Entwicklung neuer analytischer Methoden zur Erweiterung ... · ISO International Standard...
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Neue Ansätze in der Qualitätssicherung von Honig
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt
der Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften der
Technischen Universität Dresden
von
Staatl. gepr. Lebensmittelchemiker Klaus Beckmann
Geboren am 4.10.1973 in Bielefeld
Gutachter: Prof. Dr. Karl Speer
Prof. Dr. Hans Büning-Pfaue
Dr. Cord Lüllmann
eingereicht am: 14.08.2008
Tag der Verteidigung: 04.12.2008
1 1. Einführung
1
Meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. K. Speer, danke ich für die Überlassung des
Dissertationsthemas und die Betreuung, die trotz der räumlichen Distanz
hervorragend funktionierte.
Bei Frau G. Beckh und Herrn Dr. C. Lüllmann von der Firma Quality Services
International bedanke ich mich für die Betreuung vor Ort und den Freiraum, der mir
bei der Durchführung dieser Arbeit eingeräumt wurde.
Dem gesamten Team von Quality Services International danke ich für das
ausgezeichnete Arbeitsklima und die stete Hilfsbereitschaft.
Mein ganz besonderer Dank geht an Frau Sarah Englisch, Frau Karin Tausendfreund
und Herrn Shendi Xiao für ihre wertvolle Hilfe und Unterstützung bei der praktischen
Durchführung dieser Arbeit.
1. Einführung 2
2
Für meine Familie
3 1. Einführung
3
Zusammenfassung Die Qualität von Honig ist in zahlreichen Normen geregelt, welche allerdings ständig
den aktuellen Rahmenbedingungen angepasst werden müssen. Ziel dieser Arbeit
war es, Lösungen für zwei Fragestellungen zu erarbeiten, die derzeit im Fokus der
Qualitätssicherung von Honig stehen.
Der erste Teil behandelt die Substanz Phenylacetaldehyd, welche ausgehend von
der Aminosäure Phenylalanin als natürlicher Stoff, aber auch als Rückstand nach
Einsatz als Bienenvertreibungsmittel im Honig vorliegen kann. Letzteres war der
Grund dafür, dass Stiftung Warentest im April 2004 verschiedene Honige abgewertet
hatte. In dieser Arbeit sollte geprüft werden, von welchen Faktoren der natürliche
Gehalt an Phenylacetaldehyd abhängt, um beurteilen zu können, ob die Substanz
natürlicherweise oder als Rückstand im Honig vorhanden sein kann.
Untersuchungen der Phenylalaningehalte verschiedener Honige ergaben, dass die
ermittelten Konzentrationen sortenabhängig sehr unterschiedlich waren. Zur
analytischen Bestimmung der Phenylacetaldehydgehalte wurde zunächst eine in der
Literatur beschriebene Headspace-GC/MS-Methode eingesetzt, die sich jedoch als
ungeeignet erwies, da durch die Probenvorbereitung Phenylalanin bereits in
Phenylacetaldehyd umgewandelt wurde. Mit der daraufhin entwickelten
Extraktionsmethode ließen sich die Gehalte hingegen sicher bestimmen.
Im nächsten Schritt wurden verschiedene Honige sowie Zuckersirupe, mit und ohne
Phenylalanin dotiert, bei unterschiedlichen Bedingungen gelagert. Dabei zeigte sich,
dass durch erhöhte Temperatur und UV-Licht die Gehalte an Phenylacetaldehyd
deutlich zunahmen. Auch hierbei war ein unmittelbarer Zusammenhang zwischen
den Phenylalanin- und Phenylacetaldehydgehalten zu beobachten.
Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Abwertungen von Stiftung Warentest nicht
zulässig waren, da weder die Phenylalaningehalte der beanstandeten Proben
bekannt waren noch die äußeren Bedingungen, denen diese Honige beim Transport
und der Lagerung ausgesetzt waren.
1. Einführung 4
4
Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Filtration von Honig. Diese ist seit
Inkrafttreten der neuen Honigverordnung von 2004 zulässig. Beimischungen
gefilterter Honige zu ungefilterten Honigen sind allerdings illegal, und es galt, eine
Methode zu entwickeln, um einen derartigen Zusatz nachzuweisen.
Vergleichende Untersuchungen von Honigen vor und nach Filtration ergaben
zunächst, dass die Enzymaktivitäten, vor allem die der Saccharase, durch einen
solchen Prozess gemindert werden. Daraufhin wurde eine Methode zur
gelchromatographischen Trennung der Honigenzyme bzw. -proteine entwickelt. In
den Chromatogrammen war zu beobachten, dass insbesondere der Peak der
Saccharase abnahm.
Es war indes noch keine eindeutige Differenzierung von gefilterten und ungefilterten
Honigen möglich. Daher wurde im folgenden Schritt eine Methode erarbeitet, mit der
die Proteine der Saccharase elektrophoretisch aufgetrennt wurden. Dabei zeigte
sich, dass von den beiden dominierenden Banden, die die Saccharase ungefilterter
Honige aufwies, nach Filtration eine Bande nahezu verschwunden war.
Mit Hilfe einer quantitativen densitometrischen Auswertung wurden dann die
Verhältnisse der Farbdichtewerte der beiden Banden berechnet. Bei ungefilterten
Honigen lag dieses Verhältnis bei ungefähr 3, während dieses nach einer Filtration
bei mindestens 30 lag. Zumischversuche gefilterter Honige zu ungefilterten Honigen
ergaben, dass mit dieser Methode ein Nachweis gefilterter Honige ab 15 % möglich
ist.
5 1. Einführung
5
Inhaltsverzeichnis
1. Einführung ....................................................................................................... 8 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig ................... 10
2.1. Honigerzeugung ......................................................................................... 10 2.2. Inhaltsstoffe des Honigs.............................................................................. 11
2.2.1. Hauptbestandteile........................................................................... 11 2.2.2. weitere Bestandteile ....................................................................... 13 2.2.3. Enzyme .......................................................................................... 15
2.2.3.1. Diastase ................................................................................................. 16 2.2.3.2. Saccharase ............................................................................................. 16 2.2.3.3. Glucose-Oxidase ..................................................................................... 17 2.2.3.4. weitere Enzyme ....................................................................................... 18
2.3. Qualitätsuntersuchungen von Honig ........................................................... 18 2.3.1. Bestimmung der botanischen und regionalen Herkunft .................. 19 2.3.2. Parameter zum Nachweis von Verfälschungen .............................. 21 2.3.3. Untersuchung auf Wärmeschädigung ............................................ 23 2.3.4. weitere Parameter zur Prüfung der Honigqualität ........................... 25 2.3.5. Rückstandsanalytik......................................................................... 26
3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil ................... 28
3.1. Charakterisierung von Phenylacetaldehyd .................................................. 28 3.2. Phenylacetaldehyd in Honig ....................................................................... 28 3.3. Problemstellung .......................................................................................... 30 3.4. Bienenvertreibungsmittel ............................................................................ 31
3.4.1. Phenylacetaldehyd als Bienenvertreibungsmittel ........................... 32 3.5. Einflüsse auf den Phenylacetaldehydgehalt ............................................... 33
3.5.1. Analytik der freien Aminosäuren ..................................................... 33 3.5.2. Phenylacetaldehyd-Analytik mittels Headspace-GC/MS ................ 35 3.5.3. Ergebnisse und Schlussfolgerungen .............................................. 36
3.6. Bestimmung von Phenylacetaldehyd nach Extraktion ................................ 37 3.6.1. Methodenentwicklung ..................................................................... 37 3.6.2. Methodenvalidierung ...................................................................... 38
3.7. Lagerungsversuche .................................................................................... 40 3.7.1. Lagerungsparameter ...................................................................... 41 3.7.2. Ergebnisse der Lagerungsversuche ............................................... 41 3.7.3. Schlussfolgerungen ........................................................................ 43
4. Filtration von Honig ........................................................................................ 45
4.1. Begriffsbestimmung und lebensmittelrechtliche Situation ........................... 45 4.2. Anlass für eine Honigfiltration ..................................................................... 46 4.3. Technologisches Verfahren der Filtration ................................................... 48 4.4. Problemstellung .......................................................................................... 50 4.5. Probenorganisation ..................................................................................... 51 4.6. Auswirkung einer Filtration auf unterschiedliche Honigparameter .............. 52
4.6.1. Sensorik ......................................................................................... 52 4.6.2. Elementaranalysen ......................................................................... 52 4.6.3. Leitfähigkeit, pH-Wert und Säuregrad ............................................ 53 4.6.4. Flavonoide und Phenolcarbonsäuren ............................................. 53
1. Einführung 6
6
4.6.5. Spektroskopische Untersuchungen ................................................ 54 4.6.5.1. Farbmessungen nach Pfund .................................................................... 54 4.6.5.2. IR-Absorption .......................................................................................... 54 4.6.5.3. UV-Absorption ......................................................................................... 55
4.6.6. Zuckerprofile ..................................................................................... 56 4.6.6.1. Bestimmung der Oligosaccharide ............................................................ 56
4.6.7. HMF-Gehalt .................................................................................... 60 4.6.8. Mikroskopische Untersuchung ....................................................... 62 4.6.9. Enzymaktivität der Diastase ........................................................... 63 4.6.10. Enzymaktivität der Saccharase ...................................................... 64 4.6.11. Zusammenfassung der Screeningversuche ................................... 65
4.7. Methode zum Nachweis einer Filtration ...................................................... 65 4.7.1. Bestimmung der Proteinkonzentrationen ........................................ 66 4.7.2. Gelchromatographie zur Trennung der Honigenzyme .................... 69
4.7.2.1. Identifizierung der Honigenzyme .............................................................. 71 4.7.2.2. Vergleich gefilterter und ungefilterter Honige............................................ 75 4.7.2.3. Zusammenfassung der Ergebnisse der GPC ........................................... 76
4.7.3. Elektrophorese ............................................................................... 77 4.7.3.1. Elektrophorese von Saccharasefraktionen ............................................... 79 4.7.3.2. Ergebnisse der Elektrophorese ................................................................ 81 4.7.3.3. Zumischungen von gefilterten zu ungefilterten Honigen ........................... 84 4.7.3.4. Densitometrische Auswertung ................................................................. 85 4.7.3.5. Methodenvalidierung ............................................................................... 90 4.7.3.6. Ergebnisse und Schlussfolgerungen ........................................................ 94
5. Material und Methoden ................................................................................... 98
5.1. Phenylacetaldehyd (Kapitel 3) ................................................................... 98 5.1.1. Chemikalien, Geräte und Hilfsmittel ............................................... 98 5.1.2. Probenliste ..................................................................................... 99 5.1.3. Methode: Bestimmung der freien Aminosäuren ............................. 99 5.1.4. Methode: Phenylacetaldehyd-Bestimmung mittels Headspace- .....
GC/MS ............................................................................................ 100 5.1.5. Methode: Phenylacetaldehyd-Bestimmung nach Extraktion ........... 101 5.1.6. Methodenvalidierung ...................................................................... 103 5.1.7. Durchführung der Lagerungsversuche ........................................... 104
5.2. Filtration von Honig (Kapitel 4) ................................................................... 105 5.2.1. Chemikalien, Geräte und Hilfsmittel ............................................... 105 5.2.2. Probenliste ..................................................................................... 107 5.2.3. Screening-Versuche ....................................................................... 108
5.2.3.1. Methode: Bestimmung der Oligosaccharide ............................................. 108 5.2.3.2. weitere Untersuchungen .......................................................................... 109 5.2.3.3. DIN-Methoden ......................................................................................... 110 5.2.3.4. extern durchgeführte Untersuchungen ..................................................... 110
5.2.4. Methode: Bestimmung des Proteingehaltes nach Bradford ............ 111 5.2.5. Methode: Gelchromatographie ....................................................... 112
5.2.5.1. Bestimmung der Glucose-Oxidase-Aktivität ............................................. 112 5.2.6. Methode: Elektrophoretische Untersuchung ................................... 113 5.2.7. Methodenvalidierung ...................................................................... 114
6. Literatur ............................................................................................................ 116
7 1. Einführung
7
U Umdrehungen UV ultraviolett
Abkürzungsverzeichnis Å Ångström Abb. Abbildung Abschn. Abschnitt AID absolute integrated density Anl. Anlage BSA Bovine Serum Albumin c Konzentration CCD Charge-coupled Device DAD Diodenarray-Detektor DID differential integrated density DIN Deutsche Industrie-Norm EC Enzyme Commission EG Europäische Gemeinschaft EN Europäische Norm Fa. Firma F/G Fructose-Glucose-Verhältnis GC Gaschromatographie GPC Gelpermeationschromatographie h Stunde HMF Hydroxymethylfurfural HPLC Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ICP induktiv gekoppeltes Plasma IR infrarot ISO International Standard Organisation Kap. Kapitel kDa Kilo-Dalton kHz Kilohertz λ Wellenlänge min. Minute µm Mikrometer MS Massenspektrometrie m/z Masse pro Ladung n Probenzahl NaAc Natriumacetat nm Nanometer PAA Phenylacetaldehyd PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese ppm parts per million (entspricht mg/kg) RHmV Rückstandshöchstmengen-Verordnung RI Refraktionsindex SDS Natriumdodecylsulfat sek. Sekunde Tab. Tabelle
1. Einführung 8
8
Abb. 1.a: Honigjäger (6000 Jahre alte Höhlenmalerei bei Valencia, Spanien)
1. Einführung
Honig ist ein Lebensmittel, welches von Honigbienen (Apis mellifera) aus
Blütennektar oder Honigtau erzeugt wird.
Seit Jahrtausenden wird Honig als naturbelassenes und
hochwertiges Erzeugnis zum unmittelbaren Verzehr oder
zum Süßen von Speisen genutzt (Abb. 1.a). Der Name
stammt aus dem indogermanischen ab, wo er seiner Farbe
wegen als „der Goldfarbende“ bezeichnet wurde.
Vor allem in Deutschland besitzt dieses Lebensmittel einen
hohen Stellenwert. Die deutsche Bevölkerung verzehrt pro
Jahr ca. 100.000 t Honig, was einem Pro-Kopf-Verbrauch
von etwa 1,4 kg entspricht und damit den höchsten
Durchschnittskonsum der Welt darstellt. Die einheimischen
Imker produzieren dabei ungefähr ein Viertel der benötigten
Menge, der restliche Honig wird importiert.
Die Verbraucher stellen hohe Ansprüche an die Qualität von Honig. Diese wird im
deutschen und im europäischen Lebensmittelrecht in zahlreichen Normen geregelt,
wobei die honigspezifischen Qualitätsparameter in der deutschen Honigverordnung
festgelegt sind. Darüber hinaus legen die Abfüller und Importeure häufig zusätzliche
Spezifikationen fest, um ihre Produkte von denen der Mitbewerber abzuheben.
Die Qualitätsmerkmale unterliegen jedoch einem stetigen Wandel und müssen stetig
aktuellen Gegebenheiten, aber auch rechtlichen Anforderungen angepasst werden.
So gilt es Verfahren zum Nachweis von neu zugelassenen Substanzen, die im
Pflanzenschutz oder in der Bienenhaltung zum Einsatz kommen, zu entwickeln oder
Verfälschungen des Honigs analytisch nachzuweisen. Dahingehend müssen sowohl
Analysemethoden erarbeitet als auch Grenzwerte festgelegt werden.
Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Qualitätssicherung von Honig aktuellen
Fragestellungen anzupassen.
Im ersten Teil wurde die Problematik des Stoffes Phenylacetaldehyd aufgegriffen.
Dieser kann als Bienenvertreibungsmittel zur Vereinfachung der Honigernte
9 1. Einführung
9
eingesetzt werden und somit als Rückstand im Honig vorliegen. Das führte dazu,
dass Stiftung Warentest im Jahr 2004 Honige aufgrund analytischer Befunde
beanstandete. Die Substanz kann jedoch auch natürlicherweise im Honig vorliegen,
so dass die Aufgabe darin bestand, den Bildungsmechanismus von
Phenylacetaldehyd genauer zu untersuchen. Anhand der zu ermittelten Daten sollte
dem Handel die Möglichkeit gegeben werden, eindeutig zu erkennen, ob
Phenylacetaldehyd als Rückstand oder als natürlicher Bestandteil im Honig
vorhanden ist.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Auswirkungen der Filtration von Honig gemäß
der Honigverordnung aus 2004 (LFGB) untersucht. Durch die Filtration werden dem
Honig Pollen entzogen, so dass sich die botanische und geographische Herkunft
mittels mikroskopischer Pollenanalyse nicht mehr feststellen lassen. Die Folge sind
mögliche illegale Beimischungen von billigen filtrierten Honigen zu teuren Sorten und
ein Preisverfall dieser hochwertigen Produkte. Es gab bislang noch keine
Möglichkeit, derartige Zusätze zu detektieren.
Forschungsziel war es somit, eine analytische Methode zu entwickeln, um in
Honigmischungen einen unzulässigen Zusatz von filtrierten Honigen nachweisen zu
können. Dabei wurde eine Forderung des Agrarausschusses des Bundesrates
aufgegriffen, welcher im Rahmen der Zustimmung zur neuen Honigverordnung im
Jahr 2003 darum gebeten hatte, die Forschung zu verstärken, um
Nachweismethoden für eine Verschneidung zu erarbeiten.
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 10
10
Abb. 2.1.a: Biene beim Sammeln von Nektar
Abb. 2.1.b: Bienen beim Verdeckeln der Waben
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
2.1. Honigerzeugung
Honig entsteht aus Nektar bzw. Honigtau, welcher von Bienen gesammelt und
weiterverarbeitet wird. Bei Honigtau, dem Rohstoff für den Waldhonig, handelt es
sich um die zuckerhaltigen Abscheidungsprodukte von Blattläusen.
Die Säfte werden zunächst von der Biene
aufgenommen (Abb. 2.1.a) und gelangen in die
Honigblase. Ein Teil davon wird in den Darm
abgegeben und dient den Bienen als Nahrung.
Die heimkommenden Sammlerinnen geben den
unverbrauchten Honigblaseninhalt an die
Stockbienen ab. Gleiches passiert auch
zwischen den Stockbienen, so dass die
Pflanzensäfte ständig von Honigblase zu
Honigblase wechseln. Bei diesen Vorgängen wird die Flüssigkeit mit bieneneigenen
Absonderungen angereichert, die vor allem lange Zuckerketten zerkleinern und
aufspalten. Je mehr Bienen der Rohhonig auf diese Weise auf seinem Weg zur
Einlagerung passiert, desto höher ist am Ende der Enzymgehalt des ausgereiften
Honigs.
Danach wird der Honig von den Stockbienen in Waben eingelagert. Während des
Reifungsprozesses wird der Honig eingedickt. Der Wassergehalt der Honigrohstoffe
liegt bei ca. 75 % und wird während der
Honigreifung im Bienenstock bis auf 20 %
erniedrigt. Dies geschieht üblicherweise
innerhalb weniger Tage. Erst wenn der
Wassergehalt unter 20 % gesunken ist,
werden die Waben verdeckelt (Abb. 2.1.b),
und der Honig gilt als reif. Da dies aber von
verschiedenen Faktoren abhängig ist, zum
Beispiel Klima oder Volksstärke, kann es in
11 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
11
Abb. 2.1.c: Honig-schleuder
seltenen Fällen vorkommen, dass Bienen auch Honig mit höherem Wassergehalt
verdeckeln.
Bei der Honigernte durch die Imker werden die
verdeckelten Waben dem Stock entnommen. Die
Gewinnung des Honigs erfolgt üblicherweise mittels
Schleudern, bei denen der Honig durch Zentrifugalkräfte
aus den Waben herausgedrückt wird (Abb. 2.1.c)
[LÜLLMANN & HORN (2006)].
Anschließend wird der Honig gesiebt, um
Verunreinigungen wie Wachspartikel, Bienenteile oder
Bestandteile der Waben zu entfernen. Die Siebe bestehen
aus einem grobmaschigen Obersieb und einem
feinmaschigen Untersieb, wobei die maximale
Maschenweite der Siebe 200 µm beträgt [LÜLLMANN &
HORN (2006)].
Je nach Zustand des Honigs können weitere Aufarbeitungsschritte folgen, wie zum
Beispiel das Klären zum Entfernen kleinster Wachsteilchen oder das Verflüssigen
kristallisierter Honige (siehe dazu Kap. 4.2.).
2.2. Inhaltsstoffe des Honigs
2.2.1. Hauptbestandteile
Wasser und Kohlenhydrate (Zucker) ergeben zusammen etwa 90 % der Masse von
Honig.
Kohlenhydrate
Kohlenhydrate stellen mit ca. 70 % den Hauptbestandteil des Honigs dar, wobei die
Monosaccharide D-Fructose (im Folgenden nur „Fructose“) (33 - 42 %) und D-
Glucose (im Folgenden nur „Glucose“) (27 - 36 %) (Abb. 2.2.1.a) den
überwiegenden Anteil ausmachen. Als weitere Einzelzucker wurde lediglich das
Vorhandensein von Galactose in Spuren beobachtet [VAL et al. (1998)].
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 12
12
Abb. 2.2.1.a: D-Glucose (links) und D-Fructose (rechts)
Fructose und Glucose entstammen direkt dem Nektar, werden aber auch durch
Hydrolyse des Disaccharids Saccharose mit Hilfe des Enzyms Saccharase gebildet.
Da letzteres im Honig unter entsprechenden Voraussetzungen aktiv bleibt, können
während der Lagerung weitere Anteile an Saccharose umgesetzt werden (siehe Kap. 2.2.3.2.).
Das Verhältnis von Fructose und Glucose (F/G) ist unter anderem von der
Blütentracht abhängig und liegt zumeist auf der Seite der Fructose. Eine Ausnahme
bilden Rapshonige, bei denen der Anteil an Glucose überwiegen kann.
Weiterhin sind im Honig unterschiedliche Disaccharide zu finden. Am häufigsten
kommen Saccharose (Rohrzucker), Maltose, Isomaltose, Turanose und Trehalose
vor. Die Konzentrationen dieser Zucker unterliegen dabei großen Schwankungen.
Beispielsweise ist der Gehalt an Saccharose bedingt durch die Tracht und den
Einspeichelungsgrad an Saccharase durch die Biene. Manche Disaccharide sind
aber auch auf enzymatische Aktivitäten von Mikroorganismen zurückzuführen [LIPP
(1994)].
Trisaccharide, wie zum Beispiel Erlose, Melezitose und Maltotriose, sowie Tetra- und
Pentasaccharide sind ebenfalls im Honig zu finden. Honigtauhonige enthalten im
Schnitt mehr höhermolekulare Zucker als Blütenhonige, was damit zu erklären ist,
dass diese Kohlenhydrate durch Enzymsysteme der Blattlaus synthetisiert werden
[LIPP (1994)].
Di-, Tri- und höhere Saccharide können im Honig bis zu 10 % vorhanden sein.
Generell kann die Verteilung bzw. Menge der Kohlenhydrate charakteristisch für
bestimmte Honigsorten sein [FÖLDHÁZI (1994), MATEO & BOSCH-REIG (1997)]
(vergleiche Kap. 2.3.1.).
13 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
13
Wasser
Der Wassergehalt in reifen Honigen liegt zwischen 16 und 20 % (vergleiche Kap. 2.1.). Eine Ausnahme bilden Heidehonige, die durchschnittlich etwas höhere Gehalte
aufweisen.
2.2.2. weitere Bestandteile
Organische Säuren
Honig enthält eine Reihe niedermolekularer organischer Säuren, die unterschiedliche
Ursprünge haben können. Dominierend ist die Gluconsäure als Produkt der Glucose-
Oxidase (siehe Kap. 2.2.3.3.). Aber auch Citronensäure, Brenztraubensäure und DL-
Milchsäure wurden in vielen Honigsorten nachgewiesen [NOZAL et al. (2003), PILZ-
GÜTHER & SPEER (2004)].
L-Äpfelsäure kann hingegen in höheren Konzentrationen ein Indikator für eine
Gärung des Honigs sein [PATSCHKY & SCHÖNE (1970)].
Das Vorhandensein hoher Gehalte von Ameisensäure oder Oxalsäure deutet auf
eine Behandlung der Bienen gegen Varoose hin [BOGDANOV et al. (2003)].
Flavonoide und Phenolcarbonsäuren
Phenolcarbonsäuren und Flavonoide sind vielfach untersuchte Stoffgruppen, die in
unterschiedlichen Mengen im Honig in Abhängigkeit von der Tracht vorhanden sind.
In verschiedenen Sortenhonigen wurden beispielsweise p-Hydroxybenzoesäure, p-
Cumarsäure, Kämpferol oder Chrysin in Konzentrationen von 0,1 bis 15 mg/kg
beobachtet [GHELDOF et al. (2002)]. Es handelt sich dabei um so genannte
sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe, die nicht nur farb- und aromagebende
Eigenschaften besitzen, ihnen werden auch antioxidative Wirkungen zugesprochen.
Aromakomponenten
Das Spektrum der Substanzen im Honig, die für die Organoleptik verantwortlich sind,
ist sehr vielfältig. Die Sensorik ist neben dem Pollenspektrum auch das wichtigste
Beurteilungskriterium zur Unterscheidung von Honigsorten (vergleiche Kap. 2.3.1.).
Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Carbonylverbindungen und Ester stellen die
hauptsächlichen Stoffgruppen dar, die Beiträge zum Aroma liefern. Bestimmte
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 14
14
Verbindungen können sogar als Marker für einzelne Sorten herangezogen werden.
Beispiele sind 2,3-Pentandion für Eukalyptushonige oder 3-Methyl-2-butanol für
Sonnenblumenhonige [RADOVIC et al. (2001)].
Mineralstoffe und Spurenelemente
Die Zusammensetzung der mineralischen Bestandteile unterliegt starken
Schwankungen je nach Honigart und Herkunft. Kalium bildet das Hauptelement der
Asche [SOUCI et al. (1994)], wobei die Zusammensetzung von vielen Faktoren
abhängig ist. Verschiedene Arbeiten haben bereits gezeigt, dass die Profile
bestimmter Spurenelemente auf den botanischen Ursprung von Honigen hindeuten
können [DEVILLERS et al. (2002), NANDA et al. (2003)].
Aminosäuren
Unter den freien Aminosäuren, die der Honig enthält, dominiert das Prolin mit einem
Mindestgehalt von 66 % und einem durchschnittlichen Gehalt von 80 - 90 %, wobei
der größte Anteil auf Sekretzugabe durch die Bienen zurückzuführen ist. Viele
andere Aminosäuren entstammen dagegen der Tracht. Kap. 3.5.1. behandelt diese
Stoffgruppe ausführlicher, zur Bestimmung von Prolin siehe Kap. 2.3.4.
Proteine
Der Proteingehalt im Honig stammt zum überwiegenden Teil von der Biene, wird
aber auch durch die Tracht mitbestimmt. Er ist dabei von vielen Faktoren abhängig,
zum Beispiel Art der Tracht, Zustand des Bienenvolkes oder der Jahreszeit. Beim
Großteil der Proteine handelt es sich um Enzyme (siehe Kap. 2.2.3.), aber auch
kolloidale Eiweißsubstanzen kommen im Honig vor.
Der Gehalt der Proteine schwankt stark und liegt zwischen 0,01 bis 0,17 % (siehe
dazu auch Kap. 4.7.1.).
IGLESIAS et al. nahmen 2006 chromatographische Proteinuntersuchungen ohne
Berücksichtigung der Enzymaktivitäten vor, um zu zeigen, dass es möglich ist,
anhand der Eiweißprofile eine Unterscheidung zwischen Blüten- und
Honigtauhonigen zu treffen.
15 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
15
2.2.3. Enzyme
Der überwiegende Teil biochemischer Reaktionen in lebenden Organismen wird von
Enzymen gesteuert. Enzyme sind katalytisch wirkende, meist komplex aufgebaute
Proteine. Sie besitzen eine chemisch uneinheitliche Oberfläche, aus der an
verschiedenen Stellen funktionelle Gruppen herausragen. Katalytische Reaktionen
laufen dabei an dem sogenannten aktiven Zentrum, in dem das Enzym mit einem
definierten Substrat reagiert. Dies wird als „Substratspezifität“ bezeichnet. Das
Enzym, welches mit einem Substrat reagiert, bestimmt auch die Art der Reaktion,
was „Wirkungsspezifität“ genannt wird.
Nach dem Vorschlag der Enzyme Commission (EC) der IUPAC (International Union
of Pure and Applied Chemistry) werden die Enzyme nach ihrer Wirkspezifität in
sechs Gruppen eingeteilt: Oxidoreduktasen (Gruppe 1), Transferasen (2),
Hydrolasen (3), Lyasen (4), Isomerasen (5) und Ligasen (6).
Entscheidend für die Enzymaktivität sind der pH-Wert und die Temperatur. Der pH-
Wert beeinflusst die Ionisation funktioneller Gruppen der Aminosäuren und ist häufig
auch Voraussetzung dafür, dass das Substrat als Ion vorliegt, um eine Interaktion mit
dem aktiven Zentrum zu ermöglichen. Extreme pH-Werte können allerdings zu einer
Denaturierung, also einer irreversiblen Änderung der Sekundär- und Tertiärstruktur
der Enzyme führen, womit das Enzym seine katalytischen Fähigkeiten verliert.
Die Temperatur bestimmt die Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen. Diese
steigt mit zunehmender Temperatur, so dass die pro Zeiteinheit gebildete Menge des
Produktes erhöht wird. Ab einer bestimmten Temperatur beginnt jedoch auch hier
eine Denaturierung, so dass diese beiden Effekte (Erhöhung der
Reaktionsgeschwindigkeit und Denaturierung) den Bereich des Temperaturoptimums
bestimmen [LEISTNER & BRECKLE (1997)].
Honig enthält eine Reihe von Enzymen, die entweder von der Biene oder von der
Pflanze eingetragen werden können.
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 16
16
2.2.3.1. Diastase
Die α-Amylase des Honigs, die sogenannte Diastase, gehört zu der Enzymgruppe
der Hydrolasen und stammt aus dem Kopfdrüsensekret der Bienen. Die Diastase
wird dem Honig während der Reifung zugesetzt. Vermutlich wird dieses Enzym zum
Aufschluss der Pollennahrung herangezogen.
Das Molekulargewicht beträgt 57 kDa [BABACAN & RAND (2005)], das pH-Optimum
liegt im Bereich von 4,6 bis 5,3 und das Temperaturoptimum bei 55 °C [BABACAN &
RAND (2007)].
Diastase erweist sich als relativ wärmeunempfindlich. Die Inaktivierungstemperatur
liegt zwischen 60 und 100 °C. Ist keine Enzymaktivität nachweisbar, so ist dies ein
Indiz für einen unreifen Honig bzw. für eine Verfälschung. Zur Ermittlung der
Diastaseaktivität siehe Kap. 2.3.3.
Es wurde eine Abhängigkeit der Diastaseaktivität von der Honigsorte festgestellt
(siehe dazu Kap. 2.2.3.2.).
2.2.3.2. Saccharase
Das Vorhandensein der Saccharase im Honig wurde erstmals von NELSON &
COHN (1924) erwähnt.
Die Saccharase, auch Invertase genannt, ist eine α-Glucosidase und das Enzym,
welches für die Hydrolyse der Saccharose des Nektars während der Honigreifung
verantwortlich ist. Des Weiteren bewirkt dieses Enzym Transglucosidierungen im
Honig, die unter anderem zum Entstehen des Trisaccharids Erlose führen [WHITE &
MAHER (1953)]. Allerdings weisen auch Zuckerfütterungshonige bei Fütterung mit
Trockenzucker hohe Invertaseaktivitäten auf. Der Grund ist, dass das Angebot des
Hauptnahrungsmittels sehr groß ist und damit die Enzymproduktion der Biene
angeregt wird. Nach etwa 10 Tagen sind die Bausteine der Enzymbildung im
Bienenkörper allerdings erschöpft, so dass die Saccharaseaktivität in dem aus
diesen Zuckern hergestellten Honig wieder sinkt. Somit ist dieses Enzym weniger ein
Parameter für Verfälschung als ein Parameter für den Reifegrad eines Honigs
[BERGNER & HAHN (1972a)].
Das Temperaturoptimum der Saccharase liegt zwischen 40 und 50 °C, der optimale
pH-Bereich bei 6,0 (CHO (1994)].
17 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
17
Gegen Erhitzung ist die Invertase wesentlich empfindlicher als die Diastase. So
beträgt die Halbwertszeit der Saccharase bei 40 °C ca. 10 Tage, während die der
Diastase bei 31 Tagen liegt. Eine Erhitzung auf 60 °C führt schon nach wenigen
Stunden zum vollständigen Aktivitätsverlust. Ein besonders schonend behandelter
Honig wird daher auch eine relativ hohe Saccharasezahl aufweisen [BONHEVI et al.
(2000)]. Allerdings wird die Ausgangsaktivität ebenfalls von der Honigsorte
mitbestimmt. So besitzen beispielsweise Akazienhonige im Allgemeinen niedrige,
Honigtauhonige dagegen hohe Aktivitäten. Es wurde weiterhin eine ungefähre
Korrelation zwischen Diastase- und Saccharaseaktivitäten beobachtet [PERSANO-
ODDO et al. (1999), SERRANO et al. (2007)]. Zur Ermittlung der Saccharaseaktivität
siehe Kap. 2.3.3.
Zum Molekulargewicht (MG) der Saccharase sind in der Literatur unterschiedliche
Angaben zu finden. HUBER & MATHISON gaben 1976 einen Bereich von 51 – 82
kDa an, EDELHÄUSER & BERGNER (1987) ermittelten ein MG von 57 kDa und
CHO (1994) eines von 76 kDa.
2.2.3.3. Glucose-Oxidase
Die Glucose-Oxidase (EC-Nr. 1.1.3.4) gehört zu den Oxidoreduktasen und setzt
Glucose über das Gluconolacton zu Gluconsäure und Wasserstoffperoxid um (Abb. 2.2.3.3.a) [DUSTMANN (1971)]. Letzteres besitzt eine keimtötende Wirkung und ist
damit für antibakterielle Effekte des Honigs verantwortlich.
Das pH-Optimum dieses Enzyms liegt bei 6,1, das Temperaturoptimum bei 40 °C
[SCHEPARTZ & SUBERS (1964)]. Das Enzym ist sehr wärme- und lichtempfindlich
[DUISBERG & WARNECKE (1959)], so dass eine unsachgemäße Lagerung zu einer
Abnahme der Aktivität und somit zum Verlust der inhibinen Wirkung führen kann.
Abb. 2.2.3.3.a: Umsetzung von Glucose zur Gluconsäure durch die Glucose-Oxidase
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 18
18
2.2.3.4. weitere Enzyme
Die Katalase ist ein Enzym, welches Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff
zersetzt. Es kann somit die antibakterielle Wirkung der Glucose-Oxidase
abschwächen. Das Vorliegen im Honig ist trachtabhängig, da die Katalase dem
Pollen und Nektar entstammt [DUSTMANN (1971)].
Darüber hinaus wird über das Vorkommen einer sauren Phosphatase vom
Phosphormonoestertyp berichtet [GÜNTHER & BURCKHART (1967)].
LOW et al. fanden 1986 das Enzym β-Glucosidase in verschiedenen Honigen,
welches von den Bienen eingetragen wird.
Honig enthält noch weitere Enzyme. Einige davon finden in Kap. 3.2. Erwähnung.
2.3. Qualitätsuntersuchungen von Honig
In der DIN EN ISO 9000:2000-01 ist Qualität definiert als „Vermögen einer
Gesamtheit inhärenter Merkmale eines Produkts (...) zur Erfüllung von Forderungen
von Kunden und anderen interessierten Parteien“. Die Qualitätssicherung umfasst
dabei alle diejenigen geplanten und systematischen Tätigkeiten, die notwendig sind,
um ein hinreichendes Vertrauen zu schaffen, dass ein Produkt die festgelegten
Qualitätsanforderungen erfüllen wird.
In der deutschen und europäischen Lebensmittelgesetzgebung sind
Qualitätsparameter für Honig in einer Vielzahl von Rechtsnormen geregelt. Dabei ist
in erster Linie die Honigverordnung vom 16.1.2004 als vertikale Vorschrift
heranzuziehen, mit der die Richtlinie 2001/110/EG der Europäischen Union vom
20.12.2001 umgesetzt wurde. Dort sind neben der zulässigen Kennzeichnung auch
Mindest- und Höchstmengen bzw. -werte für viele Substanzgruppen verankert.
Nach Anl. 2 Abschn. I dürfen Honig keine anderen Stoffe als Honig zugefügt werden,
was bedeutet, dass beispielsweise eine Beimischung von Fremdzuckern generell
verboten ist.
19 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
19
Weiterhin dürfen auch keine honigeigenen Bestandteile entzogen werden. Eine
Ausnahme bilden gefilterte Honige. Dieser Sachverhalt wird in Kap. 4. ausführlich
behandelt.
Ferner findet man in den Leitsätzen des Deutschen Lebensmittelbuches Kennzahlen
für besondere Auslobungen von Honig, die hier in Zusammenhang mit § 3 Abs. 3
Nr. 3 der Honigverordnung zu sehen sind.
Die Rechtsnormen stellen die grundsätzlichen gesetzlichen Mindestanforderungen
an die Qualität von Honig dar. Die Inverkehrbringer von Honig legen darüber hinaus
häufig noch weitergehende Spezifikationen für ihre Produkte fest, die zusätzliche
Parameter umfassen können.
2.3.1. Bestimmung der botanischen und regionalen Herkunft
Melissopalynologie
Bei der Pollenanalyse von Honig, die als Melissopalynologie bezeichnet wird, werden
im Sediment mikroskopisch die verschiedenen Pollentypen identifiziert. Die
Auszählung der vorherrschenden Pollenarten ergeben die Haupttrachtquellen, und
das gesamte Pollenspektrum erlaubt die Aussage der geographischen Herkunft.
Der Pollenanteil im Honig entspricht jedoch in vielen Fällen nicht dem Anteil an
Nektar aus der betreffenden Pflanze. Häufige Gründe sind eine nicht einheitliche
Tracht, wenn Nektar- und Pollenangebote in den unterschiedlichen Jahreszeiten
differieren. Darüber hinaus produzieren einige Pflanzen, vielfach Neuzüchtungen,
kaum noch Pollen. Beispiele sind Sonnenblume oder Lavendel. Zu einer Irreführung
bei der Sortenbestimmung von Honigen können auch Pflanzen beitragen, die
übermäßig viele Pollen produzieren, wie zum Beispiel die Edelkastanie. Derartige
Über- und Unterrepräsentierungen müssen bekannt sein, um die Herkunft des
Honigs fehlerfrei zu bestimmen. Eine Sortendeklaration für „Edelkastanie“ bedeutet,
dass 90 % Edelkastanienpollen im entsprechenden Honig vorhanden sein müssen,
wohingegen bei einem Lavendelhonig ein Anteil von 10 bis 20 % ausreicht [TALPAY
(1985)].
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 20
20
Nach § 3 Abs. 3 der Honigverordnung dürfen Angaben zur botanischen und
regionalen Herkunft nur gemacht werden, wenn der Honig neben den
organoleptischen und physikalisch-chemischen auch die entsprechenden
mikroskopischen Merkmale aufweist.
Elektrische Leitfähigkeit
Die gemeinsam mit der Pollenanalyse durchgeführte Messung der elektrischen
Leitfähigkeit lässt Aussagen darüber zu, ob ein Blütenhonig, ein Honigtauhonig oder
eine Mischung vorliegt.
Die Bestimmung erfolgt durch Messung des elektrischen Widerstands nach
DIN 10753 und wird in mS/cm (milli-Siemens) angegeben. Von einzelnen
Ausnahmen abgesehen charakterisieren Werte unter 0,5 mS/cm Blütenhonige,
Werte über 0,8 mS/cm Honigtau- bzw. Waldhonige, Mischungen liegen zwischen
0,5 und 0,8 mS/cm.
Nach der Honigverordnung, Anl. 2 Abschn. II Nr. 4, muss die elektrische Leitfähigkeit
für Honigtau- und Kastanienhonige mindestens 0,8 mS/cm betragen, für alle anderen
Honigarten dürfen 0,8 mS/cm nicht überschritten werden.
Die elektrische Leitfähigkeit erlaubt außerdem eine indirekte Aussage über den
Mineralstoffgehalt des Honigs. Bei der Ausscheidung von Nektar gelangen weniger
Mineralstoffe aus dem Phloemsaft in den Honigrohstoff als der bei der Abscheidung
des überflüssigen Phloemsafts durch Pflanzensauger. Je höher die elektrische
Leitfähigkeit ist, desto höher ist der Mineralstoffgehalt.
Sensorik
Da Honige definierter Herkunft typische organoleptische Merkmale aufweisen, wird
parallel zur mikroskopischen Untersuchung eine Verkostung durchgeführt, um die
Befunde zu verifizieren.
Zuckerprofil
Das Zuckerprofil gibt die Menge und Art der im Honig üblicherweise vorhandenen
Zucker an.
Das F/G-Verhältnis ist abhängig von der Trachtquelle. Akazienhonig ist
beispielsweise durch hohe F/G-Werte gekennzeichnet, das Minimum für eine
21 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
21
Sortendeklaration ist ein Verhältnis von 1,40. Weiterhin bestimmt dieser Quotient
zusammen mit dem Wassergehalt im Wesentlichen das Kristallisationsverhalten
eines Honigs (vergleiche dazu Kap. 4.2.).
Die Bestimmung des Zuckerspektrums erfolgt mittels HPLC (Aminsäule und RI-
Detektion) nach der DIN 10758.
Nach der Honigverordnung, Anl. 2 Abschn. II Nr. 1, beträgt der erforderliche
Mindestgehalt an reduzierenden Zuckern (Glucose und Fructose) 60 % in
Blütenhonigen bzw. 45 % in Honigtauhonigen. Der Gehalt an Saccharose darf 5 %
nicht überschreiten. Ausnahmen bilden beispielsweise Robinien- (10 %) oder
Lavendelhonige (15 %).
Ein erhöhter Saccharosegehalt könnte ein Hinweis auf Zuckerfütterung sein, wenn er
nicht im Zusammenhang mit der Honigsorte steht. Robinienhonig kann zum Beispiel
natürlicherweise höhere Saccharosewerte aufweisen, da der Nektar überwiegend
aus diesem Zucker besteht.
2.3.2. Parameter zum Nachweis von Verfälschungen
13C-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie
Die 13C-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie weist den unerlaubten Zusatz von
Produkten aus C4-Pflanzen nach, wie zum Beispiel hydrolysierte Maisstärke oder
Zuckerrohrsirup.
Nach den Hauptformen des photosynthetischen Kohlenstoffmetabolismus kann man
die Landpflanzen in drei Gruppen einteilen. Die erste Gruppe ist die der C3-Pflanzen,
bei denen 3-Phosphorglycerinsäure als Primärprodukt der CO2-Fixierung entsteht. Zu
dieser Gruppe gehört die überwiegende Anzahl an Nektarquellen für die
Honigerzeugung.
Bei der zweiten Gruppe, zu denen unter anderem viele tropische Gräser gehören,
entstehen Dicarbonsäuren als erste Produkte der CO2-Fixierung. Mais und
Zuckerrohr gehören ebenfalls zu dieser Pflanzengruppe. Maisstärke ist zum Beispiel
Ausgangsprodukt für die Gewinnung von High-Fructose-Sirupen, die sich in ihrer
Zuckerzusammensetzung und hinsichtlich des F/G-Verhältnisses unwesentlich von
Honig unterscheiden und sich daher hervorragend zur Verfälschung eignen.
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 22
22
Saccharose aus Rohrzucker wird als Winterfutter und zur Fütterung von
Bienenvölkern in trachtarmen Zeiten eingesetzt, wobei über die Messung von
Saccharose nicht unbedingt ein Missbrauch nachweisbar ist.
Die dritte Pflanzengruppe, sogenannte CAM-Pflanzen (Crassulacean acid
metabolism), zu denen viele sukkulente Pflanzen gehören, wie Crassulaceae,
Euphorbiaceae, Cactaceae, spielen auf dem Weltmarkt als Trachtquellen für die
Honigerzeugung nur eine untergeordnete Rolle.
Da sich oben erwähnte Pflanzengruppen auch hinsichtlich der Fixierung des natürlich
vorkommenden, schwereren 13C-Isotops unterscheiden, kann man auf Grund des
δ13C-Wertes eine klare Unterscheidung treffen. C3-Pflanzen liegen in ihrem δ13C-
Wert bei -25 ‰, während C4-Pflanzen bei -10 bis -12 ‰ liegen.
Da die Nektarquellen des Honigs zu den C3-Pflanzen gehören, ist eine Beimischung
von Maiszucker- bzw. Zuckerrohrzuckerprodukten über das δ 13C-Verhältnis
nachweisbar. Die Werte für unverfälschten Honig liegen bei < -23,5 ‰.
Die Bestimmung wird nach der offiziellen AOAC Methode 998.12 von 1998 unter
Einbeziehung des internen Standards nach WHITE & WINTERS (1989)
durchgeführt. Hierbei ist die Differenz zwischen dem δ 13C-Wert der Proteinfraktion
des Honigs und δ13C-Wert des reinen Honigs für die Berechnung des zugesetzten
Zuckergehaltes ausschlaggebend.
Bei einer Differenz von > -1,0 geht man von einer sicheren Verfälschung aus. Diese
Differenz entspricht einer Verfälschung von ca. 7 % und stellt somit die
Nachweisgrenze dar, ab der ein analytisch abgesicherter Zusatz von Zucker bzw.
Zuckersirup festzustellen ist.
Eine Verfälschung mit Produkten aus Rübenzucker ist über diese Methode nicht
möglich, da die Zuckerrübe (Beta vulgaris) wie die Nektarquellen zu den C3-Pflanzen
gehört.
23 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
23
2.3.3. Untersuchung auf Wärmeschädigung
Hydroxymethylfurfural
5-Hydroxymethylfurfural (HMF) ist der klassische Parameter für Lager- und
Erhitzungsschäden des Honigs (Strukturformel siehe Abb. 2.3.3.a). Gleichzeitig dient
der HMF-Gehalt als Indikator für andere wärmebedingte Reaktionen des Honigs, wie
zum Beispiel Aromaverlust bzw. -veränderungen oder Bräunungsreaktionen. HMF
entsteht als Produkt der Maillard-Reaktion bei einer irreversiblen Dehydratisierung
von Zuckern, respektive der Fructose, unter Säureeinwirkung. Der Gehalt an HMF ist
bei frischem Honig praktisch null und erhöht sich mit Dauer der Lagerung und durch
Erwärmung, zum Beispiel bei der Verflüssigung der Rohware während des
Abfüllprozesses. Der Gehalt steigt exponentiell mit Höhe der einwirkenden
Temperatur und Dauer der Einwirkung an [TOSI et al. (2002)].
PICHLER et al. zeigten 1984, dass die wichtigsten im Honig vorkommenden Zucker
zu HMF abgebaut werden können, allerdings in recht unterschiedlichem Maße.
Demnach entsteht HMF beispielsweise bis zu 150-mal schneller aus Fructose als
aus Glucose.
Weiterhin beobachteten sie, dass die Bildung von HMF umso schneller vonstatten
geht, je niedriger der pH-Wert des Honigs ist.
Die Bestimmung des HMF-Gehalts wird photometrisch nach der DIN 10751 (nach
Winkler) durchgeführt. Nach der Honigverordnung, Anl. 2 Abschn. II Nr. 6, darf der
HMF-Gehalt von Speisehonig bei maximal 40 mg/kg, der von Honigen aus
tropischen Gebieten bei maximal 80 mg/kg liegen.
Nach den Leitsätzen für Honig des Deutschen Lebensmittelbuches, Abschn. II Nr. 2,
weisen Honige mit bestimmten Qualitätsmerkmalen, wie zum Beispiel „kalt
geschleudert“, eine maximale HMF-Konzentration von 20 mg/kg auf.
Abb. 2.3.3.a: Strukturformel von Hydroxymethylfurfural
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 24
24
Diastaseaktivität
Da die Diastase wärmeempfindlich ist, stellt sie einen guten Indikator dar, ob dem
Honig bei der Verarbeitung eine Schädigung zugefügt wurde.
Die Bestimmung der Diastaseaktivität erfolgt photometrisch nach Schade
(DIN 10750), wobei die Farbintensität einer Stärkelösung gemessen wird, die mit Jod
einen blaugefärbten Komplex bildet. Die Aktivität wird als dimensionslose
Diastasezahl angegeben und entspricht unter den Bedingungen des Verfahrens der
Enzymaktivität in 1 g Honig, die eine Stärkemenge von 0,01 g von einem definierten
Blauwert an in 1 h bei 40 °C zu einem vorgegebenen Endpunkt abzubauen vermag.
Die meisten Honige weisen Diastasezahlen zwischen 8 und 24 auf.
Die Honigverordnung schreibt in Anl. 2 Abschn. II Nr. 7 eine Diastasezahl von
mindestens 8 vor, bei Honigarten mit einem geringen natürlichen Enzymgehalt und
HMF-Werten unter 15 mg/kg mindestens 3.
Saccharaseaktivität
Die Saccharase ist deutlich wärmeempfindlicher als die Diastase. Für eine
Auslobung des Honigs mit den Begriffen „kaltgeschleudert“ oder „wabenecht“ soll die
Saccharasezahl nach Hadorn entsprechend den Leitsätzen des Deutschen
Lebensmittelbuches, Abschn. II Nr. 2, mindestens 7 betragen.
Die Saccharase-Bestimmung wird photometrisch nach Siegenthaler (DIN 10759-1)
durchgeführt. Dabei wird das Substrat p-NPG (p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranosid)
umgesetzt, wodurch aus dem Nitrophenol das Nitrophenolat-Anion entsteht.
Anschließend wird nach einer definierten Reaktionszeit die Extinktion
spektralphotometrisch bei 400 nm gemessen. Das Ergebnis wird in die Hadornzahl
umgerechnet.
Die Methode nach Hadorn stellt genauso wie die Methode nach Gontarski eine
alternative Technik zur Bestimmung der Saccharaseaktivität in Honig dar. Die
Siegenthaler-Methode hat sich jedoch als präziser (bessere Werte für
Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit) und komfortabler erwiesen (VON DER OHE
et al. (1999)].
25 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
25
2.3.4. weitere Parameter zur Prüfung der Honigqualität
Prolin
Der Prolingehalt gibt Auskunft über die Reife eines Honigs, wobei Werte unter
180 mg/kg nach Untersuchungen an Zuckerfütterungshonigen als Zeichen unreifen
bzw. eventuell verfälschten Honigs interpretiert werden können. Einschränkend wird
jedoch erwähnt, dass auch bei Massentrachten Werte von unter 200 mg/kg
beobachtet wurden [VON DER OHE et al. (1991)].
Der Prolingehalt ist im Zusammenhang mit dem Säuregrad zu sehen. Bei
Säuregraden unter 17 bzw. unter 10 bei Sorten wie Akazie, Raps und Prolinwerten
unter 200 mg/kg besteht begründeter Verdacht auf Verfälschung.
Der Gehalt an Prolin wird photometrisch nach der DIN 10754 bestimmt.
Säuregrad, pH-Wert
Bienenhonig ist schwach sauer, Blütenhonig weist im Allgemeinen einen pH-Wert
zwischen 3,3 und 4,6 auf, Honigtauhonig liegt meist zwischen 4,2 und 5,5 [LIPP
(1994)]. Obwohl letzterer mehr Säuren enthält, werden diese durch den höheren
Gehalt an Mineralstoffen und Aminosäuren abgepuffert. Der pH-Wert beeinflusst die
Enzymaktivität und die Bildung von HMF.
Je reifer der Honig ist, desto höher liegt der Säuregrad.
Nach Anl. 2 Abschn. 1 der Honigverordnung darf Honig keinen künstlich veränderten
Säuregrad aufweisen. Nach Anl. 2 Abschn. II Nr. 5 gibt es einen maximalen Wert von
50 mEqu/kg (Milliäquivalente Säure pro kg), der auf der Bestimmung freier Säuren
beruht. Der Säuregehalt von Honig liegt zwischen 0,1 bis 0,4 %, brechnet als
Äpfelsäure.
Die beiden Parameter, pH und Säuregrad, werden potentiometrisch nach der
DIN 10756 gemessen.
Wassergehalt
Unter dem Wassergehalt eines Honigs wird der refraktrometrisch ermittelte Gehalt an
Wasser verstanden, angegeben als Massenanteil in g/100 g. Die Bestimmung des
Wassergehalts erfolgt nach DIN 10752.
Generell gilt, dass hoher Wassergehalt ein Zeichen unreif geernteten Honigs ist, der
dann gärungsgefährdet ist.
2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig 26
26
Nach der Honigverordnung, Anl. 2 Abschn. II Nr. 2, darf der Wassergehalt von
Blüten- und Honigtauhonigen nicht über 21 %, der von Heidehonigen nicht über 23 %
liegen.
2.3.5. Rückstandsanalytik
Bei Rückständen handelt es sich um Stoffe, die nach bestimmten technischen
Vorgängen im Produkt zurückbleiben. Bei Lebensmitteln meint man damit
üblicherweise Restmengen von Pflanzenschutzmitteln oder Tierarzneimitteln. Diese
werden dann zusammen mit dem Lebensmittel aufgenommen und können im
menschlichen Organismus, vor allem im Fettgewebe, akkumulieren.
Pflanzenschutzmittel, Schädlingsbekämpfungsmittel
Rückstände von Pestiziden oder Bioziden können in den Honig gelangen, wenn die
Pflanzen, die die Bienen zur Bestäubung nutzen, mit derartigen Mitteln behandelt
wurden. Die Rückstandshöchstmengen-Verordnung (RHmV) regelt die zulässigen
Höchstwerte für derartige Rückstände.
Die Bestimmung von Pflanzenschutzmittel-Rückständen erfolgt bisher meistens nach
der DFG S19-Methode, einer Multimethode, mit der eine Vielzahl von Substanzen
detektiert werden kann.
Tierarzneimittel
Werden Bienenkrankheiten, wie zum Beispiel Amerikanische Faulbrut oder Varroose
(Brutmilbenkrankheit), mit pharmazeutischen Substanzen behandelt, so können
diese Stoffe auf den Honig übergehen. In der Verordnung 2377/90/EG sind für viele
dieser Substanzen Höchstmengen festgelegt.
Derartige Rückstände werden üblicherweise mittels GC/MS oder LC/MS
nachgewiesen.
27 2. Zusammensetzung und chemische Untersuchung von Honig
27
Bienenvertreibungsmittel
Viele Imker verwenden Repellents, um die Bienen aus dem Stock zu vertreiben und
damit die Honigernte zu erleichtern. Auf diese Thematik wird in Kap. 3.4. genauer
eingegangen.
Um Rückstände von Bienenvertreibungsmitteln analytisch zu bestimmen, müssen
substanzspezifische Nachweismethoden angewandt werden.
3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil 28
28
3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil
3.1. Charakterisierung von Phenylacetaldehyd
Bei Phenylacetaldehyd (CAS-Nummer: 122-78-1) handelt es sich um eine in reiner
Form farblose bis hellgelbe, ölähnliche Flüssigkeit, die in Alkohol und Ether löslich,
mit Wasser aber nicht mischbar ist. Die Substanz besitzt die Molmasse 120,15 g/mol
und kommt natürlicherweise in vielen Blüten, wie zum Beispiel Raps oder Flieder, vor
[OMURA et al. (1999), OH et al. (2008)]. Phenylacetaldehyd duftet in reiner Form
nach Hyazinthen und besitzt einen Geruchsschwellenwert von 4 µg/l Wasser. Der
Schmelzpunkt liegt bei –10 °C, der Siedepunkt bei 195 °C. Die Dichte beträgt
0,939 g/ml [TERNES et al. (2005)]. Die Substanz kann als Bestandteil von
ätherischen Ölen als Kontaktallergen wirken, wird aber bei oraler Aufnahme als nicht
toxisch für den Organismus eingestuft [SANCHEZ-POLITTA et al. (2007)].
3.2. Phenylacetaldehyd in Honig
Phenylacetaldehyd gehört zu den natürlichen Aromabestandteilen des Honigs.
ALISSANDRAKIS et al. (2007) fanden beispielsweise bei der Analyse flüchtiger
Komponenten hohe Gehalte in griechischen Thymianhonigen, wohingegen
CASTRO-VAZQUEZ et al. (2006) diese auch in spanischen Honigtauhonigen
feststellten. GUYOT et al. (1999) und RADOVIC et al. (2001) bestimmten weiterhin
höhere Phenylacetaldehyd-Konzentrationen in Heidehonigen.
Phenylacetaldehyd kann dabei aus der Aminosäure Phenylalanin auf zwei
verschiedenen Wegen gebildet werden [SPEER & MONTAG (1987), DEIFEL
(1989)].
Beim enzymatischen Abbau werden die einzelnen Reaktionsschritte durch
honigeigene Enzyme katalysiert. Zunächst erfolgt eine Transaminierung des
Phenylalanins zu Phenylbrenztraubensäure mit Hilfe der Phenylalanin-Amino-
Transferase, anschließend wird die Phenylbrenztraubensäure durch Phenylpyruvat-
Decarboxylase in Phenylacetaldehyd übergeführt. Letzteres kann dann entweder zu
29 3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil
29
Abb. 3.2.a: Bildungsmechanismus von Phenylacetaldehyd mit Hilfe von Enzymen
Phenylessigsäure oxidiert (durch Aldehyd-Dehydrogenase) oder zu Phenylethanol
reduziert werden (durch Alkohol-Dehydrogenase) (Abb. 3.2.a).
Ein anderer Bildungsweg für Phenylacetaldehyd aus Phenylalanin ist der Strecker-
Abbau. Dabei reagiert das Phenylalanin mit dem in der Maillard-Reaktion gebildeten
3-Desoxyoson als reaktivem α-Diketon unter Transaminierung und Decarboxylierung
über das Aminoketon zum Phenylacetaldehyd (Abb. 3.2.b). Das schwach saure
Milieu des Honigs und erhöhte Temperaturen sind Voraussetzung für den Ablauf
dieser Reaktion [vergleiche auch BEHLITZ & GROSCH (1992)].
Abb. 3.2.b: Bildungsmechanismus von Phenylacetaldehyd innerhalb des Strecker-Abbaus
3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil 30
30
Abb. 3.3.a: Stiftung Warentest 4/2004
3.3. Problemstellung
Bei Honiguntersuchungen von Stiftung Warentest im
Jahr 2004 (Abb. 3.3.a) wurden sechs Honigproben
sensorisch abgewertet mit dem Kommentar
„Geschmack nach Phenylacetaldehyd“. Diese
Honige wurden weiterhin aufgrund eines „erhöhten”
Gehalts an Phenylacetaldehyd (zwischen 1,0 und
2,6 mg/kg) beanstandet (Tab. 3.3.b). Es handelte
sich bei diesen Produkten allesamt um Blütenhonige
aus Südamerika. Phenylacetaldehyd wurde dabei
als unerlaubter Rückstand interpretiert, was dazu
führte, dass alle beanstandeten Honige als
„rückstandsbelastet” eingestuft wurden und in der
Rubrik Rückstände die Beurteilung „ausreichend (4,5)” statt „sehr gut (0,5)” erhielten.
Die Gesamtnote bei allen sechs Proben war aufgrund der Sensorik und der
analytischen Befunde an Phenylacetaldehyd „mangelhaft“ [STIFTUNG WARENTEST
4/2004].
Honigprobe Aldi Nord / Vom
Besten Imkerhonig
Immenhof Imkerhonig
Kaiser´s Tengel-mann / Bären-
freund Blütenhonig
Lebkuchen Schmidt
Blütenhonig
Penny / Immenland Imker-Honig
Auslese
Wal Mart / Great Value
Blütenhonig Auslese
Phenylacet-aldehydbefund
[mg/kg] 2,5 1,2 1,6 2,6 1,0 1,5
Tab. 3.3.b: In Stiftung Warentest 4/2004 aufgrund der Phenylacetaldehydbefunde abgewertete Honigproben
Die aufgrund der Phenylacetaldehydgehalte vorgenommenen Abwertungen
erschienen indes nicht schlüssig und waren der Grund dafür, die Bildung von
Phenylacetaldehyd noch einmal genauer zu prüfen. Dabei sollten die Faktoren
untersucht werden, die den natürlichen Gehalt an Phenylacetaldehyd beeinflussen
können.
Zunächst werden Funktion und Einsatz von Bienenvertreibungsmitteln näher
betrachtet.
31 3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil
31
Abb. 3.4.a: Smoker zum Vertrei-ben der Bienen
Abb. 3.4.b: „Fume Pad“ zum Be-netzen mit Bee Repellents
3.4. Bienenvertreibungsmittel
Bienenvertreibungsmittel (englisch „Bee Repellents“) sind Stoffe, welche dazu
dienen, die Bienen während der Honigernte aus dem Stock zu vertreiben und somit
die Ernte zu erleichtern.
In kleinen Imkereien werden für diesen Zweck häufig Smoker genutzt (Abb. 3.4.a),
die auch in Deutschland im Imkereibedarf erhältlich sind. Dabei wird die Vertreibung
der Bienen mit Hilfe von Rauch bewerkstelligt, welcher im Innern eines
Edelstahlbehälters durch trockenes Holz, Sträucher oder auch Tannennadeln
erzeugt wird [GRAHAM (1993)]. Rauch wirkt auf die Bienen als Alarmsignal für
bevorstehendes Feuer, was dazu führt, dass sich die Bienen mit Honigvorräten
vollsaugen, was sie träge und somit sanfter macht [BOVAN (2006)]. Der Smoker
ersetzt die früher gebräuchliche Imkerpfeife.
In Nordamerika war dagegen Phenol als Repellent weit verbreitet [DAHARU &
SPORNS (1985)], wird aber wegen der Toxizität nicht mehr angewendet. KWAN &
SPORNS (1989) berichteten ferner über den Einsatz von Propionsäure, Benzaldehyd
oder auch Buttersäure-Anhydrid zum Vertreiben der Bienen. Auch die Eignung
verschiedener ätherischer Öle wird diskutiert, um die Imker vor den Stichen der
Bienen zu schützen [GUPTA (1987)].
Für die Anwendung wird Faserstoff mit der jeweiligen Substanz, üblicherweise in
Verdünnung, benetzt und auf den Bienenstock gelegt, woraufhin die Bienen nach
wenigen Minuten in den unteren Teil des Stocks wandern. Faserstoffe, für
Bienenstöcke passend gerahmt, sind als sogenannte „Fume Pads“ kommerziell
erhältlich (Abb. 3.4.b).
3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil 32
32
Die Substanzen haben unterschiedliche Temperaturoptima, so dass der Einsatz
auch von den klimatischen Bedingungen abhängig gemacht wird. Benzaldehyd kann
beispielsweise am bestem in einem Temperaturbereich von 18 - 27 °C angewendet
werden, wohingegen Buttersäure-Anhydrid besser in einem Bereich von 28 - 38 °C
genutzt wird [GRAHAM (1993)].
Grundsätzlich ist beim Verwenden dieser Stoffe zu beachten, dass eine falsche
Anwendung (Überdosierung) zu sensorischen Problemen und auch zu Rückständen
im Honig führen kann. Das Bayerische Landesamt für Gesundheit und
Lebensmittelsicherheit (LGL) hat beispielsweise 2005 Rückstände bis zu 0,15 mg/kg
an N, N-Diethyl-m-toluamid (DEET) in Honigen gefunden, ein Repellent, welches zur
Abwehr von Mücken genutzt wird und auch als Spray im Imkereifachhandel
angeboten wird. Die Rechtslage bei der Betrachtung derartiger Rückstände ist
allerdings unklar, in der RHmV gibt es keine expliziten Höchstmengen für die
genannten Substanzen. Bei DEET-haltigen Präparaten handelt es sich um Produkte
im Sinne der Biozid-Produkt-Richtlinie 98/8/EG und somit um Wirkstoffe zur
Schädlingsbekämpfung. Nach § 1 RHmV ist daher bei diesen Erzeugnissen ein
allgemeiner Grenzwert von 0,01 mg/kg anzuwenden [LGL BAYERN (2005)].
Bei Substanzen, die natürlicherweise im Honig vorliegen können, gestaltet sich die
Beurteilung weitaus schwieriger, denn es muss geklärt sein, aus welcher Quelle der
entsprechende Stoff stammt. Es wurden beispielsweise natürliche Vorkommen von
Phenol in neuseeländischen Waldhonigen bis 0,2 mg/kg beobachtet [BECKH &
LÜLLMANN (1998)].
Eine Alternative zu chemischen Repellents sind zum Beispiel sogenannte „Bee
Blower“, benzinbetriebene Geräte, mit denen die Bienen aus den Stöcken geblasen
werden. Diese machen die Bienen jedoch auch aggressiv, daher ist deren Einsatz
nicht weit verbreitet.
3.4.1. Phenylacetaldehyd als Bienenvertreibungsmittel Auch Phenylacetaldehyd kann als Bienenvertreibungsmittel eingesetzt werden.
Dabei ergeben sich für den Imker folgende Vorteile im Vergleich zu anderen
Repellents:
33 3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil
33
- Phenylacetaldehyd ist nicht toxisch und daher in seiner Anwendung
unbedenklich und einfach.
- Phenylacetaldehyd ist organoleptisch als Fremdstoff nur sehr schwer
zu identifizieren, da der Stoff auch natürlicherweise im Honig
vorkommen kann.
- Phenylacetaldehyd ist eine lipophile Substanz und akkumuliert nach
Anwendung zum Teil im Wachs. Dadurch sinkt die Gefahr, dass
erhöhte Rückstände im Honig wiederzufinden sind.
Da Phenylacetaldehyd auch auf den Honig übergehen kann, wäre es in einem
solchen Fall sehr wohl als Rückstand zu betrachten. Aber es muss bewiesen sein,
dass die Substanz von außen eingetragen wurde.
Phenylacetaldehyd bedarf keiner Zulassung, es obliegt dem Imker, ob er diesen Stoff
verwendet.
Daten über die Häufigkeit des Einsatzes von Phenylacetaldehyd als
Bienenvertreibungsmittel und über die Mengen existieren allerdings nicht.
3.5. Einflüsse auf den Phenylacetaldehydgehalt
Ziel dieser Arbeit war es nun, die Faktoren zu untersuchen, die den natürlichen
Gehalt an Phenylacetaldehyd im Honig beeinflussen. Dies können der Gehalt an
Phenylalanin, aber auch unterschiedliche Lagerungsbedingungen der Honige sein.
3.5.1. Analytik der freien Aminosäuren Da die Aminosäure Phenylalanin sowohl bei der Strecker-Reaktion als auch beim
enzymatischen Abbau die Ausgangssubstanz bei der Synthese des
Phenylacetaldehyds darstellt (vergleiche Kap. 3.2.), wurden zunächst verschiedene
Honigsorten auf ihre Phenylalaningehalte untersucht.
Dabei wurde die Honigprobe mit internem Standard (L-Norleucin) versetzt, in Wasser
gelöst und nach Zugabe von Sulfosalicylsäure (10 %) über Nacht im Kühlschrank
belassen. Nach Zentrifugation und Membranfiltration wurde das Filtrat mit Natrium-
3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil 34
34
Abb. 3.5.1.a: Aminosäuren-Chromatogramm von Akazien- und Lavendelhonig (IS = Interner Standard L-Norleucin)
Tab. 3.5.1.b.: Phenylalaningehalte ausgewählter Honige
Citratpuffer verdünnt und mit Hilfe eines Aminosäureanalysators chromatographiert
(Methode siehe Kap. 5.1.3.).
Alle Proben wurden entsprechend den aufgeführten Bedingungen analysiert. Die
Chromatogramme eines Akazienhonigs und eines Lavendelhonigs sind in Abb.
3.5.1.a gegenübergestellt. Die Ergebnisse bestätigten Literaturangaben, dass die
Gehalte einzelner freier Aminosäuren in Abhängigkeit von der Tracht erheblich
differieren können [BERGNER & HAHN (1972b); GILBERT et al. (1981); SPEER &
MONTAG (1986); COMETTO et al. (2003); BERNAL et al. (2005)]. Im Rahmen
dieser Arbeit waren allerdings nur die Gehalte für Phenylalanin von Interesse. Die für
die einzelnen Honige ermittelten Phenylalaningehalte sind in Tab. 3.5.1.b
zusammengestellt.
Honig Phenylalanin [mg/kg]
Tanne < 5
Akazie 26,6
Wildblüte 450
Lavendel 1369
35 3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil
35
Abb. 3.5.2.a: Massenspektrum von Phenylacetaldehyd
Besonders hervorzuheben sind die hohen Phenylalaningehalte für den Wildblüten-
und für den Lavendelhonig. Bei letzterem wurde sogar der Gehalt an Prolin
übertroffen. Ein solches Ergebnis ist aber nicht ungewöhnlich, da auch schon
HERMOSÍN et al. (2003) und COTTE et al. (2004) über derart hohe Gehalte
berichtet hatten. So fanden COTTE et al. beispielsweise in Tannenhonigen einen
mittleren Gehalt an Phenylalanin von 5,5 mg/kg (n = 37), hingegen in Lavendel-
honigen durchschnittlich 1152,8 mg/kg (n = 53).
3.5.2. Bestimmung von Phenylacetaldehyd mittels Headspace-GC/MS Ein Verfahren für die Analytik von Phenylacetaldehyd in Honig mittels statischer
Headspace-GC/MS-Analytik wurde von BOGDANOV et al. (2004) vorgestellt. Eine
derartige Methode wurde im Kantonslabor Basel 2003 zur Gehaltsbestimmung im
Rahmen einer Schwerpunktsuntersuchung zu Rückständen von Imkerei-Hilfsstoffen
in Honig genutzt [FREY (2003)].
Danach wurde die Honigprobe direkt in ein Headspace-Vial eingewogen, und es
wurden interner Standard (para-Dichlorbenzol-d4), Natriumchlorid und Wasser
zugesetzt. Während der Inkubation des Vials bei 80 °C erfolgte die Überführung des
flüchtigen Phenylacetaldehyds in die Gasphase. Ein Aliquot der Gasphase wurde in
die GC/MS injiziert. Phenylacetaldehyd wurde über die Retentionszeit und mittels
Vergleich der Massenspektren identifiziert (Massenspektrum siehe Abb. 3.5.2.a)
(Methode siehe Kap. 5.1.4.).
3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil 36
36
Abb. 3.5.3.a: Phenylacetaldehyd-Ergebnisse der mit Phenylalanin dotierten Proben
3.5.3. Ergebnisse und Schlussfolgerungen Mit der Headspace-Methode wurden neben einem von der Zuckerzusammensetzung
honigähnlichen Sirup (Fructose/Glucose-Verhältnis 1,2, Wassergehalt 25 %)
verschiedene monoflorale Honige analysiert. Dabei zeigte sich, dass die
Phenylacetaldehydgehalte in starkem Maße von der jeweiligen Honigsorte abhängig
sind. Lavendelhonige, die typischerweise reich an Phenylalanin sind, wiesen
beispielsweise immer einen sehr hohen Gehalt an Phenylacetaldehyd auf,
wohingegen die Konzentrationen für Akazienhonige (wenig Phenylalanin) relativ
gering waren. Im Sirup wurde erwartungsgemäß kein Phenylacetaldehyd
nachgewiesen.
Um die Auswirkungen des Phenylalanins auf den Gehalt an Phenylacetaldehyd zu
dokumentieren, wurden die Proben mit Phenylalanin dotiert. Wie erwartet, stiegen
mit zunehmender Phenylalaninkonzentration auch die gemessenen Gehalte an
Phenylacetaldehyd an (Abb. 3.5.3.a).
Allerdings fiel auf, dass die Inkubationstemperatur einen Einfluss auf die Menge des
gebildeten Phenylacetaldehyds hatte (Abb. 3.5.3.b): Je höher die Temperatur des
Inkubatorofens war (bei gleicher Inkubationszeit), desto höher war der gemessene
Gehalt an Phenylacetaldehyd. Damit war die gewählte Headspace-Methode zur
Erfassung des Phenylacetaldehydgehaltes für Honige nicht geeignet, da sich aus
Phenylalanin während der Inkubationszeit bereits Phenylacetaldehyd bildet. Dieses
konnte eindeutig aus den Ergebnissen für den mit Phenylalanin dotierten Sirup
abgeleitet werden.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 500 1000
Zugabe von Phenylalanin [ppm]
Phen
ylac
etal
dehy
d [p
pm]
AkazienhonigZuckersirupWildblütenhonig
37 3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil
37
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
30 50 60 70 80 90
Temp. [°C]
Phen
ylac
etal
dehy
d [p
pm]
AkazienhonigZuckersirup + Phenylalanin (250 ppm)Wildblütenhonig
Abb. 3.5.3.b: Einfluss der Inkubationstemperatur bei der Headspace-Methode auf die Phenylacetaldehyd-Konzen-trationen (Inkubationszeit 2 h)
3.6. Bestimmung von Phenylacetaldehyd nach Extraktion
3.6.1. Methodenentwicklung
Es wurde eine alternative Methode zur Bestimmung dieser Substanz mittels Flüssig-
Flüssig-Extraktion in Anlehnung an TIMMROTH & SPEER (2003) entwickelt.
Dazu wurde eine wässrige Honiglösung mit tert.-Butylmethylether extrahiert und
anschließend zentrifugiert. Ein Teil der Etherphase wurde eingeengt und ein Aliquot
davon direkt zur GC/MS-Messung eingesetzt (Methode siehe Kap. 5.1.5.).
Durch die schonende Aufarbeitung (keine Wärmebehandlung) wurde eine Bildung
von Phenylacetaldehyd bei der Probenvorbereitung verhindert. Abb. 3.6.1.a zeigt am
Beispiel eines Zuckersirups, welchem Phenylalanin (250 mg/kg) zugesetzt worden
war, dass bei der Extraktionsmethode kein Phenylacetaldehyd gebildet wurde.
3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil 38
38
Abb. 3.6.1.a: Vergleich der Chromatogramme von Headspace- und Extraktionsmethode bei einem mit Phenylalanin dotierten Zuckersirup
3.6.2. Methodenvalidierung Die Methodenvalidierung soll als Instrument der Qualitätssicherung Auskunft darüber
geben, ob eine Analysenmethode geeignet ist, eine vorgegebene spezifische
Aufgabe zu erfüllen. Die Begriffsdefinition für „Validierung“ nach DIN ISO 8402 lautet:
„Bestätigen aufgrund einer Untersuchung und durch Bereitstellung eines objektiven
Nachweises, dass die besonderen Forderungen für einen speziellen beabsichtigten
Gebrauch erfüllt worden sind."
Die Ermittlung der Verfahrenskenndaten erfolgte nach KROMIDAS (1999).
Wiederholpräzision
Ein Akazienhonig, ein Waldhonig sowie ein polyfloraler Honig wurden auf ihre
Phenylacetaldehydgehalte untersucht. Danach wurden die Proben vor der
Aufarbeitung jeweils sechs Mal mit je 0,6 mg/kg Phenylacetaldehyd dotiert, und es
wurden anschließend die Konzentrationen bestimmt. Nach Abzug der natürlichen
Gehalte konnten die prozentualen Wiederfindungen ermittelt werden.
Die Wiederfindungsraten lagen bei allen Proben zwischen 80 und 110 %, wie aus
Abb. 3.6.2.a am Beispiel des Akazienhonigs hervorgeht. Somit war die
Wiederholpräzision ausreichend (siehe Kap. 5.1.6.).
39 3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil
39
Abb. 3.6.2.b: Linearität am Beispiel des Akazienhonigs (Korrelationskoeffizient: 0,997)
Linearität
Zur Bestimmung der Linearität wurden drei Honige (Akazie, Wald und polyfloraler
Honig) jeweils mit Phenylacetaldehyd in Konzentrationen von 0,12 bis 6,0 mg/kg
dotiert und die Gehalte bestimmt (Aufstockversuche siehe Kap. 5.1.6.). Für den
Konzentrationsbereich der Dotierungen wurden auch die in Stiftung Warentest
genannten Werte berücksichtigt, welche zwischen 1,0 und 2,6 mg/kg lagen (siehe
Kap. 3.3.).
Korrelationskoeffizienten von 0,994 bis 0,997 belegen, dass die Messsignale im
geforderten Konzentrationsbereich direkt proportional zu den Analytkonzentrationen
sind und die Methode somit in diesem Bereich linear ist (Abb. 3.6.2.b).
010
20304050
607080
90100
0 1 2 3 4 5 6 7
Messung
Wie
derf
indu
ng [%
]
Abb. 3.6.2.a: Wiederfindungsraten von Phenylacetaldehyd (0,6 mg/kg) in Akazienhonig
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Dotierung [mg/kg]
gem
esse
ne P
AA
-Kon
z. [m
g/kg
]
3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil 40
40
Bestimmungsgrenze
Als Bestimmungsgrenze wird die kleinste quantifizierbare Menge bezeichnet, also die
Menge, die mit einer vorgegebenen Richtigkeit und Präzision quantitativ erfasst
werden kann.
Die Bestimmungsgrenze wurde hier nicht experimentell ermittelt, sondern aus
Gründen der Vereinfachung abgeschätzt, was nach KROMIDAS (1999) zulässig ist.
Sie ergab sich aus einem Signal/Rausch-Verhältnis im Chromatogramm von 10:1
und wurde bei 0,1 mg/kg festgelegt.
3.7. Lagerungsversuche
Mit der entwickelten Methode sollten nun verschiedene Parameter untersucht
werden, die den Gehalt an Phenylacetaldehyd beeinflussen dürften. Die Gehalte
hängen, wie oben gezeigt, maßgeblich vom Phenylalaningehalt des jeweiligen
Honigs ab.
In weitergehenden Untersuchungen sollte nun geklärt werden, inwieweit ein
unmittelbarer Zusammenhang zwischen dem Gehalt an Phenylacetaldehyd eines
Honigs und seinem Gehalt an Phenylalanin besteht und inwiefern sich die
Konzentration des Phenylacetaldehyds im Laufe einer Lagerung in Abhängigkeit der
gewählten Bedingungen verändert.
Für die Versuche wurden der Akazien- und der Wildblütenhonig mit ihren recht
unterschiedlichen Phenylalaningehalten ausgewählt (siehe Tab. 3.5.1.b). Weiterhin
wurden der honigähnliche Zuckersirup in reiner Form sowie mit 250 mg/kg
Phenylalanin dotiert für die Untersuchungen eingesetzt. Bei allen vier Proben wurde
der Anfangsgehalt an Phenylacetaldehyd mit Hilfe der Extraktionsmethode ermittelt.
Die Ergebnisse sind in Tab. 3.7.a dargestellt.
41 3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil
41
Probe Phenylalanin
[mg/kg] Phenylacetaldehyd zu Beginn
[mg/kg]
Akazie 26,6 0,20
Wildblüte 450 2,7
Zuckersirup n.n. n.n.
Zuckersirup, dotiert 250 n.n.
Tab. 3.7.a: Phenylalanin- und Phenylacetaldehydgehalte (mg/kg) ausgewählter Honige (n.n. = nicht nachweisbar)
3.7.1. Lagerungsparameter
Jede der vier Proben wurde auf jeweils drei Gefäße aufgeteilt. Je ein Gefäß wurde im
Dunkeln bei Raumtemperatur (22 °C) gelagert, eines bei erhöhter Temperatur
(39 °C) und eines bei 22 °C unter UV-Licht unter Nutzung einer Pflanzenlichtlampe,
welche UV-A-Strahlung emittiert (Wellenlängenbereich 400 – 320 nm). Die erhöhte
Temperatur und das UV-Licht sollten dabei Bedingungen simulieren, wie sie beim
Lagern abgefüllter Ware allgemein oder in wärmeren Gebieten, auch in offenen
Fässern, sowie bei längerem Transport vorherrschen können (tropisches Klima,
Sonneneinstrahlung).
In definierten Abständen wurden über einen Zeitraum von 14 Wochen Proben
entnommen und der Gehalt an Phenylacetaldehyd mit der oben beschriebenen
Extraktionsmethode in Doppelbestimmung analysiert.
3.7.2. Ergebnisse der Lagerungsversuche
Wie zu erwarten war, konnte zu Beginn der Untersuchungen weder im reinen noch
im mit Phenylalanin dotierten Sirup Phenylacetaldehyd nachgewiesen werden. Der
Akazienhonig enthielt hingegen 0,20 mg/kg, der Wildblütenhonig sogar 2,7 mg/kg.
Auch hier zeigte sich, dass die Gehalte maßgeblich durch die unterschiedlichen
Phenylalaningehalte (Tab. 3.7.a) beeinflusst wurden.
Dass Phenylalanin in Phenylacetaldehyd umgewandelt wird, lässt sich eindrucksvoll
am dotierten Zuckersirup belegen. War zu Beginn des Experiments noch kein
Phenylacetaldehyd nachzuweisen, stieg die Konzentration mit zunehmender
3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil 42
42
Abb. 3.7.2.a: Chromatogramme (TIC): Wildblütenhonig (zwei Wochen gelagert bei 22 °C bzw. 39 °C) (Trennbedingungen siehe Kap. 5.1.5.)
Lagerungszeit zunächst stetig an. Schon nach zwei Wochen wurden Gehalte von
0,61 mg/kg (bei Raumtemperatur) bzw. 2,8 mg/kg (bei 39 °C und unter UV-Licht)
gemessen.
In den Lagerungsversuchen konnte ferner aufgezeigt werden, dass die
Konzentrationen an Phenylacetaldehyd (mit Ausnahme des reinen Zuckersirups) im
Dunkeln bei Raumtemperatur nur schwach, bei erhöhter Temperatur und unter UV-
Einwirkung zum Teil aber erheblich verändert wurden (Abb. 3.7.2.b), ein deutliches
Zeichen für enzymatische und/oder beginnende Strecker-Reaktionen. Abb. 3.7.2.a
zeigt anhand zweier Chromatogramme eines Wildblütenhonigs die unterschiedlichen
Gehalte an Phenylacetaldehyd nach zweiwöchiger Lagerung bei zwei verschiedenen
Temperaturen.
Sowohl der Akazienhonig als auch der Wildblütenhonig zeigten im Verlauf der
Lagerung ein ähnliches Verhalten. Bei beiden Honigen stieg die jeweilige
Konzentration an Phenylacetaldehyd zunächst über zwei Wochen an, um danach
allerdings wieder abzufallen. Daraus kann geschlossen werden, dass
Folgereaktionen abliefen, die zu einer Verminderung des nachweisbaren freien
Phenylacetaldehyds führen.
Phenylacetaldehyd
43 3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil
43
Abb. 3.7.2.b: Ergebnisse der Lagerungsversuche
3.7.3. Schlussfolgerungen Anhand der in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse wurde eindeutig aufgezeigt, dass
Honige während der Lagerzeit und des Transports erhebliche Änderungen in ihren
Phenylacetaldehydgehalten erfahren können. Die Zunahme der Konzentrationen war
bei erhöhter Temperatur bzw. unter Einfluss von UV-Licht signifikant höher als unter
Raumtemperatur. Als ganz entscheidend für die Phenylacetaldehydgehalte hatte sich
der natürliche Phenylalaningehalt eines Honigs herausgestellt.
Unter Zugrundelegung der vorgestellten Ergebnisse durfte daher die Aussage, dass
Phenylacetaldehyd in den festgestellten Konzentrationen (1,0 - 2,6 mg/kg) bei den
von Stiftung Warentest untersuchten Proben als Bienenvertreibungsmittel eingesetzt
wurde und somit als Rückstand anzusehen ist, nicht getroffen werden. Dies gilt um
so mehr, solange weder die Gehalte an Phenylalanin noch die äußeren
Bedingungen, denen die Honige ausgesetzt waren, bekannt sind.
3. Phenylacetaldehyd – Rückstand oder natürlicher Bestandteil 44
44
Die beanstandeten Honige hatten aufgrund ihrer Herkunft von der Ernte bis zur
Ankunft in Deutschland eine Lager- und Transportzeit von durchschnittlich zwei
Monaten hinter sich [WALTER LANG HONIG-IMPORT GMBH (2005)]. Die Lagerung
erfolgt üblicherweise in Fässern bei den gegebenen Temperaturen, der Transport
wird dann in ungekühlten Containern per Schiff durchgeführt. Da die abgewerteten
Honige allesamt aus Süd- bzw. Mittelamerika stammten, darf angenommen werden,
dass die ermittelten Phenylacetaldehydgehalte natürlichen Ursprungs sind. Der mit
Phenylalanin dotierte Zuckersirup zeigte, dass sich schon nach zwei Wochen
Lagerungszeit bei erhöhter Temperatur ein Gehalt von 2,8 mg/kg gebildet hat,
welcher höher ist als die maximale Konzentration, die Stiftung Warentest gefunden
hat.
45 4. Filtration von Honig
45
4. Filtration von Honig 46
46
4. Filtration von Honig
4.1. Begriffsdefinition und lebensmittelrechtliche Situation
Nach § 2 Abs. 3 der früheren deutschen Honigverordnung vom 13. Dezember 1976
durften dem Honig keine honigeigenen Bestandteile entzogen werden.
Mit der neuen Honigverordnung vom 16. Januar 2004 wurde die europäische
Richtlinie 2001/110/EG umgesetzt und die alte Verordnung abgelöst. Eingeführt
wurde damit auch die neue Verkehrsbezeichnung „Gefilterter Honig“ für „Honig, der
gewonnen wird, indem anorganische oder organische Fremdstoffe so entzogen
werden, dass Pollen in erheblichem Maße entfernt werden“ (Anl. 1 Abschn. II Nr. 8).
Da die Vermarktung dieser Produkte seit dem 1. August 2003 zugelassen ist, ist es
seit dem also möglich, Honige in den Verkehr zu bringen, denen honigeigene
Bestandteile entzogen worden sind. Allerdings dürfen diese Erzeugnisse nicht die
Verkehrsbezeichnung „Honig“ tragen, sondern müssen als „Gefilterter Honig“
deklariert sein.
Bei Honigen, die nicht gefiltert wurden, dürfen nach § 3 Abs. 3 die Bezeichnungen
„ergänzt werden durch Angaben (1.) zur Herkunft aus Blüten oder lebenden
Pflanzenteilen, wenn der Honig vollständig oder überwiegend den genannten Blüten
oder Pflanzen entstammt und die entsprechenden organoleptischen, physikalisch-
chemischen und mikroskopischen Merkmale aufweist; (2.) zur regionalen,
territorialen oder topographischen Herkunft, wenn der Honig ausschließlich die
angegebene Herkunft aufweist; (3.) zu besonderen Qualitätsmerkmalen“.
In der Begründung zur Richtlinie 2001/110/EG, Punkt (7), ist explizit darauf
hingewiesen worden, dass Honigen mit besonderen Angaben kein gefilterter Honig
beigemischt werden darf. Dort heißt es: „Dem Honig, dessen Verkehrsbezeichnung
durch Angaben, die sich auf die Herkunft aus Blüten oder Pflanzenteilen oder auf die
regionale, territoriale oder topographische Herkunft beziehen, oder durch besondere
Qualitätsangaben ergänzt werden, darf kein gefilterter Honig zugesetzt werden.“
47 4. Filtration von Honig
47
4.2. Anlass für eine Honigfiltration
In den USA kommt der größte Teil der Honige gefiltert auf den Markt [CRANE
(1979), PROBST (2004)]. Der Grund für die Produzenten, solche Verfahren
anzuwenden, ist der, den Kristallisationsprozess des Honigs aufzuhalten.
Kristallisation ist ein physikalisches Phänomen, wobei der kristallisierende Stoff
keinerlei chemischen Veränderungen unterworfen ist. Die Voraussetzung für eine
Kristallisation ist das Überschreiten des Löslichkeitsprodukts, das heißt, das
Vorliegen einer übersättigten Lösung.
Honig besitzt mit einem Gehalt von etwa 80 % eine sehr hohe Zuckerkonzentration
und ist mit Glucose und Fructose übersättigt. Die Glucosekonzentration im Honig
liegt zwischen 33 - 35 % (vergleiche Kap. 2.2.1.).
Als Kristallbildner können nur Glucose und das Trisaccharid Melezitose fungieren.
Melezitose kommt aber üblicherweise nur in wenigen Blatthonigtrachten vor. Die
Glucoseübersättigung führt dazu, dass sich zwangsläufig Kristalle im Honig bilden.
Starterkristalle, wozu winzige Glucosekristalle, aber auch Pollen und Schmutzpartikel
gehören, beschleunigen die Kristallbildung [BHANDARI et al. (1999)].
Ein höherer Anteil an Fructose kann die Kristallisation wieder abschwächen [WHITE
(1978)]. So neigen beispielsweise Akazienhonige mit einem F/G von zumeist über
1,5 nur selten zum Auskristallisieren, während dieses Verhältnis bei Rapshonigen
zwischen 0,95 und 1,05 liegt und Honige dieser Tracht üblicherweise sehr schnell
kristallisieren.
Einen wichtigen Einflussfaktor auf das Kristallisationsverhalten stellt weiterhin der
Wasseranteil dar. Die Kristallisationsneigung des Honigs sinkt mit zunehmendem
Wassergehalt infolge der abfallenden Zuckerkonzentration. Bei einem Glucosegehalt
von unter 30 % findet keine Kristallbildung mehr statt [SCHLEY & BÜSKES-SCHULZ
(1987)].
Auch die Lagerungstemperatur des Honigs hat Einfluss auf die Kristallisation. Bei
Temperaturen von unter 5 °C verringert sich die Diffusionsgeschwindigkeit der
Glucosemoleküle, und die Kristallisation wird gehemmt. Hohe Temperaturen von
über 25 °C führen zu einer Abnahme des Übersättigungsgrades der Glucose, was
ebenfalls zu verminderter Kristallbildung führt [WILSON & MARVIN (1931)]
4. Filtration von Honig 48
48
Abb. 4.2.a: nicht kristallisierter (links) und kristal-lisierter Honig (rechts)
Eine Kristallisation von Honig ist
indes unerwünscht, denn neben
der erschwerten technologischen
Handhabung führt sie zu einer
Trübung des Produktes (Abb.
4.2.a). Grobkristallisierte, körnige
Honige werden häufig abgelehnt
und als minderwertig empfunden.
Weiterhin wird das Wachstum
von osmophilen Hefen gefördert,
was zur Fermentation des Honigs
führen kann. Der Grund ist, dass durch das bei der Kristallisation frei werdende
Wasser der aw-Wert erhöht wird. Dieser liegt bei nicht kristallisiertem Honig bei etwa
0,6, wohingegen die Untergrenze für Hefenwachstum 0,88-0,94 beträgt [BROWN
(1990)]. Die geringe Wasseraktivität und der hohe osmotische Druck lassen somit bei
nicht kristallisiertem Honig kein Hefewachstum zu. Durch das Kristallwasser steigt
jedoch der aw-Wert, und die Gefahr einer Gärung steigt [DONER (1977)].
Es wird somit vielfach als notwendig erachtet, den Kristallisationsprozess
abzuschwächen und somit den Honig länger in einem flüssigen Zustand zu halten,
um auch zusätzlich die weitere Bearbeitung zu vereinfachen.
Neben der Filtration sind in der Literatur verschiedene Verfahren beschrieben, wie
dieses Ziel erreicht werden kann. DYCE schlug 1931 vor, Honige einer
Pasteurisation zu unterziehen, indem die Erzeugnisse stufenweise zunächst auf
49 °C, dann auf 66 °C erwärmt werden, so dass die Zuckerkristalle zerstört werden.
Auch bereits vorhandene Hefezellen werden dabei abgetötet.
ASSIL et al. (1991) modifizierten dieses Verfahren. Sie berichteten, dass Honige
über zwei Jahre flüssig bleiben, wenn sie zunächst fünf Minuten auf 77 °C erhitzt
werden, anschließend schnell auf Raumtemperatur abgekühlt werden und dann
mindestens fünf Wochen bei 0 °C gelagert werden.
Nach KALOYEREAS & OERTEL (1958) hat der Einsatz von Ultraschallwellen
(9 kHz/sek. für 15-30 min) ähnliche Wirkungen. Derart behandelter Honig bleibt für
15 Monate stabil.
49 4. Filtration von Honig
49
Die vorgestellten Methoden beruhen auf der Zerstörung von bereits vorhandenen
Glucosekristallen. Mittels Filtration gelingt es, auch mögliche weitere
Kristallisationskeime wie Pollen oder honigfremde Partikel zu entfernen. Daher ist
dies die in den USA populärste Technologie.
4.3. Technologisches Verfahren der Filtration
Filtration ist ein Vorgang, bei dem unterschiedliche Komponenten voneinander
getrennt werden.
PAINE et al. beschrieben 1934 als erstes eine Filtration von Honig unter Aufwand
von Überdruck mit dem Ziel, kolloidale Substanzen aus dem Produkt zu entfernen.
Die Prozessschritte und Apparaturen wurden später modifiziert, die Methode wird
aber im Prinzip noch heute von Abfüllern in den USA angewandt [CRANE (1979),
VON DER OHE (2006)]. In Abb. 4.3.a ist der technologische Ablauf einer Filtration
schematisch dargestellt.
Abb. 4.3.a: Prozessschritte bei der Honigfiltration (Schema)
A) Vorerwärmung des unbehandelten Honigs (ca. 45 °C)
B) Erhitzung: - Temp.: 80 °C - Zeit: 3 - 5 min.
D) Filtration durch Polyethylen-Membranen: - Porengröße 20 µm - Druck: 3 - 5 bar
E) Abkühlung auf Abfüll-temperatur (35 - 40 °C)
C) Zugabe von Kieselgur (0,02 % bezogen auf die Honigmenge)
4. Filtration von Honig 50
50
Die Vorerwärmung (A) dient zunächst dazu, die Viskosität des Honigs soweit zu
verringern, dass eine technologische Bearbeitung, in diesem Fall das Überführen in
die Filtrationsanlage, ermöglicht wird.
Es erfolgt dann eine kurzzeitige Erhitzung auf 80 °C (B). Die Zeit (3 - 5 min.) ist so
gewählt, dass honigeigene sensible Komponenten, wie beispielsweise die Aktivität
der Diastase, weitestmöglich erhalten bleiben sollen.
Anschließend wird Kieselgur (Diatomeenerde) mit einer durchschnittlichen
Partikelgröße von 50 µm beigemischt (C), und zwar zu 0,02 % bezogen auf die
eingesetzte Honigmenge. Kieselgur dient als adsorptives Filterhilfsmittel, wobei
bestimmte Verbindungen selektiv auf der Oberfläche des Hilfsstoffes angereichert
werden. Es besteht zu ca. 86 % aus Silizium, weitere Bestandteile sind Natrium
(5 %), Magnesium (3 %), Eisen sowie andere Mineralstoffe. Der Stoff besitzt winzige
Poren (0,5 bis 10 µm), wodurch beispielsweise kleinste Bienenteile, Wachsanteile
und einige Bakterien aus dem Honig entfernt werden können [NHB (2004)]. Laut
FDA (1987) gilt die Nutzung von Kieselgur in der Lebensmittelindustrie als
unbedenklich für die menschliche Gesundheit. Demnach hat der Stoff GRAS-Status
(„Generally recognized as safe“).
Die eigentliche Honigfiltration (D) erfolgt über Polyethylen-Membranen mit einer
Porengröße von 20 µm. Der Druck, der aufgewendet werden muss, um die Honig-
Kieselgur-Suspension durch die Filter zu pressen, liegt zwischen 3 und 5 bar,
abhängig von der Honigsorte. Die Porengröße ist ausreichend, um die Pollen aus
dem Honig zu filtern, denn die durchschnittlichen Pollengrößen der nektarliefernden
Pflanzen liegen zwischen 26 und 48 µm [STANLEY & LINSKENS (1975), VON DER
OHE, K. & W. (2002)] (Tab. 4.3.b).
Pollenart Ø-Größe [µm] Weißklee 26 Kastanie 26
Raps 27 Baumheide (Erica) 30
Sonnenblume 31 Besenheide (Calluna) 35
Rotklee 37 Lavendel 38
Buchweizen 48
Tab. 4.3.b: Durchschnittliche Pollengrößen nektarliefernder Pflanzen
51 4. Filtration von Honig
51
Nach Abschluss der Filtration wird der Honig auf eine Temperatur abgekühlt, mit
welcher die Abfüllung in die Verkaufsgebinde erfolgen kann (E). Diese liegt zwischen
35 und 40 °C.
4.4. Problemstellung
Die mikroskopische Pollenanalyse (Melissopalynologie) ist bisher die entscheidende
Methode zur botanischen und regionalen Identifizierung der Herkunft des Honigs.
Pollenart und prozentuale Zusammensetzung geben eindeutige Hinweise auf den
pflanzlichen und geographischen Ursprung des Honigs (siehe Kap. 2.3.1.). Hiermit
können auch Verfälschungen aufgeklärt werden, wenn teure Honige mit
preiswerteren Sorten gestreckt werden - ein Umstand, der häufig vorkommt. Die
Pollenanalyse dient demnach besonders dem Verbraucherschutz und dem Schutz
des redlichen Handelsbrauchs.
Wird nun durch Filtration ein Großteil der Pollen entfernt, so ist eine mikroskopische
Bestimmung der Herkunft des Honigs nicht mehr möglich. Die Gefahr einer
Verfälschung wächst daher, da ein gefilterter Honig geringerer Qualität mit einem
naturbelassenen Honig hoher Qualität geschönt werden kann und dieses
mikroskopisch nicht feststellbar ist. Solche Methoden sind wirtschaftlich interessant,
da Honige besonderer Herkunft hohe Marktpreise erzielen [SALLER (2003)] und zum
Beispiel die in Europa erzeugten Honige teurer sind als importierte Rohware
[STATISTISCHES BUNDESAMT (2003)].
In Deutschland sowie im europäischen Ausland stieß daher der Punkt „Gefilterter
Honig“ der EG-Richtlinie aufgrund der dadurch bestehenden Gefahr einer
Verfälschung in hohem Maße auf Ablehnung [REITINGER (2002), SCHWENKEL
(2002)].
Bei der Verabschiedung der neuen Honigverordnung bat der Agrarausschuss des
Bundesrates die Bundesregierung, die Forschung zu verstärken, um einfache und
kostengünstige Methoden zum Nachweis einer unerlaubten Vermischung sicher zu
erkennen. Der Bundesrat begründete dies mit dem „Interesse des
Verbraucherschutzes“ und damit, dass „der Herkunftsnachweis von Honig erschwert,
die Überwachung der Einhaltung der Honigverordnung aufwändiger“ sei. Solche
Nachweismethoden „dienen auch der Absatzsicherung von hochwertigem
4. Filtration von Honig 52
52
einheimischen Honig“. Es sollte spätestens zwei Jahre nach Inkrafttreten der
Verordnung darüber Bericht erstattet werden, welche Nachweismethoden geeignet
sind, Verfälschungen sicher zu erkennen [DRUCKSACHE 847/1/03 (2003)].
Ziel der vorliegenden Arbeit war es nun, eine analytische Methode zu entwickeln, mit
der es gelingt, einen Nachweis für eine Filtration auch in Mischungen zu erbringen.
Zunächst galt es, gefilterte Honige zu charakterisieren und mittels Screening-
Versuchen Parameter herauszuarbeiten, um gefilterte und ungefilterte Honige zu
differenzieren.
4.5. Probenorganisation
Die Referenzproben, mit denen die analytischen Untersuchungen durchgeführt
werden sollten, wurden direkt von US-amerikanischen Abfüllern und Importeuren
organisiert, welche Honigfiltrationen großtechnisch routinemäßig durchführen. Dabei
wurden Honige verschiedener botanischer und geographischer Ursprünge bezogen.
Folgende Firmen stellten dabei authentisches Probenmaterial zur Verfügung:
- Sioux Honey Association (Sioux City, Iowa)
- Burleson´s Honey, Inc. (Waxahachie, Texas)
- Golden Heritage Food, LLC (Hillsboro, Kansas)
Die Honige wurden unmittelbar vor und nach dem eigentlichen Filtrationsprozess
entnommen. Bei den Proben vor Filtration war die Vorerwärmung abgeschlossen,
nicht jedoch die kurzzeitige Erhitzung. Es war noch kein Kieselgur zugefügt worden,
und die Honige waren noch keinen hohen Drücken ausgesetzt. Die Proben nach
Filtration wurden sofort nach Passieren der Filtrationsmembran entnommen und auf
Raumtemperatur abgekühlt. So konnte gewährleistet werden, dass Einflüsse weiterer
Prozessschritte bzw. -parameter auszuschließen waren.
Insgesamt wurden 40 Probenpaare untersucht, das heißt 40 Honige vor und 40 nach
Filtration (Liste siehe Kap. 5.2.2.).
Direkt nach Probeneingang wurde die Authentizität der Honige bestätigt, um die
Unverfälschtheit und die botanische und regionale Herkunft sicherzustellen. Dabei
53 4. Filtration von Honig
53
wurden folgende Kenngrößen ermittelt: Sensorik, Pollenspektrum, Zuckerspektrum, 13C-Stabilisotopen-Analytik, pH-Wert, Säuregrad, Wassergehalt, HMF-Gehalt,
Diastase- und Saccharaseaktivität (siehe Kap. 2.3.1. bis 2.3.4.).
Alle gelieferten ungefilterten Honigproben erwiesen sich als unverfälscht und
entsprachen den Vorgaben der Honigverordnung.
Bei den gefilterten Honigen konnten hinsichtlich Zuckerspektrum, 13C-Stabilisotopen-
Analytik, Prolingehalt, pH-Wert, Säuregrad, Wassergehalt und Diastaseaktivität keine
Auffälligkeiten festgestellt werden. Siehe aber hierzu Kap. 4.6.
4.6. Auswirkung einer Filtration auf unterschiedliche Parameter
4.6.1. Sensorik
Zur Beurteilung der sensorischen Unterschiede zwischen gefilterten und ungefilterten
Honigproben wurden paarweise Vergleichsprüfungen („Duo-Tests“) nach BUSCH-
STOCKFISCH (2002) durchgeführt. Dabei handelt es sich um attributbezogene
Unterschiedsprüfungen, bei denen der Prüfer jeweils Probenpaare erhält. Die Paare
bestanden aus den ungefilterten Honigen und ihren gefilterten Pendants. Es war
darüber zu befinden, ob sich die Proben anhand der olfaktorischen und
gustatorischen Merkmale differenzieren lassen. Alle gelieferten Honigproben wurden
zu den Untersuchungen herangezogen und von jeweils drei geschulten Prüfern
bewertet.
Die Auswertungen der Prüfungen zeigten, dass gefilterte Honige nur marginale
Unterschiede zu ungefilterten Honigen aufwiesen. Diese fielen auch lediglich im
direkten Vergleich auf.
4.6.2. Elementaranalysen
Analysen der Elemente wurden durchgeführt, um zu überprüfen, ob Reste von
Kieselgur in den gefilterten Honigen wiederzufinden sind. Dazu gehören Silizium,
aber auch charakteristische Metalle wie zum Beispiel Natrium (siehe Kap. 4.3.). Die
Untersuchungen wurden mittels ICP-MS durchgeführt. Es wurden allerdings keine
Unterschiede zwischen gefilterten und ungefilterten Honigen festgestellt.
4. Filtration von Honig 54
54
4.6.3. Leitfähigkeit, pH-Wert und Säuregrad
Die analytische Bestimmung der Leitfähigkeit erfolgte nach DIN 10753 (siehe Kap. 2.3.1.), die des pH-Wertes und des Säuregrades potentiometrisch nach DIN 10756
(siehe Kap. 2.3.4.).
In den vergleichenden Untersuchungen stellte sich heraus, dass alle drei Parameter
durch den Filtrationsprozess nicht verändert wurden, so dass eine Differenzierung
gefilterter und ungefilterter Honige über diese Kenngrößen nicht möglich war.
4.6.4. Flavonoide und Phenolcarbonsäuren
Die Überlegung zur Untersuchung dieses Parameters war, dass das bei der Filtration
eingesetzte Kieselgur selektiv Komponenten dieser Substanzgruppen aus dem
Honig entfernen kann.
TRAUTVETTER et al. untersuchten 2006 gefilterte und ungefilterte Honige auf das
Spektrum der Flavonoide und Phenolcarbonsäuren mittels HPLC-DAD nach
Extraktion mit Ethylacetat. Die Ergebnisse zeigten, dass die Gehalte dieser Stoffe
durch eine Filtration keinen Veränderungen unterworfen waren. Die Messungen
erbrachten somit keine Erkenntnisse hinsichtlich einer Unterscheidung gefilterter und
ungefilterter Honige (Chromatogramme siehe Abb. 4.6.4.a).
Abb. 4.6.4.a: DAD-Chromatogramme (λ = 254 nm) eines amerikanischen Kleehonigs vor (schwarz) und nach Filtration (rot)
Minutes0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
mA
U
0
50
100
150
200
250
300DAD-254nm28748 S2 prefiltration, USA (06.02.07)
DAD-254nm28749 S2 postfiltration, USA (06.02.07)
55 4. Filtration von Honig
55
4.6.5. Spektroskopische Untersuchungen
Es gibt bereits verschiedene Ansätze, spektralphotometrische Messungen zum
Nachweis einer Honigverfälschung mit Zuckersirup oder zur simultanen Bestimmung
von Qualitätsparametern zu nutzen, wie zum Beispiel Gehalte an bestimmten
Zuckern, HMF bzw. Prolin oder auch Leitfähigkeit und Säuregrad [LICHTENBERG-
KRAAG et al. (2002), DANIEL KELLY et al. (2004), RUOFF et al. (2006)]. Dem liegt
das Prinzip zugrunde, dass bestimmte Substanzen bzw. Substanzgruppen in
definierten Wellenlängenbereichen Absorptionseffekte zeigen, die umso stärker
ausfallen, je höher der Gehalt an diesen Stoffen ist.
In dieser Arbeit sollte durch Scannen eines möglichst großen Wellenlängenbereichs
überprüft werden, ob spezifische Banden in den Spektren auftreten, die eine
vorhergehende Filtration anzeigen bzw. ob honigtypische Banden nach einer
Filtration verschwinden.
4.6.5.1. Farbmessungen nach Pfund Mit Hilfe eines Lovibond-Gerätes wird das Ausmaß der Verschiebung der Honigfarbe
zu der eines Standard-Honigs verglichen. Die Werte werden in mm Pfund
angegeben. Anhand der Ergebnisse erfolgt eine Einstufung in die Pfund-Skala. Helle
Honige wie zum Beispiel Akazie liegen im Bereich 5 bis 25 mm Pfund, dunkle Sorten
wie Waldhonige erreichen Werte bis 120 mm Pfund [PERSANO-ODDO & PIRO
(2004)].
Die Vergleichmessungen gefilterter und ungefilterter Honige zeigten keine
abweichenden Farbwerte untereinander.
4.6.5.2. IR-Absorption Energetisch liegt die Infrarotstrahlung im Bereich der Schwingungsniveaus von
Molekülbindungen, was bedeutet, dass die Absorption zu Schwingungsanregungen
dieser Bindungen führt.
Es wurde der Bereich von 500 bis 4000 nm gescannt. Vergleichende Messungen
filtrierter und unfiltrierter Honige zeigten keine signifikanten Unterschiede. Es traten
außerdem keine spezifischen Banden auf, die direkt einen Hinweis auf eine Filtration
4. Filtration von Honig 56
56
hätten geben können (Abb. 4.6.5.2.a). Aus diesem Grund wurde auch keine
Zuordnung von Banden zu einzelnen Strukturen vorgenommen.
Abb. 4.6.5.2.a: IR-Spektren eines unfiltrierten (links) und eines filtrierten amerikanischen Kleehonigs (rechts)
4.6.5.3. UV-Absorption Mittels Strahlung von sichtbarem und ultraviolettem Licht werden Valenzelektronen in
Orbitalen der äußeren Schalen angeregt.
Es wurden die Absorptionen von Honigen bei definierten Wellenlängen im Vis- und
Ultraviolett-Bereich gemessen, und zwar bei 300, 420, 525, 600 und 700 nm. Zur
Messung wurden die Honigproben in Quarzglas-Küvetten gefüllt und gegebenenfalls
Luftblasen entfernt.
Honige, die nach der Honigverordnung filtriert wurden, zeigten wie auch bei den IR-
Messungen im Vergleich zu den Originalproben nur geringe Abweichungen in den
Absorptionen (Abb. 4.6.5.3.a).
Abb. 4.6.5.3.a: UV-Messungen eines unfiltrierten (links) und eines filtrierten amerikanischen Kleehonigs (rechts)
57 4. Filtration von Honig
57
4.6.6. Zuckerprofile
Zu prüfen war, ob die Konzentrationen einzelner Zucker im Honig durch eine
Filtration derart beeinflusst werden, dass eine Differenzierung zu unfiltriertem Honig
möglich ist.
Die Bestimmung der Saccharide erfolgte mittels HPLC und Brechungsindex- (RI-)
Detektion nach DIN 10758 (siehe Kap. 2.3.1.). 1,25 g Honig wurden dabei in 50 ml
Wasser gelöst und direkt zur Messung eingesetzt.
Mit dieser Methode wurden folgende Kohlenhydrate identifiziert: Glucose, Fructose
(Monosaccharide), Saccharose, Turanose, Maltose, Trehalose, Isomaltose
(Disaccharide) sowie Erlose, Melezitose und Maltotriose (Trisaccharide).
Die Zuckerprofile gefilterter und ungefilterter Honige waren nahezu identisch (siehe
Abb. 4.6.6.a).
Abb. 4.6.6.a: Zuckerspektren eines unfiltrierten (links) und eines filtrierten amerikanischen Kleehonigs (rechts)
4.6.6.1. Bestimmung der Oligosaccharide
Bei Oligosacchariden handelt es sich um Kohlenhydrate, die aus 3 bis 10
Einzelzuckern bestehen. Darüber hinaus werden sie als Polysaccharide bezeichnet
[FREDE (2006)]. Honige enthalten Anteile an diesen höheren Zuckern zwischen
1 und 3 %.
Ziel war es, zu überprüfen, ob durch Filtration die höheren Saccharide selektiv in
ihren Gehalten gemindert werden. Sie sind größer und haben eine geringere
Zeit Zeit
Signalhöhe Signalhöhe
4. Filtration von Honig 58
58
Polarität als die Monosaccharide. Sie könnten durch das eingesetzte Kieselgur eher
beeinflusst werden.
Diese Zucker sind aufgrund ihrer geringen Gehalte mit der Methode nach DIN 10758
nicht zu erfassen, denn die Honige liegen dabei in einer zu großen Verdünnung vor.
Bei konzentrierteren Honiglösungen, mit denen man die geforderten Gehalte hätte
messen können, bestand jedoch das Problem, dass durch die großen Anteile von
Fructose und Glucose im Honig die HPLC-Säule überladen würde. Somit war die
Aufgabe, diese beiden Monosaccharide abzutrennen und die größeren Zucker
anzureichern, so dass deren Bestimmung gelingen kann.
Als Ansatz für die Methodenentwicklung diente eine Applikation von LIPP et al.
(1988), die ein Verfahren zum Nachweis von Glucose- und Hochfructosesirupen in
Honig vorstellten. Sie fraktionierten die Saccharide im Honig mittels einer
Kieselgur/Aktivkohle-Mischung, wobei zunächst die kleinen Zucker mit 7%- und
10%igem Ethanol von der Säule gewaschen wurden. Die Oligosacharide wurden mit
50%igem Ethanol eluiert, wobei man sich die unterschiedliche Löslichkeit der
Zuckerbausteine in Alkohol zunutze machte. Diese Fraktion wurde anschließend zur
Ionenaustausch-HPLC verwendet.
Die Methode wurde derart modifiziert, dass zunächst eine gelchromatographische
(GPC-) Trennung der Honigzucker an Fractogel TSK HW-40 (S) ® der Firma Merck
erfolgte. Als Eluent diente bidestilliertes Wasser, die Peakerfassung wurde mittels RI-
Detektion vorgenommen. Zunächst eluierten dabei die größeren Zucker vor den
kleineren (Chromatogramm siehe Abb. 4.6.6.1.a). Der Vorteil dieser Methode ist,
dass die Oligosaccharide mit der GPC nahezu quantitativ separiert werden und mit
kleinen Einzelfraktionen eine genauere Trennung von den Monosacchariden
vorgenommen werden kann. Glucose und Fructose können bei den Honigen zwar
nicht vollständig abgetrennt werden, die Konzentrationen dieser beiden
Kohlenhydrate in den Fraktionen waren jedoch so gering, dass die analytische
Bestimmung der größeren Zucker gelingen konnte.
Die Eluate, in denen sich die höheren Zucker befanden, wurden isoliert und
zusammengeführt. Nach Aufkonzentrierung wurde die Probe zur analytischen HPLC
eingesetzt.
59 4. Filtration von Honig
59
Abb. 4.6.6.1.a: GPC-Chromatogramm eines ungefilterten amerikanischen Kleehonigs. In den Fraktionen 5 und 6 befinden sich die Oligosaccharide.
Die analytische Trennung dieser Fraktionen erfolgte an einer Ionenaustauschersäule
mit einer wässrigen NaOH/NaAc-Lösung als Eluenten in einem isokratischen
System. Das Prinzip beruht darauf, dass Kohlenhydrate als schwache Säure (pK-
Werte zwischen 12 und 14) bei hohem pH-Wert mindestens zum Teil ionisiert sind
und sich somit mit Natronlauge/Acetatpuffer an einem Latex-Anionentauscher
trennen lassen. Dabei kam die gepulste amperometrische Detektion zum Einsatz, bei
der die Zucker an einer Goldelektrode oxidiert werden [DIONEX CORPORATION
(2005)].
Als Vergleichsstandards dienten Maltooligosaccharide, also Kohlenhydrate mit
definierten Mengen an unterschiedlichen Glucosebausteinen (Abb. 4.6.6.1.b).
Es ist mit dieser Methode möglich, in einem HPLC-Lauf Honigzucker zu trennen, die
zwischen 3 und 9 Monosaccharid-Einheiten enthalten. Die genaue Durchführung der
Methode ist in Kap. 5.2.3.1. beschrieben.
Ziel dieser Untersuchungen war es, eine Differenzierung gefilterter und ungefilterter
Honige mit Hilfe der Oligosaccharid-Chromatogramme zu erarbeiten. Nach der
Aufnahme von Oligosaccharid-Profilen verschiedener Honige vor und nach Filtration
konnte nicht bestätigt werden, dass signifikante Veränderungen durch den
4. Filtration von Honig 60
60
Filtrationsprozess eintreten. Die Gehalte an größeren Zuckern variierten, wie auch
die an den Mono- und Disacchariden, nur in einem geringen Bereich (Abb. 4.6.6.1.c, d). Aus diesem Grund wurde keine genaue Identifizierung einzelner Oligosaccharide
in den Honigproben vorgenommen.
Abb. 4.6.6.1.b: Chromatogramm der analytischen HPLC einer Maltooligosaccharid- Standardmischung Retentionszeiten: 3.67 Maltotriose (3 Glucose-Einheiten, G3)
4.76 Maltotetraose (G4) 6.40 Maltopentaose (G5) 8.82 Maltohexaose (G6)
12.58 Maltoheptaose (G7) 18.32 Maltooctaose (G8) 26.82 Maltononanose (G9)
Abb. 4.6.6.1.c: Oligosaccharid-Chromatogramm eines ungefilterten amerikanischen Kleehonigs
Zeit
Zeit
Signalhöhe
Signalhöhe
61 4. Filtration von Honig
61
Abb. 4.6.6.1.d: Oligosaccharid-Chromatogramm des gefilterten Kleehonigs
4.6.7. HMF-Gehalt
Die Bestimmung der Gehalte an Hydroxymethylfurfural erfolgte mittels HPLC nach
DIN 10751-3.
Sämtliche Proben wiesen nach einer Filtration deutliche Erhöhungen in den HMF-
Konzentrationen auf (Abb. 4.6.7.a und b). Der in der Honigverordnung festgelegte
Grenzwert von 40 mg/kg wurde jedoch in keinem der Fälle überschritten.
HMF ist ein Produkt der Maillard-Reaktion und gilt als Parameter für eine
Wärmeschädigung von Honig (siehe Kap. 2.3.3.). Da Honig vor der eigentlichen
Filtration kurzzeitig erhitzt wird (vergleiche Kap. 4.3.), lag die Vermutung nahe, dass
damit der Anstieg der HMF-Konzentrationen zu erklären war. Um dies zu belegen,
wurden daraufhin ungefilterte Honigproben mit bekannten HMF-Gehalten im Labor
für 5 Minuten in einen Trockenschrank (80 °C) gestellt und anschließend auf die
HMF-Konzentrationen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass derartige
Bedingungen zu einer Erhöhung von HMF führen (Abb. 4.6.7.c).
Für eine Differenzierung von gefiltertem und ungefiltertem Honig ist HMF nicht
geeignet, denn auch bestimmte Transport- und Lagerungsbedingungen können zu
einem Ansteigen der Konzentrationen führen und sind nicht allein durch einen
vorherigen Filtrationsprozess zu erklären.
Zeit
Signalhöhe
4. Filtration von Honig 62
62
Abb. 4.6.7.a: HMF-Chromatogramme eines ungefilterten (links) und eines gefilterten amerikanischen Kleehonigs
Abb. 4.6.7.b: HMF-Gehalte verschiedener Honigproben vor und nach Filtration
Zeit Zeit
Signalhöhe Signalhöhe
HMF
HMF
Signalhöhe
63 4. Filtration von Honig
63
Abb. 4.6.7.c: HMF-Gehalte verschiedener Honige vor und nach Erhitzung (5 min. auf 80 °C)
4.6.8. Mikroskopische Untersuchung
Die mikroskopische Untersuchung wurde nach LOUVEAUX et al. (1970)
durchgeführt.
Nach einer Filtration waren erwartungsgemäß keine Pollen mehr zu sehen, denn die
verwendete Porengröße können sie nicht passieren (vergleiche Kap. 4.3.).
Der Gehalt an Hefezellen war nach einer Filtration deutlich geringer als vorher.
Offensichtlich wird durch den Prozess ein großer Anteil entfernt. Möglich sind auch
eine komplette Abtrennung der Hefezellen und eine erneute Vermehrung während
des Transports und der Lagerung, wenn wieder Hefezellen in die Honige gelangen.
So wäre dann das Vorhandensein von Hefen auch nach der Filtration zu erklären.
Pilzsporen waren in den meisten Honigen nicht detektierbar. Durch die Filtration wird
ihre Anzahl nur marginal reduziert. Die Größen von Pilzsporen und Hefezellen sind
sehr variabel und liegen im Allgemeinen zwischen 3 und 15 µm [MÜLLER & WEBER
(1996)].
In wenigen Honigen waren vor der Filtration Stärkekörner mikroskopisch
nachweisbar, bei sämtlichen gefilterten Proben jedoch nicht.
4. Filtration von Honig 64
64
Auch größere Partikel, die keinen Honigbestandteilen zugeordnet werden konnten,
waren nach Filtration nicht mehr im Honig vorhanden. Dies gilt gleichermaßen für
Reste des Filterhilfsmittels Kieselgur.
Für eine Differenzierung ist eine mikroskopische Untersuchung zwar geeignet, ein
Nachweis von Mischungen gefilterter und ungefilterter Honige ist allerdings nicht
möglich.
4.6.9. Enzymaktivität der Diastase
Die Untersuchung der Diastaseaktivität erfolgte photometrisch nach Schade (DIN
10750) (siehe Kap. 2.3.3.).
Es wurde bei sämtlichen Proben eine Abnahme der Diastaseaktivität festgestellt. Die
Minderung betrug allerdings lediglich zwischen 5 und 15 % (Abb. 4.6.9.a), was für
eine präzise Abgrenzung gefilterter und ungefilterter Honige nicht ausreichend ist.
Abb. 4.6.9.a: Veränderungen der Diastaseaktivitäten nach Filtration am Beispiel verschiedener Honigsorten
65 4. Filtration von Honig
65
4.6.10. Enzymaktivität der Saccharase
Die Bestimmung der Saccharaseaktivität wurde photometrisch nach Siegenthaler
(DIN 10759-1) durchgeführt und wird als Hadorn-Zahl ausgedrückt (siehe Kap.
2.3.3.).
Die Enzymaktivitäten der Saccharase waren nach Filtration deutlichen
Veränderungen unterworfen. Diese wurden bei allen Proben auf ein Minimum
abgesenkt, die Verluste lagen zumeist bei mehr als 90 % (Abb. 4.6.10.a).
Im Vergleich zu den Diastaseaktivitäten waren die Unterschiede vor und nach
Filtration hier zwar beträchtlich, trotzdem gestaltete sich eine eindeutige
Differenzierung in Mischungen schwierig, da die Saccharase wärmeempfindlich ist
(vergleiche Kap. 2.2.3.2.) und die Aktivitäten somit auch durch andere äußere
Faktoren beeinflusst werden können.
Abb. 4.6.10.a: Veränderungen der Saccharaseaktivitäten nach Filtration am Beispiel verschiedener Honigsorten
4. Filtration von Honig 66
66
4.6.11. Zusammenfassung der Screeningversuche
Von den analytischen Parametern kamen nur wenige in Frage, mit denen man
gefilterten und ungefilterten Honig hätte unterscheiden können. Veränderungen
waren im mikroskopischen Bild, beim HMF-Gehalt und bei den Enzymaktivitäten von
Diastase und Saccharase zu beobachten.
Mischungen von gefilterten und ungefilterten Honigen ließen sich indes mit Hilfe
dieser Kenngrößen nicht feststellen, denn dazu waren entweder die Abweichungen
zu gering oder die Parameter zu sehr von weiteren Gegebenheiten beeinflussbar.
Theoretisch wäre es möglich, eine Differenzierung über die Enzymaktivitäten
vorzunehmen: Während die Aktivität der Diastase nach Filtration nur schwach
abnahm, erfuhr die der Saccharase große Verluste. Da jedoch die Aktivitäten beider
Enzyme in ungefilterten Honigsorten sehr stark schwankten, gelang dies nicht.
Allerdings erschien eine eingehendere Untersuchung der Proteine hinsichtlich eines
Nachweises sinnvoll, da es sich bei beiden Enzymen um Eiweissstoffe handelt und
beide durch den Filtrationsprozess unterschiedlich beeinflusst werden.
4.7. Methode zum Nachweis einer Filtration
Die Beobachtungen, dass die Enzymaktivitäten im Honig nach einer Filtration
abnehmen, führten zu der Fragestellung, ob Enzyme durch den Prozess denaturiert
oder aus dem Honig entfernt wurden. Wäre ersteres der Fall, lägen sie nach
Filtration weiterhin mindestens zum Teil vor, und es könnte sich eine eingehendere
Untersuchung anschließen.
Da die Enzyme überwiegend aus Eiweißstoffen bestehen, sollte eine Bestimmung
des Gesamtproteingehaltes im Honig Aufschluss über diese Fragestellung geben.
Nimmt der Proteingehalt nach Filtration deutlich ab, werden Eiweiße aus dem Honig
herausfiltriert. Wären nur schwache oder gar keine Verluste zu beobachten, sollten
die Enzyme weiterhin, mindestens zu einem Teil in denaturierter Form, im Honig
vorhanden sein.
67 4. Filtration von Honig
67
Abb. 4.7.1.a: Struktur von Coomassie Brillant Blue G-250
4.7.1. Bestimmung der Proteinkonzentrationen
In der Literatur werden verschiedene Methoden zur Messung von Eiweißgehalten in
Honig vorgeschlagen. BOGDANOV verglich 1981 quantitative Methoden zur
Proteinbestimmung von KJEDAHL (1883), LUND (1910), LOWRY et al. (1951) und
der Biuret-Methode mit der Methode nach BRADFORD (1976).
Die Bestimmung nach Bradford hat sich danach als sehr geeignet für die Matrix
Honig erwiesen. Die alternativen Methoden sind entweder für die Routine zu
aufwändig oder liefern aufgrund der sehr geringen Proteingehalte des Honigs nur
ungenaue Ergebnisse.
Die Proteinbestimmung nach Bradford basiert auf der unspezifischen Bindung des
Farbstoffes Coomassie Brillant Blue G-250 (Abb. 4.7.1.a) an kationische und
unpolare hydrophobe Seitenketten der Aminosäuren (vor allem Arginin). Diese
Substanz besitzt zwar eine höhere Nachweisgrenze für Proteine als R-250 (Abb. 4.7.1.b), färbt diese aber deutlich schneller und wird deshalb bevorzugt für den
Bradford-Nachweis eingesetzt [WESTERMEIER & MAROUGA (2005)].
Bei der ungebundenen (kationischen), rötlich gefärbten Form des Stoffes liegt das
Absorptionsmaximum bei 470 nm. Durch die Komplexbildung mit Proteinen wird die
Substanz in seiner blauen, unprotonierten, anionischen Sulfatform stabilisiert, und
das Absorptionsspektrum verschiebt sich auf ein Maximum bei 595 nm. Da der
Extinktionskoeffizient des Farbstoff-Protein-Komplexes sehr viel höher ist als der des
freien Farbstoffes, kann die Zunahme der Absorption durch die Bildung des
Komplexes mit hoher Empfindlichkeit gegenüber der Absorption des freien
Farbreagenz photometrisch gemessen werden und ist somit ein Maß für die
Proteinkonzentration der Lösung [REISNER et al. (1975)].
Abb. 4.7.1.b: Struktur von Coomassie Brillant Blue R-250 (besitzt 2 Methylgruppen weniger)
4. Filtration von Honig 68
68
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 5 10 15 20 25 30
Standardkonzentration BSA [µg/ml]
Abso
rptio
n
Abb. 4.7.1.c: Eichgerade für die Proteinbestimmung nach Bradford mit BSA
Der Bildungsprozess des Komplexes verläuft sehr schnell (ca. 2 min.) und hält
vergleichsweise lang an (mehr als eine Stunde) [AZEREDO et al. (2003)], wodurch
viele Proben zunächst gleichzeitig aufgearbeitet und danach zusammen gemessen
werden können. Coomassie Brillant Blue G-250 hat neben der Spezifität für Protein-
Peptid-Bindungen den Vorteil, dass es von Pufferchemikalien und reduzierenden
Stoffen kaum gestört wird. Die Methode versagt allerdings, wenn in der
Proteinlösung Substanzen enthalten sind, die in stark phosphorsauren Lösungen
grobflockige Niederschläge bilden (z. B. Detergenzien wie Desoxycholat). Störungen
des Tests werden auch durch andere Tenside wie Natriumdodecylsulfat (SDS) und
Triton X-100 verursacht. Da Honig derartige Substanzen nicht enthält und diese in
der Applikation auch nicht zu Einsatz kommen, ist die Bradford-Methode zur
Messung der Proteinkonzentrationen in Honig geeignet.
Die verdünnte Honiglösung (1:40 mit Wasser) wurde mit G-250 versetzt, welches in
ethanolischer Phosphorsäure gelöst war, anschließend wurde die Absorption bei
595 nm gemessen. Zur Kalibrierung wurde eine Eichgerade mit BSA (Bovine Serum
Albumine) erstellt (Abb. 4.7.1.c).
Die Ergebnisse ergaben, dass der Proteingehalt der Honige zwischen 0,01 und
0,07 % variierte. Die geringsten Konzentrationen wurden in Akazienhonigen ermittelt;
sie lagen in der Regel unter 0,02 %. Lediglich Wald- (bis 0,1 %) und vor allem
Heidehonige (bis 0,17 %) wiesen deutlich höhere Konzentrationen auf (siehe Abb.
69 4. Filtration von Honig
69
4.7.1.c). Dies entsprach Gehalten, die auch in der Literatur publiziert worden waren
und ebenfalls mit der Bradford-Methode ermittelt worden waren [BOGDANOV
(1981), AZEREDO et al. (2003)]. Die in den genannten Arbeiten beschriebenen
außergewöhnlich hohen Werte für Heidehonige konnten somit ebenfalls bestätigt
werden.
Einfluss der Filtration
Um den Einfluss einer Filtration auf die Proteinkonzentrationen von Honig zu
dokumentieren, wurden Honigproben vergleichend vor und nach Filtration auf ihre
Proteingehalte untersucht. Anhand der Vergleichsmessungen war zu beobachten,
dass nach einer Filtration maximal 10 % der Eiweißstoffe verloren gehen (Abb. 4.7.1.c). Bei gefilterten Honigen war also noch ein großer Anteil der Proteine
vorhanden, daher konnten im nächsten Arbeitsschritt weitergehende Enzym- und
Proteinuntersuchungen durchgeführt werden.
Abb. 4.7.1.c: Proteinkonzentrationen verschiedener Honigsorten vor und nach Filtration
4. Filtration von Honig 70
70
4.7.2. Gelchromatographie zur Trennung der Honigenzyme
Gelchromatographie (GPC), die auch als Gelpermeationschromatographie,
Gelfiltration oder Ausschlusschromatographie bezeichnet wird, ist die Bezeichnung
für eine als Säulenchromatographie durchgeführte Flüssigkeitschromatographie. Die
stationäre Phase besteht aus einem heteroporösen gequollenen Netzwerk (zum
Beispiel vernetztes Polyacrylamid oder Polystyrol), dessen Porengrößenverteilung
über mehrere Größenordnungen variiert. Die Fraktionierung erfolgt nach
Molekülgröße (Molekularsieb-Effekt). Eine Lösung des zu untersuchenden Polymers
wird durch das Gel gegeben, wobei kleinere Moleküle in alle Poren eindringen
können und ihnen daher das gesamte Volumen der mobilen Phase in der Trennsäule
zur Verfügung steht. Folglich werden sie länger in der Säule zurückgehalten als die
größeren Moleküle [YAU et al. (1979)].
Mittels GPC lassen sich demnach auch Proteine und Enzyme trennen, so dass es
sinnvoll erschien, für diesen Schritt auf eine solche Applikation zurückzugreifen. Ziel
war es, ein möglichst breites Spektrum von Proteinen und Enzymen des Honigs zu
erhalten, um zu überprüfen, ob bestimmte Substanzen aus dieser Gruppe durch eine
Filtration mehr beeinflusst werden als andere, so wie das schon bei den Aktivitäten
der Diastase und der Saccharase beobachtet worden war. In der GPC würde sich
dies dadurch ausdrücken, dass sich die Korrelationen von Peaks im
Chromatogramm nach Filtration im Vergleich zu denen ungefilterter Honige deutlich
verschieben würden.
Als Grundlage diente eine Methode von BERGNER & DIEMAIR (1975), die schon
auf ähnliche Weise Enzyme des Honigs isolieren konnten. Nach der Anreicherung
mittels Dialyse (48 h) erfolgte dort die Chromatographie an Sephadex G-200-Gel,
womit viele Proteine getrennt werden konnten, jedoch Diastase und Saccharase
zusammen in einem Peak eluierten. Ein Lauf dauerte dabei 24 - 28 h. Die
Abtrennung der Diastase gelang anschließend unter Verwendung von hydrophober
Wechselwirkungschromatographie [BERGNER & SABIR (1977)].
Bei der Methodenentwicklung für diese Arbeit fiel die Wahl des Gels für die
Chromatographie auf Toyopearl HW-55S ® der Firma Tosoh Bioscience. Es handelt
sich dabei um ein modifiziertes Methacrylat-Copolymer mit einer Partikelgröße von
71 4. Filtration von Honig
71
30 µm. Die Porengröße beträgt 500 Å und die Ausschlussgrenze für Moleküle
150 kDa. Dies erschien ausreichend, da das größte im Honig bekannte
vorkommende Enzym, die Glucose-Oxidase, ein Molekulargewicht von 120 kDa
aufweist (vergleiche Kap. 2.2.3.3.). Die Partikel besitzen eine schwach polare
Oberfläche und lassen somit zusätzlich eine geringe Retention aufgrund
hydrophober Wechselwirkungen zu, was die Trennung von Diastase und Saccharase
begünstigen sollte.
Eine Aufkonzentrierung der Honigproben vor der Chromatographie war aufgrund der
geringen Proteinkonzentrationen notwendig (vergleiche Kap. 4.7.1.). Dazu wurden
Vivaspin 20 - 10.000 ®-Gefäße der Firma Sartorius eingesetzt (Abb. 4.7.2.a), die als
Zentrifugalkonzentratoren bezeichnet werden. Diese fassen ein Probenvolumen von
20 ml und besitzen eine Membran mit einem MWCO („Molecular Weight Cut-Off“)
von 10 kDa. Das heißt, Substanzen, die ein höheres Molekulargewicht als 10 kDa
haben, werden von der Membran zurückgehalten. Die Abtrennung der Proteine und
anderer größerer Komponenten von der Matrix erfolgte mittels Zentrifugation (20 –
30 min., abhängig von der Honigsorte) bei 4000 U/min. 20 ml der Honiglösung (1:1
mit Wasser) wurden dabei auf 3 ml eingeengt. Anschließend wurde das Gefäß
zweimal mit je 1 ml Wasser nachgespült. Es resultierte somit ein Volumen von 5 ml,
was eine Anreicherung um den Faktor 4 bedeutete. Dieses Retentat mit den
abgetrennten Proteinen wurde für die GPC eingesetzt. Die Probenschleife der GPC
betrug 2 ml, so dass mit jeder Probe zwei Injektionen möglich waren.
Als Eluent für die Gelchromatographie diente ein Phosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 6,0),
detektiert wurde bei λ = 280 nm, da Proteine bei dieser Wellenlänge ein
Absorptionsmaximum aufweisen. Die Flussrate betrug 2 ml/min.
Abb. 4.7.2.a: Vivaspin 20 - 10.000 ®-Gefäß
(„Zentrifugalkonzentrator“)
4. Filtration von Honig 72
72
4.7.2.1. Identifizierung der Honigenzyme Zunächst wurden Enzymstandards von Diastase, Saccharase und Glucose-Oxidase
chromatographiert. Die kommerziell erhältliche Saccharase (EC 3.2.1.26), die
üblicherweise aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae gewonnen wird, entspricht
jedoch nicht dem Typ, der im Honig vorkommt. Bei der Honigsaccharase handelt es
sich um eine α-Glucosidase (vergleiche Kap. 2.2.3.2.), während es sich bei
käuflichen Standards um β -Fructosidasen handelt, die also bei der Spaltung der
Saccharose die Fructose-Seite angreifen. Aus diesem Grund lässt sich deren
Enzymaktivität auch nicht mit der Siegenthaler-Methode (siehe Kap. 2.3.3.)
bestimmen [EDELHÄUSER (1983)].
Der Grund, dieses Enzym trotzdem einzusetzen, war, dass es ein Molekulargewicht
270 kDa besitzt und somit in der Säule nicht zurückgehalten wurde, da Moleküle, die
größer als 150 kDa sind, nicht in die Poren des Gels eindringen können (vergleiche
Kap. 4.7.2.). Dies diente somit als ein Parameter für die Qualität der Trennung, da es
noch vor der Glucose-Oxidase eluieren sollte. Weiterhin ließ sich damit zusätzlich die
Totzeit ermitteln, also die Zeit, die die mobile Phase braucht, um das
chromatographische System von der Injektion bis zur Detektion zu durchlaufen.
Es wurde zusätzlich eine Mischung von Glucose, Fructose und Saccharose in
Wasser vermessen. Diese Substanzen absorbieren sehr schwach bei 280 nm, in
hoher Konzentration können sie aber trotzdem erfasst werden. Um ein ausreichend
großes GPC-Signal zu erhalten, wurden Konzentrationen von je 1,5 g Glucose und
Fructose bzw. 0,3 g Saccharose in 20 ml hergestellt.
Aufgrund der geringen Größe der Saccharide im Vergleich zu den Proteinen war zu
erwarten, dass nach den Zuckern keine Makromoleküle mehr eluieren. Somit konnte
der Elutionsbereich der Eiweißfraktion der Honige im Chromatogramm eingegrenzt
werden.
In Abb. 4.7.2.1.a ist ein Chromatogramm einer Mischung von Saccharase, Glucose-
Oxidase, Diastase, Glucose, Fructose und Saccharose in Wasser abgebildet. Es
zeigte sich, dass die einzelnen Enzyme unter diesen Bedingungen voneinander und
von den Zuckern getrennt werden konnten. Das Peakmaximum der Saccharase lag
bei 10 min., das der Glucose-Oxidase bei 22 min., das der Diastase bei 33 min. Die
Zucker wurden hingegen erst zwischen der 40. und 50. min. eluiert.
73 4. Filtration von Honig
73
Abb. 4.7.2.1.a: GPC-Chromatogramm von Saccharase (S), Glucose-Oxidase (G), Diastase (D) und den Zuckern Glucose, Fructose und Saccharose (Z) und die jeweiligen Konzentrationen in wässriger Lösung
Bei den Honigen wurden zunächst die nach 4.7.2. hergestellten Konzentrate
ungefilterter Proben chromatographiert. Die GPC-Chromatogramme eines Klee- und
eines Akazienhonigs sind in Abb. 4.7.2.1.b und c dargestellt.
Abb. 4.7.2.1.b: GPC-Chromatogramm eines amerikanischen Kleehonigs (ungefiltert) (Z = Zuckerpeak)
S G
D Z
Komponente Konzentration in H2O Saccharase 10 mg/25 ml
Glucose-Oxidase 5 mg/25 ml Diastase 20 mg/25 ml Glucose 1,5 g/25 ml Fructose 1,5 g/25 ml
Saccharose 0,3 g/25 ml
Z
4. Filtration von Honig 74
74
Abb. 4.7.2.1.c: GPC-Chromatogramm eines rumänischen Akazienhonigs (ungefiltert) (Z = Zuckerpeak)
Zunächst wurde entsprechend der Standards auch bei den Honigen die Enzym- bzw.
Proteinfraktion eingegrenzt, indem die Retentionszeit der Zucker bestimmt wurde.
Das mutmaßliche zwischen ca. 40 - 50 min. auftretende Signal wies eine ähnlich
charakteristische Form auf wie der Standard von Glucose, Fructose und Saccharose
(leichtes Tailing) (vergleiche Abb. 4.7.2.1.a). Zur Bestätigung wurden die einzelnen
Peaks isoliert und mittels HPLC auf die Zuckerprofile untersucht (vergleiche Kap. 2.3.1.). Die Signale nach 40 - 50 min. zeigten Zuckerprofile, welche den jeweils
reinen Honigen entsprachen, während in den weiteren Fraktionen keine Zucker
gemessen wurden. Somit entsprach der Elutionsbereich von Zucker-
Standardlösungen dem von realen Honiglösungen.
Die GPC-Chromatogramme aller Honige wiesen vor den Zuckern vier Peaks auf. Es
galt nun, die jeweiligen Enzymaktivitäten zu identifizieren. Dazu wurden die
einzelnen Signale mittels Fraktionssammler aufgefangen und nach Einengen mit
Vivaspin 20 - 10.000 ® jeweils die Aktivitäten von Saccharase, Diastase und Glucose-
Oxidase untersucht. Dabei kamen die Methoden nach Kap. 2.3.3. zum Einsatz. Die
Bestimmung der Aktivität der Glucose-Oxidase wurde mit Hilfe von Peroxid-
Teststäbchen vorgenommen, jedoch gelang damit lediglich eine qualitative Aussage
(positiv/negativ) (Methode siehe Kap. 5.2.5.1.).
Z
75 4. Filtration von Honig
75
Aktivität Honig (Bsp.) Saccharase Diastase
Kleehonig 104 30 (Abb. 4.7.2.1.b) Akazienhonig 23 8,5
(Abb. 4.7.2.1.c)
Tab. 4.7.2.1.e: Aktivitäten von Saccharase und Diastase des Klee- und des Akazienhonigs aus Abb. 4.7.2.1.b bzw. c
Abb. 4.7.2.1.d zeigt beispielhaft die Fraktionierung des Kleehonigs aus
Abb. 4.7.2.1.b und die Enzymaktivitäten der jeweiligen Peaks (Tabelle). Die
Aktivitäten der Diastase sind in Schade-Einheiten, die der Saccharase als Hadorn-
Zahlen angegeben.
Abb. 4.7.2.1.d: Chromatogramm des Kleehonigs (vergl. Abb. 4.7.2.1.b): Fraktionierung der Proteinsignale 1 - 4 (blaue Striche) (Z = Zuckerpeak) und die Ergebnisse der Untersuchungen der Enzymaktivitäten in den einzelnen Fraktionen Die Glucose-Oxidase konnte demnach dem Peak Nr. 2 zugeordnet werden. Die
Retentionszeit stimmte mit der des Standards überein (siehe Abb. 4.7.2.1.a).
Gleiches galt für die Diastase: Peak Nr. 4 zeigte eine hohe Aktivität, und das
Peakmaximum lag bei dem des Standard-Enzyms.
Die Saccharase konnte aufgrund der Aktivität dem Peak Nr. 3 zugeordnet werden.
Peak Nr. 1 zeigte keine Aktivität für eines der drei Enzyme.
Weiterhin war ein unmittelbarer Zusammenhang zwischen den Signalhöhen von
Diastase und Saccharase im GPC-Chromatogramm und den korrespondierenden
Enzymaktivitäten der ursprünglichen Honige zu erkennen. Honige mit hohen
Aktivitäten wiesen entsprechend große Signale auf, bei geringen Aktivitäten fielen
diese kleiner aus. Dies ist beispielhaft in Tab. 4.7.2.1.e dargestellt.
Aktivität
Peak-Nr. Glucose-Ox. Diastase Saccharase
1 neg. - - 2 pos. - 2,4 3 neg. 2,1 135,5 4 neg. 16,7 8,1 Z neg. 0,4 -
Z (45 min.)
4 (32 min.)
2 (23 min.)
3 (29 min.)
1 (17 min.)
4. Filtration von Honig 76
76
Es war bei den Chromatogrammen bereits optisch zu erkennen, dass mit der
Methode keine Basislinientrennung aller Komponenten erreicht wurde. Die Verteilung
der Enzymaktivitäten von Diastase und Saccharase bei den Peaks Nr. 2 - 4 belegte
dies, denn deren Aktivitäten waren über jeweils drei Signale verteilt.
Es kam folglich zu leichten Überlagerungen von Glucose-Oxidase, Saccharase und
Diastase. Es war ebenso nicht auszuschließen, dass zusätzliche Komponenten zu
weiteren Überlagerungen führten.
Die Trennung wurde aber als ausreichend befunden, um Differenzen zwischen
gefilterten und ungefilterten Honigen anhand von GPC-Chromatogrammen
feststellen zu können.
4.7.2.2. Vergleich gefilterter und ungefilterter Honige
Im nächsten Schritt wurden gefilterte Honige gemessen und die Chromatogramme
mit denen der ungefilterten Proben verglichen. In Abb. 4.7.2.2.a sind als Beispiel die
Chromatogramme des ungefilterten Kleehonigs aus Abb. 4.7.2.1.b und des
gefilterten Analogons gegenübergestellt.
Abb. 4.7.2.2.a: GPC-Chromatogramme des ungefilterten (links) und des gefilterten Kleehonigs (rechts) (G = Glucose-Oxidase, S = Saccharase, D = Diastase, Z = Zucker)
Dabei war vor allem die verhältnismäßig starke Abnahme jenes Peaks auffällig,
welcher der Saccharase zugeordnet werden konnte, während sich die Größe des
Diastase-Peaks nur wenig verändert hatte. Dies bestätigte die Beobachtungen der
Analytik der Enzymaktivitäten (siehe Kap. 4.6.8. und 4.6.9.). Auch weitere Signale
waren nach Filtration deutlich reduziert, wohingegen bei den Peaks, die hinter den
Proteinen auftraten, kaum Verschiebungen zu beobachten waren.
Z
D
S
G
D
S
G
Z
77 4. Filtration von Honig
77
Diese Beobachtungen bestätigten sich nach Vergleichsuntersuchungen von
insgesamt 20 gefilterten und ungefilterten Honigproben.
Bei einer Minderung der Saccharaseaktivität von 90 % (vergleiche Kap. 4.6.9.) nach
Filtration sollte jedoch auch die Reduzierung des entsprechenden Signals in der
GPC wesentlich ausgeprägter sein. Die Abnahme fiel dafür jedoch zu gering aus.
Dies kann zwei Ursachen haben. Eine Erklärung wäre, dass die Saccharase nach
Filtration zwar inaktiv ist, wenn zum Beispiel die Quartärstruktur des Proteins
verändert wäre, das Enzym aber als solches noch vollständig vorhanden ist. Somit
würde das Molekulargewicht und damit auch der Peak in der GPC unverändert
bleiben. Ein weiterer Grund kann eine Überlagerung der Saccharase mit anderen
Proteinen bzw. Makromolekülen sein.
4.7.2.3. Zusammenfassung der Ergebnisse der GPC Die gelchromatographische Methode zur Trennung von Honigenzymen von
BERGNER & DIEMAIR bzw. BERGNER & SABIR (siehe Kap. 4.7.2.) wurde
hinsichtlich Dauer und Trennschärfe optimiert. Saccharase und Diastase konnten in
einem Lauf getrennt werden. Der Zeitraum einer Messung wurde von mehr als 24 h
auf 90 min. reduziert, der der Probenvorbereitung (Aufkonzentrierung) sogar von
48 h auf maximal 30 min. Somit konnte bei gleichem apparativem Aufwand eine
Vielzahl von Proben vergleichsweise schnell gemessen werden.
Die Gelchromatographie von ungefilterten Honigen zeigte, dass in der Fraktion der
Proteine und Enzyme, also vor den Zuckern, vier Peaks im Chromatogramm
auftraten, von denen drei den Enzymen Glucose-Oxidase, Saccharase und Diastase
zugeordnet werden konnten. Allerdings traten Koelutionen weiterer Makromoleküle
auf.
Untersuchungen filtrierter und nicht filtrierter Honige ergaben, dass mit dieser
Analysentechnik prinzipiell Unterschiede herausgestellt werden konnten. Mittels
direkter Vergleiche der Chromatogramme konnten gefilterte und ungefilterte Proben
differenziert werden. Allein aufgrund der unterschiedlichen Signalhöhen in den
Chromatogrammen ließ sich jedoch eine Filtration noch nicht beweisen, vor allem
4. Filtration von Honig 78
78
nicht in Mischungen, denn ungefilterte Honige mit natürlichen geringen
Enzymaktivitäten hätten kleinere Signale aufweisen können als gefilterte Honige,
deren Aktivitäten vor Filtration sehr hoch waren.
Da das Signal der Saccharase bei gefilterten Honigproben allerdings deutlich
weniger reduziert wurde, als es die Messungen der Enzymaktivitäten erwarten
ließen, war zu vermuten, dass dieses Enzym noch weiterhin im Honig vorhanden
war. Es sollte nun aufbauend auf diesen Erkenntnissen eine Methode etabliert
werden, mit der das Proteinspektrum der Saccharase dargestellt wird. Es konnte
angenommen werden, dass so Unterschiede vor und nach Filtration signifikanter
herausgearbeitet werden könnten. Als geeignete Methode wurde die Elektrophorese
ausgewählt.
4.7.3. Elektrophorese
Die zwei wichtigsten physikalisch-chemischen Eigenschaften der Proteine, nämlich
Molekülgröße und Ladungszustand, werden überwiegend zu ihrer Trennung und
Charakterisierung verwendet, wobei elektrophoretische Trennmethoden eine
wichtige Stellung einnehmen.
Unter dem Begriff Elektrophorese werden Trennverfahren zusammengefasst, die die
Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Gleichstromfeld ausnutzen.
Man unterscheidet trägerfreie und trägergebundene Elektrophoresesysteme, wobei
die trägergebundenen Systeme weit mehr verbreitet sind. Die wichtigsten
Trägermaterialien für die sogenannte Gelelektrophorese sind unter anderem Stärke,
Agarose sowie Polyacrylamid, wobei letzteres weitaus am meisten für die
Gelelektrophorese von Proteinen verwendet wird. Die Polyacrylamid-
Gelelektrophorese wird als „PAGE“ abgekürzt. Bei der Gelelektrophorese werden die
einzelnen Substanzen nicht durch ihre unterschiedlichen Ladungen getrennt,
sondern durch einen Siebeffekt des Gels aufgrund der unterschiedlichen Größe und
Gestalt des Probenmaterials. Der Siebeffekt eines Polyacrylamidgels hängt von der
Porengröße ab, welche sich exakt und reproduzierbar verändern lässt.
Standardmäßig wird die SDS-PAGE zur Trennung von Proteingemischen eingesetzt.
SDS („Sodium dodecyl sulfate“) ist ein anionisches Detergenz, welches die
79 4. Filtration von Honig
79
Eigenladung von Proteinen so effektiv überdeckt, dass Micellen mit konstanter
negativer Ladung pro Masseneinheit entstehen (1,4 g SDS pro 1 g Protein). Bei der
Probenvorbereitung werden die Proben mit einem Überschuss von SDS auf 95 °C
erhitzt und so die Sekundär- und Tertiärstrukturen durch Aufspalten der
Wasserstoffbrücken und durch Streckung der Moleküle aufgelöst.
Disulfidbrückenbindungen werden durch Zugabe einer reduzierenden
Thiolverbindung, zum Beispiel β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol (DTT),
aufgespalten (Auflösen der Quartärstruktur). Dadurch wird gewährleistet, dass nur
die molare Masse des Proteins als Trennkriterium wirkt. Bei der SDS-Elektrophorese
wandert der SDS-Protein-Komplex im elektrischen Feld zum Plus-Pol [KLEINERT
(1990), SCHWEDT (1992)].
Üblichweise wird zur Bestimmung von Polypeptiden und Proteinen die Methode nach
LAEMMLI (1970) in einem diskontinuierlichen Tris-HCl/Tris-Glycin Puffersystem
genutzt (Tris: Tris(hydroxymethyl-)aminomethan). Ein weitporiges Sammelgel (Tris-
Glycin-Puffer pH 6,8; 3 - 4 % Acrylamid) überschichtet ein engmaschiges Trenngel
(Tris-Glycin-Puffer pH 8,8, 5 – 20 % Acrylamid). Der pH-Wert des Sammelgels liegt
sehr nahe am isoelektrischen Punkt von Glycin. Dadurch hat Glycin zu Beginn der
Trennung eine sehr niedrige elektrophoretische Mobilität (Folgeion). Die Chloridionen
in den Puffern haben hingegen eine sehr hohe Mobilität (Leitionen). Die Mobilität der
Proteine liegt zwischen den Folgeionen und Leitionen. Beim Anlegen des
elektrischen Feldes beginnen in diesem diskontinuierlichen System alle Ionen mit der
gleichen Geschwindigkeit zu wandern. Im Bereich der Leitionen stellt sich eine
niedrige Feldstärke ein, wohingegen im Bereich der Ionen mit niedriger Mobilität die
Feldstärke sehr hoch ist. Somit befinden sich die Proteine in einem
Feldstärkegradienten und bilden während der Elektrophorese einen Stapel in der
Reihenfolge ihrer Mobilitäten („Stacking-Effekt“). Dadurch erfolgt eine Vortrennung
und Aufkonzentrierung der einzelnen Proteinklassen beim Start. Beim Auftreffen auf
das Trenngel erfahren die Proteine einen hohen Reibungswiderstand und es gibt
einen „Stau“, was zur weiteren Zonenschärfung führt. Das niedermolekulare Folgeion
Glycin wird dadurch nicht beeinflusst und überholt die Proteine. Im Trenngel wirkt
nun auf alle Proteine die gleiche Feldstärke, und ausschließlich die Größe ist für die
Wandergeschwindigkeit ausschlaggebend.
4. Filtration von Honig 80
80
4.7.3.1. Elektrophorese von Saccharasefraktionen
Eine Möglichkeit der elektrophoretischen Trennung von Honigproteinen wurde von
MARSHALL & WILLIAMS (1987) beschrieben. Sie nutzten die SDS-PAGE
zusammen mit der Färbetechnik Silver Staining zur Sichtbarmachung der
Proteinbanden. Dabei wurden die reinen Honige mit Laemmli-Puffer und β-
Mercaptoethanol versetzt, für wenige Minuten auf 95 °C erhitzt und nach Abkühlung
direkt zur Elektrophorese eingesetzt. Es zeigte sich, dass die Verwendung von Gelen
sinnvoll war, welche die Trennung von 10 bis 200 kDa ermöglichten, da die
Hauptbanden der Honigproteine in diesem Bereich lagen.
Diese Methode wurde aufgegriffen, um das Proteinspektrum der
Saccharasefraktionen von Honigen aus der GPC zu charakterisieren.
Die entsprechenden GPC-Isolate wurden zur Anreicherung der Proteine mittels
Zentrifugalkonzentratoren auf ein definiertes Volumen von 1 ml eingeengt, um für
eine spätere Quantifizierung einheitliche Bedingungen zu erhalten. Anschließend
erfolgte die Denaturierung der Proteine analog zu MARSHALL & WILLIAMS, indem
100 µl des Konzentrates mit 50 µl Roti Load ® (Firma Carl Roth) gemischt wurden,
welches Laemmli-Puffer und β-Mercaptoethanol enthielt. Das Gemisch wurde erhitzt,
und genau 20 µl der Probenlösung wurden für die Elektrophorese eingesetzt
(Methode siehe Kap. 5.2.6.).
Um später eine näherungsweise Molekulargewichtsbestimmung der Proteinbanden
vornehmen zu können, wurde auf einer Spur des Gels ein Marker mit definierten
Proteinen aufgetragen. Zu diesem Zweck diente Roti Mark Standard ® (Carl Roth),
welcher aus sieben Proteinen von 14,5 kDa bis 200 kDa besteht und somit den
geforderten Größenbereich abdeckte.
Als Gel wurde Ready Gel 4-20 % Tris HCl ® von der Firma Bio-Rad verwendet. Es
handelt sich dabei um ein Gradientengel mit einem Anteil an Acrylamid von 4 bis
20 %. Dies ermöglicht eine Auftrennung von hoch- und niedermolekularen Proteinen
auf einem Gel in dem Bereich, der bei diesen Proben erforderlich war. Der Anteil an
Acrylamid im Gel ist deshalb bedeutend, da eine zu hohe Konzentration dazu führt,
dass Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht ausgeschlossen werden,
81 4. Filtration von Honig
81
wohingegen zu wenig Acrylamid den Siebeffekt abschwächen kann [HJERTÉN
(1963)].
Die Pufferlösung für die Elektrophorese bestand aus 10 x Tris/Glycin/SDS-Puffer ®
(Bio-Rad) in Wasser. Bei einer Spannung von 200 V betrug die Dauer der
Elektrophorese 45 min.
Anstatt Silver Staining wurde bei dieser Arbeit auf die Coomassie-Färbetechnik
zurückgegriffen. Silver Staining besitzt zwar eine wesentlich niedrigere
Nachweisgrenze, hat aber die Nachteile, dass diese Methode umständlich zu
handhaben, schwer reproduzierbar und nicht quantifizierbar ist, da verschiedene
Proteine mit unterschiedlicher Intensität gefärbt werden [REHM (2006)].
Daher kam der Farbstoff Coomassie Brillant Blue R-250 zum Einsatz (siehe hierzu
Kap. 4.7.1. und Abb. 4.7.1.b). Die Nachweisgrenze liegt dabei bei 100 ng pro
Bande. Das Gel wurde dazu nach Beendigung des Elektrophoresevorgangs in eine
Eisessig-haltige Fixierlösung gegeben, da der Coomassie-Farbstoff nur im sauren
Milieu an die Proteine binden kann. An den Färbevorgang schloss sich eine
Entfärbung an, wodurch der Background des Gels gering gehalten wurde und die
Proteinbanden deutlicher hervortraten.
Zur Dokumentation wurden die frisch entfärbten Gele mit einer CCD-Kamera
fotografiert, um die Farbechtheit zu gewährleisten und Ausbleichungen zu
verhindern.
In Abb. 4.7.3.1.a ist das Schema der Elektrophorese von Saccharasefraktionen
dargestellt, Abb. 4.7.3.1.b zeigt die Elektrophorese-Apparatur (Mini-PROTEAN III
Cell ®, Firma Bio-Rad) mit Spannungsquelle.
4. Filtration von Honig 82
82
Abb. 4.7.3.1.b: Elektrophorese-Apparatur mit Spannungsquelle
Abb. 4.7.3.1.a: Schema der Elektrophorese zur Untersuchung der Proteine von Saccharase-fraktionen der Honige aus der GPC
4.7.3.2. Ergebnisse der Elektrophorese
Elektrophorese ungefilterter Honige
Die elektrophoretischen Untersuchungen der Saccharasefraktionen von Sorten- und
polyfloralen Honige zeigten, dass grundsätzlich zwei dominierende Banden auftraten.
Es handelte sich dabei um Proteine mit den Molekulargewichten von ca. 65 kDa und
40 kDa, wobei letztere über einen größeren Molekulargewichtsbereich verlaufen war.
Die Proben wiesen auch weitere Banden auf, diese waren jedoch nicht bei allen
83 4. Filtration von Honig
83
Abb. 4.7.3.2.a: Elektrophorese der Saccharasefraktionen verschiedener Sortenhonige (1: Proteinmarker, 2: Klee, 3: Wald, 4: Linde, 5: Akazie)
Honigen, und wenn, dann nur schwach zu erkennen. Die Bandenspektren
unterschieden sich insgesamt trotz unterschiedlicher Trachtursprünge aber kaum
voneinander, was zu erwarten war aufgrund der Tatsache, dass die Saccharase der
Biene und nicht der Pflanze entstammt (siehe Kap. 2.2.3.2.).
Abb. 4.7.3.2.a zeigt das Bild eines frisch entfärbten Gels von Saccharasefraktionen
verschiedener Sortenhonige. Die tiefblauen Felder stellen die Proteinbanden da. Mit
Hilfe des Proteinmarkers (Spur 1) erfolgte die näherungsweise Zuordnung der
Molekulargewichte.
Die Farbintensitäten der beiden genannten Hauptbanden korrelierten dabei ungefähr
mit den Saccharaseaktivitäten der jeweiligen Honige: Der Waldhonig (Hadornzahl
113) wies die am stärksten ausgeprägten Banden auf, der Akazienhonig (23) die am
schwächsten. Es war weiterhin auffällig, dass ein Zusammenhang zwischen den
beiden Hauptbanden existierte: Intensiv gefärbte 65 kDa-Banden gingen mit
ebenfalls intensiven 40 kDa-Banden einher. Somit war anzunehmen, dass beide
Proteine denselben Ursprung haben und von der Saccharase abstammten.
4. Filtration von Honig 84
84
Neben den Saccharasefraktionen wurden auch reine Honige elektrophoretisch
untersucht, um die Gelbilder zu vergleichen. Dazu wurden die wässrigen
Honiglösungen in der gleichen Weise wie die GPC-Isolate aufgearbeitet. Dies
entsprach der Methode, die bereits MARSHALL & WILLIAMS nutzten.
Die Bandenspektren stimmten mit den Ergebnissen von MARSHALL & WILLIAMS
überein. Es stellte sich allerdings heraus, dass die Verwendung des reinen Honigs
Schwierigkeiten bereitete, da zum einen Substanzen aus der Honigmatrix einen
deutlich stärkeren Background auf dem Gel erzeugten und zum anderen die weiteren
Honigproteine zu Überlagerungen führten, was eine Auswertung erheblich
erschwerte (Beispiel siehe Abb. 4.7.3.2.b). Da bei den Saccharasefraktionen viele
Stoffe, wie zum Beispiel Proteine anderer Enzyme und die Zucker, zum größten Teil
abgetrennt waren (vergleiche Kap. 4.7.2.1.), hoben sich die so erzeugten Banden
stärker ab, was sich auch für eine spätere Quantifizierung als Vorteil erwies.
Abb. 4.7.3.2.b: Elektrophorese eines amerikanischen polyfloralen Honigs: Saccharasefraktion (links) und reiner Honig (rechts)
Elektrophorese gefilterter Honige
In Abb. 4.7.3.2.c ist beispielhaft die Elektrophorese von Saccharasefraktionen
filtrierter Honige dargestellt. Es fiel auf, dass die 65 kDa-Bande nahezu
verschwunden war, während sich die Intensität der 40 kDa-Bande nicht verändert
hatte. Es fand also offensichtlich eine selektive Beeinflussung des Proteinspektrums
in der Saccharasefraktion durch den Filtrationsprozess statt.
85 4. Filtration von Honig
85
Abb. 4.7.3.2.c: Elektrophorese verschiedener filtrierter Honige (1: Proteinmarker, 2: Klee, 3: Wald, 4: Linde, 5: Akazie)
Es war folglich mittels dieser Analysentechnik möglich, filtrierte und unfiltrierte
Honige optisch eindeutig zu differenzieren.
4.7.3.3. Zumischungen von gefilterten zu ungefilterten Honigen
Im nächsten Schritt sollte durch Zumischversuche geklärt werden, ob die 65 kDa-
Bande schwächer wird, je mehr filtrierter Honig im Erzeugnis vorhanden ist. Dazu
wurden gefilterte und ungefilterte Honige in bestimmten Verhältnissen vermengt und
die resultierenden Proben auf die gleiche Weise untersucht.
Ein Beispiel dieser Zumischversuche ist in Abb. 4.7.3.3.a exemplarisch
dokumentiert. Hier wurde einem naturreinen Kleehonig vor der Untersuchung
filtrierter Blütenhonig beigemischt, und zwar zu 25, 50 bzw. 75 %. Die
vorhergehenden Beobachtungen bestätigten sich bereits visuell: Mit höheren
Zumischungsgraden des filtrierten Honigs nahm die Intensität der 65 kDa-Bande ab.
4. Filtration von Honig 86
86
Abb. 4.7.3.3.a: Elektrophorese von Beimischungen (A: Kleehonig, unfiltriert, B: Blütenhonig, filtriert, sowie Zumischungen des filtrierten Honigs zu 75, 50 und 25 %)
Demnach ist es mittels Kopplung von Gelchromatographie und Elektrophorese
möglich, über die Farbintensitäten der beiden Hauptbanden filtrierten Honig in
unfiltrierten Honigen nachzuweisen.
Zur exakten Ermittlung des Anteils von filtriertem Honig in einer Mischung mussten
die Intensitäten der Proteinbanden nun in Zahlenwerten ausgedrückt werden.
4.7.3.4. Densitometrische Auswertung
Eine Möglichkeit der quantitativen Auswertung von Gelbildern in der Elektrophorese
ist die Densitometrie (Farbdichtemessung).
Für die densitometrische Auswertung wurde die Software Gelscan 5.1 ® der Firma
BioSciTec genutzt. Das Foto des Gels wurde in Gelscan eingelesen und dort in
Graustufen dargestellt. Die Erkennung der Banden erfolgte zunächst automatisch.
Die für die Quantifizierung nicht benötigten Banden wurden daraufhin manuell
eliminiert. Die Molekulargewichte des Proteinmarkers wurden definiert, anschließend
erfolgte die automatische Berechnung der Molekulargewichte der Probenbanden. Die
eigentliche Quantifizierung wurde dann derart vorgenommen, dass den Pixeln in
87 4. Filtration von Honig
87
Abb. 4.7.3.4.a: Gelbild von BSA-Lösungen in den Konzentrationen 0,3 mg/ml (2) – 0,6 mg/ml (3) – 0,9 mg/ml (4) – 1,2 mg/ml (5) – 1,5 mg/ml (6) – 1,8 mg/ml (7) – 2,1 mg/ml (8) und 2,4 mg/ml (9) (1: Proteinmarker)
einer Bande Farbwerte nach dem binären System zugeordnet wurden (0 - 255). Je
dunkler die Farbe war, desto höher lag der Wert. Die einzelnen Farbwerte wurden
mit deren Häufigkeit in der jeweiligen Bande multipliziert. Anschließend wurde der
Background des Gels abgezogen, der durch Grundfärbung und auch durch
angefärbte weitere Probenbestandteile hervorgerufen wurde. Es resultierte der
dimensionslose Farbdichtewert der Proteinbande.
Es musste im ersten Schritt geprüft werden, ob die Quantifizierung überhaupt mit
ausreichender Güte vorgenommen werden konnte, also ob eine lineare Abhängigkeit
zwischen Proteinkonzentration und Farbdichtewert bestand. Dazu wurden je 10 µl
Standardprotein-Lösungen von BSA (Bovine Serum Albumine) in Wasser mit
aufsteigenden Konzentrationen von 0,3 bis 2,4 mg/ml auf das Gel aufgetragen, und
nach beendeter Elektrophorese und Färbung wurden mittels Gelscan die
Farbdichtewerte ermittelt. Abb. 4.7.3.4.a zeigt das Gelbild einer Messung von BSA-
Standards mit unterschiedlichen Konzentrationen.
4. Filtration von Honig 88
88
Abb. 4.7.3.4.b: Gelbild der BSA-Standards und die Molekulargewichte der identifizierten Banden in Gelscan
Im Folgenden wird die Auswertung anhand der Messungen des BSA-Standards
demonstriert. In Abb. 4.7.3.4.b ist das in Gelscan eingebundene Bild mit den
bestimmten Molekulargewichten dargestellt.
Die Proteinbanden mit den Molekulargewichten von ca. 60 und ca. 40 kDa wurden in
diesem Fall zur Kalkulation der Farbdichtewerte herangezogen. Als Ergebnis erhält
man eine tabellarische Auflistung der Messwerte, die in Tab. 4.7.3.4.c aufgeführt
sind. In den jeweiligen Spalten sind folgende Informationen zu finden:
- „Lane“: Nr. der Probenspur (Lane 1 ist im Allgemeinen der Proteinmarker)
- „Band“: Proteinbande, die zur Quantifizierung genutzt wird
- „Height“: höchster Farbwert in der jeweiligen Bande
- „AID“: „Absolute integrated density“: berechneter Farbdichtewert mit
Background
- „IBG“: „Integrated background“: Anteil des Backgrounds vom Farbdichtewert
- „DID“: „Differential integrated density“: Farbdichtewert mit abgezogenem
Background
- „% DID”: Anteil an der Gesamtheit der Banden
- „RF“: „Rate of flow“: Strecke, die ein Protein auf dem Gel zurückgelegt hat
- „Mol. Weight“: berechnetes Molekulargewicht (in kDa)
89 4. Filtration von Honig
89
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 5 10 15 20 25 30
Konzentration BSA-Standard
Farb
dich
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0 kD
a-B
ande
Abb. 4.7.3.4.d: Linearitäten des AID und des DID der Bande 60 kDa der BSA-Standard-Lösungen
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 5 10 15 20 25 30
Konzentration BSA-Standard
Farb
dich
tew
ert 4
0 kD
a-B
ande
Abb. 4.7.3.4.e: Linearitäten des AID und des DID der Bande 40 kDa der BSA-Standard-Lösungen
Tab. 4.7.3.4.c: Tabellarische Aufstellung der Messwerte der BSA-Standardlösungen nach Auswertung mit Gelscan
Der AID und der DID stellen also die Farbdichtewerte der jeweiligen Bande dar. Es
sollte nun geprüft werden, ob mit linear zunehmender Konzentration der BSA-Lösung
auch der AID bzw. der DID linear ansteigen. Abb. 4.7.3.4.d und e zeigen die
Regressionsgeraden der beiden Banden. Die Linearität war mit
Korrelationskoeffizienten von 0,98 (AID) bis 0,99 (DID) ausreichend, so dass auch
die Quantifizierung der Proteinbanden der Honigproben angegangen werden konnte.
Lane Band Height AID IBG DID % DID RF Mol.Weight 1 1 86 581 553 28 2,5 33 200,0 2 103 818 738 80 7,1 70 119,0 3 129 1197 979 218 19,3 108 64,0 4 123 1436 1235 201 17,8 143 43,0 5 148 1292 1067 225 19,9 189 29,0 6 134 1146 990 156 13,8 227 20,0 7 147 1222 1000 222 19,6 257 14,5 2 1 158 1649 1218 431 92,9 116 59,2 2 104 784 651 33 7,1 153 40,0 3 1 175 2213 1530 683 90,9 120 56,8 2 115 923 855 68 9,1 154 39,7 4 1 177 2669 1800 869 88,4 122 55,6 2 121 1034 920 114 11,6 154 39,7 5 1 177 3013 2001 1012 90,1 122 55,6 2 123 1115 940 135 9,9 153 40,0 6 1 179 3506 2275 1231 86,9 122 55,6 2 138 1253 1067 186 13,1 152 40,3 7 1 181 3724 2366 1358 89,5 122 55,6 2 137 1378 990 218 10,5 151 40,6 8 1 181 4100 2511 1525 87,3 122 55,6 2 141 1489 1164 298 12,7 150 40,9 9 1 180 4425 2484 1716 88,0 118 58,0 2 138 1625 1078 325 12,0 147 41,8
4. Filtration von Honig 90
90
Die Berechnung der Farbdichtewerte der Proteinbanden aus den
Saccharasefraktionen der Honigproben wird am Beispiel des Kleehonigs, des
filtrierten Blütenhonigs und der Zumischungen aus Abb. 4.7.3.3.a dargelegt. Abb. 4.7.3.4.f zeigt das Gelbild mit den markierten Banden, die zur Quantifizierung
herangezogen wurden. In Abb. 4.7.3.4.g sind die Molekulargewichte der beiden
Hauptbanden mittels Gelscan berechnet. In Tab. 4.7.3.4.h sind die einzelnen
Messwerte für diese Proben aufgelistet.
Lane Band Height AID IBG DID % DID RF Mol.Weight
2 (=A) 1 170 3273 2153 1120 25,5 109 63,4
2 182 10274 6994 3280 74,5 151 43,0
3 (=B) 1 122 747 662 85 2,7 98 73,9
2 178 8571 5559 3012 97,3 139 42,7
4 (=75 %) 1 128 1348 1223 125 3,9 98 65,1
2 172 7965 4893 3072 96,1 136 43,4
5 (=50 %) 1 151 2167 1913 254 6,8 101 63,1
2 181 10007 6542 3465 93,2 138 43,0
6 (=25 %) 1 145 2558 2196 362 9,6 101 63,1
2 177 8862 5454 3408 90,4 141 42,4
Abb. 4.7.3.4.h: Tabellarische Aufstellung der Messwerte der Honigproben aus Abb. 4.7.3.3.a nach Auswertung mit Gelscan (rot markiert: Änderungen des DID bei der 65 kDa-Bande)
Bande
Abb. 4.7.3.4.f: unfiltrierter Kleehonig (A), filtrierter Blütenhonig (B) sowie Beimischungen von B in A zu 25, 50 bzw. 75 % (1: Bande 65 kDa, 2: Bande 40 kDa)
Abb. 4.7.3.4.g: Auswertung mittels Gelscan: Berechnung der Molekulargewichte der Banden
1
2
91 4. Filtration von Honig
91
Die Ergebnisse der Auswertung bestätigten die vorherigen Beobachtungen: Die
Probe nach Filtration wies sowohl beim AID als auch beim DID einen deutlich
geringeren Farbdichtewert bei der 65 kDa-Bande auf als bei der unfiltrierten Probe,
während die Werte für die 40 kDa-Bande relativ konstant blieben. Somit ließ sich an
der Veränderung der Bandenverhältnisse nicht nur erkennen, ob ein filtrierter Honig
vorlag, auch ein Zusatz von filtriertem zu unfiltriertem Honig war in diesem Beispiel
detektierbar.
Es zeigte sich, dass zur Bewertung der Befunde der DID herangezogen werden
sollte, da hierbei der Background nicht in die Berechnungen mit einbezogen wurde
und somit der DID deutlich konstantere Werte für die 40 kDa-Bande lieferte als der
AID. Dies konnte bereits bei der Auswertung der BSA-Standardlösungen festgestellt
werden, denn auch hier war der Korrelationskoeffizient des DID etwas höher als der
des AID.
4.7.3.5. Methodenvalidierung
Es mussten im nächsten Schritt die Parameter untersucht werden, die belegen, dass
diese Methode generell geeignet ist, gefilterte Honige auch in Mischungen zu
erkennen. Die Grundlage zur Ermittlung der Verfahrenskenndaten bildete die Arbeit
von KROMIDAS (1999).
Reproduzierbarkeit:
Um die Reproduzierbarkeit der Methode zu prüfen, wurden zwei ungefilterte Honige
jeweils viermal unter Wiederholbedingungen aufgearbeitet und elektrophoretisch auf
zwei Gelen untersucht. Als Honigproben wurden ein Akazienhonig (geringe
Saccharaseaktivität) und ein Waldhonig (hohe Saccharaseaktivität) ausgewählt.
Die absoluten Farbdichtewerte des Waldhonigs waren wie erwartet deutlich höher als
die des Akazienhonigs, wobei sich die Verhältnisse der 40 kDa- und der 65 kDa-
Banden relativ konstant verhielten. Die jeweiligen Farbdichtewerte aller Messungen
wiesen mit durchschnittlich 8 % geringe Standardabweichungen auf, demnach besaß
die Methode eine hohe Wiederholpräzision und war somit gut reproduzierbar
(Durchführung und Ergebnisse siehe Kap. 5.2.7.).
4. Filtration von Honig 92
92
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 20 40 60 80 100 120
Verhältnis 40 kDa zu 65 kDa
Zum
isch
ungs
grad
[%]
Abb. 4.7.3.5.a: Linearität der Bandenverhältnisse bei Zumischung eines filtrierten Blütenhonigs zu einem Kleehonig (Korrelationskoeffizient 0,98)
Linearität:
Es wurde geprüft, ob die Verhältnisse der 40 kDa- und der 65 kDa-Bande mit
steigenden Zumischungsgraden filtrierten Honigs linear zunehmen. Dazu wurden
fünf verschiedenen ungefilterten Sorten- und polyfloralen Honigen gefilterte Honige in
den Verhältnissen 25 %, 50 % und 75 % beigemischt und deren Saccharase-
fraktionen aus der GPC elektrophoretisch untersucht (Durchführung siehe Kap. 5.2.7.).
Mit einem durchschnittlichen Korrelationskoeffizienten von 0,98 wurde die Forderung
nach ausreichender Linearität erfüllt. In Abb. 4.7.3.5.a ist exemplarisch die
Regressionsgerade von Messungen einer Zumischung filtrierten Blütenhonigs zu
einem Kleehonig dargestellt.
Robustheit – Aufkonzentrierungen der Saccharasefraktionen:
Es wurde geprüft, inwieweit sich unterschiedliche Verdünnungsstufen einer
Saccharasefraktion auf die Bandenverhältnisse auswirken. Die Ermittlung dieses
Parameters war aus dem Grund wichtig, da die Einengung der Eluate nach der
Gelchromatographie mittels der Zentrifugalkonzentratoren nur recht ungenau
vorgenommen werden konnten.
Dazu wurden bei drei unfiltrierten Honigproben je fünf Verdünnungsstufen der
Saccharasefraktion erstellt und elektrophoretisch untersucht (siehe Kap. 5.2.7.). Abb. 4.7.3.5.b zeigt am Beispiel eines Kleehonigs, dass die Farbdichtewerte wie
93 4. Filtration von Honig
93
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 1 2 3 4 5 6
Verdünnungsstufe
Farb
dich
tew
ert
Abb. 4.7.3.5.b: Area-Werte der Banden (rot: 65 kDa, grün: 40 kDa) bei unterschiedlichen Verdünnungen eines Kleehonigs
erwartet zwar abnahmen, die Verhältnisse in den jeweiligen Verdünnungen jedoch
konstant blieben.
Robustheit - Ausschluss von Hitzeeinfluss
Obwohl die gefilterten Honige von unterschiedlichen Lieferanten stammten (siehe
Kap. 4.5.), bei denen vermutlich auch jeweils unterschiedliche Filtrationsparameter
zum Einsatz kamen, zeigten alle Proben hinsichtlich des Verlustes der
Saccharaseaktivität bzw. des Verschwindens der 65 kDa-Bande das gleiche Bild.
Trotzdem galt die Frage zu klären, ob dieser Effekt mit dem Hitzeeinfluss während
des Filtrationsprozesses zu begründen war, welcher generell gegeben ist. Die
Überprüfung dieses Faktors war aufgrund der Hitzeempfindlichkeit der Saccharase
von großer Wichtigkeit (siehe Kap. 2.2.3.2.). Wäre allein die Wärmezufuhr für das
Verschwinden des 65 kDa-Proteins verantwortlich, so wäre die erarbeitete Methode
kein garantierter Nachweis für eine vorherige Filtration, denn auf den Honig kann
Hitze in vielfältiger Weise einwirken, beispielsweise beim Transport oder den
großtechnischen Abfüllvorgängen.
Zur Absicherung wurden ungefilterte Honige im Labor entsprechend der
Filtrationsbedingungen wenige Minuten im Trockenschrank auf 80 °C erwärmt
(vergleiche Kap. 4.3.) und anschließend vor und nach Wärmezufuhr vergleichend
untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass in der kurzen Zeit, die für die
Viskositätsverminderung der Honige notwendig ist, keine Beeinflussung des
4. Filtration von Honig 94
94
Proteinspektrums der Saccharasefraktionen festzustellen war. In Abb. 4.7.3.5.c ist
anhand eines Blütenhonigs ersichtlich, dass es keine signifikanten Unterschiede
zwischen dem Gelbild vor und dem nach der Erwärmung gab; die Intensität der
65 kDa-Bande veränderte sich nicht. Eine Veränderung des Proteinspektrums der
Saccharasefraktion war somit allein durch Hitze nicht zu erklären, sondern musste
auf eine Filtration zurückzuführen sein.
Abb. 4.7.3.5.c: Proteinspektrum der Saccharasefraktionen eines Blütenhonigs vor (links) und nach Erwärmung (rechts) auf 80 °C
Robustheit – Ausschluss von Auswirkungen der Überlagerungen bei den GPC-Peaks
Bei der Auftrennung der Proteine in der GPC kam es zu Überlagerungen, wie in Kap. 4.7.2.1. dargelegt. Bei der Validierung der elektrophoretischen Analytik war zu
prüfen, inwieweit Veränderungen der Gelbilder zu beobachten waren, wenn die
Fraktionierung der Peaks etwas ungenauer erfolgte. Dazu wurden Honigproben
identisch aufgearbeitet, wobei die Peaks zum einen unmittelbar zu Beginn bzw. am
Ende und zum anderen jeweils fünf min. vorher und nachher abgenommen wurden.
Die densitometrischen Auswertungen der Gelbilder ergaben, dass sich die
Farbdichtewerte der 40 kDa- und der 65 kDa-Bande nur marginal, deren Verhältnisse
sogar überhaupt nicht veränderten. Die Überlagerungen haben demnach keine
Auswirkungen auf das Analyseergebnis.
95 4. Filtration von Honig
95
4.7.3.6. Ergebnisse und Schlussfolgerungen
Es wurden insgesamt 40 Honige vor und nach Filtration mit der vorgestellten
Methode gemessen und mit Gelscan ausgewertet.
Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass sich die Intensität und somit der
Farbdichtewert der 40 kDa-Bande nach einer Filtration praktisch nicht veränderte.
Die 65 kDa-Bande war hingegen kaum noch vorhanden. Das führte dazu, dass der
Quotient der Farbdichtewerte der 40 kDa- und der 65 kDa-Bande bei gefilterten
Honigen im allgemeinen deutlich höher als 30 war, während er bei gefilterten
Honigen grundsätzlich zwischen 2 und 3 lag. In Abb. 4.7.3.6.a sind als Beispiel noch
einmal die Messwerte der Honigproben sowie die entsprechenden
Bandenverhältnisse aus Abb. 4.7.3.4.h aufgeführt (unfiltrierter Kleehonig, filtrierter
Honig und jeweilige Zumischungen des filtrierten Honigs zu 25 %, 50 % und 75 %).
Abb. 4.7.3.6.a: Messwerte der densitometrischen Auswertung und Verhältnisse der Banden bei Kleehonig, gefiltertem Honig sowie Zumischungen
In Abb. 4.7.3.6.b ist ein Streudiagramm der Farbdichtewerte verschiedener
Honigproben vor und nach Filtration dargestellt. Darin ist zu erkennen, dass bei den
ungefilterten Proben die Intensitätswerte der 40 kDa-Bande mit denen der 65 kDa-
Bande korrelierten. Hohen Werten für die 40 kDa-Bande stehen auch hohe Werte für
die 65 kDa-Bande gegenüber. Dies gibt einen weiteren Hinweis darauf, dass beide
Proteine einer identischen Quelle entstammen, und zwar der Saccharase (siehe
Kap. 4.7.3.2.).
Kleehonig gefilterter Zumischung (ungefiltert) Honig 75 % 50 % 25 %
40 kDa 3280 3012 3072 3465 3408
65 kDa 1120 85 125 254 362
Verhältnis 40/65 2,9 35,4 24,6 13,6 9,4
4. Filtration von Honig 96
96
Abb. 4.7.3.6.b: Darstellung der Farbdichtewerte ausgewählter Honigproben (ungef.: ungefiltert, gef.: gefiltert)
Bei den Beimengungen gefilterter zu ungefilterten Honigen ließ sich beobachten,
dass mit zunehmenden Anteilen filtrierten Honigs die Intensität der 65 kDa-Bande
abnahm, während die der 40 kDa-Bande konstant blieb. Dies drückte sich dann auch
entsprechend in den Farbdichtewerten aus. Das Verhältnis verschob sich bei einem
25%igen Zusatz gefilterten Honigs zum ungefilterten Produkt von anfangs ca. 3
(ungefiltert) auf durchschnittlich 7 – 10, wobei ein Bandenverhältnis von mehr als 6
generell einen Zusatz gefilterten Honigs anzeigte. Höhere Beigaben erhöhten den
Quotienten entsprechend. Bei sämtlichen Mischungen war dabei eine lineare
Abhängigkeit mit ansteigenden Zumischungsgraden des filtrierten Honigs zu
verzeichnen.
Die Kopplung von Gelchromatographie und Elektrophorese stellt somit eine
geeignete Methode dar, um filtrierte Honige in einer Mischung mit unfiltriertem Honig
quantitativ nachzuweisen.
In Abb. 4.7.3.6.c ist das Schema der Aufarbeitung und der Untersuchung noch
einmal zusammenfassend aufgeführt.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 1000 2000 3000 4000 5000
Farbdichtewert 40 kDa
Farb
dich
tew
ert 6
5 kD
a
Klee ungef.Klee gef.Linde ungef.Linde gef.Akazie ungef.Akazie gef.Wald 1 ungef.Wald 1 gef.Wald 2 ungef.Wald 2 gef.polyfloral ungef.polyfloral gef.
97 4. Filtration von Honig
97
Abb. 4.7.3.6.c: Schema der Methode zum Nachweis von gefiltertem Honig
Das Verhältnis zweier definierter Banden im Gelbild der Elektrophorese von
Saccharasefraktionen der Gelchromatographie gab dabei Aufschluss über die Menge
des Zusatzes an gefiltertem Honig. Eine Zumischung von 25 % gefilterten Honigs
zeigte bei allen Proben ein signifikant verändertes Bandenverhältnis im Vergleich
zum ungefilterten Erzeugnis, diese Menge konnte also in sämtlichen Honigen
nachgewiesen werden.
Differenzierte man dabei die Honigsorten, so konnte diese Grenze weiter abgesenkt
werden. Wurde beispielsweise einem Akazienhonig, der üblicherweise eine geringe
Saccharaseaktivität und somit niedrige Farbdichtewerte der Banden aufwies, ein
gefilterter Honig beigemischt, der vor Filtration eine hohe Aktivität besaß (wie zum
Beispiel Waldhonig), so änderte sich das Verhältnis der Banden bereits bei einem
Lösen des Honigs in Wasser (1:1)
Aufkonzentrieren der Lösung
Gelchromatographische Auftrennung
Isolierung der Saccharasefraktion
Aufkonzentrieren der Fraktion
Versetzen mit Laemmli-Puffer und β-Mercaptoethanol
Elektrophorese
Auswertung mit Gelscan
Berechnung des Quotienten der Banden 40 kDa und 65 kDa
4. Filtration von Honig 98
98
Zusatz von 15 % sehr deutlich. Der Grund war, dass die Intensität der 40 kDa-Bande
durch die Beimischung verstärkt wurde und dadurch die 65 kDa-Bande relativ stärker
abnahm.
Unabhängig von der Saccharaseaktivität des gefilterten Honigs konnte auch alleine
die des ungefilterten Erzeugnisses von Bedeutung sein, ab welchem
Zumischungsgrad der gefilterte Honig nachgewiesen werden konnte. Wurde Honigen
mit sehr hohen Saccharaseaktivitäten, wie zum Beispiel Waldhonigen, gefilterter
Honig zugesetzt, so war auch hier bei einem Zusatz von 15 % eine deutliche
Änderung des Bandenverhältnisses 40/65 kDa zu beobachten. Grundsätzlich war
nach Untersuchung der 40 Honigproben festzustellen, dass mit zunehmender
Saccharaseaktivität des unfiltrierten Honigs die Nachweisgrenze für einen
zugesetzten filtrierten Honig sank.
Eine allgemeine Nachweisgrenze für gefilterten Honig konnte somit noch nicht
festgelegt werden, denn die Verschiebung der Bandenverhältnisse war, wie oben
dargelegt, abhängig von den Saccharaseaktivitäten des ungefilterten Honigs sowie
des gefilterten Honigs vor dem eigentlichen Filtrationsprozess. Es müssen weitere
Honige untersucht werden, um den Datenpool zu vergrößern. In Zukunft können
möglicherweise feste und in Einzelfällen niedrigere Nachweisgrenzen definiert
werden, wenn statistische Messungen belegen, dass bereits Bandenverhältnisse
40/65 kDa von weniger als 6 einen Zusatz von gefiltertem Honig sicher anzeigen.
Mit der Möglichkeit des Nachweises von Zumischungen von filtriertem zu unfiltriertem
Honig wird dem Hersteller bzw. dem Importeur die Möglichkeit gegeben,
einwandfreie Produkte einzukaufen, womit gleichzeitig der Verbraucherschutz
gewährleistet ist. Genauso erhält auch die amtliche Lebensmittelüberwachung ein
Instrument, um die Einhaltung der Honigverordnung zu gewährleisten. Somit wurde
letztendlich auch die Empfehlung des Agrarausschusses des Bundesrates erfüllt
(siehe Kap. 4.4.), der gefordert hatte, Nachweismethoden für die Verschneidung von
Honig mit gefiltertem Honig zu entwickeln.
99 5. Material und Methoden
99
5. Material und Methoden 100
100
5. Material und Methoden
5.1. Phenylacetaldehyd (Kapitel 3)
5.1.1. Chemikalien, Geräte und Hilfsmittel
Chemikalien
Substanz Reinheit Lieferant Sulfosalicylsäure x 2 H2O > 99 % Sigma Natriumcitrat p.a. Sigma Ninhydrin > 97 % Sigma Methanol p.a. Merck Natriumchlorid p.a. Merck tert.-Butylmethylether p.a., 99,5 % Merck Propylenglykol > 99,5 % Fluka
Tab. 5.1.1.a: Liste der verwendeten Chemikalien Standardsubstanzen
Substanz Reinheit Lieferant Phenylacetaldehyd > 90 % Sigma D-Phenylalanin > 98 % Sigma L-Norleucin > 99,0 % Sigma para-Dichlorbenzol-d4 99 % Sigma
Tab. 5.1.1.b: Liste der Standardsubstanzen allgemeine Geräte
Analysenwaage LSM200, Fa. PCE Magnetrührer RET, Fa. Ikamag Zentrifuge Rotina 46, Fa. Hellich Eindampfsystem Vapotherm Mobil S, Fa. Barkey Schüttler SM-30, Fa. Edmund Bühler Multipette Multipette plus, Fa. Eppendorf Eppendorf-Pipette Reference 10-100, Fa. Eppendorf Dispensette Calibrex 520, Fa. Socorex Brutschrank BM 400, Fa. Memmert Pflanzenlichtlampe Natura R80 (60 W), Fa. Conrad
Tab. 5.1.1.c: Liste der verwendeten Geräte
101
101
Hilfsmittel
Einmalspritzen (6 ml) Fa. O. Kohl Membranfilter (Porengröße 0,2 µm) Fa. Sartorius Vials für Headspace-GC (10 ml) Fa. O. Kohl Zentrifugenröhrchen (50 ml) Fa. O. Kohl HPLC-Vials (2 ml) Fa. O. Kohl HPLC-Vials, graduiert (2 ml, Graduierung 0,2 ml) Fa. O. Kohl
Tab. 5.1.1.d: Liste der verwendeten Hilfsmittel
5.1.2. Probenliste
Honigproben, die für die Untersuchungen herangezogen wurden:
botanische Herkunft geographische Herkunft interne Probennummer Akazie Rumänien 87056 Lavendel Frankreich 84334 Tanne Polen 85206 Wald Italien 85212 Wildblüte (polyfloral) Mexiko/Yucatan 83996 polyfloral Argentinien 84247 Zuckersirup "Meliose" 74011
Tab. 5.1.2.a: Liste der verwendeten Honigproben
5.1.3. Methode: Bestimmung der freien Aminosäuren
Probenvorbereitung
- 10 g Honig in 150 ml-Becherglas einwiegen, 2 ml L-Norleucin-Standardlösung
zugeben (67,5 mg in 100 ml bidest. Wasser) und ca. 20 ml bidest. Wasser
zugeben
- mit Hilfe eines Magnetrührers lösen und Lösung in 100 ml-Standzylinder
überführen, so dass das Endvolumen exakt 50 ml beträgt
- 5 ml 10%ige Sulfosalicylsäure zusetzen, umschütteln, und Standzylinder über
Nacht im Kühlschrank belassen
- ein Aliquot des Überstandes zentrifugieren (20 min. bei 13.000 U/min.)
5. Material und Methoden
102
102
- ein Aliquot des Überstandes membranfiltrieren (0,2 µm), Filtrat mit 0,2 M
Natrium-Citratpuffer (pH 2,20) im Verhältnis 1:1 verdünnen und 20 – 100 µl
der Lösung in den Aminosäureanalysator injizieren
Geräte
Gerät: Pharmacia LKB, Alpha Plus
Harz: Kationenaustauscher der Fa. Grüning, D-82140 Olching
125 x 4,6 mm PEEK, 5 µm
Analysenparameter
Flüsse: Na-Citratpuffer 16 ml/h
Ninhydrin 11 ml/h
Reaktionstemp.: 135 °C
Auswertung
- über externen Standard
5.1.4. Methode: Phenylacetaldehyd-Bestimmung mittels Headspace-
GC/MS
Probenvorbereitung
- 5 g Honig in Headspace-Vial einwiegen
- 50 µl internen Standard (para-Dichlorbenzol-d4 in Methanol, 1 ng/µl), 2 g
Natriumchlorid und 2,5 ml bidest. Wasser zugeben und Vial fest verschließen
- Vial 2 h bei 80 °C inkubieren
- 100 µl der Gasphase in GC/MS injizieren
Ansetzen der Standardlösung
- Stammlösung: 25 µl Phenylacetaldehyd in 25 ml Proplyenglykol lösen
(c = 1000 mg/l)
- 1,5 ml der Stammlösung mit Propylenglykol auf 50 ml auffüllen (c = 30 mg/l)
5. Material und Methoden
103
103
Geräte
GC: Varian 3400 Cx
MS: Varian Saturn 2000 MS/MS
Autosampler: Chromtech Combi PAL
Säule: Kapillarsäule Chrompack CP Sil8 Low Bleed MS
30 m x 0,25 mm, Filmdicke 0,25 µm
Analysenparameter
Injektortemp.: 260 °C
Trägergas Helium 6.0
Trägergas-Fluss: 1,3 ml/min. constant flow
Transferline-Temp.: 220 °C
Ion Trap-Temp.: 200 °C
Temp.-Programm: 1. 50 °C, 10 min
2. 20 °C/min. bis 260 °C
3. 260 °C, 20 min
Auswertung
- Identifizierung von Phenylacetaldehyd:
o Retentionszeit:13,1 min.
o Vergleich der Massenspektren: NIST-Datenbank
o Berechnung der Gehalte: über Hauptfragment m/z = 91
o Qualifier: Fragmente m/z = 92, m/z = 65 und m/z = 63
- Auswertung: über externen Standard
5.1.5. Methode: Phenylacetaldehyd-Bestimmung nach Extraktion
Probenvorbereitung
- 2,5 g Honig in Zentrifugenrohr einwiegen und in 10 ml Wasser lösen
- 10 ml tBME (tert.-Butylmethylether) zugeben und 15 min. durch Schütteln
extrahieren
- 5 min. bei 4000 U/min. zentrifugieren
5. Material und Methoden
104
104
- von der klaren (oberen) Etherphase genau 2 ml abnehmen und in ein
graduiertes HPLC-Vial geben, welches vorher leer gewogen wurde
- Extrakt im Luftstrom bei 40 °C auf ca. ¼ einengen und Vial nochmals wiegen
- Über Wägewerte und Dichte von tBME (0,74 g/ml) das Volumen berechnen:
(m2 – m1) [g]
VE [ml] = ρ [g/ml]
VE = Volumen des eingeengten Extraktes
m1 = Masse des leeren Vials
m2 = Masse des Vials mit Probenextrakt
ρ = Dichte von tBME
- Lösung in HPLC-Vial umfüllen, 3 µl zur GC/MS-Messung einsetzen
Ansetzen der Standardlösung
(siehe Kap. 5.1.4.)
Geräte
(siehe Kap. 5.1.4.)
Analysenparameter
(siehe Kap. 5.1.4.)
Auswertung
- Identifizierung von Phenylacetaldehyd und Auswertung: siehe Kap. 5.1.4.
- Berechnung des Phenylacetaldehydgehaltes in der Probe:
cPAA [mg/l] x VE [ml] x 5
ω [mg/kg] = 2,5 g
ω = Konzentration Phenylacetaldehyd in der Probe
cPAA = Konzentration von Phenylacetaldehyd in der Etherlösung
VE = Volumen der Messlösung
5. Material und Methoden
105
105
5.1.6. Methodenvalidierung Wiederholpräzision
- Bestimmung der Phenylacetaldehyd-Konzentrationen
- Dotierung von 6 x 50 µl der Phenylacetaldehyd-Standardlösung (siehe Kap. 5.1.4.) zu jeweils 2,5 g der Honigprobe
- Erneute Bestimmung der Phenylacetaldehyd-Konzentrationen und Abzug der
natürlichen Gehalte
Probe (Nr.)
natürlicher Gehalt PAA
[mg/kg]
Dotierung PAA-Standardlösung
[µl] Dotierung
PAA [mg/kg]
gemessener PAA-Gehalt
[mg/kg]
Wiederfin-dungsrate
[%] Akazie 0,20 50 0,60 0,68 80 (87056) 0,72 87
0,67 78 0,71 85 0,71 85 0,70 83
Wald 0,10 50 0,60 0,75 107 (85212) 0,61 87
0,72 103 0,65 93 0,67 96 0,72 103
polyfloral 0,72 50 0,60 1,2 92 (84247) 1,4 104
1,3 98 1,0 78 1,3 97 1,4 106
Tab. 5.1.6.a: Ergebnisse der Wiederfindungsmessungen Linearität
- Bestimmung der Phenylacetaldehyd-Konzentrationen
- 6 Dotierungen der Phenylacetaldehyd-Standardlösung (siehe Kap. 5.1.4.) zu
jeweils 2,5 g der Honigprobe
- Erneute Bestimmung der Phenylacetaldehyd-Konzentrationen und Abzug der
natürlichen Gehalte
5. Material und Methoden
106
106
Probe (Nr.)
natürlicher Gehalt PAA
[mg/kg]
Dotierung PAA-Standardlösung
[µl] Dotierung
PAA [mg/kg]
gemessener PAA-Gehalt
[mg/kg] Korrelations-
koeffizient Akazie 0,20 10 0,12 0,37 0,997 (87056) 15 0,18 0,43
25 0,30 0,47 50 0,60 0,88 100 1,2 1,4 200 2,4 2,8 500 6,0 5,8
Wald 0,10 10 0,12 0,18 0,994 (85212) 15 0,18 0,31
25 0,30 0,52 50 0,60 0,61 100 1,2 1,1 200 2,4 2,0 500 6,0 6,5
polyfloral 0,72 10 0,12 0,72 0,995 (84247) 15 0,18 0,96
25 0,30 1,2 50 0,60 1,2 100 1,2 1,8 200 2,4 3,4 500 6,0 6,4
Tab. 5.1.6.b: Ergebnisse der Linearitätsmessungen
5.1.7. Durchführung der Lagerungsversuche
- Einwaage von 3 mal ca. 20 g Probe in klare Glasgefäße, Gefäße mit Deckel
verschließen
- Lagerung eines Gefäßes im Brutschrank bei 39 °C, eines in einem Schrank
bei Raumtemperatur und eines in einem Schrank unter Einfluss einer
Pflanzenlichtlampe
- Nach 2, 8 und 14 Wochen Entnahme von jeweils ca. 5 g Probe und
Bestimmung der Gehalte an Phenylacetaldehyd
5. Material und Methoden
107
107
5.2. Filtration von Honig (Kapitel 4)
5.2.1. Chemikalien, Geräte und Hilfsmittel
Chemikalien
Substanz Reinheit Lieferant Natriumazid reinst, 99 % Fluka Natronlauge 50 % Fluka Natriumacetat-Trihydrat p.a., > 99 % Merck Bariumhydroxid Octahydrat p.a., > 98 % Merck Kaliumdihydrogenphosphat 99,5 % Merck di-Natriumhydrogenphosphat p.a. Merck Methanol p.a. Merck Roti-Load 1 Gelladepuffer Roth Ready Gel 4-20 % Tris-HCl Bio-Rad Tris/Glycin/SDS-Puffer Bio-Rad Ready Gel 4-20 % Tris HCl Bio-Rad Essigsäure 100 % (Eisessig) 100 % Merck Rotiphorese Blau R Coomassie Roth Quick Start Bradford Protein Assay Dye Reagent Bio-Rad
Tab. 5.2.1.a: Liste der verwendeten Chemikalien Standardsubstanzen
Substanz Reinheit Lieferant Maltooligosaccharide 98 % Sigma D(-)-Fructose reinst Merck D(+)-Glucose > 99.5 % Fluka D(+)-Saccharose > 99.5 % Fluka Saccharase Fluka Diastase 34,5 units/mg Sigma Glucose-Oxidase Sigma Roti-Mark Standard Protein-Marker Roth Bovine Serum Albumin (BSA) Standard Set Bio-Rad
Tab. 5.2.1.b: Liste der Standardsubstanzen
5. Material und Methoden
108
108
allgemeine Geräte
Analysenwaage LSM200, Fa. PCE Magnetrührer RET, Fa. Ikamag Zentrifuge Rotina 46, Fa. Hellich Vortex-Mischer Genie 2, Fa. Kleinfeld Heizbad VC, Fa. Julabo Schüttler SM-30, Fa. Edmund Bühler Rotationsverdampfer VV 2000, Fa. Heidolph Multipette Multipette plus, Fa. Eppendorf Eppendorf-Pipette Reference 10 - 100, Fa. Eppendorf Dispensette Calibrex 520, Fa. Socorex Farbbestimmungsgerät C 221 Honey Color Analyzer, Fa. Hanna Spektrometer IR 470, Fa. Shimadzu UV-Spektrometer Cary 1, Fa. Varian Mikroskop Axiostar plus, Fa. Carl Zeiss CCD-Fotokamera Power Shot G7, Fa. Canon Leuchtpult LP-503, Fa. Hama Auswertesoftware f. Elektrophorese Gelscan 5.1 für Windows, Fa. BioSciTec
Tab. 5.2.1.c: Liste der verwendeten Geräte Hilfsmittel
Einmalspritzen (6 ml) Fa. O. Kohl Membranfilter (Porengröße 0,45 µm) Fa. Sartorius UV-Küvette makro (1,5 ml) Fa. Brand Halbmikroküvette PS (1,5 ml) Fa. Nerbe Plus Irtran 2-Fenster Fa. Harrick Objektträger und Deckgläser Fa. Assistent HPLC-Spritze 100 µl Fa. Hamilton Zentrifugalkonzentratoren Vivaspin 20 - 10.000 Fa. Sartorius Peroxid-Test (0,5 - 25 mg/l H2O2) Fa. Merck Gelfärbeschalen MIDI Fa. Roth Gelschaufeln Fa. Roth
Tab. 5.2.1.d: Liste der verwendeten Hilfsmittel
5. Material und Methoden
109
109
5.2.2. Probenliste
Honigproben, die für die Untersuchungen herangezogen wurden (aufgelistet sind nur
die ungefilterten Proben):
botanische Herkunft geographische Herkunft interne Probennummer Akazie Rumänien 3557 Akazie Südosteuropa 97736 Akazie Südosteuropa 3555 Akazie Südosteuropa 4888 Eukalyptus Australien 4971 Eukalyptus Südamerika 4218 Eukalyptus USA 28750 Klee Argentinien 3537 Klee Argentinien 3548 Klee Neuseeland 3544 Klee Neuseeland 3559 Klee USA 86672 Klee USA 543 Klee USA 28748 Linde Bulgarien 3561 Linde Rumänien 3545 Linde Südosteuropa, Südamerika 3549 Raps Deutschland 3547 Raps Österreich 3541 Raps Osteuropa 6722 Raps Tschechien 3543 Sonnenblume Argentinien 3564 Sonnenblume Osteuropa 3552 Sonnenblume Südosteuropa 3542 Sonnenblume Ukraine 3546 Sonnenblume Ungarn 3562 Wald/Honigtau Italien 98406 Wald/Honigtau Italien 4753 Wald/Honigtau Spanien 3558 Wald/Honigtau Südamerika 5543 Wald/Honigtau Südamerika 17146 polyfloral Argentinien 3563 polyfloral Brasilien 97355 polyfloral Bulgarien 98310 polyfloral Dänemark 4301 polyfloral Mexiko 99496 polyfloral Süd-, Mittelamerika 275 polyfloral Südosteuropa 3550 polyfloral USA 98864 polyfloral USA 28746 Heide (Erika) Spanien 29204 Heide (Calluna) Deutschland 24171
Tab. 5.2.2.a: Liste der verwendeten Honigproben
5. Material und Methoden
110
110
5.2.3. Screening-Versuche
5.2.3.1. Methode: Bestimmung der Oligosaccharide Probenvorbereitung GPC
- 5 g Honig in ein Fingerglas einwiegen und in 5 ml Wasser lösen
- Lösung membranfiltrieren und 1 ml der Lösung für die GPC einsetzen
- Eluent ansetzen: 0,2 g Natriumazid in 1 l bidest. Wasser lösen
Geräte GPC
Säule: Merck Superperformance 16
Gel: Fractogel TSK HW-40 (S)
Pumpe: ProMinent Gamma/L
Detektor: Waters R 401
Fraktionssammler: LKB 17000 Minirac
Schreiber: ABB SE 120
Analysenparameter GPC
Fluss: 2 ml/min.
Fraktionierung: Reagenzglaswechsel alle 7 min.
Probenvorbereitung analytische HPLC
- Oligosaccharide in den Fraktionen 3 bis 5
- Fraktionen zusammenführen und am Rotationsverdampfer einengen
- Aufnehmen in 0,5 ml bidest. Wasser
- Lösung membranfiltrieren und 10 µl für die analytische HPLC einsetzen
- Eluent ansetzen: 5,4 ml Natronlauge 50 % und 13,6 g Natriumacetat-Trihydrat
in 1 l bidest. Wasser lösen
Geräte analytische HPLC
Säule: Dionex CarboPac PA-100
Vorsäule: CarboPac PA-100 Guard
Pumpe: Merck 655 A-11
Detektor: HP 1049A
Integrator: Merck D-2500
5. Material und Methoden
111
111
Analysenparameter analytische HPLC
Fluss: 0,8 ml/min.
Detektion: Potentiale/Pulszeiten: 0,1 V/120 ms, 0,6 V/300 ms,
-0,8 V/300 ms
Auswertung
- Die Auswertung erfolgt optisch durch den Vergleich der Chromatogramme von
Honigproben vor und nach Filtration. Näheres siehe Kap. 4.6.6.1.
5.2.3.2. weitere Untersuchungen
Farbmessung nach Pfund
- Honig in Einmalküvette füllen und gegebenenfalls Luftbläschen entfernen;
kristallisierte Honige mittels Wärme (50 °C) klären
- Kalibrierung des Kolorimeters (Lovibond-Gerät) mittels Standard-Honig
- Messung der Honigproben und Ablesen des Pfund-Wertes
IR-spektroskopische Untersuchung
- Honig auf Irtran 2-Fenster (ZnS) dünn Ausstreichen
- Scan von 500 bis 4000 nm im IR-Spektrometer
- Auswertung: Vergleich der IR-Spektren
UV-spektroskopische Untersuchung
- Honig in Quartzküvette füllen und gegebenenfalls Luftbläschen entfernen;
kristallisierte Honige mittels Wärme (50 °C) klären
- Messung der UV-Absorptionen bei 300, 420, 525, 600 und 700 nm
- Auswertung: Vergleich der Absorptionen
5. Material und Methoden
112
112
Mikroskopische Untersuchung
- 10 g Honig in 18 ml Wasser lösen
- Lösung bei 4000 U/min. 10 min. zentrifugieren, Wasser abdekantieren,
nochmals 18 ml zugegeben und nochmals zentrifugieren
- Sediment auf Objektträger geben, bei max. 40 °C trocknen und mit Deckglas
abdecken
- Untersuchung des Sedimentes unter dem Mikroskop bei 400facher
Vergrößerung
- Auswertung:
o Identifizieren möglichst aller vorhandenen Pollenarten
o Auszählen von mindestens 300 Pollen in 100er-Schritten
o wurde von Fachpersonal durchgeführt
5.2.3.3. DIN-Methoden
Leitfähigkeit: DIN 10753
pH-Wert, Säuregrad: DIN 10756
Zuckerprofil: DIN 10758
Bestimmung von HMF: DIN 10751
Bestimmung der Diastaseaktivität: DIN 10750
Bestimmung der Saccharaseaktivität: DIN 10759-1
5.2.3.4. extern durchgeführte Untersuchungen
Elementaranalysen
- durchgeführt von der Fa. Indikator, Wuppertal, mittels ICP-MS nach DIN
38406-E29
5. Material und Methoden
113
113
Flavonoide und Phenolcarbonsäuren
- durchgeführt von TRAUTVETTER et al.; Arbeitskreis Prof. Speer (TU
Dresden)
5.2.4. Methode: Bestimmung des Proteingehaltes nach Bradford
- Eichgerade mittels BSA-Standard nach folgendem Schema erstellen:
BSA-Standard [mg/ml] Volumen [µl]
Volumen Verdünnungswasser [ml]
Protein-Konz. [µg/ml]
2 40 3,16 25 2 35 3,47 20
1,5 35 3,47 15 1 35 3,47 10
0,75 35 3,47 7,5 0,5 35 3,47 5 0,25 35 3,47 2,5
0,125 35 3,47 1,25 blind 3,2 0
Tab. 5.2.4.a: Verdünnungsschritte des BSA-Standards zum Erstellen der Eichgerade
- Verdünnen der Honigprobe mit Wasser 1:40 und membranfiltrieren
- 2 ml Probe bzw. Standardlösung mit 2 ml Bradford-Färbereagenz mischen
und 5 min. bei Raumtemperatur stehen lassen
- Messung der Standards und der Proben bei 595 nm
Auswertung
- Bestimmung der Proteingehalte der Proben mittels Vergleich zu der
Eichgerade der BSA-Standards
5. Material und Methoden
114
114
5.2.5. Methode: Gelchromatographie
Probenvorbereitung
- 4 g Honig in 25 ml Wasser lösen und membranfiltrieren
- 20 ml der Lösung in Vivaspin 20 - 10.000 geben („Zentrifugalkonzentrator“)
- bei 4000 U/min. zentrifugieren und bis auf ein Restvolumen von 3 ml einengen
(Dauer abhängig von der Honigsorte, zwischen 15 und 30 min.)
- Retentat in 5 ml-Messkolben geben, zwei mal mit je 1 ml Wasser nachspülen,
Kolben bis zur Marke auffüllen und 2 ml der Lösung in die GPC einsetzen
- Eluent ansetzen: 0,1 M-Phosphatpuffer pH 6 (11,66 g KH2PO4 und 2,56 g
NaHPO4 auf 1000 ml Wasser)
Geräte
Säule: Merck Superperformance 10 (600/10)
Gel: Toyopearl HW-55S
Detektor: Merck L4250 UV-Vis
Schreiber: ABB SE 120
Analysenparameter
Flussrate: 2,5 ml/min
Wellenlänge: 280 nm
Auswertung
- Identifizierung über externe Enzymstandards und durch manuelle
Peakfraktionierung und anschließende Verifizierung mittels Einzelnachweisen
der Enzymaktivitäten
5.2.5.1. Bestimmung der Glucose-Oxidase-Aktivität
- GPC-Eluat abnehmen und etwas Glucose zugeben, ca. 5 min. warten
- Peroxid-Teststäbchen für 1 sek. in wässrige Lösung eintauchen,
überschüssige Flüssigkeit ablaufen lassen
- Nach 15 sek. Farbveränderung beobachten
- Auswertung: Blaufärbung zeigt Glucose-Oxidase-Aktivität an
5. Material und Methoden
115
115
5.2.6. Methode: Elektrophoretische Untersuchung
Probenvorbereitung
- Saccharasefraktion mittels Zentrifugalkonzentrator (s.o.) auf 0,6 ml einengen,
Retentat in 1 ml-Messkolben geben, zweimal mit je 0,2 ml Wasser nachspülen
und Kolben bis zur Marke auffüllen
- 100 µl des Konzentrates mit 50 µl Roti-Load 1 versetzen, mittels Vortex-
Mischer homogenisieren
- 5 min. auf 95 °C erhitzen, abkühlen lassen und Lösung zur Elektrophorese
einsetzen
- 10 µl Roti-Mark Standard in eine und 20 µl der Probenlösungen in weitere Gel-
Taschen auftragen (Ready Gel 4 - 20 % Tris HCl)
- Pufferlösung ansetzen: 30 ml 10x Tris/Glycin/SDS-Puffer mit 270 ml bidest.
Wasser mischen
Geräte
Elektrophoresekammer: Bio-Rad MiniProtean III Cell
Spannungsquelle: Bio-Rad Power Pac 300 Power Supply
Analysenparameter
Spannung: 200 V
Dauer: 45 min.
Gelfärbung
- nach Abschluss der Elektrophorese das Gel für 15 min. in Fixierlösung geben
(40 ml Methanol + 10 ml Eisessig + 50 ml bidest. Wasser)
- Gel 2 h mit Coomassie-Lösung färben (Rotiphorese Blau R)
- anschließend zum Entfärbevorgang Gel 3 h in die Fixierlösung geben
- frisch entfärbtes Gel auf Leuchtpult auflegen und mit CCD-Kamera
fotografieren
Auswertung
- Auswertung des Gelbildes mittels Gelscan 5.1 (siehe Kap. 4.7.3.4.)
5. Material und Methoden
116
116
5.2.7. Methodenvalidierung
Reproduzierbarkeit
- elektrophoretische Untersuchung zweier ungefilterter Honige mit
unterschiedlichen Saccharaseaktivitäten
- Auswertung des DID und Berechnung der Standardabweichungen
Farbdichtewerte des DID Banden- Probe Aufarbeitung 40 kDa 65 kDa verhältnis Akazie 1 1860 592 3,1 (97736) 2 1772 520 3,4
3 1750 621 2,8 4 1995 680 2,9
Standardabweichung +/- 111 = 6,0 % +/- 66 = 11 % Wald 1 4420 1580 2,8
(3558) 2 4115 1871 2,2 3 4831 1617 3,0 4 4098 1639 2,5
Standardabweichung +/- 343 = 7,9 % +/- 132 = 8,2 %
Tab. 5.2.7.b: Bestimmung der Reproduzierbarkeit
Linearität
- elektrophoretische Untersuchung ungefilterter und gefilterter Honige
- Zumischungen von 25, 50 und 75 % je eines gefilterten Honigs zu je einem
ungefilterten Honig und elektrophoretische Untersuchung der Mischungen
- Auswertung des DID
A B Verhältnis 40 kDa- zu 65 kDa-Bande bei
Zumischungsverhältnis von B zu A Probe
ungefiltert Probe gefiltert 0% 25% 50% 75% 100% Korrelations-koeffizient
Akazie polyfloral 3,1 9,4 13,6 24,6 35,4 0,98 (97736) (98865)
Klee polyfloral 2,9 10,8 13,2 29,8 35,4 0,97 (28748) (98865)
Sonnenblume polyfloral 2,2 13,0 23,9 32,1 35,4 0,98 (3552) (98865) Wald Klee 2,8 7,1 23,2 42,7 70,8 0,97
(3558) (28749) polyfloral Klee 3,2 6,2 35,4 52,3 70,8 0,98 (98864) (28749)
Tab. 5.2.7.b: Ergebnisse der Linearitätsmessungen
5. Material und Methoden
117
117
Robustheit - Aufkonzentrierungen der Saccharasefraktionen
- GPC von ungefilterter Honige und Aufkonzentrierung der Saccharasefraktion
- Verdünnungen aus Konzentrat (A) herstellen:
B 0,1 ml A + 0,1 ml bidest. Wasser
C 0,1 ml B + 0,1 ml bidest. Wasser
D 0,1 ml C + 0,1 ml bidest. Wasser
E 0,1 ml D + 0,1 ml bidest. Wasser
- elektrophoretische Untersuchung der Proben und Auswertung des DID
Bandenverhältnis 40 kDa zu 65 kDa Honig A B C D E Klee 2,9 3,2 2,5 2,9 2,7
(28748) Wald 2,8 2,8 3,3 3,2 2,8
(3558) polyfloral 3,2 3,5 3,4 2,7 3,4 (98864)
Tab. 5.2.7.c: Ergebnisse der Messungen zur Bestimmung der Robustheit
5. Material und Methoden
7. Literatur 118
118
7. Literatur ALISSANDRAKIS, E.; TARANTILIS, P. A.; HARIZANIS, P. C.; POLISSIOU, M.
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Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter
und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die
aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche
kenntlich gemacht. Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in
gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Die vorliegende Arbeit wurde unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. K. Speer (TU
Dresden, Professur für Spezielle Lebensmittelchemie/Lebensmittelproduktion) in der
Zeit von April 2004 bis Dezember 2007 bei der Firma Quality Services International
GmbH in Bremen angefertigt.