Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik I

der Universität Würzburg

Direktor: Professor Dr. med. Georg Ertl

Einfluss von Monozyten auf Heilungsvorgänge und kardiale Thromboembolien nach einem

Myokardinfarkt

Inaugural - Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät

der

Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Tobias Bobinger

aus Erlangen

Würzburg, Februar 2012

Referent: Prof. Dr. med. S. Frantz

Koreferent: Prof. Dr. med. C. Kleinschnitz Dekan: Prof. Dr. med. M. Frosch Tag der mündlichen Prüfung: 13.06.2012 Der Promovend ist Arzt.

Meinen Eltern

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extrazellulären Matrix (Porter and Turner 2009). Sie sind damit zudem

mitverantwortlich für die Aufrechterhaltung der Architektur der Herzens.

Angiotensin II, TGF-β (transforming growth factor β) und Aldosteron wirken

aktivierend auf Fibroblasten und können somit eine erhöhte Kollagenproduktion

mit nachfolgend entstehender Fibrose auslösen. Bestehende

Kollagenstrukturen können aber auch durch Metalloproteinasen (MMP)

aufgebrochen werden (Opie, Commerford et al. 2006). Diese können in mehr

als 25 verschiedene Typen eingeteilt werden, die jeweils spezifisch für

bestimmte Substrate der Matrix arbeiten (Lambert, Lopez et al. 2008). Zudem

sind diese Metalloproteinasen auch fähig, Zytokine, Chemokine oder

Wachstumsfaktoren in ihrer biologischen Aktivität zu beeinflussen

(Dobaczewski, Gonzalez-Quesada et al. 2009). Produziert werden sie entweder

durch Zellen im Myokard wie Myozyten, Fibroblasten und Endothelzellen oder

durch eingewanderte Zellen wie Makrophagen und neutrophile Granulozyten

(Lindsey 2004). In einer Studie von McGavigan et al. werden nach einem

Herzinfarkt im Serum die Marker für Kollagenauf- und abbau bestimmt. Dabei

zeigt sich ein Verlust von 25% des Kollagens innerhalb der ersten 24 Stunden

nach dem Infarkt. Zudem konnte eine direkte Korrelation zwischen dem initalen

Abbau und den in der Echokardiographie sichtbaren Umbauvorgängen gezogen

werden (McGavigan, Maxwell et al. 2006). Bei den Makrophagen spielt

insbesondere das MMP-9 bei den Umbauvorgängen die größte Rolle. MMP-9

ist unter anderem für die Denaturierung von Gelatin zuständig (Nagase, Visse

et al. 2006). Die Auswirkungen durch MMP-9 nach einem Infarkt kann durch

eine Studie an MMP-9-Knockout-Mäusen demonstriert werden. Hierbei zeigt

sich neben einer geringeren Kollagenakkumulation eine deutlich geringere

Dilatation des linken Ventrikels (Ducharme, Frantz et al. 2000). Zusätzlich wird

auch die Rolle bei der Neubildung von Gefäßen sichtbar, bei der sich jedoch

Unterschiede zwischen Skelett- und Herzmuskel zeigen. Im Skelettmuskel

kommt es nach einer Ischämie beim Wildtyp zu einer Verdopplung der

Kapillardichte, während in MMP-9 Knockout-Mäusen keine Veränderung auftritt

(Johnson, Sung et al. 2004). Im Herzmuskel dagegen führt eine Ausschaltung

von MMP-9 bei Knockout-Mäusen zu einer besseren Neovaskularisation nach

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dem Infarkt (Lindsey, Escobar et al. 2006). Diese Studien lassen MMP-9 als

interessanten Ansatzpunkt erscheinen, doch ist derzeit kein spezifischer MMP-

Inhibitor verfügbar (Lambert, Lopez et al. 2008). Neben

Matrixmetalloproteinasen schütten Makrophagen auch noch eine Reihe anderer

Wachstumsfaktoren und Zytokine aus, die einen fördernden Einfluss auf das

Gefäßwachstum haben. Darunter befinden sich zum Beispiel Thrombospondin-

1, Interferon α, IL-1 (Interleukin-1), TNFα (tumor necrosis factor α) und TGFβ

(transforming growth factor β) (Lambert, Lopez et al. 2008).

In den letzten Jahren hat sich somit deutlich gezeigt, dass die Monozyten eine

Vielzahl von Aufgaben besitzen und gleichzeitig über die Ausschüttung von

Zytokinen und Wachstumsfaktoren in viele Vorgänge bei der Wundheilung

eingreifen. Ihre genaue Aufgabe beim Herzinfarkt ist bis jetzt noch in großen

Teilen unverstanden und bietet dennoch aufgrund des Aufgabenspektrums der

Monozyten eine große Chance, regulierend in die Heilungsvorgänge

einzugreifen und Patienten mit Herzinfarkt bessere Langzeitchancen zu

ermöglichen. An einem Cryomodell durch van Amerongen et al. können schon

die Auswirkungen einer Makrophagendepletion nach einem Infarkt demonstriert

werden. Es kommt neben einer unvollständigen Abräumung der abgestorbenen

Zellen und geringeren Kollagenproduktion auch zu einer deutlich gesteigerten

Mortalität und stärkeren linksventrikulären Umbauvorgängen (van Amerongen,

Harmsen et al. 2007). Allerdings handelt es sich bei dieser Studie um ein

Cryomodell, der Infarkt wird also epikardial und durch eine Vereisung bei -

196°C erzeugt. Diese Vorgänge entsprechen nicht den Vorgängen bei einem

echten Herzinfarkt, der durch einen Verschluss der Koronararterie entsteht.

Deshalb muss davon ausgegangen werden, dass sich die Vorgänge in

wichtigen Teilen unterscheiden.

In dieser Arbeit wird versucht, die Rolle von Monozyten in Bezug auf

Heilungsvorgänge und, wie sich in den Versuchen zeigt, entwickelnde

Thromboembolien nach einem Myokardinfarkt näher aufzuklären. An den

Mäusen wird durch eine Ligatur ein Infarkt erzeugt. In bestimmten

Zeitabständen zu der Operation erhalten die Mäuse retrobulbär eine Injektion

von Clodronat in der Behandlungsgruppe oder PBS-Lösung in der

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Kontrollgruppe. Clodronat wird in Kombination mit einem Liposom von den

Monozyten aufgenommen. Intrazellulär kommt es nach Zerstörung der

liposomalen Membranen durch Lysosomen zur Freisetzung und Akkumulation

von Clodronat. Auf diese Weise erfolgt eine spezifische Elimination der

Monozyten. Ein Vergleich zwischen der Clodronat-behandelten Gruppe und der

Kontroll-Gruppe zeigt Unterschiede auf, die somit auf Monozyten

zurückzuführen sind.

2. Material und Methoden

2.1 Versuchstiere

Für die Experimente werden C57BL/60laHsd Mäuse von Harlan-Winkelmann

(Borchen, Deutschland) verwendet. Die Tiere sind weiblich und zum

Versuchszeitpunkt etwa 8-9 Wochen alt. Zum Zeitpunkt der Organentnahme

beträgt das Gewicht der Tiere etwa 19 – 28 g. Während der gesamten

Versuchszeit werden sie tiergerecht nach geltenden Vorschriften versorgt.

Zudem liegt eine behördliche Genehmigung zur Durchführung der Tierversuche

vor.

2.2 Operation

Um einen Myokardinfarkt zu induzieren, wird in einer Operation die linke

vordere absteigende Koronararterie ligiert (Michael, Entman et al. 1995;

Kumar, Hacker et al. 2005). Im ersten Schritt werden die Tiere in einen Glastopf

gesetzt, der mit Diethylether (Honeywell Speciality Chemicals Seelze GmbH,

Seelze, Deutschland) gefüllt ist und auf diese Weise narkotisiert. Für die

Atemwegssicherung erfolgt eine Intubation der Tiere, für die eine

handelsübliche Venenverweilkanüle (BD VenflonTM Pro, Becton Dickinson,

Heidelberg, Deutschland) des Menschen verwendet wird. Die Versorgung mit

Sauerstoff erfolgt über diese Kanüle mit Hilfe eines Kleintierbeatmungsgerätes

(MouseVentilator, UGO Basile biological research apparatus, Comerio, Italien).

Zudem werden die Extremitäten der Maus in Rückenlage mit Klebestreifen

fixiert. In der Operationsplatte ist zur Verhinderung der Auskühlung ein Heizteil

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integriert. Für die Inhalationsnarkose wird 0,8% Isofluran (Sigma Aldrich

Chemie GmbH, München, Deutschland) und 100%iger Sauerstoff verwendet.

Im nächsten Schritt werden noch Elektroden angebracht und ein

Elektrokardiogramm (cardiofax GEM, Nihon Kohden, Rosbach, Deutschland)

präoperativ abgeleitet. Für die Durchführung der Operation wird Besteck von

der Firma Aesculap (Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Deutschland)

verwendet. Als erster Schritt erfolgt ein Hautschnitt auf Höhe des mittleren bis

unteren Thoraxdrittels etwa auf Höhe des 4. Interkostalraumes. Nun werden der

Musculus cutaneus trunci und die Musculi serratus dorsales und ventrales

durchtrennt. Nach Absetzen des Musculus pectoralis profundus im 4. ICR wird

der Thorax eröffnet. Zum Offenhalten des Thorax wird ein modifizierter

Rippenspreizer verwendet. Auftretende Blutungen werden entweder mit einem

Mikrokoagulator oder einem Tupfer gestillt. Nach der Eröffnung erkennt man

nun das Perikard, welches nun direkt vom Herzen abgesetzt und ein Stück

davon entfernt wird. Aus Erfahrungswerten kann die Arteria coronaria sinistra

nun besser dargestellt werden, wenn zuerst unter das linke Herzohr ein kleiner

Tupfer gelegt wird. Zunächst wird die Arteria coronaria sinistra 1mm apikal des

linken Vorhofes umstochen und darauf mit einem chirurgischen Nahtmaterial

(Vicryl, Ethicon GmbH, Norderstedt, Deutschland) abgebunden. An dem

abgeleiteten Elektrokardiogramm lässt sich nun erkennen, ob durch die Ligation

eine Ischämie eingetreten ist. Nun werden die Muskelschichten und die Faszie

wieder adaptiert und die Haut mit Klammern verschlossen. Bis zum Einsetzen

der Spontanatmung wird die Maus noch unter eine Wärmelampe gelegt.

Während dieser Zeit wird 100% reiner Sauerstoff über die eingeführte

Venenverweilkanüle zugeführt. Die postoperative Schmerztherapie erfolgt über

eine Injektion mit Buprenorphin (Temgesic®, Essex Pharma, München,

Deutschland) mit einer Dosierung von 0,1mg/kg Körpergewicht. Nach dem

Erwachen werden die Mäuse wieder in den Käfig zurückgelegt.

2.3 Makrophagendepletion über die retrobulbäre Inje ktion mit Clodronat

Die Ausschaltung von Makrophagen wird über in Liposomen verpacktes

Clodronat (Cl2MDP) durchgeführt. Dies ist eine gängige Methode und wird

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bereits seit längerem für viele Fragestellungen in Bezug auf die

Makrophagenfunktion durchgeführt (van Rooijen and Sanders 1997).

Als Trägersubstanz für das Clodronat werden Liposomen benötigt. Die

Lipidmoleküle in den Liposomen bestehen aus hydrophilen und hydrophoben

Anteilen. Um den Kontakt zwischen hydrophoben Anteilen und Wasser zu

vermeiden, ordnen sie sich in einer kugelförmigen Doppelschicht um das

wässrige Kompartiment an. Somit stehen im kugeligen Liposom die hydrophilen

Anteile nach außen und die hydrophoben Anteile nach innen. Werden bei der

Herstellung andere hydrophile Moleküle wie etwa auch Clodronat mit aufgelöst,

werden diese Moleküle bei der Bildung der Liposomen mit aufgenommen.

Clodronat stammt aus der Gruppe der Bisphosphonate und wurde

hauptsächlich für die Behandlung von osteolytischen Knochenkrankheiten

entwickelt. Da Clodronat eine hohe Affinität zu Calcium zeigt, reichert es sich im

Knochen an und scheint dort eine direkte Auswirkung auf Osteoklasten zu

besitzen. Diese Zellen sind ebenfalls wie die Makrophagen Bestandteile des

monozytären Phagozytosesystems (van Rooijen and Hendrikx 2010). Die

Liposomen werden von den Makrophagen in Kombination mit dem Clodronat

via Endozytose aufgenommen. Nach Fusion mit den Lysosomen im

Makrophagen erfolgt eine Aktivierung der Phospholipasen und es kommt durch

diese Enzyme zu einer Zerstörung der Phospholipidschicht mit anschließender

Freisetzung des Clodronats in die Zelle (Van Rooijen and Sanders 1994). Da

die Wand dieser Zelle ebenfalls aus einer Phospholipid-Doppelschicht besteht,

kommt es im Folgenden zu einer Akkumulation von Clodronat (van Rooijen and

Hendrikx 2010). Ab einer bestimmten Menge dieser Substanz wird in den

Makrophagen der apoptotische Zelltod eingeleitet (Naito, Nagai et al. 1996; van

Rooijen, Sanders et al. 1996). Zudem besitzt Clodronat nur eine sehr kurze

Halbwertszeit sowohl in der Zirkulation als auch in Körperflüssigkeiten und

somit werden keine anderen Zellen in ihrer Funktion beeinträchtigt (van Rooijen

and Sanders 1997). Der Erfolg dieser Methode bei der Makrophagendepletion

wurde in vielen Studien bewiesen, an der Milz sowohl immunhistochemisch

(van Rooijen and van Nieuwmegen 1984) als auch elektronenmikroskopisch

(van Rooijen, van Nieuwmegen et al. 1985). Aus diesen Gründen scheint die

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Kombination aus Liposomen und Clodronat eine ideales Werkzeug, um die

Funktion der Makrophagen näher zu untersuchen.

Die Herstellung der Lösung erfolgt in dem Labor von Prof. van Rooijen in

Amsterdam. Die einzelnen Schritte werden in zahlreichen Veröffentlichungen

verdeutlicht (Van Rooijen and Sanders 1994). Die gelieferte Clodronatlösung

enthält 5mg Cl2MDP pro ml. In einigen Studien wird gezeigt, dass bei Mäusen

die Dosis von 0,1ml pro Injektion die größte Effektivität bezüglich der Apoptose

von Makrophagen besitzt (Van Rooijen and Sanders 1994). Diese

Injektionsmenge wird deshalb auch bei dieser Versuchsreihe verwendet.

Für diese Studie werden sowohl die Clodronat-Liposom- als auch die PBS-

Lösung (Liposom und Salzlösung gepuffert mit Phosphat) von dem Labor van

Rooijen (Amsterdam, Niederlande) bezogen. Es werden verschiedene

Behandlungsgruppen gebildet. Die Kontrollgruppe der Mäuse erhält eine PBS-

Liposomen-Injektion, die Behandlungsgruppe eine Clodronat-Liposomen-

Injektion. Für die Clodronat-Liposomen-Injektion werden zwei verschiedene

Zeitpunkte getestet. Eine Gruppe wird 2 Tage vor der Operation, am Tag der

Operation, am zweiten sowie vierten Tag nach der Operation behandelt. Die

zweite Versuchsgruppe wird nur am fünften, siebten und neunten Tag nach der

OP behandelt. Die Injektion der Clodronat- oder PBS-Lösung erfolgt in den

retrobulbären Venenplexus.

2.4 Echokardiographie

Am Tag 1, 7 und 28 nach der Operation wird bei allen Tieren eine

Echokardiographieuntersuchung durchgeführt (Tanaka, Dalton et al. 1996). Ob

es sich um die Kontroll- oder Behandlungsgruppe handelt, ist dem Untersucher

nicht bekannt. Vor der Untersuchung werden die Tiere mit einem

Inhalationsgemisch aus 0,8%igem-Isofluran und 100%igem-Sauerstoff

narkotisiert und in Rückenlage mit einem Klebeband festgeklebt. Nun können

sie im Thoraxbereich rasiert und Elektroden für die Ableitung eines EKGs

angelegt werden. Sämtliche Untersuchungen werden an einem Maus-

Echokardiographie-Gerät (Toshiba Aplio Typ SSA-700A, Toshiba Medical

Systems GmbH, Neuss, Deutschland) mit einem 15 MHz-Schallkopf

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durchgeführt. Die Messungen und Berechnungen der Flächen und

Durchmesser wird mit dem Computerprogramm Image Arena Version 2.8.1

(TomTec Imaging Systems, München, Deutschland) durchgeführt. Die

Messungen werden in der kurzen Achse sowohl auf Papillarmuskelebene (PA)

als auch apikal (AP) vorgenommen. Für jede Stelle werden drei Messungen

durchgeführt und dann das Mittelmaß bestimmt. Im B-Mode („brightness

modulation“) kann der Herzventrikel direkt dargestellt werden, indem die Sonde

ungefähr senkrecht zur Körperoberfläche bewegt wird. Auf diese Weise wird im

zweidimensionalen Schnittbild die kleinste, also endsystolische (ESA) und die

größte, also enddiastolische Fläche (EDA) der Herzhöhlen bestimmt. Durch

diese Werte kann nun sowohl für die apikale als auch die Papillarmuskelebene

das „fractional shortening“ (2D-FS) der Fläche berechnet werden.

2D-FS = (EDA-ESA) / EDA

Das „Fractional shortening“ zeigt die Verkleinerung beziehungsweise

Vergrößerung der Fläche des Herzens während des Pumpvorganges an. Im M-

Modus („motion modus“) können Bewegungsabläufe eindimensional dargestellt

werden. Somit kann der enddiastolische (EDD) und endsystolische (ESD)

Durchmesser gemessen werden. Mit diesen Werten kann nun die prozentuale

Verkürzung des Herzdurchmessers (MM-FS) für beide Ebenen während des

Pumpvorganges berechnet werden.

MM-FS = (EDD-ESD) / EDD

Des weiteren werden noch die Werte für die Dicke der Vorderwand (EDVW),

die Hinterwand (EDPW) und die Herzfrequenz gemessen. In die weiteren

Untersuchungen werden nur Tiere mit einer Infarktgröße über 30% einbezogen.

2.5 Gewebeentnahme – Präparation

Nach der letzten Echokardiographie am 28. Tag werden die Tiere in Narkose

getötet und die Herzen entnommen. Nachdem der rechte Ventrikel abgetrennt

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ist, wird der linke Ventrikel in vier gleich große Ringe geteilt. Für die Fixierung

werden die Ringe zunächst in weiße Kassetten eingelegt und in ein Glas mit

frisch angesetztem 20%igem Formalin für 24 Stunden gegeben, danach für 1

Stunde in zweifach demineralisiertes Wasser. Um von dem Gewebe

gleichmäßige Schnitte herstellen zu können, muss es in Paraffin eingebetet

werden. Da Paraffin wasserunlöslich ist, erfolgt zunächst eine Entwässerung in

einer speziellen Entwässerungsmaschine mittels einer aufsteigenden

Alkoholreihe (Bavimed Laborgerätebau GmbH, Birkenau, Deutschland).

70% Ethanol für 1 Stunde

90% Ethanol für 1 Stunde

96% Ethanol für 1 Stunde

96% Ethanol für 2 Stunden

96% Ethanol für 2 Stunden

50/50 Xylol/Ethanol für 1 Stunde

100% Xylol für 1,5 Stunden

100% Xylol für 1,5 Stunden

50/50 Xylol/Paraffin für 1 Stunde

100% Paraffin für 1,5 Stunden

100% Paraffin für 3 Stunden

Im Folgenden können die eingebetteten Ringe mit dem Schlittenmikrotom Hn40

(Reichert-Jung, Leica Microsystems, Nussloch, Deutschland) geschnitten

werden. Die Schnitte werden auf Objektträger (SuperFrost Plus Objektträger, R.

Langenbrinck Labor- und Medizintechnik, Teningen, Deutschland) gezogen und

für mindestens 12 Stunden bei 60°C in einem Wärmesc hrank aufbewahrt.

Hierauf können in dem nächsten Schritt die Schnitte gefärbt werden.

2.6 PSR-Färbung (Pikrosirius-Rot-Färbung)

Die PSR-Färbung ist eine Standardfärbemethode zur Darstellung von Kollagen.

Dieser Farbstoff enthält stark saure sulfonsäurehaltige Gruppen, die sich mit

den basischen Gruppen im Kollagenmolekül verbinden und vorhandenes

Kollagen deshalb in der Infarktnarbe als stark rot erscheinen lassen (Junqueira,

Bignolas et al. 1979). Der unbeschädigte Herzmuskel ohne Infarkt wird als

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gelber Bereich sichtbar, da dort sehr wenig bis kein Kollagen vorhanden ist.

Nachdem die Paraffinschnitte in einer Xylol- und Ethanolreihe entwachst und

rehydriert wurden, erfolgt eine Färbung in der PSR-Lösung für genau 20

Minuten und hierauf eine erneute Entwässerung.

Xylol Behälter I für 5 Minuten

Xylol Behälter II für 5 Minuten

Xylol Behälter III für 5 Minuten

Xylol 50% / Ethanol 50% für 5 Minuten

Ethanol 100% für 5 Minuten

Ethanol 95% für 5 Minuten

Ethanol 50% für 5 Minuten

Spülschritt mit destilliertem Wasser

Färbung in PSR-Lösung für 20 Minuten

Ethanol 50% für 1-2 Minuten

Ethanol 75% für 1-2 Minuten

Ethanol 95% für 1-2 Minuten

Xylol 50% / Ethanol 50% für 5 Minuten

Xylol Behälter 1 für 5 Minuten

Xylol Behälter 2 für 5 Minuten

Xylol Behälter 3 für 5 Minuten

Nach einer Entwässerung wird auf die histologischen Schnitte mittels Entellan

(Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland), einer Lösung von Polymeren in Xylol,

ein Deckglas aufgebracht.

2.7 Masson Trichrom Färbung

Als weitere Färbemethode wird die Masson Trichrom Färbung dazu verwendet,

um Kollagen und Granulationsgewebe nach einem Infarkt nachzuweisen.

Hierfür werden ebenfalls Schnitte verwendet, die zuvor in Paraffin eingebettet

wurden. Zuerst muss auch bei dieser Färbemethode eine Entparaffinierung und

Wässerung über Xylol und Ethanol durchgeführt werden. Die Färbung wird

nach einer bereits im Labor etablierten Vorschrift mit Hilfe des Accustain®-Kits

von Sigma (Accustain® Trichdrome Stains, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

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Steinheim, Deutschland) durchgeführt. Zunächst erfolgt die Färbung der

Präparate für 1 Stunde bei 56°C in einer Bouin-Lösu ng (gesättigte Pikrinsäure,

Formaldehyd, Essigsäure), später für 10 Minuten in Weigert’s

Eisenhämatoxylinlösung (Hämatoxylin, 95% Alkohol, 29% Eisenchlorid,

konzentrierte Salzsäure, destilliertes Wasser) und schließlich für 10-15 Minuten

in Biebrich-Säure-Fuchsin-Lösung (Biebrichlösung, Fuchsinsäure, Essigsäure).

Zwischen jedem Färbeschritt werden die Schnitte mit destilliertem Wasser von

Farbstoffresten abgewaschen. Die weitere Färbung erfolgt für 10 Minuten in

Phosphomolybdicsäure, in Anilinblaulösung für 5 Minuten und in 1% Salzsäure

für 2 Minuten. Im Anschluss werden die Präparate entwässert und mittels

Entellan (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) ein Deckglas aufgebracht und

für die Lichtmikroskopie vorbereitet. Durch diese Färbemethode werden

Kollagenfasern blau, Zellkerne schwarz und Muskulatur rot angefärbt.

2.8 Infarktgrößenbestimmung

Von Tieren aus der Behandlungs- und der Kontrollgruppe wird nach der PSR-

Färbung eine Infarktgrößenbestimmung durchgeführt. Dazu werden diese Bilder

unter dem Mikroskop Axioskop 2 plus (Carl Zeiss GmbH, Jena, Deutschland)

mit Kameraaufsatz digital aufgenommen. Es wird darauf geachtet, dass unter

10facher Vergrößerung jeweils der komplette linke Ventrikel zur Abbildung

kommt. Die Aufnahme auf eine digitale Bilddatei erfolgt mit dem Programm

MetaMorph 2.0 (Molecular Devices, Downingtown, PA, USA). Die weitere

Auswertung erfolgt mit der Software ScionImage (Scion Corporation, Maryland,

USA). Mit diesem Programm wirde sowohl am Endo- als auch Epikard das

gesunde und infarzierte Areal gemessen. Aus diesen Werten wird die

prozentuale Infarktgröße errechnet.

2.9 Infarktexpansionsmessung

An 11 Tieren aus der Clodronat-Gruppe und 9 Tieren aus der PBS-Gruppe wird

eine Infarktexpansionsstudie durchgeführt, wie durch Fraccarollo et al.

beschrieben (Fraccarollo, Galuppo et al. 2002). Dabei werden die Herzen durch

eiskalte Kaliumchloridlösung in der diastolischen Herzphase fixiert. Durch eine

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Hängeeinrichtung ist es möglich, den linken Ventrikel mit 10% Phosphat-

gepuffertem Formalin mit einem konstanten Druck von 7,5mmHg über 2

Stunden zu spülen. Danach werden die Herzen abgehängt, entwässert, in

Paraffin eingebettet und mittels Schlittenmikrotom (Hn40, Reichert-Jung, Leica

Microsystems, Nussloch, Deutschland) 7µm dünne Schnitte von der Spitze bis

zur Basis in einem Abstand von etwa 1mm erstellt. Hierauf erfolgt eine PSR-

Färbung wie bereits unter Punkt 2.6 beschrieben. Nun kann unter dem

Mikroskop Axioskop 2 plus (Carl Zeiss GmbH, Jena, Deutschland) und einer

Kamera die Aufnahme des vollständigen Herzschnittes erfolgen. Die

Auswertung wird mit Hilfe des Computerprogramms Sigma Scan Pro 5.0

(Systat Software Inc., San Jose, California, USA) durchgeführt. Bei der

Auswertung wird darauf geachtet, dass für jedes Herz der Schnitt mit der

größten Ausdehnung des Ventrikels benutzt wird. Die Infarktgröße wird als

Anteil des infarzierten Bereichs am Gesamtventrikel berechnet. Die

Infarktexpansion kann nun nach folgender Formel (Fraccarollo, Galuppo et al.

2002) berechnet werden:

Infarktexpansion = (Fläche Lumen des linken Ventrikels / Fläche gesamter

linker Ventrikel) x (Septum Dicke / Narben Dicke)

2.10 FACS-Analyse

Durch diese Untersuchung können innerhalb kürzester Zeit eine große Menge

von Zellen weiter charakterisiert werden.

Der Laserstrahl des Gerätes trifft direkt auf die Proben in der Küvette und wird

abgelenkt, gestreut und reflektiert. Zudem wird bei Einsatz von

fluoreszenzgekoppelten Antikörpern durch die angeregten Farbstoffe Licht von

verschiedenen Wellenlängen frei. Durch Spiegel und Filter erfolgt eine

Auftrennung in die einzelnen Wellenlängenbereiche und dies kann ebenso

durch Detektoren erfasst werden. (Luttmann, Bratke et al. 2009)

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Abb. 3: Prinzip der FACS-Analyse: Die Zellen werden markiert und in einem laminaren

Probenstrom einzeln durch einen Laser geleitet. Es wird sowohl das durch den

fluoreszenzmarkierten Antikörper emittierte Licht als auch die reflektierte und gestreute

Strahlung des Lasers erfasst. Hierüber lassen sich Aussagen über die Zellgröße, Granularität

sowie Spezifität der Antikörper treffen. Skizze modifiziert nach S. 78 (Luttmann, Bratke et al.

2009)

Abb. 4: Parameter FSC sowie SSC: Das Licht des Lasers trifft auf die Zelle. Neben dem

Streulicht in Verlängerung des Laserstrahls (FSC, Maß für die Zellgröße) wird auch das

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Seitwärtsstreulicht (SSC; Maß für die Granularität) erfasst. Skizze modifiziert nach S. 81

(Luttmann, Bratke et al. 2009)

Ändert der Laserstrahl nach Auftreffen auf eine Zelle durch die Größe oder

Oberflächeneigenschaft in die Verlängerung des Strahls seine Richtung, kann

dies durch eine FSC-Diode (Forwardscatter) erfasst werden und somit auf die

Größe der Zelle geschlossen werden. Wird der Strahl durch intrazelluläre

Strukturen wie etwa den Zellkern um einen 90°-Winke l abgelenkt, kann dies

durch eine SSC-Diode (Sidescatter) ermittelt werden und somit als ein Maß für

die Granularität verwendet werden (Luttmann, Bratke et al. 2009).

Von je 5 Tieren aus der Clodronat- und Kontrollgruppe werden die Monozyten-

und Granulozytenzahlen über FACS-Analyse ermittelt. Dazu werden ungefähr

18 Stunden nach der Clodronat-/PBS-Injektion 50µl Blut aus der Augenvene

gewonnen. Das Blut wird in eine heparinisierte 50µl Kanüle aufgezogen und

somit ungerinnbar gemacht. Im nächsten Schritt wird das Blut mit PBS-Lösung

(phosphatgepufferte Salzlösung) und 0,5% BSA (Albumin aus Rinderserum)

verdünnt. Nun wird es in einem abgedunkelten Raum bei Raumtemperatur mit

folgenden Antikörpern versetzt:

Anti-CD11b-PE 1:400 (BD biosciences, clone M1/70, San Jose, USA)

Anti-F4/80-FITC 1:400 (eBioscience, clone BM8, San Diego, USA)

Anti-Ly6G-Cy5.5 1:10000 (BioLegend, clone 1A8, San Diego, USA)

Anti-Ly6C-Alexa647 1:400 (eBioscience, HK1.4, San Diego, USA)

Nach Zugabe der Antikörper wird die Suspension für weitere 15 Minuten in

einem lichtgeschützten Raum inkubiert. Hierauf wird das Gemisch mit PBS-

Lösung gewaschen und in einem Fixations-Permeabilitationspuffer (Flow

Cytometry Staining Buffer, eBioscience, San Diego, USA) für 30 Minuten

aufbewahrt. Die Proben werden nun in dem Gerät BD FACS Calibur (BD

Biosciences, San Jose, USA) analysiert und mit der Software Cellquest (BD

Biosciences, San Jose, USA) ausgewertet.

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2.11 Mikroskopie der Thrombusformation in FeCl 3-verletzten

Mesenterialarteriolen

Dieser Versuch wird ebenfalls sowohl an Tieren aus der Clodronat- als auch

aus der Placebogruppe durchgeführt, um Auswirkungen des Wirkstoffes auf die

Thrombusformation feststellen zu können. Die Versuchsanordnung wurde vor

kurzem veröffentlicht (Varga-Szabo, Braun et al. 2008). Nach Einleitung einer

Anästhesie wie unter Punkt 2.3 bereits beschrieben, wird durch eine Inzision in

der Mittellinie des Abdomen die Mesenterialarterie aufgesucht und freigelegt.

Als Mikroskop steht ein Axiovert 200 (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena,

Deutschland) mit einer 100 Watt Quecksilberhöchstdruckfluoreszenzlampe

(HBO) zur Verfügung. Das Mikroskop hat einen invertierten Aufbau. Dies

bedeutet, dass die Lichtquelle und der Kondensator im oberen Teil, das

Objektiv im unteren Teil angebracht sind. Unter 10facher Vergrößerung ist es

mit diesem Mikroskop möglich, die Arteriolen von etwa 35-60µm Durchmesser

dazustellen. Die entstandenen Bilder werden mit der Kamera (CoolSNAP-EZ,

Visitron Systems GmbH, Puchheim, Deutschland) digital aufgezeichnet und mit

der Software Metavue (MDS Analytical Technologies, Downingtown, USA)

bearbeitet. Im Folgenden wird eine Verletzung simuliert, indem für 10 Sekunden

ein 3mm² großes Filterpapier aufgelegt wird, das zuvor in 20%iger

Eisenchloridlösung (FeCl3) getränkt wurde. Zudem werden die Thrombozyten

an einen Fluoreszenz-Antikörper (DyLight 488-konjugierter anti-GPIX Ig)

gekoppelt, um eine Zusammenlagerung oder Anheftung an die Arteriolenwand

besser sichtbar zu machen. Die Abläufe in den Arteriolen werden nun für

mindestens 30 Minuten oder bis zur vollständigen Okklusion aufgezeichnet.

2.12 Immunhistochemie

Dieses Verfahren dient dazu, das Verteilungsmuster von Proteinen in dem

Gewebe sichtbar zu machen. In dieser Arbeit wird das Verfahren genutzt, um

die Verteilung von Makrophagen, neutrophile Granulozyten, T-Zellen sowie

Defekte an Endokardzellen nach dem Infarkt zu erkennen. Diese Zellen tragen

jeweils bestimmte Oberflächenproteine, sogenannte Antigene, gegen die

spezifische Antikörper eingesetzt werden und somit eine Markierung möglich

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machen. Dieser spezifische Antikörper wird auch als Primärantikörper

bezeichnet. Um jedoch die Verteilung im Gewebe sichtbar zu machen, muss

zusätzlich ein Sekundärantikörper eingesetzt werden, der direkt gegen den

Primärantikörper gerichtet ist. Bei dem Sekundärantikörper ist von Bedeutung,

dass er gegen Antikörper aus der Tierart gerichtet sein muss, von welcher der

verwendete Primärantikörper stammt. Bei der direkten Nachweismethode

werden Sekundärantikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen verwendet, die dann

sichtbar gemacht werden können. Oft reicht jedoch dieses Signal nicht aus und

es muss in diesem Fall auf die indirekte Nachweismethode zurückgegriffen

werden, bei der Sekundärantikörper mit einem Enzym-Komplex verwendet

werden. Am häufigsten wird hierbei die Avidin-Biotin-Methode eingesetzt. Avidin

besitzt vier Bindungsstellen für Biotin. Der Biotin-Enzym-Komplex kann über

eine Biotin-Streptavidin-Brücke nahezu irreversibel gebunden werden. In

diesem Versuch wird für die Farbreaktion die Umsetzung von DAB (3,3’-

Diaminobenzidin) durch eine Meerrettich-Peroxidase benutzt. Eine positive

Reaktion zeigt sich durch ein dunkelbraunes Präzipitat.

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Abb. 5: Skizze Avidin-Biotin-Methode: In dieser Skizze ist die Avidin-Biotin-Methode

dargestellt. Zunächst wird ein spezifischer Antikörper hinzugegeben, der gegen das

gewünschte Antigen gerichtet ist. Zusätzlich wird in einem zweiten Schritt ein

Sekundärantikörper mit einem Enzym-Komplex benutzt, der gegen den Primärantikörper

gerichtet ist. Avidin besitzt 4 Bindungsstellen für Biotin, es erfolgt eine nahezu irreversible

Bindung und die Reaktion kann durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht werden. Skizze

modifiziert nach Produktinformation, Vector ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA,

USA)

2.12.1 Immunhistochemie für CD31 und neutrophile Gr anulozyten in

Paraffinschnitten

An Präparaten aus beiden Gruppen wird eine Untersuchung auf Unterschiede

in der Anzahl der neutrophilen Granulozyten und auf Defekte im Endothel

durchgeführt. Zuerst müssen die Paraffinschnitte nach interner Vorschrift über

Xylol und Ethanol entparaffinisiert und rehydriert werden. Da das Gewebe durch

die vorherige Fixierung in Formalin und durch die Einbettung enorm denaturiert

ist und die Antigene Quervernetzungen aufweisen, werden die Schnitte

zunächst für 10 Minuten bei 95°C in einer Unmasking Solution (Vector

Laboratories, CN H-3300, Burlingame, CA, USA) inkubiert und danach bei

Raumtemperatur abgekühlt. Im Anschluss erfolgt eine dreimalige Waschung mit

PBS-Lösung. Um Störungen durch das Hintergrundsignal bei der Färbung zu

vermeiden, erfolgt im nächsten Schritt eine Absättigung der endogenen

Peroxidase mittels 30-minütiger Inkubation in 3%iger Wasserstoffperoxidlösung

(H2O2). Nach diesem Schritt erfolgt eine erneute dreimalige Waschung mit 1-

facher-PBS-Lösung. Um bei der späteren Antikörperzugabe unspezifische

Bindungen und damit einen hohen Hintergrund zu verhindern, wird zusätzlich

als Blockierungsschritt für eine 15-minütige Inkubationszeit ein 5%iges

Kaninchenserum (Normal Rabbit Serum, Vector Laboratories, CN S-5000,

Burlingame, CA, USA) verwendet. Auch nach diesem Schritt schließt sich

erneut für 5 Minuten ein dreimaliges Abwaschen mit PBS-Lösung an. Nun wird

auf die Präparate der Clodronat- und Kontrollgruppe der primäre Antikörper

gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Für diese Versuchsreihe wird der

Antikörper „anti mouse CD31“ (Cat 550274, BD Pharmingen, Franklin Lakes,

NJ, USA) zur Darstellung von CD31 und der Antikörper „Linearis primary rat

24

anti mouse neutrophil antibody“ (Cat. LCU 8993, Clone 7/4, Verdünnung 1:100,

Linearis, Wertheim, Deutschland) zur Darstellung der neutrophilen

Granulozyten benötigt. Zur Überprüfung der Ergebnisse werden jeweils auch

Testschnitte mit einem unspezifischen Antikörper inkubiert. Nachdem erneut

dreimalig für 5 Minuten mit 1facher-PBS-Lösung gespült wurde, kann der

biotinylierte Sekundärantikörper Rabbit Anti Rat (BA 4001, Verdünnung 1:500,

Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Burlingame CA, USA) auf die

Präparate gegeben und für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden.

Auch nach diesem Schritt wird dreimalig für fünf Minuten mit PBS-Lösung

abgewaschen. Nun kann Avidin zusammen mit der Meerrettichperoxidase

(Vectastain ABC Kit, Vector PK 6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA,

USA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit den Schnitten inkubiert werden.

Nach dreimaligem Abwaschen wird DAB-Substanz (Vector SK-4100, Vector

Laboratories, Burlingame, CA, USA) auf die Schnitte gegeben. Nach 10

Minuten werden die Reste der DAB-Substanz abgeklopft und gründlich mit

demineralisiertem Wasser gespült. Nun können die Schnitte nach interner

Vorschrift wieder entwässert und mit Enthellan (Merck KGaA, Darmstadt,

Deutschland) eingebettet werden. Nach Trocknung unter einer Abzugsanlage

werden sie unter dem Lichtmikroskop Axioskop 2 plus (Carl Zeiss GmbH, Jena,

Deutschland) betrachtet, als digitale Bilddatei aufgenommen und ausgewertet.

2.12.2 Immunhistochemie nach CD11b, CD18 und CD25

In dieser Studie wird zudem die Einwanderung von inflammatorischen Zellen in

das Infarktgebiet in beiden Gruppen untersucht. Dabei wird eine abgewandelte

Methode der unter Punkt 2.11.1 geschilderten immunhistochemischen

Untersuchung durchgeführt. Als Primärantikörper werden hier folgende

Substanzen benutzt:

Rat Anti-Mouse CD11b (clone M1/70, BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA)

Rat Anti-Mouse CD25 (clone 7D4, BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA)

Rat Anti-Mouse CD18 (clone C71/16, BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA)

Rat Anti-Mouse CD31 (clone MEC 13.3, BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA)

25

Nach Aufbringen des sekundären biotin-konjugierten Antikörper erfolgt die

Inkubation mit einem HRP-Komplex (streptavidin-Meerrettich/horseradish-

peroxidase, Code K1016, DAKO Deutschland GmbH, Hamburg). Als Enzym

wird hier ebenfalls eine Peroxidase verwendet, als Farbstoff jedoch AEC (3-

amino-9-ethyl-carbazol, Nr. AEC01, Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Deutschland). Das Zytoplasma von positiven Zellen färbt sich bei dieser

Methode rot bis rot-bräunlich. Als Gegenfärbung wird Hämatoxylin-Lösung

verwendet (Gill Nr. 1, Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland).

Wie auch bei vielen anderen immunologischen Verfahren üblich, ist es auch

hier ratsam, einen Antikörper für eine ubiquitär vorhandene Struktur

mitzutesten. Aus diesem Grund wird auch hier ein Antikörper gegen CD31

verwendet.

2.13 ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)

Der ELISA ist ein sehr häufig angewandter Immunoassay, bei dem quantitative

Aussagen getroffen werden. Er erlaubt es, mithilfe eines Enzymmarkers eine

genaue Aussage über die Antigenkonzentration anhand des Substratumsatzes

zu treffen.

26

Abb. 6: Prinzip des ELISA: Auf eine Platte mit dem entsprechenden Antikörper wird das

Antigen gegeben. Zusätzlich wird ein zweiter Detektionsantikörper mit Enzym hinzugefügt. Das

Signal wird nun durch enzymatischen Substratumsatz generiert. Skizze modifiziert nach S. 136

(Luttmann, Bratke et al. 2009)

Zuerst muss der entsprechende Antikörper an eine feste Phase gebunden

werden, das sogenannte „Coaten“. Die Menge der hinzu gegebenen Antikörper

ist somit bekannt. Die Bindung an die Platte entsteht hauptsächlich durch

hydrophobe Wechselwirkungen und ist relativ pH-unabhängig (Luttmann,

Bratke et al. 2009). Da durch freie Proteinbindungen eine hohe

Hintergrundaktivität entstehen kann, müssen diese Stellen abgeblockt werden.

In diesem Versuch wird dafür 0,5% BSA (Rinderserum) mit PBS-Lösung

verwendet. Nun kann das Analysat auf die Platte gegeben werden und sich an

den Antikörper binden. Beim Sandwich-ELISA wird nun ein

Detektionsantikörper hinzugegeben, der spezifisch gegen den Primärantikörper

gerichtet ist. Um diese Verbindung später in einem Photometer sicht- und

auswertbar zu machen, ist an den Detektionsantikörper ein Enzym gebunden.

Nach Zugabe einer Substratlösung und Einhaltung einer Inkubationszeit von 30

Minuten erfolgt eine enzymvermittelte Umsetzung des Substrates, die dann

photometrisch gemessen werden kann. Um eine genaue Standardkurve zu

erhalten, ist es wichtig, dass zwischen den einzelnen Inkubationsschritten

mehrere Waschschritte erfolgen, um ungebundenes Antigen oder Enzyme

auszuwaschen.

In dieser Studie wird mithilfe des Sandwich-ELISA der Gehalt an

Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) nach dem Infarkt in den verschiedenen

Versuchsgruppen gemessen. Dabei wird der kommerzielle Quantikine®-ELISA

(Mouse MMP-9 Immunoassay, Cat. MMPT90, R&D Systems, Abdingdon, UK)

verwendet. Dieser Assay enthält bereits mitgelieferte Mikrotiterplatten (96-Well-

Format), die mit den Antikörpern besetzt sind. Somit entfällt das „Coating“ als

Arbeitsschritt.

27

2.14 Molekulare Analysen

Um weitere Aufschlüsse über Veränderungen am Herzmuskel und die

Unterschiede zwischen den Gruppen erkennen zu können, wird eine real-time

PCR (rt-PCR) aus Myokardgewebe durchgeführt. Zunächst wird die RNA aus

dem Gewebe extrahiert, daraufhin in cDNA (komplementäre DNA)

umgeschrieben und dann quantitativ mittels rt-PCR der Gehalt an TGF

(transformal growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor) und

Collagen-1 gemessen. Dieses Verfahren wurde vor kurzem auch in einer Arbeit

von Frantz et al. beschrieben (Frantz, Hu et al. 2004).

2.14.1 RNA-Isolierung aus dem Gewebe

Für dieses Verfahren ist es sehr wichtig, dass die verwendeten Materialen

RNAse-frei gehalten werden. Die verwendeten Gläser werden nach folgender

laborinternen Vorschrift gereinigt.

Lagerung über Nacht in 1%iger SDS-Lösung (Natriumlaurylsulfat)

Abspülen einmal mit H2O, dann zweimal mit demineralisiertem H2O

Inkubation für 20 Minuten in 3% H2O2

Abspülen mit DEPC-H2O (Diethylpyrocarbonat), hierauf abtrocknen lassen

Für eine Inaktivierung von RNasen wird zusätzlich im weiteren Versuchsablauf

nur DEPC-Wasser verwendet. Die Extraktion wird mittels Trizol®-Reagenz

(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), einer Mischung aus Guanidinthiocyanat und

Phenol durchgeführt. Diese Methode wurde 1987 zum ersten Mal beschrieben

(Chomczynski and Sacchi 1987; Chomczynski and Sacchi 2006). Es kommt zu

einer Auflösung des Gewebes, die RNasen werden jedoch schnell und effektiv

inaktiviert und somit die RNA erhalten. In die, wie oben beschrieben,

gereinigten Gläser wird 1ml Trizol vorgelegt. Ein Stück des Mausherzmuskels

wird in das Glas gegeben und danach mit einem Handrührstab manuell

vorhomogenisiert. Durch einen Homogenisierungsstab (Ultra Turrax Stab,

Janke&Kunkel-IKA Labortechnik, Staufen, Deutschland) erfolgt bei 1500rpm für

etwa 20-30 Sekunden eine maschinelle Homogenisierung. Nach Inkubation für

28

5 Minuten wird 600µl Chloroform (Trichlormethan/Chloroform, Carl Roth,

Karlsruhe, Deutschland) hinzugegeben. Durch Chloroform und eine

anschließende Zentrifugation (Biofuge fresco, Heraeus, Hanau, Deutschland)

kann nun eine Phasentrennung erfolgen, eine wässrige obere Phase mit der

RNA und eine mittlere und untere organische Schicht mit DNA, Proteinen und

dem verbliebenen Trizol®-Reagenz. Die wässrige obere Phase mit der RNA

wird entnommen und in ein anderes Gefäß gegeben. Durch Zugabe von 0,5ml

Isopropanol (2-Propanol, Merck, Darmstadt, Deutschland) und anschließender

Zentrifugation kann die RNA aus der wässrigen Phase weiter aufgereinigt

werden. Das am unteren Rand gebildete Pellet kann in einer Mischung aus

75%Ethanol/DEPC-Wasser aufgenommen und gewaschen werden. Nach einer

erneuten Zentrifugation wird der Überstand erneut abpipettiert, das Pellet

getrocknet und in 10µl DEPC-Wasser aufgelöst. Für die c-DNA-Messung wird

die Konzentration der erhaltenen RNA in einem Photometer (Ultraspec 3000,

GE Healthcare Europe, München, Deutschland) ermittelt.

2.14.2 cDNA Herstellung

Da die extrahierte RNA nicht direkt als Vorlage in einer PCR (Polymerase chain

reaction) eingesetzt werden kann, muss sie zunächst durch eine reverse

Transkriptase in eine komplementäre DNA umgeschrieben werden. Das Enzym

reverse Transkriptase besitzt als Funktion unter anderem eine RNA-abhängige

DNA-Polymerase und kann somit aus der vorhandenen RNA mithilfe dNTPs

(desoxy-Nukleotidtriphosphate) und einem geeigneten Puffer die cDNA

herstellen. Für diesen Vorgang benötigt sie ein Startmolekül, einen

sogenannten Primer, der sich als Startpunkt zunächst an die RNA binden kann.

Bei dieser Studie wird als Primer eine Mischung aus Oligodesoxythymidin-

Nukleotiden (besteht aus etwa 15-20 Desoxythymidinen) und einem random

Hexamer-Oligonukleotid (6 zufällig zusammengesetzte Nukleotide) verwendet.

Durch diese Mischung wird gewährleistet, dass in der cDNA

höchstwahrscheinlich alle RNA-Moleküle repräsentiert sind (Jansohn and

Aigner 2007). Alternativ können auch sequenzspezifische Primer verwendet

werden, um nur einen Teil der RNA zu DNA umzusetzen. Nachdem die Primer

29

an die RNA gebunden haben, kann die Reverse Transkriptase mit der Synthese

beginnen.

In diesem Versuch wird die extrahierte RNA vor der cDNA-Synthese zunächst

mit einer DNAse behandelt, um DNA-Reste in der Lösung zu beseitigen. Zu 1µl

Reaktionspuffer und 1µl DNase (beide AMP-D1, Sigma Aldrich Chemie GmbH,

Steinheim, Deutschland) werden 1µg RNA-Lösung und destilliertes Wasser in

ein RNAse-freies PCR-Tube gegeben. Nach einer Inkubation für 15 Minuten bei

Raumtemperatur wird 1µl Stop-Solution (AMP-D1, Sigma Aldrich Chemie

GmbH, Steinheim, Deutschland) hinzu pipettiert und erneut für 10 Minuten bei

70°C inkubiert. Hierauf wird die Lösung auf Eis abg ekühlt. Für die cDNA-

Synthese wird in jedes Tube 4µl Reaktionspuffer, 1µl Reverse-Transkriptase-

Enzym (iScript, BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) und 4µl

destilliertes Wasser gegeben.

30

Abb. 7: cDNA-Synthese: Die Reaktion beginnt zunächst mit der Bindung des Primer-Moleküls

an die RNA-Matrize. In den nächsten Schritten verlängert die Reverse-Transkriptase den Primer

entlang der RNA und es entsteht eine komplementäre DNA. Skizze modifiziert nach S. 166

(Jansohn and Aigner 2007)

Die Synthese erfolgt nach Herstellerangaben in einem PCR-Gerät

(Mastercycler gradient, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) mit folgendem

Ablauf:

5 Minuten bei 25°C

30 Minuten bei 42°C

5 Minuten bei 85°C

Abkühlung auf 4°C

Falls die Proben nicht direkt am gleichen Tag weiter in der rt-PCR verarbeitet

wurden, werden sie bei -20°C aufbewahrt.

2.14.3 Realtime-PCR (rt-PCR)

Grundlage dieser Methode ist die PCR (Polymerase-Kettenreaktion), mit

welcher Abschnitte einer DNA amplifiziert werden können. Durch die real-time-

PCR ist es zusätzlich möglich, über Einbringen von sequenzspezifischen

Sondenmoleküle und nachfolgenden Fluoreszenzmessungen eine Aussage

über die Menge der ursprünglichen DNA/RNA zu treffen.

Bei der PCR erfolgt zunächst eine Erhitzung der cDNA auf 94°C, so dass es zu

einer Trennung der 2 DNA-Stränge kommt. Nach einer Abkühlung auf 50-60°C

können sich die spezifischen Primer an den jeweiligen Strang anlagern

(Annealing). Eine Temperaturerhöhung auf 72°C sorgt nun für ideale

Bedingungen für die TAQ-DNA-Polymerase, die nun von den Primern

ausgehend eine Kopie für den jeweiligen DNA-Strang erstellt. Im Folgenden

wird die Temperatur wieder auf 94°C erhöht. Nun kön nen sich die mittlerweile 2

Doppelstränge wieder auseinanderlagern. Dieser Ablauf wiederholt sich immer

wieder aufs neue und sorgt für einen exponentiellen Anstieg der DNA-Menge.

Zusätzlich kommen bei der RT-PCR sog. Sondenmoleküle zum Einsatz. Diese

binden sich während der Annealing-Phase an die Sequenz zwischen den

Primern. Bei den in diesen Versuchsaufbau verwendeten Taq-Man-Sonden ist

31

auf der 5`-Seite der Sonde der Reporter-Fluoreszenzfarbstoff, auf der 3`-Seite

der sogenannte Quencher enthalten. Dieser Quencher unterdrückt

normalerweise eine messbare Fluoreszenzemission. Während der

Elongationsphase jedoch erreicht die TAQ-DNA-Polymerase die Sonde und

somit wird durch die 5`-3`-Exonukleaseaktivität der Polymerase das 5`-Ende

der Sonde hydrolytisch gespalten und der Quencher vom Reporter getrennt.

Nun kann am Ende der Elongation durch Licht der Wellenlänge 488nm die

Fluoreszenz des Farbstoffes gemessen werden. Diese Messung kann in jedem

einzelnen Reaktionszyklus erfolgen. Die Intensität ist somit direkt proportional

zu den neu gebildeten Strängen und erlaubt direkte Rückschlüsse auf die

Ausgangsmenge an Nukleinsäure. Überschreitet das Signal zum ersten Mal

das Hintergrundrauschen, wird dies als CT-Wert (Cycle treshold) bezeichnet. Ist

sehr viel DNA in der Probe vorhanden, wird also auch dieser CT-Wert früher

erreicht und lässt somit einen Rückschluss auf die Ausgangsmenge zu.

32

Abb. 8: Prinzip der PCR: Durch Erhitzung wird die DNA in eine einzelsträngige DNA überführt.

Im nächsten Schritt (Annealing) kommt es zur Anlagerung der Oligonucleotid-Primer. Hierauf

synthetisiert die DNA-Polymerase die komplementären Stränge. Da diese Schritte mehrfach

wiederholt werden, kommt es zu einer exponenziellen Amplifikation. Skizze modifiziert nach S.

154 (Jansohn and Aigner 2007)

33

Abb. 9: Darstellung der RealTime-PCR: Die Besonderheit bei der rtPCR umfasst die

Verwendung einer Sonde mit Quencher und Reporterfarbstoff. Normalerweise kommt es durch

die Verbindung zu keiner Emission. Wird jedoch im Laufe der PCR-Reaktion die Verbindung

zwischen beiden getrennt, erfolgt eine Emission und es kann ein fluoreszentes Signal

gemessen werden. Dieses Signal ist proportional zur Menge der zu untersuchenden

Zielsequenz. Skizze modifiziert nach S. 180 (Jansohn and Aigner 2007)

Um eine quantitative Aussage zu erreichen, wird mit den Proben eine

Standardreihe in der RT-PCR mit gemessen. Diese wird erstellt, indem von

einer Probe mit bekannter Molekülkonzentration mehrfach eine Verdünnung

(109, 108, 107, 106, 105, 104) hergestellt wird. Anhand dieser Verdünnungen mit

bekannter Konzentration können die Testproben eingeordnet und somit

absolute Konzentrationswerte bestimmt werden.

Um einen Vergleich verschiedener Proben zu ermöglichen, wird die

Konzentration jeweils in ein Verhältnis zu einem Referenz-Gen gesetzt. Hierfür

wird auf sogenannte „Housekeeping“-Gene zurückgegriffen. Diese spielen eine

essentielle Rolle im Zellstoffwechsel, sind also unter den Versuchsbedingungen

unverändert aktiviert und spiegeln somit die Gesamtproteinproduktion einer

Zelle wieder. Dadurch ist es möglich, das Zielprodukt direkt mit dem Produkt

des Housekeeping-Gens zu verrechnen und somit relative Werte zu erhalten,

34

die unabhängig von der Gesamtproteinproduktion der Proben sind. Erfolgt die

Berechnung der absoluten Werte anhand der CT-Werte, so werden die Werte

der Referenz-Gene von denen der Zielgene subtrahiert, bei Anwendung der

Standardreihe werden die Konzentrationsgradienten der Zielgene durch

diejenigen der Referenzgene geteilt.

In diesem Versuch wird als Housekeeping-Gen das 18S-Protein verwendet, ein

Bestandteil der zytoplasmatischen Ribosomen. Von dem 18S-Protein wird nun

eine Standardreihe (109, 108, 107, 106, 105, 104) erstellt und mitgemessen. Je

Probe werden zu den 5µl der cDNA, 12,5µl Mastermix (TaqMan® Universal

PCR Mastermix kit, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1,25µl

Sondenmix und 6,25µl Wasser gegeben. Der Sondenmix besteht aus 18S

(Hs99999901_s1), Kollagen-1 (Mm00483888_m1), VEGF (Mm00437304_m1)

und TGF-β (Mm00441724_m1, alle von Applied Biosystems, Foster City, CA,

USA). Die Lösung wird in Dreifachbestimmung in eine 96er-PCR-Platte (BioRad

Laboratories, München, Deutschland) pipettiert und anschließend in einem

iCycler (BioRad Laboratories, München, Deutschland) eine RT-PCR

durchgeführt. Durch die Dreifachbestimmung ist es möglich, bereits im Vorfeld

Ausreißerwerte zu erkennen und von der Berechnung auszuschließen.

2.15 Statistische Analysen

Sämtliche statistischen Auswertungen werden mit dem Computerprogramm

StatView Version 5.1 (Abacus Conceps Inc., Berkeley, CA, USA) durchgeführt.

Die absoluten Unterschiede zwischen den Gruppen werden mit ANOVA,

erweitert nach der David J. Fisher Regel, verglichen. P<0,05 wird als signifikant

betrachtet. Bei allen Versuchen mit Mehrfachmessungen wird der mittlere

Standardfehler errechnet. Die Berechnung der Mortalitätsraten erfolgt mit dem

log-rank Test. Die Sammlung der experimentell und sonographisch

gewonnenen Daten wird mit Hilfe von Microsoft Excel (Microsoft Office,

Microsoft, USA) durchgeführt.

35

3. Ergebnisse

3.1 Auswirkungen der Injektion von Clodronat auf Im munzellen

In dieser Studie werden die Auswirkungen von Monozyten auf Vorgänge nach

einem Myokardinfarkt untersucht. Dabei erhalten die Mäuse entweder eine

Injektion von Clodronat-Liposom in der Behandlungsgruppe oder von PBS-

Liposom in der Kontrollgruppe. Mittels einer immunhistochemischen

Untersuchung wird der Unterschied in der Einwanderung von inflammatorischen

Zellen drei Tage nach dem Myokardinfarkt in das Infarktgebiet untersucht (siehe

Abb. 10). CD11b und CD18 werden als Marker für die Monozyten sowie CD25

für T-Zellen verwendet. Dabei zeigt sich in der Behandlungsgruppe eine

deutlich erniedrigte Einwanderung von Monozyten, die T-Zellen dagegen

bleiben nahezu unverändert.

36

Abb. 10: Auswirkung der Injektion von Clodronat auf Monozyte n und T-Zellen: CD11b und CD18 werden als Marker für die Einwanderung von Monozyten in das Infarktgebiet verwendet. Hier zeigt sich eine deutliche Abschwächung in der mit Clodronat behandelten Gruppe. CD25 dient als Marker für T-Zellen, hierbei zeigt sich kein Unterschied zwischen den beiden Behandlungsgruppen.

An je 5 Tieren aus der Behandlungs- und Kontrollgruppe wird auch eine FACS-

Analyse durchgeführt, um unter anderem mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten

Antikörpern einen Unterschied in der Monozytenanzahl im peripheren Blut

zwischen den beiden Gruppen erkennen zu können. Dabei zeigt sich in der

Clodronat-Gruppe mit einem Anteil von 0,6±0,2% an der Leukozytenzahl eine

37

signifkante Verminderung gegenüber der Kontrollgruppe mit 3,2±1,3% (siehe

Abb. 11).

Abb.11: Auswirkung der Injektion von Clodronat auf den Mono zytenanteil im peripheren Blut: Prozentualer Anteil der Monozyten an der Gesamtleukozytenanzahl im peripheren Blut. Der Unterschied zwischen der Clodronat-Liposomgruppe (0,6±0,2%) ist gegenüber der PBS-Gruppe signifikant. (3,2±1,3%)(p=<0.05)

6 Tiere aus der Behandlungsgruppe und 4 Tiere aus der Kontrollgruppe werden

einer immunhistochemischen Färbung auf neutrophile Granulozyten unterzogen

und danach ausgezählt. Hierbei zeigt sich eine signifikant verringerte

Einwanderung von diesen Zellen in das Infarktgebiet in der Clodronatgruppe

(159±43 Zellen) gegenüber der Kontrollgruppe (318±49 Zellen).

Abb. 12: Auswirkung der Injektion von Clodronat auf neutroph ile Granulozyten im Infarktareal: Auszählung der eingewanderten neutrophilen Granulozyten in das Infarktgebiet.

38

Dabei zeigt sich ein signifikanter (p=0,04) Unterschied zwischen der Behandlungsgruppe (159±43 Zellen) gegenüber der Kontrollgruppe (318±49 Zellen) (p=0.04)

3.2 Auswirkung der Injektion von Clodronat auf die Mortalitätsrate

In einem weiteren Schritt werden in der Behandlungsgruppe zwei verschiedene

Gruppen gebildet. In der 2 Tage-MI-Gruppe wird das Clodronat-Liposom zwei

Tage vor der Operation, am Tage der Operation sowie zwei und vier Tage nach

der Operation gespritzt. In der 5 Tage-MI-Gruppe erfolgt die Gabe erst 5 Tage

nach dem Myokardinfarkt. Dabei wird über den Verlauf von 28 Tagen an 35

Mäusen die Unterschiede in der Sterblichkeit zwischen den Gruppen

untersucht. Hier zeigt sich ein signifikant verringertes Überleben (p=0,007)

sowohl der 2 Tage-MI-Gruppe (33%) als auch in der 5 Tage-MI-Gruppe (38%),

in der Kontrollgruppe dagegen von 92% (Abb. 13). Tot aufgefundene Tiere

werden auch durch die Eröffnung des Brustkorbes auf eine Ruptur hin

untersucht. Dies wird nur einmal in der 2 Tage-MI-Gruppe, somit bei Beginn der

Clodronat-Liposom-Gabe 2 Tage vor dem Infarkt, gefunden.

Abb. 13: Mortalitätsrate: Diese Abbildung zeigt das Überleben (in %) der Mäuse in den 3 Behandlungsgruppen. Dabei zeigt sich ein signifikanter Unterschied (p=0,007) zwischen der 2 Tage-MI-Gruppe (33%), 5 Tage-MI-Gruppe (38%) und der Kontrollgruppe (92%) (p=0.007)

3.3 Echographische Messungen an den Mäusen

Nach einem Myokardinfarkt kommt es zu Umbauvorgängen am gesamten

Ventrikel. Durch eine Echokardiographie am 1., 7. und 28. Tag nach dem Infarkt

werden die Tiere deshalb auf diese Veränderungen hin untersucht. Die

39

Messungen erfolgen sowohl auf der Höhe der Papillarmuskeln (PA) als auch

apikal (AP). In diese Auswertung werden nur Tiere einbezogen, die 28 Tage

überleben und deren Infarktgröße mindestens 30% beträgt. Ausgewertet

werden sowohl Tiere aus der 2 Tage-MI-Gruppe als auch 5 Tage-MI-Gruppe.

Sowohl in der Kontroll- als auch in der Behandlungsgruppe kommt es zu einer

Vergrößerung der linksventrikulären Innenflächen, die jedoch bei den

Clodronat-Liposom behandelten Tieren gegenüber PBS-Liposom

abgeschwächt war. Bei der enddiastolischen Fläche auf papillärer Ebene (EDA-

PA) und bei der endsystolischen Fläche auf apikaler Ebene (ESA-AP) wurde

sogar bei der 2 Tage-MI-Gruppe das Signifikanzniveau erreicht. Die

Verkürzungsfraktion fällt auf apikaler Ebene bei der 2-Tag-MI-Gruppe ebenfalls

signifikant höher aus. Wird das Clodronat erst später nach dem Infarkt

gegeben, wie bei der 5 Tage-MI-Gruppe, zeigte sich kein Unterschied zwischen

den Gruppen.

Da in den Clodronat-Gruppen sehr viele Tiere mit starken Veränderungen an

der Ventrikelstruktur starben und nicht in die Auswertung miteinbezogen

werden, können aus diesen Ergebnissen keine weiteren Schlüsse gezogen

werden. Bei den echokardiographischen Untersuchungen fiel jedoch auf, dass

sich bei den meisten Clodronat-behandelten Tieren ein Thrombus im linken

Ventrikel entwickelt hatte (Abb. 18). Dieser wird bei keinem Tier aus der PBS-

Liposom-Gruppe gefunden.

Tag 1 Tag 28 PBS-Lipo. Clodronat-

Lipo. PBS-Lipo. Clodronat-Lipo.

ESA-PA [mm²]

9,58±1,15 9,16±1,49 26,42±3,48 19,75±1,61

EDA-PA [mm²]

13,25±1,15 10,75±1,65 31,42±2,29 24,17±1,75*

ESA-AP [mm²]

10,75±1,13 10,17±0,9 31,0±2,58 20,67±2,48*

EDA-AP [mm²]

12,75±0,71 11,83±1,1 32,83±2,38 23,58±3,27

ESD-PA [cm]

0,40±0,02 0,36±0,01 0,57±0,04 0,53±0,01

EDD-PA [cm]

0,47±0,01 0,42±0,02

0,64±0,02 0,59±0,01

40

ESD-AP [cm]

0,41±0,02 0,41±0,02 0,65±0,03 0,53±0,03*

EDD-AP [cm]

0,45±0,01 0,44±0,02 0,67±0,03 0,57±0,04

2D-FS PA [%]

28,0±3,4 14,6±3,7 17,1±5,7 18,4±1,7

2D-FS AP [%]

16,3±4,1 13,0 ±1,5 5,8±1,2 11,7±1,7*

Abb. 14: Ergebnisse aus der echographischen Untersuchungen an PBS-Liposom oder Clodronat-Lipsom Injektion 2 Tage vor dem Myokardinfarkt, am OP-Tag sowohl 2 und 4 Tage nach dem Infarkt. (* Signifikanzniveau erreicht, ESA: endsystolische Fläche, EDA: enddiastolische Fläche, EDD: enddiastolischer Durchmesser, ESD: endsystolischer Durchmesser, AP: apikal, PA: papillär, FS: fractional shortening – Verkürzung in %) Am 28. Tag wird bei EDA-PA, ESA-AP, ESD-AP und 2D-FS-AP das Signifikanzniveau erreicht (p<0,05)

Tag 1 Tag 28 PBS-Lipo. Clodronat-Lipo. PBS- Lipo. Clodronat-Lipo.

ESA-PA [mm²] 9,22±0,62 7,71±0,83 18,50±0,67 15,40±0,94 EDA-PA [mm²] 11,11±1,06 9,88±0,90 22,44±1,25 20,23±1,20 ESA-AP [mm²] 9,0±0,39 7,88±0,64 17,50±0,17 17,08±1,22 EDA-AP [mm²] 10,89±0,59 10,08±0,63 21,67±0,67 20,42±1,25 ESD-PA [cm] 0,36±0,01 0,33±0,02 0,49±0,02 0,48±0,02 EDD-PA [cm] 0,42±0,01 0,39±0,01 0,55±0,02 0,55±0,01 ESD-AP [cm] 0,37±0,02 0,35±0,02 0,51±0,04 0,48±0,02 EDD-AP [cm] 0,40±0,01 0,40±0,01 0,54±0,03 0,52±0,02 2D-FS PA [%]

16,5±2,7 22,7±2,9 17,4±1,6 23,7±2,8

2D-FS AP [%]

17,2±1,1 22,5±3,1 19,2±1,7 16,7±2,0

Abb. 15: Ergebnisse aus der echographischen Untersuchungen an PBS-Liposom oder Clodronat-Lipsom Injektion 5 Tage nach dem Myokardinfarkt (* Signifikanzniveau erreicht, ESA: endsystolische Fläche, EDA: enddiastolische Fläche, EDD: enddiastolischer Durchmesser, ESD: endsystolischer Durchmesser, AP: apikal, PA: papillär, FS: fractional shortening – Verkürzung in %) Es zeigen sich keine signifkante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen.

41

Abb. 16: Ergebnisse aus der echographischen Untersuchung für die enddiastolische Fläche (mm²) auf Papillarmuskelhöhe (EDA-PA) in der Behandlungs- und Kontrollgruppe. (Tiere werden 2 Tage vor der Operation, am Tag der Operation sowie 2 und 4 Tage nach der Operation behandelt) Hier wird am 28. Tag ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen gemessen. (PBS-Liposom 31,42±2,29 gegen Clodronat-Liposom 24,17±1,75) (p<0.05)

0

5

10

15

20

25

30

35

Tag 1 Tag 7 Tag 28

ED

A-A

P (

mm

²)

PBS-Liposom - 2Tag-MI-Gruppe

Clodronat-Liposom - 2Tag-MI-Gruppe

Abb. 17: Ergebnisse aus der echographischen Untersuchung für die enddiastolische Fläche (mm²) auf apikaler Ebene (EDA-AP) sowohl in der Behandlungs- als auch Kontrollgruppe. (Tiere werden ebenfalls 2 Tage vor der Operation, am Tag der Operation sowie 2 und 4 Tage nach der Operation behandelt) Hier kann zwar am 28. Tag ein Trend zu einer geringeren Fläche bei der Clodronat-Gruppe festgestellt werden, allerdings keine Signifikanz. (PBS-Liposom 32,83±2,38 gegen Clodronat-Liposom 23,58±3,27)

42

Abb. 18: Bild aus einer echokardiographischen Untersuchung. Sichtbarer Thrombus im linken Ventrikel bei einem mit Clodronat behandelten Tier

3.4 Auswirkungen der Injektion von Clodronat auf da s Gerinnungssystem

Wie bereits in Abbildung 18 beobachtet, zeigt sich in der Clodronat-Gruppe

bereits 24 Stunden nach dem Myokardinfarkt echokardiographisch ein

Thrombus. Da dieser auch durch Veränderungen am Koagulationssystem

entstehen kann, wird die Plättchenaggregation an kleinen Arteriolen nach einer

Verletzungsinduktion mit Eisenchlorid durch eine Fluoreszenzmikroskopie

beobachtet. Diese Untersuchung wird an 6 Mäusen aus der Kontroll- und 5

Mäusen aus der Behandlungsgruppe durchgeführt. In der Abbildung 19 ist zu

erkennen, dass zwischen der Behandlungs- und Kontrollgruppe kein

wesentlicher Unterschied besteht. Innerhalb von 5 Minuten nach der Verletzung

kann bei beiden die Bildung eines kleinen Thrombozytenaggregates, später

innerhalb von 30 Minuten ein Verschluss des kompletten Gefäßes gesichtet

werden.

43

Abb. 19: Bild der Plättchenaggregation in kleinen Arteriolen nach einer Verletzungsinduktion mittels Eisenchlorid, beobachtet unter einem Fluoreszenzmikroskop. Zwischen der Behandlungsgruppe (Clodronat-Gabe) und der Kontrollgruppe (PBS-Liposom) zeigen sich keine Unterschiede.

3.5 Auswirkungen der Makrophagendepletion auf Heilu ngsvorgänge am

Herzmuskel

Eine entscheidende Aufgabe von Makrophagen bei der Wundheilung ist unter

anderem das Abräumen von nekrotischen Kardiomyozyten und Zellabfall. Um

dieses Material sowie Kollagenfasern und Granulationsgewebe darstellen zu

können, eignet sich insbesondere die Masson-Trichrom-Färbung. Hierbei wird

nicht nur ein Herzschnitt drei und sechs Tage nach dem Infarkt gefärbt, sondern

44

auch zum Vergleich ein Herz mit einer durchgeführten Schein-OP (SHAM-OP).

Dies bedeutet, dass alle Schritte der Operation, wie unter Punkt 2.2

beschrieben, durchgeführt werden, allerdings das Gefäß nicht ligiert wird.

Hierbei wird deutlich, dass in den mit Clodronat behandelten Mäusen auch noch

sechs Tage nach dem Infarkt eine Vielzahl von unabgeräumten Zellabfall

vorhanden ist. Zudem zeigt sich sechs Tage nach dem Infarkt in dieser Gruppe

deutlich mehr Granulationsgewebe als in der PBS behandelten Gruppe.

Zwischen den beiden SHAM-operierten Tieren zeigt sich kein Unterschied.

Abb. 20: Bild zeigt eine Masson-Trichrom-Färbung zu Darstellung von Zellabfall und Granulationsgewebe an Herzen drei und sechs Tage nach dem Infarkt aus beiden Behandlungsgruppen. Zusätzlich wird für beide Behandlungsgruppen zum Vergleich eine Schein-operierte Maus (SHAM) mit Clodronat-Liposom oder PBS-Liposom behandelt und gefärbt.

Neben dem Abräumen von abgestorbenen Kardiomyozyten und Zellmüll

produzieren die Makrophagen auch Metalloproteinasen, die unter anderem für

die Degradierung der extrazellulären Matrix zuständig sind. Von besonderem

Interesse ist die Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9), deren Auswirkungen auf

die Infarktheilung schon in mehreren Studien demonstriert wurden (Ducharme,

45

Frantz et al. 2000). Durch einen ELISA-Assay wird die Veränderung von MMP-9

durch eine Behandlung mit Clodronat untersucht. Dabei ergibt sich ein

signifikant erhöhtes MMP-9 bei der Behandlungsgruppe (4,2±0,1) verglichen mit

der Kontrollgruppe (1,1±0,04).

Abb.21: Mittels ELISA-Assay wird MMP-9 in den beiden Gruppen gemessen. Dabei ergibt sich ein signifikanter Unterschied (p=0,04) zwischen der Behandlungsgruppe (4,2±0,1) und der Kontrollgruppe (1,1±0,04)

Weitere wichtige Faktoren in der Wundheilung sind die Bildung einer Narbe

sowie die Neubildung von Gefäßen. Für die Untersuchung wird aus dem

Gewebe von 7 Tieren aus der Behandlungs- und 5 Tieren aus der

Kontrollgruppe eine RT-PCR durchgeführt, in der neben Collagen-1 auch TGF

und VEGF gemessen wird. TGF bleibt zwischen den Gruppen nahezu

unverändert (Behandlungsgruppe: 0,5±0,1; Kontrollgruppe: 0,8±0,1). Collagen-

1 ist durch die Clodronat-Behandlung signifikant reduziert (Behandlungsgruppe:

0,8±0,2; Kontrollgruppe: 2,4±0,2). VEGF, ein sehr wichtiger Parameter für die

Neovaskularisierung, ist hingegen signifikant erhöht in den Clodronat-

behandelten Tieren (Behandlungsgruppe: 0,3±0,1; Kontrollgruppe: 0,1±0,1).

46

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

TGF

TG

F (

ng) Behandlungsgruppe - Clodronat-

Liposom

Kontrollgruppe - PBS-Liposom

Abb. 22: RT-PCR Auswertung aus infarziertem Herzgewebe. TGF zeigt keinen signifikanten Unterschied zwischen Behandlungsgruppe (0,5±0,1) und Kontrollgruppe (0,8±0,1) (p=n.s.).

Abb. 23: RT-PCR Auswertung aus infarziertem Herzgewebe. Die Collagen-1 Produktion ist in der Behandlungsgruppe (0,8±0,2) gegenüber der Kontrollgruppe (2,4±0,2) signifikant (p<0,001) verringert.

47

Abb. 24: RT-PCR Auswertung aus infarziertem Herzgewebe. Die VEGF-Produktion ist in der Behandlungsgruppe (0,3±0,1) gegenüber der Kontrollgruppe (0,1±0,1) signifikant erhöht (p=0.04).

3.6 Auswirkungen der Clodronatgabe auf die Infarkte xpansion

Veränderungen in der Architektur des linken Ventrikels sind ein entscheidender

Anpassungsfaktor nach einem akuten Myokardinfarkt. Aus diesem Grund

werden auch die Unterschiede in der Infarktexpansion an 12 Mäusen aus der

Clodronat- und 7 Mäusen aus der PBS-Gruppe untersucht. In diesem

Versuchsteil werden den Mäuse 2 Tage vor der OP, am Tag der OP sowie 2

und 4 Tage nach der OP Clodronat injiziert. Die Infarktgrößen zwischen den

beiden Gruppen sind nahezu identisch (Behandlungsgruppe: 49,36±3,6;

Kontrollgruppe: 45,34±4,49) und somit auch untereinander vergleichbar. Bei der

Infarktexpansion zeigte sich kein signifikanter Unterschied

(Behandlungsgruppe: 0,79±0,1; Kontrollgruppe: 0,72±0,2).

48

0

10

20

30

40

50

60

Infarktgröße

Infa

rktg

röß

e (in

%)

Behandlungsgruppe - Clodronat-Liposom

Kontrollgruppe - PBS-Liposom

Abb. 25: Die Grafik demonstriert die ermittelte Infarktgröße in den beiden Gruppen. Hierbei sind die Gruppen somit vergleichbar, es zeigt sich kein signifikanter Unterschied. (Behandlungsgruppe: 49,36±3,6; Kontrollgruppe: 45,43±4,49)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

Infarktexpansion

Infa

rkte

xpan

sion

sind

ex

Behandlungsgruppe - Clodronat-Liposom

Kontrollgruppe - PBS-Liposom

Abb. 26: Skizze zeigt die errechnete Infarktexpansion. Dabei findet sich kein signifikanter Unterschied zwischen der Behandlungsgruppe (0,79±0,1) und der Kontrollgruppe (0,72±0,2)(p=n.s.).

3.7 Auswirkungen der Clodronatinjektion auf die End othelzellen nach

einem Myokardinfarkt

Als eindrucksvoller Befund kann in den echokardiographischen

Untersuchungen nach dem Infarkt in mit Clodronat behandelten Tieren ein

großer Thrombus im linken Ventrikel beobachtet werden. Diese Veränderungen

können auch an Tieren mit einer kleinen Infarktgröße gefunden werden. Durch

Untersuchungen der Plättchenaggregation an kleinen Arteriolen können zudem

49

Einflüsse des Koagulationssystems ausgeschlossen werden. Da sich die

Thromben bereits in den ersten 24 Stunden nach dem Infarkt entwickeln,

können Auswirkungen durch das Remodeling nahezu ausgeschlossen werden.

Im weiteren Verlauf wird deshalb durch eine immunhistochemische Färbung mit

CD31 das Endothel angefärbt. Während in der Clodronat-Gruppe ein Defekt im

Endothel sichtbar wird, kann dieser in der Kontrollgruppe sowie bei SHAM-

operierten Tieren nicht beobachtet werden.

Abb. 27: Übersicht zeigt mikroskopische Aufnahmen nach einer Anfärbung eines Herzens sowohl aus der Kontroll- als auch Behandlungsgruppe. Die beiden linken Abbildungen veranschaulichen das sichtbar infarzierte Herz nach einer PBS-Färbung. Die rechte Aufnahme demonstriert die Endothelfärbung mit dem Defekt bei dem Clodronat behandelten Herzen.

4. Diskussion

Nach einem Myokardinfarkt werden auch am Herzen Reparaturvorgänge

ausgelöst, die in die Phase der Inflammation, der Proliferation sowie der

endgültigen Narbenbildung unterteilt werden können. Durch diese Maßnahmen

soll die Funktion des Gewebes erhalten bleiben (Frantz, Bauersachs et al.

2009). Entzündungszellen spielen insbesondere in der ersten Phase eine

entscheidende Rolle (Frangogiannis 2008), hierunter auch vor allem die

Monozyten. In dieser Studie wird die zentrale Bedeutung von Monozyten auf die

Heilungsvorgänge nach einem Myokardinfarkt untersucht. Die Ausschaltung

50

von Monozyten erfolgt über Clodronat-Liposom, eine bereits seit vielen Jahren

erfolgreich benutzte Methode (van Rooijen and Hendrikx 2010). In dieser Studie

zeigt sich durch eine FACS-Untersuchung in der Behandlungsgruppe eine

Reduktion der Monozyten im peripheren Blut, zudem liegt immunhistochemisch

drei Tage nach dem Infarkt in der Behandlungsgruppe eine deutliche Reduktion

der Monozyten im infarzierten Gewebe vor. Die Depletion von Monozyten

konnte somit durch die Verwendung von Clodronat-Liposom erreicht werden.

In den Echokardiographieuntersuchungen fällt bei den Clodronat-behandelten

Tieren schon am ersten Tag nach dem Infarkt ein Thrombus auf, der einen sehr

großen Anteil des Lumens einnimmt. Im Vergleich zwischen den Gruppen wird

deutlich, dass dieser Thrombus ausschließlich bei infarzierten Tieren auftritt und

bei keinem einzigen Schein operierten Tier zu finden ist. Ebenso ist in der PBS-

Liposom-Gruppe kein einziges Tier mit einem Thrombus zu erkennen. Ein

Zusammenhang mit der Infarktgröße kann nicht gefunden werden. Diese

Beobachtung geht einher mit einer deutlich erhöhten Mortalität in der

Behandlungsgruppe, die wohl auf diese Thrombusformation sowie

nachfolgende thromboembolische Ereignisse zurückzuführen ist.

Wie oben beschrieben, werden thromboembolische Ereignisse nicht in der

Gruppe der Schein operierten Tiere mit Clodronat-Behandlung gesehen, so

dass eine direkte schädigende Auswirkung der Operation auf das

Gerinnungssystem ausgeschlossen werden kann. Für eine weitere Klärung der

Ursache wird auch die Thrombozytenaggregation näher untersucht. In einem

Versuch wird mittels Verletzungsinduktion durch Eisenchlorid mehrere Tiere

sowohl aus der Kontroll- als auch Behandlungsgruppe unter einem Mikroskop

bezüglich einer Okklusion beobachtet. Hierbei kann kein Unterschied zwischen

den Gruppen gefunden werden. Durch diese Untersuchungen können somit

Veränderungen am Koagulationssyndrom als Ursache ausgeschlossen werden.

Nach aktueller Recherche der wissenschaftlichen Literatur gibt es derzeit auch

keinen nachgewiesenen Zusammenhang zwischen der Gruppe der

Bisphosphonate, zu denen Clodronat gehört, und der Entwicklung von

Thromben sowie nachfolgenden thromboembolischen Ereignissen, so dass

51

davon ausgegangen werden kann, dass die Entstehung dieser Thromben auf

die Depletion von Monozyten und nicht auf direkte Effekte des Medikaments

Clodronat-Liposom zurückzuführen ist.

In den echokardiographischen Untersuchungen zeigte sich der Thrombus

bereits innerhalb der ersten 24 Stunden. Später ablaufendes Remodeling im

Rahmen des Heilungsvorganges kann somit als Ursache ebenfalls

ausgeschlossen werden. Zur weiteren Klärung wurden sowohl aus der Kontroll-

als auch der Behandlungsgruppe histologische Schnitte mit CD31 zur

Darstellung des Endothels gefärbt. Bereits 24 Stunden nach dem Infarkt und

auch vor der Bildung eines Thrombus lässt sich bei den Clodronat-behandelten

Tieren an der Endothelschicht ein Defekt nachweisen. Auch bei zeitlich

späteren Färbungen zeigt sich diese Lücke weiterhin. Zusammenfassend kann

nun davon ausgegangen werden, dass dieser Endothelschichtdefekt auf die

Depletion von Monozyten, wohl insbesondere der Ly-6Clo-Monozyten

zurückzuführen ist.

Monozyten können in eine Gruppe mit Ly-6Chi mit einer hohen Expression von

Ly-6C sowie Ly-6Clo mit einer niedrigen Expression von Ly-6C unterteilt werden

(Auffray, Sieweke et al. 2009). Ly-6Clo-Monozyten nehmen im Blutstrom eine

sogenannte Wächterfunktion über das Endothel sowie das umliegende Gewebe

wahr. In einer Arbeit wurde gezeigt, dass insbesondere die Ly-6Clo-Gruppe für

den schnellen Austritt in das entzündete Gewebe innerhalb einer Stunde nach

Eintritt der Verletzung von entscheidender Bedeutung ist und zugleich für eine

Art Kontrollfunktion über den Heilungsvorgang verantwortlich sind (Auffray,

Fogg et al. 2007). Vorstellbar ist nun natürlich, dass bei Fehlen dieser Gruppe

Endotheldefekte nicht erkannt sowie behoben werden und damit im weiteren

Verlauf bei Adhäsion von Thrombozyten eine Thrombusbildung erfolgt.

Diese Beobachtung hat durchaus klinische Konsequenzen. Bei einem Teil der

Patienten mit Myokardinfarkt kommt es innerhalb der ersten Tage zur

Entwicklung eines Thrombus im linken Ventrikel. In einer Studie aus dem Jahr

1998 wird die Häufigkeit mit etwa 5% angegeben. Risikofaktoren stellen

insbesondere ein Infarkt im Bereich der Vorderwand sowie eine niedrige

Ejektionsfraktion dar (Asinger, Mikell et al. 1981; Keren, Goldberg et al. 1990;

52

Chiarella, Santoro et al. 1998). Ausgehend von dieser Thrombusbildung sind

die Patienten nun insbesondere durch thromboembolische Ereignisse wie einen

Schlaganfall gefährdet (Stratton and Resnick 1987). Die Häufigkeit von

Infarkten in anderen Organen ausgehend von einem linksventrikulären

Thrombus werden sehr kontrovers diskutiert, im Schnitt aber mit etwa 5%

angegeben (Johannessen, Nordrehaug et al. 1984). In Autopsien werden

verständlicherweise sehr viel mehr embolische Ereignisse als in klinischen

Studien entdeckt, da ein bestimmter Anteil der Thromboembolien ohne klinische

Symptomatik verläuft (Simpson, Oberman et al. 1980).

Bei ähnlicher Infarktgröße bildet sich bei einem bestimmten Patientenkollektiv

ein Thrombus, bei anderen dagegen nicht. Die genauen Mechanismen sind

beim Menschen bisher noch nicht verstanden. Nun zeigt sich, dass

Unterschiede in der Anzahl sowie Funktion der Monozyten hierfür verantwortlich

sein können. Klinische Studien mit der Messung der verschiedenen Monozyten-

Subtypen CD14+CD16- sowie CD14+CD16+ bei Patienten mit der Entwicklung

eines linksventrikulären Thrombus können deshalb ausgehend von den

Erkenntnissen dieser Studie neue Therapieoptionen aufzeigen.

.

Neben der Entwicklung eines linksventrikulären Thrombus werden in dieser

Studie auch Veränderungen in den langfristigen Heilungs- und

Reparaturvorgängen untersucht.

Durch die Depletion der Monozyten kommt es drei und sechs Tage nach dem

Infarkt zu einem deutlich verringerten Abräumen des Zellabfalles verglichen mit

der Kontrollgruppe. Dieser Effekt wurde auch an einem Cryo-Infarkt-Modell

beobachtet, das kürzlich veröffentlicht wurde. Dort ließ sich ein deutlicher

Unterschied sogar noch 28 Tage nach dem Infarkt nachweisen (van

Amerongen, Harmsen et al. 2007). Bei diesem Cryo-Modell wurde jedoch eine

Vereisung bei -196°C durchgeführt (van Amerongen, H armsen et al. 2007), die

nicht den physiologischen Vorgängen bei einem Myokardinfarkt entspricht.

Zudem waren die betroffenen Areale des Herzens sehr klein und aufgrund der

Methodik hauptsächlich epikardial gelegen. Zurückführen lässt sich die

eingeschränkte Abräumfunktion auf den Ausfall der Ly-6Chi-Monozyten, die für

53

Phagozytose, Proteolyse sowie die Initiierung der Inflammationsreaktion

verantwortlich sind.

Neben der Phagozytose sind für die langfristige Reparatur einer Narbe auch die

extrazelluläre Matrix von besonderer Bedeutung. Für die Organisation dieses

Bereiches nehmen die Matrixmetalloproteinasen sowie deren Inhibitoren einen

besonderen Platz ein. Diese Enzyme besitzen eine spezifische

Proteaseaktivität und haben somit einen bedeutenden Anteil am Remodeling

nach einem Myokardinfarkt. Die Ausschüttung erfolgt durch Entzündungszellen,

unter anderem Monozyten (Creemers, Cleutjens et al. 2001; Spinale 2007). Ein

bedeutendes Mitglied mit Bedeutung für den Myokardinfarkt ist die

Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9). Bereits vor einigen Jahren wurde gezeigt,

dass es bei MMP-9-Knockout-Mäusen zu einem abgeschwächten

linksventrikulären Umbauvorgang und somit einer weniger ausgeprägten

Dilatation kommt (Ducharme, Frantz et al. 2000). Auch beim Menschen stellte

sich heraus, dass es eine direkte Korrelation zwischen MMP-9-Plasmaspiegeln

und den nachfolgenden Remodeling-Vorgängen gibt (Kelly, Cockerill et al.

2007). MMP-9 hat somit einen bedeutenden Einfluss auf die

Reparaturvorgänge nach einem Infarkt. In dieser Studie zeigt sich eine deutlich

erhöhte Aktivität von MMP-9 in der Behandlungsgruppe gegenüber der

Kontrollgruppe. Die Menge von MMP-9 kann somit nicht alleine auf Monozyten

zurückgeführt werden. Die Ausschüttung dieses Zytokins erfolgt auch durch

andere Zellen wie neutrophile Granulozyten (Lindsey 2004) sowie Myozyten,

Fibroblasten und Endothelzellen (Lindsey, Escobar et al. 2006) und ist für

diesen Effekt verantwortlich.

Bei der langfristigen Organisation einer Narbe spielt insbesondere die

Fibrosierung eine wichtige Rolle. Es wurde deshalb TGF-β (transforming growth

factor β) untersucht, das eines der Schlüsselmediatoren im Übergang von der

Entzündungsphase zur Fibrosierung darstellt (Bujak and Frangogiannis 2007;

Frangogiannis 2008). Es besitzt daher eine entscheidende Rolle im Remodeling

(Frangogiannis 2006; Porter and Turner 2009), aber zudem auch für die

Neovaskularisation (Roberts, Sporn et al. 1986; Nah and Rhee 2009). In dieser

Studie zeigt sich unter Monozytendepletion eine verringerte, jedoch nicht

54

signifikante Abnahme von TGF-β. Neben Monozyten sind an der Freisetzung

auch hier noch andere Zellen beteiligt, die zur Produktion beitragen und dieses

Ergebnis erklären.

Im Rahmen der Narbenbildung nimmt in dem infarzierten Bereich der Anteil von

Kollagen immer weiter zu. Die Narbe bildet sich somit durch eine zunehmende

Vernetzung der Kollagenfasern. Dies führt jedoch auch zu einer erhöhten

Steifheit des Ventrikels und trägt folglich zur diastolischen Dysfunktion bei

(Dobaczewski, Gonzalez-Quesada et al. 2009). Aktivierte Myofibroblasten

spielen bei der Wundorganisation eine wichtige Rolle und sind die

Hauptproduktionsquelle für Kollagen (Cleutjens, Verluyten et al. 1995). Für die

Aktivierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten sind jedoch verschiedene

Faktoren nötig. Aus mehreren Studien ist bekannt, dass Makrophagen für die

Umwandlung besonders wichtig sind und einen Großteil der benötigten

Faktoren freisetzen (Desmouliere, Geinoz et al. 1993). In Übereinstimmung mit

dieser Aussage zeigte eine Studie von Yano et al., dass eine Vermehrung von

Makrophagen mit M-CSF (macrophage colony stimulating factor) zu einer

vermehrten Akkumulation von Kollagen führt (Yano, Miura et al. 2006). Auch in

den molekularen Analysen in dieser Studie ist der Anteil von Collagen-1 in der

Infarktnarbe nach Monozytendepletion signifikant verringert und ist somit auf

den Ausfall der Monozyten zurückzuführen.

Als Vorgang in der Kaskade von Reparaturvorgängen spielt auch die

Neubildung von Gefäßen eine wichtige Rolle. Neben TGF-β spielt dabei auch

VEGF (vascular endothelial growth factor) als Botenstoff eine bedeutende Rolle

(Thomas 1996). Dieser Wachstumsfaktor wird von verschiedenen Zellen nach

einem Infarkt ausgeschüttet und führt zur Neubildung von Gefäßen

(Frangogiannis 2008). In einigen Modellen wurde gezeigt, dass insbesondere

die Anzahl von Makrophagen in dem betroffenen Areal positiv mit der

Entstehung von Gefäßen korreliert ist (Manoonkitiwongsa, Jackson-Friedman et

al. 2001). Aus diesem Grund wurde auch die Auswirkung einer

Monozytendepletion auf die Menge von VEGF untersucht. In dieser Studie zeigt

sich jedoch eine signifikante Erhöhung von VEGF in der Behandlungsgruppe.

Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung ist, dass nach der

55

Untersuchung von Nahrendorf et al. insbesondere Monozyten aus der Gruppe

der Ly-6Clo eine große Menge von VEGF beinhalten (Nahrendorf, Swirski et al.

2007). Somit kann ein Überwiegen dieser Zellen in der Behandlungsgruppe für

die große Menge von VEGF verantwortlich sein. Ob durch dieses Menge dieses

Wachstumsfaktors auch tatsächlich mehr Gefäße entstehen oder ob es sich

nur um eine zeitabhängige Auswirkung der Clodronatgabe auf die Depletion

bestimmter Zellgruppen handelt, muss noch durch weitere Untersuchungen

geprüft werden.

Durch Umbauvorgänge nach einem Infarkt kann sich am Herzen eine

linksventrikuläre Dilatation ausbilden, die zu einer erhöhten Rate an

Herzinsuffizienz sowie folglich reduziertem Gesamtüberleben führt (Pfeffer and

Braunwald 1990). Der Einfluss von Monozyten auf diesen Vorgang lieferte bis

jetzt in der Literatur kein klares Ergebnis. Die Studie von Maekawa et al. an

Patienten nach Reperfusion zeigte bei Monozytose als Ergebnis eine

verschlechterte linksventrikuläre Funktion (Jugdutt 2002; Maekawa, Anzai et al.

2002), während Hojo et al. an Patienten nach Myokardinfarkt eine positive

Korrelation zwischen Gehalt an Monozyten sowie VEGF und der

linksventrikulären Funktion fand (Hojo, Ikeda et al. 2000). In einer Studie am

Menschen konnte sogar durch die Injektion einer aktivierten

Makrophagensuspension ein Verbesserung der Ventrikelfunktion erreicht

werden (Leor, Rozen et al. 2006). In diesen Studien wurde jedoch nur der

Gehalt an Monozyten gemessen und keine Unterscheidung zwischen den

einzelnen Subgruppen getroffen. Auch in den Versuchsreihen zu dieser Studie

wurden durch die Clodronatgabe alle Monozytensubtypen entfernt, es zeigt sich

somit übereinstimmend mit den Ergebnissen aus den Literatur keine

signifikante Veränderung der Infarktexpansion. In einer kürzlich veröffentlichten

weiterführenden Studie durch Tsukioka et al. wurde nun die unterschiedliche

Mobilisation der Monozytensubtypen beim Menschen nach einem

Myokardinfarkt untersucht. Dabei fand sich, dass insbesondere der Anstieg der

CD14+CD16-Monozyten negativ mit der Kontraktilität der linken Ventrikels

assoziiert ist (Tsujioka, Imanishi et al. 2009). CD14+CD16-Monozyten

entsprechen Ly6C+-Monozyten bei der Maus. Unterstützt wird diese

56

Beobachtung auch durch ein Mausmodell mit einer Ly-6Chi-Monozytose , die

ein deutlich schlechteres linksventrikuläres Remodeling aufwiesen (Panizzi,

Swirski et al. 2010).

Durch diese Studie kann der entscheidende Einfluss der Monozyten auf die

Reparaturvorgänge nach einem Myokardinfarkt gezeigt werden. Insbesondere

die Verteilung der einzelnen Subtypen scheint einen wichtigen Stellenwert zu

haben. Durch die Depletion von Monozyten kommt es neben der Verringerung

der Abräumvorgange auch zu einer verringerten Bildung von Kollagenfasern.

Zudem wird gezeigt, dass es aufgrund eines Endotheldefektes zur Bildung

eines linksventrikulären Thrombus kommt. Diese Komplikation ist auch beim

Menschen bekannt und stellt ein deutliches Risiko für ein thrombembolisches

Geschehen mit Infarktbildung in anderen Organen wie zum Beispiel dem Gehirn

mit Folge eines Schlaganfalles dar. Dieses neue Wissen kann somit dazu

beitragen, Therapieoptionen zu entwickeln, um einen optimalen

Heilungsprozess nach einem Myokardinfarkt anzustoßen und somit

thrombembolische Ereignisse zu verhindern.

57

5. Zusammenfassung

Beim Myokardinfarkt führt die Unterbrechung der Blutversorgung zur Nekrose

von Myozyten. Hierauf werden im Rahmen der Entzündungsreaktion

verschiedene Reaktionen angestoßen, die dazu dienen sollen, die Integrität und

Funktion des Herzens zu erhalten. Einen wichtigen Anteil an der

Inflammationsreaktion haben die Monozyten, deren Funktion in diesem

Rahmen bis jetzt nur wenig erforscht ist. In dieser Studie wurde die Rolle von

Monozyten auf die Heilungsvorgänge nach einem Infarkt untersucht. Durch die

Gabe von Clodronat-Liposom wurden in der Behandlungsgruppe die Monozyten

ausgeschaltet. Es zeigte sich, dass die Mortalität in der Behandlungsgruppe

aufgrund der Bildung eines linksventrikulären Thrombus deutlich erhöht ist.

Dieser war bereits innerhalb der ersten 24h in den echokardiographischen

Untersuchungen sichtbar. Veränderungen im Gerinnungssystem konnten als

Ursache ausgeschlossen werden. Durch eine CD-31-Färbung wurde deutlich,

dass in den infarzierten Herzen der Behandlungsgruppe ein Defekt im

Endokard entstanden war, der als Ursache für die Entstehung der Thromben

gewertet werden kann. Zudem wurde in der Behandlungsgruppe neben einem

verschlechterten Abräumvorgang eine signifikant erniedrigte Kollagen-1-

Produktion, ein erhöhtes MMP-9, ein leicht erniedrigtes TGF sowie erhöhtes

VEGF gemessen. In dieser Studie wurde somit gezeigt, dass Monozyten ein

essentieller Bestandteil der Heilungsvorgänge nach einem Infarkt sind. Durch

eine eingeschränkte Monozytenfunktion wird zudem aufgrund von Defekten im

Endothel die Bildung eines linksventrikulären Thrombus und folgender

thromboembolischer Ereignisse begünstigt.

58

6. Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Entwickung und Differenzierung von Monozyten und Makrophagen S. 4

Abb. 2: Balance zwischen den Monozyten-Subtypen nach einem Infarkt S. 5

Abb. 3: Prinzip der FACS-Analyse S. 19

Abb. 4: Parameter FSC und SCC bei der FACS-Analyse S. 19

Abb. 5: Grundprinzip der Avidin-Biotin-Methode S. 22

Abb. 6: Grundprinzip der ELISA-Methode S. 25

Abb. 7: cDNA-Synthese S. 30

Abb. 8: PCR-Synthese S. 32

Abb. 9: Besonderheit der rtPCR S. 33

Abb. 10: Auswirkung der Clodronatinjektion auf Monozyten und T-Zellen S. 36

Abb. 11: Auswirkung der Clodronatinjektion auf Monozyten im peripheren Blut

S. 37

Abb. 12: Auswirkung der Clodronatinjektion auf neutrophile Granulozyten S. 37

Abb. 13: Auswirkung der Clodronatinjektion auf die Mortalitätsrate S. 38

Abb. 14: Ergebnisse der echographischen Messungen bei der 2 Tage Gruppe

(Injektion von Clodronat 2 Tage vor dem Infarkt) S. 39

Abb. 15: Ergebnisse der echographischen Messungen bei der 5Tage Gruppe

(Injektion von Clodronat 5 Tage nach dem Infarkt) S. 40

Abb. 16: Ergebnisse der echographischen Messungen für die enddiastolische

Fläche auf Papillarmuskelhöhe (EDA-PA) S. 41

Abb. 17: Ergebnisse der echographischen Messungen für die enddiastolische

Fläche auf apikaler Ebene (EDA-AP) S. 41

Abb. 18: sichtbarer Thrombus in der echographischen Untersuchung S. 42

Abb. 19: Plättchenaggregation in den kleinen Arteriolen nach einer

Verletzungsinduktion mittels Eisenchlorid S. 43

Abb. 20: Masson-Trichrom-Färbung mit Darstellung von Zellabfällen und

Granulationsgewebe S. 44

Abb. 21: Darstellung der Ergebnisse des MMP-9-ELISA S. 45

Abb. 22: Darstellung der Ergebnisse der rtPCR für TGF-β S. 46

Abb. 23: Darstellung der Ergebnisse der rtPCR für Collagen-1 S. 46

59

Abb. 24: Darstellung der Ergebnisse der rtPCR für VEGF S.47

Abb. 25: Darstellung der Infarktgröße bei den Tieren für die

Infarktexpansionsmessung S. 48

Abb. 26: Darstellung der Ergebnisse der Infarktexpansionsmessung S. 48

Abb. 27: mikroskopische Aufnahme des Endothels nach PSR-Färbung sowie

Färbung von CD31 S. 49

60

7. Literaturverzeichnis

Asinger, R. W., F. L. Mikell, et al. (1981). "Incidence of left-ventricular

thrombosis after acute transmural myocardial infarction. Serial evaluation

by two-dimensional echocardiography." N Engl J Med 305(6): 297-302.

Auffray, C., D. Fogg, et al. (2007). "Monitoring of blood vessels and tissues by a

population of monocytes with patrolling behavior." Science 317(5838):

666-670.

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634.

Danksagung

Herzlichen Dank allen, die mir bei der Erstellung sowie während der Arbeiten im

Labor zur Seite gestanden haben.

Ein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Stefan Frantz für die

Überlassung des Themas sowie die konstruktive und zuverlässige

Unterstützung bei allen auftretenden Fragen und Problemen während der Arbeit

im Labor sowie bei der schriftlichen Anfertigung der Dissertation. Ebenso gilt ein

großer Dank auch dem Team der Arbeitsgruppe. Die gute Stimmung sowie

positive Einstellung hat sicherlich auch zu einem großen Teil für meine

Begeisterung für die Forschung beigetragen.

Ein Dank besonders an Frau Helga Wagner, die mich von Beginn an in das

exakte Arbeit mit allen Geräten im Labor einführte und somit sicherlich die

Grundlagen für eine genaue Arbeit legte, es aber mit ihrer Art auch schaffte,

mich genau für diese Arbeit im Labor zu begeistern. Ebenso ein Dank an Frau

Barbara Bayer, Frau Nadja Blömer sowie Frau Charlotte Dienesch, die mich

insbesondere bei den tierexperimentiellen Versuchen unterstützten und bei

allen Versuchen zur Seite standen und stets aufmunternde Worte insbesondere

bei Rückschlägen fanden. Vielen Dank auch an Herrn Prof. Dr. med. Christoph

Kleinschnitz für die Übernahme des Referates.

Zum Abschluss möchte ich auch bei meinen Eltern bedanken, die mich

während der gesamten Zeit unterstützt und gefördert haben. Ohne deren

Unterstützung wäre diese Arbeit sowie mein Studium sicher nicht möglich

gewesen.

Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Tobias Bobinger

Geburtsdatum 09.05.1982

Geburtsort Günzburg

Schulausbildung

1988-1992 Grundschule Dürrlauingen

1992-2001 St.-Thomas Gymnasium Wettenhausen

Zivildienst

2001-2002 Rettungsdienst BRK Dillingen/Donau

Berufsausbildung und Berufstätigkeit

2002-2004 Rettungsdienst BRK Günzburg/Donau

Ausbildung zum staatl. examinierten Rettungsassistenten

Hochschulausbildung

10/2004-09/2006 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität

Bochum, vorklinische Semester

08/2006 Ärztliche Vorprüfung (1. Staatsexamen)

10/2006-11/2010 Studium der Humanmedizin an der Julius-Maximilians-

Universität Würzburg, klinische Semester

11/2010 2. Staatsexamen

Praktisches Jahr

1. Tertial Neurologie, Universitätsklinikum Würzburg

2. Tertial Innere Medizin, Strong Memorial Hospital, University of

Rochester, NY, USA

3. Tertial Chirurgie, Kantonsspital Winterthur, Schweiz

Berufstätigkeit nach der Hochschulausbildung

Seit 02/2011 Assistenzarzt in der Abteilung für Neurologie am

Universitätsklinikum Erlangen

Würzburg, den 03.02.2012

Tobias Bobinger