FiloviridiaeFiloviridiaeEbolaEbola und Marburg Virusund Marburg Virus

EinleitungGeschichte, Aktualität

Die Krankheit Infektion, Symptome, Behandlung und Impfstoff, Prävention von Epidemien

Das VirusKlassifizierung, Genom, Morphologie und Struktur, Die virale Proteine

Die Glycoproteine von Ebola

GliederungGliederung

1967 Marburg (31/7), Affen aus Uganda1976 Ausbruch am Ebola-Fluss in Zaïre (Kongo) (318/280) 1976/79 Sudan (284/150), Sudan (34/22)1989 Ausbruch in Reston, VA; Affen aus den Phillipinen (4/0)1994 Einzelfall an der Elfenbeinküste (1/0) , neuer Subtyp1994/96 Gabun (44/28), (98/66)1995 Kikwit (Zaire) (315/244)1998-2000 Marburgvirus: Kongo (149/123)2000 Uganda (425/224)Okt. 2004 Marburgvirus: weltweit schlimmste Epidemie von HF,

in Angola, dauert immer noch an! (337/311 am 18. Mai)Mai 2005 Kongo: Verdacht, 9 Tote (17.5)

GeschichteGeschichte

Der BundDer Bund am Mittwoch, 11. Mai 2005am Mittwoch, 11. Mai 2005

EbolaEbola HämorrhagischesHämorrhagisches Fieber (EHF)Fieber (EHF)In Menschen und einigen PrimatenNatürliches Reservoir noch immer unbekanntAusbrüche selten und unvorhersehbarInfektion: direkter Kontakt mit infizierten Körper-

flüssigkeiten (Blut, Exkremente, Speichel, Erbrochenes etc.) und Tröpfcheninfektion

Sterblickeitsraten: 25-100%Inkubationszeit: 2-16 Tage

Die KrankheitDie KrankheitAllgemeines und InfektionAllgemeines und Infektion

Plötzlicher Beginn

3-9Tage: Grippeähnliche Symptome - Hohes Fieber, Kopf-und Muskelschmerzen

Nach 1 Woche: Ausschlag, Übelkeit, Durchfall

Dann: Hämorrhagisches Fieber - Haut- und Schleimhautblutungen, Zerstörung kapillarer Blutgefässe

Tod: durch Schock, Blutungen im Gastrointestinaltrakt, Milz und Lunge, durch Organschäden

Oder Genesung: langsam, kann von Gelbfieber, Hepatitis und Myelitis begleitet sein

Die KrankheitDie KrankheitSymptomeSymptome

Behandlung: Möglichkeiten limitiertsymptomatische Behandlung

Desinfektion: zerstört durch UV, γ, Hypochlorit-und phenolische Desinfektionsmittel

GenPhar: 1. Nov. 2004

zur Zeit erste Tests an Menschen

Die KrankheitDie KrankheitBehandlung und ImpfstoffBehandlung und Impfstoff

Die KrankheitDie KrankheitPrävention von EpidemienPrävention von Epidemien

Quarantäne von Infizierten, Kontrolle von KontaktenSterile Spritzen und AusrüstungBehandelnde: Handschuhe, undurchlässige Kleidung, Gesichts- und Augenschutz, Bein- und SchuhbedeckungKremierung der Toten

Das VirusDas VirusKlassifizierungKlassifizierung

Reich

Ordnungdazu gehören:

Familie

Gattungen

(-) ss RNA Viren

MononegaviralesRhabdoviren, Paramyxoviren

Filoviridiae

Marburg (1 Spezies)Ebola (4 Spezies) :

Zaire, Sudan, Elfenbeinküste, Reston

Das VirusDas VirusDas GenomDas Genom

Grösstes Genom der Mononegavirales7 Gene identifiziert, Überlappungen (Funktion unbekannt)Ebola 3 Overlaps, Marburg 1 OverlapTranskription und Replikation: im Cytoplasma der infizierten ZelleVolle Länge (+)RNA wird synthetisiert und davon Nackommen (-)RNA

(-) sense ss RNAunsegmentiert19kb langA/U reich1.1% des Virionsist Nukleinsäure

Lange, zylinderförmige, filamentöse Partikel

Pleiomorph: gerade, gekrümmt, geringelt, „6“- oder „U“-förmig und verzweigt

Behüllt: Sprossung der Viren durch Zellmembran führtzu umhüllten Viren

Helikales Capsid (Durchmesser 50nm, Periodizität 5nm)

Durchmesser 80nm

Länge variabel (130-14‘000 nm)grösste Infektiosität: 790nm (Marb.)/970 nm (Ebola)

Das VirusDas VirusMorphologie und StrukturMorphologie und Struktur

Ribonucleoprotein ComplexNP Nucleocapsid StrukturproteinVP30 Minor nucleoprotein, RNA bindendVP35 lose, Transcriptase Complex ? L RNA-abhäng. Polymerase

Membran-assoziierte ProteineVP40 Matrix-ProteinVP24 Fkt. Unbekannt, ev. uncoatingGP Integrales Membranprotein

Oberflächen Spikes, glykosyliert7nm, 10nm Abstand

SekretiertsGP sekretierte Form des GP

Das VirusDas VirusDie Die viralenviralen ProteineProteine

GP Gen: hat Stop Codon in der Mitte → verhindert Synthese von Full-Length Protein1. Genprodukt: truncated GP, 60kDa, wird sekretiert (sGP)Funktion: unbekannt (Bindung von AK od Liganden auf T-Zellen?)

Transcriptional Editing: Insertion eines A → Frameshift2. Genprodukt: ganzes Protein, 130 kDa, Transmembran-FormFunktion: Bindung an Rezeptor und Vermittlung der Penetration

Prozessierung von GP: Synthese von 676AS ProteinSignalpeptid (N-terminale 32 AS) entferntER: N-Glykosylierung → pre-GPGolgi: vollständige Glykosylierung GP0Furin convertase: GP1 (130kDa) & GP2 (24kDa)

Die Die GlycoproteineGlycoproteine von von EbolaEbolaTranskription, Transkription, TranslationTranslation, Prozessierung, Prozessierung

Die Die GlycoproteineGlycoproteine von von EbolaEbolaDie Die GlycoproteineGlycoproteine und Penetrationund Penetration

Penetrationsmechanismus: nach wie vor unbekannt!Rezeptor auf Wirtszelle: Unbekannt!Targets des Virus: Makrophagen und Neutrophile, vaskuläre Endothelzellen, Leber- und Nierenzellen

Hypothese: GP1 verantwortlich für RezeptorbindungGP2 vermittelt Fusion mit Wirtszelle (pH?)

Welche ASWelche AS--Reste sind verantwortlich für Reste sind verantwortlich für die Bindung des Rezeptors?die Bindung des Rezeptors?

Die Die GlycoproteineGlycoproteine von von EbolaEbolaManicassamy et al: Comprehensive Analysis of Ebola Virus GP1

in Viral Entry, J Virol. 2005;79:4793-805.

Konstrukte:Deletionsmutanten mittelsPCR-directed mutagenesis

Problem: Sicherheit beim Arbeiten mit EbolaPseudotypisierung: Assoziation eines Virus mit fremden HüllproteinenExperimentell:Kotransfektion von wt od. mut. GP1 mit Luc-E--R--HIV vector in 293TIsolation der pseudotypisierten Viren aus dem Überstand nach 24-48h

Die Die GlycoproteineGlycoproteine von von EbolaEbolaManicassamy et al: Comprehensive Analysis of Ebola Virus GP1

in Viral Entry, J Virol. 2005;79:4793-805.

Assay für Infektiosität:Infektion von 293T‘s od. HeLa‘smit pseudotypis. VirenLyse nach 48h nach InfektionMessung der Luciferase Aktivität

Resultat:Nur Δ12 und Δ13 vermitteln Penetration des Virus in die ZellenD.h. die N-terminalen 230 Reste sind dafür notwenig!

Wo könnten Rezeptor-Binding Sites sein?Alanin-Substitutionen durch site-directed Mutagenese (Quick-Change)Assay mit Luciferase-Aktivität wie oben beschriebenAS-Reste 33-185 verantwortlich für Rezeptor-Erkennung