Fluoreszenzpolarisation

Vortrag im Modul

biophysikalische Methode

Kathrin Helwig und

Franziska Schramm

Gliederung

• Einführung • Aufbau • Grundlagen• Vorgehensweise der Messung• Fluorophore • Vor- und Nachteile• Anwendungsbeispiele• Literatur

Einführung

• weitverbreitete Messtechnik in der biophysikalischen Chemie

• 1926 entwickelt

• Analyse von molekularen Bindungen

Einführung

• Beobachtung der molekularen Bewegung fluoreszierender Moleküle in Lösung

• direkte, nahezu momentane Messung

• Heutige Anwendung für die Wechselwirkungsstudien bspw.DNA-DNA-, DNA-Protein-, Protein-Protein-Bindungen

Aufbau

Grundlagen

Grundlagen

Grundlagen

Vorgehensweise der Messung

• Messung der Polarisation einer Lösung fluoreszenz-markierter Liganden

FP1

• Zugabe einer Probelösung mit bestimmter Konzentration in kleinen Voluminas, Inkubation FP2

• ΔFP = FP2- FP1 Änderung des molekularen Volumens

Vorgehensweise der Messung

• Wiederholung für verschiedene Konzentrationen der Probelösung

• Graphische Darstellung der Probenkonzentration-ΔFP-Beziehung

• Temperatur konstant halten

• Gesamtzeit der Messung: ~ 5 min

Fluorophore

ONH

N

CO2C2H5

H

BODIPY (Borandipyrromethandifluorid)

Fluorescein

Rhodamin 6G

N

B

N

F FR

Vor- und Nachteile

• homogene Technologie

• Reaktionen sind sehr schnell (Sekundenbereich) zur GGW-Einstellung

• Reagenzien sind stabil

• große Ansätze können gemacht werden

Vor- und Nachteile

• hohe Reproduzierbarkeit • keine Abtrennungsschritte• hoch automatisierte Technik • keine Waschschritte steigert Genauigkeit

schnellere Messung

weniger Abfall

• Limitiert auf kleine Molekulargewichte

Anwendung

DNA-DNA-WW

• Information über DNA-Proben nach Hybridisierung

• Oligothyminderivate mit EDA oder HMDA und FITC verwendet

Anwendung

Anwendungen

• Polarisationsmessungen markierter Antigene

• Polarisation einer Mischung: aus Polarisation freier und gebundener Antigene und deren relative Fluoreszenzintensität

FPIA: Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays

Anwendungen

• Bsp.: Antigen= Hormon Cortisol, Fluophor = Fluorescein

• Mischung aus fluoreszenzmarkierten Cortisol und spezif. Antikörper Zugabe von reinem Cortisol Verdrängung des markierten Antigens

Messung der Polarisation Bestimmung der Cortisolkonzentration, die von den Antikörper gebunden wurden und der Antikörperkonzentration

Anwendung

• Enzyme Activity Imaging

Literatur

• K.Kakehi et al.,Fluorescence polarization: Analysis of Carbohydrate-Protein-Interaction, Analyt.Biochem., 2001, 297, 111-116

• W.J.Checovich et al., Fluorescence poalrization-a new tool for cell and molecular biology, nature, 1995, 375, 254-256

• Xiangning Chen et al.: Fluorescence Polarization in Homogeneous Nucleic Acid Analysis, Genome Res. 1999, 9, 492-498

• www.biotek.de• www.jolley.com • www.iss.com• http://probes.invitrogen.com/handbook/boxes/1572.html• Murakami et al., Fluorescent-labeled oligonucleotide probes:

detection of hybrid formation in solution by fluorescence polarization spectroscopy, Nucleic Acids Research, 1991, 19 (15), 4097-4102

• W. Schmidt, Optische Spektroskopie, 2000, 2.Auflage, Wiley-VCH, S. 212 ff

Ende