Grundlagen der Lichtmikroskopie - Centrum für...
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Lehrerfortbildung Nanobiotechnologie
Grundlagen der Lichtmikroskopie
Juliane Ißle
03.04.03
Universität des Saarlandes
Fachrichtung Experimentalphysik
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Inhalt• Prinzipieller Mikroskopaufbau• Köhler´sche Beleuchtung• Eigenschaften mikroskopischer Objekte• Verschiedene Mikroskopiemodi:
Hellfeld-/DunkelfeldmodusPhasenkontrastPolarisationsmikroskopieDifferentieller Interferenz Kontrast (DIC)
• Zusammenfassung und Referenzen
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Konstruktionsstrahlengang
• einfachster Aufbau: Objektiv und Okular
• Zwischenbild in vorderer Brennebene des Okulars
• Strahlenbündel eines Objektpunktes hinter Okular parallel
• virtuelles Bild
• Vergrößerung bestimmt durch Winkel zwischen Begrenzungsstrahlengang und optischer Achse
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MikroskopaufbauAuge oder Kamera
Okular als Lupe (2. Vergrößerung)
Zwischenbild
Objektiv (1. Vergrößerung, variabel)
Präparat
Kondensor
Beleuchtung mit Blende
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Mikroskopaufbau• Justierung: Mittelstrahl des beleuchtenden Strahlenkegels parallel zur optischen Achse
• Linsen begrenzen Vergrößerung
• wichtiges Bauteil: Kondensor
1. Ausleuchten des Objektfeldes
2. Verschiedene Kondensoren für verschiedene Objektfeldgrößen
3. Bei Durchlicht: eigene Einheit
4. Bei Auflicht: Objektiv wirkt als Kondensor
5. Beleuchtungsapertur
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TheorieDie Güte eines mikroskopischen Bildes hängt ab von:
• Auflösung: , Wellenlänge
numerische Apertur des Objektivs
Beleuchtungsapertur
• Kontrast: -Absorptions- oder Amplitudenobjekte
-Verzögerungs- oder Phasenobjekte
d = λ / (A0+Ak) λ
A0
Ak
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Köhler´sche BeleuchtungNetzhaut
Pupille
Okular
Zwischenblende
Objektivbrennebene
ObjektivPräparat
Kondensorlinse
Kondensorblende
LeuchtfeldblendeLampenlinseLampenwendel
Kon
jugi
erte
Bild
eben
en
• Vermeidung der kritischen Beleuchtung
• Abbildung der Lampenwendel in Ebene der Kondensorblende (damit in Objektivbrennebene)
• Abbildung der Leuchtfeldblende in Objektebene und Zwischenbildebene
optimale Ausleuchtung
jedes Strahlenbündel volle Objektbeleuchtung
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Eigenschaften mikroskopischer Objekte
Amplitudenobjekte: - dicke oder gefärbte Schnitte
- schwächen das durchstrahlende Licht
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Hell-/Dunkelfeldmodus
Beobachtung Licht
Objekt
BeobachtungLicht
Objekt
Bücherskorpion: oben: Hellfeld
unten: DunkelfeldVorteil Hellfeld:
Vorteil Dunkelfeld:
Geringere Einflüsse von Linsenfehlern
Strukturen unter der Auflösungsgrenze sichtbar
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Eigenschaften mikroskopischer Objekte
Phasenobjekte: - dünne, ungefärbte Präparate
- verschieben die Phase des durchstrahlenden Lichts
- kein Bild im Hellfeld, da alle Strahlen in einem Bildpunkt gesammelt
werden
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Eigenschaften mikroskopischer Objekte
Konstruktive Interferenz
Destruktive Interferenz
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PhasenkontrastFritz Zernike (1932)
Objektiv Phasenringe
Objektebene
Kondensorringblende
Prinzip: Dichteunterschiede ergeben
Phasenverschiebung, Brechung, Streuung
Interferenz von ungestreutem und gestreutem
Licht
Optische Elemente:
• Ringblende
• Phasenring
- Verschiebt ungestreutes Licht um λ/4
- Verringert Amplitude des ungestreuten Lichts
Auslöschung, bis auf Interferenz des ungestreuten Lichts mit dem phasenmodulierten Licht
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Phasenkontrast
Naupilus-Larve (Hüpferling) im Phasenkontrast
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PolarisationsmikroskopiePolarisationsvorrichtung Zustand des Lichtes
Analysator senkrecht polarisiert
Probe
horizontal polarisiertPolarisator
einfallendes Licht unpolarisiert
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Polarisationsmikroskopie
Kartoffelstärke in polarisiertem, monochromatischem Licht
Kartoffelstärke in polarisiertem, polychromatischem Licht
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Differentieller Interferenz Kontrast (DIC)
Wollaston-Prisma
Analysator
Wollaston-Prisma
Wollaston-Prisma
Objektiv
Präparatebene
Kondensor
Polarisator
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Differentieller Interferenz Kontrast (DIC)
Prinzip:
• Polarisator erzeugt linear polarisiertes Licht.
• Wollastonprisma teilt einfallendes Licht in zwei senkrecht zueinander schwingende Wellen, die räumlich leicht getrennt sind (unter der Auflösungsgrenze des Mikroskops).
• Am Präparat werden Strahlen, die in verschiedenen Ebenen schwingen, verschieden phasenverschoben.
• Wollastonprisma: Wiedervereinigung der beiden senkrecht zueinander schwingendenStrahlen. Phasenverschiebungn führen zu Änderung der Polarisationsrichtung.
Vorteil: Präparate werden reliefartig abgebildet, da Ränder die höchsten Dichteunterschiede aufweisen.
Nachteil: Rotationssymmetrische Objekte werden nicht rotationssymmetrisch, sondern nur in Aufspaltungsrichtung sichtbar, lineare, in Aufspaltungsrichtung verlaufende Strukturen überhaupt nicht.
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Differentieller Interferenz Kontrast (DIC)
Gelenkregion eines MilbenbeinsSchnitt durch Holz
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Zusammenfassung• optimale Ausleuchtung durch Köhler´sche Beleuchtung
• Hellfeld bei großen, gefärbten Objekten
• Dunkelfeld bei kleinen, gefärbten Objekten
• Phasenkontrast bei ungefärbten Objekten
• Polarisations-/Interferenzmikroskopie bei anisotropen Objekten
• Interferenzmikroskopie zur reliefartigen Abbildung
Referenzen• Handbuch der Mikroskopie; Dr.Hermann Beyer
• Mikroskopieren; Prof. Dr.Werner Nachtigall
• Die Grundzüge der Theorie des Mikroskops; Dr.Kurt Michel