Expression und Isolierung von Domänen der dsRNA abhängigen ... · Die vorliegende Arbeit wurde im...

Aus dem Institut für Anatomie I

Zentrum für Experimentelle Medizin

Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf

Direktorin: Prof. Dr. med. G. Rune

Projektleiter: Prof. Dr. Süleyman Ergün

Expression und Isolierung von Domänen der dsRNA abhängigen Proteinkinase (PKR) für die Aufklärung der Tertiärstruktur mittels NMR-

Spektroskopie.

DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg vorgelegt von

Mirjam A. Debus, geb. in Altenau in Oberbayern

2007

Angenommen vom Fachbereich Medizin der

Universität Hamburg am:

Veröffentlicht mit Genehmigung des Fachbereichs

Medizin der Universität Hamburg

Prüfungsausschuss, der Vorsitzende: Herr Prof. Dr.med. S. Ergün, Institut für Anatomie

Prüfungsausschuss: 2.Gutachter/in:

Prüfungsausschuss: 3.Gutachter/in:

Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen eines wissenschaftlichen

Austauschprogramms mit der Harvard Medical School in Boston, USA angefertigt

und durch das National Institute of Health, NIH, in Bethesda, Maryland gefördert.

Harvard Medical School

Laboratory for Membrane Transport

Department of Cell Biology

240 Longwood Avenue, Boston, MA

Principle Investigator: Prof. MD José Halperin

Mirjam Debus INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS 1 ZIELSETZUNG 1 2 EINFÜHRUNG 2 2.1 PKR als Zielmolekül einer antineoplastischen Therapie 2

2.2 Die Proteinstruktur von PKR 3

2.2.1 Die Kinasedomäne von PKR 4

2.2.2 Die dsRNA-bindende Domäne von PKR 5

2.2.3 Die Domäne 3 von PKR 7

2.3 Die Gewebeverteilung von PKR 7

2.4 Die Regulation der Expression von PKR 8

2.5 Mechanismen der Aktivierung von PKR 8

2.5.1 Zellulärer Stress 8

2.5.2 Aktivierende Liganden: dsRNA, PACT, Heparin 9

2.6 Mechanismen der viralen Inhibition von PKR 11

2.7 Substrate von PKR 12

2.8 Biologische Effekte von PKR 12

2.8.1 Inhibition der Translationsinitation 13

2.8.2 Regulierung der Translation bei verschiedenen mRNA Spezies 14

2.8.3 Regulierung der Gentranskription/ Signaltransduktion 15

2.8.4 PKR und Apoptose 15

2.8.5 PKR und Differenzierung 16

2.8.6 PKR und Tumorsuppression 17

3 MATERIAL 19 3.1 Antikörper 19

3.2 Bakterienstämme 19

3.3 Nukleinsäuren 19

3.3.1 Vektoren 19 3.3.2 Oligonukleotide 19

3.4 Enzyme 19

3.5 Puffer und Reagenzien für die DNA-Analytik 20

3.5.1 Reagenzien für die Plasmidisolation 20

3.5.2 Kits für die DNA Isolation 20

3.6 Puffer und Reagenzien für die Proteinaufreinigung 20

3.6.1 Affinitätsmatrizes 20

3.6.2 Puffer für die Isolierung von MBP-Fusionsproteinen 20


3.6.3 Puffer für die Isolierung von CBP-Fusionsproteinen 21

3.6.4 Puffer für die Isolierung von PG-Fusionsproteinen 21

3.7 Puffer und Lösungen für die Proteinanalytik 21

3.7.1 BCA-Assay-Reagenzien 21

3.7.2 Coomassie Blue Stain-Reagenzien 21

3.7.3 Silberfärbungsreagenzien 22

3.8 Chemikalien 22

3.9 Geräte 23

3.8. Software 23

3.9. Datenbanken 23

4 METHODEN 24 4.1 Subklonierung von DNA-Fragmenten in bakterielle Vektoren 24

4.1.1 Plasmid Isolation 24

4.1.2 Determinierung der DNA-Konzentration 24

4.1.3 Analyse von Plasmid DNA durch Restriktionsverdau 25

4.1.4 Amplifikation von Genfragmenten durch PCR 25

4.1.5 Klonierung eines PCR-Fragments 26

4.1.5.1 Präparation des PCR-Fragments und der Vektor-DNA 26

4.1.5.2 Ligation der PCR Fragmene mit Vektor-DANN 26

4.1.5.3 Transformation von Escherichia coli (DH-5α) 27

4.1.5.4 Selektion von positiven Klonen 27

4.1.5.5 Anzüchtung der Bakterienkultur 27

4.1.5.6 Überprüfung der Präsenz von Inserts 27

4.1.6 Sequenzierung von DNA-Fragmenten 28

4.1.6.1 Die Dideoxy-Kettenterminationsmethode 28

4.1.6.2 Entwurf der Primer 28

4.2 Expression der Zielproteine 29

4.2.1 Induktion durch IPTG 29

4.2.2 Aufbereitung der bakteriellen Kulturen 29

4.2.3 Proteinanalyse 30

4.2.3.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 30

4.2.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 30

4.2.3.3 Proteinfärbung mit Coomassieblau 30

4.2.3.4 Silberfärbung der Proteine 31

4.2.3.5 Immunblotting 31

4.2.3.6 Massenspektrometrie 31

4.3 Proteinisolierung mittels HPLC 32


4.3.1 Präparation der bakteriellen Kulturen 32

4.3.2 Affinitätschromatographie MBP-PKR mittels HPLC 33 4.3.2.1 Spaltung des Fusionsproteins MBP-PKR 33 4.3.2.2 Trennung von PKR-Fragment und MBP nach der Spaltung 34

4.3.3 Affinitätschromatographie CBP-PKR 34

4.3.3.1 Induktion der Spaltung mittels Faktor X 34

4.3.3.2 Die Elution des Zielproteins 35

4.3.4 Isolierung von PKR-PG Fusionsproteinen 35 4.3.4.1 Elution von PKR-PG Fusionsproteinen 35

4.4 Nukleare Magnetresonanzspektroskopie 36

5 ERGEBNISSE 37 5.1 In bakterielle Vektoren subklonierte PKR DNA-Fragmente 37

5.1.1 Konstrukte mit N-terminaler Polyhistidinsequenz 38

5.1.2 Mutagenese von PKR K296P zu PKR K296R 42

5.1.3 Exprimierte His-PKR K296R 44

5.2 Generierte Fusionsproteinen 45

5.2.1 Klonierte Fusionsgene 46

5.2.2 Expremierte Fusionsproteine 50

5.3 Isolierte PKR-Fragmente nach HPLC 51

5.3.1 Isolierte MBP-PKR K296R -Fragmente 51

5.3.2 Isolierte CBP-PKR K296R –Fragmente 52

5.3.3 Isolierte PG-PKR K296R –Fragmente 54

5.4 Die NMR-Struktur der Kinasedomäne 54

6 DISKUSSION 56 6.1 NMR-Strukturanalysen von PKR liefern Informationen betreffs der Auto-

inhibition 56

6.2 Für einzelne Domänen von PKR konnten individuelle Expressions- und

Isolationsbedingungen für eine NMR-Analytik etabliert werden 57

6.3 Die Bildung von Fusionsproteinen ermöglichte eine Isolation für NMR-

Strukturanalysen 58

6.4 Anhand der NMR-spektroskopischen Daten lässt sich die Rolle von PKR

Bei der Inhibition der Translation untersuchen 59

6.5 Die strukturanalytischen Daten von PKR bieten einen potenziellen neuen

Ansatz für die antineoplastische Therapie auf der Ebene der Translation 60


6.6 Ein antineoplastischer Effekt über eine Aktivierung von PKR lässt eine

verminderte Chemo- und Apoptoseresistenz vermuten 62

6.7 Durch den synergistischen Effekt von Interferonen und PKR kann eine

optimierte Therapie bei verminderter Toxizität erzielt werden 64

7 ZUSAMMENFASSUNG 65 8 ABKÜRZUNGEN 67 9 LITERATUR 69 10 DANKSAGUNG 77 11 LEBENSLAUF 78 12 ERKLÄRUNG 79

1

Mirjam Debus ZIELSETZUNG 1 ZIELSETZUNG Die Zielsetzung dieser Arbeit basiert auf der Annahme einer generell gesteigerten

translationalen Aktivität in Tumorzellen, insbesondere einer gesteigerten Expression von

Onkogenen. Die Translation, auf deren Initiation die von doppelsträngiger RNA (dsRNA)

abhängige Proteinkinase (PKR) einen entscheidenden inhibitorischen Effekt ausübt, erscheint

ein geeigneter potenzieller Angriffspunkt für eine antineoplastische Therapie zu sein. Die

strukturellen Informationen von PKR können dem Design von aktivierenden Molekülen

dienen, die eine antineoplastische Therapie von hoher Spezifität und Effizienz bei geringer

Toxizität versprechen.

PKR ist über unterschiedliche Mechanismen antiproliferativ wirksam. Bisher ist nur wenig

über die strukturellen Eigenschaften von PKR bekannt. Für das genauere Verständnis von

Signaltransduktion und molekularen Interaktionen ist die Kenntnis der dreidimensionalen

Struktur der beteiligten Moleküle essentiell. Ein zentrales Anliegen dieses Projektes war es

daher, herauszufinden, ob strukturelle Informationen für die einzelnen Domänen von PKR

und ihrer Interaktionspartner mittels nukleärer Magnetresonanzspektroskopie hergeleitet

werden können. Hierfür galt es zunächst entsprechend geeignete Expressionskonstrukte sowie

stabile Isolierungsbedingungen für verschiedene Fragmente von PKR zu entwickeln.

Katalytisch inaktive Mutanten unterschiedlicher Domänen sollten an geeignete

Fusionsproteine gekoppelt, in E.coli exprimiert, und schließlich isoliert werden. Für die

Isolierung mittels High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) mussten Bedingungen

etabliert werden, die eine hohe Reinheit, ausreichende Quantität sowie Stabilität des Proteins

gewährleisten.

Neben der Entwicklung einer möglichen antineoplastischen Therapie, wäre über die

Aktivierung von PKR ein weiterer therapeutischer Ansatzpunkt in einer potenziellen

antiviralen Therapie gegeben, da PKR ebenfalls einen supprimierenden Effekt auf die virale

Replikation ausübt. Weiterhin würden die strukturellen Informationen eine Aufklärung

molekularer Mechanismen der Signaltransduktion erlauben.

2

Mirjam Debus EINFÜHRUNG 2 EINFÜHRUNG

2.1 PKR als Zielmolekül einer antineoplastischen Therapie

Maligne Tumoren stehen in der westlichen Welt nach den Herz- Kreislauf-Erkrankungen an

zweiter Stelle der Statistik für Todesursachen. Jährlich erkranken in der Bundesrepublik

Deutschland 400 pro 100.000 Einwohner an einem bösartigen Tumor. Seit den ersten

Therapieversuchen maligner Lymphome mit „Senfgas“ (2,2’-Dichlordiethylsulfid) und an

Leukämie erkrankter Kinder mit Aminopterin, einem Folsäureantagonisten durch Gilman

(Yale University) und Farber (Harvard University) nach dem 2.Weltkrieg (Gilman 1963),

(Farber 1948), sind mannigfaltige Versuche unternommen worden, die Chemotherapie zu

optimieren. In der konventionellen antineoplastischen Therapie ist der Erfolg einer

Behandlung mittels zytotoxischer Medikamente und Bestrahlung immer noch durch eine

Vielzahl an Faktoren limitiert. Unter anderem durch eine hohe Toxizität, eine geringe

Spezifität, Chemoresistenz und Verlust von Apoptose. Neuere Strategien basieren daher eher

darauf, das Wissen über die molekularen Veränderungen bei malignen Transformationen der

Zellen zu vertiefen, um so zukünftig eine mehr spezifische, weniger toxische Therapie

entwickeln zu können.

Studien der letzten Jahre geben zunehmend Aufschluss für eine Verbindung zwischen der

Regulation von Proteinsynthese und dem abnormalen Zellverhalten, welches für Tumorzellen

typisch ist (Clemens and Bommer 1999). Der Ablauf der Translation wird durch viele

unterschiedliche Protein-Protein- und Protein-RNA-Interaktionen kontrolliert. Besonders

strikt erfolgt dabei die Regulation bei der Initiierung der Translation, an der diverse

Initiationsfaktoren beteiligt sind. Es existieren mehrere parallel verlaufende Mechanismen, die

mit unterschiedlicher Effizienz die Translation starten. Dabei wird davon ausgegangen, dass

die Inhibition lediglich eines Initiationsweges die Translation herunterreguliert, aber nicht

vollständig unterbindet.

Proto-Onkogene und wachstumsfördernde Proteine werden in Abwesenheit von

Initiationsfaktoren nur spärlich translatiert (Koromilas 1992). Ihre mRNAs besitzen

typischerweise hochkomplexe Sekundärstrukturen, wie z.B. hochkomplexe 5’Untranslated

Regions (5’UTRs), Open Reading Frames (ORFs) und Stopcodons. Proto-Onkogene sind

daher entscheidend auf Faktoren angewiesen, welche die Rekrutierung an die Ribosomen

3

Mirjam Debus EINFÜHRUNG

unterstützen (Kozak 1991). Die Entwicklung von Medikamenten für die Krebstherapie, die

spezifisch einen Reaktionsweg der Translationsinitiation blockieren, versprechen daher

antiproliferativ, aber wenig toxisch zu wirken.

Als ein geeignetes Zielmolekül erscheint die von doppelsträngiger RNA (dsRNA) abhängigen

Proteinkinase (PKR). Durch Phosphorylierung des eukaryotischen Initiationsfaktor 2 (eIF2)

bewirkt PKR eine Blockierung von Faktoren, welche die Initiation der Proteinsynthese,

insbesondere die Synthese von Onkoproteinen, unterstützen (Proud 1995). Die PKR ist ein

durch Typ I Interferon induzierbares Enzym, welches häufig in eukaryonten Organismen

vorkommt (Roberts 1976). Diese Serin/ Threonin spezifische Proteinkinase ist bereits seit

Mitte der siebziger Jahre durch ihre Eigenschaften in der antiviralen Abwehr bekannt

(Clemens 1975). Insbesondere in den letzten Jahren wurde sie mit großem Interesse erforscht,

und viele Kenntnisse betreffend ihrer Expression, Interaktionen mit dsRNA und

Proteinmolekülen, sowie Modi ihrer Aktivierung und Inhibierung wurden erlangt (Proud

1995), (Clemens and Elia 1997). Es konnte gezeigt werden, dass PKR in eine Vielzahl

wichtiger zellulärer Prozesse involviert ist. Sie spielt eine zentrale Rolle in der Regulation von

Translation, Transkription und Signaltransduktion (Clemens and Bommer 1999), (Clemens

and Elia 1997). Sie besitzt die Fähigkeit den Proteinsynthesefaktor eIF2, IκB, einen Inhibitor

des Transkriptionsfaktors NFκB, und andere PKR Moleküle zu phosphorylieren. (De Haro

1996), (Kumar 1994). Ihre antiproliferativen Eigenschaften und die Induktion von Apoptose

sind inzwischen von zentraler Bedeutung (Der 1997), (Jaramillo 1995). Bisher ist es

allerdings nicht gelungen, die komplette dreidimensionale Struktur sowie die strukturellen

Beziehungen zu den entsprechenden Interaktionspartnern von PKR aufzuklären.

2.2 Die Proteinstruktur von PKR

Die Primärstruktur der humanen PKR, abgeleitet von ihrer cDNA, zeigt ein 68 kD Protein mit

551 Aminosäuren (Meurs 1990). Sie weist eine aminoterminale regulatorische Domäne,

sowie eine carboxyterminale katalytische Domäne auf (Abb. 2.1). Innerhalb der katalytischen

Domäne ist die ATP-bindende Region mit dem ATP-akzeptierenden Lysin an Position 296

lokalisiert, welches essentiell für die Phosphatübertragung ist. Mutationen dieses Lysins zu

Arginin oder Prolin führen zur katalytischen Inaktivität. Die regulatorische Domäne vereint

zwei Kopien eines dsRNA-bindenden Motivs, welches reich an basischen Aminosäuren ist.

Sie sind vergleichbar mit bekannten dsRNA Bindungsmotiven (ST Johnson 1992), (Katze

4


1991). Außerdem ist die regulatorische Domäne für die Lokalisation an den Ribosomen

verantwortlich. Zusätzlich an der Regulation beteiligt ist eine dritte, bisher weitgehend

unerforschte basische Domäne, die Domäne 3 (Aminosäuren 167-248). Die Region von PKR,

die mit eIF2α interagiert, befindet sich zwischen Aminosäure 367 und 551.

R1 R2 KinaseD3

167 248 267 538296

Regulatorische Domäne Katalytische Domäne

367

eIF2α siteLysATP site

Heparin site

PKR Struktur:

Abb. 2.1: Die Struktur von PKR mit den RNA-Bindungsdomänen (R1 und R2), der regulatorische Domäne 3

und der katalytischen Domäne mit dem ATP akzeptierenden Lysin an Position 296.

2.2.1 Die Kinasedomäne von PKR

Die Kinasedomäne umfasst zentral eine Substrat-Spezifitätsregion und zwei Kinase-

Subdomänen an jeder Seite. Eine Sequenzhomologie besteht zu 30 % mit der Kinasedomäne

des basic Fibroblast Growth Factor Rezeptors 2, FGF-2-Rezeptors, dessen Tertiärstruktur

bekannt ist. Darauf basierend wurden Homologiemodelle generiert, um

Sekundärstrukturelemente zu lokalisieren (Abb. 2.2).

5


Abb. 2.2: PKR Homologiemodell, Wagner et al. 2000 Es finden sich einige konservierte Regionen von bekannten Kinasedomänen anderer

Proteinkinasen (Meurs 1990). Struktur-Funktionsstudien haben gezeigt, dass die Deletion

einer Kinase-Insertsequenz oder Mutationen von Serin 355 die Kinaseaktivität reduzieren

(Craig, Cosentino et al. 1996). Vor kurzem konnte Dar et al. in Kristallisationsstudien zeigen,

dass der C-Terminus der katalytischen Domäne für die Interaktion eIF2α verantwortlich ist

(Dar A C 2005). Einige Proteinkinasen, so auch PKR, werden durch Phosphorylierung in der

Region zwischen zwei Kinase-Subdomänen, dem sogenannten “Activation Loop“ aktiviert. In

dem PKR Activation Loop sind Thr-446 and Thr-451 für eine hohe Kinaseaktivität essentiell.

Mutationen eines dieser Threoninreste zu Alanin beeinträchtigt die translationelle Kontrolle

durch PKR in Hefe- und COS1 Zellen und führt zu Tumorformation in Mäusen.

Autophosphorylierung von PKR und Phosphorylierung von eIF2α sind dadurch gestört

(Romano, Garcia-Barrio et al. 1998).

2.2.2 Die dsRNA-bindende Domäne von PKR

Die Klonierung der humanen PKR-cDNA Anfang der 90’er Jahre hat erstmalig detailliertere

Struktur-Funktionsstudien der Kinase erlaubt (Meurs 1990), (Feng 1992). Auf diese Weise

konnte die Domäne, welche in die Interaktion mit dsRNA und konsekutiver katalytischer

Aktivierung in virusinfizierten Zellen involviert ist, identifiziert werden [Patel,

6


1992 #207]. Durch die Bindung von dsRNA wird ebenfalls die autokatalytische Aktivität von

PKR induziert (Galabru 1987). Die dsRNA-bindende Domänen (DRBDs) sind innerhalb der

ersten 171 Aminosäuren am N-Terminus lokalisiert (Katze 1991), (Patel 1994). Diese Region

umfasst zwei Folgen eines Motivs, welches häufig in anderen dsRNA-bindenden Proteinen

gefunden wurde (ST Johnson 1992). Die beiden DRBD-Motive unterscheiden sich in ihrer

Fähigkeit, dsRNA zu binden. Obwohl beide Motive benötigt werden, zeigt die DRBD I eine

höhere Affinität für dsRNA. Sie ist reich an basischen und aromatischen Aminosäureresten.

Diese Reste sind in die elektrostatische Interaktionen mit dem Phosphatrückrad der RNA

sowie der Interkalationen zwischen den Nukleotiden involviert. Es wurde gezeigt, dass die

aminoterminalen 24 Reste unentbehrlich für die Bindung und konsekutive Aktivierung durch

dsRNA sind (Patel 1994). Die DRBD I ist außerdem in die Protein-Protein Interaktionen und

die Dimerisierung von PKR-Molekülen involviert (Abb. 2.3).

P K R

P K R

D ie D im e r is ie ru n g v o n P K R d u rc h d s R N A

d s R N A

NNN

C

N C

PKR

PKR

C C

Abb. 2.3: Dimerisierung von PKR über die Bindung von dsRNA.

Die DRBD II interagiert intramolekular mit der Kinasedomäne, was eine “verschlossene”

inaktive Konformation gewährleistet. Dieses wird wahrscheinlich durch Maskierung der

Dimerisationsdomäne erreicht (Nanduri 2000). PKR bindet unabhängig von mRNA an die

40S ribosomale Untereinheit. Es konnte nachgewiesen werden, dass die DRBDs für die

Bindung an die Ribosomen erforderlich sind (Zhu, Romano et al. 1997). Ribosomen selbst

üben einen inhibitorischen Effekt auf PKR aus, da sie mit der dsRNA um die Bindung

konkurrieren (Raine 1998). Die Kristallstrukturen sowie NMR-Strukturen der DRBDs

mehrerer

7


Proteine, einschließlich der von PKR, sind bestimmt worden (Ryter 1998), (Nanduri 1998).

2.2.3 Die Domäne 3 von PKR

Nur wenig ist über die Struktur-Funktionsbeziehung einer weiteren Domäne, der sogenannten

Domäne 3 (Aminosäuren 234-272), bekannt. Struktur-Funktionsstudien zeigen, dass diese

Domäne ebenfalls in die Regulation des durch PKR-vermittelten translationellen Blocks

involviert ist (Lee 1994). Deletion der Sequenz 234-272 beeinträchtigt sowohl die

apoptotische Aktivität, als auch die Fähigkeit, die Proteinsynthese zu inhibieren (Lee,

Rodriguez et al. 1997). Zurzeit gibt es keine Informationen über die Tertiärstruktur der

Domäne 3. Sie ist reich an basischen Aminosäureresten und besitzt eine Folge von 12

Argininresten, wie sie in heparinbindenden Proteinen wie beispielsweise Apolipoprotein E zu

finden sind (Margalit H 1993). Auch PKR ist in der Lage an Heparin zu binden. Es ist

anzunehmen, dass Domäne 3 die heparinbindende Domäne von PKR ist. Diese Region besitzt

zudem autoregulatorische Eigenschaften (Taylor 1996).

2.3 Die Gewebeverteilung von PKR

PKR wird nahezu ubiquitär in allen Zelltypen exprimiert, allerdings variiert die

Expressionsrate in Abhängigkeit vom Differenzierungsgrad. Hohe PKR-Konzentrationen

wurden in einer Vielzahl von differenzierten Geweben, insbesondere in epithelialen Zelltypen

gefunden. Hingegen konnten in Blasten und unreifen Mesenchymzellen, also in Zellen, die

eine hohe Proliferationsrate aufweisen, PKR nicht nachgewiesen werden. (Haines 1993). Die

Expression von PKR in malignen Tumoren zeigt sich Gewebespezifisch. Häufig werden

niedrige Konzentrationen gefunden. In einigen malignen Tumoren, wie z.B. dem

kolorektalen Karzinom konnten allerdings hohe Level einer dominant negativen Form von

PKR festgestellt werden (Kim, Gunnery et al. 2002).

8

Mirjam Debus EINFÜHRUNG 2.4 Die Regulation der Expression von PKR

Die Transkription von PKR ist nach Behandlung mit Typ I Interferonen um das 5-10 fache

hochreguliert (Roberts 1976). Inwiefern andere Zytokine neben Interferonen in der Lage sein

könnten, PKR zu regulieren, wurde bisher nicht ausreichend untersucht. Es gibt jedoch

Grund zur Annahme für eine Induktion durch TNF-α (Yeung 1996). Andere Beobachtungen

lassen vermuten, dass der transformierende Wachstumsfaktor-β (TGFβ) die

Expression von PKR inhibieren könnte (Salzberg 1995).

2.5 Mechanismen der Aktivierung von PKR

PKR existiert in latenter Form in den meisten Säugerzellen und wird unter anderem während

einer Virusinfektion direkt durch dsRNA aktiviert, welche im Verlauf der viralen Replikation

entsteht. Aber auch diverse Einflüsse, welche zellulären Stress verursachen, haben die

Aktivierung von PKR zur Folge. Die Homodimerisierung ist entscheidend für die PKR

Aktivität in vivo. Eine primäre Funktion der dsRNA, die an die RNA-bindende Domäne

nativer PKR bindet, ist die Förderung der Dimerisierung von PKR-Molekülen mit

konsekutiver Aktivierung der Kinasedomäne (Ung, Cao et al. 2001).

2.5.1 Zellulärer Stress

Die Phosphorylierung von eIF2α durch PKR scheint häufig von einer Signalkaskade

abzuhängen, welche vom endoplasmatischen Retikulum ausgeht. Erhöhte Phosphorylierung

des Initiationsfaktors eIF2α tritt als Reaktion auf unterschiedliche Agenzien auf, welche einen

störenden Einfluss auf das endoplasmatische Retikulum ausüben. Zu ihnen gehören diverse

Ca2+ entleerende Substanzen, wie DTT, Natriumarsenid und Tunicamycin (Prostko 1993),

Clotrimazol (Aktas, Fluckiger et al. 1998), Eicosapentoinsäure (Palakurthi 2000),

Thiazolidinedione (Palakurthi 2001). Die Entleerung von endoplasmatischem Ca2+ führt zur

Induktion von Glukose-regulierten Proteinchaperonen und Hitzeschock-Proteinchaperonen

mit konsekutiver Störung der Proteinfaltung und Modifizierungen innerhalb des Organells,

was die Aktivierung von PKR zur Folge hat (Brostrom, Prostko et al. 1996). Vermutlich

verursacht die Akkumulation von ungefalteten Proteinen einen zellulären Stress, der indirekt

in einer Aktivierung von PKR, und so in einer Herabregulation der Protein- synthese

resultiert. Der genaue Mechanismus ist noch ungeklärt. Es konnte gezeigt werden,

9


dass durch die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern bevorzugt die Synthese und

Expression von G1 Cyclinen inhibiert, was in einem Zellzyklusblock in der G1-Phase

resultiert (Abb. 2.4) (Aktas, Fluckiger et al. 1998).

Protein-synthese

PeIF2α

PeIF2α

eIF2αeIF2α

PKRPKR

G1 Cycline (D,E)

Rb-P

Cycline-cdk

CLTEPATZD

E2

Ca Ca2+2+

G1

E2

S

ER

Abb. 2.4: Die Freisetzung von Ca2+ aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) durch Clotrimazol (CLT), Eicosapentoinsäure (EPA) und Thiazolidinedione (TZD) führt über die Aktivierung von PKR und einer Phosphorylation von eIF2α zur Inhibition der Translationsinitiation. Konsekutiv kommt es zu einer Herabregulation der Proteinsynthese Zellzyklus-relevanter Proteine und so zu einer Blockade in der G1-Phase.

2.5.2 Aktivierende Liganden: dsRNA, PACT, Heparin

Es existiert folgendes Modell für die Reihenfolge von Ereignissen, die zur Aktivierung von

PKR durch dsRNA führt: dsRNA assoziiert mit der dsRNA-bindenden Domäne 1 und 2.

Konsekutiv kommt es zur Freisetzung von aminoterminalen inhibitorischen Sequenzen und

einer aktivierenden Konformationsänderung in PKR. Die Interaktion zwischen PKR

Molekülen ist zudem gesteigert durch Oligomerisation und Assoziation an Ribosomen, was

eine erhöhte lokalisierte Konzentration zur Folge hat (Abb. 2.5) (Vattem, Staschke et al.

2001).

10


PKRHeparin

PKR

PKR PKR

P

Die Aktivierung von PKR

dsRNA

P

Abb. 2.5: Aktivierungsmodell von PKR: Durch die Bindung von Liganden wie dsRNA oder Heparin erfolgt die

Dimerisierung mit konsekutiver Autophosphorylierung von PKR.

Bis vor kurzem war allerdings unklar, wie die PKR Aktivierung in nicht viral infizierten

Zellen als Reaktion auf die vielfältigen extrazellulären Stimuli vermittelt wird. Vor wenigen

Jahren wurde ein endogener Proteinaktivator für PKR (PACT) identifiziert, und es ist

wahrscheinlich, dass PACT eine entscheidende, obwohl bisher noch undefinierte Rolle in

diesem Prozess spielt. PACT wird als Antwort auf diverse Stresssignale, wie Serumentzug,

Peroxyd- oder Arsenidbehandlung in der Abwesenheit von viralen Infektionen hochreguliert

(Patel and Sen 1998), (Patel 2000), (Williams 1999). PACT wird ubiquitär in niedriger

Konzentration exprimiert, was weder durch Interferone, noch durch dsRNA vermittelt wird.

PACT besitzt typische Domänen, welche für die Vermittlung von Protein-Protein

Interaktionen zwischen den Mitgliedern der PKR-Familie von dsRNA-bindenden Proteinen

bekannt sind und ist in der Lage direkt an PKR zu binden. Ein weiteres PKR aktivierendes

Molekül ist Heparin. Die strukturelle und funktionelle Basis dieser PKR Aktivierung

unterscheidet sich allerdings von derjenigen der dsRNA (Patel 1994), (George 1996). Bis vor

kurzem konnte nur die in vitro Aktivierung durch Heparin nachgewiesen werden, da eine

zelluläre Aufnahme von Heparin in der Regel nicht möglich ist. Jetzt gelang allerdings in

vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) der Nachweis einer Aktivierung in vivo. Die

Behandlung von VSMCs mit Heparin resultiert in der Aktivierung von PKR durch direkte

Bindung und führt zur Blockade des Übergangs von G1- zu S-Phase. Die Internalisierung und

die Bindung wurde mittels Immunpräzipitationsassays mit einem

11


PKR Antikörper nach erfolgter Behandlung der VSMCs mit 35S-markiertem Heparin

nachgewiesen (Patel 2002).

2.6 Mechanismen der viralen Inhibition von PKR

Viren haben effektive Mechanismen entwickelt, um die PKR Aktivität während der

Transfektion zu unterdrücken. PKR ist das Zielmolekül für die Regulation durch diverse viral

kodierte inhibitorische Moleküle (Gale and Katze 1998). Adenoviren und Epstein-Bar Viren

generieren ein virales Genprodukt, welches PKR durch direkte Interaktion mit der

aminoterminalen regulatorischen Domäne inaktiviert, und so als kompetitiver Inhibitor von

dsRNA-Bindingsreaktionen funktioniert (Galabru 1989). Daneben existiert auch ein zelluläres

Protein, das sogenannte Tar RNA Binding Protein, welches an die dsRNA-Bindungsdomäne

von PKR bindet (Park, Davies et al. 1994). Virusprodukte von Hepatitis-C Viren und

Baculoviren besitzen die Fähigkeit, die Kinasedomäne von PKR als Pseudosubstrat direkt zu

blockieren (Taylor 2000), (Taylor, Shi et al. 1999). Des Weiteren wurde ein zellulärer PKR-

Inhibitor identifiziert, p58IPK (Barber 1994). p58IPK, ist ein durch Influenzavirus aktiviertes

Co-chaperon, welches wahrscheinlich das Hitzeschockprotein hsp/Hsc70 zur Neufaltung

veranlasst, und so die Kinasefunktion inhibiert (Abb. 2.6) (Melville, Tan et al. 1999).

Inhibition von PKR durch p58 IPK

PKR

PKR

PKR PKR

p58 IPK

P P

Abb. 2.6: Inhibition der Autophosphorylierung von PKR durch das zelluläre Co-Chaperon p58IPK.

12


Hepatitis C Viren haben verschiedene Mechanismen zur Inhibition von PKR entwickelt. Das

Virusprodukt NS5A, ist in der Lage, Heterodimere mit PKR zu bilden, was die Formation von

PKR-Homodimeren unterbindet (Gale 1997). Der kombinierte Effekt könnte die ausgeprägte

Resistenz bestimmter HCV-Subtypen gegenüber Interferonen, und so die hohe Persistenzrate

dieser Subtypen erklären. Zudem ist ein Sekundäreffekt der PKR-Inhibition eine Stimulation

der Wirtszellenproliferation, was für die Bildung von HCV-assoziierten Hepatozellulären

Karzinomen eine Rolle spielen könnte (Taylor 2000).

HIV-1 hat multiple Mechanismen entwickelt, um die durch PKR und Interferon induzierte

antivirale Reaktion zu umgehen (Barber 1994), (Katze 1990). Das Poliovirus ist in der Lage

PKR zu degradieren (Black 1993).

2.7 Substrate von PKR

PKR katalysiert die intermolekulare Phosphorylierung der α-Untereinheit des

Translationsinitiationsfaktors eIF2, und phosphoryliert außerdem andere PKR Moleküle

sowie den zellulären Inhibitor des Transkriptionsfaktors NF-κB, IκB (Clemens 1994).

(Kumar 1994). Die vielfältigen zellulären Prozesse, in welche PKR involviert ist, lassen die

Existenz weiterer Substrate vermuten. In vitro Experimente haben gezeigt, dass PKR mit dem

Tumorsuppressor p53 assoziiert ist und diesen auch phosphoryliert (Cuddihy, Wong et al.

1999).

2.8 Biologische Effekte von PKR

Studien der letzten Jahre haben die große Vielfalt der durch PKR vermittelten biologischen

Prozesse verdeutlicht. Neben den antiviralen Eigenschaften haben in erster Linie die

verschiedenen wachstumsinhibierenden Prozesse an Interesse gewonnen. Sie werden zum

einen auf der Ebene der Genexpression, zum anderen durch direkte oder indirekte Induktion

der Apoptose vermittelt. Ein weiteres Forschungsfeld bietet die Rolle von PKR bei der

Differenzierung.

13


2.8.1 Inhibition der Translationsinitation

Die Rekrutierung der tRNA und mRNA zu der kleinen ribosomalen Untereinheit, welcher als

Translationsinitiation bezeichnet wird, unterliegt einer besonders ausgeprägten Regulation.

Dieser Prozess wird vermittelt durch die Translationsinitiationsfaktoren eIF2α, eIF2B und

deren assoziierte Faktoren (Pain 1996). Es bildet sich dabei zunächst ein ternärer Komplex

aus dem Initiationsfaktor 2α (eIF2α), Guanosintriphosphat (GTP) und Methionin-tRNA.

Dieser Komplex bindet an die kleine ribosomale Untereinheit und bildet den

Präinitiationskomplex. Unter Beteiligung weiterer Initiationsfaktoren wird dieser Komplex

am 5’- Ende der mRNA gebunden. Der Prä-Initiationskomplex wandert nun entlang der

mRNA bis zum Startkodon, wo er zusammen mit der ribosomalen 60S-Untereinheit das 80S-

Ribosom bildet und die Translation beginnt (Abb. 2.7).

Die Initiation der Translation

40S

40S

Met-tRNA + eIF2 GTP

46S

40S60S

60S

43S mRNAandere Faktoren

eIF5

eIF2 GDPandere Faktoren

eIF2 GDP

PKR

Abb. 2.7: Die Initiation der Translation.

Während der Initiation wird GTP zu GDP hydrolysiert. Um einen neuen Initiationsvorgang

einleiten zu können, muss GDP durch GTP ausgetauscht werden. Dieser Vorgang wird durch

eIF2B katalysiert und kann durch PKR inhibiert werden. Die Aktivierung von PKR führt zur

Phosphorylierung von eIF2α (Levin 1978). eIF2B bildet dadurch einen festen Komplex

14


mit eIF2α, wodurch der GDP- GTP Austausch blockiert wird (Abb. 2.8). Dieses resultiert in

einer allgemeinen Verknappung von Translationsinitiationsfaktoren, und führt damit zur

ineffizienten Translation wichtiger zellzyklusregulierender Proteine (wie z.B. Cyclin D1,

Cyclin E). Auf diese Weise kommt es zu einem Wachstumsstillstand in der G1 Phase.

Inh ib ition der T ransla tions in itia tion

eIF2 G TP

eIF2 G D P PK R

eIF2α G D PP

eIF2α G D PP

eIF2B

eIF2B

Abb. 2.8: Die Initiation der Translation wird durch PKR über die Phosphorylierung von eIF2α inhibiert.

2.8.2 Regulierung der Translation bei verschiedenen mRNA Spezies

Die Phosphorylierung von eIF2α dient der Feinregulation der translationellen Effizienz von

verschiedenen mRNA-Subtypen. Proteine haben unterschiedliche mRNA Spezies, die mehr

als hundertfach in ihrer translationellen Effizienz variieren. Substanzen, welche die globale

Rate der Polypetidketteninitiation reduzieren, inhibieren die Translation bevorzugt von

mRNAs mit niedriger konstanter Rate für die Polypeptidketteninitiation. (Lodish 1974). Es

konnte gezeigt werden, dass die primäre Nukleotidsequenz des Initiationscodons und/oder die

Tertiärstruktur der mRNA in der Nähe des Codons die Rate der Ribosomenbindung

bestimmen (Lodish 1970), (Steitz 1969). Viele mRNAs die für wichtige

zellzyklusregulierende Proteine codieren, zeigen eine ineffiziente Translation. Sie weisen zum

Beispiel hochkomplexe 5’ UTRs auf, was die Rekrutierung an die Ribosomen erschwert und

dadurch in einer stärkeren Abhängigkeit von TI-Faktoren resultiert (Kozak 1991).

15


2.8.3 Regulierung der Gentranskription/ Signaltransduktion

PKR reguliert die Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren, wie unter anderen NF-

κB und p53. (Kumar 1997), (Cuddihy, Wong et al. 1999). Auch konnte gezeigt werden, dass

die dsRNA induzierte TNF-α Genexpression in humanen Epithelzellen durch PKR vermittelt

wird. (Meusel 2002).

Dem Transkriptionsfaktor NFκB werden in erster Linie antiapoptotische Wirkmechanismen

zugesprochen. In der letzten Zeit erreicht zunehmend die Induktion proapoptotischer

Signalkaskaden durch NFκB an Relevanz (RyanKM, 2000). NFκB stellt den Knotenpunkt für

die Transkription diverser Gene wie FasL, Fas, IRF-1, IFNβ, Kaspase 1 oder p53 dar. Die

Expression dieser Gene resultiert in der Aktivierung von Kaspasen, und somit in der

Einleitung von Apoptose (Chu 1999), (Gil, Alcami et al. 1999). NF-κB setzt sich aus Dimeren

verschiedener Mitglieder der Rel Proteinfamilie zusammen (Gosh 1998). Die häufigste Form

von NF-κB ist ein Heterodimer von p50 und p65 (RelA), welches im Zytosol durch die IκB

Proteine sequestriert wird. Dieses inhibiert die nukleäre Translokation und die DNA-bindende

Aktivität von NF-κB (Verma 1995). Die Rel/ NF-κB Familie der Transkriptionsfaktoren

steigern die Expression von Genen, welche in immunologische- und inflammatorische

Reaktionen, in Zelldifferenzierung und in die Kontrolle der Apoptose, sowie in andere

wichtige Prozesse involviert sind (Gosh 1998). Es wurde gezeigt, dass die katalytische

Aktivität von PKR für die NF-κB Aktivierung benötigt wird. Die Phosphorylierung von IκBα

durch den über PKR aktivierten IκB Kinase Komplex (IKK) und spätere Degradation des

Proteins ist dabei erforderlich (Gil 2001). 2.8.4 PKR und Apoptose

In zahlreichen Studien wurde PKR eine entscheidende Rolle bei der Apoptose zugeschrieben.

Die Mechanismen sind vielfältig und noch nicht eindeutig geklärt. Als erwiesen gilt aber, dass

verschiene Stimuli für die Induktion von Apoptose durch PKR verantwortlich sind. Bekannte

PKR-Aktivatoren wie dsRNA, Lipopolysaccharide, TNF-α, Serumentzug, IL-3 Entzug, Ca2+-

Entleerung aus dem endoplasmatischen Retikulum, PACT Aktivierung, sowie die

Blockierung von PKR-Inhibitoren waren allesamt in der Lage Apoptose zu induzieren (Gil

and Esteban 2000). Auch wurde eine gesteigerte Phosphorylierung von eIF2α bei der

Apoptoseinduktion beobachtet, was auf eine PKR-Involvierung schließen lässt (Srivastava,

16


Kumar et al. 1998), (Gil, Alcami et al. 1999). Neuere Studien zeigen, dass PKR zu einem

Zellzyklusblock in der G2/M Phase führt, und die Apoptose in PKR-überexprimierenden

Zellen induziert. Dieser durch PKR induzierte G2/M Block konnte durch ein „Onkogen-like

v-mos“ aufgehoben werden (Dagon 2001). Des Weiteren hat sich gezeigt, dass Fibroblasten

von PKR-/- Mausembryonen gegenüber einer TNFα-induzierten Apoptose resistent sind (Der

1997).

Offenbar spielen viele unterschiedliche Mechanismen bei der Induktion von Apoptose durch

PKR eine Rolle. Zum einen ist PKR durch Regulation der Translation, zum anderen über die

Modulation von Transkription und anderen Signaltranduktionswegen in der Lage Apoptose

einzuleiten. Zum Teil ist ihre Wirkung der Kaspasenkaskade vorgeschaltet beschrieben.

Arbeiten, welche die Signaltransduktionswege in Reaktion auf TNF-α untersuchen, haben zu

dem Ergebnis geführt, dass PKR oder eine PKR-abhängige Signalkomponente auf der

Signalkaskade oberhalb des Death Domain Receptors und der Initiatorkaspase, Kaspase 8,

liegt (Jeffrey, Bushell et al. 2002), (Balachandran 1998). Andererseits wurde auch eine

Kaspase-abhängige PKR Aktivierung gezeigt. Es konnte bewiesen werden, dass PKR in

frühen Stadien der Apoptose proteolysiert und eIF2α phosphoryliert wird. Durch die

Abspaltung einer aminoterminalen inhibitorischen Sequenz ist PKR konstitutiv in einem

aktivem Zustand (Saelens, Kalai et al. 2001).

Der Apoptoseinhibitor Bcl-2 ist in der Lage PKR induzierte Apoptose zu inhibieren. Die

Translation wird dabei jedoch nicht beeinträchtigt. Dieses lässt vermuten, dass Bcl-2 keinen

direkten Einfluss auf PKR hat, allerdings in der nachgeschalteten Signalkaskade noch

oberhalb der CPP32-Proteasekaskade seinen inhibitorischen Effekt ausübt (Lee, Rodriguez et

al. 1997).

2.8.5 PKR und Differenzierung

Zellen, welche die terminale Differenzierung durchlaufen, zeigen deutliche Veränderungen in

ihrem Muster der Genexpression. Es ist wenig über die Mechanismen bekannt, welche die

Translation der meisten Transkripte inhibieren, während die Translation spezifischer mRNAs

in dem Verlauf der Differenzierung aktiviert wird. Es gibt Anhalt dafür, dass mRNAs, welche

Interferone Responsive Elemente (IRES) innerhalb langer, hochstrukturierter und ORF-

beladener 5’UTRs aufweisen, eine Untergruppe umfassen, die während der Differenzierung

spezifisch translational aktiviert wird. Diese spezifische Regulation auf Ebene der Translation

17


ist nachweislich an die Phosphorylierung von eIF2α und die nachfolgende Inhibition der

Proteinsynthese gekoppelt und somit PKR abhängig (Gerlitz, Jagus et al. 2002).

2.8.6 PKR und Tumorsuppression

PKR scheint ihre antitumorgene Aktivität über die Aktivierung multipler Transduktionswege

zu vermitteln. Sie alle kumulieren in Wachstumsinhibition und Induktion von Apoptose. Der

direkte Zusammenhang zwischen Tumorregression und der Aktivierung von PKR konnte

vielfach nachgewiesen werden.

Anfang der 90er Jahre gelang der Nachweis, dass die Expression einer katalytisch inaktiven

Mutante von PKR in NIH 3T3 Zellen in maligner Transformation resultiert (Koromilas 1992).

Diese Mutanten zeigten einen dominant negativen Effekt auf Wildtyp PKR in vitro,

wahrscheinlich durch Kompetition um die dsRNA Bindung (Sharp, Xiao et al. 1993). Auch

Mutanten mit fehlender dsRNA Bindungsdomäne I imponierten als transdominante

Inhibitoren, die maligne Transformation induzieren (Barber, Jagus et al. 1995). In humanen T

Zell Leukämiezellen fand man eine alternativ gespleißte Form von PKR. Bei ihr resultiert

eine Deletion des Exon 7 (PKRΔ7) in einem trunkiertem Protein mit fehlenden dsRNA-

bindenden Motiven. PKRΔ7 zeigt eine dominant negative Funktion, indem sie die PKR

Autophosphorylierung und eIF2α Phosphorylierung inhibiert (Li 2001).

Erst vor kurzem konnte bewiesen werden, dass der neuentdeckte Tumorsuppressor, das

Melanom Differenzierungs-assoziierte Gen 7 (mda7), die Apoptose in einer Vielzahl von

Tumorzelllinien induziert. Unter anderem führt er zur Regression bei dem kolorektalen

Karzinom und beim Mammakarzinom. Es konnte gezeigt werden, dass die mda7-Expression

in der Induktion und Aktivierung von PKR, mit konsekutiver Phosphorylierung von eIF2α

und Apoptose resultiert (Pataer, Vorburger et al. 2002).

Der tumorsuppressive Effekt von PKR wurde teilweise in Frage gestellt, als bekannt wurde,

dass verschiedene Tumoren, wie Melanome, Kolonkarzinome und Mammakarzinome eine

gesteigerte PKR-Expression und -Aktivität aufweisen (Kim, Gunnery et al. 2002), (Kim,

Forman et al. 2000). Dieses kann zum einen als reaktive Regulation gewertet werden,

andererseits konnte in weiteren Studien der Nachweis erbracht werden, dass bestimmte

18


Mammakarzinomzellen, MCF7-Zellen, eine gesteigerte PKR inhibierende Aktivität

aufweisen (Savinova 1999).

Die antineoplastischen Eigenschaften von PKR haben die viel diskutierte Frage aufgeworfen,

ob PKR als Tumorsuppressorprotein gewertet werden sollte. Diese Frage konnte bisher nicht

abschließend beantwortet werden. Allerdings muss unterstrichen werden, dass die klassischen

Kriterien eines Tumorsuppressorproteins für PKR nicht zutreffen. Ein Verlust von PKR hat

nicht unweigerlich eine maligne Transformation zur Folge. Beispielsweise wurde in

transgenen Mäusen mit gezielter Mutation der katalytischen Domäne kein Verlust der

tumorsuppressiven Wirkung durch PKR beobachtet (Abraham 1999). In späteren Studien

wurde die Verlässlichkeit dieser Ergebnisse jedoch angezweifelt. Die Resultate mit Zellen

zweier PKR-/- Modelle waren widersprüchlich und verwirrend. Neuere Daten demonstrieren,

dass es sich bei den PKR-/- Modellen um inkomplette Knockoutmäuse handelte (Baltzis, Li et

al. 2002).

In Zusammenschau der genannten Untersuchungen wird die entscheidende Rolle der

Interferon-induzierbaren, dsRNA abhängigen Proteinkinase, PKR, bei diversen zellulären

Prozessen deutlich. Insbesondere die Schlüsselrolle bei der Regulation von Zellwachstum und

Differenzierung sowie ihre potenziellen antineoplastischen Kapazitäten, ferner aber auch ihre

Relevanz in der zellulären Virusabwehr, gaben den Anlass bei dem vorliegenden Projekt, die

Kenntnisse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften von PKR zu vertiefen. Da die

dreidimensionale Struktur von PKR und die für die Interaktion mit regulierenden Molekülen

entscheidenden Sequenzen nur in Teilen bekannt war, sollten im Rahmen dieser Arbeit durch

NMR-spektroskopische Untersuchungen wesentliche Informationen diesbezüglich generiert

werden.

19

Mirjam Debus MATERIAL 3 MATERIAL 3.1 Antikörper PKR-Antikörper, C-Terminus, polyclonal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Santa-Cruz

PKR-Antikörper, N-Terminus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Santa-Cruz

His-Antikörper. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Chemicon

Sekundärantikörper. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Chemicon

3.2 Bakterienstämme E. coli DH5α . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .I nvitrogen

E. coli BL21DE3gold . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Stratagene

3.3 Nukleinsäuren dATP, dCTP, dGTP, dTTP. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Gibco 3.3.1 Vektoren pBISA PKR K296P GFP I (6000 bp) Aktas et al. pET-15b (5708bp) Novagen pTYB12(7414 bp) New England Biolabs pMal -c2X (6648 bp) New England Biolabs pGEV2 (6382 bp) Wagner et al. Wagner et al. 3.3.2 Oligonukleotide: 5’Δ196-NdeI CGGCAGCCATATGAGCACACTCGCTTCTGAA Gene link, NY5’Δ262-NdeI CGGCAGCCATATGAGG TTTGGCATGGATTT Gene link, NY 5’PKR Δ179- BamHI CGCGGATCCGGTTCTTTTGCTACTACGTGT Gene link, NY5’PKR Δ262- BamHI CGCGGATCCAGGTTTGGCATGGATTTTAAAGAA Gene link, NY3’gev2 XhoI CGGCTCGAGACATGTGTGTCGTTCATT Gene link, NY3’pTYB12 XhoI CGGCTCGAGCTAACATGTGTGTCGTTCATT Gene link, NY5’PKR K296-(Arg)NheI CACCGATCGCCCATGGCTCGAGCTTA Gene link, NY3’PKR Arg1Rev TTAACGCGTCGAATGACGTAAGTCTT Gene link, NY 3.4 Enzyme Restriktionsendonukleasen mit entsprechendem Puffer. . . . . . . . . . New England Biolabs

Elongase mit entsprechendem Puffer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Gibco

T4 DNA Ligase, T4 DNA Ligationspuffer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gibco

20

Mirjam Debus MATERIAL 3.5 Puffer und Reagenzien für die DNA-Analytik 3.5.1 Reagenzien für die Plasmidisolation Resuspensionspuffer A: Lysepuffer A: 50 mM Tris-Cl, pH 8,0 200 mM NaOH, 10 mM EDTA 1% SDS 100µg/ml RNase A Präzipitationspuffer A: Waschpuffer A: 3,0 M Kaliumacetat, pH 5,5 50 mM MOPS, pH 7,0

1,0 M NaCl Elutionspuffer A: 15% Isopropanol 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 Luria-Bertani Medium: 10 g Trypton, 5g Hefeextrakt, 10 g NaCl in 800 ml dH2O; pH 7,0 mit dH2O auf einen Liter aufgefüllt. 3.5.2 Kits für die DNA Isolation DNA-Miniprep . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Qiagen

DNA-Maxiprep . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Qiagen

Qiaquick-DNA-Gelextraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Qiagen

3.6 Puffer und Reagenzien für die Proteinaufreinigung 3.6.1 Affinitätsmatrizes Amylose Resin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

DEAE-Sepharose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Chitin Beads (50 –100 µm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . New England Biolabs

Nickel Beads. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Ni-Nitrilotriacetat (NTA) Spin Column . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Qiagen

3.6.2 Puffer für die Isolierung von MBP-Fusionsproteinen Säulenpuffer M: Elutionspuffer M 1: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 Säulenpuffer M, 200 mM NaCl 10 mM Maltose 1 mM EDTA 1 mM DTT

21

Mirjam Debus MATERIAL Spaltungspuffer M: Dialysepuffer M: Säulenpuffer M, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 1 mg Faktor Xa 25 mM NaCl pro100 mg Fusionsprotein Waschpuffer M: Elutionspuffer M 2: 10 mM Tris -HCl, pH 8.0 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 25 mM NaCl Gradient 25mM NaCl - 500mM NaCl 3.6.3 Puffer für die Isolierung von CBP-Fusionsproteinen Zelllysepuffer C: Säulenpuffer C: 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 500 mM NaCl 500 mM NaCl 1 mM EDTA 1 mM EDTA 0.1%Triton X-100 20 µM PMSF. Spaltungspuffer C: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 500 mM NaCl 1 mM EDTA 50 mM DTT 3.6.4 Puffer für die Isolierung von PG-Fusionsproteinen Säulenpuffer G: Elutionspuffer G: 10 mM Imidazol, pH 8,0 20 mM- 250 mM Imidazol, pH 8,0 3.7 Puffer und Lösungen für die Proteinanalytik 3.7.1 BCA-Assay-Reagenzien Reagenz B: Reagenz A: BCA 1% CuSO4- 5 H2O 4% Na2CO3-H2O 2% Aqua dest. Auf 50 ml. Na2C4H4O6-H2O 0,16% NaOH 0,4% Standard Arbeitsreagenz: NaHCO3 0,95% 50 Teile Reagenz A, Aqua dest. auf 1L 1 Teil Reagenz B. 3.7.2 Coomassie Blue Stain-Reagenzien: Coomassie Blue Stain: Coomassie Blue Destain: 1,0 g Coomassie Blue R-250 100 ml Methanol 450 ml Methanol, 450 ml H2O 800 ml H2O 100 ml Eisessigsäure 100ml Eisessigsäure. Aqua dest. auf 1L Aqua dest. auf 1L

22

Mirjam Debus MATERIAL 3.7.3 Silberfärbungsreagenzien Lösung A : Lösung B: 0,4 g Silbernitrat 21 ml 0,36%ige NaOH 4 ml Aqua dest. 1,4 ml Ammoniumhydroxid 14,8 mM Lösung C: Lösung D: Lösung A Tropfenweise zu Lösung B 0,5 ml 1%igeZitronensäure bis das braune Präzipitat aufklart 50 µl 38%iges Formaldehyd Aqua dest. Auf 100 ml Aqua dest. auf 100 ml Haltbarkeit:15 Min. 3.8 Chemikalien Agarose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Ampicillin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Bicinchoninic Acid (BCA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Coomassie Brilliantblau R250. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

DTT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

D-Glucose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

EDTA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

Ethanol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Essigsäure. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Ethidium-Bromid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

Glycerin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Imidazol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Merck

Isopropyl β-D-1-Thiogalaktopyranosid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

Isopropanol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Kaliumchlorid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

Kaliumacetat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

Maltose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Methanol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Magnesiumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

Magnesiumsulfat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

MOPS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

Natriumacetat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

Natriumchlorid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Natriumcitrat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

23

Mirjam Debus MATERIAL

Natronlauge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Polyacrylamid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

Salzsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sigma-Aldrich

Silbernitrat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Sodiumdodecylsulfat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

N,N,NI,NI-Tetramethylethylenediamin (TEMED). . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

TRIS-HCl 0,1 M, pH 8,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

Triton-X-100. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sigma-Aldrich

3.9 Geräte

Table-top Mikrozentrifuge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Eppendorf

Maxifuge. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Sorvall

Photometer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Shimadzu

PCR-Maschine. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Eppendorf

High Pressure Cell Disrupter 1,1 KW. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Benohtop

Ultrasonicator Tomy UR-150P. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Seiko, Japan

Elektrophoreseapparat. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .BioRad

BioLogic DuoFlow QuadTec 40 system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .BioRad

Kamaras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Polaroyd, Canon

PH-Meter. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Orion

UV-Lampe. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fluo Link

NMR-Spektroskop, 600 MHz. . . . . . . . . . . . . . . . Bruker Advance und Varian Inova

3.8. Software Laser GeneTM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DNASTAR.Inc, Madison

Biologic. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . BioRad

3.9. Datenbanken Preteome Blast Search. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .NCBI

24

Mirjam Debus METHODEN 4 METHODEN 4.1. Subklonierung von DNA-Fragmenten in bakterielle Vektoren

4.1.1. Plasmid Isolation

Plasmid-DNA wurde entsprechend des Qiagen®-Protokolls isoliert. Einzelne bakterielle

Kolonien von E. coli DH5α wurden jeweils in 4 ml Luria-Bertani (LB) Medium (10 g

Trypton, 5g Hefeextrakt, 10 g NaCl in 800 ml dH2O, pH 7,0 auf einen Liter mit ddH2O

aufgefüllt) inokuliert und für 14-16 Stunden unter ständiger Bewegung bei 37 °C inkubiert. 4

ml Kulturen wurden bei 13.000 rpm für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde

in 250 µl Resuspensionspuffer A gelöst und in Mikrofugenröhrchen transferiert. Die

Bakterien wurden unter alkalischen Bedingungen wie folgt lysiert: 250 µl Lysepuffer A

wurden hinzugesetzt und die Mikrofugenröhrchen wurden vorsichtig geschwenkt. Die

Lysereaktion dauerte 5 Minuten. Daraufhin wurden 350 µl Präzipitationspuffer A

hinzugesetzt und die Röhrchen wurden sofort 4-6 x vorsichtig geschwenkt. Die Proben

wurden dann für 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde jeweils auf eine

Affinitätssäule (QIAprep® spin column) gegeben, und für 60 Sekunden bei 4°C und 13.000

rpm zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Die Affinitätssäule wurde mit 0.5 ml

Waschpuffer A gewaschen, und für 60 Sekunden bei 4°C und 13.000 rpm zentrifugiert. Der

Durchfluss wurde verworfen. Um Reste des Waschpuffers zu entfernen, wurde die Säule für 2

weitere Minuten zentrifugiert. Daraufhin wurde die Säule in ein sauberes 1,5 ml

Mikrofugentube platziert. 50 µl Elutionspuffer A wurden hinzugesetzt. Nach einer

Inkubationszeit von 1 Minute wurde die Säule für 60 Sekunden bei 4°C und 13.000 rpm

zentrifugiert, um die DNA auf diese Weise zu eluieren.

4.1.2 Determinierung der DNA-Konzentration

Die DNA-Konzentration wurde spektrometrisch bestimmt und über die Absorption bei einer

Wellenlänge von 260 nm berechnet. Bei einem 1:50 verdünnten Ansatz entspricht eine OD260

von 1 einer dsDNA-Konzentration von 50 µg/ml. Die Reinheit der Probe wurde durch den

OD260 /OD280 Quotienten bestimmt. Bei hoher Reinheit beträgt er 1,9 bis 2,2.

25

Mirjam Debus METHODEN

4.1.3 Analyse von Plasmid DNA durch Restriktionsverdau

Um das Vorhandensein des richtigen Plasmids zu verifizieren, wurden die Plasmide mit

entsprechenden Restriktionsendonukleasen behandelt. Die Reaktion wurde wie folgt

angesetzt: 2 µg DNA in 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 (0,5 µg DNA/µl); je 1 µl der beiden

Endonukleasen ; 2 µl des entsprechenden Puffers; aufgefüllt mit ddH2O auf 20 µl. Die

Inkubationszeit bei 37 °C betrug je nach Aktivität der Enzyme 2-14 Stunden. Die Größe der

resultierenden Fragmente wurde mittels Gelelektrophorese ermittelt. Die Fragmente der durch

die Restriktionsenzymen gespalteten Plasmide wurden in einem 1%igem Agarosegel

separiert, welches 5 mM Ethidiumbromid enthielt. Die Ethidiumbromid-DNA-Komplexe

wurde unter UV Licht sichtbar gemacht, und photographisch dokumentiert.

4.1.4 Amplifikation von Genfragmenten durch PCR

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde genutzt, um spezifische DNA-Fragmente direkt

zu amplifizieren. Dabei wurde zunächst die Matrize durch Hitze bei 94°C in einzelsträngige

DNA denaturiert. Zwei synthetische Oligonukleotide, welche zu den 3’ Enden des

entsprechenden DNA Segments komplementär waren, wurden im Überschuss hinzugegeben

und die Temperatur auf 56 °C gesenkt. Die genomische DNA blieb denaturiert, da die

komplementären Stränge eine zu geringe Konzentration aufwiesen, als dass sie sich während

der Inkubationsphase aneinander lagern konnten. Die im Überschuss vorliegenden

spezifischen Oligonukleotide hybridisierten mit den komplementären Sequenzen der

genomischen DNA. Die hybridisierten Oligonukleotide dienten als Primer, welche die DNA-

Synthese mit Hilfe von hinzugesetzten Deoxynukleotiden und einer hitzeresistenten DNA-

Polymerase bei 72 °C initiierten.

Wiederholte Zyklen von Synthese und Denaturierung resultierten in einer exponentiellen

Amplifikation. Die PCR Reaktion wurde wie folgt angesetzt: dNTP 14 µl; 1. Primer 2 µl; 2.

Primer 2 µl; Elongase 6 µl; DNA 1 µl; Puffer 30 µl; ddH2O 95 µl. Der Reaktionsansatz wurde

in 20 µl Portionen aliquotiert und in PCR-Tubes transferiert.

26


4.1.5 Klonierung eines PCR-Fragments

4.1.5.1 Präparation des PCR-Fragments und der Vektor-DNA

Die PCR-Fragmente wurden mittels Gelelektrophorese in einem 1%’igen Agarosegel mit 5

mM Ethidiumbromid separiert, und dann entsprechend des Qiagen®-Protokolls aufgereinigt.

Die DNA-Banden wurden unter UV-Licht sichtbar gemacht und mit einem Skalpell aus dem

Agarosegel herausgeschnitten. Drei Volumen des Lysepuffers B wurden zu einem

Gelvolumen (100 mg ~ 100 µl) hinzugesetzt. Die Mixtur wurde dann bei 50 °C für 10

Minuten inkubiert. Zu der vollständig gelösten Probe wurde dann eine äquivalente Menge des

Gelvolumens an Isopropanol hinzugesetzt. Die Mixtur wurde auf eine Affinitätssäule gegeben

und für 1 Minute bei 4 °C und 13.000 rpm zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Für

den Waschvorgang wurden 0.75 ml des Waschpuffers B auf die Affinitätssäule gegeben und

ebenfalls für 60 Sekunden bei 4 °C und 13.000 rpm zentrifugiert. Der Durchfluss wurde

erneut verworfen, und die Säule wurde für weitere 60 Sekunden bei 4°C und 13.000 rpm

zentrifugiert. Die Säule wurde in ein sauberes 1.5 ml Mikrofugenröhrchen platziert. Für die

Elution der DNA wurden 50 µl Elutionspuffer B zentral auf die Affinitätsmembran gegeben,

und für 60 Sekunden bei 4°C und 13.000 rpm zentrifugiert. Die Konzentration der isolierten

PCR Produkte wurde mittels Gelelektrophorese und Vergleich mit Standards abgeschätzt,

bzw. UV-spektrometrisch bestimmt. Das PCR Produkt sowie 0,5 µg der Vektor-DNA wurden

mit je 10 Einheiten der entsprechenden Restriktionsenzyme bei 37 °C für 12 Stunden verdaut.

Zeigten die Enzyme eine Kreuzreaktion, so wurde ein sequenzieller Verdau durchgeführt.

4.1.5.2 Ligation der PCR Fragmente mit Vektor-DNA

Die Enden der Restriktionsfragmente wurden mittels rekombinant generierter T4-DNA-

Ligase kovalent gebunden. Dieses Enzym katalysiert während der transienten Basenpaarung

von „sticky Ends“ die Formation von 3’-5’-Phosphodiesterbindungen zwischen der 3’-

Hydroxylgruppe des einen, und dem 5’-Phosphat des anderen Restriktionsfragments. Vektor-

DNA und Insert-DNA wurden in einem 1:3 Verhältnis gemischt, 2 µl 10x T4 DNA

Ligationspuffer und 1 µl (~400 units) T4 DNA Ligase wurden hinzugesetzt. Die Mixtur

wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert.

27


4.1.5.3 Transformation von Escherichia coli (DH 5α)

Für die Transformation wurden kompetente Bakterien verwendet. Da native E. coli-Zellen

nicht in der Lage sind, Plasmide aus dem Medium aufzunehmen, wurden die Bakterien hohen

Konzentrationen von CaCl2 ausgesetzt, was die Zellwand für Fremd-DNA permeabel macht.

E. coli DH5α wurden verwendet, da sie versprechen, qualitativ hochwertige DNA zu liefern.

Die Zellen wurden bei -80 °C in Transformationspuffer A gelagert, und wurden dann für 30

Minuten auf Eis aufgetaut. 10 µl der oben genannten Ligationsmixtur wurden zu je 100 µl der

Zellen hinzugesetzt und für weitere 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Bakterien wurden dann

einer Hitzeschockbehandlung unterzogen, um ihrer Zellwände für Plasmide durchlässiger zu

machen. Es erfolgte dabei eine Erhitzung auf 42 °C für 2 Minuten. Jeweils 1 ml LB-Medium

wurde der Reaktionmixtur zugesetzt, und dann für 60 Minuten bei 37 °C unter ständiger

Bewegung inkubiert. Die Bakterien wurden auf Ampicillin-haltigen LB-Nähragarböden

ausgestrichen und für 14 Stunden bei 37 °C inkubiert.

4.1.5.4 Selektion von positiven Klonen

Die verwendeten Plasmide tragen ein Antibiotikumresistenzgen, welches für β-Laktamase

kodiert, ein Enzym das den β-Laktamring von Ampicillin oder anderen Penicillinderivaten

spaltet. Durch die Exposition gegenüber Ampicillin konnte gewährleistet werden, dass

ausschließlich plasmidtragende Bakterien überleben. Nach 14 Stunden Inkubation bei 36° C

konnten bereits einzelne Kolonien makroskopisch differenziert werden. Die Zellklone wurden

dann wie folgt angezüchtet.

4.1.5.5 Anzüchtung der Bakterienkultur Einzelne Kolonien wurden in 4 ml 100 µg/ml Ampicillin-haltigem LB-Medium inokuliert,

und unter ständiger Bewegung für 12–16 Stunden bei 37° C inkubiert. Es wurden jeweils 20

bis 50 Klone auf diese Weise parallel angezüchtet.

4.1.5.6 Überprüfung der Präsenz von Inserts

Mittels analytischem Restriktionsverdau und PCR wurde das Vorhandensein des gewünschten

Inserts überprüft. Für den analytischen Restriktionsverdau wurde die Plasmid-DNA zunächst

28


isoliert und daraufhin mit zwei Endonukleasen behandelt. Die Endonukleasen wurden so

gewählt, dass eine Schnittstelle im Vektor lag und die zweite im Insert. Auf diese Weise

konnte sowohl die Präsenz, als auch die Orientierung überprüft werden. Die resultierenden

Fragmente wurden durch Gelelektrophorese separiert.

Eine Methode, die mit geringerem Aufwand das Screenen einer großen Anzahl von Klonen

erlaubt, ist die PCR. Die Reaktion wurde wie folgt angetzt: 50µl PCR Puffer, 30 µl 1M MgCl,

5 µl 1. Primer, 5 µl 2. Primer, 40 µl 2,5 mMol dNTP, 5 µl Tac Polymerase, 365 µl ddH2O.

Bei 19 µl des Ansatzes wurde je 1 µl der Bakterienkultur als Matrize hinzugegeben. Die

Überprüfung der richtigen Orientierung wurde anschließend bei positiven Klonen durch

Restriktionsverdau durchgeführt.

4.1.6 Sequenzierung von DNA-Fragmenten

4.1.6.1 Die Dideoxy-Kettenterminationsmethode

Für die Sequenzierung der Plasmide wurden vier separate Polymerisationsreaktionen

durchgeführt, jede mit einer niedrigen Konzentration eines der vier ddNTPs in Ergänzung zu

höheren Konzentrationen von normalen Deoxynukleosidtriphosphaten (dNTPs). In jeder

Reaktion wird auf diese Weise das entsprechende ddNTP zufällig in den Positionen des

korrespondierenden dNTPs inkorporiert. Diese Additionen eines ddNTP terminiert den

Polymerisierungsprozess, da das Fehlen einer 3’ Hydroxylgruppe die Addition des nächsten

Nukleotids unterbindet. Die Mixtur der terminierten Fragmente jeder der vier Reaktionen

wurde simultan mittels Gelelektrophorese separiert und autoradiographisch ermittelt. Die

Sequenz der originalen DNA-Matritze wurde direkt aus dem resultierenden Autoradiogramm

abgelesen. Sämtliche DNA Sequenzierungen wurden durch TUFTS-Core Facility, Physiology

Department, TUFTS University, Boston MA durchgeführt.

4.1.6.2 Entwurf der Primer

Die Sequenzierung mittels Dideoxykettenterminationsmethode ist geeignet für DNA-

Moleküle bis zu einer Größenordnung von 500 bp. Entsprechend wurden Primer entworfen,

welche insbesondere die Sequenz der Schnittstellen zwischen Vektor und Insert, aber auch

von neu eingeführten Mutationen überspannten. Auf diese Weise konnte eine Verschiebung

29


des Leserahmens ausgeschlossen, bzw. die gewünschte Mutation verifiziert werden. Die

Bestimmung der gesamten Sequenz war meistens nicht notwendig, da spontane Mutationen

nur mit einer sehr geringen Wahrscheinlichkeit auftreten. Die Synthese der Oligonukleotide

wurde durch Gene link, Inc., Hawthorne, NY vorgenommen.

4.2 Expression der Zielproteine

4.2.1 Induktion durch IPTG Einzelne Kolonien wurden in 4 ml Ampicillin-haltigem LB Medium inokuliert. Die Bakterien

wurden für 12–16 Stunden bei 37 °C unter ständiger Bewegung inkubiert. Anschließend

wurden 100 μl der Zellsuspension in 8 ml frischem Ampicillin-haltigem LB-Medium

inokuliert und bis zu dem Erreichen einer optischen Dichte von 0.5 AU bei einer Wellenlänge

von 600 nm bei 37 °C unter ständiger Bewegung inkubiert. Ein Aliquot von 4 ml jeder Kultur

wurde mit IPTG in einer Konzentration von 1 mM versetzt. Über ein auf dem jeweiligen

Vektor kodiertes lac-Operon wurde so spezifisch die Expression des Zielproteins induziert.

Die induzierten Kulturen sowie Negativkontrollen wurden parallel für 4 Stunden bei 37° C

inkubiert.

4.2.2 Aufbereitung der bakteriellen Kulturen

Um die Degradation der Proteine zu reduzieren, wurden die folgenden Schritte bei 4° C

durchgeführt. Nach der Induktion der Expression mit IPTG wurden die Bakterien durch

Zentrifugation bei 12.000 x g für 1 Minute von dem Medium separiert. Der Überstand wurde

durch Aspiration entfernt, während das Pellet in 1 ml eiskaltem 50 mM Tris-HCl pH 7.4

resuspendiert wurde. Die resuspendierten Bakterien wurden erneut zentrifugiert, der

Überstand verworfen und das bakterielle Pellet in 50 µl ddH2O resuspendiert. 30 µl 4 x SDS

Gel loading Puffer wurden hinzugesetzt, welcher eine Lyse der Bakterien bewirkte. Die

unlösliche und die lösliche Fraktion wurden in einem weiteren Zentrifugationsschritt bei

12.000 g für 5 Minuten separiert. Der Überstand wurde in ein frisches Eppendorftube

überführt und bis zur Weiterbearbeitung bei –20° C gelagert. Für die Chromatographie mittels

Elektrophorese, wurden die Proben vor dem Ladevorgang für 10 Minuten bei 95°C

denaturiert.

30


4.2.3 Proteinanalyse

4.2.3.1 SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese

Für die elektrophoretische Auftrennung der löslichen Proteinbestandteile von 15-60 kD wurde

ein 12%iges Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel generiert. Durch die Polymerisation von

löslichen Acrylamidmonomeren in Polyacrylamidketten und simultaner Kreuzvernetzung der

Ketten, wurden die zwischen zwei Glasplatten gegossenen Gele in eine semisolide Matrix

überführt. Das vollständig polymerisierte Gel wurde dann in einen BioRad®

Elektrophoreseapparat überführt und die Konduktionskammern mit Tris-Glyzin-Puffer

geflutet.

Die präformierten Taschen wurden mit je 60 µl der aufbereiteten Proteinproben sowie

vorgefärbten Standartmarkern geladen. Eine Separation erfolgte bei 180 mV und 500 mA für

etwa eine Stunde bei Raumtemperatur.

4.2.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

Der Bicinchoninic Acid (BCA) Assay ist eine quantitative Methode um den Proteingehalt in

einer Lösung zu bestimmen. Dabei werden 100 µl der Probe mit 2 ml eines BCA haltigen

Reagenz für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die A562 im

Spektrophotometer bestimmt und mit einer Standartkurve verglichen. Die Sensitivitätsrate

reicht von 10-1200 µg/ml.

4.2.3.3 Proteinfärbung mit Coomassieblau

Die mittels SDS-PAGE separierten Polypeptide wurden simultan für 30 Minuten unter

ständiger Bewegung bei Raumtemperatur mit Methanol-Eisessig fixiert und mit Coomassie

Brilliantblau R250, einem Triphenylmethanfarbstoff gefärbt. Die Sensitivität reicht von 0,1-1

µg pro Proteinbande. Die Auswaschung der überschüssigen Farbe erfolgte durch wiederholte

Behandlungen mit Methanol-Wasserlösungen in absteigender Konzentration über 16-48

Stunden.

31


4.2.3.4 Silberfärbung der Proteine

Die Silberfärbung ist im Vergleich zu der Färbung mit der Coomassie Brilliant Blue-Färbung

5-10 x sensitiver. Es werden Proteinmengen von 2-10 ng pro Bande (Giulian, 1983) sichtbar

gemacht. Das SDS-Polyacrylamidgel wurde über eine Stunde in 50 % Methanol/ 10%

Essigsäure fixiert. Nach einer Spülung mit Aqua dest wurde das Gel in einer

Silbernitratlösung für 15 Minuten. unter kontinuierlicher Bewegung gefärbt. Nach einem

weiterem Waschschritt mit Aqua dest erfolgte die Entwicklung in einer formaldehyd-haltigen

Lösung für etwa 10 Minuten.

4.2.3.5 Immunoblotting

Für die Immunoblotanalyse (Westernblot) wurde die lösliche Fraktion der Proteinproben

zunächst mittels SDS-PAGE separiert. Es folgte ein Transfer der Proteinbanden auf eine

Nitrozellulosemembran mittels einer semi-trockenen Elektrophoreseprozedur bei 26 mA.

Die Membran wurde mit 5 % Milch-TBST für 5 Stunden unter ständiger Bewegung bei

Raumtemperatur geblockt. Eine Inkubation mit dem primären Antikörper, gelöst in 5 %

Milch-H2O, pH 7,4 in einem Mischungsverhältnis von 1:1000, erfolgte bei 4° C über Nacht.

Die Membran wurde mit TBST gewaschen, drei Mal für jeweils 20 Minuten und dann mit

dem enzymtragenden Sekundärantikörper für weitere vier Stunden inkubiert. Anschließend

wurde die Membran erneut mit TBST gewaschen. Ein luminiszierendes Substrat einer

Meerrettichperoxidase wurde für 2 Minuten auf die Membran gegeben und dann sofort ein

Kodak X-OMAT Film für 3-60 Sekunden belichtet.

4.2.3.6 Proteinanalyse mittels Massenspektrometrie

Die Methode der Massenspektrometrie eignet sich für die Identifizierung der Proteine über

deren Peptidmassenprofil. Bei der Time-of-Flight Massenspektrometrie werden die gelösten

Proteine und Peptide mit einer organischen Säure versetzt. Anschließend erfolgt die

Auftragung und Trocknung auf einer Metallfläche. Mittels Laser werden die Proteine ionisiert

und können in Abhängigkeit von ihrer Fluggeschwindigkeit detektiert werden. Die

Fluggeschwindigkeit ist umgekehrt proportional zu der Masse und direkt proportional zu der

Ladung der Proteine. Auf diese Weise können Proteine in einer Konzentration > 1 femtomol

32


mit einer Fehlerquote von < 0,1 % detektiert werden. Sämtliche massenpektrometrischen

Untersuchungen wurden im Department of Cell Biology, Harvard Medical School

durchgeführt.

4.3 Proteinisolierung mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Affinitätschromatographie

Tag PKR-Fragment

Tag

Tag

Tag

PKR-Fragment

PKR-Fragment

PKR-Fragment

1

2

3

4

Matrix

Matrix

Abb. 3.1: Transiente Bindung des Affinitätstags an die Matrix. 2: Elution mit kompetitivem Substrat. 3:

Enzymatische Spaltung des Fusionsproteins. 4: Separation der Fusionspartner.

4.3.1 Präparation der bakteriellen Kulturen

Von jeder E. coli BL21DE3 Kolonie wurde jeweils 1 Liter Zellkultur angesetzt. Die

spezifische Expression des Zielproteins wurde mit dem Zusatz von IPTG erzielt (siehe oben).

Die Separation von Medium und Bakterien erfolgte mittels Zentrifugation mit 4000 x g für 20

Minuten bei 4° C. Die bakteriellen Pellets wurden zunächst bei -20° C gelagert. Zur weiteren

Verarbeitung wurden die Pellets in dem entsprechenden Lyse-Puffer resuspendiert und mit

den Proteaseinhibitoren PMSF, Aprotenin und Leupeptin in einer Konzentration von jeweils

1mM versetzt.

Für die mechanische Zelllyse wurde ein spezieller Hochdruckapparat verwendet. Dabei

werden die Bakterien mit Hochdruck durch eine Edelstahlkapillare gepresst und durch den

Aufprall auf eine kalte Keramikplatte zum Bersten gebracht. Die lysierten Bakterien wurden

33


anschließend in kalten Zentrifugenröhrchen aufgefangen und mit 9000 x g für 30 min bei 4° C

zentrifugiert. Der Überstand wurde direkt bei 4° C weiterverarbeitet, um eine Degradation

weitestgehend zu verhindern.

4.3.2. Affinitätschromatographie MBP-PKR mittels HPLC

Für die Isolierung von PKR-MBP Fusionsproteinen wurde eine amylosehaltige

Affinitätsmatrix verwendet. Um eine Degradation der Amylose durch bakterielle Amylasen

zu verhindern, wurde durch den Zusatz von 2 g Glukose pro Liter LB-Medium eine

Repression der bakteriellen Maltosegene erziehlt. Dem Säulenpuffer M wurde EDTA

zugesetzt, um Proteasen, welche Ca2+ als Cofaktor benötigen zu inaktivieren. Der Zusatz von

DTT sollte ein Formation von Disulfidbrücken unterbinden. Die Bakteriolyse wurde wie oben

beschrieben durchgeführt, nachdem das bakterielle Pellet in 20 ml Säulenpuffer M

resuspensiert wurde. Anschließend wurde die lösliche Proteinfraktion wie oben beschrieben

gewonnen.

Die lösliche Fraktion der E. coli-Extrakte wurde im Verhältnis 1:5 mit Säulenpuffer M

verdünnt. Eine 2,5 x 10 cm Glassäule wurde mit 15 ml der Amylosematrix befüllt und mit

Säulenpuffer getränkt. Mit diesem Volumen kann theoretisch eine Ausbeute von bis zu 45 mg

Fusionsprotein pro Liter bakterieller Kultur zu erzielt werden. Die Säule wurde mit 100 ml

des verdünnten Zellextraktes bei einer Flußrate 0.5 ml/min beladen. Anschließend wurde der

ungebundene Anteil mit Säulenpuffer ausgewaschen. Eluiert wurde dann mit 10 mM Maltose

und in 10-20 Fraktionen á 3 ml aufgefangen. Simultan wurde die Proteinkonzentration bei

einer Wellenlänge von 280 nm ermittelt. Die Elutionsfraktionen wurden gepoolt und mittels

Spinprep Konzentrator (30K) auf etwa 1 mg/ml konzentriert.

4.3.2.1 Spaltung des Fusionsproteins MBP-PKR

40 µl Fusionsprotein (1 µg/µl) wurde mit 2 µl Faktor Xa versetzt. Um die besten Konditionen

zu ermitteln, wurden bei jeweils 5 µl Proben Inkubationszeiten von 2, 4, 6 und 24 Stunden bei

Raumtemperatur und 4° C durchgeführt. 5 µl 2 x SDS-PAGE Sample Puffer wurden zu jeder

5 µl Probe hinzugesetzt. Die Proben wurden für 5 Minuten auf 95 °C erhitzt und mittels SDS-

PAGE aufgetrennt. Die Bande mit dem erwarteten Molekulargewicht wurde mittels

Massenspektrometrie analysiert.

34


4.3.2.2 Trennung von PKR-Fragment und MBP nach der Spaltung Für die Trennung der zwei Fusionspartner erfolgte eine weitere Affinitätschromatographie. Es

wurde das Prinzip einer Ionenaustausch-Chromatographie angewandt. Zunächst wurden die

mit Faktor Xa behandelten Fragmente gegen 20 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl, pH 8,0

dialysiert, um die Protease und andere Verunreinigungen zu entfernen. Die Dialyse erfolgte

dreimal für jeweils zwei Stunden bei 4 °C. Eine 1 x 10 cm Glassäule wurde mit 6 ml der

DEAE-Sepharose befüllt und 3 Mal mit 20 ml 10 mM Tris -HCl, 25 mM NaCl, pH 8,0

gespült. Das gespaltene Fusionsprotein wurde mit einer Flussrate von 0,5 ml/min geladen.

Schrittweise wurde mit jeweils 25 ml eines Gradienten von 25 - 500 mM NaCl 20 mM Tris-

HCl, pH 8,0 eluiert. Das Eluat wurde in 1 ml Fraktionen aufgefangen während simultan die

Absorbtion (AU) bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen wurde. Bei einer NaCl-

Konzentration von 100-150 mM sowie ca 400 mM wurde jeweils ein scharfer Peak

nachgewiesen. Die entsprechenden Fraktionen wurden nach Präzipitation mit Aceton mittels

SDS- PAGE analysiert. 4.3.3 Affinitätschromatographie CBP-PKR

Die Aufreinigung der CBP-PKR-Fusionsproteine erfolgte mittels IMPACT-System (Intein

Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag). IMPACT ist ein

Proteinaufreinigungssystem, welches die induzierbare Selbstspaltungsaktivität eines

Proteinsplicingelements, Intein, für die Trennung des Zielproteins von dem Affinitätspeptid

nutzt. Auf diese Weise kann die Spaltung mittels Protease sowie ein zusätzlicher

Aufreinigungsschritt vermieden werden. Die hohe Affinität der Chitin-bindende Domäne

(CBD) zu Chitinmolekülen erlaubt eine effiziente Isolierung des Fusionsprotein aus dem

Zellextrakt. 20 ml der Chitinbeads wurden bei 4° C mit 200 ml Säulenpuffer C getränkt. Die

Affinitätssäule wurde mit löslichem Zellextrakt mit einer Flussrate von 1 ml/min beladen. Es

folgte ein Waschschritt mit 200 ml 1 M NaCl Säulenpuffer C mit einer Flussrate von 1

ml/min. Die hohe Salzkonzentration kann die unspezifische Bindung von Proteinen

reduzieren.

4.3.3.1 Induktion der Spaltung

Das Zielprotein wird von der Chitinsäule freigegeben, wenn der CBP- Inteinanhang sich einer

Selbstspaltung unterzieht. Induziert wurde dieser mit einer schnellen Flutung der Säule mit 60

35


ml Spaltungspuffer C pH 7,5, welcher 50 mM DTT enthält. Die Inkubation mit dem

Spaltungspuffer C erfolgte bei 16 °C über 16-40 Stunden.

4.3.3.2 Die Elution des Zielproteins

Die Elution des Zielproteins erfolgte mittels Säulenpuffers mit einer Flussrate von 1 ml/min.

Während der Selektion der Fraktionen á 2,5 ml wurden die Konzentration simultan UV-

spektrometrisch bei einer Wellenlänge von 280 nm bestimmt. Eine Analyse der Proben

erfolgte zunächst mittels SDS-PAGE. Bei sehr niedrigen Proteinkonzentrationen wurden

jeweils 0,2 ml der Probe mit 0,6 ml Aceton versetzt und für die Präzipitation für 30 min. auf –

20° C gebracht. Um die Spaltungseffizienz zu quantifizieren, wurde die Affinitätsmatrix nach

der Prozedur ebenfalls mittels SDS-PAGE analysiert.

4.3.4 Isolierung von PKR-PG Fusionsproteinen

Das 6-Histidin-Affinitätspeptid des Protein G-Fusionsprotein besitzt eine hohe Affinität

gegenüber Metallchelatoren wie Nickel-Nitrilotriacetat. 20 ml Ni-Nitrilotriacetic acid (NTA)

Superflow Affinitätsmatrix wurden mit jeweils 20 ml mit Säulenpuffer G 10 mM Imidazol,

pH 8,0 getränkt und anschließend 1,5 x 10 cm Glassäulen beschickt. Alle folgenden Schritte

wurden bei 4° C durchgeführt. Die Säule wurde mit 200 ml Säulenpuffer bei einer Flussrate

von 2 ml/min äquilibriert. Die lösliche Fraktion des Zelllysates wurde mit einer Flussrate von

0,25 ml/min appliziert. Anschließend wurde mit 200-400 ml Säulenpuffer G 10 mM Imidazol,

pH 8,0 gewaschen bis UV-spektrometrisch bei einer Wellenlänge von 280 nm eine stabile

Nulllinie erzielt wurde.

4.3.4.1 Elution von PKR-PG Fusionsproteinen

Die Elution der PKR-PG Fusionsproteine erfolgte mit Elutionspuffer G 20 mM- 250 mM

Imidazol, pH 8,0 bei 4° C mittels einer schrittweise gesteigerten Gradientenelution über vier

Stunden. Die Kollektion in 2,5 ml Fraktionen wurde bei simultaner UV-spektrometrischer

Bestimmung der Konzentration bei einer Wellenlänge von 280 nm durchgeführt. Eine weitere

Aufreinigung wurde mittels Dialyse über 30 K Membranen für 24 Stunden bei 4° C

durchgeführt. Auf diese Weise konnte eine Eliminierung des Imidazols und der entstandenen

Degradationsprodukte erzielt werden. Die Analyse der Proben erfolgte zunächst mittels SDS-

36


PAGE und Westernblot. Anschließend wurde die Reinheit mittels Massenspektrometrie

verifiziert.

4.4 Nukleare Magnetresonanzspektroskopie

Alle NMR experimente wurden bei 25 °C mittels Bruker Advance und Varian Inova 600

MHz Instrumenten durchgeführt. Für die 15N-markierte Proteinlösung in 93 % H2O, 7% 2H2O

Puffer wurde die 3D 15N-nucleare Overhauser enhancement Spektroskopie- heteronukleare

singuläre Quantum Koherenz (3D 15N-NOESY-HSQC) angewandt. NMR-Titrationen wurden

mit 100-200 µM Proben 15N-markiertem Proteins unter gradueller Addition einer

konzentrierten Stocklösung von unmarkiertem Bindungspartner durchgeführt. Sämtliche

NMR-Studien sowie die Spektrumanalyse wurde von der kollaborierenden Arbeitsgruppe

Wagner et al. prozessiert.

37

Mirjam Debus ERGEBNISSE

5 ERGEBNISSE Die Serin-Threoninkinase PKR ist maßgeblich an zellulären Prozessen wie

Zellzyklusregulation und Apoptose beteiligt. Aufgrund ihrer antiproliferativen Eigenschaften

stellt sie ein potenzielles Zielmolekül für antineoplastische Substanzen dar. Obwohl die

Relevanz der PKR bezüglich ihrer tumorsuppressiven Wirkung vielfach bewiesen wurde, ist

es bisher nicht gelungen die Kinase für strukturanalytische Zwecke zu isolieren. Die stabile

Expression sowie die Isolation von PKR haben in der Vergangenheit mannigfaltige Probleme

aufgezeigt. Bis dato konnte eine für die nukleäre Magnetresonanzspektroskopie (NMR)

geeignete Isolierung des Proteins nicht gelingen, da es zum einen zu groß, zum anderen zu

wenig löslich für die Isolierung und NMR-Analytik ist. Daneben erschwerte eine hohe

Toxizität gegenüber Bakterien die Überexpression in prokaryoten Systemen. Ziel dieses

Projektes war es daher, geeignete Expressionskonstrukte sowie stabile

Isolierungsbedingungen für verschiedene Fragmente von PKR zu generieren. Katalytisch

inaktive Mutanten unterschiedlicher Domänen sollten an geeignete Fusionsproteine gekoppelt

in E.coli BL21DE3 exprimiert und schließlich isoliert werden. Da die Struktur der Amino-

terminalen regulativen Domäne weitgehend identisch mit bekannten RNA-Bindungsdomänen

ist, war bei dem vorliegenden Projekt die katalytische Domäne sowie die regulativen Domäne

3 von zentralem Interesse. Für die Isolierung mittels High Performance Liquid

Chromatographie (HPLC) mussten für jedes der Fusionsproteine individuelle Bedingungen

etabliert werden, welche eine hohe Reinheit sowie Stabilität der Proteine gewährleisten.

Anschließend erfolgte die für die NMR-spektroskopische Analytik erforderliche

Inkorporation mit radioaktiven Isotopen.

5.1. In bakterielle Vektoren subklonierte PKR DNA-Fragmente Es wurden Konstrukte generiert, die sowohl die individuellen Domänen, als auch das gesamte

Carboxy-terminale Segment enthalten (Abb. 5.1). Die Länge der Fragmente wurde variiert,

um die Konditionen der besten Expression zu finden. Anhand von Homologiemodellen

wurden Schnittsequenzen ausgewählt, die sich in nicht-konservierten Regionen finden.

38


1 100 200 300 400 500 551

Δ197

Δ227

Δ262

Δ282

167-248

PKRRD1 RD2 RD3 I VIV VI VII XI

Abb. 5.1: Die Struktur von PKR und ihre C-terminalen Deletionsfragmente mit der regulatorischen Domäne 3

und der Kinasedomäne Δ179, Δ227, Δ262 und Δ282. 5.1.1 Konstrukte mit N-terminaler Polyhistidinsequenz Die cDNA der PKR-Fragmente wurde aus dem Plasmid pBISA PKR K296L mittels

Endonukleasen herausgeschnitten und in geeignete Vektorsysteme subkloniert. Der Vektor

pET15b enthält eine aminoterminale Histidinsequenz, welche dem indirekten

Proteinnachweis und der Isolierung dient. Außerdem besitzt der Vektor einen T7-Promoter

mit induzierbarem lac-Operon sowie ein Ampicillin-Resistenzgen (Abb. 5.2).

T7 Prom oter

pET-15b 5708bp

PKR lacIH is-Tag Am pr

Abb. 5.2: Vektorschema: pET15b mit dem subklonierten PKR-Fragment. T7 Promoter. His-Tag: Histidin-Affinitätsanhang. LacI: Lac-Operon. Ampr: Ampicillin-Resistenzgen.

39


PKR Δ262 u. Δ196

Nde I

BamH I

pET-15b(5708 bp)

lacI (866-1945)

ori(

3882

mcs

Ap (46

43-5

500)

Mlu I (1216)

Bcl I (1230)

BstE II (1379)

Apa I (1427)

BssH II (1627)

Hpa I (1722)

PshA (2061)

Bpu10 I(2926)

BspM I (2399)Msc I (2792)

Nru I (2319)

Eag I (2284)

Bsm I (1216)

Tth111 I (3565)

BsaA (3572)

Acc I (3590)

Bst1107 I (3591)

Bsa I (4774)

Alw I (4236)

BspLU11 I (3820)

Sap I (3704)

Xho I (324)

BamH I (319)

EcoRI I (5706)

Hind III (29)

Cla I (24)

Ssp I (1216)

Aat II (1216)

Sca I (1216) Nde I (331)

Ahd I (4713)

Pvlu I (1216)

Pst I (1216)

Bpu1102 I (276)

EcoN I (/51)Sph I (691)SgrA I (535)

Bgl II (494)Xba I (428)

Nco I (389)

Abb. 5.3: Vektorkarte: pET15b (5708 bp). Die Inserts (750-900 bp) wurden an den Schnittstellen von BamHI und NdeI subkloniert. LacI: Lac-Operon. Mcs: Multiple cloning site. Ap: Ampicillin-Resistenzgen. Die DNA Fragmente Δ196 wt und Δ262 wt wurden an den Schnittstellen BamHI und NdeI

der Multiplen Cloning Site des Vectors pET15b subkloniert (Abb. 5.3). Die Amplifikation der

DNA- Fragmente PKR wt Δ196 und PKR wt Δ262 erfolgte mittels PCR (Abb. 5.4). Vektor

und Insert wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und NdeI behandelt und isoliert.

0 ,9 K b0 ,7 5 K b

1 2 3

5 ,7 5 K b

Abb. 5.4: DNA Gel: Vektor pET15b und Insert: PKR wt PCR-Produkte. Spur 1: PKR wt Δ196 (900 bp). Spur 2: pET15b (5708 bp). Spur 3: PKR wt Δ262 (750 bp).

40


DH5α kompetente E. coli wurden transformiert und mittels Antibiotikum selektioniert. Die

auf Ampicillin-haltigem Nährboden gewachsenen Kolonien wurden mittels PCR auf das

Vorhandensein der entsprechenden Inserts überprüft. Es fanden sich 9 positive Klone von

pET15b PKR wt Δ196, sowie 3 positive Klone von pET15b PKR wt Δ262 (Abb. 5.5).

pET15B PKRwtΔ194

pET15B PKRwt Δ262

-

0,9 Kb

0,75 Kb

1 5

5

10

1

15 20

10 15 20

Abb. 5.5: PCR-Screening der transformierten E.coli DH5α auf Vorhandensein von Insert PKR wt Δ196 (900 bp) und PKR wt Δ262 (750 bp). PKR wt Δ196 wt positiv: Spur 1, 3, 4, 6, 7, 8, 16, 18, 20. PKR wt Δ262 wt positiv: Spur 2, 3, 8. Nach Auftrennung der Proteine mittels SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese zeigte sich

jeweils eine induzierbare Bande bei 58 und 41 kD. Im Westernblot mit einem oligoklonalen

PKR Antikörper sowie einem Histidinantikörper waren die Banden ebenfalls nachweisbar

(Abb. 5.6). Das Expressionssystem erwies sich aber als nicht stabil und inkonstant. Daher

wurde das Wachstums- und Expressionsverhalten der Bakterien unter unterschiedlichen

Konditionen mit variierenden Inkubationszeiten überprüft. Dabei konnte festgestellt werden,

dass die Bakterien in Abhängigkeit von der Inkubationszeit die Fähigkeit, das Zielprotein zu

exprimieren, verlieren. Die Expression der individuellen Domäne 3 war nicht erfolgreich.

41


+

41 kD

58 kD

+-

1 2 3 4 5 6 7 8

A B--- ++

Abb. 5.6: Rekombinant in E.coli exprimierte PKRwt Δ196 und Δ262, IPTG induziert und nicht induziert. SDS-Page, Coomassiefärbung und Westernblot. A Spur 1: nicht induziert PKRwt Δ196 B Spur 5: nicht induziert PKRwt Δ262

Spur 2: induziert PKRwt Δ196 Spur 6: induziert PKRwt Δ262 Spur 3: nicht induziert (PKR-Antikörper) Spur 7: nicht induziert (PKR-Antikörper) Spur 4: induziert (PKR-Antikörper) Spur 8: induziert (PKR-Antikörper)

Die katalytisch aktive PKRwt erwies sich als toxisch gegenüber E.coli. Die transformierten

Bakterien zeigten nach der Induktion mit IPTG ein charakteristisches Zeit- und Temperatur

abhängiges Wachstums- und Expressionsverhalten. Während der ersten acht Stunden fand nur

ein sehr langsames Wachstum statt. Das subklonierte Fragment wurde in dieser Phase

exprimiert. Bei längeren Inkubationszeiten kam es dann zu einer starken Beschleunigung des

bakteriellen Wachstums bei einem gleichzeitigen Verlust der induzierbaren Expression des

subklonierten Fragments. Daraus war zu schließen, dass eine Toxizität von PKRwt gegenüber

E.coli zu einem verminderten Selektionsdruck gegenüber den Bakterien ohne

Ampicillinresistenzgen führt. Nach etwa 8-10 Stunden wurde in ausreichender Konzentration

β-Laktamase in das Medium sezerniert und so den Bakterien ohne Antibiotikumresistenz ein

ungehemmtes Wachstum ermöglicht (Abb. 5.7).

42


h

Plasmidverlust

Wachstum

PKR Expression

2 16141210864

Abb. 5.7: Wachstumskurve von E.coli DH5α und Expression der Zielproteine über einen Zeitraum von 16 Stunden: Höhepunkt der PKR-Expression nach 6-8 Stunden, nach 16 Stunden ist keine PKR zu detektieren. 5.1.2 Mutagenese von PKR K296P zu PKR K296R Um eine katalytisch inaktive dominant-negative Mutante von PKR zu generieren und

gleichzeitig wesentliche Abweichungen in der Tertiärstruktur zu vermeiden, wurde das Lysin

in Position 296 durch Arginin ersetzt. Als Matrize diente bei der seitendirigierten Mutagenese

die dominant-negative PKR K296P (Abb. 5.8).

K296P K296R

3‘GTGGCTAGCGGGTACCCAGCTCGAATCTGTAGCCAGTTCA 5‘CACCGATCGCCCATGGCTCGAGCTTA

CCA CGA

Abb. 5.8: Seitendirigierte Mutagenese: Ersatz von Prolin durch Arginin in Position 296, mit Änderung des

Kodons von CCA zu CGA. Oben: Primer. Unten: Matritze.

43


Mittels geeigneter Primer, welche die zu mutierende Sequenz in Position 296 überspannten

und die Kodierung von CCA zu CAG änderten, wurde ein PCR-Fragment generiert. (Abb. 5.9

A). Das Fragment wurde in den Ursprungsvektor PBISA K296P GFP an den

Restriktionsstellen NheI und MluI subkloniert (Abb. 5.9 B).Verifiziert wurde die erfolgreiche

Ligation durch ein Screening mittels PCR.

2 0 0 b p

3 0 0 b p

6 K b

A B

Abb. 5.9: DNA-Gele: seitendirigierte Mutagenese. A: Spur 1: PCR-Mutationsreaktionsprodukt (200 bp), Spur 2: Negativkontrolle. B: Vektor:pBISA K296 GFP: Restriktionsverdau mit MluI/NheI (6000 bp). Mittels PCR wurden die Kolonien auf das Vorhandensein des entsprechenden DNA

Fragments überprüft. Da die PCR jedoch lediglich über die Präsenz des Inserts, nicht aber

über die Orientierung im Vektor Auskunft gibt, wurde bei den positiven Klonen ein

Restriktionsverdau mit den Endonukleasen XhoI und MluI vorgenommen. Von 14 Klonen

fanden sich drei in korrekter Richtung (Abb. 5.10).

1 2 3

300 bp

Abb. 5.10: DNA-Gel: Restriktionsverdau mit XhoI/ MluI zur Bestimmung der Orientierung. Korrekte Orientierung: 1, 2, 3: Insert 300 bp.

44


Die Sequenzierung mittels dideoxy-Kettenterminationsmethode erlaubt eine exakte

Überprüfung der Sequenz. Hierbei wurden die Primer 5’196 NdeI und 3’ Hind III verwendet.

Die Daten wurden mit Hilfe von Blast Search, einer elektronischen Datensammlung des

National Institute of Health (NIH) interpretiert. Sie ermöglicht den Datenabgleich der

selektierten Nukleotidsequenz mit anderen homologen Sequenzen in der Datensammlung.

Mutationen innerhalb des sequenzierten Fragmentes werden angezeigt. Es sind auf diese

Weise allerdings keine Aussagen über den Leserahmen möglich. Mit Hilfe der Software

Laser Gene, welche die Nukleotidsequenz in drei mögliche Leserahmen übersetzt, konnte die

exakte Rekonstruktion von Leserahmen, Mutation und Aminosäurensequenz erfolgen (Abb.

5.11).

Query: SEGDFSADTSEIXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXQRKAKRSLAPRFDLPDMKETKYTVDKRF SEGDFSADTSEI QRKAKRSLAPRFDLPDMKETKYTVDKRF Sbjct: SEGDFSADTSEINSNSDSLNSSSLLMNGLRNNQRKAKRSLAPRFDLPDMKETKYTVDKRF 263 Query: GMDFKEIELIGSGGFGQVFKAKHRIDGKTYVIRRVKYNNEKAEREVKALAKLDHVNIVHY GMDFKEIELIGSGGFGQVFKAKHRIDGKTYVI+RVKYNNEKAEREVKALAKLDHVNIVHY Sbjct: GMDFKEIELIGSGGFGQVFKAKHRIDGKTYVIKRVKYNNEKAEREVKALAKLDHVNIVHY 323 Query: NGCWDGFDYDPETSDDSLESSDYDPENSKNSSRSKTKCLFIQMEFCDKGTLEQWIEKRRG NGCWDGFDYDPETSDDSLESSDYDPENSKNSSRSKTKCLFIQMEFCDKGTLEQWIEKRRG Sbjct: NGCWDGFDYDPETSDDSLESSDYDPENSKNSSRSKTKCLFIQMEFCDKGTLEQWIEKRRG 383 Query: EKLDKVLALELFEQITKGVDYIHSKKLIHRDLKPSNIFLVDTKQVKIGDFGLVTSLK EKLDKVLALELFEQITKGVDYIHSKKLIHRDLKPSNIFLVDTKQVKIGDFGLVTSLK Sbjct: EKLDKVLALELFEQITKGVDYIHSKKLIHRDLKPSNIFLVDTKQVKIGDFGLVTSLK 440 Abb. 5.11: Aminosäurensequenz der Mutationsregion: PKR K296R. 5.1.3. Exprimierte His-PKR K296R Die Fragmente der dominant negativen Mutanten PKR K296R, subkloniert in das

Vektorsystem pET15b ließen sich konstant und induzierbar exprimieren. Das

Löslichkeitsverhalten war allerdings sehr unbefriedigend. Die Fragmente fanden sich so gut

wie ausschließlich in der unlöslichen Fraktion. (Abb. 5.12).

41 kD

4321

Abb. 5.12: His-PKRK296R. SDS-Page, Coomassiefärbung. Spur 1: Zelllysat. Spur 2: Lösliche Fraktion. Spur 3:

Zelllysat nicht induziert. Spur 4: Elutionsfraktion.

45

Mirjam Debus ERGEBNISSE 5.2 Generierte Fusionsproteine 5.2.1 Klonierte Fusionsgene Eine gute Löslichkeit ist für die Isolierung von Proteinen entscheidend. Um diese zu erhöhen,

wurden verschiedene Fusionsproteine generiert. Fusionen wurden gebildet mit einem

Maltosebindungsprotein (MBP), einem Chitinbindungsprotein (CBP) und einem speziell für

diese Zwecke entwickelten Peptid, Protein G (PG) mit N-terminaler Polyhistidinsequenz. Die

Fragmente PKR K296R Δ179, Δ196, Δ227, Δ262 und Δ282 wurden in geeignete bakterielle

Vektorsysteme subkloniert. Als Vektoren wurden verwendet: pTYB12, pMAL –p2X und

pGEV2. Alle Vektoren weisen ein T7-Promoter/ Lac Operator gesteuertes System auf, um

hohe Expressionslevel sowie eine kontrollierte Expression zu erreichen. Außerdem tragen sie

ein Ampicillinresistenzgen, um eine Selektion zu erlauben (Abb.5.13-15).

PKRMBP

Intein

AmprpMal-c2X

6648 bp

PKR

PKR

pTYB12

7414 bpCBD

pGEV2

6382 bpT7 promoter PGlacI Ampr

T7 promoter AmprlacI

lacI

His

T7 promoter

Abb. 5.13: Vektorschema der Fusionsgene mit dem jeweiligen subklonierten PKR-Fragment: pMal-c2X (6648 bp), pTYB12 (7414 bp), pGEV2 (6382 bp). T7 Promoter. His-Tag: Histidin-Affinitätsanhang. MBP: Maltosebindendes Protein. CBD: Chitinbindende Domäne. LacI: Lac-Operon. Ampr: Ampicillin-Resistenzgen.

46


PKR Δ262 u. Δ196Hind III

BamH I

pMAL-c2X (6648 bp )

mcs

Am

pla

cI

lacZ

pBR322 ori

M13 ori

mal

E

Xmn I

EcoR I

BamH IXba I

Sal I

Pst I

Hind III

malE... ATC GAG GGA AGG ATT TCA GAA TTC GGA TCC TCT AGA GTC GAC CTG CAG GCA AGC TTG... lacΖ

pMAL-c2X Polylinker:

Abb. 5.14: Vektorkarten: pMal-c2X (6648 bp). Die Inserts (750-900 bp) wurden an den Schnittstellen von BamHI und HindIII subkloniert. LacI: Lac-Operon. malE: Maltosebindungsgen. Mcs: Multiple cloning site. Amp: Ampicillin-Resistenzgen.

47


PKR Δ262 u. Δ196

Nde I

Xho I

pTY-B12(7414 bp)

mcs

Bsp E I (6703)

Blp I (6625)

Mfe I (5851)

Sac II( 6390)

Bst B I (6327)

Bsr E II ( 3981)

Kpn I (4987)

Sgr AI (4780)

Apa I (3893)

Bss H II (3689)

Bst Z17 I (2480)

Pci I (2310)

Dra III (1319)

Psi I 1194

Swa I 1096

Nru ISpe I

Nde I

Sal I

Nat IEcoR ISma I

PspCM I (3898)

Xho I

PanI I ( 6380)

Stu I ( 6355)

Nco I ( 5958)

Msc I ( 5955)

Nhe I ( 5794)

Acc65 I ( 4987)

Bae I ( 4980)

Xba I ( 4888)

Sph I (4629)

EcoN I (4564)

Mlu I (4100)

Abb. 5.15: Vektorkarte: pTYB12 (7414 bp). Die Inserts (750-900 bp) wurden an den Schnittstellen von XhoI und NdeI subkloniert. Der Vektor enthält Sequenzen für ein Lac-Operon, ein Chitinbindungsprotein, ein Inteintag mit Selbstspaltungsaktivität, eine Multiple Cloning Site sowie ein Ampicillin-Resistenzgen. Die Fragmente mit passendem Linker wurden mittels PCR amplifiziert (Abb. 5.17). Die passenden Primer wurden entsprechend entworfen (Abb .5.16).

5’Δ196-NdeI: CGGCAGCCATATGAGCACACTCGCTTCTGAA

5’Δ262-NdeI: CGGCAGCCATATGAGG TTTGGCATGGATTT

5’PKR Δ179- BamHI: CGCGGATCCGGTTCTTTTGCTACTACGTGT

5’PKR Δ262- BamHI: CGCGGATCCAGGTTTGGCATGGATTTTAAAGAA

3’gev2 XhoI: CGGCTCGAGACATGTGTGTCGTTCATT

3’pTYB12 XhoI: CGGCTCGAGCTAACATGTGTGTCGTTCATT

Abb. 5.16: Primer der PKR-Fragmente.

48


1 2 3 4 5 6

7 5 0 b p

9 0 0 b p

Abb. 5.17: PCR-Produkte der Fragmente K296R Δ 179, Δ 196, Δ 262. DNA-Gel. Spur 1: K296R Δ 179 (Primer: 5’PKR 179 BamHI, 3’gev XhoI) Spur 2: K296R Δ 262 (Primer :5’PKR 262 BamHI, 3’gev XhoI) Spur 3: K296R Δ 179 (Primer: 5’PKR 179 BamHI, 3’HindIII) Spur 4: K296R Δ 262 (Primer: 5’PKR 262 BamHI, 3’HindIII) Spur 5: K296R Δ 196 (Primer: 5'196 NdeI, 3’pTYB12 XhoI) Spur 6: K296R Δ 262 (Primer: 5'262 NdeI, 3’pTYB12 XhoI)

Die Vektoren wurden nach der Amplifikation in E.coli isoliert und mit den entsprechenden

Restriktionsendonukleasen versetzt (Abb. 5.18).

1 2 3

7414 bp6648 bp6382 bp

Abb. 5.18: DNA-Gel: Vektoren nach Restriktionsverdau Spur 1: pGEV2 6382 bp (BamHI/XhoI), Spur 2: pMAL 6648 bp (BamHI/HindIII), Spur 3: pTYB12 7414 bp (NdeI/XhoI).

Einzelne Klone der transformierten Bakterien wurden mittels PCR auf die Existenz der

Vektoren mit den entsprechenden Inserts überprüft (Abb.19).

49


1

2

3

900 bp

900 bp

750 bp

5

6

4

900 bp

750 bp

750 bp

Abb. 5.19: Analytische PCR der bakteriellen Kolonien mit den entsprechenden subklonierten Gensequenzen der unterschiedlichen Fusionsproteine. DNA-Gel. Spur 1 pGEV2 K296R Δ 179 (900 bp). Spur 4 pMal-c2X K296R Δ 262 (750 bp). Spur 2 pGEV2 K296R Δ 262 (750 bp). Spur 5 pTYB12 K296R Δ 196 (900 bp). Spur 3 pMal-c2X K296R Δ 179 (900 bp). Spur 6 pTYB12 K296R Δ 262 (750 bp).

Mit der Dideoxy-Kettenterminationsmethode wurden die Sequenzen überprüft. Mit Hilfe

elektronischer Datenbanken wurden die selektierten Nukleotidsequenzen interpretiert.

Leserahmen, Mutation und Aminosäurensequenz wurden mit der Software Laser Gene

überprüft und waren korrekt.

50


5.2.2 Exprimierte Fusionsproteine Die Fusionsproteine konnten erfolgreich in E.coli BL21DE3 exprimiert werden. Diese

Zelllinie wurde speziell für high-level Proteinexpression entwickelt. Die vorläufige

Proteinanalytik wurde in erster Linie mittels Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese (SDS- Page) vorgenommen. Diese Methode eignet sich für den Vergleich

und die Quantifizierung von Proteinen. Die Proteine werden dabei primär nach ihrem

Molekulargewicht separiert. SDS bindet an die hydrophoben Regionen eines Proteins und

beeinträchtigt die gefaltete Konformation. Als Ergebnis ist die Länge des SDS-

Proteinkomplexes proportional zu seinem Molekulargewicht. Darüber hinaus wurden

Immunoblots mit den entsprechenden Antikörpern angefertigt. Die Fusionsproteine PG-

K296R, MBP-K296R, CBP-K296R konnten mit ihren unterschiedlich langen Fragmenten

erfolgreich exprimiert werden. Alle Fusionsproteine wiesen eine gute Löslichkeit auf (Abb.

5.20).

C B P -P K R Δ 1 96 , Δ 26 2

M B P -P K R Δ 17 9G P -P K R Δ 1 79

8 5 k D5 8 k D

3

7 8 9 1 0 1 1 1 2

4 5 621

9 0 k D

8 3 k D

Abb. 5.20: Exprimierte Fusionsproteine MBP-PKR, CBP-PKR, PG-PKR. SDS-Page, Coomassieblau gefärbt. Die Bestimmung erfolgte jeweils aus Ganzzelllysaten induziert und nicht induziert, sowie der löslichen Fraktion. Spur 1 PG-PKR K296R Δ 179 Zellextrakt induziert. Spur 2 PG-PKR K296R Δ 179 lösliche Fraktion. Spur 3 PG-PKR K296R Δ 179 Zellextrakt nicht induziert. Spur 4 MBP-PKR K296R Δ 179 Zellextrakt induziert. Spur 5 MBP- PKR K296R Δ 179 lösliche Fraktion. Spur 6 MBP- PKR K296R Δ 179 Zellextrakt nicht induziert. Spur 7 CBP- PKR K296R Δ 196 Zellextrakt induziert. Spur 8 CBP- PKR K296R Δ 196 lösliche Fraktion. Spur 9 CBP- PKR K296R Δ 196 Zellextrakt nicht induziert. Spur 10 CBP- PKR K296R Δ 262 Zellextrakt induziert. Spur 11 CBP- PKR K296R Δ 262 lösliche Fraktion. Spur 12 CBP- PKR K296R Δ 262 Zellextrakt nicht induziert.

51

Mirjam Debus ERGEBNISSE 5.3 Isolierte PKR-Fragmente nach High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) Die Isolierung der PKR-Fusionsproteine wurde mittels High Performance Liquid

Chromatographie durchgeführt. Die Prozedur ist computerbasiert. Die Proteinkonzentration

der Fraktionen wird dabei simultan aus der Extinktion bei einer Wellenlänge von 280 nm

ermittelt.

5.3.1 Isolierte MBP-PKR K296R -Fragmente Bei der Elution von MBP-PKR K296R Δ179, Δ227, Δ262 und Δ282 zeigte sich ein deutlicher

Peak in den Elutionsfraktionen. Nach der Spaltung mit der Protease Faktor X wurde eine

Ionenaustauschchromatographie durchgeführt, um eine Trennung der PKR- Fragmente von

MBP, der Protease und anderen Kontaminationen zu erzielen. Ein Nachteil dieser Methode

ist, dass das Zielprotein und MBP gelegentlich gleichzeitig eluiert werden. Dieses war auch

hier der Fall. Photometrisch ließ sich nur ein Peak bestimmen (Abb. 5.21).

DEAE-SepharoseNaCl GradientAmylosematrix

nach Spaltung mit Faktor Xa

1. 2.

ODOD

tt

Abb. 5.21: 1. Elution des Fusionsproteins MBP-PKR. 2. Elution des Fusionsprotein MBP+ PKR nach Spaltung mit Faktor Xa. Bei der Elution mit einem NaCl2-Gradienten kam es zur Elution beider Bindungspartner in der gleichen Fraktion.

In der SDS-Gelelektrophorese war bereits nach der ersten Isolierungsprozedur eine gute

Anreicherung der Fragmente bei zufriedenstellender Reinheit zu sehen (Abb. 5.22). Die

Degradationsprodukte sowie Kontaminationen mit kleineren Proteinen ließen sich durch

wiederholte Dialyseschritte entfernen.

52


Nach der Spaltung des Fusionsproteins erschienen MBP und die PKR-Fragmente in derselben

Elutionsfraktion (Abb. 5.23). Verifiziert wurde dies durch Westernblot und

Massenspektroskopie. Dieses Problem konnte nicht gelöst werden, so dass auf die anderen

Fusionskonstrukte zurückgegriffen werden musste.

M B P - P K R Δ 1 7 9

8 5 k D

654321 7

Abb. 5.22: Isoliertes Fusionsprotein MBP-PKR K296R Δ 179. SDS-Page, Coomassiefärbung. Spur 1: Lösliche Fraktion des Zellextraktes. Spur 2: Durchfluss. Spur 3: Waschschritt. Spur 4-7: Elutionsfraktionen.

PKR-MBPΔ262

81 kD 41 kD40 kD

6 721 3 4 5

Abb. 5.23: Isoliertes Fusionsprotein MBP-PKR K296R Δ 262. SDS-Page, Coomassiefärbung. Spur 1: Lösliche Fraktion des Zellextraktes. Spur 2: Durchfluss. Spur 3: Waschschritt. Spur 4, 5: Elutionsfraktionen. MBP + PKR K296R Δ 262 nach Spaltung mit Faktor Xa. Spur 6, 7 Elutionsfraktionen.

5.3.2 Isolierte CBP-PKR K296R –Fragmente Das chitinbindende Protein mit dem Proteinsplicingelement Intein aus Saccharomyces

cerevisiae besitzt die Eigenschaft einer induzierbaren Selbstspaltungsaktivität, um auf diese

Weise das Zielprotein von der Affinitätskomponente zu trennen. Induziert wurde die Spaltung

nach der Bindungsphase durch eine rasche Flutung der Chromatographiesäule mit einem

53


Thiol, wie in diesem Falle DTT. Die Elution von CBP-K296R Δ196, Δ227, Δ262, zeigte

keinen deutlichen Peak bei der Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 280 nm. In

der Analyse der Fraktionen mittels SDS-Page zeigte sich eine ineffektive Spaltung der

Fusionsproteine, die auch durch diverse Modifikationen der Induktionsbedingungen nicht

behoben werden konnte. Der Hauptanteil des Zielproteins blieb an der Säule haften (Abb.

5.24).

CBP-PKR Δ179:ce ft el

1 432

res

83 kD

83 kD

A

B

Abb. 5.24: Isoliertes Fusionsprotein CBP-PKR K296R Δ 179. SDS-Page, Coomassiefärbung und Westernblott. Spur 1: Säulenrückstand. Spur 2: Lösliche Fraktion des Zellextraktes. Spur 3: Durchfluss. Spur 4: Elutionsfraktion. 5.3.3 Isolierte PG-PKR K296R -Fragmente Nachdem sich die Fusionsproteine MBP-K296R und CBP-K296R für unsere Zwecke als

ungeeignet erwiesen, zeigte sich das Fusionsprotein PG-K296R als erfolgversprechend. Der

Expressionsvektor wurde speziell für die Expression von Proteinen und Peptiden entwickelt,

die einer NMR-spektroskopischen Analyse zugeführt werden sollen. Vorteilhaft bei diesem

Konstrukt ist, dass eine Spaltung der Fusion nicht unbedingt notwendig ist. Da das Protein G

nur ein sehr geringes Molekulargewicht aufweist, wird die NMR-Analyse nicht beeinträchtigt.

Die Elution der Fragmente PG-K296R Δ179, Δ227, Δ262 und Δ282 mit Imidazolgradienten

zeigte jeweils einen deutlichen Peak bei einer Imidazolkonzentration von ca. 100 mM. Die

Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen (Abb.5.25).

54


4 0kD

0 0:00 05 :0004 :0003 :000 2 :000 1 :00

h

-0 ,5

0 ,00

1 ,00

2 ,00

A UIm id a zo l m M25018 01 002 0

Abb. 5.25 Elution des Fusionsproteins PG-PKR K296R Δ 179. Die Elution erfolgte über einen Zeitraum von 6 Stunden mittels Imidazolgradienten. Simultan wurde die AU bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen.

P G -P K R Δ 1 7 9

5 8 k D

8765432 91

Abb. 5.26: Isoliertes Fusionsprotein PG-PKR K296RΔ179. SDS-Page, Coomassiefärbung. Spur 1: Gesamtzelllysat. Spur 2: Lösliche Fraktion des Zellextraktes. Spur 3: Gesamtzelllysat nicht induziert. Spur 4 - 9: Elutionsfraktion. Die SDS-Gelelektrophorese (Abb. 5.26) zeigte eine gute Anreicherung der Fragmente bei

zufriedenstellender Reinheit. Die Degradationsprodukte sowie Kontaminationen mit kleineren

Proteinen ließen sich durch wiederholte Dialyseschritte entfernen, und so die Reinheit

optimieren. Es konnte eine hohe Konzentration von 1,2 µg/µl erreicht werden. Die Intaktheit

und Reinheit des Proteins wurde mittels Massenspektrometrie verifiziert.

5.4 Die NMR-Struktur der Kinasedomäne

Die NMR-Analyse der Kinasedomäne wurde mittles TROSY-15N-heteronukleärer singulärer

Quantum-Koherenz (HSQC) Experimente durchgeführt. 224 (75%) Aminosäuren konnten

lokalisiert und zugeordnet werden. Die restlichen Resonanzen waren stark überlappend und

55


konnten nicht zugeordnet werden (Abb 5.27 und 5.28).

D414

F282

E271

M366

E468

K286

E524

R413

F263

H406

I481K512

E269

G329

E359

G466

F363D331I362

I364V259

Y293D414

L374

K263N324

F507

K408

V318

I503O365

R296

H286 K261 C369

O516 L392 T537

R382Y465

Y472

L471K214K517

S520

E375O459

D470

K493

L514

I420

G325

G475

G274G279

L519

S461

G383

G276

S275

S418

C326

G289

G401

K291 A284

K285

W327V294

G431

G501G372

T373G434T529

F421

K388

T513T255

T258

R297

K400

R287I502

E393L386I430

I295 H317K521 C361

L439D370

E431 V538

R381

K429

N528

K409

F330

G443

K416

L422

D260Y300Y323V321 L272

D387V484K299

L415I273N322

15N

( ppm

)

1H (ppm)10

130

125

120

115

110

789

105

K426

Y257 D328

Q436S344

F495T496 S530

L474 L482

S462

D600O376

H483

K540I398

F267 I506

E306

O397

I460

A473O427L410

L315

A311L390

L476

D470

Y404

E480

V423I477

F395

Y332

K426

D432L515V459

L518K467 V428

V289

L478

S407

K522

K400

I532

D508S504

A305

R526

R262

D525

F386

D345

V402

W377

D497

D266T292

D505

K304

D316

R548

H549E547

S438

L394

L536

K310

E384

D333

I270

A479

V389

A391

Y346

K541

I405

E511

R499

A313

S542

F278

M265

K385D464D442

K385

K444

D424K509

F494E376

K404

L281

W539

N441

O280

8,4

124

117

118

120

122

8,2 8,0 7,8 7,6 7,4 7,21H (ppm)

15N

(pp m

)

Abb. 5.27 und 5.28: TROSY-15N-HSQC Spektrum von der PKR-Kinasedomäne K296R (Δ 262).

56

Mirjam Debus DISKUSSION 6 DISKUSSION

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten erstmals mittels nuklearer

Magnetresonanzspektroskopie, NMR, dreidimensionale Strukturelemente der Kinasedomäne

von der durch doppelsträngige RNA aktivierten Proteinkinase PKR charakterisiert, und deren

mit den regulativen Domänen interagierenden Regionen lokalisiert werden. Zahlreiche

biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Kinasedomäne von PKR in einem

latenten Status durch Interaktionen mit den regulativen Domänen inhibiert wird (Nanduri

2000). Welche Sequenzen jedoch an diesem Prozess beteiligt sind war bisher unbekannt. Die

hier vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass die gesamte regulative Domäne an der Inhibition

von PKR beteiligt ist. Die erhobenen NMR-Strukturdaten der Kinasedomäne liefern zudem

die Voraussetzungen für die Charakterisierung der vielfältigen regulativen Interaktionen

dieser Domäne sowie für deren mögliche Modifikation über kleine spezifisch interagierende

Moleküle. Über die damit einhergehende Beeinflussung der Translation

wachstumsregulierender Proteine kann so ein neuer potenzieller Ansatz für eine

antineoplastische Therapie postuliert werden.

6.1 NMR-Strukturanalysen von PKR liefern Informationen betreffs der Autoinhibition

Neben der Charakterisierung der dreidimensionalen Struktur der Kinasedomäne von PKR

stand im Fokus der Untersuchungen, Informationen über deren Dynamik und Interaktionen

mit regulierenden Molekülen zu generieren. Daher wurde unter den gängigen

strukturanalytischen Verfahren die Methode der nuklearen Magnetresonanzspektroskopie

favorisiert. Die NMR-Spektroskopie beschränkt sich nicht nur auf die Bestimmung der

Proteinstruktur, sondern bietet auch die Möglichkeit, über die reine Strukturaufklärung

hinausgehenden Fragestellungen zu untersuchen. Mit dem Wissen der dreidimensionalen

Struktur können funktionelle Fragestellungen wie die Dynamik des Proteins,

Wechselwirkungen mit anderen Molekülen wie kleinen Liganden, Polypeptiden, anderen

Proteinen und DNA-Molekülen sowie Katalysemechanismen, Faltungsverhalten oder

Hydratation des Proteins studiert werden (Riek R 2002). Im Gegensatz zu den durch

Kristallisationsverfahren erhobenen statischen Momentaufnahmen der Struktur hängen viele

NMR-spektroskopische Parameter sowohl von der Bewegung des Moleküls als ganzes, wie

Translations- und Rotationsbewegungen, als auch von internen Bewegungen, wie

57

Mirjam Debus DISKUSSION

Konformationsänderungen und Rotationen von Bindungen ab (Bernado P and 29;125(4):916-

23 2003). Die Messung dieser Parameter lässt daher nicht nur Rückschlüsse auf die

vorliegenden dynamischen Prozesse zu, sie erlaubt auch Aussagen über den zeitlichen Verlauf

dieser Prozesse. Erstmals gelang es anhand von N15-markierten Proben große Teile der PKR-

Kinasedomäne mittels NMR-Spektroskopie zu charakterisieren. In dieser Technik wurde eine

250 μM konzentrierte Proteinlösung in einem magnetischen Feld positioniert, und dabei der

Effekt der unterschiedlichen Radiofrequenzen auf die Resonanz unterschiedlicher Atome

gemessen. Das Verhalten eines jeden Atoms wird dabei durch die benachbarten Atome der

angrenzenden Aminosäuren beeinflusst, wobei die nah beieinander liegenden Aminosäuren

mehr als die entfernteren beeinflusst werden. Aus der Größenordnung des Effektes konnte der

Abstand der Aminosäuren zueinander berechnet, und konsekutiv ein Modell der

dreidimensionalen Struktur des Proteins generiert werden. Die strukturellen Informationen der

Kinasedomäne lieferten die Grundlage für weiterführende Untersuchungen der

Bindungseigenschaften der regulativen dsRNA-bindenden Domänen, DRBD I und II. Durch

Titration der unterschiedlichen Domänen konnte der größte Effekt durch die Addition der

kompletten regulativen Domäne beobachtet werden, was dafür spricht, dass sowohl DRBD I,

als auch DRBD II in entscheidendem Maße an der Regulierung beteiligt sind. Es konnte

nachgewiesen werden, dass die Inhibition der Kinasedomäne durch eine Maskierung der

eIF2α-Substratspezifitätsregion und durch eine allosterische oder direkte Blockierung der

katalytisch aktiven Region erfolgt.

6.2 Für einzelne Domänen von PKR konnten individuelle Expressions- und Isolationsbedingungen für eine NMR-Analytik etabliert werden

In dieser Arbeit gelang es erstmals durch Generierung der katalytisch inaktiven Mutante

K296R das Toxizitätsproblem bei der Überexpression von Wildtyp-PKR in E. coli zu

überwinden, um auf diese Weise eine Expression auf quantitativ hohem Niveau zu erzielen.

Um die Struktur und den Aktionsmechanismus eines Proteins studieren zu können, ist die

Isolation des Moleküls unabdingbar. Da alle der ca. 10.000 unterschiedlichen Proteine,

welche sich in einer Zelle befinden, in Größe, Ladung und Löslichkeitsverhalten variieren,

stellt die Isolation jedes einzelnen Proteins eine große Herausforderung dar [Cristea IM, 2004

#283]. Für biochemische und molekularbiologische Analysen eignen sich am besten

rekombinant generierte Proteine von bakteriellen Expressionssystemen, da diese eine

kostengünstige und zeitsparende Überexpression des entsprechenden subklonierten Proteins

58


erlauben. Frühere Arbeiten zeigen, dass rekombinante Wildtyp-PKR in E. coli

autophosphoryliert und RNA unabhängig aktiviert wird (McMillan NA 1995), und so bei der

Überexpression einen toxischen Effekt auf E. coli hat (Barber 1991). Die K296-Seitenkette ist

in die Bindung von ATP involviert. Ein Ersatz des Lysins durch Argenin inhibiert den

Phosphattransfer ohne die Bindung von ATP zu beeinflussen. Während die Phosphorylierung

dieser Mutante durch Wiltyp-PKR uneingeschränkt möglich ist, findet eine Dimerisation und

Autophosphorylierung von K296R während der bakteriellen Expression nicht statt. Generelle

Nachteile der bakteriellen Expressionssysteme liegen in der fehlenden posttranslationellen

Modifikation sowie der Bildung von Inclusion Bodies (Singh SM 2005). Da die Faltung eines

Proteins unter anderem von den intramolekularen Wechselwirkungen abhängt, kann es zudem

durch die Einführung von Mutationen zu entscheidenden strukturellen Alterationen kommen.

6.3 Die Bildung von Fusionsproteinen ermöglichte eine Isolation für NMR-Strukturanalysen

Die wahrscheinlich größte Herausforderung bei Proteinstrukturanalysen ist die Gewinnung

adäquater Proteinproben. In dem vorliegenden Projekt gelang es, durch die Etablierung von

individuell angepassten Expressions- und Isolationsbedingungen der einzelnen PKR-

Domänen die Probleme betreffs Löslichkeit- und Stabilität zu überwinden. Neben der

Modifizierung der Pufferlösungen sowie der physikalischen Gegebenheiten führten unter

anderem die Mutagenese der katalytisch aktiven Seite K296R, die Generierung von

trunkierten Domänen sowie die Bildung von Fusionsproteinen zu dem erwünschten Ergebnis.

Es war notwendig, das Protein in großen Mengen zu produzieren, und dabei Konditionen zu

finden, unter welchen das Protein bei Konzentrationen von mindestens 100 µM stabil und

löslich ist. Das häufigste Problem bei diesem Vorhaben ist die robuste Anfertigung der Probe,

da nur ca. 25 % der überproduzierten Proteine biochemisch stabil und somit geeignet für

Strukturanalysen sind (Christendat D 1998). Multiple Herangehensweisen wurden in den

vergangenen Jahren unternommen, um diese Probleme zu umgehen. In einigen Systemen war

die Modifikation der Pufferkonditionen oder die Einführung einer Punktmutation hilfreich

(Bagby S 2001). Allerdings wurden diese Methoden größtenteils durch individuelles

Ausprobieren etabliert, und lassen sich daher nicht ohne weiteres auf andere Systeme

übertragen. Um Löslichkeit, Stabilität und Expressionsrate der Proteine zu erhöhen, hat es

sich als nützlich erwiesen, Fusionsproteine mit hydrophilen Proteinen oder Peptiden zu bilden

(Pryor KD 1997). Die meisten gängigen Fusionsproteine sind allerdings sehr groß, was eine

59


direkte Strukturanalyse mittels NMR-Spektroskopie unmöglich macht. Für Strukturanalysen

müssen diese Fusionen also wieder gespalten werden, was häufig erneut zu Problemen

betreffs Löslichkeit und Stabilität führt.

Nach aufwendigen Modifikationen der Isolationsbedingungen von PKR und der Entwicklung

unterschiedlicher Expressionssysteme für die einzelnen Domänen, konnten wir von den

Studien der kollaborierenden Arbeitsgruppe G. Wagner et al. profitieren, die inzwischen gute

NMR Ergebnisse mit dem Fusionsprotein Protein G B 1, einer immunglobulinbindenden

Domäne des Streptokokkenproteins G, erzielten (Zhou 2001). Durch die Bildung eines

chimären Proteins mit Protein G B1 gelang es erstmalig, einzelne Domänen von PKR in guter

Stabilität und Löslichkeit sowie ausreichender Quantität für NMR Analysen zu generieren.

Hiermit konnte ein System entwickelt werden, welches die direkte NMR Spektroskopie des

Fusionsproteins durch 1H- 15N Korrelationsspektroskopie erlaubt.

6.4 Anhand der NMR-spektroskopischen Daten lässt sich die Rolle von PKR bei der Inhibition der Translation untersuchen

Mit den im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen strukturellen und funktionsanalytischen

Informationen sind die Voraussetzungen für eine exaktere Untersuchung der

Regulierungsprozesse von PKR gegeben. Aufgrund der zentralen Bedeutung von PKR in der

Signaltransduktion wachstumshemmender Prozesse ist sie von zunehmendem Interesse für

die Aufklärung von Mechanismen des Zellwachstums. Einige experimentelle Daten haben

gezeigt, dass die Expression wachstumsregulierender Proteine nicht nur durch die mRNA-

Akkumulation, sondern auch auf der Translationsebene reguliert wird. Extrazelluläre Signale,

welche die Transkription wachstumsregulierender Gene stimulieren, führen ebenfalls zu einer

gesteigerten Expression und Aktivität von Translationsinitiationsfaktoren (Fredrickson 1992).

Auf diese Weise verknüpfen extrazelluläre Signale die Transkription mit der Translation, was

in einer deutlichen Steigerung der Expression wachtumsregulierender Proteine in dem G0-G1

Übergang und in der G1-Phase des Zellzyklus resultiert. Beispielsweise führt eine Stimulation

durch Serum und mitogene Faktoren durch die Aktivierung von

Translationsinitiationsfaktoren zu einer gesteigerten Rate der Translationsinitiation, während

ein Serumentzug die Proteinsynthese auf der Translationsebene deutlich reduziert (Hassell JA

1976). Folglich stellen die Translationsinitiationsfaktoren wesentliche Effektoren der

wachstumskontrollierenden intrazellulären Signalkaskaden dar.

60


Es existiert eine differentielle Regulation der Genexpression durch die Initiation der

Translation. Viele Daten zeigen, dass nicht alle mRNAs mit derselben Effizienz translatiert

werden. Die Länge des Poly-A-Tails, Interaktionen von Cis-regulatorischen Elementen der

mRNA mit RNA-bindenden Proteinen, Sekundärstrukturen in der Nähe des Initiationskodons

sowie die Gesamtrate der Proteinsynthese beeinflussen die Effizienz der Translation. Ein

weiterer Faktor, der die Translationseffizienz beeinflusst, ist die Struktur des 5’UTRs der

mRNA. Umso komplexer die Struktur des 5’UTRs, umso geringer ist ihre spontane

Expressionsrate (Kozak 1991). Die Translation dieser mRNAs ist in erheblich höherem Maße

von unterstützenden Translationsinitiationsfaktoren abhängig, als mRNAs mit einfachen

5’UTRs (Koromilas 1992). Eine Modulation auf Ebene der Translationsinitiation hätte somit

einen bevorzugten Effekt auf mRNAs mit komplexen 5’UTRs. Es ist bekannt, das mRNAs

von Proto-Onkogenen im besonderen Maße hochkomplexe 5’-Enden aufweisen. Vorherige

Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass Inhibitoren der

Translationsinitiation wie PKR preferentiell die Synthese von wachstumsfördernden

Proteinen wie beispielsweise Cyclin D1 und c-myc inhibieren, während die Translation

anderer Proteine, z.B. β-Aktin und Ubiquitin unbeeinflusst bleibt (Palakurthi 2000).

Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass die Translationsinitiation ein streng kontrollierter

Prozess ist, der im Falle einer Aktivierung durch die preferentielle Expression

wachstumsfördernder Proteine substantiell zu einer Stimulation des Zellwachstums beiträgt.

Durch eine gezielte Inhibition über eine Aktivierung von PKR würde hingegen im besonderen

Maße die Expression wachstumsfördernder Proteine unterbunden werden.

6.5 Die strukturanalytischen Daten von PKR bieten einen potenziellen neuen Ansatz für die antineoplastische Therapie auf der Ebene der Translation

Aufgrund ihrer Schlüsselfunktion in der Expression von wachstumsfördernden Proteinen

stellt PKR ein attraktives Zielmolekül für die Entwicklung einer spezifischen

antineoplastischen Therapie dar. Anhand der strukturanalytischen Daten kann postuliert

werden, dass sich theoretisch kleine Moleküle generieren lassen, welche PKR durch direkte

oder indirekte Interaktion aktivieren können. Zahlreiche biochemische Untersuchungen haben

gezeigt, das eine eIF2α-Phosphorylierung durch PKR, und damit die Inhibition der

Translation, häufig über eine Ca2+-Entleerung aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER)

getriggert wird. So ist bekannt, dass Agenzien wie DTT, Natriumarsenid und Tunicamycin,

welche die Ca2+-Freigabe aus dem ER induzieren, eine gesteigerte eIF2α-Phosphorylierung

61


durch PKR erzielen (Prostko 1993). Der genaue Mechanismus der PKR-Aktivierung ist

diesbezüglich noch nicht aufgeklärt. Spekuliert wird, dass es über die Induktion von

Proteinchaperonen zur Störung der Proteinfaltung und zur Akkumulation von ungefalteten

Proteinen kommt, welche in zellulärem Stress und der Aktivierung von PKR resultiert

(Brostrom, Prostko et al. 1996).

In vorangegangenen Untersuchungen konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass das

Antimykotikum Clotrimazol (CLT) ebenfalls eine signifikante Entleerung intrazellulärer

Ca2+-Speicher verursacht, welche in der Aktivierung von PKR, in Phosphorylierung von

eIF2α, und somit im Zellzyklusarrest resultiert (Aktas, Fluckiger et al. 1998). Die konsekutive

Blockierung des Zellzyklus in der G0-Phase bewirkt einen Wachstumsstillstand in

Tumorzellen sowohl in vitro als auch in vivo. (Aktas 2004). Aus früheren Studien ist bekannt,

dass Clotrimazol die Rate der Zellproliferation von normalen und Krebszelllinien in vitro

inhibiert und zur Reduktion von Metastasen in SCID Mäusen mit Melanomen führt

(Benzaquen 1995). Ebenso verursacht Eicosapentoinsäure (EPA), einer in Fischöl enthaltenen

vielfach ungesättigten Fettsäure, eine PKR vermittelte Inhibition der Translationsinitiation

(Palakurthi 2000). Ihr werden tumorpräventive Eigenschaften zugesprochen, seitdem bekannt

ist, dass Eskimovölker, welche große Mengen an Fisch konsumieren, eine sehr niedrige

Inzidenz maligner Tumoren aufweisen (Caygill 1996). Es konnte nachgewiesen werden, dass

EPA bevorzugt die Synthese und Expression von G1-Cyclinen inhibiert, was in einem

Zellzyklusblock in der G1-Phase resultiert. Dieser Effekt wird erreicht durch Freisetzung von

Ca2+ aus intrazellulären Speichern, während die Wiederauffüllung durch kapazitativen Ca2+-

Influx verhindert wird (Aktas, Fluckiger et al. 1998). In einem KLN-205-

Plattenepithelkarzinom-Maus-Modell reduzierte die orale EPA Gabe signifikant das

Tumorwachstum. Eine reduzierte Expression von Cyclin D1 führte zu einem G1

Zellzyklusblock (Palakurthi 2000). Kürzlich konnte zudem gezeigt werden, dass auch

Thiazolidinedione (TZDs) zur Aktivierung von PKR führen. TZDs gehören zur Gruppe der

PPARγ Liganden. Sie besitzen bekannte antikarzinogene Eigenschaften (Elstner 1998). Zur

Zeit werden TZDs in klinischen Studien in der Krebstherapie bei Tumoren mit hoher PPARγ

Expression getestet. Bislang wurde angenommen, dass die antiproliferativen Eigenschaften

durch Aktivierung von PPARγ vermittelt werden (Morrison 1999). Neuere Studien zeigen

allerdings, dass TZDs die Proliferation von PPARγ-/- and PPARγ+/+ ES Zellen in gleichem

Umfang reduzieren. TZDs induzieren also einen Zellzyklusblock in der G1 Phase durch einen

PPARγ unabhängigen Mechanismus. Dieser involviert die partielle Entleerung von

intrazellulären Ca2+-Speichern, die Aktivierung von PKR und die Phosphorylierung von

62


eIF2α und resultiert in der Inhibition der Translationsinitiation (Palakurthi 2001).

Aufgrund ihrer Schlüsselrolle von PKR bei der Translation unterstreichen alle genannten

Ergebnisse die Attraktivität von PKR als pharmakologische Zielstruktur. Neben dem

spezifischen Wirkmechanismus verspricht eine Interaktion auf Ebene der Translation

gegenüber einer konventionellen antineoplastischen Therapie vor allem eine geringere

Toxizität, da hier keine generelle Schädigung der zellulären DNA und damit eine schwere

Genotoxizität induziert wird. Auch können Zellen, welche sich nicht in Teilung befinden

durch eine derartige Therapie erreicht werden. Gleichzeitig wird aber auch die Relevanz einer

grundlegenden Untersuchung der aktivierenden und inhibierenden Prozesse offensichtlich, da

nur auf diese Weise die aus einer Modifizierung resultierende Effekte bewertet werden

können. Wesentliche Informationen zu den Mechanismen einer Autoinhibition von PKR in

ihrer inaktiven latenten Form, konnten im Rahmen dieser Arbeit generiert werden.

Strukturanalytische Daten zeigen, dass beide dsRNA bindende Domänen, DRBD I und II, mit

der Kinasedomäne interagieren. Sie umwickeln sozusagen die Kinasedomäne und blockieren

auf diese Weise sowohl die Dimerisation, als auch die cis- und trans- Autophosphorylierung,

welche für eine Aktivierung von PKR essentiell ist. In Deletionsstudien konnte außerdem

gezeigt werden, dass die DRBD II die eIF2α-Bindungsstelle am C-Terminus der

Kinasedomäne, jedoch nicht die N-terminale Autophosphorylierungseite blockiert. Dieses

impliziert, dass die DRBD II allein zwar die katalytische Aktivität von PKR stört, nicht aber

die Autophosphorylierung. Eine direkte Blockierung durch die DRBD-Kinase-Interaktion

konnte nicht nachgewiesen werden. Der gezeigte Effekt kann daher über zwei möglich

Mechanismen erzielt werden: Entweder über eine Restriktion der katalytisch aktiven Seite

durch Konformationsänderungen, oder alternativ durch ein „Pseudosubstrat“ in der

Verbindungsregion zwischen den dsRNA bindenden Domänen und der Kinasedomäne. Eine

allosterische Regulation ist jedoch wahrscheinlicher.

6.6 Ein antineoplastischer Effekt über eine Aktivierung von PKR lässt eine verminderte Chemo- und Apoptoseresistenz vermuten

Ein nicht unerhebliches Problem in der Therapie von Tumoren begründet sich in einer

generellen Resistenz gegenüber Toxinen. Zum Teil wird der chemoresistente Phänotyp erst

durch die Applikation zytotoxischer Agenzien induziert. Die meisten genotoxischen Agenzien

benötigen für die Induktion des Zelltodes einen intakten Apoptoseapparat (Coultas L, 2001).

Inhibitoren der Translationsinitiation wie PKR haben gegenüber einer konventionellen

63


Chemotherapie dem Vorteil, ihren antiproliferativen Effekt auch ohne intakte

Apoptosekaskade auszuüben. Zum Teil ist ihr Effekt unabhängig von der durch p53

vermittelten Apoptosekaskade (Vorburger SA 2002).

Maligne Tumore weisen häufig Defekte in Apoptose-regulierenden Proteinen wie p53 oder

dem nukleärem Faktor kappa κB (NFκB) auf (Kaufmann SH, 2004). Aus einer defekten

Apoptosekaskade resultiert oft eine generelle Chemoresistenz. Derzeitig sind noch nicht alle

Signalwege, die in der Apoptose eine Rolle spielen, aufgeklärt. Es ist bekannt, dass der

Prozess des programmierten Zelltodes durch eine Vielzahl an Faktoren reguliert wird. Eine

Dysregulierung dieser Modulatoren kann zu einer malignen Transformation führen. Man kann

zwei Hauptsignalwege unterscheiden. Eine extrinsische oder zytoplasmatische Signalkaskade

wird durch den Fas Todesrezeptor, einem Mitglied der TNF-Rezeptor Superfamilie getriggert

(Zapata JM 2001). Eine zweite Signalkaskade, der intrinsische oder mitochondriale

Signalweg, führt über eine Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien, und

konsekutiv zur Aktivierung des Todessignals (Hockenbery D 1990). Beide Signalkaskaden

konfluieren in einer gemeinsamen Endstrecke, welche in einer Aktivierung von Caspasen und

über die proteolytische Spaltung regulatorischer und struktureller Proteine im Zelltod

resultiert (Scaffidi C 1989).

Einen wesentlichen Induktor der Apoptosekaskade stellt das Produkt des p53

Tumorsupressorgens dar (Benchimol 2001). Nach der Detektion eines DNA-Schadens führt

die p53-Aktivierung zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase, um eine Reparatur vor dem

Eintritt in die S-Phase zu ermöglichen. Kann der Schaden nicht repariert werden, so triggert

p53 den Eintritt in die Apoptose. Sowohl in Zellkultur als auch in Tiermodellen konnte

gezeigt werden, dass ein funktionelles p53-Genprodukt für den mittels genotoxischer

Agenzien getriggerten programmierten Zelltod essentiell ist (Johnstone RW 2002). Da viele

Tumoren eine p53-Mutation aufzeigen, ist hierin eine entscheidende Ursache der

Chemoresistenz zu sehen.

Ein weiterer wichtiger Regulator der Apoptose ist der Transkriptionsfaktor NFκB, welcher

unter anderem das Schlüsselmolekül FasL traskriptionell reguliert (Wajant 2002). NFκB gilt

in erster Linie als anti-apoptotischer Faktor. Situationsabhängig werden über NFκB aber

sowohl pro-, als auch antiapoptotische Signalwege induziert. Unter anderem konnte gezeigt

werden, dass die NFκB Untereinheit p65/RELA für die durch p53 getriggerte

Apoptosekaskade erforderlich ist (Ryan KM 2000). In Hinblick auf die biologischen Effekte

64


von PKR sind insbesondere die proapoptotischen Eigenschaften von Interesse. Es wurde

gezeigt, dass die Aktivierung von NFκB durch PKR über den IκB Kinasekomplex (IKK) für

die aptotische Wirkung von PKR entscheidend ist (Gil 2001). Eine wesentliche Rolle bei der

Signalübermittlung spielen dabei Proteine der TNF-Rezeptor assoziierten Faktoren (TRAF)

(Gil 2004).

6.7 Durch den synergistischen Effekt von Interferonen und PKR kann eine optimierte Therapie bei verminderter Toxizität erzielt werden

Interferone wurden ursprünglich als Regulatoren der zellulären Abwehr gegen Virus-

infektionen identifiziert. Interferone spielen aber auch eine entscheidende Rolle in der

Regulation von Zellwachstum und maligner Entartung. (Kailash 2004). Typ I Interferon wird

ubiquitär exprimiert. Die Aktivierung von Interferonrezeptoren durch Ligandenbindung

verursacht die Phosphorylierung der Rezeptoren durch assoziierte Kinasen sowie die

Induktion von Interferon stimulierten Genen (ISG) [Doly , 1998 #280]. Die Aktivität vieler

dieser Gene, wie beispielsweise PKR und 2-5 Adenylatsynthase, ist abhängig von

doppelsträngiger RNA. Die Bindung von dsRNA führt zu Aktivierung von PKR und somit

zur Inhibition der Proteinsynthese.

Typ I Interferone sind für ihre antineoplastischen Eigenschaften, insbesondere bei malignen

Erkrankungen des hämatopoetischen Systems bekannt. Die Induktion von ISG in

Tumorzellen, wie unter anderem PKR, wird zumindest partiell für den antineoplastischen

Effekt verantwortlich gemacht (Kirkwood 2002). In diesem Fall würde die gesteigerte PKR

Aktivität aus einer spontanen Dimerisierung von PKR Molekülen resultieren, welche auftritt,

wenn PKR supraphysiologische Konzentrationen erreicht. Dieses könnte die sehr hohen,

häufig toxischen, erforderlichen Dosen an Interferonen in der Krebstherapie erklären. Die

simultane Therapie von Patienten mit Interferonen und PKR-aktivierenden Agenzien wie

Clotrimazol, Eicosapentanoinsäure, Thiazolidinidionen bzw. direkt aktivierenden kleinen

Moleküle versprechen, die Effizienz bei geringerer Toxizität zu erhöhen. In vitro konnte der

synergistische Effekt von Translationsinitiations-Inhibitoren und Interferonen bereits bestätigt

werden (Caraglia M 2003). Aufgrund dieser Daten gibt es Anhalt dafür, dass eine

Kombinationstherapie mit Interferonen und Translationsinitiations-Inhibitoren nicht nur einen

effektiveren antineoplastischen Effekt als eine Monotherapie erzielt, sondern sich dadurch

auch die Dosis der kostenintensiven sowie nebenwirkungsreichen Interferone reduzieren lässt.

65

Mirjam Debus ZUSAMMENFASSUNG 7 ZUSAMMENFASSUNG Bei dem vorliegenden Projekt geht es um die Modulation der Translation als möglicher

Ansatz in der antineoplastischen Therapie. Im Fokus steht hier die von doppelsträngiger

Virus-RNA (dsRNA) aktivierte Proteinkinase (PKR), welche einen inhibitorischen Effekt auf

die Translation ausübt.

Bei der Proteinbiosynthese ist die Initiation der Translation besonders strikt reguliert. Durch

Inhibition der Translationsinitiation werden bevorzugt G1-Cycline supprimiert, was zu einem

Zellzyklusstillstand in der G1-Phase führt. Substanzen, die modulierend auf dieser Ebene

eingreifen, versprechen antiproliferativ, aber nur gering toxisch zu wirken. Die PKR stellt

somit ein potenzielles Zielmolekül in der antiproliferativen Therapie dar. Zudem spielt PKR

eine Schüsselrolle in der antiviralen Abwehr. Induziert durch Interferon-α und aktiviert durch

dsRNA vermittelt PKR die Herabregulierung viraler Replikation in infizierten Zellen.

Maligne Tumore weisen in der Regel eine gesteigerte translationelle Aktivität, insbesondere

eine gesteigerte Expression von Proto-Onkogenen auf. Die Möglichkeit einer präferentiellen

Herabregulierung von wachstumsfördernden Proteinen auf Ebene der Translationsinitiation

beruht auf der Tatsache, dass Proteine verschiedene messenger Ribonukleinsäuren (mRNA)

Spezies besitzen, die in ihrer translationalen Effizienz hundertfach variieren. Die meisten der

bekannten Proto-Onkogene und Wachstumsfaktoren haben komplexe mRNA Strukturen, die

eine starke translationelle Regulation vermuten lassen. Sie zeigen beispielsweise

hochkomplexe 5’Untranslated Regions (5’UTRs), welche die Rekrutierung der ribosomalen

Untereinheiten erschweren, und dadurch eine stärkere Abhängigkeit von unterstützenden

Faktoren erforderlich machen. Es ist also davon auszugehen, dass Proto-Onkogen-mRNAs im

besonderen Maße von Initiationsfaktoren der Translation abhängig sind.

Ziel dieses Projektes war es, einen Beitrag zu Strukturanalysen einzelner Domänen mittels

nukleärer Magnetresonanzspektroskopie (NMR) zu leisten. Bisher konnte eine für die NMR

geeignete Isolierung des Proteins aus unterschiedlichen Expressionssystemen nicht gelingen,

da es zum einen zu groß für die NMR-Analytik ist, zum anderen erschwerte eine geringe

Löslichkeit die Isolierung. Bei dem vorliegenden Projekt wurden Konstrukte generiert, die

sowohl die individuellen Domänen, als auch das gesamte C-terminale Segment enthalten. Um

die Löslichkeit zu erhöhen, wurden unterschiedliche Fusionsproteine gebildet. Die Isolierung

der Fusionsproteine gelang mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Die

66

Mirjam Debus ZUSAMMENFASSUNG

NMR-Analyse der Kinasedomäne wurde mittels TROSY-15N-heteronukleärer singulärer

Quantum-Koherenz (HSQC) Experimente durchgeführt. Auf diese Weise konnten erstmals

mittels NMR dreidimensionale Strukturelemente der Kinasedomäne von PKR charakterisiert,

und deren mit den regulativen Domänen interagierenden Regionen lokalisiert werden. Die

generierten Informationen erlauben nun eine exaktere Untersuchung der Aktionsmechanismen

von PKR und bieten zudem die Basis für die Entwicklung von kleinen aktivierenden

Molekülen zum Zweck einer mehr spezifischen weniger toxischen antineoplastischen sowie

antiviralen Therapie.

67

Mirjam Debus ABKÜRZUNGEN

8 ABKÜRZUNGEN A Ampère Abb Abbildung ApoE Apolipoprotein E Ak Antikörper ATP Adenosintriphosphat AU Absorbance Units BCA Bicinchoninic Acid bp Basenpaar Bcl-2 B-cell lymphoma protein 2 °C Grad Celsius CBP Chitin binding protein CLT Clotrimazol CPP32 Cellular Protease 32 DEAE Diethylaminoethyl dest destillatum DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosid-5’triphosphat dsDNA doppelsträngige DNA DTT Dithiolthreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat eIF2α eukaryotischer Initiationsfaktor-2α EPA Eicosapentoinsäre FasL FasLigand g Gramm G1 Gap 1 GTP Guanidin-Triphosphat h Stunde HPLC High Performance Liquid Chromatographie HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence IFN Interferon IPTG Isopropyl β-D-1-Thiogalaktopyranosid IRF-1 Interferon regulierender Faktor ISG Interferon stimulierte Gene kD kilo Dalton OD Optical Density l Liter LB Luria Bertanii m milli M Molar M Mitose MBP Maltose binding protein Mda7 Melanom Differenzierungs-assoziiertes Gen 7 mi Minute ml Milliliter mm Millimeter mM Millimolar mAk monoklonale Antikörper mRNA meesenger Ribonuleinsäure mV Millivolt

68

Mirjam Debus ABKÜRZUNGEN µ mikro NFκB Nukleärer Faktor-κB ng Nanogramm nm Nanometer NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy OD optische Dichte PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PCR Polymerase chain reaction PG Protein G PH -log [H+] PKR Proteinkinase R PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PPARγ Peroxysome Proliferator-Activated Receptor Rel Untereinheit von NFκB RNA Ribonukleinsäure rpm Rotationen pro Minute RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat TAE Tris-Acetat-EDTA TBS Tris-Base Sodium TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylendiamin TNFα Tumor-Nekrosefaktor α Tris Tris(hydroxymethyl) amino-Methan TROSY Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy TZD Thiazolidinedione UV Ultraviolet V Volt v-mos Gen einer viralen Serin-Threoninkinase W Watt Abkürzungen für Aminosäuren A Ala Alanin C Cys Cystein D Asp Aspartat E Glu Glutamat F Phe Phenylalanin G Gly Glycin H His Histidin I Ile Isoleucin K Lys Lysin L Leu Leucin N Met Methionin M Asn Asparagin P Pro Prolin Q Gln Glutamin R Arg Argenin S Ser Serin T Thr Threonin V Val Valin W Trp Tryptophan Y Tyr Tyrosin

Abkürzungen für Nukleotide A Adenin C Cytosin G Guanin T Thymin

69

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Res 32: 4696-703. Ung, T. L., C. Cao, et al. (2001). “Heterologous dimerization domains functionally substitute

for the double-stranded RNA binding domains of the kinase PKR.” Embo J 20(14): 3728-37.

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stranded-RNA-dependent protein kinase, PKR: role of dimerization and cellular localization in the stimulation of PKR phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2 (eIF2).” Eur J Biochem 268(13): 3674-84.

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stranded RNA- binding domains and facilitates in vivo phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2.” J Biol Chem 272(22): 14434-41.

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Mirjam Debus DANKSAGUNG 7 DANKSAGUNG

Ich möchte mich bei allen bedanken, die mit ihrer Unterstützung, Freundschaft und Liebe

zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Insbesondere danke ich

Herrn Prof. Dr. Süleyman Ergün für seinen grenzenlosen Enthusiasmus und für die

Vermittlung des Kontaktes nach Boston.

Herrn Prof. Dr. José Halperin für seine hohen Ansprüche, für die Konferenz in Bethesda und

das Skilaufen in den White Mountains von New Hampshire.

Herrn Dr. Huseyin Aktas für all die zahlreichen Wortgefechte und Gedankenkriege, für seine

wunderbare Art, mir die Knoten im Kopf zu lösen, und nicht zuletzt dafür, dass ich lernen

durfte, kurdisches Englisch zu verstehen.

Herrn Prof. Dr. Daniel Tosteson dafür, dass er unsere wöchentlichen Labormeetings stets mit

kontroversen Gedankengängen und wohlwollenden Fragen bereichert hat.

Frau Dr. med. Nerbil Kilic, für ihre hilfreiche Unterstützung und ihre Bemühungen die

Promotionsprozedur voran zubringen . Frau Dr. med. Anna Solth, für die Hilfe bei der

Korrektur. Herrn Dr. med. Rainer Günther für alle reflektierenden Gespräche. Frau Dr. med.

Julia Bachmann für die erfrischende Arbeit mit ihr und die korrigierende Durchsicht. Frau Dr.

rer. nat. Dr. med. Sonja Loges und Frau Dr. rer. nat. Susanne Sebens für alle guten

Ratschläge.

Cornelia, Maria, Theresa, Jakob, Charlotte, Britta, Johanna, Christina und Katharina für die

Gewissheit, dass mein Kind all die Jahre unter Eurer Obhut stets gut versorgt war.

meinen Eltern und Geschwistern, die immer für mich da sind, und vor allen Dingen meiner

wundervollen Tochter Milena Sophie, die immer noch so geduldig mit ihrer Mama ist,

obwohl der Besuch im Schwimmbad an unzählbaren Samstagen ausfallen musste.

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Mirjam Debus LEBENSLAUF 10 LEBENSLAUF

Persönliche Geburtstag: 10.04.1974 Daten Geburtsort: Altenau bei Garmisch Partenkirchen

Familienstand: ledig, eine Tochter, geb. 08.11.2001

Derzeitige Wissenschaftliche Mitarbeiterin. 2. Weiterbildungsjahr Innere Medizin seit 03-2005 Tätigkeit 1. Medizinische Klinik, Universitätsklinikum Kiel Ausbildung Medizinstudium 10-1997 bis 12-2004. Universitätsklinikum Hamburg & Training Physikum: September 1999

Erstes Staatsexamen: März 2002 Zweites Staatsexamen: März 2003 Drittes Staatsexamen: Dezember 2004 Famulaturen: Innere Medizin. 09-02. Klinikum Neustadt, Ostholstein Innere Medizin. 07 u. 08-02. Brigham Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston Pulmonologische Praxis. 03-02. Dres. Koppermann u. Hißnauer , Hamburg Pathologie. 03-00 Institut für Pathologie, Universitätsklinik Hamburg-Eppendorf Molekulare Virologie. 02-00Heinrich-Pette-Institut, Hamburg-Eppendorf Ausbildung in Naturheilkunde. Sept. 1993-Sept. 1996 Homöopathie, Akupunktur und Phytotherapie. Schule für Naturheilkunde, Hamburg

Wissenschaftliche Tätigkeiten Wissenschaftliche Angestellte. Seit 9-05. Labor für Molekulare Gastroenterologie.

Forschungsschwerpunkt: L1CAM bei der Vermittlung von Chemoresistenz und Ausprägung eines malignen Phänotypes in duktalen Pakreaskarzinomen. 1. Medizinische Klinik, Universitätsklinikum Kiel

Doktorarbeit in der Onkologie. September 2000-September 2001 Modulation der Translation als Weg in der antineoplastischen Therapie. Cell Biology Institute, Laboratory for Translational Research. NIH gefördert. Harvard Medical School, Boston, USA

Stipendien Forschungsstipendium 09-00 bis 09-01 der Harvard Medical School, Boston, USA

Publikationen Gelev V, Aktas H, Marintchev A, Ito T, Frueh D, Hemond M, Rovniak D, Debus M, Hyberts S, Usheva A, Halperin J, Wagner G, Mapping of the Auto-inhibitory Interactions of Protein Kinase R by Nuclear Magnetic Resonance. 2006, J Mol Biol.

Sebens-Muerkoester S, Werbing V, Sipos B, Debus M, Witt M, Großmann M,

Leisner D, Koetteritzsch, Kappes H, Kloeppel G, Altevogt P, Foelsch U, Schaefer H, Drug induced expression of the cellular adhesion molecule L1CAM confers anti-apoptotic protection and chemoresistance in pancreatic ductal adenocarcinoma cells. 2006, Oncogene.

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Mirjam Debus ERKLÄRUNG 11 ERKLÄRUNG

EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG: Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfasst,

andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die aus den

benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln nach Ausgabe, Band

und Seite des benutzten Werkes kenntlich gemacht habe.

Ferner versichere ich, dass ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an einer

anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung zur

Promotion beworben habe.

Mirjam A. Debus

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