Expression und Lokalisation von P-Glykoprotein in humanem ... fileDie Endlosigkeit des...

Aus der Abteilung Allgemeine Pharmakologie

des Instituts für Pharmakologie und Toxikologie

(Leiter Univ. Prof. Dr. H. K. Kroemer)

der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Expression und Lokalisation von

P-Glykoprotein in humanem Herzgewebe

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des akademischen

Grades

Doktor der Medizin (Dr. med.)

der

Medizinischen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2002

vorgelegt von Christiane Karsten

geb. am 24.03.1976

in Mönchengladbach

Dekan: Prof. Dr. H. K. Kroemer

1. Gutachter: Prof. Dr. H. K. Kroemer

2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. G. Geisslinger

Raum: Hörsaal der Klinik für Innere Medizin

Tag der Disputation: 11. Juli 2003

Die Endlosigkeit des wissenschaftlichen Ringens

sorgt unablässig dafür, dass dem forschenden

Menschengeist seine beiden edelsten Antriebe

erhalten bleiben und immer wieder von neuem

angefacht werden: Die Begeisterung und die

Ehrfurcht.

Max Planck

Inhalt

1. EINLEITUNG 1

1.1 Hintergrund und Ziel der Arbeit 1

1.2 Transport von Substanzen über Zellmembranen 2

1.3 Transporter aus der ABC-Transporter-Familie 3

1.4 Das ABC-Transportprotein P-Glykoprotein 4

1.5 Anatomie des Herzens 8

1.6 Die Herzinsuffizienz 10

1.7 Kardiomyopathien führen zu einer Herzinsuffizienz 13

2. MATERIAL UND METHODEN 16

2.1 Material 16

2.2 Methoden 21

2.2.1 Präparation von Gesamt-RNA aus Gewebe 21

2.2.2 Umschreiben der RNA in cDNA 23

2.2.3 Vervielfältigung von cDNA-Fragmenten 24

2.2.4 Gelelektrophorese der PCR-Produkte 27

2.2.5 Immunhistochemische Darstellung von P-Glykoprotein 29

2.2.6 Statistische Auswertung der Ergebnisse 30

3. ERGEBNISSE 31

3.1 Isolation von RNA aus Herzgewebe 31

3.2 Ergebnisse der RT-PCR 32

3.3 Ergebnisse der Immunhistochemie 36

4. DISKUSSION 43

5. ZUSAMMENFASSUNG 50

6. LITERATUR 51

7. ANHANG 65

Abkürzungen

APAAP Alkaline Phosphatase anti-alkaline Phosphatase

APS Ammoniumpersulfat

Aqua dest. destilliertes Wasser

ATP Adenosin-Triphosphat

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

DCM dilatative Kardiomyopathie

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

EDTA Ethylendiaminotetraacetat

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

HZV Herzzeitvolumen

ICM ischämische Kardiomyopathie

MDR Multidrug Resistance

MRP Multidrug Resistance associated Protein

MOPS Morpholinopropansulfonsäure

mRNA Boten-(messsenger)-RNA

NF Non-Failing (Gesund)

PCR Polymerasekettenreaktion

P-gp Phospho-Glykoprotein

RNA Ribonukleinsäure

rRNA ribosomale RNA

RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR

Taq Thermus aquaticus

TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer

TE Tris-EDTA-Puffer

TEMED N, N, N’, N’-Tetrametylethylendiamin

Tris Hydroxymethylaminomethan

UV Ultraviolett

Maße und Einheiten

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

bp Basenpaar

g Gramm

h Stunden

kb Kilobasenpaar

kDa Kilo-Dalton

mg Milligramm

min Minuten

V Volt

1. Einleitung 1

1. Einleitung

1.1 Hintergrund und Ziel der Arbeit

ATP-abhängige membranständige Transportproteine bestimmen die Konzentration

vieler endogener und exogener Stoffe in verschiedenen Zellen. Entdeckt wurde dieser

Effekt zunächst an resistenten Tumorzellen und schließlich auch in normalem Gewebe.

Viele verschiedene Transporter konnten in diesem Zusammenhang identifiziert werden,

einer davon ist das P-Glykoprotein (P-gp). Im Gehirn und im Darm dient P-

Glykoprotein als funktionelle Barriere, um den Eintritt toxischer Substanzen zu

verhindern. Auch im Herzen könnte eine solche Barriere den Herzmuskel vor

schädlichen Einflüssen schützen. Viele bei der Therapie von Herz-Kreislauf-

Erkrankungen eingesetzte Substanzen (Digoxin, β-Blocker) gehören zu den Stoffen, die

durch P-Glykoprotein transportiert werden. Auch Substanzen mit erwiesener

Kardiotoxizität (Doxorubicin) sind Substrate des P-Glykoproteins.

Die Expression von P-Glykoprotein ist individuell sehr verschieden. Hierfür werden

zum einen genetische Faktoren (Mutationen), zum anderen aber auch Umwelteinflüsse

(Substanzen, die P-gp induzieren oder hemmen können) verantwortlich gemacht.

Die gleichzeitige Gabe mehrerer Medikamente, die von P-Glykoprotein transportiert

werden, kann zu Interaktionen führen. Solche Interaktionen treten nicht nur in Darm

und Leber auf, sondern theoretisch in jeden P-Glykoprotein exprimierenden Gewebe.

Einige P-gp-Substrate haben eine sehr variable Kardiotoxizität, die ihre Ursache in einer

individuell unterschiedlichen Expression von P-Glykoprotein haben könnte. Daher

sollen im Rahmen der vorliegenden Arbeit Proben aus 15 humanen Herzen (linker

Ventrikel; 5 Gesunde, 5 mit ischämischer Kardiomyopathie und 5 mit dilatativer

Kardiomyopathie) auf die Expressionsstärke von P-Glykoprotein hin untersucht werden.

1. Einleitung 2

1.2 Transport von Substanzen über Zellmembranen

Jeder Wirkstoff und jeder endogene Stoff, der in eine Zelle hinein oder aus ihr heraus

gelangen soll, muss über die Zellmembran transportiert werden. Jedes Medikament

muss also auf dem Weg vom Darm ins Blut und vom Blut zum Wirkort eine Vielzahl

von Membranen passieren. Viele dieser Stoffe werden durch spezielle Transportsysteme

über die Zellmembran transportiert. Zu den wichtigsten Aufgaben dieser

Transportsysteme gehören die Anreicherung von Energieträgern und Baustoffen aus der

Umgebung sowie die Elimination von Schadstoffen und der Erhalt eines

Ionengradienten, der für die Erregbarkeit von Nerven und Muskelzellen unerlässlich ist.

Die verschiedenen Varianten dieser Transportsysteme werden in zwei große Klassen

eingeteilt. Der passive Transport benötigt keine Energie und erfolgt mit dem

Konzentrationsgradienten. Im Gegensatz dazu steht der aktive Transport, bei dem ein

Stoff mit Hilfe von Energie gegen einen Konzentrationsgradienten transportiert wird.

Zum passiven Transport zählen die freie Diffusion, die nur für Wasser und nichtpolare

Moleküle möglich ist, und die erleichterte (passive) Diffusion. Charakteristisch für die

erleichterte Diffusion ist eine begrenzte Kapazität durch das begrenzte Vorhandensein

von Träger-Proteinen (Carrier) oder Ionenkanälen. Diese Möglichkeit des Transports

ist also sättigbar. Weiterhin zeichnet sich diese Form des Transportes durch eine hohe

Spezifität der Carrier-Proteine für den zu transportierenden Stoff aus. Carrier sind

Proteine, die quer durch die Lipiddoppelschicht reichen und spezifische Bindungsstellen

für bestimmte Substanzen besitzen und deshalb auch nur diese transportieren können.

Ionenkanäle funktionieren ähnlich wie Carrier-Proteine. Ionenkanäle sind hoch

selektive Proteine, die in offener und geschlossener Form vorliegen können. Der

Funktionszustand der Ionenkanäle kann durch Signalmoleküle (z. B. Neurotransmitter),

Ionen oder GTP-bindende Proteine beeinflusst werden. Die Flussrichtung und

Geschwindigkeit wird vom Konzentrationsgradienten und von der Gesamtladung der

durchfließenden Ionen bestimmt.

Der aktive Transport transportiert Teilchen durch den Einsatz von Energie gegen das

Konzentrationsgefälle.

1. Einleitung 3

Beim primär-aktiven Transport ist der Transport direkt an eine energieliefernde

chemische Reaktion gebunden. Beispiele für diese Reaktion sind die Natrium-Kalium-

Pumpe und die Wasserstoff-Sekretion in den Belegzellen der Magenschleimhaut. Die

Energie wird durch die Spaltung von Adenosin-Triphosphat (ATP) gewonnen.

Der sekundär-aktive Transport hat die Besonderheit, dass die Energie nicht in Form von

ATP, sondern durch ein physikalisches Potential gewährleistet wird. Die Triebkraft für

den Transport eines Stoffes gegen den Konzentrationsgradienten ist der gleichzeitige

Transport eines anderen Stoffes mit dem Gefälle. Dies kann im Cotransport (Symport)

oder im Gegentransport (Antiport) geschehen. Beispiele sind die Aufnahme von

Glukose oder Aminosäuren im Intestinaltrakt oder im Tubulussystem der Niere.

Zu erwähnen ist noch die Möglichkeit der rezeptorvermittelten Endozytose, bei der

Stoffe (zumeist größere Moleküle) durch die Bindung an einen bestimmten Rezeptor

und nachfolgender Abschnürung der Zellmembran aufgenommen werden.

Die nachfolgend vorgestellten Proteine aus der ABC-Transporter-Familie gehören in die

Klasse des primär aktiven Transportes. Die notwendige Energie wird durch Spaltung

von ATP gewonnen.

1.3 Transporter aus der ABC-Transporter-Familie

ABC-Transporter (ATP-binding-cassette) sind eine große Gruppe von Transportern, die

alle gemeinsam haben, dass sie Substanzen mit Hilfe von ATP gegen den

Konzentrationsgradienten durch biologische Membranen transportieren. Transporter

dieser Familie hat man in vielen verschiedenen Spezies gefunden. Bisher sind 48

solcher Transportproteine beim Menschen bekannt.

Ein typischer ABC-Transporter besteht aus vier membranassoziierten Domänen, von

denen zwei hydrophob sind. Jede der hydrophoben Domänen besteht wiederum aus

sechs transmembranösen Segmenten (1). Entscheidend für die Zugehörigkeit zu dieser

Familie ist ein 200-250 Aminosäuren langer Bereich, in dem ATP gebunden wird (1).

1. Einleitung 4

Proteine der ABC-Transporter-Familie transportieren eine Vielzahl endogener und

exogener Stoffe. Einige dieser Transporter sind durch ihre Eigenschaft als

Resistenzproteine bei der Pharmakotherapie von Malignomen aufgefallen. Zu diesen

Transportern gehört die MRP-Familie (Multidrug Resistance associated Protein) und

das BCRP (Breast Cancer Resistance Protein). Der bekannteste Vertreter ist jedoch das

P-Glykoprotein.

1.4 Das ABC-Transportprotein P-Glykoprotein

Das Transportprotein Phospho-Glykoprotein (P-gp) wurde erstmals von JULIANO in

der Arbeitsgruppe von LING in Tumorzellen (Ovarien des chinesischen Hamsters)

entdeckt (2). Diese Tumorzellen waren in der Lage, Arzneimittel aus einer Zelle

herauszutransportieren. Zellen aus Lungen-, Darm-, Magen-, Brust- und

Schilddrüsentumoren, Neuroblastomen und Leukämien weisen oft eine erhöhte

Expression von P-gp auf (3). Folge dieser erhöhten P-gp-Expression ist eine

Multiresistenz gegenüber verschiedenen strukturell nicht miteinander verwandten

Stoffen. Diese Resistenz wird mit einem aktiven Auswärtstransport durch P-gp aus der

Zelle erklärt.

P-Glykoprotein ist das Genprodukt des MDR1-Gens, welches auf dem langen Arm des

Chromosoms 7 liegt (4). Dieses Gen wird auch MDR1-Gen genannt. Biochemische und

molekularbiologische Untersuchungen des P-Glykoproteins haben ergeben, dass es sich

um ein 1280 Aminosäuren langes, integrales Plasmamembranprotein mit einem

Molekulargewicht von 170 kDa handelt. Das Protein vermag ATP-abhängig

verschiedene hydrophobe Substanzen aus der Zelle zu transportieren und so deren

Konzentration im Intrazellularraum niedrig zu halten (5, 6).

P-gp besteht aus zwei Anteilen, die eine hohe Sequenzhomologie aufweisen. Jede dieser

Hälften enthält eine hydrophobe Domäne, die wiederum aus sechs Transmembran-α-

Helices besteht, die für den Transport von Substanzen entscheidend sind, und eine

1. Einleitung 5

zytosolische, hydrophile Domäne mit der Nukleotid-bindenden Domäne 1 und 2 (NBD

1 und NBD 2). Beide Anteile des Proteins sind über eine „linker region“ verbunden (7,

8). Trotz einer hohen Sequenz- und Strukturhomologie nimmt man an, dass das P-

Glykoprotein eher durch die Fusion von Genen, die sich entwicklungsgeschichtlich

unabhängig voneinander entwickelt haben, als durch eine Genduplikation entstanden ist

(9). Einige ABC-Transporter wie das BCRP werden als Half-Transporter bezeichnet, da

sie nur aus einer hydrophoben Domäne mit sechs Transmembran-α-Helices und einer

ATP-Bindungsstelle bestehen. Um funktionsfähig zu sein, müssen diese Transporter

dimerisieren. Die hydrophilen Regionen des P-Glykoproteins haben eine große

Homologie zu aktiven Transportsystemen bestimmter Bakterien (7). Diese bakteriellen

Transportsysteme transportieren verschiedene Aminosäuren und Zucker (10, 11).

Abb. 1.1: Schematische Zeichnung des P-Glykoproteins (12)

Auch in gesunden Geweben wie z. B. in Epithel- und Endothelzellen der Leber, der

Niere, im Gastrointestinaltrakt und in der Blut-Hirn-Schranke konnte P-gp

nachgewiesen werden (siehe Tabelle 1.2). Die physiologische Funktion von P-gp ist

noch nicht vollständig erforscht. Auf Grund der Lokalisation von P-gp im Epithel des

Magen-Darm-Traktes und der Beteiligung an exkretorischen Vorgängen liegt nahe, dass

P-gp im Organismus eine Schutzfunktion gegen in der Natur vorkommende toxische

Substanzen hat. Diese toxischen Substanzen können z. B. mit der Nahrung

aufgenommene Xenobiotika sein (13). Fremdstoffe werden so gar nicht oder nur in sehr

geringen Mengen aufgenommen bzw. schneller wieder ausgeschieden. Untersuchungen

1. Einleitung 6

in exkretorischen und sekretorischen Organen beschreiben Funktionen im Rahmen der

Detoxifikation. So ist P-gp an der Sekretion von Metaboliten in die Galle, den Urin oder

direkt in das Lumen des Gastrointestinaltraktes beteiligt (14, 15).

Zum Schutz vor Toxinen, die bereits in die Blutbahn gelangt sind, wird P-Glykoprotein

entlang der Endothelien der Blutgefäße exprimiert. Dieses konnte bisher im Gehirn (16,

17) und im Hoden (18) gezeigt werden.

Die Bedeutung von P-gp für die Blut-Hirn-Schranke ist anhand von mdr1a (-/-)-Knock-

out Mäusen gezeigt worden. Diese Mäuse wiesen eine stark erhöhte Toxizität durch

hohe Konzentrationen verschiedener Substanzen auf (16). Andere Untersuchungen

haben überproportional hohe Konzentrationen des Anthrazyklins Doxorubicin in

kardialen Proben solcher Mäuse beschrieben (19).

Tab. 1.2: Beispiele für Zelltyp, genaue Lokalisation und Transportrichtung von P-gp in verschiedenen Organen (18).

Organ Zelltyp Lokalisation Transport

Leber Hepatozyt kanalikuläre

Membran

in die Galle

Darm Enterozyt apikale Membran in das Lumen des GI-

Traktes

Niere Epithelzellen des

proximalen Tubulus

apikale Membran in das Lumen des Tubulus

Gehirn Luminale Membran luminale Membran in das Blut

P-Glykoprotein transportiert eine Vielzahl sehr unterschiedlicher Substanzen. Diese

Substanzen haben kein einheitliches Strukturmerkmal. Es sind vor allem kationische

und amphiphile Moleküle (20). Neben dem Transport von körperfremden Stoffen ist P-

gp auch in den Transport von endogen synthetisierten Stoffen eingebunden. Es konnte

gezeigt werden, dass P-gp in der Lage ist, Kortisol, Aldosteron und Dexamethason zu

transportieren (21, 22). Eine Auswahl solcher sowohl natürlich in der Umwelt

vorkommender als auch synthetisch hergestellter Substanzen zeigt Tab. 1.3.

1. Einleitung 7

Tab. 1.3: Eine Auswahl natürlicher und synthetischer Substanzgruppen und Substanzen, die durch das MDR1-Genprodukt P-gp transportiert werden.

Substanzgruppe Substrat Literatur

β-Blocker Talinolol

Celiprolol

Spahn-Langguth et al. (23),

Gramatte et al. (24)

Karlsson et al. (25)

Herz-Kreislauf-

Pharmaka

Digoxin

Verapamil

Tanigawara et al. (26)

Safa et al. (27)

HIV-Protease-Hemmer Saquinavir

Indinavir

Kim et al. (28)

Lee et al. (29)

Zytostatika Doxorubicin

Vinblastin

Taxol

Etoposid

Beck et al. (30)

Akiyama et al. (31)

Schinkel et al. (32)

Beck et al. (30)

Immunsupressiva Cyclosporin A Saeki et al. (33)

Opioide Loperamid

Morphin

Callaghan et al. (34)

Callaghan et al. (34)

Antikonvulsiva Phenytoin Thisher et al. (35)

Hormone Kortisol

Dexamethason

Aldosteron

Van Kalken et al. (22)

Ueda et al. (21)

Ueda et al. (21)

Die Transportfunktion von P-gp kann durch unterschiedliche Mechanismen reguliert

werden. So kann die Gabe von hohen Dosen des Kalzium-Kanal-Blockers Verapamil

eine P-gp vermittelte Arzneimittelresistenz wieder rückgängig machen (36, 37). Durch

die Bindung von Verapamil an den Transporter kann der Export von Arzneimitteln

nicht mehr stattfinden. Auch Cyclosporin A (38), Chinidin, Chinin, Vinblastin,

Doxorubicin, Digoxin, Nifedipin und Rocuronium werden solch günstige Effekte in

Bezug auf Mehrfachresistenzen zugeschrieben. Eine andere Möglichkeit der Regulation

ist die Induktion von P-Glykoprotein. So bewirkt das Tuberkulostatikum Rifampicin bei

1. Einleitung 8

oraler Gabe eine erhöhte Expression des MDR1-Produktes im Bürstensaum der

Enterozyten (39, 40). In Fallbeschreibungen von Patienten und in Studien mit

Probanden konnte als Folge der durch Induktoren erhöhten P-Glykoprotein-Expression

eine signifikante Abnahme der Digoxinspiegel festgestellt werden. Solch eine

veränderte Kinetik trat sowohl bei oraler als auch bei intravenöser Gabe des P-gp-

Substrates Talinolol und des P-gp-Induktor Rifampicin auf (39).

Auffallend viele Substrate des P-Glykoproteins sind Substanzen, die bei der Therapie

von Herz-Kreislauf-Erkrankungen eingesetzt werden, also kardioaktiv sind. Auch

kardiotoxische Substanzen wie Doxorubicin sind Substrate von P-Glykoprotein. Die

toxische Wirkung dieser Substrate zeigt eine hohe interindividuelle Variabilität. Daher

soll die P-Glykoprotein-Expression im Herzen untersucht werden. Im Folgenden wird

zunächst die Anatomie des Herzens beschrieben.

1.5 Anatomie des Herzens

Das Herzmuskelgewebe hat einen mesodermalen Ursprung. Die Zellen reifen zunächst

zu Myoblasten und verschmelzen anschließend zu Kardiomyozyten. Reife

Herzmuskelzellen haben wie Skelettmuskelzellen eine Querstreifung, aber nur ein bis

zwei zentral gelegene Zellkerne. Jede Herzmuskelzelle ist von einem zarten

gefäßreichen Bindegewebe, dem Endomysium umgeben. Über Glanzstreifen (Disci

intercalares) sind die einzelnen Herzmuskelzellen miteinander verbunden. Die für die

Elektrophysiologie wichtigsten Bestandteile der Disci intercalares sind die Nexus. Über

diese herzspezifischen Verbindungen kommt es zu einer elektrischen Kopplung, die die

Herzmuskelzellen eines Bündels zu einem Verband zusammenschließt. Die

Erregungsausbreitung findet so von Zelle zu Zelle statt.

Im Gegensatz zu Muskelzellen der Skelettmuskulatur sind die Kalziumspeicher in der

Herzmuskulatur weniger stark ausgeprägt, so dass der transmembranöse

Kalziumeinstrom aus dem Extrazellularraum eine bedeutende Rolle für die Kontraktion

1. Einleitung 9

spielt. Die Permeabilität der äußeren Zellmembran für Kalzium kann durch Stimulation

von β-Rezeptoren, z. B. durch Adrenalin oder Noradrenalin, gesteigert werden. Die

Kontraktion an sich läuft ohne Unterschied zu anderen Muskelgeweben durch die

Interaktion von Aktin und Myosin ab. Um eine möglichst optimale Funktion zu

erreichen ist die Aktin-Myosin-Überlappungszone von entscheidender Bedeutung.

Durch passive Dehnung, wie bei der diastolischen Füllung des Herzens, wird die Aktin-

Myosin-Interaktion optimiert. Dieser Effekt wird als Frank-Starling-Mechanismus

bezeichnet. Bei zu starker Dehnung verbreitert sich der Abstand der Z-Streifen

(Sarkomer), die Kontraktion zeigt eine verminderte Kraftentwicklung in Folge von

weniger zur Verfügung stehenden Interaktionsorten. Bei einer Sarkomerlänge von mehr

als 3,6 µm sind die Aktin- und Myosinfilamente gänzlich auseinandergeglitten und es

kann zu keiner Kontraktion mehr kommen.

Die Blutversorgung des Herzens erfolgt über die beiden Herzkranzarterien (Aa.

coronariae cordis). Beide Herzkranzarterien entspringen aus der Aorta. Die Grenzen

innerhalb der die Koronararterien das Herz mit Blut versorgen, sind sehr verschieden.

Man unterscheidet drei Versorgungstypen: 1. den ausgeglichenen Typ, 2. den

Rechtsversorgertyp und 3. den Linksversorgertyp. Alle Herzkranzgefäße ziehen von

außen nach innen durch das Myokard. Die Zweige der Herzkranzgefäße bilden

funktionelle Endarterien, d. h. sie bilden keine Kollateralen oder Anastomosen zu

Nachbararterien. Der eigentliche Stoffaustausch findet in den Kapillaren statt.

Mikroskopisch bestehen Kapillaren aus dem Endothel, das die Auskleidung des

Blutgefäßes darstellt, einer dem Endothel anliegenden Basalmembran und aus

kontraktilen Zellen (Perizyten) die wiederum der Basalmembran aufliegen. Je nach

Organ und Funktion lassen sich elektronenmikroskopisch Kapillaren mit geschlossener

Endothelschicht (Blut-Gewebe-Schranken), mit gefenstertem Endothel

(Nierenglomeruli, Darm, Drüsen) und mit interzellulären Lücken (Leber, Milz)

abgrenzen. Der venöse Abfluss verläuft entlang der arteriellen Gefäße und mündet in

den rechten Vorhof.

Erkrankungen des Herzens führen oft zu einer verminderten Pumpfunktion, also zu

einer Herzinsuffizienz.

1. Einleitung 10

1.6 Die Herzinsuffizienz

Eine Herzinsuffizienz liegt vor, wenn die Auswurfleistung des Herzens nicht mehr

ausreicht, die Peripherie mit genügend sauerstoffreichem Blut zu versorgen (41).

Die Herzinsuffizienz ist eine der häufigsten internistischen Erkrankungen. In den

westlichen Ländern treten pro Jahr 1-4/1000 Neuerkrankungen auf (42). Prävalenz und

Inzidenz nehmen mit dem Alter deutlich zu (42).

Die Ätiologie dieser Erkrankung ist sehr vielfältig. So können perikardiale,

myokardiale, endokardiale Störungen, Veränderungen der Klappen oder der großen

Gefäße ursächlich sein. Nach der EPICAL-Studie sind koronare Herzkrankheit und

dilatative Kardiomyopathie die beiden häufigsten Ursachen einer Herzinsuffizienz (43).

Die Einteilung der Herzinsuffizienz erfolgt nach ursächlichen, zeitlichen und

wirkungsorientierten Gesichtspunkten. Man unterscheidet eine Rechts- und

Linksherzinsuffizienz, systolische und diastolische Insuffizienz, High- und Low-output-

Herzinsuffienz oder ein Vorwärts- und Rückwärtsversagen (44). Dem zeitlichen Verlauf

nach wird eine akute und eine chronische Herzinsuffizienz unterschieden. Gerade im

späteren Verlauf der Erkrankung gehen die einzelnen Formen ineinander über.

Eine erniedrigte Auswurfleistung in den Körperkreislauf zieht eine Reihe komplexer

Anpassungsmechanismen nach sich. Wichtige Anpassungsmechanismen sind die

Aktivierung des adrenergen Systems, die Aktivierung des Renin-Angiotensin-

Aldosteron-Systems (RAAS) und die Freisetzung des antidiuretischen Hormons (ADH).

Die Folgen dieser Anpassungsmechanismen sind ein erhöhter systemischer

Gefäßwiderstand und eine verstärkte Natrium- und Wasserretention mit vermehrter

Kaliumausscheidung und Arrhythmieneigung. Die Sensibilität gegenüber

Katecholaminen ist gemindert (45).

Das klinische Bild ist geprägt von Dyspnoe, Erschöpfung, Schwäche, sowie

abdominellen und zerebralen Symptomen.

1. Einleitung 11

Zur Prognose von Patienten mit einer Herzinsuffizienz sind viele Studien durchgeführt

worden. Sie ist abhängig vom Schweregrad der kardialen Dysfunktion und von der

Therapie (46).

Sowohl die symptomatische Herzinsuffizienz als auch jede kardiale

Pumpfunktionsstörung mit einer Ejektionsfraktion von unter 40 % ist eine

Behandlungsindikation. Die symptomatische Therapie der Herzinsuffizienz hat zum

Ziel: 1. die Letalität zu senken, 2. eine Progression zu verlangsamen oder ganz zu

vermeiden, 3. die Symptome zu verringern und die Lebensqualität zu verbessern, 4. die

Hospitalisationsrate zu senken und 5. die hämodynamischen Parameter zu verbessern

(47).

Zunächst sollte eine Beseitigung der auslösenden Ursachen und eine Behandlung der

Grunderkrankung vorgenommen werden. Diese kausale Therapie kann sowohl

operative und katheterinterventionelle Maßnahmen als auch eine medikamentöse

Therapie umfassen. Bei nicht ausreichendem Effekt allgemeiner Maßnamen wie

körperlicher Schonung, Trinkmengenbegrenzung und Salzrestriktion, Einschränkung

des Alkohol- und Nikotinkonsums und angemessenem körperlichem Training kommt

die medikamentöse Therapie zum Einsatz. Die klassischen Medikamente der

Herzinsuffizienz sind Diuretika, ACE-Hemmer und Digitalisglykoside. Außerdem

stehen noch β-Rezeptor-Antagonisten und AT1-Rezeptor-Antagonisten Substanzen zur

Verfügung.

Gerade bei leichter bis mittelschwerer Herzinsuffizienz sind alle Klassen der Diuretika

gut wirksame Medikamente. Sie führen zu einer signifikanten Gewichtsabnahme und zu

einer Beschwerdebesserung (48, 49). Elektrolytverschiebungen und die Auswirkung auf

das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System können Probleme bei der Therapie der

Herzinsuffizienz bereiten.

Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer (ACE-Hemmer) wirken durch die Hemmung

des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems und den verminderten Abbau von Kininen

günstig auf die hämodynamischen Verhältnisse bei chronisch herzinsuffizienten

Patienten (50, 51). Sie senken den peripheren Gefäßwiderstand und führen so zu einem

besseren Herzzeitvolumen (HZV). In mehreren kontrollierten Studien konnte die

1. Einleitung 12

Progredienz und die Hospitalisationsrate vermindert und die Letalität signifikant

reduziert werden (52, 53). In vielen Studien hat sich auch die Gabe von ACE-Hemmern

bei Infarktpatienten als günstig erwiesen (53-55).

AT1-Rezeptor-Antagonisten sind eine sinnvolle Alternative bei Patienten mit

Nebenwirkungen unter einer Therapie mit ACE-Hemmern. Auch AT1-Rezeptor-

Antagonisten haben Einfluss auf das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System. Sie

blockieren die Wirkung von Angiotensin II an seinen Rezeptoren. Eine Studie von PITT

und Mitarbeitern (2000) hat keine Unterschiede zwischen dem ACE-Hemmer Captopril

und dem AT1-Rezeptor-Blocker Losartan bei der Therapie der Herzinsuffizienz

hinsichtlich der Gesamtsterblichkeit ergeben (56). Therapieabbrüche waren auf Grund

von Nebenwirkungen sogar signifikant weniger häufig.

In Studien konnte belegt werden, dass ß-Rezeptor-Antagonisten einen positiven Effekt

auf den Krankheitsverlauf bei herzinsuffizienten Patienten haben. ß-Blocker wirken am

Herzen negativ inotrop, negativ chronotrop und negativ dromotrop. Durch zusätzliche

Gabe eines β-Blockers zur Standardtherapie konnte eine verbesserte Pumpfunktion

erreicht werden (57, 58). Sowohl β1-selektive Adrenorezeptorblocker (z. B. Metoprolol)

(58) als auch nicht selektive β-Blocker (z. B. Carvedilol) (57) zeigen diesen Effekt.

Herzglykoside wirken direkt an der Herzmuskelzelle über eine Hemmung der Na+/K+-

ATPase. Durch die steigende Natrium-Konzentration in der Zelle wird Kalzium nicht

mehr über einen Na+/Ca2+-Antiport aus der Zelle geschleust, wodurch der intrazelluläre

Ca2+-Gehalt steigt und es zu einer verbesserten Aktin-Myosin-Wechselwirkung kommt.

Die Wirkung am Herzen wird als positiv inotrop, negativ chronotrop, negativ dromotrop

und positiv bathmotrop (gesteigerte Erregbarkeit) beschrieben. Digitalisglykoside haben

keinen Einfluss auf die Gesamtletalität, jedoch kann ihre Gabe die Anzahl der

Krankenhausaufenthalte reduzieren (59). Zu beachten ist, dass Digitalisglykoside einen

proarrhythmogenen Effekt haben können (59, 60).

Neben den hier besprochenen Wirkstoffen gib t es noch weitere Substanzklassen, die bei

der Therapie der Herzinsuffizienz eingesetzt werden können. Zu diesen Substanzen

gehören z. B. die Vasodilatatoren und die Nitrate. Außerdem kann eine begleitende

Therapie mit Antikoagulanzien oder eine antiarrhythmische Therapie notwendig sein.

1. Einleitung 13

Als weiterführende Therapiemöglichkeiten stehen die Schrittmachertherapie und die

Herztransplantation als ultima ratio zur Verfügung.

Viele systemische und kardiale Erkrankungen führen zu einer Herzinsuffizienz.

Beispiele für solche kardiale Erkrankungen sind die Herzmuskelerkrankungen

(Kardiomyopathien).

1.7 Kardiomyopathien führen zu einer Herzinsuffizienz

Kardiomyopathien sind das Myokard betreffende Erkrankungen, die mit einer

myokardialen Dysfunktion einhergehen (61). Anstelle der früheren Klassifikation in

primäre und in sekundäre Formen unterscheidet man heute nur noch die drei Basistypen

der funktionellen Beeinträchtigung: 1. die dilatative, welche die häufigste ist,

gekennzeichnet durch eine ventrikuläre Dilatation und eine kontraktile Dysfunktion, 2.

die hypertrophe, die mit einer Hypertrophie des linken Ventrikels und oft auch des

Septums einhergeht und 3. die restriktive, die durch eine Beeinträchtigung der

diastolischen Füllung charakterisiert ist. Außerdem werden noch eine arrhythmogene

Form und nicht klassifizierte Kardiomyopathien unterschieden (61). Der Begriff

spezifische Kardiomyopathie wird in der jetzigen Terminologie bei

Herzmuskelerkrankungen benutzt, die mit spezifischen kardiologischen oder

systemischen Erkrankungen einhergehen. Zu diesen Erkrankungen gehört auch die

ischämische Kardiomyopathie (61). Das klinische Erscheinungsbild der

Kardiomyopathie gleich welcher Genese ist weitestgehend identisch. Die meisten

Formen weisen die Charakteristika einer dilatativen Kardiomyopathie auf (62).

Eine dilatative Kardiomyopathie (DCM) geht mit einer Herzvergrößerung, einer

Beeinträchtigung der systolischen Pumpfunktion eines oder beider Ventrikel und den

Symptomen einer Herzinsuffizienz einher. Die dilatative Kardiomyopathie ist die

häufigste Erscheinungsform der Kardiomyopathien. Die Inzidenz der Erkrankung liegt

bei 5-8 pro 100000 Einwohner pro Jahr (62) und scheint besonders in den

1. Einleitung 14

Industrieländern steigend zu sein. Die Erkrankung tritt gehäuft bei Männern im

mittleren Lebensalter auf.

Eine Vielzahl verschiedener zytotoxischer, metabolischer, immunologischer, familiärer

und infektiöser Noxen können zu einer dilatativen Kardiomyopathie führen (62).

Alkohol, Schwangerschaft, Selenmangel, Hypophosphatämie, Hypokalzämie und

unkontrollierte Tachykardien kann eine reversible Form der DCM hervorrufen.

Klinisch fallen Patienten mit einer DCM durch Symptome einer Rechts- bzw.

Linksherzinsuffizienz auf. Sie leiden unter Dyspnoe, Müdigkeit, peripheren Ödemen

und Palpitationen.

Die meisten Patienten mit einer DCM zeigen eine unaufhaltsame Progredienz ihrer

Erkrankung. Die Prognose ist abhängig von der Ursache der Erkrankung, der Therapie

und Risikofaktoren wie Alter, Ejektionsfraktion, ventrikulären Arrhythmien und

erhöhten Katecholaminserumspiegeln, um nur einige zu nennen (62).

Die Behandlung der DCM richtet sich in erster Linie nach der Ätiologie der

Erkrankung. So sollte neben der symptomatischen Therapie ggf. auch eine Therapie der

Grunderkrankung erfolgen. Die symptomatische Therapie umfasst eine Behandlung der

Herzinsuffizienz und der eventuell aufgetretenen Herzrhythmusstörungen. Ein

dauerhaftes Überleben eines Patienten kann jedoch nur durch eine Herztransplantation

erzielt werden.

Die ischämische Kardiomyopathie (ICM) gehört zu den spezifischen Kardiomyopathien

(61). Bei der ischämischen Kardiomyopathie sind zunächst die Koronargefäße krankhaft

verändert. Koronararterien sind eine Prädilektionsstelle für die Ausbildung einer

Arteriosklerose. Risikofaktoren für diese Erkrankung sind hohes Plasma-LDL, niedriges

Plasma-HDL, Adipositas, Nikotinabusus, Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie und

eine positive Familienanamnese hinsichtlich ischämischer Ereignisse (63). Bei einer

Querschnittseinengung der Koronargefäße von etwa 75 % ist die Koronarreserve

eingeschränkt und bei 80 % ist bereits die Ruhedurchblutung des Herzens gemindert

(63). Ist die Durchblutung des Herzens nur kurzzeitig nicht ausreichend, kommt es zu

den typischen Symptomen der Angina pectoris. Dauert die Ischämie länger an, kommt

es zu einem Myokardinfarkt. Eine ischämische Kardiomyopathie entsteht durch

1. Einleitung 15

multiple kleine Infarkte, die jedoch die Entstehung dieser schwerwiegenden Erkrankung

nicht allein erklären können. Das klinische Erscheinungsbild der ischämischen

Kardiomyopathie entspricht meist dem einer dilatativen Kardiomyopathie (61).

Auch eine Vielzahl von Pharmaka kann zu einer Schädigung des Herzens mit dem

Resultat einer toxischen Kardiomyopathie führen. Zu diesen Pharmaka gehört das in der

Krebstherapie eingesetzte Anthrazyklin Doxorubicin. Hohe Dosen Doxorubicin führen

zu einer letalen Herzinsuffizienz. Neben der Gesamtdosis Doxorubicin konnten

verschiedene Risikofaktoren identifiziert werden. Hierzu gehören Bestrahlung, Alter,

vorbestehende Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Begleitmedikation (64) Auch die Art der

Applikation, ob als Bolusgabe oder Dauerinfusion, ist entscheidend. In diesem

Zusammenhang könnte auch die P-Glykoprotein-Expression im Herzgewebe eine Rolle

spielen, da Doxorubicin zu den von P-Glykoprotein transportierten Substanzen gehört.

Im nachfolgenden Teil sollen die Methoden zur Untersuchung der P-Glykoprotein-

Expression in humanem Herzgewebe besprochen werden.

2. Material und Methoden 16

2. Material und Methoden

2.1 Material

Zur Durchführung der Versuche sowie Ermittlung und Auswertung der Ergebnisse

wurden die nachstehenden Materialien verwendet. Alle Reagenzien wurden mindestens

in der Spezifikation „reinst“ oder in der höchstmöglichen kommerziell erhältlichen

Reinheit verwendet.

Chemikalien

Acrylamid Roth, Karlsruhe, Deutschland

Agarose Serva, Heidelberg, Deutschland

Ammoniumpersulfat (APS) Sigma, Steinheim, Deutschland

Bromphenolblau Sigma, Steinheim, Deutschland

Borsäure Sigma, Steinheim, Deutschland

Ethylendiaminotetraacetat (EDTA) Sigma, Steinheim, Deutschland

Ethanol J. T. Backer, Deventer, Holland

Ethidiumbromid (EB) Sigma, Steinheim, Deutschland

Formaldehyd Sigma, Steinheim, Deutschland

Formamid, deionisiert Sigma, Steinheim, Deutschland

Hydroxymethylaminomethan (Tris) Roth, Karlsruhe, Deutschland


Isopropanol Sigma, Steinheim, Deutschland

Morpholinopropansulfonsäure

(MOPS) Sigma, Steinheim, Deutschland

Natriumacetat Sigma, Steinheim, Deutschland

Natriumdodecylsulfat (SDS) Sigma, Steinheim, Deutschland

N, N, N’, N’-Tetrametylethylendiamin

(TEMED) Roth, Karlsruhe, Deutschland

Saccharose Sigma, Steinheim, Deutschland

Vistra Green Nucleic Acid Stain Amersham Pharmacia Biotech

Freiburg, Deutschland

Enzyme und Enzyminhibitoren

AMV-Reserse Transkriptase Amersham Pharmcia Biotech, Freiburg,

Deutschland

RNase –Inhibitor (RNasin) Promega, Mannheim, Deutschland

Taq-Polymerase (rekombinant) Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland

Antikörper

JSB-1 Alexis Biochemicals, Grünberg,

Deutschland


Kits für die Molekularbiologie

PeqGOLD RNAPure peqlab, Erlangen, Deutschland

Strataprep Total RNA Miniprep Kit Stratagene, Amsterdam, Niederlande

100 bp-DNA-Marker peqlab, Erlangen, Deutschland

Kits für die Immunhistochemie

Ventana NexES IHC Staining System Ventana Medical Systems, Frankfurt,

Deutschland

ABC Detection Kit Ventana Medical Systems, Frankfurt,

Deutschland

Verwendete Lösungen

1x TBE-Puffer 90 mM Tris-HCl

90 mM Borsäure

2 mM EDTA (pH 8,0)

1x TE-Puffer 10 mM TRIS-HCl (pH 8,0)

1 mM EDTA (pH 8,0)

10x Saccharose-Auftragspuffer 0,2 mM EDTA

25 % Saccharose

0,25 % Bromphenolblau


10x MOPS-Puffer 200 mM MOPS

50 mM Natriumacetat

10 mM EDTA

pH 7,0

Ethidiumbromidlösung 10 mg/ml

RNA-Ladepuffer 500 µl Formamid

166 µl Formaldehyd (37%ig)

100 µl 10x MOPS

34 µl Bromphenolblau (1% ig)

2,5 µl EB

200 µl Aqua dest.

Geräte und Verbrauchsmaterialien

Elektrophoresekammer Serva, Heidelberg, Deutschland

Elektrophoresekammer Bio Rad, München, Deutschland

Feinwaage Sartorius, Göttingen, Deutschland

Filtertips Biozym, Hess. Oldendorf, Deutschland

Floureszenzimager Storm 840 Molecular Dynamics, Krefeld,

Deutschland

Mikrodismembrator Braun, Melsungen, Deutschland

PCR System 9700 PE Applied Biosystems, Weiterstadt,

Deutschland

Personal Cycler Biometra, Göttingen, Deutschland


Pipetten Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Power Supply Biometra, Göttingen, Deutschland

Reaktionsgefäße Biozym, Hess. Oldendorf, Deutschland

Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg, Deutschland

UV-Spektrometer Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Waage Ohaus, Giessen, Deutschland

Zentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Zentrifuge Heraeus, Hanau, Deutschland


2.2 Methoden

Insgesamt standen 15 Gewebeproben aus menschlichem Herzmuskelgewebe zur

Verfügung. Alle Proben stammten aus dem linken Ventrikel. Je 5 Proben waren von

Gesunden (NF), Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie (DCM) und von

Patienten mit einer ischämischen Kardiomyopathie (ICM). Die Proben wurden mit N1-5

für gesund, D1-5 für dilatative Kardiomyopathie und I1-5 für ischämische

Kardiomyopathie bezeichnet.

2.2.1 Präparation von Gesamt-RNA aus Gewebe

Um die bei –80 °C gelagerten Gewebestücke möglichst schnell in dem für die

Präparation der RNA notwendigen Lysepuffer ohne vorheriges Auftauen

homogenisieren zu können, wurde das Gewebe in gefrorenem Zustand mit Hilfe einer

Schwingmühle (Mikrodismembrator) pulverisiert. Das Homogenat wurde anschließend

wieder bei –80 °C gelagert.

Mit dem Ziel einer hohen Reinheit wurde die RNA mit zwei verschiedenen Methoden

hintereinander jeweils einmal isoliert. Die Präparation der Total-RNA aus 60-80 mg

homogenisiertem Gewebe erfolgte durch eine Guanidinium-Isothiocyanat-Extraktion

(peqGOLD RNAPure TM Kit) gefolgt von einer Aufreinigung durch einen DNAse-

Verdau (StrataPrep Total RNA Miniprep Kit). Die vom Hersteller angegebenen

Standardprotokolle wurden hierzu teilweise verändert.

Zunächst wurde das tiefgefrorene Gewebehomogenat in der 1,5-fachen vom Hersteller

angegebenen Menge des im peqGOLD RNAPure TM Kit enthaltenen Lysepuffers unter

Zuhilfenahme einer sterilen 3 ml-Spritze und einer sterilen Kanüle vollständig gelöst.

Erst nach Abwiegen und Aufnahme des Gewebes in den Lysepuffer wurde der Versuch

bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die anschließende RNA-Präparation erfolgte mit der

jeweils 1,5-fachen Menge der einzelnen Reagenzien. Das RNA-Pellet wurde in 50 µl

RNAse-freiem Wasser resuspendiert.


Die bereits mit dem peqGOLD RNAPure TM Kit isolierte RNA wurde ein zweites Mal

über den Strataprep Kit isoliert. Hierzu wurde die isolierte und in RNAse-freiem Wasser

gelöste RNA mit dem im Kit enthaltenen Lysepuffer, ß-Merkaptoethanol und 70%igem

Ethanol versetzt und auf das RNA-Isolationsröhrchen (Fiber Matrix Spin Cup) gegeben.

Die weitere Isolation folgte der Anleitung des Herstellers. Der im Standardprotokoll

vorgesehene DNAse-Verdau wurde mit der doppelten Menge DNAse durchgeführt.

Eluiert wurde die RNA in 2 x 30 µl Elutionspuffer.

Bis zur Reversen Transkription wurde die isolierte RNA bei –80 °C gelagert.

Da bei der Reversen Transkription die RNA in einer Konzentration von 100 ng/µl

vorliegen muss, ist es notwendig die Konzentration der isolierten RNA zu bestimmen.

Die Konzentration sowohl von RNA als auch von DNA wird durch die Messung der

optischen Dichte (OD) bestimmt. Die Methode beruht auf der Absorption von Licht

durch die Nukleotide bei einer Wellenlänge von 260 nm. Durch das Einsetzen in

folgende Formel kann die Konzentration errechnet werden.

Konzentration (c) = Absorption 260 nm x Umrechnungsfaktor x Verdünnungsfaktor

Der Umrechungsfaktor für RNA beträgt 40, für dsDNA 50.

Zusätzlich wurde die Absorption bei 280 nm gemessen. Hier liegt das

Absorptionsmaximum für Proteine. Bildet man den Quotienten aus der Absorption bei

260 und 280 nm so erhält man ein Maß für den Reinheitsgrad der Probe. Dieser Wert

sollte für RNA etwa 2,0 und für DNA ungefähr 1,8 betragen. Bei einer Kontamination

der Probe mit Proteinen sinkt der Quotient deutlich ab.

Über die Integrität der RNA bzw. der DNA macht die Konzentrationsbestimmung keine

Aussage, da für die Absorption die einzelnen Nukleotide verantwortlich sind. Um

jedoch eine Aussage zur Integrität der RNA machen zu können ist es notwendig, eine

Elektrophorese durchzuführen. Wie bei einer DNA-Elektrophorese werden die

Moleküle abhängig von ihrem Molekulargewicht getrennt.

Für die Auftrennung der RNA wurde ein Formamidgel benutzt. Durch die

denaturierende Wirkung von Formaldehyd ist eine exakte Analyse der RNA möglich,


da hier die Wasserstoffbindungen, die zur Ausbildung von Sekundärstrukturen und

Aggregaten in der RNA und damit zu unterschiedlichem Laufverhalten während der

Elektrophorese führen, denaturiert werden.

Da die zytoplasmatische RNA zu 95 % aus ribosomaler RNA (rRNA) besteht, erhält

man bei der Untersuchung eukaryontischer RNA in einem Gel zwei Banden. Für RNA

eukaryontischer Zellen entstehen diese Banden durch die 28S- und die 18S-rRNA-

Moleküle. Für menschliche rRNA wurden für die 28S-rRNA Werte von 5,1 kb und für

die 18S-rRNA 1,9 kb ermittelt.

2.2.2 Umschreiben der RNA in cDNA

Da eine Amplifizierung einer bestimmten Sequenz nur auf Basis der DNA möglich ist,

musste für den weiteren Versuch eine zu der gewonnenen RNA komplementäre DNA

(cDNA) hergestellt werden. Diese Reaktion wird als Reverse Transkription (RT)

bezeichnet. Ein spezifischer oligo(dt)-Primer lagert sich zunächst am Poly-A-Schwanz

der messenger-RNA (mRNA) an. Von hier aus synthetisiert die Reverse Transkriptase

zunächst einen cDNA-Einzelstrang, der anschließend zu einem Doppelstrang ergänzt

wird. Die Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die aus

dem Avian Myeloblastosis Virus von Vögeln (AMV-Reverse Transkriptase) oder aus

dem Moloney-Mäuseleukämievirus (M-MLV-Reverse Transkriptase) gewonnen werden

kann.

Für die Reverse Transkription wurde die zuvor isolierte RNA auf 100 ng/µl verdünnt. In

die Reaktion wurden 200 ng RNA in einen 15 µl großen Ansatz eingesetzt. Die übrigen

Reaktionskomponenten des Ansatzes waren: 1x RT-Puffer, 1 µM oligo(dt)-15-Primer,

1 mM dNTPs, 9,75 Units RNasin, 6,5 µl Aqua dest. sowie 7,5 Units AMV-Reverse

Transkriptase.

Für die einzelnen Schritte der cDNA-Synthese sind unterschiedliche Temperaturen

erforderlich. Bei einem 10-minütigem Schritt bei 23 °C lagert sich zunächst der

oligo(dt)15-Primer an den Poly-A-Schwanz der mRNA an. Im nachfolgenden Schritt


über eine Stunde bei 42 °C findet die Reverse Transkription statt. Eine 5-minütige

Denaturierung des Enzyms bei 95 °C schließt die Reaktion ab.

Die gewonnene cDNA wurde bei –20 °C gelagert.

2.2.3 Vervielfältigung von cDNA-Fragmenten

Da es nicht möglich ist, die durch die RT-Reaktion gewonnen cDNA-Fragmente auf

einem Gel zu identifizieren und zu quantifizieren, müssen die gewünschten Fragmente

zunächst noch vervielfältigt werden. Dies geschieht mit der von MULLIS und

Mitarbeitern (1983) etablierten Methode zur gezielten in vitro Amplifikation von

Abschnitten definierter Länge und Sequenz der DNA bzw. der cDNA, der

Polymerasekettenreaktion (PCR) bzw. der RT-PCR (65).

Für eine PCR werden zwei synthetisch hergestellte Oligonukleotid-Primer, die den zu

amplifizierenden Teil eingrenzen, benötigt (For-Primer und Rev-Primer). Eine DNA-

Polymerase kann mit Hilfe dieser Primer nun die gewünschte DNA amplifizieren. Die

einzelnen Schritte der PCR finden bei unterschiedlichen Temperaturen statt. Die

dreistufige Reaktionsfolge wird zyklisch wiederholt.

Im ersten Schritt wird die Doppelstrang-DNA denaturiert, die DNA liegt danach also als

Einzelstrang vor. Dieser erste Reaktionsschritt benötigt 90-95 °C. Im nächsten Schritt

lagern sich die Primer an den Einzelstrang an (Annealing). Die Bedingungen für die

Primeranlagerung sind abhängig von der Länge und Zusammensetzung der Primer.

Nach erfolgreichem Annealing der Primer findet nun die eigentliche Synthese der DNA

statt. Die Strangverlängerung (Elongation) durch Anlagerung der Einzelnukleotide

(Desoxynukleotidtriphosophat = dNTP`s) am freien 3`-OH-Ende wird bei einem

Reaktionsoptimum von 72 °C von der DNA-Polymerase katalysiert. Meistens wird als

DNA-Polymerase die Taq-Polymerase, die aus dem thermophilen Bakterium Thermus

aquaticus gewonnen wird, verwendet. Eine wichtige Anforderung an die Taq-

Polymerase ist eine Thermostabilität während des Denaturierungsschrittes. Nach der


Elongation erfolgt wieder eine Temperaturerhöhung auf 95 °C, die DNA denaturiert

erneut. Der beschriebene Zyklus beginnt von vorne.

Die bei der PCR eingesetzten Primer sind zuvor von BORDOW und Mitarbeitern

(1994) beschrieben worden (66). Die Primer für P-gp waren:

For-Primer 5’-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3’

Rev-Primer 5’-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3’

Ein mit diesen Primern amplifiziertes PCR-Fragment umfasst 157 bp der P-gp-cDNA-

Sequenz. (Bindungsstellen und Sequenz siehe Kapitel 7. Anhang)

Neben der Vervielfältigung eines Fragmentes der P-gp-cDNA-Sequenz wurde als

interne Kontrolle ein Fragment der cDNA für die Glycerinaldehyd-3-phosphat-

Dehydrogenase (GAPDH) hergestellt (66). Die Primer für GAPDH waren:

For-Primer 5’-TTGGGAAGGTGAAGGTCGGA-3’

Rev-Primer 5’-GAAGGGGTCATTGATGGCAA-3’

Hier wurde ein 110 bp langes Fragment der GAPDH-cDNA-Sequenz vervielfältigt.

Um eine quantitative Aussage mit einer PCR machen zu können, muss berücksichtigt

werden, dass sich die Anzahl der PCR-Produkte mit jedem Zyklus verdoppelt. Limitiert

wird diese Verdopplung durch den Verbrauch der Reagenzien. Trägt man das PCR-

Produkt logarithmisch gegen die Anzahl der Zyklen auf, so erhält man eine sigmoidale

Kurve. Im flachen Bereich dieser Kurve (Plateau) kommt es trotz steigender Zyklenzahl

zu keiner Vermehrung der PCR-Produkte mehr. Um die Expressionsstärke messen zu

können muss eine Zyklenzahl gewählt werden, bei der es noch zu einer Vermehrung des

PCR-Produktes kommt. Die gewählte Zyklenzahl muss also im aufsteigenden Teil der

Kurve liegen. Aus diesem Grund wurden bei der PCR für das P-gp-Fragment 31 und für

das GAPDH-Fragment 28 Zyklen durchlaufen.


Tab. 2.1: Reaktionsansatz zur Vervielfältigung der entsprechenden P-gp- bzw. GAPDH-Fragmente mittels PCR

P-gp GAPDH

cDNA 1 µg 1 µg

dNTPs 0,08 mM 0,08 mM

Reaktionspuffer 1x 1x

MgCl2 2 mM 1,25 mM

For-Primer 50 pmol 50 pmol

Rev-Primer 50 pmol 50 pmol

Taq-Polymerase 1,25 Units 1,25 Units

Aqua dest. ad 50 µl ad 50 µl

Temperaturabfolge für P-gp:

95 °C 2 min Denaturierung

60 °C 1 min Annealing

72 °C 1 min Elongation

31 Zyklen 95 °C 30 sek Denaturierung






4 °C bis zur Probenentnahme


Temperaturabfolge für GAPDH:




28 Zyklen 95 °C 30 sek Denaturierung






4 °C bis zur Probenentnahme

Das entstandene PCR-Produkte wurde bei 4°C gelagert. Zur Auswertung wurde eine

Gelelektrophorese angefertigt.

2.2.4 Gelelektrophorese der PCR-Produkte

Zur Identifizierung von amplifizierten DNA-Fragmenten nutzt man die Eigenschaften

der Elektrophorese aus. Hier ist die Größe und Ladung eines Fragmentes entscheidend

für die Wandergeschwindigkeit. Durch die angelegte Spannung wandert die negativ

geladene DNA zur positiv geladenen Anode, jedoch können kleinere Fragmente

schneller durch das Trägermaterial gelangen als große. Die Wandergeschwindigkeit

hängt aber nicht nur von der Größe und Form des Fragmentes, sondern auch von der

Porengröße des zu durchwandernden Trägermaterials, des gewählten Laufpuffers und

der Anwesenheit interkalierender Farbstoffe ab.

Agarose ist das wichtigste Trägermaterial zur Elektrophorese von Nukleinsäuren.

Agarose ist ein Polymer aus verschieden verknüpften Galaktoseeinheiten.

Abhängig von der Konzentration der Agarose lassen sich bei niedrigen Konzentrationen

große Fragmente und bei hohen Konzentrationen kleine Fragmente am besten


auftrennen. Da P-gp 157 bp und GAPDH 110 bp zählt, wurde zur Auftrennung ein

höher konzentriertes (3%iges) Agarosegel gewählt. Als Laufpuffer stehen Tris-Acetat-

(TAE)- oder Tris-Borat-(TBE)-Puffer zur Verfügung. In den Versuchen wurde TBE-

Puffer verwendet.

Die Bestimmung der Länge der zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle erfolgt durch

einen Vergleich mit einem geeigneten Längenstandard, der DNA-Fragmente definierter

Länge enthält.

Durch die Interkalation von Ethidiumbromid (3,8-Diamino-5-ethyl-

phenylphenanthridiumbromid) in die DNA kommt es zu einer Fluoreszenzverstärkung

des Ethidiumbromids, wodurch eine optische Auswertung durch ultraviolettes Licht

möglich ist. Ethidiumbromid wird dem Gel und dem Laufpuffer in einem Anteil von

0,01 % zugesetzt. Licht bei einer Wellenlänge von 254-366 nm (ultraviolettes Licht)

führt in der interkalierten DNA zur Emission von Licht einer längeren Wellenlänge

(590 nm). Dieses wird mit einer Kamera aufgenommen und durch verschiedene

Farbabstufungen wiedergegeben.

Zur praktischen Herstellung wird Agarose in 1xTBE-Puffer durch mehrmaliges

Erhitzen gelöst, mit der entsprechenden Menge Ethidiumbromid versetzt und auf einen

Gelträger aufgebracht.

Die Proben wurden mit 1/10 Volumen Saccharose-Auftragspuffer versetzt und in die

Taschen aufgetragen. Saccharose erhöht die Dichte der DNA und verhindert so ein

Herausdiffundieren aus der Tasche in den Laufpuffer. Dem Auftragspuffer noch

zugesetztes Bromphenolbau läuft während der Elektrophorese mit der DNA zur Anode

und markiert so die bisher zurückgelegte Laufstrecke.

Die angelegte Spannung betrug zwischen 100 und 120 V über einen Zeitraum von 1 ½

bis 2 h.

Ein weiteres Trägermaterial, das für eine Elektrophorese zur Verfügung steht, ist das

Acrylamid. Polyacrylamidgele sind chemisch inert und sehr stabil. Durch

Copolymerisation von Acrylamidmonomeren mit einem Vernetzer wie z. B.

Ammoniumpersulfat (APS) entsteht ein klares und stabiles Gel mit guter Auftrennung.

Die Polymerisation erfolgt unter Luftabschluss, da es durch Sauerstoff zu einem


Kettenabbruch kommen würde. Deshalb werden diese Gele als Horizontalgele zwischen

zwei Glasplatten gegossen. Die anschließende Elektrophorese wurde 4 bis 5 h bei 160 V

durchgeführt. Nachteile dieses Verfahrens sind die kompliziertere Handhabung im

Gegensatz zu den Agarosege len und die Dermato- und Neurotoxizität des Acrylamids

vor der Polymerisation. Entscheidender Vorteil ist jedoch das höhere

Auflösungsvermögen.

Als Laufpuffer wird wie bei Agarosegelen der TBE-Puffer verwendet.

Um das Ergebnis sichtbar machen zu können, muss das Gel anschließend noch gefärbt

werden. Hierzu stehen neben Ethidiumbromid auch neuere weniger mutagene

Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfügung. Verwendet wurde hier der Farbstoff Vistra Green,

der durch Licht der Wellenlänge von 497 nm optimal angeregt wird, und ein

Emissionsmaximum von 520 nm hat. Der Farbstoff besitzt zusätzlich ein weiteres

Absorptionsmaximum bei 254 nm.

Detektiert wurden die Ergebnisse mit dem Fluoreszenzimager (Storm 840).

2.2.5 Immunhistochemische Darstellung von P-Glykoprotein

In Vorbereitung auf die Immunhistochemie wurde ein ca. 3 x 3 mm großes

Gewebestück zunächst 24 Stunden in 4%igem Formalin fixiert und anschließend in

Paraffin eingebettet. Von diesen Paraffinblöcken wurden mit Hilfe des Ventana NexEs

IHC Staining Systems Paraffinschnitte von 2 µm Dicke hergestellt.

Die technischen Arbeiten im Zusammenhang mit der Immunhistochemie wurden von

den Mitarbeitern des Institutes für Pathologie durchgeführt.

Die Immunhistochemie ist eine Methode zur Lokalisation von Proteinen und anderen

Substanzen im Gewebe.

Die Reaktion wurde am fixierten Gewebeschnitt mit der APAAP-Methode (Alkaline

Phosphatase anti-alkaline Phospathase-Methode) durchgeführt (67). Diese Methode

wurde bereits 1984 von der Arbeitsgruppe von CORDELL und Mitarbeitern

beschrieben. Benutzt wurde der monoklonale Maus-Antikörper Anti-P-Glykoprotein-


Antikörper JSB-1 in einer Konzentration von 1:20. JSB-1 ist ein Antikörper der

Subklasse IgG1. Die Epitope, gegen die sich JSB-1 richtet, sind zytoplasmatische

Epitope von P-gp (68). Als Zweitantikörper wurde der Anti-Maus-Antikörper aus dem

ABC Detection Kit in einer Verdünnung von 1:100 eingesetzt. Als Positivkontrolle

wurde humanes Nierengewebe verwendet.

2.2.6 Statistische Auswertung der Ergebnisse

Die mittels Fluoreszenzimager (Storm 840) registrierten Ergebnisse der RT-PCR

wurden mit den Programmen Image Quant, Excel und Prism ausgewertet. Es wurde

zunächst das Verhältnis der ermittelten Volumina von P-gp zu GAPDH gebildet und

anschließend der Mittelwert aus den errechneten Verhältnissen gebildet.

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem ungepaarten t-Test (einseitig).

Die mikroskopische Auswertung der Immunhistochemie erfolgte bei einer 200-fachen

Vergrößerung. Sie umfasste eine getrennte Betrachtung der Arteriolen und der

Kapillaren. Die Intensität der Anfärbung wurde in drei Kategorien eingeteilt: nicht

gefärbt (-), schwache Färbung (+) und starke Färbung (++). Die Auswertung der Proben

erfolgte in Unkenntnis der Krankheitsentität.

Es wurde die Anzahl ausgezählter Kapillaren bzw. Arteriolen einer Expressionsstärke in

Relation zu allen ausgezählten Kapillaren bzw. Arteriolen des gesamten Schnittes

gesetzt und so der prozentuale Anteil ermittelt.

3. Ergebnisse 31

3. Ergebnisse

Insgesamt standen 15 Gewebeproben aus menschlichem Herzmuskelgewebe zur

Verfügung. Je 5 Proben waren von Gesunden (NF), Patienten mit einer dilatativen

Kardiomyopathie (DCM) und von Patienten mit einer ischämischen Kardiomyopathie

(ICM). Die Proben wurden mit N1-5 für gesund, D1-5 für dilatative Kardiomyopathie

und I1-5 für ischämische Kardiomyopathie bezeichnet.

3.1 Isolation von RNA aus Herzgewebe

Unabdingbare Voraussetzung für die Untersuchung der P-gp-mRNA-Expression ist die

Präparation ausreichender Mengen intakter RNA aus dem Herzgewebe. Um die

Integrität der isolierten RNA zu überprüfen wurde ein denaturierendes Formamidgel

angefertigt. Das Gel zeigt die für eukaryonte Zellen charakteristischen beiden Banden

der 18S und 28S ribosomalen RNA.

Abb. 3.1: Denaturierendes Formamidgel zur Überprüfung der Integrität der isolierten RNA am Beispiel der Proben I1 und I2.

← 28 S

← 18 S

3. Ergebnisse 32

3.2 Ergebnisse der RT-PCR

Aus humanem Herzmuskelgewebe isolierte RNA wurde durch Reverse Transkription in

komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben und anschließend ein für MDR1

spezifisches cDNA-Fragment (157 bp) mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

amplifiziert (66).

Als interne Kontrolle wurde ein 110 bp langes cDNA-Fragment der Glycerinaldehyd-3-

phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) benutzt (66).

Nach Auftrennung des Reaktionsansatzes mittels Elektrophorese in einem 3%igen

Agarosegel zeigen sich die beiden amplifizierten PCR-Produkte im theoretisch

errechneten Bereich von 110 bp für GAPDH und 157 bp für P-gp.

Abb. 3.2: 3%iges Agarose-Gel mit Darstellung des 110 bp großen Fragmentes für GAPDH und des 157 bp großen P-gp-Fragmentes am Beispiel der Probe I5. In Bahn 1 ist der ein Marker (100 bp) aufgetragen, Bahn 2 ist die Negativkontrolle und Bahn 3 die Positivkontrolle (Plazenta-cDNA), Bahn 4 ist frei, Bahn 5 und 6 zeigen die Probe I5.

110 bp 157 bp

100 bp

200 bp

Kontrollen - / +

}

Probe I5

}

1 2 3 4 5 6

3. Ergebnisse 33

Zur besseren Beurteilung und quantitativen Auswertung wurde der gleiche

Reaktionsansatz durch eine Elektrophorese mit einem 8%igem Polyacrylamidgel

aufgetrennt.

Abb. 3.3: Im Polyamid-Gel aufgetrennte Proben. Bahn 1 zeigt den Marker, Bahn 2-6 enthält die Proben D1-D5, Bahn 7-11 die Proben N1-N5 und Bahn 12-16 zeigt I1-I5. Die Positiv- (Plazenta) und Negativkontrolle ist in Bahn 17 und 18 zu sehen.

Zur Minimierung von zufälligen Fehlern wurde für jede Probe eine Zwei- oder

Dreifachbestimmung angefertigt. Tabelle 3.1 zeigt die Einzelwerte, die Mittelwerte und

die Standardabweichung der gewonnenen Ergebnisse.

Die Werte zeigen, dass alle Gewebeproben P-gp enthalten, die interindividuellen

Unterschiede aber sehr stark ausgeprägt sind. Die Werte reichen von einem Verhältnis

P-gp zu GAPDH von 0,029 (D3) bis zu 0,514 (N2).

Der Vergleich der Daten untereinander ergibt: Patienten mit einer dilatativen

Kardiomyopathie haben im Mittel eine deutlich verminderte Expression des

Transportproteins P-gp im Vergleich mit gesunden oder an einer ischämischen

Kardiomyopathie erkrankten Personen. Diese Verringerung der P-gp-Expression hat

sich in beiden Fällen als statistisch signifikant (p < 0,05) erwiesen.

Vergleicht man die Gruppe der ischämischen Kardiomyopathien mit den Werten der

gesunden Personen, so zeigen diese beiden Gruppen nur sehr geringe Unterschiede in

der durchschnittlichen P-gp-Expression.

100 bp

200 bp P-gp

GAPDH

D1-D5 N1-N5 I1-I4 Kontrolle

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

3. Ergebnisse 34

Tab. 3.1: Aufstellung über die mit der RT-PCR gewonnen Ergebnisse. Gezeigt werden die Einzelwerte, die Mittelwerte und die Standardabweichung aus dem Verhältnis P-gp zu GAPDH.

Probe

rel. P-gp-

Expression

(P-gp/GAPDH)

Mittelwe rt

(P-gp/GAPDH) Standardabweichung

DCM

0,141

± 0,082

D1 0,184

D2 0,117

D3 0,029

D4 0,248

D5 0,125

NF 0,339 ± 0,168

N1 0,221

N2 0,514

N3 0,5

N4 0,328

N5 0,133

ICM 0,326 ± 0,111

I1 0,370

I2 0,230

I3 0,270

I4 0,5

I5 0,260

3. Ergebnisse 35

P-gp - Expression im Herzen

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

DCM NF ICM

rela

tive

P-g

p-E

xpre

ssio

n be

zoge

n au

f G

AP

DH

Abb. 3.4: Vergleich der einzelnen Patientengruppen untereinander. Der relative Gehalt an mRNA wurde aus den Mittelwerten der einzelnen Patienten errechnet. (Mittelwert ± Standardabweichung, * p < 0,05)

*

*

3. Ergebnisse 36

3.3 Ergebnisse der Immunhistochemie

Die in Formalin fixierten Gewebestücke wurden im Institut für Pathologie in Paraffin

eingebettet, 2 µm dicke Schnitte hergestellt und maschinell immunhistochemisch mit

dem monoklonalen Antikörper JSB 1 gegen P-gp gefärbt.

Zur Beurteilung der Stärke der Anfärbung wurden drei Qualitäten unterschieden. Diese

Qualitäten sind keine Anfärbung (-), schwache Anfärbung (+) und starke Anfärbung

(++). Jedes Gefäß eines Präparates wurden einer dieser Qualitäten zugeordnet. Die

Stärke der Anfärbung entspricht dem Grad der Proteinexpression.

Abb. 3.5: Mit dem monoklonalen Antikörper JSB-1 gegen P-gp immunhistochemisch gefärbter Paraffinschnitt. Zu sehen ist eine starke P-gp-Expression (++) entlang des Endothels eines Gefäßes.

3. Ergebnisse 37

Abb. 3.6: Mit dem Antikörper JSB-1 immunhistochemisch gefärbter Paraffinschnitt. Zu sehen ist eine P-gp-Expression mittlerer Stärke (+) im Endothel der mit dem Pfeil markierten Kapillare.

Abb. 3.7: Mit dem Antikörper JSB-1 immunhistochemisch gefärbter Paraffinschnitt. In dem mit einen Pfeil markierten Gefäß ist keine P-gp-Expression (-) erkennbar.

Das Diagramm (Abb. 2.5) und die Tabelle (Tab. 3.2) zeigen die Verteilung der drei

Qualitäten innerhalb der Gruppe der Kapillaren. Die Verteilung in den Präparaten der

3. Ergebnisse 38

Gesunden und der Personen mit einer ischämischen Kardiomyopathie sind nahezu

gleich. Es finden sich ca. 36-37 % nicht anfärbte Kapillaren, etwa 60 % schwach

angefärbte und um die 1-5 % stark anfärbte. Dagegen sind in der Gruppe der dilatativen

Kardiomyopathien 86 % der Kapillaren nicht angefärbt, nur 14 % weisen eine schwache

Anfärbung auf.

Tab. 3.2: Auswertung der Immunhistochemie für die Kapillargefäße. Die einzelnen Patientengruppen sind zusammengefasst und die Anzahl der Zuordnungen in jede Expressiongruppe ist in absoluten Zahlen und in Prozent angegeben.

Proben ausgewertete

Kapillargefäße absolut in Prozent

DCM

134

D - 115 86 %

D + 19 14 %

D ++ 0 0 %

NF 137

N - 49 36 %

N + 81 59 %

N ++ 7 5 %

ICM 148

I - 55 37 %

I + 92 62 %

I ++ 1 1 %

3. Ergebnisse 39

P-gp-Expression in Kapillaren

0

20

40

60

80

100

120

DCM NF ICM

P-gp

-Exp

ress

ion

in %

keine Expression

geringe Expression

starke Expression

Abb. 3.8: Säulendiagramm zur P-gp-Expression in den unterschiedlichen Patientengruppen. Betrachtet werden nur die Kapillargefäße.

P-gp-Expression in Arteriolen

0

20

40

60

80

100

120

DCM NF ICM

P-gp

-Exp

ress

ion

in %

keine Expressiongeringe Expressionstarke Expression

Abb. 3.9: Säulendiagramm zur P-gp-Expression in den unterschiedlichen Patientengruppen. Betrachtet werden nur die Arteriolen.

3. Ergebnisse 40

In der Gruppe der Arteriolen zeigen die Präparate der Gesunden und der Personen mit

ischämischen Kardiomyopathie keine so ausgeprägten Gemeinsamkeiten wie in der

Gruppe der Kapillaren. Etwa die Hälfte der Arteriolen lässt sich schwach anfärben,

21 % sind nicht angefärbt und 11 % sind stark angefärbt. Die Arteriolen der Patienten

mit einer ischämischen Kardiomyopathie dagegen weisen zum größten Teil (92 %) eine

schwache Expression auf, 8 % sind nicht anfärbbar. Präparate von Patienten mit einer

dilatativen Kardiomyopatie zeigen zu 79 % keine Anfärbung, nur in 21 % der Fälle lag

eine schwach Expression vor (Abb. 3.9 und Tab.3.3).

Tab. 3.3: Auswertung der Immunhistochemie für die Arteriolen. Die einzelnen Patientengruppen sind zusammengefasst und die Anzahl der Zuordnungen in jede Expressionsgruppe ist in absoluten Zahlen und in Prozent angegeben.

Proben ausgewertete

Arteriolen absolut in Prozent

DCM

28

D - 22 79 %

D + 6 21 %

D ++ 0 0 %

NF 48

N - 10 21 %

N + 26 54 %

N ++ 12 25 %

ICM 39

I - 3 8 %

I + 36 92 %

I ++ 0 0 %

3. Ergebnisse 41

Betrachtet man Arteriolen und Kapillaren zusammen, so zeigt sich, dass in den

Gewebeproben der Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie nur eine sehr

geringe Expression gefunden wird. 85 % der Gefäße weisen keine P-gp-Expression auf.

Dagegen wird in Herzproben von Gesunden und in denen der Patienten mit einer

ischämischen Kardiomyopathie in mehr als der Hälfte der Gefäße eine zumindest

schwache Expression gefunden. Gesunde zeigen in 10 % sogar eine starke Expression

(Abb. 3.10 und Tab. 3.3).

Tab. 3.3: Auswertung der Immunhistochemie für die Arteriolen und Kapillare. Auch hier sind die einzelnen Patientengruppen zusammengefasst und die Anzahl der Zuordnungen in jede Expressionsgruppe ist in absoluten Zahlen und in Prozent angegeben.

Proben ausgewertete Arteriolen

und Kapillaren absolut in Prozent

DCM

162

D - 137 85 %

D + 25 15 %

D ++ 0 0 %

NF 185

N - 59 32 %

N + 107 58 %

N ++ 19 10 %

ICM 187

I - 58 31 %

I + 128 68 %

I ++ 1 1 %

3. Ergebnisse 42

P-gp-Expression in Arteriolen und Kapillaren

0

20

40

60

80

100

120

DCM NF ICM

P-gp

-Exp

ress

ion

in %

keine Expressiongeringe Expression starke Expression

Abb. 3.10: Säulendiagramm zur P-gp-Expression in den unterschiedlichen Patientengruppen. Dargestellt sind Arteriolen und Kapillare zusammen.

In der vorliegenden Arbeit konnte die Expression von P-Glykoprotein in humanem

Herzmuskelgewebe gezeigt werden. Die Expression des MDR1-Genproduktes konnte

sowohl auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR als auch auf Proteinebene mit der

Immunhistochemie gezeigt werden. Mittels Immunhistochemie ist P-Glykoprotein in

den Endothelzellen des Herzmuskelgewebes lokalisiert worden. Hinsichtlich der

Expression bei unterschiedlichen Krankheitsformen konnte eine signifikante

Verminderung (p = 0,05) bei Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie

verglichen mit gesunden Patienten beobachtet werden.

4. Diskussion 43

4. Diskussion

Abb. 4.1: Anatomische Zeichnung des menschlichen Herzens mit makroskopischer und mikroskopischer Ausschnittsvergrößerung (69, 70). Das histologische Bild zeigt quer angeschnittene Herzmuskelbündel, dazwischen liegt eine Kapillare.

Diese Arbeit beschreibt die Expression und Lokalisation des MDR1-Genproduktes P-

Glykoprotein in humanem Herzgewebe. Sowohl die mRNA als auch das Protein konnte

in allen 15 Herzproben detektiert werden. Die immunhistochemische Aufarbeitung der

Proben hat eine Lokalisation des P-Glykoproteins in den Arteriolen und Kapillaren

nicht aber in den Venen ergeben.

Zum Nachweis von P-Glykoprotein sind bisher sowohl Verfahren auf RNA-Ebene, als

auch Methoden zum direkten Nachweis des Proteins bekannt (14, 18, 66, 71). Die In-

4. Diskussion 44

situ-Hybridis ierung und die RT-PCR weisen die entsprechende mRNA nach, wobei die

In-situ-Hybridisierung die mRNA lokalisieren kann, aber mit der RT-PCR quantitative

Aussagen besser zu treffen sind. Mit Antikörpern, die gegen das gesuchte Protein

gerichtet sind, arbeiten Immunhistochemie und Western Blot. Quantitative Aussagen

können mit dem Western Blot gemacht werden, allerdings ist diese Methode weniger

sensitiv als die RT-PCR. Die Immunhistochemie lokalisiert das Protein im

Gewebeschnitt, quantitative Aussagen sind mit dieser Methode, wie auch mit der In-

situ-Hybridisierung, schwerer zu treffen.

Für diese Arbeit wurde ein Verfahren auf RNA-Ebene, die semiquantitative RT-PCR,

und ein Verfahren auf Protein-Ebene, die Immunhistochemie, gewählt.

Nachdem P-Glykoprotein in Herzmuskelgewebe von Ratten mittels RT-PCR gefunden

wurde (72), konnte die vorliegende Arbeit das Vorhandensein von P-gp-mRNA

erstmals mittels RT-PCR in humanem Herzgewebe zeigen. Die semiquantitative RT-

PCR wurde auf Basis der Experimente der Arbeitsgruppe von BORDOW und

Mitarbeitern (1994) durchgeführt (66). Es konnte gezeigt werden, dass alle Proben das

Transportprotein P-Glykoprotein enthalten. Die interindividuellen Unterschiede sind

aber groß.

Die Methode der Immunhistochemie an humanem Herzmuskelgewebe ist bereits von

THIEBAUT und Mitarbeitern (1989) und von CORDON-CARDO und Mitarbeitern

(1990) beschrieben worden (18, 73). CORDON-CARDO und Mitarbeiter (1990) und

THIEBAUT und Mitarbeiter (1989) haben eine Expression in den Kardiomyozyten und

nicht in den Gefäßen beschrieben (18, 73). Bei Untersuchungen von CORDON-

CARDO und Mitarbeitern (1990) wurde der Antikörper C 219 eingesetzt (18). Die

glatte Muskulatur zeigte keine Färbung, der Skelettmuskel zeigte eine heterogene

Expression bei der Darstellung mit C 219. Auch THIEBAUT und Mitarbeiter (1989)

konnten dieses Ergebnis nachvollziehen und eine Expression im myokardialen Gewebe

und im Skelettmuskelgewebe registrieren (73). Im weiteren Verlauf ihrer

Untersuchungen hat sich aber herausgestellt, dass dieses Ergebnis auf einer

Kreuzreaktion zwischen dem Antikörper C219 und den schweren Ketten des Myosins

4. Diskussion 45

beruht. Mit den Antikörpern HYB-241 und HYB-612 kamen weder das Myokard noch

die Gefäße zur Darstellung (18).

Der monoklonale Antikörper JSB 1 ist zuvor erfolgreich bei der immunhistochemischen

Darstellung von P-Glykoprotein zum Beispiel in Kapillaren des Gehirns (74), im

Endometrium und weiblichen Genitaltrakt (75, 76) und im hämatopoetischen System

(77) verwandt worden. Jedoch konnten RAO und Mitarbeiter (1995) neben der

Darstellung von P-Glykoprotein auch Kreuzreaktionen von JSB 1 zu anderen Strukturen

feststellen (78). Diese Strukturen konnten als mitochondrale Pyruvat-Carboxylase in

Ratten- und Rinderlebern identifiziert werden. Auch in humanem Gewebe konnten

Kreuzreaktionen in Skelettmuskelgewebe, einem Gewebe, das keine P-gp-Expression

aufweist, gezeigt werden.

Die Immunhistochemie wurde an 2 µm dicken Paraffinschnitten mit der APAAP-

Methode durchgeführt (67). P-Glykoprotein konnte eindeutig in den Endothelien der

Arteriolen und Kapillaren der Präparate lokalisiert werden. Die Venen wiesen keine

Expression auf. In den Kardiomyozyten selbst konnte keine Expression nachgewiesen

werden. Eine Kreuzreaktion, die zu einer falsch positiven Lokalisation führt, kommt

deshalb unserer Meinung nach nicht in Betracht.

In vielen Arbeiten konnte P-Glykoprotein nicht nur in Tumorgewebe, sondern auch in

gesundem Gewebe nachgewiesen werden. So wurde P-Glykoprotein bisher in

stoffwechsel- und ausscheidungsaktiven Organen wie der Leber, Niere und Darm

nachgewiesen (14, 18). Auch der Nachweis in der Blut-Hirn-Schranke und im Hoden

(Blut-Hoden-Schranke) gelang (18, 79). Gestützt auf diese Ergebnisse wurde P-

Glykoprotein eine Schutzfunktion zugeschrieben (13, 18). Wie unsere Untersuchungen

gezeigt haben, wird auch im Herzen P-Glykoprotein im Endothel der Arteriolen und

Kapillaren exprimiert. Dieses Ergebnis deutet auf eine Schutzfunktion hin, wie sie auch

für den Hoden und das Gehirn angenommen wird (13). Es könnte so verhindert werden,

dass Substrate, die das Myokard schädigen könnten, aus dem Blut durch das Endothel

zu den Kardiomyozyten gelangen.

Im Vergleich hat sich ein signifikanter Unterschied der P-Glykoprotein-Expression bei

Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie und Gesunden herausgestellt. Gesunde

4. Diskussion 46

und Proben von Patienten mit einer ischämischen Kardiomyopathie zeigen keine

Unterschiede. Die gezeigte Signifikanz der unterschiedlichen Expression ist sehr

kritisch zu sehen, da diesen Resultaten nur eine sehr gering Probenanzahl je

Erkrankungsgruppe (n = 5) zugrunde liegt. Um eine wirkliche Signifikanz feststellen zu

können, sind größere Untersuchungen notwendig. Der Einfluss von Krankheiten auf die

Expression von P-gp an menschlichen Herzen ist bisher noch nicht Gegenstand großer

Untersuchungen gewesen.

Auch bei anderen Erkrankungen haben sich Unterschiede in der Expression von P-

Glykoprotein gezeigt. So konnten YACYSHYN und Mitarbeiter (1999) eine

Verminderung von P-Glykoprotein in Darmlymphozyten bei Patienten mit einer Colitis

ulcerosa gegenüber Patienten mit einem Morbus Crohn und Gesunden zeigen (80).

Neben den Unterschieden zwischen den einzelnen Patientengruppen haben die

Untersuchungen große interindividuelle Schwankungen in der Höhe der Expression

ergeben. Dieses Ergebnis könnte zum Beispiel Resultat genetischer Varianz sein.

HOFFMEYER und Mitarbeiter (2000) und CASCORBI und Mitarbeiter (2001)

beschreiben mehrere Mutationen im MDR1-Gen, von denen einige auch mit einer

veränderten Funktion einhergehen (81, 82). Dies wäre auch mit einer individuell

unterschiedlichen Kardiotoxizität bei einer Therapie mit Anthrazyklinen vereinbar. Zum

anderen sind auch Umwelteinflüsse bekannt, die zu einer Modulation der

P-Glykoprotein-Expression führen können. Ein Beispiel für eine solche Modulation ist

die Einnahme von Rifampicin, das die Expression von P-Glykoprotein zumindest im

Darm erhöhen kann (39, 40). GREINER und Mitarbeiter (1999) konnten an acht

gesunden Probanden eine signifikante Verminderung des Digoxinserumspiegel bei der

gleichzeitigen Einnahme von Rifampicin beobachten (40). Diese Verminderung der

Digoxinserumspiegel korrelierte mit einem Anstieg der P-gp-Expression im Duodenum

der Probanden. Eine vermehrte Ausscheidung über die Niere, welche ja auch durch die

Induktion von P-gp denkbar wäre, konnte nicht bestätigt werden (40). WESTPHAL und

Mitarbeiter haben bei einer ähnlich konzipierten Studie mit Rifampicin und Talinolol

zeigen können, dass es auch bei intravenöser Zufuhr von Talinolol zu einer Sekretion

4. Diskussion 47

ins Darmlumen kommt. Diese Verminderung der Talinololspiegel korrelierte auch hier

wieder mit dem Anstieg der P-gp-Expression im Duodenum der Probanden (39).

Aber nicht nur eine Induktion durch MDR1-Modulatoren, sondern auch eine Blockade

ist als Medikamenteninteraktion relevant. Klinisch relevante Interaktionen sind

zwischen dem Antiarrhythmikum Chinidin und dem Herzglykosid Digoxin beschrieben

(83). So führt die zusätzliche Gabe von Chinidin bei Digoxin-behandelten Patienten

regelmäßig zu erhöhten Digitalisserumspiegeln und den Symptomen einer

Digitalisvergiftung (84). Zunächst wurde für diese Feststellung eine vermehrte

Absorption im Darm (85), eine verminderte Ausscheidung über Niere und Galle

verantwortlich gemacht (86). Untersuchungen von FROMM und Mitarbeitern (1999)

konnten an Mäusen zeigen, dass es sich um eine Interaktion durch Chinidin als

P-Glykoprotein-Inhibitor und Digoxin als Substrat für P-Glykoprotein handelt (87).

Weitere Interaktionen zwischen MDR1-Modulatoren und Digoxin, die auf P-

Glykoprotein zurück geführt werden konnten, sind Interaktionen mit Verapamil (88,

89), Cyclosporin A (90), Propafenon (91) und Itraconazol (92).

Die kardiale Toxizität von Zytostatika, wie z. B. Anthrazyklinen, ist ein wichtiger

Faktor bei der Behandlung von Malignomen. Bei einer Gesamtdosis von mehr als

500 mg/m² Körperoberfläche kann sich eine Kardiomyopathie mit Herzversagen

entwickeln (93). VAN ASPEREN und Mitarbeiter (1999) konnten eine verstärkte

Akkumulation von Doxorubicin in Herzen von homozygoten mdr1a-/- Mäusen zeigen

(19). Den umgekehrten Fall zeigt eine mit Gentherapie an Mäusen durchgeführte

Studie. Eine hohe Expression von P-gp korreliert mit der Abwesenheit von

degenerativen Veränderungen nach der Applikation von Doxorubicin (94). Bei der

Therapie von resistent gewordenen Tumoren hat sich die Comedikation mit MDR1-

Inhibitoren in Tierversuchen als hilfreich erwiesen (95). MILLER und Mitarbeiter

konnten bei Patienten mit resistent gewordenen Tumoren, die P-Glykoprotein

exprimierten, durch die zusätzliche Gabe von Verapamil als MDR1-Inhibitor bei der

Chemotherapie Erfolge verzeichnen (37). Jedoch konnten CAYRE und Mitarbeiter

(1996) eine signifikant erhöhte Konzentration von Daunomyocin in Anwesenheit von

MDR1-Inhibitoren wie z. B. Verapamil, PSC 833 oder S 9788 in kardialen Zellen

4. Diskussion 48

beobachten (72). Diese Untersuchungen legen den Verdacht nahe, dass eine verminderte

Expression von P-Glykoprotein bzw. eine Modulation durch MDR1-Inhibitoren mit

einer erhöhten Gefährdung für das Myokard einhergehen (19, 72).

Da unsere Arbeit zeigen konnte, dass die Arteriolen und Kapillaren des Herzens P-

Glykoprotein exprimieren, sind auch am Herzen Interaktionen, wie sie in anderen

Organen durch P-Glykoprotein vorkommen, denkbar. Bedeutend ist dies vor allem

deswegen, weil viele Substrate des ABC-Transporters P-Glykoprotein potente

Wirkstoffe bei der Pharmakotherapie von Herzerkrankungen sind (23, 32). Auch

Substanzen wie das Anthrazyklin Doxorubicin, die das Herz massiv schädigen können,

sind Substrate von P-Glykoprotein. Durch Wechselwirkungen dieser Substanzen könnte

die lokale Konzentration im Herzen moduliert werden. Durch die Induktion von P-

Glykoprotein könnte z. B. die Konzentration am Wirkort Herz niedrig gehalten werden.

Eine mögliche Folge wäre eine nicht ausreichende Wirkung eines Medikamentes. Auf

der anderen Seite könnte eine Blockade von P-Glykoprotein die lokale Konzentration

im Herzen anheben. Daraus resultieren könnte eine verstärkte, sogar toxische Wirkung.

Besonders gefährlich kann dies in der Malignomtherapie mit Doxorubicin werden.

Durch die Gabe von MDR1-Inhibitoren wie PSC 833 oder Verapamil um eine P-

Glykoprotein-vermittelte Tumorresistenz rückgängig zu machen, könnte das Herz

großen Schaden nehmen. Die Blockade von P-Glykoprotein als Schutzmechanismus am

Herzen könnte zu einer massiven Erhöhung der lokalen Toxizität von Doxorubicin

führen. Es droht eine letale Herzinsuffizienz als Folge einer toxischen Kardiomyopathie.

Wie P-Glykoprotein wird auch Proteinen der MRP-Familie (Multidrug Resistance-

associated Protein) eine Rolle bei der Resistenzentwicklung und Detoxifikation von

Substanzen zugeschrieben (96). Diese Proteine sind genau wie P-gp ATP-abhängige

Transportproteine, die den Transport von Substanzen aus der Zelle katalysieren (96, 97).

FLENS und Mitarbeiter (1996) beschreiben bei einer immunhistochemischen

Darstellung von MRP1 eine Expression im Herzmuskelgewebe selbst (98). Die

Endothelien der Herzmuskelgefäße ließen sich nicht darstellen.

THUM und Mitarbeiter konnten in letzter Zeit mehrere Isoenzyme des Cytochrom P450

in humanem Herz nachweisen (99). Cytochrome sind wichtige Monooxygenasen bei der

4. Diskussion 49

Biotransformation von Arzneimitteln. Das für die Metabolisierung von β-Blockern sehr

wichtige Cytochrom 450 2D6 konnte ausschließlich im rechten Ventrikel detektiert

werden. Ob auch P-Glykoprotein eine solche regional unterschiedliche Verteilung

aufweist, konnten unsere Untersuchungen nicht klären, da alle zu unserer Verfügung

stehenden Herzgewebeproben aus dem linken Ventrikel stammten. Auch in

Kardiomyozytenkulturen von Ratten ließen sich viele Cytochrom P450-Isoenzyme

nachweisen (100).

In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals die Expression von P-Glykoprotein mittels

RT-PCR an humanem Herzgewebe gezeigt werden. Zusätzlich wurde P-gp an allen

Proben immunhistochemisch dargestellt. Damit ist neben der genetischen Ebene auch

die tatsächliche Expression des Proteins bestätigt worden. Die Lokalisation von P-gp in

den Endothelien der Arteriolen und Kapillaren lässt, wie auch in Gehirn und Hoden,

eine Schutzfunktion vor toxischen Stoffen annehmen.

Da viele Pharmaka in der Herztherapie Substrate von P-Glykoprotein sind, bedeutet

dies für die Praxis, dass nicht nur aus dem Serumspiegel eine mögliche Voraussage über

die Wirkungsstärke und Effizienz einer Therapie gewonnen werden kann, sondern auch

Stoffwechsel und Transportleistungen auf Ebene des Zielorgans zu berücksichtigen

sind. Die individuell sehr stark unterschiedliche Expression von P-Glykoprotein liefert

möglicherweise einen Beitrag zum besseren Verständnis der individuellen Wirkung und

Effizienz einer Pharmakotherapie bei verschiedenen Menschen und auch bei

verschiedenen Erkrankungen. Durch eine auf den jeweiligen Patienten mit seinen

Besonderheiten in der Expression von Enzymen und auch Transportsystemen

angepasste Therapie könnte eine Pharmakotherapie langfristig erfolgreicher und

risikoärmer sein.

5. Zusammenfassung 50

5. Zusammenfassung

Bei der Aufnahme von Arzneimitteln in Zellen spielen Transportprozesse eine große

Rolle. Das ATP-abhängige Transportprotein P-Glykoprotein ist häufig in Resistenzen

gegenüber Arzneimitteln involviert. Zunächst wurde dieser Effekt in P-Glykoprotein-

überexprimierenden Tumoren entdeckt. Später sind auch viele gesunde Gewebe, die P-

gp enthalten, identifiziert worden. Einige dieser Substanzen, die von P-Glykoprotein

transportiert werden, sind vielverwendete Medikamente bei der Therapie von

Herzerkrankungen. Für das unterschiedliche Ansprechen von Patienten auf diese

Medikamente könnte die individuelle Expression von P-Glykoprotein im Herzen eine

entscheidende Rolle spielen.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Expression von P-Glykoprotein an

15 humanen Herzmuskelgewebeproben untersucht. Zum einen wurde hierzu die

Methode der RT-PCR gewählt. Mit ausgewählten Primern wurde ein entsprechendes

Stück der P-Glykoprotein-cDNA-Sequenz vervielfältigt und anschießend durch eine

Gelelektrophorese ausgewertet. Zum anderen wurde der Nachweis der P-Glykoprotein-

Expression auf Proteinebene mittels immunhistochemischer Darstellung erbracht. Für

diesen Versuch wurde der monoklonale Antikörper JSB1 verwendet.

Die Expression von P-Glykoprotein in humanem Herzmuskelgewebe konnte an allen

Proben gezeigt werden. Bei der Immunhistochemie ist P-Glykoprotein in den

Endothelzellen des Herzmuskelgewebes lokalisiert worden. Hinsichtlich der Expression

bei verschiedenen Krankheiten konnte bei Patienten mit einer dilatativen

Kardiomyopathie eine signifikante Verminderung (p = 0,05) beobachtet werden.

Die in dieser Dissertation erbrachten Ergebnisse zeigen eine Beteiligung des Herzens an

Stoffwechsel- und Transportprozessen. Die Arbeit könnte somit einen Beitrag zum

besseren Verständnis von Interaktionen und zur Aufklärung von individuell

unterschiedlichen Wirkungen bei der Pharmakotherapie leisten.

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7. Anhang 65

7. Anhang

In der nachfolgenden Abbildung ist die cDNA-Sequenz des humanen P-Glykoproteins

(P-gp) nach CHEN und Mitarbeitern (1996) sowie die Lage der für die RT-PCR

eingesetzten Primer (blau) dargestellt (7).

Abb. 7.1: cDNA-Sequenz des humanen P-Glykoproteins. Blau dargestellt die Primer, rot das während der PCR zwischen den Primern synthetisierte Stück.

1 cctactctat tcagatattc tccagattcc taaagattag agatcatttc tcattctcct

61 aggagtactc acttcaggaa gcaaccagat aaaagagagg tgcaacggaa gccagaacat

121 tcctcctgga aattcaacct gtttcgcagt ttctcgagga atcagcattc agtcaatccg

181 ggccgggagc agtcatctgt ggtgaggctg attggctggg caggaacagc gccggggcgt

241 gggctgagca cagcgcttcg ctctctttgc cacaggaagc ctgagctcat tcgagtagcg

301 gctcttccaa gctcaaagaa gcagaggccg ctgttcgttt cctttaggtc tttccactaa

361 agtcggagta tcttcttcca agatttcacg tcttggtggc cgttccaagg agcgcgaggt

421 cgggatggat cttgaagggg accgcaatgg aggagcaaag aagaagaact tttttaaact

481 gaacaataaa agtgaaaaag ataagaagga aaagaaacca actgtcagtg tattttcaat

541 gtttcgctat tcaaattggc ttgacaagtt gtatatggtg gtgggaactt tggctgccat

601 catccatggg gctggacttc ctctcatgat gctggtgttt ggagaaatga cagatatctt

661 tgcaaatgca ggaaatttag aagatctgat gtcaaacatc actaatagaa gtgatatcaa

721 tgatacaggg ttcttcatga atctggagga agacatgacc aggtatgcct attattacag

781 tggaattggt gctggggtgc tggttgctgc ttacattcag gtttcatttt ggtgcctggc

841 agctggaaga caaatacaca aaattagaaa acagtttttt catgctataa tgcgacagga

901 gataggctgg tttgatgtgc acgatgttgg ggagcttaac acccgactta cagatgatgt

961 ctctaagatt aatgaagtta ttggtgacaa aattggaatg ttctttcagt caatggcaac

1021 atttttcact gggtttatag taggatttac acgtggttgg aagctaaccc ttgtgatttt

1081 ggccatcagt cctgttcttg gactgtcagc tgctgtctgg gcaaagatac tatcttcatt

1141 tactgataaa gaactcttag cgtatgcaaa agctggagca gtagctgaag aggtcttggc

1201 agcaattaga actgtgattg catttggagg acaaaagaaa gaacttgaaa ggtacaacaa

1261 aaatttagaa gaagctaaaa gaattgggat aaagaaagct attacagcca atatttctat

1321 aggtgctgct ttcctgctga tctatgcatc ttatgctctg gccttctggt atgggaccac

1381 cttggtcctc tcaggggaat attctattgg acaagtactc actgtattct tttctgtatt

7. Anhang 66

1441 aattggggct tttagtgttg gacaggcatc tccaagcatt gaagcatttg caaatgcaag

1501 aggagcagct tatgaaatct tcaagataat tgataataag ccaagtattg acagctattc

1561 gaagagtggg cacaaaccag ataatattaa gggaaatttg gaattcagaa atgttcactt

1621 cagttaccca tctcgaaaag aagttaagat cttgaagggc ctgaacctga aggtgcagag

1681 tgggcagacg gtggccctgg ttggaaacag tggctgtggg aagagcacaa cagtccagct

1741 gatgcagagg ctctatgacc ccacagaggg gatggtcagt gttgatggac aggatattag

1801 gaccataaat gtaaggtttc tacgggaaat cattggtgtg gtgagtcagg aacctgtatt

1861 gtttgccacc acgatagctg aaaacattcg ctatggccgt gaaaatgtca ccatggatga

1921 gattgagaaa gctgtcaagg aagccaatgc ctatgacttt atcatgaaac tgcctcataa

1981 atttgacacc ctggttggag agagaggggc ccagttgagt ggtgggcaga agcagaggat

2041 cgccattgca cgtgccctgg ttcgcaaccc caagatcctc ctgctggatg aggccacgtc

2101 agccttggac acagaaagcg aagcagtggt tcaggtggct ctggataagg ccagaaaagg

2161 tcggaccacc attgtgatag ctcatcgttt gtctacagtt cgtaatgctg acgtcatcgc

2221 tggtttcgat gatggagtca ttgtggagaa aggaaatcat gatgaactca tgaaagagaa

2281 aggcatttac ttcaaacttg tcacaatgca gacagcagga aatgaagttg aattagaaaa

2341 tgcagctgat gaatccaaaa gtgaaattga tgccttggaa atgtcttcaa atgattcaag

2401 atccagtcta ataagaaaaa gatcaactcg taggagtgtc cgtggatcac aagcccaaga

2461 cagaaagctt agtaccaaag aggctctgga tgaaagtata cctccagttt ccttttggag

2521 gattatgaag ctaaatttaa ctgaatggcc ttattttgtt gttggtgtat tttgtgccat

2581 tataaatgga ggcctgcaac cagcatttgc aataatattt tcaaagatta taggggtttt

2641 tacaagaatt gatgatcctg aaacaaaacg acagaatagt aacttgtttt cactattgtt

2701 tctagccctt ggaattattt cttttattac atttttcctt cagggtttca catttggcaa

2761 agctggagag atcctcacca agcggctccg atacatggtt ttccgatcca tgctcagaca

2821 ggatgtgagt tggtttgatg accctaaaaa caccactgga gcattgacta ccaggctcgc

2881 caatgatgct gctcaagtta aaggggctat aggttccagg cttgctgtaa ttacccagaa

2941 tatagcaaat cttgggacag gaataattat atccttcatc tatggttggc aactaacact

3001 gttactctta gcaattgtac ccatcattgc aatagcagga gttgttgaaa tgaaaatgtt

3061 gtctggacaa gcactgaaag ataagaaaga actagaaggt gctgggaaga tcgctactga

3121 agcaatagaa aacttccgaa ccgttgtttc tttgactcag gagcagaagt ttgaacatat

3181 gtatgctcag agtttgcagg taccatacag aaactctttg aggaaagcac acatctttgg

3241 aattacattt tccttcaccc aggcaatgat gtatttttcc tatgctggat gtttccggtt

3301 tggagcctac ttggtggcac ataaactcat gagctttgag gatgttctgt tagtattttc

3361 agctgttgtc tttggtgcca tggccgtggg gcaagtcagt tcatttgctc ctgactatgc

mdr1 for. Primer

mdr1 rev. Primer

7. Anhang 67

3421 caaagccaaa atatcagcag cccacatcat catgatcatt gaaaaaaccc ctttgattga

3481 cagctacagc acggaaggcc taatgccgaa cacattggaa ggaaatgtca catttggtga

3541 agttgtattc aactatccca cccgaccgga catcccagtg cttcagggac tgagcctgga

3601 ggtgaagaag ggccagacgc tggctctggt gggcagcagt ggctgtggga agagcacagt

3661 ggtccagctc ctggagcggt tctacgaccc cttggcaggg aaagtgctgc ttgatggcaa

3721 agaaataaag cgactgaatg ttcagtggct ccgagcacac ctgggcatcg tgtcccagga

3781 gcccatcctg tttgactgca gcattgctga gaacattgcc tatggagaca acagccgggt

3841 ggtgtcacag gaagagatcg tgagggcagc aaaggaggcc aacatacatg ccttcatcga

3901 gtcactgcct aataaatata gcactaaagt aggagacaaa ggaactcagc tctctggtgg

3961 ccagaaacaa cgcattgcca tagctcgtgc ccttgttaga cagcctcata ttttgctttt

4021 ggatgaagcc acgtcagctc tggatacaga aagtgaaaag gttgtccaag aagccctgga

4081 caaagccaga gaaggccgca cctgcattgt gattgctcac cgcctgtcca ccatccagaa

4141 tgcagactta atagtggtgt ttcagaatgg cagagtcaag gagcatggca cgcatcagca

4201 gctgctggca cagaaaggca tctatttttc aatggtcagt gtccaggctg gaacaaagcg

4261 ccagtgaact ctgactgtat gagatgttaa atacttttta atatttgttt agatatgaca

4321 tttattcaaa gttaaaagca aacacttaca gaattatgaa gaggtatctg tttaacattt

4381 cctcagtcaa gttcagagtc ttcagagact tcgtaattaa aggaacagag tgagagacat

4441 catcaagtgg agagaaatca tagtttaaac tgcattataa attttataac agaattaaag

4501 tagattttaa aagataaaat gtgtaatttt gtttatattt tcccatttgg actgtaactg

4561 actgccttgc taaaagatta tagaagtagc aaaaagtatt gaaatgtttg cataaagtgt

4621 ctataataaa actaaacttt catgtg

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine

anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe.

Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden.

Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass

eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.

Christiane Karsten

Lebenslauf

Name: Christiane Karsten

Geburtsdatum: 24.03.1976

Geburtsort: Mönchengladbach

Anschrift: Brüggstr. 14, 17489 Greifswald

Eltern: Wolfgang F. Karsten und Elke Karsten, geb. Tutt

Schulischer Werdegang:

1981-1986 Grundschule in North Tarrytown (USA), Neuss und

Mönchengladbach

1986-1996 Gymnasium an der Gartenstraße, Mönchengladbach

13.06.1996 Allgemeine Hochschulreife

Beruflicher Werdegang:

seit 1996 Medizinstudium an der Ernst-Moritz-Arndt-Universität,

Greifswald

23.09.1998 Ärztliche Vorprüfung

31.08.1999 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

18.09.2001 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Famulaturen: Praxis für Anästhesie

Chirurgische Klinik des Maria Hilf Krankenhauses,

Mönchengladbach

Klinik für Pädiatrische Hämatologie / Onkologie, Münster

Klinik für Neurologie, Greifswald

Klinik für Innere Medizin, Kardiologie, Greifswald

Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Kroemer für die Vergabe des interessanten

Themas, die wertvollen Anregungen und die Ausbildung in seinem Institut.

Für die wissenschaftliche Betreuung, die ständige Bereitschaft Fragen zu diskutieren

und die damit verbundenen vielen Denkanstöße, bedanke ich mich bei den Herren Dr.

Sperker und Dr. Meissner.

Des weiteren danke ich Frau Kalb für ihre hilfreichen Ratschläge und die Betreuung bei

den praktischen Arbeiten.

Herrn Prof. Dr. Warzok und den Mitarbeitern des Instituts für Pathologie der Ernst-

Moritz-Arndt-Universität möchte ich an dieser Stelle Dank sagen für die

immunhistochemische Aufarbeitung meiner Proben.

Nicht zuletzt bedanke ich mich bei allen Diplomanden und Doktoranden für die

Anregungen und Tipps und der Freude bei der Anfertigung dieser Arbeit.

Ein herzlicher Dank gilt schließlich meinen Eltern für die liebevolle Unterstützung in

allen Phasen meines Studiums und meiner Dissertation, aber auch dafür, dass sie mir

mein Studium ermöglichten.

Expression und Lokalisation von P-Glykoprotein in humanem ... fileDie Endlosigkeit des...

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