Etablierung eines MYCN vermittelten · PDF filefür ca. die Inz mittlere primitiv Nebenn...

EtablierungeinesMYCN‐vermittelten

murinenNeuroblastommodellsundAnalyse

tumorsuppressivermikroRNAs

Inaugural‐Dissertation

zurErlangungdesDoktorgrades

Dr.rer.nat.

derFakultätfürBiologie

ander

UniversitätDuisburg‐Essen

vorgelegtvon

KristinaAlthoff

ausHerne

August2013

Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden im

hämatologisch‐onkologischenLaborderKinderklinikIIIamUniversitätsklinikumEssen

durchgeführt.

1.Gutachter: Prof.Dr.JohannesSchulte

2.Gutachter: Prof.Dr.BertramOpalka

VorsitzenderdesPrüfungsausschusses: Prof.Dr.PeterBayer

TagdermündlichenPrüfung: 12.Dezember2013

Inha1 EI

1.1

1.2

1.3

1.3

1.3

1.4

1.4

1.4

2 ZI

3 M

3.1

3.

3.

3.

3.2

3.2

3.2

3.2

3.2

3.2

3.2

3.2

3.2

3.2

3.2

3.2

3.3

3.3

3.3

3.3

3.3

3.3

3.4

3.4

3.4

3.4

altsverzINLEITUNG

DasNeur

Molekula

DieMaus

3.1 Modelle

3.2 Konditi

MikroRN

4.1 DieBio

4.2 DieRol

Tumore

IELDERAR

MATERIAL

Tierexpe

1.1 Generie

1.2 Zuchtv

1.3 Xenogr

Molekula

2.1 Polyme

2.2 Agaros

2.3 Klonier

2.4 Bestimm

2.5 Isolieru

2.6 mRNA‐

2.7 Reverse

2.8 Quantit

2.9 Array‐b

2.10 mRN

2.11 miRN

Biochem

3.1 Herstel

3.2 Natrium

3.3 Wester

3.4 Proteom

3.5 Herstel

Histolog

4.1 Histolo

4.2 Elektro

4.3 Immun

zeichniG.................

roblastom.

areMarker

salsNeuro

emitneuralle

ionaleModel

NAs...............

geneseundF

levonmiRNA

entitäten........

RBEIT.......

UNDMETH

erimentelle

erungderLSL

vonLSL‐MYCN

raftsundNan

arbiologisc

erase‐Kettenr

e‐Gelelektrop

rungderKon

mungderKo

unggenomisc

‐undmiRNA‐

eTranskripti

tativePCR......

basiertecomp

NAqPCRprof

NAqPCRpro

mischeMeth

llungvonPro

mdodecylsulf

rnBlotundim

manalyse.......

llungvonCalc

ischeMeth

gischeundim

onenmikrosko

nfluoreszenzfä

s....................

......................

rundRisiko

blastom‐M

eisten‐spezif

le.......................

......................

Funktionvon

AsbeiderPa

...........................

....................

HODEN......

eMethoden

L‐MYCNMau

N;Dbh‐iCreM

opartikel‐Beh

cheMethod

reaktion.........

phorese..........

struktepDES

nzentrationv

cherDNA.......

‐Isolierung....

ionvonkomp

...........................

parativegeno

filing................

filing...............

hoden..........

oteinlysatenu

fat‐Polyacryla

mmunologisch

...........................

cium‐Phosph

oden...........

mmunhistoch

opischeUnte

ärbungenvon

....................

......................

ostratifikat

Modellorgan

fischer,stabil

...........................

......................

nmiRNAs........

athogenesede

...........................

....................

....................

n....................

s........................

MäusenundD

handlung......

den...............

...........................

...........................

ST30‐KDM1A

vonDNAund

...........................

...........................

plementärer

...........................

omischeHybr

...........................

...........................

......................

undBestimm

amidgelelekt

herNachwei

...........................

hat‐Nanopart

......................

hemischeFär

ersuchungenv

nProteineni

....................

......................

tion..............

nismus.........

erÜberexpre

...........................

......................

...........................

esNeuroblast

...........................

....................

....................

......................

...........................

Detektionvon

...........................

......................

...........................

...........................

undpDEST3

dRNA...............

...........................

...........................

DNAausisoli

...........................

ridisierung....

...........................

...........................

......................

mungihrerKo

trophorese.....

svonProtein

...........................

tikeln................

......................

rbungenvonG

vonGewebes

inhumanenZ

....................

......................

......................

......................

essioneinesO

...........................

......................

...........................

tomsundand

...........................

....................

....................

......................

...........................

Tumoren.....

...........................

......................

...........................

...........................

30‐Survivin....

...........................

...........................

...........................

iertermRNA

...........................

...........................

...........................

...........................

......................

nzentration..

...........................

nen....................

...........................

...........................

......................

Gewebeschni

schnitten........

Zelllinien........

Inhaltsverz

....................

......................

......................

......................

Onkogens......

...........................

......................

...........................

deren

...........................

....................

....................

......................

...........................

...........................

...........................

......................

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

undmiRNA.

...........................

...........................

...........................

...........................

......................

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

......................

itten................

...........................

...........................

zeichnis

I

............1

.............1

.............2

.............4

.................4

.................5

.............7

.................7

.................8

.........12

.........13

..........13

..............13

..............16

..............18

..........18

..............18

..............20

..............21

..............21

..............22

..............22

..............22

..............22

..............24

..............24

..............25

..........26

..............26

..............26

..............27

..............29

..............29

..........30

..............30

..............30

..............31

3.5

3.

3.

3.

3.

3.

3.

3.

3.

3.

3.6

3.6

3.6

3.6

4 ER

4.1

4.

4.

4.

4.

4.

4.

4.

4.

4.

4.

4.

4.2

4.2

4.2

4.2

4.2

4.2

4.2

4.2

Zellbiolo

5.1 Kultivie

5.2 Transie

5.3 Generie

5.4 Mikrosk

5.5 Zellviab

5.6 Apopto

5.7 Prolifer

5.8 Zellzyk

5.9 Luzifer

GensetE

6.1 Genset

6.2 Statisti

6.3 Bildbea

RGEBNISS

DasLSL‐

1.1 Generie

1.2 LSL‐MY

1.3 Genoty

1.4 Embryo

1.5 Tumori

1.6 Tumorh

1.7 Verglei

TH‐MYC

1.8 Genom

1.9 mRNA

1.10 miRN

1.11 miR‐

Dietumo

undZelll

2.1 Express

2.2 Funktio

2.3 Regulat

2.4 Direkte

2.5 Funktio

2.6 Partiell

Hochre

2.7 MiR‐54

undinv

ogischeMet

erungvonZe

enteTransfek

erungvonsta

kopischeAuf

bilitäts‐Assay

ose‐Assay........

rations‐Assay

klusanalyse....

aseReporter

Enrichment

EnrichmentA

scheAnalyse

arbeitung.......

E.................

MYCN;Dbh‐

erungdertra

YCNBeobacht

ypisierungen..

otoxizitätdes

inzidenzund

histologieun

chderTumo

CNMausmod

ischeAberra

Profiling.........

NAProfiling.

‐542alspote

orsuppress

linien..........

sionsanalyse

onvonmiR‐5

tionderExpr

eBindungvon

onvonSurviv

leWiederher

egulationvon

42‐3pbeladen

vivo...................

thoden........

llen..................

ktionenvonm

abilenZellklo

fnahmenvon

y.........................

...........................

y.........................

...........................

rAssay............

Analyse,st

Analyse..........

en.......................

...........................

....................

‐iCreMausm

ansgenenMau

tungskohorte

...........................

sGenotypsLS

‐lokalisation

dExpression

rinzidenzdes

dells..................

tionenvonLS

...........................

...........................

entielltumorm

siveFunktio

......................

vonmiR‐542

542‐3pExpre

ressionvonS

nmiR‐542‐3p

vinHerunterr

stellungdesP

Survivinohn

neNanoparti

...........................

......................

...........................

miRNAundsi

onenundIndu

Zellen............

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

tatistischeM

...........................

...........................

...........................

....................

modell........

uslinieLSL‐M

e........................

...........................

SL‐MYCN;Dbh

n.........................

nspezifischer

sLSL‐MYCN;D

...........................

SL‐MYCN;Dbh

...........................

...........................

modulierende

onvonmiR

......................

2undSurvivi

essioninZelll

urvivindurch

panSurvivin

regulationin

Phänotypsde

nemiRNA‐Bin

kelzurmiRN

...........................

......................

...........................

iRNA................

uktionvonko

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

Methodenu

...........................

...........................

...........................

....................

......................

MYCN.................

...........................

...........................

h‐iCre...............

...........................

rNeuroblasto

Dbh‐iCreMau

...........................

h‐iCreTumor

...........................

...........................

emiRNAimN

R‐542inhum

......................

ininhumane

inien................

hmiR‐542‐3p

n3‘UTR............

Zelllinien......

ermiR‐542‐3

ndestelle........

NA‐Behandlun

...........................

......................

...........................

...........................

onditionalen

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

undBildbea

...........................

...........................

...........................

....................

......................

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

ommarker.....

usmodellsmi

...........................

ren....................

...........................

...........................

Neuroblastom

manenNeu

......................

nPrimärtum

...........................

p........................

...........................

...........................

3pExpression

...........................

ngvonNeuro

...........................

Inhaltsverz

......................

...........................

...........................

Konstrukten

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

arbeitung.

...........................

...........................

...........................

....................

......................

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

itderdeseta

...........................

...........................

...........................

...........................

m.......................

uroblastom

......................

moren...............

...........................

...........................

...........................

...........................

nmittels

...........................

oblastomzelle

...........................

zeichnis

II

..........31

..............31

..............32

n.............33

..............34

..............34

..............35

..............35

..............36

..............36

..........37

..............37

..............38

..............38

.........39

..........39

..............39

..............39

..............40

..............40

..............41

..............47

blierten

..............48

..............49

..............51

..............54

..............57

men

..........58

..............58

..............62

..............66

..............67

..............68

..............71

eninvitro

..............72

4.3

4.3

4.3

4.3

4.3

4.3

4.3

Ho

4.3

5 D

5.1

5.

5.

5.

5.

5.

5.2

5.2

5.2

6 ZU

7 A

8 LI

9 A

10 A

10.1

10.2

11 A

11.1

11.2

11

11

11.3

11.4

Dietumo

undZelll

3.1 KDM1A

3.2 Express

3.3 Funktio

3.4 Validier

3.5 Funktio

3.6 Partiell

ochregulation

3.7 Identifi

ISKUSSION

DasLSL‐

1.1 Tumore

beschre

1.2 Gegenü

TH‐MYC

1.3 Identifi

Mausm

1.4 Möglich

dieFor

1.5 DieRel

Tumorsu

2.1 Dietum

2.2 Dietum

USAMMEN

BSTRACT.

ITERATUR

BKÜRZUN

BBILDUNG

Abbildun

Tabellen

NHANG.....

Danksag

Publikat

1.2.1 Publ

1.2.2 Kong

Lebensla

Erklärun

orsuppress

linien..........

Aalspotentie

sionsanalyse

onvonmiR‐1

rungvonKDM

onvonKDM1

leWiederher

nvonKDM1A

izierungund

N.................

MYCN;Dbh‐

edesLSL‐MY

eiben................

überstellungd

CN.....................

ikationenure

modells..............

heWeiterentw

shcungamhu

evanzdesLS

uppressive

morsuppressi

morsuppressi

NFASSUNG

....................

R..................

NGEN..........

GS‐UNDTA

ngsverzeich

nverzeichni

....................

gung..............

tionenund

likationen......

gressbeiträge

auf................

ngen.............

siveFunktio

......................

ellesZieleine

vonmiR‐137

137inZelllini

M1Aalsdirek

1AHerunterr

stellungdesP

AohnemiRNA

Validierungv

....................

‐iCreMausm

YCN;Dbh‐iCre

...........................

derbeidenNe

...........................

erZieleeiner

...........................

wicklungend

umanenNeu

L‐MYCNMau

miRNAsim

veFunktionv

veFunktionv

UNDAUSB

....................

....................

....................

ABELLENV

hnis.............

is...................

....................

......................

Kongressb

...........................

e.........................

......................

......................

onvonmiR

......................

rNeuroblast

7inhumanen

ien....................

ktesZielvon

egulationinZ

Phänotypsde

A‐Bindestelle

vonAKAP2a

....................

modell........

Mausmodell

...........................

euroblastom

...........................

Neuroblasto

...........................

desLSL‐MYCN

roblastomge

usmodellsfür

mNeurobla

vonmiR‐542

vonmiR‐137

BLICK........

....................

....................

....................

VERZEICHN

......................

......................

....................

......................

eiträge......

...........................

...........................

......................

......................

R‐137inhum

......................

tomtherapie..

nPrimärtumo

...........................

miR‐137inZ

Zelllinien.......

ermiR‐542‐3

e.........................

alsweiteresZ

....................

......................

lslassensich

...........................

‐Mausmodell

...........................

mtherapiean

...........................

N;Dbh‐iCreM

ebenkönnten

rdieGenesea

stom............

2imNeurobla

7imhumanen

....................

....................

....................

....................

NIS..............

......................

......................

....................

......................

......................

...........................

...........................

......................

......................

manenNeu

......................

...........................

oren.................

...........................

Zelllinien........

...........................

3pExpression

...........................

ielvonmiR‐1

....................

......................

alsmurineN

...........................

leLSL‐MYCN

...........................

nhanddesLS

...........................

Modells,diene

n.........................

andererTum

......................

astom..............

nNeuroblasto

....................

....................

....................

....................

....................

......................

......................

....................

......................

......................

...........................

...........................

......................

......................

Inhaltsverz

uroblastom

......................

...........................

...........................

...........................

...........................

...........................

nmittels

...........................

137...................

....................

......................

Neuroblastom

...........................

N;Dbh‐iCreun

...........................

SL‐MYCN;Dbh

...........................

eueErkenntn

...........................

orentitäten..

......................

...........................

om…................

....................

....................

....................

....................

....................

......................

......................

....................

......................

......................

...........................

...........................

......................

......................

zeichnis

III

men

..........77

..............77

..............79

..............80

..............83

..............85

..............87

..............88

.........91

..........91

ma

..............91

nd

..............93

h‐iCre

..............96

nissefür

...........103

...........105

........106

...........107

...........111

.......114

....1146

.......117

.......131

.......133

........133

........136

.......137

........137

........138

...........138

...........139

........141

........142

1 Ei

D1.1

DasNe

für ca.

die Inz

mittlere

primitiv

Nebenn

demRh

klein‐,

bösarti

Therap

(Stadie

zum To

entwick

(INSS).

Stadium

Überleb

können

Notwen

inleitun

DasNeur

uroblastom

15% aller

zidenz 1,3

eAlterbei

venNeural

nierenmark

habdomyos

blau‐, rund

genTumor

pie komplet

n 3 und 4

od des Pa

kelten5 un

Diemittler

m assoziie

bensrate v

n nur 25‐3

ndigkeitfür

ng

roblasto

mistderh

pädiatrisc

Neuerkran

Diagnoseb

lleistenzell

klokalisier

sarkom,de

dzelligen T

r,dersichb

tt zurückb

4) trotz An

atienten fü

d 1993 m

re5‐Jahres

rt ist7,8 (T

von nur 8

35% der

rneuezielg

om

häufigsteso

ch‐onkologi

nkungen a

bei17,4Mo

len,dieent

rtsind3.His

emNon‐Ho

Tumoren g

beigünstig

ildet oder

wendung m

ührt4. Die

modifizierte

s‐Überleben

Tab.1). Na

8‐31% pos

Patienten

gerichteteN

olideTumo

ischen Tod

auf 100.000

onatenlieg

tlangdess

stologisch

odgkinLym

gezählt1. Es

gerBiologie

differenzie

modernste

Einteilung

en6 Interna

nsratebetr

ach einem

stuliert9‐11

mit hohem

Neuroblast

ordesKind

desfälle. Di

0 Kinder u

t1,2.Neurob

sympathisc

wirddasN

mphomund

s handelt

e(Stadien1

ert, währe

er, multimo

der Stadi

ational Neu

rägtca.59%

Rückfall

und aktu

m Stadium

tomtherapi

desaltersu

e Prävalen

unter 15 J

blastomeen

henGrenzs

Neuroblasto

ddemEwin

sich um ei

1,2und4s)

nd eine un

odaler The

ien erfolgt

uroblastom

%,wobeidi

wird jedo

uelle Beha

m heilen4.

iensehrgro

Ein

undverantw

nz beträgt

Jahren, wo

ntwickeln

strangesso

omzusamm

ngSarkom

inen heter

)häufigau

ngünstige B

erapie nich

t nach dem

ma Staging

iesestarkm

ch eine 5

ndlungspro

Demnach

oß.

nleitung

1

wortlich

1:7.000,

obei das

sichaus

owie im

menmit

mzuden

rogenen,

chohne

Biologie

ht selten

m 1988

System

mitdem

‐Jahres‐

otokolle

ist die

Tab.1:I

Stadiu

1

2a

2b

3

4

4s

M1.2

Neben

und La

prädikt

EineAm

neurobl

Neurob

Tumorw

nurins

dass da

mRNA

beiden

Express

undPro

Die Ex

Tumors

Express

Dieme

Mutatio

Internation

m Defini

lokalisvollstälokalisunvolllokalisvollstäTumorkontrainoperTumorKnochOrganelokalisHaut,Lbeschr

Molekula

demPatien

ktatdehydr

tivfürdenV

mplifikatio

lastoma d

blastome

wachstum

seltenenFä

as erhöhte

Leveleinh

Co‐Faktor

sionvonGe

oliferation

xpression

stadium u

siondesNe

istenfamil

onenderA

nalNeurobl

ition

sierterTumändigeResesierterTumständigeRsierterTumändigeoderrinfiltrationalateralenLrabelr mit Dishen, Knochensierter PrimLeberund/ränktaufK

areMar

ntenalterb

rogenase‐S

Verlaufder

ndesOnko

derived), l

detektierb

undschlec

ällenMutat

Maß an tr

ergeht,zur

ren MAD

enen,dies

eineRolle

des Neu

nd günstig

eurotrophi

liärenund

Anaplastisc

lastomaSta

mor,keinBeektionmor,keinBeesektionmor,Befalldrunvollstänn über dLymphknot

sseminationhenmark,

märtumor/oderKnocKinder<1Ja

rkerund

beiDiagnos

Spiegeln12,1

rErkranku

ogensMYC

lokalisiert

bar und

chterProgn

ioneninM

ranskriptio

rTumorfor

und MAX

owohlbei

spielen17.

urotrophin

ger Progno

nrezeptors

10%ders

henLymph

agingSyste

efallderLy

efallderLy

deripsilatendigeResedie Mitteten,

nen zu eLeber, H

mit Dissechenmark,ahr

dRisiko

se,demTu

3 gibt es g

ungsind.

CN (v‐mycm

auf Chro

mit for

noseassoz

MYCNkodier

onell aktive

rmationfüh

X als Tran

Entwicklun

nrezeptors

ose von N

sNTRK2m

sporadische

homKinas

m(INSS)3,5,

ymphknote

ymphknote

eralenLymektionllinie ode

ntferntenHaut und/

minationen

ostratifik

umorstadiu

genetische

myelocytom

omosom

tgeschritte

ziiert14,15.D

rendenReg

emWildtyp

hrt.MYCN

nskriptions

ngundMig

NTRK1

Neuroblasto

mitschlechte

enNeurobl

se (ALK) au

,6

n,

n,

phknoten,

er Befall

Lymphknooder and

n begrenzt

kation

msowied

und biolog

matosisvira

2p24, ist

enem Stad

DNA‐Sequen

gionen16,w

p Gen, das

agiertzusa

sfaktor un

grationalsa

korreliert

ompatiente

erPrognos

lastomewe

uf.DieALK

Ein

5‐JaÜbe>90>90

>90

der ~75

oten,deren

<20

t auf ~75

denSerum‐

gischeMar

alrelatedo

bei 20%

dium, sch

nzanalysen

wasvermut

smit hohen

ammenmit

d beeinflu

auchbeiA

t mit nie

en18, währe

seassoziier

eisenaktiv

KF1174LMuta

nleitung

2

ahres‐erleben0%

0%

0%

5%

0%

5%

‐Ferritin

rker, die

oncogen,

% aller

hnellem

nzeigen

enlässt,

nMYCN

tseinen

usst die

poptose

edrigem

end die

rtist19.

vierende

ation ist

Einleitung

3

nichtnureinederhäufigervorkommendenMutationen,sondernauchdieMutationmit

dergrößtenKorrelationzueinemaggressivenKrankheitsverlauf20‐22.

Die prognostische Aussagekraft eines teilweisen oder kompletten Zugewinns von

Chromosom 17q, der bei 63‐83% aller Neuroblastome auftritt, ist umstritten23.

Innerhalb dieser Region liegt das Gen BIRC5 (Baculoviral IAP repeat‐containing 5),

welches für das Protein Survivin kodiert23,24. Im Vergleich zu Normalgewebe,

MalignomenbeiErwachsenenundnicht‐malignenfetalenNeuroblastenderNebenniere

ist die Expression von Survivin im Neuroblastom erhöht. Die Überexpression von

Survivin im Tumor korreliert außerdem mit einer ungünstigen Prognose der

Patienten25,26.SurvivininteragiertmitAuroraBKinase(AURKB),INCENPundBorealin,

die zusammen den chromosomalenPassenger Komplex (CPC) bilden. Dieser Komplex

reguliertSchlüsselereignissewährendderMitosewiedieKorrekturvonFehlernbeider

AnheftungderChromosomenandieMikrotubuli,dieAktivierungvonKontrollpunkten

beim Aufbau des Spindelapparates und die Konstruktion und Regulation des

kontraktilenApparates,derdieZytokineseantreibt27.AußerdemstabilisiertSurvivindie

MikrotubulidurchdirekteBindungandiese28.

Die Lysin‐spezifischeDemethylase 1 (KDM1A), die die Entfernung der einfachen oder

doppeltenMethylierungsowohlvonLysin4alsauchvonLysin9anHiston3katalysiert,

spielteineSchlüsselrolleinderRegulationvonGenenwährendderEntwicklung29.Eine

Überexpression von KDM1A, die mit erhöhter Zellproliferation einhergeht, wird in

verschiedenen Tumorentitäten postuliert30‐34. In primären Neuroblastomen ist die

Expression von KDM1A invers mit Differenzierung und günstigem Krankheitsverlauf

korreliert. Die Herunterregulation von KDM1A in humanen Neuroblastomzelllinien

führtaußerdemzurReduktionderZellviabilität35.

D1.3

Tiermo

Mechan

Aufgrun

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Genom

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1.3.1 M

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Einleitung

5

1.3.1.2 DasTH‐ALKF1174LModell

Berry et al. generierten das TH‐ALKF1174L Mausmodell, indem sie humanes ALKF1174L

hinter den TH Promotor aus der Ratte klonierten und dieses Konstrukt in murine

Blastozysten injizierten.Keineder transgenenTiereentwickelteinenTumor,während

dieVerkreuzungmit derTH‐MYCNMaus jedoch zu einer signifikanten Steigerung der

Tumorpenetranz dieses Modells führt, vergleichbar mit der homozygoter TH‐MYCN

Tiere39.

1.3.2 KonditionaleModelle

Das Cre‐lox‐Rekombinationssystem ermöglicht eine genetische Modifikation

spezifischer Zell‐ und Gewebearten. Die Cre‐Rekombinase wird dabei hinter einen

spezifischenPromotorkloniertundnurindenZellenexprimiert,indenenderPromotor

aktiv ist. Ein Gen, das von loxP Sequenzen flankiert ist, wird in Cre‐exprimierenden

Zellen aufgrund der Rekombinase‐Aktivität ausgeschnitten. In konditionalen

Mausmodellen wird diese Technik zum einen zum Stilllegen von Genen und zum

anderen zur Entfernung von Sequenzen, die die Transkription von Transgenen

verhindern,verwendet.ImletzterenFallwirddasTransgennachdemAusschneidender

loxPSequenzenexprimiert.Eskommthäufigvor,dassnichtalleZellendesZielgewebes

dieCre‐Rekombinaseexprimieren,waszueinemmosaikartigenAusschneidender loxP

Stellenführt.DiesesPhänomenspiegeltdieSituationeinesspontanenTumorswider,bei

dem ebenfalls nicht alle Zellen des Gewebes, aus dem dieser entsteht, die Mutation

aufweisen. Die Aktivität des Promotors, der die Expression der Cre‐Rekombinase

antreibt, ist häufig nicht nur auf die Ziel‐Zelltypen beschränkt, was eine genaue

UntersuchungdesExpressionsmustersdeszuverwendendenCre‐Modellsunabdingbar

macht.

Etablierte konditionale Neuroblastommodelle nutzen das Dbh‐iCre Mausmodell zur

spezifischenExpressiondesjeweiligenOnkogens.DieCre‐Rekombinasestehthierunter

Kontrolle des murinen Dopamin beta‐Hydroxylase (Dbh) Promotors. Stanke et al.

zeigten anhand der Verkreuzung mit einer ROSA26 Reportermaus, dass die Cre‐

Rekombinase im Dbh‐iCre Modell ausschließlich in noradrenergen Neuronen des

peripherenunddeszentralenNervensystemsexprimiertwird40(Abb.1).

Abb.1:MausmMauslinGanglienvermittesympathgewebe.

1.3.2.1

Anhand

schlech

Molena

Verkreu

Neurob

Neurob

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1.3.2.2

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Verkreu

Tumori

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nderlich

bhängig

Proteine

Einleitung

9

1.4.2.1 DasonkogenemiR‐17‐92‐Cluster

Das bekannteste Beispiel für die Beteiligung von miRNAs an der Pathogenese des

Neuroblastoms ist das miR‐17‐92‐Cluster, das sechs miRNAs umfasst

(miR‐17,‐18a,‐19a,‐19b‐20aund‐92),dieinNeuroblastomzelllinienmithoherMYCN

Expression stärker exprimiert werden als in Zelllinien mit niedrigem MYCN Level.

Mittels Luziferase Reporter Analyse konnte gezeigt werden, dass MYCN in

verschiedenen Genregionen des miR‐17‐92‐Clusters direkt bindet und die miRNAs

hochreguliert. Eine ektopische Expression des miR‐17‐92‐Clusters in der

NeuroblastomzelllinieSK‐N‐AS,dienureineKopiedesMYCNGensträgt,führtzueiner

gesteigertenProliferationderZellen59.Auch inprimärenNeuroblastomenkonnteeine

HochregulationinHoch‐Risiko‐Patientengezeigtwerden60,61.

1.4.2.2 TumorsuppressivemiRNAs

Die erste miRNA, deren tumorsuppressive Funktion im Neuroblastom beschrieben

wurde, ist miR‐34a, die auf der chromosomalen Region 1p36.23 lokalisiert ist.

Besonders inhumanenNeuroblastomen,die eineMYCNAmplifikationaufweisen, liegt

diese Region häufig homozygot deletiert vor. Tumore mit 1p Deletion weisen eine

niedrige Expression von miR‐34a auf und die exogene Expression der miRNA in

Neuroblastomzelllinien führt zu einer Reduktion der Proliferation und induziert

Apoptose62,63. Interessanterweise weist die 3’UTR von MYCN zwei funktionelle

BindestellendermiR‐34aaufunddieBindungdermiRNAandieseBindestellenführtzu

einerHerunterregulationvonMYCNaufProteinebene64.Eswirdvermutet,dassgenau

diese Regulation den Phänotyp der miR‐34a Überexpression erklärt65. Chen et al.

beschreibeneinenweiterenSignalwegindieserAchse.Siekonntenzeigen,dassMYCNin

Neuroblastomzelllinien direkt die Expression von Survivin durch Bindung an den

SurvivinPromoterreguliert66.

Schulte et al. analysierten die Expression von 430 miRNAs in 69 Tumoren von

NeuroblastompatientenmittelsmultiplexHochdurchsatz‐qPCR67.AnhandeinerKaplan‐

Meier Analyse können diese Neuroblastompatienten anhand der miRNA

Expressionsprofile inLangzeit und‐Kurzzeit‐Überlebende separiertwerden.AufBasis

der 20 miRNAs mit der höchsten positiven und der 20 miRNAs mit der höchsten

negativen Beteiligung, die zu einer effizienten Separation der Patienten führt, wurde

eine nicht‐überwachte Clusteranalyse durchgeführt (Abb.3). Beide Isoformen der

miR‐542sindinTumorenmithohemStadiumniedrigerexprimiertalsinTumorenmit

günstig

MYCNA

Tumore

Überleb

Abb.3:anhandmiRNAsundmiR

ger Biologi

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en von Pa

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nleitung

10

ren mit

sowie in

r‐freiem

rognosendauf40R‐542‐3p

Einleitung

11

Bray etal. beschreiben ebenfalls eine Korrelation zwischen fehlender Expression von

miR‐542‐5p und sowohl schlechterem Ereignis‐freiem als auch schlechteremGesamt‐

überleben in 144 Neuroblastompatienten68. Nach exogener Expression dieser miRNA

kannzwarkeinUnterschiedinderProliferationsratederNeuroblastomzelllinienKelly,

SK‐N‐AS und NB1691 detektiert werden, aber sowohl Kelly als auch SK‐N‐AS Zellen

reagieren mit signifikant verringerter Invasivität durch eine Matrigel‐Matrix. Die

Expression von miR‐542‐3p induziert eine Reduktion der Proliferationsrate der

humanen Lungenkarzinomzelllinie A549, der humanen Zervixkarzinomzelllinie HeLa

undderhumanenBrustkrebszelllinieMCF769.DesWeiteren reduziertmiR‐542‐3pdie

FähigkeitvonA549ZellenzurKoloniebildung.Sowohl inA549alsauchinHeLaZellen

konntegezeigtwerden,dassSurvivineindirektesTargetvonmiR‐542‐3pist.

EinweiteresBeispielfüreinemiRNAmittumorsuppressiverFunktionistmiR‐137,die

aufdemhumanenChromosom1p22lokalisiertist.MiR‐137istinverschiedenenhuma‐

nen Tumorentitäten, wie dem Glioblastom70, dem Kolorektalkarzinom71, dem Mund‐

höhlenkarzinomunddemPlattenepithelkarzinomdesKopfesundNackensherunterre‐

guliert72. Die exogene Expression vonmiR‐137 in denMundhöhlenkarzinomzelllinien

HSC‐6undHSC‐7reduziertderenWachstumundKonfluenzinvitro72.

ZielderArbeit

12

2 ZielderArbeit

ZieldieserDissertationwares,einneueskonditionalesMYCNvermitteltesMausmodell

zugenerierenundzuetablieren.FolgendeFragestellungensolltenbearbeitetwerden:

1. Entwickeln LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mäuse Tumore, die als murine

Neuroblastomebeschriebenwerdenkönnen?

AnhandderLokalisation sowiederhistologischenundmolekularenEigenschaftender

Tumore,diesichintransgenenLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenentwickeln,solluntersucht

werden, ob sich dasModell alsmurinesNeuroblastommodell eignet.Weiterhin sollen

verschiedene Bildgebungsmethoden angewendet werden, um das Modell genauer zu

charakterisieren.

2. Wie unterscheiden sich die Tumore des LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells von

denendesetabliertenTH‐MYCNModells?

IndiesemTeilderArbeitsollendieEigenschaftendesneuenLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMaus‐

modellsmitdenendesetabliertenNeuroblastommodellsTH‐MYCNverglichenwerden,

umGemeinsamkeitenundUnterschiedeherauszuarbeiten.

3. KanndasLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausmodell genutztwerden,umneueZiele

einerNeuroblastomtherapiezuidentifizierenundsinddiesevalidierbar?

Anhand des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mausmodells sollen potentiell tumorsuppressive

miRNAs detektiert werden, die sowohl bei der Genese als auch für die Therapie des

Neuroblastoms eine Rolle spielen könnten. Nach erfolgreicher Identifikation soll die

funktionelle Bedeutung ausgewähltermiRNAs in vitro in etablierten humanenNeuro‐

blastomzelllinienanalysiertwerden.DazusollendiemiRNAsektopischexprimiertund

die phänotypischen Auswirkungen auf die Zellen untersucht werden. Des Weiteren

sollenausanderenTumorentitätenbekannteZielgenediesermiRNAsimNeuroblastom

validiertwerden.

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MaterialundMethoden

15

Restriktionsenzymen sind in einerTabelle zusammengefasst (Tab.2).ValidierteKlone

wurdenvermehrtundinflüssigenStickstoffgelagert.

Tab.2:Sonden fürdieSouthernBlotAnalyseModifiziertnachMilestoneReportTaconicAr‐temisGmbH.

Fragmentgröße[kb]

Sonde Enzyme Wildtyp‐Allel F1RMCEAllel LSL‐MYCNAllel

5‘HindIIIEcoRIPciI

4,415,69,5

3,94,316,4

7,07,813,1

3‘AvrIIPciIStuI

5,39,54,9

12,116,48,3

6,66,715,3

neoHindIIIEcoRIAseI

‐‐‐

‐‐‐

7,07,84,5

3.1.1.3 GenerierungvonchimärenMäusen

Tetraploide Maus‐Blastozysten wurden aus superovulierten Balb/c Weibchen (Tag 3

post coitum) isoliert. In 60 Blastozysten wurden je 7‐10 rekombinante ES‐Zellen

(C57Bl/6N)injiziert.Je20BlastozystenwurdendanndreischeinträchtigenWeibchenin

den Uterus implantiert, woraufhin 10 chimäre Nachkommen geboren wurden. Die

chimärenNachkommen,diesichsowohlausdentransgenenES‐Zellenalsauchausden

Zellen der Blastozyste entwickelten, wurden weitergezüchtet und keimbahnmutierte

männlicheTiere(schwarze/weißeFellfarbe)durchVerpaarungmitC57Bl/6NWeibchen

vermehrt. Der Nachweis der Keimbahntransmission erfolgte anhand der schwarzen

Fellfarbe. Das Transgen wurde mittels LSL‐MYCN Primern in einer PCR amplifiziert

(s.3.2.1–Tab.3),umdenEinbauzuvalidieren.HeterozygoteLSL‐MYCNMäusewurden

anunsereArbeitsgruppe transferiert (Abb4(III))unddurchVerpaarungmitWildtyp‐

Tierenweitergezüchtet.

MaterialundMethoden

16

3.1.1.4 Genotypisierungen

ZurGenotypisierungallerverwendetenMausstämmewurdedenNachkommenanTag5

bis 8 nach der Geburt eine Schwanzbiopsie entnommen. Die Vervielfältigung des

LSL‐MYCN‐Amplikons aus genomischer Schwanz‐DNA erfolgte anhand einer PCR mit

LSL‐MYCN‐Primern(Abb.4:A1/A2undTab.3)unddieDetektionmitHilfederAgarose‐

Gelelektrophorese (s. 3.2.1 und 3.2.2). Homozygote LSL‐MYCN Mäuse wurden mit

ROSA26‐Wildtyp‐Primernidentifiziert(Tab.3).DieGenotypisierungvonDbh‐iCreMäu‐

senerfolgteunterVerwendungvonDbh‐iCre‐Primern(Tab.3).

3.1.2 ZuchtvonLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenundDetektionvonTumoren

Dbh‐iCreMäusewurdenfreundlicherweisevonProf.Dr.HermannRohrer(Max‐Planck‐

Institut für Hirnforschung, Frankfurt) zur Verfügung gestellt. Heterozygote Dbh‐iCre

Tiere wurden mit heterozygoten LSL‐MYCN Tiere verpaart. Doppelt‐transgene Nach‐

kommen wurden mittels LSL‐MYCN‐ und Dbh‐iCre‐Genotypisierungs‐PCRs (s.3.1.1.4)

identifiziertundalsLSL‐MYCN;Dbh‐iCrebezeichnet.

DurchwöchentlichesAbtasten des Abdomens und desHalsbereicheswurdenTumore

detektiert. Sowohl mittels Lumineszenz‐Bildgebung (s.3.1.2.1) als auch Ultraschall‐

Bildgebung (s.3.1.2.2) wurden ertastete Tumore validiert. Alle tumor‐tragenden

LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mäuse wurden bei Erreichen eines Tumorvolumens von ca.

500mm3oderbei schlechtemHabitusdurchzervikaleDislokationgetötetundseziert.

Abmagerung,BewegungseinschränkungundAtembeschwerdenaufgrundeinesTumors

inderNähederLuftröhrewurdealsschlechterHabitusdefiniert.Mittelseinerhandels‐

üblichen Kamera (Panasonic Lumix DMC‐FZ248) wurden makroskopische Fotos der

Tumoreerzeugt.Herz,Hirn,Milz,MuskulaturausdemFemur,Nebennieren(wennnicht

mitTumorverwachsen),Nieren,SchwanzundTeilederLebersowiederTumorewur‐

den sofort in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bei ‐80°C gelagert. Außerdem

wurdenFemursowieTeilederLeberundderTumore in4%Paraformaldehyd inPBS

pH7,2(Morphisto,FrankfurtamMain)eingelagert.

IndenTumorenwurdedaskonstitutiveAllelanhandderausgeschnittenenPolyadenyl‐

Stoppsequenz imVergleich zuKontrollgewebenmittels floxoutPrimern (Tab.3) vali‐

diert.

MaterialundMethoden

17

3.1.2.1 Biolumineszenz‐BildgebungvonTumor‐tragendenLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen

ZellenderLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMaus,indenendieCre‐Rekombinaseaktivistunddamit

dieTranskriptionsabbruchstelle(hGHpA)herausgeschnittenwurde,solltennebendem

OnkogenMYCNauchLuziferase exprimieren. ZurDetektiondieserZellenwurdeMäu‐

sen, die einen tastbaren Tumor trugen, in die Schwanzvene D‐Luciferin in PBS

(PerkinElmer, Rodgau) injiziert (50mg/kg Körpergewicht). In Gegenwart von Luzi‐

ferase wird Luciferin oxidiert und bei der daraus resultierenden Abspaltung von

TeilgruppenwirdEnergieinFormvonLichtabgegeben.Tierewurdenmit3%Isofluran

(Forene®; Abbott,Wiesbaden) in Sauerstoff narkotisiert und in die Kammer des IVIS

Lumina II (PerkinElmer), in der eine kontinuierliche Behandlungmit 2% Isofluran in

Sauerstoff aufrechterhalten wurde, gelegt. Mittels dieses Luminszenz‐

Bildgebungsgeräteswurdedie IntensitätderLumineszenz‐Emissiongemessenunddie

BilderimTIF‐Formatexportiert.

3.1.2.2 Ultraschall‐BildgebungverschiedenerGewebevonLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen

HochfrequenterSchallaußerhalbdeshörbarenBereichsdesMenschen(>16kHz)wird

als Ultraschall bezeichnet. In der Humanmedizin dient die Ultraschall‐Untersuchung

(Sonografie)zurBildgebungbeiverschiedenenErkrankungen.ManmachtsichzuNutze,

dass dieUltraschallwellen, die von einemSchallkopf ausgesendetwerden, je nachGe‐

webeart entweder absorbiert oder reflektiert werden. Der Schallkopf empfängt die

reflektiertenWellenwiederunddieReflektionwirdaufdemBildschirmalsGraustufen

dargestellt. Wässrige Strukturen werden schwarz dargestellt, während Luft, die kein

Ultraschallleitet,weißerscheint.

ImRahmendieserArbeitwurdedasUltraschall‐BildgebungssystemVevo®2100(Visual

Sonics, Amsterdam, Niederlande) verwendet, um Gewebe und Tumore der

LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Maus zu untersuchen. Enthaarte Tiere wurden mit 3% Isofluran

(Forene®) in Sauerstoff narkotisiert und auf dem beheizbaren Untersuchungstisch so

fixiert, dass eineAbleitung derHerz‐ undAtemfrequenz ermöglichtwurde. DieUltra‐

schall‐UntersuchungwurdeunterkontinuierlicherNarkosemit2%Isofluran inSauer‐

stoff mittels eines MicroScan‐Schallkopfs (MS550D‐Visual Sonics) durchgeführt. An‐

hand der 3D‐Funktion wurden in 100µm Abstand Schnitte durch Gewebe gemacht,

dessenOberflächeanhanddesGerätsberechnetwurde.DurchAneinanderreihendieser

Schnittewurdedie3D‐StrukturdesjeweiligenGewebesrekonstruiertunddasVolumen

berechnet.

3.1.3 X

Sechs‐W

1·107W

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18

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MaterialundMethoden

19

IndieserArbeitwurdedieMethodederPCRzurGenotypisierungtransgenerMäuseund

zur Validierung der ausgeschnittenen Polyadenyl‐Stoppsequenz benutzt, wobei die

GoTaq®HotStartPolymerase(Promega,Mannheim)Verwendungfand.DieStocklösung

derPrimerhatteeineKonzentrationvon20mM.FolgendesPipettierschemawurdefür

jedenPCR‐Ansatzverwendet:

5xGoTaq®FlexiPuffer 4µl

MgCl2(25mM) 1,2µl dNTP‐Mix(Bio‐Budget,Krefeld) 0,6µl Primerforward 1µl Primerreverse 1µl GoTaq®Polymerase(5U/µl) 0,1µl templateDNA 1µl DNase‐freiesH2O 11,1µl

DieAmplifikationdertemplateserfolgteimC1000™ThermalCycler(Bio‐Rad,München),

wobei die Annealingtemperatur vom GC‐Gehalt der verwendeten Primer und die

Elongationszeit von der Länge des zu synthetisierenden DNA‐templates (60Sek. pro

1kb)abhängigwar.DieverwendetenPrimer,sowiediespezifischenAnnealingtempera‐

turen und Elongationszeiten wurden in einer Tabelle zusammengefasst (Tab.3). Fol‐

gendesallgemeinesProgrammwurdebenutzt:

180Sek. 94°C

30Sek. 94°C 30Sek. 55‐65°C 39x 30‐180Sek. 72°C 300Sek. 72°C

MaterialundMethoden

20

Tab.3:OligonukleotidprimerfürPCRfwd=forward;rev=reverse

Bezeichnung Sequenz(5‘‐3‘) Produkt‐länge

Annealing‐temperatur

Elongations‐zeit

Dbh‐iCrefwd:ctgccagggacatggccaggrev:gcacagtcgaggctgatcagc 300bp 59°C 45Sek.

flox‐out fwd:gcccgcggtgatgcctttgaggrev:cggggactgggcggtggaac

2241bp703bp

67,7°C 240Sek.

LSL‐MYCN fwd:accacaaggccctcagtaccrev:tgggacgcacagtgatgg

168bp 60°C 30Sek.

ROSA26‐Wildtyp

fwd:ctcttccctcgtgatctgcaactccrev:catgtctttaatctacctcgatgg 299bp 62°C 45Sek.

Die Auswertung der PCRs erfolgte mittels der Agarose‐Gelelektrophorese (s.3.2.2),

wobeijeweils14µldesPCR‐Ansatzesaufgetragenwurden.

3.2.2 Agarose‐Gelelektrophorese

Aufgrund ihrernegativenLadungbewegensichsowohlDNA‐alsauchRNA‐Stränge in

einemelektrischenFeld inRichtungderAnode.DieLaufgeschwindigkeit vonNuklein‐

säure‐SträngeninAgarosegelenkorreliertmitderFragmentgröße,daAgarosegeleeine

siebartigeStrukturaufweisenundkleinerenFragmenteneinengeringerenWiderstand

bieten.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden 1‐2%‐ige Agarosegele benutzt, die in Tris‐Acetat‐

EDTA‐Puffer (40mM Tris, 20mM Essigsäure, 1mM EDTA, pH8,0) angesetzt wurden.

Die Zugabe von Ethidiumbromid (Endkonzentration 1,25µM), ein Farbstoff, dessen

Absorptionsspektrum sich bei Interkalation mit Nukleinsäuren verändert, diente zur

VisualisierungderDNA‐FragmenteunterUV‐Licht.ZurBestimmungderFragmentgrö‐

ßen wurde parallel zu den zu analysierenden Proben ein DNA‐Standard

(LifeTechnologies, Darmstadt) aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte in Tris‐Acetat‐

EDTA‐Puffer bei 120V für 45 bis 60Min. und die Visualisierung am

DokumentationsgerätBiodocAnalyzer(Biometra,Göttingen).

MaterialundMethoden

21

3.2.3 KlonierungderKonstruktepDEST30‐KDM1AundpDEST30‐Survivin

Humane KDM1A cDNA ohne 3’UTR wurde im Vektor pDONR™ erworben (E1871‐

BC048134.1; THP Medical Products, Wien, Österreich). Humane Survivin cDNA ohne

3’UTR im Gateway® pENTR™ Vektor (LifeTechnologies) wurde freundlicherweise von

Fieke Lamers aus der Arbeitsgruppe Humangenetik der Universität Amsterdam zur

Verfügunggestellt74.Beidegenesofinterest(GOIs)konntenausdiesenDonorplasmiden

anhandderGateway‐Klonierungsehreffizient inZielvektorenkloniertwerden.Mittels

Gateway®LR‐Clonase®IIEnzym‐Mix (LifeTechnologies)wurdendieGOIsnachHerstel‐

leranweisungen in den Zielvektor Gateway® pT‐Rex™‐DEST30 (LifeTechnologies) klo‐

niert.EinKonstruktmitGFPalsGOIwarschoninunsererArbeitsgruppevorhanden.Die

Hitzeschocktransformation in chemisch kompetente E.coli TOP10 (LifeTechnologies)

erfolgtenachHerstellerangaben.Je50und200µldertransformiertenE.coliwurdenauf

LBAMP‐Platten(10%Trypton,0,5%Hefeextrakt,10%NaCl,1%Agar‐Agar,pH7,0,0,01%

Ampicillin)überNacht inkubiertundEinzelzellklonegepickt.UmgrößereMengendes

PlasmidszugewinnenwurdenEinzelzellklonein100mlLBAMP‐Medium(10%Trypton,

0,5%Hefeextrakt,10%NaCl,pH7,0,0,01%Ampicillin)vermehrt.Plasmid‐DNAwurde

mit Hilfe des PlasmidMaxi Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben isoliert. Um

sicherzustellen, dass das GOI fehlerfrei im Zielvektor vorlag, wurden bei der Firma

Seqlab (Göttingen)SequenzierungeninAuftraggegeben,wobeidieSequenzierungspri‐

mer benutzt wurden, die vom Hersteller für Gateway® pT‐Rex™‐DEST30 empfohlen

wurden. Auf der Homepage des National Center for Biotechnology (NCBI,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov) wurden die aus der Sequenzierung erhaltenen Ergeb‐

nissemitBLASTNanalysiert.

3.2.4 BestimmungderKonzentrationvonDNAundRNA

DieMessungderNukleinsäurekonzentrationerfolgtephotometrischmittelsdesNano‐

Drop2000c (ThermoScientific).DabeiwurdedieoptischeDichte (OD)bei einerWel‐

lenlänge von 260nm, dem Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren, gemessen. Eine

OD260von1entspricht50µg/mldoppelsträngigerDNAund40µg/mlRNA.Eventuelle

VerunreinigungendurchProteinewurdenbei280nmdetektiert.DerQuotientausder

OD260 und derOD280 liegt bei reinenDNA‐Präparationen bei 1,8 und bei reinenRNA‐

Präparationenbei2,0.ImRahmendieserArbeitwurdennurreineNukleinsäure‐Präpa‐

rationenweiterverwendet.

MaterialundMethoden

22

3.2.5 IsolierunggenomischerDNA

Genomische DNA aus Geweben von LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mäusen wurde mittels des

peqGOLD Tissue DNAMini Kits (peqlab, Erlangen) nach Anweisungen des Herstellers

isoliertundin70µlDNase‐freiemWasseraufgenommen.

3.2.6 mRNA‐undmiRNA‐Isolierung

Die Extraktion vonmRNA aus pelletierten humanen Zelllinien undmurinenGeweben

erfolgteanhanddesRNeasy®MicrooderMidiKits(Qiagen).MiRNAswurdenausGewe‐

ben mittels desmiRNeasyMini Kits (Qiagen) extrahiert. Sämtliche Kits wurden nach

HerstelleranweisungeninklusivedesoptionalenDNase‐VerdausmittelsdesRNase‐free

DNase Sets (Qiagen) durchgeführt.Die Lagerung isoliertermRNAundmiRNAerfolgte

bei‐80°C.

3.2.7 ReverseTranskriptionvonkomplementärerDNAausisoliertermRNAund

miRNA

DiereverseTranskriptionzurHerstellungvonkomplementärerDNA(cDNA)ausmRNA

erfolgtemittelsderSuperScript® IIReverseTranscriptase (LifeTechnologies).DiecDNA

ausmiRNAwurdemittelsdesmiScriptReverseTranscriptionKits(Qiagen)transkribiert.

Beide Kitswurden nach Herstellerangaben durchgeführt und die synthetisierte cDNA

bei‐20°Cgelagert.

3.2.8 QuantitativePCR

DieMethodederquantitativenPCR(qPCR),dieaufdemPrinzipderherkömmlichenPCR

beruht,dientzurAnalysederTranskriptionspezifischerGene.DieausisoliertermRNA

mittels reverser Transkription generierte cDNA wird während der Amplifikation mit

einemFluoreszenzfarbstoffversetzt,derindieDNAinterkaliert.DiemessbareFluores‐

zenz der Probe nimmt proportional zur vorhandenen DNA‐Menge zu. Der Schwellen‐

wert‐Zyklus(Ct‐Wert)beschreibtdenPCR‐Zyklus,andemdieFluoreszenzerstmaligdie

Hintergrund‐Fluoreszenzübersteigt.

ImRahmen dieser Arbeitwurde für die Analyse von cDNA, die aus isoliertenmRNAs

synthetisiertwurden,abhängigvomOligonukleotidprimerderFastSYBR®GreenMaster

Mix(LifeTechnologies)oderderTaqMan®FastAdvancedMasterMix(LifeTechnologies)

MaterialundMethoden

23

verwendet.DieDetektionvoncDNA,dieausmiRNAs transkribiertwurde,erfolgtean‐

hand desmiScript SYBRGreen PCR Kits (Qiagen).Mittels des StepOnePlus™Real‐Time

PCR Systems (Life Technologies) wurde die qPCR durchgeführt. Die dabei benutzten

ProgrammevariierteninAbhängigkeitdesbenutztenKits(Tab.4).

Tab.4:ProgrammederqPCR

40x

SowohldieverwendetenPrimeralsauchdasbenutzteKitwurdentabellarischzusam‐

mengefasst(Tab.5).

Tab.5:OligonukleotidprimerfürqPCRhs=human;mm=murin;fwd=forward;rev=reverse

BezeichnungSequenz(5‘‐3‘) oderBestellnummer qPCRKit

Mm_Dbhfwd:tcatgcacatacaacacagarev:tgcacatagttgacacacat

Fast SYBR® Green Master Mix

Hs_GAPDHfwd:catcaagaaggtggtgaagcrev:gagcttgacaaagtggtcgt


Mm_GAPDH QT01658692(Qiagen) Fast SYBR® Green Master Mix

Hs_KDM1A QT00099442(Qiagen) Fast SYBR® Green Master Mix

Mm_Phox2bfwd:ggcagaggaattgaggtaagrev:cgtctccacatccatcttt


Hs_miR‐542‐3p MS00010073(Qiagen) miScript SYBR Green PCR Kit

Hs_MYCN QT00201404(Qiagen) Fast SYBR® Green Master Mix

Hs_NEFL QT00096369(Quagen) Fast SYBR® Green Master Mix

Hs_RNU6B MS00007497(Qiagen) miScript SYBR Green PCR Kit

Hs_Survivin Hs03063352(LifeTechnologies) TaqMan® Fast Advanced Master Mix

Hs_TFPI2fwd:gtcgattctgctgcttttccrev:ggagacagatctccgcgtta


Mm_Th fwd:aggtggtgacacttatccaarev:agtgccagagaggacaag



TaqMan® Fast Advanced Master Mix

miScript SYBR Green PCR Kit

95°C 20Sek. 95°C 20Sek. 95°C 20Sek.

95°C 3Sek. 95°C 1Sek. 95°C 3Sek.

60°C 30Sek. 60°C 20Sek. 60°C 30Sek.

MaterialundMethoden

24

DerCt‐WertvonzuanalysierendenmRNAswurdegegendendesubiquitär‐exprimier‐

tenEnzymsGlycerinaldehyd‐3‐Phosphat‐Dehydrogenase(GAPDH)dergleichenSpezies

normalisiert.DerCt‐Wertderubiquitär‐exprimiertenmiRNARNU6BdientezurNorma‐

lisierung des Ct‐Wertes der zu analysierendenmiRNAs. Anhand der ∆∆‐CtMethode75

wurdediemRNAbzw.miRNAExpressionrelativzurjeweiligenKontrollekalkuliert.

3.2.9 Array‐basiertekomparativegenomischeHybridisierung

Die Technik der Array‐basierten komparativen genomischen Hybridisierung (aCGH)

findet indermedizinischenForschungAnwendung,umVerlusteundZugewinnegeno‐

mischerDNAineinemGeweberelativzurKontrollezudetektieren.DabeiwirddieDNA

der Referenzprobe und der zu analysierenden Probemit verschiedenen Fluoreszenz‐

farbstoffen gelabelt und gegen einRaster vonDNA‐Fragmenten hybridisiert. Das Ver‐

hältnisderFluoreszenzsignalegibtAufschlussaufchromosomaleAberrationen.

FürdieDetektionchromosomalerAberrationen,dieinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCre

Modells auftraten,wurden jeweils13ProbenunddieentsprechendenKontrollen (Ge‐

webeausdemSchwanzdergleichenMaus)analysiert.GenomischeDNAwurdemitHilfe

desQIAampDNAMiniKits(Qiagen)nachHerstellerangabenisoliert.DieProbenwurden

auf einem 180K Array (AMADID 027411‐Agilent Technologies, Böblingen), der das

kompletteMausgenom enthielt, analysiert. Je 400ng DNA aus Tumorgeweben wurde

mittelsRandompriming (LifeTechnologies)Cy3(PerkinElmer,Rodgau)gelabelt,wäh‐

rend die gleiche Menge DNA aus Schwanzgewebe mit Cy5 (Perkin Elmer) markiert

wurde.DieHybridisierungundWaschungderProbenerfolgtenachHerstellerangaben

desArrays.DieMessungderFluoreszenz‐IntensitätenwurdeanhanddesAgilentScan‐

ners G2505C (Agilent Technologies) durchgeführt. Das Software Programm Feature

Extractionv10.1.1.1(AgilentTechnologies)fandbeiderExtrahierungderDatenAnwen‐

dung. Diese wurden mit Hilfe von aCGHbase (http://medgen.ugent.be/arraycghbase)

weiter bearbeitet. Verluste und Zugewinne von Genen wurden anhand des circular

binarysegmentation(CBS)Algorithmusberechnet76,77.

3.2.10 mRNAqPCRprofiling

Anhand von Exon‐Mikroarrays kann die mRNA‐Menge bestimmter Gene einer Probe

bestimmtwerden.DazuwirddieisoliertemRNAzunächstincDNAodercRNAtranskri‐

biertunddannmitFluoreszenzfarbstoffengelabelt.DerspezifischeMikroarray‐Genchip,

MaterialundMethoden

25

dereineAuswahlvonDNA‐Spotsenthält,hybridisiertdiecDNAodercRNAderzuanaly‐

sierenden Probe. Nach Abwaschen der nicht‐gebundenen Nukleinsäuren, gibt die zu

normalisierendeFluoreszenzintensitätderSpotsdiemRNAExpressiondesspezifischen

GensinderProbewieder.

Die Bestimmung der Konzentration und Qualität isolierter Gesamt‐RNA aus Tumoren

des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modells und aus nicht‐malignen Nebennieren von Wildtyp‐

Tieren erfolgte anhand des RNA6000 Nano Assays auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer

(Agilent Technologies). Die Transkription in cDNA und die Fragmentierung dieser er‐

folgtemitHilfedesGeneChip®3‘IVTExpressKit (Affymetrix,Freiburg).DieHybridisie‐

rungdercDNAaufMausgenom‐Genchips4302.0(Affymetrix),dieSondenzurDetektion

allerGenederMausenthielten,unddasAuslesenerfolgtenachAnweisungendesHer‐

stellers.CELDateienwurdennormalisiertunddieExpressionmittelsderRMAMethode

mitPowerToolsv1.15.0(Affymetrix)berechnet.

DieKalkulationderMYCNmRNASignaturbasierteaufdemvonFredlundetal.publizier‐

tenAlgorithmus78.

3.2.11 miRNAqPCRprofiling

Isolierte miRNAs aus Tumoren des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modells und nicht‐malignen

Nebennieren aus Wildtyp‐Mäusen wurden mittels des TaqMan miRNA Reverse

TranscriptionKits(LifeTechnologies)unterVerwendungdesrodentstem‐loopMegaplex

RTPrimerPoolsAundB(v2.0‐LifeTechnologies)nachHerstelleranweisungenincDNA

transkribiert.Ein12ZyklenlangerAmplifikationsschrittzurHerstellungeinergrößeren

Menge an cDNAwurde durchgeführt. Amplifizierte cDNAwurde 1zu4 verdünnt und

mittels desTaqMan®MicroRNAAssay 7900HT (LifeTechnologies) in folgender qPCR

Reaktionquantifiziert:

TaqMan®Assay 1,5µl TaqMan®geneexpressionmastermix 1,75µl cDNA 0,02µl DNase‐freiesH2O 0,23µlRohdaten der miRNA Expressionswerte wurden anhand des Cq‐cutoff gefiltert und

normalisiertanhanddesglobalmean79.

DieKalkulationderMYCNmiRNASignaturbasierteaufdemvonMestdaghetal.publi‐

ziertenAlgorithmus80.

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MaterialundMethoden

27

(Invitrogen)aufgetragen.DieelektrophoretischeAuftrennungderProteineerfolgtebei

einerkonstantenelektrischenSpannungvon120VjenachLaufweitederFarbfrontfür

90‐120Min.

3.3.3 WesternBlotundimmunologischerNachweisvonProteinen

DerWesternBlotisteineproteinbiochemischeMethode,mitderProteinevomSDS‐Gel

auf eineMembranausNitrozellulose transferiertwerdenkönnen83.DieProteinewan‐

dern dabei durch ein senkrecht zum SDS‐Gel angelegtes elektrisches Feld inRichtung

der Anode auf die Membran, auf der sie aufgrund hydrophober Wechselwirkungen

haftenbleiben.DasandenProteinenangelagerteSDSwirdausgewaschen,wodurchdie

Proteine ihre Sekundär‐ und Tertiärstruktur wieder einnehmen. Freie unspezifische

Bindungsstellen der Proteine werden mit einer Lösung aus entfettetem Milchpulver

blockiert.DieDetektionbestimmterProteinekannmitspezifischenPrimärantikörpern,

dieanihrAntigenbinden,erfolgen.MittelseinesSekundärantikörpers,derspezifischan

denprimärenbindetundeinReporterenzymenthält,dasdasSubstratLuminolumsetzt,

wirddieProteinbandevisualisiert.

ImRahmendieserArbeitwurdenaufgetrennteProteinemittelsdesTrans‐Blot®Turbo™

(Biorad) vom SDS‐Gel auf die Hybond‐™C Extra Nitrozellulose‐Membran (Amersham

Biosciences, Freiburg) transferiert. Dazuwurden zuerst zwei Filterpapiere (Whatman)

mitAnodenpuffer1(300MTris,20%Methanol)getränktundinderBlotkammerüber‐

einanderpositioniert.EinweiteresFilterpapier,mitAnodenpuffer2(25mMTris,20%

Methanol)getränkt,wurdeaufdiebeidenFilterpapieregelegt.Alsnächsteswurdedie

Membran (in Anodenpuffer 2) und das SDS‐Gel, welchesmit Kathodenpuffer (25mM

Tris,40mMGlycine,10%Methanol)getränktwar,aufgestapelt.DreiweitereFilterpa‐

piere (in Kathodenpuffer) bildeten den Abschluss. Bei einer konstanten elektrischen

Stromstärkevon90mAwurdendieProteinefür1Std.übertragen.DieMembranwurde

mitTBS‐T0,1(0,1%Tween20inTBS)gewaschenunddieProteinemitPonceauS‐Lösung

(0,1%PonceauS,5%Essigsäure)zurÜberprüfungdesTransfersundzurEinzeichnung

derMarkerbandenangefärbt.NacheinemweiterenWaschschrittwurdendieunspezifi‐

schen Proteinbindestellen für 1 Std. mit Bovine Lacto Transfer Techniques Optimizer

(BLOTTO‐5%Milchpulver,50mMTrisHClpH8,80mMNaCl,2mMCaCl2,0,2%NP‐40)

blockiert.DieInkubationdesPrimärantikörpersinBLOTTOerfolgteüberNachtbei4°C,

gefolgtvoneinemweiterenWaschschritt.DerSekundärantikörper,andenMeerettich‐

MaterialundMethoden

28

peroxidase gekoppelt war, inkubierte in TBS‐T0,1 für eine Std. bei Raumtemperatur,

ebenfalls gefolgt von einemWaschschritt. Verwendete Verdünnungen der Antikörper

wurdentabellarischaufgeführt(Tab.6).ProteinewurdenmittelsdesDetektionsreagenz

ECLPlus™(AmershamBiosciences)visualisiert,imFusionFX(peqlab)detektiertunddie

Bilderalsjpegexportiert.

Tab.6:AntikörperfürdenimmunologischenNachweisvonProteinen

Antigen Bestellnummer Verdünnung

AuroraBkinase 3094(CellSignaling) 1:1.000

AKAP2 Ab64904(Abcam) 1:1.000

Aktin A3853(Sigma‐Aldrich) 1:2.000

Caspase9 IM3434(Immunotech) 1:1.000

GAPDH MAB374(Millipore) 1:2.000

Kaninchen‐IgG NA9340V(GEHealthcare) 1:5.000

KDM1A 2139(CellSignaling) 1:1.000

Maus‐IgG NA9310V(GEHealthcare) 1:5.000

N‐Myc sc‐53993(SantaCruz) 1:1.000

Survivin 2808(CellSignaling) 1:1.000

TetR 631131(Clontech) 1:2.000

3.3.4 P

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MaterialundMethoden

32

SämtlicheverwendeteZelllinienwurdeninRPMI1640Mediumsupplementiertmit10%

FCS,AmphotericinB(3µg/ml),Penicillin(100U/ml)undStreptomycin(100µg/ml)bei

37°C, 80% Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 kultiviert. Bei Erreichen etwa 80%‐iger Kon‐

fluenzwurdendieZellenmit0,2%Trypsin/EDTA für2‐3Min.abgelöst.DurchZugabe

vonKulturmediumwurdedieReaktionabgestoppt.DieZellenwurdenmittelsdesTC10™

Automated Cell Counter (BioRad) gezählt und in für die Versuche erforderlichen Ver‐

dünnungenausgesätoderweiterkultiviert.

DieKryokonservierungvonZellenerfolgteinFCSmit10%DMSOinflüssigemStickstoff.

ZumAuftauenwurdendieKryoröhrchenbei37°Cfürca.1Min.inkubiertunddieZellen

inKulturmediumaufgenommen.

3.5.2 TransienteTransfektionenvonmiRNAundsiRNA

FürtransienteTransfektionenvonmiRNAundsiRNAinhumaneZelllinieninvitrowur‐

denZelleninverschiedenenZahlenausgesät,abhängigvonihrerWachstumsgeschwin‐

digkeit undGröße.Die imRahmendieserArbeit ausgesäten Zellzahlenwurden tabel‐

larischzusammengefasst(Tab.8).

Tab.8:AusgesäteZellzahlenderverwendetenZelllinien

ZelllinieZellzahl

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HEK‐293 2·104 ‐ ‐

IMR‐32 1,5·104 12·104 18·104

SHEP 0,5·104 4·104 6·104

SK‐N‐BE 1·104 8·104 12·104

WACII 0,5·104 4 · 104 6·104

Transiente Transfektionen der Pre‐miRs™ (AM17100‐Life Technologies) miR‐137

(PM10513),miR‐542‐3p(PM11340)undmiR‐542‐5p(PM13010)PrecursorMolekülen

undderPre‐miR™Negativkontrolle(AM17110‐LifeTechnologies)erfolgtenmittelsdes

TransfektionsreagenzessiPort™NeoFX™(LifeTechnologies) ineinerEndkonzentration

von30nMnachAnweisungendesHerstellers.

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(10272

fektion

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s.3.3.3).

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en.DerVek

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3.5.5 Z

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Zellena

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34

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MaterialundMethoden

35

DieAnalysederViabilitätvonZellenerfolgteim96‐wellFormatzuverschiedenenZeit‐

punkten (24, 48, 72, 96und120Std.) nach der transientenTransfektion vonmiRNAs

undsiRNAs(s.3.5.2).DerFarbstoffMTTwurdeinPBSgelöst(10mM)und20µlprowell

zu den Zellen gegeben (Endkonzentration 1,7mM). Nach einer Inkubationszeit von

2Std.bei37°CwurdederÜberstandabgesaugtunddasentstandeneFormazanin100µl

Solubilisierungslösung (10% SDS, 0,6% Essigsäure in DMSO) gelöst. Die Messung er‐

folgte bei einer Wellenlänge von 570nm (Referenzwellenlänge 630nm) im Epoch

Spektralphotometer‐System (BioTech, Bad Friedrichshall). Alle Experimente wurden

mindestensdreiMal,jeweilsindreifach‐Bestimmungdurchgeführt.

3.5.6 Apoptose‐Assay

Zellen, die aufgrund von Apoptose sterben, geben Mono‐ und Oligonukleosome ins

Zytoplasmaab.DasCellDeathDetectionELISAPLUSKit(11774425001‐Roche)verwen‐

detAntikörper, die spezifisch gegenDNAundHistone gerichtet sind, umdieseMono‐

und Oligonukleosome zu detektieren. Die Umsetzung eines spezifischen Substrates

korreliertmitderFraktionapoptotischerZelleninderProbe.

DieAnalyseder apoptotischenZellen erfolgtenachHerstellerangaben im96‐well For‐

mat96Std.nachTransfektionvonmiRNAsodersiRNAs(s.3.5.2).DieMessungerfolgte

anhand des Epoch Spektralphotometer‐Systems (BioTech). Alle Experimente wurden

dreiMal,jeweilsindreifach‐Bestimmungdurchgeführt.

3.5.7 Proliferations‐Assay

DieSynthesevonDNAisteinindirekterParameterderZellproliferation.DasPrinzipdes

CellProliferationELISAKits(1647229001‐Roche)beruhtaufdemEinbauvon5‐bromo‐

2‘‐Deoxyuridin(BrdU)anstellevonThymidinindiegenomischeDNAvonproliferieren‐

denZellen.MittelseinesAntikörperswirddaseingebauteBrdUgebunden.DerUmsatz

desSubstratsgibtAufschlussaufdieProliferationsrateeinerZellprobe.

Die Analyse der proliferierenden Zellen erfolgte im 96‐well Format 96Std. nach der

Transfektion von miRNAs oder siRNAs (s.3.5.2). Es wurde nach Herstellerangaben

vorgegangen. Die Messung erfolgte anhand des Epoch Spektralphotometer‐Systems

(BioTech). Alle Experimentewurdenmindestens dreiMal und jeweils in dreifach‐Be‐

stimmungdurchgeführt.

MaterialundMethoden

36

3.5.8 Zellzyklusanalyse

Der Farbstoff Propidiumiodid interkaliert mit Nukleinsäuren von perforierten Zellen.

Bei der Zellzyklusanalysewird anhand vonDurchflusszytometriederDNA‐Gehalt von

Zellen bestimmt. Dieser gibt Aufschluss auf den Zellzyklusstatus einzelner Zellen. Die

subG1‐PhaseistcharakterisiertdurchdegradierteDNAunddamiteinCharakteristikum

apoptotischerZellen.InderG1‐PhaseliegtinderZelleeinvollständigerChromosomen‐

satzvor.BefindetsicheineZelleinderS‐Phase,inderdieDNArepliziertwird,liegtein

1‐2‐facherChromosomensatzvor.DieG2/M‐PhaseistdurchdasVorhandenseinzweier

Chromosomensätzecharakterisiert.

Zu analysierendeZellenwurden in12‐well PlattenmitmiRNAsoder siRNAs transient

transfiziert(s.5.3.2)undnach96Std.analysiert.ZellpelletswurdenmitPBSgewaschen

(5Min.bei1.000g),in70%EthanolaufEisfür1Std.fixiertundzentrifugiert(5Min.bei

1.000g).DasPelletwurdein500µlPBSresuspendiertunddieRNAdurchZugabevon

RNase A (Endkonzentration 0,25mg/ml) für 1Std. bei 37°C verdaut. Propidiumiodid

wurde in einer Endkonzentration von 10µg/ml zugegeben. Der zelluläre DNA‐Gehalt

von jeweils5.000ZellenwurdemittelsdesFlowCytometers FC500 (BeckmanCoulter,

Krefeld)gemessenundanhandderSoftwareCXPanalysiert.AlleExperimentewurden

mindestensdreiMaldurchgeführt

3.5.9 LuziferaseReporterAssay

DiedirekteBindungeinermiRNAaneinevorhergesagteZiel‐mRNAkannmittelseiner

LuziferaseReporterAnalysevalidiertwerden.DasLuziferase‐Reporter‐Plasmidenthält

diepotentielleBindestelledermiRNA.DieBindungdermiRNAandieBindestelleführt

zurHemmungderLuziferaseExpressionundsomitzurgeringerenAktivität.

Die Bindung vonmiR‐137 an die 3’UTR vonKDM1A wurdewie folgt untersucht: Das

Glühwürmchen‐LuziferaseReporterPlasmidpMir‐Target(OriGene),welchesdie3’UTR

von KDM1A beinhaltete (SC0204616‐NM_015013), das Plasmid pRL‐TK (E224A–

Promega, Mannheim), das als Transfektionskontrolle Renilla‐Luziferase exprimierte,

und Negativkontroll‐miRNA oder miR‐137 wurden im 12‐well Format sowohl in

HEK‐293alsauchinSHEPZellenkotransfiziert.

DieValidierungdermiR‐542‐3pBindungandie3’UTRvonSurvivinerfolgtemitfreund‐

licherweisevonDr.KwangheeBaek(Graduiertenschule fürBiotechnologie,KyungHee

Universität, Yongin, Korea) zur Verfügung gestellten Psi‐Check2‐Vektoren (Promega),

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MaterialundMethoden

38

3.6.2 StatistischeAnalysen

SämtlicheGraphenwurdenmitGradhPadPrism®5.0erstellt.StatistischeAnalysenwie

derStudent‘st‐Test,derLog‐Rank‐TestundderWilcoxonTesterfolgtenebenfallsmit‐

telsdieserSoftware.StatistischeUntersuchungenzumVerlaufzweierGraphenwurden

von Johannes Köster (Genome Informatics, Institut für Humane Genetik, Universität

Duisburg‐Essen) anhand eines Permutationstests durchgeführt. Expressionsdaten aus

qPCR‐Analysen einzelnermRNAswurdenmitBiogazelleqbasePLUS2.0 berechnet.Die

Signifikanz der Unterschiede zwischen zwei experimentell verschieden behandelten

Gruppenwurdemit*(p<0,05),**(p<0,01)und***(p<0,001)gekennzeichnet.

3.6.3 Bildbearbeitung

EingescanntehistologischeSchnittewurdenmitPanoramicViewer1.15.2analysiertund

als TIF‐Dateien exportiert.DieQualität vonFotos und anderenDateienwurdemittels

derSoftwarePhotoshop®CS4(Adobe)sinnerhaltendaufgewertet.

4 Er

D4.1

4.1.1 G

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4.1.3 G

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4.1.4 E

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6‐337Tage

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1). Währen

bis 688 Ta

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enentwicke

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,während

m(11,1%)s

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glion auch

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gebnisse

41

n Unter‐

notypen

hschlie‐

notypenSL‐MYCNnGenoty‐rat‐Test:bachtete

verpaart

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en Tiere

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der LSL‐

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Tumore

kalgang

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mittels Lum

ekonnten

glion(I)un

2: Luziferasn In vivoYCN;Dbh‐iCreGanglionco

YCN;Dbh‐iC

sequenzhe

exprimieren

mineszenz‐

sowohlan

ndamGang

se‐Expressio BiolumieMäusenanoeliacum(III

CreMaus,

erausgesch

n.Luziferin

‐Bildgebung

ndenNebe

glioncoeliac

ion dreierineszenz BndenNebenI).Luziferase

in denen d

hnittenwur

nwird inG

g visualisi

ennieren(I,

cum(III)na

repräsentBildgebungnnieren(I,e‐Aktivität:

Abb.11im LSLKaplan‐freienMäusenn=21)LSL‐MYTumoreren,demoberenTest.

die Cre‐Rek

rde,sollten

Gegenwart

iert werde

, IIund III

achgewiese

tativer Tumrepräsen

IIundIII),ablau=niedr

1:EntwicklL‐MYCN;Dbh‐Meier‐AnalÜberleben

n (Beim

YCN;Dbh‐iCrentwicklungmGanglionZervikalg

kombinase

nnebende

vonLuzife

n (Abb.12

),alsauch

enwerden.

more aus Lntativer Tuamoberenrig;rot=ho

Erg

lungvonTh‐iCreMaulyse desns von LSobachtungsVergleich

re Tiereng an den Ncoeliacumu

ganglion. L

e aktivwar

emOnkoge

eraseoxidi

2). Repräse

amobere

.

LSL‐MYCN;Dumore voZervikalganoch.

gebnisse

42

TumorenusmodellTumor‐

SL‐MYCNskohorte;h zu(n=38).ebennie‐unddemLog‐Rank

r, da die

nMYCN

iertund

entative

nZervi‐

Dbh‐iCreon dreinglion(I)

Ergebnisse

43

Die Tumore des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mausmodells wurden mittels Ultraschall‐Bildge‐

bungweiteruntersucht.WährenddieoberenZervikalganglienaufgrundihrergeringen

Größe in heterozygoten LSL‐MYCN Tieren nicht genau dargestellt werden konnten

(Abb.13a), waren repräsentative Tumore die aus diesen Geweben entstandenwaren,

deutlichalsechoärmere,raumforderndeStrukturinderHalsregionrechtsundlinksder

Luftröhrenachweisbar(Abb.13b).ZurAuffindungeinerNebennierewurdezunächstdie

Lokalisation der Niere anhand ihrer auffälligen Struktur aus Nierenrinde, ‐mark

und ‐becken, die imUltraschall deutlich erkennbarwaren, definiert (nicht gezeigt). In

RichtungkranialkonntebeiheterozygotenLSL‐MYCNTierendieNebenniereamvorde‐

renNierenpol dargestelltwerden (Abb.13c).DieNebennierenrindewar als echoarme

Strukturdeutlicherkennbar,währenddas innenliegendeNebennierenmarkeinstärke‐

res Echo aufwies. Tumore der Nebenniere, die im LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mausmodell

auftraten, konnten als echoarme Strukturen am oberen Nierenpol dargestellt werden

(Abb.13d).Mittelsder3D‐FunktiondesVevo2100wurdendie3‐dimensionalenStruk‐

turen verschiedener Gewebe rekonstruiert (Abb.13e) und ihre Volumina bestimmt.

Nicht‐maligneNebennierenausgewachsenerMäusewieseneinmittleresVolumenvon

2,18mm3(±0,61mm3)auf(Datennichtgezeigt).DieVoluminaderNebennierenvonje

sechs LSL‐MYCN und LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Tieren wurden über 100Tage wöchentlich

gemessenundgegendasAlterderTiereaufgetragen(Abb.13f).ZwischendenVolumina

nicht‐maligner Nebennieren von LSL‐MYCN;Dbh‐iCre und LSL‐MYCN Mäusen konnte

keinUnterschieddetektiertwerden.Zweiderdoppelt‐transgenenMäuseentwickelten

innerhalb der Beobachtungszeit Tumore an einer der beiden Nebennieren, anhand

derenVolumina sichein exponentiellesWachstumnachweisen ließ.EinweiteresLSL‐

MYCN;Dbh‐iCreTierdieserKohortebildeteeinenTumordesoberenZervikalganglions

mitschnellerVolumenvergrößerungausundmusstenach50Beobachtungstagengetö‐

tetwerden(Datennichtgezeigt).DieTumorinzidenzderhierbeobachtetenKohortelag

innerhalbderStreuungderGesamtkohorte.

Abb.13(a)DurckalgangbeidseitLSL‐MYC(NN)einmeliert.LSL‐MYCeiner LLSL‐MYCgen TieeinenTu

3: Ultraschchschnittdelien (aufgrutig aus deYCN;Dbh‐iCrenerheterozy(d) Durch

YCN;Dbh‐iCreLSL‐MYCN;DYCN;Dbh‐iCreres. Zwei dumoranein

hall‐BildgeerHalsregiound der gern obereneMaus.(c)DygotenLSL‐hschnitt dure Maus. (e)Dbh‐iCre MeMäusenmder doppelt‐nerderNebe

ebung vonneinerheteringen GrößZervikalganDurchschnitMYCNMausrch einen a) 3D‐RekonMaus. (f)ittels3D‐Re‐transgenenennieren.

n Tumoreerozygotenße nicht genglien entsttderamvos.Nebennieraus der Nebnstruktion eNebenniereekonstruktion Tiere entw

en aus LLSL‐MYCNMenau definiestandene TorderenNierrenrindeschbenniere heeines repräsenvoluminaonaufgetragwickelten in

LSL‐MYCN;DMausinHöherbar). (b)Tumore einrenpollokalhwarz;Nebeervorgegangsentativen Nvon je

gengegendnnerhalb de

Erg

Dbh‐iCrehederobereDurchschniner repräselisiertenNebennierenmagenen TumNebenniere6 LSL‐MYCdasAlterdeser Beobacht

gebnisse

44

MäusenenZervi‐itt durchentativenbennierearkweiß‐or einerntumorsCN undsjeweili‐tungszeit

Sobald

aufgrun

einena

getötet

derers

desobe

Abb.14Modellseines Tuausdem

DasVor

LSL‐MY

Rekomb

Mittels

LSL‐MY

(Abb.1

cher d

ausgesc

durche

ein Tumo

nd eines d

allgemeinen

. Während

owohlTum

erenZervik

4: Makrokos (a) Darstumors desmoberenZer

rhandense

YCN;Dbh‐iC

bination s

PCR(Prim

YCN;Dbh‐iC

5). In geno

ie Polyade

chnittenw

einRekomb

or ein Volu

ie Luftröhr

nschlechte

d der Sekti

morederN

kalganglion

opische Auellung beidGanglion corvikalgangli

inderspez

reMäusen

tattgefund

merflox‐out

re Tieren

omischerD

enyl‐Stopp

wurde,war

binationser

umen von

re zudrück

esHabitusa

ion wurden

Nebennieren

ns(Abb.14b

ufnahmenseitig entstoeliacum (Monnaheder

zifischenPo

n deutete d

en hatte,

t‐Tab.3)k

, ein 224

DNAausTu

sequenz a

das Ampli

reigniskon

500mm3

kenden Tum

aufwies,wu

n makrosk

nunddes

b)dokume

repräsentatandener NeMitte). (b)DrLuftröhre.

olyadenyl‐S

darauf hin,

also keine

konnteing

41bp lang

umoren de

aufgrund d

ikon 703b

nntesoind

überschrit

mors einge

urdedieses

kopische A

Ganglionc

entiertwur

ativer TumebennierentDarstellung e

Stoppseque

dass in de

e Cre‐Reko

genomische

ges Amplik

es LSL‐MYC

der Expres

p lang. Die

enTumore

tt, die Atm

eschränkt w

sdurchzer

Aufnahmen

oeliacum(A

den.

more des Ltumore (receines Tumo

enzingeno

em jeweilig

ombinase e

erDNAaus

kon nachg

CN;Dbh‐iCr

ssion der

e Aktivieru

ennachgew

Erg

mung eines

war oder e

rvikaleDisl

gemacht,

Abb.14a)a

LSL‐MYCN;Dchts und linors, hervorg

omischerD

genGeweb

exprimiert

sHerzgew

gewiesen

reModells,

Cre‐Rekom

ung des Tr

wiesenwerd

gebnisse

45

s Tieres

ein Tier

lokation

anhand

alsauch

Dbh‐iCrenks) undgegangen

DNAvon

be keine

wurde.

ebevon

werden

inwel‐

mbinase

ansgens

den.

DieExp

auch au

undTu

vier rep

wurde

Tumore

höhteE

ten Kon

erhöhte

gleiche

(Abb.1

Abb.16(a)BalkwebenTest:pverMäu

pressionde

uf Protein‐

umorenvon

präsentativ

relativ zur

e zeigten i

Expression

ntrollgewe

e Expressio

n Maus w

6b).

6: Überexpkendiagrammaus einer=0,0002.(buse.GAPDH

esTransge

‐Ebenemit

nLSL‐MYCN

verTumor

r Expressio

mVergleic

vonMYCN

eben war d

on des Pro

urde in vi

pression vomderMYCNWildtyp‐Mab)MYCNPralsLadungs

ensMYCNw

ttelsWeste

N;Dbh‐iCre

e sowiede

on der nic

ch zuNebe

NmRNA.Im

die Hochre

oteinsMYC

er repräse

on MYCNNmRNAExpaus relativoteinExpreskontrolle.

Abb1tenenpräseniCreMHerz2der jewflox oTu=T

wurde sow

ern Blot in

eMäusena

erKontroll

cht‐malinge

ennieren ei

mVergleich

egulation v

CN im Tum

entativen L

in Tumorpressionviezur Expres

essionimHe

5:PCRzurPolyadeny

ntativen TMäusen Kon2241bplanweils gleichout (Tab.3umor.

wohl aufm

n Kontrollg

analysiert.D

gewebeNi

en Nebenn

ine signifik

hderTumo

vonMYCN

mor im Ver

LSL‐MYCN;D

en des LSerrepräsentssion der Nerz(He)und

Validierunyl‐Stoppsequmoren aunditionalesg,konstituthen Maus 73). wt=W

RNA‐Ebene

geweben vo

DieMYCN

iere,Leber

iere aufget

kant, imM

rezudena

mRNA noc

gleich zum

Dbh‐iCre M

SL‐MYCN;DtativerTumNebennieredTumor(Tu

Erg

ngderausgquenz in vus LSL‐MYLSL‐MYCNtivesAllel im703 bp langWildtyp; He

emittelsq

onWildtyp

mRNAExp

r,Herzund

tragen (Ab

ittel 14,5‐f

anderenan

ch deutlich

mHerz der

Mäusen dar

Dbh‐iCre MmoreundKo(NN). Stud

u)vierrepr

gebnisse

46

geschnit‐vier re‐YCN;Dbh‐Allel immTumorg. Primere=Herz;

qPCRals

p‐Tieren

pression

dGehirn

bb.16a).

fach, er‐

nalysier‐

her. Die

r jeweils

rgestellt

Modellsntrollge‐dent‘s t‐äsentati‐

4.1.6 T

DieExp

mittels

Marker

Herzun

gen (Ab

Nebenn

ren im

sion vo

derana

Die Str

histolog

DieTum

das a

Elektro

neuron

Zelladh

exprim

Neurob

wurdea

Tumorhis

pressionde

qPCRinve

r‐Expressio

ndGehirnw

bb.17). Inn

niereamhö

Mitteleine

onTh und

alysiertenN

ruktur repr

gischer Sch

morebesta

auch im

onenmikros

nales Gewe

häsionsmol

iert wird8

blastommar

anhandim

tologieun

erNeurobl

erschieden

onvierrep

wurderela

nerhalb de

öchsten.D

e2,4‐fach

eine22‐fa

Neuroblasto

räsentative

hnitte, die

andenausk

humanen

skopische

ebe spezifis

ekül,dasin

88, immunh

rkers Th, d

munhistoc

ndExpress

lastommark

nenGewebe

räsentative

ativzurExp

er Kontroll

ieTumore

erhöhteEx

ch erhöhte

ommarker

er Tumore

mitHämat

kleinen,bla

n Organis

Aufnahme

sch sind1 (

nneuronal

histochemi

die schon a

hemischer

sionspezif

kerDbh,T

endesLSL‐

erTumore

pressionde

lgewebe w

wiesenve

xpressionv

eExpressio

indenTum

AbblaTuBalmRTumExp(NNTum(StPhoHy

aus LSL‐M

toxylin und

auen,runde

smus die

en zeigten

(Abb.18b).

lenundneu

sch darge

auf Transk

rFärbungen

fischerNeu

ThundPhox

‐MYCN;Dbh

undderK

ernicht‐ma

war die Exp

erglichenm

vonDbh, e

on vonPho

morenwar

b.17: mRNastommarkmoren auslkendiagramRNA Expremore undpression deN). Signifmoren imtudent‘st‐Teox2b: p=droxylase;T

MYCN;Dbh‐

d Eosin an

enZellen,ty

se Strukt

neurosek

. Weiterhin

uroendokr

stellt (Abb

kriptionseb

naufProte

uroblastom

x2bwurde

h‐iCreMod

Kontrollgew

alignenNeb

pression al

mitnicht‐m

ine4,2‐fac

ox2b auf.D

signifikant

NA Expreskern in vies LSL‐MYCNmm der Nession vieKontrollgeer nicht‐mafikante HVergleich

est:Dbh:p=0,0006). DTh=Tyrosin

iCre Mäus

ngefärbtwu

ypischfürd

tur aufw

kretorische

n wurde C

inenGewe

b.18c). Die

bene gezeig

inebeneva

Erg

mmarker

eaufmRNA

dellsanalys

webeNiere

bennierea

ller Marker

malignenNe

cherhöhte

DieHochreg

t.

ssion voner repräsenN;Dbh‐iCreeuroblastomer repräseeweben relalignen NebHochregulatih zur Neb=0,005;Th:Dbh=DopamnHydroxyla

en wurde

urden, unt

dasNeurob

weist1 (Ab

Vesikel,

CD56, ein n

ebenundT

e Express

gt werden

alidiert(Ab

gebnisse

47

A‐Ebene

iert.Die

e,Leber,

ufgetra‐

r in der

ebennie‐

Expres‐

gulation

Neuro‐ntativenMäusenmmarkerentativerativ zurbenniereion inbennierep=0,02;min‐betase.

anhand

ersucht.

blastom,

bb.18a).

die für

neurales

umoren

ion des

konnte,

bb.18d).

Abb.18LSL‐MYblaue ZAufnahmtochemi(rechts)Negativk

4.1.7 V

d

DasTu

lierten

fanden

129x1/

Mäuse

(50%)

schon i

zeigten

Überleb

des T

LSL‐MY

TH‐MYC

82,5Ta

8: HistoloYCN;Dbh‐iCrellen. Maßsmemitneurische Färbu). Maßstabskontrollenu

Vergleich

desetablie

mor‐freieÜ

TH‐MYCN

sich im

/SvJ (25%)

100%129x

und 129x

in vorherig

n im Vergl

ben,ermitt

TH‐MYCN‐M

YCN;Dbh‐iC

CN Mäusen

agenlag.Di

ogische ureModellsstabsbalkenrosekretorisung von CDsbalken=20urmitSekun

derTumo

ertenTH‐M

Überleben

Neuroblas

gemischte

), während

x1/SvJwar

1/SvJ (50%

gen Publik

eich zu TH

teltanhand

Modells be

re Modell

n betrug 1

ejenigenT

und mole(a)Hämato: links=10schenVesikeD56 (links)00 µm. (d)ndärantikör

orinzidenz

MYCNMau

vonLSL‐M

stommodel

en genetis

d der gene

r.TH‐MYCN

%) entwick

kationen be

H‐MYCN T

deinerKap

etrug 48%

ls (76,3%

54 Tage, w

iere,dieim

ekulare CoxylinundE0µm; rechteln(Pfeile).und NegaImmunhist

rper(rechts)

zdesLSL‐M

usmodells

MYCN;Dbh‐

lls verglich

schen Hint

etische Hi

NTiereim

kelten kein

eschrieben

Tieren ein

plan‐Meier

% und w

%). Das m

während d

mLaufeder

CharakterisEosinFärbuts=50µm.Maßstabsbtivkontrolletochemische).Maßstabs

MYCN;Dbh

iCreMäuse

hen. Die LS

tergrund

ntergrund

gemischten

ne Tumore

wurde37.

signifikant

‐Analyse(A

war dam

mediane T

das von LS

rBeobachtu

tika vonng.Überwie(b) Elektrobalken=500e nur mit Se Färbung v‐balken=20

‐iCreMaus

enwurdem

SL‐MYCN;D

aus C57Bl

der analy

nHintergru

e (Daten n

LSL‐MYCN

t schlechte

Abb.19).D

it geringe

umor‐freie

L‐MYCN;Db

ungmindes

Erg

n Tumoreegendkleinonenmikrosk0nm.(c)ImSekundäranvon Th (lin00µm.

smodellsm

mitdemd

Dbh‐iCre Ti

l6/N (75%

ysierten TH

undausC5

nicht gezei

N;Dbh‐iCre

eres Tumo

DieTumori

er als d

e Überleb

bh‐iCre Tie

stenseinen

gebnisse

48

en dese,runde,kopischemmunhis‐ntikörpernks) und

mitder

esetab‐

iere be‐

%) und

H‐MYCN

57Bl6/N

gt), wie

Mäusen

or‐freies

inzidenz

die des

en von

eren bei

nTumor

ausbild

Lebens

4.1.8 G

Genom

nieren

demSc

einerÜ

Zeit bis

Tumore

zur Ent

der Zei

konnte

den.

Einer d

Chromo

kalgang

Zunahm

sowohl

ren. Au

LSL‐MY

ren Ze

frequen

more g

17, die

Tumore

deten, entw

,imLSL‐M

Genomisch

ischeAber

undzweiT

chwanzder

Übersichtsg

s zur Entw

enwurden

twicklung

it bis zur T

aufgrund

der analysi

osoms1. In

glions wur

medeskom

lTumored

uf diesem

YCNMausm

rvikalgang

ntierte Zun

gefunden (A

e in 50% a

ewurdeein

wickeltend

YCN;Dbh‐iC

heAberra

rrationenv

Tumorede

r jeweils g

graphikden

wicklung ei

n keine chr

dieser beid

Tumorentw

der gering

ierten Tum

nachtTum

rde eine Z

mplettenC

derNebenn

Chromoso

modellsklo

glions amp

nahmeder

Abb.20c),

aller huma

nekomplet

iesen imT

CreModell

ationenvon

on13LSL‐

esoberenZ

leichenMa

njeweiligen

ines Tumo

romosomal

den Tumor

wicklung u

genAnzahl

more einer

morender

Zunahme d

hromosom

nierenals a

om liegt de

niertwurd

lifizierten

distalenH

entspreche

aner Neuro

tteZunahm

TH‐MYCNM

nach79,6

Abb.zwisundAnalyheter(n=8(n=3Mäus

nLSL‐MYC

‐MYCN;Dbh

Zervikalgan

ausmittels

nChromos

ors in dies

lenAberra

re betrug 4

und dem A

l an analys

Nebennie

Nebennier

des komple

ms6 zeigten

auchdeso

er ROSA26

de.EinTum

diesen Lo

HälftedesC

end einer R

oblastome

medesChro

Modell imM

Tagen.

19: Vergchen demdem TH‐

yse des Trozygot tr84) und38).Tumorisensignifika

CN;Dbh‐iCr

h‐iCreTumo

nglions)wu

s einer aCG

omenzuge

er Kohorte

tionen det

46Tage. E

Auftreten ch

iertenTum

ere zeigte e

reundeine

etten Chro

n fünfder

oberenZerv

6 Genlokus

morderNe

okus sogar

Chromosom

Region auf

eine Zuna

omosoms1

Mittelnach

gleich der LSL‐MYCNMYCN ModTumor‐freieansgenenLSL‐MYCN

inzidenzinanthöher(L

reTumore

oren(elfTu

urdenrelat

GHAnalyse

eteilt(Abb.

e betrug 8

tektiert. Die

in Zusamm

hromosom

morennich

eine teilwe

emTumor

omosoms 3

analysierte

vikalgangli

s, in den d

ebenniereu

r (Abb.20b

ms11wurd

f dem hum

hme aufwe

12festgeste

Erg

h85,3Tage

r TumoriN;Dbh‐iCredell Kaplaen ÜberlebTH‐MYCNN;Dbh‐iCreLSL‐MYCN;DLog‐RankTe

en

umoreder

tivzuGew

edetektiert

.20a).Die

80,4 Tage.

emittlere

menhang zw

maler Aberr

ht untersuc

eise Zunah

desobere

3 detektie

enTumore

ionsbetrof

das Transg

undeinerd

b). Eine n

de invier

manen Chro

eist42. In d

ellt.Beide

gebnisse

49

en ihres

inzidenzModelln‐Meier‐ens vonMäusenTieren

Dbh‐iCreest).

rNeben‐

webeaus

t und in

mittlere

In zwei

Zeit bis

wischen

rationen

chtwer‐

hme des

nZervi‐

rt. Eine

e,wobei

ffenwa‐

gen des

desobe‐

iedriger

derTu‐

omosom

drei der

Tumore

desobe

auf.

Interes

Aberrat

mor12

andere

(Tumor

Teilwei

LSL‐MY

Abb.20AnalysegleichenZunahmROSA26des ChrBeckers

erenZervik

santerweis

tionenauf

2und13)),

Aberratio

r8und9).

ise oder k

YCN;Dbh‐iC

0: Genomis von13LSLnMaus.(a)me;rot=Abn6Genlokusaromosoms 1s.

kalganglion

se wies ein

wiederTu

während

onen als d

komplette

reModells

sche AberrL‐MYCN;DbhÜberblickünahme.(b)RaufChromos11 in vier d

nssowieein

ner der Tu

umorausd

derzweite

er dazugeh

Verluste g

nichtdete

rationen vh‐iCreTumoübergenomRepräsentatsom6.(c)Reer Tumore.

nTumord

umore des

derNebenn

eanalysiert

hörige Tum

ganzer Chr

ektiert.

von TumororenrelativmischeAberrtiveDarstellepräsentativ. Graphik ge

erNebenn

oberen Ze

nierederg

teTumord

mor der N

romosomen

ren des LSvzuGeweberationenallelungdesinzveAnsichtdeneriert in

ierewiesen

ervikalgang

gleichenMa

desoberen

Nebenniere

n wurden

SL‐MYCN;DeausdemSeranalysierzweiderTuderZunahmeZusammena

Erg

ndieseAbe

glions die g

aus(Abb.2

Zervikalga

e zeigte (A

in Tumor

Dbh‐iCre MSchwanzdertenTumorumoreampliederdistalearbeitmit A

gebnisse

50

erration

gleichen

20a(Tu‐

anglions

Abb.20a

ren des

Modellsr jeweilse.blau=ifiziertenenHälfteAnneleen

Ergebnisse

51

4.1.9 mRNAProfiling

Mittels Affymetrix mRNA Arrays wurden mRNA Expressions Profile von drei nicht‐

malignenNebennierenundachtLSL‐MYCN;Dbh‐iCreTumorenerstellt.

4.1.9.1 Gene Set Enrichment Analyse (GSEA) von Tumoren des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre

Mausmodells

Eines der am stärksten angereicherten Gensets innerhalb der in Tumoren von

LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mäusen hochregulierten Gene, das anhand der GSEA detektiert

wurde, beinhalteteMarkerpädiatrischerKrebserkrankungen89 (Abb.21a (oben)).Die‐

sesGenset besteht aus in Xenografts, die acht verbreitete pädiatrischeTumore reprä‐

sentieren,verschiedenexprimiertenGenenimVergleichzuNormalgewebe.Einweiteres

Genset,das inTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells starkangereichertwar,bein‐

halteteGene,dieinBZellLymphomen,dieeineaktivierteFormvonMYCexprimieren,

hochreguliertsind90(Abb.21a(unten)).WeiterevonMYChochregulierteGensetswaren

inTumorenausLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenangereichert91‐93,währendvonMYCherun‐

terregulierteGensets90,93,94 inNebennierenangereichertwurden(Abb.21b).Zusätzlich

waren verschiedene Gene, die die DNA Replikation und den Zellzyklus betreffen95‐98,

statistisch signifikant hochreguliert in Tumoren des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modells. Ein

weiteresGenset,dasGenerepräsentierte,diewährendneuralerDifferenzierungherun‐

terreguliert sind99, wurde in Tumoren aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen hochreguliert,

wasdieHypotheseeinesundifferenziertenPhänotypunterstützt.

Abb.21NebennKrebseristderPMSigDBwaren.Größe=positivR

4.1.9.2

An den

Basisd

einezw

Regulat

amplifiz

gene.or

Die nic

einerei

1:GensetEnierenvonWrkrankungenPlotderRanC2KollektiRang=Ran=AnzahlderRate.Graphi

Expressio

Tumoren

n gleichen

dervonFre

wei‐dimens

tion dieser

zierten Ne

rganhand

cht überwa

indeutigen

nrichmentAWildtyp‐Mäunrepräsentingsummendion,die inLng des GensrGeneinjedikgeneriert

on einer Si

mRNA Arr

edlundeta

ionaleClus

r mRNAs

euroblastom

vonPfeilen

achte Clust

Separation

AnalyseAchusen.(a)Hoiert(oben)desMSigDBLSL‐MYCN;Dsets innerhdemGenset,inZusamm

ignatur MY

ray Daten,

al. publizier

steranalyse

in humane

men78 und

ndargestel

teranalyse

nvonNebe

htLSL‐MYCNochregulatioundeinesM(v3.1)GensDbh‐iCrebzwhalb aller G,NES=norm

menarbeitmi

YC(N) regu

die für die

rtenMYC(N

edurchgefü

en MYCN‐

d die der

lt.

anhand de

ennierenun

N;Dbh‐iCreoneinesGenMYCN‐abhänsets.(b)Taw. inNebenGensets, geomalisierterEitAnneleen

ulierter mR

e GSEA ver

N)Signatu

ührt(Abb.

amplifizier

Internet‐D

er Gene de

ndLSL‐MYC

Tumoreundnsets,dasMngigenGensbelleausgewnnierensignordnet nachEnrichmentBeckers.

RNAs in LS

rwendetw

rhumaner

22).DesW

rten im Ve

atenbank

er MYCN S

CN;Dbh‐iCr

Erg

ddreinichtMarkerpädiasets(unten)wählterGennifikantangeh abfallendeScore,FDR

SL‐MYCN;D

wurden, wu

rNeurobla

Weiterenwu

ergleich zu

www.myc‐

Signatur fü

reTumoren

gebnisse

52

‐maligneatrischer.Gezeigtnsetsderereichertem NES,=falsch‐

Dbh‐iCre

urde auf

astome78

urdedie

u nicht‐

‐cancer‐

ührte zu

n.

Abb,22sionaletur vonNebennDatenbaphikgen

Die Ho

konnte

Mitose

konnte

hohe N

LSL‐MY

hydrog

marker

murine

netes T

regulier

2:Regulierthierarchischn Fredlundieren.Regulank (www.mneriertinZu

chregulatio

imMausm

von Neu

eine Hoch

NME1 Expr

YCN;Dbh‐iC

enaseLeve

r13. Die Reg

eNeuroblas

Target von

rt.

temRNAsinheClusteranet al.78 inlationinMYmyc‐cyncer‐usammenarb

on vonNra

modellvalid

uroblastom

hregulation

ression mi

re Modells

el imBlut

gulation de

stomedies

n MYCN103,

nTumorennalysebasien acht LSLYCN‐amplifiz‐gene.org) abeitmitAnn

as, die auc

diertwerde

zelllinien

n detektier

it einem u

s überexpr

vonNeuro

es Gens in

esEnzymü

, war im

ndesLSL‐Merendaufde‐MYCN;Dbhziertenhumals Pfeile. ExneleenBeck

ch für das

en.DemGe

zugeschrie

rt werden.

ungünstige

rimierten d

oblastompa

n LSL‐MYCN

überexprim

LSL‐MYCN

MYCN;Dbh‐iCerExpressio‐iCre TumomanenNeuroxpression: bers.

humane N

nUBE2Cw

eben101. A

In human

en Stadium

diese mRN

atientendi

N;Dbh‐iCre

mierten.SR

N;Dbh‐iCre

CreMausmondermRNAoren und doblastomen7blau=hoch;

Neuroblasto

wirdeinepo

Auch in LS

en Neurob

m assoziier

NA ebenfall

ent inder

Tumoren

M,einbeka

Modell eb

Erg

modellsZweAsderMYCdrei nicht‐m78undRegu; rot = nied

om bekann

ositiveRoll

SL‐MYCN;D

blastomen

rt102. Tumo

ls. Der Lak

Klinik als

zeigte, da

anntesnac

enfalls sig

gebnisse

53

ei‐dimen‐CNSigna‐malignenulationindrig. Gra‐

nt ist100,

leinder

Dbh‐iCre

ist eine

ore des

ktat‐De‐

Tumor‐

ass auch

hgeord‐

gnifikant

4.1.9.3

Die Ex

(Abb.2

tionals

vonMY

Rolle in

konnte

nen Ne

Dickkop

miR‐19

zeigten

tionvon

Abb.23(log2)MLSL‐MYC

4.1.10

Mittels

LSL‐MY

4.1.10.1

Einezw

zierten

der mi

Regulatio

Mausmod

xpression b

3).DieCar

s vonMYC

YChochreg

nderRegu

auch inTu

ebennieren

pf‐3(Dkk3)

9bundmiR

n imVergle

nDkk3.

3:ReguliertMYCNhochrYCN;Dbh‐iCre

miRNAPr

qPCR wu

YCN;Dbh‐iC

1 Expressio

LSL‐MYCN

wei‐dimens

MYCSigna

iRNAs in h

onbekannte

dells

bekannter

rbamoyl‐Ph

undMYCN

uliertesZie

ulationdes

umorende

n festgeste

)wirdinh

R‐92aandie

eichzunich

teMYCTarregulierter(eTumorenu

rofiling

urden miRN

reTumore

on einer

N;Dbh‐iCre

sionaleClu

aturhuman

humanen

erMYCNm

MYCN re

hosphatSy

Nhochregu

elistdieCy

Zellzyklus

esLSL‐MYC

llt werden

humanenN

e3’UTRerk

ht‐maligne

rgets inTu(CadundCdundnicht‐m

NA Profile

enerstellt.

Signatur

Modells

steranalys

nerNeurob

MYCN‐amp

mRNATarge

egulierter

ynthetase2

uliertesEn

yclin‐abhän

s spielt106,1

CN;Dbh‐iCr

n. Die MYC

Neuroblasto

klärt108,109.

enNebenni

morendesdk4)undMYmalignenNeb

e von fünf

MYCN re

ewurdeau

blastomed

plifizierten

etsinTum

Targets w

2(Cad)wir

nzymbesch

ngigeKinas

07.Eine sig

eModells

CN‐induzie

omzellenm

.Tumored

iereneine

sLSL‐MYCNYCNheruntebennieren.S

f nicht‐mal

egulierter

ufBasisde

urchgeführ

im Vergl

orendesLS

wurde geso

rd inversc

hrieben92,10

se4(Cdk4)

gnifikant er

imVerglei

rte Herun

mitderdire

erLSL‐MY

signifikant

N;Dbh‐iCreMerregulierterStudent‘st‐te

lignen Neb

miRNAs i

ervonMes

rt80(Abb.2

eich zu ni

Erg

SL‐MYCN;D

ondert unt

chiedenenP

04,105. Ein e

),dieeinew

rhöhteExp

chzunich

nterregulati

ektenBindu

YCN;Dbh‐iC

teHerunte

Modells Exr(Dkk3)Zietest.

bennieren

in Tumor

stdagheta

24).DieReg

icht‐amplif

gebnisse

54

Dbh‐iCre

tersucht

Publika‐

benfalls

wichtige

pression

t‐malig‐

ion von

ungvon

reMaus

rregula‐

xpressionelgenein

und elf

ren des

al. publi‐

gulation

fizierten

Neurob

stellt.

Dienich

einer e

Mäusen

Abb.24nalehievonMesRegulatihoch;roVerschi

miR‐18

LSL‐MY

nieren.

sionin

tumors

miR‐21

Tumore

blastomen,

htüberwac

eindeutigen

n.

4:RegulierterarchischeCstdaghetal.ion in MYCot=niedrig.

iedene miR

8a‐5p, mi

YCN;Dbh‐iC

Dieonkog

LSL‐MYCN

uppressive

14‐3p114,m

en eine He

aufderdi

chteCluste

n Separatio

temiRNAsClusteranaly.80inelfLSLN‐amplifizieGraphikgen

RNAs des b

iR‐19a‐3p,

reTumore

gene,direk

N;Dbh‐iCreT

er Funktio

miR‐340‐3p1

erunterreg

eMYCNSi

eranalysea

on von Neb

inTumoreysebasierenL‐MYCN;Dbherten humaneriertinZu

bekannten

miR‐20a

ensignifika

tvonMYC

Tumoren.V

n im Neur

115undmiR

gulation. W

ignaturber

anhandder

bennieren

envonLSLndaufderEh‐iCreTumoanen Neurobusammenarb

n onkogene

a‐5p, miR

anthöhere

Nreguliert

Verschiede

roblastom

R‐542‐5p67

Weitere miR

ruht,wurd

rmiRNAsd

und Tumo

L‐MYCN;DbhExpressiondorenundfünblastomen abeitmitAnn

en miR‐17‐

R‐20b‐5p,

exprimiert

te80,miR‐1

enebeschri

wie miR‐1

7,116zeigten

RNAs, die

eanhandv

derMYCNS

oren aus LS

h‐iCreMäusdermiRNAsnfnicht‐malals Pfeile80.neleenBeck

‐92 Cluster

miR‐92a

alsinnicht

181azeigte

ebenemiR

103‐3p111,

nauchinLS

im human

Erg

vonPfeilen

Signaturfü

SL‐MYCN;D

sen Zwei‐dsderMYCNlignenNebeExpression

kers.

rs110 (miR‐

‐3p) war

t‐malignen

eeineÜber

RNAsmitpo

miR‐184‐3

SL‐MYCN;D

nen Neurob

gebnisse

55

ndarge‐

ührtezu

Dbh‐iCre

imensio‐Signaturennieren.n: blau =

‐18a‐3p,

ren in

Neben‐

rexpres‐

otentiell

3p112,113,

Dbh‐iCre

blastom

gleich r

15b, m

61580.V

humane

renkei

Neurob

signifik

eineein

4.1.10.2

Die Exp

ebenfal

miR‐19

zu nich

anderen

miR‐19

Abb.25ExpressLSL‐MYC

reguliert w

miR‐30c, m

Verschiede

enNeurobl

neeindeut

blastom re

kantherunt

ndeutigeHo

2 Regulatio

LSL‐MYCN

pression b

lls untersu

9a‐3pundm

ht‐malignen

nMitgliede

9b‐3p)sign

5: Reguliertion (log2)

YCN;Dbh‐iCre

werdenwie

iR‐103, mi

enemiRNAs

lastomvon

tigeRegula

guliert. Zu

terregulier

ochregulat

on von

N;Dbh‐iCre

bekannter

ucht (Abb

miR‐92a‐3p

n Nebenni

erdesClus

ifikanthoc

teMYCNmausgewählteTumorenu

e in Tumor

iR‐140, mi

s,wiezum

nMYCindu

ation.Ande

um Beispie

t(s.4.3),w

tionzeigten

miRNAs

Mausmod

MYCN reg

.25). Eine

pinTumor

eren konn

sters(miR‐

hreguliert

miRNA Targter MYCN hundnicht‐m

ren des LS

iR‐148a, m

Beispieldi

uziertwird1

remiRNAs

el ist die

währendTu

n.

des miR‐

ells

gulierter Ta

e signifika

renvonLS

nte validier

17‐3p,miR

(Datennic

gets in Tumhochregulie

malignenNeb

SL‐MYCN;Db

miR‐326, m

iebekannt

117,zeigtei

swarenen

miR‐137 i

umoredes

‐17‐92 Cl

argets des

ante Hoch

SL‐MYCN;Db

rt werden.

R‐18a‐5p,m

htgezeigt)

moren deserter miRNAbennieren.S

bh‐iCreMo

miR‐491, m

eonkogene

nLSL‐MYC

tgegengese

n humane

LSL‐MYCN

lusters in

miR‐17‐9

regulation

bh‐iCreMä

Weiterhin

miR‐18a‐3p

.

s LSL‐MYCNAs des miRStudent‘st‐te

Erg

odells ware

miR‐500 un

emiR‐9‐5p

CN;Dbh‐iCre

etztzumhu

en Primärt

N;Dbh‐iCre

n Tumore

92 Clusters

von miR

äusenimV

n waren a

p,miR‐20a

N;Dbh‐iCreR‐17‐92 Clutest.

gebnisse

56

enmiR‐

nd miR‐

p,dieim

eTumo‐

umanen

tumoren

Modells

en des

s wurde

R‐17‐5p,

ergleich

auch die

‐5pund

Modellsusters in

4.1.11 m

Eine tu

blastom

Funktio

miRNA

auchim

Es ste

LSL‐MY

herunte

miR‐54

Express

miR‐54

siert.A

in90%

Abb.26TH‐MYCLSL‐MYC(NN).St

Aufgrun

zelllinie

wurde

Zelllinie

miR‐542a

umorsuppr

mzellen gez

onimKolon

imLSL‐MY

mmurinen

ellte sich

YCN;Dbh‐iC

erreguliert

42‐5psonie

sionvonm

42‐5pinzeh

uchindies

(miR‐542‐

6:RegulatioCN DotplotsYCN;Dbh‐iCretudent‘st‐Te

ndderbek

en und ih

deren pote

enweitera

alspotenti

ressive Fun

zeigt word

nkarzinom

YCN;Dbh‐iC

Neuroblast

heraus, d

re Mäusen

t waren. In

edrig,dass

miR‐542‐3p

hnunddie

senTumore

‐5p)bzw.7

onvonmiRs der ExpreundTH‐Mest:***=p<

kanntenRo

rer starke

entiell tum

analysiert(

ielltumorm

nktion der

den68. Auch

mnachgewie

CreModell

tommodell

dass beide

n im Vergl

n 91% der

diesenich

p in55%d

emiR‐542‐

enwarenb

76%(miR‐5

R‐542 inTuession vonYCNTumor<0,001.

ollender Is

en Regulat

morsuppres

(s.4.2).

moduliere

5p‐Isofor

h für miR‐5

esenwerde

sollteAufs

lreguliertw

e Isoform

leich zu ni

r analysier

htdetektier

derTumore

3pExpress

beideIsofo

542‐3p)so

umorende (a) miR‐5renrelativz

soformenv

tion im ne

ssive Funkt

endemiRN

m von mi

542‐3p ko

en69.DieA

schlussdar

wurde.

men der m

icht‐malign

rten Tumo

rtwerdenk

e.Weiterhi

sionin21T

rmensigni

garnichtd

rMausmod542‐5p undurExpressi

vonmiR‐54

euen LSL‐M

tion in hum

NAimNeur

R‐542 ist

nnte eine

nalyseder

rübergeben

miR‐542 i

nen Neben

ore war di

konnte.Die

nwurded

TH‐MYCNT

ifikantheru

etektierbar

delleLSL‐Md der vononnicht‐ma

42 in versc

MYCN;Dbh‐

manenNeu

Erg

roblastom

bereits in

tumorsupp

Expression

n,obdiese

in Tumor

nnieren sig

ie Expressi

esgaltauch

dieExpress

Tumorenr

unterreguli

r(Abb.26)

MYCN;Dbh‐i(b) miR‐54alignerNebe

chiedenen

‐iCre Maus

uroblastom

gebnisse

57

m

Neuro‐

pressive

ndieser

emiRNA

ren aus

gnifikant

ion von

hfürdie

sionvon

e‐analy‐

iertund

).

Creund42‐3p inennieren

Tumor‐

smodell,

men und

D4.2

N

Beide I

vonTu

nieren

konnte.

inhuma

4.2.1 E

Ineiner

profile

Dateng

aufdie

überdi

(Tab.9)

Dietumo

Neurobla

Isoformen

umoren aus

herunterr

.Indiesem

anenprimä

Expressio

rvorherige

von 69 P

generiert67

Regulation

ePatienten

).

orsuppr

astomen

dermiR‐5

s LSL‐MYCN

eguliert ge

mTeilderA

ärenNeuro

nsanalyse

enStudiew

Primärtumo

.ImRahm

ndermiR‐

nalsauchd

ressiveF

nundZe

42wurden

N;Dbh‐iCre

efunden, w

Arbeitsollte

oblastomen

evonmiR‐5

wurdensow

oren huma

endieserA

542Isofor

dasStadium

Funktio

elllinien

n bei der A

eMäusen i

was im TH

edietumo

nundZellli

542undS

wohldiem

aner Neur

Arbeitwur

rmenre‐an

mundden

onvonm

n

Analyse de

mVergleic

H‐MYCN M

rmoduliere

nienunters

urvivinin

miRNAalsa

roblastomp

rdedervor

alysiert.Ge

Verlaufder

miR‐542

ermiRNA E

ch zu nicht

ausmodell

endeFunkt

suchtwerd

humanen

auchdiem

atienten a

rhandeneD

enaueInfor

rErkranku

Erg

2inhum

Expression

t‐malignen

validiert

tiondieser

den.

nPrimärtu

mRNAExpre

anhand vo

Datensatzin

rmationen

ungwarenb

gebnisse

58

manen

nsprofile

Neben‐

werden

rmiRNA

umoren

essions‐

n qPCR

nBezug

sowohl

bekannt

Ergebnisse

59

Tab.9:Zusammensetzungder69NeuroblastompatientendermiRNAundmRNAExpres‐sions‐KohorteModifiziertnachAlthoffetal.67.

AnzahlPatienten 69

Geschlechtmännlich 37weiblich 32

AlterbeiDiagnose<1Jahr 25≥1Jahr 44

Stadium1+2 133+4 384s 18

MYCNAmplifikation

nein 53ja 16

11qWildtyp 36Deletion 16Ungleichgewicht 2

1p36Wildtyp 44Deletion 15Ungleichgewicht 6

17q Zugewinn 13

Verlauf

Rückfall 28Ereignis‐freiesÜberleben 41Tod 20Überleben 49

Ereignis‐freiesÜberleben[Tage]

Median 2283Bereich 456‐4844

Gesamt‐Überleben[Tage]

Median 2260Bereich 456‐4844

Die Expression beidermiR‐542 Isoformenwurde gegen verschiedene bekannte prog‐

nostischeMarkerderKohorteaufgetragen(Abb.27a).SowohlmiR‐542‐5palsauch‐3p

waren inTumorenvonPatienten,die spätereinenRückfall erlitten,herunterreguliert.

WeiterhinkonnteeineKorrelationzwischenniedrigermiR‐542‐5pund‐3pExpression

und hohem Stadium sowie MYCN Amplifikation gezeigt werden. Neuroblastome mit

hoherNTRK1 ExpressionwiesenerhöhteLevelbeidermiR‐542 Isoformenauf.Mittels

Kaplan‐Meier Analyse konnte gezeigtwerden, dass Patientenmit Tumorenmit hoher

miR‐542‐5p bzw. ‐3p Expression eine signifikant höhere Wahrscheinlichkeit eines

Ereignis‐freien Überlebens aufwiesen, als diejenigen mit niedriger Expression der

miRNAs(Abb.27b).

Abb.27Überlebren vonderExpoderohWhitneynis‐freiebzw.‐3p

ZurBes

sionspr

Datensa

fünfNe

über de

(Tab.10

Tab.10Modifizi

7Korrelatiobeninhumn 69 NeurobpressionderhneMYCNAyU‐Test:*=enÜberlebepExpression

stimmungd

rofile,diem

atzerstellt

euroblastom

en Krankh

0).

0: ZusammeiertnachSch

AnzahlPatiStadiumAlterbeiDi[Tage]

MYCNAmpTodaufgrunEreignis‐freÜberleben[

Gesamtübe[Tage]

onvonmiRmanenNeurblastompatir Tumore vomplifikation=p<0,05;*ens (EFS)von.Log‐Rank

derabsolut

mittelsNext

twurden110

menmitgü

heitsverlauf

ensetzunghulteetal.11

ienten

agnose

lifikationndvonErkreies[Tage]

rleben

‐542‐5punoblastomenenten anhanonPatienten(MNA)un**=p<0,01onPatientenTest.

tenmiR‐54

t‐Generatio

0,re‐analys

ünstigemun

f, sowie St

der Patien10.

MedianBereich

rankungMedianBereichMedianBereich

nd‐3pExprnExpressiond vorhandnmit oderdmithoher;***=p<0nmitTumo

42‐5pund

on‐Sequenz

siert.Diese

ndungüns

tadium und

nten der Ne

günstiger51456103‐961neinnein31092856‐37431092856‐374

ressionmitonvonmiR‐5dener qPCRohneRückfroderniedr0,001.(b)Kaorenmithoh

‐3pExpres

zierungine

rDatensat

tigemVerl

dMYCN A

ext‐Generat

rVerlauf

45

45

prognostis542‐5pundDaten67 (Tafall, verschirigerNTRK1aplan‐Meierherodernie

ssionwurd

einemweit

zbestanda

auf.Genau

mplifikatio

tion‐Sequen

ungünstig541045496‐4827jaja261184‐946539207‐1375

Erg

schenMark‐3pinPrimab.9). (a)Viedener Stad1Expressionr‐AnalysedeedrigermiR

enmiRNA

terenvorha

ausProfile

uereInform

on waren b

nzierungs‐K

gerVerlauf

7

5

gebnisse

60

kernundmärtumo‐Vergleichdien,mitn.Mann‐esEreig‐R‐542‐5p

Expres‐

andenen

nvonje

mationen

bekannt

Kohorte

Sowohl

Verlauf

Express

Cluster

absolut

Ergebn

Abb.28NeurobblastomExpressmiR‐542

Da in i

wurde6

qPCRD

niedrig

Scatterp

Tumore

niedrig

lationz

analysi

lmiR‐542‐

fimVerglei

sionfielnie

s,sogarin

tenExpress

is,dassdie

8:Korrelatiblastome Rmenmitgünion des mi2‐5pund‐3p

in silico A

69,sollteein

Daten der 6

gerSurvivin

plots geze

enmithoh

gerExpress

zwischenh

ertanhand

‐5p als auc

ichzuTum

edrigeraus

Neuroblas

sionsleveld

eseetwagle

onvonmiRRe‐Analyse vstigemundR‐17‐92‐Clupäquivalen

Analysen Su

neKorrelat

69Neurob

nExpressio

igt werden

hermiR‐54

siondermi

hoherSurvi

deinerKap

chmiR‐542

morenmitg

salsdieEx

stomenmit

derbeiden

eichhoche

R‐542‐5punvon Next‐Geungünstigeusters undt.

urvivin als

tionzwisch

blastompati

onundhoh

n (Abb.29

42‐3pExpre

iRNA(Abb.

ivinExpres

lan‐Meier‐A

2‐3pwaren

günstigemV

xpressiond

tgünstigem

miR‐542‐I

exprimiertw

nd‐3pExpeneration‐SemVerlauf11beider miR

s potentiel

henmiR‐54

ienten67 un

hermiR‐54

a). Außerd

essionsign

.29b).Wei

ssionunds

Analyse(A

n inNeuro

Verlaufher

dermiRNA

mVerlauf(

Isoformenu

wurden(A

ressionmitequenzierun10 (Tab.10)R‐542‐Isofor

les Ziel fü

42‐3pundS

ntersuchtw

42‐3pExpr

dem war d

nifikantnie

iterhinbest

schlechtere

Abb.29c).

oblastomen

runterregul

sdesonko

(Abb.28a).

untereinan

bb.28b).

tgünstigemngs‐Daten v.(a)Darstermen. (b)Ex

ür miR‐542

Survivinin

werden. Di

ressionkon

die Survivi

edrigerals

tandeines

emÜberleb

Erg

nmit ungü

liert.Ihrea

ogenenmiR

.EinVergle

nderführte

mVerlaufhvon je fünfellungderaxpressionsle

2‐3p vorhe

ndenvorha

ie Korrelat

nnteanhan

in Express

vonTumo

signifikante

benderPa

gebnisse

61

nstigem

absolute

R‐17‐92‐

eichder

ezudem

humanerf Neuro‐bsolutenevel von

ergesagt

andenen

tion von

ndeines

ion von

orenmit

eKorre‐

atienten,

Abb.29derExphandeneniedrigeMeier‐ArigerSu

4.2.2 F

Dieim

LSL‐MY

miRNA

Überpr

humane

Eine fü

mende

BEund

tenmit

normal

mitder

tät übe

Reaktio

zeigten

bilitätü

allerun

9:Korrelatipressionvoner qPCR Daer SurvivinAnalysedesrvivinExpre

Funktionv

Vergleichz

YCN;Dbh‐iC

einetumo

rüfung dies

enNeurobl

ürkeinemi

ermiR‐542

dWACIIex

ttelsdesM

lisiert und

rNegativko

er die Zeit

onen. Währ

n, führtedie

überdieZe

ntersuchten

ionvonmiRnmiR‐542‐3aten67 (TabExpressionEreignis‐freession.Log‐

vonmiR‐5

zumKontr

reModell

orsuppress

ser Hypoth

lastomzelll

iRNAkodie

wurdenin

primiert.D

TTAssayg

gegendie

ontroll‐miR

auf.Die Ex

rend IMR‐

eExpressio

eit.DieExp

nZelllinien

R‐542‐3pu3pundSurvb.9). (a/b)anhand voeiesÜberlebRankTest.

542‐3pExp

rollgewebe

und inhum

iveFunktio

hese wurde

liniendurch

erendeNeg

ndenhuma

Dierelative

gemessen,

Zeit aufge

RNAtransfi

xpression v

32, SK‐N‐B

oninSHEP

pressionde

nimVerglei

undSurvivivivinmRNAKorrelationn Scatter‐ ubensvonNe

pressionin

niedrigeE

manenPrim

onimNeu

en verschie

hgeführt.

gativkontro

anenNeuro

eZellviabili

aufden24

etragen (Ab

ziertwurd

vonmiR‐5

BE undWA

Pzueiner

ermiR‐542

ichzurNeg

in inhumainhumanenn von hoheund Boxploeuroblastom

nZelllinien

Expression

märtumore

roblastom

edene in v

oll‐miRNA

oblastomze

itätwurde

4Std.Wert

bb.30). All

en,wiesen

42‐5p führ

ACII keine

signifikant

2‐3phingeg

gativkontro

nenNeuronNeuroblaser miR‐542‐t. Student‘smpatientenm

n

vonmiR‐5

en ließver

habenkön

vitro Versu

odereined

elllinienIM

zuverschi

tderNegat

e analysier

Steigerung

rte zu Zelll

Reduktion

enVerring

genverring

oll‐miRNAs

Erg

oblastomenstomenanh‐3p Express t‐Test. (c)mithoheru

542‐5pund

rmuten,da

nnte.Zurw

uche in eta

derbeiden

MR‐32,SHEP

iedenenZe

tivkontroll

rtenZelllin

genderZel

linien‐spez

n der Zellv

gerungder

gertedieV

signifikant

gebnisse

62

Analyseandvor‐sion mitKaplan‐

undnied‐

d‐3pim

ssdiese

weiteren

blierten

n Isofor‐

P,SK‐N‐

eitpunk‐

‐miRNA

nien, die

llviabili‐

zifischen

viabilität

Zellvia‐

Viabilität

.

Abb.30miR‐54SHEP,SMessungmiR‐542

Zur gen

durchm

Transfe

Zellena

menmi

exprim

Express

nachTr

lichwie

0: Redukti42‐3pExpreK‐N‐BEundgderZellvi2‐5poder‐3

naueren U

miR‐542‐3p

ektion dur

amstärkst

iR‐542‐3p

ierendenZ

sion vonm

ransfektion

emitmiR‐5

ion der VessionTrandWACIImitabilitätanh3pgegenNK

Untersuchun

pExpressi

rchgeführt,

tenverring

exprimiere

Zelleneine

miR‐542‐5p

nmitNegat

542‐3p(Ab

ViabilitätsienteTranstNegativkonanddesMTKberechnet

ng der Me

onzugrun

da zu die

gertwerden

enderZelle

deutlichve

p zeigten N

tivkontroll

bb.31).

von humsfektionderntroll‐miRNTTAssay.Ananhandeine

echanismen

de liegen,

esem Zeitp

nkonnte.A

nkonnteim

erringerteK

Neuroblasto

‐miRNA,je

manen NeurhumanenNNA(NK),miRngegebenepesPermutat

n, die der

wurdenw

punkt die

Anhandvo

mVergleich

Konfluenz

omzellen e

edochward

uroblastomNeuroblastoR‐542‐5podp‐Wertefürtionstests.

Reduktion

eitereAnal

Viabilität

onmakrosk

hzurNegat

festgestellt

eine gering

derEffekth

Erg

mzelllinienomzellliniendermiR‐542rdieSignifik

n der Zellv

lysen96St

aller analy

kopischen

tivkontroll

twerden.A

gere Konflu

hiernichts

gebnisse

63

mittelsnIMR‐32,2‐3pundkanzvon

viabilität

td.nach

ysierten

Aufnah‐

‐miRNA

Auchbei

uenz als

sodeut‐

Abb.31Mikrosktroll‐miR

Weiterh

untersu

Negativ

subG1‐

Express

Zellen

(G2/M)

inkein

Zellzyk

nienein

IMR‐32

ging. E

werden

1: ReduzierkopischeAuRNA(NK),m

hinwurde

ucht.Währ

vkontroll‐m

Phase,dem

sion von m

in den Zel

)wurdena

erder ana

klus‐Fraktio

nesignifika

2,SHEPund

ine tenden

n.

rte KonfluefnahmenvomiR‐542‐5p

mittelsDu

renddieEx

miRNA zu

mnachmutm

miR‐542‐5p

lzyklus‐Ph

alsBalkend

alysiertenZ

onen.Dahin

anteSteiger

dWACIIZe

nziell verri

enz von NonNeuroblaodermiR‐5

urchflusszyt

xpressionv

einer sign

maßlichap

p aus (Dat

asen Postm

dargestellt

Zelllinien z

ngegenwu

rungderFr

ellenmitei

ngerte G1‐

Neuroblastoastomzellen542‐3p.Maß

tometried

vonmiR‐54

nifikant ges

poptotische

ten nicht g

mitose (G1

(Abb.32).

zueiner sig

urde inalle

raktionvon

nersignifik

‐Phase kon

omzellen n96Std.nach

ßstabsbalken

derZellzykl

42‐3p imV

steigerten

enZellen,f

gezeigt). D

1), Synthes

DieExpres

gnifikanten

enmitmiR

nZellenin

kantenRed

nnte auch

nach miR‐5hTransfektn=200µm.

us96Std.

Vergleichz

Fraktion v

führte,blieb

ie prozent

e (S) und

ssionvonm

nVeränderu

‐542‐3ptr

derS‐Phas

duktionder

in SK‐N‐BE

Erg

542‐3p ExptionmitNeg

nachTran

zurExpress

von Zellen

bdieserEf

tualen Ant

Prämitose

miR‐542‐5p

ungder ei

ransfizierte

sedetektier

rG1‐Phase

E Zellen v

gebnisse

64

pressiongativkon‐

sfektion

sionder

n in der

ffektbei

eile der

/Mitose

pführte

nzelnen

enZellli‐

rt,diein

einher‐

ermutet

Abb.32nachmkontroll(Postmit‐Test:*

Dierela

Isoform

untersu

scher Z

Zellpro

nahm9

währen

erreich

Abb.33nachm(NK),mgemessezuNK,g**=p<

2:VerschiebmiR‐542‐3pl‐miRNA (Ntose), S (Sy*=p<0,05;

ativeAnzah

menimVer

ucht.DieB

Zellen, wäh

liferation,

96Std.nach

nd ein dera

twurde(A

3:InduktionmiR‐542‐3pmiR‐542‐5penmittelsCgemessenan0,01;***=p

bung des ZExpression

NK), miR‐54ynthese) un**=p<0,0

hlapoptoti

rgleichzur

ehandlung

hrend mit

dieanhand

hmiR‐542‐

artiger Effe

Abb.33b).

nvonApopExpressionoder ‐3p. (aCelldeathELnhandvonEp<0,001.

Zellzyklus dn Analyse d42‐5p odernd G2/M (P1.

scherZelle

Negativkon

mitmiR‐5

miR‐542‐5

dderELISA

‐3pExpres

ekt bei Exp

ptoseundRn Analyse 9a)BalkendiLISA.(c)BalELISA‐basier

durch gestdes Zellzyklu‐3p. AnteilPrämitose u

enwurde9

ntroll‐miRN

542‐3pind

5p kein Ef

A‐basierten

sioninalle

pression v

Reduktionv96Std. nachagrammdelkendiagramrterBrdUIn

teigerte S‐Pus 96Std. n der Zellenund Mitose)

96Std.nach

NAanhand

uziertesig

ffekt detek

nBrdUInk

enanalysie

onmiR‐54

vonProliferhTransfektier Zahl apopmmderZahnkorporation

Phase inNenach Transfen in den Ze als Prozen

hExpressio

ddesELISA

nifikantde

ktiert wurd

orporation

rtenZelllin

42‐5p nur i

rationinNeon vonNegptotischer Zlproliferiern.Student‘s

Erg

euroblastofektion vonellzyklus‐Phnt‐Balken. S

onbeiderm

ACelldeath

enAnteilap

de (Abb.33

ngemessen

niensignifi

in SK‐N‐BE

euroblastogativkontrolZellen relativrenderZellet‐Test:*=

gebnisse

65

mzellenNegativ‐hasen G1Student‘s

miR‐542

hAssays

poptoti‐

3a). Die

nwurde,

kantab,

E Zellen

omzellenll‐miRNAv zuNK,enrelativp<0,05;

Ergebnisse

66

4.2.3 RegulationderExpressionvonSurvivindurchmiR‐542‐3p

Die 3’UTR von Survivin weist eine Bindestelle für miR‐542‐3p auf, die schon in der

Adenokarzinomzelllinie A549 und der Brustkrebszelllinie MCF7 validiert wurde69. In

diesemTeilderArbeitsolltedieRegulationvonSurvivindurchmiR‐542‐3pinhumanen

Neuroblastomzellen validiert werden. Dazu wurden Negativkontroll‐miRNA,

miR‐542‐5p oder miR‐542‐3p transient in IMR‐32, SHEP, SK‐N‐BE undWACII Zellen

exprimiertunddieExpressionvonSurvivin96Std.nachTransfektionuntersucht.

DieSurvivinmRNAExpressionvonmiR‐542‐5pbzw.‐3pexprimierendenZellenwurde

relativ zu Negativkontroll‐miRNA exprimierenden aufgetragen. Die Expression von

miR‐542‐3p führte zu einer signifikanten Reduktion von Survivin mRNA in IMR‐32,

SHEPundWACIIZellenundinSK‐N‐BEZellenkonnteeineTendenzzurHerunterregula‐

tionvonSurvivinmRNAgezeigtwerden. ImGegensatzdazuzeigtedieExpressionvon

miR‐542‐5pkeinenEffektaufdieSurvivinExpression(Abb.34a).InWesternBlotAnaly‐

sen wurden zum einen das Protein Survivin und zum anderen der Komplexpartner

AURKB detektiert. Anhand der Ladungskontrolle Aktin konnte eine ungleichmäßige

BeladungderGeleausgeschlossenwerden.SowohldieProteinexpressionvonSurvivin

als auch die von AURKB wurden nach Expression von miR‐542‐3p im Vergleich zur

Negativkontroll‐miRNA deutlich herunterreguliert, während dieser Effekt mit

miR‐542‐5p nicht erreicht wurde (Abb.34b). In Immunfluoreszenzfärbungen wurde

DAPIeingesetzt,umdieZellkernenachBehandlungmitderNegativkontrolleodermiR‐

542‐3p anzufärben. Die Konfluenz der Zellen nach Transfektionmit miR‐542‐3p war

geringeralsnachBehandlungmitderNegativkontroll‐miRNA,einEffekt,der schon in

vorherigen Versuchen (Abb.31) gezeigt werden konnte. Sowohl Survivin als auch

AURKBwurde inallenmitNegativkontroll‐miRNAbehandeltenZellendetektiert.Nach

ExpressionvonmiR‐542‐3pdagegenwardieExpressionbeiderProteinedeutlichver‐

ringert(Abb.34c).

Abb.34pressiomiRNAt‐Test: *nachExzenz‐FäNKoderstabsbal

4.2.4 D

Anhand

gulation

miR‐54

Vektore

Vektore

HEK‐29

mit der

sowohl

DieAkt

als Tra

4:Herunteron (a)Survi(NK), detek*=p<0,05;xpressionvorbung vonrmiR‐542‐3lken=50µm

DirekteBi

dvonLuzif

nvonSurv

42‐3pandi

en enthielt

ensomutie

93undSHE

r Negativk

ldieAktivit

tivitätder

ansfektions

rregulationvinmRNAnktiert mitte **=p<0,0onNK,miR‐Survivin (A3pExpressiom.

indungvon

feraseRepo

ivinnachd

e3’UTRvo

ten die 3’U

ert,dassdi

EPZellenw

kontroll‐mi

tätderSee

Glühwürm

kontrolle e

n von SurvinachmiR‐54els qPCR un01. (b)Wes‐542‐5podelexa‐Fluor‐4on.Zellkern

nmiR‐542

orterAnaly

derExpress

onSurvivin

UTR von Su

evorherge

wurdenmit

RNA oder

feder‐alsa

mchen‐Luzif

exprimiert

ivin in Neu42‐5pundnd normalistern Blot Aer ‐3p.Aktin488 ‐ grün)neimselben

2‐3panSu

ysensollte

sionvonmi

zurückgef

urvivin, je

esagteBind

jeweilsein

miR‐542‐

auchdiede

ferasewur

t wurde, no

uroblastom‐3pExpresssiert gegenAnalyse dernalsLadunundAURKnFeldmitte

rvivin3‘UT

untersucht

iR‐542‐3p

führtwerde

doch war

destelleder

nemderbe

3p kotrans

erGlühwür

rdeaufdie

ormalisiert

mzellen nacsion relativGAPDH ExProteine Sugskontrolle

KB (Alexa‐FluelsDAPI(bla

TR

twerden,o

aufeinedir

enkonnte.

diese auf

rmiR‐542‐

idenVekto

sfiziert. Na

rmchen‐Luz

derSeefed

t. Die norm

Erg

chmiR‐542zuNegativkxpression. Survivin und.(c) Immunuor‐568 ‐ rau)angefär

obdieHeru

rekteBind

BeidePsi‐

einem der

3pzerstört

orenunden

ach 48Std

ziferasege

der‐Luzifer

mierte Glüh

gebnisse

67

2‐3p Ex‐kontroll‐Student‘sd AURKBnfluores‐rot) nachrbt.Maß‐

unterre‐

ungvon

Check2‐

r beiden

tvorlag.

ntweder

. wurde

messen.

rase,die

hwürm‐

chen‐Lu

relativ

Reporte

Reporte

kantre

mutiert

3pand

Abb.35undSHEtyp‐ odechen‐LuStudent

4.2.5 F

Einedir

deneH

sollte u

Neurob

gen mi

Zellenw

gegenS

siSurviv

Wester

express

siRNAh

uziferase‐A

zur Aktivi

ergen‐Aktiv

ergen‐Aktiv

eduziert.Im

tenBindest

die3’UTRv

5:DirekteBEPZellenener mutierteuziferase‐Akt‘st‐Test:**

Funktionv

rekteBind

Herunterreg

untersucht

blastomzell

t sich brin

wurdenen

Survivin(s

vin wurde

rnBlotanal

sionvonSu

herunterre

Aktivität,di

ität nach

vität).Sow

vitätbeiK

mGegensat

tellenichtg

onSurvivin

Bindungvontwedermiten Survivinktivitätnach=p<0,01;*

vonSurviv

ungvonm

gulationvo

werden, o

llinienIMR

ngen würd

twedermit

iSurvivin)

die Expre

lysiert,wob

urvivin, als

guliertwer

iebeiExpr

Negativkon

wohl inHEK

Kotransfekt

tzdazu,kon

gezeigtwer

nkonnteda

onmiR‐542tNegativkon3’UTR trageh48Std.und***=p<0,0

vinHerunt

iR‐542‐3p

onSurvivin

ob eine He

R‐32,SHEP,

e, die dene

teinerNeg

transient t

ession des

beiGAPDH

sauchdie

rden(Abb.

ressionvon

ntroll‐miRN

K‐293alsa

tionmit de

nntediese

rden(Abb.

amitvalidie

2‐3panSurntroll‐miRNenden LuzifdNormalisi001.

terregulat

andas3’U

nmRNAun

erunterreg

,SK‐N‐BEu

en der miR

gativkontro

transfiziert

Proteins

HalsLadun

desKomp

36).

nmiR‐542‐

NA Transfe

auch inSHE

emWildtyp

rEffektbe

35).Diedi

ertwerden

rvivin3‘UTNA(NK)odeferase Repoerunggegen

tioninZell

UTRvonSu

ndProtein

ulation vo

undWACII

R‐542‐3p E

oll‐siRNAo

t.ZurÜber

48Std. na

ngskontroll

lexpartner

‐3pberech

ektion aufg

EPZellenw

p3’UTRvo

iderKotra

irekteBind

.

RKotransfeermiR‐542‐3orter. MessunSeefeder‐L

llinien

rvivinund

konntegez

n Survivin

phänotypi

Expression

dereiners

rprüfungde

ch der Tra

ediente.So

sAURKBk

Erg

hnetwurde

fgetragen (

wurdedie

on Survivin

ansfektion

dungvonm

ektionvonH3pundeineung der GlüLuziferase‐A

diedamit

zeigtwerd

n in den hu

ischeVerän

n entspräch

spezifische

erEffektiv

ansfektion

owohldieP

konntemit

gebnisse

68

e,wurde

(relative

relative

n signifi‐

mitder

miR‐542‐

HEK‐293emWild‐ühwürm‐Aktivität.

verbun‐

en.Nun

umanen

nderun‐

hen. Die

nsiRNA

vitätvon

mittels

Protein‐

ttelsder

Abb.36von SusiRNA WExpressAURKBTransfekzellliniesiRNAsiRNAgGAPDH

Die Via

wurde

Negativ

aufwies

beider

nienals

Abb.37regulat(NK)odvivingeDieTra

troll‐siR

Apopto

Phasen

6: Spezifiscurvivin PrWestern Bloion von48Std. naktion vonn mit Ne(NK) ode

gegenSurvivalsLadungs

abilität der

mittels MT

vkontroll‐si

sen,zeigten

Datensätze

ssignifikan

7: ReduktioionvonSudersiRNAgegenNKbere

ansfektion

RNAzuein

osehinwies

n G1, S und

che Reduktrotein mittot AnalyseSurvivin uach transienNeuroblastoegativ‐kontrr spezifiscvin(siSurvivskontrolle.

r Zellen na

TT Assay

iRNA trans

ndiemits

ebeschrieb

ntverschied

on der ViaurvivinMTTegenSurviviechnetanha

von siSurv

nemsignifik

s(Datenni

d G2/M (A

tiontelsderundnterom‐roll‐chervin).

ch Transfe

untersucht

sfizierte Ze

siSurvivinb

bdenVerla

den(Abb.3

abilität huTAssaynachin(siSurviviandeinesPe

vivin führte

kantenAns

chtgezeigt

Abb.38) so

ektionmit

t und gege

ellen einen

behandelte

aufderGra

37).

umaner Nehtransientein).Angegebermutations

e imVergl

stiegdersu

t).Weiterh

owohl in IM

Negativko

en die Zeit

n Anstieg i

enZellenei

apheninne

euroblastomerTransfekbenep‐WertestsPermu

eich zurTr

ubG1Phas

hinkonnte

MR‐32 und

ntroll‐siRN

t aufgetrag

hrer Viabil

ineRedukt

rhalbdera

mzelllinientionmitNetefürdieSiutationstest.

ransfektion

e,dieaufe

beiVerglei

d SHEP als

Erg

NA bzw. siS

gen. Währe

lität über

tion.DerV

analysierte

durch Heegativkontroignifikanzvo.

n vonNega

eineIndukt

ichderZel

s auch in S

gebnisse

69

Survivin

end mit

die Zeit

ergleich

enZellli‐

erunter‐oll‐siRNAonsiSur‐

ativkon‐

tionvon

llzyklus‐

SK‐N‐BE

Zellene

Phase d

SHEPu

Phase.

Abb.38Neurobverschietransien(siSurvi

Der Eff

siRNA

analysi

signifik

einesignifi

detektiert

undWACIIZ

8: Verschieblastomzelledenen Phanter Transfvin).Studen

fekt auf di

wure anh

erten Zell

kanterRedu

ikanteStei

werden. W

Zellenreag

ebung desen nachHasen des Zfektion vonnt’st‐Test:*

ie Zellproli

hand der

llinien rea

uktionder

gerungder

WACII Zelle

giertenauß

s ZellzykluerunterregZellzyklus. An Negativk=p<0,05;

iferation n

ELISA‐bas

agierten a

Zellprolifer

rS‐Phasem

en zeigten

ßerdemmit

us durchgulation voAnalyse mkontroll‐siR***=p<0,0

nach siSurv

sierten Brd

auf die H

ration(Abb

AbhuHeInTr(NSt**

miteinherg

n eine Ten

teinemsign

gesteigerton Survivinittels DurcNA (NK)001.

vivin im V

dU‐Inkorpo

Herunterreg

b.39).

bb.39: Reumaner NeerunterregnkorporationransfektionNK)odersiRtudent‘s t‐T**=p<0,00

gehenderR

denz zur e

nifikantenA

te S‐ bzw Fraktionenhflusszytomoder siRN

ergleich zu

oration er

gulation v

eduktioneuroblastomgulation von von Ze

mit NeRNAgegenSTest: *=p<1.

Erg

Reduktion

erhöhten S

Anstiegde

w. G2/M‐Phn von Zellenmetrie 96StNA gegen

u Negativk

rmittelt. A

von Surviv

der Prolimzelllinienon Survivinellen 96Stdegativkontrourvivin(siS<0,05; **=

gebnisse

70

derG1‐

S‐Phase.

rG2/M‐

hase inn in dentd. nachSurvivin

kontroll‐

lle vier

vin mit

ferationn durchn BrdU‐d. nacholl‐siRNAurvivin).p<0,01;

4.2.6 P

m

DieHer

Neurob

Prolifer

Herunt

Zusamm

Herunt

miR‐54

Einzelz

Konstru

(SHEP‐

induzie

24Std.

ten un

(Abb.4

Gesamt

wurde.

ternBlo

Abb.40SurvivinBlot AnTetrazykhandluneinemmitGFP(SHEP‐S

Diegen

mitTet

tivkont

wurde

einer s

Tetrazy

Dieglei

Partielle

mittelsHo

runterregu

blastomzell

ration.Dies

erregulatio

menhangz

erregulatio

42‐3penthi

zellklone se

ukt,jedoch

GFP). Die

ert werden

nachTetra

d zum SH

0).Aufgrun

tproteinme

Innicht‐in

ots(Abb.3

0: Survivinn nach Indnalyse derklin‐ (TET)ng von stabTetrazyklinP (SHEP‐GFPSurvivin).

neriertenZ

trazyklino

troll‐miRNA

dieZellviab

signifikant

yklin behan

ichzeitigeE

Wiederhe

ochregulat

ulationvon

llinien zu

serPhänoty

on von Sur

zwischend

on bestand

ielt,stabilm

elektiert (

hmiteiner

Expression

n. MittelsW

azyklin‐Beh

HEP‐GFP‐Kl

ndderhoh

enge gearb

nduzierten

4undAbb.

n ÜberexduktionmitSurvivin Ex bzw. Lösubil‐transfizien‐ induzierbP)oderSurv

ZellkloneSH

oderdemL

Aodermit

bilitätaller

reduzierte

ndelt oder

Expression

erstellung

tionvonSu

Survivinm

erhöhter

ypähnelte

rvivin einh

emPhänot

d. Dazu w

mittelseine

SHEP‐Surv

cDNAfürG

n beider cD

Western Blo

handlungin

lon ermitt

henIndukti

beitet wer

SHEP‐Zell

36)nurei

xpressiont Tetrazyklxpression 2ungsmittel‐erten SHEPbaren Vektvivin cDNA

HEP‐GFPu

Lösungsmit

tmiR‐542‐

rAnsätzeb

en Zellviab

nicht, und

derSurviv

des Phän

urvivinoh

mittelssiRN

Apoptose

demderE

herging. Es

typdermi

wurde Surv

esVektorsy

vivin). Ein

GFPstattS

DNAs konn

ot wurde d

nSHEP‐Su

telt, wobei

onvonSur

rden, die

enwardes

inegeringe

in SHEPlinWestern24Std. nach(EtOH) BeP‐Zellen mitorkonstrukohne3’UTR

undSHEP‐S

ttelEthano

3p transien

estimmt.D

bilität des

d des unbe

vincDNAoh

notyps de

hnemiRNA

NAführtei

und ver

Expression

sollte nun

R‐542‐3pE

vivin cDNA

ystemsinS

Negativkon

Survivintru

nte durch

die Indukt

rvivinimV

GAPDH a

rvivinkonn

in vorher

shalb imV

SurvivinE

‐nh‐ttR

Survivinwu

olbehandel

nt transfizi

DieExpress

SHEP‐GFP

handelten

hneBindes

er miR‐54

A‐Bindeste

ndenanal

ringerter

vonmiR‐5

n untersuch

Expression

A, die kein

SHEPZelle

ntroll‐Klon

ug,wurdee

Behandlun

ion der Su

Vergleichzu

als Ladung

ntenurmit

igen Versu

Vergleichzu

Expression

urdenüber

ltundgleic

iert.Mittel

ionvonmi

P‐Klons, un

SHEP‐Surv

tellefürdie

Erg

42‐3p Exp

elle

lysiertenhu

Zellviabilit

42‐3p,der

ht werden

nundderS

ne Bindest

eneingebra

n, der das

ebenfallsge

ng mit Tetr

urvivin Exp

umnicht‐in

gskontrolle

teinemFün

uchen ver

uvorherige

detektierb

r96Std.en

chzeitigm

lsdesMTT

iR‐542‐3pg

nabhängig

vivin‐Klons

emiRNAu

gebnisse

71

ression

umanen

tät und

mitder

, ob ein

Survivin

telle für

achtund

gleiche

eneriert

razyklin

pression

nduzier‐

e diente

nftelder

rwendet

enWes‐

ar.

ntweder

itNega‐

TAssays

gingmit

ob mit

einher.

ndmiR‐

542‐3p

ringerte

4.2.7 M

N

Zusätzl

blastom

diealsX

einems

kel als

sphäris

Potenti

keine s

geladen

p führte zw

enZellviab

MiR‐542‐3

Neuroblas

ich zumN

mzelllinien

Xenografts

sofortigen

Transpor

schundha

ial betrug

strukturelle

nenNanopa

war imVerg

bilität,jedoc

3p belad

stomzellen

achweis de

in vitro, so

inMäusen

Abbauder

ter verwe

atten einen

+37mV.

en Untersc

artikelnfes

gleich zur

chwardies

dene Na

ninvitrou

er tumorsu

ollte diese

ninvivowu

selbenführ

ndet84,85. D

mittleren

Anhand e

chiede zwis

stgestelltw

Negativkon

serEffektn

anopartike

undinvivo

uppressive

auch inN

uchsen.Da

renwürde

Die versch

Durchmes

elektronenm

schen Neg

werden(Ab

ANA(t

ntroll‐miRN

nichtsignifi

Abb.4lungmittelvin ohMTT Avonoder mTetraztel‐ (EZellentor‐kooderSBindesdent‘s***=p

el zur

nFunktion

euroblasto

dieInjektio

,wurdenC

hieden bela

sser vonw

mikroskopi

gativkontro

b.42).

Abb.42:StrNanopartikAufnahmen(NK)undmtikeln.Graph

NA zu eine

ikant(Abb.

41: Partielldes miR‐5lsÜberexprhne miR‐5Assay 96 StNegativkonmiR‐542‐3pzyklin‐ (TETEtOH) Behamit einemnstrukt miSurvivincDNstelle (SH

t‐Tesp<0,001.

miRNA‐Be

nvonmiR‐

omzellen un

onvonmiR

Calcium‐Pho

adenen Na

weniger als

ischer Auf

ll‐miRNA‐

rukturvonkelnElektrovon Nega

iR‐542‐3p‐bhikerstelltv

Erg

er tendenz

.41).

le Wiederh542‐3p Phressionvo542‐3p Bintd. nach Exntroll‐miRNAp und gleichT)bzw. Lösuandlung voninduzierbait GFP (SHNAohnemiRHEP‐Survivinst: *=

ehandlung

‐542‐3p in

ntersuchtw

RNAindieM

osphat‐Nan

anopartikel

200nm. Ih

fnahmen k

und miR‐

miRNA‐beonenmikroskativkontrollbeladenenNvonDianaK

gebnisse

72

iell ver‐

her‐stel‐änotypsnSurvi‐ndestellexpressionA (NK)hzeitigerungsmit‐n SHEP‐renVek‐HEP‐GFP)R‐542‐3pn). Stu‐p<0,05;

g von

nNeuro‐

werden,

Mauszu

noparti‐

l waren

hr Zeta‐

konnten

542‐3p‐

ladenenkopische‐miRNA‐Nanopar‐Kozlova.

Ergebnisse

73

Zur Untersuchung der Funktionalität der Nanopartikel in vitro wurden WACII Zellen

ausgewählt,dadieseindenvorherigentransientenTransfektionenamstärkstenaufdie

Expression der miR‐542‐3p reagiert hatten. Die Zellen wurden mit Negativkontroll‐

miRNA‐ oder miR‐542‐3p‐beladenen Nanopartikeln behandelt und der Effekt auf die

Zellen inverschiedenenAssaysuntersucht.DierelativeZellviabilität,gemessenmittels

MTTAssay,wurdeanverschiedenenZeitpunktendetektiert,aufden24Std.Wertunbe‐

handelterZellennormalisiertundgegendieZeitaufgetragen.DieBehandlungmitNega‐

tivkontroll‐miRNA beladenen Nanopartikeln führte im Vergleich zu unbehandelten

Zellen tendenziell zu einer Reduktion der Zellviabilität über die Zeit, die jedoch nicht

signifikantwar.WährenddessenverringertedieBehandlungmitmiR‐542‐3p‐beladenen

NanopartikelndieViabilitätderZellensignifikant,sowohlimVergleichzuunbehandel‐

tenalsauchzumitNegativkontroll‐miRNAbeladenenNanopartikelnbehandeltenZellen

(Abb.43a). Der Anteil apoptotischer Zellen wurde 96Std. nach Behandlung mit den

verschieden beladenen Nanopartikeln anhand des ELISA Cell deathAssay untersucht.

WieschonbeiderAnalysederZellviabilitätwurdeauchindiesemAssayeintendenziel‐

ler Effekt der mit Negativkontroll‐miRNA beladenen Nanopartikel beobachtet, der

jedoch nicht das Signifikanzniveau erreichte. Dagegen reagierten die Zellen bei Be‐

handlungmitmiR‐542‐3p beladenen Nanopartikelnmit einer signifikanten Induktion

vonApoptose,sowohlimVergleichzuunbehandeltenZellenalsauchzumitNegativkon‐

troll‐miRNA behandelten Zellen (Abb.43b). Die Abnahme der BrdU Inkorporation bei

mitmiR‐542‐3p‐beladenenNanopartikelnwarimVergleichzuallenKontrollensignifi‐

kantvermindert.AllerdingszeigtendiemitNegativkontroll‐miRNAbeladenenNanopar‐

tikelbereitseinesignifikantverminderteBrdUInkorporationimVergleichzuunbehan‐

delten Zellen (Abb.43c). Die Funktionalität der miR‐542‐3p Expression nach

BehandlungmitmiR‐542‐3p‐beladenenNanopartikeln inWACII Zellenwurde anhand

derExpressiondesZielproteins Survivin analysiert. EineWesternBlotAnalyse zeigte,

dass dieBehandlungmitmiR‐542‐3p‐beladenenNanopartikeln imVergleich zu unbe‐

handelten und mit Negativkontroll‐miRNA behandelten Zellen zu einer deutlichen

HerunterregulationderSurvivinProteinexpressionführte(Abb.43d).DieSpezifitätder

miR‐542‐3p Expression durch Behandlung mit miR‐542‐3p‐beladenen Nanopartikeln

invitrokonntesomitbewiesenwerden.

Abb.43HerunteZellenNanopaanhandgrammgemessedelten KELISA‐bSurvivin

ZurUnt

Xenogr

Negativ

und die

mittels

miR‐54

behand

t‐Test:

relativ

gen. Im

more i

signifik

542‐3p

InWes

3:Reduktioerregulatioin vitro Bertikeln.(a)desMTT Ades zur unenanhanddKontrolle rebasierter Brnnach48St

tersuchung

afts in nu/

vkontroll‐m

e Leber so

qPCR gem

42‐3p‐beha

deltereine

p=0,006;

zu der Exp

mMittelwa

im Verglei

kanterhöht

pwurdeanh

tern Blot A

onderZellvon von Surehandlung mZellviabilitäAssay. SignifnbehandeltendesELISACelativen AntdU Inkorpotd.*=p<0,0

gdesEffekt

/nuMäuse

miRNA‐ als

owie die T

messen un

andelter Le

200‐fache

Datennich

pression e

ardiemiR‐

ch zu mit

t(Abb.44a

handdesE

Analysen k

viabilitätunrvivinmittemit Negativätrelativzufikanz berecn KontrolleCelldeath.Stteil proliferoration. Stud05;**=p<0

tsdersynt

nwuchsen

auchmit

Tumore ana

nd gegen d

eber konnt

erhöhteExp

ht gezeigt)

ines derm

‐542‐3pEx

t Negativko

).DieFunk

Einflussesa

konnte eine

ndderProelsmiR‐54vkontroll‐miu24Std.Wechnet anhane relativen Atudent‘st‐Terierender Zedent‘s t‐Tes0,01;***=p

thetisierten

n,wurden

miR‐542‐3

alysiert. D

die Expres

te im Verg

pressionde

.DiemiR‐

mit Negativ

xpressiond

ontroll‐miR

ktionalität

aufdieExp

e reduziert

oliferation,2‐3p‐beladiRNA‐ (NK)ertderunbend eines PeAnteils apopest.(c)Balkellen nach 9st. (c) Westp<0,001.

nNanopart

Xenograft‐

3p‐beladen

ie Express

sion von R

gleich zu

ermiRNAd

542‐3pEx

vkontroll‐m

dermitdie

RNA behan

derinden

ressiondes

te Express

InduktiondenenNano oder miR‐ehandeltenKermutationsptotischer Zkendiagramm96 Std., gemtern Blot An

tikelaufWA

‐tragendeM

nen Nanopa

sion von m

RNU6B no

mit Negati

detektiertw

pressiond

miRNA beha

esermiRNA

ndelten Tu

Tumorene

sTargetsS

ion des Su

Erg

vonApoptopartikel in‐542‐3p‐ beKontrolle,gtest. (b)BaZellen nachmdeszurumessen anhnalyse des

ACIIZellen

Mäuse sow

artikeln be

miR‐542‐3p

ormalisiert.

ivkontroll‐

werden(St

derTumore

andelten a

Abehandel

umoren 25

exprimiert

Survivinge

urvivin Pro

gebnisse

74

toseundnWACIIeladenenemessenalkendia‐96 Std.,

unbehan‐hand vonProteins

n,dieals

wohlmit

ehandelt

p wurde

. In mit

miRNA‐

tudent‘s

ewurde

ufgetra‐

ltenTu‐

5,8‐fach,

tenmiR‐

messen.

oteins in

mit mi

Ladung

Abb.44miRNA‐miR‐542behandeWesterntrolle.

Die tum

scher S

Tumore

spezifis

(Abb.4

Schnitt

wiesen

miRNA

derapo

rer Ant

miRNA

Zellen w

Tumors

relativ

tragen.

Negativ

Anteila

(Abb.4

R‐542‐3p‐b

gskontrolle

4: Expressi‐beladenen2‐3p in miteltenNeuronBlotAnaly

morsuppre

Schnitte de

en analysi

schen klei

5a).Weite

enangefär

wesentlich

behandelt

optotischen

teil apopto

behandelt

wurde rela

sausgezäh

zudenenv

Die Zellpr

vkontroll‐m

apoptotisch

5c).

beladenen

dienteGAP

ion von mn Nanopart Negativkooblastom‐XeysevonSur

ssive Wirk

er mit Neg

ert. Eine H

n‐, blau‐

rhinwurde

bt.Diemit

hweniger

ten.Mittels

nZellengef

otischer Ze

twurden.

ativ zur Ge

hlt.DieMitt

vonTumore

roliferation

miRNA‐beh

herZellenw

Nanoparti

PDH(Abb.

miR‐542‐3prtikeln inntroll‐miRNnograftsanrvivinProtei

kung der m

gativkontro

Hämatoxyl

und rund

eMib‐1,ein

miR‐542‐3

aktiv‐proli

sderFärbu

färbt.Inmi

ellen detek

Der Anteil

esamtzellza

telwertede

en,diemit

n der miR‐

andelten s

warindies

ikeln beha

44b).

p und HerWACII‐Xe

NA‐ (NK) odnhandvonqin indengl

miR‐542‐3p

oll‐miRNA

lin‐Eosin‐F

dzelligen T

nMarkerf

3p‐beladen

iferierende

ungvonge

iR‐542‐3p

ktiert, als

derMib‐1

ahl von dr

ermitmiR‐

tNegativko

‐542‐3p‐be

signifikant

senTumore

ndelten Tu

runterregulenograftsder miR‐54PCR‐Daten.leichenTum

p Expressi

und der m

ärbung off

Tumore1, d

füraktiv‐pr

nenNanopa

eZellenauf

espaltener

behandelte

in Tumore

1 bzw. gesp

rei repräse

‐542‐3p‐be

ontroll‐miR

ehandelten

um 85%

ensignifika

umoren ge

lation voninvivo (a)2‐3p‐beladeStudent‘st‐

moren.GAPD

on wurde

mit miR‐54

fenbarte d

die den X

roliferieren

artikel‐beha

falsdiemi

Caspase3

enTumore

en, die mit

paltene Ca

entativen A

ehandelten

RNAbehand

Tumore w

% reduziert

antumden

Erg

ezeigt werd

n Survivina) Expressienen Nanop‐Test:p=0,DHalsLadu

anhand hi

42‐3p‐beha

die Neurob

Xenograft b

ndeZellen,

andeltenT

itNegativk

wurdede

nwurdeei

t Negativk

aspase 3 ge

Ausschnitte

nTumoren

deltwurden

war relativ

t (Abb.45

nFaktor2,9

gebnisse

75

den. Als

mittelsion vonpartikeln,008.(b)ungskon‐

istologi‐

andelten

blastom‐

bildeten

aufden

umoren

kontroll‐

erAnteil

inhöhe‐

kontroll‐

efärbten

en jedes

wurden

n,aufge‐

zu den

b). Der

9erhöht

Abb.45mierenEosingescheZelnenNanvonMibrenreladreirep*=p<0

5:HemmundenNeuroefärbtenundllen)gefärbtnopartikeln‐b‐1undApoativzumitNpräsentative0,05.

ngderProlblastom‐XedMib‐1(aktenSchnitte‐behandelteoptoseanhanNegativkontrenAusschnit

iferationuenografts(aktiv‐proliferiendermitNenNeuroblandvongesproll‐miRNAttenrelativ

und Induktia) JezweirierendeZellNegativkontastom‐XenogpaltenerCas(NK)behanzurGesamt

ionvonAprepräsentatilen)sowiegroll‐miRNA‐grafts. (b/c)spase3inmndelten.Kaltzellzahljed

poptose inmiveBildervogespalteneC‐(NK)undm)MittlerePmiR‐542‐3p‐kulationdudesXenograf

Erg

miR‐542‐3vonHämatoxCaspase3(amiR‐542‐3pProliferation‐behandelteurchAuszähfts.Student

gebnisse

76

p‐expri‐xilinundapoptoti‐p‐belade‐nanhandnTumo‐lungvon‘st‐Test:

D4.3

N

4.3.1 K

KDM1A

chunge

Retinob

DieReg

Tumore

Tumore

Express

sieben

Express

Aufgrun

nach m

aufweis

KDM1A

KDM1A

Dietumo

Neurobla

KDM1Aal

A ist in un

nkonnte a

blastomen

gulationdie

endesLSL‐

e zeigten i

sionvonK

TH‐MYCN

sionaufwie

ndderpot

miRNAs ges

sen. Für m

A vorherges

AlagdieseB

orsuppr

astomen

spotentie

ndifferenzie

außerdem

gezeigt we

esespotent

‐MYCN;Dbh

mVergleic

Kdm1a.Zur

Tumoren

esen(Abb.

tentiell onk

sucht, für

miR‐137 w

sagt (www

Bindestelle

ressiveF

nundZe

ellesZielei

erten Neur

eineHoch

erden (Pro

tielltherap

h‐iCreMaus

ch zu nicht

Validierun

untersuch

46).

kogenenAk

die 3’UTR

wurde ein p

w.Targetsca

ezwischen

Funktio

elllinien

inerNeuro

roblastome

regulation

of. Dr. Joha

peutischrel

smodellsu

t‐malignen

ngdiesesR

ht, die ebe

ktivitätvon

von huma

passende

an.org). Inn

denPositio

onvonm

n

oblastomt

en hochreg

inaggress

annes Schu

levantenTa

untersucht.

n Nebennie

Resultatsw

nfalls eine

Abb.46:Rin LSL‐MYTumorenExpressionTH‐MYCNTnicht‐maligdent’st‐Tes

nKDM1Aw

anem KDM

Bindestelle

nerhalb de

onen65un

miR‐137

herapie

uliert. In w

sivenMedu

ulte, persön

argetswurd

ren eine s

wurdedieE

e signifikan

Regulation vYCN;Dbh‐iCrBoxplot din LSL‐M

Tumorenrelgner Nebenst:***=p<

wurden in

M1A eine d

e (7mer‐m

er 327bp l

nd71(Abb.

Erg

7inhum

weiteren U

ulloblastom

nliche Mitt

dedeshalb

ignifikant

Expression

nt erhöhte

vonKdm1are und Tder Kdm1aMYCN;Dbh‐iClativzurExnnieren (N0,001.

in silico A

direkte Bin

m8) an 3’U

langen 3’U

47).

gebnisse

77

manen

Untersu‐

menund

teilung).

bauchin

erhöhte

auchin

Kdm1a

amRNATH‐MYCNa mRNACre undpressionN). Stu‐

Analysen

ndestelle

UTR von

UTR von

Abb.47vorhergPos.=PIn ver

Lungen

Funktio

DieExp

analysi

renvon

dieHyp

werden

vorherg

vorherg

Abb.48LSL‐MYder ELSL‐MYCgleich zNebenn***=p<

Imfolg

vonmi

suchtw

7: 3’UTR vogesagten Biosition.Mod

rschiedenen

ntumoren12

ondieserm

pressionvo

ert,wobei

nWildtyp‐M

potheseein

n. Dies kön

gesagtenT

gesagtwird

8: RegulatioYCN;Dbh‐iCrxpression

YCN;Dbh‐iCrezur Expressieren (NN<0,001.

endenTeil

R‐137alsa

werden.

on KDM1Andestelle vdifiziertnac

n humane

21, Melano

miRNAbere

onmiR‐13

sichherau

Mäusenhoc

nertumors

nnte darin

TargetKDM

d(www.tar

on von mre Tumorevon miR

e Tumorenion in nichtN). Student

ldieserArb

auchdaso

mit Bindevon miR‐13hAlthoffet

en Tumor

mzellen122

eitsbekann

7wurdea

usstellte,da

chreguliert

uppressive

n begründe

M1A immu

rgetscan.or

iR‐137 inn BoxplotR‐137 inn im Ver‐t‐malignent’s t‐Test:

beitsolltes

onkogeneT

estelle von37 innerhalal.118.

rentitäten

und Bru

nt.

uch inTum

asssieinde

twar(Abb.

enFunktion

et liegen, d

urinenOrga

rg).

sowohldie

TargetKDM

n miR‐137lb der 3’UT

wie dem

stkrebs123

morenaus

enTumore

.48).Immu

nvonmiR‐

dass dem

anismuske

epotentiell

M1A imhu

SchematiscTR von KD

m Kolorek

ist eine

LSL‐MYCN

enimVergl

urinenNeu

‐137demna

im human

eineBindes

ltumorsup

manenNeu

Erg

ches DiagraDM1A (Targ

ktalkarzino

tumorsupp

N;Dbh‐iCre

leichzuNe

uroblastom

achnichtb

nen Neuro

stelle fürm

ppressiveF

uroblastom

gebnisse

78

amm dergetscan).

m119,120,

pressive

Mäusen

ebennie‐

mkonnte

bestätigt

blastom

miR‐137

Funktion

munter‐

4.3.2 E

Wie sch

Neurob

In Bezu

miR‐13

miRNA

denzfü

Die Exp

(Abb.4

Express

freien‐

Abb.49ÜberlebNeuroblsionvonhoher o***=p<des GesExpress

Expressio

hon für m

blastompat

ug auf ver

37Expressi

signifikan

ürdieHeru

pression v

9a). Mitte

sionfürdie

alsauchde

9: Korrelatben inhumlastompatienPatientenoder niedrig<0,001;n.s.samtüberlebion.Wilcoxo

nsanalyse

miR‐542 du

ienten67(T

rschiedene

ion aufgetr

tmitgüns

unterregula

von NTRK1

ls Kaplan‐

ePatienten

esGesamtü

tion der ExmanenPrimntenanhanverschiedeger NTRK1=nichtsign

bens (OS) von‐Test.Mo

evonmiR‐1

urchgeführt

Tab.9)auch

prognosti

ragenwurd

tigemStad

ationvonm

1 korrelier

‐Meier‐Ana

nsowohlm

überlebens

xpressionmärtumorenndvorhandenerStadiumExpressionnifikant.(b)on Patientedifiziertnac

137inhum

t, wurde in

hdieExpre

ische Mark

de, zeigte s

diumeinhe

miR‐137in

rte signifik

alysen wur

miteinerhö

einherging

von miR‐1n ExpressioenerqPCRDm,mitoderals Balken)Kaplan‐Meen mit TumchAlthoffet

manenPri

n den vorh

essionvonm

ker des Ne

sich, dass

erging.Auß

MYCN‐am

kant mit de

rde gezeig

herenWah

g(Abb.49b

137 mit pon vonmiR‐Daten67 (TabohneMYCNdiagramm.eier‐Analysemoren mit htal.118.

märtumor

handen qP

miR‐137un

euroblastom

einehohe

ßerdemste

plifizierten

er Express

t, dass ein

hrscheinlich

b).

rognostisch‐137 in Primb.9).(a)VeNAmplifikatStudent‘s t‐edesEreignoher gegen

Erg

ren

PCR Daten

ntersucht.

ms, gegen

Expression

elltesichei

nTumoren

sion von m

ne hohe m

hkeitdesE

hen Markemärtumorenergleichdertion(MNA)t‐Test.: **=nis‐freien‐(En niedriger

gebnisse

79

von 69

die die

n dieser

ineTen‐

heraus.

miR‐137

miR‐137

Ereignis‐

ern undn von69rExpres‐undmitp<0,01;EFS)undmiR‐137

Die Re

(Tab.10

günstig

geführt

Die Exp

undfiel

miR‐92

4.3.3 F

Diehoh

ologie u

Theses

den.

Wiesch

einerfü

transfiz

MTTAs

bilitätw

die Exp

Zellenm

e‐Analyse

0), indem

gemundun

twurde,so

pression vo

lsignifikan

2a(p<0,00

Funktionv

heExpressi

unterstützt

solltemitte

honfürmiR

ürkeinemi

ziertundd

ssayunters

wurdegege

pression vo

miteinersi

des vor

dieabsolu

ngünstigem

llteauchfü

onmiR‐13

ntniedriger

01;Abb.50)

vonmiR‐1

ionvonmi

te die Thes

els invitro

R‐542wur

iRNAkodie

dieZellviab

sucht.Dier

endieZeit

on miR‐13

ignifikante

handenen

utenExpres

mVerlaufu

ürmiR‐137

7 korrelier

rausalsdi

).

137inZelll

R‐137inh

se einer tu

Studien in

rdendiehu

erendenNe

ilitätanhan

relativzum

aufgetrage

7 im Verg

nVerringe

Next‐Gen

ssionenvo

untersucht

7ausgeführ

rte signifik

iederonko

linien

humanenN

umorsuppr

nhumanen

umanenZel

egativkontr

nddermet

mjeweiligen

en.Alledre

gleich zu N

rungderV

eration‐Seq

onmiRNAs

wurden,d

rtwerden.

kantmit gü

ogenenmiR

AbbmiRgembladenzierblaungDarsiongen92anac

euroblasto

ressiven Fu

nNeurobla

lllinienIMR

roll‐miRNA

tabolischen

nWertnac

eianalysier

Negativkont

Viabilitätüb

quenzierun

infünfNe

ieschonfü

ünstigem V

RNAsmiR‐1

b.50: KR‐137Exprm Verlaufastome Rener Next‐rungs‐Datenstomen mgünstigem Vrstellungden von miR‐nen miRNAsa. Student‘schAlthoffet

omenmitgü

unktion die

stomzelllin

R‐32,SHEP

Aodermitm

nAktivität

ch24Std.g

rtenZelllin

troll‐miRNA

berdieZeit

Erg

ngs‐Datens

euroblastom

ürmiR‐542

Verlauf (p=

17(p<0,0

Korrelationressionmithumaner

e‐Analyse‐Generation‐nvonjefünit günstigeVerlauf110 (erabsoluten‐137 und des miR‐17 us t‐Test. Motal.118.

ünstigerTu

esermiRNA

nienvalidie

PundSK‐N

miR‐137tr

derZellen

gemessene

nienreagie

A exprimie

t(Abb.51).

gebnisse

80

satzes110

menmit

2durch‐

=0,046)

01)und

vontgünsti‐Neuro‐vorhan‐‐Sequen‐nfNeuro‐em undTab.10).nExpres‐er onko‐und miR‐odifiziert

umorbi‐

A. Diese

ertwer‐

N‐BEmit

ransient

nmittels

Zellvia‐

rtenauf

erenden

Abb.51miR‐13SHEP unüberdietionstes

Makros

einede

miRNA

Mittels

(subG1

Dieser

signifik

miR‐13

bestimm

(Abb.5

ein Eff

Caspase

1: Reduktio7 Expressind SK‐N‐BEeZeitsignifst.Modifizier

skopischeA

eutlichverr

(Abb.52).

Analyse d

) in allen

Effektdom

kant (Abb.5

37 gegen N

mt und zei

3b).Inein

fekt der in

e9 Aktivitä

on der Viaion TransieE mit NegatfikantverschrtnachAlth

Aufnahmen

ringerteKo

des Zellzyk

analysierte

miniertein

53a). Die r

Negativkon

igte eine s

nerWestern

n pro‐apop

ät konnte

abilität huente Transfetivkontroll‐mhieden.Statoffetal.118.

nderZelle

onfluenzim

klus konnt

en Zelllinie

SHEPZelle

relativeAn

ntroll‐miRN

ignifikante

nBlotAnal

ptotischen

deutlich ge

umaner Neektion dermiRNA (NKtistischeSig

nzeigten9

mVergleich

te ein Ans

en nach m

en,warabe

nzahl apopt

NA wurde

e Induktion

lysewurde

Zellen au

ezeigtwer

uroblastomhumanen NK) oder miRnifikanzber

96Std.nac

hzurTrans

AbflublgeMiZetio(Nbana

stieg des A

miR‐137 Ex

erauchfür

totischer Z

anhand d

n von Apop

ederAntei

uftritt, unt

rden (Abb.

mzelllinienNeuroblastomR‐137. Verlarechnetanh

chTransfek

sfektionvon

bb.52: Reduenz huastomzellliener miRikroskopischellen96Std.on mit NegaNK) oder malken = 20achAlthoffe

Anteils apo

xpression d

rIMR‐32un

ellen nach

es ELISA

ptose in al

ildergespa

tersucht. D

53c). Anha

Erg

mittels exmzelllinienauf der ZellvhandeinesP

ktionmitm

nNegativk

duktion deumanerinien nacR‐137 Exphe Aufnahm.nachderTativ‐kontrolmiR‐137. M00 µm. Moetal.118.

optotischer

detektiert w

ndSK‐N‐BE

hTransfekt

Cell death

llen drei Z

altenenCa

Die Indukt

and der EL

gebnisse

81

xogenerIMR‐32,viabilitätPermuta‐

miR‐137

kontroll‐

er Kon‐Neuro‐

ch exo‐pressionmen vonTransfek‐ll‐miRNAaßstabs‐odifiziert

r Zellen

werden.

EZellen

tion von

Assays

elllinien

spase9,

ion der

LISA‐ba‐

sierten

primier

allendr

Abb.53rendenNegativkZellen inexprimiZahlapoWesternBalkendter BrdUnachAltUmzu

kann,w

Marker

zu Neg

inmiR‐

BrdU Ink

renden Zel

reiZelllinie

3: InduktionZellenAnakontroll‐miRnverschiederenden ZeoptotischernBlotAnalydiagrammdeU Inkorporathoffetal.118

testen,ob

wurde anha

rfürneuron

gativkontro

‐137‐exprim

orporation

llen relativ

enreduzier

nvonApopalysendesPRNA‐exprimdenenPhaseellen signifikZellenrelatysevonKDMerZahlprolation. Stude8.

miR‐137n

and einer

naleDiffere

ll‐miRNA‐e

mierenden

n gemessen

v zu Negat

rtemiR‐137

ptoseundRhänotypsvomierenden (endesZellzykant erhöhttivzuNK,geM1Aundgeliferierenderent‘s t‐Test.

neuronaleD

qPCR die E

enzierung,

exprimiere

Zellensign

n, wurde d

tivkontroll‐

7dieProlif

ReduktiononmiR‐137(NK) 96StdyklusalsPrt. Student‘semessenmiespaltenerCrZellenrela*=p<0,05

Differenzie

Expression

gemessen

enden Zelle

nifikanthoc

Abb.54:inNeurofilamExpressioExpressionormalise*=p<0,0

die Prolifer

‐miRNA ex

ferationsig

derProlife‐exprimiered. nach Trarozent‐Balket‐Test: p<ittelsELISACaspase9.AativzuNK,g5; **=p<0,

rungvonN

n vonNeur

undgegen

enwurde d

chreguliert

EinleitungmiR‐137‐ement (NEon relativon (NK), dert gegen001.Modifiz

rationsrate

xprimieren

gnifikant(A

eration inmendenZelllinansfektion. (en.SubG1‐F0,05. (b)BCelldeath.AktinalsLagemessenm,01; ***=p

Neuroblasto

rofilament,

nGAPDHno

deutlich, da

twurde(Ab

neuronaleexprimierenEFL) mRNA

zu Negdetektiert mGAPDH.

iertnachAl

Erg

e von miR‐

nden analys

Abb.53d).

miR‐137exnienimVerg(a) FraktioFraktion inalkendiagraStudent‘st‐adungskontrmittelsELISA<0,001.Mo

omzellene

einem bek

ormalisiert

ass Neurof

bb.54).

er DifferenndenA nachgativkontrolmittels qPStudent‘s

lthoffetal.11

gebnisse

82

‐137‐ex‐

siert. In

xprimie‐gleichzunen vonmiR‐137amm der‐Test.(c)rolle.(d)A‐basier‐odifiziert

einleiten

kannten

.Relativ

filament

nzierungZellen

miR‐137ll‐miRNACR undt‐Test:

18.

4.3.4 V

Die vor

diesem

Zellen

vonKD

undauf

troll‐mi

Zellen

Herunt

Abb.55mRNA nblastomTest: *=Expressdungsko

Zur Val

KDM1A

feraseR

TK,das

miRNA

fiziert.

Seefede

(Abb.5

konnte

Validierun

rhergesagt

TeilderU

im Verglei

DM1A unter

fdieExpre

iRNA‐expri

signifikant

erregulatio

5:Herunternach miR‐1mzellen dete=p<0,05; *ion Negativontrolle.Mo

lidierung d

A (Abb.46)

ReporterP

salsTrans

oder miR

Relativ zu

er norma

6). Die vor

damitvali

ngvonKDM

e, direkte

ntersuchun

ich zu mit

rsucht. Mit

essionvon

imierenden

t herunterr

onvonKDM

rregulation37 Expressktiertmitte**=p<0,01vkontroll‐modifiziertnac

der direkte

) wurde ei

Plasmid,we

fektionsko

R‐137 wurd

u Negativk

alisierte G

rhergesagt

diertwerd

M1Aalsdi

Bindung v

ngvalidiert

Negativko

ttels qPCR

GAPDHno

n Zellen, w

reguliert (A

M1Aaucha

nvonKDM1ion relativels qPCRun1; ***=p<0iRNA‐ (NK)chAlthoffet

en Bindung

in Reporte

elchesdie

ntrolleRen

den sowoh

kontroll‐m

Glühwürmc

te direkte B

en.

irektesZie

von miR‐13

twerden.D

ontroll‐miR

wurde die

ormalisiert.

wurde KDM

Abb.55a).

aufProteine

1A inmiR‐zu Negativk

nd normalisi0,001. (b) W) und miR‐tal.118.

g vonmiR‐

er Assay d

3’UTRvon

nilla‐Luzife

hl in HEK‐2

iRNA‐expr

chen‐Luzife

Bindung v

elvonmiR

37 an die

Dazuwurd

RNA‐transfi

eKDM1A m

.Relativzu

M1A mRNA

In Wester

ebenevalid

137‐exprimkontroll‐miiert gegenGWestern Blo137‐exprim

‐137 an die

durchgeführ

nKDM1Abe

eraseexpri

293 als au

imierenden

erase‐Aktiv

onmiR‐13

R‐137inZe

3’UTR von

enmitmiR

izierten au

mRNA Exp

urExpressi

A in miR‐1

rn Blot Ana

diertwerde

mierendenRNA (NK) iGAPDH Exprot Analyse dmierender Ze

e Bindeste

rt. Ein Glü

einhaltete,

mierte,und

ch in SHEP

n Zellen, w

vität sign

7 an die 3

Erg

elllinien

n KDM1A s

R‐137‐trans

uf ihre Exp

pression ge

ioninNega

37‐exprim

alysen kon

en(Abb.55

Zellen (a)in humanenression. Studer KDM1Aellen. Aktin

elle der 3’U

ühwürmche

dasPlasm

dNegativk

P Zellen k

wurde die

nifikant re

3’UTR von

gebnisse

83

sollte in

sfizierte

pression

emessen

ativkon‐

miernden

nnte die

5b).

)KDM1An Neuro‐udent‘s t‐A Proteinn als La‐

UTR von

en‐Luzi‐

midpRL‐

kontroll‐

o‐trans‐

e gegen

eduziert

KDM1A

Abb.563’UTRHEK‐29tivkontrnem KDLuziferaGlühwüund NoAktivitäStudentAlthoffe

Im We

miR‐13

Target

tion vo

TFPI2 i

einerq

Express

liert,wa

6:DirekteBvon KDM3 und SHEProll‐miRNADM1A 3’UTRase Reportrmchen‐Luzrmalisierunät der Trat‘s t‐Test: *etal.118.

iteren soll

37 Express

vonKDM1

on KDM1A

in Negativk

qPCRgeme

sionvonTF

asdieFunk

BindungvonM1A Ko‐TP Zellen en(NK) oderR tragendenter Plasmiziferase‐Aktng gegen Seansfektionsk*=p<0,01.

te untersu

sion für Sig

AistTFPI2

in Neurob

kontroll‐m

ssenundg

FPI2inalle

ktionalität

nmiR‐137Transfektionntweder mitmiR‐137 un Glühwürmd. Messuntivitätnacheefeder‐Luzikontrolle p. Modifizier

ucht werde

gnalwege

2(tissuefac

blastomzell

iRNA‐ und

gegenGAPD

enanalysie

derKDM1A

andien vont Nega‐und ei‐mchen‐ng der48Std.iferase‐pRL‐TK.rt nach

en, ob die

des Protei

ctorpathw

llinien hoc

d miR‐137‐

DH normal

ertenZelllin

AHerunter

AmvoinmtrunSt**et

Herunterr

ins von Be

wayinhibito

chreguliert

‐exprimiere

lisiert.Rela

nienmitm

regulation

Abb.57:ReamiR‐137‐indon KDM1Anhibitor 2)miR‐137 Exproll‐miRNAnd normalistudent‘s t‐T**=p<0,00tal.118.

regulation

edeutung i

r2),dasbe

wird35. Di

enden Zell

ativ zurKo

iR‐137sign

validierte

aktionvonduzierte HA TFPI2 (tis

mRNA ipression rel(NK), deteksiert gegenTest: *=p<01. Modifiz

Erg

von KDM1

ist. Ein be

eiHerunter

ie Express

len wurde

ontrollewu

nifikantho

(Abb.57).

KDM1AZiHerunterregssue factorin Zelllinieativ zuNegktiert mitteGAPDH Exp<0,05; **=ziert nach

gebnisse

84

1A nach

kanntes

rregula‐

ion von

anhand

urdedie

ochregu‐

elenaufgulationpathwayen nachgativkon‐els qPCRpression.p<0,01;Althoff

4.3.5 F

KDM1A

Bindun

ebene.

wargez

wirkun

tionvon

KDM1A

SHEPu

wurden

gegen

48Std.

Redukt

Abb.58KDM1ABlot An48Std.nNeuroblkontrollsiRNA gkontrolletal.118.

Die im

Alle an

gleichz

Abb.59relativ z(NK) odsiKDM1

Funktionv

Awurdeals

ng führte so

TPFI2,ein

zeigt,dass

ngenaufdie

nKDM1Ae

AHerunterr

undSK‐N‐B

n transient

KDM1A (s

nach Tran

tiondesKD

8: SpezifiscAProteinmnalyse dernachtransielastomzelllinl‐siRNA (NgegenKDM1le. Modifi

MTTAssay

alysierten

zurNegativ

9:Reduktiozum jeweilider siRNAAgegenNK

vonKDM1

sdirektesT

owohl zu e

bekanntes

dieBindun

eNeuroblas

eintreten.N

regulation

BEdenPhä

t mit einer

siKDM1A)

nsfektion a

DM1AProte

che RedukmittelssiRN KDM1AenterTransfnien mitK) oder s1A. Aktin alziert nach

yermittelt

Zelllinien

vkontrollem

on der Zellgen 24Std.gegen KDM

Kberechneta

1AHerunte

Targetvon

einer Heru

sZielvonK

ngvonmiR

stomzellen

Nunsollteu

mittelssiR

notypder

r Negativko

transfizier

anhand ein

einsvalidie

ktion vonNAWesternExpressionfektionvon

Negativ‐spezifischers Ladungs‐h Althoff

teZellviabi

reagierten

miteinersi

viabilität dWert nach

M1A (siKDManhandeine

erregulati

miR‐137,d

unterregula

KDM1A,ko

R‐137and

nhervorruf

untersucht

RNAinden

miR‐137E

ontroll‐siR

rt. Zunächs

nerWestern

ertwerden

ilitätwurde

auf dieHe

ignifikantr

durchHeruh transienteM1A). AngeesPermutat

oninZelll

dieandie3

ation aufm

onnteeben

die3’UTRv

ft,dieauch

twerden,o

humanen

Expression

NA oder m

st wurde

n Blot Ana

konnte(Ab

egegendie

erunterreg

reduzierten

unterregular Transfektegebene p‐WtionstestsM

inien

3’UTRbind

mRNA‐, als

fallsvalidie

vonKDM1A

beidirekte

obderPhän

Neuroblast

ähnelnwü

mit einer s

die Spezif

alyse unter

bb.58).

eZeitaufg

gulation vo

nViabilität

ation vonKtion von NeWerte für dodifiziertna

Erg

det,validier

auch auf P

ertwerden

A funktione

erHerunter

notypderd

tomzellen

ürde.DieZ

pezifischen

fität dieser

rsucht, wob

getragen(A

nKDM1A

überdieZ

KDM1A MTegativkontrodie SignifikachAlthoffe

gebnisse

85

rt.Diese

Protein‐

n.Damit

elleAus‐

rregula‐

direkten

IMR‐32,

elllinien

n siRNA

r siRNA

bei eine

Abb.59).

imVer‐

eit.

TT Assayoll‐siRNAkanz vonetal.118.

Die det

Herunt

einesC

fektion

imVerg

dieInd

tionde

tiert(A

Abb.60ZellendtivkontrverschieZellen,**=p<anhandModifizi

taillierte U

erregulatio

CelldeathE

untersuch

gleichzur

uktionvon

rProliferat

Abb.60c).

0: InduktiodurchHeruroll‐miRNAedenenPhasrelativ zu0,01. (c) Bder ELISA‐iertnachAlt

ntersuchun

on von KD

LISAundd

ht.DerAnte

Negativkon

nApoptose

tion,diere

n von Apounterregula(NK) odersendesZellNK, geme

BalkendiagrabasiertenBthoffetal.11

ng derMe

M1Amitte

derELISA‐b

eilapoptot

ntroll‐siRN

validiertw

elativzurN

optose undationvonKsiRNA gegezyklusalsPssen mittelamm der ZBrdU Inkorp8.

chanismen

els siRNAw

basiertenB

tischerZell

NAan (Abb

werden(Ab

Negativkon

d ReduktioKDM1AAnaen KDM1AProzentbalkels ELISA Cahl proliferporation. Stu

n der Redu

wurde anh

BrdUInkor

enstiegbe

b.60a).Mit

bb.60b).Au

troll‐miRN

n der Viabalysen96Std(siKDM1A)en.(b)BalkCell death.rierender Zudent‘s t‐Te

uktion der

and einer

rporation9

eiTransfek

telsCellde

ußerdemw

Aaufgetra

bilität undd.nachTran. (a) FraktiendiagrammStudent‘sellen relativest: *=p<0

Erg

Zellviabilit

Zellzyklus

96Std.nach

ktionvonsi

eath ELISA

wurdeeine

agenwurde

Proliferatnsfektionvoionen von Zmderapoptt‐Test: *=v zu NK, g0,05; ***=p

gebnisse

86

tät nach

analyse,

hTrans‐

iKDM1A

Akonnte

eReduk‐

e,detek‐

tion vononNega‐Zellen intotischenp<0,05;emessenp<0,001.

Ergebnisse

87

4.3.6 Partielle Wiederherstellung des Phänotyps der miR‐542‐3p Expression

mittelsHochregulationvonKDM1AohnemiRNA‐Bindestelle

Der Phänotyp von Neuroblastomzelllinien nach der Herunterregulation von KDM1A

mittelssiRNAähneltedemderExpressionvonmiR‐137.Nunwurdeuntersucht,obder

miR‐137‐Phänotyp aufgrund der durch miR‐137 Expression herunterregulierten

KDM1A Expression auftrat. KDM1A ohne miR‐137‐Bindestelle (3‘UTR) wurde mittels

eines Tetrazyklin‐induzierbaren Vektors stabil in SHEP Zellen eingebracht

(SHEP‐KDM1A).AlsKontrollewurdenSHEPZellenmitdemgleichemVektorabereiner

induzierbarenExpressionvonGFPgeneriert(SHEP‐GFP).UnabhängigvonderBehand‐

lungmitTetrazyklinwurdedieExpressionvonKDM1AinSHEP‐GFPZellenbeiExpres‐

sionvonmiR‐137reduziert.AuchinSHEP‐KDM1AZellenreduziertedieExpressionvon

miR‐137dieExpression vonKDM1A inAbwesenheit vonTetrazyklin.BeiBehandlung

mitTetrazyklinwurdedieExpressionvonKDM1A ohne3‘UTR inSHEP‐KDM1AZellen

induziert,dieresistentgegendieExpressionvonmiR‐137war(Abb.61a).MittelsMTT

Assay wurde die Zellviabilität unter den gleichen Bedingungen wie im Western Blot

analysiert.DieViabilitätderZellenbeiExpressionvonmiR‐137wurdedazurelativzur

jeweiligen Negativkontroll‐miRNA exprimierenden Viabilität aufgetragen. Die Expres‐

sion vonmiR‐137 reduzierte die Viabilität sowohl von SHEP‐GFP als auch von SHEP‐

KDM1AZelleninAn‐undAbwesenheitvonTetrazyklinsignifikant.InnerhalbderSHEP‐

GFP Zellen konnte kein Unterschied zwischen der Zellviabilität von nicht‐induzierten

undinduziertenZellen,diemitmiR‐137behandeltwurden,detektiertwerden.Zwischen

miR‐137exprimierendenSHEP‐KDM1AwardieReduktionderZellviabilitätininduzier‐

tenZellensignifikantwenigerstarkalsinnicht‐induziertenZellen(Abb.61b).

Abb.61miR‐13TetrazykeinemT3’UTR.Gder ZellNegativkmittelsetal.118.

4.3.7 I

Das du

zwar e

KDM1A

von KD

werden

ZurDet

manaly

troll‐mi

gefunde

zeigt).

sowohl

kam.

1: Induzierb7 Expressklin‐ (TET)Tetrazyklin‐iGleichzeitigelviabilität vokontroll‐miRMTT Assay

Identifizie

urchgeführt

ein Teil de

Azurückzuf

DM1A, sond

nmusste.

tektionwe

yse vonmi

iRNA expr

en, die dur

Mittels in

leineBinde

bare Expresion (a) W oder LösuinduzierbareExpressioonmiR‐137RNA exprimy. Student‘s

erungund

te Rettung

es Effekts

führenwar

dern allein

eitererpote

R‐137 exp

rimierende

rchmiR‐13

silico Anal

estellefür

ession vonWestern Blngsmittel‐BrenVektorkonvonmiR‐17 exprimiermierenden is t‐Test: **

Validierun

gsexperime

der miR‐1

r,aberdass

n oder zusä

entiellerZie

rimierende

Zellen als

37 Express

lyse wurde

miR‐137au

n KDM1A iot AnalyseBehandlungonstruktmi137.Aktinaenden SHEPin Ab‐ und*=p<0,01;

ngvonAK

ent des mi

137 Expres

sdergröße

ätzlich auf

elewurde

en SHEP Z

s Vergleich

sion signifi

e untersuc

ufwies,als

n SHEP‐KDe der KDMvon stabil‐itGFP(SHEPalsLadungsP‐GFP undAnwesenh***=p<0

KAP2alsw

R‐137 Phä

ssion auf

ereAnteiln

f weitere m

96Std.nac

ellen durch

h dienten.

ikant regul

ht, welche

auchalsp

DM1A ZelleM1A ExprestransfizierteP‐GFP)oderkontrolle.(bSHEP‐KDM1eit von Tet,001. Modif

eiteresZie

änotyps de

die Herun

nichtallein

miR‐137 Zi

chTransfe

hgeführt,w

Dabei wu

liert waren

dieser reg

otentielles

Erg

en resistenssion 96Sten SHEP‐ZerKDM1AcDb)Balkendi1A Zellen rtrazyklin, gfiziert nach

elvonmiR

emonstrier

nterregulati

aufdieReg

iele zurück

ktioneine

wobeiNega

urden 38 P

n (Daten n

gulierten P

sOnkogeni

gebnisse

88

nt gegentd. nachellen mitNAohneiagrammelativ zuemessenh Althoff

R‐137

te, dass

ion von

gulation

kgeführt

Proteo‐

ativkon‐

Proteine

nicht ge‐

Proteine

inFrage

DasPro

Zellenb

(Abb.6

Abb.62mittelsgleichdkontrollmiR‐137Proteomgleichenkontroll

Dem P

bekann

gesagt

Bindest

(8mer)

Abb.63vorherg(www.ta

Anhand

Neurob

Funktio

gezeigt

oteinAKAP

beiderAna

2a),wasim

2: HerunteExpressio

derExpressil‐miRNA (N7exprimiermanalyse.(bn Proben wle.

rotein AKA

ntist,wurd

(www.tar

tellenand

und3851‐

3: 3’UTR vogesagten Bargetscan.or

d einer

blastomen

on imNeur

werden,

P2 (Akinas

alysedesP

mWestern

erregulationon von miRion vonAKANK) exprimrendenZelleb)WesternBwie (a). Akti

AP2, über

envierdir

rgetscan.or

enPosition

‐3857(7me

on AKAP2Bindestellenrg).Pos.=P

Analyse

sollte festg

roblastom

dass Pati

seanchorp

Proteomsa

Blotvalidie

n von AKR‐137 (a)AP2 inNegamierendenenanhandeBlotAnalysein als Ladu

dessen tu

ekteBinde

rg). Innerh

nen912‐91

er‐m8)(Abb

mit Bindesn von mosition.

der Expr

gestelltwer

spielenkö

enten mit

protein2)

alssignifika

erbarwar(

KAP2Ver‐ativ‐undeinerederungs‐

umormodu

estellenvon

halb der

18(7mer‐1

b.63).

stellen vonmiR‐137

ression vo

rden, obd

önnte.Mitte

t Tumoren

war inmiR

antherunte

(Abb.62b)

lierende F

nmiR‐137

4014bp

1A),1634‐1

nmiR‐137innerhalb

on AKAP2

iesesProte

els einerK

n mit hoh

R‐137expr

erreguliert

.

Funktion b

am3’UTRd

langen 3’U

1640(7me

Schematiscder 3’U

2 in hum

eineine tu

Kaplan‐Meie

her AKAP2

Erg

rimierende

gefunden

isher noch

dermRNA

UTR lagen

er‐m8),177

ches DiagraUTR von

manen pr

umormodul

erAnalyse

2 Expressio

gebnisse

89

enSHEP

wurden

h nichts

vorher‐

n diese

75‐1782

amm derAKAP2

rimären

lierende

ekonnte

on eine

signifik

Patient

desGes

AKAP2

ImFolg

renzin

behand

ziert(A

eine Re

ELISA‐b

Abb.65siRNAgNegativkbilitätüsiAKAP2tischendiagramTest:*=

kantniedrig

tenmitTum

samtüberle

imTumor

genden sol

SHEPZelle

deltwurden

Abb.65a).W

eduktion d

basiertenB

5:ReduktiogegenAKAPkontroll‐siRüberdieZeit2gegenNKZellen96StmmderZahl=p<0,05.

geWahrsch

morenmit

ebens(Abb

signifikant

ltedieFun

ennäheru

n,war imV

Weiterhini

der Zellpro

BrdUInkorp

nderZellvP2transfiziRNA(NK)odtrelativzumberechnetatd.nachTralproliferiere

heinlichkei

niedrigerA

b.64).DesW

tmitMYCN

nktioneine

ntersuchtw

Vergleichz

nduziertes

liferation,

poration(A

iabilitätuniertenSHEPdereinersiRmWertnachanhandeinensfektionreenderZellen

itfüreinE

AKAP2Exp

Weiterenk

NAmplifikat

erAKAP2H

werden.Di

zumitNeg

siAKAP2in

gemessen

Abb.65b/c

ndProliferaPZellenTrRNAgegenh24Std.AnesPermutatielativzuNKnrelativzu

Ereignis‐fre

pression.D

korrelierte

tion(Daten

Herunterre

ieViabilität

gativkontro

nSHEPZell

anhand de

).

ationundInansienteTrAKAP2(siAngegebenepionstests.(bK.Student‘stNK96Std.

iesÜberleb

iesgaltau

eineerhöh

nnichtgeze

Abb.64:ExpressionÜberlebenroblastompMeier‐Analyfreien (EFSüberlebensroblastomprenmit hohAKAP2 ExpTest.

gulationm

tderZellen

ll‐siRNAtr

ensowohl

es Cell dea

nduktionvoansfektionvAKAP2).(a)p‐Wertefürb)Balkendiat‐Test:*=pnachTrans

Erg

benaufwie

uchfürdie

hteExpress

eigt).

Korrelation von AKAn vonpatientenyse des ES) und des (OS) vopatientenmiher gegen npression. W

mittelsRNA

n,diemits

ransfizierte

Apoptosea

ath ELISA u

onApoptosvonSHEPZeVerlaufderrdieSignifikagrammder<0,001.(c)sfektion.Stu

gebnisse

90

esen,als

Analyse

sionvon

on derAP2 mit

Neu‐Kaplan‐Ereignis‐Gesamt‐

on Neu‐itTumo‐niedrigerWilcoxon‐

A Intefe‐

siAKAP2

enredu‐

alsauch

und der

seinmitellenmitrZellvia‐kanzvonrapopto‐)Balken‐udent‘st‐

5 Di

Die vor

MYCN‐v

weitere

derFun

weitera

D5.1

5.1.1 T

b

Eine Ü

Stadium

dieHei

dernse

MYCN‐A

in dies

Erkrank

tersuch

analysi

ristika

piendie

Dievom

lich im

Express

anhand

Die ana

oberen

Neurob

undden

iskussi

rliegende A

vermittelte

envorhand

nktioniden

analysiertw

DasLSL‐

Tumored

blastomeb

berexpress

m und eine

ilungschan

ehrgutsind

Amplifikati

en bösarti

kungenwi

hungen von

ertenLSL‐M

deshuman

eserbeimK

mDbh‐Pro

m sympathi

sion der C

dderUnter

atomischen

Zervikalg

blastome, d

nNebennie

ion

Arbeit umf

en Neurob

denenDate

ntifiziert,de

wurden.

MYCN;D

esLSL‐MY

beschreib

sion oder

er schlecht

cen einesN

d,istdieSt

ionnochim

igen Tumo

iderspiegel

n potentiel

MYCN;Dbh

nenNeurob

Kindfatalv

motorgetr

schen Gren

Cre‐Rekomb

rsuchungen

n Lokalisat

ganglien un

die sich au

erenentwic

fasst die Ch

blastom‐Ma

enwurden

erenFunkt

Dbh‐iCre

YCN;Dbh‐iC

en

Amplifikat

ten Progno

Neuroblast

terberatev

mmerhoch

ren sind M

n, von gro

ll wirksam

‐iCreMaus

blastomsin

verlaufende

riebeneEx

nzstrang s

binase zur

nderTum

tionen dies

nd dem G

us abdomin

ckeln4.

harakterisi

ausmodells

zweiKand

tioneninhu

eMausm

CreMausm

tion von W

ose human

tomsmit n

vonPatient

h1.Besonde

Mausmode

oßer Bedeu

men spezifis

smodellwu

nsichverei

enErkrank

pressiond

tatt40. In L

gewebssp

oreaufmR

serMYCN‐

Ganglion co

nalen Gang

ierung ein

. Anhand

didaten‐miR

umanenNe

modell

modellslas

Wildtyp M

ner Neurob

niedrigerem

tenmitSta

ersfürdie

lle, die de

utung.Weit

schen Med

urdeunters

inigt,umA

kungsformz

derCre‐Rek

LSL‐MYCN;

pezifischen

RNA‐undP

vermittelte

oeliacum ä

glien, dem

es neuen C

dieses M

RNAsmit t

euroblastom

sensicha

YCN geht

blastome ei

mStadium

adium4Ne

Erforschun

n genetisc

terhin sind

dikamenten

sucht,inwie

Aufschlüsse

zugeben.

kombinase

Dbh‐iCre M

Expressio

Proteinebe

en Tumore

ähnelten de

sympathis

Dis

Cre‐kondit

odells sow

tumormod

menundZ

alsmurine

mit einem

inher124. W

bei jünger

euroblastom

ngderSign

chen Status

d vorklinis

n möglich.

eweitesCh

eüberneue

findethau

Mäusen füh

n vonMYC

enegezeigt

e an Neben

er Lage h

schen Gren

skussion

91

ionalem

wie aus

ulieren‐

elllinien

Neuro‐

m hohen

Während

renKin‐

menmit

nalwege

s dieser

che Un‐

Im hier

harakte‐

eThera‐

uptsäch‐

hrte die

CN, was

twurde.

nnieren,

humaner

nzstrang

Diskussion

92

ImhistologischenBildbestandenTumoreausLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenauskleinen,

blauen,rundenZellen.InderpathologischenUntersuchungvonhumanenpädiatrischen

TumorenwirdebenfallszuersteineHämatoxylinundEosinFärbungdurchgeführt.Die

Unterscheidung zwischen den Entitäten der klein‐, blau‐ und rundzelligen Tumore

erfolgthauptsächlichanhanddesNachweisesspezifischerMarkerinimmunozytochemi‐

schen und genetischen Analysen. Sind diese Untersuchungen nicht eindeutig, werden

elektronenmikroskopischeAufnahmenzuRategezogen.Alsspezifischeultrastrukturelle

Kennzeichen des Neuroblastoms innerhalb der klein‐, blau‐ und rundzelligen Tumore

gelten Neuriten, neurosekretorische Vesikel, Synapsen‐ähnliche Strukturen und zwi‐

schenzelluläre Anschlüsse1. Neurosekretorische Vesikel, die neurale Differenzierung

anzeigen,warenauchinTumorenausLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusendetektierbar.

Tumoredes LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells exprimierten sowohl dasOberflächenantigen

CD56,alsauchdieNeuroblastommarkerDbh,ThundPhox2b.DieExpressionvonCD56

gilt als Marker für neuroendokrine Tumore. Th katalysiert die Biosynthese der Kate‐

cholamine und wird vor allem in noradrenergen Zellen exprimiert125. Bei der

UnterscheidungvonNeuroblastomenzuanderenklein‐,blau‐undrundzelligenTumo‐

rengiltdieExpressionvonTh,diespezifischfürdasNeuroblastomist,alsMerkmal126.

Phox2bwirdbei derEntwicklung von sympathischen, parasymphatischenund enteri‐

schen Ganglien exprimiert, die sich von der Neuralleiste ableiten127. Hartomo etal.

beschreiben elfMarker, anhand derer sich eineminimale Resterkrankung desNeuro‐

blastomsdetektierenlässt,unterdenensichsowohlDbhundThalsauchPhox2bbefin‐

den128.

Anhand der Lokalisation, der histologischen Eigenschaften und der Expression von

spezifischenNeuroblastommarkernwurdedieHypothesebestätigt, dass es sichbei in

dieser Arbeit analysierten Tumoren des LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausmodells ummurine

Neuroblastomehandelte.

Diskussion

93

5.1.2 Gegenüberstellung der beiden Neuroblastom‐Mausmodelle

LSL‐MYCN;Dbh‐iCreundTH‐MYCN

Das TH‐MYCN Mausmodell37 stellt ein exzellentes, weltweit anerkanntes Neuro‐

blastommodelldar,dasinverschiedenenArbeitsgruppen,diesichmitderErforschung

desNeuroblastomsbeschäftigen,zuüber200Publikationengeführthat.Esgibtjedoch

EinschränkungendesModells,diedieForschungandiesemerschweren.IndiesemTeil

derArbeitsollenverschiedeneEigenschaftendesTH‐MYCNunddesLSL‐MYCN;Dbh‐iCre

Mausmodells einander gegenübergestellt werden, um abzuschätzen, ob das neue

MausmodellVorteilegegenüberdemetabliertenaufweist.

DasTH‐MYCNModellwurde1997durchPronukleusinjektiondercDNAvonhumanem

MYCNinmurineBlastozystengeneriert37.DieDefinitiondergenauenIntegrationsstelle

inderdistalenRegiondesChromosoms18imGenomderMauserfolgteerst2003129.Es

istnichtbekannt, obder entsprechendeLokusubiquitär exprimiertoder epigenetisch

inaktiviert wird, was zu einer instabilen Expression von MYCN führen könnte. Das

LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modell wurde mittels eines Rekombinase‐vermittelten Kassetten‐

austauschineinengenaudefiniertenGenlokusgeneriert,waszurFolgehatte,dassder

Genlokus,indendasMYCNTransgenintegriertwurde,genaubekanntwar.DerROSA26

Genlokus stellt bei der Generierung transgener Mausmodelle den am häufigsten ver‐

wendetengenetischenLokusdar,daeineUnterbrechungdiesesubiquitärexprimierten

GensbekanntermaßenkeinenPhänotyphervorruft130‐133.

VorteiledesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellsgegenüberdemTH‐MYCNModell,dieIntegra‐

tionsstelledesTransgensbetreffend,sinddemnachzumeinendieGewissheit,dassjede

phänotypischeVeränderungdoppelt‐transgenerTiereaufdasVorhandenseindes inte‐

griertenTransgens, nicht aber auf dieUnterbrechung eines endogenen Lokus zurück‐

zuführen ist und zum anderen dieKenntnis, dass der Lokus ubiquitär exprimiert und

nichtinirgendeinerWeisereprimiertwird.

Die Vermehrung undErhaltungder transgenenMausstämmeLSL‐MYCN undDbh‐iCre

erfolgtdurchdieVerkreuzungmitWildtyp‐TierenodermitTierendes gleichenStam‐

mes.DadiegetrennteZuchtbeiderStämmezukeinemPhänotypführtistdieseunkom‐

plizierter als die desTH‐MYCN‐Modells, das im 129x1/SvJ Hintergrund potentiell Tu‐

more entwickelt. Die Ausbildung eines tödlichen Tumors in einem transgenen

Muttertier führt dabei häufig zumVerlust des ganzenWurfes oder zurNotwendigkeit

Diskussion

94

einerAmme.InfolgedessenwerdenhäufigheterozygoteTH‐MYCN‐MännchenundWild‐

typ‐Weibchen für die Erhaltungszucht benutzt, die stets verfügbar sein sollten. Es ist

unabdingbar jedes transgene TH‐MYCN Tier nach Tumoren abzutasten, was einen

enormenZeitaufwandmitsichbringt.WeiterhinbestehtinnerhalbeinerPopulationaus

TH‐MYCN Tieren ein Selektionsvorteil für die Tiere, die keinen Tumor entwickeln, da

sichdiesemit größererWahrscheinlichkeit fortpflanzen.Dassdies aufDauer zu einer

AbnahmederTumorinzidenzführenkann,wurdeauchinunsererArbeitsgruppefestge‐

stellt.

TumoredesTH‐MYCNModellsentstammenunifokalausdemGanglioncoeliacum37.Die

LokalisationvonTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells,dievorallemandenNeben‐

nieren, aber auch an den oberen Zervikalganglien auftraten, spiegelte die humaner

Neuroblastome4demnachbesserwideralsdiedesTH‐MYCNModells.

MöglicherweiseistdergenetischeHintergrund129x1/SvJsensiblerfürdieEntwicklung

bösartigerNeuroblastomealsandereMausstämme,wiez.B.C57Bl/6N,weilsiesichin

der Expression nicht‐identifizierter Stamm‐spezifischerModifizierer unterscheiden134.

Trotz des unsensibleren Hintergrundes zeigte die Kaplan‐Meier‐Analyse der beiden

Mausmodelle eine signifikant gesteigerte Tumor‐Inzidenz des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre

Modells.

AufgrundderExpressionvonLuziferaseinCre‐RekombinaseexprimierendenZellendes

LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellssindTumoredieserMäusemittelsinvivoBiolumineszenz‐

Bildgebungsverfahren detektierbar. Diese Eigenschaft der Tumore kann eingesetzt

werden, um Tumorvolumenveränderungen im Vergleich mit anderen Individuen des

gleichen Stammes, z. B. während einer Behandlungssimulation, zu untersuchen (hier

nichtdurchgeführt).TumoreausTH‐MYCNMäusenexprimierendahingegenkeinRepor‐

tergen, weshalb diese Methode der schnellen und unkomplizierten Bildgebung nicht

anwendbarist.

Die Kombination von Tumormodellenmit anderen transgenenMausmodellen, die ein

fürdieEntwicklungderTumorentitätpotentiellfunktionellesGenherunter‐oderüber‐

exprimierenisteineinteressanteStrategie,fürdieErkrankungrelevanteSignalwegezu

findenundzuuntersuchen.DasLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellentwickelteimnicht‐sensi‐

Diskussion

95

tivengenetischenHintergrund(75%C57Bl/6Nund25%129x1/SvJ)Tumore,während

TH‐MYCN Mäuse nur im sensitiven 129x1/SvJ Hintergrund Tumore ausbilden. Eine

KombinationvonTH‐MYCNmitanderenMausmodellenistdemnachnurmöglich,wenn

dieseweitestgehendaufden129x1/SvJHintergrundzurückgekreuztwurden.Erfahrun‐

gen unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass mindestens fünf Rückkreuzungen (96,9%

129x1/SvJ) erforderlich waren, damit Mäuse im gemischten genetischen Hintergrund

eineähnlicheTumorinzidenzerreichten,wie reine129x1/SvJTiere.Der zeitlicheAuf‐

wandderRückkreuzungenvonmehrerenMonaten,derbeieinerKombinationmitdem

TH‐MYCN Modell aufgewendetwerdenmuss, ist bei Verwendung des LSL‐MYCN;Dbh‐

iCreModellnichterforderlich.DarüberhinaussindtumorspezifischeRegulationenvon

GenenbeiKombinationdesLSL‐MYCN;Dbh‐iCremitanderenCre‐konditionalenModel‐

lenohnegroßenAufwandmöglich.

Aus der Gegenüberstellung der beiden murinen Neuroblastommodelle TH‐MYCN und

LSL‐MYCN;Dbh‐iCreergabensichdiverseVorteilefürdieLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMaus,wie

dieKenntnisseüberdenGenlokusderTransgenintegration,dieKosten‐undZeiterspar‐

nisbeiderErhaltungszucht,dieanatomischenLokalisationenderentstehendenTumore

sowiederenInzidenz,dieOpportunitätderLumineszenz‐Bildgebungsowiedieunkom‐

plizierteundschnelleMöglichkeitderKombinationmitanderentransgenenTiermodel‐

len.DasLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausmodellüberkommtsomitdie indieserArbeitdisku‐

tiertenLimitationendesetabliertenTH‐MYCNModells.

Diskussion

96

5.1.3 Identifikation neuer Ziele einer Neuroblastomtherapie anhand des

LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausmodells

IndiesemTeilderArbeitsollengenomischeAberrationenundreguliertemRNAssowie

miRNAsausTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellsmitdenenhumanerErkrankun‐

genundmitdenenanderermurinerNeuroblastomeverglichenwerden,umfestzustel‐

len,obdasLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellgenutztwerdenkönnte,umneuepotentiellfunk‐

tionelleZieleeinerNeuroblastomtherapiezudetektieren.

5.1.3.1 Vergleich genomischer Aberrationen von Tumoren aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCre

MäusenmitdenenhumanerundanderermurinerNeuroblastome

Genomische Aberrationen von 13 LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Tumoren wurden relativ zu

GewebeausdemSchwanzderjeweilsgleichenMausdetektiert.

Eine teilweise Zunahme des Chromosoms 1 wurde in einem der Tumore aus

LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusengefunden.DieZunahmedeshumanenChromosoms2q,das

ortholog zummurinen Chromosom 1 ist, wird für 12% der humanen Neuroblastome

beschrieben135.TeilederhumanenChromosomen1q,2q,5q,6p,8q,13qund18qsind

ebenfalls ortholog zu Teilen des murinen Chromosom 1, jedoch ist deren Funktion

bishernichtbekannt. ImTH‐MYCNModell isteineZunahmedesChromosoms1 in5%

bis30%derTumorengefundenworden37,129,136.

DieTumoredesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellsweisenin69%derFälleeineZunahmedes

komplettenChromosoms3auf,welchesorthologzuTeilenderhumanenChromosomen

1,3q,4,8qund13qist137.DashumaneChromosom1q,eineRegion,diehäufiginhuma‐

nenNeuroblastomenmehrfachauftritt,istebenfallsortholog138.Daspubliziertemurine

Neuroblastommodell, das von der Überexpression vonmutiertemALKF1174L getrieben

wird,weistin100%derFälleeineZunahmedesChromosoms3auf42.

Dasmurine Chromosom6, dessen Zunahme in fünf Tumoren auftrat, ist teilweise or‐

tholog zudenhumanenChromosomen2p, 3, 4q, 7, 10qund12p. In humanenNeuro‐

blastomen kommt eine Zunahme des kompletten Chromosoms 7 in 40% der Tumore

verschiedenerStadienvor,wobeieineZunahmevon7q in12%auftrittundmithoch‐

Risiko Tumoren assoziiert ist139. Interessanterweise weisen zwei Tumore eine lokale

AmplifikationdesChromosoms6auf,diedenROSA26‐Genlokuseinschließt,indendas

Diskussion

97

humane MYCN Transgen kloniert wurde. Infolgedessen wurde untersucht, ob beide

Tumore, die über diese Aberration verfügen, im Vergleich zu denen ohne Aberration

aucheinehöhereExpressiondesTransgensaufweisenundeskonntegezeigtwerden,

dass dies der Fall war (Daten nicht gezeigt). Schon im TH‐MYCN Mausmodell wurde

gezeigt,dasshomozygoteMäusedieserLinie schnellerTumoreentwickeltenunddass

dieseschnellerzumTodführtenalsbeiheterozygoteTiere.MitderhöherenExpression

vonMYCNwurdediesbegründet137.Sowirdvermutet,dassdieZunahmedesROSA26‐

LokusimneuenLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModelldasTumorwachstumbeschleunigenkönnte.

Die Zunahmeder distalenHälfte des Chromosoms11 in 30%der LSL‐MYCN;Dbh‐iCre

Tumore ist ortholog zumhumanenChromosomenarm17q, der in50%allerhumaner

Neuroblastome mehrfach vorkommt und mit ungünstigem Verlauf der Erkrankung

sowiemitMYCNAmplifikationkorreliert42.Einbekanntes,potentiellfunktionellesOnko‐

genaufdiesemLokusistSurvivin,dasinderRegion17q25liegt140,141.TH‐MYCNTumore

weisen ebenfalls häufig (20‐30%) eine Zunahme der Region auf Chromosom 11

auf129,136,137.

DieZunahmedesChromosoms12istorthologzuTeilendeshumanenChromosoms2p,

dasdenendogenenMycnLokusenthält, sowie14qundTeilenvon7pund7q.DieZu‐

nahme von 7q tritt, wie schon erwähnt, in 12% humaner Neuroblastome auf ist mit

hohemRisikokorreliert139.

Der Verlust der Heterogenität von Chromosom 1p36 korreliert in humanen Neuro‐

blastomenmitderAmplifikationvonMYCNundeinerungünstigenPrognose142‐144.Auf

diesemLokus liegtmiR‐34a,der inverschiedenenTumorentitäteneinetumorsuppres‐

siveFunktionzugeschriebenwird145,146.DieExpressionvonmiR‐34ainduziertinNeuro‐

blastomzellen Apoptose63 und reguliert direkt die Expression von MYCN64. Weitere

potentiell funktionelle Kandidaten auf diesem Lokus sindCHD5147 undKIF1Bβ148. Ein

VerlustdesmurinenChromosoms4,dasdasOrthologzumhumanen Lokus1p36ent‐

hält,istwederimTH‐MYCNModell136,nochinTumorenvonLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen

vorhanden. Jedochweisen50%derTumoredesALKF1174LModellseinenVerlustdieses

Lokus auf42. Eine Erklärung für diese Beobachtung könnte sein, dass das Transgen in

beidenMYCN‐vermitteltenMausmodellen inFormvoncDNAvorliegtunddamitkeine

Bindestelle fürmiR‐34aaufweist.DementsprechendwäreeinVerlustdiesesLokus für

Diskussion

98

dieMYCN‐getriebenenModellekeinVorteilfürdieEntstehungvonTumoren.Weiterhin

wird damit die Hypothese unterstützt, dass in humanen Neuroblastomen durch die

RepressionvonmiR‐34adieTumorentwicklungangetriebenwird,wodurchdieFunkti‐

onalitätdesVerlustesdesChromosoms1p36erklärtwerdenkönnte.

ImVergleichzudemALKF1174L;Dbh‐iCreNeuroblastommodellsindchromosomaleAber‐

rationen in Tumoren aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCre und TH‐MYCN Mäusen seltener 37,42,129.

EineÜberexpressionvonWildtypMYCNbenötigtdemnach,umeinenTumorzutreiben,

weniger bis keine weiteren spontanen Aberrationen als die Überexpression der

ALKF1174LMutation.Heukampetal. beschreiben in einemvondreiTumorenvondrei‐

fach‐transgenen TH‐MYCN;ALKF1174L;Dbh‐iCre eine Zunahme des Chromosoms 3. Des

Weiteren werden nur wenige Verluste einzelner Regionen von Chromosomen detek‐

tiert42.DemnachsindbeigleichzeitigerÜberexpressionvonWildtypMYCNundmutier‐

tem ALKF1174L weniger chromosomale Aberrationen nötig, als bei den beidenMYCN‐

getriebenenModellen.

Aus demVergleich der chromosomalenAberrationen des LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells

mitpubliziertenhumanenundanderenmurinenNeuroblastomenergibtsich,dasssich

dieSpektrenderchromosomalenAberrationensehrähnlichsind.

5.1.3.2 Vergleich der Genregulationen von Tumoren aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen

mithumanenundanderenmurinenNeuroblastomenaufmRNAEbene

Mittels mRNA Profiling drei nicht‐maligner Nebennieren und acht Tumoren aus

LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenwurdenimModellreguliertemRNAsidentifiziert.

AnhandderGSEAwurdendiverseGensets,dievonMYC(N) regulierteZiele enthalten,

als signifikant angereichert in Tumoren des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modells detektiert,

wodurchdieHypothesebestätigtwird,dassMYCNimmurinenSystemähnlicheSignal‐

wege reguliert wie im humanen. Weitere Gensets, die in Tumoren von

LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenalssignifikantangereichertdetektiertwurden,beinhalteten

Gene, die sowohl die DNA Replikation als auch den Zellzyklus betrafen. Dementspre‐

chendreguliertendieseTumoreGene,diefürdieKennzeichenvonTumorzellen,wiedie

Stimulation ihres eigenen Wachstums, Resistenzen gegen Wachstumsstopp sowie

Diskussion

99

ApoptoseundunendlicheVervielfältigung149,vonBedeutungsind.DieAnreicherungvon

Gensets,dieneuronaleDifferenzierungherunterregulieren,bestätigte,dasssichTumore

ausLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen ineinemundifferenziertenStatusbefinden,einweite‐

resbekanntesMerkmalvonTumorzellen150.

Mittels einer Clusteranalyse derGene, die in einer publiziertenMYCN Signatur aufge‐

decktwurden78,konntenTumoredesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellseindeutigvonnicht‐

malignenNebennierensepariertwerden,eindeutlicherHinweisaufdieÄhnlichkeitder

MYCNreguliertenmRNAsinmurinenundhumanenTumoren.

DieRegulationeinzelnermRNAsderMYCNSignatur78undweitererbekannterZielevon

MYCNinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellswurdenimFolgendenmithumanen

Neuroblastomenverglichen:

Cyclin‐abhängigeKinase4 (Cdk4)wirdwährendderG1‐PhasedesZellzyklusvonCyc‐

linendesTypesDaktiviert.Molenaaretal.zeigen,dassdiehoheExpressionvonCDK4

mitschlechteremÜberlebenvonNeuroblastompatientenkorreliert.AußerdemistCDK4

sowohl in Tumoren als auch Zelllinien im Vergleich zu verschiedenen nicht‐malignen

Geweben hoch exprimiert. Die Herunterregulation von CDK4 in humanen Zelllinien

führt sowohl zu einem Arrest in der G1‐Phase des Zellzyklus als auch zur Induktion

neuralerDifferenzierung151,152.DieerhöhteExpressionvonCdk4inLSL‐MYCN;Dbh‐iCre

TumorenkönntemalignenZellendenDurchgangdurchdieG1‐Phaseerleichtern.

DasUbiquitin‐konjugierendeEnzymE2C(Ube2c)spieltbeiderDegradationvonmitoti‐

schenCyclinen und demAblauf des Zellzyklus eineRolle153. InGliomzellen führt eine

Herunterregulation von UBE2C zu einem Zellzyklusarrest in der G2/M Phase und zu

Apoptose154.IndenhumanenNeuroblastomzellenSHEPundSK‐N‐BE(2)‐CwirdUBE2C

einewichtigeRolle inderMitosezugeschrieben,wieeinsiRNAScreeningaufdeckte101.

LSL‐MYCN;Dbh‐iCreTumorezeigteneineHochregulationvonUbe2c.

MYCN‐amplifiziertehumaneNeuroblastomeexprimierensignifikanthöhereMengenan

Laktat‐Dehydrogenase(LDH) imVergleichzuTumorenmitnureinerMYCNKopie.Die

HerunterregulationvonLDHindenbeidenMYCN‐amplifiziertenNeuroblastomzelllinien

LAN5 und Kelly reduziert deren Proliferation. Außerdem verlieren Kelly Zellen bei

komplettemVerlustvonLDHihreTumorigenitätinvivo155.LSL‐MYCN;Dbh‐iCreTumore

exprimiertenLDHimVergleichzunicht‐malignenNebennierenüber.

Diskussion

100

EineÜberexpressionvonNme1korreliertmitungünstigemStadiumvonNeuroblastom‐

patienten. Eine Zunahme desNme1 Gens, das auf Chromosom17q lokalisiert ist, tritt

häufig inNeuroblastomenmithohemRisikoauf156.AußerdemistdasExpressionslevel

vonNme1starkmitderAggressivitätMYCN‐amplifizierterNeuroblastomeassoziiert102.

DieHochregulationvonNme1mRNAinLSL‐MYCN;Dbh‐iCreTumorenwurdeparallelzur

ZunahmedesChromosoms11,dasorthologzuhumanem17qist,festgestellt.

DerFamiliederRAS‐GenewerdeninverschiedenenTumorentitätenonkogeneFunktio‐

nen zugeschrieben157. Einer der drei Hauptvertreter dieser Familie ist NRAS, das ur‐

sprünglichauseinemhumanenNeuroblastomisoliertwurde158.InNeuroblastomzellen

mithoherMalignitätwirdNRAShöherexprimiertalsindenenmitniedrigererMaligni‐

tät100.InTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellswarNrasebenfallserhöht.

Schulteetal.beschreiben,dassKDM1AinundifferenziertenNeuroblastomenhochregu‐

liert ist.Außerdem regulierendifferenzierendeNeuroblastomzelllinienKDM1Aherun‐

terunddieHerunterregulationvonKDM1Amittels siRNA führtzurWachstumsinhibi‐

tion in vitro35. Sowohl LSL‐MYCN;Dbh‐iCre als auch TH‐MYCN Tumore weisen im

Vergleichzunicht‐malignenNebenniereneinesignifikanteÜberexpressionvonKdm1a

mRNAauf.

LSL‐MYCN;Dbh‐iCreTumorenexprimierienSpermidinSynthase(SRM)über.DieExpres‐

siondiesesEnzymskorreliertstarkmitderExpressionvonMYCNinhumanenNeuro‐

blastomen103.

Weitere Gene, die im LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModell reguliert wurden, wurdenmit einer

Internet‐Datenbank Myc‐regulierter Gene verglichen (www.myc‐cyncer‐gene.org),

wobeivalidiertwerdenkonnte,dassdiverseZielevonMYC,die imhumanenOrganis‐

musreguliertwerden,auchimmurineneinerRegulationunterliegen.

Einzelne mRNAs, die im murinen System anders reguliert waren, als im humanen

Neuroblastom, wurden ebenfalls detektiert, wodurch der Unterschied zwischen den

beidenSpeziesdeutlichwird.VerschiedeneepigenetischeRegulationsmechanismenund

verschiedeneSignalwegekönntenhiereineBegründungsein.

Diskussion

101

5.1.3.3 Vergleich der Genregulationen von Tumoren aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen

mithumanenundanderenmurinenNeuroblastomenaufmiRNAEbene

Mittels miRNA Profiling von fünf nicht‐malignen Nebennieren und elf Tumoren aus

LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenwurdenimModellreguliertemiRNAsidentifiziert.

AnhandeinerClusteranalysederGene,dieineinerpubliziertenMYCNmiRNASignatur

aufgedecktwurden80, konnten Tumore des LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells eindeutig von

nicht‐malignenNebennierensepariertwerden,eindeutlicherHinweisaufdieÄhnlich‐

keitderMYCNreguliertenmiRNAsinmurinenundhumanenTumoren.

DieRegulationeinzelnermRNAsderMYCNmiRNASignatur80undweitererbekannter

miRNAZielevonMYCNinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellswurdenimFolgen‐

denmithumanenNeuroblastomenverglichen:

TumoreausLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenwieseneineerhöhteExpressiondesmiR‐17‐92

Clusters auf. Für das humane Neuroblastom ist bekannt, dass dieses von c‐MYC und

MYCN induzierte, onkogene Cluster, Targets mit Schlüsselrollen in der Kontrolle des

Zellzyklus und der Apoptose reguliert159, wie zum Beispiel Bim59, E2F1159, p2159 und

TGFβ61. Für TH‐MYCN Tumore ist die Hochregulation verschiedener miRNAs des

miR‐17‐92Clustersebenfallsbeschrieben160.

Im Vergleich zu Neuroblastomenmit günstigemVerlauf, überexprimieren sowohl Tu‐

moremitungünstigemVerlaufalsauchTumoremitMYCNAmplifikationdasonkogene

miR‐181 Cluster80,110,112. Mestdagh et al. zeigen, dass miR‐181a zwar in MYCN‐

amplifizierten,abernicht inTumorenmiteinzelnerMYCNKopiehochreguliert istund

dassMYCNdirektandenPromotorvonmiR‐181abindet80.AuchinLSL‐MYCN;Dbh‐iCre

TumorenwarmiR‐181aüberexprimiert.

Die miR‐184 ist herunterreguliert in MYCN‐amplifizierten Tumoren im Vergleich zu

Tumoren mit nur einer Kopie von MYCN112. In den humanen Neuroblastomzelllinien

KellyundSK‐N‐ASkorrelierteineektopischeExpressionvonmiR‐184mitderInhibie‐

rung des Überlebens und der Herunterregulation von AKT2, einem Mitglied des

Phophatidylinositol‐3‐Kinase Signalweges, das eine wichtige Rolle für das Überleben

vonverschiedenenTumorzellenspielt.EineÜberexpressionvonMYCNführtzurHerun‐

terregulation der tumorsuppressiven miR‐184112,113,161. Auch Tumore des

LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modells wiesen eine Herunterregulation von miR‐184 auf, die

vermutlichaufdieÜberexpressionvonMYCNzurückzuführenist.

Diskussion

102

EineniedrigeExpressionvonmiR‐340istsignifikantmitMYCNAmplifikation,schlech‐

temEreignis‐freiemundGesamtüberlebenkorreliert. Außerdem führt dieExpression

vonmiR‐340 in denhumanenNeuroblastomzelllinien SK‐N‐BE, SH‐SY5YundKelly zu

einer signifikanten Reduktion der Zellviabilität80,115. Tumore aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCre

MäusenzeigtenebenfallseinegesteigerteExpressionvonmiR‐340.

Schulte et al. beschreiben eine signifikante Korrelation von niedrigermiR‐542‐5p Ex‐

pression und hohem Stadium in primären Neuroblastomen. Des Weiteren zeigen sie

eineAssoziationvonPatienten,dieeinenRückfallerleidenodereineMYCNAmplifika‐

tion haben und niedrigerer Expression dieser miRNA67. Sowohl miR‐542‐5p als auch

miR‐542‐3pwareninLSL‐MYCN;Dbh‐iCreundTH‐MYCNTumorensignifikantherunter‐

reguliert.

SowohlmiR‐26a undmiR‐26b als auchmiR‐30a,miR‐30d undmiR‐30e undmiR‐328

waren in Tumoren aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen niedriger exprimiert als in nicht‐

malignenNebennieren.EineFunktiondiesermiRNAsinhumanenoderTH‐MYCNTumo‐

ren ist zwar noch nicht beschriebenworden, aber sowohl inMYCN‐amplifizierten hu‐

manenNeuroblastomenalsauchinmurinenTumorensindsieherunterreguliert80,160.

WeiteremiRNAs,diesowohl inhumanenNeuroblastomenmitMYCNAmplifikationals

auch in Tumoren des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modells gleich reguliert werden, sind

miR‐15b, miR‐30c, miR‐103, miR‐140, miR‐148a, miR‐326, miR‐491, miR‐500 und

miR‐61580. Funktionen dieser miRNAs im Neuroblastom sind bisher jedoch nicht be‐

kannt.

Sowohl miR‐149, miR‐214 und miR‐324‐5p als auch miR‐331 und miR‐488 sind in

Tumorendes LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells undhumanenNeuroblastomen verschieden

reguliert.Während humaneNeuroblastomemit ungünstiger Prognose eine niedrigere

miR‐149 undmiR‐324‐5p Expression aufweisen als die mit günstiger Prognose110,112,

exprimierenTumoredesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellsdiesemiRNAsüber.Tumoremit

MYCN Amplifikation bzw. ungünstiger Prognose exprimieren miR‐214 über, was ver‐

mutlichaufdiedirekteBindungvonMYCNandenPromotordermiRNAberuht80,wäh‐

rend Tumore der LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Maus eine Herunterregulation dieser miRNA

aufweisen.HumaneNeuroblastomemitungünstigemVerlaufexprimierenimVergleich

zu denen mit günstigem Verlauf niedrige Level der miRNAs miR‐331‐3p und

miR‐488‐p110,währendTumoreausLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenbeidemiRNAsüberex‐

primieren.

Diskussion

103

AusderAnalysederinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellsreguliertenmRNAund

miRNA lässt sich zusammenfassen, dass ein großer Teil der im Modell regulierten

mRNAsundmiRNAsTargetsvonMYC(N)sindunddassdiversemRNAsundmiRNAsim

LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modell ähnlich reguliert sind wie im humanen Neuroblastom. Je‐

dochwurdenauchmRNAsundmiRNAsgefunden,dieimmurinenSystemandersregu‐

liertwaren,als imhumanenNeuroblastom,woranderUnterschiedzwischendenSpe‐

zieserkennbarwird.EineweitermöglicheBegründungdafürkönntesein,dasssichdie

miRNA‐Bindestellen mancher mRNAs zwischen den Spezies unterscheiden

(www.targetscan.org),waszuverschiedenenRegulationenführt.

EinevollständigeÜbertragungvonErkenntnissensowohlaufderEbenechromosomaler

Aberrationenals auchaufmRNAundmiRNALevel,die imLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModell

gewonnenwerden, aufdashumaneNeuroblastom istdemnach,wie in jedemanderen

Mausmodell auch, nicht möglich. Jedoch kann das LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mausmodell

genutztwerden,umneuepotentielltumormodulierendemRNAsundmiRNAszuidenti‐

fizieren. Ob diese auch bei der humanen Erkrankung eine Rolle spielen, muss dann

weiteranalysiertwerden.

5.1.4 MöglicheWeiterentwicklungen des LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells, die neue

ErkenntnissefürdieForschungamhumanenNeuroblastomgebenkönnten

Eine interessante Fragestellung betreffend der Neuroblastomentwicklung des

LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells,istdienachderZeitspanne,inderdasTransgenexprimiert

werdenmuss,damit esdieEntstehungeinesTumorsvermittelt.Dazu soll in späteren

VersuchendieVerpaarungderLSL‐MYCNMausmiteinerinduzierbarenDbh‐iCreMaus

durchgeführtwerden.Stubbuschetal. generierten2011dasMausmodellDbh‐CT,des‐

senCre‐Rekombinase‐AktivitätabhängigvoneinerBehandlungmitTamoxifen ist.Wie

beidemindieserArbeitverwendetenModellvonStankeetal.40stehtdieCre‐Rekombi‐

nase‐Expression unter Kontrolle des Dbh‐Promotors, jedoch handelt es sich um eine

inaktive Form der Rekombinase, die nur in Anwesenheit von Tamoxifen aktiviert

wird162. Mittels einer Tamoxifen‐Behandlung doppelt‐transgener LSL‐MYCN;Dbh‐CT

MäusewährendihrerEntwicklungundzuverschiedenenZeitpunktenihresLebenssoll

die Zeitspanne detektiert werden, während der eineMYCN Überexpression die Ent‐

wicklung eines Neuroblastoms vermittelt. Eine Übertragung auf den menschlichen

Diskussion

104

Organismus könnteweitere Einblicke in die Entstehung des humanenNeuroblastoms

gewähren.

Anhand des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mausmodells, dessen Tumore sich sowohl in ihren

chromosomalenAberrationenalsauchihrenmiRNAundmRNARegulationenhumanen

Neuroblastomenähneln, könnenneuepotentielleTargets einermedikamentösenThe‐

rapiegefundenundgetestetwerden.DieReaktionderTumoreaufdieBehandlungmit

nochnichtetabliertenMedikamentenkannwichtigeAufschlüsseaufdiehumaneThera‐

pierelevanzderMittelgeben.

EinweitererinteressanterVersuchsansatzistdieVerkreuzungmitanderentransgenen

Mausmodellen,diepotentiellfürdieNeuroblastomgeneserelevanteGeneregulieren.

UnsereArbeitsgruppepublizierte2012dasshLsd1‐Mausmodell,dasDoxycyclin‐abhän‐

gig eine shRNA gegen Lsd1 (Kdm1a) exprimiert, die Kdm1a spezifisch herunterregu‐

liert163.DieVerpaarungdiesesModellsmitderLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausunddieInduk‐

tion des Kdm1a Knockdowns könnte ein interessanter Ansatz zur Untersuchung der

RollevonKdm1abeiderTumorgenesedesNeuroblastomssein.Eswirdvermutet,dass

derKnockdownvonKdm1a,aufgrundseineronkogenenFunktion35,118,dasWachstum

der MYCN‐vermittelten murinen Neuroblastome verlangsamt. Weiterhin könnte der

VergleichdermolekularenEigenschaftenvonDoxycyclin‐behandeltenundnicht‐behan‐

deltenTumorenneueEinblickeindenSignalwegvonKdm1ageben.

AuchdieVerkreuzungmitMausmodellen,diemiRNAsregulieren, istein interessanter

Versuchsansatz. Eine miR‐17‐92‐Maus, die die miRNAs dieses Clusters Cre‐abhängig

deletiert164,stehtunsererArbeitsgruppezurVerfügung.EineHerunterregulationdieses

ClustersindenZellendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells,diehumanesMYCNexprimieren,

könntedieTumorgeneseverlangsamenodersogarunterbinden,schließlichwirddiesen

onkogenenmiRNAseinewichtigeFunktionimNeuroblastomzugeschrieben59,61.Weiter‐

hinkönntenunbekannteTargetsdermiRNAsdiesesClustersanhandvonExon‐Arrays

entdeckt werden, die nicht nur im Mausmodell sondern auch im humanen Neu‐

roblastomeineRollebeiderFunktiondiesermiRNAsspielenkönnten.

Diskussion

105

DieEtablierungeinerZelllinieausTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellskannvon

großerBedeutung fürdieArbeitmitdiesemModell sein.PotentiellwirksameMedika‐

mente könnten vor dem in vivo Experiment an den Zellen in vitro getestet werden,

wodurchTierexperimenteeingeschränktwürden. ImVerlaufdieserArbeit ist esnicht

gelungeneineZellliniedesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellszuetablieren.

5.1.5 Die Relevanz des LSL‐MYCN Mausmodells für die Genese anderer

Tumorentitäten

Neben der Verpaarung mit derDbh‐iCre Maus, wurden LSL‐MYCN Tiere mit Alb‐iCre

Mäusengekreuzt.Doppelt‐transgeneNachkommenentwickeltenimAltervon246‐286

Tagen mit einer Inzidenz von 86% Tumore, die pathologisch als Leberzellkarzinome

beschriebenwurden (Datennicht gezeigt). Somit konnte gezeigtwerden, dass die Ex‐

pression vonhumanemMYCN in spezifischenGewebendieEntwicklung vonweiteren

Tumormodellen treiben kann. Besonders für Tumorentitäten, für die noch keine pas‐

sendenMausmodelleexistieren,wäredieseininteressanterAspektfürdieForschung.

T5.2

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106

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Diskussion

107

5.2.1 DietumorsuppressiveFunktionvonmiR‐542imNeuroblastom

Aufgrund der niedrigen Expression vonmiR‐542‐3p in murinen Neuroblastomen des

neuenLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausmodellswurdevermutet,dassmiR‐542‐3peinetumor‐

suppressiveFunktionimNeuroblastomhabenkönnte.EinesignifikanteHerunterregula‐

tionvonmiR‐542‐3pinhumanenNeuroblastomenmitschlechterPrognoseimVergleich

zuTumorenmitguterPrognosebestätigtedieseThese.

AnhandvoninvitroAnalyseninetabliertenNeuroblastomzelllinienwurdederNachweis

erbracht,dasseineexogeneExpressionvonmiR‐542‐3psowohlApoptoseinduziertals

auch die Viabilität und Proliferation der Zellen reduziert. Weiterhin konnte gezeigt

werden,dassdieExpressiondiesermiRNAeinenArrestderZellen inderS‐Phasedes

Zellzyklusmit sich bringt.Dahingegen resultierte die exogeneExpressionder5p‐Isof‐

ormdermiR‐542nurbeieinerderanalysiertenZelllinienineinerReduktionderZellvi‐

abilitätund‐proliferation.WederApoptosenocheinArrestimZellzykluswurdeinden

Zelllinien ausgelöst. Dieses Resultat unterstützt die Publikation von Bray etal., dass

miR‐542‐5p keinen Effekt auf die Proliferation der Neuroblastomzelllinien Kelly,

NB1691 und SK‐N‐AS hat, aber sowohl in Kelly als auch in SK‐N‐AS Zellen zu einer

verringerten Invasivität durch eineMatrigel‐Matrix führt68. Entgegen der allgemeinen

Annahme, dass die 5p‐Isoform vonmiRNAs diejenige ist, die den biologischen Effekt

ausmacht, wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass im Fall der miR‐542 die 3p‐Form als

tumorsuppressivfungiert,währenddie5p‐FormkeineneindeutigenEffektzeigt51,52.

Yoon et al. publizierten, dassmiR‐542‐3p das vorhergesagte Target Survivin in A549

undMCF7 Zellen direkt herunterreguliert69. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt

werden, dass in primären humanen Neuroblastomen eine niedrige Expression von

SurvivinzumeinenmiteinergesteigertenExpressionvonmiR‐542‐3pundzumanderen

einer besseren Prognose für den Patienten einhergeht,wobei die Korrelationmit der

Prognosebekanntist173,174.WeiterhinwareineexogeneExpressionvonmiR‐542‐3pin

NeuroblastomzelllinienmiteinerHerunterregulationvonSurvivinkorreliert.Außerdem

führtediesermiR‐542‐3p‐vermittelteKnockdownvonSurvivinzueinerVerminderung

derExpressionvonAURKB,demKomplexpartnervonSurvivin.Esistbekannt,dassdie

EntfernungvonSurvivinmitFehllokalisationundverminderterAktivitätvonAURKBin

Zusammenhangsteht.AußerdemführtderKnockdownvonSurvivinzuFehlernbeider

Zytokinese, die auf die verminderteAktivität vonAURKBzurückgeführtwerden175‐177.

InteressanterweisewirdbeiderdurchdiePolo‐like‐Kinase1‐vermitteltenPhosphoylie‐

rung von Survivin zuerst Survivin und dann AURKB aktiviert178.Wie schon für A549

Diskussion

108

Zellenpubliziert69,wurdeanhandvonLuziferaseReporterAssayseinedirekteBindung

dermiR‐542‐3pandieWildtyp3’UTRvonSurvivin,sowohlinfürdiesenAssayetablier‐

tenHEK‐293 als auch in SHEP Zellen, nachgewiesen,während dieser Effektmit einer

mutiertenBindestellenichterreichtwurde.

In Neuroblastomzelllinien führte ein Knockdown von Survivin zu einer verminderten

Zellviabilitätund‐proliferation,einEffekt,derauchdurchExpressionvonmiR‐542‐3p

erreichtwurde.BeiderUntersuchungdesZellzyklusreagiertendreivonvierZelllinien

beiKnockdownvonSurvivinmiteinemArrestinderPhaseS,währendeineZellliniemit

einemArrestinderG2/M‐Phaseantwortete.

Die herausragende Bedeutung von Survivin für die tumorsuppressive Funktion der

miR‐542‐3p im Neuroblastomzelllinien, konnte anhand eines Rettungsexperimentes

bewiesenwerden.DieÜberexpressionvonSurvivincDNAohnemiR‐542‐3p‐Bindestelle

rettetedieNeuroblastomzelllinieSHEPgrößtenteilsvordemPhänotypdermiR‐542‐3p

Expression. Daraus lässt sich schließen, dass es einen Zusammenhang zwischen dem

Phänotyp dermiR‐542‐3p Expression und der Survivin Regulation gibt. Jedoch ist es

möglich, dassdieRegulation vonanderenZielendiesermiRNAebenfalls eine funktio‐

nelle Auswirkung auf den Phänotyp humaner Neuroblastomzellen haben könnte. In

zusätzlichenExperimenten,diebeimVerfassendieserArbeitnochnichtabgeschlossen

waren, sollten weitere von miR‐542‐3p regulierte Targets gefunden werden. Dazu

werden mRNA‐Expressionsprofile von mit Negativkontroll‐miRNA oder miR‐542‐3p

transfiziertenNeuroblastomzelllinienmiteinanderverglichen.Weiterepotentiellfunkti‐

onelle Targets der miRNA, die dabei evtl. gefunden werden, sollen dann anhand von

weitereninvitroStudienvalidiertwerden.

Transfektionsreagenzienwerden benutzt, ummiRNAs in vitro in Zellen einzubringen.

Für eine Behandlung in vivo müssen miRNAs vor ihrem Abbau durch Nukleasen ge‐

schütztwerden.DieArbeitsgruppeEppleanderUniversitätDuisburg‐Essenentwickelte

Calcium‐Phosphat‐Nanopartikel,mitderenHilfesiesiRNAsinvitroinZelleneinbringen

konnten,waszueinerHerunterregulationdessiRNATargetsführte84.Dabeiwerdenmit

siRNA‐beladene Calcium‐Phosphat‐Nanopartikel durch Endozytose in die Zelle aufge‐

nommen.ImZytoplasmaschütztderNanopartikeldieNukleinsäurevorihremAbbau.Es

istbekannt,dassdasEindringenderNukleinsäureindenZellkernüberKernporenkom‐

plexevermitteltwird,aberesistnochunklar,obderNanopartikeldiesenWegebenfalls

nimmt oder im Zytoplasma verbleibt. Im Rahmen dieser Arbeit sollten mit miRNA‐

beladeneCalcium‐Phosphat‐NanopartikelfürdieUntersuchungdertumorsuppressiven

Diskussion

109

FunktionvonmiR‐542‐3pinvivoverwendetwerden.ZuerstwurdederenFunktionalität

invitroanWACIIZellenvalidiert.ImVergleichzurunbehandeltenKontrollereagierten

mitNegativkontroll‐miRNAbeladenenNanopartikeln behandelte Zellenmit einer ten‐

denziellen,abernichtsignifikantenReduktionvonZellviabilitätsowie‐proliferationund

mit einer signifikanten Induktion von Apoptose. Demnach schienen die verwendeten

Calcium‐Phosphat‐Nanopartikel allgemein einen toxischen Effekt aufWACII Zellen zu

induzieren.EineToxizitätaufdieZellviabilität ist inHeLaZellennichtbekannt179.Auf‐

grund der apoptotischen Wirkung von PEI auf verschiedene humane Zelllinien180,181,

wurdevermutet,dassauch inWACIIZellendas indenNanopartikelnvorhandenePEI

derenToxizitätausmacht.TrotzdeminduzierteeineBehandlungvonWACIIZellenmit

miR‐542‐3pbeladenenNanopartikelnimVergleichzuunbehandeltenundmitNegativ‐

kontroll‐miRNAbehandeltenZellensignifikantsowohleineReduktionderZellviabilität

und‐proliferationalsaucheineSteigerungderApoptose.AufBasisdieserTatsacheund

desNachweises, dassmiR‐542‐3p‐beladeneNanopartikel die SurvivinProteinExpres‐

sion inWACII Zellen reduzieren, wurde die Spezifität der mit miR‐542‐3p‐beladenen

Nanopartikel bestätigt. Weiterhin wurden Neuroblastom‐Xenografts‐tragende Mäuse

mitmiR‐542‐3p beladenen Nanopartikeln über zwei Tage behandelt. Sowohl eine er‐

höhteExpressionvonmiR‐542‐3palsaucheineReduktionvonSurvivinProteinkonnte

in den Tumoren aus mit miR‐542‐3p behandelten Mäusen im Vergleich zu den mit

Negativkontroll‐miRNAbehandeltenvalidiertwerden,wasdieSpezifitätderNanoparti‐

kel auch invivo bestätigte.Die signifikanteReduktionvonProliferationund Induktion

von Apoptose in diesen Tumoren wies darauf hin, dass der miR‐542‐3p‐vermittelte

KnockdownvonSurvivinauchinvivofunktionellwar.DieProduktionvonmiRNA‐bela‐

denenNanopartikelnistbiszumheutigenZeitpunktnochineffektiv,weshalbeineLang‐

zeitstudie zum Effekt der Behandlung auf die Volumenveränderung der Tumore im

RahmendieserArbeitnichtdurchgeführtwerdenkonnte.

AufgrundderhohenÜberexpressionvonSurvivininverschiedenenTumorentitätenund

derniedrigenExpressioninnormalenGewebenwirdSurvivinsowohlalsTumormarker

alsauchalsTargetfürdieNeuroblastomtherapiediskutiert182,183.VerschiedeneGruppen

beschreiben Medikamente, die die Expression von Survivin in Neuroblastomzellen

reduzieren. Demnach ist die proapoptotische Antwort der Neuroblastomzelllinien

SK‐SY5Y und LA1‐5S auf Noscapine vermittelt durch die Unterdrückung der Survivin

Protein Expression184. Interessanterweise potenziert ein Survivin Knockdown in SK‐

N‐BE2 und SH‐SY5Y Zellen den Effekt von Epigallocatechingallat185, einem

Diskussion

110

CarbonsäureesterderGallussäure,deringrünemTeevorkommtunddemapoptotische

Wirkung in verschiedenen neuroektrodermalen Tumoren nachgewiesen wurde186. Da

ein direkter Knockdown von Survivin in vivo nicht ausführbar ist, könnte hier eine

Kombination aus miR‐542‐3p‐beladenen Nanopartikeln und Epigallocatechingallat

getestetwerden.YM155,einnieder‐molekularesPräparatzurRepressionvonSurvivin,

wurde2007vonNakaharaetal.beschrieben.DieSubstanzsupprimiertdieExpression

von Survivin, induziert Apoptose von Prostatakarzinomzelllinien PC‐3 und PPC‐1 in

vitround induziertTumor‐RegressionvonXenograftsausPC‐3Zellen187.Lamersetal.

untersuchten die Effizienz von YM155 in 23 Neuroblastomzelllinien, die auf einen

shRNA‐vermitteltenKnockdownvonSurvivinmitmassiverApoptose reagierten.Neun

Zelllinienwiesen eineResistenz gegenYM155 auf, diemit hoher Expression desMul‐

tidrug‐ResistanceProtein1(MDR1)korrelierte74.UnterdenresistentenZelllinienbefin‐

det sich unter anderen SK‐N‐BE, die wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, auf die

miR‐542‐3p‐vermittelte Repression von Survivin sehr effizient reagiert. In weiteren

StudiensolltedieEffektivitätdermiR‐542‐3pExpressionaufweitereNeuroblastomzell‐

liniengetestetwerden,davermutetwird,dassdertumorsuppressiveEffektdermiRNA

nichtdurchResistenzentwicklungaufgehobenwerdenkann.

Sobald die Effizienz der Nanopartikelherstellung erweitert und damit effektiver ist,

könnte eine Nanopartikel‐basierte Therapie mit ausgewählten miRNAs, wie der

miR‐542‐3p, inZukunfteinneuerAnsatz fürdieBehandlunghumanerNeuroblastome

undandererTumorentitätensein.

Diskussion

111

5.2.2 DietumorsuppressiveFunktionvonmiR‐137imhumanenNeuroblastom118

SowohlimneuenLSL‐MYCN;Dbh‐iCrealsauchimetabliertenTH‐MYCNMausmodellfür

dasNeuroblastomwarKdm1a imVergleichzunicht‐malignenNebennierensignifikant

hochreguliert. Auf Basis dieser Erkenntnis wurde KDM1A als potentielles Ziel einer

Neuroblastomtherapie gehandelt. In verschiedenen Tumorentitäten wie Brustkrebs33,

kleinzelligem Lungenkarzinom, Kolorektal‐, Blasen‐ und Prostatakrebs188 ist KDM1A

überexprimiert. Auch im humanenNeuroblastom ist eine erhöhte Expression imVer‐

gleich von undifferenzierten zu differenzierten Tumoren bekannt35. Weiterhin ist

KDM1AinnerhalbderneuroblastischenTumoreimNeuroblastomhöherexprimiertals

imgutartigenGlanglioneuroblastom189.DieEffektivitätverschiedenernieder‐molekula‐

rer Inhibitoren gegenMonoaminoxidasenwurden auf ihreWirkung gegen KDM1A in

NeuroblastomzelllinienSHEP,SH‐SY5YundLAN‐1getestet,jedochwareinEffektaufdie

ViabilitätderZellennur invitro,nichtaberim invivoXenograft‐Modellnachweisbar35.

DieEntwicklungvonneuenspezifischenKDM1AInhibitorenwirdalsKDM1A‐gerichtete

TherapiegegendasNeuroblastomdiskutiert35,190.

EinemöglicheVerminderungderKDM1AExpressionkönnteauchdurchdieExpression

einermiRNAerreichtwerden,diedirektandie3’UTRvonKDM1Abindet.Einepotentiell

tumorsuppressive Funktion, die eine Bindestelle in der 3’UTR von humanem KDM1A

aufweist, war miR‐137. In murinen LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Tumoren war diese miRNA

hochreguliert, was die These einer tumorsuppressivenmiRNA nicht unterstützte. Am

murinen Kdm1a befindet sich jedoch keine Bindestelle für diese miRNA

(www.targetscan.org),weshalbdieseRegulationsachse immurinenSystemkeineRolle

spielt.ImhumanenNeuroblastomwurdedieFunktionvonmiR‐137imweiterenVerlauf

derAnalysenuntersucht.

Eine niedrige Expression vonmiR‐137 ging sowohlmit ungünstigemVerlauf als auch

mit niedrigeremÜberleben vonNeuroblastompatienten einher. Invitro reduzierte die

exogeneExpression dermiRNA sowohl Zellviabilität und ‐proliferation als auch indu‐

zierte sie Apoptose, Caspase 9 Aktivität sowie neuronale Differenzierung der Neuro‐

blastomzelllinienIMR‐32,SHEPundSK‐N‐BE.WeiterhinwurdeKDM1Adirektdurchdie

ExpressionmiR‐137herunterreguliert,wodurchdasKDM1AZielTFPI2ebenfallsregu‐

liertwurde.FürmiR‐137sindverschiedenemRNAZielevorhergesagt,weshalbsichdie

Frage stellte, welcher Teil des Effektes von miR‐137 auf die Regulation von KDM1A

zurückgingundwelcheraufdenKnockdownanderermiR‐137Ziele.EinRettungsexpe‐

rimentzeigte,dassderEffektdermiR‐137ExpressionteilweiseaufdieRegulationvon

Diskussion

112

KDM1Azurückzuführenwar,jedochandereZieledermiRNAebenfallseinefunktionelle

Rollespielenmussten.WeiterhinerklärtedasModelldiephänotypischenUnterschiede

zwischenderExpressionvonmiR‐137unddesKnockdownvonKDM1AmittelssiRNA,

wiezumBeispieldieEinleitungvonApoptoseoderderBlockderProliferationinIMR‐32

Zellen.

AnhandderdurchgeführtenProteomanalysewurdeAKAP2alsweiterespotentiellfunk‐

tionelles Target der miR‐137 gefunden. Dieses Protein, welches vier Bindestellen für

miR‐137 aufweist, separiert die Prognose von Neuroblastompatienten anhand seiner

Expression in den Tumoren,was eine onkogene Funktion vermutet lässt. Der Knock‐

down von AKAP2 mittels siRNA kopierte den Phänotyp der miR‐137 Expression. Im

RahmendieserArbeitwurdedieBedeutungdermiR‐137‐vermitteltenRegulationvon

AKAP2nichtweiteruntersuchtunddiedirekteBindungdermiRNAandievorhergesag‐

tenBindestellenbishernichtvalidiert. InweiterenExperimentensollteAKAP2alspo‐

tentiellfunktionellesTargetdermiR‐137näheruntersuchtwerden.BiszudiesemZeit‐

punktistnochkeineFunktionvonAKAP2inKrebserkrankungenbeschrieben.

InteressanterweiseistKDM1AauchinneuralenVorläuferzellenexprimiertundintera‐

giert hier mit dem Transkriptionsfaktor NR2E1. Dieser nukleare Rezeptor wird aus‐

schließlich imembryonalenNeuroepitheliumexprimiertundregulierthierdieExpres‐

sionvonmiR‐137.KDM1AgiltalstranskriptionalerKo‐RepressorvonNR2E1undeine

erhöhteExpressionvonmiR‐137inneuralenStammzellenführtzureduzierterProlife‐

rationund induziert neuronaleDifferenzierung191.DieExpression vonmiR‐137 ist im

GlioblastomsignifikantniedrigeralsimGehirnundinneuralenStammzellen.Weiterhin

unterstützteineÜberexpressiondermiRNAneuronaleDifferenzierung inGlioblastom‐

zellen. In diesen Zellen wird ein weiteres Zielgen der miR‐137, nämlich RTVP‐1, be‐

schrieben, das direkt von miR‐137 gebunden wird und dessen Herunterregulation

tumorsuppressiveWirkunghat192.Lietal.demonstrierten,dassdieExpressionvonmiR‐

137dasZellwachstumsowiedieInvasionderGlioblastomzellenU87undU373inhibiert

und die Expression von CSE1L, einemweiteren vorhergesagten Target diesermiRNA,

reguliert193.WeiterhinsupprimiertmiR‐137dieInvasionvonKolorektalkarzinomzellen

durchdiedirekteBindunganFMNL2120.AndersrumführtdieSuppressionvonmiR‐137

inKolorektalkarzinomzellenzueinerÜberexpressionvonPaxillin(PXN)undzurInhibi‐

tionderProliferation,MigrationundInvasionderZellen119. InBrustkrebszellen istdie

Diskussion

113

Expression von miR‐137 invers mit der von YB‐1 korreliert, einem weiteren Target

diesermiRNA194.SowohlCDC42alsauchCDK6sindbeschriebeneTargetsvonmiR‐137

inLungenkrebszellen,derenProliferationdurchdieExpressionvonmiR‐137 inhibiert

wird121.DieseundweiterePublikationenunterstützendieTheseeinertumorsuppressi‐

ven Funktion vonmiR‐137 in verschiedenen Tumorentitäten, die in dieser Arbeit an‐

handdesNeuroblastomsgezeigtwurde.DiebeschriebenenTargetsdermiRNAkönnten

auch im humanen Neuroblastom die tumorsuppressive Funktion vonmiR‐137weiter

erklären.

ZusammenfassungundAusblick

114

6 ZusammenfassungundAusblick

DasNeuroblastom istderhäufigstesolideTumordesKindesaltersundverantwortlich

fürca.15%allerpädiatrisch‐onkologischenTodesfälle.EineAmplifikationdesOnkogens

MYCN,durchwelchedieprognostischungünstigstePatientengruppedefiniertist,liegtin

20%allerNeuroblastomevor.ImRahmendieserArbeitwurdeeinneuesCre‐konditio‐

nalesMYCN‐vermitteltesMausmodell (LSL‐MYCN) entwickelt.DurchdieKreuzungmit

Dbh‐iCre Mäusen wurde die Expression desMYCN Transgens auf Dopamin‐‐Hydro‐

xylaseexprimierendeZellenbeschränkt,waszurEntwicklungvonTumorenderNeben‐

nieren, der oberen Zervikalganglien und des Ganglion coeliacum führte. Die Tumore

wiesensowohldiefürdasNeuroblastomspezifischenkleinen,blauenundrundenZellen

alsauchneurosekretorischeVesikelauf.WeiterhinkonnteeinesignifikanteÜberexpres‐

sion von humanem MYCN und spezifischer Neuroblastommarker detektiert werden.

Genomische Aberrationen sowie mRNA und mikroRNA (miRNA) Expressions‐Profile

entsprachendenenhumanerNeuroblastome.

MiRNAs sind kurze, nicht‐kodierende RNA Moleküle, die durch Bindung an mRNAs

derenStabilitätundTranslationregulieren.DieBedeutungvonmiRNAsinderTumorbi‐

ologie ergibt sich aus der Regulation von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen. In

humanenprimärenNeuroblastomenwardieniedrigeExpressiondermiRNAsmiR‐542‐

3pundmiR‐137mitungünstigerPrognoseassoziiertundeineHerunterregulationvon

miR‐542‐3pkonnteauchinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellsbeobachtetwer‐

den.DieFunktionbeidermiRNAswurde invitro inpräklinischenModellsystemendes

humanen Neuroblastoms detailliert untersucht. Die ektope Expression der miRNAs

reduziertedieZellviabilitätundProliferation,erhöhtedieApoptoserateundinduzierte

einenZellzyklusarrest.WeiterhinwurdediedirekteBindungder vorhergesagtenZiel‐

mRNAsKDM1A(miR‐137)undSurvivin(miR‐542‐3p)mittelsLuziferaseReporterAna‐

lysenvalidiertunddieRegulationsowohlaufmRNA‐alsauchaufProteinebeneverifi‐

ziert.DieHerunterregulationderZielgeneinNeuroblastomzellenstellteeinePhänoko‐

piederEffekteeinerexogenenExpressionderjeweiligenmiRNAdar.DieSpezifitätder

miRNA‐vermittelten Regulationwurde durch ektope Expression des Zielgensmitmu‐

tierter miRNA‐Bindestelle nachgewiesen. Eine Therapiesimulation in Neuroblastom‐

Xenografts mit miR‐542‐3p‐beladenen Nanopartikeln zeigte sowohl eine Herunterre‐

ZusammenfassungundAusblick

115

gulationdesZielproteinsSurvivinalsaucheineReduktionderProliferationundErhö‐

hungderApoptoserateindenTumorzellen.

DieEtablierungdesneuenLSL‐MYCN;Dbh‐iCreNeuroblastom‐Mausmodellskanndabei

helfensowohldiePathogenesedesNeuroblastomsbesserzuverstehenalsauchpotenti‐

ellNeuroblastom‐relevanteGeneundmiRNAszuidentifizieren.EineWeiterentwicklung

dieses Modells durch Kombination mit anderen Mausmodellen, die potentiell Neuro‐

blastom‐relevante Gene regulieren, könnte im Zusammenspiel mit neuen Behand‐

lungsstrategien Einblicke in die Wirksamkeit von künftigen Neuroblastomtherapien

geben. Die Behandlung humaner Neuroblastompatienten mit tumorsuppressiven

miRNAs,wiemiR‐542‐3pundmiR‐137,könnteeinmöglicherAnsatzseindenaggressi‐

venVerlaufdieserErkrankungzureduzieren.

Abstract

116

7 Abstract

Neuroblastomaisacommonsolidtumorofinfancyandaccountsformorethan15%of

pediatric cancer deaths. Amplification ofMYCN oncogene defines themost aggressive

subtypeofneuroblastomawithpoorprognosis. Inthepresentstudy,anewCre‐condi‐

tionalMYCN‐driventransgenicmousemodelwasgeneratedtoanalysetumorigenesisin

vivo.WhentargetingMYCNexpressiontotheneuralcrestintransgenicLSL‐MYCN;Dbh‐

iCremice,palpabletumorsdeveloped,whicharosepredominantly frombothadrenals,

but also from superior cervical ganglia and ganglion coeliacum. LSL‐MYCN;Dbh‐iCre‐

induced tumors consisted of small round blue cells and possessed neurosecretory

vesicles.ExpressionofhumanMYCNandspecificneuroblastomamarkergeneswashigh

intumors.Furthermore,murineneuroblastomasrecapitulatedgenomicaberrationsand

MYCNmRNAaswellasmicroRNA(miRNA)signaturesdescribedforhumanneuroblas‐

toma.MiRNAsaresmallnoncodingRNAmoleculesthatbindtargetmRNAsresultingin

translational repressionordegradationof themRNA. Incancer, theycanactas tumor

suppressorsoroncogenes. Inhumanprimaryneuroblastomas, lowexpressionofmiR‐

542‐pandmiR‐137washighlycorrelatedwithunfavourableprognosisandmiR‐542‐3p

wasupregulatedinmurineLSL‐MYCN;Dbh‐iCretumors.Exogenousexpressionofthese

miRNAs in established neuroblastoma cell lines reduced viability and proliferation,

increased apoptosis and induced cell cycle arrest. Furthermore, direct interaction be‐

tweenthepredictedtargetssurvivin(miR‐542‐3p)andKDM1A(miR‐137)wasvalidated

by luciferase reporter assays and regulation was demonstrated on mRNA as well as

protein level. Ectopic expression of miR‐542‐3p or miR‐137 phenocopied the knock‐

down of respective targets. In addition, wewere able to validate a direct interaction

between miRNAs and their targets by performing rescue experiments. Treatment of

micebearingneuroblastomaxenograftswithmiR‐542‐3p‐loadednanoparticlesresulted

indownregulationof survivinand inducedreduced tumorcellproliferationaswell as

increasedapoptosis.

Inconclusion,thenovelLSL‐MYCN;Dbh‐iCreneuroblastomamousemodelcontributeto

abetterunderstandingofMYCN‐drivenneuroblastomaandtoidentificationofrelevant

genes and miRNAs. Combination with other transgenic models, regulating potential

relevantgenes,couldprovidenewinsightsintoneuroblastomatumorigenesis.Restoring

functionoftumorsuppressivemiRNAs,suchasmiR‐542‐3pormiR‐137,couldrepresent

afeasibleapproachtoreduceneuroblastomaaggressiveness.

Literatur

117

8 Literatur

1 Pizzo,P.&Poplack,D.Principlesandpracticeofpediatriconcology.6thed.edn,(LippincottWilliams&Wilkins,2011).

2 Schwab,M.,Westermann,F.,Hero,B.&Berthold,F.Neuroblastoma:biologyandmolecularandchromosomalpathology.Thelancetoncology4,472‐480(2003).

3 Matthay, K. K., George, R. E. & Yu, A. L. Promising therapeutic targets inneuroblastoma. Clinical cancer research : an official journal of the AmericanAssociationforCancerResearch18,2740‐2753,doi:10.1158/1078‐0432.CCR‐11‐1939(2012).

4 Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. The New England journal ofmedicine362,2202‐2211,doi:10.1056/NEJMra0804577(2010).

5 Brodeur, G. M., Seeger, R. C., Barrett, A., Berthold, F., Castleberry, R. P. et al.Internationalcriteriafordiagnosis,staging,andresponsetotreatmentinpatientswithneuroblastoma.Journalofclinicaloncology:officialjournaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology6,1874‐1881(1988).

6 Brodeur,G.M.,Pritchard,J.,Berthold,F.,Carlsen,N.L.,Castel,V.etal.Revisionsofthe international criteria forneuroblastomadiagnosis, staging, and response totreatment.Journalofclinicaloncology :official journaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology11,1466‐1477(1993).

7 (2004).8 Spix, C., Pastore, G., Sankila, R., Stiller, C. A. & Steliarova‐Foucher, E.

NeuroblastomaincidenceandsurvivalinEuropeanchildren(1978‐1997):reportfrom the Automated Childhood Cancer Information System project. Europeanjournalofcancer42,2081‐2091,doi:10.1016/j.ejca.2006.05.008(2006).

9 Ceschel, S., Casotto, V., Valsecchi, M. G., Tamaro, P., Jankovic, M. et al. Survivalafterrelapseinchildrenwithsolidtumors:afollow‐upstudyfromtheItalianoff‐therapy registry.Pediatricblood& cancer47, 560‐566, doi:10.1002/pbc.20726(2006).

10 Simon,T.,Berthold,F.,Borkhardt,A.,Kremens,B.,DeCarolis,B.etal.Treatmentand outcomes of patients with relapsed, high‐risk neuroblastoma: results ofGerman trials. Pediatric blood & cancer 56, 578‐583, doi:10.1002/pbc.22693(2011).

11 Cotterill, S. J., Pearson, A. D., Pritchard, J., Foot, A. B., Roald, B. et al. Clinicalprognosticfactorsin1277patientswithneuroblastoma:resultsofTheEuropeanNeuroblastomaStudyGroup'Survey'1982‐1992.Europeanjournalofcancer36,901‐908(2000).

12 Hann, H.W., Evans, A. E., Siegel, S. E., Wong, K. Y., Sather, H. et al. PrognosticimportanceofserumferritininpatientswithStagesIIIandIVneuroblastoma:theChildrens Cancer Study Group experience. Cancer research 45, 2843‐2848(1985).

13 Shuster, J. J., McWilliams, N. B., Castleberry, R., Nitschke, R., Smith, E. I. et al.Serumlactatedehydrogenaseinchildhoodneuroblastoma.APediatricOncologyGrouprecursivepartitioningstudy.Americanjournalofclinicaloncology15,295‐303(1992).

14 Brodeur, G. M., Seeger, R. C., Schwab, M., Varmus, H. E. & Bishop, J. M.Amplification of N‐myc in untreated human neuroblastomas correlates withadvanceddiseasestage.Science224,1121‐1124(1984).

Literatur

118

15 Canete,A.,Gerrard,M.,Rubie,H.,Castel,V.,DiCataldo,A.etal.Poorsurvivalforinfants with MYCN‐amplified metastatic neuroblastoma despite intensifiedtreatment: the International Society of Paediatric Oncology EuropeanNeuroblastoma Experience. Journal of clinical oncology : official journal of theAmerican Society of Clinical Oncology 27, 1014‐1019,doi:10.1200/JCO.2007.14.5839(2009).

16 Pugh,T.J.,Morozova,O.,Attiyeh,E.F.,Asgharzadeh,S.,Wei,J.S.etal.Thegeneticlandscape of high‐risk neuroblastoma. Nature genetics 45, 279‐284,doi:10.1038/ng.2529(2013).

17 Amati,B.&Land,H.Myc‐Max‐Mad:atranscriptionfactornetworkcontrollingcellcycle progression, differentiation and death. Current opinion in genetics &development4,102‐108(1994).

18 Shimada, H., Nakagawa, A., Peters, J., Wang, H., Wakamatsu, P. K. et al. TrkAexpression in peripheral neuroblastic tumors: prognostic significance andbiologicalrelevance.Cancer101,1873‐1881,doi:10.1002/cncr.20557(2004).

19 Nakagawara, A., Azar, C. G., Scavarda, N. J. & Brodeur, G. M. Expression andfunction of TRK‐B andBDNF in human neuroblastomas.Molecularand cellularbiology14,759‐767(1994).

20 Chen,Y.,Takita,J.,Choi,Y.L.,Kato,M.,Ohira,M.etal.OncogenicmutationsofALKkinase in neuroblastoma. Nature 455, 971‐974, doi:10.1038/nature07399(2008).

21 DeBrouwer,S.,DePreter,K.,Kumps,C.,Zabrocki,P.,Porcu,M.etal.Meta‐analysisof neuroblastomas reveals a skewed ALK mutation spectrum in tumors withMYCNamplification.Clinicalcancerresearch :anofficial journaloftheAmericanAssociationforCancerResearch16,4353‐4362,doi:10.1158/1078‐0432.CCR‐09‐2660(2010).

22 Mosse,Y.P.,Laudenslager,M.,Longo,L.,Cole,K.A.,Wood,A.etal.IdentificationofALKasamajorfamilialneuroblastomapredispositiongene.Nature455,930‐935,doi:10.1038/nature07261(2008).

23 Bown, N., Cotterill, S., Lastowska, M., O'Neill, S., Pearson, A. D. et al. Gain ofchromosomearm17qandadverseoutcomeinpatientswithneuroblastoma.TheNew England journal of medicine 340, 1954‐1961,doi:10.1056/NEJM199906243402504(1999).

24 Combaret, V., Brejon, S., Iacono, I., Schleiermacher, G., Pierron, G. et al.Determination of 17q gain in patients with neuroblastoma by analysis ofcirculatingDNA.Pediatricblood&cancer,doi:10.1002/pbc.22816(2011).

25 Islam, A., Handley, S. L., Thompson, K. S. & Akhtar, S. Studies on uptake, sub‐cellular traffickingandeffluxofantisenseoligodeoxynucleotides ingliomacellsusing self‐assembling cationic lipoplexes as delivery systems. Journal of drugtargeting7,373‐382(2000).

26 Lamers,F.,vanderPloeg,I.,Schild,L.,Ebus,M.E.,Koster,J.etal.Knockdownofsurvivin (BIRC5) causes apoptosis in neuroblastoma via mitotic catastrophe.Endocrine‐relatedcancer18,657‐668,doi:10.1530/ERC‐11‐0207(2011).

27 Carmena, M., Wheelock, M., Funabiki, H. & Earnshaw,W. C. The chromosomalpassenger complex (CPC): from easy rider to the godfather of mitosis.Naturereviews.Molecularcellbiology13,789‐803,doi:10.1038/nrm3474(2012).

28 Altieri, D. C. The case for survivin as a regulator ofmicrotubule dynamics andcell‐death decisions. Current opinion in cell biology 18, 609‐615,doi:10.1016/j.ceb.2006.08.015(2006).

Literatur

119

29 Xu, J. & Andreassi, M. Reversible histone methylation regulates brain geneexpression and behavior. Hormones and behavior 59, 383‐392,doi:10.1016/j.yhbeh.2010.08.019(2011).

30 Hu, X., Ybarra, R., Qiu, Y., Bungert, J. & Huang, S. Transcriptional regulation byTAL1: a linkbetweenepigeneticmodifications anderythropoiesis.Epigenetics :officialjournaloftheDNAMethylationSociety4,357‐361(2009).

31 Huang,J.,Sengupta,R.,Espejo,A.B.,Lee,M.G.,Dorsey,J.A.etal.p53isregulatedbythelysinedemethylaseLSD1.Nature449,105‐108,doi:10.1038/nature06092(2007).

32 Kontaki,H.&Talianidis,I.LysinemethylationregulatesE2F1‐inducedcelldeath.Molecularcell39,152‐160,doi:10.1016/j.molcel.2010.06.006(2010).

33 Lim, S., Janzer, A., Becker, A., Zimmer, A., Schule, R. et al. Lysine‐specificdemethylase 1 (LSD1) is highly expressed in ER‐negative breast cancers and abiomarker predicting aggressive biology. Carcinogenesis 31, 512‐520,doi:10.1093/carcin/bgp324(2010).

34 Magerl, C., Ellinger, J., Braunschweig, T., Kremmer, E., Koch, L. K. et al. H3K4dimethylation in hepatocellular carcinoma is rare compared with otherhepatobiliaryandgastrointestinalcarcinomasandcorrelateswithexpressionofthemethylaseAsh2and thedemethylaseLSD1.Humanpathology41, 181‐189,doi:10.1016/j.humpath.2009.08.007(2010).

35 Schulte, J.H., Lim,S., Schramm,A., Friedrichs,N.,Koster, J.etal. Lysine‐specificdemethylase 1 is strongly expressed in poorly differentiated neuroblastoma:implications for therapy. Cancer research 69, 2065‐2071, doi:10.1158/0008‐5472.CAN‐08‐1735(2009).

36 Frese,K.K.&Tuveson,D.A.Maximizingmouse cancermodels.Naturereviews.Cancer7,645‐658,doi:10.1038/nrc2192(2007).

37 Weiss,W.A.,Aldape,K.,Mohapatra,G.,Feuerstein,B.G.&Bishop,J.M.TargetedexpressionofMYCNcausesneuroblastomaintransgenicmice.TheEMBOjournal16,2985‐2995,doi:10.1093/emboj/16.11.2985(1997).

38 Banerjee,S.A.,Hoppe,P.,Brilliant,M.&Chikaraishi,D.M.5'flankingsequencesoftherattyrosinehydroxylasegenetargetaccuratetissue‐specific,developmental,andtranssynapticexpressionintransgenicmice.TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience12,4460‐4467(1992).

39 Berry, T., Luther,W., Bhatnagar, N., Jamin, Y., Poon, E. et al. The ALK(F1174L)mutation potentiates the oncogenic activity ofMYCN in neuroblastoma.Cancercell22,117‐130,doi:10.1016/j.ccr.2012.06.001(2012).

40 Stanke,M.,Duong,C.V.,Pape,M.,Geissen,M.,Burbach,G.etal.Target‐dependentspecification of the neurotransmitter phenotype: cholinergic differentiation ofsympatheticneuronsismediatedinvivobygp130signaling.Development133,141‐150,doi:10.1242/dev.02189(2006).

41 Molenaar, J. J., Domingo‐Fernandez, R., Ebus, M. E., Lindner, S., Koster, J. et al.LIN28BinducesneuroblastomaandenhancesMYCNlevelsvialet‐7suppression.Naturegenetics44,1199‐1206,doi:10.1038/ng.2436(2012).

42 Heukamp, L. C., Thor, T., Schramm, A., De Preter, K., Kumps, C. et al. Targetedexpression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenicmice. Sciencetranslationalmedicine4,141ra191,doi:10.1126/scitranslmed.3003967(2012).

43 Bartel,D.P.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.Cell116,281‐297(2004).

44 Lee,Y.,Kim,M.,Han,J.,Yeom,K.H.,Lee,S.etal.MicroRNAgenesaretranscribedby RNA polymerase II. The EMBO journal 23, 4051‐4060,doi:10.1038/sj.emboj.7600385(2004).

Literatur

120

45 Cai, X., Hagedorn, C. H. & Cullen, B. R. HumanmicroRNAs are processed fromcapped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. Rna 10,1957‐1966,doi:10.1261/rna.7135204(2004).

46 Lee,Y.,Ahn,C.,Han,J.,Choi,H.,Kim,J.etal.ThenuclearRNaseIIIDroshainitiatesmicroRNAprocessing.Nature425,415‐419,doi:10.1038/nature01957(2003).

47 Han,J.,Lee,Y.,Yeom,K.H.,Kim,Y.K.,Jin,H.etal.TheDrosha‐DGCR8complexinprimary microRNA processing. Genes & development 18, 3016‐3027,doi:10.1101/gad.1262504(2004).

48 Bohnsack,M. T., Czaplinski, K.&Gorlich,D. Exportin 5 is a RanGTP‐dependentdsRNA‐binding protein that mediates nuclear export of pre‐miRNAs. Rna 10,185‐191(2004).

49 Hutvagner,G.,McLachlan,J.,Pasquinelli,A.E.,Balint,E.,Tuschl,T.etal.Acellularfunction for the RNA‐interference enzyme Dicer in thematuration of the let‐7small temporal RNA. Science 293, 834‐838, doi:10.1126/science.1062961(2001).

50 Salzman,D.W.,Shubert‐Coleman,J.&Furneaux,H.P68RNAhelicaseunwindsthehuman let‐7 microRNA precursor duplex and is required for let‐7‐directedsilencing of gene expression. The Journal of biological chemistry 282, 32773‐32779,doi:10.1074/jbc.M705054200(2007).

51 Khvorova, A., Reynolds, A. & Jayasena, S. D. Functional siRNAs and miRNAsexhibitstrandbias.Cell115,209‐216(2003).

52 Schwarz, D. S., Hutvagner, G., Du, T., Xu, Z., Aronin, N. et al. Asymmetry in theassemblyoftheRNAienzymecomplex.Cell115,199‐208(2003).

53 Garzon, R., Calin, G. A. & Croce, C. M. MicroRNAs in Cancer. Annual review ofmedicine60,167‐179,doi:10.1146/annurev.med.59.053006.104707(2009).

54 Lewis,B.P.,Shih,I.H.,Jones‐Rhoades,M.W.,Bartel,D.P.&Burge,C.B.PredictionofmammalianmicroRNAtargets.Cell115,787‐798(2003).

55 Grimson, A., Farh, K. K., Johnston, W. K., Garrett‐Engele, P., Lim, L. P. et al.MicroRNA targeting specificity inmammals:determinantsbeyond seedpairing.Molecularcell27,91‐105,doi:10.1016/j.molcel.2007.06.017(2007).

56 Kedde,M., Strasser,M. J., Boldajipour,B.,OudeVrielink, J. A., Slanchev,K.etal.RNA‐bindingproteinDnd1 inhibitsmicroRNAaccess to targetmRNA.Cell131,1273‐1286,doi:10.1016/j.cell.2007.11.034(2007).

57 Garzon, R. & Croce, C. M. MicroRNAs and cancer: introduction. Seminars inoncology38,721‐723,doi:10.1053/j.seminoncol.2011.08.008(2011).

58 Miska, E. A. How microRNAs control cell division, differentiation and death.Current opinion in genetics & development 15, 563‐568,doi:10.1016/j.gde.2005.08.005(2005).

59 Fontana,L.,Fiori,M.E.,Albini,S.,Cifaldi,L.,Giovinazzi,S.etal.Antagomir‐17‐5pabolishes thegrowthof therapy‐resistantneuroblastomathroughp21andBIM.PloSone3,e2236,doi:10.1371/journal.pone.0002236(2008).

60 De Preter, K., Mestdagh, P., Vermeulen, J., Zeka, F., Naranjo, A. et al. miRNAexpression profiling enables risk stratification in archived and freshneuroblastomatumorsamples.Clinicalcancerresearch:anofficialjournaloftheAmerican Association for Cancer Research 17, 7684‐7692, doi:10.1158/1078‐0432.CCR‐11‐0610(2011).

61 Mestdagh,P.,Bostrom,A.K.,Impens,F.,Fredlund,E.,VanPeer,G.etal.ThemiR‐17‐92microRNAclusterregulatesmultiplecomponentsoftheTGF‐betapathwayinneuroblastoma.Molecularcell40,762‐773,doi:10.1016/j.molcel.2010.11.038(2010).

Literatur

121

62 Cole,K.A.,Attiyeh,E.F.,Mosse,Y.P.,Laquaglia,M.J.,Diskin,S.J.etal.AfunctionalscreenidentifiesmiR‐34aasacandidateneuroblastomatumorsuppressorgene.Molecular cancer research :MCR 6, 735‐742, doi:10.1158/1541‐7786.MCR‐07‐2102(2008).

63 Welch,C.,Chen,Y.&Stallings,R.L.MicroRNA‐34afunctionsasapotentialtumorsuppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells. Oncogene 26, 5017‐5022,doi:10.1038/sj.onc.1210293(2007).

64 Wei, J. S., Song, Y. K., Durinck, S., Chen, Q. R., Cheuk, A. T. et al. The MYCNoncogene is a direct target of miR‐34a. Oncogene 27, 5204‐5213,doi:10.1038/onc.2008.154(2008).

65 Stallings, R. L. MicroRNA involvement in the pathogenesis of neuroblastoma:potentialformicroRNAmediatedtherapeutics.Currentpharmaceuticaldesign15,456‐462(2009).

66 Chen,Y.,Tsai,Y.H.&Tseng,S.H.Inhibitionofcyclin‐dependentkinase1‐inducedcell death in neuroblastoma cells through the microRNA‐34a‐MYCN‐survivinpathway.Surgery153,4‐16,doi:10.1016/j.surg.2012.03.030(2013).

67 Schulte, J.H.,Schowe,B.,Mestdagh,P.,Kaderali,L.,Kalaghatgi,P.etal.Accurateprediction of neuroblastoma outcome based on miRNA expression profiles.International journalofcancer. Journal internationalducancer127,2374‐2385,doi:10.1002/ijc.25436(2010).

68 Bray,I.,Tivnan,A.,Bryan,K.,Foley,N.H.,Watters,K.M.etal.MicroRNA‐542‐5pas a novel tumor suppressor in neuroblastoma. Cancer letters 303, 56‐64,doi:10.1016/j.canlet.2011.01.016(2011).

69 Yoon,S.,Choi,Y.C.,Lee,S.,Jeong,Y.,Yoon,J.etal.InductionofgrowtharrestbymiR‐542‐3p that targets survivin. FEBS letters 584, 4048‐4052,doi:10.1016/j.febslet.2010.08.025(2010).

70 Silber,J.,Lim,D.A.,Petritsch,C.,Persson,A.I.,Maunakea,A.K.etal.miR‐124andmiR‐137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and inducedifferentiationofbraintumorstemcells.BMCmedicine6,14,doi:10.1186/1741‐7015‐6‐14(2008).

71 Balaguer,F.,Link,A.,Lozano, J. J.,Cuatrecasas,M.,Nagasaka,T.etal.Epigeneticsilencing of miR‐137 is an early event in colorectal carcinogenesis. Cancerresearch70,6609‐6618,doi:10.1158/0008‐5472.CAN‐10‐0622(2010).

72 Kozaki, K., Imoto, I., Mogi, S., Omura, K. & Inazawa, J. Exploration of tumor‐suppressivemicroRNAssilencedbyDNAhypermethylationinoralcancer.Cancerresearch68,2094‐2105,doi:10.1158/0008‐5472.CAN‐07‐5194(2008).

73 Saiki,R.K.,Gelfand,D.H.,Stoffel,S.,Scharf,S.J.,Higuchi,R.etal.Primer‐directedenzymatic amplification of DNAwith a thermostable DNA polymerase. Science239,487‐491(1988).

74 Lamers, F., Schild, L., Koster, J., Versteeg, R., Caron,H. N. etal. TargetedBIRC5silencingusingYM155causescelldeathinneuroblastomacellswithlowABCB1expression. European journal of cancer 48, 763‐771,doi:10.1016/j.ejca.2011.10.012(2012).

75 Livak, K. J. & Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data usingreal‐timequantitativePCRandthe2(‐DeltaDeltaC(T))Method.Methods25,402‐408,doi:10.1006/meth.2001.1262(2001).

76 Menten,B.,Pattyn,F.,DePreter,K.,Robbrecht,P.,Michels,E.etal.arrayCGHbase:an analysis platform for comparative genomic hybridization microarrays. BMCbioinformatics6,124,doi:10.1186/1471‐2105‐6‐124(2005).

Literatur

122

77 Olshen, A. B., Venkatraman, E. S., Lucito, R. & Wigler, M. Circular binarysegmentationfortheanalysisofarray‐basedDNAcopynumberdata.Biostatistics5,557‐572,doi:10.1093/biostatistics/kxh008(2004).

78 Fredlund, E., Ringner,M.,Maris, J.M.& Pahlman, S.HighMyc pathway activityand low stage of neuronal differentiation associate with poor outcome inneuroblastoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStatesofAmerica105,14094‐14099,doi:10.1073/pnas.0804455105(2008).

79 Mestdagh,P.,VanVlierberghe,P.,DeWeer,A.,Muth,D.,Westermann,F.etal.AnovelanduniversalmethodformicroRNART‐qPCRdatanormalization.Genomebiology10,R64,doi:10.1186/gb‐2009‐10‐6‐r64(2009).

80 Mestdagh,P.,Fredlund,E.,Pattyn,F.,Schulte, J.H.,Muth,D.etal.MYCN/c‐MYC‐inducedmicroRNAsrepresscodinggenenetworksassociatedwithpooroutcomein MYCN/c‐MYC‐activated tumors. Oncogene 29, 1394‐1404,doi:10.1038/onc.2009.429(2010).

81 Bradford,M.M.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantities of protein utilizing the principle of protein‐dye binding. Analyticalbiochemistry72,248‐254(1976).

82 Schagger,H.&von Jagow,G.Tricine‐sodiumdodecyl sulfate‐polyacrylamidegelelectrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.Analyticalbiochemistry166,368‐379(1987).

83 Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins fromsodium dodecyl sulfate‐‐polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose andradiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analyticalbiochemistry112,195‐203(1981).

84 Sokolova,V.V.,Radtke,I.,Heumann,R.&Epple,M.Effectivetransfectionofcellswith multi‐shell calcium phosphate‐DNA nanoparticles. Biomaterials 27, 3147‐3153,doi:10.1016/j.biomaterials.2005.12.030(2006).

85 Sokolova,V.,Knuschke,T.,Kovtun,A.,Buer,J.,Epple,M.etal.TheuseofcalciumphosphatenanoparticlesencapsulatingToll‐likereceptorligandsandtheantigenhemagglutinin to induce dendritic cell maturation and T cell activation.Biomaterials31,5627‐5633,doi:10.1016/j.biomaterials.2010.03.067(2010).

86 Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunologicalmethods65,55‐63(1983).

87 Liberzon,A.,Subramanian,A.,Pinchback,R.,Thorvaldsdottir,H.,Tamayo,P.etal.Molecular signatures database (MSigDB) 3.0. Bioinformatics 27, 1739‐1740,doi:10.1093/bioinformatics/btr260(2011).

88 Cunningham,B.A.,Hemperly,J.J.,Murray,B.A.,Prediger,E.A.,Brackenbury,R.etal. Neural cell adhesionmolecule: structure, immunoglobulin‐like domains, cellsurfacemodulation,andalternativeRNAsplicing.Science236,799‐806(1987).

89 Whiteford, C. C., Bilke, S., Greer, B. T., Chen, Q., Braunschweig, T. A. et al.Credentialing preclinical pediatric xenograftmodels using gene expression andtissue microarray analysis. Cancer research 67, 32‐40, doi:10.1158/0008‐5472.CAN‐06‐0610(2007).

90 Yu, D., Cozma, D., Park, A. & Thomas‐Tikhonenko, A. Functional validation ofgenes implicated in lymphomagenesis: an in vivo selection assay using aMyc‐inducedB‐celltumor.AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences1059,145‐159,doi:10.1196/annals.1339.047(2005).

91 Cairo, S.,DeFalco, F., Pizzo,M., Salomoni,P., Pandolfi, P. P.etal. PML interactswith Myc, and Myc target gene expression is altered in PML‐null fibroblasts.Oncogene24,2195‐2203,doi:10.1038/sj.onc.1208338(2005).

Literatur

123

92 Schuhmacher, M., Kohlhuber, F., Holzel, M., Kaiser, C., Burtscher, H. et al. ThetranscriptionalprogramofahumanBcell lineinresponsetoMyc.Nucleicacidsresearch29,397‐406(2001).

93 Zeller,K.I.,Jegga,A.G.,Aronow,B.J.,O'Donnell,K.A.&Dang,C.V.Anintegrateddatabase of genes responsive to the Myc oncogenic transcription factor:identificationofdirectgenomictargets.Genomebiology4,R69,doi:10.1186/gb‐2003‐4‐10‐r69(2003).

94 Lee, J. S., Chu, I. S., Mikaelyan, A., Calvisi, D. F., Heo, J. et al. Application ofcomparative functional genomics to identify best‐fit mouse models to studyhumancancer.Naturegenetics36,1306‐1311,doi:10.1038/ng1481(2004).

95 Kauffmann,A.,Rosselli,F.,Lazar,V.,Winnepenninckx,V.,Mansuet‐Lupo,A.etal.High expression of DNA repair pathways is associated with metastasis inmelanomapatients.Oncogene27,565‐573,doi:10.1038/sj.onc.1210700(2008).

96 Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A. et al.Identificationof genesperiodically expressed in thehuman cell cycle and theirexpression in tumors. Molecular biology of the cell 13, 1977‐2000,doi:10.1091/mbc.02‐02‐0030.(2002).

97 Eguchi,T.,Takaki,T.,Itadani,H.&Kotani,H.RBsilencingcompromisestheDNAdamage‐induced G2/M checkpoint and causes deregulated expression of theECT2oncogene.Oncogene26,509‐520,doi:10.1038/sj.onc.1209810(2007).

98 Georges, S. A., Biery, M. C., Kim, S. Y., Schelter, J. M., Guo, J. et al. Coordinatedregulation of cell cycle transcripts by p53‐Inducible microRNAs, miR‐192 andmiR‐215. Cancer research 68, 10105‐10112, doi:10.1158/0008‐5472.CAN‐08‐1846(2008).

99 Le, M. T., Xie, H., Zhou, B., Chia, P. H., Rizk, P. et al. MicroRNA‐125b promotesneuronaldifferentiationinhumancellsbyrepressingmultipletargets.Molecularandcellularbiology29,5290‐5305,doi:10.1128/MCB.01694‐08(2009).

100 Han, D., Spengler, B. A. & Ross, R. A. Increased wild‐type N‐ras activation byneurofibromin down‐regulation increases human neuroblastoma stem cellmalignancy. Genes & cancer 2, 1034‐1043, doi:10.1177/1947601912443127(2011).

101 Batra,R.,Harder,N.,Gogolin,S.,Diessl,N.,Soons,Z.etal.Time‐lapseimagingofneuroblastoma cells to determine cell fate upon gene knockdown. PloS one 7,e50988,doi:10.1371/journal.pone.0050988(2012).

102 Carotenuto, M., Pedone, E., Diana, D., de Antonellis, P., Dzeroski, S. et al.Neuroblastoma tumorigenesis is regulated through the Nm23‐H1/h‐Prune C‐terminalinteraction.Scientificreports3,1351,doi:10.1038/srep01351(2013).

103 Hogarty,M. D., Norris,M. D., Davis, K., Liu, X., Evageliou, N. F. et al. ODC1 is acritical determinant of MYCN oncogenesis and a therapeutic target inneuroblastoma. Cancer research 68, 9735‐9745, doi:10.1158/0008‐5472.CAN‐07‐6866(2008).

104 Fernandez,P.C.,Frank,S.R.,Wang,L.,Schroeder,M.,Liu,S.etal.Genomictargetsof the human c‐Myc protein. Genes & development 17, 1115‐1129,doi:10.1101/gad.1067003(2003).

105 Li, Z., Van Calcar, S., Qu, C., Cavenee, W. K., Zhang, M. Q. et al. A globaltranscriptionalregulatoryroleforc‐MycinBurkitt'slymphomacells.Proceedingsof theNationalAcademyof Sciencesof theUnited StatesofAmerica100, 8164‐8169,doi:10.1073/pnas.1332764100(2003).

Literatur

124

106 Dauphinot,L.,DeOliveira,C.,Melot,T.,Sevenet,N.,Thomas,V.etal.Analysisoftheexpressionofcellcycleregulators inEwingcell lines:EWS‐FLI‐1modulatesp57KIP2and c‐Myc expression. Oncogene 20, 3258‐3265,doi:10.1038/sj.onc.1204437(2001).

107 Gogolin, S., Ehemann, V., Becker, G., Brueckner, L. M., Dreidax, D. et al. CDK4inhibition restores G(1)‐S arrest inMYCN‐amplified neuroblastoma cells in thecontext of doxorubicin‐induced DNA damage. Cell cycle 12, 1091‐1104,doi:10.4161/cc.24091(2013).

108 DeBrouwer,S.,Mestdagh,P.,Lambertz,I.,Pattyn,F.,DePaepe,A.etal.Dickkopf‐3is regulated by the MYCN‐induced miR‐17‐92 cluster in neuroblastoma.International journalofcancer. Journal internationalducancer130,2591‐2598,doi:10.1002/ijc.26295(2012).

109 Haug, B. H., Henriksen, J. R., Buechner, J., Geerts, D., Tomte, E. et al. MYCN‐regulated miRNA‐92 inhibits secretion of the tumor suppressor DICKKOPF‐3(DKK3) in neuroblastoma. Carcinogenesis 32, 1005‐1012,doi:10.1093/carcin/bgr073(2011).

110 Schulte, J. H., Marschall, T., Martin, M., Rosenstiel, P., Mestdagh, P. et al. Deepsequencing reveals differential expression of microRNAs in favorable versusunfavorable neuroblastoma. Nucleic acids research 38, 5919‐5928,doi:10.1093/nar/gkq342(2010).

111 Annibali,D.,Gioia,U.,Savino,M.,Laneve,P.,Caffarelli,E.etal.Anewmodule inneuraldifferentiationcontrol:twomicroRNAsupregulatedbyretinoicacid,miR‐9 and ‐103, target the differentiation inhibitor ID2. PloS one 7, e40269,doi:10.1371/journal.pone.0040269(2012).

112 Chen, Y. & Stallings, R. L. Differential patterns of microRNA expression inneuroblastoma are correlated with prognosis, differentiation, and apoptosis.Cancerresearch67,976‐983,doi:10.1158/0008‐5472.CAN‐06‐3667(2007).

113 Foley,N.H.,Bray,I.M.,Tivnan,A.,Bryan,K.,Murphy,D.M.etal.MicroRNA‐184inhibits neuroblastoma cell survival through targeting the serine/threoninekinaseAKT2.Molecularcancer9,83,doi:10.1186/1476‐4598‐9‐83(2010).

114 Chen,H., Shalom‐Feuerstein, R., Riley, J., Zhang, S. D., Tucci, P. etal.miR‐7 andmiR‐214arespecificallyexpressedduringneuroblastomadifferentiation,corticaldevelopment and embryonic stem cells differentiation, and control neuriteoutgrowth in vitro. Biochemical and biophysical research communications 394,921‐927,doi:10.1016/j.bbrc.2010.03.076(2010).

115 Das, S., Bryan, K., Buckley, P. G., Piskareva, O., Bray, I. M. et al. Modulation ofneuroblastoma disease pathogenesis by an extensive network of epigeneticallyregulatedmicroRNAs.Oncogene,doi:10.1038/onc.2012.311(2012).

116 Bray, I., Bryan, K., Prenter, S., Buckley, P. G., Foley, N. H. et al. WidespreaddysregulationofMiRNAsbyMYCNamplificationandchromosomalimbalancesinneuroblastoma: association of miRNA expression with survival. PloS one 4,e7850,doi:10.1371/journal.pone.0007850(2009).

117 Ma, L., Young, J., Prabhala, H., Pan, E.,Mestdagh, P. etal.miR‐9, aMYC/MYCN‐activated microRNA, regulates E‐cadherin and cancer metastasis. Nature cellbiology12,247‐256,doi:10.1038/ncb2024(2010).

118 Althoff, K., Beckers, A., Odersky, A., Mestdagh, P., Koster, J. et al. MiR‐137functions as a tumor suppressor in neuroblastoma by downregulatingKDM1A.International journal of cancer. Journal international du cancer,doi:10.1002/ijc.28091(2013).

Literatur

125

119 Chen,D.L.,Wang,D.S.,Wu,W. J.,Zeng,Z.L.,Luo,H.Y.etal.Overexpressionofpaxillin induced by miR‐137 suppression promotes tumor progression andmetastasis in colorectal cancer. Carcinogenesis 34, 803‐811,doi:10.1093/carcin/bgs400(2013).

120 Liang, L., Li, X., Zhang, X., Lv, Z., He, G. etal.MicroRNA‐137, anHMGA1 target,suppresses colorectal cancer cell invasion and metastasis in mice by directlytargeting FMNL2. Gastroenterology 144, 624‐635 e624,doi:10.1053/j.gastro.2012.11.033(2013).

121 Zhu,X.,Li,Y.,Shen,H.,Li,H.,Long,L.etal.miR‐137inhibitstheproliferationoflung cancer cells by targeting Cdc42 and Cdk6. FEBS letters 587, 73‐81,doi:10.1016/j.febslet.2012.11.004(2013).

122 Luo,C.,Tetteh,P.W.,Merz,P.R.,Dickes,E.,Abukiwan,A.etal.miR‐137inhibitsthe invasion of melanoma cells through downregulation of multiple oncogenictarget genes. The Journal of investigative dermatology 133, 768‐775,doi:10.1038/jid.2012.357(2013).

123 Zhao, Y., Li, Y., Lou, G., Zhao, L., Xu, Z. et al. MiR‐137 targets estrogen‐relatedreceptor alpha and impairs the proliferative and migratory capacity of breastcancercells.PloSone7,e39102,doi:10.1371/journal.pone.0039102(2012).

124 Seeger,R.C.,Brodeur,G.M.,Sather,H.,Dalton,A.,Siegel,S.E.etal.Associationofmultiple copies of the N‐myc oncogene with rapid progression ofneuroblastomas. The New England journal of medicine 313, 1111‐1116,doi:10.1056/NEJM198510313131802(1985).

125 Hoyle,G.W.,Mercer,E.H.,Palmiter,R.D.&Brinster,R.L.Cell‐specificexpressionfrom the human dopamine beta‐hydroxylase promoter in transgenic mice iscontrolled via a combination of positive and negative regulatory elements.TheJournal of neuroscience : the official journal of the Society forNeuroscience 14,2455‐2463(1994).

126 Gilbert,J.,Haber,M.,Bordow,S.B.,Marshall,G.M.&Norris,M.D.Useoftumor‐specific gene expression for the differential diagnosis of neuroblastoma fromotherpediatricsmallround‐cellmalignancies.TheAmericanjournalofpathology155,17‐21,doi:10.1016/S0002‐9440(10)65093‐6(1999).

127 Tiveron, M. C., Hirsch, M. R. & Brunet, J. F. The expression pattern of thetranscription factor Phox2 delineates synaptic pathways of the autonomicnervoussystem.TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience16,7649‐7660(1996).

128 Hartomo,T.B.,Kozaki,A.,Hasegawa,D.,Pham,T.V.,Yamamoto,N.etal.Minimalresidualdiseasemonitoring inneuroblastomapatientsbasedon theexpressionof a set of real‐timeRT‐PCRmarkers in tumor‐initiating cells.Oncology reports29,1629‐1636,doi:10.3892/or.2013.2286(2013).

129 Hackett,C.S.,Hodgson,J.G.,Law,M.E.,Fridlyand,J.,Osoegawa,K.etal.Genome‐wide array CGH analysis of murine neuroblastoma reveals distinct genomicaberrations which parallel those in human tumors. Cancer research 63, 5266‐5273(2003).

130 Casola, S. Mousemodels for miRNA expression: the ROSA26 locus.Methods inmolecularbiology667,145‐163,doi:10.1007/978‐1‐60761‐811‐9_10(2010).

131 Tchorz,J.S.,Suply,T.,Ksiazek,I.,Giachino,C.,Cloetta,D.etal.AmodifiedRMCE‐compatible Rosa26 locus for the expression of transgenes from exogenouspromoters.PloSone7,e30011,doi:10.1371/journal.pone.0030011(2012).

132 Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.Naturegenetics21,70‐71,doi:10.1038/5007(1999).

Literatur

126

133 Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C. & Fehling, H. J. Faithfulactivation of an extra‐bright red fluorescent protein in "knock‐in" Cre‐reportermice ideally suited for lineage tracing studies.European journalof immunology37,43‐53,doi:10.1002/eji.200636745(2007).

134 Rasmuson, A., Kock, A., Fuskevag, O.M., Kruspig, B., Simon‐Santamaria, J. etal.Autocrine prostaglandin E2 signaling promotes tumor cell survival andproliferation in childhood neuroblastoma. PloS one 7, e29331,doi:10.1371/journal.pone.0029331(2012).

135 Vandesompele, J., Speleman, F., Van Roy, N., Laureys, G., Brinskchmidt, C. etal.MulticentreanalysisofpatternsofDNAgainsand losses in204neuroblastomatumors:howmanygeneticsubgroupsarethere?Medicalandpediatriconcology36, 5‐10, doi:10.1002/1096‐911X(20010101)36:1<5::AID‐MPO1003>3.0.CO;2‐E(2001).

136 Weiss,W. A., Godfrey, T., Francisco, C. & Bishop, J.M. Genome‐wide screen forallelicimbalanceinamousemodelforneuroblastoma.Cancerresearch60,2483‐2487(2000).

137 Rasmuson, A., Segerstrom, L., Nethander, M., Finnman, J., Elfman, L. H. et al.Tumordevelopment,growthcharacteristicsandspectrumofgeneticaberrationsin the TH‐MYCN mouse model of neuroblastoma. PloS one 7, e51297,doi:10.1371/journal.pone.0051297(2012).

138 Schleiermacher,G.,Janoueix‐Lerosey,I.,Ribeiro,A.,Klijanienko,J.,Couturier,J.etal. Accumulation of segmental alterations determines progression inneuroblastoma. Journal of clinical oncology : official journal of the AmericanSociety of Clinical Oncology 28, 3122‐3130, doi:10.1200/JCO.2009.26.7955(2010).

139 Stallings, R. L., Howard, J., Dunlop, A., Mullarkey, M., McDermott, M. et al. Aregains of chromosomal regions 7q and 11p important abnormalities inneuroblastoma?Cancergeneticsandcytogenetics140,133‐137(2003).

140 Miller,M.A.,Ohashi,K.,Zhu,X.,McGrady,P.,London,W.B.etal.SurvivinmRNAlevels are associated with biology of disease and patient survival inneuroblastoma:areportfromthechildren'soncologygroup.Journalofpediatrichematology/oncology 28, 412‐417, doi:10.1097/01.mph.0000212937.00287.e5(2006).

141 Ito, R., Asami, S., Motohashi, S., Ootsuka, S., Yamaguchi, Y. et al. Significance ofsurvivin mRNA expression in prognosis of neuroblastoma. Biological &pharmaceuticalbulletin28,565‐568(2005).

142 Attiyeh,E.F.,London,W.B.,Mosse,Y.P.,Wang,Q.,Winter,C.etal.Chromosome1pand11qdeletionsandoutcomeinneuroblastoma.TheNewEnglandjournalofmedicine353,2243‐2253,doi:10.1056/NEJMoa052399(2005).

143 Maris, J. M., Weiss, M. J., Guo, C., Gerbing, R. B., Stram, D. O. et al. Loss ofheterozygosity at 1p36 independently predicts for disease progression but notdecreased overall survival probability in neuroblastoma patients: a Children'sCancerGroupstudy.Journalofclinicaloncology :official journaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology18,1888‐1899(2000).

144 White,P.S.,Thompson,P.M.,Gotoh,T.,Okawa,E.R.,Igarashi, J.etal.Definitionandcharacterizationofaregionof1p36.3consistentlydeletedinneuroblastoma.Oncogene24,2684‐2694,doi:10.1038/sj.onc.1208306(2005).

145 Chim,C.S.,Wong,K.Y.,Qi,Y.,Loong,F.,Lam,W.L.etal.Epigeneticinactivationofthe miR‐34a in hematological malignancies. Carcinogenesis 31, 745‐750,doi:10.1093/carcin/bgq033(2010).

Literatur

127

146 Li,N.,Fu,H.,Tie,Y.,Hu,Z.,Kong,W.etal.miR‐34ainhibitsmigrationandinvasionbydown‐regulationofc‐Metexpressioninhumanhepatocellularcarcinomacells.Cancerletters275,44‐53,doi:10.1016/j.canlet.2008.09.035(2009).

147 Fujita, T., Igarashi, J., Okawa, E. R., Gotoh, T., Manne, J. et al. CHD5, a tumorsuppressorgenedeletedfrom1p36.31inneuroblastomas.JournaloftheNationalCancerInstitute100,940‐949,doi:10.1093/jnci/djn176(2008).

148 Schlisio,S.,Kenchappa,R.S.,Vredeveld,L.C.,George,R.E.,Stewart,R.etal.Thekinesin KIF1Bbeta acts downstream from EglN3 to induce apoptosis and is apotential 1p36 tumor suppressor. Genes & development 22, 884‐893,doi:10.1101/gad.1648608(2008).

149 Hanahan,D.&Weinberg,R.A.Thehallmarksofcancer.Cell100,57‐70(2000).150 He,S.,Nakada,D.&Morrison,S.J.Mechanismsofstemcellself‐renewal.Annual

review of cell and developmental biology 25, 377‐406,doi:10.1146/annurev.cellbio.042308.113248(2009).

151 Molenaar,J.J.,Ebus,M.E.,Koster,J.,vanSluis,P.,vanNoesel,C.J.etal.CyclinD1and CDK4 activity contribute to the undifferentiated phenotype inneuroblastoma. Cancer research 68, 2599‐2609, doi:10.1158/0008‐5472.CAN‐07‐5032(2008).

152 Molenaar, J. J.,Koster, J., Ebus,M.E., vanSluis,P.,Westerhout,E.M.etal. Copynumber defects of G1‐cell cycle genes in neuroblastoma are frequent andcorrelatewithhighexpressionofE2Ftargetgenesandapoorprognosis.Genes,chromosomes&cancer51,10‐19,doi:10.1002/gcc.20926(2012).

153 Yamanaka,A.,Hatakeyama,S.,Kominami,K.,Kitagawa,M.,Matsumoto,M.etal.Cellcycle‐dependentexpressionofmammalianE2‐Cregulatedbytheanaphase‐promoting complex/cyclosome. Molecular biology of the cell 11, 2821‐2831(2000).

154 Jiang, L., Bao, Y., Luo, C., Hu, G., Huang, C. et al. Knockdown of ubiquitin‐conjugatingenzymeE2C/UbcH10expressionbyRNAinterferenceinhibitsgliomacellproliferationandenhancescellapoptosisinvitro.Journalofcancerresearchandclinicaloncology136,211‐217,doi:10.1007/s00432‐009‐0651‐z(2010).

155 Qing, G., Skuli, N., Mayes, P. A., Pawel, B., Martinez, D. et al. CombinatorialregulationofneuroblastomatumorprogressionbyN‐Mycandhypoxiainduciblefactor HIF‐1alpha. Cancer research 70, 10351‐10361, doi:10.1158/0008‐5472.CAN‐10‐0740(2010).

156 Garcia, I., Mayol, G., Rios, J., Domenech, G., Cheung, N. K. et al. A three‐geneexpressionsignaturemodelforriskstratificationofpatientswithneuroblastoma.Clinicalcancerresearch:anofficialjournaloftheAmericanAssociationforCancerResearch18,2012‐2023,doi:10.1158/1078‐0432.CCR‐11‐2483(2012).

157 Schubbert, S., Shannon, K. & Bollag, G. Hyperactive Ras in developmentaldisorders and cancer.Nature reviews.Cancer7, 295‐308, doi:10.1038/nrc2109(2007).

158 Shimizu, K., Goldfarb, M., Suard, Y., Perucho, M., Li, Y. et al. Three humantransforming genes are related to the viral ras oncogenes. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 80, 2112‐2116(1983).

159 O'Donnell, K. A.,Wentzel, E. A., Zeller, K. I., Dang, C. V. &Mendell, J. T. c‐Myc‐regulated microRNAs modulate E2F1 expression. Nature 435, 839‐843,doi:10.1038/nature03677(2005).

Literatur

128

160 Terrile, M., Bryan, K., Vaughan, L., Hallsworth, A., Webber, H. et al. miRNAexpression profiling of the murine TH‐MYCN neuroblastoma model revealssimilaritieswithhumantumorsandidentifiesnovelcandidatemiRNAs.PloSone6,e28356,doi:10.1371/journal.pone.0028356(2011).

161 Testa,J.R.&Bellacosa,A.AKTplaysacentralroleintumorigenesis.Proceedingsof theNationalAcademyof Sciencesof theUnited StatesofAmerica98, 10983‐10985,doi:10.1073/pnas.211430998(2001).

162 Stubbusch, J.,Majdazari,A.,Schmidt,M.,Schutz,G.,Deller,T.etal.Generationofthetamoxifen‐inducibleDBH‐CretransgenicmouselineDBH‐CT.Genesis49,935‐941,doi:10.1002/dvg.20773(2011).

163 Sprussel,A.,Schulte,J.H.,Weber,S.,Necke,M.,Handschke,K.etal.Lysine‐specificdemethylase 1 restricts hematopoietic progenitor proliferation and is essentialforterminaldifferentiation.Leukemia26,2039‐2051,doi:10.1038/leu.2012.157(2012).

164 Ventura,A.,Young,A.G.,Winslow,M.M.,Lintault,L.,Meissner,A.etal.Targeteddeletion reveals essential and overlapping functions of themiR‐17 through 92family of miRNA clusters. Cell 132, 875‐886, doi:10.1016/j.cell.2008.02.019(2008).

165 Carleton,M.,Cleary,M.A.&Linsley,P.S.MicroRNAsandcellcycleregulation.Cellcycle6,2127‐2132(2007).

166 Wiemer,E.A.TheroleofmicroRNAsincancer:nosmallmatter.Europeanjournalofcancer43,1529‐1544,doi:10.1016/j.ejca.2007.04.002(2007).

167 Shohet,J.M.,Ghosh,R.,Coarfa,C.,Ludwig,A.,Benham,A.L.etal.Agenome‐widesearch for promoters that respond to increased MYCN reveals both newoncogenic and tumor suppressor microRNAs associated with aggressiveneuroblastoma. Cancer research 71, 3841‐3851, doi:10.1158/0008‐5472.CAN‐10‐4391(2011).

168 Petrelli,A.&Giordano, S. From single‐ tomulti‐targetdrugs in cancer therapy:when aspecificity becomes an advantage.Currentmedicinal chemistry15, 422‐432(2008).

169 Schrattenholz,A.,Groebe,K.&Soskic,V. Systemsbiologyapproaches and toolsforanalysisofinteractomesandmulti‐targetdrugs.Methodsinmolecularbiology662,29‐58,doi:10.1007/978‐1‐60761‐800‐3_2(2010).

170 Modak, S. & Cheung, N. K. Neuroblastoma: Therapeutic strategies for a clinicalenigma. Cancer treatment reviews 36, 307‐317, doi:10.1016/j.ctrv.2010.02.006(2010).

171 Iorio, M. V. & Croce, C. M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics,monitoringandtherapeutics.Acomprehensivereview.EMBOmolecularmedicine4,143‐159,doi:10.1002/emmm.201100209(2012).

172 Tivnan, A., Orr,W. S., Gubala, V., Nooney, R.,Williams, D. E. etal. Inhibition ofneuroblastomatumorgrowthby targeteddeliveryofmicroRNA‐34ausinganti‐disialoganglioside GD2 coated nanoparticles. PloS one 7, e38129,doi:10.1371/journal.pone.0038129(2012).

173 Adida, C., Berrebi, D., Peuchmaur, M., Reyes‐Mugica, M. & Altieri, D. C. Anti‐apoptosisgene,survivin,andprognosisofneuroblastoma.Lancet351,882‐883,doi:10.1016/S0140‐6736(05)70294‐4(1998).

174 Islam, A., Kageyama, H., Takada, N., Kawamoto, T., Takayasu, H. et al. Highexpression of Survivin,mapped to 17q25, is significantly associatedwith poorprognosticfactorsandpromotescellsurvivalinhumanneuroblastoma.Oncogene19,617‐623,doi:10.1038/sj.onc.1203358(2000).

Literatur

129

175 Adams,R.R.,Carmena,M.&Earnshaw,W.C.Chromosomalpassengersandthe(aurora)ABCsofmitosis.Trendsincellbiology11,49‐54(2001).

176 Chen, J., Jin, S., Tahir, S. K., Zhang, H., Liu, X. etal. Survivin enhances Aurora‐Bkinase activity and localizes Aurora‐B in human cells.The Journal of biologicalchemistry278,486‐490,doi:10.1074/jbc.M211119200(2003).

177 Giodini,A.,Kallio,M. J.,Wall,N.R.,Gorbsky,G. J., Tognin, S.etal.Regulationofmicrotubule stability and mitotic progression by survivin. Cancer research 62,2462‐2467(2002).

178 Chu,Y.,Yao,P.Y.,Wang,W.,Wang,D.,Wang,Z.etal.AuroraBkinaseactivationrequires survivin priming phosphorylation by PLK1. Journal of molecular cellbiology3,260‐267,doi:10.1093/jmcb/mjq037(2011).

179 Sokolova,V.,Kozlova,D.,Knuschke,T.,Buer,J.,Westendorf,A.M.etal.Mechanismof the uptake of cationic and anionic calciumphosphate nanoparticles by cells.Actabiomaterialia9,7527‐7535,doi:10.1016/j.actbio.2013.02.034(2013).

180 Florea,B.I.,Meaney,C.,Junginger,H.E.&Borchard,G.TransfectionefficiencyandtoxicityofpolyethylenimineindifferentiatedCalu‐3andnondifferentiatedCOS‐1cellcultures.AAPSpharmSci4,E12,doi:10.1208/ps040312(2002).

181 Neu,M.,Fischer,D.&Kissel,T.Recentadvancesinrationalgenetransfervectordesign based on poly(ethylene imine) and its derivatives. The journal of genemedicine7,992‐1009,doi:10.1002/jgm.773(2005).

182 Verissimo,C.S.,Molenaar,J.J.,Fitzsimons,C.P.&Vreugdenhil,E.Neuroblastomatherapy: what is in the pipeline? Endocrine‐related cancer 18, R213‐231,doi:10.1530/ERC‐11‐0251(2011).

183 Duffy,M.J.,O'Donovan,N.,Brennan,D.J.,Gallagher,W.M.&Ryan,B.M.Survivin:a promising tumor biomarker. Cancer letters 249, 49‐60,doi:10.1016/j.canlet.2006.12.020(2007).

184 Li, S., He, J., Li, S., Cao, G., Tang, S. et al. Noscapine induced apoptosis viadownregulation of survivin in human neuroblastoma cells havingwild type ornullp53.PloSone7,e40076,doi:10.1371/journal.pone.0040076(2012).

185 Hossain,M.M.,Banik,N.L.&Ray,S.K.Survivinknockdownincreasedanti‐cancereffectsof(‐)‐epigallocatechin‐3‐gallateinhumanmalignantneuroblastomaSK‐N‐BE2 and SH‐SY5Y cells. Experimental cell research 318, 1597‐1610,doi:10.1016/j.yexcr.2012.03.033(2012).

186 Martin, S., Lamb, H. K., Brady, C., Lefkove, B., Bonner, M. Y. et al. Inducingapoptosis of cancer cells using small‐molecule plant compounds that bind toGRP78.Britishjournalofcancer,doi:10.1038/bjc.2013.325(2013).

187 Nakahara, T., Kita, A., Yamanaka, K., Mori, M., Amino, N. et al. YM155, a novelsmall‐molecule survivin suppressant, induces regression of established humanhormone‐refractoryprostate tumorxenografts.Cancerresearch67, 8014‐8021,doi:10.1158/0008‐5472.CAN‐07‐1343(2007).

188 Hayami,S.,Kelly,J.D.,Cho,H.S.,Yoshimatsu,M.,Unoki,M.etal.Overexpressionof LSD1 contributes to human carcinogenesis through chromatin regulation invarious cancers. International journalof cancer. Journal internationaldu cancer128,574‐586,doi:10.1002/ijc.25349(2011).

189 Xu,G.,Xiao,Y.,Hu,J.,Xing,L.,Zhao,O.etal.TheCombinedEffectofRetinoicAcidandLSD1siRNAInhibitiononCellDeathintheHumanNeuroblastomaCellLineSH‐SY5Y. Cellular physiology and biochemistry : international journal ofexperimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology 31, 854‐862,doi:10.1159/000350103(2013).

Literatur

130

190 Stavropoulos, P. & Hoelz, A. Lysine‐specific demethylase 1 as a potentialtherapeutic target. Expert opinion on therapeutic targets 11, 809‐820,doi:10.1517/14728222.11.6.809(2007).

191 Sun,G.,Ye,P.,Murai,K.,Lang,M.F.,Li,S.etal.miR‐137formsaregulatoryloopwithnuclearreceptorTLXandLSD1inneuralstemcells.Naturecommunications2,529,doi:10.1038/ncomms1532(2011).

192 Bier, A., Giladi, N., Kronfeld, N., Lee, H. K., Cazacu, S. et al. MicroRNA‐137 isdownregulatedinglioblastomaandinhibitsthestemnessofgliomastemcellsbytargetingRTVP‐1.Oncotarget4,665‐676(2013).

193 Li,K.K.,Yang,L.,Pang,J.C.,Chan,A.K.,Zhou,L.etal.MIR‐137SuppressesGrowthandInvasion, isDownregulated inOligodendroglialTumorsandTargetsCSE1L.Brainpathology23,426‐439,doi:10.1111/bpa.12015(2013).

194 Zhu, X., Li, Y., Shen, H., Li, H., Long, L. et al. miR‐137 restoration sensitizesmultidrug‐resistant MCF‐7/ADM cells to anticancer agents by targeting YB‐1.Acta biochimica et biophysica Sinica 45, 80‐86, doi:10.1093/abbs/gms099(2013).

Abkürzungen

131

9 Abkürzungen

°C GradCelsiusaCGH Array‐comparativegenomichybridizationAURKB AuroraBKinaseBIRC5 BaculoviralIAPrepeat‐containing5bp BasenpaarBrdU 5‐bromo‐2‘‐DeoxyuridinCAG Hühner‐Aktin‐PromotorcDNA komplementäreDNACDK4 Cyclin‐abhängigeKinase4CPC ChromosomalPassengerKomplexCt‐Wert Schwellenwert‐ZyklusDbh Dopaminbeta‐HydroxylaseDGCR8 DiGeorgesyndromecriticalregiongene8DKFZ DeutschesKrebsforschungszentrumDMSO DimethylsulfoxidDMSZ DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbHDNA DesoxyribonukleinsäuredNTP DesoxyribonukleosidtriphosphatEDTA EthylendiamintetraessigsäureES EnrichmentScoreES‐Zellen embryonaleStammzellenetal. undandereFCS fetalcalfserum(fetalesKälberserum)FDR falsch‐positivRateFluc LuziferaseGeng ErdbeschleunigungG1‐Phase PostmitoseG2/M‐Phase PrämitoseundMitoseGAPDH Glycerinaldehyd‐3‐Phosphat‐DehydrogenaseGFP GrünfluoreszierendesProteinGOI geneofinterestGSEA GeneSetEnrichmentAnalyseH&E Hematoxylin&EosinHCl ChlorwasserstoffINSS InternationalNeuroblastomaStagingSystemIRES interneribosomaleEintrittsstellei.v. intravenöskb kiloBasenKDM1A Lysin‐spezifischeDemethylase1LB‐Medium lysogenybrothLDH Laktat‐Dehydrogenase

Abkürzungen

132

LIN28B LIN28HomologBLSL loxP‐flankiertePolyadenyl‐StoppsequenzmiRNA microRNAMPL MolecularProteomicsLaboratoryMSigDB MolecularSignaturesDatenbankMTT 3‐(4,5‐Dimethylthiazol‐2‐yl)‐2,5‐Diphenyl‐tetrazoliumbromidMYCN v‐myc myelocytomatosis viral related oncogen ,neuroblastoma

derivedNEFL NeurofilamentNES normalisierterEnrichmentScoreNTRK1 neurotropheRezeptor‐Tyrosinkinase1OD optischeDichtePBS PhosphatgepufferteSalzlösungPCR PolymerasekettenreaktionPEI Poly‐Ethyleniminpri‐miRNA primäremicroRNApre‐miRNA Vorläufer‐microRNAqPCR quantitativePolymerasekettenreaktionRCME Rekombinase‐vermittelteKassettenaustauschstelleRIPA RadioimmunoprecipitationassaybufferRISC RNA‐induziertersilencingKomplexRNA RibonukleinsäureS‐Phase SynthesePhasedesZellzyklusSDS‐PAGE Natriumdodecylsulfat‐PolyacrylamidgelelektrophoresesiRNA silencerRNASRM SpermidinSynthaseTBS TrisgepufferteSalzlösungTFPI2 tissuefactorpathwayinhibitor2TH TyronsinHydroxylaseTris Tris(hydroxymethyl)‐aminomethanU unitUBE2C Ubiquitin‐konjugierendeEnzymE2CUTR untranslatierteRegionUV ultraviolettwt Wildtyp

10 A

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…...49

Abbildungs‐undTabellenverzeichnis

134

Abb.20: GenomischeAberrationenvonTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCre

Modells………………………………………………………………………………..……………………………...50

Abb.21: GensetEnrichmentAnalyse……………………………………………………………………….52

Abb.22: ReguliertemRNAsinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausmodells……….53

Abb.23: RegulierteMYCTargetsinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells………...54

Abb.24: ReguliertemiRNAsinTumorenvonLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen……………….55

Abb.25: RegulierteMYCNmiRNATargetsinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCre

Modells……………………………………………………………………………………………………………….56

Abb.26: RegulationvonmiR‐542inTumorenderMausmodelle

LSL‐MYCN;Dbh‐iCreundTH‐MYCN………………………………………………….……………………57

Abb.27: KorrelationvonmiR‐542‐5pund‐3pExpressionmitprognostischen

MarkernundÜberlebeninhumanenNeuroblastomen…………………………………………60

Abb.28: KorrelationvonmiR‐542‐5pund‐3pExpressionmitgünstigemVerlauf

humanerNeuroblastome……………………………………………………………………………………..61

Abb.29: KorrelationvonmiR‐542‐3pundSurvivininhumanenNeuroblastomen……62

Abb.30: ReduktionderViabilitätvonhumanenNeuroblastomzelllinienmittels

miR‐542‐3pExpression……………………………………………………………………………………….63

Abb.31: ReduzierteKonfluenzvonNeuroblastomzellennachmiR‐542‐3p

Expression…………………………………………………………………………………………………………..64

Abb.32: VerschiebungdesZellzyklusdurchgesteigerteS‐Phasein

NeuroblastomzellennachmiR‐542‐3pExpression………………………………………………..65

Abb.33: InduktionvonApoptoseundReduktionvonProliferationin

NeuroblastomzellennachmiR‐542‐3pExpression………………………………………………..65

Abb.34: HerunterregulationvonSurvivininNeuroblastomzellennachmiR‐542‐3p

Expression…………………………………………………………………………………………………………..67

Abb.35: DirekteBindungvonmiR‐542‐3panSurvivin3’UTR………………………………….68

Abb.36: SpezifischeReduktionvonSurvivinProteinmittelssiRNA…………………………69

Abb.37: ReduktionderViabilitäthumanerNeuroblastomzellliniendurch

HerunterregulationvonSurvivin………………………………………………………………………….37

Abb.38: VerschiebungdesZellzyklusdurchgesteigerteS‐bzw.G2/M‐Phasein

NeuroblastomzellennachHerunterregulationvonSurvivin………………………………….70

Abb.39: ReduktionderProliferationhumanerNeuroblastomzellliniendurch

HerunterregulationvonSurvivin………………………………………………………………………….70

Abb.40: SurvivinÜberexpressioninSHEP‐SurvivinnachInduktionmit

Tetrazyklin………………………………………………………………………………………………………….71

Abbildungs‐undTabellenverzeichnis

135

Abb.41: PartielleWiederherstellungdesmiR‐542‐3pPhänotypsmittels

ÜberexpressionvonSurvivinohnemiR‐542‐3pBindestelle….…………………………..… 72

Abb.42: StrukturvonmiRNA‐beladenenNanopartikeln………………………………………….72

Abb.43: ReduktionderZellviabilitätundderProliferation,Induktionvon

ApoptoseundHerunterregulationvonSurvivinmittelsmiR‐542‐3p‐beladenen

NanopartikelinWACIIZelleninvitro…………………………………………………………………....74

Abb.44: ExpressionvonmiR‐542‐3pundHerunterregulationvonSurvivinmittels

miRNA‐beladenenNanopartikelninWACII‐Xenograftsinvivo………………………………75

Abb.45: HemmungderProliferationundInduktionvonApoptoseinmiR‐542‐3p‐

exprimierendenNeuroblastom‐Xenografts…………………………………………………………...76

Abb.46: RegulationvonKDM1AmRNAinLSL‐MYCN;Dbh‐iCreundTH‐MYCN

Tumoren………………………………………………………………………………………………..……………77

Abb.47: 3’UTRvonKDM1AmitBindestellevonmiR‐137………………………………………..78

Abb.48: RegulationvonmiR‐137inLSL‐MYCN;Dbh‐iCreTumoren………………………….78

Abb.49: KorrelationderExpressionvonmiR‐137mitprognostischenMarkern

undÜberlebeninhumanenPrimärtumoren………………………………………………………….79

Abb.50: KorrelationvonmiR‐137ExpressionmitgünstigemVerlaufhumaner

Neuroblastome……………………………………………………………………………………………………80

Abb.51: ReduktionderViabilitäthumanerNeuroblastomzelllinienmittels

exogenermiR‐137Expression……………………………………………………………………………...81

Abb.52: ReduktionderKonfluenzhumanerNeuroblastomzellliniennachexogener

miR‐137Expression…………………………………………………………………………………………….81

Abb.53: InduktionvonApoptoseundReduktionderProliferationinmiR‐137

exprimierendenZellen…………………………………………………………………………………………82

Abb.54: EinleitungneuronalerDifferenzierunginmiR‐137‐exprimierendenZellen…82

Abb.55: HerunterregulationvonKDM1AinmiR‐137‐exprimierendenZellen…………..83

Abb.56: DirekteBindungvonmiR‐137andie3’UTRvonKDM1A……………………………84

Abb.57: ReaktionvonKDM1AZielenaufmiR‐137‐induzierteHerunter‐regulation

vonKDM1A…………………………………………………………………………………………………………84

Abb.58: SpezifischeReduktionvonKDM1AProteinmittelssiRNA…………………………..85

Abb.59: ReduktionderZellviabilitätdurchHerunterregulationvonKDM1A……………85

Abb.60: InduktionvonApoptoseundReduktionderViabilitätundProliferation

vonZellendurchHerunterregulationvonKDM1A…………………………………………………86

Abb.61: InduzierbareExpressionvonKDM1AinSHEP‐KDM1AZellenresistent

gegenmiR‐137Expression…………………………………………………………………………………..88

Abb.62: 3’UTRvonAKAP2mitBindestellenvonmiR‐137……………………………………….89

Abb.63: HerunterregulationvonAKAP2mittelsExpressionvonmiR‐137……………….89

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Publika

Publikatio

K,Beckers

manF,Stalli

37 function

A

ncer.2013

aarJJ,Domi

uisP,Valent

mpL,Sprüs

ammA,van

egR,Schult

Binducesn

net.2012No

K,Lindner

A,Knauer

A,Schramm

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kripteinge

K,Beckers

sL,Kumps

Cre‐condit

tionsofthe

bereitung

ationen

onen

sA,Odersk

ngsRL,Sch

ns as a tu

Feb7.doi:

ingo‐Ferná

tijnLJ,van

sselA,Thor

nNoeselMM

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Anhang

139

11.2.2 Kongressbeiträge

Auszüge der Arbeit wurden auf folgenden Konferenzen für einen Vortrag oder eine

Posterpräsentationausgewählt:

11.2.2.1 Vorträge

AlthoffK,LindnerS,OderskyA,MestdaghP,MolenaarJJ,KnauerS,SpelemanF,BaekK,

VandesompeleJ,EggertA,SchrammA,SchulteJH.MiR‐542‐3pexertstumorsuppressive

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‐AdvancedNeuroblastomResearchConference,08.‐21.Juni2012,

Toronto,Kanada

‐4thInternationalTuebingenSymposiuminPediatricSolidTumors–FromBench

toBedsideinNeuroblastoma,16.‐18.Februar2012,Tübingen

11.2.2.2 Posterpräsentationen

AlthoffK,BeckersA,SprüsselA,ThorT,HeukampL,dePreterK,KumpsC,SpelemanF,

SchrammA,EggertA,SchulteJH.AnewMYCN‐drivenneuroblastomamousemodelusing

Cre‐drivenconditionalexpressionofMYCN.

‐PediatricCancerResearchattheINTERFACE,06.‐08.Juni2013,Wien,Österreich

‐5thAnnualMeetingofNGFN‐PlusandNGFN‐TransferintheProgramofMedical

GenomeResearch,11.‐13.Dezember2012,Heidelberg,Deutschland

‐11.ForschungstagderMedizinischenFakultätderUniversitätDuisburg‐Essen,

23.November2012

AlthoffK,LindnerS,OderskyA,MestdaghP,MolenaarJJ,KnauerS,SpelemanF,BaekK,

VandesompeleJ,EggertA,SchrammA,SchulteJH.MiR‐542‐3pexertstumorsuppressive

functionsinneuroblastomabydown‐regulatingsurvivin.




Anhang

140

AlthoffK,BeckersA,OderskyA,MestdaghP,SpelemanF,VandesompeleJ,EggertA,

SchrammA,SprüsselA,SchulteJH.MiR‐137functionsasatumorsuppressorin

neuroblastomabydownregulatingKDM1A.




‐AdvancedNeuroblastomResearchConference,08.‐21.Juni2012,Toronto,

Kanada

‐4thInternationalTuebingenSymposiuminPediatricSolidTumors–FromBench

toBedsideinNeuroblastoma,16.‐18.Februar2012,Tübingen,Deutschland

L11.3

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Anhang

141

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