Forschungsberichte Labor für Tumorimmunologie · neuartige Methode zur Gewinnung von Anti-körpern...

Forschung für das Leben 47

Forschungsberichte Labor für Tumorimmunologie

Laser- und Immunologie-Forschungseinrichtungen

Einleitung

Krebs ist nach Erkrankungen des Herzkreis-laufsystems die zweithäufigste Todesursache in den westlichen Industrienationen. Die Ge-fährlichkeit der Krebserkrankung ist bedingt durch das unkontrollierte, invasive Wachstum der Tumorzellen, insbesondere aber durch die Fähigkeit zur Metastasenbildung in Kombina-tion mit einer fehlenden oder unzureichenden Reaktion der körpereigenen Abwehr. Obwohl Tumorzellen weniger immunogen als Patho-gene sind (es ist schwer für das Immunsystem, die geringen Unterschiede zwischen gesundem Gewebe und Tumorgewebe zu erkennen), hat eine überwältigende Zahl von experimentellen und klinischen Befunden gezeigt, dass das Im-munsystem eindeutig in der Lage ist, Tumor-zellen zu erkennen und abzutöten. Als beson-ders immunogen haben sich im Menschen Me-lanome und Nierentumoren erwiesen. Allerdings gelingt es den Tumorzellen häufig, durch Tarnung oder durch Manipulation des Immunsystems der Immunabwehr zu entkommen und Tumoren zu bilden. Auch beobachtet man oft eine Schwächung des Immunsystems des Patienten durch die fortgeschrittene Tumorerkrankung.

Die Tumorimmunologie hat sich zur Aufgabe gemacht, die körpereigenen Abwehrmechanis-men zu erforschen und neue Wege zu finden, die Zellen des Immunsystems oder Tumorzel-len gezielt therapeutisch zu beeinflussen, um Krebserkrankungen zu bekämpfen. Aufgrund der immer besseren technischen Möglichkeiten und dem damit verbundenen enormen Wissens-zuwachs wurde in den letzten Jahren eine Reihe von neuen Immuntherapien erarbeitet und in der Klinik getestet. Hierzu gehören Therapien mit Zytokinen (körpereigene Botenstoffe zur gezielten Beeinflussung von Immunzellen oder Tumorzellen), Tumor-vakzinen (Impfstoffe zur spezifischen Stimulation der Immunabwehr), adoptive Zelltherapien (Immunzellen des Patienten werden außerhalb des Körpers stimuliert, vermehrt und reinfundiert), sowie Antikörper-therapien (Hemmung oder Zerstörung von Tu-morzellen durch selektive Bindung von Anti-körpern). Einen neuen Aspekt der Tumorimmunologie stellt die immun-therapeutische Wirkung von Photodynamischer Therapie (PDT) dar. Sie erlaubt die Tötung von Tumorzellen mit Hilfe von Photosensibili-satoren nach Lichtbestrahlung bei gleich-zeitiger Stimulation einer Tumorimmun-antwort.

Das aufgrund von wissenschaftlichen Untersu-chungen der letzten Jahre entwickelte Konzept der Tumorstammzelle wird auch Einfluss auf die Entwicklung von Tumorimmuntherapien nehmen. Die für den Fortbestand und Metasta-sierung verantwortlichen Tumorstammzellen machen nur einen sehr geringen Bruchteil der Tumormasse aus. Sie zeigen in vielen Fällen eine ausgeprägte Unempfindlichkeit gegenüber Chemo- und Strahlentherapie und werden daher für das Wiederauftreten des Tumors nach zunächst erfolgreich erscheinender Therapie verantwortlich gemacht.

Die Erfahrungen mit auftretenden Resistenzen bei neuen Wirkstoffen (niedermolekulare Kina-seinhibitoren, sog. small molecule drugs), die gezielt aufgrund der Kenntnis molekularer Vorgänge bei der Krebsentstehung entwickelt wurden, zeigen, dass Krebs wahrscheinlich nur erfolgreich mit Kombinationstherapien be-kämpft werden kann. Daher wird auch der Im-muntherapie ein wichtiger Stellenwert zukom-men, da die Resistenzmechanismen für immun-therapeutische und Small-molecule-drug-Therapieansätzen sehr verschieden sein dürften und so eine Kreuzresistenz von Tumoren ver-mieden werden kann.

Die Forschungsaktivitäten im Labor für Tu-morimmunologie (LTI) betreffen hauptsächlich urologische Tumoren, insbesondere Nieren- und Prostatatumoren. Für die Entwicklung und Verbesserung der Immuntherapie solider Tumoren forschen wir auf folgenden Gebieten:

• Identifizierung und Evaluierung von antige-nen Zielstrukturen

Ziel: Herstellung von polyvalenten Tumor-vakzinen für die adjuvante Tumortherapie

• Identifizierung von Immune-escape-Strate-gien in Tumoren

Ziel: Verständnis der Tumortoleranz des Immunsystems; neue therapeutische An-sätze

• Evaluierung von neuen Immuntherapien im Tiermodell (z. B. Stimulation von Anti-Tu-morimmunreaktionen durch PDT)

Ziel: Grundlage für klinische Versuche

• Immunphänotypisierung von Immun- und Chemotherapie-resistenten Tumorzellen (Tumorstammzellen?)

Ziel: Therapeutische Adressierung von Tu-morstammzellen


• Identifizierung, rekombinante Herstellung und Expression von Tumor-erkennenden Rezeptoren zytotoxischer T-Zellen (TCR) - Designer-T-Zellen

Ziel: Umgehung von Toleranz und Suppres-sionsphänomenen durch Überexpression der TCR in T-Zellen von Patienten

• Entwicklung, Optimierung und Testung von Tumorvakzinen (gentechnisch modifizierte allogene Tumorzellvakzine; mit Tumoranti-genen beladene dendritische Zellen (DC) als Tumorvakzine; Erhöhung der Immuno-genität von Tumorantigenen)

Ziel: Klinische Testung und Therapieopti-mierung

• Weiterentwicklung von standardisierten Methoden zum immune monitoring

Ziel: Überprüfung der Wirksamkeit und Vergleich von Immuntherapien

Im LIFE-Zentrum haben wir die einmalige Möglichkeit, interdisziplinäre Forschung zu betreiben. Neben der Nähe zu den Kliniken, die eine patientennahe Forschung stimuliert, eröffnet das Know-How des Laser-Forschungslabors (LFL) und des LTI neuartige Versuchsansätze. Dies wird besonders deutlich in einem von der Deutschen Krebshilfe geförderten Projekt zur Stimulation von Anti-Tumorreaktionen des Immunsystems durch Photodynamische Therapie.

In weiteren regionalen Kooperationen mit der Abteilung für Klinische Pharmakologie und Immuntherapie, der Medizinischen Klinik Innenstadt (Prof. Stefan Endres; Dr. Carole Bourquin) und der Chirurgischen Klinik (Prof. Rudolph Hatz, PD Dr. Hauke Winter, Dr. Natasja van den Engel) werden neue immuntherapeutische Ansätze mit CpG-Oligo-nukleotidadjuvantien und neuartigen Tumor-zellvakzinen an einem von uns entwickelten Spontantumormodell erprobt.

In den vergangenen Jahren haben wir eine neuartige Methode zur Gewinnung von Anti-körpern mittels genetischer Immunisierung bei uns etabliert, die zu einer Antikörper-Plattform

ausgebaut werden soll. Diese Methode erlaubt die rasche Generierung von vielseitig verwend-baren monoklonalen Antikörpern. Ein proof of principle mit einem externen Partner (PD Dr. Frank Kolligs und Dr. Andreas Herbst, Med. II) ist bereits erfolgreich abgeschlossen worden.

Mit der Chirurgischen Klinik (Prof. Christo-pher Heeschen) und dem Institut für Chirurgi-sche Forschung (Prof. Georg Enders) haben wir eine Zusammenarbeit zur (Immun-)Therapie von Tumorstammzellen begonnen.

Im Rahmen einer zwischen dem Institut für Molekulare Immunologie (IMI) der GSF (Prof. Dolores Schendel) und der Urologischen Klinik des Klinikums der Universität München (Prof. Christian Stief), vereinbarten Klinischen Kooperationsgruppe „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (Leiterin Dr. Heike Pohla) wurde im Berichtszeitraum eine Pati-entenstudie zur Erprobung einer genetisch mo-difizierten Nierenzellkarzinom-Vakzine er-folgreich abgeschlossen. Im Mittelpunkt der weiteren gemeinsamen Forschungsarbeiten ste-hen Designer-T-Zellen und dendritische Zellen, eine Immunzellpopulation, die wichtig für die optimale Stimulierung des körpereigenen Ab-wehrsystems für den Kampf gegen Tumor-zellen ist.

In Zusammenarbeit mit der Urologischen Kli-nik der TU München (Prof. Rudolf Hartung) und dem Institut für Experimentelle Onkologie und Therapieforschung (Prof. Bernd Gänsba-cher; Dr. Thomas Brill) wurde eine klinische Phase-I/II-Studie zur Erprobung einer genmodifizierten Tumorzellvakzine für die Therapie des hormonrefraktären Prostatakarzi-noms ebenfalls abgeschlossen. Die Hinweise auf eine Verlangsamung der Tumorprogression bei einzelnen Patienten haben sich bei dem größeren Patientenkollektiv bestätigt. Durch die gewonnene Erfahrung mit dem immune monitoring dieser Studien und dem Zulassungsprozedere wurden wichtige Grund-lagen für nachfolgende Studien geschaffen.

Prof. Dr. rer. nat. W. Zimmermann

Leiter des Labors für Tumorimmunologie


Bedeutung von „gepaarten Immunrezeptoren“ bei der Immunantwort

Einführung: Die Funktion von Leukozyten wird durch positive und negative Signale, die durch Zelloberflächenmoleküle übermittelt werden, gesteuert. Die Zugänglichkeit von Genomdatenbanken und so genannten EST-Datenbanken (expressed sequence tag) hat es ermöglicht, relativ einfach neue Mitglieder von Genfamilien und neue Spleißvarianten von Proteinen, zu identifizieren. Eine der überraschendsten Ergebnisse der durchge-führten Datenbankanalysen war die Entdeckung von Genen, die für nahverwandte Immunrezeptoren mit entgegengesetzter Funktion kodieren. Diese so genannten „gepaarten Immunrezeptoren“ haben extrem ähnliche extrazelluläre Domänen, wodurch sie meist mit den gleichen Liganden interagieren. Sie verfügen jedoch über entgegengesetzte Sig-nalmotive im zytoplasmatischen Bereich oder verbinden sich intrazellulär mit Adaptorprote-inen, die über entgegengesetzte Signalmotive verfügen. Bisher bekannte „gepaarte Immun-rezeptoren“ gehören zwei Molekülfamilien an, der Immunglobulinsuperfamilie (IgSF) und der C-Typ-Lektin-Familie. Zu diesen Rezeptorpaa-ren oder Rezeptorfamilien gehören die killer cell Ig-like receptors (KIR) und die leukocyte Ig-like receptors (LILR) der Primaten, sowie die paired Ig-like receptors (PIR), die myeloid-associated Ig-like receptors (MAIR) und die Ly49-Familie der Nager, sowie die CD94/NKG2-Familie, die sowohl in Primaten und Nagern vorkommt. Die funktionelle Rele-vanz der gepaarten inhibitorischen und aktivie-renden Immunrezeptoren ist bisher kaum ver-standen. Es liegt jedoch nahe, eine Funktion bei der Feinabstimmung der Immunantwort zu vermuten. Einen wichtigen Hinweis auf die Entstehung der Immunrezeptorpaare lieferte die Entdeckung eines aktivierenden Moleküls innerhalb der Ly49-Familie in der Maus. Die bisher bekannten Mitglieder der Ly49-Familie sind inhibitorische Immunrezeptoren, die von natürlichen Killerzellen exprimiert werden und über die Erkennung von MHC-I-Molekülen eine Attacke gegen gesunde Zellen verhindern. Das murine Cytomegalievirus (MCMV) kodiert für ein MHC-ähnliches Protein (m157). Dieses viruseigene Protein bindet an die inhibitorischen Ly49-Rezeptoren und verhindert dadurch die Elimination virusinfi-zierter Zellen in MCMV-empfindlichen Mäu-sen. In MCMV-resistenten Mäusen wird ein zum Ly49 sehr nahe verwandter aktivierender Rezeptor (Ly49H) von NK-Zellen exprimiert, der an das m157-Protein bindet, was zu einer Aktivierung der NK-Zellen und dadurch zu

einem Schutz gegenüber dem MCMV führt. Aufgrund der hohen Homologie der beiden Rezeptoren wird vermutet, dass der aktivie-rende Rezeptor, als Reaktion auf den starken Selektionsdruck, der durch das Pathogen aus-geübt wurde, ausgehend vom inhibierenden Rezeptor entstanden ist. Dieser Mechanismus könnte für das Vorkommen vieler der „gepaarten Immunrezeptoren“ verantwortlich sein, obwohl dies bisher für keinen weiteren Rezeptor gezeigt werden konnte. Angata und Mitarbeiter haben kürzlich gepaarte Rezeptoren innerhalb der Siglec Familie beschrieben. Siglecs sind Lektine, die zu der IgSF gehören und Zuckerreste binden, die Sialinsäure enthalten. Das Siglec-Rezeptorpaar ist durch Genkonversion entstanden, eine Pathogen induzierte Entstehung wurde deshalb bezweifelt. Wäre der Grund für die Entstehung des aktivierenden Rezeptors der selektive Druck eines Pathogens, das an den inhibieren-den Rezeptors bindet, so sollte die Genkonver-sion vom inhibierenden Rezeptor zum aktivie-renden Rezeptor statt gefunden haben, dies war jedoch nicht der Fall. Um die Gründe für die Entstehung von „gepaarten Immunrezeptoren“ besser verstehen zu können haben wir die Evolution der CEA-Genfamilie untersucht. Die CEA-Genfamilie ist Mitglied der IgSF und zeichnet sich durch eine einzigartige spezies-spezifische Evolution aus. Das CEACAM1, eines der Urgene der CEA Genfamilie, hat durch extensive Genduplikation die Zusam-mensetzung und den Umfang der CEA-Genfa-milie bestimmt. CEACAM1 ist ein inhibieren-der Immunrezeptor, der von unterschiedlichen Leukozyten exprimiert wird. Sowohl im Men-schen als auch in der Maus konnten Pathogene identifiziert werden, die an CEACAM1 binden. Die CEA-Genfamilie und besonders die von CEACAM1 abstammenden Mitglieder sind daher interessante Kandidaten für die Suche nach Pathogen-induzierten „gepaarten Immun-rezeptoren“.

Ergebnisse: Innerhalb der CEA-Familie der Nager gibt es keine Oberflächenrezeptoren, die über aktivierende Signalmotive oder über Adaptorprotein-bindende transmembran Do-mänen verfügen. In der humanen CEA-Familie kennen wir dagegen zwei Rezeptoren (CEACAM3 und CEACAM4), die über so genannte ITAMs (immunoreceptor tyrosin-based activation motif) verfügen. Vor allem das CEACAM3 verfügt über eine extrazelluläre IgV-ähnliche N-Domäne, die der entsprech-enden Domäne des CEACAM1 sehr ähnlich

Immunologische Grundlagen 51

ist. In der Tat wurde gezeigt, dass Neisserien, die an CEACAM1 binden, auch mit CEACAM3 interagieren, dabei aber entgegen-gesetzte Signale auslösen, was im Fall der CEACAM3-Bindung zur Aufnahme und Zerstörung der Bakterien führt. Da beide Moleküle von Granulozyten exprimiert werden, erfüllen sie formal die Kriterien von „gepaarten Immunrezeptoren“. Ob sich beide Rezeptoren auch zelluläre Liganden teilen ist nicht bekannt. Durch die Fortschritte der unter-schiedlichen Genomprojekte hat man heute die Möglichkeit, die Struktur von Genfamilien in weiteren Spezies zu analysieren. Das Genom des Hundes ist neben dem des Menschen und der Maus nahezu vollständig sequenziert. Wir haben deshalb die CEA-Genfamilie des Hundes, im Hinblick auf das Vorkommen von „gepaarten Immunrezeptoren“, analysiert und nach Hinweisen gesucht, die für eine pathogen-getriebene Evolution dieser Rezeptoren sprechen. Außer 6 Spleißvarianten von CEACAM1 konnten wir Produkte von weiteren 5 Genen identifizieren und klonieren (Abb. 1). Von vier dieser Gene gibt es mindestens eine Spleißvariante die über ein ITAM im zytoplasmatischen Anteil verfügt. Auch das CEACAM24 besaß vermutlich bei seiner Entstehung ein ITAM, das aber durch eine Punktmutation in der Spleißdonorstelle eines Exons, das für die zytoplasmatische Domäne kodiert, verloren ging. Eines dieser Moleküle (CEACAM28) verfügt über eine N-Domäne, die sich von der N-Domäne von CEACAM1 nur in zwei Aminosäuren unterscheidet. Beide Aminosäuren liegen außerhalb, des für die homophile Interaktion von CEACAM1 zuständigen Bereichs. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass CEACAM1 und CEACAM28 mit den gleichen Liganden, sowie auf heterotypische Weise, miteinander interagieren. Da sie aufgrund ihrer unterschiedlichen zytoplasmatischen Motive entgegengesetzte Signale transduzieren, handelt es sie bei diesen beiden Molekülen um typische „gepaarte Immunrezeptoren“.

Durch weitergehende Sequenzanalysen konnten wir zeigen, dass die Übereinstimmung der N-Domänen von CEACAM1 und CEACAM28 durch eine kürzlich statt-gefundene Genkonversion, wie sie in Abb. 2 dargestellt ist, hervorgerufen wurde. Die Richtung der Genkonversion, das heißt das Ersetzen des für die ursprünglichen N-Domäne des CEACAM28-kodierenden Genbereichs durch den korrespondierenden Bereich des CEACAM1, gibt einen entscheidenden Hinweis auf den möglichen Selektionsdruck, der zu diesem Ereignis geführt hat.

A2

B

N

SSA1

SS

SS N N N

CEACAM234L

CEACAM241L CEACAM25

1L 1S

A SS

N

CEACAM283L

2L1

A2 SS

N

A1 SS

A

N

SS

2L2

CEACAM30

A2

B

N

SSA1

SS

SSA2

B

N

SSA1

SS

SS A2 S

S

N

A2 SS

N

CEACAM14L 4S

2L 2S

1L 1S

NN

A2

B

N

SSA1

SS

SS N N N

CEACAM234L

CEACAM241L CEACAM25

1L 1S

A SSSS

N

CEACAM283L

2L1

A2 SS

N

A1 SS

A

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SSSS

2L2

CEACAM30

A2

B

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SS

SSA2

B

N

SSA1

SS

SS A2 S

S

N

A2 SS

N

CEACAM14L 4S

2L 2S

1L 1S

NN

Abb. 1: Domänenorganisation der CEACAM1-verwandten Proteine des Hundes. Die Domänenorganisation wurde basierend auf Genomdatenbanken vorhergesagt und durch RT-PCR, Klonierung und Sequenzierung bestätigt. Die Anzahl der Ig-ähnlichen Domänen und das Vorhandensein einer langen (L) oder kurzen (S) zytoplasmatischen Domäne ist über der grafischen Darstellung der Proteine angegeben. Signalkonsensmotive sind als schwarze (ITIM), weiße (ITSM) und als graue (ITAM) Punkte dargestellt.


CEACAM1 CEACAM28

N

A1

B

A2

N

A1

A2

98%

92%

85%

L L 100%

5‘FR984 L64 Int I810 N360 Int II114

A

B

CEACAM1 CEACAM28

N

A1

B

A2

N

A1

A2

98%

92%

85%

L L 100%

5‘FR984 L64 Int I810 N360 Int II114

A

B

Abb. 2: Von der Genomkonversion betroffene Regionen von CEACAM1 und CEACAM28. Die 2332 bp große Region von CEACAM1, die etwa 1 kb der 5’-flankierenden Region (5’-FR), das Leader-Exon (L), das erste Intron (INT I), das N-Domänenexon (N) und einen Teil des zweiten Intron (INT II) umfasst, weist eine extrem hohe Ähnlichkeit (99%) mit dem entsprechenden Bereich in CEACAM28 auf. Dies deutet auf eine kürzlich stattgefundene Genkonversion hin. Demgegenüber weisen die homologen Bereiche stromauf und stromab nur eine Ähnlichkeit von 80% bzw. 92% auf (A). Den selben Schluss lässt der Vergleich des Leader, der N- und der A-Domänen auf Aminosäureebene zu (B).

Wie bereits angeführt, würde man von einem aktivierenden Rezeptor, der von einem Wirt als Maßnahme gegen eine Pathogenattacke ent-wickelt wurde, fordern, dass sich dieser dem inhibierenden Rezeptor, der vom Pathogen als zelluläre „Eintrittspforte“ verwendet wird, an-gleicht. Dadurch könnte der inhibierende Rezeptor weiter seine physiologische Funktion ausüben. Würde die Genkonversion dazu führen, dass der inhibierende Rezeptor sich dem aktivierenden angleicht, würde der inhi-bierende Rezeptor, zumindest zeitweise, seine natürliche Funktion verlieren. Fasst man also die hier gemachten Beobachtungen zusammen, kann man schließen, dass die dominierende physiologische Funktion von CEACAM1 aus-geübt wird. Und das ursprüngliche CEACAM28, zugunsten einer verbesserten Pathogenabwehr seine Funktion aufgegeben hat.

Hinweise über die Art des Pathogens, das im Hund möglicherweise das CEACAM1 als zellulären Rezeptor verwendet, lieferten die durchgeführten Expressionsanalysen. Wie in Abb. 3 gezeigt, werden beide Rezeptoren von peripheren Blut-T-Zellen koexprimiert.

C28-3

C30-2

GAPDH

C1-4

Tce

lls

Tce

lls(IL

-2)

PBMC

-Tce

llPB

MC-T

cell (

IL-2)

Tce

lls(P

HA)T

cells

(aCD3)

C1-2

C1-1C28-3

C30-2

GAPDHGAPDH

C1-4

Tce

lls

Tce

lls(IL

-2)

PBMC

-Tce

llPB

MC-T

cell (

IL-2)

Tce

lls(P

HA)T

cells

(aCD3)

C1-2

C1-1

Abb. 3: Entgegengesetzte Expression der „gepaarten Immunrezeptoren“ CEACAM1 und CEACAM28 in stimulierten T-Zellen. RNA wurde von aufgereinigten Lymphozytenpopulationen isoliert und mittels RT-PCR analysiert. Die CEACAM1-cDNA (C1*) ist in IL-2-stimulierten T-Zellen erhöht, während die CEACAM28-cDNA (C28*) erniedrigt ist. *Die Zahl nach dem Bindestrich gibt die Anzahl der Ig-Domänen in den gefundenen Spleißvarianten an.

Die natürliche Funktion von T-Zellen ist die Bekämpfung von intrazellulären Pathogenen (z. B. Viren). Dabei erkennen T-Zellen virus-infizierte Zellen entweder, über MHC-I-präsen-tierte, virusspezifischen Peptide mittels des T-Zellrezeptors oder über Interaktionen von T-Zell-eigenen koregulatorischen Oberflächen-molekülen mit vom Virus in der infizierten Zelle induzierten Oberflächenmolekülen. Handelt es sich um ein virusinduziertes Oberflächenprotein, das als Ligand von CEACAM1 fungiert, so würde dies ohne Koexpression von CEACAM28 in der T-Zelle dazu führen, dass über CEACAM1 ein inhibitorisches Signal in die T-Zelle transferiert wird, wenn sie eine virusinfizierte Zelle attackiert. Daraus würde unweigerlich in einer reduzierten Anti-Virus Immunantwort resul-tieren. Wie leicht einzusehen ist, würde die simultane Expression von CEACAM28 das CEACAM1 vermittelte inhibierende Signal aufheben oder sogar ins Gegenteil verwandeln. Wir denken daher, dass wir ein weiteres Immunrezeptorpaar gefunden haben, das Pathogen-induziert ist. Durch Kooperation mit einer englischen sowie einer amerikanischen Arbeitsgruppe versuchen wir nun, das an CEACAM1/CEACAM28-bindende Pathogen zu identifizieren.

R. Kammerer, T. Popp, S. Härtle 1, B.B. Singer 2, W. Zimmermann

Koop.: 1 Institut für Tierphysiologie, Universität München; 2 Institut für Anatomie, Universitätsklinikum Essen.

Immune-escape-Mechanismen 53

Funktionelle Inaktivierung Tumor-infiltrierender natürlicher Killer-zellen beim Nierenzellkarzinom Einführung: Tumorinfiltrierende natürliche Killerzellen (NK-TIL): NK-Zellen sind granu-läre Lymphozyten, die als Teil des angeborenen Immunsystems vor allem bei der Abwehr von Virus-infizierten Zellen eine bedeutende Rolle spielen. NK-Zellen sollten aber auch für die Erkennung von Tumorzellen entscheidend sein, da sie vor allem für die Eliminierung körpereigener Zellen zuständig sind und für ihre Aktivierung keine fremden oder neu exprimierten Antigene brauchen. Dies sind Eigenschaften von Tumorzellen, die es anderen Zellen des Immunsystems meist unmöglich machen, diese Zellen als entartet zu erkennen. Die NK-Zellen befinden sich in der Regel in einem Ruhezustand oder einem inaktivierten Zustand, um gesunde Körperzel-len vor einem Angriff dieser Lymphozyten zu schützen. Die Regulation der Aktivierung oder Inhibierung von NK-Zellen beruht auf einer fein austarierten Balance: Nicht infizierte oder nicht entartete Zellen besitzen vorwiegend Liganden für inhibitorische Rezeptoren (IR) der NK-Zellen und bewirken somit deren Ab-schaltung; infizierte Zellen oder Tumorzellen haben in den meisten Fällen dagegen eine verminderte Anzahl an Liganden für IR, so dass die NK-Zellen nicht ausreichend inhibiert werden. Auf diese Weise kommen Signale über aktivierende Rezeptoren (AR) zum Tragen und führen zu einer Eliminierung der Zielzellen. Liganden für IR sind vor allem Moleküle des sog. Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC), die von allen kernhaltigen Zellen des Körpers exprimiert werden (Abb. 1).

Akt.Ligand

MHC

+ -

IRAR

Abb. 1: Regulation der Aktivierung oder Inhibierung einer NK-Zelle durch aktivierende Liganden oder MHC-Mole-küle einer Zielzelle. AR: aktivierender Rezeptor, IR: inhibierender Rezeptor.

Somit ist jede Körperzelle mit normaler (aus-reichender) Expression von MHC-Molekülen vor einem Angriff von NK-Zellen geschützt. Tumorzellen zeichnen sich dagegen in den meisten Fällen durch eine Reduktion der MHC-

Moleküle auf der Zelloberfläche aus, um anderen Zellen des Immunsystems (T-Zellen, B-Zellen) zu entkommen, welche die MHC-Moleküle für die Erkennung und als aktivieren-des Signal benutzen. Das Immunsystem tritt diesem T-/BZell-escape-Mechanismus von Tumoren mit den NK-Zellen entgegen: NK-Zellen erkennen diese Reduktion der MHC-Moleküle und die so entarteten Zellen. Bisher ist allerdings nicht geklärt, warum NK-Zellen trotz dieser guten Voraussetzungen in der Regel nicht in der Lage sind, Tumorzellen zu erkennen und zu vernichten.

Im Labor für Tumorimmunologie wird seit längerer Zeit untersucht, warum NK-Zellen das Wachstum des Nierenzellkarzinoms (RCC) trotz alledem nicht verhindern. Wir konnten erstmals anhand einer spezifischen immuno-logischen Färbung von Tumorgewebe zeigen, dass alle Tumoren NK-Zellen enthalten und einige Tumoren sogar von einer sehr großen Zahl an NK-Zellen infiltriert werden. Um diese Zellen näher untersuchen zu können, wurden Lymphozyten schonend aus frisch entnom-menen RCC-Tumorgeweben isoliert und ex vivo einer phänotypischen und funktionellen Analyse unterzogen.

Ergebnisse: Die Untersuchungen zeigten, dass die NK-TIL im RCC-Gewebe in einem inaktiven Zustand vorliegen. Direkt aus dem Gewebe isolierte NK-TIL zeigten nur sehr geringe zytotoxische Aktivität gegenüber Tumorzellen. Erst eine Kurzzeitkultivierung mit Interleukin-2 (IL-2) konnte zu einer deutlichen Eliminierung der Tumorzellen führen.

Nicht alle Tumoren enthielten jedoch NK-Zellpopulationen, die über IL-2 zu einer deut-lichen Lyse aktiviert werden konnten. Es ließen sich zwei verschiedene Tumortypen unter-scheiden: Tumoren mit einem hohen Prozent-satz an NK-Zellen (> 20%, high-NK-TIL), die sich als aktivierbar erwiesen, und Tumoren mit einem niedrigeren Prozentsatz an NK-Zellen (< 20%, low-NK-TIL), die sich nicht durch Kurzzeitstimulation aktivieren ließen (Abb. 2).

Weitere Analysen zeigten überraschende Unterschiede in der CD16-Expression zwischen beiden von uns definierten Tumorgruppen: high-NK-TIL waren haupt-sächlich CD16high und zeigten daher einen für zytotoxische NK-Zellen charakteristischen Phänotyp. Low-NK-TIL waren dagegen vorwiegend CD16neg/dim und zeigten somit den


Phänotyp der geringer zytotoxisch wirkenden NK-Zellen (Tab. 1, Abb. 3).

% s

pezi

fisch

e Ly

se

Abb. 2: Zytotoxische Aktivität von NK-PBMC im Ver-gleich zu high-NK-TIL und low-NK-TIL. * Zytotoxizität gegen die HLA-negative Erythroleukämie-Zelllinie K562 mit einem Effektor-zu-Zielzell-Verhältnis von 20:1 oder 40:1. � NK-Zell-Anreicherung zu 60-95%. � Drei Proben der high-NK-TIL wurden nicht angereichert und enthielten zwischen 35% und 42% NK-Zellen (Schleypen et al. Clin. Canc. Res. 2006).

43.5 ( 24.8 – 68.9 )**12.2 ( 5.9 – 17.9 )14low-NK-TIL

89.8 ( 82.0 – 96.9 )**35.4 ( 22.0 – 62.1 )7high-NK-TIL

59.3 ( 24.8 – 96.9 )22NK-TIL �

89.5 ( 72.4 – 98.7 )12.7 ( 2.0 –26.0 )13NK-PBMC §

% CD16+ (range) ‡% NK (range) †N*

Tab. 1: Expression von CD16 auf NK-TIL. * Zahl der untersuchten Spender. † Prozentsatz CD3-CD56+-NK-Zellen. ‡ Prozentsatz CD16+-Zellen innerhalb der CD3-CD56+-NK-Zellen. § NK-Zellen im peripheren Blut von RCC-Patienten. � Tumor-infiltrierende Lymphozyten wurden direkt aus dem Gewebe isoliert und analysiert. ** Der p-Wert zwischen beiden Gruppen an NK-TIL-Zellen war < 0,0001 (Wilcoxon Test) (Schleypen et al. Clin. Canc. Res. 2006).

Die Bedeutung der CD16-Expression bei NK-vermittelter Eliminierung von Tumorzellen ist noch unklar. Auch für die NK-PBMC wird kontrovers diskutiert, ob die CD16neg/dim-Popu-lation eine eigene funktionelle Subpopulation ist oder, ob es sich um terminal differenzierte NK-Zellen handelt.

Ferner zeigte sich, dass NK-TIL ein zu NK-Zellen der Peripherie unterschiedliches Expres-sionsmuster an inhibitorischen Rezeptoren auf-weisen, die eventuell für die Inaktivierung der NK-Zellen im Tumor verantwortlich sein könn-ten.

Abb. 3: Korrelation zwischen der Häufigkeit von NK-Zellen in TIL und der CD16high-Subpopulation im Ver-gleich zu NK in PBMC (Schleypen et al. Clin. Canc. Res. 2006).

Ein weiterer phänotypischer Unterschied zwi-schen beiden Tumortypen zeigte sich in der Expression der zytotoxischen Effektormoleküle Perforin, Granzym A und Granzym B (Zytoto-xine), die an der Kontaktstelle zwischen NK-Zelle und Zielzelle sezerniert sowie von der Zielzelle aufgenommen werden und den Tod der Zielzelle über die Aktivierung von Caspasen verursachen. Intrazelluläre Fluores-zenz-Färbungen konnten zeigen, dass annähernd alle high-NK-TIL ähnlich wie die NK-PBMC die drei Zytotoxine exprimierten, wogegen sich ein sehr viel geringerer Prozentsatz an low-NK-TIL positiv für diese Effektormoleküle zeigte. Auch diese Beobachtung korrelierte mit dem funktionellen Status der jeweiligen NK-Zellen beider Tumortypen.

Fazit: Obgleich es derzeit unbekannt ist, warum einige RCC-Tumoren mehr NK-TIL aufweisen, könnte die Beobachtung, dass die Anzahl der NK-TIL mit einer charakteristischen Funktion assoziiert ist, zukünftig als prädiktiver Marker dienen. Für einige solide Tumoren korreliert die Präsenz von NK-TIL mit einem besseren Überleben. Zumindest in der Untersuchung unseres kleinen Patientenkollektives konnten interessanter-weise in der Gruppe mit den funktionellen NK-TIL keine Patienten mit Fernmetastasen gefunden werden.

J.S. Schleypen, N. Baur 1, K. Rohrmann 2, R. Kammerer, C.S. Falk 1, E. Nössner 1, D.J. Schendel 1, H. Pohla

Koop.: 1 Institut für Molekulare Immunologie, GSF; 2 Urologische Klinik, Klinikum der Universität München.

Förderung: Strategiefond III der Helmholtz-Gemeinschaft; KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF); Deutsche Krebshilfe, SFB571.


Die Rolle der Chemokine in soliden Tumoren

Einführung: Obwohl häufig eine starke lymphozytäre Infiltration solider Tumoren stattfindet, führt dies nicht zu einer effektiven Kontrolle der Tumorprogression. Es stellt sich deshalb die Frage, ob die Akkumulation von immunkompetenten Zellen im Tumor tat-sächlich, wie meist angenommen, ein Zeichen einer stattfindenden immunologischen Anti-tumorreaktion darstellt oder ob der Infiltration des Tumorgewebes durch immunkompetente Zellen andere Mechanismen zugrunde liegen. Deshalb wollten wir klären, ob die Tumorzellen selbst, entweder in aktiver (Sekretion von Chemoattraktoren) oder passiver (Sekretion von Migrationsinhibitoren) Form an der Leukozytenanreicherung im Tumor beteiligt sind.

Ergebnisse: Wir fanden, dass sich sowohl kolorektale Karzinomzellen als auch Nieren-zellkarzinomzellen aktiv an der Rekrutierung des Immuninfiltrates durch Sekretion von Chemokinen beteiligen. Unter diesen Chemo-kinen befanden sich auch solche, die durch Interaktion mit dem selektiv auf aktivierten T- und NK-Zellen exprimierten Chemokinrezeptor CXCR3 ihre Wirkung entfalten (Abb 1).

Die Sekretion dieser Chemokine wird durch die Stimulation der Tumorzellen mit pro-inflammatorischen Zytokinen noch beträchtlich gesteigert, was funktionell zu einer verstärkten Rekrutierung von aktivierten T-Zellen führt. Daraus muss man folgern, dass sich maligne Zellen verschiedener Tumorentitäten, scheinbar paradoxerweise, aktiv an der immunologischen Antitumorantwort beteiligen. Man sollte aber berücksichtigen, dass eine entzündliche Reaktion im Tumor auch vorteilhaft für den Tumor sein kann, da in entzündeten Geweben die Neoangiogenese verstärkt und Proteasen vermehrt freigesetzt werden, was die Metastasierung der Tumoren erleichtern kann. Auf der anderen Seite kann sich der Tumor vor den negativen Folgen der Immunreaktion durch so genannte Immune-escape-Mechanismen schützen. Am effektivsten sind solche, die durch das von aktivierten Lymphozyten freigesetzte IFNγ angeschaltet werden, da dadurch der Tumor die erhöhte Aktivität des Immunsystems erkennen und zeitgleich neutralisieren kann. In dem wir zeigen konnten, dass Nierenzellkarzinomzellen als Reaktion auf eine Attacke von zytotoxischen Zellen, CEACAM1 exprimieren, gelang es uns solch einen Immune-escape-Mechanismus zu identifizieren. Das von Tumorzellen

A

B

C

T

T

T

A

B

C

T

T

T

Abb. 1: Immunhistologischer Nachweis von CXCL10 (A) und CXCR3 (B, C) in kolorektalen Karzinomen (CRC). Die immunhistologischen Untersuchungen zeigen, dass das Chemokin CXCR3 in einigen CRC konstitutiv von den Tumorzellen (T) exprimiert wird (A). Einige positive, dunkelgefärbte Areale sind mit weißen Pfeilen hervorgehoben. Ebenso konnten in den meisten Tumoren eine große Anzahl von CXCR3-positiven Lymphozyten nachgewiesen werden (B, C). Während sich die infiltrierenden T-Zellen bei Tumor T31 (B) gleichmäßig verteilt innerhalb der Tumorzellnester befinden, sind die infiltrierenden CXCR3-positiven T-Zellen im Tumor T77 (C) vorwiegend im Tumorstroma lokalisiert. Tumor-bereiche mit einer starken Infiltration mit CXCR3-positiven T-Zellen sind durch schwarze Pfeile markiert.

exprimierte CEACAM1 kann über eine homophile Interaktion mit CEACAM1 auf aktivierten T- bzw. NK-Zellen deren zyto-toxischen Aktivität inhibieren. Findet keine akute Immunreaktion mehr statt, kann die


Tumorzelle die CEACAM1-Expression wieder einstellen. Wir sind beim CRC auch der Frage nachgegangen, wie sich das Chemokinmilieu des Primärtumors von dem des korrespon-dierenden Normalgewebes bzw. der Metastasen unterscheidet. Die Analyse von 58 Microarray-Datensätzen (15 Primärtumoren, 14 Metas-tasen, 29 Normalgewebe) ergab zwar ein vergleichbares Chemokinmuster in diesen drei Geweben, allerdings waren auch interessante Unterschiede zu finden. So waren die IFNγ-induzierbaren Chemokine in den Primär-tumoren regelmäßig überexprimiert, während einige auf aktivierte T-Zellen und/oder reife dendritische Zellen chemotaktisch wirkende CC-Chemokine in den malignen Geweben herunterreguliert waren. Weitere Analysen von Microarray-Datensätzen in öffentlichen Daten-banken ergaben, dass unterschiedliche Tumor-entitäten, charakteristische Chemokinmuster aufweisen (Abb. 2).

0 500 1000

Prostata

Blase

Brust

Kolon

Magen

Niere

Leber

Ovar

Pankreas

Lunge

CCL20CXCL8CX3CL1CXCL12CXCL3

1000 2000

Relative Expression

Tum

oren

titä

t

Abb. 2: Vergleich der Chemokinexpression in verschiedenen Tumorentitäten. Dargestellt sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen der relativen Expression der Chemokine. Den Daten lagen Expressionsprofile von 175 humanen Tumoren zugrunde, die unter http://source.stanford.edu (carcinoma classifi-cation) zugänglich sind.

Anhand dieser Chemokinmuster ließen sich drei verschiedene Tumorgruppen benennen. Bei dieser Einteilung spielt die Expression eines „Leitchemokins“ die entscheidende Rolle. Wie in Abb. 2 ersichtlich ist, zeichnen sich das kolorektale Karzinom, das Lungenadenokarzinom, das Blasenkarzinom sowie das Magenkarzinom durch die starke Expression von CCL20 aus (CCL20-Gruppe). Demgegenüber exprimieren das Nierenzell-karzinom, das Prostatakarzinom, das Brust-drüsenkarzinom sowie das Ovarialkarzinom große Mengen an CX3CL1 (CX3CL1-Gruppe). Die dritte Gruppe, zu der das Leberkarzinom und das Pankreaskarzinom gehören, ist durch die nahezu gleich starke Expression von CCL20 und CX3CL1 gekennzeichnet.

Ob sich solche typischen Chemokinmuster in der Zusammensetzung des Tumorinfiltrates widerspiegeln, haben wir am Beispiel des Nierenzellkarzinoms untersucht. Dabei ergab sich, dass die Expression der Chemokine CX3CL1 bzw. CXCL12 mit der Infiltration von CD16+- bzw. CD16--NK-Zellen im Nieren-zellkarzinom korreliert. Der für das Chemokin CX3CL1 spezifische Rezeptor CX3CR1 wird von CD16+, nicht jedoch von CD16--NK-Zellen exprimiert. Da die CD16+-NK-Zellen nach IL-2-Stimulation eine stärkere zytotoxische Aktivität aufwiesen als die CD16-

-NK-Zellen, vermuten wir, dass Patienten mit einem hohen CD16+-NK-Zellanteil im Tumor stärker von einer IL-2-basierenden Immun-therapie profitieren, als Patienten mit einem geringen CD16+-NK-Zellanteil. Dies könnte in einer klinischen Anwendung münden, bei der die recht einfach, mittels quantitativer RT-PCR, zu bestimmende Expression dieser Chemokine im Primärtumor als Kriterium für die Anwendung einer häufig nebenwirkungs-reichen IL-2-basierten Immuntherapie verwendet werden könnte.

R. Kammerer, M. Földi 1, A. Hennig, T. Popp, H. Pohla, K.M. Skubitz 2, W. Zimmermann

Koop.: 1 Frauenklinik, Universität Freiburg; 2 Hematology, Oncology and Transplantation, University of Minnesota.

Förderung: Deutsche Krebshilfe (70-2729).


Indolamin-2,3-dioxygenase-Expression in Tumorendothelzellen korreliert bei Nierenzellkarzinompatienten mit einer besseren Prognose

Nur ein begrenzter Anteil von Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom (RCC) pro-fitiert von der sehr kostenintensiven und mit er-heblichen Nebenwirkungen vergesellschafteten Zytokinimmuntherapie. Es wäre daher wün-schenswert, mit Hilfe geeigneter prognostischer Marker aus dem Kollektiv von Patienten die-jenigen herauszufinden, die auf eine solche Immuntherapie ansprechen. Da das RCC zu den wenigen immunogenen Tumoren gehört, deren Wachstum nur bei einem Teil der RCC-Patienten durch unspezifische Immuntherapien mit Zytokinen vermindert werden kann, liegt es nahe, dass Immune-escape-Mechanismen bei dieser Tumorart von Bedeutung sind.

Indolamin-2,3-dioxygenase (IDO), ein Schlüs-selenzym für den Tryptophanabbau, scheint maßgeblich dafür verantwortlich zu sein, dass Schwangere keine Abstoßungsreaktionen gegen den Fötus entwickeln. Der sich ent-wickelnde Embryo besitzt mit der Expression von IDO ein Mittel, um eine Immunsup-pression bei der Mutter zu erwirken und so ge-zielt die zur normalen Entwicklung notwendige Toleranz selbst zu induzieren. Diesen Mecha-nismus macht sich der Tumor zu Nutzen: Die Hemmung von Tumor-infiltrierenden T-Zellen durch lokale Depletierung der essentiellen Aminosäure Tryptophan oder durch toxische Tryptophanabbauprodukte, wie Kynurenin, er-möglicht den normalerweise durch das Immun-system eliminierten Tumoren das weitere Wachstum. Viele menschliche Tumoren expri-mieren IDO, so auch das RCC. Aufgrund der außergewöhnlichen Empfindlichkeit von T-Zellen gegenüber Tryptophanmangel kann die Aktivität dieser Zellen auch durch Expression von IDO in Immunsystem-regulierenden Zel-len, wie dendritischen Zellen, gesteuert werden. In einem Mausmodell konnte gezeigt werden, dass Tumorzellen durch konstitutive IDO-Expression der Kontrolle durch das Immunsystem entkommen können. In einer Reihe aktueller Publikationen konnte tatsächlich gezeigt werden, dass, zumindest für bestimmte Tumoren (Ovarialkarzinom, Kolonkarzinom), eine Korrelation zwischen der IDO-Expression in Tumoren und einem ungünstigen Krankheitsverlauf besteht.

In diesem Projekt haben wir deshalb eine grö-ßere Anzahl von klarzelligen RCC-Geweben (jeweils 60 Primärtumoren und Metastasen) sowie „Normalgewebe“ von 30 Tumor-tragen-

den Nieren auf IDO-Expression mit Hilfe von quantitativer RT-PCR und exemplarisch einige davon mit IDO-spezifischen Antikörpern ver-gleichend untersucht und mit dem Überleben der Patienten korreliert. Auf diese Weise sollte geklärt werden, ob die Expression von IDO im RCC zum Unterlaufen der Tumorbekämpfung durch das Immunsystem führen kann.

Abb. 1: IDO-Expressionsanalyse mittels quantitativer RT-PCR von Nierennormalgeweben, RCC-Primärtumoren und RCC-Metastasen (Einzelauftragung nach Organlokalisation im rechten Teil der Abb.). Die relative IDO-cDNA-Menge wurde anhand des �-Aktin-cDNA-Gehalts normalisiert. Für einen Teil der Patienten ist nur sehr wenig IDO-mRNA im Tumorgewebe nachweisbar (� 10 AU).

Im Vergleich zum Nierennormalgewebe, in dem in der Regel IDO-mRNA nicht nachweis-bar war, enthielten die RCC-Tumoren sehr va-riable in rund 2/3 der Fälle erhöht IDO-mRNA-Mengen. Es zeigte sich kein deutlicher Unter-schied der IDO-Expression in Abhängigkeit von der Organlokalisation der Metastasen. Eine Ausnahme bilden möglicherweise IDO-nega-tive Knochen-, Gehirn- und Brust-Metastasen, die allerdings nur in einer kleinen Zahl unter-sucht wurden (Abb. 1). Bei einer kleinen Sub-gruppe von Patienten konnte sowohl der Pri-märtumor als auch eine davon abstammende Metastase untersucht werden. Interessanter-weise korrelierte die Expression in beiden Ge-weben (R2 = 0,71), was dafür spricht, dass IDO-Expression eine stabile Eigenschaft des Tumors darstellt.

Kaplan-Meier-Analysen ergaben, dass wider Erwarten Patienten mit erhöhtem IDO-mRNA-Gehalt in ihrem Tumor tendenziell länger leben (Primärtumor: p = 0,13; Metastasen: p = 0,15).


IDO

A

CEACAM1

b

C

b

CD34

B

b

Abb. 2: Tumorendothelzellen sind für die Expression von IDO im RCC verantwortlich. Zur Lokalisation von IDO-exprimierenden Zellen in RCC wurden die RCC-Schnitte mit einem IDO-spezifischer monoklonaler Maus-Antikör-per (mAk) (A), einem Endothelzell-spezifischen anti-CD34-mAK (B) oder einen Maus-anti-CEACAM1-mAK (C) immunhistologisch gefärbt. Man beachte die differentielle Färbung der Kapillargefäße (alle sichtbar durch anti-CD34-Markierung) durch den anti-IDO-mAk, der in begrenzten Arealen (links der Bindegewebssepte) kleine (Pfeile) und oft auch große Gefäße (gefüllte Pfeilspitzen) markiert. CEACAM1, das bevorzugt in kleinen unreifen, neu gebildeten, nicht jedoch in großen Tumorgefäßen (offene Pfeilspitzen) exprimiert wird. b: Bindegewebssepte.

Immunhistologische Färbungen ergaben, dass IDO fast ausschließlich in Endothelzellen der Tumorgefäße, vernachlässigbar wenig in infil-trierenden CD45+-Leukozyten detektierbar ist. Die Identität dieser Strukturen konnte durch den etablierten Endothelzellmarker CD34 bzw. Leukozytenmarker CD45 (nicht gezeigt) bestä-tigt werden. Allerdings war meist nur ein klei-ner Teil aller Endothelzellen IDO-positiv. Es gab oft große Tumorareale, in denen alle Gefäßendothelien IDO-negativ waren (Abb. 2). Bei den IDO-positiven Kapillaren dürfte es

sich meist um neu gebildete Blutgefäße handeln, da sie fast immer auch CEACAM1, einen Marker für Neoangiogenese in Tumoren, exprimierten (Abb. 2). Der Mechanismus der möglicherweise auf das RCC beschränkten IDO-Expression in Tumorendothelzellen ist unklar. Möglicherweise ist Interferon- (IFN-), ein TH1-Immunreaktionen-anzeigendes Zytokin, an der Induktion des IDO-Gens beteiligt. Wir konnten nämlich zei-gen, dass in vitro IFN- in der Lage ist, in primären menschlichen mikrovaskulären En-dothelzellen der Haut (HDMEC) IDO-mRNA und IDO-Protein zu induzieren (Abb. 3).

BA

+ IFN�

- IFN�

0

1000

2000

IND

O-c

DN

A-G

ehal

t[A

U]

(nor

mal

isie

rt)

- IFN� + IFN�

Abb. 3: IDO-mRNA und -Protein kann durch IFN- in HDMEC induziert werden. HDMEC wurden für 2,5 Tage mit oder ohne 80 ng/ml IFN- kultiviert. Der IDO-mRNA-Gehalt der Zellen wurde mittels quantitativer RT-PCR bestimmt und mittels ihres �-Aktin-cDNA-Gehalts normalisiert (A). IDO-Protein wurde in sedimentierten HDMEC (Zytospin) immunhistologisch wie in Abb. 2 nachgewiesen (B).

Aufgrund dieser Befunde spekulieren wir, dass IDO in Tumorendothelzellen den Zutritt der essentiellen Aminosäure Tryptophan in den Tumor reduzieren und so, zumindest regional, das Tumorwachstum behindern könnte. Diese Hypothese kann nun an Tiermodellen überprüft werden. Falls sich diese Hypothese verifizieren lässt, soll in Zukunft untersucht werden, ob sich die Expression von IDO in Tumoren-dothelzellen selektiv steigern oder auch in an-deren Tumorentitäten induzieren lässt. Dies könnte zu neuartigen Therapieansätzen in der Onkologie führen.

R. Riesenberg, O. Spring, M. Castro, T. Popp, S. Neckermann, A. Buchner, R. Kammerer, C. Weiler 1, O. Takikawa 4, R.A. Hatz 3, C. Stief 2, W. Zimmermann

Koop.: 1 Institut für Pathologie, 2 Urologische Klink, 3 Chirurgische Klinik, Klinikum der Universität München; 4 National Center for Geriatrics and Gerontology, Gengo, Japan.

Förderung: Förderprogramm Promotionsstudium “Mole-kulare Medizin” der Universität München (02/2004); Deutsche Krebshilfe (106141).

Antigene Zielstrukturen 59

Identifizierung antigener Zielstrukturen auf RCC-26 und primären RCC-Zellen

In den letzten Jahren wurden mehrere neue Technologien wie subtraktive Hybridisierung, Microarray-Analysen, Screening von Expres-sionsbanken mit Antikörpern und Proteom-analysen beschrieben, die einen Vergleich des Expressionsprofils zwischen Tumorgewebe und Normalgewebe erlauben. Mit diesen neuen Technologien können umfangreiche Datensätze gewonnen werden. Davon ausgehend wurden zahlreiche Gene beschrieben, die ein unter-schiedliches Expressionsprofil im Tumorge-webe gegenüber Normalgewebe aufweisen. Mit Hilfe von Computer-Algorithmen können für diese differentiell exprimierten Gene auch Epitope vorhergesagt werden, die an MHC-Moleküle binden können. Mühsam wird es dann, mit Hilfe geeigneter funktioneller Nach-weissysteme die biologische und klinische Relevanz dieser Epitope abzuklären. Dennoch wurden mit diesen neuen Verfahren einige sehr interessante Kandidaten für das Nierenzellkar-zinom gefunden. Antigene mit potentieller Relevanz sind das Her2/neu-Antigen, das Wilms' Tumorsuppressor-Antigen WT1 und insbesondere CA-IX/G250. Sie enthalten jeweils antigene Epitope, die über HLA -A2 präsentierten werden und von T-Zellen erkannt werden können.

RCC-26

Säure-Elution der Peptiderp-HPLC / Sequenzierung

HPLCHPLC

„„in in silicosilico““

Datenbanken

Peptid-Nonamere

NKC-26 Vakzine

MicroarraysMicroarrayscDNA

qRT-PCR

Abb. 1: Strategien zur Identifizierung Tumor-assoziierter Antigene (TAA) beim RCC. Mittels quantitativer real time-RT-PCR wird abschließend die Expression der Genkandidaten in Geweben und etablierten Zelllinien von Tumor (z. B. RCC-26 Vakzine) und Normalniere (z. B. NKC-26) überprüft.

Mittels dieser Datenbankenanalysen sowie eines biochemischen Ansatzes über reverse phase HPLC-Analyse von MHC-eluierten Pep-tiden aus der RCC-Linie RCC-26 konnten mehrere Peptide identifiziert werden, die auf

primärem RCC-Gewebe, auf RCC-26 sowie auf den Vakzinezelllinien RCC-26/CD80/IL-2 und RCC-26/CD80/IL-7, nicht jedoch auf Normalnierengewebe exprimiert werden (Kooperation Dr. Bernhard Frankenberger, Dr. Elfriede Nössner, GSF; Dr. Stefan Stevanovic, Tübingen; Abb. 1-3). Abb. 2 zeigt beispielhaft die Genexpressionsanalyse des Antigens EGFR (epidermal growth factor receptor).

1 21.9

419

105

719

0

200

400

600

800

NKC-I NKC-II NKC-III RCC-I RCC-II RCC-III

Abb. 2: Quantitative Real-time-RT-PCR von EGFR in verschiedenen primären RCC-Geweben und den jeweiligen Normalnierengeweben (NKC) (die Zahlen bedeuten n-fache Überexpression). Unten ist zum Vergleich die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Amplifikate im Agarosegel gezeigt.

CA

-IX

ILG

F-B

P3

Cyc

lin D

1M

ET

AD

FPS

urvi

vin

PR

AM

E

RCC26 IL2/B7 - +++ +++ +++ ++ ++++ - +++RCC26 IL7/B7 - ++++ +++ +++ ++ ++++ + +++

ELA

CR

GS

5O

FA

MM

P 7

VE

GF

VIM

+ - ++ - ++ + - - + ++

Tab. 1: Expressionsanalyse einiger Genkandidaten in den RCC-26–Vakzine-Zelllinien mittels quantitativer Real-time-RT-PCR.

In Tab. 1 sind einige unserer in RCC überexprimierten Antigenkandidaten und ihr Expressionsprofil in den RCC-26-Vakzine-Zelllinien gelistet. Insgesamt haben wir bis jetzt 32 verschiedene Antigene identifizieren können. Für diese haben wir 78 Peptid-Epitope mit HLA-A2-Bindungsmotiv für das Immun-monitoring unserer klinischen Phase-I-Studie ausgewählt und von R. Frank (Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Abteilung für Chemische Biologie, Braunschweig) syntheti-sieren lassen.

H. Pohla, B. Stadlbauer, A. Buchner, B. Frankenberger 1, E. Nössner 1, A. Slusarski 1, S. Stevanovic 2, D.J. Schen-del 1

Koop.: 1 Institut für Molekulare Immunologie, GSF; 2 Institut für Immunologie, Eberhard-Karls-Universität Tü-bingen.

Förderung: KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).


Identifizierung von Prognosefaktoren und antigenen Zielstrukturen an Laser-mikrodissezierten Nierenzellkarzinom-Metastasen mittels Transkriptomanalysen

Das Nierenzellkarzinom führt in Deutschland zu etwa 12.000 Neuerkrankungen jährlich. Etwa ein Drittel der Patienten haben zum Dia-gnosezeitpunkt bereits Metastasen, ein weiteres Drittel entwickelt sie im weiteren Verlauf. Für das metastasierte Nierenzellkarzinom existieren bei weitgehender Strahlen- und Chemo-resistenz als systemische Therapieoptionen eine kostenintensive und nebenwirkungsreiche unspezifische Immuntherapie auf der Basis von Zytokinen (meist Interleukin-2 und Interferon-alpha) mit Ansprechraten von maximal ca. 30% sowie die neuen Kinaseinhibitoren, die anti-angiogenetisch und antiproliferativ wirken, jedoch meist nur zu einer vorübergehenden Stabilisierung der Erkrankung führen. Abgesehen von der TNMG-Klassifikation gibt es keine tumorbezogenen prognostischen Parameter, so dass eine präzise Abschätzung des Progressionsrisikos und somit ein individuell angepasstes therapeutisches Vor-gehen kaum möglich sind.

Mit bisher üblichen methodischen Ansätzen wie RT-PCR, Western Blot und Immunhisto-chemie gelang es nicht, Zielstrukturen auf den Tumorzellen für eine spezifische Therapie oder neue Prognosefaktoren zu definieren, was nicht zuletzt an der sehr großen Zahl von Kandidatenmolekülen liegt. Seit einigen Jahren ist die Microarray-Technologie verfügbar, die eine simultane Überprüfung sehr vieler, im Ide-alfall aller in Frage kommenden Moleküle ermöglicht. Gerade im Bereich der Nukleinsäu-ren-Diagnostik ist inzwischen ein sehr hoher methodischer Standard erreicht; die aktuell ver-fügbare Generation von Oligonukleotid-Arrays (GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0, Affymetrix) erlaubt die Beurteilung der Expression von ca. 47.000 Sequenzen auf mRNA-Ebene, was annähernd einem genom-weiten Screening entspricht. Die Anwendung dieser Technologie erlaubt erstmals eine effektive, globale Suche nach prognostisch relevanten und als Therapie-Target geeigneten Molekülen in Tumoren. Die Haupt-fragestellungen lauten:

• Gibt es potentielle Zielstrukturen für eine spezifische Immuntherapie?

• Finden sich prognostisch relevante Gen-expressionsmuster?

• Sind (Immun-)Therapieresponder identifi-zierbar?

Zum Nierenzellkarzinom existieren erst wenige publizierte Daten, die meist auf sehr kleinen Serien von untersuchten Gewebeproben beru-hen und mit weniger komplexen Microarrays (cDNA-Arrays oder früheren Versionen von Oligonukleotid-Arrays) erhoben wurden. In der Regel wurde Primärtumorgewebe analysiert, Metastasen nur vereinzelt. Stets wurde die RNA aus „makroskopischen“ Gewebestücken isoliert, so dass die Stromaanteile des Tumors zwangsläufig für einen Teil der gemessenen Genexpression verantwortlich sind und damit einen Bias verursachen. Seit kurzem verfügbare Protokolle zur linearen RNA-Amplifikation erlauben zusammen mit der Technologie der Laser-Mikrodissektion Transkriptom-Analysen an sehr präzise defi-niertem Material, da gezielt vitale Tumorareale berührungsfrei isoliert und der RNA-Extraktion zugeführt werden, nicht aber Bindegewebs-brücken, große Gefäße, Nekrosen oder andere nicht relevante Zonen der Gewebeprobe. Dies minimiert die Verzerrung der Expressionsdaten durch Nicht-Tumorzellen.

Die Gewebeproben werden so rasch wie mög-lich nach Entnahme aus dem Tumor- bzw. Metastasen-Präparat durch den Pathologen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Von den Proben werden Serienschnitte im Kryostat her-gestellt und das Gewebe mittels Übersichtsfär-bung inspiziert. Schnitte der Dicke 16 µm wer-den auf spezielle Polyethylenfolie-Objektträger aufgezogen, dann fixiert und gefärbt.

Bei der Mikrodissektion (Gerät: P.A.L.M. Mic-roBeam; Prinzip: Abb. 1) werden Tumorzell-areale mitsamt der Trägerfolie durch den fokussierten N2-Laser erst umschnitten und so von der Umgebung abgetrennt. Dann wird das isolierte Areal durch einen einzelnen Laserim-puls in den direkt darüber positionierten Deckel eines speziellen Reaktionsgefäßes katapultiert und bleibt dort haften. Sind alle interessanten Gewebeareale auf diese Weise in den Deckel transferiert, wird das Gewebe lysiert und die RNA extrahiert. Alternativ sind auch weitere Downstream-Analysen möglich, beispielsweise auf Protein-Ebene. In einem Proof-of-principle-Kooperationsprojekt konnte die erfolgreiche Analyse differentiell exprimierter Proteine an mikrodisseziertem Nierentumor-gewebe demonstriert werden (J. Proteome Res. 2005).


Abb. 1: Prinzip der Laser-Mikrodissektion: Die relevanten Gewebeareale auf dem Objektträger werden zunächst mit dem Laser von der Umgebung isoliert und danach (auf der Trägerfolie) berührungsfrei in das Auffanggefäß transfe-riert (Grafik mit freundlicher Genehmigung von P.A.L.M. Microlaser Technologies AG, Bernried).

Die RNA wird nach der Extraktion mittels Kapillarelektrophorese (Agilent 2100 Bio-analyzer mit RNA 6000 Pico LabChip-Kit) auf Integrität überprüft (Abb. 2). Intakte Proben werden mit zwei Zyklen reverser Transkription und linearer In-vitro-Transkription amplifiziert und dann auf das Microarray hybridisiert. Dort ist jedes Transkript durch je 11 Perfect-match- und 11 Mismatch-Areale (Quadrate mit 11 µm Kantenlänge) repräsentiert. Durch Laser-Fluoreszenzmessung dieser Areale erhält man zu jeder Gewebeprobe einen Rohdatensatz für ca. 47.000 Gene (inkl. Varianten; jeweils 22 Messwerte).

Abb. 2: Beispiel für intakte RNA (4 ng/µl) aus einer mikrodissezierten Nierenzellkarzinom-Metastase (Kapillar-elektrophorese). Die ribosomale 18S- und 28S-RNA bildet klare Peaks, keine Degradation; diese Probe ist zur weiteren Analyse geeignet.

Aus den Rohdaten wird nach Normierung der Arrays mit einem aufwändigen Algorithmus für jedes Gen in jeder Gewebeprobe ein

Expressionswert bestimmt. Diese Datensätze werden für alle folgenden Analysen verwendet. Dabei kommen komplexe Verfahren aus derzeit sechs verschiedenen für Expressions-daten spezialisierten Softwarepaketen zum Einsatz.

Zwischen Metastasen in verschiedenen Organen gibt es keine typischen Unterschiede im Expressionsprofil (Abb. 3). Dagegen zeigen Metastasen meist deutliche Ähnlichkeit zum zugehörigen Primärtumor (Analyse von 10 korrespondierenden Probenpaaren).

Abb. 3: Nierenzellkarzinom-Metastasen in verschiedenen Organen (Farbcode) unterscheiden sich nicht im Expressionsprofil. Die 3D-Darstellung der ersten drei principal components zeigt keine Gruppierung der Proben.

Derzeit werden funktionelle Analysen der Expressionsdaten durchgeführt, die erstmals gemeinsame Veränderungen in Signal-transduktions- und Stoffwechselwegen der Tumorzellen in den Metastasen aufzeigen. Dies kann einen Ansatzpunkt darstellen zur Entwicklung neuer, zielgerichteter Therapie-verfahren.

Von 28 Patienten mit klarzelligen Nierenzell-karzinom-Metastasen liegen Follow-up-Daten vor. Mit dem neuartigen Verfahren der semi-supervised principal components analysis (mit leave-one-out-cross validation (LOOCV) und Permutationstest; Bair E and Tibshirani RJ 2004) konnte eine Signatur aus 3 Genen bestimmt werden, die unabhängig von der TNMG-Klassifikation der Patienten eine signifikante Unterscheidung zwischen zwei Prognosegruppen ermöglicht (Abb. 4). Der nächste Schritt ist jetzt die Validierung dieser Gensignatur an weiteren Patienten mittels RT-PCR, um eine zuverlässige prognostische Stratifizierung und damit ein individuell optimales therapeutisches Vorgehen zu ermöglichen.


0 20 40 60 80 100 120

Zeit [Monate]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Üb

erle

ben

swah

rsch

einl

ichk

eit

low risk, n=14

high risk, n=14 p<0,05

Abb. 4: Eine Signatur aus drei Genen im Metastasen-gewebe detektiert bei 28 Patienten mit klarzelligem Nierenzellkarzinom zwei Gruppen mit signifikant unter-schiedlicher Prognose.

Ein weiterer Ansatz dieses Projekts ist die Identifizierung potentieller Targets für eine

immunologische Therapie zur gezielten Eliminierung der Nierentumor-Metastasen. Dazu werden die Microarray-Daten aufwändig nach verschiedenen Kriterien gefiltert und mit Expressionsdatenbanken abgeglichen. Solche Gene, die als potentielle Therapietargets geeignet erscheinen (z. B. regelmäßige Expression in den Metastasen, keine Expression in normalem Körpergewebe) wer-den in der Folge mit weiteren Methoden (RT-PCR, Immunhistochemie u. a.) evaluiert.

A. Buchner, M. Castro, A. Hennig, G. Assmann 1, W. Zimmermann

Koop.: 1 Institut für Pathologie, Klinikum der Universität München; Institut für Neuropathologie, Universität München; Münchner Leukämie-Labor (MLL) GmbH.

Förderung: Deutsche Krebshilfe (106141); Förder-programm für Forschung und Lehre (FöFoLe) der Universität München (343).


Funktionelle Analyse von CEACAM20, einem potentiellen Zielmolekül für die Tumorimmuntherapie des Prostatakarzinoms

Einführung: Das Prostatakarzinom ist der häufigste Tumor des Mannes. Rund 19% aller in Deutschland bei Männern jährlich neu auftretenden Krebserkrankungen betreffen die Prostata. Die oft schon in frühen Krankheitsstadien ausgestreuten Tumorzellen führen, trotz vollständiger chirurgischer Entfernung des Primärtumors, häufig zu nicht mehr kontrollierbarer Metastasierung und zum Tod. Daher wird intensiv nach neuen Zielstrukturen gesucht, die eine gezielte Hemmung oder Zerstörung von Krebszellen durch therapeutische Antikörper erlauben. Eine gegenwärtig auch für das Prostatakarzinom intensiv untersuchte Zielstruktur stellt ERBB2 dar, das besondere Bedeutung für die Tu-mortherapie bei Brusttumorpatienten erlangt hat.

Vor kurzem haben wir ein neues Mitglied der humanen karzinoembryonalen Genfamilie (CEACAM20) entdeckt, das hauptsächlich in Prostata- und in Prostatakarzinomgewebe, so-wie, in geringerem Maße, in Dünndarm und Hoden exprimiert wird. Analysen des murinen CEACAM20-Gens zeigten eine Über-expression in primären Magenadenokarzi-nomen und Brusttumoren der Maus. Durch RT-PCR-Untersuchungen konnten wir CEACAM20-Transkripte in humanen Prosta-takarzinomgeweben nachweisen. In normaler Prostata wird CEACAM20 wahrscheinlich an der lumenwärts gerichteten Seite des Prostatadrüsenepithels exprimiert, wie immunhistologische Untersuchungen mit durch genetische Immunisierung generierten CEACAM20-Antiseren zeigten (Abb. 1). Andere Mitglieder der CEA-Genfamilie sind bekannt für die Deregulation ihrer Expression in Tumorgeweben und stehen in Verdacht, an der Tumorprogression und Metastasierung beteiligt zu sein. Am bekanntesten ist CEA, das weit verbreitet als Serumtumormarker bei Kolonkarzinomen Verwendung findet. Ein ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) in der zytoplasmatischen Domäne von CEACAM20 könnte an dem Transformationsprozess der Prostataepithel-zellen durch Aktivierung des �-Catenin-Sig-nalwegs beteiligt sein, wie es z. B. für MMTV-env-transfizierte (mouse mammary tumor virus) Brustepithelzellen, für Epstein-Barr-Virus (EBV) LMP2A-exprimierende (latent membrane protein 2A) Fibroblasten oder generell bei Überexpression von ITAM-tragen-den Proteinen in Epithelzellen beobachtet wird.

Dies würde die Möglichkeit eröffnen, für den Tumor essentielle Wachstumssignale durch in-hibitorische Antikörper unterbinden zu können, wie dies für therapeutisch wirksame Anti-ERBB2-Antikörper (z. B. Trastuzumab/-Herceptin®) beobachtet wird. Unsere Ar-beitshypothese, die in diesem Projekt unter-sucht werden soll, ist in Abb. 2 grafisch dar-gestellt. Zur Abklärung des möglichen klini-schen Nutzens von CEACAM20, ist geplant, immunhistologische Expressionsanalysen an Prostatakarzinomen durchzuführen.

Abb. 1: CEACAM20-Expression in normalem Prostata-gewebe des Menschen. Kryoschnitte von normalem Pros-tatagewebe wurde mit Hilfe von Seren genetisch gegen CEACAM20 immunisierter Mäuse immunhistologisch ge-färbt. Pfeile zeigen die apikale Markierung der Drüsenepithelzellen (A). Keine Färbung wurde mit Präimmunserum beobachtet (B).

Ergebnisse: Eine wichtige Voraussetzung für die CEACAM20-Expressionsanalyse in menschlichem Tumorgeweben sind spezifische Antikörper. Da Anti-CEACAM20-Antikörper kommerziell nicht erhältlich sind, haben wir solche Antikörper durch genetische Immunisie-rung in Zusammenarbeit mit der Firma GENOVAC hergestellt. Die dafür benötigten vollständigen cDNA-Klone wurden von uns über RT-PCR generiert. Zwei monoklonale Antikörper wurden näher charakterisiert. Sie können für FACScan- und Western-Blot-Ana-lysen eingesetzt werden (Abb. 3).


Syk

src

B2

A2

B1

SSA1

N*

SS

SS B2

A2

B1

SSA1

N*

SS

SS

PI3K

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B1

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SS

SS B2

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B1

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SS

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2

1

34

SykSyk

srcsrc

B2

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SSSS

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MAPK

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2

1

34

Abb. 2: Hypothetisches Model der CEACAM20-Funktion in Normal- und Tumorgewebe. Diesem Modell liegen Be-funde anderer Gruppen zugrunde, die zeigten, dass Überex-pression von ITAM-tragenden Proteinen in Epithelzellen zu Wachstumsstimulation und Transformation führen kann. In unserem Modell wird durch einen noch unbekannten CEACAM20-Liganden CEACAM20-Moleküle vernetzt (1). Dadurch kommt es intrazellulär zu Tyro-sinphosphorylierung des ITAM durch src-Kinasen (2), was in der Folge die Bindung von Syk-Kinase über SH2-Domänen erlaubt (3). Gebundenes Syk wiederum aktiviert down-stream weitere mögliche Signalkettenkomponenten, deren Stimulierung zu Wachstum und Transformation führen. Unterbindung von Schritt (1) durch inhibitorische Antikörper könnte einen Therapieansatz darstellen.

B2

A2

B1

SSA1

N*

SS

SS A2

B1

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B1

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B1

SSA1

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SSA2

B1

SSSSA1

N*

SSSS

Abb. 3: Charakterisierung der anti-CEACAM20 (C20)-mAk 12D8 und 6G4A5. HeLa-Zellen wurden transient mit dem Vektor oder mit pcDNA3-C20-Spleißvarianten trans-fiziert (Domänenanordnung im oberen Teil der Abb. ge-zeigt) und ihre Lysate im Western Blot analysiert. Die je-weils obere Bande entspricht der erwarteten Größe der Spleißvarianten, bei den unteren Banden könnte es sich um Abbauprodukte oder Glykosylierungsvarianten handeln.

Abb. 4: CEACAM20 ist an Tyrosinresten innerhalb seiner zytoplasmatischen Domäne phosphorylierbar. HeLa-Zellen wurden transient mit pcDNA3 (Vektor) oder pcDNA3-CEACAM20 (CEACAM20) transfiziert und 30 Min. mit oder ohne Phosphataseninhibitor Pervanadat inkubiert. Western-Blot-Analysen mit Anti-p-Tyr-mAk (4G10) oder anti-CEACAM20-mAk (6G4A5; -C20) wurden zum Nachweis von P-Tyr-haltigen Proteinen bzw. CEACAM20 verwendet (Stern: Haupt-P-Tyr-Protein; Pfeile: C20).

Zur Klärung der Funktion von CEACAM20 sollte zunächst untersucht werden, ob das po-tentielle ITAM überhaupt an Tyrosinresten phosphoryliert werden kann. Nach Transfektion mit einem Full-length-CEACAM20-Plasmid bzw. mit dem leeren Vektor konnte in Gegenwart oder in Abwesenheit eines P-Tyr-Phosphatase-inhibitors im Vergleich zur Vektortransfektante ein ca. 90 kDa großes, in der Größe dem CEACAM20 entsprechendes Protein als das dominante Phosphotyrosinprotein identifiziert werden (Abb. 4). Dies spricht für die grund-sätzliche Phosphorylierbarkeit des CEACAM20-ITAM.

Des Weitern sind Fragen nach dem Einfluss von CEACAM20-Überexpression auf das Wachstum von Epithelzellen zu klären. Auch wollen wir die Signalwege aufdecken, die nach Vernetzung von CEACAM20-Molekülen durch Antikörper (ein Ersatz für Liganden-vermittelte Ligation von Rezeptoren) aktiviert werden. Offen ist noch die Häufigkeit und Stärke der Expression von CEACAM20 in Prostatakarzinomen und ihre Bedeutung für den Krankheitsverlauf. Dies soll in Zusammenarbeit mit dem Pathologischen Institut der Universität München an einer größeren Anzahl von Prostatakarzinomproben immunhistologisch untersucht werden. M. Paptistella, A. Eisenried, R. Zebhauser, R. Riesen-berg, T. Popp, K. Ebelt 1, R. Kammerer, W. Zimmer-mann

Koop.: 1 Institut für Molekulare Immunologie, GSF, Mün-chen.

Förderung: Förderprogramm Promotionsstudium “Mole-kulare Medizin” der Universität München (12/2003; 41/2005).

Optimierung von Tumorvakzinen 65

Generierung dendritischer Zellen für die klinische Anwendung

Einführung: Dendritische Zellen (DC) gehö-ren zu den effizientesten Antigen-präsentieren-den Zellen (APC) im Immunsystem und nehmen daher eine Schlüsselrolle bei der Akti-vierung spezifischer Immunantworten ein. Hieraus leitet sich auch das große Interesse ab, DC für die Immuntherapie bei Krebspatienten zu nutzen und so werden derzeit intensiv die optimale Kultivierung und Ex-vivo-Beladung der DC mit Tumorantigenen untersucht. Die Fähigkeit, tumorspezifische T-Zell-Antworten zu induzieren, konnte bereits in mehreren präklinischen Studien nachgewiesen werden.

Für eine optimale T-Zell-Aktivierung ist es wichtig, dass DC ihre Peptidantigene über MHC-Moleküle (Signal 1) präsentieren, ko-stimulatorische Moleküle (Signal 2) exprimie-ren und IL-12p70 produzieren (Signal 3) können. Eine Reifung der DC kann durch inflammatorische Signale induziert werden, wie z. B. durch Tumornekrosefaktor (TNF), IL-1β, oder durch bakterielle Lipopoly-saccharide, Ribomunyl, poly (I:C), Interferone und/oder Prostaglandine, die an die sog. Toll-like-Rezeptoren (TLR) auf den DC binden. IL-12p70-sezernierende DC sind wünschens-wert für eine Vakzineentwicklung, da sie die Polarisation der T-Zell-Entwicklung in Rich-tung T-Helfer 1 (Th1)-Zellen fördern. Th1-Zellen wiederum unterstützen die Entwicklung von CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTL), die für eine erfolgreiche Anti-Tumor-Antwort nötig sind. Ebenfalls unterstützen IL-12p70-sezernierende DC die angeborene Immunität über Induktion der NK-Zell-Proliferation. Basierend auf diesen Überlegungen wurde ein Herstellungsverfahren etabliert, um aus Monozyten (Abb. 1) eine möglichst hohe Anzahl reifer DC zu generieren, die IL-12p70 produzieren können und als APC sowohl für die Beladung mit Peptiden als auch mit RNA geeignet sind, und sich zudem problemlos einfrieren lassen.

Die Vorteile der Verwendung von RNA liegt auf der Hand: Selbst kleinste Tumormengen erlauben die Isolierung und In-vitro-Amplifi-zierung von RNA, die dann für mehrfache Immunisierungen ausreicht. Außerdem können einzelne oder Sätze von bekannten oder noch zu identifizierenden Tumorantigenen in Form ihrer RNA leicht hergestellt werden. Letztend-lich werden jedoch erst klinische Studien zei-gen können, ob eine Vakzinierung mit RNA-tranfizierten DC in der Lage ist, Toleranz zu brechen und ohne evtl. auftauchende Autoim-

munität eine Tumorimmunität im Patienten erzeugen kann (Abb. 1).

� CD80, 86, 83, 40, HLA-DR� DC-SIGN, CCR7� CD14

unreife DC reife DC

TumorantigeneTumorimmunität

Autoimmunität Toleranz

GM-CSFIL-4

Reifungs-Cocktail

Elektroporation

Monozyten

Leukapherese

Abb. 1: Strategie der DC-basierten Vakzinierung.

Präklinische Studien konnten bereits zeigen, dass DC, beladen mit Tumor-RNA aus RCC-Geweben, sehr effektiv in der Lage sind, Tumor-spezifische T-Zellen zu induzieren (Gilboa et al. 2004). Eine zweite präklinische Studie konnte diese Beobachtung bestätigen und zeigen, dass sowohl die Gesamt-Tumor-RNA als auch die amplifizierte Tumor-mRNA aus RCC-26-Tumorzellen zur Stimulation von Tumor-spezifischen CTL eingesetzt werden kann (Geiger et al. 2005).

Material und Methoden: Für die Gewinnung von Monozyten als Progenitoren wurde das ge-schlossene System einer Elutriation verwendet (Abb. 2; ELUTRA, Gambro BCT, USA), bei der die Zellen über Gegenstrom-Zentrifugation mittels Festwinkelrotor getrennt werden (2400 Umdrehungen/min.). Angereicherte Monozyten befinden sich dann in Fraktion 5 und Lympho-zyten in der Fraktion 3.

Abb. 2: ELUTRA, Gambro BCT (Lakewood, CO, USA). Geschlossenes System zur Anreicherung verschiedener Leukozyten-Populationen aus peripherem Blut.


Anschließend wurden die Monozyten mit GM-CSF (Leukine®, Berlex, USA; 100 ng/ml) und rekombinantem IL-4 (R&D Systems; 20 ng/ml) für sechs Tage kultiviert, um zunächst unreife DC zu generieren, die dann mit verschiedenen Reifungscocktails für wei-tere 24 Stunden inkubiert wurden (Tab. 1).

TNF-αααα, IL-1ββββ,IFN-γγγγ



TNF-αααα, IL-1ββββ,IFN-αααα, IFN-γγγγ

TNF-αααα, IL-1ββββ, IL-6

InflammatorischeZytokine,Interferone

+

+

+

-

+

PGE2-Zugabe

kein TLR-Ligand

-JonuleitDC1

TLR3poly (I:C)KalinskiDC2

TLR7/8TLR3

R848,poly (I:C)

Cocktail 5DC5

TLR7/8R848Cocktail 4DC4

TLR7/8,reduziertes IFN-γγγγund PGE2

R848Cocktail 3DC3

AnmerkungTLR-LigandCocktailDC

Population

Tab. 1: Reifungscocktails für die DC-Generierung. Konzentrationen: TNF-α (10 ng/ml), IL-1β (10 ng/ml), Resiquimod R848 (1 µg/ml), poly (I:C) (20 ng/ml) sowie zusätzlich bei Jonuleit et al. 1997: IL-6 (15 ng/ml), PGE2 (1000 ng/ml); Kalinski (Mailliard et al. 2004): IFN-α (3000 IU/ml), IFN-γ (1000 IU/ml); Cocktail 3: IFN-γ (1000 IU/ml), PGE2 (100 ng/ml); Cocktail 4 und 5: IFN-γ (5000 IU/ml), PGE2 (250 ng/ml).

Die DC wurden dann entweder zuvor ein-gefroren oder direkt phänotypisch analysiert. Für die funktionellen Experimente wurden die reifen DC entweder mit Peptiden beladen oder per Elektroporation mit RNA transfiziert.

Ergebnisse der In-vitro-Studien: Die durch-flusszytometrischen Analysen zeigten, dass alle DC-Präparationen den Phänotyp reifer DC aufwiesen: > 80% CD83, CD86, CD80, HLA-DR, CD40, > 60% CD209 (DC-SIGN), > 60% CD197 (CCR7) und < 2% CD14. Dieser blieb auch nach dem Einfrieren und nach dem Auswaschen der Zytokine für weitere 48 Std. stabil. Die Anzahl vitaler DC war mit dem DC2 Cocktail (Kalinski) jedoch etwas schlechter durch die starke Plastikadhärenz dieser DC. Die Expression des Chemokin-Rezeptors CCR7 weist auf die Homing-Kapazität der DC in die Lymphknoten hin, ein wesentliches weiteres Merkmal reifer DC. Abb. 3 zeigt jedoch, dass nicht alle DC-Präparationen gleichermaßen biologisch aktives IL-12p70 sezernieren, wobei sogar die DC im Jonuleit-Cocktail (DC1) nicht in der Lage sind, IL-12p70 zu produzieren. IL-10 ist als Gegen-spieler von IL-12p70 anzusehen und sollte in möglichst geringer Menge produziert werden. In einem weiteren Experiment wurde die allostimulatorische Kapazität der DC-Präparationen in gemischten Lymphozyten-Reaktionen (MLR) überprüft (Abb. 4). Alle DC

sind in der Lage, eine starke Alloantwort zu induzieren, wobei sie bei DC2 (Kalinski) etwas geringer ausfällt.

Abb. 3: ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) als funktioneller Assay zur Quantifizierung von IL-12p70 (schwarze Balken) und IL-10 (weiße Balken) im Überstand der kultivierten DC nach 24-std. Ausreifung.

Abb. 4: Analyse der allostimulatorischen Kapazität der unterschiedlichen DC-Präparationen anhand der Prolifera-tion von T-Zellen in einer gemischten Lymphozyten-Reaktion (MLR), gemessen nach sechs Tagen über radio-aktiven 3H-Thymidin-Einbau. Die Abbildung zeigt das Resultat aus drei unabhängigen Experimenten.

Anzahl IFN-γγγγ-produzierender T-Zellen pro well Abb. 5: IFN-γ-ELISPOT zur Analyse der Immunantwort autologer T-Zellen nach Stimulation mit Peptid-beladenen DC. 40.000 T-Zellen, in vitro mit den DC vorstimuliert, wurden jeweils in Triplikaten mit 20.000 autologen Mono-zyten und CEF-Peptiden im ELISPOT restimuliert. Folgende CEF-Peptide mit HLA-A2-Bindungsmotiv wurden verwendet: CMVpp65495-503 (NLVPMVATV), EBV-BMLF1280-288 (GLCTLVAML), EBV-LMP-2426-434

(CLGGLLTMV), influenza M1 protein58-66 (GILGFVFTL), and influenza RNA polymerase PA46-54 (FMYSDFHFI) von PANATecs GmbH, Tübingen.

Dass alle DC auch gleichermaßen in der Lage sind, Peptide autologen T-Zellen zu präsen-tieren, wurde anhand eines IFN-γ-ELISPOT analysiert (Abb. 5). Dazu wurden die T-Zellen


aus Fraktion 3 (54,8% CD3+) zunächst für sieben Tage mit reifen Peptid-beladenen DC stimuliert und anschließend im ELISPOT erneut restimuliert. Aufgrund der schlechteren Ernteeigenschaften reichten die DC2 für dieses Experiment nicht mehr aus.

Ferner wurde die Proteinexpression der unterschiedlichen DC-Präparationen nach Transfer von RNA per Elektroporation getestet. Als Modell diente EGFP-RNA (enhanced green fluorescent protein-RNA). Die Expres-sion wurde mittels eines EGFP-spezifischen Antikörpers am Durchflusszytometer bestimmt (Abb. 6).

Abb. 6: EGFP-Expression in DC nach Transfektion in vitro transkribierter RNA. Die RNA wurde per Elektro-poration in die reifen DC transfiziert und für die Immun-fluoreszenz 24 Std. später geerntet. Angegeben sind jeweils die Prozentsätze EGFP-positiver DC und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI).

Die Gegenwart von poly(I:C) scheint die Proteinexpression nach Transfektion der exo-genen RNA zu blockieren, vermutlich eine Art Schutzmechanismus durch TLR3 oder andere RNA-bindende Rezeptoren, um Zellen vor Fremd-RNA zu schützen. Damit scheinen DC2 (Kalinski) und DC5 für RNA-beladene DC nicht so geeignet zu sein. Cocktail 3 und 4 sind sowohl für RNA- als auch Peptid-beladene DC die geeigneten Reifungscocktails.

Fazit: Mit Hilfe der Elutriation und des neuen Reifungscocktails ist es möglich, DC zu gene-rieren, die sich insbesondere unter GMP-konformen Bedingungen leicht in großer Menge ernten lassen. Ferner zeigen sie sich

auch nach dem Einfrieren sehr stabil, produ-zieren hohe Mengen an IL-12p70 und weisen gute stimulatorische Kapazität auf. RNA kann effizient per Elektroporation in die reifen DC eingeschleust werden, wobei sich insbesondere DC eignen, die im Reifungscocktail TLR7/8-Liganden enthielten. Die Zugabe von TLR3-Liganden eignet sich dagegen anscheinend eher für DC, die beispielsweise mit Peptiden beladen werden.

Zukünftige Studien müssen nun klären, wie effizient die Kapazität derartiger mit einem Pool RCC-spezifischer Tumorantigen-RNA transfizierter DC ist, um im Patienten existierende Central-memory-T-Zellen zu reaktivieren oder de novo CD4+- bzw. CD8+ T-Zellen zu stimulieren. Dieses wird gegenwärtig an unserem RCC-26-Modell-system getestet und soll dann zur Vorbereitung einer klinischen Studie führen. Abb. 7 zeigt zusammenfassend unsere geplanten therapeu-tischen Strategien für das Nierenzellkarzinom auf.

RCC-26

RCCRCC--2626--basedbasedVaccineVaccine

Vaccine

CD80CD80

ILIL--2/IL2/IL--77

geneticengineering

1

generic totaltumor RNA

2

gene

ric p

eptid

e po

ols

4

TTT

T cells (large scope)

Adoptive Cell TherapyAdoptive Cell Therapy

TCR transgenicT cells

5

selectedselected TAAsTAAs

gene

ric R

NA

poo

ls

3

DC DC VaccineVaccine

DC

Abb. 7: Therapeutische Optionen für das Nierenzell-karzinom

H. Pohla, B. Stadlbauer, A. Zobywalski 1, M. Javorovic 1, B. Frankenberger 1, C. Geiger 1, E. Kremmer 1, I. Bi-galke 1, 2, D.J. Schendel 1

Published in: Generation of clinical grade dendritic cells with capacity to produce biologically active IL-12. Journal of Translational Medicine, 5:18, 70 (2007)

Koop.: 1 Institut für Molekulare Immunologie, GSF; 2 GMP-Labor der GSF.

Förderung: SFB 455 (Projekte C1 und Z1; D.J. Schendel), KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).


Konstruktion und Charakterisierung von T-Zell-Rezeptor-Gen-modifizierten T-Zellen für den adoptiven Transfer

Einführung: Grundlegende Arbeiten von H.-J. Kolb (Medizinische Klinik III, Klinikum der Universität) hatten gezeigt, dass eine Infusion von Spender-Lymphozyten nach Knochenmarktransplantation die Eliminierung von Leukämiezellen herbeiführen kann und auf einer T-Zell-vermittelten Immunität basiert. Dies bedeutet, dass das Immunsystem grundsätzlich dazu in der Lage ist, Tumoren zu heilen. Allerdings lässt sich der Schwierigkeitsgrad, klinische Erfolge bei möglichst geringen Nebenwirkungen mit Hilfe der adoptiven T-Zell-Therapie zu erzielen, wie folgt reihen:

Virus-assoziierte Erkrankungen � Virus-asso-ziierte hämatopoetische Tumoren � hämato-poetische Tumoren ohne bekannte virale Be-teiligung � solide Tumoren.

Solide Tumoren sind somit das schwierigste Target, machen aber 80-90% aller Krebser-krankungen aus (Karzinome epithelialen Ur-sprungs) und sind sehr oft nicht kurabel. Selbst in vergleichbar einfachen Mausmodellen kön-nen adoptiv transferierte spezifische T-Zellen Tumoren, die länger als ca. 14 Tage zu soliden Tumoren wachsen konnten, in der Regel nicht mehr abstoßen. Die Ursachen sind nicht völlig geklärt. Einige Befunde zeigen, dass T-Zellen solides Tumorgewebe nicht effizient infiltrieren können. Eine andere Möglichkeit ist, dass das Target-Antigen nicht ausreichend stark ausgeprägt wird und daher nicht kreuz-präsentiert werden kann. Es gibt gute Hinweise, dass Vorbehandlung durch beispiels-weise Chemotherapie oder Entzündungs-mediatoren das Tumorgewebe wieder zugänglicher für T-Zellen machen. Die genauen Wirkmechanismen solcher kombinierter Therapien, vor allem Verteilung, Migration oder Überleben transferierter T-Zellen, sind noch unzureichend verstanden.

Die Komplexität des adoptiven T-Zell-Transfers erfordert die interdisziplinäre Zu-sammenarbeit zwischen Grundlagen- und klinischen Immunologen, Molekularbiologen, Virologen und klinisch tätigen Wissen-schaftlern. Langfristig wird sich der Erfolg des adoptiven T-Zell-Transfers an klinischen Er-gebnissen messen lassen müssen. Sowohl die für die klinische Anwendung notwendige Tech-nologieentwicklung als auch kleinere klinische Pilotstudien selber sind häufig nicht sonderlich publikationsträchtig, aber essentiell für eine Verbesserung klinischer Forschung. Aus

diesem Grund wurde ein neuer transregionaler Sonderforschungsbereich zwischen München (stellvertretende Sprecherin: D.J. Schendel) und Berlin (Sprecher: T. Blankenstein) mit dem Thema „Grundlagen und Anwendung adoptiver T-Zell-Therapie“ etabliert (SFB-TR 36/1).

Selbst wenn es hoch affine T-Zellen gegen Tumorantigene gibt, muss man nach heutigem Kenntnisstand davon ausgehen, dass es sich hierbei um individual-spezifische, d. h. soma-tisch mutierte, Antigene handelt. Dadurch ent-ziehen sie sich praktisch einem therapeutischen Ansatz. Was bleibt, sind sog. Tumor-assoziierte Antigene (TAA), d. h. Selbst-Antigene, gegen die Toleranzmechanismen, etwa die klonale Deletion hoch affiner T-Zellen, nicht ausgeschlossen werden können. Um hoch affine T-Zellen gegen Selbst-Anti-gene herzustellen, muss man das Problem der klonalen Deletion umgehen. Die T-Zellen müssen aus einem Antigen-, bzw. MHC/Peptid-Komplex-freien Milieu generiert werden. Die Antigenspezifität der T-Zellen wird durch die beiden Ketten des T-Zell-Rezeptors (TCR) vermittelt. Da recht effektive Methoden und Vektoren etabliert sind, quantitativ Gene in primäre T-Zellen einzuschleusen und auszuprägen, nimmt der TCR-Gentransfer daher viel Raum in diesem SFB ein (Abb. 1). Dies ist zum einen sinnvoll, um sich hoch affine Antigen-spezifische Patienten-T-Zellen gegen Selbst-Antigene aus Tumoren herzustellen. Weiterhin könnte der TCR-Gentransfer den Zeitablauf zur Her-stellung spezifischer, auch gegen virale Anti-gene gerichtete, T-Zellen so verkürzen, dass adoptive T-Zell-Therapie praktikabler wird.

Adoptiver T-Zell-Transfer

Patient

T-Zell-Isolierung

Ex vivoTCR

Gentransfer

Abb. 1: Adoptiver T-Zell-Transfer: Redirigierung der T-Zell-Spezifität über einen Ex-vivo-TCR-Gentransfer.

Projekt Z1: Verschiedene Teilprojekte des SFB-TR 36/1 beinhalten die Generierung von Antigen-spezifischen T-Zellen durch TCR-Gentransfer, deren Charakterisierung und den adoptiven Transfer TCR-modifizierter T-Zellen. Im Rahmen des Z1-Projektes wird unter der Leitung von W. Uckert (Berlin), H. Pohla (LTI, Universität München) und B. Gänsbacher (TU München) ein TCR-Labor


als core facility mit Standorten in Berlin und München etabliert (Abb. 2). Die Konstruktion von TCR-modifizierten T-Zellen und deren Charakterisierung wird als Kooperations-leistung für andere Gruppen durchgeführt bzw. als Technologie weitergegeben. Retrovirus-Vektoren für den TCR-Gentransfer werden optimiert und neuartige Verpackungszellen für die Produktion von TCR-Retroviren sowie Indikatorzelllinien zum Nachweis der TCR-Funktion konstruiert. Methoden werden etabliert, um aus Biopsiematerial und Blut von Studienpatienten vitale Antigen-spezifische T-Zellen isolieren und diese phänotypisch und funktionell charakterisieren zu können. Diese Methoden dienen neben der Detektion Antigen-spezifischer T-Zellen auch der Generierung von T-Zellen für den adoptiven Transfer.

Klonierung derTCR Gene

T-Zell-Klonierung

Generierung derTCR-Retroviren

Transduktionder PBL

LTR LTRTCR

TCR Identifizierung,RNA Isolierung → cDNA(RT-PCR, RACE-PCR)

Erste funktionelleCharakterisierung

Anreicherung,Expansion

Z1Core facility

Berlin/München

Koop.PartnerKoop.

Partner

Koop.Partner

Koop.Partner

Abb. 2: Schema zur Konstruktion und Charakterisierung TCR-Gen-modifizierter T-Zellen für den adoptiven Transfer im Rahmen des Z1-Projektes.

Die Vorteile der Einrichtung einer derartigen Serviceeinheit liegen auf der Hand: die Ver-wendung von Standardprotokollen, die Ver-gleichbarkeit der Resultate, die gleich bleiben-de Qualität der Produkte sowie Zeit- und Geld-ersparnis. Außerdem dient sie als Basis für die Produktion der GMP-Reagenzien (Abb. 3).

ExperimentelleForschung

KlinischeAnwendung

GMP-Labor

Selektion der TCR für die klinische Anwendung

Design des Protokolls

Dokumentation der Reagenzien

Adaption des experimentellen Ansatzes

Z1Core facility

Berlin/München

Abb. 3: Die Z1-core-facility als Basis für die Produktion der GMP-Reagenzien für den adoptiven Transfer TCR-Gen-modifizierter T-Zellen.

Proof of principle: In einer Zusammenarbeit der Arbeitsgruppen E. Nössner, D.J. Schendel,

W. Uckert und T. Blankenstein ist eine effektive und reproduzierbare TCR-Genexpres-sion in primären T-Zellen etabliert worden. Abb. 4 zeigt die Expression des RCC-26-spezifischen TCR nach retroviralem Transfer in 48% der humanen PBL. Die transduzierten Zellen wiesen gleiche Spezifität und Sensitivi-tät wie die ursprünglichen TIL-26-Zellen auf (Abb. 5).

Vββββ22

coun

ts

100 101 102 103 1040

200

48 %

Abb. 4: Expression des RCC-26-spezifischen Vβ22 TCR auf primären Blutlymphozyten gezeigt anhand einer durchflusszytometrischen Analyse mit einem Vβ22-spezi-fischen monoklonalen Antikörper (Engels et al. 2005, Hum. Gene Ther.).

% s

pezi

fisch

e Ly

se

Abb. 5: Nachweis der zytotoxischen Aktivität humaner PBL nach retroviralem Transfer des RCC-26-spezifischen TCR von TIL-26 (Engels et al. 2005, Hum. Gene Ther.). Als Kontrollen dienten die Normalnieren-Zelllinie NKC-26, die lymphoblastoide B-Zelllinie LCL-26, die Erythroleukämielinie K-562 sowie eine weitere RCC-Linie RCC-53, die alle nicht erkannt wurden.

Fazit: Der adoptive T-Zelltransfer, kombiniert mit der Generierung neuer Antigenspezifität, bietet die Möglichkeit, hoch affine T-Zellen gegen praktisch jedes Zielantigen zu generie-ren. Generell ist adoptive T-Zell-Therapie bei Krebs die am wenigsten untersuchte Form der Immuntherapie; bietet nach gegenwärtigem Kenntnisstand aber das größte Potenzial, u. a. da sie mit anderen Therapieformen wie Chemotherapie kombiniert werden kann.

H. Pohla, H. Herbig, B. Stadlbauer, M. Anton 1, B. Gänsbacher 1, B. Frankenberger 2, E. Nössner 2, B. Engels 3, W. Uckert 4, D.J. Schendel 2, T. Blankenstein 4

Koop.: 1 Institut für Experimentelle Onkologie und Therapieforschung, TU München; 2 Institut für Molekulare Immunologie, GSF; 3 Institut für Biologie, Humboldt-Universität Berlin; 4 Institut für Immunologie, Charité-Berlin und Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin-Buch.

Förderung: SFB-TR 36/1.


Die Rolle der CEACAM-Moleküle bei der DC-T-Zell-Interaktion

Einführung: Das carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1) ist ein hochglykosyliertes Transmembran-protein der Karzinoembryonalen Antigen-familie, die ihrerseits zur Immunglobulin-superfamilie gezählt wird. CEACAM1 wird von unterschiedlichen Zellen wie z. B. Endothel-, Epithelzellen und Zellen des Immunsystems exprimiert. Neben neutrophilen Granulozyten exprimieren humanen T-, NK- und B-Zellen sowie T- und B-Zellen der Maus, der Ratte und des Rindes CEACAM1. CEACAM1 vermittelt homophile Zell-Zell-Adhäsion, und leitet dabei mittels im zytoplasmatischen Teil befindlichen ITM (im-munoreceptor tyrosin-based motif) Signale in das Zellinnere. Diese Signale sind unter anderem an der Regulation der T-Zell-aktivierung beteiligt. In vivo wird die T-Zellaktivierung durch Antigen präsentie-rende Zellen (APC) gesteuert, die den naiven T-Zellen zusätzlich zur Präsentation von Anti-genen entsprechende kostimulatorische, aber auch koinhibitorische Signale vermitteln. Die für die T-Zellaktivierung wichtigsten APC sind die dendritischen Zellen (DC). Kürzlich fanden wir, dass CEACAM1 von murinen DC expri-miert wird und Signale zur Reifung der DC vermittelt. Moleküle mit einem solchen Poten-tial sind interessante Zielstrukturen, um die Effektivität von DC-basierten Tumorimmun-therapien zu verbessern. Allerdings ist bis heute nichts über die Expression von CEACAMs in humanen DC bekannt.

Ergebnisse: Unsere Untersuchungen zeigen, dass humane DC in erster Linie nach Stimulation mit INFγ CEACAM1 expri-mierten. In vivo wird INFγ im Zuge der von DC vermittelten T-Zellaktivierung freigesetzt, so dass während der T-Zell-DC-Interaktion CEACAM1 auf der Oberfläche beider Zelltypen erscheint und über homophile Inter-aktion das Verhalten beider Zellen regulieren kann. Die für murine DC beschriebene Vermittlung von Reifungssignalen, konnten wir für humane DC bisher nicht bestätigen. Der Grund für diese speziesspezifischen Unter-schiede könnte in der unterschiedlichen Signaltransduktion von CEACAM1 in den ver-schiedenen Spezies liegen. In der Tat kennt man zwei verschiedene Spleißvarianten von CEACAM1, die sich dramatisch in ihrem zy-toplasmatischen Teil unterscheiden. Die CEACAM1-Variante mit der längeren zytoplasmatischen Domäne enthält zwei ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition

motif), die bei der kurzen zytoplasmatischen Variante fehlen. Wie eigene Untersuchungen zeigten, unterscheidet sich interessanterweise, das Verhältnis der exprimierten Spleiß-varianten zwischen murinen und humanen DC stark. Während in murinen DC etwa die Hälfte des exprimierten CEACAM1 den kurzen zytoplasmatischen Teil hat, kommt diese Spleißvariante in humanen DC praktisch nicht vor (Abb. 1).

Abb. 1: Expression von CEACAM1-Spleißvarianten in DC von Maus und Mensch. A: Die Gesamt-RNA von reifen (für 6 Tage kultivierte (d6)) und unreifen (für 8 Tage kultivierte (d8)) murinen DC wurde mit der RT-PCR unter Verwendung von CEACAM1-spezifischen Primern analysiert. Links ist die Analyse der zwei zyto-plasmatischen Isoformen und rechts die Analyse der Isoformen, die sich im extrazellulären Bereich unter-scheiden, gezeigt. B: Zeitlicher Verlauf der Expression von unterschiedlichen CEACAM1-Spleißvarianten unter INFγ-Stimulation.

Da sich die CEA-Genfamilie in Maus und Mensch stark unterscheidet (siehe auch http://cea.klinikum.uni-muenchen.de) besteht die Möglichkeit, dass die oben erwähnten funktionellen Unterschiede durch die unter-schiedliche Expression von weiteren CEA-Familienmitgliedern hervorgerufen wer-den. Tatsächlich konnten wir zeigen, dass murine DC außer CEACAM1 auch CEACAM10, CEACAM15 (reife DC) und CEACAM19 (unreife DC) exprimieren (Abb. 2A). In humanen DC konnten wir neben CEACAM1 auch zwei Spleißvarianten von CEACAM19 nachweisen. CEACAM19-TM verfügt über eine Transmembrandomäne und einen zytoplasmatischen Teil, der ein ITAM-ähnliches Sequenzmotiv enthält. Die CEACAM19-S-Spleißvariante ist ein sezer-


niertes Molekül (Abb. 2B). In der Maus gibt es nur die transmembran verankerte Isoform.

Mon

ozyte

nun

reife

DC

reife

DC

CEACAM19-S

CEACAM19-TM

ß-Aktin

unreif

CEACAM1a

CEACAM2

CEACAM9

CEACAM10

CEACAM12

CEACAM15

CEACAM18

CEACAM19

CEACAM20

�-Aktin

285

495

407

396

259

394

482

388

497

569

reifDC der MausA

B

Mon

ozyte

nun

reife

DC

reife

DC

CEACAM19-S

CEACAM19-TM

ß-Aktin

unreif

CEACAM1a

CEACAM2

CEACAM9

CEACAM10

CEACAM12

CEACAM15

CEACAM18

CEACAM19

CEACAM20

�-Aktin

285

495

407

396

259

394

482

388

497

569

reifDC der MausA

B

Abb. 2: Expression von CEACAM in DC von Maus und Mensch. A: Die Gesamt-RNA von unreifen und reifen murinen DC wurde mit RT-PCR unter Verwendung von Gen-spezifischen Primern analysiert. B: Expression von unterschiedlichen CEACAM19-Spleißvarianten in humanen DC.

Für die DC-T-Zell-Interaktion könnten mögliche molekulare Interaktionen, mit von T-Zellen exprimierten CEACAMs, von Bedeutung sein. Bisher wurde in T-Zellen nur die Expression von CEACAM1-Isoformen gezeigt. Inwieweit CEACAM1 in der Maus oder im Menschen mit CEACAM10 oder CEACAM19 heterophil interagieren kann, ist nicht bekannt. Die beschriebene Interaktion von CEACAM1 und CEACAM10 in der Ratte, lässt eine solche Interaktion als wahrscheinlich erscheinen. Würde dies zutreffen, könnten folgende, in Abb. 3 schematisch dargestellte, speziesspezifischen Signale für die unterschiedliche Regulation der DC-T-Zell-Interaktion in Maus und Mensch verantwortlich sein. Zum Beispiel exprimieren murine DC einen großen Teil des CEACAM1 mit der kurzen zytoplasmatischen Domäne. Diese Isoform induziert Differenzierung in epithelialen Zellen und könnte daher auch für die Reifung der murinen DC verantwortlich sein. Die nahezu vollständige Abwesenheit dieser kurzen CEACAM1-Isoform könnte der

Grund dafür sein, dass CEACAM1-vermittelte Signale in humanen DC keine Reifung auslösen.

CEACAM1

CEACAM19 TM

ITIM ITSM

ITAM

MausTDC

Mensch

CEACAM10

Short form CEACAM19 S

DC

CEACAM1

CEACAM19 TM

ITIM ITSM

ITAM

MausTDC

Mensch

CEACAM10

Short form CEACAM19 S

DC

Abb. 3: Schematische Darstellung der möglichen spezies-spezifischen CEACAM-CEACAM-Interaktionen und der dadurch transduzierten Signale während der DC-vermittelten T-Zell-Aktivierung. Die Zellmembranen der T-Zellen (T) sind in der Mitte angeordnet, die der dentritischen Zellen (DC) sind links (Maus) und rechts (Mensch), dargestellt. ITIM: immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITSM: immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activation motif.

Demgegenüber scheint die Bilanz von inhibierenden und aktivierenden CEACAM- vermittelten Signalen in Mensch und Maus vergleichbar zu sein, wenn auch die Regulation dieses Verhältnisses auf unterschiedliche Weise realisiert ist. In beiden Spezies dominieren CEACAMs, die aktivierende Signale übermitteln, auf unreifen DC, während auf reifen DC CEACAMs dominieren, die inhibierende Signale vermitteln können. Während der DC-Reifung wird dies in der Maus durch die Herunterregulation des ITAM-tragenden CEACAM19, im Menschen durch die Hochregulation des ITIM-haltigen CEACAM1 realisiert. Schließlich können die löslichen CEACAMs die Feinregulation der CEACAM-Interaktionen während der DC-T-Zell-Kommunikation übernehmen. Das Verständnis der Rolle der CEACAMs bei der DC vermittelten T-Zellaktivierung könnte neue therapeutische Möglichkeiten eröffnen, Immunreaktionen gezielt zu beeinflussen.

R. Kammerer, B. Sievers, A. Hennig, T. Popp, B.B. Singer 1, W. Zimmermann

Koop.: 1 Institut für Anatomie, Universitätsklinikum Essen.

Förderung: KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).


Induktion von Anti-Tumor-Immunantworten durch Photodynamische Therapie

Einführung: Die Photodynamische Therapie (PDT) ist eine neuartige Modalität zur Be-handlung von Krebs. Dabei werden Photo-sensibilisatoren oder metabolische Vorstufen, wie 5-Aminolävulinsäure (5-ALA), ver-abreicht, die bevorzugt in Tumorzellen akkumulieren oder metabolisiert werden. Be-strahlung des Tumors mit Licht zerstört den Tumor hauptsächlich durch die Bildung von hochreaktivem Singulett-Sauerstoff und freien Radikalen, deren Entstehung durch den Photosensibilisator vermittelt wird. Es konnte gezeigt werden, dass PDT in Mäusen systemische Immunreaktionen auslösen kann, von denen man annimmt, dass sie für das vollständige Verschwinden von Tumoren in Mausmodellen verantwortlich sind. Weiterhin erwiesen sich Extrakte aus PDT-behandelten Tumorzellen als wirksamer zur immunthera-peutischen Behandlung von Maustumoren als Lysate durch UV- oder Gammastrahlung ab-getöteter Tumorzellen. Gelegentlich bei Gli-ompatienten nach PDT beobachtete vollstän-dige Tumorregressionen, legen nahe, dass auch beim Menschen durch PDT systemische Anti-Tumorimmunreaktionen ausgelöst werden. Wir haben uns nun zum Ziel gesetzt, die PDT im Sinne einer maximal wirksamen Anti-Tumor-Immunantwort zu optimieren.

Ziele und Vorgehen: Für die Anwendung der PDT mit Anti-Tumorimmunantwort im Maus-model und im Patienten müssen drei Effekte optimiert werden: i) direkte Tumorzerstörung durch PDT, ii) die Stimulation der Immun-antwort durch PDT und iii) die differentielle Akkumulation des Photosensibilisators im Tumor im Vergleich zum zu schonenden Normalgewebe.

Etablierung des Tiermodells: Das beste zugängliche spontane autochthone Prostata-karzinom-Mausmodell stellt das C57BL/6-TRAMP-Modell (transgenic adenocarcinoma mouse prostate) dar. Die Mäuse enthalten ein Transgen bestehend aus dem Ratten-Probasin-promotor und dem SV40-T-Antigen-Gen und entwickeln im Alter von 10 Wochen pathologische Epithelveränderungen in der Prostata und 2 Wochen später sind die ersten Metastasen vor allem in den aortanahen Lymphknoten und in der Lunge feststellbar. Im Alter von 28 Wochen zeigen 100% der Männchen ausgeprägte Metastasierung. Von TRAMP-Prostata-Adenokarzinomen wurden Zelllinien etabliert (C1 und C2), die subkutan in syngenen C57BL/6-Mäusen transplantiert

werden können. Immuntherapeutische Studien zeigten, dass gegen das SV40-T-Antigen in diesem Modell eine periphere Toleranz besteht, die grundsätzlich (z. B. mit peptidbeladenen DC) gebrochen werden kann. Zu Beginn dieses Projektes wurde die subkutane Tumorbildung der C1- und C2-Zelllinien bestimmt. Dabei hat es sich gezeigt, dass unter den von uns gewählten Versuchsbedingungen die Trans-plantation von 3 x 106 Tumorzellen für ein sicheres reproduzierbares Angehen beider Tumorzelllinien notwendig war (Abb. 1). Die subkutan wachsenden Tumoren reicherten den Photosensibilisator Protoporphyrin IX (PPIX) nach i.p.-Injektion von 500 mg/kg 5-ALA, innerhalb von 3 h hoch selektiv an, so dass selbst sehr kleine Tumoren eindeutig von dem umgebenden Normalgewebe abgrenzbar waren.

Abb. 1: Reproduzierbares Wachstum von subkutan transplantierten C1-Zellen in männlichen immun-kompetenten Wildtyp-C57BL/6-Mäusen. A: Wachs-tunmsgeschwindigkeit der Tumoren nach subkutaner inokulation von 1 x 106 und 3 x 106 C1 Prostatakarzinom-zellen in verschiedenen Mäusen. B: Subkutan gewachsener C1-Tumor (mit weißer Linie eingekreist).

Empfindlichkeit der C1-Zellen gegenüber PDT: Im weiteren Verlauf der Untersuchungen haben wir das PPIX-Anreicherungsverhalten der C1- und C2-Zellen bestimmt. Dabei konnten wir zeigen, dass eine homogene An-reicherung in der Zellpopulation stattfindet


(Abb. 2). Das Maximum der 5-ALA-Anreicherung wird bei einer Konzentration von 50 µg 5-ALA pro ml Kulturmedium erreicht. Um die Vitalität der PDT-behandelten Tumorzellen, sowie deren transkriptionelle Reaktionsfähigkeit aufrecht zu erhalten, sind wir, abweichend vom üblichen Vorgehen, dazu übergegangen die 5-ALA-Inkubation in Anwesenheit von 5% fötalem Kälberserum durchzuführen. Unter den oben angeführten Beladungsbedingungen konnten wir die LD50 für die C1- und C2-Zellen bei einer Lichtdosis von 2 J/cm2 bestimmen (Abb. 2).

AC1 C2

B

C

Übe

rlebe

n [%

]R

eativ

eFl

uore

szen

zint

ensi

tät

0 10 200

10

20

30

40

50C1C2

C1 5-ALAC2 5-ALA

Zeit [h]

0 1 2 3 4 5 60

20

40

60

80

100

120 C1 C2

Lichtdosis [J/cm2]

AC1 C2

B

C

Übe

rlebe

n [%

]R

eativ

eFl

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szen

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ensi

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0 10 200

10

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30

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50C1C2

C1 5-ALAC2 5-ALA

Zeit [h]

0 1 2 3 4 5 60

20

40

60

80

100

120 C1 C2

Lichtdosis [J/cm2] Abb. 2: Anreicherung von PPIX in C1- und C2-Zellen und deren Empfindlichkeit gegenüber PDT. A: C1- und C2-Zellen wurden für 4 h mit 100 µg/ml 5-ALA inkubiert und das angereicherte PPIX mittels Durchflusszytometrie bestimmt. B: C1- und C2-Zellen wurden mit 50 µg/ml inkubiert und der Gehalt an PPIX in den Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten bestimmt. C: C1- und C2-Zellen wurden mit 5 µg/ml 5-ALA für 4 h inkubiert und mit unterschiedlichen Lichtdosen bestrahlt. Nach 4 h wurde die Vitalität der Zellen mit dem MTT-Test bestimmt.

Reaktion der C1-Zellen auf eine subletale PDT: Zellen reagieren auf Noxen, wie zum Beispiel auf Schädigungen durch PDT-generierte reaktive Sauerstoffspezies, mit der Induktion von Stressproteinen und pro-inflammatorischen Faktoren. Diese können im Falle von Tumorzellen einen stimulierenden Einfluss auf die Induktion einer Anti-Tumorimmunantwort beim Vorliegen ge-eigneter Gefahrensignale (danger signals) haben. Hitzeschockproteine (HSP) stellen eine wichtige Gruppe von Stressproteinen dar, die eine effektive Anti-Tumorimmunantwort unterstützen können. Einige dieser Proteine (z. B. HSP90) werden, komplexiert mit Tumorpeptiden, bereits in klinischen Studien getestet. Wir haben deshalb C1-Zellen einer PPIX-vermittelten PDT unterzogen und die Expression verschiedener Hitzeschockproteine auf Proteinebene mittels Western Blot untersucht. Wie in Abb. 3 gezeigt, reagieren die C1-Zellen auf Hitzestress mit der Hochregulation verschiedener HSP, und tatsächlich war auch in PDT behandelten C1-Zellen eine Hochregulation von HSP70 nachzuweisen. Obwohl die Hochregulation bei weitem nicht so ausgeprägt war wie nach Hitzebehandlung, zeigen diese Experimente deutlich, dass Tumorzellen im Zuge einer PDT so genannte danger signals aussenden, die bekanntermaßen die Immunantwort unter-stützen.

Abb. 3: Induktion von Hitzeschockproteinen. A: C1-Zellen wurden mit 5-ALA beladen und mit 2 J/cm2 bestrahlt. Die überlebenden Zellen wurden nach den angegebenen Zeitpunkten geerntet und die Expression der HSP mittels Western Blot bestimmt. B: Der Hitzeschock wurde in einem Wasserbad bei 45°C für 22 min. durchgeführt.

R. Kammerer, P. Palluch, W. Beyer, R. Baumgartner, M. Heide, H. Pohla, H. Stepp, W. Zimmermann

Förderung: Deutsche Krebshilfe (107320).


Erfolgreiche Immuntherapie des Magenkarzinoms in einem spontanen autochthonen Mausmodell

Einführung: Auf der Basis zweier transgener Mausmodelle haben wir in den letzten Jahren ein In-vivo-Tumormodell aufgebaut, das für die Überprüfung und Optimierung von Tumor-immuntherapien hervorragend geeignet ist. Im ersten transgenen Mausmodell wird ein humanes Tumorantigen (CEA) exprimiert (CEA-tg-Mäuse). Das CEA wird in diesen Mäusen als Selbstantigen akzeptiert, so dass, wie im Menschen, keine immunologische Reaktion gegen dieses Antigen induziert wird. Im zweiten transgenen Modell wird das T-An-tigen, ein Onkogen des SV40-Virus, unter der Kontrolle des CEA-Promotors exprimiert (424CEA-Tag-tg-Mäuse). Dies führt in 100% der Tiere in einem Alter von 90-110 Tagen zu einer spontanen Tumorentwicklung im Pylorusbereich des Magens (Abb. 1).

Abb. 1: Vergleich des Magens einer 424CEA-TAg-tg-Maus (links) und einer Wildtyp-C57BL/6-Maus (rechts). Die einzelnen Bereiche des Magens sind in der Mitte der Abbildung angegeben und markieren die entsprechenden Regionen beider Mägen. Die Mägen wurden entlang der kleinen Kurvatur geöffnet.

Kreuzt man diese beiden Tierstämme, so erhält man Mäuse, die, wie oben beschrieben, Magen-karzinome entwickeln und das humane Tumorantigen im Tumor und im Normal-gewebe exprimieren (CEA424-TAg/CEA-tg). Aus diesen spontan entstandenen Tumoren beider transgener Mausstämme haben wir mehrere Tumorzelllinien etabliert und charakterisiert. Die Tumorzelllinien können, trotz der Expression der erwähnten Antigene, in immunkompetente Wildtyp-C57BL/6-Mäuse subkutan transplantiert werden, ohne eine Abstoßungsreaktion auszulösen. Durch die Kombination der verschiedenen Mausstämme und den daraus etablierten Zelllinien können wir die Wirksamkeit von Tumorimmun-therapien in Modellen mit aufsteigendem Schwierigkeitsgrad, bis hin zu einem spontan entstehenden Tumor, überprüfen. In Abb. 2 sind die Komponenten und ihre Kombinations-möglichkeiten schematisch zusammengefasst.

C57BL/6J CEA424-TAg

transplantierbar

C57BL/6J

Etablierte Zelllinien(CEA424-TAg/CEA-tg)

mGC11++mGC2++ mGC4++

CEA424-TAg transgene Mäuse (H-2b)

Spontaner Magentumor

CEA424-TAg/CEA transgeneMäuse (H-2b)

Etablierte Zelllinien(CEA424-TAg-tg)

424GC+-mGC3+-mGC5+-mGC8+-

transplantierbar

CEA424-Tag-tgCEA-tg

(CEA424-TAg/CEA)-tg

Einzelnes TSA

ZweiTSA

Einzelnes TAA

TSA TAA

TSA TAA

TAA TAA

Abb. 2: Schematische Darstellung der unterschiedlichen Tumormodelle zur systematischen Optimierung von Tumorimmuntherapien.

Ergebnisse: Um grundsätzlich die Frage zu beantworten, ob die Progression des spontan entstehenden Magentumors in den transgenen Mäusen durch eine Tumorimmuntherapie beeinflusst werden kann, haben wir einen adoptiven Transfer von Milzzellen aus nicht immunisierten (naive, T-Ag-spezifische T-Zellen) und gegen SV40-T-Ag-immuni-sierten (geprimte, T-Ag-spezifische T-Zellen) C57BL/6-Mäusen auf CEA424-Mäuse durch-geführt. Bei diesem Vorgehen wird die zentrale Toleranz gegenüber dem T-Ag, die in den transgenen Mäusen besteht, umgangen. Wie in Abb. 3 gezeigt ist, haben die CEA424-Mäuse, die einmal Milzzellen von immunisierten C57BL/6-Mäusen bekamen („Adoptiver Transfer 1“) eine signifikant längere Über-lebenszeit als Mäuse, die Milzzellen von nicht immunisierten Tieren („Kontrolle“) bekamen oder bei denen kein adoptiver Transfer durch-geführt wurde. Die Überlebenszeit konnte noch einmal deutlich erhöht werden wenn eine Wiederholung des adoptiven Transfers durch-geführt wurde („Adoptiver Transfer 2“) (Abb. 3). Wurden Milzzellen von nicht immun-isierten C57BL/6-Mäusen transferiert und die transgenen Rezipienten danach gegen das SV40-T-Ag immunisiert, so konnten wir keine Lebensverlängerung erzielen. Analysen der Milzzellen dieser Tiere zeigten jedoch, dass eine begrenzte Anzahl von T-Ag-spezifischen T-Zellen durch diese Behandlung erzeugt wurde. Die Frequenz der antigenspezifischen T-Zellen konnte jedoch durch wiederholtes Immunisieren nicht erhöht werden. Diese Befunde sprechen für eine zusätzlich vor-handene, periphere Toleranz gegenüber dem

Tiermodelle 75

T-Ag in diesen Tieren, die eine T-Ag-spezifische Immunantwort limitiert. Solche Toleranzphänomene sind auch beim Menschen häufig der Grund für das Scheitern von aktiven Tumorimmuntherapien.

Überleben

Kontro

lle

Adopti

ver T

ransfe

r 1

Adopti

ver T

ransfe

r 2

100

120

140

160

Behandlung

Zeit

Abb. 3: Überleben von 424CEA-Tag-tg-Mäusen. 108 Milzzellen von naiven (Kontrolle) oder T-Ag-immunen C57BL/6-Mäusen (Adoptiver Transfer 1) wurden i.p. in CEA424T-Ag-transgenen Mäuse transferiert. Mäuse bei denen der adoptive Transfer mit Milzzellen von immunisierten Mäusen wiederholt wurde sind mit „Adoptiver Transfer 2“ bezeichnet. Die Mäuse, die einen zweifachen Milzzelltransfer bekamen, wurden im Alter von etwa 150 Tagen getötet, ohne dass Krankheitsanzeichen zu erkennen waren.

In den letzten Jahren wurden große Fortschritte bei der Entwicklung von so genannten „Designer-T-Zellen“ gemacht. Dabei handelt es sich um T-Zellen, die gentechnisch so verändert wurden, dass sie über künstlich modifizierte T-Zellrezeptoren bestimmte Tumorantigene erkennen. Durch diese neuen Möglichkeiten kommt der adoptiven Immun-therapie wieder eine erhöhte Bedeutung zu. Im Mausmodell kann man solche „Designer-T-Zellen“ sehr leicht simulieren, indem man antigenspezifische T-Zellen im nichttransgenen Elternstamm der transgenen Tiere durch konventionelle Immunisierung herstellt. Diese tumorantigen-spezifischen T-Zellen können nun adoptiv in die transgenen, tumortragenden Mäuse transferiert und deren therapeutische Wirkung bestimmt werden.

Das längere Überleben der transgenen Mäuse , nach dem adoptiven Transfer von T-Ag-spez-ifischen T-Zellen zeigt, dass diese Form der Immuntherapie in der Lage ist, die Progression des Magenkarzinoms zu verzögern. Da sich T-Ag-spezifische T-Zellen aus der Magenwand

dieser Mäuse isolieren ließen, scheint die spezifische Tumorzelllyse durch T-Ag-spezifische CTL für diesen therapeutischen Effekt verantwortlich zu sein. Tatsächlich zeigen immunhistologische Untersuchungen eine vermehrte Präsenz von lymphozytären Zellen in den submukosalen Tumorarealen der behandelten Mäuse. Entsprechend ist die submukosale Tumorausbreitung in den behandelten Mäusen deutlich kleiner als in den unbehandelten Mäusen (Abb. 4).

Abb. 4: Ausbreitung des spontan entstandenen Magenkarzinoms in der Mukosa und Submukosa des Magens von unbehandelten Mäusen (A) und durch adoptiven T-Zell-Transfer behandelter Mäuse (B). Der Verlauf die Lamina muscularis mucosae, welche die Mukosa von der Submukosa trennt, ist durch Pfeile markiert. Die Stärke der submukosalen Tumormasse ist durch die senkrechten Linien verdeutlicht.

Überraschenderweise unterschieden sich die mukosalen Tumorareale der behandelten Mäuse histologisch kaum von denen der unbe-handelten Mäuse. Es konnte auch keine ver-stärkte lymphozytäre Infiltration in diesem Bereich festgestellt werden. Einen vergleichbareren Befund erhält man nach wiederholtem adoptiven T-Zell-Transfer. Obwohl die Stärke der submukosalen lymphozytären Infiltration wesentlich erhöht und die submukosale Ausbreitung des Tumors deutlich verringert war, konnte keine auffällige Antitumor-Immunreaktion in der Drüsen-magenmukosa beobachtet werden. Dies spricht dafür, dass die Effektivität einer adoptiven Immuntherapie, auch mit antigenspezifischen T-Zellen, regional sehr unterschiedlich sein kann. Dies hat für die therapeutische Intention, der Behandlung von Metastasen oder einer minimal residual disease, enorme Bedeutung.

R. Kammerer, N.K. van den Engel 1, B. Sievers, J. Nöckel, H. Winter 1, I. Drexler 2, 3, W. Zimmermann

Koop: 1 Chirurgische Klinik, Klinikum der Universität München; 2 Institut für Molekulare Virologie, GSF; 3 Institut für Virologie, TU München.

Förderung: Deutsche Krebshilfe (70-2729).


Allogene genetisch modifizierte Tumorzellvakzine (RCC-26/CD80/IL-2) zur Therapie von Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom (klinische Phase-I-Studie)

Studienaufbau und klinische Daten: Das Nierenzellkarzinom führt in Deutschland zu etwa 12.000 Neuerkrankungen im Jahr. Etwa jeder dritte Patient hat zum Zeitpunkt der Diagnosestellung bereits Metastasen, ein weite-res Drittel der Patienten entwickelt Metastasen im weiteren Verlauf. Während der Primärtumor in der Regel operativ entfernbar ist, stellt die Behandlung der metastasierten Erkrankung we-gen der Resistenz gegenüber Strahlen- und Chemotherapie ein großes Problem dar. Zytokin-basierte Therapieformen und anti-angiogenetische Wirkstoffe wie die neuen Kinase-Inhibitoren führen bei einem Teil der Patienten zu begrenzten Erfolgen (meist nur eine vorübergehende Stabilisierung) bei oft er-heblichen Nebenwirkungen.

Das Ziel unserer Vakzinetherapie-Studie mit genetisch modifizierten Tumorzellen ist die Entwicklung einer spezifischen Therapie gegen das metastasierte Nierenzellkarzinom. Dabei wurde aus Tumormaterial eines HLA-A*0201- positiven Patienten eine Zelllinie etabliert (RCC-26), die durch genetische Modifikation (Transfektion mit Expressionskonstrukten für Interleukin-2 (IL-2) und CD80 (B7.1)) eine gegenüber der Ursprungszelle erhöhte Immunogenität aufweist und T-Zellen zu Proli-feration und Tumor-spezifischer Zytotoxizität aktivieren kann (Abb. 1). Dieses wurde in zahl-reichen In-vitro-Untersuchungen nachgewie-sen.

Es wurde eine klinische Phase-I-Studie initiiert, um die allogene RCC-26/CD80/IL-2-Tumor-zellvakzine an einem Patientenkollektiv mit metastasiertem Nierenzellkarzinom bezüglich folgender Zielvariablen zu testen:

• Sicherheit / Toxizität der Vakzine

• Aktivierung spezifischer Immunreaktionen

• Klinisches Ansprechen

Im Vordergrund stand dabei die klinische Überwachung der Patienten mit umfangreichen Laborkontrollen, insbesondere auch von Para-metern, die die Induktion potentieller Autoim-munreaktionen anzeigen (antinukleäre Antikör-per, Rheumafaktor, Komplementfaktoren u. a.). Die Aktivierung spezifischer antitumoraler Immunreaktionen wird derzeit mit einer Reihe aufwändiger Methoden an Blutproben und Hautbiopsien der Patienten überprüft (Immun-monitoring, siehe unten). Die Beurteilung des

klinischen Ansprechens der Tumorerkrankung erfolgte durch engmaschiges Restaging der Pa-tienten mit Computertomographie und Skelett-szintigraphie.

Für den Einschluss von Patienten in die Vakzi-nestudie galten folgende Kriterien:

• metastasiertes Nierenzellkarzinom

• mindestens eine messbare Markerläsion

• keine systemische Therapie 3 Monate zuvor

• guter Allgemeinzustand

• keine Autoimmunerkrankung

• keine immunmodulatorische Therapie (Kortikoide etc.)

• HLA-A*0201-Subtyp

Abb. 1: (a) Die ursprüngliche Tumorzelle RCC-26 präsen-tiert zwar Tumorantigen, dies allein führt aber bei den zytotoxischen T-Zellen nicht zur Aktivierung. (b) Erst die genmodifizierte Vakzinezelle bewirkt durch das kostimu-latorische Signal (CD80) und die IL-2-Produktion die Proliferation und antitumorale Aktivierung der T-Zellen.

Damit die Vakzine zu einer effektiven Antigen-präsentation im Immunsystem des Patienten führen kann, sollte dieser zumindest ebenfalls den HLA-A*0201-Subtyp aufweisen. Dieses wurde an einer Blutprobe zunächst serologisch und nach Isolierung der genomischen DNA mittels PCR und Sequenzierung getestet. Der Subtyp HLA-A*0201 findet sich in Mittel-europa bei etwa der Hälfte aller Menschen.

Klinische Studien 77

Das Zeitschema für die Vakzinestudie (Abb. 2) zeigt die intradermale Applikation der Vakzine in drei ansteigenden Konzentrationsstufen so-wie die dreimalige Entnahme einer Hautbiopsie aus einer Applikationsstelle, um eine histo-pathologische Beurteilung des lokalen Zellin-filtrats 48 Stunden nach Applikation sowie funktionelle Untersuchungen an den infiltrie-renden Lymphozyten in der Zellkultur vorneh-men zu können. Bei drei Patienten wurde das Protokoll modifiziert, indem die vier Gaben der niedrigsten Dosisstufe gestrichen wurden, so dass von Anfang an 1 x 107 Vakzinezellen gegeben wurden.

Abb. 2: Zeitschema für die intradermale Applikation der Tumorzellvakzine in drei ansteigenden Dosisstufen. In Studienwoche 6, 14 und 22 wird jeweils eine Hautbiopsie aus einer Injektionsstelle (48 Stunden nach Vakzinegabe) entnommen.

Nr. Alter, m/w Stadium** Vakzine Survival

1 39, m T2N0M0G2 4 / 1 / - 31

2 66, m T2N0M1G3 4 / 4 / 2 79

3 68, w T3bN0M1G2 4 / 4 / 2 68

4 61, m T3bN0M1G2 4 / 4 / 2 76

5* 61, m T3bNxM1G2 - / 4 / - 18

6* 63, m T2N0M0G2 - / 4 / 2 84

7* 68, w T1N0M1G2 - / 4 / 2 79

8 65, w T2NxM0G1 4 / 4 / 2 55

9 49, m T3bNxM1G2 4 / 4 / - 17

10 48, w T1bN2M1G3 4 / - / - 8

11 53, m T1bN0M0G2 4 / 4 / 2 30 (lebt)

12 61, m T3aN0M1G3 4 / 4 / 2 36 (lebt)

13 58, m T2NxM1G2 4 / 4 / 2 29 (lebt)

Tab. 1: Übersicht über die Patienten der Vakzinestudie (Stand 3/07). In der Spalte „Vakzine“ ist die Zahl der Applikationen pro Dosis-Stufe angegeben (2,5 / 10 / 40 x 106 Zellen). In der Spalte „Survival“ ist die Überlebenszeit in Wochen angegeben. * bei drei Patienten entfiel die niedrigste Dosis. ** Bei Stadium N0M0 und NxM0 traten die Metastasen zu einem späteren Zeitpunkt auf.

Insgesamt wurden 135 Patienten für die Studie HLA-typisiert, von denen 69 Patienten A*0201-positiv waren. Viele der Patienten waren jedoch zu progredient oder wurden von Klinikseite in Industrie-gesponserte Studien eingeschlossen. Bis März 2007 konnten jedoch

15 Patienten in die Studie eingeschlossen werden. Von diesen sind 13 Patienten auswertbar, da sie alle die komplette Anzahl an Vakzine-Applikationen erhalten haben oder gemäß dem Studienprotokoll bis zur Progression vakziniert worden sind (Tab. 1).

Ernsthafte systemische Nebenwirkungen traten bei keinem Patienten auf, ebenso gab es keinen Hinweis für die Induktion von klinisch rele-vanten Autoimmunphänomenen. Typisch war eine lokale Hautreaktion an den Injektions-stellen innerhalb von 48 Stunden (Rötung, Induration, leichter Juckreiz) im Sinne einer Typ-IV-Immunreaktion, die spontan wieder ab-geklungen und nicht behandlungsbedürftig war.

Bei einem Teil der Patienten fanden sich vorübergehende Erhöhungen von Amylase und Lipase (Abb. 3) sowie leichte Verschiebungen im Differentialblutbild (Anstieg der neutro-philen und eosinophilen Granulozyten, Abfall der Lymphozyten), aber kein Hinweis auf klinisch relevante Autoimmunphänomene wie etwa Thyreoiditis oder Pankreatitis.

Abb. 3: Beispiel für den Verlauf von Amylase und Lipase bei einem Patienten im Verlauf der zehn Vakzinierungen (Pfeile mit Angabe der Studienwoche am oberen Bildrand). Beide Werte stiegen während der vier rasch aufeinander folgenden Vakzinegaben der mittleren Dosis an und normalisierten sich während der längeren Therapiepausen wieder (Einheiten: U/l).

Das mediane Zeitintervall bis zur Progression war 28 Monate, das mediane Überleben der Patienten betrug 68 Monate, drei Patienten sind noch unter Beobachtung (Stand 3/07, Abb. 4). Remissionen wurden nicht beobachtet. Es besteht eine Assoziation zwischen dem Auftreten einer deutlichen lokalen Haut-reaktion an der Vakzine-Applikationsstelle und einem längeren Überleben. Dies kann als Hinweis auf einen immunologischen Effekt der Vakzine gewertet werden.

Derzeit laufen die umfangreichen Analysen zum Immunmonitoring sowie zur histopatho-logischen und funktionellen Untersuchung der Hautbiopsien. Einige der Ergebnisse sind im Folgenden dargestellt.


Abb. 4: Kaplan-Meier-Kurven für 13 Patienten. (A) Zeit bis zur Progression, (B) Gesamtüberleben.

Immunmonitoring: Für das Immunmonitoring wurden jeweils vor der ersten Vakzinierung und 48 Std. nach der 4., 8., und 10. Vakzinierung, d. h. zum Zeitpunkt der Hautbiopsien, und zum Follow-up-Termin drei Monate später, Blutproben abgenommen. Bei fünf Patienten wurde zusätzlich 14 Tage nach der letzten Vakzinierung eine weitere Blut-probe abgenommen. Aus diesen heparinisierten Blutproben wurden PBMC isoliert und kryokonserviert. Ferner wurden jeweils vor der ersten Vakzinierung und vor und 48 Std. nach der 4., 8., und 10. Vakzinierung sowie vor und 24 Std. nach jeder Dosiserhöhung (5. und 9. Vakzinierung) zusätzliches Blut für die Serumgewinnung abgenommen. Auch das Serum wurde aliquotiert und kryokonserviert, und dient derzeit einer umfangreichen Multiplex-Zytokin-Bestimmung (IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF etc.). Die mit Skalpell heraus-geschnittenen und maximal erbsengroßen Hautbiopsien wurden aufgeteilt und für die Immunhistologie sowie für die direkte RNA-Isolierung zum TCR-Tracking zunächst ebenfalls eingefroren. Außerdem wurden kleine Stückchen direkt in T-Zell-Kulturmedium aufgenommen, um auswandernde Lympho-zyten phänotypisch und funktionell charakterisieren zu können. Allerdings mussten die Zellen meistens 10-18 Tage mit

50 U IL-2/ml in Kultur gehalten werden, da ansonsten die Zellzahl ex vivo nicht ausgereicht hätte, um eine durchflusszytome-trische Analyse ihrer Zelloberflächenmarker und ihres Zytokin- bzw. Chemokin-Expressionsprofils durchführen zu können. In den meisten Fällen dominierten CD4+-T-Zellen vom Effector-memory-Typ in der Kultur. Die Zytokinprofile nach In-vitro-Stimulation mit den Tumorzellen wiesen bei einigen Patienten eine erhöhte Sekretion von IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 und GM-CSF auf. Die Sezernierung von TNFα und G-CSF nahm dagegen eher ab. IL-1β, IL-7, IL-12 und IL-17 waren meistens nicht detektierbar, IL-2 und IFN-γ ließen sich aus methodischen Gründen (lt. Firma: Serumgehalt im Medium) quan-titativ nicht reproduzierbar bestimmen. Gut ließen sich jedoch mittels des Cytometric Bead Arrays bei den Patienten die Chemokine IP-10 (CXCL10), MIG (CXCL9) und RANTES (CCL5) am Durchflusszytometer quantifizie-ren. Abb. 5 zeigt die verstärkte Sekretion von RANTES nach wiederholter Impfung am Beispiel von Patient 2.

Abb. 5: RANTES-Produktion der Haut-infiltrierenden Lymphozyten von Patient 2. Die Biopsieentnahmen erfolgten jeweils 48 Std. nach 4., 8. und 10. Vakzinegabe. in vitro in der Kultur auswandernde T-Zellen wurden erneut mit der RCC-26/CD80/IL-2 Vakzine stimuliert. Die Chemokine wurden mittels des Cytometric Bead Arrays am FACSCalibur im Kulturüberstand bestimmt (Angabe in pg/ml aus 50 µl Kulturüberstand; 500.000 T-Zellen stimu-liert mit 50.000 Tumorzellen in 1,5 ml Medium).

RANTES ist ein Chemokin, das u. a. chemo-taktisch auf T-Zellen und Eosinophile wirkt, und eine aktive Rolle bei der Rekrutierung von Leukozyten in inflammatorisches Gewebe spielt. Es unterstützt insbesondere die Migra-tion von Monozyten und CD4+-T-Zellen. Außer RANTES werden ebenfalls die Chemokine IP-10 und MIG nach Stimulation verstärkt sezerniert. Die Expression dieser Chemokine wird insbesondere über IFN-γ induziert und sie wirken ebenfalls


chemotaktisch auf aktivierte T-Zellen. Betrachtet man jedoch die einzelnen Vakzinierungszeitpunkte, stellt sich dieser Ver-lauf durchaus unterschiedlich bei den einzelnen Patienten dar. Eine Korrelation zum klinischen Befund lässt sich derzeit noch nicht klar ableiten, da noch nicht alle Patientenproben analysiert worden sind.

TCR-Tracking: Speziell für unsere RCC-26- Vakzinestudie hat die quantitative Analyse des TCR über die Real-time-RT-PCR mittels des LightCycler� große Bedeutung. Mit der Bestimmung der TCR-Sequenz eines autologen RCC-reaktiven TIL-26-Klones, erhielten wir einen außerordentlich nützlichen Surrogat-marker, um die Entwicklung von Tumor-assoziierten Immunantworten nicht nur in autologen und allogenen Kulturen sondern auch während der Vakzinierungen verfolgen zu können (Abb. 6).

TIL-26„GG“

CDR3AV20 GGSARQL AJ22

TIL-26„LSG“

CDR3AV20 LSGSARQL AJ22

AV20.3 – AJ22.3 AV20 – AJ22.5

Molekularer Marker zur Molekularer Marker zur ÜÜberprberprüüfung der Reaktivierung/Expansion fung der Reaktivierung/Expansion TumorTumor--assoziierterassoziierter GedGedäächtnischtnis--TT--ZellenZellen

- Keine Kreuzreaktivität der Primer- Bestätigung durch Sequenzierung- Standardkurven (real-time RT-PCR)

Dominante in situTIL26 T-Zellklone

Abb. 6: TCR-Tracking. Die für TIL-26 charakteristische TCR-Sequenzen in der CDR3-Region des TCR können als molekulare Marker für die Quantifizierung Tumor-reaktiver T-Zellen in den Patienten dienen. Die CDR3-Region (complementary determining region-3) des TCR interagiert mit dem Peptidantigen und weist demnach auch die höchste Sequenzvariabilität auf.

Das TCR-Tracking ist gegenwärtig in Arbeit. Abb. 6 zeigt die Expression des TIL-26-spezifischen TCR (AV20.3-AJ22.3 mit der „GG“-Sequenz in der CDR3-Region) in der Hautbiopsie von Patient 6 nach der 4. Vakzi-nierung.

Abb. 7: Expression des TIL-26-spezifischen AV20.3-AJ22.3 TCR mit der „GG“-Sequenz in der CDR3-Region. Die Gelanalyse der PCR-Amplifikate aus den Hautbiopsien zeigt im Vergleich zu Patient 1 in der Hautbiopsie von Patient 6 die spezifische Bande.

Die PBMC der Patienten dienen folgenden Immunmonitoring-Analysen:

• ELISPOT: IFN-γ, Perforin

• MHC/Peptid-Multimer-Färbungen

• Mehrfarben-Durchflusszytometrie am LSRII-Gerät: T-Zell-Subpopulationen, NK-Zellen, regulatorische Zellen

• TCR-Tracking

• In-vitro-Stimulationen (IVS)

Ergebnisse der 4-wöchigen IVS-Kulturen mit Zellen vor der ersten und nach der zehnten Vakzinegabe zeigen, dass die T-Zellen aus den Patienten mit der längeren Überlebensrate eine schnellere Proliferationsrate insbesondere gegenüber der Vakzine-Zelllinie aufweisen, was bedeuten könnte, dass hier bereits ein größerer Anteil an Effektor-Gedächtnis-T-Zellen vorliegt. Eine Analyse der Oberflächenmarker, des Zytokinprofils sowie der TCR-Expression wird auch hier derzeit durchgeführt.

Um Inter-Assay-Variabilitäten zu vermeiden, werden die sehr sensitiven aber auch empfindlichen ELISPOT-Assays erst durchge-führt, wenn die Proben aller Patienten vor-liegen. Aus Vorarbeiten wissen wir, dass die Verwendung eingefrorener PBMC kein Pro-blem für ELISPOT-Analysen darstellt. Zwischenzeitlich konnten wir in Kooperation mit der GSF (D.J. Schendel, B. Frankenberger, E. Nössner), H.G. Rammensee und S. Stevano-vic (Tübingen), sowie D. Hunt (USA) 34 interessante Antigenkandidaten identifizieren, die als Surrogatmarker für das Immun-monitoring von Bedeutung sind. Für diese 34 Antigene wurden 78 Peptide mit HLA-A*0201-Bindungsmotiv bestimmt, die uns von R. Frank (Helmholtz-Zentrum für Infektions-forschung, Braunschweig) synthetisiert worden sind. Die Peptidepitope, die sich in den ELISPOT-Analysen als erfolgreich erweisen, werden dann für die Multimer-Herstellung verwendet (Kooperation: D. Busch, TU München).

Von Patient 5 stand nach einer notwendigen tumororthopädischen Operation Material einer Knochenmetastase zur Verfügung. Dieses Ge-webe wurde mittels quantitativer PCR analy-siert und zeichnete sich insbesondere durch Überexpression der Gene für G250, Survivin, PRAME, EGFR und Vimentin aus (Tab. 2). Diese Antigene sind ebenfalls als geeignete Monitoringmarker für die Patienten ausgewählt worden.


1,371,440,44754,831CAIX(=G250)

0,840,650,0394,351PRAME

4,0311,477,5212,641Vimentin

0,661,360,661,111ELAC

1314,231,710,351,221NY-ESO-1

26,7285,0417,0314,831EGFR

0,421,600,221,601Adipophilin

6,72155,4258,89114,561Survivin

RCC26/CD80/IL7RCC26/CD80/IL2RCC26#5NN

Tab. 2: Expressionsanalyse einiger Genkandidaten mittels quantitativer Real-time-RT-PCR Normalisiert wurde auf primäres Normalnierengewebe (NN). Verglichen wurden die RCC-26-Zelllinien und Material aus der Knochen-metastase des Patienten 5. (Die Zahlen bedeuten n-fache Überexpression).

Zusammenfassung: Grundsätzlich handelt es sich bei RCC-26/CD80/IL-2 um eine sehr sichere Genvakzine. Es gab bisher keine ernsthaften systemischen oder lokalen Neben-wirkungen und keinen Anhalt für die Induktion einer Autoimmunität. Die bisher vorliegenden Daten deuten auf einen immunologischen Effekt mit Beeinflussung des Krankheits-verlaufs bei einem Teil der Patienten hin.

A. Buchner 1, H. Pohla, B. Stadlbauer, B. Konkol, H. Herbig, R. Oberneder 2, A. Baur 3, A. Hofstetter, C. Stief 1, T. Blankenstein 4, D.J. Schendel 5.

Koop.: 1 Urologische Klinik, Klinikum der Universität München; 2 Urologische Klinik, München-Planegg; 3 Institut für Klinische Radiologie, Klinikum der Universität München; 4 Institut für Immunologie, Charité Berlin und Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin-Buch; 5 Institut für Molekulare Immunologie, GSF.

Förderung: BMBF DLR 01 GE 9624/1; KKG „Immun-therapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).


Einsatz einer Zytokin-Gentherapie beim hormonrefraktären Prostatakarzinom (klinische Phase-I-Studie)

Einführung: Das Prostatakarzinom (CaP) ist unter den urologischen Tumoren die häufigste Todesursache und ab dem 80. Lebensjahr auch die häufigste tumorbedingte Todesursache beim Mann. Die Therapie der Wahl bei einem lokal begrenzten CaP ist die radikale Prostatektomie. In Abhängigkeit vom Tumorstadium wird adjuvant auch die Radiotherapie angewandt. Eine weitere Therapieoption ist die Hormontherapie, die entweder als neoadjuvante Therapie vor Strahlentherapie beim lokal fortgeschrittenen CaP oder als adjuvante Therapie nach kurativer Ersttherapie eingesetzt wird. Grundsätzlich von Bedeutung ist die Androgenblockade beim metastasierten CaP. Fast immer entwickelt sich aus einem primär Androgen-abhängig wachsenden Tumor ein Hormon-unabhängiges (hormonrefraktäres) Karzinom (HRPC). Hier sind die Therapieoptionen limitiert und der Patient kann zumeist nur noch palliativ behandelt werden (zytotoxische Chemo-therapie, Gabe von Bisphosphonaten bei Knochenmetastasen). Als alternative experi-mentelle Therapieoptionen beim HRPC gelten die Gentherapie, der Einsatz von Inhibitoren bestimmter Wachstumsfaktoren und der Angio-genese sowie monoklonale Antikörper (Abb. 1).

Diagnose: Hormonrefraktäres CaP (HRPC); Stadium IV Medianes Überleben: 8.8 – 22.8 Monate (Halabi, 2003)Keine effektive Therapie mehr verfügbar (palliative Behandlung)

*

PS

A A

nstie

g

Zeit

Standard-Therapie I(Operation,Bestrahlung)

Standard-Therapie II(androgeneAblation)

ExperimentelleTherapy(Gentherapie)

�

D: CaP D: met. CaP

*

Abb. 1: Charakteristischer Verlauf des PSA-Wertes in Abhängigkeit von Diagnose und Therapie beim Prostata-karzinom.

Durchführung der Gentherapiestudie: Am Klinikum der Technischen Universität Mün-chen (Prof. B. Gänsbacher, Institut für Experi-mentelle Onkologie und Therapieforschung, Prof. R. Hartung, Urologische Klinik) wurde eine klinische Phase-I/II-Studie mit einer gene-tisch modifizierten Tumorzellvakzine durch-geführt, für die im Labor für Tumor-immunologie sowohl die HLA-Typisierung als auch das Immunmonitoring durchgeführt wurde. Produziert wurde diese Vakzine am Sloan-Kettering Cancer Center, New York. Die allogene HLA-A*0201-positive Prostata-karzinomzelllinie LNCaP wurde durch retro-viralen Gentransfer mit den cDNAs für die

Zytokine IL-2 und IFN-γ transfiziert. IL-2 soll die Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten und NK-Zellen fördern, IFN-γ soll u. a. zu einer gesteigerten Expression von MHC-Molekülen auf der Zelloberfläche der Tumorzellen und damit auch zu einer gestei-gerten Präsentation Tumor-assoziierter Peptid-fragmente führen. Die Zellen wurden vor In-jektion mit 150 Gy bestrahlt, um ein Tumor-wachstum im Körper der Patienten zu verhin-dern. Anschließend wurden die Zellen dann in einem Dosis-Eskalationsversuch den Patienten intradermal an den Tagen 1, 15, 29 und 92 injiziert und dann alle weiteren 90 Tage bis Tumorprogression erkennbar war. Phase I der klinischen Studie mit 6 Patienten und Phase II mit 24 Patienten und einem Follow up von mindestens sechs Monaten bei vier Vakzinierungen sind beendet und befinden sich in der Auswertung. PSA-Bestimmung, Com-putertomographie und Knochenszintigraphie dienten dem klinischen Monitoring. Primäres Ziel war die Verlängerung der PSA-Ver-dopplungszeit. Sekundärer Endpunkt der Studie war die longitudinale Evaluierung der Immunantwort.

Ergebnisse: Abb. 2 zeigt die bei den Patienten typischen PSA-Konzentrationsverläufe unter Therapie.

Abb. 2: Typische Verläufe der PSA-Konzentrationen im Serum der Patienten zum Zeitpunkt der einzelnen Vakzinierungen (durch Pfeil gekennzeichnet) am Beispiel der Patienten 105 („Non-Responder“), 108 (transiente Stabilisierung) und 125 („Responder“) aus der klinischen Phase-I-Studie.


Insgesamt 4/30 Patienten (aus Phase I und II) mussten wegen zu starkem Krankheitsprogress nach drei Injektionen aus der Studie genommen werden. Von den restlichen zu bewertenden Patienten zeigten 10 Patienten einen weiteren Anstieg des PSA-Wertes, 13 eine transiente Stabilisierung über einen Zeitraum von min-destens sechs Wochen und drei Patienten zeig-ten eine 50%ige Reduktion der PSA-Konzen-tration, wobei ein Patient seit über drei Jahren stabil ist.

Insgesamt zeigte sich, dass es sich um eine sehr sichere Vakzine mit einem geringen Neben-wirkungsspektrum (< WHO 2-3) handelt. Zu keiner Zeit - auch nach Dosiserhöhung von 7,5 auf 15 Mio. Zellen - wurden stärkere lokale oder sogar systemische Nebenwirkungen beo-bachtet.

Immunmonitoring: Für ELISPOT-Analysen und MHC/Peptid-Tetramer-Bindungsstudien wurden insgesamt 40 verschiedene Peptide, einschließlich einiger bereits beschriebener HLA-A2-restringierter T-Zell-Epitope syntheti-siert. In Abhängigkeit der Verfügbarkeit an Patientenmaterial wurden insbesondere die Epitope folgender Antigene getestet: PSA, PSMA (Prostata-spezifisches Membrananti-gen), PAP (prostatic acid phosphatase), PSCA (prostate stem cell antigen), STEAP (six-transmembrane epithelial antigen of the prostate), PSGR (prostate-specific G protein-coupled receptor), PCTA (prostate carcinoma tumor antigen), PRAME (preferentially expressed in melanoma), Survivin und EpCAM (epithelial cell adhesion molecule). Abb. 3 zeigt die Reaktivität peripherer T-Zellen des Patienten 113 gegenüber PSGR-1 im IFNγ-ELISPOT.

A B

Tag 0 (vor Vakzinierung) Tag 22 (nach 2. Vakz.) Tag 512 (nach 9. Vakz.)

C

D E F

Abb. 3: IFNγ-ELISPOT zur Analyse der Immunantwort gegenüber PSGR-1 (ILLVMGVDV) am Beispiel des Patienten 113. Dem Patienten wurden vor und jeweils acht Tage nach den einzelnen Vakzinierungen Blutproben entnommen, die PBMC isoliert und eingefroren. Am Tag der ELISPOT-Analyse wurden die Zellen aufgetaut und 100.000 Zellen pro well direkt mit 5 µg/ml Peptid für 24 Std. inkubiert.

Patient 113 bekam protokollgemäß insgesamt 14 Impfungen und musste dann erst wegen eines PSA-Progresses an Tag 1020 aus der Studie genommen werden. Sein PSA-Verlauf zeichnete sich erst nach einer langen Verzögerung durch einen > 50%igen Abfall des Wertes und einer sehr langen Stabilisierungsphase aus. Wie in Abb. 4 ersichtlich reagiert dieser Patient auch im ELISPOT erst sehr spät.

010

20

30

40

5060

70

80

PSA-1

23

PSM

A-P

2

PSC

A-P

4

Ep-

2H

PSG

R-1

STEAP-3

PR

AM

E-P

4

pre vaccinat ion

d8 (1st)d22 (2nd)

d36 (3rd)

d57d99 (4th)

d183

d274d365

d512 (9th)

d602

d692d783

d870

d968d1127

d1332

d1338d1367

d1532

Anz

ahl I

FN

-γpr

oduz

iere

nder

T-Z

elle

n pr

o w

ell

Abb. 4: IFN-γ-ELISPOT zur Analyse der Immunantworten am Beispiel des Patienten 113. Dem Patienten wurden vor und jeweils acht Tage nach den einzelnen Vakzinegaben Blutproben entnommen, die PBMC isoliert und eingefroren. Am Tag der ELISPOT-Analyse wurden die Zellen aufgetaut und in Triplikaten von 100.000 Zellen pro well direkt mit 5 µg/ml Peptid für 24 Std. inkubiert. PSA123 (FLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQV), PSMA-P2 (ALFDIESKV), PSCA-P4 (ALQPGTALL), Ep-2H (ILYENNVIV), PSGR-1 (ILLVMGVDV), STEAP-3 (LLLGTIHAL), PRAME-P4 (SLLQHLIGL). Die Hintergrundreaktivität der PBMC ohne Peptid ist hier bereits abgezogen.

Patienten, die z. B. wie Patient 113 als Responder gelten, wiesen außerdem in ihren Hautbiopsien zumeist eine starke Infiltration von T-Lymphozyten im Verhältnis 3:1 (CD4+:CD8+-T-Zellen) und eine Ansammlung von eosinophilen und neutrophilen Granulozy-ten sowie von Makrophagen auf. Von einigen Patienten konnten aus den Hautbiopsien T-Lymphozyten gewonnen und sowohl ihr Zytokinexpressionsmuster als auch ihr T-Zellrezeptor-Repertoire charakterisiert wer-den. In Abb. 5 ist beispielhaft die Hautreaktion bei Patient 113 zu sehen sowie die Hämatoxylin-Eosin-Färbung eines Paraffin-schnittes des entsprechenden Hautarreales. Die injizierten Vakzinezellen konnten in keinem der Patienten mehr nachgewiesen werden, was auf die sofortige Reaktion des Immunsystems hindeutet. Bei Patient 113 wiesen die Haut-


infiltrierenden T-Zellen zudem ein stark einge-schränktes Repertoire an T-Zell-Rezeptoren (TCR) auf. Hier wurden ebenfalls umfang-reiche Sequenzanalysen durchgeführt, um ähn-lich wie bei der RCC-Studie, TCR als Surro-gatmarker für das Monitoring einsetzen zu können.

A

B

Abb. 5: Hautreaktion von Patient 113 nach mehrfacher Vakzinierung. (A) zeigt die Hautrötung und (B) die immunhistologische Färbung des leukozytären Infiltrates (Hämatoxylin-Eosin; 400fache Vergrößerung).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

IFNg TNFa IL-10 IL-5 IL-4 IL-2

24h48h

pg/m

l

Abb. 6: Zytokinprofil der T-Zellen aus der Hautbiopsie von Patient 113. Die Biopsie-Entnahme erfolgte 48 Std. nach intradermaler Vakzinegabe. In vitro in der Kultur auswandernde T-Zellen wurden erneut mit der Vakzine stimuliert und die Zytokine im Kulturüberstand mittels eines cytometric bead array am Durchflusszytometer quantifiziert.

In Abb. 6 ist das Zytokinexpressionsmuster der Haut-infiltrierenden Zellen ebenfalls von Patient 113 dargestellt. Hier wurden die aus den kleinen Hautstückchen auswandernden Zellen erneut mit der Vakzine stimuliert und jeweils nach 24 bzw. 48 Std. der Zellkultur-überstand mittels eines Cytometric bead arrays analysiert. Der hohe Anteil an IL-5-

produzierenden Zellen steht dabei in Übereinstimmung mit der höheren Ratio an CD4+-T-Zellen und der Infiltration an Eosino-philen.

Zusammenfassung: Sowohl die klinische Phase-I- als auch die Phase-II-Studie wurde erfolgreich abgeschlossen. Alle Daten werden derzeit ausgewertet und zur Publikation vorbereitet. Grundsätzlich handelt es sich bei LNCaP/IL-2/IFNγ ebenfalls um eine sehr sichere, nebenwirkungsarme Vakzine. Über 50% der Patienten reagierten zumindest mit einer transienten Stabilisierung ihrer PSA-Werte. Damit ist das primäre Ziel, die Verlängerung der Zeit bis zur PSA-Verdopplung, erreicht. Einige Patienten zeigten charakteristische Hautinfiltrate und im Blut ließen sich sowohl im ELISPOT als auch mittels Tetramer-Bindungsstudien (hier nicht gezeigt) T-Zellen mit Spezifität für einige be-kannte Prostata-spezifische Antigene nachwei-sen. Fasst man die ELISPOT-Daten aller Patienten zusammen, so scheinen die immunogensten Peptide PSGR-1, STEAP, PSA und PRAME sowie PSCA, PSMA und EpCAM zu sein. Ferner zeigen die Patienten mit der höchsten Frequenz an Peptid-reaktiven T-Zellen die niedrigsten PSA-Werte, was evtl. auf eine niedrigere Tumorlast hindeuten würde. Jedoch eine Korrelation zwischen PSA-Verlauf und Immunantwort ist derzeit nicht erkennbar, da noch nicht alle Patienten ausgewertet sind. Zum Teil lässt sich bei den „PSA-Respondern“ eher eine inverse Korrelation beobachten, da sie häufig eine niedrigere Frequenz an Peptid-reaktiven T-Zellen zum Zeitpunkt des Abfalls bzw. der Stabilisierung des PSA-Wertes aufweisen. Dies würde wiederum die Hypothese stützen, dass die T-Zellen während der klinischen Antwort aus der Peripherie verschwinden.

H. Pohla, B. Stadlbauer, B. Konkol, H. Herbig, M. Osthoff, D.J. Schendel 1

Koop.: Institut für Experimentelle Onkologie und Therapieforschung, Institut für Pathologie und Urologische Klinik, Klinikum rechts der Isar (TU München); 1 Institut für Molekulare Immunologie, GSF.

Förderung: BMBF DLR 01 GE 9625/4; KKG „Immun-therapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).


Einsatz einer Multipeptidvakzine zur Behandlung des metastasierten Nierenzellkarzinoms (klinische Phase-I-Studie)

Einführung: IMA901 ist eine therapeutische Tumorvakzine, basierend auf mehreren Tumor-assoziierten Peptiden, die auf primärem RCC-Gewebe überexprimiert sind. Sie besteht aus neun HLA-Klasse-I-bindenden Peptiden und einem HLA-Klasse-II-bindenden Peptid und ist in der Lage, CD8+-CTL- und CD4+-Th-Zellen zu aktivieren.

Entwickelt wurde diese Vakzine von der Firma immatics biotechnologies GmbH, die im Jahr 2000 als Spin-off-Unternehmen der Universität Tübingen gegründet wurde. Die Firma beschäftigt sich mit der Identifizierung und Validierung neuer Immuntherapeutika zur Krebsbehandlung. Aufgrund ihrer Expertise und ihrer Technologieplattformen aus den Bereichen Genomics, Peptidomics, Bioinfor-matik und Immunologie hat immatics zahlreiche Antigene („TUMAPs“, Tumor-assoziierte Peptide) für verschiedene Tumor-entitäten identifiziert und patentiert. Nach einigen viel versprechenden Pilotversuchen war eine erste multizentrische klinische Phase-I-Studie zur Behandlung von Patienten mit fortgeschrittenem RCC durchgeführt worden. Hauptziel dieser offenen, nicht-kontrollierten, einarmigen Studie war die Untersuchung der Verträglichkeit und Sicher-heit dieser Vakzine zusammen mit dem intradermal injizierten rekombinanten humanen (rhu) GM-CSF als Adjuvants. Ferner sollte die Immunogenität bezüglich einer T-Zell-Antwort, das systemische pharmakokinetische Profil des rhu GM-CSF sowie der Tumorstatus mittels bildgebender Verfahren nach RECIST-Kriterien analysiert werden.

Durchführung der Studie: In die Studie wurden insgesamt 28 Patienten eingeschlossen. Vier urologische Universitätskliniken aus Deutschland (Universität München, Tübingen, Heidelberg, Mainz), eine aus Genf und zwei aus London waren beteiligt. Die Patienten mussten HLA-A*02-positiv sein und ein histologisch gesichertes RCC der Stadien III oder IV aufweisen. Sie bekamen acht Impfungen (4,5 mg IMA901, 75 µg rhu GM-CSF) an den Tagen 1, 2, 3, 8, 15, 22, 36, und 64 intradermal injiziert (Abb. 1).

1IMA901 Phase 1 Immunomonitoring

StudyTreatment and Blood Samples

VACCINATIONGM- CSF _____________

IMA901 ________________

WEEKDAY 85-92

-up Period

VISIT 1.2.3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 6 101–2 131.2.3. 8 15 22 36 64–3–14

Screening Vaccination (Treatment) Period

Scr FU

T - CELLSAMPLE

FUV1 V4 V5 V6 V7 V8S2

Abb. 1: Therapieschema zur IMA901-Studie (mit freundlicher Genehmigung von immatics biotechnologies GmbH).

Wir haben für diese Studie 76 Patienten HLA-typisiert und 15 Patienten konnten alleine in München eingeschlossen werden. Dement-sprechend wurden in unserer Arbeitsgruppe auch die meisten erfolgreichen PBMC-Auf-arbeitungen (n = 111) durchgeführt.

Erste Ergebnisse: IMA901 ist eine sehr sichere, gut verträgliche und immunogene Multipeptidvakzine. Das klinische und immu-nologische Monitoring befindet sich derzeit in der Auswertung der Tübinger Firma. Eine erste Analyse zeigt, dass bei 74% der Patienten T-Zell-Antworten zumindest gegen eines der TUMAP detektiert werden konnten und 30% der Patienten zeigten Antworten auf mehrere Peptide. Mehrheitlich gab es auch in dieser Gruppe einen klinischen Benefit für die Patienten zu verzeichnen.

Aufgrund des Erfolges ist für Mai 2007 eine multizentrische klinische Phase-II-Studie mit 200 Patienten geplant, an der erneut unsere Arbeitsgruppe und die Urologische Klinik des Klinikums der Universität München beteiligt sein wird.

H. Pohla, H. Herbig, B. Stadlbauer, B. Roser 1, M. Staehler 1, C. Stief 1

Koop.: 1 Urologische Klinik, Klinikum der Universität München; ICON Clinical Research, Langen (für die Logistik).

Federführend: immatics biotechnologies GmbH: H. Singh, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, S. Stevanovic, H.G. Rammensee, J. Frisch.

Förderung: immatics biotechnologies GmbH; KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).


Erste Pilotstudie zur Therapie von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (The Munich NSCLC Vaccine Study Group)

Einführung: Trotz weit reichender Bemühun-gen in der Weiterentwicklung von Diagnose und Therapie weist weltweit keine andere Krebsart so starke Zuwachsraten auf wie das Bronchialkarzinom. Die Fünfjahresüberlebens-rate stieg dabei in den letzten 25 Jahren nur geringfügig an und liegt derzeit bei ca. 13%. Innovative, nebenwirkungsarme Therapiefor-men werden dringend benötigt. Insbesondere die therapeutische Vakzinierung erscheint at-traktiv durch die hohe Spezifität bei relativ nie-drigem Nebenwirkungsspektrum. Für die aktiv-spezifische Immuntherapie durch Vakzinierung mit bestrahlten, autologen Tumorzellen, die nach genetischer Manipulation GM-CSF (Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulie-render Faktor) produzieren, konnte der klini-sche Nachweis der Durchführbarkeit und An-wendungssicherheit bereits erbracht werden, ein überzeugender klinischer Erfolg blieb allerdings bislang aus. Grundsätzlich zeichnet sich jedoch ab, dass immuntherapeutische Strategien ihren Platz vor allem im Rahmen multimodaler Behandlungskonzepte im Sinne einer adjuvanten Therapie finden werden.

In präklinischen Versuchen konnte gezeigt werden, dass CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten, die sich normalerweise nicht oder sehr langsam vermehren, rasch proliferieren, wenn sie in eine lymphopenische Umgebung übertragen werden (sog. “lymph-openia/homeostasis-driven proliferation”). Durch diese Strategie konnte die Frequenz zirkulierender Tumor-spezifischer T-Lympho-zyten deutlich gesteigert werden. Eine einfache Erklärung für diese Beobachtung könnte sein, dass für die Proliferation Tumor-spezifischer T-Lymphozyten nach Lymphodepletion mehr Raum zur Verfügung steht (“space theory”). Möglicherweise wird durch die zur Lymphopenie eingesetzten Chemotherapeutika auch die Anzahl der CD4+CD25+-regulatorischen T-Zellen (Treg) reduziert. Unter physiologischen Bedingungen kontrollie-ren diese Treg eine Immunantwort und ver-hindern eine überschießende immunologische Reaktion. Ebenfalls diskutiert wird die Be-teiligung eines reaktiven Anstiegs bestimmter Zytokine in sero nach Lymphodepletion. Auch wenn die zugrunde liegenden Mechanismen derzeit noch weitgehend unklar sind, in der klinischen Erstanwendung erreichten Rosen-berg et al. bei Patienten mit metastasiertem, malignem Melanom mit diesem Konzept, allerdings in Kombination mit adoptivem

Transfer von TIL, eine beeindruckende Responserate von 45% (Dudley et al. 2002). Kürzlich wurde unter Leitung der Chirur-gischen Klinik (Klinikum der Universität München) eine klinische Pilot-Phase-I-Studie begonnen, in der Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC) nach chirurgischer Resektion mit bestrahlten, autologen Tumorzellen vakziniert werden (Abb. 1). Am Ort der Vakzinierung wird per Minipumpe eine kontinuierliche Infusion von GM-CSF appliziert. Eine genetische Manipula-tion der Tumorzellen entfällt also. Zusätzlich erhalten die Patienten vor Vakzinierung und nach Lymphopenie-Induktion durch Gabe von Cyclophosphamid/Fludarabine eine Reinfusion autologer Leukozyten (Leukaphereseprodukt). Zur Durchführung der Studie und dem wissenschaftlichen Begleitprogramm wurde die Munich NSCLC Vaccine Study Group gegründet.

Abb. 1: Schematische Darstellung des Studienablaufs: nach T-Zell-Apharese zum späteren adoptiven Transfer sowie zum Immunmonitoring erfolgt die Herstellung der Vakzine aus autologen Tumorzellen. Nach Lymphopenie-Induktion mit Hilfe einer niedrig dosierten Chemotherapie (CTX) für drei Tage und Rekonstitution mit den autologen T-Zellen werden die Patienten intradermal geimpft unter gleichzeitiger GM-CSF Infusion per Minipumpe.

Durchführung der Studie: Aufgenommen werden Patienten mit histologisch gesichertem NSCLC der Stadien IIb und IIIa. Studienarm A erhält nur die Vakzinierung mit lokaler, kontinuierlicher Infusion von GM-CSF. Studienarm B erhält vor Vakzinierung zusätz-lich eine dreitägige Behandlung mit niedrig-dosiertem Cyclophosphamid und Fludarabine zur Lymphopenie-Induktion sowie eine Reinfu-sion autologer Leukozyten. Nach Abnahme der zwei Leukapheresen für das Immunmonitoring und für die Reinfusion autologer PBMC unterziehen sich die Patienten dem standardi-sierten, operativen Eingriff. Aus dem resezier-ten Präparat werden autologe Tumorzellen


isoliert, bestrahlt und kryokonserviert. An Tag 1 nach Rekonstitution der Lymphozyten wird die Vakzine unmittelbar vor Beginn der subkutanen Infusion von GM-CSF intradermal appliziert (alle 2 Wochen, gesamt max. 5 Vakzinierungen, Abb. 2).

Abb. 2: Therapieplan IML = Immunmonitoring-Leukapherese OP = operative Tumorentfernung � = Lymphopenie-Induktion (Tag 1-3)

In Abhängigkeit von der verfügbaren Tumor-zellzahl wird für jeden Patienten die Dosierung der Vakzine individuell bestimmt und beträgt 5x106 bis 50x106 Zellen pro Impfung. Unmittelbar nach intradermaler Vakzinierung wird der Katheter einer Minipumpe in die Mitte der Impfstelle platziert und GM-CSF (50 µg/24 Std.) über 6 Tage subkutan infundiert (Abb. 3). Hierdurch sollen Antigen-präsentierende Zellen wie z. B. DC an die Impfstelle “gelockt” werden. Diese Zellen nehmen die Bestandteile der Tumorzellen auf und können so die relevanten Tumorantigene dem körpereigenen Immunsystem präsentieren. Ziel ist die Induktion einer systemischen, Tumor-spezifischen Immunantwort und damit die generalisierte Bekämpfung einer potentiell vorliegenden Mikrometasierung (“minimal residual disease”).

Abb. 3: Intradermale Applikation der autologen Tumor-vakzine (oben) sowie die kontinuierliche Infusion von GM-CSF an der Impfstelle per Minipumpe (unten)

Im Anschluss an die Vakzinierungen wird erneut eine Leukapherese für das Immun-

monitoring durchgeführt. Außerdem wird die immunologische Antwort vor und nach der vierten Impfung anhand einer DTH–Testung (delayed type hypersensitivity) durch Injektion von 1x106 autologen, bestrahlten Tumorzellen in die Haut des Oberarms geprüft.

Ergebnis: Bislang wurde bei 3 von 3 Patienten erfolgreich ein Impfstoff hergestellt und zwei Patienten haben das Protokoll aus insgesamt 5 Impfungen ohne wesentliche Neben-wirkungen abgeschlossen und befinden sich derzeit im Follow up. Klinisch traten lediglich Grad 1/2-Reaktionen an der Impfstelle (Rötung, Induration, Juckreiz) auf. Auch die bisher beobachteten systemischen Nebenwirkungen waren nur gering ausgeprägt (Muskel-, Gelenkschmerzen, Abgeschlagen-heit, erhöhte Temperatur). Damit zeigt sich dieses Therapieprotokoll bisher als sehr sicher und gut verträglich.

In allen Patienten konnte durch die 3-tägige Chemotherapie eine ausgeprägte Lymphopenie induziert werden. FACS-Analysen zeigten, dass sowohl unterschiedliche T-Zell-Subpopulationen (CD4, CD8, CD4CD25) als auch NK-Zellen, Granulozyten und B-Zellen signifikant reduziert werden konnten. Nach Rekonstitution nahmen neutrophile Zellen am schnellsten wieder zu, die anderen Zellpopulationen zum Teil etwas langsamer. Erste immunhistologische Analysen zeigten an der Injektionsstelle eine vermehrte Infiltration von Makrophagen, Eosinophilen, Neutrophilen und Lymphozyten. Im Vergleich zu Biopsien an Kontrollhaut der Patienten ließen sich insbesondere CD1a+-dendritische Zellen und vermehrt CD4+-T-Lymphozyten detektieren. ELISPOT-Analysen zum Immunmonitoring befinden sich derzeit in der Auswertung.

H. Pohla, B. Stadlbauer, D.J. Schendel 1

Koop.: 1 Institut für Molekulare Immunologie, GSF; 2 Chirurgische Klinik, 3 Medizinische Klinik III, 4 Klinik für Anästhesiologie, Abteilung für Transfusionsmedizin und Hämostaseologie, Klinikum der Universität München; 5 Robert W. Franz Cancer Research Center, Earle A. Chiles Research Institute, Portland, Oregon, USA.

Federführend: D. Rüttinger 2, H. Winter 2, N.K. van den Engel 2, M. Schlemmer 3, S. Grützner 4, B. Wagner 4, K.W. Jauch 2, R.A. Hatz 2, B.A. Fox 5

Alle genannten Autoren repräsentieren die Munich NSCLC Vaccine Study Group.

Smiths Medical (Kirchseeon) stellt die Minipumpen zur Verfügung.

Förderung: Chiles Foundation, Portland, Oregon, USA; „Programm zur Förderung von Forschung und Lehre“ der Universität München (FöFoLe an D. Rüttinger).

Immunmonitoring 87

Das Immunmonitoring – Techniken zur Evaluierung immuntherapeu-tischer Behandlungskonzepte

Einführung: Für eine erfolgreiche Umsetzung klinischer Studienprotokolle müssen erstens Laboreinrichtungen verfügbar sein, um Zelltherapeutika unter Bedingungen vor-zubereiten, die einen Transfer zurück in die Patienten gestatten (sog. good manufacturing practice (GMP)-Einrichtungen). Alle Arzneimittel, die am Patienten eingesetzt werden, unterliegen strengen gesetzlichen Auflagen. Eine dafür notwendige Reinraum-anlage wird derzeit von der GSF vorbereitet. Zweitens müssen auch Strategien zur Über-prüfung des Immunstatus’ der behandelten Patienten entwickelt, standardisiert und vali-diert werden. Von besonderer Bedeutung ist dieses Immunmonitoring immer dann, wenn Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung in klinische Phase-I/II-Studien aufgenommen werden. Bei diesen Patienten wird ein klinisches Ansprechen auf die jeweilige Therapie nur selten erwartet und somit sind hochsensitive und standardisierte Immun-monitoring-Technologien von ganz entschei-dender Bedeutung für die Evaluierung der therapeutischen Effekte auf das Immunsystem.

Die Immunmonitoring-Plattform: Die GSF und die beiden Münchener Universitäten arbeiten auf dem Gebiet der Immuntherapie maligner und infektiöser Erkrankungen in vielfältigen Kooperationen sowie im Rahmen mehrerer Klinischer Kooperationsgruppen (KKG) zusammen, darunter auch unsere KKG „Immuntherapie bei urologischen Tumoren“ und die KKG „Antigen-spezifische Immun-therapie“ (Leiter: D.H. Busch). Mit Hilfe eines im Helmholtz-Programm „Infektion und Immunität“ bewilligten Überzeichnungs-projekts wurde von den zwei GSF-Instituten (Molekulare Immunologie und Molekulare Virologie) im Jahr 2004 eine Plattform „Immunmonitoring“ gegründet, mit dem Ziel der Entwicklung und Standardisierung verschiedenster State-of-the-Art-Verfahren zur Überwachung der Immunantwort von Patienten in laufenden klinischen Studien. Basierend auf der langjährigen, engen Kooperation zwischen meiner Arbeitsgruppe im LTI und D.J. Schendel (GSF) wurden im Rahmen des BMBF-Forschungsverbundes „Somatische Gentherapie bei Nierenzell- und Prostata-karzinom“ drei klinische Phase-I/II-Studien mit allogenen genetisch-modifzierten Tumor-Zelllinien gemeinsam etabliert und durchgeführt. Für diese Studien wurden am LTI mehrere Immunmonitoring-Verfahren

entwickelt und ein Prüflabor für Lymphozytenstimulierung unter GMP-Bedingungen aufgebaut. Durch diese Kerneinheit von qualifizierten Wissen-schaftlern und technischem Personal, die vielfältige Immunmonitoring-Technologien standardisieren und validieren, wird sicher-gestellt, dass den klinischen Partnern die neuesten Werkzeuge zur Untersuchung der Wirkung ihrer experimentellen Therapien zur Verfügung stehen, ohne die Notwendigkeit viele komplizierte Technologien selber etablieren zu müssen. Darüber hinaus kann eine solche Kerneinheit immer auf dem neuesten Stand der Technik in diesem Gebiet sein, und gleichzeitig die laufenden Studien durch validierte Tests unterstützen und beratend zur Seite stehen. Die Mitglieder dieser Plattform interagieren ebenfalls mit der GMP-Arbeitsgruppe der GSF um Methoden der Qualitätssicherung für klinisches Prüfmaterial zu etablieren. Neben der Betreuung klinischer Studien ist die Grundlagenforschung ein weiteres Ziel, um die molekularen und zellulären Regulationen der Immunantworten besser verstehen zu können. Durch die Kombination der genannten Ziele wird es in Zukunft möglich sein, immer effizientere Therapieverfahren für die Klinik zu entwickeln.

Die Immunmonitoring-Technologien: Meist reicht ein einzelnes diagnostisches Verfahren nicht aus, um die vielschichtigen Folgen verschiedenster therapeutischer Maßnahmen auf das Immunsystem zu erfassen. Dies ist insbesondere der Fall, wenn es sich um individualisierte Therapieschemata handelt und/oder z. B. eine Tumorerkrankung weit fortgeschritten ist. Folgende Technologien wurden dafür am LTI etabliert:

• ELISPOT-Analysen (enzyme linked immunosorbent spot) zur Quantifizierung Antigen-spezifischer T-Zell-Antworten anhand von Zytokin- bzw. Granzym- oder Perforin-Produktion

• Cytometric bead array (CBA FlexSet, BD Biosciences) bzw. BioPlex-Assay (Bio-Rad, Luminex-Technologie) für die gleichzeitige Quantifizierung von über 20 verschiedenen Zytokinen und Chemokinen aus Serum oder Zellkulturüberständen sowie die Quantifizierung von Zell-signalling-Molekülen (Phosphoproteinen)


• Zytokin-Sekretions- bzw. capture-Assay (MACS®-Miltenyi-Technologie), der eine Anreicherung z. B. Tumor-spezifischer CD4+- und CD8+-T-Zellen auch ohne Kenntnis des Antigens erlaubt

• Multiparameter-Immunfluoreszenz am LSRII-Gerät (BD Biosciences) der GSF, für eine kombinierte phänotypische und funktionelle Analyse verschiedener T-Zell-Subpopulationen

• MHC/Peptid-Tetramer- bzw. Multimer-Bindungsanalysen, vorausgesetzt, dass immunogene, MHC-restringierte Antigene bekannt sind

• Quantitative T-Zell-Rezeptor-Analysen (TCR) mittels Real-time-RT-PCR, wie es z. B. für die RCC-26-Vakzinestudie möglich ist, da hier bereits Tumor-spezifische TCR-Sequenzen bekannt sind.

Um das zytotoxische Potential von T-Zellen zu charakterisieren, wurden zum einen ELISPOT-Assays für Granzym B und Perforin etabliert, zum anderen der Nachweis der sog. CD107a/b-Mobilisierung eingesetzt. Hierbei handelt es sich um vesikuläre Membranproteine, die während der Degranulierung transient an die Zelloberfläche kommen und dann über Bindung an einen Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörper sichtbar gemacht werden. In Kombination mit einer Multimerfärbung, intrazellulärer Zytokin-bestimmung sowie einer Oberflächenmarker-analyse lassen sich am Durchflusszytometer sowohl der Phänotyp als auch die Spezifität und der funktionelle Status Antigen-spezifischer T-Zellen gleichzeitig überprüfen. Eine derartige Mehrfarbenanalyse testen wir derzeit am LSRII-Gerät (BD Biosciences) der GSF.

Als Material für die Etablierung und Vali-dierung der Immunmonitoring-Technologien standen uns Blut- und Hautbiopsieproben der Patienten unserer klinischen Studien zur Verfügung. Um unter Therapie beispielsweise das Zytokinprofil der Zellen aus Biopsiematerial zu analysieren, wurde u. a. der Cytometric Bead Array eingesetzt. Abb. 1 zeigt das Zytokinprofil von T-Zellen aus der Haut-biopsie eines Patienten unserer Prostata-karzinomstudie nach mehrfacher Impfung.

IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-ααααIFN-γγγγ



C

A

B

Abb. 1: Zytokinprofil der T-Zellen aus der Hautbiopsie eines Patienten der Prostatakarzinomstudie nach wiederholter Impfung. Die T-Zellen wurden in vitro mit der LNCaP/IL-2/IFN-γ Vakzine stimuliert und die Zytokine nach 48 Std. aus dem Überstand anhand eines CBA-Assays am Durchflusszytometer bestimmt. Das Fluoreszenzsignal FL2 ist proportional zur Zytokin-konzentration. Dargestellt ist der Überstand der kultivierten T-Zellen ohne Vakzine (A), stimuliert mit Vakzine (B) und der Vakzine allein zur Kontrolle (C).

Das Cancer Vaccine Consortium: Um auch auf internationaler Ebene die Immun-monitoring-Technologien evaluieren zu können, ist die Beteiligung am Cancer Vaccine Consortium des Sabin Vaccine Institutes, USA, vorteilhaft. Das Cancer Vaccine Consortium wurde 2002 mit dem Ziel gegründet, Immunmonitoring-Assays und klinische Studien zu standardisieren und zu validieren, Kombinationstherapien zu identifizieren, Informationsplattformen und internationale Workshops zu bilden, um die Entwicklung von Vakzinen für Krebserkrankungen zu forcieren und auch um internationale Firmen für die Weiterentwicklung von Krebsimpfstoffen zu interessieren. Letzteres ist besonders wichtig um die Translation von experimenteller prä-klinischer Forschung in die Klinik zu er-leichtern.

Im Jahr 2006 wurde ein internationales ELISPOT Proficiency Panel (EPP) durch-geführt, an dem auch die Immunmonitoring-Gruppe des LTI (H. Pohla, B. Stadlbauer,

Immunmonitoring 89

H. Herbig) beteiligt war. Hierfür wurden an 29 verschiedene Labore (USA, Kanada, Belgien, Frankreich, England, Schweiz, Deutschland) 4 tiefgefrorene PBMC-Proben gesunder Spender mit unterschiedlicher Reaktivität gegenüber Mischungen von Peptiden spezifisch für Cytomegalie-Virus (CMV) alleine bzw. gegenüber CMV, Epstein-Barr-Virus und Influenza-Virus (CEF) verschickt. Platten-belegung und Zellzahl waren vorgeschrieben, die Reaktivität der Spender und die Antigene waren unbekannt. Jedes Labor konnte auch seine eigene ELISPOT-Methode und seine eigenen Reagenzien verwenden, um die Robustheit des Assay-Systems zu testen. Abb. 2 zeigt die Plattenbelegung und das Ergebnis eines Experimentes.

no responder high responder

low responder medium responder

Mediaonly

Mediaonly

CMV

CMV

CEF

CEF

no peptide

no peptide

Abb. 2: IFN-γ ELISPOT des Proficiency Panels. PBMC von vier Spendern mit unterschiedlicher Reaktivität gegenüber CMV- (Cytomegalie-Virus) bzw. CEF- spezifischen (Cytomegalie-Virus, Epstein-Barr-Virus, Influenza-Virus) Peptidantigenen wurden entsprechend der Plattenbelegung in jeweils sechs Replikaten mit 200.000 Zellen pro well der Mikrotiterplatte aufgetragen und mit den Antigenen über Nacht inkubiert.

Abb. 3 zeigt als Beispiel ein well der Mikrotiterplatten von allen beteiligten 29 Laboren. Hier zeigen sich deutliche Unter-schiede zwischen den einzelnen Laboren. Ursachen dafür können sein: verwendetes Serum im Medium, fehlerhafte Zählung, unterschiedliche Antikörper und Kit-Systeme. Trotzdem haben alle Labore zumindest die richtige Zuordnung der no, low, medium und high responder getroffen.

In Abb. 4 sind Box-plot-Analysen beispielhaft für Spender 1 (no responder) und für Spender 2 (high responder) gegenüber den CEF-Peptiden dargestellt.

Alle Ergebnisse des EPP werden derzeit validiert (S. Janetzki, ZellNet Consulting Inc., USA) und zur Publikation vorbereitet.

Um weiter zeigen zu können, wie wichtig derartige Evaluierungen der Immunmonitoring-

Technologien sind, haben wir den Einfluss von Serum im Medium getestet. Das Ergebnis ist sehr eindrucksvoll in Abb. 5 zu sehen.

Abb. 3: IFN-γ-ELISPOT des Proficiency Panels. Gezeigt ist jeweils well F3 (low responder) für alle beteiligten 29 Labore.

Overall Results – Donor 1 (no responder), CEF50

40

30

20

10

0� Lab No.�

Overall Results – Donor 2 (high responder), CEF1000

800

600

400

200

0� Lab No.�

Abb. 4: Box-Plots aller IFN-γ-ELISPOTs des Proficiency Panels am Beispiel Spender 1 (no responder, oben) und Spender 2 (high responder, unten) gegenüber den CEF-Peptiden. Dargestellt ist die Anzahl IFN-γ-produzierender PBMC für die einzelnen Labore.


0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

ohnePeptid

CEF ohnePeptid

CEF ohnePeptid

CEF

RPMI IIIAB Serum

RPMI IIIHS Serum

Mediumserumfrei

Anz

ahl I

FNγ-

seze

rnie

rend

erT-

Zelle

n

Abb. 5: Einfluss von Serum im Kulturmedium für die ELISPOT-Analysen. Gezeigt ist die Anzahl IFN-γ- produzierender Zellen pro eingesetzte 50.000 Zellen eines gesunden Spenders nach Stimulation mit CEF-Peptiden.

Fazit: Im Rahmen des ImmunoAssay Proficiency Panel Program sind 2007 zu-sätzliche Analysen für MHC/Peptid-Tetramer-Bindung (Leitung: P. Romero, Lausanne und C.M. Britten, Leiden), intrazelluläre Zytokin-messung (ICS; Leitung: H. Maecker, BD Biosciences, USA) und Proliferationsmessung anhand der Markierung der Zellen mit CFSE (Carboxylfluorescin-Succinimidyl-Ester; Leit-ung: J. Boyer, Pennsylvania, USA) geplant, an denen wir ebenfalls beteiligt sein werden. Ein ähnliches Ziel verfolgt auch die Monitoring Working Group des CIMT (Association for Cancer Immunotherapy) unter Leitung von C.M. Britten, C. Gouttefangeas, Tübingen, und S.H. van der Burg, Leiden.

Neben der Standardisierung der Immun-monitoring-Methoden und der Erstellung von Standard Operating Procedures (SOP) wird auch eine für die Auswertung klinischer Studien benötigt. Die Komplexität der klini-schen Resultate und der Immunmonitoring-Daten bei Patienten unter Immuntherapie benötigt dringend spezialisierte Analyse-methoden wie z. B. die Anwendung artifizieller neuronaler Netzwerke. Ein Computer-programm, das im LTI zur Verfügung steht, ist STATISTICA Neural Networks 7 (StatSoft, Tulsa, OK, USA). Hier ist die enge Kooperation mit A. Buchner (Urologische Klinik) von großer Bedeutung.

H. Pohla, B. Stadlbauer, H. Herbig, M. Odendahl 1, D.H. Busch 1, A. Cosma 2, K. Ebelt 3, D.J. Schendel 3

Koop.: 1 Institut für Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, TU München; 2 Institut für Molekulare Virologie, GSF; 3 Institut für Molekulare Immunologie, GSF.

Förderung: BMBF DLR 01 GE 9624/1; BMBF DLR 01 GE 9625/4; KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF); KKG „Immunmonitoring“.

Antikörperplattform 91

Herstellung von Antikörpern durch genetische Immunisierung

Einführung: In Zusammenarbeit mit der auf Antikörperproduktion spezialisierten Firma Genovac GmbH, Freiburg, die vom Leiter des LTI mitgegründet wurde, konnten wir die Methode der genetischen Immunisierung zur Antikörperherstellung im LTI etablieren. Die Herstellung von monoklonalen und polyklona-len Antikörpern durch genetische Immunisie-rung beruht auf dem ballistischen Transfer von Expressionsplasmiden (Immunisierungsvekto-ren) mittels gene gun in die Haut von Ver-suchstieren. Das kodierte Protein wird dort exprimiert und führt zur Erkennung durch B-Zellen. Herkömmliche Technologien erlau-ben dann die Herstellung von monoklonale Antikörper produzierenden Hybridomen aus den so immunisierten Tieren (Abb. 1). Die vielfältig erprobte Methode hat den Vorteil, dass man bei der Antikörperherstellung das Protein weder rekombinant herstellen noch reinigen muss. Es wird nur die entsprechende cDNA benötigt, die häufig über Ressourcen-zentren bezogen werden kann. Die erhaltenen Antikörper besitzen in der Regel eine hohe Affinität und erkennen native Proteine. Die Methode ist besonders nützlich für die Herstellung von Antikörpern gegen oft durch Glykosylierung modifizierte, sezernierte und transmembran gebundene Proteine, die eine wichtige Gruppe der Therapie- und Diagnose-relevanten Zielstrukturen darstellen. Außerdem gelingt damit die gezielte Herstellung von Antikörpern gegen definierte Proteindomänen (wichtig u.a. für Funktionsbeeinflussung des Zielproteins und für die Herstellung von nicht um die Bindung an das Antigen konkurrieren-den Antikörperpaaren).

Im Rahmen zweier Dissertationsarbeiten wurde die parallele Produktion von Antikörpern durch Immunisierung mit mehreren Expressionsplas-miden als gut durchführbar gezeigt (Necker-mann, 2006; Meyle, eingereicht). Durch Auto-matisierung des Hybridom-Screeningverfah-rens mittels Robotik könnte die Zahl der pro Zeiteinheit hergestellten Antikörper gesteigert werden.

Antikörpergenerierungsprojekte: Nach der Implementierung und Optimierung der Methode der Antikörperherstellung durch genetische Immunisierung haben wir die ersten Projekte zur Herstellung von Antikörpern durchgeführt. Gegen folgende, für die For-schung am LTI relevanten Antigene wurden monoklonale und polyklonale Antikörper her-gestellt (siehe auch die entsprechenden in die-sem Bericht aufgeführten Projekte):

Abb. 1: Schematische Darstellung der genetischen Immu-nisierung mittels gene gun. Die cDNA des interessierenden Proteins wird in einen Immunisierungsvektor kloniert. Dieser erlaubt die transiente Expression des Proteins an der Zelloberfläche nach ballistischem Transfer des auf Goldstaub aufgebrachten Immunisierungsplasmids in die Haut des Versuchstiers. Das dort gebildete Protein stimu-liert antigenspezifische B-Zellen, die mit Hilfe gängiger Hybridomtechologie immortalisiert werden können. Die Identifizierung der die gewünschten Antikörper produzie-renden Hybridome erfolgt durch einen so genannten zell-basierten ELISA (CELISA) mittels Zellen, die nach Trans-fektion mit dem Immunisierungskonstrukt das interessie-rende Protein exprimieren.

• Bovines CEACAM1

• murines CEACAM16

• humanes CEACAM20

• humanes IDO.

Die innovative Methode der Antikörperher-stellung durch genetische Immunisierung hat breite Anwendungsmöglichkeiten und große Vorteile, wenn die native Konformation des Antigens durch die Antikörper erkannt werden soll oder wenn das Antigen nur schwer herzu-stellen ist. Daher bieten wir anderen Arbeits-gruppen des Klinikums an in Kooperation Antikörper zu produzieren. Ein solches Projekt wird im folgenden vorgestellt:

Der Transkriptionsfaktor ITF2B: Die Arbeitsgruppe um Frank Kolligs und Andreas Herbst konnte in Untersuchungen an Patienten mit kolorektalen Karzinomen zeigen, dass die Expression des Transkriptionsfaktors ITF2B im Tumorgewebe im Vergleich zum Normalge-webe verringert ist. Der Verlust der ITF2B-Expression in Kolonkarzinomen ist u.a. auf den Verlust eines ITF2-Allels zurückzuführen. Zu den Zielgenen von ITF2B gehört auch der Zellzyklusinhibitor p21Cip1.

Zur Untersuchung der (fehlenden) Induktion des Zellzyklusinhibitors p21Cip1 wurden zwei Kolonkarzinomzelllinien, DLD-1 und SW480, die kein endogenes ITF2B exprimieren, stabil mit einem Doxycyclin-induzierbaren Expressi-


onskonstrukt für ITF2B transfiziert. Die Doxy-cyclin-induzierte Synthese des Transkriptions-faktors ITF2B führt zu einem Arrest des Zell-zyklus in der G1-Phase. Der Arrest des Zell-zyklus korreliert zeitlich mit der Induktion der ITF2B-Expression und mit dem im Vergleich zur ITF2B-Expression zeitlich verzögerten Auftreten der p21Cip1-Expression, nachgewie-sen durch Immunoblots. Das Fehlen der ITF2B-Expression bietet den betroffenen Kolonkarzinomzellen also einen Selektions-vorteil, da in diesen Zellen der Transkriptions-faktor ITF2B keinen p21Cip1-vermittelten Zellzyklusarrest induzieren kann und sie somit ungehindert proliferieren können.

Vor diesem Hintergrund erschien der Einsatz eines bisher fehlenden Antikörpers zur Lokali-sierung von ITF2B in Tumor- und Normalge-weben von Patienten als äußerst wünschens-wert. Mittels genetischer Immunisierung von Mäusen konnten monoklonale Antikörper durch intradermale Applikation von Goldparti-keln mit adsorbiertem ITF2B-Expressionspla-mid und nachfolgender Fusion der Lymphozy-ten mit Myelomzellen gewonnen werden. Anti-körper des besten Subklons (Ri3B9) wurden aufgereinigt und stehen nun in ausreichender Menge für experimentelle Anwendungen zur Verfügung. Die beiden Anwendungsbeispiele belegen, dass durch genetische Immunisierung gewonnene Antikörper, prinzipiell sowohl nati-ves Protein, wie in den Zytospinpräparaten vorliegend (Abb. 2), als auch denaturiertes Protein, vermutlich im Immunoblot vorliegend (Abb. 3), erkennen können.

Abb. 2: Immunzytochemischer Nachweis von ITF2B (braun) mit mAk Ri3B9 nach Doxycyclin-induzierter IFB2B-Expression in DLD1-Zellen (Zytospinpräparat).

Abb. 3: Western Blot von Doxycyclin-aktivierten und nicht aktivierten DLD1-Zellen mit mAk Ri3B9.

R. Riesenberg, A. Herbst 1, F. Kolligs 1 A. Eisenried, A. Hennig, R. Krupar, R. Kammerer, S. Neckermann, S. Meyle, W. Zimmermann

Koop.: 1 Medizinische Klinik II, Klinikum der Universität München.

Förderung: Förderprogramm Promotionsstudium “Mole-kulare Medizin” der Universität München (12/2003; 40/2005); Deutsche Krebshilfe (106141).


Mitarbeiter (LTI)

Wissenschaftlicher Leiter LTI

Prof. Dr. rer. nat. Wolfgang Zimmermann

Sekretariat

Kornelia Eberle

Arbeitsgruppenleiter

Dr. med. Alexander Buchner Dr. med. vet. Robert Kammerer Dr. rer. nat. Heike Pohla Dr. rer. nat. Rainer Riesenberg

Postdoktoranden

Dr. med. Kathleen Ebelt

Doktoranden (Dr. rer. nat.)

Dipl. Biol. Sandra Neckermann Dipl. Biol. Birte Sievers

Doktoranden (Dr. med.)

Martin Eder Andreas Eisenried Rosemarie Krupar Stefanie Meyle Jessica Nöckel Michael Osthoff Michaela Paptistella Oliver Spring Roland Zebhauser

Technische Assistenten

Anja Hennig Heidi Herbig Birgit Konkol Patrick Palluch Tanja Popp Birgit Stadlbauer

Praktikanten

Mihael Jahovac Katharina Knöpfle Peggy Lang


Kooperationen (LTI)

KKG-Kooperationen Klinische Kooperationsgruppe (KKG) Im-muntherapie urologischer Tumoren

Leitung

Dr. rer. nat. Heike Pohla

Kooperationspartner

Urologische Klinik und Poliklinik, Klinikum der Universität München

Prof. Dr. med. Christian Stief

Institut für Molekulare Immunologie der GSF, München

Prof. Dr. Dolores J. Schendel

Wissenschaftliche Einrichtungen in München Abteilung für Klinische Pharmakologie, Klinikum der Universität München

Prof. Stefan Endres PD Dr. Gunther Hartmann Dr. Dr. Carole Bourquin Dr. Martin Schneider Philipp Schneider

Abteilung Hämatologie-Onkologie, III. Medi-zinische Klinik, Klinikum rechts der Isar, TU München

PD Dr. Helga Bernhard

Chirurgische Klinik und Poliklinik, Klinikum der Universität München

PD Dr. Rudolf A. Hatz Dr. Hauke Winter Dr. Natasja K. van den Engel Dr. Dominik Rüttinger

Genzentrum der Universität München

Prof. Dr. Eckhard Wolf Dr. Marlon Schneider Dr. Georg J. Arnold Dr. Thomas Fröhlich

Institut für Biometrie und Epidemiologie

Prof. Dr. Karl Überla Dr. Alexander Crispin

Institut für Chirurgische Forschung, Klinikum der Universität München

Prof. Dr. Georg Enders

Institut für Experimentelle Onkologie und The-rapieforschung, TU München

Prof. Dr. Bernd Gänsbacher Dr. Thomas Brill Dr. Martina Anton

Institut für Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, TU München

Prof. Dr. Dirk Busch Dr. Marcus Odendahl

Institut für Molekulare Immunologie der GSF, München

Prof. Dr. Dolores J. Schendel PD Dr. Christine S. Falk Dr. Bernhard Frankenberger PD Dr. Elfriede Nößner Dr. Miran Javorovic Dr. Anke Zobywalski Dr. Kathleen Ebelt

Institut für Pathologie, TU München

Prof. Dr. Falk Fend

Institut für Pathologie, Universität München

Prof. Dr. Thomas Kirchner Dr. Christoph Weiler Dr. Gerald Assmann

Institut für Tierphysiologie, Universität München

Prof. Dr. Bernd Kaspers Dr. Stefan Härtle

Labor für Funktionelle Genomik & Transplan-tationsbiologie, Kinderklinik der TU München

Dr. Günther Richter

Medizinische Klinik II, Klinikum der Universität München

PD Dr. Frank Kolligs Dr. Andreas Herbst

MLL Münchener Leukämie Labor GmbH

Prof. Torsten Haferlach Sonja Rauhut

Urologische Klinik, Klinikum rechts der Isar, TU München

Prof. Dr. Rudolf Hartung PD Dr. Roger Paul Dr. Heiner van Randenborgh Dr. Hubert Kübler


Urologische Klinik München-Planegg

Dr. Ralph Oberneder

Urologische Klinik und Poliklinik, Klinikum der Universität München

Dr. Michael Staehler

Nationale wissenschaftliche Ein-richtungen

Deutsches Rheumaforschungszentrum, Berlin

Prof. Dr. Andreas Radbruch Dr. Andreas Thiel

Hämatologie, Onkologie und Tumorimmu-nologie, Charité Berlin, Campus Berlin-Buch

Prof. Dr. Antonio Pezzutto Dr. Jörg Westermann

Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Abteilung für Chemische Biologie, Braun-schweig

Dr. Ronald Frank

Institut für Immunologie, Charité Berlin, Campus Benjamin-Franklin

Prof. Dr. Thomas Blankenstein Prof. Dr. Wolfgang Uckert Dr. Gerald Willimsky

Institut für Molekularbiologie und Biochemie, Charité, Berlin

PD Dr. Lothar Lucka Dr. Bernhard B. Singer

Klinikum Traunstein

Dr. Thomas Hofmann

Medizinische Klinik III, Hämatologie und Onkologie, Johannes-Gutenberg-Universität Mainz

Prof. Dr. Thomas Wölfel

Zellkulturlabor für Klinische Prüfung (ZKP), MDC Berlin-Buch

Dr. Joachim Kopp Engelbert Wehnes

Zentrum für Infektionsforschung, Universität Würzburg

Prof. Dr. Christof R. Hauck

Internationale wissenschaftliche Einrichtungen

Cancer Vaccine Consortium of the Albert B. Sabine Vaccine Institute, Washington DC, USA

Dr. Charu Malik

Department of Cell & Molecular Biology, Karolinska Institute, Stockholm, Sweden

Prof. Dr. Björn Öbrink

Department of Clinical Oncology, Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands

Prof. Dr. Peter J. Schrier

Department of Microbiology, University of Colorado Health Sciences Center, USA

Prof. Dr. Kathryn V. Holmes

Department of Oncology-Pathology, Karolin-ska Institute, Stockholm, Sweden

Prof. Dr. Pavel Pisa

Department of Pathology & Microbiology, School of Medical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

Dr. Darryl J. Hill Prof. Dr. Mumtaz Virji

Department of Pathophysiology, Medical University of Vienna, Österreich

Prof. Dr. Erika Jensen-Jarolim Dr. Kira H. Brämswig

Developmental Genetics Laboratory, Depart-ment of Biochemistry, Biosciences Institute, University College Cork, Cork, Ireland

Dr. Tom Moore Dr. Andrew S. McLellan

Elispot Consulting for the CVC and Chair of Assay Working Group/CVC, ZellNet Con-sulting Inc., USA

Dr. Sylvia Janetzki

Hematology, Oncology, and Transplantation, University of Minnesota Medical School, Minneapolis, USA

Prof. Dr. Keith M. Skubitz

Institute for Animal Health, Compton, New-bury, UK

Dr. Jayne Hope


The Lautenberg Center for General and Tumor Immunology, The Hebrew University, Hadassah Medical School, Jerusalem, Israel

Prof. Dr. Ofer Mandelboim Dr. Gal Markel

Ludwig Institute for Cancer Research, Division of Clinical Onco-Immunology, Lausanne, Schweiz

Prof. Dr. Pedro Romero

National Center for Geriatrics and Gerontol-ogy, Laboratory of Radiation Safety, Gengo, Japan

Dr. Osamu Takikawa

Neuroimmunology Branch, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, Bethesda, USA

Prof. Dr. Steven Jacobson

Norwegian School of Veterinary Science, Oslo, Norway

Dr. Anne Dorset

Robert W. Franz Cancer Research Center, Earle A Chiles Research Institute, Providence Portland Medical Center, Portland, USA

Prof. Dr. Bernard A. Fox Dr. Hong-Ming Hu

University of Leiden, The Netherlands

Dr. Cedric Britten

Industriepartner BT Pharma, Labège Innopole Cedex France

GENOVAC GmbH, Freiburg

immatics biotechnologies GmbH, Tübingen

P.A.L.M. Microlaser Technologies AG, Bern-ried

Trion Research, Martinsried

Vaccine Project Management GmbH, Hanno-ver

Wilex AG, München


Promotionen (LTI)

Martin Eder (Dr. med.), Expressionsanalyse von Zielantigenen für die Immuntherapie von Nierenzellkarzinomen (in Arbeit)

Andreas Eisenried (Dr. med.), CEACAM20, ein Zielmolekül für Tumordiagnose und Tumorimmuntherapie des Prostatakarzinoms? (in Arbeit)

Rosemarie Krupar (Dr. med.), Funktionelle Analyse des Innenohr-spezifischen CEA-Familienmitglieds CEACAM16 (in Arbeit)

Stefanie Meyle (Dr. med.), Verbesserung der Antikörperproduktion durch multiple geneti-sche Immunisierung (in Arbeit)

Sandra Neckermann (Dr. rer. nat.), Optimie-rung der genetischen Immunisierung zur Her-stellung von funktionsbeeinflussenden Anti-körpern gegen Multitransmembranproteine am Beispiel von Chemokinrezeptoren (2006)

Jessica Nöckel (Dr. med.), Charakterisierung eines neuen murinen In-vivo-Modells für die Evaluierung von Tumorimmuntherapien des Magenkarzinoms (in Arbeit)

Michael Osthoff (Dr. med.), Analyse der T-Zellantwort bei Patienten mit hormonrefrak-tärem Prostatakarzinom vor und nach allogener Tumorzellvakzinierung (in Arbeit)

Michaela Paptistella (Dr. med.), Analyse der Signaltransduktion von CEACAM20, einem potentiellen Zielmolekül für die Immuntherapie von Prostatakarzinompatienten (in Arbeit)

Karl Rohrmann (Dr. med.), In-vitro-Analyse der T-Zellantwort von Patienten mit metastasierendem Nierenzellkarzinom unter Behandlung mit Interleukin-2, Interferon- und 5-Fluorouracil (2006)

Birte Sievers (Dr. rer. nat.), Einfluss von CEACAM1-vermittelten Signalen auf die Kreuz-Präsentation von Tumorantigen durch murine dendritische Zellen (in Arbeit)

Oliver Spring (Dr. med.), Beeinflusst die Expression von Indolamin-2,3-dioxygenase (INDO) im Nierenzellkarzinom das Anspre-chen von Patienten auf eine Zytokinimmunthe-rapie? (in Arbeit)

Roland Zebhauser (Dr. med.), Charakterisie-rung eines Mausmodells zur Evaluierung neuer Mitglieder der CEA-Familie als Zielstrukturen für Tumortherapie (2006)


Publikationen (LTI)

2005

B. Frankenberger, S. Regn, C. Geiger, E. Noessner, C.S. Falk, H. Pohla, M. Javo-rovic, T. Silberzahn, S. Wilde, A. Buchner, M. Siebels, R. Oberneder, G. Willimsky, A. Pezzutto, T. Blankenstein, D.J. Schendel: Cell-based vaccines for renal cell carcinoma: genetically-engineered tumor cells and mono-cyte-derived dendritic cells. World J Urol. 23, 166-74 (2005)

B. Frankenberger*, H. Pohla*, E. Noessner, G. Willimsky, B. Papier, A. Pezzutto, K. Kopp, R. Oberneder, T. Blankenstein, D.J. Schendel: Influence of CD80, IL-2 and IL-7 expression in human renal cell carcinoma on the expansion, function and survival of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes. Clin. Cancer Res. 11, 1733-1742 (2005) (*equally contributed)

B. Frankenberger, S. Regn, C. Geiger, E. Noessner, C.S. Falk, H. Pohla, M. Javo-rovic, T. Silberzahn, S. Wilde, A. Buchner, M. Siebels, R. Oberneder, G. Willimsky, A. Pezzutto, T. Blankenstein, D.J. Schendel: Cell-based vaccines for renal cell carcinoma: Genetically-engineered tumor cells and monocyte-derived dendritic cells. World J. Urol. 23, 166-174 (2005)

M. Javorovic, H. Pohla, B. Frankenberger, T. Wölfel, D.J. Schendel: RNA Transfer by electroporation into mature dendritic cells leading to reactivation of effector-memory cytotoxic T lymphocytes: A quantitative analy-sis. Mol. Ther. 12, 734-743 (2005)

A.S. McLellan, B. Fischer, G. Dveksler, T. Hori, F. Wynne, M. Ball, K. Okumura, T. Moore, W. Zimmermann: Structure and evolution of the mouse pregnancy-specific glycoprotein (Psg) gene locus. BMC Genomics 6, 4 (2005)

A.S. McLellan, W. Zimmermann, T. Moore: Conservation of pregnancy-specific glycopro-tein (PSG) N-domains following independent expansions of the gene families in the mouse and human. BMC Evol. Biol. 5, 39 (2005)

S. Poznanovi�, W. Wozny, G. Schwall, C. Sastri, C. Hunzinger, W. Stegman, A. Schrattenholz, A. Buchner, R. Gangnus, R. Burgemeister, M. Cahill: Differential radioactive proteomic analysis of microdissected renal cell carcinoma tissue by 54 cm isoelectric focusing in serial immobilized pH gradient gels. J. Proteome Res. 4, 2117-25 (2005)

O. Schmetzer, G. Moldenhauer, R. Riesen-berg, J.R. Pires, P. Schlag, A. Pezzutto: Quality of recombinant protein determines the amount of autoreactivity detected against the tumor-associated Epithelial Cell Adhesion Molecule antigen: low frequency of antibodies against the natural protein. J. Immunol. 174, 942-952 (2005)

B.B. Singer, E. Klaile, I. Scheffrahn, M.M. Müller, R. Kammerer, W. Reutter, B. Öbrink, L. Lucka: CEACAM1 (CD66a) mediates delay of spontaneous and Fas ligand-induced apoptosis in granulocytes. Eur. J. Immunol. 35, 1949-1959 (2005)

R. Zebhauser, R. Kammerer, A. Eisenried, A.S. McLellan, T. Moore, W. Zimmermann: Identification of a novel group of evolutionary conserved members within the rapidly diverging murine Cea family. Genomics 86, 566-580 (2005)

W. Zimmermann: Ceacam10. AfCS-Nature Molecule Pages (doi:10.1038/mp.a003606.01) (2005)


2006

A. Buchner*, R. Riesenberg*, I. Kotter, A. Hofstetter, C. Stief, R. Oberneder: Frequency and prognostic relevance of disseminated tumour cells in bone marrow of patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer 106, 1514-20 (2006) (*equally contributed)

J. Nöckel, N.K. van den Engel, H. Winter, R.A. Hatz, W. Zimmermann, R. Kammerer: Characterization of gastric adenocarcinoma cell lines established from CEA424/SV40 T antigen-transgenic mice with or without a human CEA transgene. BMC Cancer 6, 57 (2006)

D. Rüttinger, H. Winter, N.K. van den Engel, R.A. Hatz, M. Schlemmer, H. Pohla, S. Grutzner, D.J. Schendel, B.A. Fox, K.W. Jauch: Immunotherapy of lung cancer: an update. Onkologie 29, 33-38 (2006)

J.S. Schleypen, N. Baur, R. Kammerer, P.J. Nelson, K. Rohrmann, E.F. Gröne, M. Hohenfellner, A. Haferkamp, H. Pohla, D.J. Schendel, C.S. Falk, E. Noessner: Cytotoxic markers and frequency predict functional capacity of natural killer cells infiltrating renal cell carcinoma. Clin. Cancer Res. 12, 718-725 (2006)

K.M. Skubitz, W. Zimmermann, R. Kam-merer, S. Pambuccian, A.P.N. Skubitz: Differential gene expression identifies subgroups off renal cell cancer. J. Lab. Cin. Med. 147, 250-67 (2006)

F. Wynne, M. Ball, A.S. McLellan, P. Dock-ery, W. Zimmermann, T. Moore: Mouse pregnancy-specific glycoproteins exhibit tissue-specific expression and association with maternal vasculature. Reproduction 131, 721-32 (2006)


Drittmittelförderungen (LTI)

Projekttitel / Förderer / Laufzeit

Analyse und Beeinflussung des Verhaltens humaner Lymphozyten in der Mikroumgebung kolorektaler Karzinome (70-2561-Ka 2). Deut-sche Krebshilfe, 01.12.02 - 30.11.04, verlän-gert bis 31.05.05

Dendritische-Zell-basierte Vakzine und im-munstimulatorische Oligonukleotide zur The-rapie spontaner Magenkarzinome im SV40 T-Antigen-transgenen Mausmodell (10-2214-En 3). Deutsche Krebshilfe, 02.04.04 - 01.04.06 (Mitantragstellung)

Identifizierung und Evaluierung von Ziel-strukturen für die Antikörper- und Zell-ver-mittelte Immuntherapie des Nierenzellkarzi-noms (106141). Deutsche Krebshilfe, 19.10.04 - 30.04.07

Untersuchung der synergistischen Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-basierter photodynami-scher Therapie und Immuntherapie beim Gli-oblastom und Prostatakarzinom (107320). Deutsche Krebshilfe 18.05.06 - 17.05.08

Core facility for the construction and charac-terization of T cell receptor gene-modified T lymphocytes (SFB-TR 36Z1). SFB-TR “Principles and applications of adoptive T cell therapy” 01.07.06 - 30.06.10

Klinische Kooperationsgruppe: Immuntherapie bei urologischen Tumoren (FE 71791). GSF/BMBF, 01.09.01 - 31.08.06

Phase I Trial: IL-2/B7.1 modifizierte allogene Tumorzellen als Vakzine für Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom (DLR 01 GE 9624/1). BMBF, 01.04.04 - 31.12.06

Identifikation potentieller Zielstrukturen für eine spezifische Immuntherapie und prognos-

tisch relevanter Faktoren beim metastasierten Nierenzellkarzinom mittels Laser-Mikrodis-sektion und Oligonukleotid-Microarrays (Reg.-Nr. 343). FöFoLe der Universität München, 14.04.04 - 13.10.05

CEACAM20, ein potentielles prostataspezi-fisch exprimiertes Zielmolekül für Tumordiag-nose und Tumorimmuntherapie (Reg.-Nr. 12/2003). Promotionsstudium “Molekulare Medizin” der Universität München, 01.02.04 -31.07.05

Beeinflusst die Expression von Indolamin-2,3-dioxygenase (INDO) im Nierenzellkarzinom das Ansprechen von Patienten auf eine Zytoki-nimmuntherapie? (Reg.-Nr. 2/2004). Promoti-onsstudium “Molekulare Medizin” der Universität München, 01.02.05 - 31.07.06

Expressionsanalyse von Zielantigenen für die Immuntherapie von Nierenzellkarzinomen (Reg.-Nr. 3/2004). Promotionsstudium “Molekulare Medizin” der Universität München, 01.02.05 - 31.07.06

Untersuchung der Funktion von CEACAM16 im Innenohr (Reg.-Nr. 40/2005). Promotions-studium “Molekulare Medizin” der Universität München, 01.02.06 - 31.07.07

Untersuchung der therapeutischen und prog-nostischen Möglichkeiten von CEACAM20 für das Prostatakarzinom (Reg.-Nr. 41/2005). Promotionsstudium “Molekulare Medizin” der Universität München, 01.02.06 - 31.07.07

Entwicklung und Validierung einer neuartigen Tumor-Prognostik anhand der CEACAM-Familie: Multianalyt-Sandwich-Pair-ELISA. BioChancePLUS BMBF, bewilligt für 3 Jahre (Subkontraktnehmer)


Veranstaltungen, Ausbildung, Lehre (LTI)

Seminarreihe des Labors für Tumorim-munologie und der KKG „Immuntherapie urologischer Tumoren“ (GSF - Universität München)

Regression and escape of melanoma after an antigen-driven expansion and persistence of gp100-specific TCR-transgenic CD8+ T cells in lympho-depleted mice. Dr. Hong-Ming Hu, E.A. Chiles Research Institute and Franz W. Cancer Center, Providence Health Center, Portland, OR, USA (24. Januar 2005)

The adenylate cyclase from Bordetella pertus-sis: a promising vector for immunotherapy. Dr. Xavier Préville, Head Immunothera-peutics, BT Pharma, Prologue-Biotech, Paris, France (14. Februar 2005)

Trifunktionelle Antikörper in der Tumorthera-pie. Dr. Peter Ruf, Dr. Michael Jäger, Trion Research, Martinsried (9. Mai 2005)

Anti-angiogenetischer und anti-vaskulärer Effekt von m-TOR-Inhibitoren bei soliden Tumoren: Vorstellung verschiedener präklini-scher Tiermodelle. PD Dr. Christiane Bruns, Chirurgische Klinik und Poliklinik, Klinikum der Universität München (23. Mai 2005)

Mimotopes for epitope-specific tumor immu-notherapy. Prof. Dr. med. Erika Jensen-Jarolim, Center of Physiology and Patho-physiology, Medical University of Vienna, Vienna, Österreich (27. Juni 2005)

Immunoglobulin gene conversion or hyper-mutation: that’s the question. Prof. Dr. Jean-Marie Buerstedde, Institut für Molekulare Radiobiologie, GSF, Neuherberg (4. Juli 2005)

Identification of novel human T cell epitopes in HLA-B27-transgenic mice and man associated with spondyloarthropathy. Dr. rer. nat. Wolfgang Kuon, Medizinische Poliklinik Innenstadt, Klinikum der Universität München, (11. Juli 2005)

Strategien multimodaler molekularer Bildge-bung: Anwendungen beim Zell-Trafficking. Dr. Frank Berger, Institut für klinische Radiologie, Universität München (17. Oktober 2005)

The CD8+ and CD4+ T cell response in a patient with RCC following vaccination with GM-CSF gene transduced autologous tumor cells. Dr. Josef Mautner, Kinderklinik der Technischen Universität München (28. November 2005)

Immunogenicity of MVA-based Her2/neu vaccines in a murine model of breast cancer. Dr. med. Ingo Drexler, Institut für Virologie, Technische Universität München (12. Dezember 2005)

„Cell-on-a-chip“-Assays in Forschung und Medizin. Dr. Martin Brischwein, Heinz Nix-dorf-Lehrstuhl für Medizinische Elektronik der Technischen Universität München (8. Mai 2006)

Humane endogene Retroviren (HERV), Troja-nische Pferde im menschlichen Genom. PD Dr. Christine Leib-Mösch, Institut für Molekulare Virologie der GSF, Neuherberg (29. Mai 2006)

Identifikation von Wnt-Zielgenen im Kolonkar-zinom. PD. Dr. med. Frank Kolligs, Medizi-nische Klinik II, Klinikum der Universität München (26. Juni 2006)

Bedeutung von beta-Catenin für die Regulation von Invasion, Differenzierung und stemness in der Progression humaner, kolorektaler Karzi-nome. PD Dr. Andreas Jung, Pathologisches Institut, Universitat München (27. November 2006)

Role of the non-receptor tyrosine kinase Syk for the control of the acute inflammatory response. Prof. Dr. Barbara Walzog, Institut für Phy-siologie, Universität München (18. Dezember 2006)


Praktikum

„Molekularbiologische Methoden in der Immu-nologie und Tumorimmunologie“ 16. – 20.01.06 17. – 21.07.06 Zimmermann, Buchner, Kammerer, Pohla, Riesenberg

In diesem Praktikum werden in Kleingruppen eigenständig molekularbiologische Methoden kennengelernt, die aktuell in der immunologi-schen und tumorimmunologischen Forschung eingesetzt werden:

HLA-Typisierung durch Durchflusszytometrie

Nachweis von Tumorantigenen durch Immun-histologie

Nachweis von tumorspezifischen murinen CTL durch Durchflusszytometrie

Validierung von Tumorantigenen

Nachweis von humanen peptidspezifischen CTL durch IFN�-Elispot

Praktikum

„Grundlagen der Immunologie“

sowie Vorlesung für Biologie-Studenten und Seminar über aktuelle Probleme der Tumor-immunologie (zusammen mit dem Institut für Immunologie der Universität München).

Sommersemester 2005 Wintersemester 2005/2006 Sommersemester 2006 Wintersemester 2006/2007

Dr. Heike Pohla

LTI-Doktoranden-Seminar

In diesem Seminar sind die medizinischen und naturwissenschaftlichen Doktoranden aufgefor-dert, in Form von Kurzvorträgen den aktuellen Stand ihrer wissenschaftlichen Tätigkeit zu präsentieren und zu diskutieren. Das Seminar bildet ein Forum, um übergeordnete Fragestel-lungen zu erörtern und in den Forschungsrah-men des LTIs einzupassen, sowie den Stellen-wert der eigenen wissenschaftlichen Aktivitä-ten einzuordnen. Do., 8.30 – 10.00 Uhr

Forschungsberichte Labor für Tumorimmunologie · neuartige Methode zur Gewinnung von Anti-körpern...

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