FP 22 - Lichtmikroskopie - WordPress.com · 2007-10-31 · FP 22 - Lichtmikroskopie 2 1 Einführung...

Fachbereich 1

LaborprotokollFP 22 Lichtmikroskopie

Schriftliche Ausarbeitung und

Protokollauswertung im Fortgeschrittenenpraktikum

für Physik SS 2007

Dozent: Prof. Dr. Thomas Schmidt

Tutorin: Tanja Dodenhof

vorgelegt von: Thorsten Schönbohm

Eschenplatz 2

26129 Oldenburg

Email: [email protected]

Bremen, 02.05.2007

FP 22 - Lichtmikroskopie 1

Inhaltsverzeichnis 1 Einführung und Ziel des Versuches................................................................. 2

2 Theoretische Ausarbeitung...............................................................................3

2.1 Kurzbeschreibung des Gesamtsystems Mikroskops................................3

2.1.1 Kurzbeschreibung der wichtigsten Teile des Mikroskops......................5

2.1.2 Die wichtigsten Größen eines Mikroskops.............................................5

2.2 Grundbegriffe.............................................................................................7

2.3 Brownsche Molekularbewegung, Bolzmann Konstante, ............................

Avogadrokonstante...................................................................................7

2.4 Kontrastverändernde Methoden................................................................8

2.4.1 Phasenkontrast..................................................................................9

2.4.2 Differential-Interferenz-Kontrast (DIK).............................................11

2.4.3 Reflektions-Interferenz-Kontrast (RIKM + Antiflex)......................... 13

2.4.4 Fluoreszenz......................................................................................15

3 Versuchsdurchführung und Auswertung........................................................16

3.1 Bestimmung der Auflösung und Tiefenschärfe von schwach bis mittel ..

vergrössernder Objekte.......................................................................... 16

3.2 Bestimmung der Avogadrokonstante mit Hilfe der Brownschen .............

Molekularbewegung................................................................................19

3.3 Vergleich der Kontrastmethoden.............................................................23

3.4 Fluoreszenzanfärben von zellulären Strukturen..................................... 25

4 Resümee.........................................................................................................27

3 Anhang............................................................................................................28


1 Einführung und Ziel des VersuchesDer Versuch ist in vier Aufgabenbereiche geteilt:

1. Bestimmung der Auflösung und Schärfentiefe mit dem Ziel, die

Bedienung und den Aufbau des Mikroskops kennen zu lernen.

2. Bestimmung der Avogadrokonstante mit Hilfe der Brownschen

Molekularbewegung, wobei hier in die digitale Bildverarbeitung

eingeführt werden soll.

3. Hochauflösende Aufnahmen von Zellen dienen zur Einführung in die

verschiedenen Kontrastmethoden: Ölimmersion, Phasenkontrast,

Differential-Interferenz-Kontrast, Reflektions-Interferenz-Kontrast.

4. Einführung in die Fluoreszenzmikroskopie.

Bei den Fragestellungen soll die Sichtweise der Biophysik angenommen

werden, in dem man verschiedene Methoden der Lichtmikroskopie kennen

lernt.


2 Theoretische Ausarbeitung

2.1 Kurzbeschreibung des Gesamtsystems MikroskopsMit Mikroskopen werden kleine im Nahbereich liegende Objekte in zwei

Stufen vergrößert betrachtet, während eine Lupe nur eine einstufige Vergrös-

serung ergibt. Im Gegensatz zum Fernrohr wird das Objekt bereits durch das

Objektiv vergrößert abgebildet; das Zwischenbild wird durch das Okular

nachvergrößert1. Die wichtigsten Komponenten eines Mikroskops sind:

● Lichtquelle

● Kondensor

● Objektiv

● Okular

● für ein Auflichtmikroskop kommt noch ein Strahlenteiler hinzu.

In der nachfolgenden Zeichnung werden die beiden wichtigsten, schemati-

schen Strahlengänge für die Durchlichtmikroskopie, Abb. 48a mit Hygens-

Okular und Auflichtmikroskopie, Abb. 48b. gezeigt.

verwendete Formelzeichen:

O, O' Objekt- und Bildpunkt auf der Achse

F, F' Objekt- und Bildbrennpunkt

Ob ObjektivOk OkularAP Aperturblendet Brennpunkt-

abstand von Systemen (optischeTubuslänge

T StrahlungsteilerL Tubuslinse

1 Schröder, Gottfried: Technische Optik, Grundlagen und Anwendungen. 8. ü. Aufl. Würzburg: Vogel, 1998 (= Kamprath-Reihe), S. 149f.

Abbildung 1: Strahlengang eines Mikroskops (Zeichnung nach DIN 1335) a) Abbildung durch das Objektiv in die Okularbrenn-

ebene b) Abbildung durch das Objektiv nach ∞, Einspiegeln

der Auflichtbeleuchtung durch den Strahlenteiler T.Quelle: Schröder, Gottfried (1998)


1. Stativfuß

1.a Kippgelenk bei älteren Mikroskopen

mit „Hufeisenfuß“

2. Tubusträger oder Stativarm

3. Objekttisch

4. Kondensor

5. Zentrierschrauben

6. Kondensorhilfslinse

7. Filterhalter mit Einlegefilter

8. Kondensorträger (höhenverstellbar)

9. Grobtriebknöpfe (beidseitig)

10. Feintriebknöpfe (beidseitig)

12. Lampenfassung und Glühlampe

13. 14. Lampenkollektor

15. Beleuchtungsspiegel

16. Leuchtfeldblende

17. Objektiv

18. Objektivwechsler (Revolver)

19. Tubus: bei modernen Mikros-

kopen als Prismenkopf mit einem oder

mehreren Umlenkprismen für den

Schrägeinblick; auswechselbar gegen

andere Tuben.

20. Okulartubus

21. Okular

22. Auge

Abbildung 3: Seitenansicht eines Durchsichtmikroskops. Quelle: www.mikroskopie-muenchen.de/mikteile.html (04.2007)

Abbildung 2: Strahlengang eines Durchlichtmikroskops. Quelle: www.mikroskopie-muenchen.de/mikteile.html (04.2007)

http://www.mikroskopie-muenchen.de/mikteile.html

http://www.mikroskopie-muenchen.de/mikteile.html


3.2.1 Kurzbeschreibung der wichtigsten Teile des Mikroskops

Der Kondensor (Pos. 4) ist ein Linsensystem und dient zur „Aufbereitung“

des Lichts. Das heißt, das von der Lichtquelle stammende Licht wird auf die

Objektebene / das Objekt gebündelt. Dabei wird die Apertur des Objektivs ganz

mit Licht gefüllt, um die größtmögliche Auflösung zu erreichen.

Das Objektiv (Pos. 17.) sitzt meistens auf einem so genannten Revolver

oder Objektivwechsler (Pos. 18). Dies soll eine einfache Handhabung beim

Umschalten zwischen den verschiedenen Vergrößerungen gewährleisten. Das

von ihm entworfene reale Zwischenbild des Objekts in der Zwischenbildebene

ist ausschlaggebend für die Qualität des Bildes, das man im Okular sehen kann.

Um Linsenfehler, wie sphärische und achromatische Aberration zu minimieren,

besteht das Objektiv nicht aus Einzellinsen, sondern aus einem Linsensystem,

dem so genannten Achromat. Um tiefer auf Linsenfehler einzugehen, vergleiche

hierzu Demtröder: Experimentalphysik 2, Elektrizität und Optik, 3. Aufl. Berlin,

Heidelberg, New York: Springer, 2004, S. 273 ff.

Die Okulare (Pos. 21) dienen als „Lupe“ um das Zwischenbild in der

Zwischenbildebene zu vergrößern. Ähnlich wie bei den Objektiven bestehen die

Okulare auch aus einem Linsensystem, um Linsenfehler zu minimieren.

3.2.2 Die wichtigsten Größen eines Mikroskops

Die Gesamtvergrößerung eines Mikroskops berechnet sich aus der

Vergrößerung des Okulars mal der Vergrößerung des Objektivs:

(1)

Hierbei sollte man aber beachten, dass es sich um die förderliche Vergrös-

serung und nicht um eine leere Vergrößerung handelt.1

1 Schröder, Gottfried: Technische Optik, Grundlagen und Anwendungen. 8. ü. Aufl. Würzburg: Vogel, 1998 (= Kamprath-Reihe), S. 151f.

V=VOb⋅V Ok


Neben der Vergrößerung ist die Auflösung die wesentliche Größe eines

Mikroskops. Unter der Auflösung wird in der Mikroskopie, wie auch in der

Fotografie, die Möglichkeit verstanden, zwei Punkte zu unterscheiden. Je

geringer der Winkelabstand der Punkte, die noch unterschieden werden

können, desto größer die Auflösung. Hierzu kann das Rayleigh'sche Kriterium

herangezogen werden. Es besagt, dass bei einer kreisförmigen Öffnung mit

einem Durchmesser d die kritische Winkeldifferenz αk, bei der zwei Quellen

noch getrennt wahrzunehmen sind, gegeben ist durch:

(2)

Dabei ist λ die Wellenlänge und d der Öffnungsdurchmesser der Linse.

Nach Ernst Karl Abbe ist die Auflösung eines Mikroskops wesentlich von

dessen Numerischer Apertur AN bestimmt. Diese ergibt sich aus dem Berech-

nungsindex n des Mediums zwischen Objekt und Objektiv und aus dem Sinus

des halben Öffnungswinkels α des Objektivs:

(3)

Damit lässt sich der minimale Abstand dmin zweier unterscheidbarer Punkte

folgender Maßen mit der Wellenlänge λ und AN ausdrücken:

(4)

Die Schärfentiefe beschreibt die Länge der Strecke parallel zur optischen

Achse, die vom Betrachter scharf wahrgenommen werden kann. Die Schärfen-

tiefe hängt von der Objektiv-Brennweite, der Blendzahl, der Gegenstandsweite

und dem Zerstreuungskreisdurchmesser ab.

k=1,22⋅

d

AN=n⋅sin 2

dmin=

2⋅n⋅sin 2=

2⋅AN


2.2 Grundbegriffe

2.3 Brownsche Molekularbewegung, Boltzmann Konstante, Avogadrokonstante

Robert Brown (1773-1858) war Botaniker und entdeckte 1827, dass in

Flüssigkeiten suspendierte Teilchen unregelmäßige Zitterbewegungen aus-

führen, die man unter einem Mikroskop beobachten kann. Diese Bewegungen

lassen sich erklären, wenn man annimmt, dass die im Vergleich zu den Atomen

sehr großen Teilchen – in unserem Versuch handelt es sich dabei um Latex-

Kugeln – dauernd von sich schnell bewegenden Atomen bzw. Molekülen in

statistisch verteilte Richtungen gestoßen werden. Abbildung 4 zeigt eine sche-

matische Darstellung der Brownschen Bewegung. Die grundlegende Theorie zur

Brownschen Molekularbewegung wurde 1905 gleichzeitig von Albert Einstein

(1879-1955) und Marian Smoluchowski (1872-1917) entwickelt.

Einstein und Smoluchowski formulierten die Gleichung:

(5)

Abbildung 4: Brownsche Molekularbewegung als Schema in zwei Vergrößerungen

D⋅f =k⋅T


Dabei beschreibt der Koeffizient f die Reibung der Teilchen im Medium, k

ist die Boltzmann-Konstante und T die absolute Temperatur in Kelvin. Für eine

Latexkugel entspricht f der Stokes'schen Reibung. Diese beschreibt die

Abhängigkeit des Reibungskoeffizienten von der Viskosität η des Mediums und

dem Radius r für sphärische Kugeln:

(6)

Alle diese Größen sind messbar. Die Lohschmidt- oder auch Avogadro

Konstante NA kann nun über die Beziehung:

(7)

bestimmt werden. Die absolute Gaskonstante R ist ebenfalls makroskopisch

messbar. Eine Alternativmethode, um die Avogadro-Konstante zu messen, ist

den Zusammenhang F = NA * e zwischen der Faraday-Konstante F und der

Elementarladung e auszunutzen.

Eine empirische Beschreibung ermöglicht das Diffusionsgesetz, das den

zeitlichen Verlauf des mittleren Abstandsquadrates r2 zweier solcher Mole-

küle beschreibt. D ist die Diffusionskonstante, t die Zeit und n die Freiheits-

grade der Translation.

(8)

Im Mikroskop wird nur eine Ebene betrachtet, daher gilt für zwei

Freiheitsgrade die Gleichung:

(9)

2.4 Kontrastverändernde MethodenIm Versuch FP 22 werden verschiedene kontrastverändernde Methoden

der Mikroskopie verglichen. In diesem Abschnitt sollen die physikalischen

Prinzipien, die hinter diesen Methoden stehen, näher erklärt werden. Dabei

handelt es sich um die

● Phasenkontrast-Mikroskopie, entwickelt von den Niederländer Frits

Zernike in den 1930er Jahren. Zernike bekam für diese Arbeiten 1953 den

Physik-Nobelpreis,1

● DIK Mikroskopie, welche in den 1940er und 50er von der

österreichischen Firma Reichert entwickelt wurde,

1 www.dhm.de/lemo/html/kaiserreich/wissenschaft/nobelpreis/physik/index.html (05.2007)

r2=2⋅n⋅D⋅t

r2=4⋅D⋅t

f =6⋅⋅⋅r

N A=Rk

http://www.dhm.de/lemo/html/kaiserreich/wissenschft/nobelpreis/physik/index.html


● RIK Mikroskopie / Antiflex. Die Methode wurde zuerst von Curtis (1964)

zur Untersuchung der Zelladhäsion verwendet und mit der Einführung

der Antiflex-Technik durch Ploem (1975) entscheidend verbessert.

● Floureszenz-Mikroskopie.

2.4.1 PhasenkontrastDer Strahlenverlauf im Phasenkontrast-Mikroskop verläuft folgend1,

(vergleiche auch hierzu die Abbildungen 5 und 6):

● Der von einer Lichtquelle stammende Lichtstrahl wird durch einen

Kollektor und Leuchtfeldblende begrenzt und nahezu parallelisiert,

dieser trifft dann in der vorderen Brennebene des Kondensators auf eine

Ringblende.

● Durch die Ringblende wird ein „Lichtzylinder“ erzeugt und durch einen

Kondensor auf die Objektebene bzw. auf das Objekt fokussiert.

● Das Licht bricht sich im Objekt und ändert so seine Phase (Abbildung 5).

● Das mikroskopische Bild entsteht durch Interferenz des direkten

Mikroskopierlichts mit dem am Präparat gebeugten Lichts. Im Hellfeld-

Mikroskop würde dieses gebeugte Licht zu schwach sein, um durch

Interferenz mit dem direkten Mikroskopierlicht ein kontrastreiches Bild

zu ergeben.

● Der anschließende Phasenring in der hinteren Objektiv-Brennebene

verändert das direkte Licht durch Schwächung seiner Amplitude – da der

Phasenring getönt ist – und Veränderung seiner Phase. Das gebeugte

Licht nimmt dagegen weitgehend unbeeinflusst an der Bildentstehung

teil.

1 www.mikroskopie.de/kurse/navigation/phasenkontrast/kurs.htm (05.2007)

Abbildung 5: Amplituden- und Phasenobjekte

http://www.mikroskopie.de/kurse/navigation/phasenkontrast/kurs.htm


● Im Phasenkontrast-Mikroskop wird somit der Einfluss des gebeugten

Lichts relativ zum direkten Mikroskopierlicht durch das Objektiv und

Okular vergrößert.

● Dadurch kommt es zu einer kontrastreichen Abbildung normalerweise

schwer erkennbarer Präparatstrukturen. Vergleiche hierzu Abbildung 7

und 8.

Wie in der Abbildung 8 zu erkennen, ist das Bild sehr kontrastschwach

und Einzelheiten sind kaum zu erkennen. Hingegen erscheint in Abbildung 7

das gleiche Präparat kontrastreich und Details – wie die beiden Zellkerne –

werden deutlich erkennbar.1

1 www.mikroskopie.de/kurse/navigation/phasenkontrast/kurs.htm (05.2007)

Abbildung 8: Präparat im Hellfeld

Abbildung 7: Präparat im Phasenkontrast

Abbildung 6: Strahlengang im Phasenkontrast-Mikroskop.Quelle: www.mikroskopie.de/kurse/navigation/phasenkontrast/kurs.htm (05.2007)




2.4.2 Differential-Interferenz-Kontrast (DIK)

Von einer monochomatischen Lichtquelle trifft das Licht über den Polarisator,

das Nomarski Prisma und den Kondensor auf die Objektebene. Der Polarisator

erzeugt linear polarisiertes Licht. Im Nomarski-Prisma wird nun das Licht in

zwei kohärente Wellenfronten mit gleicher Amplitude aufgespalten. In der

Abbildung ist dies durch Querstriche oder Punkte im Strahlengang kenntlich

gemacht, die verdeutlichen sollen, dass die beiden Wellenfronten zueinander

senkrecht orientierte Schwingungsebenen besitzen. Der Kondensor parallelisiert

nun diese beiden Lichtstrahlen. Daher passieren die Wellenzüge die

Objektebene und somit auch das Beobachtungsobjekt in einem kleinen Abstand

zueinander. Dieser Abstand liegt aber unterhalb der Auflösungsgrenze des

Mikroskops. Anschließend werden die Wellenzüge über ein zweites Nomarski-

Prisma wieder vereint. Das zweite Nomarski-Prisma lässt sich senkrecht zum

Strahlengang verschieben. Das kann man sich so vorstellen, dass zwei

keilförmige Prismenhälften über die Diagonale verschoben werden. Dadurch

lässt sich der Gangunterschied zwischen den beiden Wellenzügen stufenlos

verändern. Nach dem zweiten Nomarski-Prisma befindet sich der Analysator in

Kreuzstellung zum Polarisator. Nach dem Austritt aus dem Analysator kommt

es zu Interferenz zwischen den zusammengeführten Wellenzügen. Diese

Interferenzerscheinungen sind einerseits vom eingestellten Gangunterschied

abhängig; andererseits wird der zwischen beiden Wellenzügen eingestellte

Gangunterschied durch das Präparat zusätzlich modifiziert. Dies rührt daher,

dass der eine Wellenzug beispielsweise nur durch das Einschlussmedium, der

andere, lateral versetzt laufende Wellenzug jedoch bereits durch eine

Präparatstruktur mit von dem Einschlussmedium abweichender Brechzahl

verläuft.

Die Abbildung zeigt eine Amöbe mit einem DIK Mikroskop aufgenommen.

Typisch dabei sind die hellen (oben) und dunklen (unten) Ränder des Präparats.

Diese Ränder machen das Bild quasi plastisch.


Abbildung 9: Strahlengang eines DIK-Mikroskops

Abbildung 10: Amöbe im DIK mit dem typischen Relief-Kontrast hervorgerufen durch Interferenz. Dadurch ergibt sich ein Hell-Dunkel-Effekt an den Zellaus-senseiten.


2.4.3 Reflektions-Interferenz-Kontrast (RIKM + Antiflex)

Für monochromatisches Licht sorgt eine Quecksilberdampflampe mit

hoher Intensität, die inkohärentes Licht in einem Linienspektrum aussendet.

Wie in der Abbildung erkennbar befindet sich zwischen Kollektor und Apertur-

blende ein Interferenzfilter (Monochromator), der eine bestimmte Lichtwellen-

länge im grünen Linienspektrum passieren lässt. Eine anschließende Köhler-

optik sorgt für eine gleichmäßige Ausleuchtung der Objektebene und bildet

außerdem die Leuchtfeldebene in dieser Ebene ab. Nun gelangt der Wellenzug

über einen dichroitischen Umlenkspiegel in das Objektiv, welches nun als

Kondensor dient. An den verschiedenen Grenzflächen der Probe reflektiertes

Licht interferiert und wird durch das Objektiv und die abbildende Linse in die

CCD-Kamera oder zum Auge des Betrachters geleitet. Die entstehenden Bilder

können mit Hilfe einer Bildverarbeitungssoftware weiter verarbeitet werden.

Das Antiflex-Verfahren trägt zu einer Kontrastverbesserung bei, da sie

Streulicht, das in der Mikroskopoptik entsteht, unterdrückt. Nach der Leucht-

feldblende wird wie beim DIK ein Polarisator in den Strahlengang eingesetzt,

der für linear polarisiertes Licht sorgt. Das polarisierte Licht ist in der

Abbildung als gestrichelte Linie dargestellt. Vorm Okular bzw. der CCD-Kamera

befindet sich zum Polarisator der gekreuzte Analysator. Oberhalb des Objektivs

befindet sich ein λ/4 – Plättchen, welches linearpolarisiertes Licht in zirkular-

polarisiertes Licht umwandelt. Die speziellen Eigenschaften des zirkular-

polarisierten Lichts werden nun geschickt genutzt: Bei der Reflexion unter

kleinen Winkeln an optisch dünneren Medien erhält die Komponente des

elektrischen Felds, die parallel zur Einfallsebene liegt, eine Phasenverschiebung,

die Komponente senkrecht zur Einfallsebene bleibt unverändert. Im Falle einer

Reflexion an optisch dichteren Medien bleibt die parallele Komponente erhal-

ten, die senkrechte verschiebt ihre Phase um einen bestimmten Betrag. Somit

wird bei jeder Reflexion die Richtung der Zirkularpolarisation geändert und

beim erneuten Durchgang durch das λ/4 – Plättchen entsteht Licht, das

senkrecht zur ursprünglichen Richtung linearpolarisiert (durch Plus-Zeichen im

Strahlengang gekennzeichnet) ist.


Dieses Licht kann den Analysator passieren und das Streulicht, welches nicht

oberhalb des Objektivs entstanden ist, wird herausgefiltert.1

1 Lortz, Babara G.: Etablierung eines Modellsystems der Zelladhäsion über spezifische Bindungen geringer Affinität, Dissertation, TU München 2003

Abbildung 11: Optischer Weg eines RIK Mikroskops

Quelle: Lortz, Babara G.: Etablierung eines Modellsystems der Zelladhäsion über spezifische Bindungen geringer Affinität, Dissertation, TU München 2003


2.4.4 Fluoreszenz

Im Gegensatz zur Phosphoreszenz, bei der die Emission eine sehr viel

längere Abklingdauer (10-10 bis 10-7 s1) besitzt und die Entstehung der Licht-

Emission aus einem angeregten Triplett-Zustand (Gesamt-Spinquantenzahl

S=1) stammt, besitzt die Fluoreszenz eine kürzere Lebensdauer (> 10-³ s) und

dessen Emissionsenergie stammt aus strahlenden Übergängen von vibro-

nischen Niveaus. Gewöhnlich sind es die niedrigsten eines elektronischen

Anregungszustandes des Grundzustandes. Vergleiche dazu die Abbildung 12. für

diese Übergänge gilt ebenfalls wie für die Absorption das Franck-Condon-

Prinzip2. Die Fluoreszenz erfolgt bei Quantenenergien, die kleiner oder höch-

stens gleich sind wie diejenigen der Absorption.3

1 www.chemie.uni-freiburg.de/aoanchem/cj/Analytik1/VL19_Fluoreszenz_und_FIAweb.pdf (05.2007)

2 Haken, Hermann; Wolf, Hans Cristoph: Molekühlphysik und Quantenchemie, Einführung in die experimentellen und theoretischen Grundlagen. 5. völlig neubearb. und erw. Aufl. Berlin; Heidelberg; New York: Springer, 2006 (=Springer-Lehrbuch) S. 275ff. und S. 343ff.

3 ebd. S. 303.

Abbildung 12: Termschema eines Moleküls mit Singulett- und Triplett-System zur Erläuterung der wichtigsten strahlenden und strahlungslosen Prozesse.

http://www.chemie.uni-freiburg.de/aoanchem/cj/Analytik1/VL19_Fluoreszenz_und_FIAweb.pdf


3 Versuchsdurchführung und Auswertung

Für die Bestimmung der Auflösung, Vergrößerung der Bilder sowie für alle

weiteren Aufnahmen verwenden wir eine computergesteuerte CCD-Kamera, die

durch die Software IGOR unterstützt wird. Mit IGOR ist es möglich, Bilder

sowie Videosequenzen aufzunehmen, zu speichern und zu drucken. Die Kamera

wird an einem zusätzlichen optischen Ausgang angeschlossen und es ist so

möglich, zwischen Okular- und Kamerabetrieb umzuschalten.

3.1 Bestimmung der Auflösung und Tiefenschärfe von schwach bis mittel vergrössernder Objekte

Vergrößerung der verwendeten Objektive (Kalibrieren)

Zunächst soll die Vergrößerung der verwendeten Objektive bestimmt

werden. In den Abbildungen 13 bis 15 sind die dazu aufgenommenen Bilder in

20-, 40-, 63- und 100-facher Vergrößerung zu sehen. Die beiden Objektive mit

63-facher und 100-facher Vergrößerung sind Ölimmersionsobjektive. Diese

Objektive werden dazu verwendet, die Luft zwischen Objekt und Objektiv gegen

Öl austauschen zu können. Da Öl einen höheren Brechungsindex als Luft

besitzt, kann eine größere Numerische Apertur (Glg. 3) und dadurch eine

bessere Auflösung (Glg 4) erzielt werden.

Zur Kalibrierung wird ein Kalibriermaßstab verwendet. Dieser besitzt 100

Striche pro Milimeter. Mit dem jeweiligen Objektiv wurde dieser Kalibrier-

maßstab betrachtet, anschließend auf den zweiten optischen Ausgang umge-

schaltet und über die CCD-Kamera ein Bild aufgenommen. Die Bilder haben am

Rand eine Skala, dessen Werte in Pixel angeben sind. Mit einer Analyse-

funktion von IGOR kann nun ein Intensitätsprofil entlang einer gewählten Linie

(in den Bildern blau dargestellt) aufgenommen werden. Das Intensitätsprofil ist

jeweils über den Mikroskopaufnahmen zu sehen. Über eine weitere Software-

funktion von IGOR lässt sich der Pixelabstand im Intensitätsprofil bestimmen.

Dafür werden manuell zwei Marken ins Profil gesetzt. Der Abstand wird für

mehrere Linien bestimmt, um Fehler bei der Messung zu minimieren.


Das Programm gibt dann die gemessenen Pixel aus, mit denen über den

Kalibrierungsmaßstab die Länge pro Pixel berechnet werden kann. Die unten

stehende Tabelle listet die entsprechenden Kalibrierungsfaktoren auf. Die

Berechnung erfolgt über die Gleichung:

(10)

ObjektivAbstand Striche/

µmPixel/

pixFaktor k /

nm/pix

20 fach 450 1224 368

40 fach 310 1632 190

63 fach 190 1617 118

100 fach 130 1750 74

Tabelle 1: Berechnete Kalibrierungsfaktoren

Einschätzung der Auflösung

Um die Auflösung genauer zu bestimmen, müsste der Fehler des verwen-

deten Kalibrierungsmaßstabs und die genauere Pixelwahl im Intensitätsprofil

des Programms bekannt sein. Hier wird aber der Größtfehler grob geschätzt.

Für diese Schätzung vergrößern wir das Intensitätsprofil der 100fachen Vergrös-

serung. Da kein geeignetes Softwareprogramm für einen Ausschnitt zur

Verfügung stand, wurde das gesamte digital vergrößerte Bild in den Anhang

gestellt. Die Auswertung erfolgte jedoch am Bildschirm.

Werden nun die schwarzen Teilstriche und die hellen Zwischenräume im

Bild 16 stark vergrößert, erkennt man, dass die Teilstriche ca. 7 Pixel und die

Zwischenräume ca. 12 Pixel breit sind. Dies entspräche bei einem Kalibrierungs-

faktor für das 100 fach Objektiv für 7 Pixel ca. 518 nm und für 12 Pixel ca. 888

nm. Die Flanken der schwarzen Teilstriche verlaufen aber nicht sprunghaft,

sonder eher wie eine steile „Verteilungskurve“. Führt man nun theoretisch zwei

dieser Teillinien immer enger zusammen, so würde der helle Zwischenraum

grauer werden und schließlich ganz in schwarz übergehen. Eine Auflösung

würden wir so auf ca. 4 Pixel schätzen, bei denen noch zwei Teillinien vernünftig

getrennt werden können. Dies liegt ca. bei ± 296 nm und aufgerundet bei ± 300

nm.

k= n⋅Abstand der StrichePixelanzahl zwischennStriche


Bilder mit Normalobjektiven aufgenommen:

Bilder mit Ölimmersionsobjektive aufgenommen:

Abbildung 13: Kalibrierung für 20facher Vergrößerung





Theoretische Bestimmung der Schärfentiefe

Um eine Einschätzung der Schärfentiefe vorzunehmen, könnte man unter

eine Seite des Kalibrierungsmaßstabs einen Gegenstand mit bekannter Höhe

legen. Somit würde man einen definierten Höhenunterschied parallel zur

optischen Achse erzeugen. An dem Kalibrierungsmaßstab lässt sich so ablesen,

welcher Bereich noch scharf abgebildet wird. An dieser Stelle sollte noch darauf

hingewiesen werden, dass es sich korrekterweise um die Schärfentiefe und

nicht, wie es umgangssprachlich üblich ist, um die Tiefenschärfe handelt. Dieser

Teil wurde im Praktikum nicht durchgeführt.

3.2 Bestimmung der Avogadrokonstante mit Hilfe der Brownschen Molekularbewegung

Die Lösung der Latexkügelchen war bereits vorhanden. Anhand einer

Aufnahme mit vorher kalibrierten Längenmaßangaben in µm kann die Größe

der Latexkügelchen auf ca. 2,5-3µm am Bildschirm gemessen werden. Verglei-

che hierzu Abbildung 17.

Abbildung 17: Drei Latexkügelchen (ca. 2,9 µm) im Größen-vergleich zu einer eingeschlossenen Luftblase (ca. 22,5 µm).

Luftblase

Latex-kügelchen


Um den sogenannten Random-Walk beobachten zu können, muss

zunächst eine geschlossene Kammer für die Latexkügelchen hergestellt werden.

Dazu wird auf einem Objektträger mit Vaseline ein Quadrat in Größe eines

Deckplättchens gezogen. In dieses Quadrat wird mit einer Pipette eine Lösung

mit Latexkugeln gegeben und anschließend mit einem Deckplättchen „luftdicht“

verschlossen. Dies wird gemacht, da ansonsten die Lösung schnell im

Strahlengang des Mikroskops verdunsten und so die Brownsche

Molekularbewegung mit dem „Verdunstungsstrom“ um ein vielfaches

überlagern würde. Im Bild 19 kann dieser Effekt bereits beobachtet werden. Es

zeugt davon, dass die Kammer ungenügend mit Vaseline abgedichtet wurde.

Die Kugeln werden mit dem 20fach-Objektiv betrachtet und 10 Sekunden

lang über die CCD-Kamera aufgenommen. Dazu gibt es zwei Auswertungsarten;

die erste wäre, einzelne Latexkugeln aufzunehmen, die zweite mehrere

Latexkugeln gleichzeitig auszuwerten. Im Praktikum haben wir uns auf die

zweite Variante beschränkt, da nicht mehrere einzelne Latexkugeln gefunden

wurden. Nach der Kalibrierung der Längen und der Zeit (Festlegen der

Framerate in der Software) werden drei Kugeln markiert und mit Hilfe der

Erkennungssoftware in IGOR verfolgt. Ein Makro protokolliert die Bewegungen

der drei Latexkugeln. Abbildung 19 zeigt das protokollierte Ergebnis des

Random-Walks der drei Kügelchen. IGOR erzeugt ein r²-t-Diagramm mit einer

Regressionsgerade und kann über diese mit Gleichung 9 die

Diffusionskonstante D berechnen. Mit IGOR wurde die Diffusionskonstante D

= 1,899 * 10-13 m2/s bestimmt. Die Auswertung mit mehreren Kügelchen

gleichzeitig führt man durch, da ein gemittelter Wert gegenüber Einzelwerten

genauer ist. Mit der Diffusionskonstante D lässt sich nun die Bolzmann-

Konstante k über

11)

bestimmen. Werte eingesetzt ergibt

12)

k = 2,36*10-23 J/K .

k= 6⋅ r DT

k=6⋅1⋅10−3 Ns

m2⋅2m⋅1,899⋅10−13 m

2

s303K


Die Temperatur haben wir über die Annahme genähert, dass die Kammer

bei Raumtemperatur (ca. 20°C) gelagert wurde und die Temperatur im

Mikroskop durch die starke Beleuchtung um 10°C ansteigt. Als Radius der

Latexkugeln haben wir den im Skript vorgegebenen Wert von 1,1 µm und

unseren gemessenen Wert von 2,9 µm gemittelt. Mit Gleichung 7 ergibt sich

über die Gaskonstante R = 8,31 J/mol *K die Beziehung zwischen NA und D

(Glg 11 in 7 einsetzen):

NA = 3,52*1023 mol-1

Verglichen mit dem Literaturwert von

NALit = 6,022*1023 mol-1

ergibt dieser Einzelwert schon eine entsprechend gute Näherung. Auf eine

Fehlerabschätzung wird in diesem Zusammenhang verzichtet, da nur ein Wert

zur Verfügung stand. Würde man anstelle von einem Radius = 2µm den Skript-

Radius von 1,1 µm einsetzen, wäre der Wert entsprechend näher am

Literaturwert. Ebenso müssten wir uns genauer Gedanken über die tatsächliche

Temperatur machen, da es sich auch bei diesem Wert um einen Schätzwert

handelt.

N A=R⋅T

6⋅⋅⋅r⋅D

N A=8,31⋅ J

mol K⋅303K

6⋅⋅10−3 Nsm2

⋅2⋅µm⋅1,899⋅10−13⋅m2

s


Abbildung 19: Brownsche Molekularbewegung mit Drift in x-Richtung von drei Latexkügelchen bei 20 facher Vergrößerung.

Abbildung 20: Multi-Auswertung von drei Latexkügelchen; r²-t-Diagramm bei 20 facher Vergrößerung.

Abbildung 18: Brownsche Molekularbewegung (random-walk) von einer Latexkugel bei 63 facher Vergrößerung.


3.3 Vergleich der Kontrastmethoden

Für die Aufnahmen der 3T3-Zellen im Hellfeld und im Phasenkontrast

wurde wiederum eine geschlossene Kammer angefertigt. Unter Anleitung wurde

eine Lösung mit lebendigen 3T3-Zellen in die Kammer gegeben und anschlies-

send unter dem Mikroskop bei einer 40 fachen Vergrößerung betrachtet und

jeweils von der selben Stelle mit IGOR eine Aufnahme aufgenommen.

Deutlich zu erkennen ist, dass die Aufnahme im Phasenkontrast

wesentlich weniger Artefakte hat und somit das Gesamtbild homogener

erscheint. Die Zellen mit dem roten und blauen Pfeil haben eine ungefähre

Abmessung von 100 µm. Wobei davon auszugehen ist, dass der Zellkern

(Pfeilspitze) dicker ist als der übrige Zellkörper. Ebenso erkennbar ist, dass der

Zellkern (blauer Pfeil) im Hellfeld dunkel und im Phasenkontrast hell erscheint.

Dies ist durch konstruktive Interferenz zu erklären. Der rote Pfeil zeigt einen

anderen Zellkern. Die Details im rechten Bild dieses Zellkerns (Abb. 22)

scheinen bei Vergrößerung am Bildschirm reichhaltiger zu sein als im linken

Bild.

Abbildung 21: 3T3 Zellen im Hellfeld, 40x Abbildung 22: 3T3-Zellen im Phasenkontrast, 40x


Die Abbildungen 23 und 24 wurden im DIC bzw. im RIC Verfahren

aufgenommen. Hierbei handelt es sich wiederum um Ölimmersionsobjektive.

Zu erkennen sind wiederum 3T3-Zellen mit 100 facher Vergrößerung bei der

DIC Aufnahme und 63 fache Vergrößerung in der RIC Aufnahme.

Um wirklich Vergleiche von Aufnahmen machen zu können, müsste man

das gleiche Bild mit der gleichen Vergrößerung betrachten. Beides ist hier nicht

der Fall und somit in diesem Beispiel nicht zu realisieren. Ebenso scheinen die

Aufnahmen (besonders die DIC Aufnahme) recht verschwommen zu sein. Dies

mag auch daran liegen, dass die Schärfentiefe sehr gering ist.

Abbildung 24: 3T3 Zelle im DIC, 100x Abbildung 23: 3T3 Zellen im RIC, 63x


3.4 Fluoreszenzanfärben von zellulären Strukturen

In diesem Versuchsteil wurden einige 3T3-Zellen mit Fluoreszenzfarb-

stoffen markiert. Es handelt sich dabei einerseits um Phalloidin-Rodamin und

andererseits um Ethidium-Bromid. Die Präparierung wurde unter Anleitung der

Tutoren vorgenommen. Die Zellen wurden anschließend bei 10 facher und 20

facher Vergrößerung betrachtet.

Abbildung 26: 3T3 Zellen, Rodamin 50%, 20x Abbildung 25: 3T3 Zellen, Rodamin und Brodamid 50%, 20x

Abbildung 27: 3T3 Zellen, Bromid, 10x


Die Präparierung der Proben kann in drei Schritten beschrieben werden:

1. Zur Konservierung und Erhaltung der Zellen wird mit einer Paraform-

aldehyd Stammlösung fixiert und durch Formaldehyd die Proteine ver-

netzt und denaturiert.

2. Um die Zellmembran permeabel für die Farbstoffe zu machen, werden

die Zellen mit Triton X-100 aufgeschlossen. Triton X-100 löst Proteine

aus der Zellmembran.

3. Anschließend werden die Zellen mit einem oder beiden Farbstoffen ein-

gefärbt.

Bei der Präparierung der Proben müssen die MSDS (Sicherheitsdaten-

blätter) der verwendeten Stoffe unbedingt beachtet werden, da diese Stoffe als

giftig eingestuft sind. Ein entsprechender umsichtiger Umgang mit diesen

Stoffen ist ebenfalls notwendig.

Die Fluoreszenzfarbstoffe markieren unterschiedliche Zellbereiche.

Rhodamin-Phalloidin markiert Aktin (das ist ein Protein der Zellmembran) und

Ethidium-Bromid markiert hingegen die DNS bzw. die RNS, welche im Zellkern

liegt. Drei Zellkulturen standen zur Verfügung. Eine wurde mit Ethidium-

Bromid (Abb. 27), die zweite mit Rhodamin-Phalloidin (Abb. 26) und die dritte

mit beiden Farbstoffen (Abb. 25) eingefärbt.

Gut zu erkennen ist, welchen Bereich nun diese Farbstoffe zum

Fluoreszieren bringen. In der Abbildung 26 ist Aktin hervorgehoben worden

und somit auf dem Bild gut sichtbar. Leider sieht man auf den aufgenommenen

Bilder nicht den farblichen Unterschied. Das Aktin erleuchtete dem Betrachter

mit einem kräftigen Rot. Die Abbildung 27 zeigt mit Ethidium-Bromid einge-

färbte Zellen. Bei Vergrößerung am Bildschirm ist gut zu erkennen, dass nur der

Zellkern bzw. die DNS leuchten. Die Fluoreszenz überstrahlt aber dabei auch

andere Bereiche des Zellkerns und somit ist eine genauere Auflösung der DNS

nicht sichtbar.


4 Resümee

Als Gesamtversuch betrachtet gab dieser Versuch einen anwendungs-

bezogenen Einblick in die Lichtmikroskopie und deren Grundlagen aus den

Bereichen Optik (Funktionsweise des Mikroskops und der Kontrastmethoden)

und Quantenmechanik (Fluoreszenz). Die Aufgabe, das Mikroskop zu kalibrie-

ren sowie eine Abschätzung der Auflösung und der Schärfentiefe vorzunehmen,

konnte gut nachvollzogen werden. Dies gilt auch für die zweite Aufgabe, anhand

der Brownschen Molekularbewegung die Bolzmann- und die Avogadro-

Konstante zu bestimmen. Die dritte Aufgabe, die verschiedenen Verfahren

miteinander zu vergleichen, gelang nur zwischen dem Hellfeld und dem

Phasenkontrast, da gleiche Ausschnitte betrachtet werden konnten und diese

Aufnahmen auch deutlich sichtbarer waren. Für den Vergleich und die

Bewertung der DIK-Aufnahmen und RIK-Aufnahmen bedürfte es einer

größeren Sorgfalt in der Durchführung und Vorbereitung und ggf. auch mehr

Erfahrung im Bereich der Mikroskopie. Der vierte Aufgabenteil zeigte

beeindruckende Bilder in die Fluoreszenzmikroskopie. Angeregt durch diese

Bilder stieg auch die Motivation, sich eingehender mit der

quantenmechanischen Wirkungsweise von Fluoreszenz und Phosphoreszenz

auseinander zu setzen.


4 Anhang

Abbildung 28: Digitale Vergrößerung von Bild 15

ca. 7 pixca.12 pix

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