Auch das

kardiovaskuläre System ist bei diesen KO-Tieren stark betroffen. So haben adulte

GCKO-Mäuse einen um 30 mmHg erhöhten systolischen Blutdruck im Vergleich zu ihren

Wildtyp(WT)-Geschwistertieren. Bei Organbadversuchen mit Aorten-Ringen bleibt eine

NO-vermittelte Relaxation völlig aus. Ebenfalls konnte in unserer Arbeitsgruppe gezeigt

werden, dass NO in GCKO-Thrombozyten weder die Thrombin-induzierte Aggregation

hemmt, noch die ADP-induzierte Adhäsion oder Thrombin-induzierte Ca2+-Ausschüttung

20

beeinflusst. Physiologisch wird dies von der stark reduzierten Blutungszeit der GCKO-

Tiere untermauert. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass NO-GC in murinen

Thrombozyten und der Aorta der einzige NO-Rezeptor ist, der die Inhibition der Ca2+-

Ausschüttung, Adhäsion und Aggregation vermittelt (Dangel et al., 2010).

1.9.2 Glattmuskelspezifischer Knock-out der NO-GC

Zusätzlich zum globalen Knock-out (GCKO) wurde ein Zell-spezifisches Mausmodell

kreiert, bei dem die NO-GC nur in glatten Muskelzellen deletiert wird (SMC-GCKO); alle

übrigen Zellen bleiben unverändert. Zur Generierung dieser Zell-spezifischen KO-Mäuse

wurden flox/flox-ß1-Mäuse mit Mäusen verpaart, die ein Fusionsprotein der Cre mit einer

modifizierten Estrogenrezeptor-Bindestelle (CreERT2) exprimieren. Dieses

Fusionsprotein befindet sich unter dem Einfluss des SMMHC(„smooth muscle myosin

heavy chain“)-Promotors (Wirth et al., 2008), so dass bei diesen Tieren die Cre nur in

glatten Muskelzellen exprimiert wird. Die Bindung des selektiven Estrogenrezeptor-

Modulators Tamoxifen an die CreERT2-Domäne der Cre ermöglicht deren Translokation

in den Zellkern. Dort erkennt die Cre die loxP-stellen und schneidet die gefloxten DNA-

Sequenzen aus. Dadurch kommt es ausschließlich in glatten Muskelzellen zur Deletion

der NO-GC. 50 Tage nach einer 5-maligen Tamoxifen-Injektion (1 mg i.p.) ist die NO-

GC in glatten Muskelzellen nicht mehr nachweisbar; immunohistochemische Analysen

bestätigen den erfolgreichen Ausschnitt der NO-GC (Groneberg et al., 2010). Da das

SMMHC-Cre-Transgen auf dem Y-Chromosom lokalisiert ist, tragen ausschließlich

männliche Nachkommen dieses Gen. Deshalb wurden als Kontrollen lediglich männliche

Tiere verwendet.

21

2 Zielsetzung

Das Signalmolekül NO wird in den Endothelzellen der Blutgefäße von der eNOS

produziert NO diffundiert in die glatten Muskelzellen (SMC) und stimuliert dort die NO-

sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die GTP zu cGMP umwandelt. Erhöhte cGMP-

Spiegel führen in der Zelle zur Aktivierung der PKG und letztendlich zu einer Relaxation

der glatten Muskulatur. Diese NO/cGMP-Signalkaskade trägt im vaskulären System

entscheidend zur Regulation des Blutdrucks bei. Auch der sekundäre Botenstoff cAMP

bewirkt in SMCs durch Stimulierung der PKA eine Relaxation. Eine Schnittstelle

zwischen diesen beiden Botenstoffen und ihren Signalkaskaden bildet die cGMP-

inhibierte cAMP-abbauende PDE3. Für die Untersuchung dieser Signalkaskaden

wurden verschiedene Knock-out Modelle (KO) für die NO-GC verwendet: einerseits KO-

Mäuse, bei denen die NO-GC in allen Zelltypen ausgeschaltet ist (GCKO) und

andererseits Zell-spezifische KO-Mäuse, bei denen die NO-GC lediglich in glatten

Muskelzellen deletiert ist (SMC-GCKO).

Um das Zusammenspiel von cAMP und cGMP näher zu beleuchten, wurde die PDE3

als Schlüsselenzym zwischen diesen beiden Botenstoffen genauer untersucht. Dafür

wurden im ersten Teil dieser Arbeit folgende Versuche mit der murinen Aorta

durchgeführt:

Expression und Aktivität der PDE3 in Aortahomogenaten

Messung der Relaxation von Aorten-Ringen bei PDE3-Blockade

Einfluss von cAMP-stimulierenden Bedingungen auf die Milrinon-induzierte

Relaxation

Der Verlust der NO-GC führt zu einigen Störungen der Körperfunktionen in KO-Mäusen.

So zeigen GCKO-Mäuse neben einer verlangsamten gastrointestinalen Motilität auch

einen erhöhten systolischen Blutdruck von ~30 mmHg im Vergleich zu den Kontrollen.

Auch die SMC-GCKO-Mäuse zeigen diese Blutdruckerhöhung. Daher sollte im zweiten

Teil dieser Arbeit die Steifigkeit der Aorta als mögliche Ursache der Blutdruckerhöhung

mittels folgender Versuche näher untersucht werden:

Messung der Steifigkeit der Aorta anhand des Spannungs-Dehnungs-Tests

und der Pulswellengeschwindigkeit

Quantifizierung der am häufigsten vorkommenden ECM-Proteine Kollagen

und Elastin

Untersuchung der Struktur der Aorta

22

3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Chemikalien

Bradford-Reagenz (5-fach) Serva, Heidelberg Bromphenolblau Applichem, Darmstadt DePex Serva, Heidelberg Diclofenac Cayman Chemical, MI (USA) DMBA Sigma-Aldrich, Taufkirchen Eosin Carl Roth, Karlsruhe Formalin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Forskolin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Glukose Sigma-Aldrich, Taufkirchen Glycerin 85% Merck, Darmstadt Hämatoxylin Carl Roth, Karlsruhe IBMX Sigma-Aldrich, Taufkirchen Kaliumdihydrogenphosphat AppliChem, Darmstadt L-NAME Alexis, Lausen (CH) β-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt Miglyol 812 Apotheke des Uniklinikums, Würzburg Milrinon LKT Laboratories, St. Paul (USA) Natriumhypochloritlösung ChemSolute, Renningen ODQ Alexis, Lausen (CH) PageRuler Prestained Protein Ladder Sigma-Aldrich, Taufkirchen Paraffin Carl Roth, Karlsruhe Phenylephrin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Pikrosiriusrot Morphisto, Frankfurt a.M. Ponceau S Carl Roth, Karlsruhe Roti-Block Carl Roth, Karlsruhe Roti-Histol Carl Roth, Karlsruhe Rotiphorese 30 Carl Roth, Karlsruhe SDS Applichem, Darmstadt Tamoxifen Sigma-Aldrich, Taufkirchen Tween 20 Carl Roth, Karlsruhe

Alle weiteren Chemikalien zur Herstellung der verschiedenen Puffer wurden bei Sigma-

Aldrich (Taufkirchen) bestellt.

23

3.1.2 Antikörper für Western Blot

1°Antikörper Verdünnung Hersteller

ß-Tubulin 1:1000 Cell Signaling, Danvers (USA) GAPDH 1:1000 Cell Signaling, Danvers (USA) mß1 (NO-GC) 1:1000 eigene Herstellung PDE3A 1:1000 Zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Viacheslav Nikolaev, Hamburg PDE3B 1:200 Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg 2°Antikörper Verdünnung Hersteller

Kaninchen anti-Ziege lgG 1:100000 Jackson Laboratories, Newmarket (UK)

3.1.3 Antikörper für Immunhistochemie

1° Antikörper Verdünnung Hersteller

α-SMA, clone 1A4 1:500 Sigma-Aldrich, München mß1 (NO-GC) 1:800 eigene Herstellung PDE3A 1:200 Zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Viacheslav Nikolaev, Hamburg PDE3B 1:250 Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg 2°Antikörper Verdünnung Hersteller Alexa 555 (anti-Hase) 1:800 Invitrogen, Carlsbad (USA) Alexa 594 (anti-Schaf) 1:800 Invitrogen, Carlsbad (USA)

3.1.4 Puffer und Lösungen

Soweit nicht anders angegeben wurde von allen nachfolgenden Reagenzien 1 l

hergestellt.

Homogenisierungspuffer

TEA-Puffer

NaCl 50 mM TEA/HCl 50 mM EDTA 1 mM DTT 2 mM

24

Proteaseinhibitoren

Benzamidin 1 mM PMSF 1 mM Pepstatin A 1 µM Leupeptin 50 µM

Krebs-Henseleit-Lösung

Stammlösung A

NaCl 118,0 mM KCl 4,7 mM CaCl2 2,5 mM MgSO4 1,2 mM KH2PO4 1,2 mM

Stammlösung B

NaHCO3 25,0 mM

Für 1000 ml Puffer wurden 920 ml voll-entmineralisiertes Wasser, 40 ml Stammlösung A und 40 ml Stammlösung B mit 1,5 g Glukose gemischt. Die Krebs-Henseleit-Lösung wurde jeden Tag frisch angesetzt, im Wasserbad auf 37° C erwärmt und konstant mit Carbogen (95% O2, 5% CO2) begast, um den pH von 7,4 aufrechtzuerhalten.

Puffer für die PCR

Alkalischer Lysepuffer

NaOH 1 M EDTA 50 µM

pH 8,0

Neutralisationspuffer

Tris/HCl 0,1 M

Puffer für Gelelektrophorese und Western Blot

Sammelgelpuffer

SDS 0,4 % (w/v) Tris/OH 0,5 mM

pH 6,8

Trenngelpuffer

SDS 0,4 % (w/v) Tris/OH 1,5 mM

pH 8,8

Gel-Laufpuffer

Glycin 192 mM Tris/OH 25 mM SDS 0,1 % (w/v)

25

Probenpuffer nach Laemmli

Tris/OH 62,5 mM Glycerin 10 % (v/v) ß-Mercaptoethanol 5 % (w/v) SDS 1 % (w/v) Bromphenolblau 0,005 % (w/v)

Transferpuffer

Glycin 192 mM Tris/OH 25 mM SDS 0,2 % (w/v) Methanol 20 % (v/v)

Waschpuffer (TBST-T)

NaCl 150 mM Tris/OH 10 mM Tween 20 0,1 % (w/v)

Ponceau-S Reagenz

Trichloressigsäure 10 % (w/v) Tris/OH 0,2 % (w/v)

SDS-Polyacrylamid-Gel

Sammelgel (4%)

VE-Wasser 1,05 ml Sammelgelpuffer 1,5 ml Rotiphorese 0,4 ml TEMED 1,8 µl APS 36 µl

Trenngel (7,5%)

VE-Wasser 4,38 ml Trenngelpuffer 2,25 ml Rotiphorese 2,25 ml TEMED 9 µl APS 90 µl

Reagenzien für Hydroxyprolin-Assay

Acetrat-Citrat-Puffer

Citronensäure 50 g Natriumacetat 72 g NaOH 34 g Essigsäure (96%ig) 12 ml

pH 6,0

Für den Gebrauch wurden zu 500 ml Puffer 100 ml Wasser und 150 ml 1-Propanol

gegeben.

26

Chloramin-T Reagenz

Chloramin-T 1,41 g Wasser 10 ml 1-Propanol 10 ml Acetat-Citrat-Puffer (fertig) 80 ml

Ehrlich‘s Reagenz

DMAB 1,5 g 1-Propanol 6 ml Perchlorsäure (60%ig) 2,6 ml

Mit 1-Propanol wurde auf 10 ml aufgefüllt.

3.1.5 Geräte

Gerät Produktbezeichnung Firma

Flüssigszintilationszähler 1600 TR Packard Bionokular SZ51 Olympus CCD-Kamera FluorChemSP AlphaInnotech CCD-Kamera GelLogic100 Kodak Druckballon Respiration Sensor Graseby Medical Ltd. Kryotom CM 3050 Leica Lichtquelle KL1500 Schott Mini-Gelkammern Mini-PROTEAN Tetra Cells Bio-Rad Mikroskop BZ 9000 BioRevo Keyence Schlittenmikrotom Hn40 Reichert Jung Spektrometer Avance 750 Bruker Biospin Multilabel Counter Viktor2 Wallac 1420 Perkin Elmer Nitrozellulosemembran Whatman Protran BA 85 GE Health Care Organbad Multi Myograph Model 610M Danish Myo Technology Photometer Nano Drop, SimpliNano GE Health Care PowerLab PowerLab 8/30 AD Instruments PowerLab PowerLab 16/30 AD Instruments Vakuumzentrifuge Speed Vac Concentrator Bachhofer UV-Transilluminator Vaporisator Ventilator Verstärker

Fluo-Link Vapor 2000 Ugo Basile 7025 MPVS Ultra

Biometra Dräger Hugo Sachs Elektronik Millar

Software Firma

Amira 5.0 FEI Company GraphPad Prism Software GraphPad Software Inc. ImageJ Wayne Rasband (www.imagej.nih.gov/ij/) LabChart 7.3.8 AD Instruments LabChart 8 AD Instruments MATLAB The Mathworks Inc. Microsoft Excel 2013 Microsoft Windows

27

3.2 Methoden

3.2.1 Tiere und Präparation

3.2.1.1 Haltung und Zucht

Die in den Versuchen verwendeten Mauslinien (GCKO: globaler NO-GC-Knockout und

SMC-GCKO: Glattmuskel-zell-spezifischer NO-GC-Knockout) wurden von Herrn Prof.

Dr. Andreas Friebe zur Verfügung gestellt. Die Mäuse wurden entsprechend den

Anforderungen in Makrolon-Typ-II-Käfigen mit Holzspänen als Einstreu gehalten.

GCKO-Mäuse erhielten aufgrund ihrer eingeschränkten Darmmotilität eine

ballaststoffarme Diät (Altromin 1013), die mit Omeprazol und Natriumbikarbonat

angereichert war. Alle übrigen Tiere erhielten eine Nager-Standarddiät (Altromin 1320)

und Wasser ad libitum. Zur Zucht der verschiedenen NO-GC-defizienten Maus-linien

wurden je zwei heterozygote Weibchen im gebärfähigen Alter (8 bis 45 Wochen) und ein

heterozygotes Männchen (7 Wochen bis 1 Jahr) verpaart. 18 bis 21 Tage nach der

Geburt wurden die Nachkommen genotypisiert und nach Geschlechtern getrennt von

der Mutter abgesetzt. Alle Versuche wurden mit adulten Mäusen (8 bis 24 Wochen)

durchgeführt. Da das SMMHC-Cre-Transgen auf dem Y-Chromosom lokalisiert ist,

tragen ausschließlich die männlichen Nachkommen dieses Gen. Somit wurden

Versuche mit SMC-GCKO-Tieren lediglich mit männlichen Mäusen durchgeführt. In

jedem Experiment wurden, Geschwistertiere als Kontrollen verwendet. Bei gleichem

Alter konnte kein Unterschied zwischen WT- und heterozygoten Tieren festgestellt

werden, weshalb die Ergebnisse dieser Tiere in einigen Experimenten unter dem Namen

„Kontroll-Tiere“ (ctrl) zusammengefasst wurden.

3.2.1.2 Tamoxifen-Injektionen

Zur Induktion des genetischen Knock-outs in SMC-GCKO Mäusen, wurde diesen im

Alter von 6 bis 8 Wochen an fünf aufeinanderfolgenden Tagen Tamoxifen (1 mg i.p.

gelöst in Miglyol 812) injiziert. Frühestens 50 Tage nach der Injektion wurden die Tiere

in die Versuche eingesetzt. Erst ab diesem Zeitpunkt lässt sich die NO-GC sowohl auf

Proteinebene als auch funktionell nicht mehr nachweisen (Groneberg et al., 2010).

3.2.1.3 Genotypisierung

Die Genotypisierung der Mäuse erfolgte 21 Tage nach der Geburt durch Analyse von

Ohrgewebe. Die Ohrstanzen wurden für 17 min bei 95 °C in 50 µl Lysepuffer gekocht

und anschließend zur Neutralisation mit 50 µl Neutralisationspuffer versetzt. Aus den so

erhaltenen Proben wurden definierte DNA-Sequenzen mittels Polymerase-

Kettenreaktion (Mullis & Faloona, 1987; Saiki et al., 1988a; Saiki et al., 1988b) zunächst

28

amplifiziert. Anschließend wurden die so entstandenen DNA-Fragmente anhand ihrer

unterschiedlich negativen Ladung und Größe mittels Agarosegel (2%) aufgetrennt. Um

die DNA-Banden im Gel sichtbar zu machen, wurde dem Gel der Farbstoff GelRed

(1:50.000) hinzugefügt. Die Ethidium-Untereinheiten dieses Farbstoffs interkalieren

zwischen die Basen der DNA, wodurch die DNA-Banden im Gel bei Anregung mit

UV-Licht fluoreszieren. Alle Agarosegele wurden auf einem UV-Transilluminator mit UV-

Licht bestrahlt und ein Bild mit einer CCD-Kamera erstellt.

3.2.1.4 Organentnahme

Mäuse wurden mit dem Inhalationsnarkotikum Isofluran betäubt, durch zervikale

Dislokation getötet und Tibialänge und Körpergewicht protokolliert. Anschließend wurde

die Bauch- und Brusthöhle geöffnet und der thorakale Teil der Aorta, die Arteria carotis

oder die Nieren entnommen und in mit Carbogen (95% O2, 5% CO2) begaster Krebs-

Henseleit-Lösung (KH-Lösung) gegeben. Die Gefäße wurden gespült, um sie von

Blutresten zu befreien und von allen Organen das Fettgewebe abgeschnitten. Bei Bedarf

wurde noch das Gesamt-Herzgewicht bestimmt, wobei der linke Ventrikel abpräpariert

und separat gewogen wurde.

3.2.2 Western Blot

3.2.2.1 Herstellung der Western Blot-Proben

Die Aorta wurde wie unter 3.2.1.4 beschrieben präpariert und mit 100 µl

Homogenisierungspuffer in einem Glas/Teflon Homogenisator mit Hilfe eines

Mikrohandrührgeräts auf Eis homogenisiert. Die Nieren wurden mit der 5-fachen Menge

Homogenisierungspuffer im Glas/Glas-Homogenisator mit Hilfe eines drehzahlvariablen

Rührwerkes (30 Hübe, 500 U/min) homogenisiert. Um nicht-lösliche Zellbestandteile

abzutrennen, wurden die Nieren-Homogenate 10 Minuten bei 300 x g und 4 °C

zentrifugiert. Die Homogenate wurden mit Probenpuffer nach Laemmli (1970) versetzt,

3 Minuten bei 95 °C gekocht, anschließend auf Eis abgekühlt und bis zur weiteren

Verwendung bei -20 °C eingefroren.

3.2.2.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Bestimmung der Proteinkonzentration der Homogenate erfolgte nach der Methode

von (Bradford, 1976). Hierbei wurde in einer Mikrotiterplatte 20 l Probe bzw. Standard

(0-0,1 mg/ml Rinderserumalbumin) mit 200 l Bradford-Reagenz versetzt, 5 Minuten bei

Raumtemperatur (RT) inkubiert und die Absorption bei 590 nm mittels Photometer

gemessen. Anhand der BSA-Eichgerade wurde die Proteinkonzentration der Proben

29

bestimmt. Um zu gewährleisten, dass die gemessene Absorption im linearen Bereich

der erstellten Eichgeraden liegt, wurden die Proben gegebenenfalls vorverdünnt.

Aufgrund des geringen Volumens der Aorten-Homogenate, wurde deren

Proteinkonzentration mittels Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 280 nm

gemessen.

3.2.2.3 Gelelektrophorese

Zur Auftrennung der in den Homogenaten enthaltenen Proteine, wurde eine

diskontinuierliche Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

nach Laemmli (1970) durchgeführt. Die aufzutrennenden Proben wurden zunächst mit

Probenpuffer versetzt. Der hierbei verwendete Laemmli-Probenpuffer enthält zur

Denaturierung der Proteine Natriumdodecylsulfat (SDS) und β-Mercaptoethanol. Durch

Zugabe von β-Mercaptoethanol werden zunächst die stabileren Disulfidbrücken der

Proteine gespalten. Das anionische Detergenz SDS denaturiert die Proteine, bindet an

deren hydrophobe Aminosäurereste und überlagert dabei deren Eigenladung, sodass

alle Proteine eine negative Ladung aufweisen. Zusätzlich zu den Proben wurde ein

Protein-Größenstandard aufgetragen. Die Gelelektrophorese erfolgte in Elektrophorese-

Modulen in Mini-Gelkammern mit 1,5 mm dicken, 7,5%igen SDS-Polyacrylamid-Gelen

für ca. 1 Stunde bei einer Stromstärke von 45 mA.

3.2.2.4 Blotting

Zum Nachweis bestimmter Proteine folgte der Gelelektrophorese ein Western Blot nach

der Methode von Towbin et al. (1979). Dabei wurden die aufgetrennten Proteine durch

elektrischen Transfer aus dem Gel eluiert und auf eine Nitrozellulosemembran

übertragen. Das „Blotting“ erfolgte in mit Transferpuffer gefüllten Elektrophorese-

Transfer-Modulen in Mini-Gelkammern unter Kühlung für 1 Stunde bei 320 mA. Um die

Proteine auf der Membran sichtbar zu machen und damit den Erfolg des Transfers zu

überprüfen, wurde die Membran 5 min bei RT mit Ponceau-S gefärbt. Damit freie

Proteinbindestellen abgesättigt und somit unspezifische Antikörperbindungen

vermieden werden, wurde die Membran 30 min bei RT mit RotiBlock geblockt. Zum

Nachweis der zu untersuchenden Proteine, wurde die Membran anhand der farbigen

Markerbanden an den entsprechenden Stellen getrennt und in den jeweiligen

spezifischen primären Antikörper-Lösungen (Antikörper in 3% Ovalbumin (w/v) in TBST)

bei 4 °C auf einem Schüttler über Nacht inkubiert. Um unspezifisch gebundene

Antikörper zu entfernen, wurde die Membran mehrfach mit TBST gewaschen und

danach für 1 Stunde in einem Meerrettich-Peroxidase-gekoppelten, Immunglobulin-

spezifischen Sekundär-Antikörper (in 3% Ovalbumin (w/v) in TBST) bei RT inkubiert. Zur

30

Detektion der Antikörper wurde als Substrat das „SuperSignal ELISA Femto Maximum

Sensitivity Substrat“ von Thermo Scientific verwendet. Die dabei entstandene

Chemilumineszenz wurde mit einer 16-bits CCD-Kamera in einer lichtisolierten Kammer

detektiert.

3.2.3 Messung von Durchmesser und Wanddicke

Zunächst wurden die Mäuse mit einer Überdosis Isofluran getötet, die Aorta entnommen

und in Carbogen-begaste KH-Lösung überführt. Die Aorta wurde von Fett und

Bindegewebe befreit, durchgespült und mit einer Schneidevorrichtung in sechs 2 mm

lange Ringe geschnitten. Vier Ringe wurden für die nachfolgenden Organbadversuche

verwendet. Je zwei Ringe wurden halbiert, sodass vier schmale Stücke entstanden.

Diese wurden in einen Tropfen KH-Lösung auf einem Objektträger mit Lineal gegeben.

Unter dem Binokular wurden diese Aorten-Ringe so ausgerichtet, dass die Ringstruktur

gut sichtbar war. Mit Hilfe der Software ImageJ wurde im Anschluss die Wanddicke und

der Umfang der Ringe gemessen und daraus der Durchmesser berechnet.

3.2.4 Aktivitätsmessungen

3.2.4.1 Phosphodiesterase-Assay

Der Phosphodiesterase-Assay (PDE-Assay) ist eine Methode zur Bestimmung der

katalytischen Aktivität verschiedener Phosphodiesterasen. Hierbei macht man sich zu

Nutze, dass die Phosphodiesterasen in 32P-cAMP die Phosphodiesterbindung zwischen

der Phosphatgruppe und der Ribose spalten. Das so entstandene 32P-AMP wird

anschließend durch die Alkalische Phosphatase in Adenosin und 32P-Phosphat

gespalten. Die Impulse pro Minute (cpm) der freien radioaktiven Phosphatreste können

dann in einem β-Counter gemessen und daraus die PDE-Aktivität berechnet werden.

Um die Hydrolyseaktivität der PDE3 in Aorta-Homogenaten zu untersuchen, wurde

zuvor radioaktiv-markiertes cAMP als Substrat hergestellt (Mullershausen et al., 2003)

Herstellung des radioaktiv-markierten Substrats

Zur Herstellung von radioaktiv markiertem 32P-cAMP wurde das am α-C-Atom markierte

Triphosphat α-32P-ATP mit gereinigter NO-GC umgesetzt. Dazu wurden in einem

Gesamtvolumen von 100 µl 18,5 MBq des α-32P-ATP in 50 mM TEA-Puffer mit 0,5 mg/ml

BSA, 3 mM DTT, 3 mM MnCl2, 1 mM GSNO und 2,5 g gereinigter NO-GC in einem

Reaktionsgefäß im Wasserbad bei 37 °C für 90 Minuten inkubiert. Durch die Zugabe von

je 450 l Zink-Acetat (120 mM) und Na2CO3 (120 mM) wurde die Reaktion gestoppt. Das

dabei entstandene Zinkcarbonat präzipitierte mit den freien 5‘-Phosphaten der nicht

umgesetzten Nukelosidtriphosphate. Nach 4-minütiger Zentrifugation bei 12000 x g

31

wurde der Überstand auf eine mit 0,1 M Perchlorsäure äquilibrierte Aluminiumoxidsäule

gegeben. Das zyklische ATP bindet an das Säulenmaterial, während nicht-zyklisierte

Nukleotide und Pyrophosphate mit VE-Wasser (10 ml) von der Säule gespült werden.

Zur Elution des Substrats wurde die Säule mehrfach mit 300 µl einer 250 mM Natrium-

Acetat-Lösung gespült. Mit einem β-Counter wurde die Substratkonzentration der

einzelnen Fraktionen bestimmt.

Messung der PDE3-Aktivität

Zur Bestimmung der Hydrolyse-Aktivität der PDE3 wurde radioaktiv markiertes 32P-

cAMP als Substrat benutzt. Der Reaktionsansatz bestand aus einem Gesamtvolumen

von 100 µl eines Puffers aus 50 mM TEA/HCl, 0,5 mg/ml BSA, 3 mM DTT, 1 U alkalischer

Phosphatase, 3 mM MgCl2, 1 µl Aorta-Homogenat, 1 µM nicht-radioaktives cAMP und

einer bestimmten Menge des radioaktiv markierten Tracers 32P-cAMP. Der Einsatz von

nicht-radioaktivem Substrat diente dazu eine ausreichende Substratkonzentration in der

Nähe des Km-Wertes zu gewährleisten. BSA diente während der Reaktion als

Schutzprotein, DTT als Oxidationsschutz und Magnesium zur Aufrechterhaltung der

Phosphatase-Aktivität. Die Menge an radioaktiv markiertem Substrat wurde so gewählt,

dass die Zählrate etwa 100.000 cpm betrug. Außerdem wurde darauf geachtet, dass die

umgesetzte Substratmenge mindestens den doppelten Wert des Leerwertes und nicht

mehr als 20% der Gesamtsubstratmenge betrug. Nach Zugabe des spezifischen PDE3-

Inhibitors Milrinon wurde die Reaktion durch Inkubation im 37 °C warmen Wasserbad

gestartet. Nach 10 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 900 µl gekühlter

Aktivkohlesuspension (30% Aktivkohlepulver in 50 mM KH2PO4, pH 2,3) gestoppt und

die Proben 4 min bei 12.000 x g zentrifugiert. Dabei werden die an die Aktivkohle

gebundenen nicht-umgesetzten Nukleotide und Nukleoside sedimentiert, so dass im

Überstand die abgespaltenen freien radioaktiven Phosphatreste vorliegen. 600 µl dieses

Überstandes wurden in Szintillationsgefäße überführt und die Impulse pro Minute im

Flüssigszintillationszähler gemessen. Die PDE-Aktivität wurde anschließend mit Hilfe

der folgenden Formel berechnet:

� � = − 0 ∗ ∗� ∗ � ∗ ∗ �

(PDE) spezifische Aktivität der PDE (nmol/min/mg)

C Zählrate der Probe (cpm) C0 Zählrate des Leerwertes (cpm) CT Zählrate des eingesetzten Tracers 32P-cAMP (cpm) t Inkubationsdauer (min) VH eingesetzte Aorta-Homogenat-Menge ( l) VI Inkubationsvolumen ( l) Vg gemessenes Probenvolumen ( l)

32

cs eingesetzte Substratkonzentration ( M) Vt gesamtes Probenvolumen ( l) cP gemessene Proteinkonzentration (mg)

3.2.4.2 Radioimmunoassay

Der Radioimmunoassay (RIA) ist eine immunologische Nachweisreaktion zur

Bestimmung von geringen Substanzmengen, in diesem Falle cAMP. Dabei wird das

radioaktiv-markierte cAMP-Analogon 125I-Sc-cAMP-TME (Tracer) durch einen

spezifischen Antikörper präzipitiert und so der cAMP-Gehalt in einer Aortenprobe

bestimmt. Durch die Inkubation von radioaktiv markiertem Tracer mit einem spezifischen

Antikörper stellt sich ein Gleichgewicht zwischen gebundener und freier Form des

Tracers ein. Dieses Gleichgewicht kann durch das in der Probe enthaltene cAMP in

Richtung des freien Tracers verschoben werden, wodurch der präzipitierbare gebundene

Anteil sinkt. Nach Proteinfällung und Absaugung des Überstands wird die Radioaktivität

des Präzipitats bestimmt. Durch Verwendung einer Standardkurve mit bekannten cAMP-

Mengen kann die cAMP-Konzentration in einer unbekannten Probe ermittelt werden.

Die gewählten Bedingungen zur Durchführung des RIAs, die Behandlung der Proben

und die Antikörperinkubation erfolgten, wie in (Jager et al., 2013) beschrieben.

Synthese des 125I-cAMP-Tracers

Als Tracer wurde im RIA das radioaktive cAMP-Analogon 125I-Sc-cAMP-TME verwendet.

Zur Herstellung dieses Tracers wurde das zyklische Nukleotidanalogon TME-ScAMP

(2'-SuccinylcAMP-Tyrosylmethylester) mit 125I markiert. Dabei wird der

Tyrosylmethylester am aromatischen Ring des Tyrosylrests durch eine elektrophile

Substitution mit 125Iod markiert. Diese Synthese erfolgte nach der Chloramin T (N-Chlor-

Toluol-Sulfonamid Natrium)-Methode von (Hunter & Greenwood, 1964) und (Steiner et

al., 1972) durchgeführt.

Der Reaktionsansatz mit einem Gesamtvolumen von 100 µl enthielt 35,5 l

Phosphatpuffer (500 mM, pH 7,4), 5 l Sc-cAMP-TME (800 pmol, gelöst in 50 mM

Phosphatpuffer) und 9,5 l Na125I (37 MBq bzw. 400 pmol). Zum Start der Reaktion

wurden 50 l Chloramin-T (90 nmol, gelöst in 50 mM Phosphatpuffer) zugegeben.

Chloramin-T oxidiert das radioaktive Iodid zu elementarem Iod, welches an mehreren

Positionen des aromatischen Tyrosylrestes des Sc-cAMP-TME bindet. Um eine

maximale Ausbeute an dem bevorzugten orthosubstituierten 125I-TME-Sc-cAMP zu

erreichen, musste die Reaktion nach 50 s gestoppt werden. Dafür wurden 100 µl 2,6 µM

Na-Bisulfat zugegeben, welches das elementare Iod zu Iodid reduziert. Zur Reinigung

des jodierten Produkts (Tracer) wurde eine Anionenaustauscher-Säule (QAE Sephadex

A-25, GE Healthcare, ca. 10 ml Säulenvolumen) verwendet. Zuvor wurde das

33

Reaktionsgemisch mit 100 µl H2O verdünnt, um die Ionenstärke zu senken und

anschließend auf die mit Ammoniumformiatpuffer (50 mM, pH 6) equlibrierte QAE-Säule

gegeben. Die Elution erfolgte direkt im Anschluss mit 250 mM Ammoniumformiatpuffer

(pH 6) in 25 einzelnen 5 ml Fraktionen, von denen je 5 µl im β-Counter gemessen

wurden. Die Fraktionen mit der höchsten spezifischen Aktivität wurden vereinigt und mit

dem gleichen Volumen Isopropanol versetzt, um die Autoradiolyse zu verlangsamen.

Diese Gemische wurden bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.

Herstellung der Aortenproben

Die Aorten wurden wie oben beschrieben (3.2.1.4) präpariert und in flüssigem N2

schockgefroren. Das gefrorene Gewebe wurde anschließend im Glas/Teflon

Homogenisator mit 500 µl eisgekühltem 70%igem Ethanol auf Eis homogenisiert. Nach

Zentrifugation (15 min, 20.000 x g, 4 °C) wurde der cAMP-enthaltende Überstand

entnommen und bei 100 °C getrocknet. Die getrockneten Proben wurden in 100 µl RIA-

Puffer (100 mM Natriumacetat, pH 6) gelöst. Das Proteinpellet wurde mit 0,1 M NaOH

und 0,1 M SDS bei 60 °C über Nacht unter Schütteln gelöst und die Proteinkonzentration

(wie unter 3.2.2.2 beschrieben) bestimmt.

Radioimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von cAMP

Die zu analysierenden getrockneten Proben in RIA-Puffer wurden mit 3 µl eines

Gemisches aus Triethylamin und Acetanhydrid (2:1) versetzt. Dadurch wurde das in den

Proben enthaltene cAMP acetyliert und somit die Sensitivität des Assays um den Faktor

40 gesteigert (Harper & Brooker, 1975). Wobei die Nachweisgrenze dieses Assays bei

2 fmol zyklischem Nukleotid liegt. Das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes betrug

200 µl. Dafür wurden 50 µl RIA-Puffer in Polypropylen-Röhrchen vorgelegt und mit 10 µl

der gegebenenfalls verdünnten Probe, 100 µl Antiserum (final 1:100.000) und 40 µl

Tracer (verdünnt und auf 40 µl mit RIA-Puffer aufgefüllt) versetzt. Um die Adsorption des

Antikörpers an die Wände des PP-Röhrchens weitgehend zu verhindern, wurde dieser

in -Globulin (0,5 mg/ml) verdünnt. Der Ansatz wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert, so

dass sich ein Gleichgewicht zwischen freiem und von Antikörper-gebundenem Nukleotid

einstellen konnte. Zur Trennung von freiem und gebundenem cGMP wurde das im

Reaktionsansatz befindliche Protein durch Zugabe von 3 ml Polyethylenglycol-Puffer

(16% PEG 6000 in 10 mM Tris/HCl, pH 7,4) gefällt. Zuvor wurden die Ansätze mit 50 l

einer 0,8%igen -Globulinlösung versetzt, um eine möglichst vollständige Fällung des

Proteins zu gewährleisten. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei 4 °C wurden die

Proben zentrifugiert (30 min, 6000 x g, 4 °C) und der Überstand abgesaugt. Die im

Sediment an den Antikörper gebundene Aktivität wurde mittels β-Counter bestimmt. Die

pro Probe eingesetzte Aktivität des Tracers betrug etwa 10.000 cpm, wobei die

34

Antikörpermenge und die Verdünnung der Probe so gewählt wurden, dass etwa 30-40%

der Aktivität gebunden wurden. Das gleiche Verfahren wurde mit den Ansätzen der

Standardkurve (2 - 512 fmol) durchgeführt. Die Aktivität wurde entweder unter basalen

Bedingungen oder mit Forskolin-stimuliert gemessen. Mit den Aktivitätswerten der

Standardkurve wurde die in den Proben enthaltene Menge an cAMP errechnet.

3.2.5 Organbad

Für die Untersuchungen der Gefäße im Organbad wurden zwei 4-Kanal-Multi-

Myographen verwendet, deren Kammern jeweils 5 ml KH-Lösung enthielten, die

konstant mit Carbogen begast und auf 37 °C erwärmt wurden. In den Organbadkammern

befinden sich jeweils zwei Haken, von denen der Eine beweglich ist und mittels

Stellschraube um eine bestimmte Länge verschoben werden kann, während der Andere

fest mit einem Kraftmesser gekoppelt ist. So können die durch das Gewebe

hervorgerufenen Kräfte gemessen werden.

3.2.5.1 Test zur Relaxation der Gefäße

Nach Fixierung der Gefäßringe in den Organbadkammern wurden diese bei einer

Vorspannung von 5 mN (Aorta) bzw. 2mN (A. carotis) für 15 min äquilibriert. Da durch

die für das Gewebe geänderten Bedingungen der Tonus spontan abfiel, musste die

Vorspannung nachjustiert werden. Nach ca. 15 min war die Kraft stabil und der Versuch

konnte gestartet werden. So konnten sowohl die Kraftentwicklung bei isometrischer

Kontraktion als auch der Kraftabbau bei der Relaxation der Gefäßringe gemessen und

mit der Software LabChart ausgewertet werden.

Vor Versuchsbeginn wurde die KH-Lösung erneuert, um anschließend die

Gewebestücke in Anwesenheit der Inhibitoren Diclofenac (Cyclooxygenase-Hemmer; 3

µM) und L-NAME (NO-Synthase-Hemmerν 200 µM) mit dem α1-Adrenozeptoragonisten

Phenylephrin (1 µM) zu kontrahieren. Erst nach Erreichen eines stabilen

Kontraktionsniveaus erfolgte je nach Versuch die Zugabe von Forskolin, Milrinon oder

Glyceroltrinitrat (GTN) in steigenden Konzentrationen (0,001 bis 10 µM; in 10er

Schritten). Forskolin ist ein nicht selektiver Stimulator der Adenylyl-Cyclasen, der einen

Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration und damit eine Vasodilatation bewirkt.

Milrinon hemmt die PDE3, wodurch cAMP akkumuliert. GTN bewirkt als NO-Donor eine

Vasodilatation. Erst nach dem Durchlaufen der Minima der Kontraktionen wurde die

nächste Konzentration appliziert. Am Ende der Versuche wurde der unspezifische PDE-

Inhibitor IBMX (100 µM) zur vollständigen Relaxation der Ringe zugegeben. Dieser letzte

Wert diente als Referenz zur Berechnung der prozentualen Relaxation.

35

In einem weiteren Organbad-Versuch wurde zusätzlich der spezifische NO-GC Inhibitor

ODQ (10 µM) verwendet. Um eine vollständige Inhibition der NO-GC zu gewährleisten

wurde nach Zugabe von ODQ 20 min gewartet bevor mit dem Erstellen der kumulativen

Dosis-Konzentrations-Kurven begonnen wurde.

3.2.5.2 Spannungs-Dehnungs-Test

Ein Versuch zur Messung der Gefäßsteifigkeit und damit Charakterisierung der

Materialeigenschaften, ist der Spannungs-Dehnungs-Test. Hierbei werden die

isometrischen Kräfte während der Dehnung des Gewebes gemessen. Da die Geometrie

der Aorten-Ringe einen direkten Einfluss auf die gemessene Kraft und die einzustellende

Auslenkung hat, mussten reduzierte Einheiten verwendet werden. Um Daten für die

murine Aorta zu erhalten, die nur von der Struktur des Gefäßes und nicht von dessen

geometrischen Abmessungen abhängen, musste bei allen Ringen die gleiche

Schnittlänge (2 mm) gewählt werden. Durch Berechnung der Dehnung werden die

Messungen vom Durchmesser unabhängig gemacht. Um weiterhin das

Materialverhalten zu beschreiben, ist es notwendig, die gemessenen Kräfte durch die

wirkende Querschnittsfläche A zu dividieren. Dafür wird vorausgesetzt, dass die

Schnittlänge und die Wanddicke bei allen Proben gleich sind, wodurch die gemessenen

Kraftwerte direkt miteinander vergleichbar sind und daraus die Spannung berechnet

werden kann. Das daraus resultierende Spannungs-Dehnungs-Diagramm beschreibt

das Materialverhalten und ist unabhängig von den geometrischen Eigenschaften der

einzelnen Aorten-Ringe.

Nachdem die Mäuse mit einer Überdosis Isofluran getötet wurden, wurde die Aorta

entnommen und in Carbogen-begaster KH-Lösung, präpariert und der

Aortendurchmesser wie in 3.2.3 bestimmt. Die Ringe wurden dehnungsfrei über die

beiden Haken der Organbadkammern gezogen und die Vordehnung auf 0 gestellt.

Abhängig vom Aortendurchmesser wurden die Ringe unterschiedlich stark gespannt, um

bei allen Gewebsstücken die gleiche Dehnung zu erreichen. Mit folgender Formel wurde

zunächst die einzustellende Auslenkung berechnet:

� = � ∗ ∗ � −

L Auslenkung (µm) ε Dehnung (einheitenlos) d Durchmesser (mm)

36

Durch drehen der Stellschraube des Organbads wurde die jeweilige Länge eingestellt.

Erreichte die Kurve ein Plateau, wurde erneut gedehnt. Maximal wurde eine Dehnung

von 16% eingestellt, jedoch rissen einige Aorten-Ringe bereits bei niedriger Dehnung.

So konnte die Kraftentwicklung bei isometrischer Kontraktion der Aorten-Ringe

gemessen und mit einem PowerLab System und der Chart Software für Windows

digitalisiert werden. Aus den gemessenen Kräften wurde mit folgender Formel die

Spannung berechnet:

= � ∗ �

U Spannung (mN/mm2) F Kraft (mN) t Wanddicke (mm) l Länge des Aortenstücks (mm)

Da lediglich der Vergleich zwischen den beiden KO-Mauslinien und den Kontroll-Tieren

von Interesse war, wurde auf den Spannungswert bei 16% Dehnung der Kontroll-Tiere

normiert. Dieser Wert war der maximal erreichbare Wert, denn bei höheren Dehnungen

rissen die Aorten-Ringe. Aus den so erhaltenen Werten wurde ein Spannungs-

Dehnungs-Diagramm erstellt

3.2.6 Messung der Pulswellengeschwindigkeit mittels MRT

Die Pulswellengeschwindigkeit (PWV) beschreibt die Ausbreitungsgeschwindigkeit, mit

der die Druckwelle die Arterien durchläuft. Sie ist nicht nur abhängig vom Blutdruck,

sondern auch von der Elastizität und dem Durchmesser der Gefäße, weshalb sie ein

wichtiges Maß für die lokale Gefäßsteifigkeit darstellt. Bei vielen Krankheiten, wie z.B.

Arteriosklerose, kommt es zur Zunahme der PWV. Sie ist somit auch klinisch von großer

Relevanz und ein Indikator für kardiovaskuläre Risiken.

Die Magnetresonanztomographie ist ein computergestütztes bildgebendes Verfahren

zur Darstellung von Struktur und Funktion von Gewebe und Organen. Es beruht

physikalisch auf dem Prinzip der Kernspinresonanz, also dem Drehimpuls bestimmter

Protonen. Im Körper der Säugetiere sind dies hauptsächlich Wasserstoffatome (H+). Die

unterschiedliche Menge an H+-Atomen und ihre Relaxationszeit in verschiedenen

Geweben nach einem Hochfrequenz-Impuls sind ausschlaggebend für den Bildkontrast

und geben damit Hinweise auf die Morphologie.

37

Die Pulswellengeschwindigkeit wurde mit der QA-Methode bestimmt, d.h. sie wurde

lokal aus der Änderung des Volumenflusses und der Querschnittsfläche des Gefäßes

während der frühen Systole errechnet (Vulliemoz et al., 2002; Herold et al., 2009).

Der gesamte Versuch, von Präparation über Messung bis hin zur Auswertung, erfolgte

unter Anleitung von Dr. Volker Herold aus dem Lehrstuhl für Experimentelle Physik 5 der

Universität Würzburg.

3.2.6.1 Tierpräparation und Messung

Die Messungen wurden an einem Spektrometer in einem vertikalen MR-System mit einer

Feldstärke von 17,6 T und einer Kerngröße von 89 mm durchgeführt. Der

Versuchsaufbau des gesamten Systems ist in Abbildung 4A dargestellt. Während den

Messungen wurden die Tiere kontinuierlich mit einem Isofluran-Sauerstoff-Gemisch

(1,5-2%) narkotisiert. Die Körpertemperatur konnte mithilfe des Gradientenkühlsystems

konstant auf 38 °C gehalten werden. Die Mäuse wurden in eine Spule mit einem

Innendurchmesser von 25 mm gezogen, weshalb für die PWV-Messungen

ausschließlich Tiere mit einem Gewicht kleiner als 30 g verwendet werden konnten.

Um die Datenerfassung des Scanners mit der Eigenbewegung des Herzens und der

Atmung zu synchronisieren und somit Bewegungsartefakte und Reflexionen zu

minimieren, mussten Atem- und Herzsignal mittels Druckballon aufgezeichnet werden.

Der Ballon wurde auf der Haut oberhalb des Mausherzens positioniert. Durch ein Stück

Schaumstoff zwischen Spule und Ballon konnte neben dem Atem- auch das Herzsignal

dargestellt werden. Diese beiden Drucksignale wurden mittels Signalwandler in

elektrische Signale umgewandelt und diese auf einer EKG-Einheit dargestellt. Neben

der kardialen Triggerung, wurde auch ein Atemgating durchgeführt, d.h. die Messung

wurde während der Atembewegung unterbrochen und erst nach Ende des Atemzuges

fortgesetzt. Außerdem wurde das Trigger-Delay so eingestellt, dass die Messung in der

frühen Systole stattfand. Da Elastizität und Durchmesser der Aorta von zentral nach

peripher abnehmen, war es wichtig die PWV immer an der gleichen Stelle zu bestimmen.

Als Orientierungspunkt diente hierbei das Diaphragma. Somit wurden die lokalen PWVs

oberhalb des Zwerchfells im thorakalen Teil der Aorta bestimmt. Um den vollen

Durchmesser der thorakalen Aorta und damit die zur Errechnung der PWV notwendigen

Parameter zu messen, wurden mit Longitudinal- und Transversalwellen verschiedene

Längs- und Querschnitte durch die Aorta gelegt. In 4B ist ein Frontal-Sagittal-Schnitt

durch die Maus-Aorta dargestellt. Man sieht die gesamte Aorta mit aufsteigendem Teil,

Aortenbogen und dem absteigenden Teil bis kurz vor dem Zwerchfell. Oberhalb dieser

Stelle wurde die Schnittebene für den Transversal-Schnitt gewählt, um so einen

Querschnitt des Gefäßes zu erhalten (Schnittebene siehe Abb. 4B). Anhand dieser

Abb. 4: Magnetresonanztomographie der Maus-AortaA) Schematischer Aufbau des mechanischen Triggersystems. Für weitere

Erklärungen siehe Text.

B) Frontal-Sagittal-Schnitt durch den Bauchraum einer Maus. Um die

Pulswellengeschwindigkeit (PWV) in der absteigenden Aorta zu bestimmen, wurde

die transversale Schnittebene auf Höhe des Zwerchfells gewählt und aus dem

Aortenquerschnitt und dem Volumenfluss die PWV errechnet.

B

vertikales MR-System

Isofluran-Vaporisator

Druckballon

Drucksignal-Wandler

Trigger-Einheit

Computer

Kopf

Fuß

transversale Schnittebene

Aorta

A

38

39

Aortenquerschnitte und den darin enthaltenen frühsystolischen Fluss- und

Flächenpulsdaten, konnte die lokale PWV berechnet werden. Bei allen Messungen

wurden folgende Parameter eingestellt: Matrixgröße 160x160, Echozeit 1,7 ms,

Schnittdicke 1 mm, maximale Geschwindigkeit 166,66 cm/s und Gesamtzahl der

Aufnahmen 40.

3.2.6.2 Auswertung

Mit einem speziellen Makro im Programm MATLAB in Kombination mit der

kommerziellen Software AMIRA wurde die PWV anhand der aufgenommen Aorten-

Bilder während der Systole berechnet. Hierzu wurde die Segmentierung des

Aortenquerschnitts (A) für jede Aufnahme viermal mit der Software Amira durchgeführt

und diese Werte gemittelt. Der Volumenfluss (Q) wurde durch die Integration der

Geschwindigkeitswerte jedes Pixels des Gefäßquerschnitts bestimmt. Die PWV wurde

anschließend über die lineare Kalibriergerade der Werte von A und Q berechnet.

3.2.7 Biochemische Untersuchungen der Aorta

Blutgefäße wie die Aorta bestehen aus einer Vielzahl an Strukturproteinen (Wagenseil

& Mecham, 2009), welche die mechanischen Eigenschaften des Gefäßes bedingen.

Kollagen und Elastin sind die in der Aorta am häufigsten vorkommenden Proteine.

Kollagen ist verantwortlich für die Zugfestigkeit des Gefäßes, während Elastin die

elastischen Eigenschaften der Aorta vor allem während der systolischen Phase des

Herzschlags vermittelt.

3.2.7.1 Elastin-Assay

Zur Quantifizierung von Elastin wurde der kommerziell erhältliche „Fastin Elastin Assay“

von Biocolor verwendet. Der Assay wurde wie vom Hersteller angegeben durchgeführt.

Zunächst wurde der thorakale Teil der Aorta entnommen, von Bindegewebe und Fett

freipräpariert und gespült. Das Gewebe wurde in kleine Stücke geschnitten und in 150 µl

0,25 M Oxalsäure bei 100 °C gekocht. Nach 60 min wurden die Proben bei 10.000 x g

für 10 min zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Diese beiden Schritte wurden

mit 100 µl Oxalsäure wiederholt, die Überstände vereinigt und 100 µl als zu

analysierende Probe in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Aus α-Elastin Lösung

wurden die Standard-Proben mit bekanntem Elastin-Gehalt in Duplikaten hergestellt, die

im Folgenden wie die zu analysierenden Proben behandelt wurden. Zu allen Proben

wurde das gleiche Volumen „Elastin Precipitating Reagent“ gegeben und gevortext.

Nach 10 min wurde erneut zentrifugiert, der Überstand verworfen und mit einem

Wattestäbchen vorsichtig die restliche Flüssigkeit entfernt. Zu dem gelartigen Pellet

40

wurden 1 ml „Dye Reagent“ pipettiert und die Reaktionsgefäße für 90 min auf einem

Schüttler invertiert. Nach erneuter Zentrifugation und Entfernung der Flüssigkeit, war ein

rot-brauner Rückstand sichtbar. Um das ausgefallene Elastin zu lösen, wurden 250 µl

„Dye Dissociation Reagent“ zugegeben und gut gevortext, bis sich der Rückstand

vollständig gelöst hatte. Die Absorption der Proben und Standards (200 µl in

Mikrotiterplatte) wurde mittels Photometer bei einer Wellenlänge von 490 nm gemessen.

Anhand des gemessenen Standards konnte der Elastin-Gehalt der Aorten-Proben pro

mg Trockengewicht errechnet werden.

3.2.7.2 Kollagen-Assay

Die Quantifizierung des Strukturproteins Kollagen erfolgte nach einer erweiterten

Methode ursprünglich von Woessner (1961), modifiziert durch Stegemann and Stalder

(1967). Es handelt sich hierbei, wie auch beim Elastin-Assay, um eine kolorimetrische

Methode zur Konzentrationsbestimmung bestimmter Proteine. In diesem Fall wird die α-

Aminosäure Hydroxyprolin nachgewissen, die chemisch gebunden zu etwa 13,5% im

Kollagen vorkommt Durch Säurehydrolyse werden die Polypeptide des Kollagens in ihre

Aminosäuren zerlegt. Hydroxyprolin wird durch Chloramin T schrittweise zu Pyrrol

oxidiert, welches zusammen mit dem im Ehrlich’s Reagenz enthaltenen Farbstoff

Dimethylaminobenzaldehyd ein rosafarbenes Kondensationsprodukt bildet. Dieses

Chromophor hat sein Absorptionsmaximum bei 565 nm und kann photometrisch

vermessen werden.

Der thorakale Teil der Aorta wurde entnommen, von Bindegewebe und Fett

freipräpariert, gespült und in 1,5 ml-Reaktionsgefäße mit Gummidichtung überführt. Das

Gewebe wurde zunächst getrocknet, um das Trockengewicht zu bestimmen.

Anschließend wurde es in 6 M Salzsäure bei 115 °C für mindestens 18 h gekocht. Der

Überstand wurde abgenommen und vollständig in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Der

abgelagerte Rückstand wurde in 200 µl Wasser resuspendiert und die Proben 1:10 mit

Wasser verdünnt. Aus einer Trans-4-Hydroxy-L-Prolin-Stocklösung (1 mg/ml in Wasser)

wurde eine Verdünnungsreihe als Standard in Duplikaten hergestellt. Zu 200 µl der

Proben bzw. Standards wurden 100 µl Chloramin-T Reagenz pipettiert und in den

Reaktionsgefäßen mit offenem Deckel bei RT inkubiert. Nach 20 min wurde in alle

Proben 100 µl Ehrlich’s Reagenz gegeben und das Gemisch 15 min bei 60 °C inkubiert.

Daraufhin wurden erneut 50 µl 6 M HCl zugegeben und die Proben nochmals 15 min bei

60 °C inkubiert. Abschließend wurden 200 µl der Proben/Standards in eine

Mikrotiterplatte pipettiert und die Absorption in einem Photometer bei 560 nm gemessen.

Anhand des gemessenen Standards konnte der Hydroxyprolin-Gehalt und daraus der

Kollagen-Gehalt der Aorten pro mg Trockengewicht errechnet werden.

41

3.2.8 Immunhistochemie

Die Aorten und Arteria carotis wurden wie unter 3.2.1.4 beschrieben präpariert und in

ein Reaktionsgefäß mit 3% Paraformaldehyd (in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4)

überführt. Nach 1 h wurde das Gewebe mit 20% Saccharose versetzt und über Nacht

bei 4 °C im Kühlschrank gelagert. Die Aorten wurden mit PBS gewaschen und in

TissueTek eingebettet. Anschließend wurden mit einem Kryotom 10 µm Gewebsschnitte

angefertigt, diese luftgetrocknet und mit Antikörpern gegen die ß1-Untereinheit der NO-

GC zusammen mit einem Fluoresceinisothiocyanat-markierten-Antikörper für anti-α-

Glattmuskel-Aktin-Antikörper (α-SMA) versetzt. Der mß1-Antikörper wurde zuvor mit

einem Alexa 555-konjugierten Antikörper für eine Stunde inkubiert. Die Schnitte wurden

in Mowiol eingedeckt und mit einem Mikroskop mit Fluoreszenzfilterset für Alexa 555

und FITC ausgewertet.

3.2.9 Histologie

Der thorakale Teil der Aorta wurde wie oben beschrieben entnommen und von Fett-und

Bindegewebe und Blutresten befreit. Die präparierten Aorten wurden 24 h in 3%igem

gepuffertem Formalin eingelegt und bis zur Verwendung (maximal 1 Woche) in 1 M KCl

gelagert. Nach der Fixierung in Formalin wurde das Gewebe in einem Halbautomaten

über Nacht entwässert, um es anschließend in Paraffin einzubetten. Diese Blöcke waren

nach einem Tag ausgehärtet und wurden mit einem Schlittenmikrotom in die gewünschte

Dicke geschnitten.

Das Entparaffinieren der Schnitte erfolgte in Roth-Histol a, Roth-Histol b, Xylol und

Xylol/abs. Alkohol (1:1) für jeweils fünf Minuten. Daraufhin folgte eine absteigende

Alkoholreihe mit 96%, 75% und 50% Ethanol über je fünf Minuten. Vor der Färbung

wurden die Schnitte 2-3 mal mit Aqua dest. gespült.

Nach der Färbung und vor dem Einbetten wurde das Gewebe entwässert. Dazu wurden

die Schritte zum Entparaffinieren in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt, wobei die

Objektträger lediglich 1-2 min in eine aufsteigende Alkoholreihe gegeben wurden. Am

Ende wurden die Schnitte in DePex mit einem Deckglas eingedeckelt und unter dem

Abzug getrocknet. Mit einem Mikroskop wurden die Schnitte bei Durchlicht ausgewertet.

Die genauen Färbeprotokolle sind im Anhang aufgeführt.

3.2.9.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung ist eine gängige Methode zur morphologischen

Untersuchung von Gewebsstrukturen. Dabei werden alle sauren bzw. basophilen

Strukturen durch Hämalaun blau und alle basischen bzw. acidophilen Strukturen durch

42

Eosin rosa-rot gefärbt. Somit werden Zellkerne dunkelblau eingefärbt, während die

anderen Zellbestandteile hellrosa erscheinen.

Zur HE-Färbung wurden von den in Paraffin-eingebetteten Aorten 5 µm dicke Schnitte

angefertigt, diese auf Objektträger gezogen und zunächst wie oben beschrieben

entparaffiniert. Dann erfolgte die 10-minütige Färbung mit Hämalaun mit

anschließendem Bläuen unter Leitungswasser. Durch den niedrigen pH-Wert der

Hämatoxylin-Lösung erscheinen die Zellkerne zunächst rötlich-braun; erst durch das

Bläuen und damit durch erhöhen des pH-Wertes schlägt der Farbton ins blau-violett um.

Vor dem Färben mit Eosin (5 min) wurden die Schnitte zweimal mit dest. Wasser gespült.

Zum Schluss wurden die Präparate entwässert und mit DePex eingedeckelt.

3.2.9.2 Pikrosiriusrot-Färbung

Bei dieser Färbemethode handelt sich um eine Einzelfärbung mittels Pikrosiriusrot (PSR)

zum Nachweis von Kollagen. Siriusrot ist ein stark anionischer Farbstoff, der mit den

Sulfonsäuregruppen des Kollagens reagiert und dieses dadurch rot einfärbt (Junqueira

et al., 1978).

Für diese Färbemethode wurden 7 µm dicke Gewebsschnitte auf Objektträgern

gezogen, entparaffiniert und genau 20 min in PSR-Lösung gefärbt. Die gefärbten

Präparate wurden entwässert und eingedeckelt.

3.2.10 Statistik

Von allen Daten wurde der Mittelwert mit SEM („standard error of the mean“) als

Fehlerbalken ermittelt. Die statistische Auswertung der Versuche erfolgte mit der

Software GraphPad Prism. Zuerst wurden die Daten mit dem Kruskal-Wallis Test auf

Normalverteilung untersucht und anschließend ein zweiseitiger Mann-Whitney-U Test

durchgeführt. Wurden nur 2 Gruppen miteinander verglichen, wurde lediglich der Mann-

Whitney-U Test durchgeführt.

43

4 Ergebnisse

Die NO/cGMP-vermittelte Signalkaskade trägt entscheidend zur Regulation des Tonus

der glatten Muskulatur in vielen Organen bei. Der Tonus ergibt sich aus einem

komplexen Zusammenspiel von Relaxation und Kontraktion der glatten Muskelzellen.

Das Signalmolekül NO vermittelt dabei durch Stimulierung der NO-GC und Synthese

des sekundären Botenstoffs cGMP die Relaxation der Zellen. Im ersten Teil dieser Arbeit

sollte die PDE3 für den cAMP/cGMP-Crosstalk in der glatten Muskulatur der Aorta

untersucht werden. In einem weiteren Teil sollte die Rolle der NO-GC bei der Steifigkeit

der Gefäße erforscht werden.

4.1 Ausschnitt der NO-GC

Im ersten Teil dieser Arbeit sollte die Deletion der NO-GC in der glatten Gefäßmuskulatur

überprüft werden. Dafür wurden zwei verschiedene Gefäße gewählt: zum einen die Aorta

als größte Arterie und zum anderen die Arteria carotis.

4.1.1 Immunhistochemie der glatten Muskulatur

Zunächst wurden immunhistochemische Analysen durchgeführt. Dafür wurden glatte

Muskelzellen (SMC) von Aorta und A. carotis mit einem spezifischen Antikörper gegen

α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA; grüne Färbung) gefärbt. Die Expression der NO-GC wurde

mit einem spezifischen Antikörper gegen deren ß1-Untereinheit nachgewiesen (ß1; rote

Färbung). Als Kontrolle wurde ein heterozygotes Tier verwendet, das mindestens 50

Tage zuvor mit Tamoxifen behandelt wurde. Hierdurch sollte untersucht werden, ob

Tamoxifen in Mäusen einen unspezifischen Effekt hervorruft. Wie in den Abbildungen 5

und 6 zu sehen, führte die Inkubation mit dem ß1-Antikörper zu starken Signalen in der

Aorta und A. carotis der Kontroll-Tiere. Es bestätigte sich auch, dass Tamoxifen in

Kontroll-Tieren keinen Einfluss auf die NO-GC-Expression hatte. Die Inkubation mit dem

α-SMA-Antikörper zeigte starke Signale in den SMC der beiden Gefäße aller drei

Genotypen. Jedoch trat ausschließlich in den Kontroll-Gefäßen eine Kolokalisation der

NO-GC- und α-SMA-Immunfluoreszenzen auf, was die Expression der NO-GC in SMC

bestätigt. Die Gefäße von GCKO- und SMC-GCKO-Mäusen zeigten keine NO-GC-

spezifischen Immuno-Signale in den α-SMA-positiven Zellen. Zudem konnte in der

Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden, dass auch in den kleinen Gefäßen und Kapillaren

im Musculus cremaster von GCKO-Tieren kein NO-GC-Signal nachweisbar ist. Aus

diesen immunhistochemischen Analysen lässt sich schlussfolgern, dass die NO-GC in

Abb. 5: Immunhistochemische Analyse des NO-GC-Ausschnitts in der AortaAorten von Kontroll-, GCKO- und SMC-GCKO-Tieren wurden mit PFA fixiert, in

Flüssigstickstoff schockgefroren und mit Hilfe des Kryotoms Schnitte (20 µm)

angefertigt. Die Schnitte wurden mit Antikörpern gegen NO-GC und α-SMA

gefärbt. (ctrl = Kontroll-Tiere)

NO

-GC

Üb

erla

ger

un

gα-

SM

A E

GCKO SMC-GCKOctrl

50 µm

44

NO

-GC

Üb

erla

ger

un

gα-

SM

A

GCKO SMC-GCKOctrl

50 µm25 µm

Abb. 6: NO-GC-Ausschnitt in der Arteria carotis

A. carotis von Kontroll-, GCKO- und SMC-GCKO-Tieren wurden mit PFA fixiert, in

Flüssigstickstoff schockgefroren und mit Hilfe des Kryotoms Schnitte (20 µm)

angefertigt. Die Schnitte wurden mit Antikörpern gegen NO-GC und α-SMA gefärbt.

(ctrl = Kontroll-Tiere)

45

46

der glatten Gefäßmuskulatur der beiden KO-Mauslinien tatsächlich vollständig deletiert

ist.

4.1.2 NO-induzierte Relaxation der Gefäße

Als nächstes wurde das Fehlen der NO-GC funktionell in Organbadexperimenten

untersucht. Dafür wurden Aorten-Ringe im Organbad auf 5 mN, die A. carotis-Ringe auf

2 mN vorgespannt und durch Zugabe von Phenylephrin, einem α1-Adrenorezeptor-

Agonisten, eine Kontraktion der glatten Muskulatur induziert. Das geschah in

Anwesenheit von L-NAME, zur Blockade der endothelialen NO-Synthase, und

Diclofenac, einem Hemmstoff der Cyclooxygenasen COX-1 und COX-2. Durch diese

beiden Inhibitoren wird die endogene Produktion von NO und eine durch Prostaglandine

vermittelte Relaxation unterbunden. Nach Erreichen eines stabilen Plateaus wurden

steigende Konzentrationen des NO-Donors Glyceroltrinitrat (GTN) hinzugegeben und

die hervorgerufenen Relaxationen gemessen. Die Werte der Kontroll-Tiere wurden auf

100% gesetzt (Abb. 7 und 8). In den Kontroll-Aorten zeigte sich wie zu erwarten eine

konzentrationsabhängige NO-induzierte Relaxation (siehe Abb. 7A). Im Gegensatz dazu

blieb in den KO-Aorten die Relaxation durch den NO-Donor GTN aus. Die statistische

Auswertung der Relaxations-Kurven bestätigte den Verlust der NO-induzierten

Relaxation in GCKO- und SMC-GCKO-Aorten (siehe Abb. 7B). Die Organbadversuche

mit A. carotis lieferten die gleichen Ergebnisse: lediglich die Kontroll-Gefäße relaxierten

bei Zugabe von GTN; die A. carotis der KO-Tiere blieben kontrahiert (siehe Abb. 8). Der

Verlust der NO-vermittelten Relaxation in den KO-Modellen bestätigt somit die

vollständige Deletion der NO-GC und damit das Ausschalten der NO/cGMP-

Signalkaskade in der glatten Gefäßmuskulatur.

4.2 cAMP/cGMP-Crosstalk

Durch die Deletion der NO-GC kommt es zu einer Verminderung der NO-stimulierten

cGMP-Synthese (Friebe et al., 2007). Der sekundäre Botenstoff cGMP hat viele

Effektorproteine; so reguliert er z.B. Phosphodiesterasen (PDEs) in ihrer Akitivität. PDEs

katalysieren nicht nur den Abbau von cGMP, sondern auch den des zweiten sekundären

Botenstoffs cAMP. Sie stellen somit eine Verknüpfung der beiden Signalwege her.

Deshalb sollte im Weiteren der Einfluss der reduzierten cGMP-Synthese auf die cAMP-

induzierte Signalkaskade untersucht werden.

A

B

ctrl

GCKO

SMC-GCKO

0

25

50

75

100

0 0,001 0,01 0,1 1 10

GTN (µM)

Ko

ntr

ak

tio

n (

%)

* ** ** ** **

Abb. 7: Verlust der NO-induzierten Relaxation in KO-AortenA) Original-Spuren der GTN-vermittelten Relaxation von Aorten der GCKO-, SMC-

GCKO- und Kontroll-Tiere. Aortenringe wurden mit PE (1 µM) vorkontrahiert und

durch steigende GTN-Konzentrationen relaxiert.

B) Quantitative Analyse der NO-induzierten Relaxation. Gezeigt sind Mittelwerte

± SEM von n=5 (*p<0,05; **p<0,01; gilt für beide KOs). (ctrl = Kontroll-Tiere)

PE

GCKO

ctrl

GTN (µM)

0,001

10 min

2 m

N

SMC-GCKO

10

47

Abb. 8: NO-induzierten Relaxation der Arteria carotis

A) Original-Spuren der GTN-vermittelten Relaxation der A. carotis von GCKO-,

SMC-GCKO- und Kontroll-Tieren. Ringe der A. carotis wurden mit PE (1 µM)

vorkontrahiert und durch steigende Konzentrationen von GTN relaxiert.

B) Quantitative Analyse der NO-induzierten Relaxation. Gezeigt sind Mittelwerte

± SEM von n=5 (*p<0,05, gilt für beide KOs). (ctrl = Kontroll-Tiere)

A

B

GCKO

ctrl

SMC-GCKO

PE

10 min

10

GTN (µM)

0,001

1 m

N

ctrl

GCKO

SMC-GCKO

0

25

50

75

100

0 0,001 0,01 0,1 1 10

GTN (µM)

Ko

ntr

ak

tio

n (

%)

* * **

48

49

4.2.1 cAMP-Signalkaskade

4.2.1.1 Messung des cAMP-Spiegels mittels Radioimmunoassay

Zunächst sollte festgestellt werden, ob das Fehlen der NO-GC die cAMP-Produktion und

damit den cAMP-Gehalt beeinflusst. Dafür wurde in Aorten-Homogenaten mittels

Radioimmunoassay (RIA) die cAMP-Konzentration gemessen. Zunächst wurde die

Proteinkonzentration der Aorten-Homogenate bestimmt, um den cAMP-Gehalt

anschließend auf das Gesamtprotein zu normieren und so die Konzentrationen

vergleichen zu können. Der basale cAMP-Spiegel in den Aorten der GCKO- und

SMC-GCKO-Tiere unterschied sich mit 0,22 bzw. 0,32 pmol/mg Protein nicht signifikant

von dem der Kontroll-Tiere mit 0,3 pmol/mg Protein (siehe Abb. 9). Nach Stimulation der

Adenylyl-Cyclase (AC) mit 1 µM des nicht-selektiven Stimulators Forskolin stieg der

cAMP-Gehalt etwa um das 100-fache auf ca. 30 pmol/mg Protein an. Jedoch ergab sich

auch hier kein Unterschied zwischen den Kontroll- und KO-Tieren. Somit scheinen die

basale sowie die Forskolin-stimulierte Enzymaktivität der AC und damit die cAMP-

Produktion unbeeinflusst von der Deletion der NO-GC zu sein.

4.2.1.2 Effekt von Forskolin auf die Relaxation der Aorta

Um eine eventuelle Änderung der AC-Aktivität im ganzen Gewebe zu untersuchen,

wurde als nächstes die AC in der glatten Muskulatur der Aorta in Organbad-

Experimenten mit Forskolin als AC-Aktivator untersucht. Dafür wurden Aorten-Ringe in

die Organbadkammern eingespannt und unter Anwesenheit von Diclofenac und L NAME

mit Phenylephrin (PE) kontrahiert. Anschließend wurde Forskolin in steigenden

Konzentrationen hinzugegeben und die hervorgerufene Relaxation gemessen. Wie die

Originalspuren in Abbildung 10 zeigen, relaxierten die Aorten aller Genotypen bereits bei

einer Forskolin-Konzentration von 0,01 µM. Steigende Aktivator-Konzentrationen führten

zu einer stärkeren Relaxation der Aorten-Ringe. Die statistische Auswertung der

Konzentrations-Wirkungs-Kurven (Abb. 11) zeigt keinen Unterschied zwischen den

Aorten der beiden KO-Mauslinien und denen der Kontroll-Tiere. Somit wird deutlich, dass

die cAMP-vermittelte Relaxation der Aorta nach Stimulation mit Forskolin durch die NO-

GC-Deletion nicht beeinflusst wird.

4.2.2 PDE3-vermittelter cAMP/cGMP-Crosstalk

Da es auf Ebene der cAMP-Bildung nicht zu einer Veränderung kam, sollte im Folgenden

der Abbau des Botenstoffs untersucht werden. Phosphodiesterasen (PDEs) bauen

cAMP und/oder cGMP ab und stellen somit eine Verknüpfung dieser beiden Signalwege

her. Von besonderer Bedeutung sind hierbei PDEs mit gemischter Substratspezifität, wie

Abb. 9: Basal und Forskolin-stimulierte cAMP-ProduktionDer basale oder durch Forskolin-stimulierte cAMP-Gehalt in Aortenhomogenaten dervon Kontroll-, GCKO- und SMC-GCKO-Tieren wurde mittels Radioimmunoassaybestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM von n=5. (ctrl = Kontroll-Tiere)

cA

MP

(p

mo

l/m

g P

rote

in)

ctrl GCKO SMC-GCKO

60

30

45

Forskolin - + - +- +

0,4

0,2

0

50

Abb. 10: Effekt von Forskolin auf die Relaxation der AortaAbgebildet sind repräsentative Original-Spuren einer Forskolin Konzentrations-Wirkungskurve von A) GCKO und B) SMC-GCKO mit ihren jeweiligenGeschwistertieren. Aortenringe wurden in Anwesenheit von L-NAME und Diclofenacmit PE (1 µM) kontrahiert und durch die Zugabe steigender Forskolin-Konzentrationen relaxiert.

B

30 min

Forskolin (µM)

0,01 1 100,1

IBMX

PE5

mN

A

5 m

N

30 min

1010,10,01

IBMX

PE

Forskolin (µM)

WT

GCKO

Kontrolle

SMC-GCKO

51

Abb. 11: Forskolin-induzierte Relaxation der AortaStatistische Auswertung der zuvor gezeigten Original-Spuren einer Forskolin-Konzentrations-Wirkungskurve von GCKO-, SMC-GCKO- und Kontroll-Tieren.Aufgrund der Übereinstimmung der WT- und Kontrollwerte wurde lediglich dieKontrollkkurve (ctrl) zum Vergleich herangezogen. Die Werte repräsentierenMittelwerte ± SEM von n=6.

0 0,001 0,01 0,1 1 10

Forskolin (µM)

ctrlGCKOSMC-GCKO

100

0

50

Ko

ntr

ak

tio

n (

%)

25

75

52

53

beispielsweise die PDE3, die auch als cGMP-inhibierte cAMP-abbauende PDE

bezeichnet wird (Bender & Beavo, 2006). Daher wurde der Einfluss der NO-GC-Deletion

auf die PDE3 und den PDE3-vermittelten cAMP/cGMP-Crosstalk untersucht.

4.2.2.1 PDE3-Expression in der glatten Gefäßmuskulatur

Da von der PDE3 zwei Isoformen (PDE3A und PDE3B) existieren, sollte zunächst

untersucht werden, welche der beiden Isoenzyme in der Gefäßmuskulatur vorkommt.

Aus der Literatur ist bekannt, dass die PDE3A vornehmlich in glatter Muskulatur

lokalisiert ist, während die PDE3B stark in Fett- und Nierengewebe exprimiert wird

(Bender & Beavo, 2006). Daher wurden als Positivkontrollen die glatte Muskulatur der

Aorta zum Nachweis der PDE3A und Nierengewebe mit dem umgebenen Fett zum

Nachweis der PDE3B gewählt. Die Proteine wurden mittels spezifischer Antikörpern

gegen PDE3A und PDE3B im Western Blot sichtbar gemacht. In Abbildung 12A ist das

Ergebnis dieses Western Blots dargestellt. Der PDE3A-Antikörper zeigt deutliche

Proteinbanden in der Aorta bei 100 und 120 kDa und auch im Nierenhomogenat bei

100 kDa. Im Gegensatz dazu ist bei Verwendung des PDE3B-Antikörpers nur im

Nierenhomogenat eine Proteinbande mit einem apparenten Molekulargewicht von

124 kDa zu erkennen. Im Aortenhomogenat hingegen bindet der PDE3B-Antikörper

nicht.

Um dieses Ergebnis zu überprüfen wurden immunhistochemische Färbungen

durchgeführt. Dafür wurden PFA-behandelte Aorten schockgefroren und mit Hilfe des

Kryotoms 20 µm dicke Gewebsschnitte angefertigt. Die Gewebsschnitte wurden mit

einem spezifischen Antikörper gegen α-Glattmuskel-Aktin (α-SMA; grüne Färbung)

gefärbt. Die Expression der PDE3A bzw. B wurde mit den spezifischen Antikörpern

nachgewiesen, die bereits im Western Blot verwendet wurden (PDE3A bzw. PDE3B;

rote Färbung). Abbildung 12B zeigt die Färbung mit PDE3A- und α-SMA-Antikörpern.

Die blauen Punkte stellen die Zellkerne dar, die zuvor mit DAPI angefärbt wurden. Eine

Gelbfärbung der Zellen zeigt eine Kolokalisation von PDE3A und α-SMA. Es wird somit

deutlich, dass das A-Isoenzym der PDE3 in glatten Muskelzellen vorkommt. Zusätzlich

ist die PDE3A in einer Zellschicht exprimiert, die nicht α-SMA-positiv ist. Hierbei handelt

es sich um die einschichtige, aus Endothelzellen bestehende Tunica intima (siehe Pfeil

in Abb. 12B). Die PDE3A ist in der Aorta somit nicht nur in glatten Muskelzellen, sondern

auch Endothelzellen exprimiert. Betrachtet man im Gegensatz dazu die Färbung mit

PDE3B (Abb. 12C) in Kombination mit α-SMA, lässt sich keine Kolokalisation der beiden

Proteine erkennen. Stattdessen ist bei Einsatz des PDE3B-Antikörpers ein Signal in den

die Aorta umgebenden Fettzellen zu sehen. Diese immunhistochemischen Analysen

bestätigen daher die im Western Blot erhobenen Ergebnisse. Insgesamt zeigt sich, dass

Abb. 12: Expression der PDE3A) Für die Western Blot-Analyse wurden Aorta- und Nierenhomogenate von einem

WT-Tier auf ein 7,5%-iges Gel aufgetragen. Mit spezifischen Antikörpern wurde die

Expression von PDE3A und PDE3B untersucht.

B), C) Aorten wurden entnommen, in PFA fixiert und Kryoschnitte (20 µm)

angefertigt. Anschließend wurden die Schnitte mit spezifischen Antikörpern gegen α-

SMA und PDE3A (B) bzw. PDE3B (C) angefärbt. Die blauen Punkte stellen die mit

DAPI angefärbten Zellkerne dar. Der weiße Pfeil in B) zeigt die PDE3A-Expression

in einer nicht α-SMA positiven Zellschicht.

B

A

C

α-SMA PDE3B Überlagerung

α-SMA PDE3A Überlagerung

Aorta

PDE3A

130[kDa]

100

70

PDE3B

Niere

130[kDa]

100

70

Aorta Niere

54

55

lediglich die PDE3A und nicht die PDE3B in den glatten Muskelzellen der Gefäße

exprimiert wird. Aus diesem Grund wurde im Weiteren nur noch die PDE3A untersucht.

4.2.2.2 Rolle der PDE3A bei der Relaxation der Aorta

Nach dem Nachweis der PDE3A-Expression in der Aorta sollte die Wirkung des Enzyms

bei der Relaxation der SMC in der Aorta untersucht werden. Zur Untersuchung der

Wirkweise von Enzymen können diese pharmakologisch mittels Akitvatoren stimuliert

oder durch Hemmstoffen blockiert werden. Da es für die PDE3 keine Aktivatoren gibt,

mussten Hemmstoffe eingesetzt werden. Als Hemmstoffe der PDE3 eignen sich Milrinon

und Cilostamid. Um die Wirkung der PDE3A-Blockade auf die Relaxationsfähigkeit der

Aorta zu untersuchen, wurden Aorten-Ringe in die mit KH-Lösung gefüllten

Organbadkammern eingespannt und in Anwesenheit von Diclofenac und L-NAME mit

Phenylephrin kontrahiert. Nach dem Erreichen eines stabilen Kontraktionsniveaus

wurden steigende Konzentrationen des PDE3-Hemmers Milrinon zugegeben. Bereits in

den Originalkurven erkennt man, dass durch steigende Milrinon-Konzentrationen eine

Relaxation der Aorta induziert wird (Abb. 13). Die statistische Auswertung bestätigt diese

Beobachtung und zeigt zusätzlich, dass die Relaxationskurven von GCKO- und SMC-

GCKO-Tieren nach links verschoben sind (Abb. 14). So sind beispielweise bei einer

Milrinon-Konzentration von 0,1 µM die Aorten der beiden KO-Tiere bereits um etwa 40%

relaxiert, während die Aorta der Kontroll-Tiere noch ein Kontraktionsniveau von 90% hat.

Die Sensitivität der PDE3A im Aorten-Gewebe der Kontroll-Tiere entsprach mit einem

IC50-Wert von 0,8 µM in etwa dem publizierten Wert für das gereinigte Enzym (Harrison

et al., 1986). Der IC50-Wert der KO-Tiere betrug lediglich 0,2 µM. Somit ist in den KO-

Aorten weniger PDE3-Blocker notwendig, um die gleiche Relaxation zu erreichen wie im

Kontroll-Gewebe. Auch bei Verwendung des zweiten PDE3A-Hemmstoffs Cilostamid

kam es zu einer Linksverschiebung der Relaxationskurven der Aorten der beiden KO-

Mauslinien (Daten nicht gezeigt). Die Linksverschiebung deutet auf eine Veränderung

der PDE3A-vermittelten Signalweiterleitung in den SMC der NO-GC-defizienten Mäusen

hin.

4.2.2.3 Effekt von ODQ auf die Milrinon-induzierte Relaxation

Im nächsten Schritt sollte untersucht werden, wie sich ein akutes Abschalten der NO-

GC auf die PDE3A-vermittelte Relaxation auswirkt. Dafür wurde ein pharmakologischer

Weg gewählt und die NO-GC durch den spezifischen Inhibitor ODQ blockiert. In die mit

Krebs-Henseleit-Lösung gefüllten Organbadkammern wurden die Aorten-Ringe

eingespannt, äquilibriert und Diclofenac und L-NAME zugegeben. Nach Zugabe von

Phenylephrin (1 µM) und dem Erreichen eines stabilen Kontraktionsniveaus erfolgte die

Abb. 13: Effekt von Milrinon auf die Relaxation der AortaAbgebildet sind repräsentative Original-Spuren einer Mirinon-Konzentrations-

Wirkungskurve von Aorten aus A) GCKO und B) SMC-GCKO mit ihren jeweiligen

Geschwistertieren. Aortenringe wurden in Anwesenheit von L-NAME und Diclofenac

mit PE (1 µM) kontrahiert und durch die Zugabe steigender Milrinon-Konzentrationen

relaxiert.

B

A

30 minSMC-GCKO

Kontrolle

PE

IBMX

2 m

N

30 min

WT

GCKO

IBMX

PE

Milrinon (µM)

0,10,01 101

2 m

N

Milrinon (µM)

0,01 1010,1

56

Abb. 14: Milrinon-induzierte Relaxation der AortaStatistische Auswertung der zuvor gezeigten Original-Spuren einer Mirinon-

Konzentrations-Wirkungskurve von Aorten aus Kontroll-, GCKO- und SMC-GCKO-

Tieren. Die Werte repräsentieren Mittelwerte ± SEM von n=6 Tieren (*/+p<0,05;

**/++p<0,01). (ctrl = Kontroll-Tiere)

+

*SMC-GCKO

0

25

50

75

100

0 0,001 0,01 0,1 1 10

Ko

ntr

ak

tio

n (

%)

Milrinon (µM)

GCKO

ctrl

**

**

++

57

58

Inkubation mit ODQ (10 µM). 20 min später wurden steigende Konzentrationen Milrinon

zugegeben und die dadurch ausgelöste Relaxation gemessen. Milrinon führte in WT-

und GCKO-Aorta zu einer konzentrationsabhängigen Relaxation (Abb. 15). Die

Relaxationskurve der Aorta von GCKO-Mäusen war jedoch nach Links verschoben. Die

Relaxationskurve der GCKO-Tiere nach ODQ-Behandlung zeigte, wie zu erwarten,

keinen Unterschied zur Kurve der unbehandelten GCKO-Aorta; beide Kurven lagen

direkt aufeinander. Im Gegensatz dazu zeigte die Relaxationskurve der Aorten aus WT-

Tieren mit ODQ eine wie zu erwartende Linksverschiebung. Diese Linksverschiebung

ergibt sich dadurch, dass Milrinon, durch die Zugabe von ODQ, nicht mit cGMP um die

PDE3A-Bindung konkurrieren muss und somit weniger Milrinon nötig ist, um den

gleichen Effekt wie im unbehandelten Kontroll-Gewebe hervorzurufen. Die Annahme,

dass die Kontroll-Kurve durch ODQ so weit nach links verschoben wird, dass sie auf die

des GCKO-Tieres fällt, trat nicht ein. Dieser Unterschied ergibt sich aus den

Versuchsbedingungen: Die NO-GC-Deletion im GCKO-Tier stellt eine chronische

Hemmung dar, die nicht der akuten Hemmung durch ODQ im Kontroll-Tier entspricht.

Insgesamt wird deutlich, dass die PDE3A in den GCKO-Tieren im Vergleich zu den

Kontroll-Tieren durch einen anderen Mechanismus beeinflusst wird. Deshalb wurde in

den nachfolgenden Versuchen nach Veränderung der PDE3A-Expression und -Aktivität

gesucht.

4.2.2.4 Abnahme der PDE3A-Expression

Zunächst wurde die Expression der PDE3A in der Aorta näher untersucht. Dafür wurden

aus den Aorten der verschiedenen Genotypen Homogenate hergestellt, die darin

enthaltenen Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine

Nitrozellulosemembran übertragen. Anschließend wurden unter Verwendung

spezifischer Antikörper und Chemilumineszenz die Proteine PDE3A, NO-GC und

GAPDH sichtbar gemacht. Das „House-keeping“-Protein GAPDH diente hierbei zur

Quantifizierung des PDE3-Signals. „House-keeping“-Gene codieren für Proteine, die

essentiell für die Aufrechterhaltung der Zellfunktionen sind. Sie unterliegen keiner

Regulation und werden unabhängig vom Zelltyp, der Zellzyklusphase oder äußeren

Einflüssen konstitutiv exprimiert (Eisenberg & Levanon, 2013). Sie können daher zur

Quantifizierung für die Expression anderer Proteine herangezogen werden.

In Abbildung 16A ist ein exemplarischer Western Blot dargestellt. Hier ist zu erkennen,

dass das PDE3A-Signal in GCKO- und SMC-GCKO-Homogenaten im Vergleich zu den

Homogenaten der Kontroll-Tiere deutlich reduziert ist. Diese Reduktion wurde durch die

statistische Auswertung bestätigt. Die PDE3A-Expression in den Aorten-Homogenaten

der GCKO- und SMC-GCKO-Mäuse war im Vergleich zu den Homogenaten der Kontroll-

Abb. 15: Effekt von ODQ auf die Relaxation der AortaAorten-Ringe aus GCKO- und Kontroll-Tieren wurden mit PE (1 µM) kontrahiert

und anschließend 20 min mit ODQ inkubiert. Anschließend wurden die Ringe mit

steigenden Konzentrationen von Milrinon relaxiert. In A) sind die Orginal-Spuren

von WT- und GCKO-Aorten dargestellt. Abbildung B) zeigt die statistische

Auswertung mit Mittelwerten ± SEM von je n=6 (*p<0,05). Zum Vergleich wurden

die in Abb. 14 gezeigten Daten ohne ODQ in B) eingefügt.

B

A

2 m

N

30 min

IBMX

PE

Milrinon (µM)

0,10,01 101ODQ

2 m

N

30 min

IBMX

PE

ODQ

WT

GCKO

Milrinon (µM)

0,10,01 101

0

25

50

75

100

0 0,001 0,01 0,1 1 10

Ko

ntr

ak

tio

n (

%)

Milrinon (µM)

GCKOGCKO+ODQ

WTWT+ODQ

*

*

59

Abb. 16: Quantifizierung der PDE3A-ExpressionMittels Western Blot wurde die Expression der PDE3A in Aorta-Homogenaten der

verschiedenen Genotypen untersucht. Als Ladekontrolle und zur Quantifizierung

diente das House-keeping Gen GAPDH.

A) Exemplarischer Western Blot für die in B) gezeigte Quantifizierung.

B) Quantifizierung der Western Blot Analysen. Die Werte entsprechen dem

Mittelwert ± SEM von n=6. (ctrl = Kontroll-Tiere)

B

A

0,5

ctrl GCKO0,0

1,0

PD

E3

A E

xp

res

sio

n(r

el.

Ein

he

ite

n)

* *

SMC-GCKO

ctr

l

PDE3A(120 kDa)

GAPDH(37 kDa)

NO-GC-β1

(70 kDa)

GC

KO

SM

C-G

CK

O

60

61

Tiere um 50% reduziert (Abb. 16B). Zusätzlich wurde in den Homogenaten die NO-GC

mittels spezifischem Antikörper nachgewiesen. Wie bereits in Abbildung 5

immunhistochemisch dargestellt, konnte lediglich in Aorten von Kontroll-Mäusen die

Expression der NO-GC bestätigt werden. Im Gegensatz dazu gab es in den beiden KO-

Aorten kein NO-GC-Signal, da die NO-GC in der Aorta dieser beiden KO-Mäuse nicht

mehr exprimiert wird.

Im Weiteren sollte untersucht werden, ob der Rückgang der PDE3A-Expression in

direktem Zusammenhang mit der NO-GC-Deletion stand. Hierzu wurde die PDE3A-

Expression mit der zeitabhängigen Abnahme der NO-GC-Expression in SMC-GCKO-

Aorten verknüpft (Abbildung 17). Das Zeitschema für diesen Versuch ist in Abbildung

17A dargestellt. Mäusen, die die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des SMMHC-

Promotors exprimieren, wurde an fünf aufeinanderfolgenden Tagen Tamoxifen (1 mg

i.p.) injiziert. Der letzte Tag der Tamoxifen-Injektion wurde als Tag 0 definiert.

Unbehandelte heterozygote Glattmuskel-spezifische Tiere dienten als Kontrolle (pre).

Die Western Blot-Untersuchungen fanden 5 und 50 Tage nach den Tamoxifen-

Injektionen statt. Dafür wurden Aorten aus den gespritzten Tieren entnommen,

Homogenate hergestellt und die enthaltenen Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt.

Nach dem Blotten der Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran wurden NO-GC und

PDE3A mittels spezifischer Antikörper sichtbar gemacht. Abbildung 17B zeigt die

statistische Auswertung dieses Versuchs. Es wird deutlich, dass die PDE3A-Expression

bereits nach 5 Tagen um 50% reduziert war. Dies ging einher mit einer deutlichen

Reduktion der NO-GC-Expression von 80% an Tag 5. Bis zu Tag 50 reduzierte sich die

NO-GC-Expression um weitere 20% (von 20% auf 0%), während sich die PDE3A-

Expression nicht mehr änderte. Die 50%ige Abnahme der PDE3A-Expression verlief

also parallel mit dem Rückgang der NO-GC-Expression. In unserer Arbeitsgruppe

konnte zuvor bereits nachgewiesen werden, dass der Rückgang der NO-GC-Expression

mit einer Reduktion der NO-stimulierten cGMP-Konzentration einhergeht (Groneberg et

al., 2010). Somit lässt sich schlussfolgern, dass die Reduktion der PDE3A-Exression

durch die NO-GC-Deletion und dem damit verbundenen Rückgang der cGMP-Synthese

bedingt ist.

4.2.2.5 PDE3A-Aktivität

Als nächstes sollte untersucht werden, ob die verminderte PDE3A-Expression in der

glatten Muskulatur auch mit einer Reduktion ihrer Enzymaktivität einhergeht. Dafür

wurden erneut Aorten-Homogenate hergestellt und die cAMP-abbauende Aktivität der

PDE3A im PDE-Assay gemessen. Die Bestimmung der PDE3A-Aktivität wurde bei

einer) durchgeführt. Hierbei wurde eine relativ niedrige Substrat-Konzentration (1 µM

B

A

Abb. 17: Zusammenhang zwischen NO-GC- und PDE3A-ExpressionA) Zeit-Schema zur Generierung Glattmuskel-spezifischer Mäuse (SMC-GCKO).

An fünf aufeinanderfolgenden Tagen wurden Cre-exprimierende SMMHC-Mäusen

jeweils 1 mg Tamoxifen intraperitoneal injiziert. Der letzte Tag der Tamoxifen-

Injektion wurde als Tag 0 definiert. Unbehandelte heterozygote Glattmuskel-

spezifische Tiere dienten als Kontrolle (pre). Die Western Blot-Untersuchungen

fanden 5 und 50 Tage nach den Tamoxifen-Injektionen statt.

B) Western Blot-Analysen von Aortenhomogenaten von SMC-GCKO-Tieren. Zu

sehen sind die Abnahme der NO-GC- und PDE3A-Expression 5 bzw. 50 Tage nach

Tamoxifen-Injektion. Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM von n=6.

NO-GC

5 50pre

100

0

50

Tage nach Tamoxifen-Injektion

PDE3A

PD

E3

A /

N

O-G

C

Ex

pre

ss

ion

(%

)

Tage nach denTamoxifen-Injektionen

Tamoxifen

pre 0 5 50

62

63

cAMP) gewählt. Damit konnte gewährleistet werden, dass lediglich die PDE3A am

Abbau beteiligt ist, da andere cAMP-abbauende PDEs erst bei deutlich höheren

Konzentrationen katalytisch aktiv sind (Bender & Beavo, 2006). Durch die Aktivität der

PDE3A wird in den cAMP-Molekülen die Phosphodiesterbindung zwischen der

Phosphatgruppe und der Ribose gespalten. Das so entstandene 32P-AMP wird

anschließend durch die Alkalische Phosphatase in Adenosin und 32P-Phosphat

gespalten. Die abgespaltenen freien radioaktiven Phosphatreste werden in einem

β-Counter gezählt und die Enzymaktivität anhand des abgebauten cAMPs pro mg

Gesamtprotein berechnet. Bei der Auswertung wurde bezüglich der Kontroll-Tiere

normiert. In Abbildung 18 ist die statistische Auswertung dieses Versuches dargestellt.

Es ist deutlich zu erkennen, dass in beiden KO-Mauslinien die PDE3-Aktivität gegenüber

den Kontroll-Tieren signifikant reduziert war. In SMC-GCKO-Mäusen betrug diese

Reduktion ca. 30%, während in GCKO-Mäusen die Aktivität sogar um 50% reduziert war.

Diese Reduktion geht einher mit der verminderten PDE3A-Expression in beiden

Mauslinien (siehe Abb. 16).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es durch Deletion der NO-GC in glatten

Muskelzellen keine Beeinflussung der AC und damit des cAMP-Signalweges gibt.

Allerdings kommt es in Folge der Deletion zu einer Verminderung der PDE3A-

Expression und -Aktivität.

4.3 Einfluss der NO-GC auf die Steifigkeit der Aorta

Aus der Arbeitsgruppe ist bekannt, dass sowohl durch den globalen, wie auch durch den

zellspezifischen glattmuskulären Knock-out der NO-GC einen Blutdruckanstieg um

30 mmHg erfolgt. Somit sollte im dritten Teil dieser Arbeit untersucht werden, in welcher

Verbindung die NO-GC-Deletion mit der auftretenden Blutdruckerhöhung steht. Da eine

Erhöhung des Blutdrucks mit einer erhöhten Gefäßsteifigkeit einhergeht, wurden

verschiedene Versuche zur Steifigkeit der Aorta und zum Aufbau ihrer Wand

durchgeführt.

4.3.1 Messung des spezifischen Herzgewichtes

Bisher konnte gezeigt werden, dass der arterielle Blutdruck in beiden KO-Mauslinien im

Vergleich zu den Kontroll-Tieren deutlich erhöht war. Die verminderte

Relaxationsfähigkeit der Gefäße und der Hypertonus erfordern eine Anpassung des

Herzens, um weiterhin eine kontinuierliche Versorgung der Organe und der Peripherie

mit Sauerstoff und Nährstoffen zu gewährleisten. Deswegen wurde untersucht, ob es in

Folge der Druckbelastung zu einer Myokardhypertrophie kam. Dazu wurden der linke

Ventrikel (LV) und das gesamte Herz der KO- und WT-, und Kontroll-Tiere gewogen.

Abb. 18: cAMP-abbauende PDE3A-Aktivität

Aus Aortengewebe wurden Homogenate hergestellt und die cAMP-abbauende

PDE3A-Aktivität in Abhängigkeit von Milrionon mittels PDE-Assay gemessen. Es

handelt sich um prozentuale Werte ± SEM bezogen auf die Kontrolltiere von n=5

(*p<0,05). (ctrl = Kontroll-Tiere)

PD

E3

A-A

kti

vit

ät

(%)

0

50

100

ctrl GCKO

*

SMC-

GCKO

*

64

65

Zusätzlich wurde die Tibialänge bestimmt und das LV-Gewicht/ bzw. Gesamt-

Herzgewicht/Tibia-Verhältnis ermittelt (Abb. 19). Diese relativen Werte waren für die

GCKO-Mäuse im Vergleich mit ihren WT-Kontrollen identisch und betrugen 4 (LV/Tibia)

bzw. 5 (Gesamtherz/Tibia) relative Einheiten. Auch zwischen dem Verhältnis der SMC-

GCKO-Mäuse bestand im Vergleich zu ihren heterozygoten Kontrollen kein Unterschied.

Hier waren die Verhältnisse etwas höher; 4,5 (LV/Tibia) bzw. 5,5 (Gesamtherz/Tibia)

relative Einheiten. Vergleicht man die Verhältnisse der beiden KO-Mauslinien ist auch

hier kein signifikanter Unterschied zu erkennen. Damit lässt sich festhalten, dass der

durch NO-GC-Deletion ausgelöste Hypertonus der beiden KO-Mauslinien zumindest in

einem Alter von etwa 4 Monaten (GCKO-Mäuse) und 6 Monaten (SMC-GCKO-Mäuse)

weder eine Linksherzhypertrophie noch eine das ganze Herz betreffende Hypertrophie

zur Folge hat.

4.3.2 Aortensteifigkeit

Ein erhöhter Blutdruck ist die Konsequenz einer erhöhten arteriellen Gefäßsteifigkeit.

Diese Versteifung wird durch Umbauprozesse in den Gefäßwänden ausgelöst. Bei

anhaltendem mechanischem Stress werden weitere Umbauprozesse ausgelöst, die zu

Arteriosklerose und letztlich zu einer Vielzahl kardiovaskulärer Krankheiten führen

können. Um zu ermitteln, ob es in Folge der NO-GC-Deletion zu einer erhöhten

Gefäßsteifigkeit kam, wurden zwei verschiedene Versuche durchgeführt.

4.3.2.1 Spannungs-Dehnungs-Test

Zunächst wurde ein Spannungs-Dehnungs-Diagramm von Aorten-Ringen erstellt.

Dieser Versuch wird angewendet, um die Eigenschaften eines Materials hinsichtlich

seiner Festigkeit und Elastizität zu charakterisieren. Das in Abbildung 20 dargestellte

Spannungs-Dehnungs-Diagramm ist nur von der Struktur der Aorten und nicht von den

geometrischen Abmessungen des Gefäßes abhängig. Es lassen sich somit direkte

Rückschlüsse auf die Gefäßsteifigkeit ziehen. Bei Betrachtung der Kurve fällt zunächst

auf, dass bei allen drei Genotypen, die Spannung der Aorta mit erhöhter Dehnung

zunimmt. Die Spannungskurve der SMC-GCKO Aorta lag ein wenig oberhalb der

Kontroll-Tiere. Diese Erhöhung war jedoch statistisch nicht signifikant. Im Gegensatz

dazu zeigte die GCKO-Aorta eine deutliche Spannungserhöhung; diese trat schon bei

sehr niedrigen Dehnungen (1%) auf. Zudem hielten im Gegensatz zu den Aorten der

anderen Genotypen einige GCKO-Aorten den höheren Spannungen nicht stand und

rissen bereits bei einer Dehnung von 14% (siehe Zahlen über der Kurve). Dies und die

höherliegende Kurve deuten im Vergleich zur Kontroll- oder auch SMC-GCKO-Aorta auf

eine steifere GCKO-Aorta hin.

Abb. 19: Spezifisches HerzgewichtHerzgewichte von etwa fünf Monate alten KO- und Kontrollmäusen wurden

bestimmt. In A) ist die Relation des linken Ventrikels und in B) das Gesamt-

Herzgewicht normiert auf Tibialängen dargestellt. Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM

von n = 5-12.

SMC-GCKO

0

LV

/Tib

ia(r

ela

tive

Ein

he

ite

n)

GCKOWT

6

2

Kontrolle

4

SMC-GCKO

0

Gesam

therz

/Tib

ia(r

ela

tive

Ein

he

ite

n)

GCKOWT

6

2

Kontrolle

4

A

B

66

Abb. 20: Spannungs-Dehnungs-DiagrammAorten wurden in Ringe geschnitten, der Durchmesser bestimmt und daraus die für

die entsprechende Dehnung einzustellende Länge berechnet. Im Organbad wurde

die daraus resultierende Kraft gemessen. Aus der Kraft wurde unter

Berücksichtigung der Schnittlänge und Wanddicke die Spannung berechnet. Die

Werte von SMC-GCKO und GCKO wurden auf die Kontrollwerte normiert. Die Daten

zeigen Mittelwerte ± SEM von n=5-6 mit Ausnahme der letzten drei GCKO-Werte

(*p<0,05; **p<0,01). (ctrl = Kontroll-Tiere)

150

250

200

100

50 0

Kraftentwicklung (%)

De

hn

un

g (

%)

02

46

812

10

14

16

***

**

****

**

****

***

*

*

*

*

*

(3)

(3)

(2)

67

68

4.3.2.2 Pulswellengeschwindigkeit

Ein weiteres und häufig verwendetes Maß für Gefäßsteifigkeit ist die

Pulswellengeschwindigkeit (PWV). Sie beschreibt die Ausbreitungsgeschwindigkeit, mit

der die Druckwelle durch die Arterien läuft. Diese Geschwindigkeit ist nicht nur abhängig

von der Kontraktionsfähigkeit des Herzens, sondern auch von der Elastizität und dem

Durchmesser der großen Arterien wie der Aorta.

Die Bilder zur Errechnung der PWV wurden mittels Magnetresonanztomographie

aufgenommen und die Geschwindigkeit mit der QA-Methode bestimmt, d.h. sie wurde

lokal aus der Änderung des Volumenflusses und der Querschnittsfläche des Gefäßes

während der frühen Systole errechnet. In Abbildung 21 sind diese Parameter und die

aus ihnen bestimmte PWV dargestellt. Zunächst wurde die prozentuale Zunahme der

aortalen Querschnittsfläche berechnet (siehe Abb. 21A). Dabei ergibt sich zwischen den

einzelnen Genotypen kein Unterschied, d.h. die Zunahme während der frühen Systole

verlief in allen Mauslinien gleich. Betrachtet man jedoch die Zeit, in der diese Zunahme

stattfand, so ergibt sich bei den GCKO-Tieren ein signifikanter Unterschied im Vergleich

zu den Kontroll-Tieren (siehe Abb. 21B). Dies spiegelt sich auch in den in Abbildung 21C

dargestellten PWV wieder. Während in der Aorta der Kontroll-Tiere eine lokale PWV von

2,3 m/s herrscht, ist diese bei GCKO-Tieren mit 4,0 m/s fast doppelt so hoch. In

SMC-GCKO-Mäusen ist keine Erhöhung der PWV zu erkennen; sie betrug 2,1 m/s. Die

erhöhte aortale PWV in GCKO-Mäusen deutet auf ein steiferes Gefäß in diesen Tieren

hin. Diese Tatsache stimmt mit den Ergebnissen des Spannungs-Dehnungs-Diagramms

überein. Es lässt sich zusammenfassen, dass lediglich der globale KO der NO-GC zu

einer steiferen Aorta führt. Da jedoch die Aorta der SMC-GCKO-Tiere keine erhöhte

Steifigkeit aufweist, kann die in beiden KO-Mauslinien auftretende Hypertonie nicht in

direktem Zusammenhang mit der erhöhten PWV stehen.

4.3.3 Messung der Aorten-Geometrie

Bereits bei der Messung des Durchmessers zur Erstellung des Spannungs-Dehnungs-

Diagramms fiel auf, dass die GCKO-Aorten insgesamt kleiner waren als die der Kontroll-

oder SMC-GCKO-Tiere. Der Durchmesser ist für die Entstehung der PWV ein wichtiger

Parameter. Bei konstantem Blutvolumen und Blutdruck gilt: Je kleiner das Rohr, desto

größer die Fließgeschwindigkeit des Blutes. Deswegen wurden Wanddicke und

Durchmesser der Aorta gemessen und auf die Tibialänge der Tiere normiert (Abb. 22)

Bei den Ergebnissen handelt es sich somit um ex vivo-Werte, die nicht den Größen im

Tier gleichen, da die Dehnung durch das durchfließende Blut wegfällt. Aufgrund des

unterschiedlichen Alters und dem sich daraus ergebenden Größenunterschied konnten

die Daten der WT- und heterozygoten Kontroll-Tiere nicht zusammengefügt werden. Die

A

B

Abb. 21: PulswellengeschwindigkeitMäuse wurden mit Isofluran narkotisiert, in einer Spule fixiert und Atmung und

Herzschlag mittels EKG überwacht. In einem MRT wurde die Querschnittsfläche der

thorakalen Aorta bildlich dargestellt. Zur Errechnung der

Pulswellengeschwindigkeiten (PWV) wurden A) die prozentuale Flächenzunahme

und B) die Zeit, in der die Zunahme stattfindet, gemessen. Aus diesen Werten

wurden die in C) dargestellten PWVs errechnet. Die Daten entsprechen dem

Mittelwert ± SEM von n=5 (*p<0,05). (ctrl = Kontroll-Tiere)

C

Flä

ch

en

zu

na

hm

e (

%)

0

10

20

SMC-GCKO

30

GCKOctrl

40

0

15

SMC-GCKO

Zeit

der

Zu

nah

me

(%

)

GCKOctrl

*

25

5

Genotyp PWV (m/s)

ctrl 2,3 ± 0.2

GCKO 4,0 ± 0.5 *

SMC-GCKO 2,1 ± 0.3

10

20

69

A

B

Wa

nd

dic

ke

/Tib

ia(r

ela

tive

Ein

he

ite

n)

0,005WT GCKO SMC-

GCKOKontrolle

0,006

0,007D

urc

hm

es

ser/

Tib

ia(r

ela

tive

Ein

he

ite

n)

0,028

0,038

WT GCKO SMC-GCKO

Kontrolle

0,033

*

Abb. 22: Geometrie der AortaAorten wurden entnommen, in KH-Lösung freipräpariert und in dünne Ringe

geschnitten. Diese Ringe wurden in einem Tropfen KH-Lösung auf einem

Objektträger mit Lineal unter dem Binokular fotografiert. Mit der Software ImageJ

wurde anhand der Bilder A) der Durchmesser und B) die Wanddicke der Ringe

bestimmt und auf die Tibialänge normiert (*p<0,05).

70

71

Messung der Wanddicke ergab bei den KO-Tieren im Vergleich zu ihren Kontrollen kein

Unterschied. Jedoch waren die GCKO-Aorten, wie erwartet, deutlich kleiner als die der

WT-Tiere. Im Gegensatz dazu unterschied sich die Größe der SMC-GCKO-Aorta nicht

von der ihrer Kontrolle. Es scheint, dass ein globaler KO der NO-GC zu der Ausbildung

einer kleineren Aorta führt.

4.3.4 Messung der ECM-Proteine

Aus den vorangegangenen Versuchen wurde deutlich, dass die GCKO-Aorten steifer

sind als jene von Kontroll- oder SMC-GCKO-Tieren. Für die Elastizität der Gefäße sind

die Proteine der ECM verantwortlich. In der Aorta und den großen Arterien sind das

hauptsächlich Elastin und Kollagen. Kollagen verleiht den Gefäßen ihre Zugfestigkeit,

während Elastin für die Dehnbarkeit verantwortlich ist. Da die veränderte Dehnbarkeit

von GCKO-Aorten sowohl durch eine vermehrte Kollagen- wie auch eine verminderte

Elastin-Expression bedingt sein kann, sollte im Folgenden der aortale Gehalt der beiden

Proteine bestimmt werden.

Um den Anteil an Kollagen zu untersuchen wurde zunächst die Pikrosiriusrot-Färbung

angewendet (Daten nicht gezeigt). Da die Färbung der Schnitte unterschiedlich stark

ausfiel, abhängig vom Platz der Objektträger in den Färbeschalen und der dadurch

unterschiedlich starken Entfärbung, konnte keine Quantifizierung der angefärbten

Kollagenfasern durchgeführt werden. Deshalb musste ein anderer, diesmal

biochemischer Ansatz gewählt werden. Die Quantifizierung des Strukturproteins

Kollagen erfolgte mittels kolorimetrischer Messung nach einer modifizierten Methode

von Stegemann and Stalder (1967). In Abbildung 23A sind die Ergebnisse dieser

Messung dargestellt. Die Werte der Kontroll-Tiere wurden als 100% definiert. Bei diesen

Messungen konnten die Daten von WT- und heterozygoten Kontroll-Tieren nicht

zusammengefasst werden. SMC-GCKO- und ihre Kontroll-Mäuse wurden erst im Alter

von 6-8 Wochen mit Tamoxifen behandelt und konnten erst 50 Tage später in den

Versuch eingesetzt werden. Dadurch ergab sich eine Altersdifferenz zwischen den

GCKO- und SMC-GCKO-Tieren mit zugehöriger Kontrolle. Im Alter kommt es zu einer

Veränderung der ECM-Zusammensetzung, die u.a. mit einer Erhöhung des Kollagen-

und einer Erniedrigung des Elastin-Gehalts einhergeht (Brooke et al., 2003). Diesen

Sachverhalt bestätigten auch die absoluten Kollagen- und Elastin-Mengen (nicht

dargestellt). Betrachtet man nun die prozentualen Kollagen-Werte der KO-Aorten im

Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen, so ist kein Unterschied erkennbar. Es kam

sogar an Stelle der erwarteten Erhöhung des Kollagen-Gehalts zu einer minimalen

Reduktion desselben. Diese Reduktion betrug jedoch weniger als 10% und ergab in der

A

B

Abb. 23: Biochemische Messung von Elastin und KollagenAortenproben wurden in Säure gekocht, um die Struktur aufzulösen und die ECM-

Proteine Kollagen und Elastin mittels verschiedener kolorimetrischer Methoden

quantifizieren zu können.

A) Der Kollagen-Gehalt wurde in einer veränderten Weise nach Stegmann und

Stalder (1967) anhand der Hydroxyprolin-Konzentration bestimmt.

B) Der Elastin-Gehalt wurde mit dem kommerziellen Elastin-Assay von Biocolor

gemessen. Die Daten entsprechen dem Mittelwert ± SEM von n=4-6.

SMC-GCKO

0

80

Ela

sti

n (

%)

GCKOWT

100

20

Kontrolle

60

40

SMC-GCKO

0

80

Ko

lla

ge

n (

%)

GCKOWT

100

20

Kontrolle

60

40

72

73

statistischen Auswertung keine Signifikanz. Der Kollagen-Gehalt war in beiden KO-

Mauslinien nicht verändert.

Als nächstes wurde das zweithäufigste ECM-Protein der Gefäßwand gemessen: Elastin.

Dafür wurde ein kommerzieller Elastin-Assay von Biocolor verwendet. Auch hierbei

handelt es sich um eine biochemische Methode, die auf der Farbreaktion der Proben

und des zur Quantifizierung notwendigen Standards beruht. Die Absorptionen der

Proben und Standards wurden mittels Photometer bei einer Wellenlänge von 490 nm

gemessen und der Elastin-Gehalt der Aorten-Homogenaten anhand des mitgeführten

Elastin-Standards errechnet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 23B dargestellt. Die

Werte der Kontroll-Tiere wurden als 100% definiert. Wie auch bei der Kollagen-Messung

konnten die Werte der WT- und heterozygoten WT-Tiere nicht zusammengefasst

werden. Bei Betrachtung der prozentualen Elastin-Werte ergibt sich das gleiche Bild wie

im Kollagen-Diagramm. Auch hier gibt es zwischen den KO-Tieren und ihren jeweiligen

Kontrollen keinen Unterschied. Zwar kam es hier zu dem erwarteten Rückgang des

Proteins, der jedoch mit ca. 5% nicht signifikant war. Diese Ergebnisse deuten darauf

hin, dass die Deletion der NO-GC weder zu einer Veränderung des Kollagen- noch des

Elastin-Gehalts in Aorten führt.

4.3.5 Struktur der Aorta

Zusätzlich zu den äußeren Abmessungen der Aorta sollte auch deren Struktur näher

untersucht werden. Dafür wurden 7 µm dünne Paraffinschnitte der Aorten hergestellt und

diese mit Eosin und Hämatoxylin angefärbt. Eosin färbt alle basischen Zellstrukturen rot,

während Hämatoxylin in seiner oxidierten Form alle sauren Strukturen, somit die DNA,

blau färbt. In Abbildung 24 und 25 sind die aufgenommen Durchlichtbilder dargestellt.

Zunächst fällt auf, dass der Durchmesser der GCKO-Aorten kleiner war im Vergleich zu

den Aorten aller anderen Genotypen. Damit bestätigt sich die in 4.3.3 gemessene

Durchmesser-Reduzierung der GCKO-Aorten. Außerdem scheint die Wand der GCKO-

Aorten verändert zu sein. Die Anzahl der „elastic lamellae“ (EL) in den Aorten aller

Genotypen ist gleich; sie beträgt 5-7. Jedoch ist die Struktur der EL in den GCKO-Aorten

deutlich verändert. Während die EL der WT-Aorten eine große Anzahl an Windungen

aufweisen, besitzen die GCKO-Tiere viele gerade Abschnitte (siehe Abb. 24). Vor allem

die innerste, dem Lumen zugewandte Schicht ist in den Kontroll-Tieren stark gewunden.

Dies ist in GCKO-Mäusen nicht der Fall; zusätzlich scheinen die EL näher zusammen

zu liegen, also die gesamte Aorta komprimierter zu sein als es im WT der Fall ist. Bei

SMC-GCKO- und ihren Kontroll-Mäusen sind diese Unterschiede nicht zu sehen (siehe

Abb. 25). Die Aorten der SMC-GCKO-Tiere besitzen ähnlich viele Windungen wie ihre

Kontroll-Tiere und auch der Abstand zwischen den EL scheint gleich. Somit scheint nur

Abb. 24: Veränderte Struktur der „elastic lamellae“ in GCKO-Aorten

Aorten von WT- und GCKO-Tieren wurden in Paraffin eingebettet, Schnitte (7 µm)

angefertigt und diese mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt.

74

Abb. 25: Struktur der „elastic lamellae“ in SMC-GCKO-Aorten

Aorten von heterozygoten Kontroll- und SMC-GCKO-Tieren wurden in Paraffin

eingebettet, Schnitte (7 µm) angefertigt und diese mit Hämatoxylin und Eosin

angefärbt.

75

76

der globale KO der NO-GC zu einer veränderten Geometrie und Struktur der Aorta zu

führen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es nur in den Aorten der GCKO-Tieren zu

einem reduzierten Durchmesser, einer veränderten Geometrie und einer erhöhten

Steifigkeit kommt (Abb. 26). Diese Steifigkeit ist unabhängig von Kollagen und Elastin

und scheint nicht durch die Hypertension hervorgerufen zu sein.

Abb. 26: Zusammenfassung der Ergebnisse aus Teil 4.3Dargestellt sind die beobachteten Veränderungen der KO-Aorten.

(„EL“ elastic lamellae, durchgestrichener Kreis: keine Veränderung blauer Pfeil:

erniedrigt, roter Pfeil: erhöht)

GCKO SMC-GCKO

Durchmesser

Steifigkeit

PWV

Blutdruck

Kollagen

Elastin

„EL“-Struktur

77

78

5 Diskussion

Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) wird durch das Signalmolekül NO aktiviert

und katalysiert die Bildung des intrazellulären Botenstoffs cGMP. Als Schlüsselenzym in

der NO/cGMP-Signalkaskade ist sie bei vielen physiologischen Prozessen, z.B. der

Relaxation der glatten Muskulatur, von entscheidender Bedeutung. Im kardiovaskulären

System ist die NO-GC durch das Zusammenspiel von Relaxation und Kontraktion der

glatten Muskelzellen an der Regulation des Blutdrucks beteiligt.

Um die Bedeutung der NO/cGMP-Signalkaskade genauer zu untersuchen wurden in

unserem Labor globale Knockout-Mäuse für das Enzym erzeugt (GCKO). Zusätzlich

wurde eine zellspezifische Knockout-Linie mit Hilfe des Cre-LoxP-Systems hergestellt.

Injektion von Tamoxifen führt in diesem induzierbaren KO-Modell ausschließlich in

glatten Muskelzellen zur Deletion der NO-GC (SMC-GCKO).

5.1 Deletion der NO-GC in den Gefäßen

In dieser Arbeit sollte zunächst die erfolgreiche NO-GC-Deletion in den Gefäßen auf

Proteinebene und funktionell in Organbadexperimenten untersucht werden. Hierzu

wurde sowohl die Aorta, als auch die Arteria carotis verwendet. Die Aorta als größte

Arterie im Säugetierkörper entspringt direkt aus der linken Herzkammer. Aufgrund der

großen Elastizität ihrer Gefäßwand verwandelt die Aorta das schubweise aus dem Herz

ausgestoßenen Blut in einen kontinuierlichen Blutstrom („Windkesselfunktion“). Der

Druck des Blutes wird dabei ständig durch Drucksensoren, den Barorezeptoren,

gemessen. Auch in der Gefäßwand des Sinus carotis der A. carotis sitzen

Barorezeptoren mit gleicher Funktion. Diese Drucksensoren leiten bei Veränderung des

arteriellen Blutdrucks nervale Impulse in das Kreislaufsystem des autonomen

Nervensystems in der Medulla oblongata. Hier werden, wenn nötig, reflektorisch

Herzfrequenz und Blutdruck gesenkt. Beide Arterien sind somit von großer Bedeutung

für die Regulation des Blutdrucks.

Um die NO-GC auf Proteinebene und in glatten Muskelzellen (SMC) nachzuweisen,

wurden immunhistochemische Analysen durchgeführt. Dadurch konnte die Deletion der

NO-GC in den SMC der Aorta und A. carotis der GCKO- und SMC-GCKO-Tiere bestätigt

werden (siehe Abb. 5 und 6). Um zusätzlich den funktionellen Verlust der NO-GC und

damit der NO/cGMP-Signalkaskade zu untersuchen, wurden Aorta- bzw. A. carotis-

Ringe in das Organbad eingespannt und nach Kontraktion mit NO relaxiert (siehe Abb.

7 und 8). In beiden KO-Mauslinien blieb im Gegensatz zu den Kontroll-Tieren eine NO-

vermittelte Relaxation vollständig aus. Durch den Verlust der NO-Responsivität und des

79

Proteinsignals kann die Deletion der NO-GC in den Gefäßen der GCKO- und SMC-

GCKO-Tiere bestätigt werden. Beide KO-Mausmodelle könnten deshalb verwendet

werden, um den Wegfall des NO-GC-Signals in den folgenden Zusammenhängen näher

zu untersuchen:

(1) Einfluss der NO-GC-Deletion auf den cAMP/cGMP-Crosstalk

(2) Bedeutung der NO-GC für die Steifigkeit der Aorta

5.2 Einfluss der NO-GC-Deletion auf den cAMP/cGMP-Crosstalk

Durch die Relaxation der glatten Muskelzellen trägt die NO/cGMP-Signalkaskade

entscheidend zur Regulation des Blutdrucks bei. Mäuse mit einer Deletion der NO-GC

leiden an einer Vielzahl gastrointestinaler und vaskulärer Erkrankungen. Auch der KO

der cGMP-abhängige Protein-Kinase I in Mäusen führt zu ähnlichen Symptomen. Der

fehlerfreie Ablauf des cGMP-Signalwegs ist somit wichtig für die Erhaltung der gesunden

Körperfunktion. Neben dem von der NO-GC synthetisierten sekundären Botenstoff

cGMP gibt es noch einen weiteren v.a. für die Blutdruckregulation wichtigen Botenstoff:

cAMP. Dieses Signalmolekül wird von der Adenylyl-Cyclase produziert und bewirkt

durch Aktivierung der cAMP-abhängige Protein-Kinase eine Relaxation der glatten

Muskelzellen. Phosphodiesterasen (PDEs) beenden die Relaxationssignale durch

Abbau der beiden sekundären Botenstoffe. Sie bilden somit den Verknüpfungspunkt im

cAMP- und cGMP-Signalweg. Dieser sogenannte Crosstalk findet in vielen

verschiedenen Zelltypen statt. Da beide Signalwege über die PDEs mit gemischter

Substratspezifität verknüpft sind, sollte untersucht werden, ob die Deletion der NO-GC

zu einem Kompensationsmechanismus in der cAMP-Signalkaskade führt.

Um etwaige Veränderungen in diesem Signalweg zu untersuchen, wäre es von Vorteil

die Expression der Adenylyl-Cyclase (AC) in den verschiedenen KO-Tieren im Vergleich

zu Kontroll-Tieren zu untersuchen. Allerdings ist es aufgrund der vielen Isoenzyme der

AC schwierig, geeignete Antikörper zu finden. Um dennoch eine eventuell auftretende

Modifikation der AC festzustellen, wurde der von der AC synthetisierte sekundäre

Botenstoff cAMP näher untersucht. Dafür wurde zunächst der cAMP-Spiegel in Aorten-

Homogenaten basal und nach Zugabe von Forskolin gemessen (siehe Abb. 9). Der

basale cAMP-Gehalt war in GCKO-, SMC-GCKO- und Kontroll-Tieren Protein in allen

Genotypen gleich. Durch die Stimulation der AC mit Forskolin stieg die intrazellulären

cAMP-Konzentration zwar um das 10fache an, zeigte jedoch auch hier keinen

Unterschied zwischen den beiden KO-Mauslinien und den Kontroll-Tieren. Auch die im

Organbad gemessene Forskolin-induzierte Relaxation der Aortenmuskulatur ergab

zwischen den KO- und Kontroll-Tieren keinen Unterschied; alle im Organbad erzeugten

80

Relaxationskurven lagen direkt aufeinander (siehe Abb. 11). Die cAMP-Synthese und

die cAMP-vermittelte Relaxation scheinen somit unverändert. Dies deutet darauf hin,

dass der cAMP-Signalweg nicht von der Deletion der NO-GC und der dadurch

reduzierten cGMP-Synthese beeinflusst wird. Da jedoch die cAMP- und die cGMP-

Signalkaskade über PDEs miteinander verknüpft sind, stellte sich die Frage, ob bei

diesen Enzymen eine Veränderung durch NO-GC-Deletion stattfindet.

Die für den cAMP-Abbau in glatten Muskelzellen wichtigste PDE ist die PDE3 (Bender

& Beavo, 2006). Sie gehört zur Gruppe der PDEs mit gemischter Substratspezifität,

wobei die Bindungsaffinität für cGMP höher ist als für cAMP. Allerdings ist die maximale

Umsatzgeschwindigkeit für cAMP 10fach höher als für cGMP, weshalb sie auch als

cGMP-inhibierte PDE bezeichnet wird. Die PDE3 baut beide sekundären Botenstoffe

schon bei sehr niedrigen intrazellulären Konzentrationen ab (Km-Wert ca. 0,2). Die PDE3

ist somit einer der wichtigsten Vermittler zwischen dem cGMP- und dem cAMP-

Signalweg. Sie spielt dadurch bei vielen Körperfunktionen eine wichtige Rolle. So trägt

sie beispielsweise zu der Kontraktilität des Herzens bei. In gesunden Menschen wird sie

stark im Myokard exprimiert (Hambleton et al., 2005; Vandeput et al., 2009). In

insuffizienten Herzen ist die Expression der PDE3 hingegen vermindert und die

Apoptoserate der Kardiomyozyten stark erhöht (Ding et al., 2005). Auch ist die PDE3 ein

klinisch relevantes Target. Der spezifische PDE3-Inhibitor Milrinon wird zur Therapie der

akuten Herzinsuffizienz eingesetzt (Packer et al., 1991). Durch Hemmung der PDE3

akkumuliert der sekundäre Botenstoff cAMP. Dieser aktiviert die Proteinkinase A, was

zu einer Phosphorylierung von Ca2+-Kanälen führt. Durch den Ca2+-Einstrom kommt es

zu einer Kontraktion des Herzmuskels und zusätzlich durch Gefäßdilatation zur

Reduktion des peripheren Widerstandes. Ein weiterer spezifischer PDE3-Inhibitor

(Cilostamid) wird zur Behandlung peripherer arterieller Verschlusskrankheiten, die durch

Arteriosklerose entstanden sind, eingesetzt (Kanlop et al., 2011). Ist die PDE3A durch

Deletion auf genetischer Ebene nicht mehr vorhanden, so kommt es sogar zu einer

Fehlregulation der Proliferation vaskulärer Myozyten (Begum et al., 2011). Auch führt die

genetische Mutation der PDE3A zu einer Brachydaktylie in Kombination mit einer

Hypertension (Houslay, 2015; Maass et al., 2015). Es zeigt sich, dass die PDE3 von

großer Bedeutung für das Herz-Kreislaufsystem ist. Deshalb wurde im weiteren Verlauf

dieser Arbeit der cAMP/cGMP-Crosstalk auf Ebene der PDE3 untersucht.

Von der PDE3 existieren zwei Isoformen, die von zwei verschiedenen Genen gebildet

werden. Mittels Western Blot und immunhistochemischen Analysen konnte gezeigt

werden, dass ausschließlich die PDE3A und nicht die PDE3B in Aortengewebe

exprimiert wird (siehe Abb. 12). Zusätzlich zeigte durch immunhistchemischen

Aufnahmen eine Kolokalisation der PDE3A in α-Glattmuskel Aktin-exprimierenden

81

Zellen, was die Expression der PDE3A in glatten Muskelzellen beweist. Die PDE3B

hingegen wird in dem die Aorta umgebenden Fettgewebe exprimiert und spielt somit in

glatten Muskelzellen keine Rolle (siehe Abb. 12C). Diese Ergebnisse werden auch von

der Literatur bestätigt, in der es heißt, dass die PDE3A die Kontraktilität des Herzens,

die Thrombozyten-Aggregation und die Kontraktion der glatten Muskelzellen reguliert.

Die PDE3B hingegen sei für den Effekt von Insulin und den Zellzyklus verantwortlich

(Bender & Beavo, 2006). Für die Gefäße und damit relevant für die Blutdruckregulation

ist somit lediglich die PDE3A.

Die Relevanz der PDE3A für die Funktionalität der Gefäße bestätigte sich auch in

Organbadexperimenten. Durch Zugabe von Milrinon (10 µM) konnten zuvor kontrahierte

Aorten-Ringe nahezu vollständig relaxiert werden (siehe Abb. 14). Überraschenderweise

waren die Relaxationskurven von GCKO- und SMC-GCKO-Tieren im Vergleich zu der

Kurve der Kontroll-Tiere nach links verschoben. Dies deutet auf eine höhere Sensitivität

der KO-Aorten für den Inhibitor Milrinon hin, was sich folgendermaßen erklären lässt:

Durch die Deletion der NO-GC kommt es zu einem verminderten intrazellulären cGMP-

Spiegel (Groneberg et al., 2010). Somit blockiert Milrinon direkt die PDE3A und muss

nicht mit cGMP um die Blockade konkurrieren. Deshalb reicht bereits eine geringere

Milrinon-Konzentration aus, um den gleichen Effekt wie im WT-Tier hervorzurufen. Auch

bei der Verwendung des PDE3-Inhibitors Cilostamid ergibt sich diese

Linksverschiebung, was einen zufällig auftretenden Milrinon-Effekt ausschließt. Die oben

genannte Vermutung bestätigte sich auch bei einer akuten Blockade der NO-GC durch

den spezifischen Inhibitor ODQ (siehe Abb. 15). Bei Inkubation der WT-Aorta mit ODQ

verschob sich die Relaxationskurve nach links, jedoch fiel sie dabei nicht auf die der

GCKO-Tiere. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte ein noch vorhandener basaler

cGMP-Spiegel sein, der noch mit Milrinon um die PDE3A-Blockade konkurriert und somit

den Sensitivitätseffekt auf Milrinon vermindert. Diese Vermutungen sind schematisch

und zusammenfassend in Abbildung 27 dargestellt. Zusätzlich muss berücksichtigt

werden, dass es sich bei der NO-GC-Inhibition mit ODQ um eine akute Blockade der

NO-GC handelt und nicht wie in den GCKO-Tieren um eine chronische Deletion und

damit Reduktion des cGMP-Spiegels.

Allerdings stellte sich die Frage, ob nicht auch eine Veränderung der PDE3A auf Ebene

ihrer Expression oder Aktivität der Grund für die sensitivere Reaktion der KO-Aorten auf

Milrinon sein könnte. Derzeit ist wenig über die Regulation der PDE3A-Expression

bekannt, wobei es in der Literatur einige Hinweise auf eine Beteiligung der NO/cGMP-

Signalkaskade gibt. In Ratten kam es in Folge einer Herzinsuffizienz zu einer erhöhten

vaskulären PDE3A-Expression (Hubert et al., 2014). In isolierten glatten Muskelzellen

von Ratten bewirkten NO-Donatoren und NO-GC-Stimulatoren eine Erhöhung der

Abb. 27: Einfluss von Milrinon auf den PDE3A-vermittelten

cAMP/cGMPCrosstalk

Dargestellt ist der Ablauf des PDE3-vermittelten cAMP/cGMP-Crosstalks in den

Glattmuskelzellen (SMC) der Aorta von WT-Tieren mit und ohne ODQ und GCKO-

bzw. SMC-GCKO-Tieren in Anwesenheit von Milrinon (Mil). Weitere Erklärungen

siehe Text. (cG = cGMP, cA = cAMP)

Relaxation

SMC

WT

PDE3A

cGPDE3A

cG

PDE3A

cG

PDE3A

cG

PDE3A

cG

Mil

Mil

PDE3AMil

cAcA

cA cA

cA

cAcA

cA

SMC-GCKO

GCKO

PDE3A

PDE3A

PDE3A

Mil

Mil

Mil

cA

cA

cA

cA

WT + ODQ

PDE3A

PDE3A

Mil

Mil

cG

PDE3A

Mil

82

83

PDE3A-Expression und -Aktivität. Hingegen führte die Blockade der NO-GC durch ODQ

zu einer verminderten PDE3A-Expression (Busch et al., 2010). Auch in dieser Arbeit

konnte ein Einfluss der NO/cGMP-Signalkaskade auf die PDE3A-Expression gezeigt

werden. Aus Western Blot Analysen ergab sich im Vergleich zu den Kontroll-Tieren eine

50%ige Reduktion der PDE3A in GCKO- und SMC-GCKO-Aorten. (siehe Abb. 16). Um

die Frage zu klären, ob diese Reduktion mit der NO-GC-Deletion und der damit

verminderten cGMP-Synthese verbunden war, wurden Expressions-Verlaufsstudien mit

SMC-GCKO-Tieren durchgeführt (siehe Abb. 17). Mittels Western Blot Analysen ließ

sich bereits nach 5 Tagen neben der verminderten NO-GC-Expression auch eine

Reduzierung der PDE3A-Expression feststellen. Die 50%ige Abnahme der PDE3A-

Expression an Tag 5 ging einher mit einer 80%igen Verminderung der NO-GC-

Expression. Dies bestätigt den Einfluss der NO-GC-Deletion auf die Expression der

PDE3A.

Wie zu erwarten kam es in Folge der verminderten PDE3A-Expression auch zu einer

geringeren cAMP-abbauenden Aktivität (siehe Abb. 18). Diese ergab sich sehr

wahrscheinlich aus der geringeren Konzentration an PDE3A-Molekülen. Durch das

Fehlen der NO-GC ist die PDE3A somit in ihrer Expression und Aktivität reduziert. Dieser

Kompensationsmechanismus dient vermutlich dazu das cAMP-Signal weitgehend zu

erhalten und so eine cAMP-induzierte Relaxation der Gefäße zu gewährleisten. Würde

es keine Rückkopplung zwischen dem cAMP- und cGMP-Signalweg und keinen internen

Ausgleich bei Verlust eines der beiden Signale geben, würde der Blutdruck durch

fehlende Gefäß-Relaxation möglicherweise noch weiter ansteigen.

All diese Daten weisen auf eine direkte Regulation der PDE3A in glatten Muskelzellen

durch die NO/cGMP-Signalkaskade und einen PDE3A-vermittelten cAMP/cGMP-

Crosstalk hin. Der genaue Mechanismus dieser Expressionsregulation muss allerdings

noch aufgeklärt werden. Hier könnte es, analog zum „cAMP-responsive element“

(Montminy et al., 1990; Bourtchuladze et al., 1994), eine cGMP-vermittelte

Transkriptionsregulation geben. Erste Hinweise auf ein solches „cGMP-responsive

element“ gibt es bereits im Zusammenhang mit der Guanylyl-Cyclase A-Expression

(Hum et al., 2004; Martel et al., 2010). Alternativ wäre auch eine Modulation der

Translation der PDE3A denkbar.

5.3 Bedeutung der NO-GC für die Steifigkeit der Aorta

Glatte Muskulatur befindet sich in verschiedenen Systemen, wie den Gefäßen und dem

gesamten Gastrointestinaltrakt. Sie steuert durch geregelte Kontraktionen und

Relaxationen der einzelnen glatten Muskelzellen die grundlegenden Funktionen des

Körpers, so z.B. die Regulation des Blutdrucks. Eine Dysregulation des Blutdrucks, die

84

arterielle Hypertonie, ist als Risikofaktor verantwortlich für Arteriosklerose und führt

darüber hinaus zu einer Vielzahl kardiovaskulärer Erkrankungen wie Herzinfarkt,

Herzinsuffizienz oder Schlaganfall. Die der Entstehung der Hypertonie

zugrundeliegenden Mechanismen sind derzeit nicht vollends bekannt und werden

kontrovers diskutiert. Da die NO/cGMP-Signalkaskade bei der Relaxation der glatten

Muskulatur eine entscheidende Rolle spielt, trägt sie wesentlich zur Regulation des

Blutdrucks bei. Anhand verschiedener KO-Maus-Modelle der NO/cGMP-Signalkaskade

wird die Bedeutung der an diesem Signalweg beteiligten Komponenten deutlich. So

zeigen globale KO-Maus-Linien der eNOS, der PKG und des BK-Kanals einen erhöhten

Blutdruck (Nelson et al., 1995; Pfeifer et al., 1998; Brenner et al., 2000). Auch die

pharmakologische Inhibition der NO-GC durch die Gabe von L-NAME führt zu einer

Hypertonie (Van Vliet et al., 2003). Dies zeigte sich auch bei Untersuchungen in unserem

Labor. Hier wurde L-NAME dem Trinkwasser der Tiere zugesetzt und der Blutdruck an

drei Tagen mittels Schwanz-Plethysmographie gemessen. Bereits am ersten Tag nach

L-NAME Gabe kam es in WT-Tieren zu einer Erhöhung des systolischen Blutdrucks um

20 mmHg. Im Gegensatz dazu zeigten die SMC-GCKO-Tiere auch 5 Tage nach der

Behandlung keine Veränderung des Blutdrucks. Daraus lässt sich schließen, dass die

Blutdruck-regulierende Wirkung von NO exklusiv über die NO-GC in glatten

Muskelzellen vermittelt wird (Groneberg et al., 2010). Auch bei genetischem Knock-out

der NO-GC kommt es zur Erhöhung des systolischen Blutdrucks. Die in unserem Labor

erzeugten NO-GC-defizienten und in dieser Arbeit verwendeten GCKO- und SMC-

GCKO-Mäuse besitzen im Vergleich zu ihren Kontrollen einen um 30 mmHg erhöhten

systolischen Blutdruck (Friebe et al., 2007; Groneberg et al., 2010). All diese

Untersuchungen bestätigen eine enorme Beteiligung der NO/cGMP-Signalkaskade an

der Blutdruckregulation.

Eine Erhöhung des Blutdrucks ist die Konsequenz eines pathologischen arteriellen

Wandumbaus (Cohn, 2006). Das heißt eine erhöhte Aortensteifigkeit geht der

Hypertonie zeitlich voraus (Kaess et al., 2012). Bei zunehmender Gefäßsteifigkeit geht

die Windkesselfunktion der Aorta verloren und führt zu einer erhöhten systolischen

Pulswellengeschwindigkeit. Dadurch kommt es zur erhöhten Reflexion von Pulswellen

einschließlich der Überlagerung dieser bereits in der Systole und nicht wie bei normal

elastischen Gefäßen erst in der Diastole. Daraus resultiert ein Anstieg des systolischen

und eine Abnahme des diastolischen Blutdrucks und somit eine Erhöhung des

Pulsdrucks (London, 1997). Diese negativen hämodynamischen Veränderungen führen

zu einer verstärkten Nachlast für das Herz und einem verminderten diastolischen Fluss

in den Koronararterien. Eine anhaltende kardiale Nachlast kann zu einer Hypertrophie

des Herzens und einem Verlust der geordneten Struktur der Myozyten und Myofibrillen

85

führen. Dieser Vorgang stellt einen Kompensationsmechanismus an die vermehrt zu

leistende Herzarbeit dar. Im Laufe der bestehenden Hypertonie kommt es bei

gleichbleibender Zellzahl zu einer Zunahme des Zellvolumens, also zu einer Erhöhung

der Wanddicke bei unveränderter Muskelmasse (prähypertrophierte Symptome). Bei

weiterhin bestehender erhöhter Blutdruckbelastung entwickelt sich eine echte

Hypertrophie. Meist entsteht zuerst eine konzentrische Hypertrophie mit normaler Größe

der linken Herzkammer aber deutlich zu dicken Muskelwänden und anschließend eine

exzentrische Hypertrophie mit Vergrößerung der Herzkammer aber wieder relativ

normaler Wanddicke (Hennersdorf & Strauer, 2007).

Trotz der systolischen Blutdruckerhöhung von 30 mmHg in den untersuchten GCKO-

und SMC-GCKO-Mäusen kam es weder zu einer Zunahme der Masse des linken

Ventrikels, noch zu einer Gesamtherz-Hypertrophie (siehe Abb. 19). Auch die

Ejektionsfraktion des linken Ventrikels war in unseren GCKO-Mäusen im Vergleich zu

den WT-Tieren nicht erhöht (Zhu et al., 2015). Somit lag noch keine konzentrische oder

exzentrische Hypertrophie vor. Erst diese Stadien gehen mit einer Zunahme der

Muskelmasse bzw. einer erhöhten Auswurfleistung einher. Eine mögliche Begründung

für die fehlende Hypertrophie ist vermutlich das Alter der verwendeten Mäuse. Die Tiere

waren nicht älter als 6 Monate und die Hypertrophie des Herzgewebes vermutlich noch

nicht feststellbar ausgeprägt. Histologische Untersuchungen könnten Aufschluss über

ein bereits in diesem Alter der Tiere auftretendes prähypertrophiertes Stadium geben.

Auch sollten ältere Tiere auf eine Hypertrophie des Herzens untersucht werden.

Die Erhöhung des Blutdrucks ist die späte Folge einer erhöhten Gefäßsteifigkeit. Um

Gefäßschäden früher zu entdecken und somit dem Auftreten kardiovaskulärer

Krankheiten frühzeitig entgegen wirken zu können, sind Methoden zur Gefäßbeurteilung

von großer klinischer Relevanz. Als mögliche Ursache für die Blutdruckerhöhung von 30

mmHg in GCKO- und SMC-GCKO-Tieren wurde daher eine erhöhte Aortensteifigkeit in

Betracht gezogen. Da beide KO-Mausmodelle einen erhöhten Blutdruck aufweisen war

zu erwarten, dass auch die Aorten beider Mauslinien eine erhöhte Steifigkeit aufweisen.

Um die Steifigkeit zu untersuchen wurden zwei verschiedene Versuche durchgeführt.

Zunächst wurde ex vivo die Materialeigenschaft der Aorten im Spannungs-Dehnungs-

Test untersucht. Die Erstellung eines Spannungs-Dehnungs-Diagramms gibt Aufschluss

über die Zugfestigkeit und Elastizität eines Materials (siehe Abb. 20). Unter

Berücksichtigung der geometrischen Größen der unterschiedlichen murinen Aorten,

konnten Daten erzeugt werden, die nur von der Struktur der Gefäße abhängig waren. Es

zeigte sich, dass lediglich die Aorten der GCKO-Tiere im Vergleich zu den Kontroll-

Tieren weniger elastisch waren. Die deutlich erhöhte Zugfestigkeit zeigte sich bereits bei

der geringsten Dehnung von 1%. Auch waren die Aorten deutlich weniger belastbar als

86

die der SMC-GCKO- und Kontroll-Tiere, denn sie rissen deutlich früher. Ein weiteres und

häufig verwendetes Maß für eine erhöhte Gefäßsteifigkeit ist die

Pulswellengeschwindigkeit (PWV). Sie beschreibt die Ausbreitungsgeschwindigkeit, mit

der die Druckwelle durch die Arterien läuft. Bei der Versteifung der Gefäße kommt es zur

Zunahme der PWV und dadurch zu einer Erhöhung des systolischen Blutdrucks. Die

Magnetresonanztomographie (MRT) stellt ein nicht-invasives Verfahren zur Bestimmung

der PWV dar und wird deshalb auch in der Humanmedizin angewendet. Die

Pulswellengeschwindigkeit wurde mit der QA-Methode bestimmt, d.h. sie wurde lokal

aus der Änderung des Volumenflusses und der Querschnittsfläche des Gefäßes

während der frühen Systole errechnet. Wider erwartend zeigte sich auch hier lediglich

bei den GCKO-Tieren eine erhöhte Aortensteifigkeit. Die PWV in diesen Tieren war im

Vergleich zu den SMC-GCKO- und Kontroll-Tieren beinahe verdoppelt (siehe Abb. 21).

Allerdings ist die PWV nicht nur abhängig von der Kontraktionsfähigkeit des Herzens

und der Elastizität des Gefäßes, sondern vor allem von dessen Durchmesser. Die

ausschließlich in GCKO-Tieren auftretende PWV-Erhöhung, könnte auch mit dem

reduzierten Aorten-Durchmesser dieser Mäuse erklärt werden (siehe Abb. 22). Bei

gleichem Blutdruck und gleicher Ejektionsfraktion, aber kleinerem Gefäß-Durchmesser

erhöht sich die PWV (Gesetz von Hagen-Poiseulles). In SMC-GCKO-Tieren ist der

Durchmesser im Vergleich zu den Kontroll-Tieren nicht reduziert und möglicherweise

auch deshalb die PWV nicht erhöht. Jedoch zeigten die SMC-GCKO-Tiere auch keine

erhöhte Aortensteifigkeit im Spannungs-Dehnungs-Diagramm. Als mögliche

Begründung für die veränderte Dehnbarkeit der GCKO-Aorten wäre eine veränderte

Zusammensetzung der extrazellulären Gefäßmatrix (ECM) denkbar gewesen. Für die

Elastizität der Gefäße sind hauptsächlich die ECM-Proteine Elastin und Kollagen

verantwortlich. Kollagen verleiht den Gefäßen ihre Zugfestigkeit, während Elastin für die

Dehnbarkeit verantwortlich ist. Die Gefäßsteifigkeit kann somit sowohl durch eine

vermehrte Kollagen- als auch eine verminderte Elastin-Expression bedingt werden.

Wider erwartend waren beide Proteine in den GCKO-Aorten im Vergleich zu den WT-

Tieren unverändert (siehe Abb. 23). Eine erhöhte Aortensteifigkeit ist charakterisiert

durch den Verlust ihrer Windkesselfunktion. Betrachtet man die Struktur der Aorten

(siehe Abb. 24 und 25), so fällt auf, dass die Struktur der „elastic lamellae“ (EL) in den

GCKO-Aorten verändert ist. Während die EL der WT-Aorten eine große Anzahl an

Windungen aufweisen, besitzen sie in den GCKO-Tieren viele gerade Abschnitte und

scheinen näher zusammen zu liegen. Durch die Reduzierung der Windungen und der

Kompression der GCKO-Aorta, geht der Windkesseleffekt des Gefäßes verloren, es

kann sich weniger stark dehnen und somit nicht mehr den zyklisch-pulsatilen in einen

kontinuierlichen-phasischen Blutfluss umwandeln. Dies führt zu einer Zunahme der

87

Pulswellengeschwindigkeit, wodurch es zu einem erhöhten Pulsdruck und letztlich zu

einer Erhöhung des systolischen Blutdrucks kommt. Somit scheint in den GCKO-Tieren

der reduzierte Durchmesser und die veränderte EL-Struktur verantwortlich für die

Steifigkeit der Aorta zu sein und damit den erhöhten Blutdruck zu bedingen. Die SMC-

GCKO-Tiere hingegen zeigen keine Durchmesser- oder EL-Veränderung und weisen

passend dazu auch keine erhöhte Aortensteifigkeit auf. Anhand dieser Datenlage kann

nicht erklärt werden, wodurch der erhöhte systolische Blutdruck in den SMC-GCKO-

Tieren entsteht und warum trotz der gleichen Blutdruckerhöhung lediglich die GCKO-

und nicht die SMC-GCKO-Tiere steifere Gefäße und eine veränderte Gefäßstruktur

aufweisen. Einige Hypothesen zur Erklärung dieser Diskrepanz sollen im Folgenden

aufgestellt werden:

Ein äußerst wichtiger Unterschied zwischen den GCKO- und SMC-GCKO-Mäusen ist

der Zeitpunkt der NO-GC-Deletion. Während diese in GCKO-Tieren während der

Ontogenese stattfindet, wird sie in SMC-GCKO-Tieren erst im Alter von 6-8 Wochen

durch Injektion von Tamoxifen induziert. Zu diesem Zeitpunkt sind die Mäuse adult und

die Ontogenese abgeschlossen. Weitere 50 Tage später ist die NO-GC sowohl

funktionell ausgeschaltet, als auch auf Proteinebene nicht mehr nachweisbar. Der

Blutdruck hingegen steigt bereits 10 Tage nach Induktion der NO-GC-Deletion an und

erreicht an Tag 50 sein Maximum. Möglicherweise können die SMC-GCKO-Tiere diese

verhältnismäßig schnelle hämodynamische Veränderung nicht durch

Anpassungsmechanismen, wie die Bildung neuer Kapillaren, ausgleichen. Erste

Beobachtungen einer verminderten Angio- und Arteriogenese in SMC-GCKO-Tieren

wurden in unserer Arbeitsgruppe bereits gemacht (Bettaga et al., 2015). Die GCKO-Tiere

hingegen können eventuell in ihrer Entwicklungsphase bis zum adulten Tier die

Wachstums- und Regenerationsfähigkeit nutzen, um zusätzliche Gefäße auszubilden

und so den Blutdruck trotz steifer Gefäße relativ niedrig halten.

Denkbar ist auch, dass die Blutdruckerhöhung um 30 mmHg in beiden KO-Mauslinien,

trotz unterschiedlicher Mechanismen, zufällig den gleichen Wert hat. In GCKO-Tieren

könnte dies durch die steiferen Gefäße bedingt sein, wohingegen in SMC-GCKO-Tieren

eine Veränderung der Gefäße in der Peripherie als mögliche Ursache in Frage kommt.

Ein weiterer Grund könnte eine veränderte Regulation des Tonus der

Widerstandsgefäße sein. Viele verschiedene Mechanismen, wie z.B. die myogene

Aktivität der Schrittmacherzellen, die im Blut zirkulierende Hormone oder die

Erregungsübertragung aus Gefäßnerven, greifen in das Wechselspiel von Relaxation

und Kontraktion ein. In den SMC-GCKO-Tieren könnten diese Mechanismen im

Vergleich zu den GCKO-Tieren verändert sein, was bei ihnen zu einer reduzierten

88

Vasodilatation der kleinen Gefäße und somit zu einem erhöhten peripheren Widerstand

führen könnte.

Diese Hypothesen können allerdings nicht abschließend bewiesen werden, da der

Einfluss der oben beschriebenen Parameter auf die Regulation des Blutdrucks unklar

ist. Um eine abschließende Erklärung für den Unterschied zwischen GCKO- und SMC-

GCKO-Mäusen zu finden, sollten in weiteren Untersuchungen die kleinen Gefäße der

Peripherie untersucht werden.

89

6 Zusammenfassung

Die NO/cGMP-vermittelte Signalkaskade ist im vaskulären System entscheidend an der

Regulation des Blutdrucks beteiligt. Innerhalb der Kaskade nimmt die NO-sensitive

Guanylyl-Cyclase (NO-GC) eine Schlüsselfunktion als wichtigster Rezeptor für das

Signalmolekül Stickstoffmonoxids (NO) ein. NO wird endogen von verschiedenen

Isoformen der NO-Synthase produziert. Die Bindung von NO an die NO-GC führt zur

Produktion des sekundären Botenstoffs cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP).

Dieser Botenstoff aktiviert verschiedene Effektor-Moleküle und bewirkt letztlich eine

Relaxation der glatten Muskulatur. Ein weiterer sekundärer Botenstoff, das

Signalmolekül cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP), ist ebenfalls an der

Regulation des Tonus der glatten Muskulatur und dadurch an der Blutdruckregulation

beteiligt. Unterschiedliche Phosphodiesterasen (PDE) bauen die sekundären

Botenstoffe ab und beenden dadurch die Signalkaskaden. Die PDE3 spielt hierbei eine

besondere Rolle, da sie eine gemischte Substratspezifität besitzt. Um den Einfluss der

NO-GC auf das kardiovaskuläre System zu untersuchen, wurden NO-GC Knockout(KO)-

Mäuse mit globaler (GCKO) oder Glattmuskel-spezifischer (SMC-GCKO) Deletion der

NO-GC generiert.

Um das Zusammenspiel von cAMP und cGMP näher zu beleuchten, wurde im ersten

Teil dieser Arbeit die PDE3 genauer untersucht. Im Gefäßsystem wird lediglich die

PDE3A und nicht die PDE3B exprimiert. Die Aorten von GCKO- und SMC-GCKO-Tieren

reagieren sensitiver auf PDE3A-Blockade als die Kontroll-Tiere. Auch die akute

Blockade der NO-GC führt zu diesem Sensitivitätseffekt. Die PDE3A ist in Folge der NO-

GC-Deletion sowohl in ihrer Expression, als auch ihrer Aktivität um die Hälfte reduziert.

Dies dient vermutlich kompensatorisch dazu, das cAMP-Signal weitgehend zu erhalten

und so eine cAMP-induzierte Relaxation der Gefäße zu gewährleisten. Ohne

Rückkopplung zwischen den beiden Signalwegen käme es vermutlich zu weiteren

negativen Konsequenzen für das Herz-Kreislaufsystem. Diese Daten weisen auf eine

direkte Regulation der PDE3 in glatten Muskelzellen durch die NO/cGMP-Signalkaskade

und einen PDE3-vermittelten cAMP/cGMP-Crosstalk hin. Der genaue Mechanismus

dieser Expressionsregulation ist noch unklar. Denkbar wäre eine cGMP-vermittelte

Transkriptionsregulation oder eine Modulation der Translation der PDE3A.

Der Verlust der NO-GC führt in GCKO- und SMC-GCKO-Mäusen zu einem erhöhten

systolischen Blutdruck von ~30 mmHg. Bei der Entwicklung der arteriellen Hypertonie

könnte eine erhöhte Aortensteifigkeit beteiligt sein, die im zweiten Teil dieser Arbeit

90

näher untersucht wurde. In GCKO-Mäusen ist die aortale Steifigkeit und daraus

resultierend die Pulswellengeschwindigkeit (PWV) deutlich erhöht. Die Steigerung der

PWV wird in den GCKO-Tieren zusätzlich durch den verminderten Aorten-Durchmesser

bedingt. Außerdem weisen die Aorten dieser Tiere eine veränderte Wandstruktur auf,

die zu einer Verminderung der aortalen Windkesselfunktion führt. Diese Veränderungen

könnten die Blutdruckerhöhung in GCKO-Mäusen erklären. In SMC-GCKO-Tieren tritt

keine dieser Gefäß-Modifikationen auf. Eine Aortensteifigkeit als mögliche Ursache für

den erhöhten systolischen Blutdruck in den SMC-GCKO-Tieren kann somit

ausgeschlossen werden. Zur Aufklärung müssen weitere Versuche zum Aufbau der

Gefäßwände und zur Bestimmung des peripheren Widerstands gemacht werden. Auch

der Einfluss anderer Zelltypen, wie z.B. Perizyten oder Fibroblasten, auf die

Blutdruckregulation sollte untersucht werden.

7 Summary

The NO/cGMP-mediated signaling cascade is crucially involved in the regulation of blood

pressure. Within the cascade, NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) plays a key role

as the most important receptor for the signaling molecule nitric oxide (NO).

NO is endogenously produced by three different isoforms of NO synthase. Binding of NO

to NO-GC stimulates the production of the second messenger cyclic guanosine

monophosphate (cGMP). cGMP, in turn, activates various effector molecules, finally

leading to smooth muscle relaxation. Another second messenger, the signalling

molecule cyclic adenosine monophosphate (cAMP), also participates in the regulation of

smooth muscle tone and is thus also involved in the regulation of blood pressure.

Phosphodiesterases (PDE) degrade cyclic nucleotides thereby ending their signalling. In

order to investigate the effect of NO-GC on the cardiovascular system, mice with global

(GCKO) or smooth muscle-specific (SMC-GCKO) deletion of NO-GC have been

generated.

To shed light into the interplay of cAMP and cGMP, PDE3 was studied in the first part of

this thesis. PDE3 plays a special role in cGMP/cAMP crosstalk based on its mixed

substrate specificity. From the two PDE3 isoenzymes (PDE3A and PDE3B), only PDE3A

is expressed in the aorta. The aortas of GCKO- and SMC-GCKO animals are more

sensitive to PDE3A inhibition than those from control animals. The acute blockade of

NO-GC using ODQ also leads to this sensitivity effect. As a result of NO-GC deletion,

PDE3A expression and activity are reduced by approx. 50%. This is probably a

91

compensatory response in order to maintain functional cAMP signalling and to guarantee

cAMP-induced relaxation of blood vessels. These results indicate a direct regulation of

PDE3A in smooth muscle cells by the NO/cGMP-signalling cascade and a PDE3-

mediated cAMP/cGMP crosstalk. The exact mechanism how NO-GC/cGMP regulates

PDE3A expression remains unclear; conceivable options are a cGMP-mediated

regulation of transcription or a modulation of PDE3A translation.

Loss of NO-GC in GCKO and SMC-GCKO mice leads to an elevated systolic blood

pressure by around 30 mmHg. In the second part of this thesis, stiffness of aortae from

these KO animals was examined. In GCKO mice, the pulse wave velocity (PWV) was

significantly faster than in control animals indicating an increased aortic stiffness. The

increase in PWV in GCKO animals is likely to be explained by a reduced aortic diameter.

Even though elastin and collagen content were unchanged, the aortas of these animals

have an altered wall structure. SMC-GCKO animals show neither an increase in PWV

nor morphological changes of the aorta. Thus, an increased aortic stiffness can be

excluded as cause for the elevated systolic blood pressure in GCKO animals.

92

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10 Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die durch ihre fachliche und moralische Unterstützung zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. In erster Linie gilt mein großer Dank Herrn Prof. Dr. Andreas Friebe für die Überlassung des Dissertationsthemas und das Vertrauen in meine Arbeit. Ich bin sehr dankbar, dass mich meine Wege und meine Suche nach einer geeigneten Promotionsstelle nach Würzburg und in Dein Büro führten. Ich danke Dir für Deine stets offene Tür, Deine wertvollen Ratschläge und konstruktiven Ideen. Das alles hat mir spannende und vor allem lehrreiche Einblicke in die Wissenschaft ermöglicht. Auch möchte ich mich herzlich bei Herrn Prof. Dr. Erhard Wischmeyer, für die Bereitschaft als mein Zweitgutachter zu fungieren, bedanken. Ich danke Dir für Deine Zeit und Motivation dich mit meiner Arbeit auseinanderzusetzen. Herrn Dr. Volker Herold vom Lehrstuhl für experimentelle Physik 5 der Universität Würzburg danke ich für die Erklärung und Hilfe bei den MRT-Messungen und deren Auswertung. In diesem Kontext danke ich auch Sabine Voll, die mir in dieser Zeit immer mit Rat und Tat zur Seite stand. Mein besonderer Dank gilt allen ehemaligen und derzeitigen Mitarbeitern der AG Friebe, die mir den Alltag nicht nur durch ihre unerschütterliche Expertise, sondern auch durch ihr sonniges Gemüt versüßten: Danke, Dieter Groneberg, Barbara Voußen, Katharina Beck, Annemarie Aue, Linda Holzer, Fabian Schwiering, Nadine Mauro und Noomen Bettaga. Danke, für Eure wertvollen Ratschläge, Anregungen und Tipps, die herausragenden Diskussionen, die tolle Atmosphäre und die gute Zusammenarbeit. Danke, liebstes Spaßlabor. Weiterhin bedanken möchte ich mich bei Marco Abeßer, Benjamin Aßmus, Melanie Ullrich, Annemarie Augustin und Kai Schuh sowie Estefania Prentki Santos, Katarina Spiranec und Erick Miranda Laferte. Ich danke Euch für die wunderbaren Ablenkungen, die vielen tollen & überaus lustigen Stunden und die insgesamt wunderschöne Zeit in Würzburg. Darüber hinaus möchte ich mich herzlich bei allen übrigen Mitarbeitern des physiologischen Instituts für das tolle Arbeitsklima und die gesprächigen Pausen bedanken. Bedanken möchte ich mich auch bei Gudrun Müller und Regine Knitsch ohne die ich nicht so leicht an diesen Punkt gekommen wäre. Danke Euch beiden für die tolle, manchmal nervige, sehr interessante, aufregende und überaus lustige Studienzeit und eure Freundschaft auch jetzt noch. Ein ganz großer Dank geht an eine Handvoll außergewöhnlicher Menschen: Annika Weigl-Strebel, Magdalena Kasper, Sarah Zimmermann und Anna-Maria Ebling. Ihr begleitet mich schon mehr als mein halbes Leben und seid darin ein wesentlicher und wertvoller Bestandteil. Ihr habt mich immer wieder aufgebaut, mit mir geweint, getanzt und besonders viel gelacht. Danke meine „magic 5“. Ein weiterer wichtiger und einzigartiger Lieblingsmensch, den ich niemals missen möchte, ist Verena Ilgen. Ich danke Dir für Deine Zuverlässigkeit, unverhohlene Ehrlichkeit, Deinen immerwährenden Zuspruch und Deinen bedingungslosen Beistand in den letzten 14 Jahren und erst recht in der letzten Zeit, die wirrer, lustiger, berührender und aufregender nicht hätte sein können. Mädels, ich bin Euch überaus dankbar und freue mich auf viele fabelhafte Jahre mit Euch. Zwei weitere tolle, liebe und wichtige Menschen habe ich auch hier treffen dürfen: Katharina Beck und Estefania Prentki Santos. Ihr seid der HIT! Ich danke Euch für Eure Offenheit, Eure Gelassenheit, Euren Humor, zusammengefasst für Eure Freundschaft. Eins habe ich mit Euch gelernt „wie man es auch dreht, am Ende zählt wir ham gelebt“. Nur auf dem Papier zuletzt möchte ich meiner gesamten tollen Familie danken. Allen voran danke ich meiner großartigen Mama Barbara, die mir ein echtes Vorbild ist, meiner unglaublichen und bewundernswerten Schwester Melanie und meiner starken und wundervollen Schwester Nadia. Auch meinem Neffen Gabriel und meiner Nichte Elora möchte ich Danke sagen, weil sie mich so wunderbar ablenken und aufheitern. Weiterhin danke ich meinem brillanten und liebenswerten Onkel Andreas. Liebste Familie, ich danke euch für Eure grenzenlose Unterstützung, Euer Verständnis, Euer Mitgefühl, Euer Vertrauen, Eure Liebe. Ihr seid die beste Familie, die man sich nur wünschen kann. Danke auch an meinen Freund Steffen. Ich danke Dir unendlich für Deine Geduld, Deine unermüdliche Diskussionsbereitschaft, Deine Motivation, Deinen Humor, für Alles. Ich freu mich auf die Zukunft mit Dir und bin gespannt auf alles was da kommen mag.

Einfluss der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase auf den cGMP ... · Einfluss der NO-sensitiven...

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