Epidemiologie der Resistenzmechanismen gegen Makrolid ...

Aus der Abteilung fur Medizinische Mikrobiologie

der Ruhr-Universitat Bochum

Leiter: Prof. Dr. med S. G. Gatermann

Epidemiologie der Resistenzmechanismen gegen

Makrolid-Lincosamid-Streptogramin B - Antibiotika

bei koagulasenegativen Staphylokokken

Inaugural Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultat

der Ruhr-Universitat Bochum

vorgelegt von

Tanja Christina Koschinski

aus Bochum

2006

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

Referent: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann

Koreferent: Prof. Dr. rer. nat. H.-J. Streckert

Tag der Mundlichen Prufung: 17.04.2007

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

1.1 Koagulasenegative Staphylokokken (CNS) als Gruppe im Genus Staphy-

lococcus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.1 Die Infektion des Menschen mit CNS . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.2 Die allgemeine Resistenzsituation von CNS . . . . . . . . . . . . 2

1.2 MLSB-Resistenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2.1 Beschreibung der Wirkungsweise von MLSB-Antibiotika . . . . . 3

1.2.2 Resistenzgene und Resistenzmechanismen . . . . . . . . . . . . 4

1.2.3 Resistenzmuster . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.2.4 Resistenzplasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.3 Oxacillin-Resistenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.4 Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2 Material und Methoden 10

2.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.1.1 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.1.2 Antibiotika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.1.3 Stamme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.1.4 Kulturbedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.1.5 Spezielle Kulturmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.2.1 Biochemische Differenzierungsmethoden . . . . . . . . . . . . . 12

2.2.2 Resistenzbestimmungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.2.3 Detektion der Resistenzgene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.2.4 Herstellung Clindamycin-resistenter Mutanten . . . . . . . . . . 14

2.2.5 Differenzierung der CNS durch sodA-Gen-Sequenzierung . . . . 15

2.2.6 Uberprufung der Oxacillin-Resistenz durch mecA-PCR . . . . . 16

3 Ergebnisse 18

3.1 Epidemiologie koagulasenegativer Staphylokokken . . . . . . . . . . . . 18

3.1.1 Bestimmung der Spezies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.1.2 Bestimmung der MLSB-Resistenz koagulasenegativer Staphylo-

kokken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

3.1.3 Bestimmung des Phanotyps der Resistenz bei bestehender MLSB-

Resistenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

3.1.4 Clindamycin-resistente-Mutanten . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.1.5 Verteilungsmuster der Resistenzgene bei MLSB-resistenten

Stammen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22i

3.1.6 Korrelation konstitutiver oder induzierbarer MLSB-Resistenz zu

den ermittelten Resistenzgenen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.1.7 Spezies-spezifische Verteilung der Resistenzgene . . . . . . . . . 24

3.1.8 Spezies-spezifische Verteilung der phanotypischen Auspragung

der Resistenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.2 Oxacillin-Resistenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.2.1 Oxacillin-Resistenz in Abhangigkeit von der Spezies . . . . . . . 26

3.2.2 Korrelation zwischen Oxacillin- und Erythromycin-Resistenz . . 26

3.2.3 Phanotypische Auspragung der Oxacillinresistenz . . . . . . . . 27

3.2.4 Korrelation zwischen Oxacillin-Resistenz und Resistenzgenen . . 28

4 Diskussion 29

4.1 Wie ist die Verteilung der Spezies bei koagulasenegativen Staphylokokken? 29

4.2 Wie haufig ist Erythromycinresistenz bei CNS? . . . . . . . . . . . . . 29

4.3 Wie ist die phanotypische Verteilung der Resistenz? . . . . . . . . . . . 30

4.3.1 Herstellung Clindamycin-resistenter Mutanten . . . . . . . . . . 31

4.4 Wie ist das Verteilungsmuster der Resistenzgene? . . . . . . . . . . . . 32

4.5 Wie ist die Korrelation zwischen Phanotyp und Resistenzgen? . . . . . 32

4.6 Wie haufig ist die Oxacillin-Resistenz bei CNS allgemein und bei den

einzelnen Spezies? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

4.7 Wie ist die Korrelation zwischen Erythromycin- und Oxacillin-Resistenz,

sowie die phanoytypische Verteilung? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

4.8 Wie haufig ist die isolierte Lincomycin-Resistenz? . . . . . . . . . . . . 34

4.9 Fazit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

5 Zusammenfassung 36

Literatur 37

ii

Abbildungsverzeichnis

1 Translation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2 Stem-Loop-Struktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

3 Agardiffusionstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4 Nachweis von PCR-Produkten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

5 Zeitliche Entwicklung der Erythromycinresistenz . . . . . . . . . . . . . 30

Tabellenverzeichnis

1 Resistenzgene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2 Primer der PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3 Primer der sod -Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4 Primer der mecA-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

5 Verteilung der Spezies koagulasenegativer Staphylokokken vor sodA-

Gen-Differenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

6 Verteilung der Spezies koagulasenegativer Staphylokokken nach sodA-

Gen-Differenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

7 Ergebnis des Agardiffusionstestes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

8 Verteilung der Resistenzgene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

9 Phanotyp der Clindamycinresistenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

10 Verteilung der Resistenzgene in Abhangigkeit von der Spezies . . . . . 24

11 Verteilung der phanotypischen Resistenz in Abhangigkeit von der Spezies 25

12 Oxacillin-Resistenz in Abhangigkeit von der Spezies . . . . . . . . . . . 26

13 Korrelation zwischen Oxacillin- und Erythromycin-Resistenz . . . . . . 27

14 Phanotypische Auspragung der Oxacillinresistenz . . . . . . . . . . . . 27

15 Korrelation zwischen Oxacillin-Resistenz und Resistenzgenen . . . . . . 28

16 Referenzwerte fur den Genotyp bei koagulasenegativen Staphylokokken 33

iii

Verzeichnis der Abkurzungen

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise◦C Grad Celsius

ca. circa

CNS Koagulasenegative Staphylokokken

DNS Desoxyribonukleinsaure

EDTA Ethylendiaminotetraessigsaure

kb Kilobasenpaare

min Minute(n)

m-RNS Messenger-Ribonukleinsaure

MRSA Methicillinresistenter Staphylococcus aureus

UNK Ubernachtkultur

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PIA polysaccharide intercellular adhesin

RNS Ribonukleinsaure

sec Sekunde(n)

ssp. Subspezies

t-RNS Transfer-Ribonukleinsaure

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

iv

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Koagulasenegative Staphylokokken (CNS) als Gruppe im

Genus Staphylococcus

Die grampositiven Kokken der Gattung Staphylococcus gehoren zur Familie der Mi-

crococcaceae und sind mikroskopisch in teils unregelmassigen Haufen bzw. Trauben

gelagerte Bakterien. Sie haben einen Durchmesser von etwa 1 µm, sind unbeweglich

und nicht sporenbildend. Sie bilden Katalase und sind fakultativ anaerob [39].

Die Unterscheidung zwischen koagulasepositiven und koagulasenegativen Staphylokok-

ken (CNS) verlauft uber den Nachweis des Enzyms Koagulase und des Clumpingfak-

tors, welche beide bei CNS negativ sind. Wahrend der Hauptvertreter der koagulasepo-

sitiven Staphylokokken der haufig pathogene Staphylococcus aureus ist, zahlt man zu

den koagulasenegativen Staphylokokken vor allem die Spezies S. epidermidis, S. hae-

molyticus, S. hominis, S. saprophyticus sowie ihre Subspezies. In der Literatur werden

35 verschiedene Staphylokokken-Spezies sowie 17 Subspezies beschrieben [41].

1.1.1 Die Infektion des Menschen mit CNS

Wahrend der koagulasepositive S. aureus seit langem als pathogener Keim bekannt ist,

wurden koagulasenegative Staphylokokken als physiologische Besiedler der Haut und

Schleimhaute lange Zeit als apathogen angesehen.

In den letzten Jahren sind sie jedoch hauptsachlich als Erreger nosokomialer Infek-

tionen immer mehr in den Vordergrund geruckt. Die Infektionen sind meist endoge-

nen Ursprungs [39], die Ausbreitung einzelner Klone bei hospitalisierten Patienten ist

vereinzelt beschrieben [3, 40]. Als wichtigster Vertreter der CNS bei Infektionen ist

S. epidermidis zu nennen. Die Bildung extrazellularer Schleimsubstanz und Adharenz-

faktoren befahigt ihn zur Besiedlung von Kunststoffmaterialien. Durch die Ausbildung

eines Biofilms, vermittelt durch ein Polysaccharidadhasin (PIA), kann er so der Im-

munabwehr und Antibiotikatherapie entgehen. Daher sind als relevante Infektionen

Besiedlung von Plastikkathetern (Peritonitis bei Peritonealdialyse), zentral- und pe-

riphervenosen Zugangen, Prothesen (Osteomyelitis), Linsen (Endophthalmitis) sowie

kunstlichen Herzklappen (Endocarditis) mit entsprechender Entzundungsreaktion als

nosokomiale Infektionen zu nennen. Eine schwerwiegende Sonderstellung nimmt die

durch CNS ausgeloste Fruhgeborenensepsis ein [10, 49].

Einleitung 2

Als weitere Virulenzfaktoren einiger koagulasenegativer Staphylokokken konnen Ha-

molysine sowie Fibronektin- und Kollagen-bindende Proteine genannt werden [35]. Im

Gegensatz zu S. aureus sind bisher keine eindeutig Toxin-bedingten Erkrankungen be-

schrieben.

S. saprophyticus als weiterer haufiger Vertreter der CNS ist Verursacher von ambulant

erworbenen Harnwegsinfekten, da der Erreger durch Adhasine am Uroepithel haftet

und grosse Mengen Urease produziert. Auch S. lugdunensis nimmt als Erreger bei

schweren Endokarditiden eine bedeutsame Sonderstellung ein [45, 58].

1.1.2 Die allgemeine Resistenzsituation von CNS

Die Therapie von Infektionen mit CNS beruht in der Regel auf der Gabe von Antibio-

tika und gegebenenfalls chirurgischer Intervention.

Da Staphylokokken in der Regel eine β-Lactamase produzieren, die Penicillin G und

andere gegen das Enzym empfindliche Penicilline durch hydrolytische Spaltung des

ß-Lactamringes unwirksam macht, stellen penicillinasefeste Penicilline (wie z. B. Oxa-

cillin, Dicloxacillin, Flucloxacillin) die Therapie der Wahl dar.

Alternativ stehen Cephalosporine, sowie Antibiotika, die unter der Bezeichnung MLSB-

Antibiotika zusammengefasst werden, zur Verfugung. Die Gruppe der MLSB-Antibioti-

ka umfasst die Makrolide (z. B. Erythromycin), Lincosamide (Lincomycin, Clindamy-

cin) und Streptogramin B.

Bei Oxacillin-resistenten Staphylokokken empfiehlt sich die Gabe der Glykopeptidan-

tibiotika Vancomycin, Teicoplanin oder des Oxazolidinons Linezolid, die allerdings ab-

solute Reserveantibiotika darstellen [21].

Die aktuellen Ergebnisse der Resistenzstudie der Paul-Ehrlich-Gesellschaft [43] fur Che-

motherapie AG”Empfindlichkeitsprufung und Resistenz“ zeigten im Zeitraum von

1995 bis 2001 eine signifikante Zunahme der Resistenz der koagulasenegativen Staphy-

lokokken gegen Erythromycin sowie gegenuber Oxacillin. Eine ahnliche Entwicklung

zeigte die GENARS-Resistenzstudie von 2002 [16].

Diese Ergebnisse weisen eine erhebliche Relevanz fur die klinische Therapie auf.

Die Bedeutung koagulasenegativer Staphylokokken als Erreger nosokomialer Infektio-

nen belegt unter anderem die NIDEP-Studie von 1995 [48], die besagt, dass 8% aller

nosokomialen Infektionen durch koagulasenegative Staphylokokken verursacht werden.

Einleitung 3

1.2 MLSB-Resistenz

1.2.1 Beschreibung der Wirkungsweise von MLSB-Antibiotika

Zur Gruppe der MLSB-Antibiotika gehoren, wie bereits erwahnt, die Makrolide, Lin-

cosamide und Streptogramin B-Antibiotika.

Als gangige Makrolide sind das Erythromycin, als altestes Makrolid, sowie Roxithro-

mycin, Clarithromycin und Azithromycin zu nennen. Ihre chemische Struktur besteht

aus einem makrozyklischen Lactonring, der mit Zuckern und/oder Aminozuckern ver-

knupft ist. Die einzelnen Makrolide unterscheiden sich durch die Grosse des Lacton-

ringes sowie die Art des Zuckers [28]. Erythromycin besteht aus einem 14-gliedrigen

Lactonring, der mit den Zuckern Cladinose und Desosamin verknupft ist. Roxithro-

mycin, Clarithromycin und Azithromycin sind 14-bzw.15-gliedrige Makrolide, die, im

Gegensatz zu Erythromycin, ein breiteres Wirkspektrum, eine optimierte Pharmako-

kinetik sowie weniger Nebenwirkungen und Wechselwirkungen aufweisen.

Aufgrund dieser Vorteile stellen die neueren Makrolide in den letzten Jahren haufig

genutzte Therapeutika bei bakteriellen Infektionen dar [54].

Makrolide wirken prinzipiell bakteriostatisch durch Inhibition der bakteriellen RNS-

abhangigen Proteinsynthese. Indem sie die 50S-ribosomale Untereinheit der Bakterien

reversibel binden, bewirken sie eine Blockierung der Translokationsreaktion der Poly-

peptidverlangerung [4, 59]. Die ribosomale Bindungsstelle gilt sowohl fur Makrolide, als

auch fur die einfacher strukturierten Lincosamide und Streptogramin B-Antibiotika.

Zur Gruppe der Lincosamide sind das Lincomycin, das von Streptomyces lincolnensis

isolierte wurde, und das semisynthetische Derivat Clindamycin zu zahlen [28].

Beide Antibiotika bestehen chemisch aus einer Verbindung zwischen einem Aminozu-

cker und einer Aminosaure, wobei Clindamycin ein breiteres Wirkspektrum sowie eine

verbesserte enterale Absorption aufweist als Lincomycin.

Lincosamide inhibieren die bakterielle Proteinsynthese, da sie in den Peptidtransfer

eingreifen und so die Verlangerung der Peptidketten verhindern. Sie wirken folglich

bakteriostatisch. Die ribosomale Bindungsstelle befindet sich auch hier an der 50S-

Untereinheit (s. Abb. 1).

Einleitung 4

Abbildung 1: Translation

Die Translation umfasst die Ubersetzung einer linearen Basensequenz in die Folge von Aminosauren

eines Peptids. Dieser Vorgang besteht aus zwei Abschnitten: 1. Spezifische Wechselwirkungen eines

Codons der mRNS mit dem Anticodon der mit einer Aminosaure beladenen tRNS. 2. Ausbildung der

Peptidbindung der Aminosauren auf benachbart gelegenen AA-tRNSs (aus Kayser [20])

Streptogramin-Antibiotika wie das Dalfopristin und Quinupristin wirken synergistisch

und werden daher meist als Kombination verabreicht (Synercid R©). Wahrend Dalfo-

pristin als Streptogramin A-Komponente direkt am Peptidyl-Transferase-Zentrum bin-

det, bindet Quinupristin, die Streptogramin B-Komponente an die 50S-Untereinheit des

Ribosoms. Synercid wird vorwiegend als Reserveantibiotikum bei nosokomialen Pneu-

monien sowie Haut- und Weichteilinfektionen eingesetzt [15].

1.2.2 Resistenzgene und Resistenzmechanismen

Die Wirkweise der MLSB-Antibiotika ist trotz chemischer Unterschiede ahnlich bis

gleich. Alle binden an die 50S-ribosomale Untereinheit und inhibieren die Proteinsyn-

these der Bakterien [4].

Die MLSB-Resistenz beruht vor allem auf zusatzlichen erm-Genen (erythromycin-

resistant methylase), die fur eine 23S-rRNS-Methylase kodieren. Diese Veranderung

der rRNS verhindert eine Bindung des Antibiotikums an seine Zielstruktur [39, 25].

Diese ribosomale Methylierung fuhrt zu einer Kreuzresistenz gegen alle MLSB-Antibioti-

ka, dem sogenannten MLSB-Phanotyp.

Fur Staphylokokken sind die erm-Gene A bis C als Methylase-kodierende Gene be-

kannt, wobei das ermB-Gen sehr selten und ausschliesslich in konstitutiver Auspragung

auftritt [33, 14, 32, 59].

Das Resistenzgen msrA kodiert fur einen Resistenzmechanismus in Form einer Efflux-

Einleitung 5

pumpe, der allein gegen Makrolide gerichtet ist. Es handelt sich hierbei um eine plas-

midgebundene Resistenz gegen 14-und 15-gliedrige Makrolide [33, 47].

Bei einigen Staphylokokken findet man gelegentlich eine isolierte Resistenz gegen Linco-

mycin bei gleichzeitiger Sensibilitat gegen Erythromycin und verminderter Sensibilitat

gegen Clindamycin. Als hierfur verantwortlich gelten das linA-Gen bei koagulasenega-

tiven Staphylokokken und das linA’-Gen bei S. aureus. Beide Gene kodieren fur eine

Nucleotidyltransferase [27, 29].

Allerdings sind in der Literatur Lincomycin-resistente Isolate beschrieben, bei denen

der Nachweis des linA-Gens und linA’-Gens nicht gelang [27].

Tabelle 1: Resistenzgene

Genotyp Mechanismus Resistenzmechanismus fur:

Ery My Cl SgB

erm Modifikation des Targets R R R R

msrA Aktiver Efflux R S S Sa

linA’ Inaktivierung des Antibiotikums S R Sb S

Ery= Erythromycin; My= Lincomycin; Cl= Clindamycin; SgB= StreptograminB;

R= resistent; S= sensibel

a) Resistenz nach Induktion mit Erythromycin

b) diese Stamme erscheinen in vitro sensibel, obwohl das Enzym auch Clindamycin als Substrat

verarbeitet

1.2.3 Resistenzmuster

Man kann bei Staphylokokken drei unterschiedliche Auspragungen der phanotypischen

MLSB-Resistenz beobachten. Sie kann in konstitutiver, induzierbarer oder nicht indu-

zierbarer Form erfolgen.

Die MLSB-Antibiotika inhibieren, wie bereits erwahnt, durch Bindung an die 50S-

Untereinheit des Ribosoms, die Proteinbiosynthese. Die Resistenz gegenuber allen MLS-

B-Antibiotika erfolgt folglich uber die Methylierung der 23S rRNS am Adenin 2058,

was die Bindungsfahigkeit des Antibiotikums am Ribosom vermindert bzw. erschwert.

Bei einigen erm-Genen wird die Methylase in der Wildform nur in Anwesenheit von

Erythromycin exprimiert; die Resistenz ist folglich induzierbar.

Die Induzierbarkeit der Resistenz erklart sich uber eine Konformationsanderung der

mRNS im Bereich des Methylasegens. Vor dem Methylasegen befindet sich ein mRNS-

Bereich, der fur ein 19-Aminosauren-langes Peptid kodiert (s. Abb. 2).

Die Sequenzen dieses Leaderpeptids und die Sequenzen im Startbereich fur das Me-

thylasegen bilden gewohnlich zwei Stem-Loop-Strukturen, die die Ribosomenbindungs-

Einleitung 6

stelle fur die Methylase unzuganglich machen. Das Gen kann folglich nicht abgelesen

werden.

Abbildung 2: Stem-Loop-Struktur (modifiziert nach Leclercq [28])

Konformationsanderung der mRNA des induzierbaren ermC-Gens. Gezeigt sind SD1 und SD2, sowie

die Sequenz des Kontrollpeptids und Sequenz des Methylasegens. 1,2,3 und 4 sind inverted repeats.

Bindet aber ein Makrolid (z.B. Erythromycin) an das Ribosom, erfolgt eine Stabilisie-

rung des mRNS-Ribosom-Komplexes an der 1.Stem-Loop-Struktur mit nachfolgender

Losung der Paarung 1:2, was zur Instabilitat der Paarung 3:4 fuhrt, mit anschliessender

Assoziation zwischen den Bereichen 2 und 3.

Aufgrund dieser Konformationsanderung der mRNS wird die Ribosomenbindungsstelle

SD2 freigelegt und das Methylasegen ablesbar. Es erfolgt eine Methylierung der 23S-

rRNS mit einer Resistenzentwicklung gegen alle MLSB-Antibiotika. Lincosamide und

Streptogramin B-Antibiotika induzieren keine Resistenz [28].

Bei konstitutiver Resistenz ist aufgrund verschiedener Mutationen, Deletionen oder Du-

plikationen eine Konformationsanderung fur die Expression nicht notig [61, 34]. Diese

Stamme sind folglich immer gegen Erythromycin, Clindamycin und Streptogramin B

resistent.

Von klinischer Bedeutung ist nun, dass solche Mutationen auch unter Therapie auftre-

ten konnen und zu Therapieversagen Anlass geben [60, 61, 51].

Der msrA-Phanotyp ist immer Erythromycin-resistent sowie Clindamycin- und Lin-

comycin-sensibel. Die Unterscheidung zum erm-Phanotyp liegt in der fehlenden Indu-

zierbarkeit der Clindamycin- und Lincomycin-Resistenz [2].

Einleitung 7

Die isolierte Lincomycinresistenz bei gleichzeitiger Sensibilitat gegen Erythromycin und

verminderter Empfindlichkeit gegen Clindamycin wird meist durch das linA bzw. linA’-

Gen bedingt, welche fur eine Nucleotidyltransferase kodieren. Der Mechanismus be-

wirkt eine Inaktivierung der Lincosamide; ist aber insgesamt rar [33].

Die verschiedenen Resistenzmuster lassen sich sehr gut mit einem einfachen phanoty-

pischen Test untersuchen, bei dem drei Antibiotikatestblattchen in einem Abstand von

2 cm zueinander auf eine Resistenzplatte gelegt werden [8] (s. Abb. 3).

Es werden heute aber vermehrt automatisierte Systeme verwendet, von denen keines

einen Test auf Induktion durch geringe Konzentrationen eines Makrolides enthalt. Die-

se Methoden konnen die Empfindlichkeit gegenuber Clindamycin also nicht korrekt

vorhersagen.

Diese Arbeit soll untersuchen, wie haufig bei verschiedenen Spezies koagulasenegativer

Staphlokokken die Resistenz gegenuber Erythromycin durch ein induzierbares erm-

Gen hervorgerufen wird und wie haufig der Exportmechanismus ist. Weiterhin soll

untersucht werden, ob die gemessene Resistenz gegen Erythromycin den Genotyp aus-

reichend haufig vorhersagen kann.

1.2.4 Resistenzplasmide

Die Resistenzgene fur MLSB-Antibiotika sind auf Plasmiden oder den Chromosomen

kodiert. In der Literatur wird bei Staphylokokken ein gehauftes Vorkommen von ermC

auf Plasmiden beschrieben [34, 22]; ermA hingegen wird vorwiegend auf Chromosomen

gefunden [63, 22]. Das ermB-Gen findet sich vor allem auf Plasmiden von Streptokok-

ken [22].

1.3 Oxacillin-Resistenz

Oxacillin, das so genannte Staphylokokkenpenicillin, ist ein ß-Lactamantibiotikum aus

der Gruppe der Penicilline. Es ist penicillinasefest, saurestabil und wirkt, wie alle ß-

Lactamantibiotika, bakterizid auf proliferierende Erreger. Dies erfolgt uber eine Hem-

mung der Zellwandsynthese. Der Einsatz von Oxacillin erfolgt primar in der Therapie

von Infektionen mit Stammen die resistent gegen Penicillin G sind [21].

Auch bei Oxacillin konnte in den letzten Jahren eine Zunahme der Resistenz beobach-

tet werden [43].

Die Oxacillin-Resistenz von Staphylokokken wird durch das Penicillin-Bindeprotein

PBP2a vermittelt, welches durch das chromosomale mecA-Gen kodiert wird [38, 13].

Bei koagulasenegativen Staphylokokken ist haufiger eine Resistenz gegenuber Oxacillin

zu beobachten als bei S. aureus [43, 16].

Einleitung 8

1.4 Fragestellung

Gibt es bei koagulasenegativen Staphylokokken eine speziesspezifische Ver-

teilung der MLSB-Resistenzgene bzw. des phanotypischen Resistenzmus-

ters?

Bisherige Studien verwandten ublicherweise nur die pauschale Bezeichnung koagula-

senegative Staphylokokken (CNS), anstatt die Spezies genau zu bestimmen. Spezies-

spezifische Differenzierungen konnten somit nicht gefunden werden.

Es gibt nur wenig Ergebnisse bezuglich der MLSB-Resistenz koagulasenegativer Sta-

phylokokken, doch einige Studien belegen ein haufiges Vorkommen von Methylasen als

bedeutsamsten Resistenzmechanismus [33, 63]. Wenn man folglich davon ausgeht, dass

Erythromycin-resistente Stamme, bei konstitutiver oder induzierbarer Auspragung der

Resistenz, meistens auch Clindamycin-resistent sind, wurde dies zur generellen Vermei-

dung im Einsatz von MLSB-Antibiotika bei Erythromycinresistenz fuhren. Die Konse-

quenz ware der gesteigerte Gebrauch von Glykopeptidantibiotika.

Angesichts dieser Ausgangslage ergibt sich die Frage nach der Haufigkeit der kon-

stitutiven oder induzierbaren Resistenz bei koagulasenegativen Staphylokokken, dem

jeweiligen Genotyp sowie der speziesspezifische Verteilung.

Sollte die Exporterpumpe msrA zumindest bei einigen Spezies eine grossere Rolle spie-

len, empfiehlt sich bei automatisierten Systemen zur Testung der Resistenz ein zusatz-

licher Test auf Induzierbarkeit, um die Verwendbarkeit von Clindamycin bei Isolaten

mit bestehender Erythromycin-Resistenz und gleichzeitiger Clindamycin-Sensibilitat

vorhersagen zu konnen. Wenn aber die induzierbare Resistenz durch erm-Gene der

uberwiegende oder ausschliessliche Mechanismus ware, ware die Resistenz gegen Clin-

damycin bei allen Erythromycin-resistenten Stammen anzunehmen. Diese Situation

liegt bei S. aureus vor [9].

Einleitung 9

Folgende Fragen sollten untersucht werden:

- Wie ist die Verteilung der Spezies bei koagulasenegativen Staphylokokken?

- Wie haufig ist die Erythromycin-Resistenz bei den verschiedenen Spezies CNS?

- Wie ist die phanotypische Verteilung der Resistenz?

- Wie ist das Verteilungsmuster der Resistenzgene?

- Wie ist die Korrelation zwischen Phanotyp und Resistenzgen?

- Wie haufig ist die Oxacillin-Resistenz bei CNS und bei den einzelnen Spezies?

- Wie ist die Korrelation zwischen Erythromycin-und Oxacillin-Resistenz,

sowie die phanotypische Verteilung?

- Wie haufig ist die isolierte Lincomycin-Resistenz?

Material und Methoden 10

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Chemikalien

Alle verwendeten Chemikalien waren von hochstem Reinheitsgrad und wurden, falls

nicht anders angegeben, von den Firmen Merck Eurolab (Darmstadt) und Sigma/Aldri-

ch (Munchen) bezogen.

2.1.2 Antibiotika

Die Antibiotika-Testblattchen wurden von der Firma Oxoid bezogen und waren mit

folgenden Antibiotika-Konzentrationen beschickt: Erythromycin 15 µg, Clindamycin

10 µg, Novobiocin 5 µg, Lincomycin 15 µg. Oxacillin-Natriumsalz wurde von der Fir-

ma Sigma/Aldrich bezogen.

2.1.3 Stamme

Die verwendeten koagulasenegativen Staphylokokken dieser Arbeit waren klinische Iso-

late aus dem Institut fur Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum. Alle Stamme

wurden mit Hilfe der Gramfarbung als grampositive Kokken identifiziert, der Nach-

weis von Katalase mit H2O2 war positiv, sowie der Nachweis des Fibrinogenrezeptors

mit dem Clumpingfactor-Test (CF) negativ. Ausserdem wurden alle Isolate aus Blut-

kulturen mit dem VITEK-System (bioMerieux, Nurtingen) differenziert. Zur Kontrol-

le wurden folgende Stamme eingesetzt: S. aureus ATCC 38591 (Oxacillin-resistent),

S. aureus ATCC 25923 (Oxacillin-sensibel), S. lugdunensis (PYRase/ODC positiv),

S. haemolyticus (PYRase positiv). Die Referenzstamme entstammten der American

Type Culture Collection (ATCC, Atlanta, USA).

2.1.4 Kulturbedingungen

Die koagulasenegativen Staphylokokken-Stamme (CNS) wurden auf Blutagarplatten

(Columbia Agar-Basis mit Zusatz von 4% defibriniertem Schafsblut, beides Oxoid) an-

gezuchtet. Der Agar-Diffusionstest wurde auf Mueller-Hinton-Agarplatten (Merck) mit

einer Schichtdicke von 3,8 bis 4,2 mm durchgefuhrt.


2.1.5 Spezielle Kulturmedien

Urease-Platten: Christensens Harnstoffagar (Merck) mit Zusatz von Harnstoff

(26,6 g/l Agar) in Aqua bidest gelost (13,3 g Harnstoff auf 10 ml Aqua bidest)

Oxacillin- Screeningplatte: Mueller-Hinton Agar (Merck) mit Zusatz von 4% NaCl und

4 mg/l Oxacillin nach Ferreira et al [7]

Purple-Agar-Base: Proteose-Pepton No.3 10 g/l, Bacto Beef Extract 1 g/l, NaCl 5

g/l, Bacto Agar 15 g/l, Bromkresolpurpur 0,02 g/l in Aqua bidest gelost, zur Dif-

ferenzierung mit dem jeweiligen Zusatz von je 2,5 g/l (in 10 ml bidest) D-Mannose,

D-Trehalose, D-Mannitol, sowie Phenolphtalein-Diphosphat (0,1 g/l)

Ornithindecarboxylase-Nachweis (ODC): Fleischextrakt (Merck) 5 g/l, Pepton (Merck)

5 g/l, Dextrose (Merck) 0,5 g/l, Pyridoxal (Serva) 5 mg/l, Bromkresolpurpur 5 ml/l,

Kresolrotlosung 2,5 ml/l auf 1000 ml Aqua bidest; zur Losung 2,5 g L-Ornithinhydro-

chlorid 1% hinzufugen

Nachweis der Pyrrolidonyl-arylamidase (PYRase): Todd-Hewitt-Bouillon (Oxoid) mit

Zusatz von 0, 01% Pyrrolidonyl-b-naphthalide (Sigma), dazu PYR 10 mg/ml in Me-

thanol gelost und 0,1 ml zu 10 ml Todd-Hewitt-Bouillon gegeben; Entwicklungsreagenz

0, 5% Dimethylaminocinnamaldehyde (Sigma) in 1M HCl gelost

Tabelle 2: Primer der PCRName Primersequenz Gen Genbanknr.

ermA1 GTTCAAGAACAATCAATACAGAG ermA K02987

ermA2 GGATCAGGAAAAGGACATTTTAC

ermB1 CCGTTTACGAAATTGGAACAGG ermB U35228

ermB2 GAATCGAGACTTGAGTGTGC

ermC1 GCTAATATTGTTTAAATCGTCAATTCC ermC X54338

ermC2 wie ermA2

msrA1 GGCACAATAAGAGTGTTTAAAGG msrA X52085

msrA2 AAGTTATATCATGAATAGATTGTCCTGTTReferenz: Lina et al [33]


2.2 Methoden

2.2.1 Biochemische Differenzierungsmethoden

Nachweis des Enzyms Pyrrolidonyl-arylamidase (PYR-Test)

PYR-Substrat (200 µl)wurde von einer frischen Platte des zu testenden Stammes mit

einer Ose beimpft, bis McFarland 2-3 erreicht wurde und 2 Stunden bei 37◦C inkubiert.

Anschliessend wurde 1 Tropfen des Entwicklungsreagenz hinzugefugt. Die Reaktion war

ablesbar durch Farbumschlag nach dunkelrot. Zur Kontrolle wurden S. haemolyticus

(positiv), S. lugdunensis (positiv) und S. aureus (negativ) mitgetestet.

Differenzierung durch Nachweis von Zuckerspaltung

Die Purple-Agar-Base-Platten mit dem jeweiligen Zusatz von D-Mannose oder D-

Trehalose oder D-Mannitol wurden mit einer Ose strichformig mit einer Bakteriensus-

pension der Dichte McFarland 0,5 beimpft und bei 37◦C inkubiert. Die Bebrutungszeit

betrug fur Trehalose und Mannitol 24 Stunden, fur Mannose bis zu 72 Stunden. Die

Auswertung erfolgte durch Kontrolle des Farbumschlages nach gelb.

Nachweis der Alkalischen Phosphatase

Der Nachweis erfolgte auf der Mannose-Platte, die Phenolphthalein-diphosphat ent-

hielt, durch Zugabe von 1-2 Tropfen Ammoniaklosung (25%) auf ein Filterpapier im

Deckel der Platte. Auch hier war die Reaktion durch einen Farbumschlag nach rot

sichtbar.

Nachweis der Urease-Spaltung

Die Urease-Platten wurden mit einer Ose strichformig mit einer Bakteriensuspension

der Dichte McFarland 0,5 beimpft und bei 37◦C fur 24 Stunden inkubiert.

Die Reaktion erfolgte durch Farbumschlag nach rot.


Nachweis der Ornithindecarboxylase (ODC)

2 ml des Reagenz wurden mit 20 µl Bakteriensuspension in Soja-Flussigmedium be-

impft. Nach Zugabe von etwas sterilem Paraffin wurde das Reagenz 16-18 h bei 37◦C

bebrutet. Eine positive Reaktion zeigte sich durch eine Persistenz der violetten Ur-

sprungsfarbe.

2.2.2 Resistenzbestimmungen

Agar-Diffusionstest (nach DIN)

Die zu testenden Keime wurden in 2 ml physiologische NaCl entsprechend der Dichte

McFarland 0,5 eingerieben und anschliessend 10 ml physiologische NaCl mit 50 µl die-

ser Suspension beimpft. Eine Mueller-Hinton-Agar-Platte (Merck, Schichtdicke 3,8 bis

4,2 mm) wurde mit dieser Bakteriensuspension uberschichtet, uberschussige Flussig-

keit abgegossen und die Platte 30 min bei 37◦C vorinkubiert. Danach wurde die Platte

schrag gestellt, die Restflussigkeit mit einer Pasteurpipette abgesaugt, die Antibiotika-

testblattchen in einem Abstand von 2 cm zueinander aufgelegt und die Resistenzplatte

16-18 h bei 35◦C bebrutet (Agarseite unten).

Oxacillin-Screening-Test

Zur Uberprufung der Oxacillinresistenz wurden alle Stamme auf Oxacillin-Screening-

platten gegeben. Dazu wurden 10 µl einer Bakteriensuspension der Dichte McFarland

0,5 mit einer Pipettenspitze strichformig auf die Platten aufgetragen und diese dann

2 Tage bei 30◦C inkubiert. Zur Kontrolle wurden die S. aureus-Stamme ATCC 38591

(positiv) und ATCC 25923 (negativ) mitgetestet.

Die Testung erfolgte nach Vorschrift von Ferreira et al [7].

2.2.3 Detektion der Resistenzgene

Isolierung der Staphylokokken-DNA fur PCR

Eine mit je 1-2 Kolonien (von der Platte) beimpfte LB-Bouillon wurde uber Nacht

im 37◦C Schuttelbad inkubiert. 1 ml der Schuttelkultur wurden abzentrifugiert (1 min

bei 12000 xg) und den Uberstand verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml sterilem Aqua

bidest gelost (vortex). Der Vorgang wurde 2x wiederholt. Anschließend wurde das Pel-

let in 100 µl Aqua bidest gelost, 10 min bei 95◦C im Heizblock gekocht, 15 min im

Ultraschallbad beschallt und 10 min bei 18000 xg in der Biofuge 15 (Kendro) bei 4◦C

abzentrifugiert. Der Uberstand wurde in ein frisches Reaktionsgefass uberfuhrt und es


wurden 5 µl dieser DNA-Losung fur die PCR eingesetzt.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Fur einen 50 µl-Ansatz wurden 5 µl 10x PCR-Puffer, 50 pmol von jedem Primer, 10

pmol dNTPs und 1,25U Taq-Polymerase (Amersham /Pharmacia) in einem Reakti-

onsgefaß zusammenpipettiert. Dazu kamen 5 µl der DNA.

Zu jeder PCR wurde eine Negativkontrolle mit Aqua bidest angesetzt.

PCR-Cycling:

Denaturierung: 94◦C fur 5 min,

Amplifizierung: 30 Zyklen,

Denaturierung bei 94◦C fur 30 sec,

Primerbindung bei 55◦C fur 30 sec,

Elongation bei 72◦C fur 30 sec,

Elongation: bei 72◦C fur 7 Minuten.

Agarose-Gelelektrophorese von DNA

Die gelelektrophoretische Auftrennung erfolgte auf einem 1, 2%-igen Agarosegel in ei-

ner horizontalen Elektrophoresekammer bei einer konstanten Spannung von 10 V/ cm.

Als Elektrophorespuffer wurde 0,5x TAE-Puffer (20 mM Tris-acetat, 0,5 mM EDTA)

verwendet.

Je 5 µl der PCR-Proben wurden vor der Auftragung mit 5 µl Stopp-Mix (10% Glyce-

rin, 0, 05% Bromphenolblau) versetzt. Auf jedes Gel wurde zur Großenbestimmung ein

1 kb-DNA-Leiter (Invitrogen) aufgetragen. Zur Detektion der DNA unter UV-Licht

(254 nm) wurde das Gel zuvor in einer Ethidiumbromidlosung (2 µg/ml) 5-10 min

bei Raumtemperatur gefarbt. Die gefarbten Agarosegele wurden mit dem MultiImager

(Bio Rad) fotografiert.

2.2.4 Herstellung Clindamycin-resistenter Mutanten

Sechs S. epidermidis-Stamme mit induzierbarer MLSB-Resistenz und dem ermC-Gen

wurden auf einer Blutplatte frisch ausgestrichen und uber Nacht bei 37◦C inkubiert.

Dann wurden 5 ml einer Mueller-Hinton-Bouillon mit je einer Kolonie beimpft und

uber Nacht (12-16 Stunden) bei 37◦C inkubiert. 50 µl der Ubernachtkultur wurden

auf Mueller-Hinton-Platten mit Clindamycin (je 8, 16, 32 mg/l) ausgestrichen und bei


37◦C inkubiert. Die Beurteilung erfolgte nach 24 und 48 Stunden. Zur Kontrolle erfolg-

te ein Agardiffusionstest mit Erythromycin und Clindamycin (im Abstand von 2 cm)

von Mutanten und Wildstamm.

2.2.5 Differenzierung der CNS durch sodA-Gen-Sequenzierung

Samtliche zu bestimmende Stamme wurden auf Blutplatten frisch ausgestrichen und

uber Nacht bei 37◦C inkubiert. Die Isolierung der Staphylokokken-DNA erfolgte wie

gewohnt (s.o.).

PCR: Amplifizierung mit degenerierten Primern sodA-d1 und d2

Volumen: 50 µl (150 ng DNA, 0,5 µm jedes Primers, 200 µm Deoxynucleosid Tri-

phosphat, 1U Taq-Polymerase in PCR-Puffer (10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1,5mM

MgCl2)

Denaturierung: 3 min. bei 95◦C,

Amplifizierung: 30 Zyklen,

Annealing: 60 sec bei 37◦C,

Elongation: 45 sec bei 72◦C,

Denaturierung: 30 sec bei 95◦C.

Elektrophorese des PCR-Produktes in 1% Agarose-Gel mit Ethidiumbromid (s.o.) zur

Kontrolle.

Aufreinigung der PCR-Produkte

Die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte mit dem Applichem DNA Isolation-Kit

nach Vorschrift des Herstellers Applichem (Darmstadt).

Es wurden 50 µl der PCR mit 250µl Puffer PB (Qiagen) gemischt, dazu wurden 5µl

der gut aufgeschuttelten Glasmilch gegeben. Nach vorsichtigem Mischen wurde das

Glasmilchpellet abzentrifugiert und der Uberstand entfernt. Nach Zugabe von 250 µl

Waschpuffer wurde erneut zentrifugiert und der Uberstand entfernt. Das Glasmilch-

pellet wurde 3mal mit Waschpuffer gewaschen, der Uberstand jeweils verworfen. Die

DNA wurde eluiert durch Mischen der getrockneten Glasmilch mit 20 µl 10mM Tris

pH 7,5 mit anschliessender Inkubation bei 55◦C fur 5 min und Abzentrifugation. Der

Elutionsschritt wurde wiederholt und beide Uberstande vereinigt.


Sequenzierung der PCR-Produkte

Die Sequenzierung erfolgte im automatischen Sequenzer LICOR der Firma MWG Bio-

tech mit 5’ IRD-800 markierten sod -Primern (MWG Biotech) unter Verwendung des

SequiTherm EXCEL II Kit (Biozym) nach Vorschrift des Herstellers. In die Reaktion

wurden 130 ng/kb der gereinigten Plasmid-DNS eingesetzt. Die Auswertung der Se-

quenzdaten erfolgte mit dem BLAST-Programm (Basic Local Alignment Search Tool)

des National Center for Biotechnologie Information (NCBI).

Tabelle 3: Primer der sod-Sequenzierung

Gen Gensequenz Referenz

d1 CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARC Poyart, Quesne et al [44],

2001

d2 ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRT Poyart

2.2.6 Uberprufung der Oxacillin-Resistenz durch mecA-PCR

Bei allen fraglich Oxacillin-resistenten Stammen erfolgte die Anzuchtung im LB-Medi-

um. 100 µl der UNK wurden 2 min bei 12000 xg zentrifugiert und das Pellet ansch-

liessend in 100 µl Lysispuffer (10mM Tris-HCL, pH 8,0, 1mM EDTA, 1% Triton X100,

0,5% Tween 20) suspendiert. Nach 10 min Kochen wurde das Gemisch erneut fur 2

min bei 12000 xg zentrifugiert. Es wurden 5 µl fur die PCR eingesetzt.

Volumen: 50 µl (150 ng DNA, 0,5 µm jedes Primers, 200 µm Deoxynucleosid Triphos-

phat, 1U Taq-Polymerase in PCR-Puffer (10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1,5mM MgCl2)

PCR-Cycling:

Pre-PCR: 7 min bei 95◦C,

Cycling: 30 Zyklen

- 30 sec bei 95◦C,

- 30 sec bei 55◦C,

- 40 sec bei 72◦C,

Post-PCR: 7 min bei 72◦C


Tabelle 4: Primer der mecA-PCRGen Gensequenz Referenz

mecA3 GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA Kobayashi et al [26],

1994

mecA4 CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA [26]

femB1 TTACAGAGTTAACTGTTACC [26]

femB2 ATACAAATCCAGCACGCTCT [26]

Elektrophorese des PCR-Produktes in 0, 8% Agarose-Gel mit Ethidiumbromid (s.o.)

zur Kontrolle.

Bei allen Oxacillin-resistenten Stammen konnte ein 533 bp-Stuck aus dem mecA-

Gen nachgewiesen werden. Der Nachweis des femB1/femB2-Gens erfolgte als Kontrolle

(femA/femB lassen sich in S. aureus nachweisen, nicht aber in CNS).

Ergebnisse 18

3 Ergebnisse

Von Marz bis Oktober 2003 wurden 500 Isolate koagulasenegativer Staphylokokken ge-

sammelt. Alle Stamme stammten aus dem Institut fur Medizinische Mikrobiologie der

Stadt Bochum, das seine Untersuchungsmaterialien aus den Kliniken im Raum Bochum

und Umgebung erhalt. Ein hohes Patientenaufkommen, sowie ein breites Spektrum an

Grunderkrankungen war gegeben, da es sich vorwiegend um Universitatskliniken oder

akademische Lehrkrankenhauser handelt. Alle Isolate wurden im Vorfeld als koagulase-

negative Staphylokokken identifiziert.

3.1 Epidemiologie koagulasenegativer Staphylokokken

3.1.1 Bestimmung der Spezies

Alle koagulasenegativen Staphylokokken wurden mittels biochemischer Testverfahren

[5] (s. Kapitel 2) differenziert. Die Untersuchung zeigte S. epidermidis als haufigsten

Vertreter, sowie ein haufiges Auftreten von S. warneri, S. haemolyticus und S. lug-

dunensis (siehe Tabelle 5). Bei 25 Stammen konnte die Spezies mittels biochemischer

Testverfahren nicht eindeutig bestimmt werden; 3 Stamme wurden wegen Verunrei-

nigung oder nachtraglicher Testung als nicht-koagulasenegativ aus der Wertung ge-

nommen. Ausserdem stand die hohe Anzahl an S. warneri in Kontrast zu anderen

Studien [24, 17, 1] und erschien somit zweifelhaft. Folglich wurden 44 Stamme mittels

der Sequenzierung des sodA-Gens [44], welches fur eine Superoxid-Dismutase kodiert,

nachdifferenziert.

Die Verteilung der Spezies nach sodA-Gen-Sequenzierung zeigte nach wie vor S. epi-

dermidis als haufigsten Vertreter, sowie S. haemolyticus und S. lugdunensis als haufige

Spezies.

S. warneri allerdings war nach sodA-Gen-Differenzierung nur in geringer Anzahl vor-

handen, dafur konnte S. hominis ssp. hominis gehauft nachgewiesen werden (siehe

Tabelle 6).

Ergebnisse 19

Tabelle 5: Verteilung der Spezies koagulasenegativer Staphylokokken vor

sodA-Gen-Differenzierung

Spezies Anzahl

S. epidermidis 327

S. warneri 43

S. haemolyticus 52

S. lugdunensis 10

S. hominis ssp. hominis 5

S. hominis ssp. novobiosepticus 3

S. caprae 7

S. simulans 6

S. capitis 5

S. saprophyticus 4

S. cohnii 5

S. xylosus 4

S. chromogenes 1

nicht bestimmbar 25

verunreinigt/fehlend/keine CNS 3

Gesamtanzahl 500

3.1.2 Bestimmung der MLSB-Resistenz koagulasenegativer Staphylokok-

ken

Bei allen 500 vorliegenden Isolaten wurden nach Anzuchtung auf Blutagarplatten ein

Agardiffusionstest mit Antibiotikatestblattchen fur Erythromycin, Clindamycin und

Lincomycin durchgefuhrt.

Von den 500 untersuchten Stammen waren 189 Stamme sensibel gegen alle untersuch-

ten Antibiotika, wahrend 305 resistent gegen Erythromycin waren. Davon waren 233

auch resistent gegen Clindamycin und Lincomycin und 72 Stamme Clindamycin und

Lincomycin sensibel.

Nur 3 Stamme waren isoliert Lincomycin-resistent (s. Tabelle 7).

3.1.3 Bestimmung des Phanotyps der Resistenz bei bestehender MLSB-

Resistenz

Wie bereits in der Einleitung unter 1.2.3 beschrieben, kann die Auspragung der Resis-

tenz in induzierbarer oder konstitutiver Form erfolgen. Diese Form lasst sich mit Hilfe

des Agardiffusionstestes unter Anordnung der Antibiotikatestblattchen in bestimmter

Ergebnisse 20

Tabelle 6: Verteilung der Spezies koagulasenegativer Staphylokokken nach

sodA-Gen-Differenzierung

Spezies Anzahl

S. epidermidis 333

S. warneri 9

S. haemolyticus 59

S. lugdunensis 15

S. hominis ssp. hominis 37

S. hominis ssp. novobiosepticus 5

S. caprae 7

S. simulans 6

S. capitis 5

S. saprophyticus 2

S. cohnii 5

S. xylosus 4

S. chromogenes 1

S. sciuri 3

S. schleiferi 3

fehlend/keine CNS 6

Gesamtanzahl 500

Abfolge und definiertem Abstand feststellen.

Erythromycin- und Clindamycintestblattchen werden in einem Abstand von etwa 2 cm

auf den Agar aufgelegt. Anhand der charakteristischen Ausbildung der Hemmhofform

lasst sich eine klare Aussage uber das Vorliegen einer induzierbaren oder konstitutiven

Resistenz treffen [8] (s. Abbildung 3).

Ergebnisse 21

Tabelle 7: Ergebnis des Agardiffusionstestes

untersuchte Stamme 494

Erythromycin-resistent 305

Clindamycin-resistent (konstitutiv) 155

Clindamycin-resistent (induzierbar) 78

Resistenz nicht induzierbar 72

nur Lincomycin-resistent 3

Abbildung 3: Phanotypische Auspragung des Agardiffusionstest

Darstellung der Hemmhofform bei konstitutiver (A), induzierter (B) und nicht-induzierbarer

Clindamycin-Resistenz (C). Abbildung D zeigt die isolierte Lincomycinresistenz.

Antibiotikaplattchen: links Lincomycin, mittig Erythromycin und rechts Clindamycin.

Von den vorliegenden 233 Erythromycin- und Clindamycin resistenten Stammen be-

stand bei 78 Stammen eine induzierbare, hingegen bei 155 Stammen eine konstitutive

Resistenz.

Bei 72 Stammen konnte die Resistenz gegen Clindamycin nicht induziert werden. Auf-

grund dessen muss man hier von einer Resistenz ausgehen, die durch eine msrA-kodierte

Effluxpumpe bedingt ist [33, 56]. Diese konnte letzlich bei allen 72 Stammen durch eine

Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) bestatigt werden.

3.1.4 Clindamycin-resistente-Mutanten

Die Herstellung von Clindamycin-Mutanten wurde nur mit S. epidermidis-Stammen,

als Hauptvertreter der koagulasenegativen Staphylokokken durchgefuhrt. Alle diese

Stamme besaßen bei induzierbarer MLSB-Resistenz das ermC-Gen.

Nach Inkubation bei 37◦C mit jeweils 8, 16 bzw. 32 mg/l Clindamycin wurde nach 24

und 48 Stunden die Anzahl der Kolonien beurteilt. Eine reprasentative Auswahl wurde

anschliessend im Agardiffusionstest mit Erythromycin und Clindamycin getestet. Es

konnte bei allen untersuchten Stammen eine Mutation von induzierbarer Resistenz zu

konstitutiver Resistenz beobachtet werden.

Ergebnisse 22

3.1.5 Verteilungsmuster der Resistenzgene bei MLSB-resistenten

Stammen

Bei koagulasenegativen Staphylokokken finden sich folgende Resistenzgene:

- ermA, ermB und ermC kodieren eine Methylase

- msrA kodiert eine Effluxpumpe fur Erythromycin

Die Bestimmung der Resistenzgene erfolgte fur ermA, ermB, ermC, sowie, auch wenn

schon an der Konfiguration der Hemmhofe ablesbar, auch fur msrA. Bei Vorliegen ei-

ner Erythromycin-Resistenz wurden grundsatzlich alle Gene getestet.

Die Gene wurden mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mit geeigneten Primern

von 305 Erythromycin-resistenten Isolaten ermittelt. Der Nachweis der PCR-Produkte

erfolgte auf einem Agarosegel (s. Abbildung 4). Durch die Amplifikation mit samtli-

chen Primern konnte so ein 421 bp-Stuck aus dem ermA-Gen, ein 359 bp-Stuck aus

dem ermB-Gen, ein 572 bp-Stuck aus dem ermC-Gen, sowie ein 940 bp-Stuck aus dem

msrA-Gen nachgewiesen werden [33, 23].

Abbildung 4: Nachweis von PCR-Produkten auf einem Agarosegel

Die PCR-Produkte von ermA mit 421 bp, ermC mit 572 bp, msrA mit 940 bp, sowie ermB mit 359

bp werden wie oben bezeichnet (mit jeweils einer Negativkontrolle (Aqua bidest)) dargestellt. Std

zeigt den 1kb-Leiter (Gibco) als Standard-Marker.

Ergebnisse 23

Tabelle 8: Verteilung der Resistenzgene

Erythromycin resist. ermA ermB ermC msrA ermA + msrA +

Stamme ermC ermC

305 16 7 200 72 1 9

prozentualer Anteil (5, 2%) (2, 3%) (65, 6%) (23, 6%) (0, 3%) (3, 0%)

Bei allen Stammen, die Erythromycin-resistent waren und bei denen gleichzeitig eine

konstitutive oder induzierbare Clindamycin-Resistenz vorlag, konnte der Nachweis von

ermA, ermB oder ermC erbracht werden. Die ermB-Gene, sowie Genkombinationen

lagen ausschliesslich als konstitutiver Phanotyp vor.

Alle Stamme, die Erythromycin-resistent waren, bei denen aber keine Induzierbarkeit

der Clindamycin-Resistenz vorlag, konnten als msrA-Genotyp identifiziert werden.

Fur die drei isoliert Lincomycin-resistenten Stamme wurde das linA-Gen als einzig

hierfur bekannter Resistenzmechanismus angenommen [2].

3.1.6 Korrelation konstitutiver oder induzierbarer MLSB-Resistenz zu den

ermittelten Resistenzgenen

Die Uberprufung der Verteilung der Resistenzgene in Bezug zur konstitutiven oder

induzierbaren Resistenz beim MLSB-Phanotyp ergab folgendes Verteilungsmuster (s.

Tabelle 9):

Tabelle 9: Phanotyp der Clindamycinresistenz

Gen Summe induzierbar konstitutiv nicht-induzierbar

ermA 16 4 (25%) 12 (75%) 0

ermB 7 0 7 (100%) 0

ermC 200 74 (37%) 126 (63%) 0

msrA 72 0 0 72 (100%)

msrA + ermC 9 0 9 (100%) 0

ermA + ermC 1 0 1 (100%) 0

Gesamt 305 78 (25,6%) 155 (50,8%) 72 (23,6%)

Ergebnisse 24

3.1.7 Spezies-spezifische Verteilung der Resistenzgene

Bei der relativ grossen Anzahl der Spezies der Gattung koagulasenegativer Staphylo-

kokken ergab sich die Fragestellung nach der Verteilung der Resistenzgene in Abhangig-

keit von der Spezies, die im folgenden dargestellt wird (s. Tabelle 10):

Tabelle 10: Verteilung der Resistenzgene in Abhangigkeit von der SpeziesSumme ermA ermB ermC msrA msrA + ermA +

ermC ermC

S. capitis 1 0 0 1 0 0 0

S. caprae 3 0 0 3 0 0 0

S. chromogenes 0 0 0 0 0 0 0

S. cohnii 4 0 1 3 0 0 0

S. epidermidis 208 12 1 143 46 6 0

(5,8%) (0,5%) (68,8%) (22,1%) (2,9%)

S. haemolyticus 53 2 3 29 16 3 0

(3,8%) (5,7%) (54,7%) (30,2%) (5,7%)

S. hominis 19 2 0 11 6 0 0

ssp. hominis (10,5%) (57,69%) (31,6%)

S. hominis 4 0 1 2 0 0 1

ssp. novob. (25%) (50%) (25%)

S. lugdunensis 0 0 0 0 0 0 0

S. saprophyticus 1 0 0 1 0 0 0

S. schleiferi 1 0 0 0 1 0 0

S. sciuri 0 0 0 0 0 0 0

S. simulans 4 0 0 3 1 0 0

S. warneri 5 0 0 3 2 0 0

(60%) (40%)

S. xylosus 2 0 1 1 0 0 0

Summe 305 16 7 200 72 9 1

(5,2%) (2,3%) (65,6%) (23,6%) (2,9%) (0,3%)

In der speziesspezifischen Verteilung der Resistenzgene lasst sich als auffallige Varia-

tion bei S. haemolyticus (30,2%) und S. hominis ssp. hominis (31,6%) eine hohere

Pravalenz des msrA-Gens beobachten. Ausserdem liegt bei S. hominis ssp. hominis

das ermC-Gen haufig in induzierbarer Form vor, wahrend es bei anderen Spezies meist

in konstitutiver Form vorliegt.

Ergebnisse 25

3.1.8 Spezies-spezifische Verteilung der phanotypischen Auspragung der

Resistenz

Bei der speziesspezifisch auffalligen Verteilung der Resistenzgene ist es sinnvoll, noch

einmal die phanotypische Auspragung der Resistenz in Abhangigkeit von der Spezies

zu betrachten (s. Tabelle 11).

Tabelle 11: Verteilung der phanotypischen Resistenz in Abhangigkeit von

der SpeziesSumme konstitutiv induzierbar nicht-induzierbar

S. capitis 1 1 0 0

S. caprae 3 1 2 0

S. chromogenes 0 0 0 0

S. cohnii 4 3 1 0

S. epidermidis 208 108 54 46

(51,9%) (25,9%) (22,1%)

S. haemolyticus 53 30 8 15

(56,6%) (15,1%) (28,3%)

S. hominis 19 3 10 6

ssp. hominis (15,7%) (52,6%) (31,6%)

S. hominis 4 4 0 0

ssp. novob.

S. lugdunensis 0 0 0 0

S. saprophyticus 1 0 1 0

S. schleiferi 1 0 0 1

S. sciuri 0 0 0 0

S. simulans 4 2 1 1

S. warneri 5 2 1 2

S. xylosus 2 2 0 0

Summe 305 155 78 72

(50,8%) (25,6%) (23,6%)

Die Verteilung der phanotypischen Auspragung der Resistenz zeigt insbesondere fur die

Spezies S. epidermidis, S. haemolyticus und S. hominis ssp. hominis eine auffallige Ver-

teilung. S. epidermidis zeigt in 51,9% eine konstitutive, in 25,9% eine induzierbare und

in 22,1% eine nicht-induzierbare Auspragung der Resistenz; S. haemolyticus in 56,6%

eine konstitutive, 15,1% eine induzierbare und 28,3% eine nicht induzierbare Form. Bei

S. hominis ssp. hominis hingegen zeigt die Verteilung eine andere Tendenz mit 15,7%

konstitutiver, 52,6% induzierbarer und 31,6% nicht-induzierbarer Auspragung.

Ergebnisse 26

3.2 Oxacillin-Resistenz

3.2.1 Oxacillin-Resistenz in Abhangigkeit von der Spezies

Da bisherige Studien eine zunehmend erhohte Oxacillin-Resistenz koagulasenegativer

Staphylokokken ergaben, wurde auch in dieser Arbeit die Oxacillin-Resistenz der vor-

liegenden Stamme in Abhangigkeit von der Spezies gepruft (s. Tabelle 12)

Tabelle 12: Oxacillin-Resistenz in Abhangigkeit von der Spezies

Stamm Summe Erythromycin- Erythromycin-

resistenz sensibilitat

S. capitis 1 (20%) 1 0

S. caprae 2 (28,6%) 2 0

S. chromogenes 1 (100%) 0 1

S. cohnii 3 (60%) 2 1

S. epidermidis 186 (55,9%) 151 35

S. haemolyticus 51 (86,4%) 48 3

S. hominis 14 (37,8%) 11 3

ssp. hominis

S. hominis 4 (80%) 4 0

ssp. novobiosepticus

S. lugdunensis 0 0 0

S. saprophyticus 0 0 0

S. schleiferi 0 0 0

S. sciuri 1 (33,3%) 0 1

S. simulans 2 (33,3%) 2 0

S. warneri 5 (55,5%) 4 1

S. xylosus 2 (50%) 2 0

Summe 272 (55,1%) 227 45

Die Oxacillin-Resistenz ist generell sehr haufig (55,1%), aber die Pravalenz ist bei ver-

schiedenen Spezies unterschiedlich. Sie ist am haufigsten bei S. haemolyticus (86,4%),

S. hominis ssp. novobiosepticus (80%), gefolgt von S. epidermidis (55,9%) und S. war-

neri (55,6%). Bei S. lugdunesis, S. schleiferi und S. saprophyticus wurde keine Oxacillin-

Resistenz gefunden.

3.2.2 Korrelation zwischen Oxacillin- und Erythromycin-Resistenz

Da bei koagulasenegativen Staphylokokken sowohl eine hohe Erythromycin-Resistenz

als auch eine hohe Oxacillin-Resistenz nachgewiesen werden konnte, soll hier einmal

Ergebnisse 27

die Korrelation der beiden Resistenzen dargestellt werden (s. Tabelle 13).

Tabelle 13: Korrelation zwischen Oxacillin- und Erythromycin-Resistenz

Erythromycin Oxacillin-R Oxacillin-S Summe

R 227 78 305

S 45 144 189

Summe 272 222 494

Von den vorliegenden 494 Stammen waren 272 Stamme Oxacillin-resistent und 222

Oxacillin-sensibel. Auffallig war, dass von den 272 Oxacillin-resistenten Stammen 227

(83, 2%) auch Erythromycin-resistent waren.

3.2.3 Phanotypische Auspragung der Oxacillinresistenz

Bei nachweislicher Korrelation von Oxacillin- und Erythromycin-Resistenz interessiert

nun noch die phanotypische Verteilung der Clindamycin-Resistenz bei gleichzeitig vor-

liegender Oxacillin-Resistenz (s. Tabelle 14).

Tabelle 14: Phanotypische Auspragung der Oxacillinresistenz

Oxacillin-resistent 272 Stamme

davon gleichzeitig Clindamycin konstitutiv resistent 138

induzierbar resistent 45

nicht induzierbar 44

sensibel 44

isoliert ohne Erythromycin-Resistenz 1

Die Ergebnisse zeigen eine hohe Pravalenz der konstitutiven Auspragung der Resistenz

bei bestehender Oxacillinresistenz (50,7%). Die induzierbare und nicht-induzierbare

Form liegen etwa gleich haufig vor (ca.16%).

Ergebnisse 28

3.2.4 Korrelation zwischen Oxacillin-Resistenz und Resistenzgenen

Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse, die zeigten, dass eine hohe Korrelation zwischen

Oxacillin- und Erythromycin-Resistenz vorliegt, soll nun noch die Korrelation zu den

Resistenzgenen uberpruft werden (s. Tabelle 15).

Tabelle 15: Korrelation zwischen Oxacillin-Resistenz und Resistenzgenen

Oxacillin ermA ermB ermC msrA msrA+ ermA+ Summe

ermC ermC

R 10 5 159 45 7 1 227

S 6 2 41 27 2 0 78

Summe 16 7 200 72 9 1 305

Es lasst sich, bis auf das haufigere Auftreten von Genkombinationen, keine Korrelation

zwischen Oxacillinresistenz und den Resistenzgenen beobachten. Die hohe Anzahl an

ermC-Genen resultiert aus der hohen Korrelation zur Erythromycinresistenz.

Diskussion 29

4 Diskussion

4.1 Wie ist die Verteilung der Spezies bei koagulasenegativen

Staphylokokken?

Um uberhaupt eine Aussage uber die speziesspezifische Verteilung der MLSB-Resis-

tenzgene treffen zu konnen erfolgte bei den vorliegenden 500 CNS-Stammen eine Be-

stimmung der Spezies mittels biochemischer Differenzierungsmethoden [5] und sodA-

Gen-Differenzierung [44] (s. Kap. 2). Es konnten 494 Stamme eindeutig als koagulase-

negative Staphylokokken identifiziert werden.

Es ergab sich ein Hauptanteil an S. epidermidis, mit 333 Stammen (66,6%), sowie ein

hoher Anteil an S. haemolyticus mit 59 Stammen (11,8%). Folgend sind S. hominis ssp.

hominis mit 37 Stammen (7,4%) und S. lugdunensis mit 15 Stammen (3%) zu nennen.

Andere Spezies wurden nur in geringer Anzahl gefunden. Bei 44 Stammen wurde eine

sodA-Gen-Sequenzierung aufgrund fragwurdiger Ergebnisse der biochemischen Diffe-

renzierung durchgefuhrt.

Eine danische Studie 1996 von Jarlov et al [17] zeigte bei 499 untersuchten koagula-

senegativen Staphylokokken vergleichbare Ergebnisse in der Differenzierung. So ergab

sich auch hier ein Hauptanteil an S. epidermidis (57,1%), sowie ein hoher Anteil an

S. hominis (12,2%) und S. haemolyticus (8,6%). Die weiteren Spezies wurden in ahn-

lich geringer Anzahl gefunden [17]. Eine andere Studie von Kleeman et al 1993 [24]

zeigte ebenfalls eine signifikant hohe Anzahl an S. epidermidis in der Differenzierung.

Allerdings zeigten sich auch in dieser Studie Schwierigkeiten in der Differenzierung ei-

niger Spezies, welche mit den ublichen Differenzierungsverfahren nicht gelost werden

konnten [24]. Dieses Problem konnten wir durch Sequenzierung des sodA-Gens umge-

hen.

Weitere Studien zeigten keine auffalligen Abweichungen von den Ergebnissen dieser

Studie [1].

4.2 Wie haufig ist Erythromycinresistenz bei CNS?

Zur Uberprufung der Haufigkeit der Erythromycin-Resistenz wurden 494 Stamme CNS

mittels Agardiffusionstest auf Erythromycinresistenz gepruft. Eine Erythromycin-Resis-

tenz fand sich in 305 Fallen (62%). Dieses Ergebnis korreliert mit Ergebnissen einer

fruheren Studie von Hamilton-Miller et al 2000 [14], welche einen Anteil Erythromycin-

resistenter Stamme von 56% bei koagulasenegativen Staphylokokken nachwies, nicht

Diskussion 30

Abbildung 5: Zeitliche Entwicklung der Erythromycinresistenz bei S. epidermidis im

mitteleuropaischen Raum (modifiziert nach Kresken et al [43]); Wert von 2004 belegt

die Ergebnisse dieser Arbeit

jedoch mit einer aktuelleren Studie von John et al 2002 [19], welche nur einen Anteil

von 35% an der Erythromycinresistenz ergab.

Insbesondere S. haemolyticus (89,8%), S. epidermidis (62,5%) und S. hominis ssp. ho-

minis (51,4%) waren Erythromycin-resistent. Bei S. lugdunensis, S. sciuri und S. chro-

mogenes hingegen wurde keine Erythromycin-Resistenz gefunden [11].

Die Paul-Ehrlich-Gesellschaft fur Chemotherapie”Empfindlichkeitsprufung und Resis-

tenz“ belegte in der PEG-Studie [43] von 2001 eine deutliche Zunahme der Erythromy-

cin-Resistenz bei S. epidermidis von 1995 (55,3%) bis 2001 (64,7%). Bei S. aureus

hingegen wurde in der gleichen Studie eine deutlich geringere Resistenzrate (ca. 25%)

gefunden. Auch belegten Hamilton-Miller et al 2000 [14] in einer Studie eine deutliche

hohere Resistenzrate gegenuber Erythromycin bei koagulasenegativen Staphylokokken

als bei S. aureus.

4.3 Wie ist die phanotypische Verteilung der Resistenz?

Der Hauptanteil der Erythromycin-resistenten Stamme zeigte eine konstitutive Aus-

pragung der Clindamycin-Resistenz (50,8%), was in Kontrast zur Studie von Hamilt-

on-Miller 2000 [14] steht, welcher nur in 25% der Falle eine konstitutive Auspragung

bei Erythromycin-resistenten Stammen vorfand, sowie Lina et al 1999 [33], welche 39%

konstitutiv-resistenter Stamme beobachteten.

Ebenso fand Schreckenberger 2004 [53] diesen Phanotyp nur bei 26-37% seiner koagulase-

Diskussion 31

negativen Staphylokokken.

Bei der konstitutiven Auspragung der Resistenz liegt eine Kreuzresistenz gegenuber

Makroliden, Lincomycin, Clindamycin und Streptogramin B vor. Bei der induzierbaren

Form ist Erythromycin resistent, wahrend die anderen Antibiotika sensibel erscheinen.

Durch die hier verwendete Form des Agardiffusionstests kann man jedoch eine indu-

zierte Clindamycin-Resistenz nachweisen.

Die isolierte Erythromycin-Resistenz ohne Induktion einer Clindamycin-Resistenz, der

msrA-Phanotyp, wird nur bei Vorliegen des msrA-Gens beobachtet.

Der induzierbare Phanotyp fand sich in in 25,6% der Falle.

Der nicht-induzierbare Phanotyp wurde in ca. 23,6% identifiziert.

Bei S. aureus findet sich in der Literatur ein 1:1 Verhaltnis zwischen konstitutivem und

induzierbarem Phanotyp [33, 18, 9]. Der msrA-Phanotyp wird nur selten beschrieben

[14, 33].

Auffallig war die speziesspezifische Verteilung der phanotypischen Auspragung der Re-

sistenz vor allem fur S. epidermidis, S. haemolyticus und S. hominis ssp. hominis.

S. epidermidis zeigte in 51,9% eine konstitutive, in 25,9% eine induzierbare und in

22,1% eine nicht-induzierbare Auspragung der Resistenz; S. haemolyticus in 56,6% ei-

ne konstitutive, in 15,1% eine induzierbare und in 28,3% eine nicht induzierbare Form.

Bei S. hominis ssp. hominis hingegen zeigte die Verteilung eine andere Tendenz mit

15,7% konstitutiver, 52,6% induzierbarer und 31,6% nicht-induzierbarer Auspragung.

Somit sind bei getesteter Erythromycinresistenz und primarer Clindamycinsensibilitat

bei S. epidermidis 46% der Stamme als Clindamycin-sensibel zu werten. Bei S. hae-

molyticus sogar 65,2% und bei S. hominis ssp. hominis 37,5%.

Bei diesen Spezies koagulasenegativer Staphylokokken lohnt also im Gegensatz zu S. au-

reus die Testung der Induzierbarkeit der Clindamycinresistenz, da in einem hohen Pro-

zentsatz Clindamycin noch als Therapeutikum eingesetzt werden kann.

4.3.1 Herstellung Clindamycin-resistenter Mutanten

Das bei S. aureus bekannte Phanomen des Therapieversagens von Clindamycin bei

bestehender Erythromycinresistenz durch Mutation von Stammen mit induzierbarer

MLSB-Resistenz zu Stammen mit konstitutiver Resistenz wurde in Studien von Siber-

ry et al 2003 [55], Drinkovic et al 2001 [6], sowie Lewis et al 2005 [31] beschrieben.

Das Prinzip dieser Mutation wurde von Schmitz et al 2002 [51] fur ermA und Werck-

enthin et al 1999 [61] fur ermC gezeigt.

Fur koagulasenegative Staphylokokken gab es bisher keine Ergebnisse bezuglich dieses

Phanomens. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit bei sechs S. epider-

midis-Stammen, bei denen eine induzierbare MLSB-Resistenz, sowie das ermC-Gen

Diskussion 32

vorlag, eine Mutation selektiert. Alle untersuchten Stamme zeigten nach Inkubation

nach 24 bzw. 48 Stunden mit unterschiedlichen Clindamycin-Dosen (s. 2.2.4) eine Mu-

tation von induzierbarer zu konstitutiver Resistenz. Folglich ist davon auszugehen, dass

der bisher nur fur S. aureus beschriebene Mechanismus auch fur koagulasenegative Sta-

phylokokken gultig ist.

4.4 Wie ist das Verteilungsmuster der Resistenzgene?

Die Erythromycinresistenz koagulasenegativer Staphylokokken wird durch das ermA-

und ermC-Gen, die fur eine Methylase kodieren, sowie durch das ermB-Gen und das

fur eine Effluxpumpe kodierende msrA-Gen verursacht. Alle Genotypen wurden mit-

tels PCR identifiziert.

Es wurde ein Hauptanteil an ermC identifiziert (65,6%), sowie ein hoher Anteil an

msrA (23,6%). Das ermA (5,3%) und ermB-Gen (2,3%), sowie Genkombinationen

(3,3%) kamen nur selten vor.

Es konnte kein Stamm gefunden werden, der Erythromycin-resistent war, aber kein

erm-Gen und kein msrA-Gen hatte. In anderen Studien konnte dieses durchaus nach-

gewiesen werden [8, 50].

Die einzige auffallige Variation in der speziesspezifischen Verteilung der Resistenzgene

war die hohere Pravalenz von msrA bei S. haemolyticus (30,2%) und S. hominis ssp.

hominis (31,6%) im Gegensatz zu S. epidermidis (22,1%).

Wie schon in anderen Studien (siehe Tabelle 15) beschrieben [33, 62, 18, 8, 36], ist

die MLSB-Resistenz meist durch ermC bedingt, was in Kontrast zu S. aureus steht,

bei dem die Resistenz etwa gleich haufig durch ermA und ermC verursacht wird

[33, 18, 8, 50, 37]. Auch die relativ geringe Anzahl an kombinierten Resistenzmecha-

nismen bei CNS steht im Gegensatz zu fruheren Studien [8, 50].

Das msrA-Gen wird bei S. aureus nur sehr selten beobachtet, ist aber bei koagulase-

neagtiven Staphylokokken haufiger anzutreffen [33, 14]. Nur eine Studie berichtet uber

ein gehauftes Vorkommen der Effluxpumpe bei S. aureus [8].

4.5 Wie ist die Korrelation zwischen Phanotyp und Resistenz-

gen?

Man kann im Allgemeinen eine erhohte Pravalenz der konstitutiven Auspragung der

Resistenz beobachten. Diese ist beim ermC-Gen mit 63 % am grossten. Dieses Ergebnis

steht in Kontrast zu Ergebnissen von S. aureus, bei dem konstitutive Resistenz vorwie-

gend durch ermA und induzierbare Resistenz durch ermC bedingt wird [33, 18, 8, 50].

Diskussion 33

Tabelle 16: Referenzwerte fur den Genotyp bei koagulasenegativen Staphy-

lokokkenStudie/Herkunftsland/ n ermA ermB ermC msrA Gen-

Jahr kombinationen

diese Arbeit,

Deutschland, 2004 305 (5,2%) (2,3%) (65,6%) (23,3%) (3,3%)

Fiebelkorn et al

USA, 2003 100 (18%) 0 (51%) (19%) (12%)

Martineau et al

Canada, 2000 114 (4,4%) 0 (51%) (5,3%) (0,3%)

Lina et al

Frankreich, 1999 150 (18%) (0,6%) (44%) (11,3%) (0,3%)

Westh et al

Danemark, 1995 58 (0,3%) 0 (75,9%) ng 0n= Anzahl der Stamme; ng= nicht genannt

Eine Ausnahme bildet S. hominis ssp. hominis, bei dem uberwiegend (90,9%) ermC

in induzierbarer Form vorliegt.

Das bei Staphylokokken seltene ermB-Gen liegt, wie auch schon in anderen Studien

beschrieben [42], ausschliesslich in konstitutiver Auspragung vor. Bei S. aureus konnte

es bislang ebenfalls nur selten beobachtet werden [50, 37, 32], wahrend es bei Strepto-

kokken und Enterokokken das haufigste Gen darstellt [52].

Das bei koagulasenegativen Staphylokokken relativ haufige msrA-Gen (23,6%) liegt

ausschliesslich als nicht-induzierbarer Phanotyp vor [56, 8]. In einigen Fallen konnte

allerdings auch bei diesem Gen eine induzierte Resistenz gegen Streptogramin B durch

Erythromycin nachgewiesen werden [46].

4.6 Wie haufig ist die Oxacillin-Resistenz bei CNS allgemein

und bei den einzelnen Spezies?

Die Oxacillin-Resistenz koagulasenegativer Staphylokokken konnte in etwa der Halfte

(55,1%) aller getesteten Stamme beobachtet werden. Diese Beobachtung korreliert in

etwa mit Ergebnissen anderer Studien, die eine zunehmende Resistenz gegenuber Oxa-

cillin (68,9%) bei S. epidermidis feststellten [43, 57]. Eine danische Studie von Jarlov

et al 1996 belegte eine Oxacillin-Resistenz von 32% bei koagulasenegativen Staphylo-

kokken [17].

Bei S. aureus hingegen wird eine zwar zunehmende, jedoch geringere Resistenzrate

beschrieben (ca. 20%) [43, 57], in anderen Studien ca. 40 % [30].

Diskussion 34

Bei koagulasenegativen Staphylokokken ist eine besonders deutliche Haufung der Oxacil-

lin-Resistenz bei S. haemolyticus (86,4%), S. hominis ssp. novobiosepticus (80%) ge-

folgt von S. epidermidis (55,9%) und S. warneri (55,6%) zu verzeichnen.

Bei S. lugdunensis, S. saprophyticus und S. schleiferi fand sich keine Oxacillinresistenz.

4.7 Wie ist die Korrelation zwischen Erythromycin- und Oxacil-

lin-Resistenz, sowie die phanoytypische Verteilung?

Wie erwartet besteht eine hohe Korrelation zwischen Erythromycinresistenz und Oxa-

cillinresistenz. Die Pravalenz der Erythromycinresistenz bei gleichzeitiger Oxacillin-

resistenz betrug 83,5%. Von den 227 Stammen, die gleichzeitig Erythromycin- und

Oxacillin-resistent waren, lagen 138 (60,1%) als konstitutiver Phanotyp, 45 (19,8%)

als induzierbarer und 44 (19,4%) als nicht-induzierbarer (msrA)-Phanotyp vor. Nur 45

(16,5%) der Oxacillin-resistenten Stamme waren Erythromycin-sensibel.

In der Literatur finden sich vergleichbare Ergebnisse. So zeigten etwa Martineau et

al 2000 [37] eine nahezu hundertprozentige Korrelation zwischen Erythromycin- und

Oxacillin-Resistenz, wobei sich die Resistenzrate von S. aureus sowohl gegenuber Ery-

thromycin als auch gegenuber Oxacillin als deutlich geringer erwies als die von S. epi-

dermidis.

4.8 Wie haufig ist die isolierte Lincomycin-Resistenz?

Als Ursache einer Lincomycinresistenz bei koagulasenegativen Staphylokokken kommen

sowohl das fur Lincosamide spezifische linA’-Gen, das fur eine Nucleotidyltransferase

kodiert [28, 33] in Frage, als auch eine konstitutive Auspragung des MLSB-Phanotyps,

der uber den Mechanismus der Kreuzresistenz ebenfalls eine Lincomycinresistenz be-

wirkt.

Bei den untersuchten 494 koagulasenegativen Staphylokokken ergab der Agardiffusi-

onstest bei 3 Stammen eine isolierte Lincomycin-Resistenz (0,6%), wahrend bei 155

(31,4%) eine konstitutive Auspragung des MLSB-Phanotyps mit gleichzeitiger Linco-

mycinresistenz vorlag.

Der zu Grunde liegende Genotyp wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht.

Der identifizierte geringe Anteil an isoliert Lincomycin-resistenten Stammen deckt sich

mit Ergebnissen vorangegangener Studien, die allerdings primar die Resistenz bei S.

aureus untersuchten. So fanden Leclercq et al [27] bei 0,2% von 2100 S. aureus-Isolaten

eine isolierte Lincomycinresistenz, kodiert durch das linA’-Gen. Lina et al [33] entdeck-

ten 1999 bei 144 S. aureus-Isolaten, die den MLSB-Phanotyp aufwiesen, einen Stamm,

Diskussion 35

der eine Kombination aus einem ermC-Gen und einem linA’-Gen aufwies. Generell

wird die isolierte Lincomycinresistenz als Raritat angesehen [27, 9].

4.9 Fazit

In der abschließenden Betrachtung zeigt sich Spezies-spezifisch fur S. epidermidis,

S. hominis ssp. hominis und S. haemolyticus eine gehaufte Erythromycinresistenz.

S. lugdunensis hingegen ist immer Erythromycin-sensibel. Die Testung der Oxacillin-

resistenz ergab eine nahezu identische Verteilung.

Bei der Analyse der Resistenzgene zeigten S. epidermidis, S. hominis ssp. hominis und

S. haemolyticus haufig msrA als einzigen Resistenzmechanismus. Ausserdem bestatigte

sich im Disk-Annaherungstest (D-Test) bei diesen Spezies eine z. T. uber 50-prozentige

Clindamycin-Sensibilitat bei gleichzeitiger Erythromycin-Resistenz. Insbesondere bei

diesen haufig multiresistenten Spezies mit limitierten Therapieoptionen kommt somit

diesem Verfahren eine hohe klinische Relevanz zu, da Clindamycin in etwa der Halfte

der Falle als Therapeutikum eingesetzt werden kann. Folglich sollte bei diesen Spezies

bei Bedarf eine zusatzliche Testung auf Induzierbarkeit der Clindamycinresistenz er-

folgen.

Zusammenfassung 36

5 Zusammenfassung

Koagulasenegative Staphylokokken sind in den letzten Jahren als Erreger nosokomia-

ler Infektionen in den Vordergrund geruckt, nachdem sie jahrelang als physiologische

Besiedler von Haut und Schleimhauten als apathogen angesehen wurden.

Bei einer zunehmenden Resistenzlage gegenuber MLSB-Antibiotika und nur unzurei-

chend erforschten Mechanismen der Resistenz erschien eine Untersuchung der Resis-

tenzsituation examplarisch am Ruhrgebiet angebracht.

Die aus 494 klinischen Isolaten gewonnen epidemiologischen Daten bestatigten die in

vorherigen Studien beschriebene Verteilung der Spezies koagulasenegativer Staphylo-

kokken, sowie einen Anstieg der Erythromycin-und Oxacillinresistenz. Die Ergebnisse

zur phanotypischen Verteilung der Resistenz hingegen standen in Kontrast zu fruheren

Studien. Die Verteilung der Resistenzgene und des Phanotyps unterschied sich deutlich

von der von Staphylococcus aureus.

Wahrend bei S. aureus die Erythromycinresistenz praktisch ausschließlich von den Me-

thylasen ermA und ermC verursacht wird und somit regelmaßig zur Entwicklung von

Clindamycinresistenz unter Therapie Anlass gibt, liegt bei koagulasenegativen Staphy-

lokokken auch das Resistenzgen msrA in der Haufigkeit bis zu 30% vor.

Die Daten dieser Arbeit belegten eine Clindamycinsensibilitat bei S. epidermidis und

S. hominis ssp. hominis in nahezu der Halfte der getesteten Isolate; bei S. haemolyticus

zeigten sich sogar 65% der Erythromycin-resistenten Isolate Clindamycin-sensibel.

Im Vergleich zu S. aureus kann somit bei koagulasenegativen Staphylokokken das Tes-

tergebnis von Erythromycin nicht ohne weiteres auf die Verwendbarkeit von Clinda-

mycin ubertragen werden [12].

Diese Studie zeigt die klinische Relevanz des D-Tests bei Erythromycinresistenz und

primarer Clindamycinsensibilitat in automatisierten Testverfahren. Es kann davon aus-

gegangen werden, dass bei den beschriebenen Spezies koagulasenegativer Staphylokok-

ken uber 50 Prozent der mit dieser Methode getesteten Isolate einer Clindamycinthe-

rapie zuganglich sind.

Gerade bei Spezies mit sehr eingeschrankten Therapieoptionen aufgrund multipler Re-

sistenzen gegenuber Antibiotika kann somit eine wertvolle Therapieoption erhalten

werden.

Literaturverzeichnis 37

Literatur

[1] Boisson, K., Thouverez, M., Talon, D., Bertrand, X. (2002).

Characterisation of coagulase-negative staphylococci isolated from blood infecti-

ons: incidence, susceptibility to glycopeptides, and molecular epidemiology.

Eur J Clin Microbiol Infect Dis 21(9), 660 – 665.

[2] Brisson-Noel, A., Delrieu, P., Samain, D., Courvalin, P. (1988).

Inactivation of lincosaminide antibiotics in Staphylococcus. Identification of linco-

saminide O-nucleotidyltransferases and comparison of the corresponding resistance

genes.

J Biol Chem 263(31), 15880 – 15887.

[3] Center, K., Reboli, A., Hubler, R., Rodgers, G., Long, S. (2003).

Decreased vancomycin susceptibility of coagulase-negative staphylococci in a neo-

natal intensive care unit: evidence of spread of Staphylococcus warneri.

J Clin Microbiol 41(10), 4660 – 4665.

[4] Champney, W., Burdine, R. (1996).

50S ribosomal subunit synthesis and translation are equivalent targets for erythro-

mycin inhibition in Staphylococcus aureus.

Antimicrob Agents Chemother 40(5), 1301 – 1303.

[5] De Paulis, A., Predari, S., Chazarreta, C., Santoianni, J. (2003).

Five-test simple scheme for species-level identification of clinically significant

coagulase-negative staphylococci.

J Clin Microbiol 41(3), 1219 – 1224.

[6] Drinkovic, D., Fuller, E., Shore, K., Holland, D., Ellis-Pegler, R. (2001).

Clindamycin treatment of Staphylococcus aureus expressing inducible clindamycin

resistance.

J Antimicrob Chemother 48(2), 315 – 316.

[7] Ferreira, R., Iorio, N., Malvar, K., Nunes, A., Fonseca, L., Bastos, C., Santos, K.

(2003).

Coagulase-negative staphylococci: comparison of phenotypic and genotypic oxacil-

lin susceptibility tests and evaluation of the agar screening test by using different

concentrations of oxacillin.

J Clin Microbiol 41(8), 3609 – 3614.

[8] Fiebelkorn, K., Crawford, S., McElmeel, M., Jorgensen, J. (2003).

Practical disk diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance

in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci.

J Clin Microbiol 41(10), 4740 – 4744.


[9] Friedrich, J. (2000).

Epidemiologie der MLSB-Resistenz von Staphylococcus aureus und Entdeckung

eines neuen Resistenzmechanismus fur Lincomycin.

Abteilung fur Medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universitat Bochum.

[10] Galanakis, E., Krallis, N., Levidiotou, S., Hotoura, E., Andronikou, S. (2002).

Neonatal bacteraemia: a population-based study.

Scand J Infect Dis 34(8), 598 – 601.

[11] Gatermann, S., Koschinski, T., Friedrich, S. (2004).

Distribution of Macrolide, Lincosamide, Streptogramin B (MLSB) Resistance Ge-

nes in Coagulase-Negative Staphylococci.

Deutsche Gesellschaft fur Hygiene und Mikrobiologie (DGHM), Munster.

[12] Gatermann, S., Koschinski, T., Friedrich, S. (2005).

Genetic basis of macrolide, lincosamide, streptogramin, resistance in coagulase-

negative staphylococci.

15th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Kopen-

hagen, Denmark.

[13] Gradelski, E., Valera, L., Aleksunes, L., Bonner, D., Fung-Tomc, J. (2001).

Correlation between genotype and phenotypic categorization of staphylococci ba-

sed on methicillin susceptibility and resistance.

J Clin Microbiol 39(8), 2961 – 2963.

[14] Hamilton-Miller, J., Shah, S. (2000).

Patterns of phenotypic resistance to the macrolide-lincosamide-ketolide-

streptogramin group of antibiotics in staphylococci.


[15] Harms, J., Schlunzen, F., Fucini, P., Bartels, H., Yonath, A. (2004).

Alterations at the peptidyl transferase centre of the ribosome induced by the

synergistic action of the streptogramins dalfopristin and quinupristin.

BMC Biol 2(1), –.

[16] Huppertz, K., Noll, H., Wiedemann, B., the GENARS-group (2002).

GENARS: Aktuelle Resistenzsituation in Deutschland.

[17] Jarlov, J., Hojbjerg, T., Busch-Sorensen, C., Scheibel, J., Moller, J., Kolmos, H.,

Wandall, D. (1996).

Coagulase-negative Staphylococci in Danish blood cultures: species distribution

and antibiotic susceptibility.

J Hosp Infect 32(3), 217 – 227.

[18] Jenssen, W., Thakker-Varia, S., Dubin, D., Weinstein, M. (1987).


Prevalence of macrolides-lincosamides-streptogramin B resistance and erm gene

classes among clinical strains of staphylococci and streptococci.


[19] John, M., Pletch, C., Hussain, Z. (2002).

In vitro activity of quinupristin/dalfopristin, linezolid, telithromycin and compa-

rator antimicrobial agents against 13 species of coagulase-negative staphylococci.


[20] Kaiser, F., Bient, K., Eckert, J., Zinkernagel, R. (1997).

Medizinische Mikrobiologie.

Thieme Verlag, Stuttgart.

[21] Karow, T., Lang, R. (2003).

Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie.

Thomas Karow, Pulheim.

[22] Khan, A., Nawaz, M., Khan, S., Steele, R. (2002).

Detection and characterization of erythromycin-resistant methylase genes in

Gram-positive bacteria isolated from poultry litter.

Appl Microbiol Biotechnol 59(2-3), 377 – 381.

[23] Khan, S., Nawaz, M., Khan, A., Cerniglia, C. (1999).

Simultaneous detection of erythromycin-resistant methylase genes ermA and ermC

from Staphylococcus spp. by multiplex-PCR.

Mol Cell Probes 13(5), 381 – 387.

[24] Kleeman, K., Bannerman, T., Kloos, W. (1993).

Species distribution of coagulase-negative staphylococcal isolates at a community

hospital and implications for selection of staphylococcal identification procedures.

J Clin Microbiol 31(5), 1318 – 1321.

[25] Kloos, W., Schleifer, K. (1986).

Staphylococcus. In: Bergey’s Manual of systematic bacteriology.

Williams and Wilkins, Baltimore.

[26] Kobayashi, N., Wu, H., Kojima, K., Taniguchi, K., Urasawa, S., Uehara, N., Omi-

zu, Y., Kishi, Y., Yagihashi, A., Kurokawa, I. (1994).

Detection of mecA, femA, and femB genes in clinical strains of staphylococci using

polymerase chain reaction.

Epidemiol Infect 113(2), 259 – 266.

[27] Leclercq, R., Brisson-Noel, A., Duval, J., Courvalin, P. (1987).

Phenotypic expression and genetic heterogeneity of lincosamide inactivation in

Staphylococcus spp.



[28] Leclercq, R., Courvalin, P. (1991).

Bacterial resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin antibiotics by

target modification.


[29] Leclercq, R., Courvalin, P. (1991).

Intrinsic and unusual resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin an-

tibiotics in bacteria.


[30] Leclercq, R., Soussy, C., Weber, P., Moniot-Ville, N., Dib, C. (2003).

In vitro activity of the pristinamycin against the isolated staphylococci in the

french hospitals in 1999-2000.

Pathol Biol (Paris) 51(7), 400 – 404.

[31] Lewis JS, n., Jorgensen, J. (2005).

Inducible clindamycin resistance in Staphylococci: should clinicians and microbio-

logists be concerned?

Clin Infect Dis 40(2), 280 – 285.

[32] Lim, J., Kwon, A., Kim, S., Chong, Y., Lee, K., Choi, E. (2002).

Prevalence of resistance to macrolide, lincosamide and streptogramin antibiotics

in Gram-positive cocci isolated in a Korean hospital.


[33] Lina, G., Quaglia, A., Reverdy, M., Leclercq, R., Vandenesch, F., Etienne, J.

(1999).

Distribution of genes encoding resistance to macrolides, lincosamides, and strep-

togramins among staphylococci.


[34] Lodder, G., Werckenthin, C., Schwarz, S., Dyke, K. (1997).

Molecular analysis of naturally occuring ermC-encoding plasmids in staphylo-

cocci isolated from animals with and without previous contact with macroli-

de/lincosamide antibiotics.

FEMS Immunol Med Microbiol 18(1), 7 – 15.

[35] Mardh, P., Schleifer, K. (1986).

Coagulase-Negative Staphylococci.

Almqvist and Wiksell International, Stockholm.

[36] Martineau, F., Picard, F., Grenier, L., Roy, P., Ouellette, M., Bergeron, M. (2000).

Multiplex PCR assays for the detection of clinically relevant antibiotic resistance

genes in staphylococci isolated from patients infected after cardiac surgery. The

ESPRIT Trial.



[37] Martineau, F., Picard, F., Lansac, N., M inverted question markenard, C., Roy,

P., Ouellette, M., Bergeron, M. (2000).

Correlation between the resistance genotype determined by multiplex PCR assays

and the antibiotic susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylo-

coccus epidermidis.


[38] Mason, W., Blevins, J., Beenken, K., Wibowo, N., Ojha, N., Smeltzer, M. (2001).

Multiplex PCR protocol for the diagnosis of staphylococcal infection.

J Clin Microbiol 39(9), 3332 – 3338.

[39] Mims, C., Playfair, J., Roitt, I., Wakelin, D., Williams, R. (1996).

Medizinische Mikrobiologie.

Ullstein Mosby GmbH, Berlin/Wiesbaden.

[40] Monsen, T., Karlsson, C., Wistrom, J. (2005).

Spread of clones of multidrug-resistant, coagulase-negative staphylococci within a

university hospital.

Infect Control Hosp Epidemiol 26(1), 76 – 80.

[41] Murray, P., Baron, E., Jorgensen, J., Pfaller, M., Yolken, R. (2003).

Manual of Clinical Microbiology, Vols. 1 and 2: Eighth Edition.

American Society Microbiology.

[42] Nicola, F., McDougal, L., Biddle, J., Tenover, F. (1998).

Characterization of erythromycin-resistant isolates of Staphylococcus aureus re-

covered in the United States from 1958 through 1969.


[43] Paul-Ehrlich-Gesellschaft fur Chemotherapie e. V. (2001).

Empfindlichkeitsprufungen und Resistenz.

website: http://www.p-e-g.org/ag resistenz/main.htm.

Letzter Aufruf: 13.11.2005.

[44] Poyart, C., Quesne, G., Boumaila, C., Trieu-Cuot, P. (2001).

Rapid and accurate species-level identification of coagulase-negative staphylococci

by using the sodA gene as a target.

J Clin Microbiol 39(12), 4296 – 4301.

[45] Rodriguez-Gascon, M., Roig, P., Montagud, J., Merino, J. (2003).

Acute Staphylococcus lugdunensis endocarditis with septic cerebral and pulmo-

nary emboli, showing favorable evolution.

Enferm Infecc Microbiol Clin 21(8), 465 – 467.


[46] Ross, J., Eady, E., Cove, J., Baumberg, S. (1996).

Minimal functional system required for expression of erythromycin resistance by

msrA in Staphylococcus aureus RN4220.

Gene 183(1-2), 143 – 148.

[47] Ross, J., Eady, E., Cove, J., Cunliffe, W., Baumberg, S., Wootton, J. (1990).

Inducible erythromycin resistance in staphylococci is encoded by a member of the

ATP-binding transport super-gene family.

Mol Microbiol 4(7), 1207 – 1214.

[48] Ruden, H., Daschner, F., Schumacher, M. (1995).

Nosokomiale Infektionen in Deutschland: Erfassung und Pravention (NIDEP-

Studie).

Bundesministerium fur Gesundheit, Nomos-Verlag, Baden-Baden.

[49] Sanghvi, K., Tudehope, D. (1996).

Neonatal bacterial sepsis in a neonatal intensive care unit: a 5 year analysis.

J Paediatr Child Health 32(4), 333 – 338.

[50] Schmitz, F., Petridou, J., Fluit, A., Hadding, U., Peters, G., von Eiff, C. (2000).

Distribution of macrolide-resistance genes in Staphylococcus aureus blood-culture

isolates from fifteen German university hospitals. M.A.R.S. Study Group. Multi-

centre Study on Antibiotic Resistance in Staphylococci.


[51] Schmitz, F., Petridou, J., Jagusch, H., Astfalk, N., Scheuring, S., Schwarz, S.

(2002).

Molecular characterization of ketolide-resistant erm(A)-carrying Staphylococcus

aureus isolates selected in vitro by telithromycin, ABT-773, quinupristin and clin-

damycin.


[52] Schmitz, F., Sadurski, R., Kray, A., Boos, M., Geisel, R., Kohrer, K., Verhoef, J.,

Fluit, A. (2000).

Prevalence of macrolide-resistance genes in Staphylococcus aureus and Enterococ-

cus faecium isolates from 24 European university hospitals.


[53] Schreckenberger, P., Ilendo, E., Ristow, K. (2004).

Incidence of constitutive and inducible clindamycin resistance in Staphylococcus

aureus and coagulase-negative staphylococci in a community and a tertiary care

hospital.

J Clin Microbiol 42(6), 2777 – 2779.

[54] Schwabe, U., Paffrath, D. (2005).


Arzneiverordnungsreport 2005.

Springer-Verlag Heidelberg.

[55] Siberry, G., Tekle, T., Carroll, K., Dick, J. (2003).

Failure of clindamycin treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus

expressing inducible clindamycin resistance in vitro.

Clin Infect Dis 37(9), 1257 – 1260.

[56] Steward, C., Raney, P., Morrell, A., Williams, P., McDougal, L., Jevitt, L., Mc-

Gowan JE, J., Tenover, F. (2005).

Testing for induction of clindamycin resistance in erythromycin-resistant isolates

of Staphylococcus aureus.

J Clin Microbiol 43(4), 1716 – 1721.

[57] Ug, A., Ceylan, O. (2003).

Occurrence of resistance to antibiotics, metals, and plasmids in clinical strains of

Staphylococcus spp.

Arch Med Res 34(2), 130 – 136.

[58] Van Hoovels, L., De Munter, P., Colaert, J., Surmont, I., Van Wijngaerden, E.,

Peetermans, W., Verhaegen, J. (2005).

Three cases of destructive native valve endocarditis caused by Staphylococcus

lugdunensis.


[59] Weisblum, B. (1995).

Erythromycin resistance by ribosome modification.


[60] Werckenthin, C., Schwarz, S. (2000).

Molecular analysis of the translational attenuator of a constitutively expressed

erm(A) gene from Staphylococcus intermedius.


[61] Werckenthin, C., Schwarz, S., Westh, H. (1999).

Structural alterations in the translational attenuator of constitutively expressed

ermC genes.


[62] Westh, H., Hougaard, D., Vuust, J., Rosdahl, V. (1995).

erm genes in erythromycin-resistant Staphylococcus aureus and coagulase-negative

staphylococci.

APMIS 103(3), 225 – 232.

[63] Westh, H., Hougaard, D., Vuust, J., Rosdahl, V. (1995).


Prevalence of erm gene classes in erythromycin-resistant Staphylococcus aureus

strains isolated between 1959 and 1988.


45

Danksagungen

Mein besonderer Dank gilt:

Herrn Prof. Dr. med. Soeren G. Gatermann fur die freundliche Uberlassung des The-

mas, sowie die hervorragende Betreuung.

Frau Susanne Friedrich fur die jederzeit perfekte Organisation und Beratung.

Dr. med. Martin Kaase fur viele praktische Hinweise und Diskussionen.

46

Lebenslauf

Name: Tanja Christina Koschinski

Geburtsdatum: 03.12.1978

Geburtsort: Bochum

Anschrift: Wegmannstrasse 3, 44795 Bochum

Tel: 0234/450510

Bildungsweg:

1985 – 1989 Gemeinschaftsgrundschule Weitmar, Bo-

chum

1989 – 1998 Graf-Engelbert-Gymnasium Bochum

08. 1998 – 01. 2000 Ausbildung zur Arzthelferin

01. 2000 – 10. 2000 Arzthelferin im Ausbildungsbetrieb

10. 2000 – 10. 2006 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-

Universitat Bochum

08. 2002 Arztliche Vorprufung

08. 2003 Erster Abschnitt der Arztlichen Prufung

08. 2005 Zweiter Abschnitt der Arztlichen Prufung

10. 2005 – 10. 2006 Praktisches Jahr:

Innere Medizin am Marienhospital Herne,

Universitatsklinik,

Dermatologie am St. Josef-Hospital Bo-

chum, Universitatsklinik,

Chirurgie am Marienhospital Herne

11. 2006 Dritter Abschnitt der Arztlichen Prufung

Epidemiologie der Resistenzmechanismen gegen Makrolid ...

Documents

Transcript of Epidemiologie der Resistenzmechanismen gegen Makrolid ...