epub.ub.uni-greifswald.de · VI Abkürzungsverzeichnis 3H Tritium (Radiolabel) 1xIP / 2xIP einfach...

Untersuchungen zum Einfluss von Hilfsstoffen auf

die Pharmakokinetik von Arzneistoffen unter

besonderer Berücksichtigung von

Aufnahmetransportern

I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n

zur

Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

vorgelegt von

Anett Engel

geboren am 27.04.1983

in Rostock

Greifswald, den 21.02.2013

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Klaus Fesser

1. Gutachter: Prof. Dr. med. Werner Siegmund

2. Gutachter: Prof. Dr. med. Martin Fromm (Erlangen)

Tag der Promotion: 11.06.2013

„Wer etwas recht erkennen will,

der muss zuvor in richtiger Weise gezweifelt haben.“

Aristoteles

Für meine verstorbenen Großeltern

IV

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................. VI

Abbildungsverzeichnis .................................................................................................. VIII

Tabellenverzeichnis ...................................................................................................... XII

1 Einleitung .............................................................................................................. 1

2 Aufgabenstellung ................................................................................................. 9

3 Material & Methoden ............................................................................................ 14

3.1 In vitro Untersuchungen ................................................................................ 14

3.1.1 Zellkultur ........................................................................................... 14

3.1.2 Kompetitionsassay ............................................................................ 16

3.1.3 Zellviabilität ....................................................................................... 20

3.1.4 Bestimmung der kritischen Mizellbildungskonzentration .................... 21

3.2 Tierexperimentelle Arbeiten .......................................................................... 21

3.3 Arzneistoffanalytik ......................................................................................... 26

3.3.1 Paracetamol ...................................................................................... 30

3.3.2 Paracetamol-Konjugate ..................................................................... 33

3.3.2.1 Talinolol ............................................................................................. 37

3.3.3 Colchicin ........................................................................................... 39

3.3.4 Ciclosporin A ..................................................................................... 43

3.4 Biometrie ....................................................................................................... 46

4 Ergebnisse ............................................................................................................ 50


4.1.1 Kompetitionsassay ............................................................................ 50

4.1.2 Zellviabilität ....................................................................................... 55

4.1.3 Kritische Mizellbildungskonzentration ................................................ 57

4.2 Tierexperimentelle Untersuchungen .............................................................. 57

4.2.1 Paracetamol ...................................................................................... 58

4.2.2 Talinolol ............................................................................................. 63

4.2.3 Colchicin ........................................................................................... 67

4.2.4 Ciclosporin A ..................................................................................... 72

5 Diskussion ............................................................................................................ 78


5.2 Tierexperimentelle Untersuchungen .............................................................. 79

6 Zusammenfassung ............................................................................................... 92

Literaturverzeichnis ...................................................................................................... 95

Inhaltsverzeichnis

V

Anhang ......................................................................................................................... 107

Eigenständigkeitserklärung ........................................................................................... A

Lebenslauf .................................................................................................................... B

Danksagung ................................................................................................................. D

VI

Abkürzungsverzeichnis

3H Tritium (Radiolabel)

1xIP / 2xIP einfach bzw. doppelt konzentrierter Inkubationspuffer

IPS substrathaltiger Inkubationspuffer

ABCB1 P-Glykoprotein (MDR1)

ABCC multidrug resistance associated protein (MRP)

ABCG2 breast cancer resistance protein (BCRP)

ACN Acetonitril

Ae F kumulative Ausscheidung im Fäzes

Ae F(M) kumulative Ausscheidung der Konjugate im Fäzes

Ae U kumulative Ausscheidung im Urin

Ae U(M) kumulative Ausscheidung der Konjugate im Urin

AL Arbeitslösung

AUC Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve

BSP Bromosulfophthalein

C*Organ normierte Organkonzentration

C0 initiale Blutkonzentration

Cav durchschnittliche Blutkonzentration im steady state

ClF fäkale Clearance

ClF(M) fäkale Clearance der Konjugate

ClM metabolische Clearance

ClR renale Clearance

ClR(M) renale Clearance der Konjugate

Cltot totale Körperclearance

CMC kritische Mizellbildungskonzentration

Cmin minimale Blutkonzentration im steady state

CrEL Cremophor EL

CYP Cytochrom P450

E17βG Estradiol-17β-glukuronid

E3S Estron-3-sulfat

EC50 halbmaximale effektive Konzentration

FDA Food and Drug Administration, amerikanische Arzneimittelbehörde

GFP grün fluoreszierendes Protein

GFR glomeruläre Filtrationsrate

HEK human embryonic kidney (Zellen)

Abkürzungsverzeichnis

VII

HPCD Hydroxypropyl-β-cyclodextrin

IC50 halbmaximale inhibitorische Konzentration

IS Interner Standard

LOQ limit of quantitation, Bestimmungsgrenze

MeOH Methanol

MIE maximal inhibitorischer Effekt

NCE new chemical entity, Arzneistoffentwicklungskandidat

NTCP Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (SLC10A1)

OATP organic anion transporting polypeptide (SLCO)

PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PEG Polyethylenglykol

SL Stammlösung

SOL Solutol HS15

T1/2 terminale Halbwertzeit

TA Taurocholat

TEAP Triethylammoniumphosphat-Puffer

UGT Uridindiphosphat-glukuronosyltransferase

Vc initiales zentrales Verteilungsvolumen

Vss Verteilungsvolumen im Gleichgewichtszustand

VIII

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1: Phasen der Arzneimittelentwicklung. .......................................................... 1

Abb. 1.2: Schematische Darstellung einer Emulgatormizelle in wässrigem Medium. . 3

Abb. 1.3: Strukturformeln der Hauptkomponenten von Cremophor EL und Solutol HS15.

................................................................................................................... 3

Abb. 1.4: Schematische Darstellung eines Cyclodextrinkomplexes mit einem

Gastmolekül und Strukturformel von Hydrxypropyl-β-cyclodextrin. ............. 4

Abb. 1.5: Strukturformel von Polyethylenglykol 400. .................................................. 4

Abb. 1.6: Schematische Darstellung der Expression einer Auswahl wichtiger

Arzneistofftransporter im Enterozyten, Hepatozyten, der Nierentubuluszelle

und der Kapillarendothelzelle in der Blut-Hirn-Schranke beim Menschen. .. 6

Abb. 2.1: Strukturformeln der verwendeten Modellarzneistoffe Paracetamol, Talinolol,

Colchicin und Ciclosporin A. ....................................................................... 13

Abb. 3.1: Prinzip des Kompetitionsassays. ................................................................ 16

Abb. 3.2: Beispiel einer Plattenbelegung im Kompetitionsassay für einen Versuch mit

einem Transporter im Konzentrationsbereich 0,0316 – 10% (w/v) im Triplett.

................................................................................................................... 18

Abb. 3.3: Inzisionsstelle und Platzierung des Katheters in der Arteria carotis. ........... 23

Abb. 3.4: Schematische Darstellung des Studienablaufs. .......................................... 25

Abb. 3.5: Beispiel für eine Kalibration von Paracetamol in Vollblut. ........................... 33

Abb. 3.6: Beispiel für eine Kalibration von Talinolol in Vollblut. .................................. 39

Abb. 3.7: Beispiel für eine Kalibration von Colchicin in Vollblut. ................................. 43

Abb. 3.8: Beispiel für eine Kalibration von Ciclosporin A in Vollblut............................ 46

Abb. 4.1: Absolute Aufnahme von Estron-3-sulfat in Vektor-transfizierte Kontrollzellen

und OATP1A2-transfizierte Zellen in Anwesenheit steigender Konzentrationen

von Polyethylenglykol 400. ......................................................................... 50

Abb. 4.2: Hemmung der OATP1A2-vermittelten Nettoaufnahme von Estron-3-sulfat und

Taurocholat durch Polyethylenglykol 400. .................................................. 51

Abb. 4.3: Effekt von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin auf die Nettoaufnahme von Estradiol-

17β-glukuronid durch OATP1B3. ................................................................ 52

Abb. 4.4: Effekt von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin auf die Nettoaufnahme von

Taurocholat und Bromosulfophthalein durch NTCP. ................................... 52

Abb. 4.5: Hemmung der Nettoaufnahme von Bromosulfophthalein durch Solutol HS15

und Cremophor EL. .................................................................................... 54


IX

Abb. 4.6: Zellviabilität in Anwesenheit der hohen Hilfsstoffkonzentration nach 0 und 1 h.

.................................................................................................................... 56

Abb. 4.7: Bestimmung der Kritischen Mizellbildungskonzentration anhand der

Oberflächen-spannung. ............................................................................... 57

Abb. 4.8: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte

pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Paracetamol mit

isotoner Kochsalzlösung bzw. Polyethylenglykol 400. ................................. 58



isotoner Kochsalzlösung bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ...................... 59



isotoner Kochsalzlösung bzw. Solutol HS15. ............................................... 59


pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol mit









pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Talinolol mit









pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol mit






X



isotoner Kochsalzlösung bzw. Solutol HS15. .............................................. 66


pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Colchicin mit

isotoner Kochsalzlösung bzw. Polyethylenglykol 400. ................................ 68



isotoner Kochsalzlösung bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ..................... 69





pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin mit

isotoner Kochsalzlösung bzw. Polyethylenglykol 400. ................................ 70



isotoner Kochsalzlösung bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ..................... 71





pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Ciclosporin A mit

isotoner Kochsalzlösung und Polyethylenglykol 400. .................................. 73



isotoner Kochsalzlösung und Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ...................... 73



isotoner Kochsalzlösung und Solutol HS15. ............................................... 74


pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A mit

isotoner Kochsalzlösung und Polyethylenglykol 400. .................................. 75



isotoner Kochsalzlösung und Hydroxypropyl-β-cyclodextrin. ...................... 75


XI

Abb. 4.31: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min nd ausgewählte


isotoner Kochsalzlösung und Solutol HS15. ................................................ 76

Abb. 7.1: Ansatz der Verdünnungsreihen für den Kompetitionsassay. ........................ 111

Abb. 7.2: Stabilität der Stammlösungen von Paracetamol und 7β-

Hydroxyehtyltheophyllin bei -20 °C. ............................................................ 120

Abb. 7.3: Stabilität der Stammlösungen von Paracetamol und 7β-

Hydroxyehtyltheophyllin über mehrere Gefrier-Tau-Zyklen. ......................... 120

Abb. 7.4: Stabilität der Arbeitslösungen von Paracetamol und 7β-

Hydroxyehtyltheophyllin im Kühlschrank...................................................... 121

Abb. 7.5: Stabilität der Stammlösungen von Colchicin und Demecolcin bei -20 °C. .... 121

Abb. 7.6: Stabilität der Arbeitslösungen von Colchicin und Demecolcin im Kühlschrank.

.................................................................................................................... 122

Abb. 7.7: Hemmung der Transporter-vermittelten Aufnahme der Referenzsubstrate

durch Polyethylenglykol 400. ....................................................................... 123


durch Hydroxypropyl-β-cyclodextrin............................................................. 124


durch Solutol HS15. .................................................................................... 125


durch Cremophor EL. .................................................................................. 126

XII

Tabellenverzeichnis

Tab. 2.1: Physiko-chemische und pharmakokinetische Eigenschaften der

Modellarzneistoffe. ..................................................................................... 12

Tab. 3.1: Charakterisierung der verwendeten Zelllinien anhand geeigneter

Referenzsubstrate und -Inhibitoren. ............................................................ 15

Tab. 3.2: Verwendete Substrate und Referenzinhibitoren im Kompetitionsassay. ..... 17

Tab. 3.3: Verwendete Hilfsstoffkonzentrationen im Kompetitionsassay. .................... 17

Tab. 3.4: Verwendete Hilfsstoffkonzentrationen im Viabilitätsassay........................... 20

Tab. 3.5: Hilfsstoffkonzentration der Injektionslösungen. ........................................... 23

Tab. 3.6: Tagesdosis und Arzneistoffkonzentration der Injektionslösungen. .............. 24

Tab. 3.7: Lokalisation der Entnahmestellen der mRNA-Proben. ................................ 25

Tab. 3.8: Extraktion, Detektion und Arbeitsbereich der Analyten. .............................. 26

Tab. 3.9: Verwendete Leermatrizes. .......................................................................... 29

Tab. 3.10: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Paracetamol.................. 33

Tab. 3.11: MS-Detektionsparameter für Paracetamol und Propranolol. ....................... 36

Tab. 3.12: MS-Detektionsparameter für Talinolol und Propranolol. .............................. 38

Tab. 3.13: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Talinolol. ....................... 39

Tab. 3.14: MS-Detektionsparameter für Colchicin und Demecolcin. ............................ 42

Tab. 3.15: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Colchicin. ...................... 42

Tab. 3.16: MS-Detektionsparameter für Ciclosporin A und Pimecrolimus. ................... 45

Tab. 3.17: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Ciclosporin A................. 45

Tab. 4.1: Interaktion von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin mit OATPs und NTCP. ......... 53

Tab. 4.2: Interaktion von Solutol HS15und Cremophor EL mit OATPs und NTCP. .... 55

Tab. 4.3: Ausscheidungsparameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol unter

Einfluss von Lösungsvermittlern. ................................................................ 62

Tab. 4.4: Organverteilung der multiple dose Kinetik von Talinolol unter Einfluss von

Lösungsvermittlern. .................................................................................... 67

Tab. 4.5: Organverteilung der multiple dose Kinetik von Colchicin unter Einfluss von


Tab. 4.6: Organverteilung der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A unter Einfluss von


Tab. 5.1: Postulierte Mechanismen der Hilfsstoff-Arzneistoff-Interaktionen im

Tierversuch................................................................................................. 87

Tab. 7.1: Ansatz des 2xIPS für den Kompetitionsassay. ............................................ 110

Tab. 7.2: Ansatz des 1xIPS für den Kompetitionsassay. ............................................ 110

Tabellenverzeichnis

XIII

Tab. 7.3: Ansatz der Inhibitorkontrolle für den Kompetitionsassay. ............................. 111

Tab. 7.4: Ansatz der Stamm- und Arbeitslösungen von Paracetamol, 7β-

Hydroxyethyltheophyllin und Propranolol. .................................................... 115

Tab. 7.5: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf das

jeweilige Matrixvolumen für die Bestimmung von Paracetamol. ................... 116

Tab. 7.6: Ansatz der Stamm- und Arbeitslösungen von Talinolol und Propranolol. ..... 116

Tab. 7.7: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf 100 µl

Matrix für die Bestimmung von Talinolol. ..................................................... 117

Tab. 7.8: Ansatz der Stamm- und Arbeitslösungen von Colchicin und Demecolcin. ... 117

Tab. 7.9: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf das

jeweilige Matrixvolumen für die Bestimmung von Colchicin. ........................ 118

Tab. 7.10: Ansatz der Stamm- und Arbeitslösungen von Ciclosporin A und Pimecrolimus.

.................................................................................................................... 119

Tab. 7.11: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf 100 µl

Matrix für die Bestimmung von Ciclosporin A. ............................................. 119

Tab. 7.12: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Paracetamol unter

Einfluss von Lösungsvermittlern. ................................................................. 127

Tab. 7.13: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol

unter Einfluss von Lösungsvermittlern. ........................................................ 127

Tab. 7.14: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Talinolol unter


Tab. 7.15: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol unter


Tab. 7.16: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Colchicin unter


Tab. 7.17: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin unter


Tab. 7.18: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Ciclosporin A


Tab. 7.19: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A


1

1 Einleitung

Die Neuentwicklung von Arzneistoffen ist ein langwieriger, kostspieliger und risikoreicher

Prozess,1-3 der in mehreren Phasen abläuft (Abb. 1.1). Dabei kommt nur ein Bruchteil der

ursprünglichen Entwicklungskandidaten (new chemical entity, NCE) bis zur Markt-

einführung als Fertigarzneimittel.

Abb. 1.1: Phasen der Arzneimittelentwicklung. Die Neuentwicklung eines Arzneimittels von der

Entdeckung bis zur Markteinführung dauert bis zu 16 Jahre und kostet insgesamt bis

zu 900 Mio. US$ (meist Beteiligung mehrerer Unternehmen inkl. öffentlich geförderter

Forschung). Dabei erlangt im Durchschnitt von ca. 10.000 Substanzen nur eine die

Marktzulassung.3-5

Den einzelnen Phasen der Arzneimittelentwicklung von der

Entdeckung bis zur Markteinführung geht die Grundlagenforschung voraus. Nach der

Markteinführung folgt eine weiterführende Anwendungsbeobachtung.

Daher ist es nötig, bereits in den frühen Entwicklungsphasen zu entscheiden, welche NCE

vielversprechend sind. Zu den Entscheidungskriterien gehören neben der pharmako-

logischen Aktivität unter anderem physiko-chemische Eigenschaften wie Löslichkeit,

Azidität / Basizität und Lipophilie sowie biopharmazeutische Eigenschaften wie

Permeabilität bis hin zu klinischen Parametern wie Bioverfügbarkeit.

Gru

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0 5 10 150

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1 000

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9 000

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)

Zeit (Jahre)

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Koste

n (

Mio

US

$)

1 Einleitung

2

Die Orientierung an natürlich vorkommenden wirksamen Substanzen (zumeist Peptide

und andere Makromoleküle) zur Generierung von Leitstrukturen führte in den letzten

Jahrzehnten dazu, dass neue Arzneistoffe immer größer und lipophiler werden.6 Eine

hohe Lipophilie beeinträchtigt jedoch die Wasserlöslichkeit der betreffenden Substanz,

was wiederum die Permeabilität (Permeation nur von gelösten Molekülen) und

schlussendlich die orale Bioverfügbarkeit deutlich reduzieren kann. Dies erschwert die

erfolgreiche Entwicklung von oralen Darreichungsformen, welche für die ambulante

Therapie und eine angemessene Compliance jedoch unverzichtbar sind. Des Weiteren

behindert eine schlechte Wasserlöslichkeit die Herstellung von Injektions- und

Infusionslösungen. Solche parenteralen Arzneiformen sind unter anderem erforderlich bei

Arzneistoffen, die z.B. auf Grund eines sehr hohen first pass Effektes keine hinreichende

Bioverfügbarkeit besitzen (z.B. Naloxon, Peptide / Proteine), die eine sehr genaue

Steuerung der Dosis erfordern (z.B. Injektionsnarkotika, Chemotherapeutika gegen

Tumorerkrankungen) und / oder bei denen ein schneller Wirkeintritt nötig ist

(Notfallmedizin, Operationen). Im Rahmen der Arzneistoffentwicklung haben

Injektionslösungen v.a. eine Bedeutung in frühen tierexperimentellen und klinischen

Untersuchungen und sind notwendig für die Bestimmung der absoluten Bioverfügbarkeit.

Darüber hinaus ist eine ausreichende Wasserlöslichkeit Voraussetzung für die

Durchführung von in vitro Untersuchungen. Somit wird der Trend zu lipophileren

Molekülen mit schlechterer Wasserlöslichkeit zunehmend zu einem Problem in der

Neuentwicklung von Arzneistoffen und zu einer Herausforderung für den

pharmazeutischen Technologen.7,8 Wie bedeutend das Problem mangelnder

Wasserlöslichkeit ist, zeigt die Entwicklungsgeschichte des Chemotherapeutikums

Paclitaxel, dessen Struktur und gute Antitumorwirkung bereits Anfang der 70er Jahre

publiziert, die Weiterentwicklung zu einem marktfähigen Arzneimittel wegen der extrem

schlechten Wasserlöslichkeit jedoch um über eine Dekade ausgesetzt wurde.9,10

Mangelnde Wasserlöslichkeit ist eine wesentliche Ursache für das Scheitern von

hoffnungsvollen NCE, die in vitro eine hoch potente Wirkung gezeigt haben aber ihre

Zielstruktur in vivo nicht oder nicht ausreichend erreichen (z.B. Renin-Antagonisten).

Ein Weg zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit ohne die hinsichtlich der Aktivität

optimierte Leitstruktur zu verändern ist die Verwendung von Hilfsstoffen zur

Lösungsvermittlung. Als Lösungsvermittler finden eine Vielzahl amphiphiler Verbindungen

verschiedener Strukturklassen mit unterschiedlichen Mechanismen der

Lösungsvermittlung Verwendung.

Am weitesten verbreitet sind die Emulgatoren. Diese strukturell äußerst heterogene

Gruppe zeichnet sich dadurch aus, dass sie ab einer bestimmten Konzentration (kritische

1 Einleitung

3

Mizellbildungskonzentration, CMC) Mizellen bildet. In einer wässrigen Phase richten sich

die Monomere dabei so aus, dass die lipophilen Molekülteile nach innen zeigen und ein

geeignetes Medium für die Aufnahme lipophiler Verbindungen bilden, während die

hydrophilen Teile nach außen zeigen und so eine gute Wasserlöslichkeit vermitteln (Abb.

1.2). Häufig verwendete Emulgatoren sind z.B. Polysorbate, Cremophor EL (CrEL, Abb.

1.3 A) und RH40, Solutol HS15 (SOL, Abb. 1.3 B) und D-α-Tocopheryl-polyethylenglykol

1000-succinat.

Abb. 1.2: Schematische Darstellung einer Emulgatormizelle in wässrigem Medium.

Abb. 1.3: Strukturformeln der Hauptkomponenten von Cremophor EL (Polyethylenglykol-

glycerol-ricinoleat, A, x+y+z ~ 35) und Solutol HS15 (Polyethylenglykol-12-

hydroxystearat, B, n ~ 15).

Eine weitere Möglichkeit der Lösungsvermittlung ist die Komplexbildung. Hier spielen v.a.

die Einschlussverbindungen mit Cyclodextrinen eine wichtige Rolle. Cyclodextrine sind

Emulgatormolekül

hydrophiler Teil

lipophiler Teil

lipophiler Arzneistoff

A

B

1 Einleitung

4

zyklische Zuckermoleküle aus 6 bis 8 Glukose-Einheiten mit konischer Gesamtstruktur.

Der innere Hohlraum ist lipophil und kann so lipophile Gastmoleküle aufnehmen (Abb. 1.4

A), während die hydrophile Außenseite die Wasserlöslichkeit des Komplexes vermittelt.

Durch Derivatisierung der Hydroxylgruppen kann die Wasserlöslichkeit gegenüber den

natürlichen Cyclodextrinen weiter gesteigert werden.11 Am häufigsten werden β-

Cyclodextrin und dessen Derivate wie Methyl-, Dimethyl-, Sulfobutylether- und

Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, Abb. 1.4 B) verwendet.

Abb. 1.4: Schematische Darstellung eines Cyclodextrinkomplexes mit einem Gastmolekül (A)

und Strukturformel von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (B, Substitutionsgrad 0,1 – 0,45).

Eine dritte Option sind die sogenannten Strukturbrecher. Vertreter dieser Gruppe

enthalten im Verhältnis zur Molekülgröße eine große Anzahl an Wasserstoff-

brückendonatoren und / oder -Akzeptoren, wodurch sie die Clusterstruktur des

Wassers brechen können. Dadurch stehen mehr

freie Valenzen der Wassermoleküle für die

Ausbildung von Hydrathüllen zur Solvatisierung der

zu lösenden Arzneistoffe zur Verfügung

(Hydrotropieeffekt). In der Formulierung von

Arzneimitteln häufig eingesetzte Vertreter dieser

Gruppe sind z.B. Alkohole, Polypropylen- und

Polyethylenglykole (PEG, Abb. 1.5).

Abb. 1.5: Strukturformel von

Polyethylenglykol 400

(n ~ 8 – 9).

Pharmazeutische Hilfsstoffe wie Lösungsvermittler sollten inert also ohne eigene

pharmakologische Wirkung sein. Die Vergangenheit hat aber gezeigt, dass dies nicht

Gastmolekül

Cyclo-

dextrin-

molekül

A B

1 Einleitung

5

immer der Fall ist. Für viele häufig verwendete Lösungsvermittler wurde bereits

beschrieben, dass sie die Pharmakokinetik von Arzneistoffen verändern können.12,13

Wichtige Determinanten der Pharmakokinetik sind Transportproteine. Sie vermitteln die

Aufnahme von Substanzen in die Zelle und den Auswärtstransport (Efflux) aus der Zelle

und bestimmen damit maßgeblich die Permeabilität einer Substanz über biologische

Barrieren.

Für die Pharmakokinetik von Arzneistoffen wichtige Transportproteine werden in zwei

Superfamilien unterteilt, die adenosine triphosphate binding cassette (ABC) Transporter

(Efflux) und die solute carrier (SLC, hauptsächlich Aufnahmetransporter).

Pharmakokinetisch relevante Effluxtransporter der ABC-Familie sind unter anderem P-

Glykoprotein (ABCB1), multidrug resistance associated protein (ABCC) 2 und breast

cancer resistance protein (ABCG2). Sie begrenzen die Resorption von Arzneistoffen und

Xenobiotika aus dem Darm und die Verteilung in empfindliche Organe (z.B. Gehirn,

Testes) und unterstützen die aktive Ausscheidung über Leber, Nieren und Darm. Sie

transportieren ein großes Spektrum an überwiegend lipophilen Arzneistoffen, wobei v.a.

ABCC2 und ABCG2 auch anionische Verbindungen wie Phase II Metaboliten

ausschleusen.14-16

Die Aufnahmetransporter der SLC-Familie umfassen deutlich mehr pharmakokinetisch

relevante Mitglieder, unter anderem organic anion transporting polypeptides (OATP),

Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP), organic cation transporter (OCT),

organic anion transporter (OAT) und peptide transporter (PEPT).14 Je nach

Expressionsort erfüllen sie unterschiedliche Aufgaben.

In der apikalen Membran von Enterozyten scheinen nach bisheriger Datenlage beim

Menschen u.a. PEPT1, OATP2B1 und OATP1A2 (umstritten) exprimiert zu sein.17-19 Dort

ermöglichen sie die Resorption von Nahrungsbestandteilen und Arzneistoffen.

In der basolateralen Membran von Leber, Nieren und Darm ermöglichen

Aufnahmetransporter den Zugang zu metabolisierenden Enzymen und arbeiten mit den

apikalen Effluxtransportern bei der Elimination von Arzneistoffen Hand in Hand. In der

basolateralen (sinusoidalen) Membran von Hepatozyten finden sich OCT1, OAT2,

OATP2B1 und die leberspezifischen Transporter OATP1B1, OATP1B3 und NTCP.14,16,20

In der menschlichen Niere werden basolateral v.a. OCT2 und einige OATs exprimiert,

aber auch OATP4C1. Basolaterale Aufnahmetransporter im Darm sind bisher nur

unzureichend charakterisiert.14,16,20

In der apikalen Membran des Nierentubulus ermöglichen Aufnahmetransporter die

Reabsorption renal ausgeschiedener Substanzen. Beim Menschen scheinen hierfür u.a.

OAT4, PEPT1, PEPT2 und OATP1A2 eine Rolle zu spielen.14,16

1 Einleitung

6

Abb. 1.6: Schematische Darstellung der Expression einer Auswahl wichtiger

Arzneistofftransporter im Enterozyten (A), Hepatozyten (B), der Nierentubuluszelle (C)

und der Kapillarendothelzelle in der Blut-Hirn-Schranke (D) beim Menschen.14,16

OATPs

1B1, 1B3, 2B1

NTCPOCT1

OAT2

ABCC3

AB

CG

2

basolateral / sinusoidal

B

apikal / kanalikulär

Blu

t

GalleABCC3

OCT1OATPs

1A2, 2B1

PEPT1

ABCB1

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Darm

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ABCC3

OCT2OATPs

1A2, 2B1

PEPT1/2

ABCB1

ABCC2

ABCG2

C

basola

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al

Blu

t

Tubulus

OATP4C1

OATs 1-3

OATP1A2

OATP2B1

ABCB1

ABCG2

D

apik

al /

lum

inal

Blu

t

basola

tera

l

Inte

rsti

tiu

m

1 Einleitung

7

Auch der Übertritt von Substanzen aus dem Blut in die übrigen Organe und Gewebe wird

durch Aufnahmetransporter erleichtert oder gar erst ermöglicht. Sie bestimmen damit

neben den Effluxtransportern die Verteilung von Arzneistoffen im Organismus. In der Blut-

Hirn-Schranke des Menschen sind hierfür z.B. OATP1A2 und OATP2B1 verantwortlich.14

Abb. 1.6 fasst die Verteilung der beschriebenen Aufnahme- und Effluxtransporter in den

verschiedenen Geweben nochmals zusammen.

Neben der Lokalisation unterscheiden sich die Aufnahmetransporter auch in ihrem

Substratspektrum. OATPs und NTCP transportieren u.a. endogene Substanzen wie

Hormone, Gallensäuren und deren Salze sowie Arzneistoffe wie Statine, Chinolone,

Digoxin, Fexofenadin und Talinolol.14,18,21 PEPTs vermitteln die Aufnahme von Di- und

Tripeptiden und strukturell ähnlicher Arzneistoffe wie β-Lactam-Antibiotika, einige ACE-

Hemmer und Valaciclovir.17 Über OCTs werden v.a. organische Kationen wie

Neurotransmitter, Metformin, Chinin und Antihistaminika aufgenommen,22 während OATs

v.a. organische Anionen wie Prostaglandine, Sulfate und Glukuronide von

Steroidhormonen, Harnsäure, nicht-steroidale Antirheumatika, Methotrexat, β-Lactam-

Antibiotika, Antiviralia und einige ACE-Hemmer transportieren.23

Die Expression und Funktion von Efflux- und Aufnahmetransportern unterliegt einer

starken Variabilität bedingt durch genetische Varianten, Krankheit und Interaktionen mit

verschiedensten Substanzen. Hinsichtlich der genetischen Variabilität sind für viele

Transportproteine zahlreiche single nucleotide Polymorphismen bekannt.24,25 Diese

können u.a. die Funktion des Transporters einschränken (z.B. reduzierte Affinität von

Vincristin zu genetischen Varianten von ABCB1; reduzierte bis gar keine Affinität von

Taurocholat zu genetischen Varianten von OATP1B1)24,25 und ggf. auch zu klinisch

relevanten Veränderungen in der Pharmakokinetik von Arzneistoffen führen (z.B. erhöhte

AUC von Statinen verbunden mit reduzierter Wirkung und erhöhtem Myopathie-Risiko in

Gegenwart von OATP1B1 Polymorphismen).25 Solche Polymorphismen können auch mit

einer veränderten Prädisposition für Erkrankungen einhergehen (z.B. Assoziation eines

ABCB1 Polymorphismus mit Parkinson).26 Umgekehrt können Krankheiten die Expression

von Transportproteinen modellieren (z.B. Hochregulation von ABCB1 und ABCC2 sowie

Runterregulation von OATPs bei Diabetes)27,28 und so die Pharmakokinetik von

Arzneistoffen beeinflussen.

Weitaus besser untersucht ist die Variabilität von Transportproteinen im Zusammenhang

mit Interaktionen zwischen Arzneistoffen. So kann z.B. die Hemmung von

Effluxtransportern die orale Bioverfügbarkeit erhöhen und den Übertritt über die Blut-Hirn-

Schranke erleichtern, wie es für Digoxin und andere ABCB1-Substrate demonstriert

wurde.29,30 Eine Hemmung hepatischer Aufnahmetransporter ist mit einer verringerten

1 Einleitung

8

präsystemischen Eliminierung und einer erhöhten systemischen Arzneistoffexposition

assoziiert. Dies kann zu unerwünschten Arzneimittelwirkungen führen, wie es für die

Kombination von Statinen mit Gemfibrozil oder Ciclosporin bereits gezeigt wurde.31

Neben Arzneistoff-Arzneistoff-Interaktionen können aber auch Arzneistoff-Nahrungsmittel-

Interaktionen zur Variabilität in der Pharmakokinetik von Arzneistoffen führen. So kann die

Hemmung apikaler Aufnahmetransporter im Darm durch Grapefruitsaft zu einer

geringeren systemischen Exposition und Wirksamkeit von Fexofenadin und Talinolol

führen.32,33

Auch von Hilfsstoffen wie Lösungsvermittlern weiß man inzwischen, dass sie u.a.

Transportproteine beeinflussen12,13 und damit ebenfalls zur Variabilität in der

Pharmakokinetik von Arzneistoffen beitragen können. Dies wurde in der

Arzneimittelentwicklung und der Pharmakotherapie bisher jedoch kaum beachtet, nicht

zuletzt aus Ermangelung an systematischen Untersuchungen zu diesem Aspekt der

Transporter-Interaktionen.

9

2 Aufgabenstellung

Einige pharmazeutische Hilfsstoffe, insbesondere Lösungsvermittler, scheinen

pharmakologisch nicht inert zu sein und führen zu pharmakokinetischen Interaktionen. Als

mögliche Ursache für die Beeinflussung der Pharmakokinetik von Arzneistoffen durch

Lösungsvermittler wurde die Hemmung von Effluxtransportern wie ABCB1 und

metabolisierenden Enzymen wie Cytochrom P450 (CYP) 3A4 identifiziert.12,13 Der

diesbezüglich am besten untersuchte Hilfsstoff ist CrEL. Für diesen häufig verwendeten

Emulgator wurde in der Literatur eine potente Hemmung der metabolisierenden Enzyme

CYP3A4, CYP2C9 und Uridindiphosphat-glukuronosyltransferase (UGT) 1A1 in

Lebermikrosomen34-36 sowie der Effluxtransporter ABCB1, ABCC2 und ABCG2 in

Transporter-transifizierten Zellen37-39 gezeigt. Dass eine Modulation von Metabolismus

und Effluxtransport auch zu klinisch relevanten Veränderungen in der Pharmakokinetik

von Arzneistoffen führen kann, wurde z.B. beschrieben für den β-Blocker Talinolol mit D-

α-Tocopheryl-polyethylenglykol 1000-succinat, für das Chemotherapeutikum Paclitaxel mit

CrEL und für Digoxin mit Cremophor RH40.40-42

Dass neben metabolisierenden Enzymen und Effluxtransportern aber auch

Aufnahmetransporter wie OATPs und NTCP eine bedeutende Rolle für die

Pharmakokinetik von Arzneistoffen spielen, wurde in der Einleitung bereits dargelegt. Es

gibt bisher aber kaum Untersuchungen zum Einfluss von Lösungsvermittlern auf

Aufnahmetransporter. In der Literatur weisen unter anderem eine erhöhte

Wiederfindungsrate in Leberperfusaten, eine verringerte Aufnahme in Tumorzellen und

eine nicht-lineare Pharmakokinetik von Paclitaxel in Anwesenheit von CrEL jedoch darauf

hin, dass Lösungsvermittler auch einen Einfluss auf Aufnahmetransporter haben

könnten.43-45 Systematische Untersuchungen auf in vitro wie in vivo Ebene zum Einfluss

von Lösungsvermittlern auf Aufnahmetransporter fehlten bisher hingegen.

Entsprechend der Arbeitshypothese, dass Lösungsvermittler die Funktion von

Aufnahmetransportern beeinflussen, ergaben sich für eine systematische Untersuchung

auf in vitro wie in vivo Ebene folgende Aufgaben:

1. Untersuchung des Einflusses ausgewählter Lösungsvermittler auf die Funktion

pharmakokinetisch relevanter Aufnahmetransporter an geeigneten zellulären

Transportermodellen.

Als pharmakokinetisch relevante Aufnahmetransporter wurden OATP1A2, OATP1B1,

OATP1B3, OATP2B1 und NTCP auf Grund ihrer Relevanz für die Absorption, Verteilung

2 Aufgabenstellung

10

und Elimination von Arzneistoffen sowie wegen ihres breiten Substratspektrums (s.

Einleitung, S. 5ff) ausgewählt. Darüber hinaus waren geeignete Zellmodelle zu diesen

Transportproteinen am Institut für Pharmakologie bereits etabliert und gut charakterisiert

(s. Material & Methoden, S. 14).

Als Hilfsstoffe wurden PEG 400, HPCD, SOL und CrEL ausgewählt, da sie häufig

verwendete Lösungsvermittler v.a. in der Präklinik darstellen. Sie sind außerdem

repräsentative Vertreter für verschiedene Mechanismen der Lösungsvermittlung (s.

Einleitung, S. 3ff).

2. Definition geeigneter Modellarzneistoffe und Charakterisierung ihrer

Pharmakokinetik in der Ratte in An- und Abwesenheit der Lösungsvermittler nach

intravenöser Applikation (proof of concept Studie).

Als Modellarzneistoffe für die tierexperimentelle Studie wurden Substanzen mit guter wie

schlechter Wasserlöslichkeit ausgewählt, deren Pharmakokinetik bekannt ist und in

unterschiedlichem Ausmaß durch Aufnahme- und Effluxtransporter sowie

metabolisierende Enzyme beeinflusst wird, nämlich Paracetamol, Talinolol, Colchicin und

Ciclosporin A.

Paracetamol (Abb. 2.1 A und Tab. 2.1) ist eine relativ hydrophile, schwache Säure und

damit ausreichend wasserlöslich. Bei der Biotransformation wird es v.a. mit Sulfat und

Glukuronsäure konjugiert. Ein geringer Teil wird über CYP2E1 zum toxischen Chinonimin-

Derivat umgesetzt, das wiederum mittels Glutathionkopplung entgiftet wird. Paracetamol

selbst ist bisher nicht als Transportersubstrat beschrieben, aber die Konjugate werden

durch die Auswärtstransporter ABCC2 – 4 und ABCG2 eliminiert.46,47 Daher diente

Paracetamol in der Tierstudie als Testsubstanz für Einflüsse der Lösungsvermittler auf

den Phase II Metabolismus und ggf. den Effluxtransport seiner Metabolite.

Talinolol (Abb. 2.1 B und Tab. 2.1) ist eine lipophile, schwache Base und damit v.a. im

Sauren gut wasserlöslich. Es wird praktisch nicht metabolisiert, ist aber Substrat diverser

Aufnahmetransporter der OATP-Familie und wird über ABCB1 und ABCC2

ausgeschieden. Somit wurde Talinolol als Modellarzneistoff für Einflüsse auf den

Aufnahme- und Effluxtransport ausgewählt.

Colchicin (Abb. 2.1 C und Tab. 2.1) ist ein weniger lipophiler Neutralstoff und gut

wasserlöslich. Es wird hauptsächlich über CYP3A4 verstoffwechselt und ist außerdem

Substrat der Auswärtstransporter ABCB1 und ABCC2.48,49 Für die hepatische Aufnahme

von Colchicin wird die Beteiligung eines Transporters vermutet, der bisher jedoch noch

nicht identifiziert wurde.50,51 Auf ähnliche Weise wird Ciclosporin (Abb. 2.1 D und Tab. 2.1)

metabolisiert und transportiert.52,53 Folglich wurden diese beiden Arzneistoffe als

Testsubstanzen für kombinierte Einflüsse der Lösungsvermittler auf CYP3A4-

2 Aufgabenstellung

11

Metabolismus und Effluxtransport verwendet. Ciclosporin A stellte mit seiner deutlich

größeren Molekülmasse von 1203 Da, der hohen Lipophilie und der extrem schlechten

Wasserlöslichkeit ein Beispiel für jene „Problemarzneistoffe“ dar, für deren Formulierung

man auf die Verwendung von Lösungsvermittlern oder ähnlichem angewiesen ist.

In der tierexperimentellen Studie wurde nur der Einfluss der Lösungsvermittler PEG 400,

HPCD und SOL untersucht. Auf CrEL wurde aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit zu

SOL und des gleichen Mechanismus der Lösungsvermittlung verzichtet, um die Anzahl

der benötigten Tiere so gering wie möglich zu halten.

Für die analytische Auswertung der pharmakokinetischen Studie wurden ferner geeignete

analytische Methoden zur Quantifizierung der Modellarzneistoffe in den vorgesehenen

Probenmatrizes benötigt.

Zusammenfassend ergaben sich daraus für die vorliegende Dissertation folgende

detaillierte Aufgabenstellungen:

1. Entwicklung und Validierung analytischer Methoden zur Quantifizierung von

Paracetamol, Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A in Blut, Urin, Fäzes und

Organen sowie von Paracetamol-Konjugaten in Urin und Fäzes der Ratte.

2. Untersuchung des Einflusses der Lösungsvermittler PEG 400, HPCD, SOL und

CrEL auf die Funktion der Aufnahmetransporter OATP1A2, OATP1B1,

OATP1B3, OATP2B1 und NTCP an geeigneten zellulären Transportermodellen.

3. Charakterisierung der Pharmakokinetik von Paracetamol, Talinolol, Colchicin und

Ciclosporin A in der Ratte in An- und Abwesenheit der Lösungsvermittler

PEG 400, HPCD und SOL nach intravenöser Applikation.

12

Tab. 2.1: Physiko-chemische und pharmakokinetische (Mensch) Eigenschaften der Modellarzneistoffe.

Paracetamol Talinolol Colchicin Ciclosporin A

Molekülmasse54

151,2 Da 363,5 Da 399,4 Da 1202,6 Da

pKa54

9,9 9,5 14,8 13,3

logP54

0,48 2,98 1,07 2,79

logD (pH 7)54

0,47 0,48 1,07 2,79

BCS-Klasse 1 3 1/3 2

Aufnahme unbekannt OATP1A255

nicht identifiziert50,51

unbekannt

Efflux Konjugate: ABCC2–4, ABCG246,47

ABCB1, ABCC255

ABCB1, ABCC248

ABCB156

, ABCC253

Phase I CYP2E1, CYP1A2 u.a.57

CYP3A458

CYP3A449

CYP3A459,60

Phase II

UGT2B15, UGT1A9 u.a.;

SULT1A3/4, SULT1A1;

Phase I Metaboliten: GSTP1 u.a.57

--- Phase I Metaboliten:

UGTs; SULTs; GSTs61

UGT2B7 u.a.

62

Verteilung ~0,9 l/kg63

3 – 6 l/kg55

7 – 10 l/kg64

~4 l/kg65,66

Elimination

>85% renal, davon 4% unverändert,

55% Glukuronid, 30% Sulfat,

8% GST-Metaboliten63

<3% Hydroxylierung;

~43% unverändert renal,

~22% unverändert fäkal55

5 – 50% renal;

16 – 50% fäkal64,67

starke Metabolisierung;

Ausscheid. hauptsächl. fäkal,

~6% renal, davon 0,1%

unverändert65,66

T1/2 1,9 – 2,5 h63

10 – 17 h55

14 – 30 h64

6 – 20 h65,66

BCS, biopharmaceutics classification system; ABCC, multidrug resistance protein; ABCG2, breast cancer resistance protein; CYP, Cytochrom P450; UGT,

Uridindiphosphat-glukuronosyltransferase; SULT, Sulfotransferase; GST, Glutathion-S-Transferase; T1/2, terminale Eliminationshalbwertzeit

2 Aufgabenstellung

13

Abb. 2.1: Strukturformeln der verwendeten Modellarzneistoffe Paracetamol (A), Talinolol (B),

Colchicin (C) und Ciclosporin A (D).

A B

C D

14

3 Material & Methoden

Eine vollständige Auflistung der verwendeten Geräte, Materialien und Chemikalien sowie

Pipettierschemen für die im Folgenden beschriebenen Methoden ist im Anhang (S. 107ff)

zu finden.

3.1 In vitro Untersuchungen

Im Rahmen der in vitro Arbeiten wurde der Einfluss der Hilfsstoffe PEG 400, HPCD, SOL

und CrEL auf die Aufnahmetransporter OATP1A2, OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 und

NTCP am Zellmodell untersucht.

3.1.1 Zellkultur

Verwendete Zelllinien

Für die in vitro Untersuchungen wurde ein etabliertes zelluläres Transportermodell

verwendet. Dieses wurde bereits im Vorfeld in der Abteilung für Klinische Pharmakologie

im Rahmen anderer Projekte entwickelt und charakterisiert.68,69 Als Mutterzelllinie wurden

human embryonic kidney (HEK293) Zellen verwendet. Diese wurden mit DNA-

Fragmenten des menschlichen Adenovirus Typ 5 transfiziert, wachsen adhärent und sind

hinsichtlich der Expression endogener Proteine sehr zuverlässig.70 Verwendet wurden

Zellen, die stabil die Transportproteine OATP1A2, OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 und

NTCP exprimieren, sowie eine entsprechende Vektor-transfizierte Kontrollzelllinie (GFP).

Expression und Lokalisierung der Transportproteine wurden mittels Western-Blot und

Immunfluoreszenzmikroskopie sichergestellt. Die Funktionalität der Transporter wurde

durch Aufnahmeversuche geeigneter bekannter Substrate sowie deren Hemmung durch

bekannte Inhibitoren überprüft (Tab. 3.1, Daten zur Verfügung gestellt durch Dr. Markus

Keiser, Institut für Pharmakologie, Universität Greifswald).68,69


15

Tab. 3.1: Charakterisierung der verwendeten Zelllinien anhand geeigneter Referenzsubstrate

und -Inhibitoren.

Transporter Substrat / Inhibitor Km (µmol/l) Vmax (pmol/mg min) IC50 (µmol/l)

OATP1A2 E3S 23,1 ± 3,2 87,8 ± 3,1

TA 80,5 ± 7,8 20,5 ± 0,7

Naringin 21,3

(19,7; 23,0)

OATP1B1 E3S 0,97 ± 0,77 2,2 ± 0,4

BSP 4,2 ± 0,77 52,9 ± 3,6

Rifampicin 14,2

(12,9; 15,6)

OATP1B3 E17βG 17,7 ± 17,4 51,4 ± 35,5

BSP 10,8 ± 1,1 24,2 ± 0,96

Rifampicin 2,5

(2,2; 2,8)

OATP2B1 E3S 21,9 ± 7,6 55,7 ± 6,0

BSP 11,1 ± 4,0 22,4 ± 3,0

Rifampicin 90,8

(75,1; 110)

NTCP TA 22,1 ± 2,0 103 ± 4,2

BSP 54,6 ± 13,8 349 ± 54,6 9,0

(7,5; 10,7)

E3S, Estron-3-sulfat; TA, Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid

(Km / Vmax: arithmetischer Mittelwert ± Standardabweichung von 3 Tripletts, IC50: geometrischer

Mittelwert und geometrische Standardabweichung von 3 Tripletts; Daten zur Verfügung gestellt

durch Dr. Markus Keiser).

Kultivierung der Zellen

Sämtliche Arbeiten im Rahmen der Zellkultivierung wurden unter einer Sterilwerkbank

durchgeführt. Während des Wachstums wurden die Zellen in einem Brutschrank bei

37 °C, 5% CO2-Gehalt und 95% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert.

Zum Auftauen der in flüssigem Stickstoff gelagerten Vorratskulturen wurden diese

zunächst im Wasserbad bei 37 °C schnell aufgetaut, in 5 bis 10 ml kalter

phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendiert und anschließend 1,5 min bei

560 g in einer Kühlzentrifuge (4 °C) pelletiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die

Zellen in 10 ml Nährmedium (MEM mit Zusätzen, s. Anhang, S. 108ff) resuspendiert und

auf einer Kulturschale (Ø 10 cm, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) ausgesät. Am darauf

folgenden Tag wurden die Zellen passagiert und mit einem entsprechenden


16

antibiotikahaltigen Selektionsmedium (MEM mit Zusätzen und G418 oder Hygromycin,

s. Anhang, S. 108ff) versetzt. Im weiteren Verlauf wurden die Zellen je nach

experimentellem Bedarf und Dichte des Zellrasens ein- bis dreimal die Woche passagiert.

Zur Passage wurde nach lichtmikroskopischer Kontrolle das Medium abgesaugt, die

Kulturschale vorsichtig mit 5 ml PBS gewaschen und mit 1 ml Trypsin-Lösung inkubiert.

Die Zellen wurden in einer geeigneten Menge Selektionsmedium resuspendiert und je

nach Bedarf in unterschiedlicher Dichte auf neue Zellkulturschalen ausgesät.

3.1.2 Kompetitionsassay

Bei einem Kompetitionsassay wird der Transport eines bekannten Substrats in An- und

Abwesenheit einer zweiten Substanz (hier der Hilfsstoff), untersucht. Wird die innerhalb

einer bestimmten Zeit in die Zelle aufgenommene Substratmenge in Anwesenheit der zu

untersuchenden Substanz geringer, handelt es sich im Falle der Aufnahmetransporter um

einen Inhibitor (Abb. 3.1).

Abb. 3.1: Prinzip des Kompetitionsassays.

Ansatz der Lösungen zur Inkubation

Für den Ansatz der Inkubationslösungen wurden die für den Transporter jeweils

geeigneten Referenzsubstanzen (Tab. 3.2) in Inkubationspuffer gelöst. Zur

Quantifizierung der aufgenommenen Menge des Referenzsubstrates wurden

entsprechende Tritium (3H) -markierte Substanzen verwendet. Diesen Lösungen wurden

bis zu 10% (w/v) Hilfsstoff zugesetzt (Endkonzentration s. Tab. 3.3, Pipettierschema im

Anhang, S. 110ff). Zur Überprüfung der Funktionalität und Aktivität der Transportproteine

wurde in einer Positivkontrolle statt des Hilfsstoffs ein geeigneter Inhibitor zu den Zellen

gegeben (Tab. 3.2).

Transporter Substrat Inhibitor

vs.


17

Tab. 3.2: Verwendete Substrate und Referenzinhibitoren im Kompetitionsassay.

Transporter Substrate 3H-Substrate Referenzinhibitoren

OATP1A2 1 µM E3S 5 nM

3H-E3S 0,5 mM Naringin

10 µM TA 54 nM 3H-TA 0,5 mM Naringin

OATP1B1 1 µM E3S 5 nM

3H-E3S 1 mM Rifampicin

40 nM BSP 10 nM 3H-BSP 1 mM Rifampicin

OATP1B3 10 µM E17βG 6 nM

3H-E17βG 1 mM Rifampicin

1 µM BSP 10 nM 3H-BSP 1 mM Rifampicin

OATP2B1 1 µM E3S 5 nM

3H-E3S 1 mM Rifampicin

1 µM BSP 10 nM 3H-BSP 1 mM Rifampicin

NTCP 10 µM TA 54 nM

3H-TA 1 mM BSP

1 µM BSP 10 nM 3H-BSP 1 mM TA

E3S, Estron-3-sulfat; TA, Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid

Tab. 3.3: Verwendete Hilfsstoffkonzentrationen im Kompetitionsassay.

Transporter Hilfsstoffkonzentration (% w/v)

& Substrat PEG 400 HPCD SOL CrEL

OATP1A2

E3S 1 10-3

– 10 3 10-4

– 0,1 3 10-3

– 1 3 10-5

– 0,01

TA 1 10-3

– 10 3 10-3

– 1 3 10-4

– 0,1 3 10-5

– 0,01

OATP1B1

E3S 0,03 – 10 3 10-3

– 1 3 10-3

– 1 0,03 – 10

BSP 0,03 – 10 0,03 – 10 0,03 – 10 0,03 – 10

OATP1B3

E17βG 0,03 – 10 3 10-4

– 0,1 3 10-4

– 0,1 3 10-4

– 0,1

BSP 0,03 – 10 0,03 – 10 3 10-3

– 1 3 10-4

– 0,1

OATP2B1

E3S 0,03 – 10 3 10-4

– 0,1 3 10-3

– 1 3 10-4

– 0,1

BSP 0,03 – 10 0,03 – 10 3 10-4

– 0,1 3 10-4

– 0,1

NTCP

TA 0,03 – 10 0,03 – 10 0,03 – 10 0,03 – 10

BSP 0,03 – 10 0,03 – 10 3 10-3

– 1 3 10-3

– 1

E3S, Estron-3-sulfat; TA, Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-

glukuronid; PEG, Polyethylenglykol; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin; SOL, Solutol HS15;

CrEL, Cremophor EL


18

Durchführung des Kompetitionsassays

Die Zellen in den Kulturschalen wurden wie bei der Passage gewaschen und trypsiniert.

Nach Bestimmung der Zellzahl (CASYone Zellzähler, Schärfe System, Reutlingen,

Deutschland) wurden 150.000 Zellen / well in antibiotikafreiem Nährmedium (MEM mit

Zusätzen, s. Anhang, S. 108ff) auf 24-well-Platten (Falcon, BD Biosciences, Heidelberg,

Deutschland) ausgesät. Bei der Durchführung der Transportversuche wurde auf das

Selektionsantibiotikum verzichtet, da auch Antibiotika Transportproteine beeinflussen

können und somit beim Versuch stören könnten.71,72 Nach Erreichen einer 100%igen

Konfluenz wurden die Zellen mit auf 37°C vorgewärmten PBS gewaschen und mit 150 µl

der jeweiligen Inkubationslösung für 5 min bei 37 °C inkubiert (Abb. 3.2). Innerhalb dieses

Zeitraums folgt die Aufnahme einer Kinetik 1. Ordnung und ist damit linear (Daten aus der

Charakterisierung).68,69 Zum Abschluss des Transportversuchs wurden die Inkubations-

lösungen abgesaugt und die Zellen dreimal mit kaltem PBS gewaschen. Die Zellen

wurden anschließend in 800 µl Lysis-Puffer (Zusammensetzung s. Anhang, S. 108ff)

lysiert und homogenisiert.

Abb. 3.2: Beispiel einer Plattenbelegung

im Kompetitionsassay für einen

Versuch mit einem Transporter

im Konzentrationsbereich

0,0316 – 10% (w/v) im Triplett.

Analytik

Die intrazelluläre Substratmenge wurde mit Hilfe eines β-Counters (type 1409, LKB-

Wallac, Turku, Finnland) nach Zelllyse bestimmt. Dazu wurden 200 µl des

homogenisierten Zelllysats mit 2 ml der Szintillationsflüssigkeit (Rotiszint eco plus, Roth,

Karlsruhe, Deutschland) im Szintillationsröhrchen gemischt und im β-Counter vermessen.

Beim liquid scintillation counting wird die emittierte β-Strahlung der 3H-markierten

Referenzsubstrate von den Lösungsmittelmolekülen der Szintillationsflüssigkeit

aufgenommen und auf die Moleküle des Primärszintillators und weiter auf den

Sekundärszintillator übertragen. Die so angeregten Moleküle emittieren beim Zurückfallen

0% Hilfsstoff

10% Hilfsstoff

3,16% Hilfsstoff

1% Hilfsstoff

0,316% Hilfsstoff

0,1% Hilfsstoff

0,0316% Hilfsstoff

Referenzinhibitor


19

auf ein niedrigeres Energieniveau Photonen, die als Lumineszenz vom

Szintillationsspektrometer gemessen werden.

Zusätzlich erfolgte eine Proteinbestimmung mittels eines Bicinchoninsäure-Kits (Pierce

BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific, Rockford, USA) zur Normierung der

aufgenommenen Menge des Substrats auf die Zellzahl. Dies war notwendig, da durch die

verschiedenen Waschvorgänge ein Teil der Zellen abgewaschen wurde und somit eine

unterschiedliche Anzahl von Zellen in jedem well vorhanden war.

Dabei wird in Anwesenheit von Proteinen konzentrationsabhängig Cu2+ zu Cu+ reduziert.

Dieses bildet mit Bicinchoninsäure einen violetten Chelatkomplex, der kolorimetrisch

ausgewertet werden kann. Die Messung der Absorption erfolgte in einem

Plattenphotometer (Tecan infinite M200, Tecan, Crailsheim, Deutschland) bei 562 nm. Die

Proteinmenge wurde mittels einer Kalibriergeraden (bovines Serumalbumin, 0 - 50 µg,

ungewichtete lineare Regression) berechnet.

Datenauswertung

Nach Normalisierung der gemessen Radioaktivität auf den Proteingehalt und Korrektur

auf den Anteil an markiertem Substrat wurde die Substrataufnahme ins Zellinnere

entsprechend nachfolgender Formel berechnet:

Substrataufnahme in pmol/mg min

korrigierte, normalisierte Aktivität in µCi/µg

spezifische Aktivität des markierten Substrats in Ci/mmol

Inkubationszeit in min

Die Transporter-abhängige Nettoaufnahme errechnete sich als Differenz aus der

Aufnahme in Transporter-transfizierte und Vektor-transfizierte Zellen. Alle Versuche

wurden mindestens dreimal in Triplikaten durchgeführt und zur Auswertung der

arithmetische Mittelwert über alle Versuche herangezogen. Die so erhaltenen Werte

wurden auf die Aufnahme in Abwesenheit der Hilfsstoffe normalisiert (entsprechend 100%

Aufnahme). Die Konzentration an Hilfsstoff, bei der eine halbmaximale Hemmung der

Substrataufnahme auftrat (IC50, geometrisches Mittel), wurde berechnet, indem mittels

nicht-linearer Regression durch die GraphPad Prism Software (GraphPad, San Diego,

USA) eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve an die Daten in halblogarithmischer


20

Auftragung angepasst wurde. Der maximale inhibitorische Effekt wurde als bottom of the

curve berechnet oder gleich Null gesetzt, wenn der Wert ansonsten negativ wäre.

3.1.3 Zellviabilität

Die Zellviabilität wurde bestimmt, um eine scheinbare Aufnahme-Hemmung auf Grund

toxischer Effekte der Hilfsstoffe auszuschließen bzw. beurteilen zu können. Sie wurde mit

Hilfe eines Resazurinassays (PrestoBlue, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) überprüft.

Resazurin ist ein blauer Redoxfarbstoff, der in den Mitochondrien lebender Zellen zum

blass rosanen Resorufin reduziert wird. Das Ausmaß der Entfärbung über die Zeit

korreliert mit dem Anteil lebender Zellen.

Für diesen Versuch wurden jeweils 25.000 Zellen in einer 96-well-Platte (nunc, Thermo

Scientific, Roskilde, Dänemark) ausgesät und nach Erreichen der Konfluenz mit Farb- und

Hilfsstoff-haltigem Medium inkubiert. Untersucht wurden entsprechend den

Transportversuchen jeweils eine hohe und eine niedrige Hilfsstoffkonzentration (Tab. 3.4).

Tab. 3.4: Verwendete Hilfsstoffkonzentrationen im Viabilitätsassay.

Hilfsstoffkonzentration (% w/v)

Transporter PEG 400 HPCD SOL CrEL

OATP1A2 1; 10 0,1; 1 0,1; 0,5 1; 10

OATP1B1 1; 10 1; 10 1; 10 1; 10

OATP1B3 1; 10 1; 10 0,1; 0,5 1; 10

OATP2B1 1; 10 1; 10 0,1; 0,5 1; 10

NTCP 1; 10 1; 10 0,1; 0,5 1; 10

PEG, Polyethylenglykol; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin; SOL, Solutol HS15; CrEL,

Cremophor EL

Als Referenzwerte dienten reines Medium (MEM mit Zusätzen, s. Anhang, S. 108ff),

Medium mit Resazurin, sowie Zellen mit gefärbtem Medium ohne Hilfsstoff. Nach 0, 1, 2

und 4 h wurde im Plattenphotometer (Tecan infinite M200) die Absorption bei 570

(reduzierte Form) und 595 (oxidierte Form) nm gemessen. Die Zellviabilität in der mit

Hilfsstoff behandelten Probe ergab sich als prozentualer Anteil reduzierten Resazurins im

Verhältnis zur Hilfsstoff-freien Vergleichsprobe. Der Anteil reduzierten Resazurins wurde

wie folgt berechnet:


21

Anteil reduzierten Resazurins in %

Absorption der Probe bei 570 bzw. 595 nm

Differenz der Absorption von Medium mit und ohne Resazurin bei

570 bzw. 595 nm

Der Versuch wurde in Triplikaten durchgeführt und mindestens einmal wiederholt.

3.1.4 Bestimmung der kritischen Mizellbildungskonzentration

Die CMC der Emulgatoren SOL und CrEL in Inkubationspuffer wurde bestimmt, um einen

möglichen Einfluss der Mizellbildung auf die Substrataufnahme beurteilen zu können. Sie

wurde anhand der konzentrationsabhängigen Veränderung der Oberflächenspannung

ermittelt. Unterhalb der CMC nimmt die Oberflächenspannung mit zunehmender

Emulgatorkonzentration ab, da sich die Monomeren zunächst an Grenzflächen anlagern.

Mit Einsetzen der Mizellbildung werden keine weiteren Monomeren mehr an Grenzflächen

angelagert und die Oberflächenspannung bleibt annähernd konstant.

Für die Berechnung der CMC wurde die Oberflächenspannung von Inkubationspuffer und

von sieben Hilfsstoffverdünnungen im Konzentrationsbereich von 0,001 bis 0,1% (w/v) mit

einem Ringtensiometer (K11 MK3, Krüss, Hamburg, Deutschland) in zehnfacher

Wiederholung bestimmt. Mittels ungewichteter linearer Regression wurden die

Geradengleichungen der beiden Abschnitte unter- und oberhalb der CMC ermittelt. Die

CMC berechnete sich als Schnittpunkt dieser beiden Geraden.

3.2 Tierexperimentelle Arbeiten

Mit der tierexperimentellen Studie wurde der Einfluss der Hilfsstoffe PEG 400, HPCD und

SOL auf die Pharmakokinetik und Organverteilung der Modellarzneistoffe Paracetamol,

Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A nach einmaliger und mehrmaliger intravenöser

Applikation untersucht.


22

Tierkollektiv und Tierhaltung

Die tierexperimentelle Studie wurde durch das Landesamt für Landwirtschaft,

Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern (Aktenzeichen LALLF M-

V/TSD/7221.3-1.1-029/08) genehmigt und am Institut für Diabetes „Gerhardt Katsch“ e.V.,

Karlsburg durchgeführt. Die Untersuchungen wurden an männlichen Wildtyp-Wistarratten

(Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland) mit einem Gewicht von ca. 250 bis 400 g

(Alter ca. 3 Monate) vorgenommen. Die Haltung erfolgte unter Standardbedingungen in

einem 12 h Hell-Dunkel-Rhythmus (Licht von 6:00 bis 18:00 Uhr) in Polycarbonatkäfigen

auf sterilisierter Standardeinstreu (Lignocel 3-4, steril, sniff, Soest, Deutschland). Auf

Grund der Instrumentierung (s.u.) war eine Einzeltierhaltung notwendig. Die Tiere hatten

ad libitum Zugang zu Standard Futterpellets (R/M-H extrudiert, V1326, sniff, Soest,

Deutschland) und angesäuertem Wasser (mit HCl auf pH 3 zur Keimreduktion). Zur

Überwachung des Gesundheitszustandes wurden die Tiere vor der Katheterimplantation

einmal und anschließend dreimal pro Woche gewogen.

Instrumentierung der Tiere

Nach Einstallung wurde den Ratten vor der Instrumentierung eine einwöchige

Adaptationsphase gewährt. Zur sicheren, schmerz- und stressarmen, wiederholten

Arzneistoffapplikation und Blutentnahme wurden die Tiere mit einem arteriellen und einem

venösen Katheter versehen. Zur Vorbereitung wurden die Katheter mit Penicillin G

und / oder Heparin vorbehandelt (s. Anhang, S. 113) und mit Markierungen sowie einem

Stopper und einem Verschluss versehen. Unter Vollnarkose (25 µl Xylazin 2% und 50 µl

Ketamin 10% pro 100 g intraperitoneal, ggf. Sevofluran inhalativ zur Aufrechterhaltung der

Narkose) wurde das Operationsfeld (Kehl- u. Nackenbereich) rasiert und desinfiziert. Dem

Tier in Rückenlage wurde die Haut am Hals mittels Skalpell eröffnet und die Arteria carotis

sinister und die Vena jugularis dexter stumpf frei präpariert (Abb. 3.3 A). Zur Insertion der

Katheter wurden um Arterie und Vene jeweils zwei Ligaturen gelegt und die Gefäße mit

einer gebogenen 21G Kanüle angestochen. Das offene Ende des mit Kochsalzlösung

gefüllten Katheters wurde mit einer Insertionshilfe im Gefäß platziert und mit den

Ligaturen fixiert (Abb. 3.3 B). Der Katheter wurde im Anschluss mit Kochsalz-

Heparinlösung (500 I.E./ml) aufgefüllt und verschlossen. Im nächsten Schritt wurde das

Tier in Bauchlage gebracht und die Haut im Nacken über eine Länge von ca. 0,5 cm

eröffnet. Von hier aus wurden die verschlossenen Katheterenden subkutan links-seits in

den Nacken geführt und dort beim Wundverschluss mittels aufgeklebtem Stopper unter

der Haut fixiert, um ein Herausziehen des Katheters zu verhindern. Am Ende des Eingriffs

wurden die Operationswunden am Hals und im Nacken verschlossen.


23

Die Katheter wurden 3x wöchentlich auf Funktionsfähigkeit geprüft und mit Kochsalz-

Heparinlösung (500 I.E./ml) gespült. Zwischen der Instrumentierung und dem

Versuchsbeginn wurde den Tieren eine weitere Woche zur Wundheilung und Adaptation

an die Handhabung der Katheter gewährt.

Abb. 3.3: Inzisionsstelle (A) und Platzierung des Katheters in der Arteria carotis73

(B).

Herstellung der Injektionslösungen

Die in der tierexperimentellen Studie

angewendeten Injektionslösungen wurden

unter aseptischen Bedingungen täglich

frisch hergestellt (Konzentration laut Tab.

3.6) und bis zur Verwendung fest

verschlossen bei Raumtemperatur bzw.

gekühlt (Ciclosporin A) gelagert. Die dafür

als Lösungsmittel benötigten Hilfsstoff-

lösungen wurden in ausreichender Menge

für den aktuellen Durchgang aseptisch mit

kommerziell erworbenem aqua ad

injectabilia angesetzt (Konzentration laut

Tab. 3.5: Hilfsstoffkonzentration der

Injektionslösungen.

Hilfsstoff Konzentration

NaCl 0,9% (w/v)

PEG 400 50% (w/v)

HPCD 30% (w/v)

SOL 10% (w/v)

PEG 400, Polyethylenglykol 400; HPCD,

Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin, SOL, Solutol

HS15

Tab. 3.5) und fest verschlossen gekühlt gelagert. Die als Referenzlösungsmittel

eingesetzte isotone Kochsalzlösung wurde ebenfalls kommerziell erworben. Die

Nervus vagus

Katheterinsertion in

die Arteria carotis

vordere Ligatur

hintere Ligatur

dorsal in den

Nackenbereich

geführtes

Katheterende

A B


24

Lösungsmittel wurden vor Verwendung für die Herstellung der Injektionslösungen

nochmals sterilfiltriert.

Tab. 3.6: Tagesdosis und Arzneistoffkonzentration der Injektionslösungen.

Arzneistoff Tagesdosis Konzentration

single dose

Konzentration

multiple dose

Paracetamol 5 mg/kg 2,5 mg/ml 1,25 mg/ml

Talinolol 5 mg/kg 2,5 mg/ml 1,25 mg/ml

Colchicin 0,1 mg/kg 0,05 mg/ml 0,025 mg/ml

Ciclosporin A 0,1 mg/kg 0,025 mg/ml 0,0125 mg/ml

Studienprotokoll

Eine Woche nach der Instrumentierung der Tiere wurde der Versuch durchgeführt (Abb.

3.4). Er untergliederte sich in eine single dose (Tag 1) und eine multiple dose (Tag 2 – 5)

Phase. Zur Applikation und Blutentnahme wurden die nicht narkotisierten Tiere durch eine

Hilfsperson leicht fixiert. Durch vorausgegangene Gewöhnung an die Handhabung der

Katheter sollte Stress während der Versuchsdurchführung vermieden werden. Die

Arzneistoffapplikationen erfolgten über den Venenkatheter, die Blutentnahmen über den

Arterienkatheter. Nach der Arzneistoffapplikation wurde der Venenkatheter zur

vollständigen Überführung der Injektionslösung in den Blutkreislauf mit ca. 100 µl isotoner

Kochsalzlösung nachgespült und anschließend wieder mit Kochsalz-Heparinlösung

(500 I.E./ml) aufgefüllt. Bei den Blutabnahmen wurden die ersten Flüssigkeitstropfen

verworfen (Heparinlösung!) und dann ca. 200 µl Blut in einem heparinisierten 0,5 ml

Plastikreaktionsgefäß gesammelt. Anschließend wurde der Katheter wieder mit Kochsalz-

Heparinlösung gefüllt. Die Blutproben wurden nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff

schockgefroren. Die dadurch bedingte Lyse der enthaltenen Blutzellen war beabsichtigt,

um den darin enthaltenen Arzneistoffanteil bei der Analytik des Vollblutes mit zu erfassen.

Am ersten Tag wurde morgens (ca. 8:00 Uhr) die volle Tagesdosis appliziert, gefolgt von

wiederholten Blutabnahmen über einen Zeitraum von 24 h (0, 2, 8, 15, 45 min, 1, 2, 4, 8,

12, 24 h, single dose Kinetik). An den folgenden Tagen erhielten die Tiere im Abstand von

12 h (ca. 8:00 und 20:00 Uhr) die halbe Tagesdosis. An Tag 4 wurde nach der

morgendlichen Applikation erneut über einen Zeitraum von 12 h Blut entnommen (0, 2, 8,

15, 45 min, 1, 2, 4, 8, 12 h, multiple dose Kinetik). Nach der abendlichen Applikation

wurden die Tiere in Stoffwechselkäfige verbracht und für 12 h Urin und Fäzes gesammelt.

Am nächsten Morgen wurden die Tiere tierschutzgerecht getötet (s.u.) und die Organe


25

entnommen. Dazu wurde unter Inhalationsnarkose (Sevofluran) der Bauchraum geöffnet,

die Aorta abdominalis zur finalen Blutentnahme punktiert (Vacutainer Blutentnahme-

system, BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) und anschließend zum vollständigen

Entbluten die Blutgefäße durchtrennt. Es wurden Gehirn, Herz, Leber, Nieren, Testes und

Darm in der angegebenen Reihenfolge entnommen. Die Darmabschnitte Duodenum (vom

Magenausgang bis zum Ende des anhaftenden Pankreas), Jejunum, Ileum (die letzten ca.

10 cm vor dem Caecum) und Colon wurden jeweils mit Inhalt abgebunden und

voneinander getrennt. Die entnommenen Organe wurden auf Filterpapier abgetupft, eine

ca. erbsengroße Biopsie zur mRNA-Isolation entnommen (Lokalisation laut Tab. 3.7) und

diese im 1 ml Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Das übrige Organ

(Darmabschnitte mit Inhalt und Ligatur) wurde gewogen und in Plastikreaktionsgefäßen

(10 bzw. 50 ml) ebenfalls schockgefroren. Sämtliche mRNA-Proben sowie alle Proben der

Ciclosporin A-Gruppen wurden bis zur Analyse bei -80 °C, alle anderen bei -20 °C

gelagert.

Abb. 3.4: Schematische Darstellung des Studienablaufs (rot: Blutentnahmeperiode, gelb:

Sammelintervall für Urin, braun: Sammelintervall für Fäzes).

Tab. 3.7: Lokalisation der Entnahmestellen der mRNA-Proben.

Organ Lokalisation der mRNA-Probe

Gehirn vordere Spitze der rechten Hemisphäre

Herz Herzspitze

Leber Spitze des rechten unteren Leberlappens

Nieren oberer Pol der rechten Niere

Testes oberer Pol des rechten Testikels

Darmabschnitte jeweils die ersten 1 bis 2 cm,

mit NaCl gesäubert

24 h single dose

Kinetik

1. Tag 2. Tag 3. Tag 4. Tag 5. Tag

i.v. Applikation Organentnahme

12 h multiple

dose Kinetik

12 h Stoff-

wechselkäfig


26

3.3 Arzneistoffanalytik

Die Arzneistoffanalytik wurde in einem nach GLP zertifizierten Labor am Institut für

Pharmakologie der Universität Greifswald durchgeführt. Zu allen verwendeten

Referenzsubstanzen lagen Analysenzertifikate der Hersteller vor. Die Quantifizierung der

Arzneistoffe in den verschiedenen Probenmatrizes erfolgte mittels LC-MS/MS bzw.

HPLC-UV (Paracetamol) (Tab. 3.8). Die Methoden wurden entsprechend internationaler

Richtlinien validiert74,75 und in Standardarbeitsanweisungen dokumentiert. Die

Probenaufarbeitung erfolgte mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion bzw. Proteinfällung (Tab.

3.8).

Tab. 3.8: Extraktion, Detektion und Arbeitsbereich der Analyten.

Analyt Matrix Extraktion Detektion Arbeitsbereich

Paracetamol

Vollblut

Flüssig-Flüssig-Extraktion HPLC-UV

(LaChrom Elite)

5 – 7000 ng/ml

Urin 50 – 5000 ng/ml

Fäzes 10 – 1000 ng/ml

Organe Flüssig-Flüssig-Extr. nach

Proteinfällung 2,5 – 250 ng/ml

Paracetamol-

Konjugate

Urin Flüssig-Flüssig-Extr. nach

Konjugatspaltung

HPLC-UV 50 – 5000 ng/ml

Fäzes LC-MS/MS

(API4000) 10 – 1000 ng/ml

Talinolol

Vollblut

Flüssig-Flüssig-Extraktion LC-MS/MS

(API2000)

5 – 8000 ng/ml



Organe 5 – 8000 ng/ml

Colchicin

Vollblut

Flüssig-Flüssig-Extraktion LC-MS/MS

(API3000)

0,5 – 250 ng/ml

Urin 100 – 1500 ng/ml


Organe 0,5 – 100 ng/ml

Ciclosporin A

Vollblut

Proteinfällung LC-MS/MS

(API3000)

1 – 500 ng/ml



Organe 1 – 500 ng/ml

HPLC-UV: LaChrom Elite, VWR Hitachi, Darmstadt, Deutschland; LC-MS/MS: API2000/3000/4000,

Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland


27

Kalibratoren und Qualitätskontrollen wurden durch Zusatz von sukzessiv verdünnten

Stammlösungen zur entsprechenden Leermatrix (Tab. 3.9, S. 29) und anschließender

Aufarbeitung erstellt.

Die Auswertung der Chromatogramme erfolgte nach der Internen Standard-Methode über

das Peakflächen-Verhältnis (LC-MS/MS) mit Hilfe der Analyst Software (Applied

Biosystems, Darmstadt, Deutschland) bzw. über das Peakhöhen-Verhältnis (HPLC-UV)

mit EZChrom Elite (Agilent, Böblingen, Deutschland) und WinVal (Frank Siegmund,

Berlin, Deutschland). Die Kalibrierfunktionen wurden mit 1/x gewichteter linearer

(Paracetamol, Talinolol, Colchicin) bzw. quadratischer (Ciclosporin A) Regression

berechnet und die Konzentrationen in den Messproben anhand der Kalibrierfunktionen

berechnet.

Validierung

Die Validierung erfolgte nach den Richtlinien der Food and Drug Administration (FDA) und

der International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for

Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH).74,75 Es wurden die Parameter

Bestimmungsgrenze (limit of quantitation, LOQ), Arbeitsbereich, Linearität / Korrelation,

Präzision & Richtigkeit sowie Stabilität bestimmt und statistisch ausgewertet.

Als LOQ galt der kleinste Kalibrierwert, der eine Präzision und Richtigkeit von ± 20%

(Primärkriterium) und ein Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens 1:5

(Sekundärkriterium) aufweisen sollte. Der Arbeitsbereich wurde entsprechend der zu

erwartenden Konzentrationen ausgewählt. Die Validität des jeweiligen

Konzentrationsbereiches wurde anhand von 6 Kalibrationsreihen beurteilt. Präzision und

Richtigkeit (s.u.) sollten innerhalb von ± 15% (LOQ: ± 20%) liegen. Die Korrelation der

Kalibrierfunktion wurde mit Hilfe des Korrelationskoeffizienten der 6 Kalibrationsreihen

sichergestellt. Der Korrelationskoeffizient sollte > 0,995 sein.

Die within day Präzision und Richtigkeit wurden anhand von 6 Qualitätskontrollsätzen

innerhalb einer Messung nach den unten stehenden Formeln 4 bis 6 berechnet. Für die

between day Präzision und Richtigkeit wurden die Kalibriergeraden und Qualitäts-

kontrollsätze von 6 unterschiedlichen Messungen ausgewertet. Die entsprechenden

Daten sind als Qualitätsparameter bei den jeweiligen Methoden wiedergegeben.

Die genannten Parameter wurden jeweils für die Matrizes Vollblut, Urin, Fäzes und

Organhomogenat separat validiert.


28

√∑

Mittelwert

Sollwert

Standardabweichung

Anzahl der Bestimmungen

Die Stabilitätsuntersuchungen setzten sich aus der Stabilität der Stammlösung (SL) und

der Arbeitslösung (AL) der Analyten und Internen Standards (IS), der Stabilität der

aufgearbeiteten Proben im Probengeber (Rack-Stabilität) sowie der Stabilität der Analyten

in der Probenmatrix zusammen. Für alle Stabilitätsuntersuchungen wurde die für die

Präzision und Richtigkeit erlaubte Abweichung von ± 15% als Grenze definiert.

Zur Bestimmung der Lagerstabilität von Analyten und IS in der SL und AL wurden

entsprechende Lösungen (Zusammensetzung s. Anhang, S. 115ff ggf. mit reduzierter

Konzentration für eine Signalintensität innerhalb des linearen Bereichs des Detektors)

frisch hergestellt und sofort (Initialwert, 100%) sowie nach geeigneten Zeiträumen

entsprechender Lagerung (Lagerung s. „Herstellung der Lösungen“ in den jeweiligen

Kapiteln der Arzneistoffe, S. 30ff, ggf. aliquotiert bei unzureichender Gefrier-Tau-Stabilität,

s.u.) wiederholt vermessen. Bei tiefgekühlt zu lagernden Lösungen wurde außerdem die

Gefrier-Tau-Stabilität bestimmt. Hierzu wurden entsprechende Lösungen sofort nach

Herstellung und nach mehreren Einfrier- und Auftau-Zyklen vermessen. Zur Auswertung

wurden die Peakflächen der einzelnen Substanzen herangezogen und in Prozent des

Initialwertes angegeben. Anhand der Ergebnisse wurden zur Sicherstellung einer

gleichbleibenden Konzentration der Lösungen entsprechende Haltbarkeitsbegrenzungen

und Lagerungsvorschriften für die SL und AL definiert (s. „Herstellung der Lösungen“ in

den jeweiligen Kapiteln der Arzneistoffe, S. 30ff).

Zur Bestimmung der Rack-Stabilität wurden die 6 Qualitätskontrollsätze der within day

Präzision nach einer angemessenen Wartezeit (mind. 8 h, max. 24 h) im Probengeber

erneut injiziert, anhand der Kalibration quantifiziert und in Prozent des Initialwertes

angegeben (s. „Probenaufarbeitung“ in den jeweiligen Kapiteln der Arzneistoffe, S. 30ff).

Diese Daten dienten als Rationale zur Aufarbeitung einer größeren Anzahl von Proben

(verbunden mit längerer Wartezeit im Probengeber) sowie ggf. zur Wiederholung von

Injektionen zu einem späteren Zeitpunkt.


29

Zur Beurteilung der Stabilität der Arzneistoffe in der Probenmatrix wurden die Gefrier-Tau-

Stabilität (s.o.) sowie die Lagerstabilität bei -20 °C (Paracetamol, Talinolol, Colchicin) bzw.

-80 °C (Ciclosporin A) mittels 6 Qualitätskontrollsätzen pro Messpunkt bestimmt

(Auswertung über die anhand der Kalibrationsreihe berechnete Konzentration).

Die Stabilität im Probengeber und in der Matrix wurde jeweils nur in Vollblut stellvertretend

für alle Matrizes gemessen, da für alle biologischen Matrizes die gleiche Stabilität

angenommen wurde. Für Talinolol wurde auf eine Erhebung von Stabilitätsdaten

verzichtet, da diese Substanz bereits seit vielen Jahren am Institut für Pharmakologie

etabliert ist und auf die Haltbarkeitsbegrenzungen und Lagerungsvorschriften früherer

Standardarbeitsanweisungen zurückgegriffen werden konnte.

Biologisches Referenzmaterial

Während der Methodenentwicklung,

Validierung und Probenmessung wurde

biologisches Referenzmaterial ohne die

zu untersuchenden Analyten (Leer-

matrix) benötigt, u.a. für die Erstellung

von Kalibriergeraden. Aus Gründen der

Verfügbarkeit wurde für die meisten

Probenmatrizes ersatzweise eine ver-

gleichbare Matrix von einer anderen

Tab. 3.9: Verwendete Leermatrizes.

Probenmatrix Leermatrix

Rattenvollblut humanes Vollblut

Rattenurin Humanurin bzw. Rattenurin

(Paracetamol)

Rattenfäzes Rattenfäzes

Rattenorgane Organhomogenat vom

Schwein

Spezies verwendet (Tab. 3.9). Humanes Vollblut wurde von der Transfusionsmedizin der

Universitätsmedizin Greifswald in Form von abgelaufenen Eigenblutspenden zur

Verfügung gestellt. Urin, Fäzes und Organe der Ratte wurden während der Tierstudie von

6 unbehandelten Tieren desselben Stammes gewonnen, bei denen ein oder beide

Katheter versagt hatten und daher nicht für die Studie verwendet werden konnten. Organe

vom Schwein (tiefgekühlt) stammten vom Schlachter (Jörg Hartmann

Schweinemastbetrieb und Partyservice, Behrenhoff, Deutschland).

Die festen Probenmatrizes Fäzes und Organe wurden mit Wasser im Verhältnis 1:5

(Fäzes) und 1:3 (Organe) bzw. 1:2,5 (Gehirn) mit Hilfe eines Stabmixers (Ultraturrax T25

basis, IKA-Labortechnik, Staufen, Deutschland) homogenisiert. Die Organersatzmatrix

vom Schwein bestand zu gleichen Teilen aus Herz-, Leber- und Nierenhomogenat. Die

Verwendbarkeit der Ersatzmatrizes wurde während der Methodenentwicklung und

Validierung einmalig anhand von Qualitätskontrollen mit der jeweiligen Rattenleermatrix

überprüft. Lediglich vom Fäzes war auf Grund der größeren Menge und starken

Verdünnung ausreichend Leermatrix der Ratte vorhanden, um für alle Arzneistoffe die

vollständige Validierung und Probenmessung mit der Originalmatrix durchführen zu


30

können. Des Weiteren war für diese Matrix am ehesten auf Grund des Einflusses der

Ernährung mit einem relevanten Unterschied in der Zusammensetzung zwischen den

Spezies (z.B. Ratte vs. Mensch) zu rechnen.

3.3.1 Paracetamol

Herstellung der Lösungen, Kalibratoren und Qualitätskontrollen

Die SL von Paracetamol und dem IS 7β-Hydroxyethyltheophyllin (je 1 mg/ml) wurden mit

10%igem Methanol (MeOH) hergestellt. Die AL (Paracetamol: 100 – 0,1 µg/ml; 7β-

Hydroxyethyltheophyllin: 10 µg/ml) wurden durch sukzessive Verdünnung mit bi-

destilliertem Wasser zubereitet (s. Anhang, S. 115). Die AL beider Substanzen wurden

monatlich frisch aus den tiefgekühlten SL angesetzt und im Kühlschrank gelagert (Gehalt

der SL nach 3 Monaten bei -20 °C: Paracetamol: 107%, 7β-Hydroxyethyltheophyllin:

112%; stabil über mind. 5 Gefrier-Tau-Zyklen; Gehalt der AL nach 33 Tagen im

Kühlschrank: Paracetamol: 90,5%, 7β-Hydroxyethyltheophyllin: 98%; s. Anhang, S. 120f).

Die Kalibratoren und Qualitätskontrollen wurden in folgenden Konzentrationen

entsprechend dem Pipettierschema im Anhang (S. 116) angesetzt:

Kalibratoren:

Vollblut: 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000, 4000, 7000 ng/ml

Urin: 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000 ng/ml

Fäzes: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ng/ml

Organe: 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 250 ng/ml

Qualitätskontrollen:

Vollblut: 30, 1000, 6000 ng/ml

Urin: 100, 750, 4000 ng/ml

Fäzes: 30, 150, 750 ng/ml

Organe: 7,5, 30, 150 ng/ml

Probenaufarbeitung

Paracetamol in Vollblut, Urin, Fäzes:

200 µl (Vollblut), 100 µl (Urin) bzw. 500 µl (Fäzes) Probenmatrix wurden mit 25 µl

(Vollblut) bzw. 50 µl (Urin, Fäzes) des IS (AL 7β-Hydroxyethyltheophyllin) versetzt und

gemischt. Nach Zusatz von 2 ml (Vollblut), 1 ml (Urin) bzw. 2,5 ml (Fäzes) eines Lösungs-

mittelgemisches bestehend aus 50% tert-Butylmethylether und 50% Essigsäureethylester

wurde für 15 min bei Raumtemperatur im Horizontalschüttler extrahiert. Anschließend


31

wurden die Proben 2 min lang zentrifugiert (2021 g, 4 °C), die organische Phase

abgenommen und bei 50 °C im Luftstrom zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde

mit 75 µl (Vollblut) bzw. 100 µl (Urin, Fäzes) einer Mischung aus 93% 25 mM

Triethylammoniumphosphat-Puffer (TEAP, pH 3) und 7% Acetonitril (ACN) aufgenommen,

erneut zentrifugiert (5 min, 11.200 g, Raumtemperatur) und 70 µl des Überstands in

Mikroliterprobengefäße überführt.

Die extrahierten Proben waren für mindestens 24 h im Probengeber stabil (Rack-

Stabilität: 104,6% ± 1,5% nach 24 h; n = 14). Anhand von Qualitätskontrollproben wurde

gezeigt, dass Paracetamol während mehrmonatiger Lagerung bei -20 °C im Vollblut stabil

bleibt (Gehalt 91,2% ± 6,8% nach 69 Tagen bei -20 °C; n = 9) und mehrmals aufgetaut

und wieder eingefroren werden kann (Gehalt 94,3% ± 4,3% nach 3 Gefrier-Tau-Zyklen;

n = 9).

Für die Bestimmung von Paracetamol im Urin musste als Leermatrix Rattenurin

eingesetzt werden, da Humanurin unter den gegebenen Bedingungen unzählige

Störpeaks im Chromatogramm (UV-Detektion!) erzeugte.

Paracetamol in Organen:

500 µl Organhomogenat wurden mit 25 µl des IS (AL 7β-Hydroxyethyltheophyllin) versetzt

und gemischt. Durch Zusatz von 500 µl eiskaltem ACN wurde eine Proteinfällung

durchgeführt. Ohne Abtrennung der ausgefällten Bestandteile wurde mit 2,5 ml eines

Lösungsmittelgemisches bestehend aus 50% tert-Butylmethylether und 50%

Essigsäureethylester für 15 min bei Raumtemperatur im Horizontalschüttler extrahiert.

Anschließend wurden die Proben 2 min lang zentrifugiert (2021 g, 4 °C) und die

organische Phase abgenommen. Die verbleibende Matrix wurde erneut extrahiert, die

organische Phase nach Zentrifugation (2 min, 2021 g, 4 °C) mit der der ersten Extraktion

vereint und bei 50 °C im Luftstrom zur Trockne eingedampft. Anschließend wurde der

Rückstand mit 100 µl einer Mischung aus 93% 25 mM TEAP (pH-Wert 3) und 7% ACN

aufgenommen. Zum Ausfrieren koextrahierter Fettanteile wurden die Proben für

mindestens 30 min in den Tiefkühlschrank gestellt, anschließend erneut zentrifugiert

(5 min, 11.200 g, Raumtemperatur) und 70 µl des Überstands in Mikroliterprobengefäße

überführt.

Die Kombination von Proteinfällung und Flüssig-Flüssig-Extraktion war in diesem Fall

notwendig, da die Wiederfindung zwischen den einzelnen Rattenorganen und

insbesondere im Vergleich zur Ersatzmatrix vom Schwein ohne Zusatz von ACN stark

schwankte. Mit Zusatz von ACN war die Wiederfindung in den verschiedenen

Rattenorganen mit der in der Ersatzmatrix vergleichbar. Eine zweimalige Extraktion war

notwendig, um das LOQ so weit wie möglich zu reduzieren, da auf Grund der kurzen


32

Halbwertzeit von Paracetamol mit sehr niedrigen Konzentrationen in den Organen zu

rechnen war. Das Ausfrieren des koextrahierten Fettes war notwendig, um die Säule vor

Verstopfung zu schützen (andernfalls allmähliches Ausfallen des Fetts im gekühlten

Probengeber).

Instrumentelle Bedingungen

Gerät: HPLC-UV-System LaChrom Elite (VWR Hitachi, Darmstadt, Deutschland)

bestehend aus:

Pumpe VWR L-2130

Probengeber VWR L-2200, 10 °C

Säulenthermostat VWR L-2300, 35 °C

Detektor VWR L-2455 DAD

mobile Phase: A: 25 mM TEAP, pH 3

B: ACN

Elution: Vollblut: isokratisch 93% A / 7% B

Urin: Gradient 0 – 6,3 min 95% A / 5% B

6,4 – 7,3 min 50% A / 50% B

7,4 – 12 min 95% A / 5% B

Fäzes: Gradient 0 – 0,2 min 89% A / 11% B

0,3 – 1,2 min 50% A / 50% B

1,3 – 5,5 min 89% A / 11% B

Organe: Gradient 0 – 4,5 min 94% A / 6% B

4,6 – 5,5 min 50% A / 50% B

5,6 – 10,5 min 94% A / 6% B

Flussrate: 1 ml/min

Injektionsvolumen: 50 µl

Trennsäulen: Vollblut, Urin, Fäzes: EcoCart® 125-3, LiChrospher® RP-18e (5µm),

Merck, Darmstadt, Deutschland

Organe: EcoCart® 125-3, LiChrospher® 60 RP-select B (5µm),

Merck, Darmstadt, Deutschland

Detektion: Kanal 1: 244 nm (Paracetamol)

Kanal 2: 272 nm (IS)


33

Qualitätsparameter

Tab. 3.10 fasst die Parameter Präzision und Richtigkeit aus der Validierung von

Paracetamol in den verschiedenen Matrizes zusammen. Abb. 3.5 zeigt exemplarisch eine

Kalibration in Vollblut. Der Korrelationskoeffizient war für alle Matrizes > 0,9996. Die

Methode entsprach somit in allen Punkten den Anforderungen.

Tab. 3.10: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Paracetamol.

Präzision Richtigkeit

Matrix within day between day within day between day

Vollblut 2,9 – 6,8 1,5 – 12,8 -0,7 – 6,5 -9,2 – 5,1

Urin 2,0 – 4,0 0,8 – 4,4 -0,9 – 5,0 -2,5 – 3,6

Fäzes 0,8 – 10,1 1,4 – 13,0 0,4 – 6,8 -2,0 – 11,0

Organe 1,7 – 6,9 1,2 – 8,1 -2,5 – 9,4 -2,2 – 4,5

Präzision: Streuung um den Mittelwert in %; Richtigkeit: Abweichung vom Sollwert in %

Abb. 3.5: Beispiel für eine Kalibration von Paracetamol in Vollblut.

3.3.2 Paracetamol-Konjugate

Die indirekte Bestimmung der Glukuronid- und Sulfat-Konjugate ist möglich durch die

Quantifizierung der Muttersubstanz vor und nach enzymatischer Spaltung mittels β-

Glukuronidase (kombinierte Glukuronidase- und Sulfatase-Funktionalität, s.u.). Dabei wird

zwischen den Konjugaten nicht unterschieden. Die Konzentration der Konjugate errechnet

sich aus der Differenz der Konzentrationen der Muttersubstanz nach enzymatischer

Spaltung (totales Paracetamol) und vor enzymatischer Spaltung (freies Paracetamol).

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 70000

5

10

15

Kalibration

Qualitätskontrolle

c (ng/ml)

Peakh

öhenve

rhältn

is


34


Die SL und AL von Paracetamol und 7β-Hydroxyethyltheophyllin wurden analog der oben

beschriebenen Methode für die Bestimmung der Paracetamol-Muttersubstanz zubereitet

(s. S. 30). Für die LC-MS/MS-Methode zur Bestimmung der Paracetamol-Konjugate im

Fäzes diente Propranolol als IS. Die SL Propranolol (100 µg/ml) wurde mit einer

methanolischen Natriumazidlösung hergestellt. Der Zusatz von Natriumazid diente der

Stabilisierung der Lösung. Die AL Propranolol (5 µg/ml) wurde durch Verdünnung mit

einer Mischung aus 50% ACN und 50% bidestilliertem Wasser wöchentlich frisch aus der

tiefgekühlten SL zubereitet und im Kühlschrank gelagert (s. Anhang, S. 115).

Die Kalibratoren und Qualitätskontrollen wurden in den gleichen Konzentrationen wie in

der oben beschriebenen Methode für die Bestimmung der Paracetamol-Muttersubstanz

(s. S. 30) entsprechend dem Pipettierschema im Anhang (S. 116) angesetzt.

Probenaufarbeitung

freies Paracetamol im Urin:

100 µl Urin wurden wie in der oben beschriebenen Methode für die Bestimmung der

Paracetamol-Muttersubstanz durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit einem Lösungs-

mittelgemisch aus 50% tert-Butylmethylether und 50% Essigsäureethylester aufgearbeitet

(s. S. 30).

totales Paracetamol im Urin:

10 µl Urin wurden mit 10 µl Glukuronidase-Lösung (β-Glukuronidase Typ HP-2 von Helix

pomatia; 145.700 Units/ml Glukuronidase-Aktivität, 887 Units/ml Sulfatase-Aktivität;

Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) versetzt und für 5 h bei 50 °C im Heizschüttler bei

400 rpm inkubiert. Die trockenen Proben wurden mit 100 µl Leerurin der Ratte

aufgenommen und sorgfältig gemischt. 25 µl dieser Lösung wurden mit weiteren 75 µl

Leerurin verdünnt und nach Zusatz von 50 µl des IS (AL 7β-Hydroxyethyltheophyllin) wie

in der oben beschriebenen Methode für die Bestimmung der Paracetamol-Muttersubstanz

durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit einem Lösungsmittelgemisch aus 50% tert-

Butylmethylether und 50% Essigsäureethylester aufgearbeitet (s. S. 30).

Das notwendige Volumen an Glukuronidase-Lösung und v.a. die Inkubationszeit sind in

Vorversuchen an Testproben in Doppelbestimmung auf möglichst vollständigen Umsatz

hin optimiert worden (1:1 Verhältnis von Testurin zu Glukuronidase-Lösung zeigte deutlich

höheren Umsatz und bessere Reproduzierbarkeit als 1:10 Verhältnis; 5 h Inkubationszeit

zeigten höheren Umsatz als 1 und 2 h Inkubationszeit, 16 h Inkubationszeit zeigten keine

weitere Steigerung des Umsatzes).


35

freies Paracetamol im Fäzes:

250 µl Fäzeshomogenat wurden mit 25 µl des IS (AL Propranolol) versetzt und gemischt.

Nach Zusatz von 1,25 ml eines Lösungsmittelgemisches bestehend aus 50% tert-

Butylmethylether und 50% Essigsäureethylester wurde für 15 min bei Raumtemperatur im

Horizontalschüttler extrahiert. Anschließend wurden die Proben 2 min lang zentrifugiert

(2021 g, 4 °C), die organische Phase abgenommen und bei 50 °C im Luftstrom zur

Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit 50 µl einer Mischung aus 85% 25 mM

Ammoniumacetat-Puffer (pH-Wert 3), 15% ACN und 0,01% Natriumazid aufgenommen.

Nach 30 min im Tiefkühlschrank wurden die Proben erneut zentrifugiert (5 min, 21.100 g,

4 °C) und der klare Überstand in Mikroliterprobengefäße überführt.

totales Paracetamol im Fäzes:

250 µl Fäzeshomogenat wurden mit 50 µl Glukuronidase-Lösung versetzt und für 5 h bei

50 °C im Heizschüttler bei 400 rpm inkubiert. Nach Zusatz von 25 µl des IS (AL

Propranolol) wurde wie unter freies Paracetamol im Fäzes beschrieben mit der Flüssig-

Flüssig-Extraktion weiter verfahren.

Das notwendige Volumen an Glukuronidase-Lösung und v.a. die Inkubationszeit sind in

ähnlicher Weise wie für Urin (s.o.) in Vorversuchen an Testproben in Doppelbestimmung

auf möglichst vollständigen Umsatz hin optimiert worden.


Die Messung der Konjugate im Urin erfolgte unter denselben Einstellungen wie oben für

die Muttersubstanz beschrieben mittels HPLC-UV (s. S. 32). Die Bedingungen für die LC-

MS/MS Bestimmung der Konjugate im Fäzes waren wie folgt:

Gerät: LC-MS/MS-System API4000 bestehend aus:

HPLC: Pumpe Agilent 1100 series G1376A

Degasser Agilent 1100 series G1379A

Probengeber Agilent 1100 series G1329A

Probenkühlung Agilent 1100 series G1330B, 10 °C

Säulenthermostat Agilent 1100 series G1316A, 40 °C

(Agilent 1100 series, Agilent, Böblingen, Deutschland)

Massenspektrometer: API4000 triple quad

(Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland)


36

mobile Phase: A: 25 mM Ammoniumacetat-Puffer, pH 3

B: MeOH

Elution: Gradient 0 – 0,1 min 85 % A / 15 % B

0,2 – 2,1 min 10 % A / 90 % B

2,2 – 15 min 85 % A / 15 % B

Flussrate: 200 µl/min


Trennsäule: XTerra MS (100 x 2,1 mm; 3,5 µm), Waters, Milford, USA

PEEK-Vorfilter (0,5 µm), Supelco, Deisenhofen, Deutschland

Ionisation: Turbo Ion Spray Interface

curtain gas 25 psi

collision gas 4 psi

gas source 1 40 psi

gas source 2 70 psi

ion spray voltage 5500 V

Interface Temperatur 450 °C

Detektion:

Tab. 3.11: MS-Detektionsparameter für Paracetamol und Propranolol.

Parameter Paracetamol Propranolol

Masseübergang (m/z) 152,1 110,1 260,5 116,2

declustering potential 68 V 75 V

entrance potential 10 V 10 V

collision energy 23 V 25 V

cell exit potential 10 V 8 V

Qualitätsparameter

Die Qualitätsparameter für Urin sind in Tab. 3.10 (S. 33) zu finden. Die between day

Präzision für die LC-MS/MS Bestimmung in Fäzes betrug 2,5 – 13% (Streuung um den

Mittelwert), die between day Richtigkeit -14 – 8,8% (Abweichung vom Sollwert), der

Korrelationskoeffizient betrug 0,998. Die Parameter lagen somit innerhalb der geforderten

Grenzen.


37

3.3.2.1 Talinolol


Die SL Talinolol (10 µg/ml) und des IS Propranolol (8 µg/ml) wurden mit bidestilliertem

Wasser hergestellt und bei -20 °C gelagert. Die AL Talinolol (1 – 0,1 µg/ml) wurden durch

sukzessive Verdünnung mit bidestilliertem Wasser wöchentlich frisch aus der

tiefgekühlten SL zubereitet und im Kühlschrank gelagert (s. Anhang, S. 116).



Kalibratoren: 5, 20, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000, 8000 ng/ml

Qualitätskontrollen: 15, 3000, 7000 ng/ml

Probenaufarbeitung

100 µl Probenmatrix wurden mit 250 µl bidestilliertem Wasser verdünnt. Nach Zusatz von

50 µl des IS (SL Propranolol) und 100 µl gesättigter Natriumcarbonat-Lösung wurde kurz

gemischt und mit 4 ml Diethylether für 15 min bei Raumtemperatur im Horizontalschüttler

extrahiert. Anschließend wurden die Proben 4 min lang zentrifugiert (2021 g, 4 °C), die

organische Phase abgenommen und im Luftstrom bei 40 °C zur Trockne eingedampft.

Der Rückstand wurde mit 100 µl einer Mischung aus 50% verdünnter Ameisensäure

(0,1%; pH 3) und 50% ACN aufgenommen und in Mikroliterprobengefäße überführt.



HPLC: Pumpe HP 1100 series G1312A

Degasser HP 1100 series G1322A

(Hewlett Packard, Böblingen, Deutschland)

Probengeber PE 200 series N293-0100

Probenkühlung PE 200 series N293-0036, 5 °C

(Perkin Elmer, Rodgau, Deutschland)

Säulenthermostat Merck T 6300/2, 40 °C

(Merck, Darmstadt, Deutschland)




38

mobile Phase: A: 0,1%ige Ameisensäure, pH 3

B: ACN

Elution: isokratisch 50 % A / 50 % B




PEEK-Vorfilter (0,5 µm), Supleco, Deisenhofen, Deutschland


curtain gas 30 psi

collision gas 3 psi

gas source 1 60 psi

gas source 2 60 psi



Detektion:

Tab. 3.12: MS-Detektionsparameter für Talinolol und Propranolol.

Parameter Talinolol Propranolol



focusing potential 390 V 390 V

entrance potential 10,5 V 10,5 V



Qualitätsparameter

Tab. 3.13 fasst die Parameter Präzision und Richtigkeit aus der Validierung von Talinolol

in den verschiedenen Matrizes zusammen. Abb. 3.6 zeigt exemplarisch eine Kalibration in

Vollblut. Der Korrelationskoeffizient war für alle Matrizes > 0,9997. Die Methode entsprach

somit abgesehen von einer geringfügigen aber akzeptablen Überschreitung der Grenzen

(17% Abweichung statt 15%) bzgl. der between day Richtigkeit in Urin den

Anforderungen.


39

Tab. 3.13: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Talinolol.



Vollblut 3,5 – 8,5 0,5 – 14 -12 – -6,5 -10 – 2,4

Urin 2,6 – 4,1 0,1 – 6,2 -2,9 – 3,1 -17 – 3,0

Fäzes 0,5 – 3,9 1,0 – 4,9 4,8 – 8,9 -6,2 – 15

Organe 1,6 – 9,8 0,2 – 11 -6,7 – 9,5 -12 – 13


Abb. 3.6: Beispiel für eine Kalibration von Talinolol in Vollblut.

3.3.3 Colchicin


Die SL Colchicin und des IS Demecolcin (je 100 µg/ml) wurden mit MeOH hergestellt. Die

AL (Colchicin: 10 µg/ml – 10 ng/ml, Demecolcin: 500 und 50 ng/ml) wurden auf Grund

unzureichender Stabilität von Colchicin (s.u.) täglich frisch durch sukzessive Verdünnung

mit einer Mischung aus 50% MeOH und 50% bidestilliertem Wasser aus den tiefgekühlten

SL zubereitet (Pipettierschema s. Anhang, S. 117; Gehalt der SL Colchicin nach 35 Tagen

bei -20 °C: 100%; Gehalt der SL Demecolcin nach 17 Tagen bei -20 °C: 108%; Gehalt der

AL Colchicin nach 1 Tag im Kühlschrank: 80%; Gehalt der AL Demecolcin nach 7 Tagen

im Kühlschrank: 100%; s. Anhang, S. 121).



0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 80000

10

20

30

Kalibration

Qualitätskontrolle

c (ng/ml)

Peakf

lächenve

rhältn

is


40

Kalibratoren:

Vollblut: 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 175, 250 ng/ml

Urin: 100, 250, 500, 750, 1000, 1500 ng/ml

Fäzes: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ng/ml

Organe: 0,5, 1 2,5, 5, 10, 25, 50, 100 ng/ml

Gehirn: 0,25, 0,5, 1 2,5, 5, 10, 25, 50 ng/ml

Qualitätskontrollen:

Vollblut: 1,5, 25, 150 ng/ml

Urin: 300, 700, 1300 ng/ml

Fäzes: 30, 200, 750 ng/ml

Organe: 1,5, 15, 75 ng/ml

Gehirn: 0,75, 7,5, 37,5 ng/ml

Probenaufarbeitung

100 µl Probenmatrix bzw. 200 µl Gerhirnhomogenat wurden mit 25 µl des IS (AL 1 für Urin

und Fäzes, AL 2 für Vollblut und Organe) versetzt und gemischt. Nach Zusatz von 1,5

bzw. 2 ml (Gehirn) Dichlormethan wurde für 15 min bei Raumtemperatur unter Lichtschutz

im Horizontalschüttler extrahiert. Anschließend wurden die Proben 5 min lang zentrifugiert

(2021 g, 4 °C), die organische Phase abgenommen und bei 40 °C im Luftstrom unter

Lichtschutz zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit 75 µl (Vollblut, Organe)

bzw. 100 µl (Urin, Fäzes) einer Mischung aus 45% ACN und 55% bidestilliertem Wasser

aufgenommen und zum Ausfrieren der Fettanteile für 30 min in den Tiefkühlschrank

gestellt. Nach erneuter Zentrifugation (5 min, 21.100 g, 4 °C) wurde der klare Überstand in

Mikroliterprobengefäße überführt.

Die extrahierten Proben waren für 12 h im Probengeber stabil (Rack-Stabilität: 94,1% ±

3,2% nach 12 h; n = 18). Anhand von Qualitätskontrollproben wurde gezeigt, dass

Colchicin während der Lagerung bei -20 °C im Vollblut ausreichend stabil ist (Gehalt

87,5% ± 7,7% nach 29 Tagen bei -20 °C; n = 18) und mehrmals aufgetaut und wieder

eingefroren werden kann (Gehalt 106,0% ± 8,3% nach 3 Gefrier-Tau-Zyklen; n = 18)

Für das Gehirnhomogenat konnte nicht die Ersatzmatrix vom Schwein verwendet werden,

da die Qualitätskontrollen aus Gehirnhomogenat in Bezug auf die Kalibration mit der

Ersatzmatrix eine systematische Abweichung von mehr als +25% aufwiesen.


41



HPLC: Mikropumpen PE 200 series N291-00503

Degasser PE 200 series N260-0507

Mixer PE 200 series N291-0520




Säulenthermostat Jetstream 2 Plus, 30 °C

(Thermotechnic Products, Langenzersdorf, Österreich)



mobile Phase: A: ACN

B: 0,1%ige Ameisensäure, pH 3

Elution: Blut, Urin, Organe isokratisch 45% A / 55% B

Fäzes, Colon Gradient -2 – 0,1 min 45% A / 55% B

0,6 – 2,5 min 80% A / 20% B

3 – 10 min 45% A / 55% B






curtain gas 8 psi

collision gas 4 psi

nebulizer gas 15 psi




42

Detektion:

Tab. 3.14: MS-Detektionsparameter für Colchicin und Demecolcin.

Parameter Colchicin Demecolcin







Qualitätsparameter

Tab. 3.15 fasst die Parameter Präzision und Richtigkeit aus der Validierung von Colchicin

in den verschiedenen Matrizes zusammen. Abb. 3.7 zeigt exemplarisch eine Kalibration in

Vollblut. Der Korrelationskoeffizient war für alle Matrizes > 0,9989. Die Methode entsprach

somit in allen Punkten den Anforderungen.

Tab. 3.15: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Colchicin.



Vollblut 4,4 – 7,3 3,0 – 15 -10 – -0,4 -6,3 – 10

Urin 4,7 – 5,3 1,7 – 7,1 -0,8 – 8,9 -4,8 – 6,8

Fäzes 6,9 – 11 0,7 – 10 3,0 – 5,2 -4,4 – 4,2

Organe 5,1 – 10 2,2 – 13 -8,1 – 5,9 -3,0 – 7,8



43

Abb. 3.7: Beispiel für eine Kalibration von Colchicin in Vollblut.

3.3.4 Ciclosporin A


Die SL Ciclosporin A (100 µg/ml) und des IS Pimecrolimus (20 µg/ml) wurden mit MeOH

angesetzt. Die AL Ciclosporin A (10 µg/ml – 10 ng/ml) wurden durch sukzessive

Verdünnung mit einer Mischung aus 50% MeOH und 50% bidestilliertem Wasser

zubereitet. Die AL Pimecrolimus (200 ng/ml) wurde durch Verdünnung mit MeOH erhalten

(s. Anhang, S. 119). Die AL beider Substanzen wurden täglich frisch aus den bei -80 °C

gelagerten SL angesetzt (eigene Stabilitätsdaten trotz mehrfacher Wiederholung äußerst

widersprüchlich, Stabilität der SL aus der Literatur bekannt).76,77



Kalibratoren: 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ng/ml

Qualitätskontrollen: 2,5, 25, 250, 500 ng/ml

Probenaufarbeitung

100 µl Probenmatrix wurden mit 25 µl des IS (AL Pimecrolimus) und 25 µl einer 0,2%igen

Natriumazid-Lösung versetzt und gemischt. Nach Zusatz von 300 µl (Vollblut, Fäzes,

Organe) bzw. 200 µl (Urin) eiskaltem ACN zur Proteinfällung wurden die Proben 10 min

lang zentrifugiert (21.100 g, 4 °C). Der klare Überstand wurde für 30 min in einer

Vakuumzentrifuge (600 g, Raumtemperatur) eingeengt. Nach erneuter Zentrifugation

(10 min, 21.100 g, 4 °C) wurde der klare Überstand in Mikroliterprobengefäße überführt.

0 50 100 150 200 2500

1

2

3

4

5

6

7

Kalibration

Qualitätskontrolle

c (ng/ml)

Peakf

lächenve

rhältn

is


44

Die extrahierten Proben waren für 12 h im Probengeber stabil (Rack-Stabilität: 104,1% ±

10,2% nach 12 h; n = 20). Aus der Literatur war bekannt, dass Ciclosporin A während

mehrmonatiger Lagerung bei -80 °C im Vollblut stabil bleibt.77,78 Anhand von

Qualitätskontrollproben wurde gezeigt, dass Ciclosporin A in Vollblut bis zu zweimal

aufgetaut und wieder eingefroren werden kann (Gehalt 110,0% ± 9,7% nach 2 Gefrier-

Tau-Zyklen; n = 24).



HPLC: Mikropumpen PE 200 series N291-00503

Degasser PE 200 series N260-0507

Mixer PE 200 series N291-0520




Säulenthermostat Jetstream 2 Plus, 30 °C

(Thermotechnic Products, Langenzersdorf, Österreich)



mobile Phase: A: ACN

B: 10 mM Ammoniumacetat-Puffer, pH 3,8

Elution: Gradient -2 – 0,1 min 45% A / 55% B

0,6 – 2,5 min 80% A / 20% B

3 – 10 min 45% A / 55% B






45


curtain gas 15 psi

collision gas 4 psi

nebulizer gas 14 psi



Detektion:

Tab. 3.16: MS-Detektionsparameter für Ciclosporin A und Pimecrolimus.

Parameter Ciclosporin A Pimecrolimus







Qualitätsparameter

Tab. 3.17 fasst die Parameter Präzision und Richtigkeit aus der Validierung von

Ciclosporin A in den verschiedenen Matrizes zusammen. Abb. 3.8 zeigt exemplarisch eine

Kalibration in Vollblut. Der Korrelationskoeffizient war für alle Matrizes > 0,996. Die

Methode entsprach somit in allen Punkten den Anforderungen.

Tab. 3.17: Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Ciclosporin A.



Vollblut 1,3 – 6,2 2,3 – 10 -1,9 – 11 -7,4 – 8,2

Urin 4,9 – 8,3 0,9 – 10 -1,5 – 3,2 -3,0 – 3,7

Fäzes 1,5 – 3,7 1,1 – 11 -1,9 – 19 -6,8 – 9,6

Organe 4,5 – 9,1 0,5 – 11 -1,7 – 13 -5,4 – 11



46

Abb. 3.8: Beispiel für eine Kalibration von Ciclosporin A in Vollblut.

3.4 Biometrie

pharmakokinetische Auswertung

Aus den Messdaten der tierexperimentellen Studie wurden folgende pharmakokinetische

Parameter für die Modellarzneistoffe Paracetamol, Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A

berechnet:

initiale Blutkonzentration (C0)

minimale Blutkonzentration im steady state (Cmin)

durchschnittliche Blutkonzentration im steady state (Cav)

Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (AUC0-t und AUC0-∞)

terminale Halbwertzeit (T1/2)

initiales zentrales Verteilungsvolumen (Vc)

Verteilungsvolumen im Gleichgewichtszustand (Vss)

totale Körperclearance (Cltot)

kumulative Ausscheidung im Urin (Ae U)

renale Clearance (ClR)

kumulative Ausscheidung im Fäzes (Ae F)

fäkale Clearance (ClF)

normierte Organkonzentration (C*Organ)

0 100 200 300 400 5000

5

10

15

Kalibration

Qualitätskontrolle

c (ng/ml)

Peakf

lächenve

rhältn

is


47

Für Paracetamol wurde außerdem berechnet:

kumulative Ausscheidung der Konjugate im Urin (Ae U(M))

renale Clearance der Konjugate (ClRM)

kumulative Ausscheidung der Konjugate im Fäzes (Ae F(M))

fäkale Clearance der Konjugate (ClFM)

metabolische Clearance in Bezug auf die Konjugate (ClM)

Die einzelnen Konzentrations-Zeit-Kurven wurden mit Hilfe von GraphPad Prism und

Origin einem 3-Kompartiment-Modell entsprechend Formel 7 angepasst. Dabei wurden

nur die Messwerte oberhalb des jeweiligen LOQ berücksichtigt. Mit Hilfe dieser

Modellierung konnten etwaige fehlende Messwerte, Ausreißer und stärkere,

messtechnisch bedingte Schwankungen der jeweils letzten Messwerte einer Kinetik

besser ausgeglichen werden. Ein 2-Kompartiment-Modell erwies sich für Talinolol,

Colchicin und Ciclosporin A als unzureichend und wäre lediglich für Paracetamol

verwendbar gewesen. Da sich die Paracetamol-Gruppe jedoch ebenfalls mit einem 3-

Kompartiment-Modell anpassen ließ, wurde im Sinne einer einheitlichen Berechnung für

alle Gruppen ein 3-Kompatiment-Modell verwendet.

∑

Konzentration zum Zeitpunkt t

Achsenabschnitt der jeweiligen Teilfunktion

Eleminationskonstante des jeweiligen Kompartiments

Zeit

Mit Hilfe dieser Parameter berechnete sich die theoretische initiale Konzentration C0 direkt

nach der i.v. Applikation wie folgt:

∑

Die AUC0-t wurde über das Integral der angepassten Kurve berechnet (Formel 9). Für die

Berechnung der AUC0-∞ konnte diese Formel durch Grenzwertbetrachtung vereinfacht

werden (Formel 10):


48

∫

[

]

∑

AUC im Dosierungsintervall

AUC vom Zeitpunkt 0 bis unendlich

In der multiple dose Kinetik wurde Cmin mit Hilfe der angepassten Exponentialfunktion

berechnet, da die Messwerte bei 12 h oftmals unterhalb des LOQ lagen. Die

durchschnittliche Konzentration in diesem Intervall errechnete sich wie folgt:

Zur Berechnung von T1/2 wurde die aus der Anpassung ermittelte terminale Eleminations-

konstante herangezogen:

Die Verteilungsvolumina wurden nach folgenden Formeln berechnet. Auf eine

Normalisierung auf das Körpergewicht der Tiere wurde verzichtet, da die Dosis bereits

körpergewichtsadaptiert appliziert wurde:

∑

Dosis

Fläche unter der ersten Moment Kurve


49

Die verschiedenen Clearances ergaben sich aus folgenden Berechnungen. Dabei wurden

die intestinalen Clearances analog den renalen Clearances berechnet:

Die gemessenen Organkonzentrationen wurden auf die Cav normiert.

Statistische Methoden

Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit Excel und GraphPad Prism. Die

pharmakokinetischen Parameter und Konzentrations-Zeit-Kurven wurden als Median mit

dem 25. und 75. Perzentil dargestellt. Zur Ermittlung statistischer Unterschiede zwischen

den Hilfsstoffgruppen und der Kontrollgruppe wurde ein nicht-parametrischer, ungepaarter

Signifikanztest (Mann-Whitney-Test) mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5%

angewendet.

50

4 Ergebnisse


4.1.1 Kompetitionsassay

Die untersuchten Lösungsvermittler PEG 400, HPCD, SOL und CrEL erwiesen sich im

Kompetitionsassay als nicht inert gegenüber Interaktionen mit relevanten

Aufnahmetransportern.

Abb. 4.1: Absolute Aufnahme von Estron-3-sulfat (E3S) in Vektor-transfizierte Kontrollzellen und

OATP1A2-transfizierte Zellen in Anwesenheit steigender Konzentrationen von

Polyethylenglykol 400 (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts).

Abb. 4.1 zeigt einmalig am Beispiel von PEG 400 die absolute Aufnahme des

Referenzsubstrates (hier E3S) in die Vektor-transfizierte Kontrollzellinie und in die

Transporter-transfizierte Zelle (hier OATP1A2) separat. Die Aufnahme des

Referenzsubstrates in die Vektor-transfizierte Kontrollzellinie war insgesamt gering und

wurde durch den Hilfsstoff nicht wesentlich beeinflusst. Dagegen wurde in die

Transporter-transfizierte Zelle deutlich mehr Substrat aufgenommen, was durch steigende

Hilfsstoffkonzentrationen zunehmend gehemmt werden konnte.

Die folgenden Abbildungen stellen jeweils nur die prozentuale Veränderung der

Nettoaufnahme (Differenz aus der Aufnahme in Transporter-transfizierte und Vektor-

transfizierte Zellen) im Verhältnis zur Aufnahme in Abwesenheit des Hilfsstoffes dar.

10-7

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1

Vektor-Kontrolle

OATP1A2

0

Konzentration (% w/v)

pm

ol E

3S

/ m

g P

rote

in ×

min

4 Ergebnisse

51

Im Detail hemmte PEG 400 selektiv die Aufnahme von E3S (IC50 = 0,14%) und TA

(IC50 = 0,05%) durch OATP1A2 (Abb. 4.2), während die Aufnahme der Referenzsubstrate

durch OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 und NTCP unbeeinflusst blieb (Abb. 7.7 im

Anhang, S. 123).

Abb. 4.2: Hemmung der OATP1A2-vermittelten Nettoaufnahme von Estron-3-sulfat (E3S) und

Taurocholat (TA) durch Polyethylenglykol 400 (Mittelwert, Standardabweichung von 3

Tripletts).

HPCD war ein starker Inhibitor der E17βG-Aufnahme durch OATP1B3 (IC50 = 0,001%,

Abb. 4.3). Die Aufnahme von E3S und TA durch OATP1A2, OATP1B1, OATP2B1 wurde

mit geringerer Potenz gehemmt (IC50 von 0,01 bis 0,24%, Tab. 4.1). Die Aufnahme von

BSP via OATP1B1 und OATP2B1 wurde von HPCD-Konzentrationen bis zu 10% nicht

beeinflusst (Abb. 7.8 im Anhang, S. 124). Auf die NTCP-vermittelte BSP-Aufnahme hatte

HPCD einen stimulierenden Effekt mit einer halb-maximal effektiven Konzentration (EC50)

von 0,5%, während die NTCP-vermittelte Aufnahme von TA gehemmt wurde (Abb. 4.4).

0

25

50

75

100

125

10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1

E3S IC50 = 0,14%

TA IC50 = 0,05%

0


Au

fna

hm

e (

%)

4 Ergebnisse

52

Abb. 4.3: Hemmung der OATP1B3-vermittelten Nettoaufnahme von Estradiol-17β-glukuronid

durch Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts).

Abb. 4.4: Effekt von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin auf die Nettoaufnahme von Taurocholat (TA)

und Bromosulfophthalein (BSP) durch NTCP (Mittelwert, Standardabweichung von 3

Tripletts).

0

25

50

75

100

125

10 -4 10 -3 10 -2 10 -1


0

Aufn

ahm

e (

%)

IC50 = 0,001%

0

25

50

75

100

125

150

175

10 -2 10 -1 10 0 10 1

BSP EC50 = 0.5%

TA IC50 = 4,6%


0

Au

fna

hm

e (

%)

4 Ergebnisse

53

Tab. 4.1: Interaktion von Hydroxypropyl-β-cyclodextrin mit OATPs und NTCP.

Transporter Substrat IC50 (10-3

% w/v) MIE (%)

OATP1A2

E3S 27

100 (23; 31)

TA 25

53 (19; 32)

OATP2B1 E3S

10 87

(8,5; 12)

BSP kein Effekt kein Effekt

OATP1B1 E3S

240 100

(180; 300)


OATP1B3 E217βG

1,0 76

(0,66; 1,6)


NTCP

TA 4600

100 (3500; 6100)

BSP 520*

70* (390; 690)

Geometrische Mittelwerte mit geometrischer Standardabweichung der IC50 (*EC50) und der

maximale inhibitorische (*stimulierende) Effekt (MIE) von 3 Tripletts.

BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid, E3S, Estron-3-sulfat; TA, Taurocholat

SOL und CrEL waren potente Inhibitoren aller untersuchten Transporter. Abb. 4.5 zeigt

beispielhaft die Hemmung der BSP-Aufnahme via OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 und

NTCP. Die Aufnahme der Estrogen-Konjugate durch OATP1A2, OATP1B1, OATP1B3

und OATP2B1 und von TA durch OATP1A2 und NTCP wurde ebenfalls stark gehemmt

(IC50 zwischen 0,0003% und 0,3%, Tab. 4.2 sowie Abb. 7.9 und Abb. 7.10 im Anhang, S.

125f). In Bezug auf NTCP zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen BSP und TA.

Während beide Lösungsvermittler die NTCP-vermittelte BSP-Aufnahme schon in geringen

Konzentrationen hemmten, war ihre Affinität zur Inhibition der TA-Aufnahme durch NTCP

250mal geringer.

4 Ergebnisse

54

Abb. 4.5: Hemmung der Nettoaufnahme von Bromosulfophthalein durch Solutol HS15 (A) und

Cremophor EL (B) (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts).

0

25

50

75

100

125

10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 10


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 10


Au

fna

hm

e (

%)

A

B

0

25

50

75

100

125

10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 10

OATP1B1

OATP1B3

OATP2B1

NTCP


Au

fna

hm

e (

%)

4 Ergebnisse

55

Tab. 4.2: Interaktion von Solutol HS15 (SOL) und Cremophor EL (CrEL) mit OATPs und NTCP.

SOL CrEL

Transporter Substrate IC50 (10-3% w/v) MIE (%) IC50 (10-3

% w/v) MIE (%)

OATP1A2

E3S 7,4

95 0,54

100 (7,0; 7,9) (0,47; 0,62)

TA 4,1

97 0,34

78 (2,9; 5,8) (0,28; 0,42)

OATP2B1

E3S 11

91 1,1

88 (9,6; 12) (0,81; 1,6)

BSP 0,95

87 9,8

100 (0,78; 1,2) (7,6; 13)

OATP1B1

E3S 21

83 190

100 (18; 24) (170; 210)

BSP 290

94 300

96 (260; 330) (190; 490)

OATP1B3

E217βG 1,9

82 1,0

66 (1,3; 2,9) (0,86; 1,2)

BSP 8,7

100 4,7

76 (6,3; 12) (3,6; 6,1)

NTCP

TA 1500

100 2800

100 (1300; 1800) (2400; 3300)

BSP 5,8

67 12

78 (5,0; 6,8) (8,2; 16)

Geometrische Mittelwerte mit geometrischer Standardabweichung der IC50 und der maximale

inhibitorische Effekt (MIE) von 3 Tripletts.

BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid, E3S, Estron-3-sulfat; TA, Taurocholat

4.1.2 Zellviabilität

Die Zellviabilität aller Transporter-transfizierten Zelllinien wurde mittels Resazurin-Assay

in Anwesenheit einer niedrigen und einer hohen Hilfsstoffkonzentration überprüft. PEG

400 und SOL hatten keinen nennenswerten Einfluss auf die Viabilität der verschieden

Zelllinien (Abb. 4.6). Bei HPCD und CrEL war der Effekt konzentrationsabhängig. 10%

HPCD reduzierte die Viabilität nach 1 h signifikant um ~ 20 – 35% in OATP1B1-,

OATP1B3-, OATP2B1- und NTCP-transfizierten Zellen (Abb. 4.6 B – D), während 1%

HPCD keinen Einfluss auf die Zellen hatte (Viabilität ≥ 95%, Abb. 4.6 A). 10% CrEL

reduzierte v.a. initial die Viabilität um ~ 30 – 40%. Dieser Unterschied relativierte sich

4 Ergebnisse

56

jedoch innerhalb der ersten Stunde (Viabilität ~ 80 – 95%, Abb. 4.6). Der Unterschied

zwischen den einzelnen Zelllinien innerhalb derselben Konzentration desselben

Hilfsstoffes war ≤ 20%.

Abb. 4.6: Zellviabilität in Anwesenheit der hohen Hilfsstoffkonzentration nach 0 und 1 h (Median,

Interquartilsabstand von 4 bzw. 2 (CrEL) Tripletts; rot: 10% PEG, blau: 1% (A) bzw.

10% HPCD, grün: 0,5% bzw. 10% (C) SOL, gelb: 10% CrEL).

OATP1A2

0 10

25

50

75

100

125

t (h)

Via

bili

tät

(%)

OATP2B1

0 10

25

50

75

100

125

t (h)

Via

bili

tät

(%)

OATP1B1

0 10

25

50

75

100

125

t (h)

Via

bili

tät

(%)

OATP1B3

0 10

25

50

75

100

125

t (h)

Via

bili

tät

(%)

NTCP

0 10

25

50

75

100

125

t (h)

Via

bili

tät

(%)

A B

C D

E

4 Ergebnisse

57

4.1.3 Kritische Mizellbildungskonzentration

Die anhand der Änderung der Oberflächenspannung ermittelte CMC der beiden

Emulgatoren SOL und CrEL in Inkubationspuffer betrug 0,005% bzw. 0,007% (Abb. 4.7).

Abb. 4.7: Bestimmung der Kritischen Mizellbildungskonzentration anhand der Oberflächen-

spannung (Mittelwert, n = 10; geringe Standardabweichung optisch nicht darstellbar).

4.2 Tierexperimentelle Untersuchungen

Es wurde der Einfluss der Lösungsvermittler PEG 400, HPCD und SOL auf die

Modellarzneistoffe Paracetamol, Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A nach i.v.

Applikation in der Ratte untersucht.

Jeder der Lösungsvermittler beeinflusste die Pharmakokinetik von mindestens einem

Modellarzneistoff substanziell (single dose: alle Lösungsvermittler mit Ciclosporin A;

multiple dose: PEG / Ciclosporin A, HPCD / Talinolol und SOL / Colchicin). Es konnte eine

Vielzahl signifikanter Veränderungen gegenüber der NaCl-Kontrolle beobachtet werden.

Häufig trat eine Veränderung von AUC, T1/2 und in der Verteilung auf, die jedoch nicht

immer signifikant war. Die Effekte desselben Lösungsvermittlers auf die verschiedenen

Modellarzneistoffe waren sehr unterschiedlich. Die Effekte der verschiedenen Hilfsstoffe

auf denselben Arzneistoff waren hingegen eher mit einander vergleichbar. Daher wurden

im Folgenden die Ergebnisse entsprechend den Arzneistoffen zusammengefasst. Eine

vollständige Zusammenstellung aller Ergebnisse der pharmakokinetischen Auswertung

über die im Folgenden präsentierten Daten hinaus findet sich im Anhang ab S. 127ff.

0

10

20

30

40

50

60

70

0,0001 0,001 0,01 0,1

Oberf

lächenspannung m

N/m


A

0

10

20

30

40

50

60

70

0,0001 0,001 0,01 0,1O

berf

lächenspannung m

N/m


B

4 Ergebnisse

58

4.2.1 Paracetamol

Die Kontrollgruppe war im Hinblick auf Vss (~0,8 l), die kurze T1/2 (~1 h) und die geringe

Ausscheidung der unveränderten Substanz (1,6% im Urin; 0,1% im Fäzes) vergleichbar

mit Literaturangaben zum Menschen (Tab. 2.1, S. 12) und der Ratte.79 Es wurden jedoch

nur 37% der Dosis als Konjugate wiedergefunden und damit deutlich weniger als üblich

(> 70% beim Menschen;63 > 90% innerhalb 24 h bei der Ratte nach 10 mg/kg

Paracetamol i.v.).79 Dies kann zum einen auf die diskontinuierliche Entleerung von Blase

und Darm zurückzuführen sein. Es könnte aber auch darauf hindeuten, dass die

Konjugate bei der Probenaufarbeitung trotz der Optimierung (s. S. 34) nicht vollständig

umgesetzt worden sind. Ein möglicher Grund dafür könnte sein, dass bei niedriger

Dosierung die Sulfatierung in der Ratte deutlich überwiegt,79 die verwendete β-

Glukuronidase jedoch eine geringere Aktivität bzgl. der Sulfat- im Verhältnis zur

Glukuronidspaltung aufweist.

In der single dose Kinetik hatten PEG (Abb. 4.8) und HPCD (Abb. 4.9) keinen

nennenswerten Einfluss auf die Pharmakokinetik von Paracetamol. Hingegen erhöhte

SOL signifikant das Vss (2,2x) und verringerte signifikant die Cltot (1,5x). Entsprechend

nahm die AUC tendenziell zu (1,3x) und die T1/2 verlängerte sich deutlich (7x) (Abb. 4.10).

Abb. 4.8: Konzentrations-Zeit-Kurven der ersten 120 min und ausgewählte pharmakokinetische

Parameter der single dose Kinetik von Paracetamol mit isotoner Kochsalzlösung

(NaCl, schwarz) bzw. Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand;

n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 30 60 90 120

c (

µg

/ml)

t (min)

Parameter NaCl PEG

AUC0-24h (µg*h/ml) 1,14 (1,07; 1,43) 1,42 (1,28; 1,59)

C0 (µg/ml) 6,9 (6,2; 8,9) 6,3 (6,2; 7,0)

Vss (l) 0,69 (0,59; 0,92) 0,95 (0,72; 1,8)

T1/2 (h) 0,8 (0,4; 2,0) 1,5 (0,8; 3,0)

Cltot (ml/min) 25 (19; 27) 21 (18; 23)

4 Ergebnisse

59



(NaCl, schwarz) bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,

Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test).



(NaCl, schwarz) bzw. Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;

*p < 0,05 Mann-Whitney-Test).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 30 60 90 120

c (

µg

/ml)

t (min)

Parameter NaCl HPCD

AUC0-24h (µg*h/ml) 1,14 (1,07; 1,43) 1,45 (1,34; 1,78)

C0 (µg/ml) 6,9 (6,2; 8,9) 6,1 (5,7; 7,4)

Vss (l) 0,69 (0,59; 0,92) 0,72 (0,6; 0,88)

T1/2 (h) 0,8 (0,4; 2,0) 1,3 (0,9; 3,3)

Cltot (ml/min) 25 (19; 27) 20 (17; 22)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 30 60 90 120

c (

µg

/ml)

t (min)

Parameter NaCl SOL

AUC0-24h (µg*h/ml) 1,14 (1,07; 1,43) 1,54 (1,29; 2,26)

C0 (µg/ml) 6,9 (6,2; 8,9) 6,0 (5,5; 6,4)

Vss (l) 0,69 (0,59; 0,92) 1,51* (1,16; 6,31)

T1/2 (h) 0,8 (0,4; 2,0) 5,3 (2,8; 13,8)

Cltot (ml/min) 25 (19; 27) 17* (12; 19)

4 Ergebnisse

60

In der multiple dose Kinetik zeichnete sich mit SOL ein ganz ähnliches Bild ab. Das

tendenziell größere Vss (1,4x) und die signifikant geringere Cltot (1,4x) spiegeln sich in

einer signifikant größeren AUC (1,3x) und v.a. einer längeren T1/2 (3,8x) wider (Abb. 4.13

und Tab. 7.13 im Anhang, S. 127f). Im Gegensatz dazu erhöhte HPCD initial das Vc von

Paracetamol signifikant (1,7x) und reduzierte entsprechend die C0 (1,6x). Im weiteren

Verlauf wurde das Vss jedoch tendenziell kleiner (1,3x) als in der Kontrollgruppe. Daraus

resultierten eine signifikant höhere AUC (1,4x) und eine tendenziell längere T1/2 (2,2x)

(Abb. 4.12 und Tab. 7.13 im Anhang, S. 127f). PEG hatte in der multiple dose Kinetik

keinen signifikanten Einfluss auf die pharmakokinetischen Parameter im Blut verhielt sich

qualitativ jedoch ähnlich wie HPCD (Abb. 4.11 und Tab. 7.13 im Anhang, S. 127f).


Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol mit isotoner Kochsalzlösung

(NaCl, schwarz) bzw. Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand;


0,0

2,5

5,0

7,5

0 30 60 90 120

c (

µg

/ml)

t (min)

Parameter NaCl PEG

AUC0-12h (µg*h/ml) 0,61 (0,57; 0,68) 0,70 (0,62; 0,78)

C0 (µg/ml) 6,0 (5,5; 6,8) 4,7 (3,4; 6,3)

Vss (l) 0,82 (0,73; 1,01) 0,77 (0,63; 1,74)

T1/2 (h) 1,0 (0,6; 1,7) 1,1 (0,8; 4,8)

Cltot (ml/min) 23 (20; 24) 22 (18; 24)

ClR (ml/min) 0,33 (0,29; 0,34) 0,47* (0,43; 0,52)

ClF (µl/min) 21 (7,2; 42) 31 (26; 36)

4 Ergebnisse

61



(NaCl, schwarz) bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,




(NaCl, schwarz) bzw. Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;


0,0

2,5

5,0

7,5

0 30 60 90 120

c (

µg

/ml)

t (min)

Parameter NaCl HPCD

AUC0-12h (µg*h/ml) 0,61 (0,57; 0,68) 0,84* (0,73; 0,96)

C0 (µg/ml) 6,0 (5,5; 6,8) 3,6* (3,5; 4,0)

Vss (l) 0,82 (0,73; 1,01) 0,63 (0,55; 2,65)

T1/2 (h) 1,0 (0,6; 1,7) 2,3 (1,0; 8,3)

Cltot (ml/min) 23 (20; 24) 18 (15; 19)

ClR (ml/min) 0,33 (0,29; 0,34) 0,54* (0,48; 0,57)

ClF (µl/min) 21 (7,2; 42) 10 (9,5; 14)

0,0

2,5

5,0

7,5

0 30 60 90 120

c (

µg

/ml)

t (min)

Parameter NaCl SOL

AUC0-12h (µg*h/ml) 0,61 (0,57; 0,68) 0,77* (0,75; 1,14)

C0 (µg/ml) 6,0 (5,5; 6,8) 6,4 (3,4; 7,3)

Vss (l) 0,82 (0,73; 1,01) 1,17 (0,62; 2,25)

T1/2 (h) 1,0 (0,6; 1,7) 3,9 (1,5; 8,6)

Cltot (ml/min) 23 (20; 24) 16* (10; 18)

ClR (ml/min) 0,33 (0,29; 0,34) 0,27 (0,20; 0,29)

ClF (µl/min) 21 (7,2; 42) 36 (22; 48)

4 Ergebnisse

62

Auf die Ausscheidung von Muttersubstanz und Konjugaten (Tab. 4.3) hatte SOL kaum

einen Einfluss. Während sie im Urin nahezu unverändert war, war sie im Fäzes

tendenziell höher (Ae F 2,2x; ClF 1,7x; Ae F(M) 4,7x; ClF(M) 3,7x). Insgesamt betrug die fäkale

Ausscheidung jedoch weniger als 0,3%. PEG erhöhte die Ae U und ClR der Muttersubstanz

signifikant (1,2x bzw. 1,4x), während die Ae U(M) und ClR(M) der Konjugate tendenziell

geringer ausfiel (1,4x bzw. 1,3x). Im Fäzes wurden tendenziell sowohl die Muttersubstanz

als auch die Konjugate verstärkt ausgeschieden (Ae F 1,4x; ClF 1,5x; Ae F(M) 4,9x; ClF(M)

4,9x). Insgesamt blieb die Ausscheidung mit dem Fäzes jedoch vernachlässigbar gering

(< 0,2% der Dosis). In ähnlicher Weise kam es in Kombination mit HPCD zu einer

verstärkten Ausscheidung der Muttersubstanz (Ae U 2,2x; ClR 1,7x) bei geringerer

Ausscheidung der Konjugate im Urin (Ae U(M) 1,5x; ClR(M) 2,3x). Im Fäzes hingegen war die

Ausscheidung der Konjugate unverändert, während die Ausscheidung der Muttersubstanz

sogar eher abnahm (Ae F 1,4x; ClF 2x).

Tab. 4.3: Ausscheidungsparameter von Paracetamol in der multiple dose Kinetik unter Einfluss

von Lösungsvermittlern.

Parameter NaCl PEG HPCD SOL

Ae U (% Dosis) 1,48 1,80* 3,07* 1,75

(1,28; 1,59) (1,74; 2,09) (2,54; 3,61) (1,64; 1,86)

ClR (ml/min) 0,33 0,47* 0,54* 0,27

(0,29; 0,34) (0,43; 0,52) (0,48; 0,57) (0,20; 0,29)

Ae U(M) (% Dosis) 37 27 24 41

(35; 39) (26; 30) (19; 35) (22; 49)

ClR(M) (ml/min) 8,4 6,0 3,6* 6,7

(7,3; 9,1) (5,8; 7,1) (2,9; 6,2) (2,1; 8,8)

Ae F (% Dosis) 0,10 0,14 0,07 0,22

(0,03; 0,19) (0,10; 0,18) (0,05; 0,10) (0,12; 0,27)

ClF (µl/min) 21 31 10 36

(7,2; 42) (26; 36) (9,5; 14) (22; 48)

Ae F(M) (% Dosis) 0,009 0,043 0,009 0,042

(0,002; 0,016) (0,035; 0,051) (0,007; 0,015) (0,019; 0,051)

ClF(M) (µl/min) 2,0 10,0 1,6 7,4

(0,4; 3,5) (8,7; 12,1) (1,0; 2,8) (3,6; 8,3)

NaCl, isotone Kochsalzlösung; PEG, Polyethylenglykol 400; HPCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin;

SOL, Solutol HS15 (Median, Interquartilsabstand; n = 6; *p < 0,05 Mann-Whitney-Test)

4 Ergebnisse

63

4.2.2 Talinolol

Die Kontrollgruppe war im Hinblick auf das relativ große Vss (~1,6 l), und die überwiegend

renale Ausscheidung der unveränderten Substanz (5x vs. fäkal) vergleichbar mit

Literaturangaben im Menschen (Tab. 2.1, S. 12) und der Ratte.80 Es wurden jedoch nur

22% der Dosis unverändert wiedergefunden und damit deutlich weniger als beim

Menschen üblich. In der Ratte wird Talinolol jedoch deutlich stärker nicht nur zu dem im

Menschen gefundenen 4-trans-Hydroxycyclohexyl-Metaboliten verstoffwechselt, sondern

v.a. auch zum 4-cis-Hydroxycyclohexyl-Derivat und in geringen Mengen zu einem

Cyclohexenyl-Derivat.80 Konkrete quantitative Angaben und Untersuchungen zur fäkalen

Ausscheidung fehlen jedoch. Vermutlich bedingt durch den stärkeren Metabolismus war

die T1/2 mit ~2 h deutlich kürzer als beim Menschen, jedoch mit Literaturangaben in der

Ratte nach oraler Applikation vergleichbar.81 Darüber hinaus kann die diskontinuierliche

Entleerung von Darm und Blase zu einer unvollständigen Wiederfindung geführt haben.

In der single dose Kinetik übten alle drei Lösungsvermittler qualitativ den gleichen Effekt

auf Talinolol aus: Das Vss war erhöht (2,2 – 6,5x; PEG nicht signifikant) und die T1/2

verlängert (4,6 – 14x; PEG nicht signifikant), ohne dass dies nennenswerte Auswirkungen

auf die AUC hatte (Abb. 4.14 bis Abb. 4.16 sowie Tab. 7.14 im Anhang, S. 129).


Parameter der single dose Kinetik von Talinolol mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,

schwarz) bzw. Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 30 60 90 120

c (

µg

/ml)

t (min)

Parameter NaCl PEG

AUC0-24h (µg*h/ml) 1,28 (1,18; 1,34) 1,43 (1,35; 1,53)

C0 (µg/ml) 7,9 (7,2; 8,2) 6,4 (6,2; 6,8)

Vss (l) 1,01 (0,97; 1,07) 2,26 (1,16; 8,03)

T1/2 (h) 1,3 (1,2; 1,5) 5,9 (1,7; 16,8)

Cltot (ml/min) 22,0 (21,7; 25,6) 20,3* (18,2; 21,0)

4 Ergebnisse

64



schwarz) bzw. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,




schwarz) bzw. Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 30 60 90 120

c (

µg

/ml)

t (min)

Parameter NaCl HPCD

AUC0-24h (µg*h/ml) 1,28 (1,18; 1,34) 1,04 (0,98; 1,23)

C0 (µg/ml) 7,9 (7,2; 8,2) 5,7 (4,9; 5,8)

Vss (l) 1,01 (0,97; 1,07) 2,58* (1,63; 3,93)

T1/2 (h) 1,3 (1,2; 1,5) 6,0* (2,8; 8,4)

Cltot (ml/min) 22,0 (21,7; 25,6) 26,5 (25,3; 27,4)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 30 60 90 120

c (

µg

/ml)

t (min)

Parameter NaCl SOL

AUC0-24h (µg*h/ml) 1,28 (1,18; 1,34) 1,29 (1,27; 1,35)

C0 (µg/ml) 7,9 (7,2; 8,2) 5,2 (4,5; 5,9)

Vss (l) 1,01 (0,97; 1,07) 6,6* (2,4; 46)

T1/2 (h) 1,3 (1,2; 1,5) 19,1* (5,7; 91,8)

Cltot (ml/min) 22,0 (21,7; 25,6) 20,3 (19,7; 24,4)

4 Ergebnisse

65

In der multiple dose Kinetik waren dieselben Effekte zu beobachten, jedoch weniger stark

ausgeprägt (Vss: 1,7 – 3,3x höher, nur SOL signifikant; T1/2: 2,2 – 3,4x länger, nicht

signifikant). Die verlängerte T1/2 spiegelte sich auch in einer tendenziell höheren Cmin wider

(3,3 – 4,3x) (Abb. 4.17 bis Abb. 4.19 sowie Tab. 7.15 im Anhang, S. 129f).

Die veränderte Verteilung äußerte sich bei den einzelnen Lösungsvermittlern

unterschiedlich. Das leicht vergrößerte Vss in der PEG-Gruppe spiegelte sich allenfalls im

Ileum wider (1,6x). Dem stand jedoch eine signifikant geringere Verteilung ins Colon

(2,5x) und tendenziell geringere Verteilung ins Gehirn (1,9x) gegenüber. Das tendenziell

größere Vss unter Einfluss von HPCD spiegelte sich in einer dramatischen Akkumulation

von Talinolol in Nieren (8x) und Duodenum (4,4x) wider, tendenziell war dies auch in

anderen Organen wie der Leber zu beobachten (1,6x). Das signifikant größere Vss mit

SOL spiegelte sich auch in einer tendenziell stärkeren Verteilung in die Darmabschnitte

(v.a. Ileum: 3,8x) wider. Dem gegenüber stand jedoch eine signifikant geringere

Verteilung in die Nieren (2x) (Tab. 4.4, S. 67).


Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,



0

1

2

3

4

5

0 30 60 90 120

c (

µg

/ml)

t (min)

Parameter NaCl PEG

AUC0-12h (µg*h/ml) 0,60 (0,55; 0,62) 0,68 (0,54; 0,74)

C0 (µg/ml) 3,3 (2,9; 4,5) 3,4 (3,3; 4,1)

Vss (l) 1,6 (1,5; 3,2) 2,8 (2,0; 7,4)

T1/2 (h) 2,3 (1,7; 6,8) 5,1 (4,1; 12,5)

Cltot (ml/min) 24,5 (21,6; 27,6) 21,8 (18,3; 24,8)

ClR (ml/min) 4,8 (4,6; 5,0) 3,1 (3,0; 3,5)

ClF (ml/min) 1,10 (0,80; 1,16) 0,44 (0,39; 0,44)

4 Ergebnisse

66









0

1

2

3

4

5

0 30 60 90 120

c (

µg

/ml)

t (min)

Parameter NaCl HPCD

AUC0-12h (µg*h/ml) 0,60 (0,55; 0,62) 0,57 (0,52; 0,61)

C0 (µg/ml) 3,3 (2,9; 4,5) 3,5 (3,2; 4,1)

Vss (l) 1,6 (1,5; 3,2) 3,2 (2,5; 3,8)

T1/2 (h) 2,3 (1,7; 6,8) 5,6 (4,6; 6,7)

Cltot (ml/min) 24,5 (21,6; 27,6) 25,6 (23,0; 26,4)

ClR (ml/min) 4,8 (4,6; 5,0) 4,8 (4,5; 5,2)

ClF (ml/min) 1,10 (0,80; 1,16) 0,72 (0,67; 0,94)

0

1

2

3

4

5

0 30 60 90 120

c (

µg

/ml)

t (min)

Parameter NaCl SOL

AUC0-12h (µg*h/ml) 0,60 (0,55; 0,62) 0,57 (0,53; 0,58)

C0 (µg/ml) 3,3 (2,9; 4,5) 2,5 (2,4; 2,6)

Vss (l) 1,6 (1,5; 3,2) 5,3* (3,8; 9,4)

T1/2 (h) 2,3 (1,7; 6,8) 7,7 (6,7; 12,1)

Cltot (ml/min) 24,5 (21,6; 27,6) 23,3 (21,0; 29,5)

ClR (ml/min) 4,8 (4,6; 5,0) 4,9 (3,7; 5,5)

ClF (ml/min) 1,10 (0,80; 1,16) 0,72 (0,48; 1,12)

4 Ergebnisse

67

Tab. 4.4: Organverteilung von Talinolol in der multiple dose Kinetik unter Einfluss von

Lösungsvermittlern.


Hirn 0,65 0,35 0,40 0,38

(Ratio COrgan/Cav) (0,35; 0,98) (0,25; 0,43) (0,38; 0,42) (0,36; 0,44)

Herz 0,90 0,67 1,17 0,59

(Ratio COrgan/Cav) (0,84; 0,91) (0,39; 0,95) (1,02; 1,42) (0,56; 0,68)

Nieren 0,56 0,35 4,42* 0,27*

(Ratio COrgan/Cav) (0,50; 0,66) (0,30; 0,60) (3,44; 5,18) (0,24; 0,29)

Leber 0,20 0,14 0,32 0,19

(Ratio COrgan/Cav) (0,14; 0,27) (0,04; 0,24) (0,23; 0,38) (0,15; 0,22)

Testes 14,5 11,4 17,8 13,6

(Ratio COrgan/Cav) (13,8; 16,1) (11,1; 15,9) (15,9; 20,2) (13,2; 14,7)

Duodenum 0,23 0,27 0,99* 0,37

(Ratio COrgan/Cav) (0,21; 0,40) (0,16; 0,40) (0,87; 1,07) (0,33; 0,43)

Jejunum 1,74 1,75 1,31 2,11

(Ratio COrgan/Cav) (1,40; 1,90) (1,27; 1,89) (1,21; 1,42) (1,51; 2,6)

Ileum 0,66 1,06 0,57 2,49

(Ratio COrgan/Cav) (0,64; 0,70) (0,34; 1,36) (0,35; 0,77) (1,07; 2,67)

Colon 50 20* 46 51

(Ratio COrgan/Cav) (41; 60) (6,2; 28) (29; 55) (24; 63)



4.2.3 Colchicin

Die Kontrollgruppe war im Hinblick auf das sehr große Vss (4 bzw. 8 l), die lange T1/2 (14

bzw. 20 h) und die beträchtliche Menge an unverändert ausgeschiedenem Colchicin (je

15% der Dosis renal bzw. fäkal) vergleichbar mit Literaturdaten im Menschen (Tab. 2.1, S.

12) und in der Ratte.67,82

In der single dose Kinetik waren keinerlei signifikante Effekte zu beobachten.

Insbesondere mit PEG kam es jedoch zu größeren numerischen Unterschieden. Initial

erhöhte PEG das Vc (2,5x) und reduzierte entsprechend die C0 (2,4x). Auch das Vss

vergrößerte sich (1,9x). Als Ausdruck für die stärkere Umverteilung erhöhte sich auch Cltot

(2x) und die AUC0-24h wurde kleiner (2x). Entsprechend verlängerte sich T1/2 (1,9x). Im Fall

von Colchicin war auf Grund der langen T1/2 die über den gemessenen Zeitraum hinaus

extrapolierte Restfläche der AUC deutlich größer als 20%. Daher wurde hier zusätzlich die

4 Ergebnisse

68

AUC0-∞ betrachtet. Sie war in der single dose Kinetik mit PEG tendenziell größer (1,4x) als

in der Kontrollgruppe und spiegelte damit die auf Grund der langsamen Rückverteilung

aus tieferen Kompartimenten verlängerte T1/2 wider (Abb. 4.20 bis Abb. 4.22 sowie Tab.

7.16 im Anhang, S. 131).


Parameter der single dose Kinetik von Colchicin mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,



0

50

100

150

200

250

0 30 60 90 120

c (

ng

/ml)

t (min)

Parameter NaCl PEG

AUC0-24h (ng*h/ml) 66 (63; 75) 31 (30; 47)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 83 (76; 136) 118 (46; 203)

C0 (ng/ml) 215 (175; 227) 90 (68; 96)

Vss (l) 8,2 (6,3; 9,6) 15,7 (4,9; 28,5)

T1/2 (h) 20 (16; 36) 39 (11; 100)

Cltot (ml/min) 9,2 (7,3; 10,6) 18,8 (13,5; 19,8)

4 Ergebnisse

69









0

50

100

150

200

250

0 30 60 90 120

c (

ng

/ml)

t (min)

Parameter NaCl HPCD

AUC0-24h (ng*h/ml) 66 (63; 75) 62 (60; 81)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 83 (76; 136) 115 (98; 1577)

C0 (ng/ml) 215 (175; 227) 163 (147; 199)

Vss (l) 8,2 (6,3; 9,6) 9,0 (7,5; 12,3)

T1/2 (h) 20 (16; 36) 35 (24; 491)

Cltot (ml/min) 9,2 (7,3; 10,6) 9,4 (7,8; 9,8)

0

50

100

150

200

250

0 30 60 90 120

c (

ng

/ml)

t (min)

Parameter NaCl SOL

AUC0-24h (ng*h/ml) 66 (63; 75) 83 (58; 94)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 83 (76; 136) 120 (91; 195)

C0 (ng/ml) 215 (175; 227) 159 (105; 186)

Vss (l) 8,2 (6,3; 9,6) 8,9 (4,5; 13,0)

T1/2 (h) 20 (16; 36) 25 (20; 34)

Cltot (ml/min) 9,2 (7,3; 10,6) 6,8 (5,5; 10,0)

4 Ergebnisse

70

In der multiple dose Kinetik hatte PEG ebenfalls keinen signifikanten Effekt auf Colchicin.

Wiederum war die T1/2 verlängert (1,8x). Obwohl eine stärkere Verteilung in die Leber

(1,6x) und die Darmabschnitte (1,3 – 3,5x) beobachtet wurde, nahm das Vss eher ab

(1,3x) (Abb. 4.23 und Tab. 4.5, S. 72).

HPCD und SOL verringerten in der multiple dose Kinetik signifikant die Cltot (1,3x bzw.

1,7x) und erhöhten signifikant die AUCs (1,3 – 2,3x), Cmin und Cav (1,3 – 1,8x). Damit

einher ging eine tendenzielle Verlängerung der T1/2 (1,4x bzw. 1,2x) (Abb. 4.24 und Abb.

4.25). Obwohl Vss in beiden Gruppen nahezu unverändert war, gab es tendenziell

Differenzen in der Organverteilung. HPCD verringerte tendenziell die Verteilung in alle

untersuchten Organe (bis zu 3,4x), v.a. Gehirn, Herz, Testes und Darmabschnitte. SOL

hingegen verringerte tendenziell die Verteilung v.a. in Herz und Colon (1,3x bzw. 2,4x),

aber erhöhte tendenziell die Verteilung in die Leber (1,4x) (Tab. 4.5, S. 72). Des Weiteren

war in beiden Gruppen die Ausscheidung der Muttersubstanz mit dem Fäzes tendenziell

geringer als in der Kontrollgruppe (Tab. 7.17 im Anhang, S. 131f).


Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin mit isotoner Kochsalzlösung (NaCl,



0

20

40

60

80

100

120

0 30 60 90 120

c (

ng

/ml)

t (min)

Parameter NaCl PEG

AUC0-12h (ng*h/ml) 55 (55; 60) 67 (43; 86)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 88 (65; 104) 124 (54; 205)

C0 (ng/ml) 91 (64; 112) 75 (70; 88)

Vss (l) 4,4 (3,2; 5,5) 3,5 (3,0; 4,0)

T1/2 (h) 14 (10; 24) 26 (7; 41)

Cltot (ml/min) 5,0 (4,7; 5,9) 4,6 (3,5; 7,2)

ClR (ml/min) 0,81 (0,61; 2,05) 0,67 (0,34; 1,13)

ClF (ml/min) 0,68 (0,55; 2,05) 1,13 (0,39; 2,02)

4 Ergebnisse

71









0

20

40

60

80

100

120

0 30 60 90 120

c (

ng

/ml)

t (min)

Parameter NaCl HPCD

AUC0-12h (ng*h/ml) 55 (55; 60) 74* (67; 79)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 88 (65; 104) 146* (132; 226)

C0 (ng/ml) 91 (64; 112) 79 (64; 87)

Vss (l) 4,4 (3,2; 5,5) 4,6 (4,0; 5,2)

T1/2 (h) 14 (10; 24) 33 (26; 48)

Cltot (ml/min) 5,0 (4,7; 5,9) 3,9* (3,7; 4,0)

ClR (ml/min) 0,81 (0,61; 2,05) 0,99 (0,86; 1,12)

ClF (ml/min) 0,68 (0,55; 2,05) 0,17 (0,13; 0,38)

0

20

40

60

80

100

120

0 30 60 90 120

c (

ng

/ml)

t (min)

Parameter NaCl SOL

AUC0-12h (ng*h/ml) 55 (55; 60) 94* (83; 104)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 88 (65; 104) 203 (156; 388)

C0 (ng/ml) 91 (64; 112) 81 (71; 99)

Vss (l) 4,4 (3,2; 5,5) 3,6 (3,5; 4,4)

T1/2 (h) 14 (10; 24) 30 (25; 64)

Cltot (ml/min) 5,0 (4,7; 5,9) 3,0* (2,6; 3,5)

ClR (ml/min) 0,81 (0,61; 2,05) 0,65 (0,56; 0,68)

ClF (ml/min) 0,68 (0,55; 2,05) 0,18 (0,06; 1,05)

4 Ergebnisse

72

Tab. 4.5: Organverteilung von Colchicin in der multiple dose Kinetik unter Einfluss von



Hirn 0,038 0,036 0,028 0,031

(Ratio cOrgan/Cav) (0,036; 0,055) (0,028; 0,057) (0,027; 0,035) (0,030; 0,034)

Herz 3,36 2,88 2,06 2,50

(Ratio cOrgan/Cav) (2,28; 4,53) (2,56; 5,37) (1,89; 2,21) (2,18; 3,93)

Nieren 3,35 4,92 2,63 3,06

(Ratio cOrgan/Cav) (2,64; 6,04) (4,34; 8,05) (2,32; 3,29) (2,54; 4,62)

Leber 2,19 3,48 2,03 3,14

(Ratio cOrgan/Cav) (1,83; 3,29) (2,90; 4,22) (1,86; 2,20) (1,67; 5,53)

Testes 1,79 1,91 1,21 1,48

(Ratio cOrgan/Cav) (1,04; 2,19) (1,39; 2,87) (1,07; 1,24) (1,32; 1,83)

Duodenum 3,88 4,89 2,83* 3,28

(Ratio cOrgan/Cav) (3,3; 4,79) (3,22; 7,55) (2,71; 2,98) (2,95; 4,85)

Jejunum 6,1 12,1 5,6 7,2

(Ratio cOrgan/Cav) (4,5; 8,5) (6,5; 22,4) (5,1; 6,2) (5,3; 11,1)

Ileum 10,3 14,6 9,0 8,3

(Ratio cOrgan/Cav) (7,4; 12,4) (8,3; 28,8) (7,5; 10,2) (7,1; 12,6)

Colon 9,9 34,9 2,9 4,2

(Ratio cOrgan/Cav) (4,6; 23,8) (11,2; 82) (1,8; 3,3) (2,6; 29,6)



4.2.4 Ciclosporin A

Die Kontrollgruppe war im Hinblick auf das große Vss (1 – 4 l) mit starker Verteilung in

Leber und Nieren, langer T1/2 (11,5 h) und geringer Ausscheidung der unveränderten

Substanz (4,5%, v.a. im Fäzes) vergleichbar mit Literaturdaten im Menschen (Tab. 2.1,

S. 12) und bei der Ratte.83-85

In der single dose Kinetik hatten alle drei Lösungsvermittler qualitativ den gleichen

Einfluss auf Ciclosporin A. Vc und Vss waren signifikant reduziert (2 – 6x), ebenso die Cltot

(3,1 – 6,2x). Als Ausdruck der geringeren Verteilung war bei HPCD und SOL tendenziell

auch die T1/2 verringert (1,5 – 1,9x). Entsprechend waren die AUCs und C0 signifikant

erhöht (2,2 – 5,9x) (Abb. 4.26 bis Abb. 4.28 sowie Tab. 7.18 im Anhang, S. 133).

4 Ergebnisse

73


Parameter der single dose Kinetik von Ciclosporin A mit isotoner Kochsalzlösung

(NaCl, schwarz) und Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand;




(NaCl, schwarz) und Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,


0

100

200

300

400

500

600

0 30 60 90 120

c (

ng

/ml)

t (min)

Parameter NaCl PEG

AUC0-24h (ng*h/ml) 71 (61; 73) 214* (190; 243)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 89 (77; 97) 232* (225; 304)

C0 (ng/ml) 102 (94; 132) 224* (151; 261)

Vss (l) 4,1 (3,5; 8,8) 1,69* (1,46; 2,09)

T1/2 (h) 11,5 (6,0; 21,3) 11,5 (7,7; 15,4)

Cltot (ml/min) 8,7 (7,8; 9,9) 2,8* (2,4; 3,1)

0

100

200

300

400

500

600

0 30 60 90 120

c (

ng

/ml)

t (min)

Parameter NaCl HPCD

AUC0-24h (ng*h/ml) 71 (61; 73) 309* (263; 343)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 89 (77; 97) 344* (285; 435)

C0 (ng/ml) 102 (94; 132) 494* (418; 556)

Vss (l) 4,1 (3,5; 8,8) 0,94* (0,91; 1,39)

T1/2 (h) 11,5 (6,0; 21,3) 7,8 (7,1; 9,2)

Cltot (ml/min) 8,7 (7,8; 9,9) 1,8* (1,8; 2,3)

4 Ergebnisse

74



(NaCl, schwarz) und Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;


In der multiple dose Kinetik zeichnete sich grundsätzlich ein ähnliches Bild ab, wobei die

Unterschiede nicht mehr ganz so groß und für HPCD auch nicht mehr signifikant waren

(Abb. 4.29 bis Abb. 4.31 sowie Tab. 7.19 im Anhang, S. 133f). Darüber hinaus war die ClR

bei allen drei Lösungsvermittlern reduziert (1,6 – 3x; nur PEG signifikant). Hingegen blieb

die ClF durch PEG unbeeinflusst und wurde durch HPCD tendenziell erhöht (1,7x) aber

durch SOL verringert (1,7x). Das tendenziell geringere Vss spiegelte sich in allen drei

Gruppen in einer tendenziell geringeren Verteilung in Gehirn, Leber und Darmabschnitte

wider (bis 2,3x). Dem stand bei HPCD jedoch eine verstärkte Verteilung in Nieren (2x)

und Testes (2,2x, signifikant), bei SOL in die Testes (1,5x) gegenüber (Tab. 4.6, S. 77).

0

100

200

300

400

500

600

0 30 60 90 120

c (

ng

/ml)

t (min)

Parameter NaCl SOL

AUC0-24h (ng*h/ml) 71 (61; 73) 422* (277; 562)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 89 (77; 97) 452* (298; 595)

C0 (ng/ml) 102 (94; 132) 411* (255; 615)

Vss (l) 4,1 (3,5; 8,8) 0,68* (0,39; 0,95)

T1/2 (h) 11,5 (6,0; 21,3) 5,9 (5,2; 7,7)

Cltot (ml/min) 8,7 (7,8; 9,9) 1,4* (1,0; 2,1)

4 Ergebnisse

75


Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A mit isotoner Kochsalzlösung

(NaCl, schwarz) und Polyethylenglykol 400 (PEG, rot) (Median, Interquartilsabstand;




(NaCl, schwarz) und Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD, grün) (Median,


0

100

200

300

400

0 30 60 90 120

c (

ng

/ml)

t (min)

Parameter NaCl PEG

AUC0-12h (ng*h/ml) 187 (161; 227) 491* (432; 560)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 353 (219; 433) 950 (700; 984)

C0 (ng/ml) 208 (151; 231) 341 (252; 387)

Vss (l) 0,95 (0,69; 1,94) 0,54 (0,32; 0,75)

T1/2 (h) 11,6 (6,6; 43) 17,8 (7,8; 33)

Cltot (ml/min) 1,5 (1,3; 1,7) 0,6* (0,5; 0,7)

ClR (µl/min) 6,5 (4,5; 10,0) 2,2* (1,9; 2,4)

ClF (µl/min) 55 (30; 84) 60 (55; 70)

0

100

200

300

400

0 30 60 90 120

c (

ng

/ml)

t (min)

Parameter NaCl HPCD

AUC0-12h (ng*h/ml) 187 (161; 227) 229 (224; 390)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 353 (219; 433) 244 (229; 407)

C0 (ng/ml) 208 (151; 231) 361 (296; 411)

Vss (l) 0,95 (0,69; 1,94) 0,44 (0,3; 0,54)

T1/2 (h) 11,6 (6,6; 43) 5,8 (5,4; 6,5)

Cltot (ml/min) 1,5 (1,3; 1,7) 1,3 (0,7; 1,4)

ClR (µl/min) 6,5 (4,5; 10,0) 3,3 (2,5; 4,0)

ClF (µl/min) 55 (30; 84) 91 (68; 110)

4 Ergebnisse

76



(NaCl, schwarz) und Solutol HS15 (SOL, blau) (Median, Interquartilsabstand; n = 6;


0

100

200

300

400

0 30 60 90 120

c (

ng

/ml)

t (min)

Parameter NaCl SOL

AUC0-12h (ng*h/ml) 187 (161; 227) 538* (346; 678)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 353 (219; 433) 703 (373; 2676)

C0 (ng/ml) 208 (151; 231) 326 (226; 401)

Vss (l) 0,95 (0,69; 1,94) 0,37 (0,33; 0,72)

T1/2 (h) 11,6 (6,6; 43) 8,3 (6,8; 47)

Cltot (ml/min) 1,5 (1,3; 1,7) 0,5* (0,4; 0,9)

ClR (µl/min) 6,5 (4,5; 10,0) 4,0 (3,6; 5,0)

ClF (µl/min) 55 (30; 84) 33 (22; 59)

4 Ergebnisse

77

Tab. 4.6: Organverteilung von Ciclosporin A in der multiple dose Kinetik unter Einfluss von



Hirn 0,168 0,078 0,110 0,091

(Ratio cOrgan/Cav) (0,122; 0,182) (0,070; 0,088) (0,105; 0,112) (0,078; 0,103)

Herz 1,16 0,91 0,98 0,81

(Ratio cOrgan/Cav) (0,98; 1,85) (0,82; 1,06) (0,55; 1,05) (0,54; 0,98)

Nieren 4,9 3,9 9,7 4,9

(Ratio cOrgan/Cav) (4,0; 9,9) (3,8; 4,2) (5,0; 16,9) (3,9; 6,5)

Leber 19,0 13,8 11,2 9,2

(Ratio cOrgan/Cav) (9,2; 26,2) (10,2; 17,3) (8,5; 13,4) (7,2; 9,9)

Testes 1,3 1,1 2,9* 2,0

(Ratio cOrgan/Cav) (1,2; 1,4) (0,9; 1,2) (2,5; 4,9) (1,4; 3,9)

Duodenum 2,0 1,3 1,8 1,5

(Ratio cOrgan/Cav) (1,2; 2,4) (1,1; 1,4) (1,5; 2,0) (1,1; 2,1)

Jejunum 2,8 1,5 1,4 1,2

(Ratio cOrgan/Cav) (1,6; 3,4) (1,2; 1,6) (1,1; 1,8) (1,0; 1,5)

Ileum 2,1 2,2 1,8 1,6

(Ratio cOrgan/Cav) (1,8; 5,1) (1,7; 2,2) (1,7; 2,3) (1,6; 2,2)

Colon 5,8 3,8* 4,0 4,5

(Ratio cOrgan/Cav) (4,9; 7,0) (3,0; 5,1) (3,4; 4,3) (3,7; 5,4)



78

5 Diskussion


PEG 400, HPCD, SOL und CrEL konnten die Funktion von OATPs und NTCP im

Zellversuch deutlich beeinflussen. Ein unspezifischer Effekt durch Beeinflussung der

Zellviabilität ist für PEG und SOL auszuschließen. Die leichte Reduktion der Zellviabilität

in Anwesenheit von 10% HPCD oder CrEL schien nicht relevant zu sein, da die OATP-

Hemmung deutlich unterhalb der gut verträglichen Konzentration von 1% auftrat.

Da diese Lösungsvermittler häufig in oralen und parenteralen Arzneizubereitungen

eingesetzt werden und Aufnahmetransporter bedeutende Faktoren in der Resorption,

Verteilung und Elimination von Arzneistoffen sind, ist bei gleichzeitiger Anwendung mit

substanziellen pharmakokinetischen Interaktionen zu rechnen.

PEG 400 zeigte sich im Zellversuch als selektiver OATP1A2-Hemmstoff. Da das

Kosolvens weder stabile Komplexe noch Mizellen ausbildet und die Aufnahme von E3S

und TA nur in OATP1A2-transfizierten Zellen gehemmt wurde, ist hierfür ein spezifischer

Mechanismus zu vermuten. Basierend auf dem durchschnittlichen Blutvolumen eines

Erwachsenen wären ca. 5 ml reines PEG 400 i.v. notwendig, um Blutkonzentrationen

vergleichbar der bestimmten IC50 zu erreichen, ausschließlich intravaskuläre Verteilung

vorausgesetzt. In Anbetracht der langsamen Infusionsgeschwindigkeit (≤ 0,6 ml/min)

kommerzieller Produkte und der kurzen Plasmahalbwertzeit von PEG 400 (≤ 18 min)86

erreichen PEG-haltige Produkte zur i.v.-Applikation (z.B. Torasemid, Diazepam,

Temsirolimus) vermutlich keine ausreichend hohe Konzentration am Transporter, um

OATP1A2 z.B. in der Blut-Hirn-Schranke zu hemmen. Gleiches trifft auch auf den

Effluxtransporter ABCB1 zu, für den PEG 400 ebenfalls als Inhibitor beschrieben ist.12 Im

Darm hingegen ist das Flüssigkeitsvolumen sehr variabel und im nüchternen Zustand

vernachlässigbar klein.87 Daher kann die lokale Konzentration nach oraler Applikation

PEG-haltiger Produkte die IC50 überschreiten und die OATP1A2-vermittelte Absorption

von gleichzeitig verabreichten Arzneistoffen ggf. beeinträchtigen.

Darüber hinaus könnte die Selektivität von PEG 400 für OATP1A2 als experimentelles

Werkzeug ausgenutzt werden, um die Spezifität von OATP1A2 gegenüber anderen

OATPs in vitro wie in vivo zu beurteilen.

Die Interaktion von HPCD mit OATPs und NTCP war im vorliegenden Zellversuch

substratabhängig. Dieser Befund könnte darauf hinweisen, dass HPCD nicht direkt mit

dem Transportprotein interagiert, sondern durch die Ausbildung stabiler Komplexe mit den

5 Diskussion

79

Steranen E3S, E17βG und TA deren freie Konzentration verringert. Des Weiteren sind

HPCD und andere Cyclodextrine dafür bekannt, stabile Komplexe mit Cholesterol zu

formen.88,89 Daher ist zu vermuten, dass solch eine Komplexierung zu verschiedenen

Interaktionen mit vielen Steranen und anderen lipophilen Verbindungen wie

Glukokortikoiden, Herzglykosiden und oralen Kontrazeptiva führen könnte. Dem

entsprechend wurde bereits beschrieben, dass HPCD die Organverteilung von Oridonin

und Flupirtin nach i.v. und oraler Applikation in Nagern deutlich verändern kann.90,91

Ein weiteres Ergebnis des Zellversuchs war, dass HPCD die Aufnahme von TA durch

NTCP verringerte, die BSP-Aufnahme jedoch erhöhte. Diese Verbesserung der Aufnahme

könnte durch eine allosterische Stimulation bedingt sein, wie sie kürzlich für OATP1B1,

OATP1B3 und OATP2B1 mit den Testsubstanzen Ibuprofen und Progesteron gezeigt

wurde.92,93 Eine Komplexierung von BSP wurde in diesem Zellversuch als nicht relevant

angesehen, da BSP kein Sterangrundgerüst wie die anderen Substrate aufweist.

SOL und CrEL hemmten alle untersuchten Aufnahmetransporter. Eine Hemmung der

Substrataufnahme oberhalb der CMC von 0,005% bzw. 0,007% könnte auf ein mizellares

trapping der Substrate ähnlich der Komplexbildung von HPCD zurückzuführen sein.

OATP1A2, OATP1B3 und OATP2B1 wurden jedoch bereits unterhalb dieser

Konzentration inhibiert. Daher spielen bei den Emulgatoren vermutlich sowohl spezifische

wie unspezifische Mechanismen eine Rolle. Der unspezifische Einschluss in Mizellen ist

wahrscheinlich der Hauptmechanismus für die Hemmung der weniger empfindlichen

Transporter OATP1B1 und NTCP. Entsprechend den in vitro Befunden könnten schon

weniger als 600 µl der Emulgatoren ausreichend sein, um OATP1A2, OATP1B3 und

OATP2B1 im Darm, der Leber und an Blut-Organ-Schranken zu beeinflussen. Daher

können Veränderung in der Absorption und Verteilung von OATP-Substraten mit

zugelassenen SOL- oder CrEL-haltigen Medikamenten auftreten, wie es für SOL und

Colchicin oder CrEL und Paclitaxel bereits belegt ist.82,94,95

5.2 Tierexperimentelle Untersuchungen

Zur Beurteilung der in vivo Relevanz der in vitro Befunde wurde der Einfluss der

Lösungsvermittler PEG 400, HPCD und SOL auf die Modellarzneistoffe Paracetamol,

Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A untersucht. Diese Modellarzneistoffe sind in

unterschiedlichem Ausmaß Substrate für metabolisierende Enzyme der Phase I und II

sowie für Aufnahme- und Effluxtransporter (Tab. 2.1, S. 12), die wichtige Determinanten

der Pharmakokinetik sind. Die ausgewählten Hilfsstoffe stellen häufig v.a. in der Präklinik

verwendete Lösungsvermittler mit unterschiedlichen Mechanismen der Lösungs-

5 Diskussion

80

vermittlung dar (s. Einleitung, S. 3ff). Dieses Set sollte auch Rückschlüsse auf den

Hauptmechanismus der Hilfsstoff-Arzneistoff-Interaktion des jeweiligen Lösungs-

vermittlers ermöglichen. Die Studie wurde in eine single dose und eine multiple dose

Phase unterteilt, um akute (z.B. Transporter-Hemmung) und chronische (z.B. Transporter-

Induktion oder Runterregulation) Effekte erfassen zu können.

Keiner der untersuchten Lösungsvermittler war in der tierexperimentellen Studie

pharmakologisch vollständig inert, wie es per Definition für Hilfsstoffe eigentlich sein

sollte. Zwischen den einzelnen Hilfsstoff-Arzneistoff-Kombinationen gab es z.T.

beträchtliche Unterschiede, so dass eine pauschale Interpretation unmöglich ist. Daher ist

eine differenzierte Betrachtung der einzelnen Hilfsstoff-Arzneistoff-Kombinationen

notwendig.

Als Diskussionsgrundlage werden im Folgenden kurz die pharmakokinetischen

Eigenschaften der Hilfsstoffe vorgestellt, bevor die einzelnen Hilfsstoff-Arzneistoff-

Kombinationen sortiert nach den Arzneistoffen betrachtet werden.

PEG 400 (Abb. 1.5, S. 4) ist ein eher kleines, hydrophiles Molekül (~ 400 Da; logP -5)96

und kann daher Biomembranen leicht durch passive Diffusion und v.a. sogenannten

solvent drag überwinden.97 Aufgrund seiner Hydrophilie wird es rasch und nahezu

vollständig unverändert über den Urin ausgeschieden (77% binnen 12 h nach i.v.

Applikation).98 PEG 400 ist in der Literatur als Inhibitor des metabolisierenden Enzyms

CYP3A4 und des Effluxtransporters ABCB1 beschrieben.12,13,99 Im in vitro Teil dieser

Dissertation wurde aber auch eine selektive Hemmung des Aufnahmetransporters

OATP1A2 gezeigt.

HPCD (Abb. 1.4 B, S. 4) ist ein relativ großes, außen hydrophiles Molekül (~ 1400 Da,

logP -2,1)100 und kann Biomembranen daher kaum passieren.101 Dem entsprechend wird

HPCD nach i.v. Applikation fast ausschließlich unverändert renal eliminiert (glomeruläre

Filtration; 90% binnen 4 h nach i.v. Applikation).100 Auch die in der Literatur beschriebene

CYP3A4-Hemmung konnte nur in Mikrosomen, jedoch nicht in Hepatozyten gezeigt

werden.102 Darüber hinaus inhibiert HPCD den Effluxtransporter ABCB1.12,13 Im in vitro

Teil dieser Dissertation wurde aber auch eine Substrat-abhängige Inhibition von OATPs

und eine Stimulation von NTCP beobachtet.

SOL ist ein äußerst komplexes Stoffgemisch bestehend aus ca. 70% Polyethylenglykol

660-12-hydroxystearat (lipophiler Anteil) und ca. 30% freiem PEG 660 (hydrophiler Anteil)

sowie weiteren Bestandteilen (Diester, PEG–stearate, –palmitate und –oleate, freie

Fettsäuren etc.).103 Zur Verteilung und Elimination ist in der Literatur nichts beschrieben.

Auf Grund seiner Struktur ist eine Spaltung via Lipasen und anschließende β-Oxidation

5 Diskussion

81

der Fettsäure sowie die unveränderte renale Ausscheidung der PEG-Anteile naheliegend.

SOL ist als Inhibitor von CYP3A4 in Hepatozyten und in vivo beschrieben,34,82 woraus sich

eine ausreichende Membranpermeabilität schließen lässt. Des Weiteren ist SOL als

ABCB1-Inhibitor bekannt12 und wurde im in vitro Teil dieser Dissertation außerdem als

potenter Inhibitor von OATPs und NTCP identifiziert.

Paracetamol ist gut permeabel und verteilt sich relativ gleichmäßig in die Gewebe.104 Die

Elimination erfolgt rasch, primär über Phase II Metabolisierung und renale Ausscheidung

der Konjugate, wobei in der Ratte die Sulfatierung überwiegt.79 Ein geringer Teil wird auch

oxidativ über CYP2E1, CYP1A2 (Cyp2e1 und Cyp1a2 in der Ratte) und andere CYPs

zum Chinonimin-Derivat umgesetzt, das mittels Glutathionkopplung entgiftet wird.57

Metaboliten und Muttersubstanz werden fast ausschließlich renal eliminiert, wobei die

Konjugate aktiv über ABCC2 – 4 und ABCG2 sezerniert46,47 werden und die

Muttersubstanz einer starken Reabsorption unterliegt.104

PEG führte zu keinen nennenswerten Veränderungen der kinetischen Parameter von

Paracetamol im Blut nach Einzel- wie auch Mehrfachgabe. Jedoch veränderte sich in der

multiple dose Kinetik die Ausscheidung sowohl der Paracetamol-Muttersubstanz als auch

der Konjugate (keine Daten zur Ausscheidung in der single dose Kinetik erhoben). Beides

wird fast ausschließlich renal eliminiert. Als Ursache für die tendenziell geringere absolute

Ausscheidung und ClR der Konjugate ließe sich zunächst eine Hemmung des Phase II

Metabolismus durch PEG in der Leber vermuten. Dem widersprechen jedoch die

unveränderte T1/2 und Cav und die signifikant erhöhte ClR der Muttersubstanz. Daher

kommt als Ursache für die verringerte Elimination der Konjugate eher eine Hemmung des

Konjugat-Effluxes (ABCCs, ABCG2; s.o.) in Betracht.

PEG 400 ist bisher als ABCB1-Hemmer in der Literatur beschrieben.12,99 Zum Einfluss auf

ABCCs und ABCG2 ist jedoch nichts bekannt.

Eine Efflux-Hemmung erklärt aber nicht den Anstieg der ClR der Muttersubstanz.

Paracetamol unterliegt einer starken Reabsorption im Nierentubulus wie es aus der

Literatur bekannt ist104 und auch in der vorliegenden Studie beobachtet wurde (ClR der

Kontrollgruppe von 0,33 ml/min, fu ~ 0,963 vs. glomeruläre Filtrationsrate (GFR) von ca.

3,9 ml/min).105 Die Reabsorption in der Niere kann bei lipophilen Substanzen durch

passive Diffusion erfolgen. Dies wurde bisher auch für Paracetamol angenommen.

Darüber hinaus gibt es in der apikalen Membran der Tubuluszellen Aufnahmetransporter

wie OAT4, novel organic cation transporter (OCTN) 1 und 2, PEPT1 und 2 sowie

OATP1A2, die diesen Prozess für weniger lipophile Verbindungen erleichtern können.14,16

Eine Inhibition der tubulären Reabsorption über solche Transporter kann zu einer

verstärkten renalen Elimination des entsprechenden Substrats führen.106 Da PEG genau

diesen Effekt auf die Paracetamol-Muttersubstanz hatte und eine Beeinträchtigung der

5 Diskussion

82

passiven Diffusion von Paracetamol durch PEG unwahrscheinlich erscheint (kein Effekt

von PEG auf den passiven transzellulären Transport von Testosteron in Caco2-Zellen),107

könnte hier ein bisher unbekannter Aufnahmetransporter für die tubuläre Reabsorption

von Paracetamol durch PEG gehemmt worden sein.

Auf Grund seiner Säureamidstruktur kommen v.a. PEPT1 und PEPT2 dafür in Frage.

PEPT1 wird außerdem auf der apikalen Seite von Enterozyten exprimiert14,16 und könnte

dort auch für die gute Resorption von Paracetamol aus dem Darm verantwortlich sein.

Zum Einfluss von PEG auf PEPT1/2 ist bisher in der Literatur nichts bekannt und ein

geeignetes Zellmodell für diese Transporter stand zum Zeitpunkt der Untersuchungen am

Institut für Pharmakologie nicht zur Verfügung.

Dagegen wurde im in vitro Teil dieser Arbeit gezeigt, dass PEG 400 humanes OATP1A2

hemmen kann. Inwiefern dieses Ergebnis auf Ratten übertragbar ist, bleibt fraglich, da es

in der Ratte kein direktes Orthologes gibt (z.B. Oatp1a1 in der Niere, Oatp1a5 im

Darm).108 Da PEG 400 OAPT1A2 selektiv gegenüber den anderen humanen OATPs

hemmte, ist nicht abzuschätzen, ob PEG 400 auch die anderen Mitglieder der Oatp1a-

Familie in der Ratte hemmen würde.

HPCD erhöhte initial das Vc von Paracetamol und verringerte damit die C0. Der

zusätzliche Verteilungsraum könnte durch Komplexbildung zustande gekommen sein.

Eine Komplexierung von Paracetamol durch Cyclodextrine ist schon länger bekannt.

Kürzlich wurde auch der Paracetamol-HPCD-Komplex beschrieben.109 Cyclodextrin-

Komplexe lassen sich auf Grund ihrer Hydrophilie der Molekülaußenseite nicht

extrahieren, so dass nur die verringerte freie Paracetamol-Konzentration messbar wäre.

Cyclodextrine und deren Komplexe können nur in sehr geringem Ausmaß Biomembranen

passieren.101 Demnach wäre die Verteilung von Paracetamol in die Organe durch die

verzögerte Freisetzung aus dem Komplex behindert, wie es das tendenziell geringere Vss

suggeriert. Entsprechend würde HPCD indirekt den Metabolismus in der Leber hemmen,

wie es die längere T1/2 und die geringere ClM widerspiegeln. Ob Paracetamol tatsächlich

weniger in die Leber und andere Organe verteilt wurde, konnte in dieser Studie nicht

überprüft werden, da die gemessenen Konzentrationen in den Organen auf Grund der

kurzen T1/2 von Paracetamol in allen Gruppen (inkl. NaCl-Kontrolle) unterhalb des LOQ

lagen.

HPCD und seine Komplexe werden schnell und vollständig über die Nieren

ausgeschieden (glomeruläre Filtration).100 Die erhöhte ClR von Paracetamol ließe sich in

diesem Rahmen dadurch erklären, dass der komplexierte Anteil nicht tubulär reabsorbiert

werden kann. Somit ließen sich die beobachteten Effekte in dieser Gruppe allein mit der

physiko-chemischen Interaktion zwischen HPCD und Paracetamol erklären ohne direkten

Einfluss von HPCD auf Transporter oder metabolisierende Enzyme.

5 Diskussion

83

SOL reduzierte in beiden Studienarmen die Cltot und verlängerte entsprechend die T1/2

und erhöhte die AUC. Dies könnte auf eine Hemmung des Metabolismus hindeuten. Da

die ClM der Konjugate jedoch nur wenig kleiner war, kommt hier eher eine Hemmung des

Phase I Metabolismus in Frage. SOL ist zwar bereits als CYP3A-Hemmer

beschrieben,34,82 so dass eine Hemmung der am Metabolismus von Paracetamol

beteiligten Enzyme CYP2E1 und CYP1A2 (Cyp2e1 und Cyp1a2 in der Ratte) durch SOL

nicht unwahrscheinlich ist. Dieser Stoffwechselweg scheint jedoch auch in der Ratte

insbesondere bei der niedrigen Dosierung kaum eine Rolle zu spielen.79

Die reduzierte Cltot und verlängerte T1/2 könnte auch mit dem größeren Vss

zusammenhängen, dessen Ursache jedoch ebenfalls fraglich ist. Grundsätzlich kann ein

größeres Vss durch ein trapping in den Organen auf Grund einer Hemmung von

Effluxtransportern möglich sein, was auch die Rückverteilung ins Blut und damit die

Elimination verzögern würde.

SOL ist bereits als ABCB1-Inhibitor bekannt,12 Paracetamol ist jedoch, wenn überhaupt,

ein sehr schwaches ABCB1-Substrat.110 Zu anderen Effluxtransportern ist weder zu SOL

noch zur Paracetamol-Muttersubstanz etwas bekannt.

Talinolol gilt als gut permeable Substanz, die Biomembranen v.a. mit Hilfe von

Transportproteinen in größerem Umfang überwindet. So sind für die zelluläre Aufnahme

verschiedene OATPs (s.u.) verantwortlich, während Talinolol über ABCB1 und ABCC2

aktiv z.B. von Nieren, Leber und Darm sezerniert wird.55 Unverändertes Talinolol wird

nach i.v. Applikation primär renal eliminiert. Es gibt Hinweise darauf, dass Talinolol in der

Ratte zu einem bedeutenden Anteil metabolisiert wird. Quantitative Aussagen zum

Metabolismus und zur fäkalen Ausscheidung fehlen jedoch.80

Auf die pharmakokinetischen Parameter von Talinolol im Blut hatten alle drei

Lösungsvermittler in beiden Studienarmen qualitativ den gleichen Effekt. Das größere Vss

ließe sich durch ein trapping in den Organen via ABCB1-Hemmung erklären. Alle drei

Hilfsstoffe sind als ABCB1-Hemmer beschrieben12,13 und Talinolol ist als gutes ABCB1-

Substrat bekannt.55 Der Effekt auf die tatsächlich gemessene Organverteilung von

Talinolol unterschied sich jedoch zwischen den einzelnen Hilfsstoffen.

In der PEG-Gruppe spiegelte sich das vergrößerte Vss lediglich im Ileum wider. Dem

gegenüber stand eine geringere Verteilung von Talinolol in Gehirn, Nieren, Leber und

Colon. Die geringere Verteilung ins Colon kann Ausdruck der verringerten ClF als Folge

einer Efflux-Inhibition in den oberen Darmabschnitten und der Leber gewesen sein. Die

Darmabschnitte wurden inklusive des Inhalts analysiert, so dass die gemessenen

Arzneistoffkonzentrationen primär die Konzentration im Fäzes in den jeweiligen

Darmabschnitten widerspiegeln.

5 Diskussion

84

Die geringere Verteilung in die übrigen Organe kann durch eine Hemmung von

Aufnahmetransportern, insbesondere der OATP1A-Familie, verursacht worden sein.

Talinolol ist Substrat verschiedener OATPs, darunter humanes OATP1A2 (u.a. apikal im

Gehirn) und Oatp1a5 der Ratte (u.a. apikal im Darm).55 Es ist wahrscheinlich, dass

Talinolol auch Substrat für die übrigen Oatp1a-Mitglieder der Ratte ist (u.a. Oatp1a1

apikal im Gehirn und Oatp1a4 basolateral in der Leber)108 und dass PEG 400 eventuell

auch diese wie OATP1A2 hemmt. Dass die Reduktion der Verteilung in die Leber weniger

stark ausgeprägt war als im Gehirn, mag an einer möglichen Kompensation über Oatp1b2

in der Leber gelegen haben. Unpublizierte hauseigene Daten belegen, dass Talinolol

auch Substrat für OATP1B1 und OATP1B3 (humane Orthologe zu Oatp1b2 der Ratte)108

ist. Diese Transporter wurden im Zellversuch nicht durch PEG gehemmt.

Als basolaterales OATP in der Niere wurde OATP4C1 identifiziert.111 Dieser Transporter

wurde bisher aber wenig untersucht, so dass unbekannt ist, ob Talinolol Substrat für

OATP4C1 ist und ob Hilfsstoffe mit diesem Transporter interagieren. Des Weiteren käme

OCT2 in Frage. Andere β-Blocker sind bereits als OCT2-Substrate bekannt und Talinolol

ist als Inhibitor für diesen Transporter beschrieben,55 was darauf hindeutet, dass auch

Talinolol Substrat für OCT2 sein könnte. Eine OCT2-Hemmung durch PEG 400 wäre zwar

rein hypothetisch, würde aber die geringere Verteilung in die Nieren erklären.

Das größere Vss von Talinolol unter Einfluss von HPCD äußerte sich v.a. in einer

massiven Anreicherung in Nieren und Duodenum. In den Nieren sind die apikalen

Effluxtransporter ABCB1 und ABCC2 für HPCD auch ohne das Überwinden von

Biomembranen sehr leicht zu erreichen (glomeruläre Filtration von HPCD) und damit

hemmbar. Fraglich ist, ob die alleinige Hemmung von ABCB1 und ggf. ABCC2 für die

massive Akkumulation in der Niere (7x) ausreicht oder ob eventuell auch eine Stimulation

basolateraler Aufnahmetransporter wie OCT2 eine Rolle spielen könnte (vgl. Stimulation

der NTCP-abhängigen Aufnahme von TA durch HPCD im Zellversuch, Abb. 4.4, S. 52).

Unter Einfluss von SOL nahm die Verteilung von Talinolol im gesamten Dünndarm(lumen)

zu. Dem gegenüber stand eine geringere Verteilung ins Gehirn und v.a. die Nieren. Dies

kann durch eine Hemmung von Aufnahmetransportern wie OATPs und OCT2 verursacht

worden sein (vgl. Talinolol / PEG).

Colchicin ist eine eher gut permeable Substanz und verteilt sich daher gut in verschiedene

Organe und Gewebe mit Ausnahme des Gehirns.67 Ein beträchtlicher Anteil wird über

CYP3A4 (Cyp3a2 in der Ratte) oxidativ demethyliert und anschließend konjugiert (UGT,

SULT und GST).61,67 Die Ausscheidung von Colchicin und seinen Metaboliten erfolgt

hauptsächlich mit dem Fäzes, die renale Elimination ist aber nicht zu vernachlässigen.67

5 Diskussion

85

Colchicin wird u.a. in Leber, Nieren und Darm aktiv via ABCB1 und ABCC2 sezerniert und

unterliegt einem enterohepatischen Kreislauf.48,64

Das größere Vss und die verlängerte T1/2 in der single dose Kinetik von Colchicin in

Kombination mit PEG 400 könnte durch eine Hemmung von Effluxtransportern und ggf.

metabolisierenden Enzymen erklärt werden. Entsprechend zeigte sich in der multiple dose

Kinetik (nur verlängerte T1/2) eine Akkumulation in Leber und Nieren. PEG 400 ist bereits

als Inhibitor für ABCB1 und CYP3A4 (Cyp3a2 in der Ratte) beschrieben.12,13 Da beide

Proteine essentielle Determinanten der Pharmakokinetik von Colchicin sind, ist eine

Interaktion über diesen Mechanismus sehr wahrscheinlich.

HPCD hatte auf Colchicin qualitativ den gleichen Effekt wie auf Paracetamol. Da auch für

Colchicin kürzlich der HPCD-Komplex beschrieben wurde,112 ist hier in Analogie zu

HPCD / Paracetamol ebenfalls die Komplexbildung als Ursache der beobachteten Effekte

zu vermuten. Entsprechend der Annahme, dass komplexierter Arzneistoff nur schwer

Biomembranen passieren kann, war die Verteilung in sämtliche untersuchten Organe

verringert.

Auch SOL hatte einen ähnlichen Effekt auf Colchicin. SOL bildet jedoch keine Komplexe,

sondern Mizellen, in denen der Arzneistoff eingelagert werden kann. Rein rechnerisch lag

initial die SOL-Konzentration (ca. 0,3% w/v) im Blut oberhalb der CMC, so dass das

Vorkommen von SOL-Mizellen im Blut zumindest zu Beginn der Kinetik denkbar wäre.

Damit könnte in Analogie zur Komplexbildung mit HPCD ein mizellares trapping für die

beobachteten Effekte verantwortlich gemacht werden. Dagegen spricht jedoch die

Anreicherung in Leber und Jejunum, so dass doch selektivere Mechanismen in Betracht

kommen. Die stärkere Verteilung in die Leber gepaart mit der verlängerten T1/2 könnten

auf eine Hemmung des Metabolismus (CYP3A4/Cyp3a2) und / oder des hepatischen

Efflux (ABCB1, ABCC2) hindeuten. SOL ist bereits als Hemmer von CYP3A4 und ABCB1

beschrieben.12,34 Da die Verteilung in andere Organe, die ebenfalls ABCB1 exprimieren

(z.B. Gehirn und Nieren), jedoch tendenziell verringert war, erscheint die Hemmung des

Metabolismus wahrscheinlicher. Dies wurde auch von einer anderen Arbeitsgruppe

bereits so postuliert.82

Ciclosporin A ist auf Grund seiner hohen Lipophilie eine relativ gut permeable Substanz

und verteilt sich entsprechend gut in verschiedene Organe und Gewebe.83 Die Verteilung

wird jedoch durch die Effluxtransporter ABCB1 und ABCC2 begrenzt.53,56 Ciclosporin A

wird umfangreich über CYP3A4 (Cyp3a2 in der Ratte) metabolisiert und primär in Form

der Metabolite über den Fäzes ausgeschieden.85

5 Diskussion

86

Die single dose Kinetik von Ciclosporin A wurde durch alle drei Lösungsvermittler in

gleicher Weise beeinflusst. Die höhere C0 und AUC hängen mit der geringeren

Umverteilung zusammen. Diese kann durch eine Hemmung von Aufnahmetransportern

verursacht worden sein. Ciclosporin A reduziert jedoch auch konzentrationsabhängig den

renalen und hepatischen Blutfluss und kann so über eine Minderperfusion zu einer

geringeren Gewebeverteilung führen.113,114 Es gibt jedoch Hinweise, dass die

Minderperfusion primär durch den im Fertigarzneimittel enthaltenen Lösungsvermittler

CrEL verursacht wird, der in der vorliegenden Tierstudie nicht angewendet wurde.114

In der multiple dose Kinetik setzte sich dieses Bild im Wesentlichen fort, auch wenn die

Effekte nicht mehr ganz so groß waren. Die tatsächliche Verteilung von Ciclosporin A in

den Organen wurde durch die Hilfsstoffe jedoch unterschiedlich beeinflusst. Gemeinsam

war ihnen eine geringere Verteilung ins Darmlumen, was auf einer ABCB1-Hemmung

beruhen könnte.

Trotz möglicher Efflux-Hemmung war auch die Verteilung in Gehirn und Leber reduziert.

Dies deutet auf eine Hemmung von Aufnahmetransportern hin. Für Ciclosporin A ist

bisher zwar noch kein Aufnahmetransporter identifiziert, die Inhibition verschiedener

OATPs115,116 und massive Reabsorption in der Niere (ClR der Kontrollgruppe von

6,5 µl/min, fu ~0,165,66 vs. GFR von ca. 3,9 ml/min)105 trotz Efflux via ABCB1 und ABCC2

können jedoch ein erster Hinweis auf die Existenz von Aufnahmetransportern für

Ciclosporin A sein. Hierfür könnten z.B. Transporter der OATP1A-Familie und OATP2B1

in Frage kommen.

Beträchtliche Unterschiede in der Organverteilung von Ciclosporin A zwischen den

einzelnen Hilfsstoffgruppen gab es in den Nieren und den Testes. Unter Einfluss von

HPCD wurde Ciclosporin A stärker in die Nieren verteilt. Im Zusammenhang mit der

verringerten ClR könnte das auf eine Hemmung von Effluxtransportern wie ABCB1 und

ABCC2 hindeuten. Des Weiteren erhöhten HPCD und SOL die Verteilung von Ciclosporin

A in die Testes. Auch hier könnte die Hemmung von Effluxtransportern eine Rolle spielen.

Im Gegensatz zum Gehirn, wo ebenfalls ABCB1 luminal (und damit für HPCD erreichbar)

exprimiert wird,14,117 muss es in den Testes einen Aufnahmemechanismus für Ciclosporin

A geben, der durch SOL und HPCD nicht beeinträchtigt oder im Falle von HPCD ggf.

sogar stimuliert wurde. Dies können verschiedene Transporter der OATP-, OCT- und

OAT-Familien sein, die z.T. auch Testes-spezifisch exprimiert werden (z.B. OATP6B1,

OATP6C1). Auch eine Interaktion mit den verschieden z.T. ebenfalls Testes-spezifischen

junctions ist nicht auszuschließen.117,118

87

Tab. 5.1: Postulierte Mechanismen der Hilfsstoff-Arzneistoff-Interaktionen im Tierversuch.

Polyethylenglykol 400 Hydroxypropyl-β-cyclodextrin Solutol HS15

Paracetamol

Hemmung Konjugat-Efflux

(ABCCs?, ABCG2?);

Hemmung Reabsorption

(Pept1?, Oatp1a1? Oatp1a3?)

Komplexbildung Hemmung Phase I Metabolismus

(Cyp2e1?, Cyp1a2?)

Talinolol

Hemmung ABCB1 & ABCC2?;

Hemmung Oatp1a-Familie,

evtl. Hemmung Oct2?

Hemmung ABCB1 & ABCC2?;

evtl. Stimulation Oct2?

Hemmung ABCB1 & ABCC2?

Hemmung Oatps,

evtl. Hemmung Oct2?

Colchicin Hemmung ABCB1;

Hemmung Cyp3a2 Komplexbildung

evtl. Hemmung ABCB1;

Hemmung Cyp3a2;

evtl. auch mizellares trapping

Ciclosporin A

Hemmung ABCB1 & ABCC2

Hemmung Aufnahmetransporter

(Oatp1a-Familie?)

Hemmung ABCB1 & ABCC2


(Oatp1a-Familie?, Oatp2b1?)

Hemmung ABCB1 & ABCC2;


(Oatp1a-Familie?, Oatp2b1?);

evtl. auch mizellares trapping

5 Diskussion

88

In der tierexperimentellen Studie beeinflussten die Lösungsvermittler PEG 400, HPCD

und SOL die Modellarzneistoffe Paracetamol, Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A in

ihrer Pharmakokinetik auf unterschiedliche Weise (Tab. 5.1) und in unterschiedlichem

Ausmaß. Die beobachteten Veränderungen schienen dabei von mehreren Variablen

(Pharmakokinetik der Arzneistoffe, Pharmakokinetik der Hilfsstoffe, Substrat / Inhibitor-

Eigenschaften, physiko-chemische Eigenschaften etc.) bestimmt zu werden, so dass die

Überlagerung von Einzeleffekten (z.B. Efflux- vs. Aufnahme-Hemmung) zu einem sehr

komplexen Bild führte. Da der Einfluss der Lösungsvermittler primär von den Substrat-

Eigenschaften des jeweiligen Arzneistoffes abhängig zu sein scheint, können auch keine

allgemeinen Schlussfolgerungen bezüglich zu erwartender Einflüsse der Hilfsstoffe auf

andere Arzneistoffe anhand der BCS-Klassen abgeleitet werden. Ebenso deutete sich an,

dass selbst von so gut erforschten Arzneistoffen, wie den verwendeten Modellsubstanzen,

noch nicht alle Determinanten der Pharmakokinetik bekannt sind (z.B. eventuelle

Aufnahmetransporter für Paracetamol und Ciclosporin A).

Um die klinische Relevanz der Befunde aus der Tierstudie zu beurteilen, muss zunächst

geklärt werden, ob die Ratte ein geeignetes Modell zur Prädiktion für den Menschen

darstellt. Wie im Ergebnis-Teil dargelegt, stimmen die pharmakokinetischen Parameter

wie Vss, T1/2, Art und Umfang der Metabolisierung sowie der Hauptausscheidungsweg der

Ratten für Colchicin und Ciclosporin A relativ gut mit den Daten aus dem Menschen

überein (vgl. S. 67 und S. 72 sowie Tab. 2.1, S. 12). Bei Paracetamol und Talinolol gab es

hingegen Diskrepanzen bzgl. Art und Umfang der Metabolisierung. So wird Paracetamol

in der Ratte deutlich stärker sulfatiert, während Paracetamol beim Menschen

hauptsächlich glukuronidiert wird.79 Insgesamt bleibt aber der Hauptausscheidungsweg in

Form der renalen Elimination beider Konjugate bei Ratte und Mensch vergleichbar. In

beiden Spezies spielen die Ausscheidung der unveränderten Muttersubstanz und der

Metabolismus über CYP-Enzyme mit anschließender Glutathionkopplung nur eine

untergeordnete Rolle (vgl. S. 58 sowie Tab. 2.1, S. 12).63,79 Somit ist die Ratte auch für

Paracetamol ein geeignetes Modell für die Prädiktion von wesentlichen

pharmakokinetischen Aspekten im Menschen.

Bei Talinolol scheint es hingegen gravierendere Unterschiede bzgl. des Umfangs des

Metabolismus zu geben. Während der Metabolismus von Talinolol im Menschen kaum

eine Rolle zu spielen scheint (<3%),55 gibt es Hinweise darauf, dass in der Ratte

möglicher Weise > 50% der Dosis metabolisiert werden.80 Damit ließe sich auch die

Diskrepanz in der T1/2 (10 – 17 h im Menschen vs. 1 – 2 h in der Ratte)55,81 erklären.

Darüber hinaus spielen verschiedene Aufnahmetransporter der OATP-Familie eine Rolle

für die Pharmakokinetik von Talinolol. Insbesondere in Bezug auf die OATP1A-Isoformen

gibt es jedoch deutliche Unterschiede bzgl. Expression und Funktion zwischen Mensch

5 Diskussion

89

und Ratte. So gibt es im Menschen nur das OATP1A2, das u.a. apikal im Gehirn, der

Niere und wahrscheinlich auch im Darm, nicht jedoch basolateral im Hepatozyten

exprimiert ist.18 In der Ratte werden in den einzelnen Organen hingegen unterschiedliche

Oatp1a-Isoformen exprimiert u.a. Oatp1a1 und Oatp1a3 apikal in der Niere, Oatp1a1 und

Oatp1a5 apikal im Gehirn, Oatp1a5 apikal im Darm aber eben auch Oatp1a1 und Oat1a4

basolateral im Hepatozyten.21 So kann je nach Substratspezifität die Verteilung in der

Ratte eine andere sein und Inhibitoren können je nach Affinität einen anderen Einfluss

haben, wie am Beispiel des gegensätzlichen Effektes von Grapefruitsaft auf die

Resorption von Talinolol in Ratten und Menschen in der Literatur belegt.119 Unter diesem

Aspekt ist die Ratte kein gutes Modell für die Prädiktion der Pharmakokinetik von Talinolol

im Menschen.

Grundlegende qualitative Aussagen darüber, ob überhaupt mit einem Einfluss von

Lösungsvermittlern auf die Pharmakokinetik im Menschen zu rechnen ist, sind dennoch

möglich. Darüber hinaus bezieht sich ein wesentlicher Aspekt dieser Arbeit auf die

präklinische Forschung, in der Ratten häufig eingesetzt werden. Trotzdem soll an dieser

Stelle zunächst eine mögliche klinische Relevanz im Menschen beurteilt werden (zur

Relevanz in der Präklinik s.u., S. 90ff).

Die klinische Relevanz dieser in vivo Befunde dürfte in erster Linie von der

therapeutischen Breite des jeweiligen Arzneistoffes sowie den Hilfsstoffkonzentrationen

abhängen. Unter Berücksichtigung des geringen Einflusses der verhältnismäßig hohen

Hilfsstoffkonzentrationen auf AUC (außer Colchicin / SOL) und C0 von Paracetamol,

Talinolol und Colchicin dürften die festgestellten Unterschiede zwar mechanistisch (v.a.

für die Präklinik) interessant, zumindest für die i.v. Applikation gut löslicher Arzneistoffe

(BCS Klassen 1 und 3) mit großer bis mittlerer therapeutischer Breite wohl aber kaum

klinisch relevant sein. Auf Grund der vielfältigen Interaktionen mit Transportproteinen und

metabolisierenden Enzymen ist auch mit einem Einfluss auf die enterale Resorption nach

oraler Applikation zu rechnen, deren Ausmaß und Relevanz anhand der vorliegenden

Daten wegen der vielen und z.T. unbekannten Variablen jedoch nicht vorhersagbar ist,

u.a. da die Applikation nur i.v. erfolgte.

Hingegen waren AUC und C0 von Ciclosporin A (schlecht löslich, sehr enge

therapeutische Breite), z.T. dramatisch erhöht (bis zu 5x), so dass in der Klinik mit einer

erhöhten Toxizität für schlecht lösliche Arzneistoffe (BCS Klassen 2 und 4; erfordern hohe

Konzentrationen an Lösungsvermittlern) mit enger therapeutischer Breite (klinische

Relevanz bereits bei geringen Veränderungen der Disposition) zu rechnen wäre.

Für das konkrete Beispiel Ciclosporin A / HPCD ließe sich im Verhältnis zur Erhöhung der

Bioverfügbarkeit sogar eine überproportional höhere Nephrotoxizität wegen der

5 Diskussion

90

verstärkten Verteilung in die Nieren vermuten. Im Gegensatz dazu wäre die

Hepatotoxizität in Anwesenheit der Lösungsvermittler im Verhältnis zur Bioverfügbarkeit

eventuell geringer wegen der reduzierten Verteilung in dieses Organ. Der Einfluss der

Hilfsstoffe auf die erwünschte immunsuppressive Wirkung lässt sich anhand der Daten

jedoch nicht abschätzen. In Abhängigkeit davon, ob die Aufnahme von Ciclosporin A in

die Lymphozyten (Ort der Wirkung; ebenfalls Expression von ABCB1 und OATPs (z.B.

OATP3A1))120,121 durch die Lösungsvermittler beeinträchtigt wird, könnte die

immunsuppressive Wirkung abgeschwächt (bei Aufnahme-Hemmung) oder verstärkt (bei

ungehinderter Aufnahme und ABCB1-Hemmung) werden. Im ungünstigsten Fall

(verstärkte Verteilung in einzelne Organe wie Niere, verminderte Aufnahme in

Lymphozyten) könnte die erwünschte Wirkung trotz erhöhter Toxizität vermindert sein

(evtl. HPCD?). Im günstigsten Fall (geringere Aufnahme in Organe, verstärkte Aufnahme

in Lymphozyten) ließe sich das Wirkprofil zu Gunsten der erwünschten Wirkungen

verschieben (evtl. PEG 400?).

Im Allgemeinen bergen Lösungsvermittler damit nicht nur ein Risiko für

Arzneimittelinteraktionen wie im vorherigen Abschnitt 5.1. (S. 78ff) bereits diskutiert,

sondern könnten ggf. auch ähnlich wie Ritonavir zur Boosterung von HIV-Protease-

Inhibitoren122 gezielt zur Verbesserung der Pharmakokinetik von Arzneistoffen eingesetzt

werden (z.B. gezielte Verbesserung der Antitumorwirkung von Chemotherapeutika durch

absichtliche ABCB1- und CYP-Hemmung).123

Eine weitere wichtige Bedeutung haben die vorliegenden Ergebnisse in der präklinischen

und frühen klinischen Forschung für die Zulassung neuer Arzneistoffe. In Zellversuchen,

tierexperimentellen Studien und ersten Humanstudien kommen oftmals größere Mengen

von Lösungsvermittlern zum Einsatz, um schlecht lösliche Arzneistoffe für die

notwendigen Untersuchungen in Lösung zu bringen. Wenn der mögliche Einfluss der

Hilfsstoffe auf die NCE unbekannt ist oder nicht bedacht wird, könnte es zu Problemen bei

der Änderung von Formulierungen oder zu Fehlentscheidungen bzgl. Weiterentwicklung

oder Abbruch von NCE kommen. So könnte es z.B. bei einem Kandidaten, der ABCB1-

Substrat ist, bei einer Umstellung von einer Lösungsvermittler-haltigen oralen Lösung auf

eine Lösungsvermittler-freie Tablette zu einem dramatischen Abfall der Bioverfügbarkeit

kommen auf Grund des Wegfalls der ABCB1-Hemmung (Limitierung der enteralen

Resorption durch ABCB1). Bei einem Kandidaten, der Substrat für Aufnahmetransporter

ist, die durch den verwendeten Lösungsvermittler gehemmt werden, könnte der Kandidat

trotz guter Wirksamkeit an der isolierten Zielstruktur bereits bei ersten Versuchen an

intakten Zellen scheitern, weil er wegen des Hilfsstoffes nicht zur Zielstruktur vordringen

kann. Dagegen könnte die Entwicklung mit Hilfe eines anderen Hilfsstoffes erfolgreich

5 Diskussion

91

verlaufen. Das Wissen um solche möglichen Hilfsstoff-Arzneistoff-Interaktionen an

Transportproteinen und metabolisierenden Enzymen ist also bereits zu Beginn der

Arzneistoffentwicklung von Bedeutung, um im Bedarfsfall den geeigneten

Lösungsvermittler auswählen zu können. Dies setzt allerdings voraus, dass sowohl der

Arzneistoff als auch der Hilfsstoff dahingehend gut charakterisiert sind. Diese Arbeit stellt

diesbezüglich einen wichtigen Bestandteil der Grundlagenforschung dar, indem eine

kleine Auswahl häufig verwendeter Lösungsvermittler hinsichtlich ihres Einflusses auf

einzelne Aufnahmetransporter im Zellmodell und die in vivo Relevanz anhand von

Modellarzneistoffen charakterisiert wurde. Sie ergänzt damit die in der Literatur bereits

vorhanden Daten zum Einfluss auf Effluxtransporter wie ABCB1 und metabolisierende

Enzyme wie CYP3A4.12,13

Die Auswahl der untersuchten Lösungsvermittler und Transportproteine war jedoch klein.

Weitere häufig verwendete Lösungsvermittler wie Polysorbate, Poloxamere und D-α-

Tocopheryl-polyethylenglykol 1000-succinat beeinflussen ebenfalls ABCB1 und

CYP3A4,12,13,34,124,125 sind in Bezug auf Aufnahmetransporter jedoch bisher nicht

untersucht. Neben ABCB1, OATPs und NTCP spielen weitere Transportproteine wie z.B.

ABCCs, ABCG2 und multidrug and toxin extrusion proteins (MATEs) für den Efflux und

PEPT1/2, OCTs, OCTN1/2, OATs und ileal apical sodium / bile acid cotransporter (ASBT;

intestinales Pendant zu NTCP) für die Aufnahme eine wichtige Rolle in der

Pharmakokinetik von Arzneistoffen.14 Diese sind bezüglich der Beeinflussung durch

Lösungsvermittler jedoch kaum bis gar nicht untersucht.

Doch auch auf Seiten der Arzneistoffe gibt es Wissenslücken insbesondere im Bereich

der zellulären Aufnahme wie sich in der tierexperimentellen Studie gezeigt hat. Hinzu

kommt, dass zwar die Genexpression vieler Transporter in den wichtigsten Organen (v.a.

des Menschen) verhältnismäßig gut untersucht ist,16,20 die Quantität der mRNA-

Expression aber nicht immer mit der Proteinexpression korreliert126 und auch die

subzelluläre Lokalisation und damit die funktionelle Bedeutung der Transporter nicht

immer bekannt ist. Auf Grund der vielen und z.T. unbekannten Variablen ist es daher

zurzeit nicht möglich, Hilfsstoff-Arzneistoff-Interaktionen vorherzusagen. Deshalb und zur

Beurteilung der Übertragbarkeit auf den Menschen und der klinischen Relevanz sind in

Analogie zur vorliegenden Arbeit weiter führende in vitro und tierexperimentelle Studien

sowie ähnliche Untersuchungen im Menschen notwendig.

92

6 Zusammenfassung

Moderne Arzneistoffentwicklungsprogramme erbringen in zunehmendem Maße schwer

wasserlösliche Arzneistoffe. Dies bringt pharmazeutisch-technologische und

biopharmazeutische Probleme für deren Formulierung mit sich. Eine ausreichende

Löslichkeit ist notwendig für die Herstellung von intravenös zu applizierenden

Zubereitungen und die Durchführung von in vitro Untersuchungen z.B. im Rahmen der

Arzneistoffentwicklung. Eine schlechte Löslichkeit kann die Resorption verzögern und so

die Bioverfügbarkeit von oral verabreichten Arzneistoffen beeinträchtigen. Lösungs-

vermittler bieten eine Möglichkeit, die Wasserlöslichkeit von Arzneistoffen zu verbessern

und finden breite Anwendung in vielen zugelassenen Arzneimitteln und v.a. in der

präklinischen und klinischen Entwicklung. Trotz des Anspruchs der pharmakologischen

Inaktivität wurde in der Literatur für verschiedene Lösungsvermittler jedoch ein Einfluss

auf die Pharmakokinetik von Arzneistoffen beschrieben.12,13

Die Absorption, Verteilung und Elimination eines Arzneistoffes wird zu großen Teilen von

Transportproteinen und metabolisierenden Enzymen bestimmt. Als Ursache für die

pharmakokinetischen Veränderungen wurde eine Interaktion der Hilfsstoffe mit dem

Effluxtransporter P-Glykoprotein (ABCB1) und dem metabolisierenden Enzym Cytochrom

P450 (CYP) 3A4 erkannt.12,13 Zum Einfluss auf Aufnahmetransporter gab es bisher nur

wenige Erkenntnisse für Cremophor EL.95,127 Da sie dem Metabolismus und Efflux

vorgelagert sind, spielen Aufnahmetransporter eine besondere Rolle. Daher gab es einen

speziellen Bedarf an Wissen über den Einfluss von Lösungsvermittlern auf

Aufnahmetransporter.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Lösungsvermittler Polyethylenglykol

(PEG) 400, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD), Solutol HS15 (SOL) und Cremophor

EL (CrEL) auf die Aufnahmetransporter organic anion transporting polypeptide (OATP)

1A2, OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 und Na+ / taurocholate cotransporting polypeptide

(NTCP) an zellulären Transportermodellen untersucht. PEG 400 hemmte selektiv

OATP1A2. HPCD hemmte bei allen Transportern nur die Aufnahme von Substraten mit

Sterangrundgerüst vermutlich durch Komplexbildung, stimulierte jedoch die NTCP-

abhängige Aufnahme von Bromosulfophthalein (kein Steran). SOL und CrEL hemmten

alle Transporter. Für OATP1B1 und NTCP (Hemmung oberhalb der kritischen

Mizellbildungskonzentration (CMC)) ist ein mizellares trapping als Ursache

wahrscheinlich. Für OATP1A2, OATP1B3 und OATP2B1 (Hemmung unterhalb der CMC)

müssen spezifische Mechanismen involviert gewesen sein. Pharmakokinetische

6 Zusammenfassung

93

Interaktionen mit Hilfsstoffen können also auch auf Ebene der Aufnahmetransporter

stattfinden.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde die in vivo Relevanz der Befunde überprüft. In einer

Studie wurde der Einfluss von PEG 400, HPCD und SOL auf die Pharmakokinetik der

Modellarzneistoffe Paracetamol, Talinolol, Colchicin und Ciclosporin A nach intravenöser

Applikation an Ratten untersucht. Dabei erwies sich keiner der Hilfsstoffe als vollständig

inert. Es wurde eine Vielzahl unterschiedlicher Effekte beobachtet.

Häufig traten Veränderungen in der AUC, der Halbwertzeit und der Verteilung auf.

Grundsätzlich schienen alle in Frage kommenden Mechanismen auch in vivo eine Rolle

zu spielen. Die in der Literatur beschriebene Hemmung von Effluxtransport und Phase I

Metabolismus konnte bestätigt werden. Die in vitro beobachtete Hemmung von

Aufnahmetransportern konnte in vivo belegt werden. Auch unspezifische Mechanismen

wie Komplexbildung und mizellares trapping schienen in vivo relevant zu sein. Durch die

Überlagerung verschiedener Mechanismen ergab sich jedoch ein sehr komplexes Bild,

das sowohl von den Eigenschaften des jeweiligen Hilfsstoffes als auch von denen des

Arzneistoffes geprägt war. Daher konnten in den meisten Fällen nur allgemeine

Hypothesen zu den möglichen Ursachen der Interaktion aufgestellt werden. Aus

demselben Grund ist keine Extrapolation der Daten auf andere Lösungsvermittler und

Arzneistoffe im Sinne einer Vorhersage möglich, da die wenigsten Substanzen

ausreichend gut charakterisiert sind.

Dennoch lässt sich schlussfolgern, dass Lösungsvermittler ein gewisses Interaktions-

potenzial besitzen, das sich nicht nur auf ABCB1 und CYP3A4 beschränkt. Damit können

sie an Arzneimittelinteraktionen beteiligt sein. Diese Effekte sollten somit auch in der

Arzneimittelentwicklung berücksichtigt werden.

95

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107

7 Anhang

7.1 Übersichten über Geräte, Materialien, Chemikalien und

Pipettierschemen

7.1.1 In vitro Untersuchungen

Geräte

Analysenwaage Satorius research R200D, Satorius, Göttingen

β-Counter type 1409, LKB-Wallac, Turku, Finnland

Brutschrank HERAcell, Heraeus, Hanau, Deutschland

Heizschüttler Thermomixer 5436, Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Kühlzentrifuge Rotina 35R, Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland

Lichtmikroskop Typ 11090137001, Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland

Plattenphotometer Tecan infinite M200, Tecan, Crailsheim, Deutschland

Plattenschüttler CM-9, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Ringtensiometer K11 MK3, Krüss, Hamburg, Deutschland

Sterilwerkbank HERAsafe HS18, Heraeus, Hanau, Deutschland

Vakuumpumpe Typ N86KN-18, KNF Neuberger, Freiburg, Deutschland

Wasseraufbereitung SG Reinstwassersystem, Barsbüttel, Deutschland

Zellzähler CASYone, Schärfe System, Reutlingen, Deutschland

Software

Excel 2007 & 2010 Microsoft, Redmont, USA

GraphPad Prism 5.01 Graph Pad Software, San Diego, USA

Tecan i-control 1.6 Tecan, Crailsheim, Deutschland

Materialien

24-well-Platten Falcon 24-well, BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland

96- well -Platten nunc F96 MicroWell, Thermo Scientific, Roskilde, Dänemark

Zellkulturschalen 100x20 mm, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

7 Anhang

108

Medien und Puffer

Einfriermedium:

Fetal Bovine Serum Gold (PAA, Coelbe, Deutschland)

10% Dimethylsulfoxid (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

Inkubationspuffer:

142 mM NaCl (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

5 mM KCl (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

1 mM KH2PO4 (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

1,5 mM CaCl2 (Merck, Darmstadt, Deutschland)

1,2 mM MgSO4 7H2O (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

5 mM Glukose (Merck, Darmstadt, Deutschland)

12,5 mM HEPES (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

pH 7,3

Lysis-Puffer:

25mM Tris (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

50 mM NaCl (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

0,5% Desoxycholat (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland)

0,5 % Triton X-100 (Merck, Darmstadt, Deutschland)

pH 8

Nährmedium für Transportversuche mit HEK-Zellen:

MEM with Earle’s Salts without Glutamine (PAA, Coelbe, Deutschland)

10% Fetal Bovine Serum Gold (PAA, Coelbe, Deutschland)

2 mM stabiles Glutamin (PAA, Coelbe, Deutschland)

2 mM MEM Non Essential Amino Acids (PAA, Coelbe, Deutschland)

PBS:

8 g/l NaCl (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

1,15 g/l Na2HPO4 (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

0,2 g/l KCl (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

0,2 g/l KH2PO4 (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

7 Anhang

109

Selektionsmedium für HEK-Zellen:

MEM with Earle’s Salts without Glutamine (PAA, Coelbe, Deutschland)

1% Penicillin / Streptomycin (PAA, Coelbe, Deutschland)

10% Fetal Bovine Serum Gold (PAA, Coelbe, Deutschland)

2 mM stabiles Glutamin (PAA, Coelbe, Deutschland)

2 mM MEM Non Essential Amino Acids (PAA, Coelbe, Deutschland)

Selektionsantibiotikum (10 µl/ml G418 für Transportertransfektanten bzw.

3,5 µl/ml Hygromycin für Vektor-transfizierte Kontrollen)

Chemikalien und Kits

[3H]BSP 14 Ci/mmol, Hartmann Analytic, Braunschweig, Deutschland

[3H]E3S 50 Ci/mmol, Biotrend, Köln, Deutschland

[3H]E17βG 41,8 Ci/mmol, PerkinElmer Life and Analytical Sciences,

Waltham, USA

[3H]TA 4,6 Ci/mmol, PerkinElmer Life and Analytical Sciences,

Waltham, USA

Bicinchoninsäure-Kit Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific, Rockford,

USA

BSP Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

CrEL Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

E3S Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

E17βG Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

G418-sulfat PAA, Coelbe, Deutschland

HPCD AppliChem, Darmstadt, Deutschland

Hygromycin B PAA, Coelbe, Deutschland

Naringin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

PBS, steril Dulbecco’s PBS, PAA, Coelbe, Deutschland

PEG 400 AppliChem, Darmstadt, Deutschland

Resazurin PrestoBlue, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

Rifampicin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

SOL Bayer Healthcare, Berlin, Deutschland

Szintillationsflüssigkeit Rotiszint eco plus, Roth, Karlsruhe, Deutschland

TA Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

Trypsin-EDTA PAA, Coelbe, Deutschland

Wasser hausintern, einfach- und bidestilliert (s. Geräte)

Zellzählflüssigkeit CASYton, Schärfe System, Reutlingen, Deutschland

7 Anhang

110

Pipettierschema

Ansatz der Inkubationslösungen für einen Kompetitionsassay mit einem Transporter im

Konzentrationsbereich 0,0316 – 10% (w/v) im Triplett inklusive der mitgeführten

Kontrollen.

Tab. 7.1: Ansatz des 2xIPS für den Kompetitionsassay.

Trans-

porter Vol. IP Volumen Substrat Volumen markiertes Substrat

OATP1A2

1100 µl

2xIP

+ 2,2 µl E3S (1mM) + 0,55 µl [3H]E3S (50 Ci/mmol)

+ 2,2 µl TA (10mM) + 0,55 µl [3H]TA (4,6 Ci/mmol)

OATP1B1 + 2,2 µl E3S (1mM) + 0,55 µl [

3H]E3S (50 Ci/mmol)

+ 0,88 µl BSP (100 µM) + 0,31 µl [3H]BSP (14 Ci/mmol)

OATP1B3 + 2,2 µl E17βG (10mM) + 0,55 µl [

3H] E17βG (41,8 Ci/mmol)

+ 2,2 µl BSP (1mM) + 0,31 µl [3H]BSP (14 Ci/mmol)

OATP2B1 + 2,2 µl E3S (1mM) + 0,55 µl [

3H]E3S (50 Ci/mmol)


NTCP + 2,2 µl TA (10mM) + 0,55 µl [

3H]TA (4,6 Ci/mmol)


IP, Inkubationspuffer; IPS, substrathaltiger Inkubationspuffer; 2x, doppelt konzentriert

Tab. 7.2: Ansatz des 1xIPS für den Kompetitionsassay.

Trans-

porter Vol. IP Volumen Substrat Volumen markiertes Substrat

OATP1A2

6,5 ml

1xIP

+ 6,5 µl E3S (1mM) + 1,625 µl [3H]E3S (50 Ci/mmol)

+ 6,5 µl TA (10mM) + 1,625 µl [3H]TA (4,6 Ci/mmol)

OATP1B1 + 6,5 µl E3S (1mM) + 1,625 µl [

3H]E3S (50 Ci/mmol)

+ 2,6 µl BSP (100 µM) + 0,91 µl [3H]BSP (14 Ci/mmol)

OATP1B3 + 6,5 µl E17βG (10mM) + 1,625 µl [

3H] E17βG (41,8 Ci/mmol)


OATP2B1 + 6,5 µl E3S (1mM) + 1,625 µl [

3H]E3S (50 Ci/mmol)


NTCP + 6,5 µl TA (10mM) + 1,625 µl [

3H]TA (4,6 Ci/mmol)


IP, Inkubationspuffer; IPS, substrathaltiger Inkubationspuffer; 1x, einfach konzentriert

7 Anhang

111

Tab. 7.3: Ansatz der Inhibitorkontrolle für den Kompetitionsassay.

Transporter Substrat Volumen IPS Volumen Inhibitor

OATP1A2 E3S

990 µl 1xIPS

+ 10 µl Naringin (50 mM)

TA + 10 µl Naringin (50 mM)

OATP1B1 E3S + 10 µl Rifampicin (100 mM)

BSP + 10 µl Rifampicin (100 mM)

OATP1B3 E17βG + 10 µl Rifampicin (100 mM)


OATP2B1 E3S + 10 µl Rifampicin (100 mM)


NTCP TA + 10 µl BSP (100 mM)

BSP + 10 µl TA (100 mM)

IPS, substrathaltiger Inkubationspuffer

Abb. 7.1: Ansatz der Verdünnungsreihen für den Kompetitionsassay.

7.1.2 Tierexperimentelle Untersuchungen

Geräte

Analysenwaage SBC 21, Scaltec Instruments, Göttingen, Deutschland

Feinwaage EBM 200-2, Kern & Sohn, Balingen, Deutschland

Sterilwerkbank Z 633/80, VEB Elektromat, Dresden, Deutschland

550 µl 2xIPS

550 µl 20% Hilfsstoff

990 µl 1xIPS

110 µl

finale Hilfsstoffkonzentration 10% 1%

990 µl 1xIPS

110 µl

0,1%

550 µl 2xIPS

990 µl 1xIPS

110 µl

3,16% 0,316%

990 µl 1xIPS

110 µl

0,0316%

550 µl 6,32% Hilfsstoff

7 Anhang

112

Materialien

Arterienkatheter PhysioCath, Data Science International, St. Paul, USA

Einstreu Lignocel 3-4, steril, sniff, Soest, Deutschland

Futter R/M-H extrudiert, V1326, sniff, Soest, Deutschland

Insertionshilfe Catheter Introducer, BD Biosciences, Heidelberg,

Deutschland

Kanülen ( Arterienkatheter) Microlance 3 26G ½“, BD Biosciences, Heidelberg,

Deutschland

Kanülen (Venenkatheter) Sterican Gr. 12 22G 1¼“, B. Braun, Melsungen,

Deutschland

Kanülen (Insertion, Narkose) Neoject 21G 2“, Dispomed, Gelnhausen,

Deutschland

Kryoröhrchen nunc 1 ml, Thermo Scientific, Roskilde, Dänemark

Nahtmaterial Polyester, nicht resorbierbar, Resorba, Nürnberg,

Deutschland

Plastikreaktionsgefäße 0,5 ml Safe-Lock Tubes, Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Plastikreaktionsgefäße 10 ml PE, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Plastikreaktionsgefäße 50 ml Falcon, BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland

Ratten HsdHan:WIST, Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland

Spritzen Omnifix-F 1 ml, B. Braun, Melsungen, Deutschland

Sterilfilter Filtropur S 0,2, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Stopper Heftpflaster standard, Gothaplast, Gotha, Deutschland

Vacutainer Blutentnahmesystem Heparinröhrchen 6 ml mit 21G Kanüle,

BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland

Venenkatheter PU SoloCath, Instech Solomon, Plymouth Meeting, USA

Chemikalien und Medikamente

aqua ad injectabilia DetlaSelect, Dreieich, Deutschland

Ciclosporin A LC Laboratories, Woburn, USA

Colchicin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

Desinfektionsmittel Softasept N, B. Braun, Melsungen, Deutschland

Spitacid, Ecolab, Düsseldorf, Deutschland

Heparin Heparin-Natrium-25000, ratiopharm, Ulm, Deutschland

HPCD AppliChem, Darmstadt, Deutschland

isotone Kochsalzlösung 0,9% B. Braun, Melsungen, Deutschland

Ketamin 10% Ceva Tiergesundheit, Düsseldorf, Deutschland

7 Anhang

113

Paracetamol Caelo, Hilden, Deutschland

PEG 400 Fagron, Barsbüttel, Deutschland

Penicillin G Pen G 1 Mega, Jenapharm, Jena, Deutschland

SOL Bayer Healthcare, Berlin, Deutschland

Sevofluran Sevorane, Abott, Wiesbaden, Deutschland

Talinolol AWD, Dresden, Deutschland

Xylazin Rompun 2%, Bayer HealthCare, Monheim,

Deutschland

Kathetervorbereitung

Länge: 11 cm

Markierungen: 1,9 cm vom einen Ende (Insertionstiefe)

4 cm vom anderen Ende (Stopper)

Vorbehandlung: 30 min in Pen G einlegen, steril lufttrocknen, 5x mit aqua ad

injectabilia spülen (nur Venenkatheter)

30 min mit Kochsalz-Heparinlösung (250 I.E./ml) gefüllt

einlegen, steril lufttrocknen

Aufbewahrung in sterilem Gefäß

7.1.3 Arzneistoffanalytik

Geräte

Analysenwaage MC1 Research RC210D, Sartorius, Göttingen, Deutschland

API4000-System HPLC 1100 series, Agilent, Böblingen, Deutschland;

API4000, Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland

API3000-System HPLC 200 series, Perkin Elmer, Rodgau, Deutschland;

Jetstream 2 Plus Säulenofen, Thermotechnic Products,

Langenzersdorf, Österreich;

API3000, Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland

API2000-System Pumpe + Degasser 1100 series, Hewlett Packard, Böblingen,

Deutschland;

Säulenofen, Merck, Darmstadt, Deutschland;

Autosampler 200 series, Perkin Elmer, Rodgau, Deutschland

Heizschüttler Mixing Block MB-102, Biozym, Hess. Oldendorf, Deutschland

Horizontalschüttler Thys 2, MLW Labortechnik, Ilmenau, Deutschland

Kühlzentrifuge Fresco 21, Thermo Scientific, Osterode, Deutschland

7 Anhang

114

LaChrom Elite VWR Hitachi, Darmstadt, Deutschland

pH-Messgerät Hi 8818, Windaus, Clausthal-Zellerfeld, Deutschland

Probenkonzentrator Dri Bloc DB3, Techne, Burkhardtstorf, Deutschland

Spritzenpumpe Syringe Pump 11 Plus, Harvard Apparatus, Holiston, USA

Ultraturrax T25 basis, IKA-Labortechnik, Staufen, Deutschland

Vakuumzentrifuge ScanSpeed 32, Labogene, Lynge, Dänemark

Wasseraufbereitung SG Reinstwassersystem, Barsbüttel, Deutschland

Zentrifuge Megafuge 1.0R, Heraeus, Osterode, Deutschland

Software

Analyst 4.1 Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland

Excel 2007 & 2010 Microsoft, Redmont, USA

EZChrom Elite 3.2.1 Agilent, Böblingen, Deutschland

GraphPad Prism 5.01 Graph Pad Software, San Diego, USA

Origin 8.0 OriginLab, Northampton, USA

WinVal 0.86b Frank Siegmund, Greifswald/Berlin, Deutschland

Materialien

Trennsäulen XTerra MS C18 (100 x 2,1 mm; 3,5 µm), Waters, Milford, USA;

EcoCart® 125-3, LiChrospher® RP-18e (5µm) & LiChrospher®

60 RP-select B (5µm), Merck, Darmstadt, Deutschland

Vorfilter PEEK Mikrofilter (0,5 µm), Supelco, Deisenhofen, Deutschland

Chemikalien

ACN Rotisolv LC-MS Grade, Roth, Karlsruhe, Deutschland;

J.T. Baker HPLC Gradient Grade, Aventor Materials,

Deventer, Niederlande

Ameisensäure Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

Colchicin Fluka, Steinheim, Deutschland

Ciclosporin A Fluka, Steinheim, Deutschland

Demecolcin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

Dichlormethan p.a., Merck, Darmstadt, Deutschland

Diethylether p.a., Merck, Darmstadt, Deutschland

Essigsäureethylester Rotipuran p.a., Roth, Karlsruhe, Deutschland

7 Anhang

115

Glukuronidase β-Glukuronidase Typ HP-2 von Helix pomatia (145.700

Units/ml Glukuronidase-Aktivität, 887 Units/ml Sulfatase-

Aktivität), Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

7β-Hydroxyethyltheophyllin Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

MeOH Rotisolv LC-MS Grade, Roth, Karlsruhe, Deutschland;

J.T. Baker HPLC Gradient Grade, Aventor Materials,

Deventer, Niederlande

Natriumcarbonat Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumazid Merck, Darmstadt, Deutschland

Ammoniumacetat Merck, Darmstadt, Deutschland

Paracetamol Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

Pimecrolimus Roche, Mannheim, Deutschland

Propranolol MP Biomedicals, Eschwege, Deutschland

Talinolol AWD, Dresden, Deutschland

TEAP Fluka, Steinheim, Deutschland

tert-Butylmethylether LiChrosolv, Merck, Darmstadt, Deutschland

Wasser hausintern, einfach- und bidestilliert (s. Geräte)

Pipettierschemen

Tab. 7.4: Ansatz der Stamm- (SL) und Arbeitslösungen (AL) von Paracetamol, 7β-

Hydroxyethyltheophyllin und Propranolol.

Paracetamol

SL (1 mg/ml) 10 mg Paracetamol in 1 ml Methanol lösen, mit bidestilliertem Wasser

auf 10 ml auffüllen

AL1 (100 µg/ml) 1 Teil SL mit 9 Teilen bidestilliertem Wasser verdünnen

AL4 (0,1 µg/ml) 1 Teil AL3 mit 9 Teilen bidestilliertem Wasser verdünnen

7β-Hydroxyethyltheophyllin

SL (1 mg/ml) 10 mg 7β-Hydroxyethyltheophyllin in 1 ml Methanol lösen, mit

bidestilliertem Wasser auf 10 ml auffüllen

AL (10 µg/ml) 1 Teil SL mit 99 Teilen bidestilliertem Wasser verdünnen

Propranolol

SL (100 µg/ml) 1 mg Propranolol in 2,5 ml Methanol lösen, mit 0,01%iger

Natriumazidlösung auf 10 ml auffüllen

AL (5 µg/ml) 1 Teil SL mit 19 Teilen einer Mischung aus 50% Acetonitril und 50%

bidestilliertem Wasser verdünnen

7 Anhang

116

Tab. 7.5: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf das jeweilige

Matrixvolumen für die Bestimmung von Paracetamol.

c (ng/ml) Vollblut Urin Fäzes Organe

2,5 K1 12,5 µl AL4

5 K1 10 µl AL4 K2 2,5 µl AL3

7,5 Q1 3,75 µl AL3

10 K2 2 µl AL3 K1 2,5 µl AL3 K3 5 µl AL3

25 K3 5 µl AL3 K2 6,25 µl AL3 K4 12,5 µl AL3

30 Q1 6 µl AL3 Q1 7,5 µl AL3 Q2 15 µl AL3

50 K4 10 µl AL3 K1 5 µl AL3 K3 12,5 µl AL3 K5 2,5 µl AL2

100 K5 2 µl AL2 K2/Q1 10 µl AL3 K4 2,5 µl AL2 K6 5 µl AL2

150 Q2 3,75 µl AL2 Q3 7,5 µl AL2

250 K6 5 µl AL2 K3 2,5 µl AL2 K5 6,25 µl AL2 K7 12,5 µl AL2

500 K7 10 µl AL2 K4 5 µl AL3 K6 12,5 µl AL2

750 Q2 7,5 µl AL3 Q3 18,75 µl AL2

1000 K8/Q2 2 µl AL1 K5 10 µl AL2 K7 2,5 µl AL1

2000 K9 4 µl AL1

2500 K6 2,5 µl AL1

4000 K10 8 µl AL1 Q3 4 µl AL1

5000 K7 5 µl AL1

6000 Q3 12 µl AL1

7000 K11 14 µl AL1

Ki: Kalibrator; Qi: Qualitätskontrolle

Tab. 7.6: Ansatz der Stamm- (SL) und Arbeitslösungen (AL) von Talinolol und Propranolol.

Talinolol

SL (10 µg/ml) 2 mg Talinolol mit bidestilliertem Wasser auf 200 ml auffüllen

AL1 (1 µg/ml) 1 Teil SL mit 9 Teilen bidestilliertem Wasser verdünnen

AL2 (0,1 µg/ml) 1 Teil AL1 mit 9 Teilen bidestilliertem Wasser verdünnen

Propranolol

SL (8 µg/ml) 2 mg Propranolol mit bidestilliertem Wasser auf 250 ml auffüllen

7 Anhang

117

Tab. 7.7: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf 100 µl Matrix für die

Bestimmung von Talinolol.

c (ng/ml) Verdünnung mit H2O Dosierung Talinolol

K1 5 250 5 µl AL2

K2 20 250 20 µl AL2

K3 50 250 5 µl AL1

K4 100 250 10 µl AL1

K5 500 250 5 µl SL

K6 1000 250 10 µl SL

K7 2000 250 20 µl SL

K8 4000 210 40 µl SL

K9 8000 170 80 µl SL

Q1 15 250 15 µl AL2

Q2 3000 220 30 µl SL

Q3 7000 180 70 µl SL


Tab. 7.8: Ansatz der Stamm- (SL) und Arbeitslösungen (AL) von Colchicin und Demecolcin.

Colchicin

SL (100 µg/ml) 1 mg Colchicin mit Methanol auf 10 ml auffüllen

AL1 (10 µg/ml) 1 Teil SL mit 9 Teilen einer Mischung aus 50% Acetonitril und 50%


AL4 (10 ng/ml) 1 Teil AL3 mit 9 Teilen einer Mischung aus 50% Acetonitril und 50%


Demecolcin

SL (100 µg/ml) 1 mg Demecolcin mit Methanol auf 10 ml auffüllen

AL1 (500 ng/ml) 1 Teil SL mit 199 Teilen einer Mischung aus 50% Acetonitril und 50%


AL2 (50 ng/ml) 1 Teil AL1 mit 9 Teilen einer Mischung aus 50% Acetonitril und 50%


7 Anhang

118

Tab. 7.9: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf das jeweilige

Matrixvolumen für die Bestimmung von Colchicin.

c (ng/ml) Vollblut Urin Fäzes Organe

0,5 K1 5 µl AL4 K1 5 µl AL4

1 K2 10 µl AL4 K2 10 µl AL4

1,5 Q1 15 µl AL4 Q1 15 µl AL4

2,5 K3 2,5 µl AL 3 K3 2,5 µl AL3

5 K4 5 µl AL3 K4 5 µl AL3

10 K5 10 µl AL3 K1 10 µl AL3 K5 10 µl AL3

15 Q2 15 µl AL3

25 K6/Q2 2,5 µl AL2 K2 2,5 µl AL2 K6 2,5 µl AL2

30 Q1 3 µl AL2

50 K7 5 µl AL2 K3 5 µl AL2 K7 5 µl AL2

75 Q3 7,5 µl AL2

100 K8 10 µl AL2 K1 10 µl AL2 K4 10 µl AL2 K8 10 µl AL2

150 Q3 15 µl AL2

175 K9 1,75 µl AL1

200 Q2 2 µl AL1

250 K10 2,5 µl AL1 K2 2,5 µl AL1 K5 2,5 µl AL1

300 Q1 3 µl AL1

500 K3 5 µl AL1 K6 5 µl AL1

700 Q2 7 µl AL1

750 K4 7,5 µl AL1 Q3 7,5 µl AL1

1000 K5 10 µl AL1 K7 10 µl AL1

1300 Q3 13 µl AL1

1500 K6 15 µl AL1


7 Anhang

119

Tab. 7.10: Ansatz der Stamm- (SL) und Arbeitslösungen (AL) von Ciclosporin A und

Pimecrolimus.

Ciclosporin A

SL (100 µg/ml) 1 mg Ciclosporin A mit Methanol auf 10 ml auffüllen

AL1 (10 µg/ml) 1 Teil SL mit 9 Teilen einer Mischung aus 50% Methanol und 50%


AL4 (10 ng/ml) 1 Teil AL3 mit 9 Teilen einer Mischung aus 50% Methanol und 50%


Pimecrolimus

SL (20 µg/ml) 1 mg Pimecrolimus mit Methanol auf 50 ml auffüllen

AL (200 ng/ml) 1 Teil SL mit 99 Teilen Methanol verdünnen

Tab. 7.11: Dosierung der Kalibratoren und Qualitätskontrollen berechnet auf 100 µl Matrix für die

Bestimmung von Ciclosporin A.

c (ng/ml) Dosierung Ciclosporin A

K1 1 10 µl AL4

K2 / Q1 2,5 2,5 µl AL3

K3 5 5 µl AL3

K4 10 10 µl AL3

K5 / Q2 25 2,5 µl AL2

K6 50 5 µl AL2

K7 100 10 µl AL2

K8 / Q3 250 2,5 µl AL1

K9 / Q4 500 5 µl AL1


7 Anhang

120

7.2 ergänzende Ergebnisübersichten

7.2.1 Stabilitätsdaten

Paracetamol

Abb. 7.2: Stabilität der Stammlösungen von Paracetamol (blau) und 7β-Hydroxyehtyltheophyllin

(rot) bei -20 °C (n = 3; gestrichelte Linien: Initialwert (100%) und Stabilitätsgrenzen

(85% und 115%)).

Abb. 7.3: Stabilität der Stammlösungen von Paracetamol (blau) und 7β-Hydroxyehtyltheophyllin

(rot) über mehrere Gefrier-Tau-Zyklen (n = 3; gestrichelte Linien: Initialwert (100%)

und Stabilitätsgrenzen (85% und 115%)).

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Geh

alt

(%

)

Zeit (d)

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5

Geh

alt

(%

)

Zyklus

7 Anhang

121

Abb. 7.4: Stabilität der Arbeitslösungen von Paracetamol (blau) und 7β-Hydroxyehtyltheophyllin

(rot) im Kühlschrank (n = 3; gestrichelte Linien: Initialwert (100%) und

Stabilitätsgrenzen (85% und 115%)).

Colchicin

Abb. 7.5: Stabilität der Stammlösungen von Colchicin (blau) und Demecolcin (rot) bei -20 °C

(n = 6; gestrichelte Linien: Initialwert (100%) und Stabilitätsgrenzen (85% und 115%)).

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Geh

alt

(%

)

Zeit (d)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Geh

alt

(%

)

Zeit (d)

7 Anhang

122

Abb. 7.6: Stabilität der Arbeitslösungen von Colchicin (blau) und Demecolcin (rot) im

Kühlschrank (n = 3; gestrichelte Linien: Initialwert (100%) und Stabilitäts-grenzen

(85% und 115%)).

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7

Geh

alt

(%

)

Zeit (d)

7 Anhang

123

7.2.3 Transportversuche

Polyethylenglykol 400

Abb. 7.7: Hemmung der Transporter-vermittelten Aufnahme der Referenzsubstrate durch

Polyethylenglykol 400 (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts). (A)

OATP1A2, (B) OATP2B1, (C) OATP1B1, (D) OATP1B3, (E) NTCP; E3S, Estron-3-

sulfat; TA, Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid.

0

25

50

75

100

125

10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1

E3S

TA

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

150

10 -2 10 -1 10 0 10 1

E3S

BSP

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

150

175

10 -2 10 -1 10 0 10 1

E3S

BSP

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

10 -2 10 -1 10 0 10 1

E17ßG

BSP

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

10 -2 10 -1 10 0 10 1

TA

BSP

0


Au

fna

hm

e (

%)

A B

C

E

D

7 Anhang

124

Hydroxypropyl-β-cyclodextrin


Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts). (A)

OATP1A2, (B) OATP2B1, (C) OATP1B1, (D) OATP1B3, (E) NTCP; E3S, Estron-3-

sulfat; TA, Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid.

0

25

50

75

100

125

150

10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0

E3S

TA

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

150

10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1

E3S

BSP

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

150

10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1

E3S

BSP

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

150

10 -4 10 -2 10 0

BSP

0

E17ßG


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

150

175

10 -2 10 -1 10 0 10 1

BSP

TA

0


Au

fna

hm

e (

%)

A B

C

E

D

7 Anhang

125

Solutol HS15


Solutol HS15 (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts). (A) OATP1A2, (B)

OATP2B1, (C) OATP1B1, (D) OATP1B3, (E) NTCP; E3S, Estron-3-sulfat; TA,

Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid.

0

25

50

75

100

125

10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0

E3S

TA

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0

E3S

BSP

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1

E3S

BSP

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

10 -4 10 -3 10 -2 10 -1

E17ßG

BSP

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1

BSP

TA

0


Au

fna

hm

e (

%)

A B

C

E

D

7 Anhang

126

Cremophor EL


Cremophor EL (Mittelwert, Standardabweichung von 3 Tripletts). (A) OATP1A2, (B)

OATP2B1, (C) OATP1B1, (D) OATP1B3, (E) NTCP; E3S, Estron-3-sulfat; TA,

Taurocholat; BSP, Bromosulfophthalein; E17βG, Estradiol-17β-glukuronid.

0

25

50

75

100

125

10 -5 10 -4 10 -3 10 -2

E3S

TA

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

10 -4 10 -3 10 -2 10 -1

E3S

BSP

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

10 -2 10 -1 10 0 10 1

E3S

BSP

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

10 -4 10 -3 10 -2 10 -1

E17ßG

BSP

0


Au

fna

hm

e (

%)

0

25

50

75

100

125

10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1

BSP

TA

0


Au

fna

hm

e (

%)

A B

C

E

D

7 Anhang

127

7.2.4 Tierexperimentelle Untersuchungen

Paracetamol

Tab. 7.12: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Paracetamol unter

Einfluss von Lösungsvermittlern.


AUC0-24h (µg*h/ml) 1,14 1,42 1,45 1,54

(1,07; 1,43) (1,28; 1,59) (1,34; 1,78) (1,29; 2,26)

C0 (µg/ml) 6,9 6,3 6,1 6,0

(6,2; 8,9) (6,2; 7,0) (5,7; 7,4) (5,5; 6,4)

Vc (ml) 244 275 295 255

(198; 275) (250; 292) (235; 329) (250; 259)

Vss (l) 0,69 0,95 0,72 1,51*

(0,59; 0,92) (0,72; 1,8) (0,6; 0,88) (1,16; 6,31)

T1/2 (h) 0,8 1,5 1,3 5,3

(0,4; 2,0) (0,8; 3,0) (0,9; 3,3) (2,8; 13,8)

Cltot (ml/min) 25 21 20 17*

(19; 27) (18; 23) (17; 22) (12; 19)



Tab. 7.13: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol unter



AUC0-12h (µg*h/ml) 0,61 0,70 0,84* 0,77*

(0,57; 0,68) (0,62; 0,78) (0,73; 0,96) (0,75; 1,14)

C0 (µg/ml) 6,0 4,7 3,6* 6,4

(5,5; 6,8) (3,4; 6,3) (3,5; 4,0) (3,4; 7,3)

Cmin (ng/ml) 0,09 0,04 0,58 2,63

(0,00; 0,51) (0,01; 3,59) (0,09; 5,87) (0,21; 7,25)

Cav (ng/ml) 51 58 70* 64*

(47; 57) (52; 65) (61; 80) (63; 95)

Vc (ml) 138 192 238* 116

(131; 142) (147; 245) (206; 252) (113; 201)

Vss (l) 0,82 0,77 0,63 1,17

(0,73; 1,01) (0,63; 1,74) (0,55; 2,65) (0,62; 2,25)

7 Anhang

128

Tab. 7.13 Fortsetzung: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Paracetamol

unter Einfluss von Lösungsvermittlern.


T1/2 (h) 1,0 1,1 2,3 3,9

(0,6; 1,7) (0,8; 4,8) (1,0; 8,3) (1,5; 8,6)

Cltot (ml/min) 23 22 18 16*

(20; 24) (18; 24) (15; 19) (10; 18)

ClM (ml/min) 8,4 6,1 3,6* 6,7

(7,3; 9,1) (5,8; 7,1) (3,0; 6,2) (2,1; 8,8)

Ae U (% Dosis) 1,48 1,80* 3,07* 1,75

(1,28; 1,59) (1,74; 2,09) (2,54; 3,61) (1,64; 1,86)

ClR (ml/min) 0,33 0,47* 0,54* 0,27

(0,29; 0,34) (0,43; 0,52) (0,48; 0,57) (0,20; 0,29)

Ae U(M) (% Dosis) 37 27 24 41

(35; 39) (26; 30) (19; 35) (22; 49)

ClR(M) (ml/min) 8,4 6,0 3,6* 6,7

(7,3; 9,1) (5,8; 7,1) (2,9; 6,2) (2,1; 8,8)

Ae F (% Dosis) 0,10 0,14 0,07 0,22

(0,03; 0,19) (0,10; 0,18) (0,05; 0,10) (0,12; 0,27)

ClF (µl/min) 21 31 10 36

(7,2; 42) (26; 36) (9,5; 14) (22; 48)

Ae F(M) (% Dosis) 0,009 0,043 0,009 0,042

(0,002; 0,016) (0,035; 0,051) (0,007; 0,015) (0,019; 0,051)

ClF(M) (µl/min) 2,0 10,0 1,6 7,4

(0,4; 3,5) (8,7; 12,1) (1,0; 2,8) (3,6; 8,3)



7 Anhang

129

Talinolol

Tab. 7.14: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Talinolol unter Einfluss



AUC0-24h (µg*h/ml) 1,28 1,43 1,04 1,29

(1,18; 1,34) (1,35; 1,53) (0,98; 1,23) (1,27; 1,35)

C0 (µg/ml) 7,9 6,4 5,7 5,2

(7,2; 8,2) (6,2; 6,8) (4,9; 5,8) (4,5; 5,9)

Vc (ml) 233 242 325 344

(215; 239) (240; 270) (294; 348) (336; 355)

Vss (l) 1,01 2,26 2,58* 6,6*

(0,97; 1,07) (1,16; 8,03) (1,63; 3,93) (2,4; 46)

T1/2 (h) 1,3 5,9 6,0* 19,1*

(1,2; 1,5) (1,7; 16,8) (2,8; 8,4) (5,7; 91,8)

Cltot (ml/min) 22,0 20,3* 26,5 20,3

(21,7; 25,6) (18,2; 21,0) (25,3; 27,4) (19,7; 24,4)



Tab. 7.15: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol unter Einfluss



AUC0-12h (µg*h/ml) 0,60 0,68 0,57 0,57

(0,55; 0,62) (0,54; 0,74) (0,52; 0,61) (0,53; 0,58)

C0 (µg/ml) 3,3 3,4 3,5 2,5

(2,9; 4,5) (3,3; 4,1) (3,2; 4,1) (2,4; 2,6)

Cmin (ng/ml) 1,0 3,4 4,1 4,5

(0,5; 2,9) (2,7; 5,1) (3,9; 4,6) (3,8; 5,2)

Cav (ng/ml) 50 56 48 48

(46; 51) (45; 61) (43; 51) (44; 49)

Vc (ml) 277 226 231 347

(184; 299) (207; 276) (204; 288) (285; 380)

Vss (l) 1,6 2,8 3,2 5,3*

(1,5; 3,2) (2,0; 7,4) (2,5; 3,8) (3,8; 9,4)

T1/2 (h) 2,3 5,1 5,6 7,7

(1,7; 6,8) (4,1; 12,5) (4,6; 6,7) (6,7; 12,1)

7 Anhang

130

Tab. 7.15 Fortsetzung: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Talinolol



Cltot (ml/min) 24,5 21,8 25,6 23,3

(21,6; 27,6) (18,3; 24,8) (23,0; 26,4) (21,0; 29,5)

Ae U (% Dosis) 18,6 15,3 18,3 18,7

(17,4; 19,5) (12,7; 21,5) (16,6; 19,8) (15,4; 20,4)

ClR (ml/min) 4,8 3,1 4,8 4,9

(4,6; 5,0) (3,0; 3,5) (4,5; 5,2) (3,7; 5,5)

Ae F (% Dosis) 3,8 2,1 3,0 3,3

(3,3; 4,5) (1,8; 2,9) (2,7; 3,2) (1,7; 3,8)

ClF (ml/min) 1,10 0,44 0,72 0,72

(0,80; 1,16) (0,39; 0,44) (0,67; 0,94) (0,48; 1,12)

Hirn 0,65 0,35 0,40 0,38

(Ratio COrgan/Cav) (0,35; 0,98) (0,25; 0,43) (0,38; 0,42) (0,36; 0,44)

Herz 0,90 0,67 1,17 0,59

(Ratio COrgan/Cav) (0,84; 0,91) (0,39; 0,95) (1,02; 1,42) (0,56; 0,68)

Nieren 0,56 0,35 4,42* 0,27*

(Ratio COrgan/Cav) (0,50; 0,66) (0,30; 0,60) (3,44; 5,18) (0,24; 0,29)

Leber 0,20 0,14 0,32 0,19

(Ratio COrgan/Cav) (0,14; 0,27) (0,04; 0,24) (0,23; 0,38) (0,15; 0,22)

Testes 14,5 11,4 17,8 13,6

(Ratio COrgan/Cav) (13,8; 16,1) (11,1; 15,9) (15,9; 20,2) (13,2; 14,7)

Duodenum 0,23 0,27 0,99* 0,37

(Ratio COrgan/Cav) (0,21; 0,40) (0,16; 0,40) (0,87; 1,07) (0,33; 0,43)

Jejunum 1,74 1,75 1,31 2,11

(Ratio COrgan/Cav) (1,40; 1,90) (1,27; 1,89) (1,21; 1,42) (1,51; 2,6)

Ileum 0,66 1,06 0,57 2,49

(Ratio COrgan/Cav) (0,64; 0,70) (0,34; 1,36) (0,35; 0,77) (1,07; 2,67)

Colon 50 20* 46 51

(Ratio COrgan/Cav) (41; 60) (6,2; 28) (29; 55) (24; 63)



7 Anhang

131

Colchicin

Tab. 7.16: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Colchicin unter Einfluss



AUC0-24h (ng*h/ml) 66 31 62 83

(63; 75) (30; 47) (60; 81) (58; 94)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 83 118 115 120

(76; 136) (46; 203) (98; 1577) (91; 195)

C0 (ng/ml) 215 90 163 159

(175; 227) (68; 96) (147; 199) (105; 186)

Vc (ml) 158 392 212 224

(149; 226) (360; 551) (185; 219) (179; 331)

Vss (l) 8,2 15,7 9,0 8,9

(6,3; 9,6) (4,9; 28,5) (7,5; 12,3) (4,5; 13,0)

T1/2 (h) 20 39 35 25

(16; 36) (11; 100) (24; 491) (20; 34)

Cltot (ml/min) 9,2 18,8 9,4 6,8

(7,3; 10,6) (13,5; 19,8) (7,8; 9,8) (5,5; 10,0)



Tab. 7.17: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin unter Einfluss



AUC0-12h (ng*h/ml) 55 67 74* 94*

(55; 60) (43; 86) (67; 79) (83; 104)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 88 124 146* 203

(65; 104) (54; 205) (132; 226) (156; 388)

C0 (ng/ml) 91 75 79 81

(64; 112) (70; 88) (64; 87) (71; 99)

Cmin (ng/ml) 1,7 2,2 2,4* 3,0*

(1,4; 1,8) (0,9; 2,6) (2,0; 2,7) (2,6; 3,5)

Cav (ng/ml) 4,6 5,6 6,2* 7,8*

(4,5; 5,0) (3,6; 7,2) (5,6; 6,6) (6,9; 8,7)

Vc (ml) 203 239 217 210

(155; 279) (203; 249) (208; 277) (175; 224)

7 Anhang

132

Tab. 7.17 Fortsetzung: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Colchicin



Vss (l) 4,4 3,5 4,6 3,6

(3,2; 5,5) (3,0; 4,0) (4,0; 5,2) (3,5; 4,4)

T1/2 (h) 14 26 33 30

(10; 24) (7; 41) (26; 48) (25; 64)

Cltot (ml/min) 5,0 4,6 3,9* 3,0*

(4,7; 5,9) (3,5; 7,2) (3,7; 4,0) (2,6; 3,5)

Ae U (% Dosis) 14,8 14,4 24,1 21,7

(12,2; 19,9) (6,8; 16,7) (23,6; 25,7) (19,2; 23,4)

ClR (ml/min) 0,81 0,67 0,99 0,65

(0,61; 2,05) (0,34; 1,13) (0,86; 1,12) (0,56; 0,68)

Ae F (% Dosis) 15,0 19,5 4,4 7,5

(11,3; 26,6) (11,0; 34,4) (3,4; 9,8) (1,9; 26,8)

ClF (ml/min) 0,68 1,13 0,17 0,18

(0,55; 2,05) (0,39; 2,02) (0,13; 0,38) (0,06; 1,05)

Hirn 0,038 0,036 0,028 0,031

(Ratio cOrgan/Cav) (0,036; 0,055) (0,028; 0,057) (0,027; 0,035) (0,030; 0,034)

Herz 3,36 2,88 2,06 2,50

(Ratio cOrgan/Cav) (2,28; 4,53) (2,56; 5,37) (1,89; 2,21) (2,18; 3,93)

Nieren 3,35 4,92 2,63 3,06

(Ratio cOrgan/Cav) (2,64; 6,04) (4,34; 8,05) (2,32; 3,29) (2,54; 4,62)

Leber 2,19 3,48 2,03 3,14

(Ratio cOrgan/Cav) (1,83; 3,29) (2,90; 4,22) (1,86; 2,20) (1,67; 5,53)

Testes 1,79 1,91 1,21 1,48

(Ratio cOrgan/Cav) (1,04; 2,19) (1,39; 2,87) (1,07; 1,24) (1,32; 1,83)

Duodenum 3,88 4,89 2,83* 3,28

(Ratio cOrgan/Cav) (3,3; 4,79) (3,22; 7,55) (2,71; 2,98) (2,95; 4,85)

Jejunum 6,1 12,1 5,6 7,2

(Ratio cOrgan/Cav) (4,5; 8,5) (6,5; 22,4) (5,1; 6,2) (5,3; 11,1)

Ileum 10,3 14,6 9,0 8,3

(Ratio cOrgan/Cav) (7,4; 12,4) (8,3; 28,8) (7,5; 10,2) (7,1; 12,6)

Colon 9,9 34,9 2,9 4,2

(Ratio cOrgan/Cav) (4,6; 23,8) (11,2; 82) (1,8; 3,3) (2,6; 29,6)



7 Anhang

133

Ciclosporin A

Tab. 7.18: Pharmakokinetische Parameter der single dose Kinetik von Ciclosporin A unter



AUC0-24h (ng*h/ml) 71 214* 309* 422*

(61; 73) (190; 243) (263; 343) (277; 562)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 89 232* 344* 452*

(77; 97) (225; 304) (285; 435) (298; 595)

C0 (ng/ml) 102 224* 494* 411*

(94; 132) (151; 261) (418; 556) (255; 615)

Vc (ml) 326 161* 76* 90*

(283; 356) (137; 249) (59; 86) (54; 136)

Vss (l) 4,1 1,69* 0,94* 0,68*

(3,5; 8,8) (1,46; 2,09) (0,91; 1,39) (0,39; 0,95)

T1/2 (h) 11,5 11,5 7,8 5,9

(6,0; 21,3) (7,7; 15,4) (7,1; 9,2) (5,2; 7,7)

Cltot (ml/min) 8,7 2,8* 1,8* 1,4*

(7,8; 9,9) (2,4; 3,1) (1,8; 2,3) (1,0; 2,1)



Tab. 7.19: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin A unter



AUC0-12h (ng*h/ml) 187 491* 229 538*

(161; 227) (432; 560) (224; 390) (346; 678)

AUC0-∞ (ng*h/ml) 353 950 244 703

(219; 433) (700; 984) (229; 407) (373; 2676)

C0 (ng/ml) 208 341 361 326

(151; 231) (252; 387) (296; 411) (226; 401)

Cmin (ng/ml) 6,3 14,9* 5,7 17,8*

(4,1; 6,9) (13,0; 17,4) (4,7; 10,1) (8,9; 21,1)

Cav (ng/ml) 15,6 41* 19,1 45*

(13,4; 18,9) (36; 47) (18,6; 33) (29; 57)

Vc (ml) 85 53 52 55

(70; 124) (45; 73) (42; 59) (42; 78)

7 Anhang

134

Tab. 7.19 Fortsetzung: Pharmakokinetische Parameter der multiple dose Kinetik von Ciclosporin

A unter Einfluss von Lösungsvermittlern.


Vss (l) 0,95 0,54 0,44 0,37

(0,69; 1,94) (0,32; 0,75) (0,3; 0,54) (0,33; 0,72)

T1/2 (h) 11,6 17,8 5,8 8,3

(6,6; 43) (7,8; 33) (5,4; 6,5) (6,8; 47)

Cltot (ml/min) 1,5 0,6* 1,3 0,5*

(1,3; 1,7) (0,5; 0,7) (0,7; 1,4) (0,4; 0,9)

Ae U (% Dosis) 0,45 0,35 0,54 0,88

(0,37; 0,59) (0,24; 0,39) (0,18; 0,56) (0,53; 0,97)

ClR (µl/min) 6,5 2,2* 3,3 4,0

(4,5; 10,0) (1,9; 2,4) (2,5; 4,0) (3,6; 5,0)

Ae F (% Dosis) 3,9 9,4 8,1 6,5

(1,6; 7,5) (8; 12,7) (7,3; 8,6) (5,2; 7,0)

ClF (µl/min) 55 60 91 33

(30; 84) (55; 70) (68; 110) (22; 59)

Hirn 0,168 0,078 0,110 0,091

(Ratio cOrgan/Cav) (0,122; 0,182) (0,070; 0,088) (0,105; 0,112) (0,078; 0,103)

Herz 1,16 0,91 0,98 0,81

(Ratio cOrgan/Cav) (0,98; 1,85) (0,82; 1,06) (0,55; 1,05) (0,54; 0,98)

Nieren 4,9 3,9 9,7 4,9

(Ratio cOrgan/Cav) (4,0; 9,9) (3,8; 4,2) (5,0; 16,9) (3,9; 6,5)

Leber 19,0 13,8 11,2 9,2

(Ratio cOrgan/Cav) (9,2; 26,2) (10,2; 17,3) (8,5; 13,4) (7,2; 9,9)

Testes 1,3 1,1 2,9* 2,0

(Ratio cOrgan/Cav) (1,2; 1,4) (0,9; 1,2) (2,5; 4,9) (1,4; 3,9)

Duodenum 2,0 1,3 1,8 1,5

(Ratio cOrgan/Cav) (1,2; 2,4) (1,1; 1,4) (1,5; 2,0) (1,1; 2,1)

Jejunum 2,8 1,5 1,4 1,2

(Ratio cOrgan/Cav) (1,6; 3,4) (1,2; 1,6) (1,1; 1,8) (1,0; 1,5)

Ileum 2,1 2,2 1,8 1,6

(Ratio cOrgan/Cav) (1,8; 5,1) (1,7; 2,2) (1,7; 2,3) (1,6; 2,2)

Colon 5,8 3,8* 4,0 4,5

(Ratio cOrgan/Cav) (4,9; 7,0) (3,0; 5,1) (3,4; 4,3) (3,7; 5,4)



A

Eigenständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-

Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch an

einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht

wurde.

Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die

darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten

ohne Kennzeichnung übernommen habe.

Greifswald, den 21.02.2013

(A. Engel)

B

Lebenslauf

Anett Engel

geboren am 27.04.1983 in Rostock

1989 – 1993 Grundschule 4 Dierkow, Rostock

1993 – 1997 Albert-Schweitzer-Gymnasium, Rostock

1997 – 2002 Ernst-Barlach-Gymnasium, Rostock - Abitur

10/2002 – 09/2006 Studium der Pharmazie, Universität Greifswald

11/2006 – 06/2007 Diplomarbeit am Institut für Pharmakologie der Universität

Greifswald bei Prof. Siegmund (Entwicklung und Validierung einer

LC-MS/MS-Methode zur quantitativen Bestimmung von Tacrolimus

und Sirolimus in menschlichen Körperflüssigkeiten)

07/2007 – 12/2007 Pharmaziepraktikum in der Südstadt-Center-Apotheke, Rostock

28.01.2008 Erlangung des Titels Diplom-Pharmazeutin

06.05.2008 Approbation als Apothekerin

04/2008 – 06/2012 wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Pharmakologie der

Universität Greifswald

seit 04/2008 Anfertigung der vorliegenden Dissertation am Institut für

Pharmakologie der Universität Greifswald bei Prof. Siegmund

seit 10/2008 Weiterbildung zur Fachapothekerin für Pharmazeutische Analytik

seit 07/2012 wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Klinik für Anästhesiologie und

Intensivmedizin in Kooperation mit dem Institut für Pharmakologie,

Universität Greifswald

Greifswald, den 21.02.2013 (A. Engel)

C

Publikationen:

Engel, A.; Oswald, S.; Siegmund, W.; Keiser, M.: Pharmaceutical excipients influence the function of human uptake transporting proteins. Mol.Pharm., 2012, 9 (9), 2577-2581.

Oswald, S.; Nassif, A.; Modess, C.; Keiser, M.; Ulrich, A.; Runge, D.; Hanke, U.; Lutjohann, D.; Engel, A.; Weitschies, W.; Siegmund, W.: Drug interactions between the immunosuppressant tacrolimus and the cholesterol absorption inhibitor ezetimibe in healthy volunteers. Clin.Pharmacol.Ther., 2011, 89 (4), 524-528.

Oswald, S.; Nassif, A.; Modess, C.; Keiser, M.; Hanke, U.; Engel, A.; Lutjohann, D.; Weitschies, W.; Siegmund, W.: Pharmacokinetic and pharmacodynamic interactions between the immunosuppressant sirolimus and the lipid-lowering drug ezetimibe in healthy volunteers. Clin.Pharmacol.Ther., 2010, 87 (6), 663-667.

Kongressbeiträge:

Engel, A.; Keiser, M.; Oswald, S.; Scheuch, E.; Berg, S.; Freyse, E. J.; Weitschies, W.; Siegmund, W.: Solubilizing agents influence the pharmakkokinetics of probe drugs by transporter interaction. Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft, Greifswald, 2012 (Vortrag).

Engel, A.; Oswald, S.; Scheuch, E.; Berg, S.; Freyse, E. J.; Siegmund, W.: Solubilizing agents influence the pharmacokinetics of probe drugs. Controlled Release Society German Chapter Annual Meeting, Würzburg, 2012 (Vortrag).

Engel, A.; Oswald, S.; Scheuch, E.; Siegmund, W.: Influence of solubilizing agents on the function of human organic anion uptake transport proteins. Jahreskongress für Klinische Pharmakologie, Zürich, 2011 (Poster mit Auszeichnung).

Engel, A.; Keiser, M.; Oswald, S.; Berg, S.; Freyse, E. J.; Weitschies, W.; Siegmund, W.: Influence of solubilizing agents on the function of uptake transport proteins in vitro and in vivo. Doktorandentagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft, Heringsdorf, 2011 (Poster).

Engel, A.; Keiser, M.; Oswald, S.; Siegmund, W.: Influence of solubilizing agents on the function of human organic anion uptake transport proteins. Controlled Release Society German Chapter Annual Meeting, Jena, 2011 (Vortrag).

D

Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde in der Abteilung für Klinische Pharmakologie am Institut für

Pharmakologie der Universität Greifswald unter der Leitung von Prof. Dr. Werner

Siegmund angefertigt. An dieser Stelle möchte ich mich bei ihm ganz herzlich für die

Überlassung des interessanten und bedeutenden Themas, die Bereitstellung exzellenter

technischer Voraussetzungen und die fortlaufende Unterstützung bedanken.

Ich bedanke mich bei Dr. Ernst-Joachim Freyse, Sabine Berg und allen anderen

Mitarbeitern des Instituts für Diabetes „Gerhardt Katsch“ in Karlsburg für die warmherzige

Aufnahme ins Team, die Einführung in den Umgang mit Versuchstieren und insbesondere

die kompetente Unterstützung in der Durchführung des komplexen Tierversuchs.

Bei Dr. Markus Keiser, Jia Jia und Marten Möller bedanke ich mich für die intensive

Einführung in die Zellkultur und umfangreiche Unterstützung in der Durchführung der

Zellversuche. Dr. Markus Keiser danke ich außerdem für das Korrekturlesen der

Publikation und der vorliegenden Arbeit.

Mein besonderer Dank gilt Dr. Stefan Oswald, der mich bereits im Rahmen der

Diplomarbeit in die Geheimnisse der LC-MS/MS-Analytik eingeweiht hat, für die

jahrelange gute Betreuung, das Korrekturlesen der Publikation und der vorliegenden

Arbeit und dass er bei Problem immer ein offenes Ohr für mich hatte. Stefan, ich habe

dich immer bewundert und ich werde auch weiterhin zu dir aufschauen. Du bist nach wie

vor ein berufliches Vorbild für mich.

Für die tatkräftige Unterstützung in der Analytik danke ich natürlich auch dem restlichen

GLP-Team, namentlich Dr. Eberhard Scheuch, Sabine Bade, Gitta Schuhmacher und

Anja Moll.

Bei Danilo Wegner bedanke ich mich für die Unterstützung bei diversen Berechnungen

v.a. im Zusammenhang mit der Pharmakokinetik, den wiederholten Erklärungen zur

Signifikanzberechnung, die nahezu philosophischen Diskussionen über nicht nur

mathematische Probleme und die Freundschaft.

Prof. Weitschies und Dr. Ulrike Hanke aus der pharmazeutischen Technologie danke ich

für den Kontakt zur Bayer Healthcare AG Berlin (ehemals Schering), die den Tierversuch

initiiert und mitfinanziert hat. Dr. Ulrike Hanke danke ich außerdem für die

Wiedereinführung in die Herstellung von Injectabilia und die Bereitstellung von

Substanzen und Sterilfiltern für den Tierversuch.

Beatrice Semmling aus der pharmazeutischen Technologie danke ich für die

Unterstützung bei der Messung der CMC.

E

Ebenso möchte ich mich bei Dr. Jette Penski für das Korrekturlesen der Publikation und

der vorliegenden Arbeit sowie die guten Ratschläge bei Problemen aller Art bedanken.

Dr. Markus Grube aus der Abteilung für Allgemeine Pharmakologie danke ich für die

hilfreichen Hinweise in der Planung der Zellversuche.

Darüber hinaus danke ich auch allen anderen Mitarbeitern der Klinischen und

Allgemeinen Pharmakologie sowie den ehemaligen InnoProfile-Mitgliedern für die

langjährige gute Zusammenarbeit.

Ebenso danke ich meiner Familie und meinem Freund für die immer währende

Unterstützung, Zuwendung und Aufmunterung v.a. während der Phasen großer

Frustration. Ich bedauere sehr, dass meine Großeltern den Abschluss dieser Arbeit nicht

mehr erleben konnten.

Zu guter Letzt möchte ich auch allen meinen Freunden für den sozialen Halt außerhalb

von Familie und Arbeit und die kurzweiligen Stunden danken, in denen ich mir mal nicht

den Kopf über Probleme im Labor zerbrochen habe. Solche kleinen Auszeiten waren

notwendig, um den Kopf für neue Lösungsansätze und neue Blickwinkel wieder frei zu

bekommen.

Vielen lieben Dank an alle! Ohne die Unterstützung wäre ich heute nicht da, wo ich jetzt

bin!

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