Furane, Furanone und Pyranone – ihr Beitrag zur Farbe und ... · I Kurzzusammenfassung Die...

Furane, Furanone und Pyranone – ihr Beitrag zur Farbe und den antioxidativen

Eigenschaften in der MAILLARD-Reaktion der Maltose

vorgelegt von

Diplom-Lebensmittelchemiker

Clemens Kanzler

geboren in Staaken

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

– Dr. rer. nat. –

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender Prof. Dr. Hajo Haase

Gutachter Prof. Dr. Lothar W. Kroh

Gutachter Prof. Dr. Marcus A. Glomb

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 20. Dezember 2016

Berlin 2017

I

Kurzzusammenfassung Die MAILLARD-Reaktion ist dafür bekannt, bei der thermischen Behandlung von Lebensmitteln

neben deren organoleptischen Eigenschaften, wie Geschmack, Geruch, Textur und Farbe,1–4 auch die oxidative Stabilität zu beeinflussen. Letzteres ist auf die Bildung von komplexierenden5–8 und reduzierenden Verbindungen9 zurückzuführen, die antioxidativ und prooxidativ wirken können.10;11

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden die antioxidativen Kapazitäten von dreizehn MAILLARD-Reaktionsintermediaten mit Furan-, Furanon- und Pyranonstruktur verglichen. Dabei kann festgestellt werden, dass alle eingesetzten Verbindungen mit Reduktonstruktur antioxidative Eigenschaften besitzen. Doch nur die Furan-3-one und 3,5-Dihydroxy-6-methyl-2,3-dihydro-4H-pyran-4-on (DHHM) zeigen in allen Methoden ähnliche antioxidative Kapazitäten wie das Referenzredukton Ascorbinsäure. Isomaltol, Maltol und Maltosin sind aufgrund ihrer komplexbildenden Eigenschaften in Gegenwart von Metallionen nicht reduzierend, verhalten sich aber ansonsten vergleichbar zu den anderen Reduktonen. Ein prooxidatives Verhalten in Anwesenheit von Metallionen kann dementsprechend ausschließlich für die Furan-3-one und DHHM beobachtet werden. Die selektive Blockade der freien Hydroxyfunktionen der Reduktone durch Schutzgruppen bewirkt eine signifikante Abnahme der antioxidativen Kapazitäten, wodurch die Reduktonstruktur als entscheidendes Strukturmerkmal identifiziert werden kann. Auf Grundlage des Produktspektrums ausgewählter Reduktone nach Umsatz mit Oxidationsmitteln wird ein entsprechender Reaktionsmechanismus vorgestellt.

In Modellreaktionen von Maltose mit verschiedenen Aminokomponenten kann sowohl im wässrigen als auch im trockenen System eine Korrelation zwischen Bräunung und antioxidativer Aktivität festgestellt werden. Es ergibt sich jedoch kein Zusammenhang zwischen beiden Eigenschaften und der Konzentration einzelner heterocyclischer Reduktone. Das antioxidativ inaktive Hydroxymethylfurfural (HMF) ist in allen Systemen die Hauptkomponente und in etwa zehnfach höheren Konzentrationen nachweisbar als die Reduktone Maltol und DHHM.

Der Beitrag zu Farbe und antioxidativen Eigenschaften der Reduktone Maltol, Furaneol, DHHM und Isomaltol sowie von HMF wird in wässrigen Modellsystemen untersucht. Dabei zeigt Isomaltol die stärkste Farbbildung und den stärksten Abbau. Der Abbau von HMF ist hingegen minimal, aber führt zur zweithöchsten Bräunung. Bei Furaneol und DHHM verhalten sich die Restkonzentrationen und die Farbbildung wiederum proportional zueinander. Maltol zeigt weder einen Abbau noch eine Farbentwicklung. Für die Reduktone kann mit steigender Bräunung eine Abnahme der antioxidativen Aktivität beobachtet werden, während die Reaktionsprodukte von HMF zu einem leichten Anstieg der antioxidativen Eigenschaften führen.

Da die verwendeten Modelle annäherungsweise die Prozesse der Bierherstellung abbilden, werden zum Vergleich Bierproben analysiert. Für Gerstenmalzbiere kann eine Korrelation zwischen antioxidativer Aktivität und der Farbe festgestellt werden. Das Spektrum an α-Dicarbonylverbindungen entspricht einer Mischung der D-Glucose- und Maltosemodelle, doch der HMF-Gehalt ist deutlich niedriger. Der Anteil an metallreduzierenden Substanzen ist in allen Bierproben geringer als in den Modellversuchen.

II

Abstract It is well known that the MAILLARD reaction leads to significant changes of the organoleptic

characteristics of food during heat treatment.1–4 But besides aroma, color, and texture the oxidative stability is influenced, because of the formation of complexing5–8 and reducing compounds.9

In this thesis, the antioxidant capacities of thirteen heterocyclic MAILLARD reaction intermediates were measured with five different methods. All used substances with reductone structure showed an antioxidative behavior, but only furan-3-ones and 3,5-dihydroxy-6-methyl-2,3-dihydro-4H-pyran-4-one (DHHM) were on a comparable level to the reference reductone ascorbic acid in all assays. Isomaltol, maltol, and maltosine did not exhibit measurable antioxidant capacities in the presence of metal ions due to their complexing abilities. Consequently, these reductones did not cause radical generation through redox cycling in contrast to the furan-3-ones and DHHM. The antioxidant capacities of the reductones were lowered significantly by the introduction of protecting groups to their free hydroxyl function. Therefore, the reductone structure could be identified as the crucial structural feature for their antioxidant properties. The reaction of different oxidizers with selected reductones resulted mainly in short-chained compounds typically derived from dicarbonyl cleavage reactions. Based on the product range an according reaction mechanism was postulated.

In model incubations of maltose and different amino acids under aqueous as well as dry conditions a correlation of color and antioxidant activity could be found. However, there was no connection between both properties and the concentration of heterocyclic intermediates. The dominating compound in all systems was hydroxymethylfurfural (HMF) – a furan derivative that did not show reducing or complexing abilities.

Additionally, the formation of color and the changes in antioxidant properties of the reductones maltol, furaneol, DHHM, and isomaltol as well as of HMF were analyzed in aqueous systems. The strongest color formation and the fastest degradation were shown by isomaltol. The concentration of HMF was nearly unaffected by the heat treatment, but its reaction mixtures exhibited the second strongest color. The remaining concentrations of Furaneol and DHHM corresponded to their color formation. Maltol was the most stable intermediate and did not undergo a browning reaction. The reductones showed decreasing antioxidant ativities with increasing color, whereas HMF formed antioxidative compounds.

The prepared model systems were based on roasting and cooking processes comparable to the production of beer. In order to transfer the results to a real food matrix different beer samples were analyzed. Beers brewed with barley malt showed a correlation between color and antioxidant activity. The range of α-dicarbonyl compounds corresponded to the degradation of maltose and D-glucose known from the model incubations. The HMF content relative to the concentration of 3-deoxyosones was lower than in the model experiments with maltose and other heterocyclic compounds could only be found in small amounts. The ratio of metal reducing substances in comparison to radical scavenging substances was considerably lower in beer.

III

Danksagung Die vorliegende Arbeit entstand im Zeitraum vom Juni 2013 bis zum November 2016 am Institut

für Lebensmitteltechnologie und Lebensmittelchemie der Technischen Universität Berlin unter Anleitung von Prof. Dr. Lothar W. Kroh.

An erster Stelle gilt mein Dank meinem Doktorvater Prof. Dr. Lothar W. Kroh, der mir die Möglichkeit gab, neben der Bearbeitung eines AiF-Forschungsvorhabens frei zum Thema der Reduktone in der MAILLARD-Reaktion zu forschen, mich fachlich stets unterstützte und dafür Sorge trug, dass ich in der gegebenen Zeit genügend Ergebnisse produzieren konnte.

Für die kompetente, freundliche und noch dazu sehr schnelle Übernahme der Berichterstattung möchte ich mich bei Prof. Dr. Marcus A. Glomb von der MARTIN-LUTHER-Universität Halle-Wittenberg bedanken.

Für die fachliche Unterstützung und die wirklich angenehme Arbeitsatmosphäre, die nicht unerheblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat, danke ich allen Mitarbeitern des Arbeitskreises von Prof. Dr. Kroh. Im Einzelnen Beate Beyerlein, Annette Berghäuser und Elfriede Mannteufel, die mich bei unterschiedlichsten Problemen im Labor unterstützten, sei es das Wechseln sämtlicher Ersatzteile der guten, alten HPLCs oder das Auffinden von exotischen Chemikalien und Glasgeräten. Bei Dr. Bettina Cämmerer möchte ich mich für die Hilfe bei fachlichen Fragen und bei organisatorischen Belangen im Universitätsbetrieb bedanken.

Besonderer Dank gilt Dr. Paul Haase, der mich im Labor 381 aufnahm, mir mit seiner Fachkompetenz in der organischen Synthese zur Seite stand und stets zum Diskurs über wissenschaftliche Themen (aber zum Glück auch über alle anderen) bereit war. Für die produktiven Gespräche, die manchmal notwendige Stille und die gemeinsamen Lacher, gerade wenn es einmal nicht so gut lief, danke ich meinen Bürokollegen Steffen Wegener und Philipp Bruhns. Martin Kaufmann bin ich dankbar dafür, dass er sein Wissen zu spektroskopischen Methoden mit mir geteilt und mir bei der Interpretation von NMR-Spektren geholfen hat. Dafür, dass sie „meine“ MAILLARD-Produkte auf diverse Zelllinien losgelassen hat, danke ich Dr. Claudia Keil.

Alexander Sader, Sophia Matthäus, Marcus Radant, Wiebke Alker, Sven Asbrede und Helena Schestkowa gilt mein Dank für ihre engagierten Beiträge im Rahmen ihrer wissenschaftlichen Abschlussarbeiten bzw. in ihrer Zeit als studentische Hilfskräfte.

Der AiF danke ich für die Finanzierung während meiner Arbeit und den Projektpartnern in Berlin – Prof. Dr. Frank-Jürgen Methner und Thomas Kunz – sowie in Weihenstephan – Prof. Dr. Thomas Becker und Dr. Martina Gastl – für die gute Zusammenarbeit.

Dr. Matthias Koch sowie Julia Keller und Dominique Lörchner vom Fachbereich 1.7 der BAM gilt mein Dank für die freundliche Unterstützung mit den EC-ESI-MS-Experimenten. Für die Bereitstellung von Maltosin und HMPO danke ich Dr. Michael Hellwig aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. Thomas Henle der Technischen Universität Dresden.

Abschließend danke ich meiner Freundin Carolin, meiner Familie und meinen Freunden, die mir in den letzten drei Jahren, aber natürlich auch in der Zeit davor, beigestanden und damit diese Arbeit überhaupt erst möglich gemacht haben.

V

Publikationen Teile dieser Arbeit wurden bereits in wissenschaftlichen Fachzeitschriften als Originalarbeiten publiziert, diese Veröffentlichungen sind mit * gekennzeichnet und werden im Folgenden nicht mehr zitiert. Zeitschriftenbeiträge

Kanzler, C.; Haase, P. T.; Kroh, L. W.: „Antioxidant Capacity of 1-Deoxy-D-erythro-hexo-2,3-diulose and D-arabino-Hexo-2-ulose” J. Agric. Food Chem., 2014, 62 (13), 2837–2844. Wilker, D.; Kaufmann, M.; Kanzler, C.; Haase, P. T.; Keil, C.; Kroh, L. W.: „Über Struktur-Wirkungs-Beziehungen von α-Dicarbonylverbindungen“ Lebensmittelchemie, 2014, 68, 143–149. Kanzler, C.; Haase, P. T.; Kroh, L. W.: „ESR-Untersuchungen zu reduzierenden Eigenschaften und zur pH-abhängigen Komplexierung von Kupfer(II)-Ionen durch MAILLARD-Reaktionsprodukte“ Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 2016, 112, 107–112. * Kanzler, C.; Haase, P. T.; Schestkowa, H.; Kroh, L. W.: „Antioxidant Properties of Heterocyclic Intermediates of the MAILLARD Reaction and Structurally Related Compounds” J. Agric. Food Chem., 2016, 64 (41), 7829–7837. * Haase, P. T.; Kanzler, C.; Hildebrandt, J.; Kroh, L. W.: „The Browning Potential of C6-α-Dicarbonyl Compounds under MAILLARD Conditions” J. Agric. Food Chem., 2017, 65 (9), 1924–1931.

Tagungsvorträge

Kanzler, C.; Haase, P. T.; Kroh, L. W.: „Untersuchung antioxidativer Eigenschaften von α-Dicarbonylverbindungen mit der ESR-Spektroskopie” Arbeitstagung des Regionalverbandes Nordost der LChG, Berlin, 27. März 2014.

Kanzler, C.; Haase, P. T.; Kroh, L. W.: „Bestimmung der reduzierenden Eigenschaften von Zuckerabbauprodukten“ 2. Institutskolloquium für Doktoranden am Institut für Lebensmitteltechnologie und Lebensmittelchemie, Berlin, 20. Oktober 2014.

VI

Schestkowa, H.; Kanzler, C.; Kroh, L. W.: „Vergleichende Untersuchungen antioxidativer Eigenschaften von MAILLARD-Reaktionsgemischen der Maltose“ Arbeitstagung des Regionalverbandes Nordost der LChG, Berlin, 07. März 2016. Kanzler, C.; Haase, P. T.; Kroh, L. W.: „Antioxidant Properties of Heterocyclic MAILLARD Reaction Intermediates” 3rd World Congress on MAILLARD Reaction, Budapest, 26–27. Mai 2016. Kanzler, C.; Haase, P. T.; Kroh L. W.: „Antioxidant Properties of Heterocyclic MAILLARD Reaction Intermediates” Young AGErs Symposium – MAILLARD reaction in Food and in vivo, Dresden, 21–22. Juli 2016. Poster

Kanzler, C.; Haase, P. T.; Kroh, L. W.: „Untersuchungen zur pH-abhängigen Komplexierung von Kupfer(II)-Ionen durch MAILLARD-Reaktionsprodukte mittels ESR-Spektroskopie“ 44. Lebensmittelchemikertag, Karlsruhe, 14–16. September 2015. Kanzler, C.; Haase, P. T.; Schestkowa, H.; Kroh, L. W.: „Vergleichende Untersuchung der antioxidativen Eigenschaften von heterocyclischen Zwischenprodukten der MAILLARD-Reaktion“ 45. Lebensmittelchemikertag, Karlsruhe, 12–14. September 2016 Forschungsprojekte

Kunz, T.; Kanzler, C.; Gastl, M.; Methner, F.-J.; Kroh, L. W.; Becker, T.: „Einfluss spezifischer MAILLARD-Reaktionsprodukte auf den Röstprozess und oxidative Prozesse in Getränken (Lebensmitteln)“ AiF-Forschungsvorhaben 17641 N, 01. Juli 2013–31. Juli 2016

VII

Inhalt Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................................... XI

1 Einleitung ................................................................................................................................. 1

2 Theoretischer Hintergrund ...................................................................................................... 2

2.1 Die MAILLARD-Reaktion ........................................................................................................ 2

2.1.1 Die Edukte ................................................................................................................... 2

2.1.2 Die initiale Phase ......................................................................................................... 3

2.1.3 Die intermediäre Phase ............................................................................................... 5

2.1.3.1 Bildungswege der α-Dicarbonylverbindungen ..................................................... 5

2.1.3.2 Spaltungsreaktionen ............................................................................................. 6

2.1.3.3 Der STRECKER-Abbau .............................................................................................. 8

2.1.3.4 Übersicht der heterocyclischen Intermediate ...................................................... 9

2.1.3.5 Bildungswege der Sauerstoffheterocyclen ......................................................... 11

2.1.3.6 Bildungswege der Stickstoffheterocyclen .......................................................... 17

2.1.4 Die finale Phase ......................................................................................................... 19

2.1.5 Übersicht ................................................................................................................... 22

2.2 Die oxidative Stabilität von Lebensmitteln ....................................................................... 23

2.2.1 Antioxidantien ........................................................................................................... 23

2.2.2 Reduktone in der MAILLARD-Reaktion ........................................................................ 25

2.2.3 Radikalgenerierung durch Reduktone ...................................................................... 26

2.3 Bier als Lebensmittelmatrix .............................................................................................. 27

2.3.1 Bierherstellung .......................................................................................................... 27

3 Zielstellung ............................................................................................................................. 29

4 Ergebnisse und Diskussion ..................................................................................................... 31

4.1 Antioxidative Eigenschaften der Heterocyclen ................................................................. 31

4.1.1 Reduzierende und radikalfangende Eigenschaften .................................................. 33

4.1.2 Reduktion von Metallionen ....................................................................................... 36

4.1.3 Gewichtetes Mittel (WAAOC) ................................................................................... 37

4.1.4 Komplexbildung mit Kupfer(II)-ionen........................................................................ 39

4.1.5 Prooxidatives Verhalten ............................................................................................ 40

4.1.6 Oxidationsmechanismus ........................................................................................... 41

4.1.7 Elektrochemische Oxidation ..................................................................................... 45

VIII

4.1.8 Einordnung der Ergebnisse ....................................................................................... 47

4.2 Modellreaktionen reduzierender Kohlenhydrate in wässriger Lösung ............................ 48

4.2.1 Farbbildung ............................................................................................................... 48

4.2.2 Antioxidative Eigenschaften ...................................................................................... 49

4.2.3 Abbau und Bildung von Kohlenhydraten .................................................................. 50

4.2.4 Bildung von MAILLARD-Reaktionsintermediaten ........................................................ 53

4.2.4.1 Bildung von α-Dicarbonylverbindungen ............................................................. 53

4.2.4.2 Bildung von HMF aus 3-Desoxyosonen .............................................................. 55

4.2.4.3 Abbauprodukte der 1-Desoxyosone ................................................................... 59

4.2.4.4 Bildung von Furfural aus Osonen........................................................................ 62

4.2.5 Bildung von hochmolekularen Verbindungen .......................................................... 65

4.3 Modellreaktionen reduzierender Kohlenhydrate im trockenen System .......................... 67

4.3.1 Farbbildung ............................................................................................................... 68


4.3.3 Bildung von MAILLARD-Intermediaten ........................................................................ 70

4.3.3.1 Bildung von α-Dicarbonylverbindungen ............................................................. 70

4.3.3.2 Bildung von heterocyclischen Intermediaten ..................................................... 72


4.4 Modellreaktionen heterocyclischer MAILLARD-Intermediate in wässriger Lösung ........... 77

4.4.1 Farbbildung ............................................................................................................... 77


4.4.3 Abbau der Heterocyclen ........................................................................................... 80


4.5 Bierproben ........................................................................................................................ 84

4.5.1 Farbe ......................................................................................................................... 84


4.5.3 Gehalt an MAILLARD-Intermediaten ........................................................................... 87

4.5.3.1 Gehalt an α-Dicarbonylverbindungen ................................................................ 88

4.5.3.2 Gehalt an heterocyclischen Intermediaten ........................................................ 89

4.5.4 Analyse der hochmolekularen Verbindungen........................................................... 90

5 Zusammenfassung ................................................................................................................. 91

6 Experimenteller Teil ............................................................................................................... 97

6.1 Synthesen .......................................................................................................................... 97

6.1.1 Phenylmaltosazon ..................................................................................................... 97

6.1.2 Maltoson-Chinoxalin ................................................................................................. 98

IX

6.1.3 3-Desoxymaltoson-Bis(benzoylhydrazon) ................................................................. 99

6.1.4 3-Desoxymaltoson-Chinoxalin ................................................................................ 100

6.1.5 1-Desoxymaltoson-Chinoxalin ................................................................................ 101

6.1.6 Dihydrohydroxymaltol ............................................................................................ 102

6.1.7 O-Galactosylisomaltol ............................................................................................. 104

6.1.8 Isomaltol .................................................................................................................. 105

6.1.9 Acetylierung mit Essigsäureanhydrid ...................................................................... 106

6.1.10 Acetylierung mit Acetylchlorid ................................................................................ 107

6.2 Modellreaktionen in wässriger Lösung ........................................................................... 109

6.3 Modellreaktionen im trockenen System ........................................................................ 110

6.4 Lebensmittelproben........................................................................................................ 110

6.5 Oxidation ausgewählter Reduktonether ........................................................................ 110

6.6 Analytische Methoden .................................................................................................... 111

6.6.1 Bestimmung der Farbe ............................................................................................ 111

6.6.2 Bestimmung der antioxidativen Kapazität .............................................................. 111

6.6.2.1 TEAC-Assay ....................................................................................................... 111

6.6.2.2 FCR-Assay .......................................................................................................... 112

6.6.2.3 ESR-Methode .................................................................................................... 113

6.6.2.4 CUPRAC-Assay (Multiplattenmethode) ............................................................ 114

6.6.2.5 Phenanthrolinassay (Multiplattenmethode) .................................................... 115

6.6.3 Bestimmung der antioxidativen Aktivität ............................................................... 116

6.6.3.1 TEAC-Assay (Multiplattenmethode) ................................................................. 116

6.6.3.2 Phenanthrolinassay (Multiplattenmethode) .................................................... 117

6.6.4 Messung von Kupfer(II)-Komplexen mittels ESR ..................................................... 117

6.6.5 Messung von Radikaladdukten mittels ESR ............................................................ 118

6.6.6 Bestimmung von α-Dicarbonylverbindungen mittels RP-HPLC-DAD ...................... 119

6.6.7 Bestimmung von heterocyclischen MAILLARD-Intermediaten mittels GC-MS ......... 121

6.6.8 Bestimmung von heterocyclischen MAILLARD-Intermediaten mittels RP-HPLC-DAD ................................................................................................................................. 122

6.6.9 Bestimmung von organischen Säuren als Trimethylsilylderivate mittels GC-MS ... 123

6.6.10 Bestimmung von organischen Säuren als Dodecylester mittels GC-MS ................. 124

6.6.11 Bestimmung von Zuckern mittels HPLC-PAD .......................................................... 125

6.6.12 Bestimmung der Molekülgewichtsverteilung und der antioxidativen Aktivität mittels GPC-online-TEAC ..................................................................................................... 126

6.6.13 EC-ESI-MS-Messungen ............................................................................................ 127

X

6.6.14 ESI-MS-Messungen ................................................................................................. 128

6.7 Geräte ............................................................................................................................. 129

6.8 Chemikalien .................................................................................................................... 131

7 Literatur ............................................................................................................................... 134

8 Abbildungsverzeichnis ......................................................................................................... 146

9 Tabellenverzeichnis .............................................................................................................. 152

10 Anhang ................................................................................................................................. 153

XI

Abkürzungsverzeichnis α-DC α-Dicarbonylverbindung

[α-DC] (oxidative) α-Dicarbonylspaltung (in Kombination mit [O] in Reaktionsgleichungen)

[β-DC] (hydrolytische) β-Dicarbonylspaltung (nur in Reaktionsgleichungen)

1,4-DDG 1,4-Didesoxyglucoson ((5S)-5,6-Dihydroxyhexan-2,3-dion)

1-DG 1-Desoxyglucoson (1-Desoxy-D-erythro-hexo-2,3-diulose)

1-DM 1-Desoxymaltoson (α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-1-Desoxy-D-erythro-hexos-2,3-diulose)

3-DG 3-Desoxyglucoson (3-Deoxy-D-erythro-hexos-2-ulose)

3-DGal 3-Desoxygalactoson (3-Deoxy-D-threo-hexos-2-ulose)

3-DM 3-Desoxymaltoson (α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-3-Deoxy-D-erythro-hexos-2-ulose)

3-DP 3-Desoxypentoson ((4S)-4,5-Dihydroxy-2-oxopentanal)

AA antioxidative Aktivität

Abs[420] Absorption bei 420 nm

ABTS 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)

AK antioxidative Kapazität

Ala L-Alanin

CUPRAC aus dem Englischen cupric ion reducing antioxidant capacity für antioxidative Kapazität hinsichtlich des Reduktionsvermögens gegenüber Kuper(II)-ionen

DAD aus dem Englischen diode array detector für Diodenarraydetektor

DC Dünnschichtchromatographie

DHHM Dihydrohydroxymaltol (3,5-Dihydroxy-6-methyl-2,3-dihydro-4H-pyran-4-on)

EBC aus dem Englischen European Brewery Convention als Bezeichnung der Organisation der europäischen Brauer sowie als Maßeinheit der Bierfarbe (EBC-Einheiten)

EC Elektrochemie bzw. elektrochemisch

ESI Elektrosprayionisierung

ESR Elektronenspinresonanz

XII

F Verdünnungsfaktor

FCR FOLIN–CIOCALTEU-Reagenz

Gal D-Galactose bzw. Galactosylrest in Strukturformeln

GC Gaschromatographie

Glc D-Glucose bzw. Glucosylrest in Strukturformeln

GO Glyoxal (Ethandial)

GPC Gelpermeationschromatographie

HAT aus dem Englischen hydrogen atom transfer für protonengekoppelte Einzelelektronenübertragung

HMF Hydroxymethylfurfural (5-(Hydroxymethyl)-2-furaldehyd)

HMPO Hydroxymethylpyridinon (3-Hydroxy-2-methylpyridin-4(1H)-on)

HPLC aus dem Englischen high performance liquid chromatography für Hochleistungsflüssigchromatographie

Lys L-Lysin

KPDS Kaliumperoxodisulfat

Mal Maltose

Maltri Maltotriose

MGO Methylglyoxal (2-Oxopropanal)

MS Massenspektrometrie

nd nicht detektiert

NIST aus dem Englischen National Institute of Standards and Technology für Nationales Institut für Standards und Technologie als Bezeichnung der entsprechenden US-amerikanischen Behörde

NMR aus dem Englischen nuclear magnetic resonance für Kernspinresonanz

[O] oxidative Bedingungen (nur in Reaktionsgleichungen)

OPD ortho-Phenylendiamin (1,2-Diaminobenzen)

PAD aus dem Englischen pulsed amperometric detector für gepulster amperometrischer Detektor

PBN N-tert-Butyl-α-phenylnitron

PBS aus dem Englischen phosphate buffered saline für phosphatgepufferte Salzlösung

XIII

Pro L-Prolin

[RA] Retro-Aldol-Spaltung (nur in Reaktionsgleichungen)

RI aus dem Englischen refraction index für Brechungsindex

RP aus dem Englischen reversed phase für Umkehrphase

SET aus dem Englischen single electron transfer für Einzelelektronenübertragung

TE aus dem Englischen trolox equivalents für Troloxäquivalente

TEAC aus dem Englischen trolox equivalent antioxidant capacity für antioxidative Kapazität in Bezug zu Trolox

TMS Trimethylsilyl-Gruppe

UV ultraviolett

Vis aus dem Englischen visible für sichtbar

WAAOC aus dem Englischen weighted average antioxidant capacity für das gewichtete Mittel der antioxidativen Kapazität

EINLEITUNG

1

1 Einleitung Die thermische Prozessierung ist in der heutigen Zeit, sowohl im Haushalt als auch bei der

industriellen Produktion, ein elementarer Bestandteil der Lebensmittelverarbeitung. Ursprünglich standen dabei die Haltbarmachung und der Schutz vor Pathogenen im Vordergrund, doch auch die Beeinflussung der sensorischen Qualität spricht für eine Hitzebehandlung.3 Durch Braten, Backen, Kochen oder Frittieren werden Geruch, Geschmack, Textur und Farbe von Lebensmitteln in einer Weise verändert, die der Verbraucher häufig als charakteristisch für bestimmte Produkte empfindet. In den letzten 100 Jahren wurden dabei wichtige Fortschritte zur Aufklärung dieser Effekte auf struktureller Ebene gemacht. So konnte eine der bedeutendsten nicht-enzymatischen Bräunungsreaktionen 1912 durch den französischen Chemiker LOUIS CAMILLE MAILLARD auf die Reaktion von reduzierenden Zuckern und Aminosäuren zurückgeführt werden.12 Nach heutigem Wissensstand spielt die von MAILLARD beschriebene Reaktion nicht nur bei der Bildung von braunen Polymeren eine Rolle, sondern trägt auch maßgeblich zu allen weiteren genannten sensorischen Eigenschaften von thermisch behandelten Lebensmitteln bei.

MAILLARD selbst erkannte unmittelbar die Bedeutung seiner Entdeckung für verschiedene wissenschaftliche Disziplinen, aufgrund der ubiquitären Verbreitung von Zuckern und Aminosäuren, brachte sie jedoch nicht mit Lebensmitteln in Verbindung.4 In den folgenden Jahrzehnten beschäftigten sich aber zahlreiche Forscher mit genau diesem Zusammenhang und kurze Zeit nach seinem Tod im Jahr 1937 setzte es sich durch, die komplexe Reaktionsfolge als MAILLARD-Reaktion zu bezeichnen.4 Einige der wichtigen Mechanismen und Zwischenprodukte konnten noch vor der Hälfte des 20. Jahrhunderts aufgeklärt oder zumindest postuliert werden und wurden 1953 von HODGE in seiner wegweisenden Publikation zusammengefasst.1

Neben der Lebensmittelchemie weiteten sich die Untersuchungen auch auf andere Fachgebiete aus und so gewannen beispielsweise physiologische Thematiken an Bedeutung. Zahlreiche Krankheiten konnten mittlerweile auf den Ablauf der MAILLARD-Reaktion im Körper, konkret auf die nicht-enzymatische Glykierung von Proteinen in Blut oder Plasma, zurückgeführt werden.13 Dazu zählen im Besonderen Alterserkrankungen wie Diabetes mellitus,14 Arteriosklerose,14 Urämie,15;16 Kataraktbildung,17 Herz-Kreislauf-Erkrankungen18 und auch die ALZHEIMER-Krankheit.19;20 Eine weitere Fragestellung, die Physiologie und Lebensmittelchemie verbindet, ist die der Aufnahme von alimentären MAILLARD-Reaktionsprodukten sowie des Transports, der Umwandlung und der Ausscheidung dieser Verbindungen durch den menschlichen Organismus.21–24

Frühzeitig wurde auch der Zusammenhang zwischen Farbbildung und reduzierenden Eigenschaften von MAILLARD-Reaktionsgemischen erkannt.25;26 Durch diesen ergibt sich bei der thermischen Behandlung von Lebensmitteln nicht nur eine Veränderung der sensorischen, sondern auch der funktionellen Eigenschaften, da die oxidative Stabilität maßgeblich durch reduzierende Verbindungen beeinflusst wird. In Lebensmitteln wie Bier,27 Kaffee28;29 oder Kakao30;31 konnte die Bildung von reduzierenden MAILLARD-Reaktionsprodukten nachgewiesen werden.

THEORETISCHER HINTERGRUND

2

2 Theoretischer Hintergrund Im folgenden Kapitel sollen die zum Verständnis der Arbeit notwendigen chemischen

Hintergründe vorgestellt werden. Die hier gezeigten Reaktionsmechanismen bilden an vielen Stellen die Grundlage der Diskussion in Kapitel 4.

2.1 Die MAILLARD-Reaktion

Beim thermischen Abbau von reduzierenden Zuckern tritt eine Vielzahl von Reaktionen auf, die unter dem Begriff der nicht-enzymatischen Bräunung vereint werden. Die speziellen Reaktionswege in Abwesenheit von Aminokomponenten werden als Karamellisierung bezeichnet, während alle Abbauwege unter Beteiligung von Aminokomponenten als MAILLARD-Reaktion zusammengefasst werden. Beide Reaktionen können in Lebensmitteln während der thermischen Prozessierung ablaufen und dabei grundlegend deren Farbe, Geschmack, Geruch und Textur verändern.4;2 Neben diesen Eigenschaften, die jeder Verbraucher bewusst wahrnimmt, wird außerdem die oxidative Stabilität aufgrund der Bildung bestimmter Reaktionsprodukte, wie zum Beispiel von Reduktonen, beeinflusst.

Die MAILLARD-Reaktion ist gegenüber der Karamellisierung die bedeutendere Bräunungsreaktion, da in den meisten Lebensmitteln Aminokomponenten in Form von freien Aminosäuren oder Proteinen vorhanden sind. Das Produktspektrum beider Reaktionen weist Überschneidungen auf, wobei durch die Karamellisierung keine stickstoffhaltigen Verbindungen gebildet werden und die MAILLARD-Reaktion im Allgemeinen unter vergleichbaren Bedingungen zu einem schnelleren Abbau der reduzierenden Kohlenhydrate führt. Zur Verbesserung der Übersichtlichkeit wurden die zahlreichen Reaktionen von HODGE1 1953 in drei Phasen eingeteilt: die initiale Phase, die intermediäre Phase und die finale Phase. In den folgenden Abschnitten sind die wichtigsten Reaktionsmechanismen aller drei Phasen zusammengefasst, wobei der Schwerpunkt auf der Bildung und dem Abbau der in dieser Arbeit wichtigen heterocyclischen Intermediate liegt. Bevor jedoch die MAILLARD-Reaktion an sich diskutiert wird, werden die verwendeten Kohlenhydrate und Aminokomponenten kurz vorgestellt.

2.1.1 Die Edukte

Neben den gewählten Reaktionsbedingungen wie Temperatur oder pH-Wert sind Art und Struktur der eingesetzten Kohlenhydrat- und Aminokomponenten ausschlaggebend für den Verlauf der Reaktion.32 Besonders gut untersucht ist die Chemie von Hexosen wie D-Glucose 1a, welche deutlich reaktiver ist als die Oligomere Maltose 1b oder Maltotriose 1c (Abbildung 1). Maltose ist jedoch in Lebensmitteln meist in größeren Konzentrationen vorhanden als D-Glucose, da Stärke in vielen Pflanzen als Speicherkohlenhydrat dient und während der Verarbeitung beabsichtigt oder unbeabsichtigt in Maltose und andere Oligomere der D-Glucose abgebaut werden kann. Dies geschieht hauptsächlich durch enzymatische Spaltung der α-1→4-glycosidischen Bindung innerhalb der Stärkemoleküle durch verschiedene Amylasen. Aufgrund der großen Bedeutung der Maltose im Lebensmittel fokussiert sich die vorliegende Arbeit auf die MAILLARD-Reaktion dieses Disaccharids,


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wobei in kleinerem Umfang vergleichende Untersuchungen mit D-Glucose und Maltotriose durchgeführt wurden.

Abbildung 1: Strukturen der eingesetzten Kohlenhydratkomponenten D-Glucose 1a, Maltose 1b und Maltotriose 1c.

Zu beachten ist, dass die Di- und Trisaccharide im Verlauf der MAILLARD-Reaktion durch saure Hydrolyse gespalten werden können und so neben ihren spezifischen Reaktionsprodukten auch immer Reaktionsprodukte der entsprechenden Di- bzw. Monosaccharide zu erwarten sind.

Maltose wurde äquimolar mit je einer der drei Aminosäuren L-Prolin 2a, L-Alanin 2b und L-Lysin 2c umgesetzt, welche sich strukturell stark voneinander unterscheiden (Abbildung 2). Das sekundäre Amin L-Prolin stellt unter anderem die quantitativ wichtigste Aminokomponente in Bier dar.33 L-Alanin ist ebenfalls in vergleichsweise hohen Konzentrationen in Bier vorhanden,33 besitzt jedoch eine primäre Aminofunktion und der Methylrest ist chemisch inert, weswegen diese Aminosäure häufig als Referenz in früheren Untersuchungen verwendet wurde.34;35 Im Vergleich zu den anderen beiden Aminosäuren verfügt L-Lysin über eine zusätzliche primäre ε-Aminofunktion und kann so Quervernetzungen in den Endprodukten der MAILLARD-Reaktion verursachen.

Abbildung 2: Strukturen der eingesetzten Aminokomponenten L-Prolin 2a, L-Alanin 2b und L-Lysin 2c.

Die Reaktivität der Aminosäuren ist maßgeblich vom vorliegenden pH-Wert abhängig, da die Nucleophilie der Amine drastisch reduziert wird, sobald diese vorwiegend protoniert vorliegen.

2.1.2 Die initiale Phase

Wie zuvor beschrieben ist die MAILLARD-Reaktion im Gegensatz zur Karamellisierung eine aminokatalysierte Reaktion und dementsprechend ist der erste Schritt in der initialen Phase ein nucleophiler Angriff der Aminofunktion einer Aminosäure 2 oder einer anderen Aminoverbindung auf den Carbonylkohlenstoff eines reduzierenden Kohlenhydrats 1 (Abbildung 3). Unter Öffnung des Rings entsteht dabei ein Aminoalkohol 3, welcher nach Eliminierung von Wasser das Imin 4.1 bildet. Wie auch die Kohlenhydrate selbst stabilisiert sich 4.1 durch einen Ringschluss zum entsprechenden Glycosylamin 4.2.2;32


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Abbildung 3: Bildung des Glycosylamins 4 aus dem Kohlenhydrat 1 (R = H für Glucose; R = Glc für Maltose; R = Mal für Maltotriose).2;32

Keines der bisherigen Zwischenprodukte ist dauerhaft stabil und so lagert sich das Glycosylamin 4.2 nach Ringöffnung und anschließender Keto-Enol-Tautomerie in eine 1-Amino-1-desoxyketose 5 um (Abbildung 4). Letztere wird nach ihrem Entdecker als AMADORI-Verbindung bezeichnet und die beschriebene Gleichgewichtsreaktion ist als AMADORI-Umlagerung bekannt.2;32 Die 1-Amino-1-desoxyketose 5 stellt das erste MAILLARD-Reaktionsprodukt dar, das analytisch bestimmt werden kann und liegt in wässriger Lösung in einem Isomerengemisch vor, wobei im Gegensatz zu den Ausgangskohlenhydraten neben verschiedenen pyranoiden und furanoiden Isomeren auch die offenkettige Form in einer messbaren Konzentration vorhanden ist.36

Abbildung 4: Die AMADORI-Umlagerung und das Gleichgewicht der offenkettigen AMADORI-Verbindung 5 mit seinen cyclischen Isomeren.2;37

Die in der initialen Phase gebildeten AMADORI-Produkte sind gegenüber den Kohlenhydraten, aus denen sie hervorgehen, deutlich reaktiver.36;38;39 Dies ist unter anderem ein Grund, warum die MAILLARD-Reaktion bei ansonsten vergleichbaren Bedingungen eine stärkere Bräunung verursacht als die Karamellisierung.


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2.1.3 Die intermediäre Phase

Innerhalb der intermediären Phase kommt es zum Abbau der zuvor gebildeten AMADORI-Verbindungen, wobei primär α-Dicarbonylverbindungen gebildet werden. Aus diesen hochreaktiven Zwischenprodukten können durch Spaltungsreaktionen verschiedene kurzkettige Säuren, Aldehyde und Dicarbonyle oder nach Eliminierung von Wasser heterocyclische MAILLARD-Produkte, wie Furane, Pyrrole, Furanone und Pyranone, entstehen.2;1

2.1.3.1 Bildungswege der α-Dicarbonylverbindungen

Die zahlreichen möglichen Abbauwege der AMADORI-Verbindungen legen den Grundstein für die Produktvielfalt, die im weiteren Verlauf der MAILLARD-Reaktion gebildet wird. Die wichtigsten Zwischenprodukte, die dabei aus den 1-Amino-1-desoxyketosen 5 hervorgehen, sind verschiedene α-Dicarbonylverbindungen, welche vorerst das Grundgerüst der Ausgangskohlenhydrate beibehalten. Unterschieden wird zwischen Osonen, die oxidativ, besonders in Anwesenheit von Eisen(III)- oder Kupfer(II)-ionen, gebildet werden und Desoxyosonen, die aus Eliminierungsreaktionen hervorgehen. Entscheidend für die Bildung beider Verbindungsklassen ist die Enolisierbarkeit des

AMADORI-Produktes 5.1 zum 1,2-Enaminol 5.2 oder zum 2,3-Endiol 5.3 (Abbildung 5).

Die schrittweise Oxidation des Enaminols 5.2 und die anschließende Hydrolyse führt zum Oson 6.40;41 Das 3-Desoxyoson 7 wird aus 5.2 nach Eliminierung von Wasser an C-3 und Hydrolyse des entstandenen Imins gebildet, während das 1-Desoxyoson aus 5.3 durch Eliminierung des Amins an C1 hervorgeht.42 Dabei entstehen, je nachdem ob von D-Glucose 1a oder Maltose 1b ausgegangen wird, die korrespondierenden Mono- oder Disaccharidderivate der genannten α-Dicarbonylverbindungen.43 Aufgrund ihrer zusätzlichen Carbonylfunktion können die Osone und Desoxyosone in wässrigen Lösungen theoretisch eine noch größere Anzahl von fünf- und sechsgliedrigen Halbacetalen ausbilden als ihre Zuckervorstufen.44–46 Für 1-Desoxyglucoson 8a (R = H) gelang es beispielsweise 15 Isomere zu identifizieren, die in einem komplexen Gleichgewicht vorliegen, das unter anderem von Temperatur und pH-Wert abhängig ist.45 Für Glucoson 6a (R = H) konnten deutlich weniger Isomere gefunden werden, dafür liegen jedoch alle relevanten Isomere als Hydrate vor.46


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Abbildung 5: Enolisierung und Abbau des AMADORI-Produkts zu α-Dicarbonylverbindungen.2;40–43

Nicht unerwähnt sollte bleiben, dass bei der Bildung der wichtigen drei α-Dicarbonylkomponenten die Aminosäure, die in der initialen Phase nucleophil an den Zucker addierte, wieder frei wird. Somit steht sie erneuten Reaktionen zur Verfügung und kann daher als Katalysator aufgefasst werden.

2.1.3.2 Spaltungsreaktionen

Im Verlauf der intermediären Phase reagieren die α-Dicarbonyle vielfältig weiter und werden zum Teil durch Spaltungsreaktionen in kurzkettige Verbindungen überführt. Abbildung 6 gibt eine Übersicht der in der MAILLARD-Reaktion relevanten Mechanismen und zeigt die jeweils erforderlichen Strukturmerkmale sowie das entsprechende Produktspektrum. Die in eckigen Klammern gefassten Hydroxyfunktionen sind für den Ablauf der beschriebenen Reaktionen nicht erforderlich, sind jedoch in den betroffenen α-Dicarbonylverbindungen meist vorhanden.


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Abbildung 6: Mögliche Spaltungsreaktionen in der MAILLARD-Reaktion.47

Retro-Aldol-Reaktionen sind in der Kohlenhydratchemie von großer Bedeutung und können nicht nur für α-Dicarbonyle sondern für fast alle relevanten Strukturen inklusive der Edukte formuliert werden.48;49 Voraussetzung ist das Vorhandensein einer Carbonylfunktion mit β-ständiger Hydroxygruppe.

Die hydrolytische α-Dicarbonylspaltung wurde lange Zeit kontrovers in der Literatur diskutiert, doch mittlerweile konnten DAVIDEK et al.50 nachweisen, dass diese Reaktion, zumindest unter von ihnen gewählten Bedingungen, nicht abläuft. Die Spaltprodukte, deren Bildung in früheren Publikationen der hydrolytischen α-Spaltung zugeordnet wurden,51;52 können stattdessen über die oxidative α-Spaltung53 sowie die hydrolytische β-Spaltung50 erklärt werden. Aus beiden Reaktionen gehen ebenfalls kurzkettige Säuren bzw. Säuren und Aldehyde oder Ketone hervor. Im folgenden Abschnitt sollen einige wichtige Spaltungsreaktionen im Detail besprochen werden, die zur Bildung von Produkten führen, die im weiteren Verlauf der Arbeit von Bedeutung sind.

Abbildung 7: Retro-Aldol-Reaktion von 3-Desoxyglucoson 7a.48


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Methylglyoxal 9 kann unter anderem durch eine Retro-Aldol-Reaktion (RA) aus 3-Desoxyglucoson 7a gebildet werden (Abbildung 7),48 wobei Glycerinaldehyd 10 als Gegenstück aus der Reaktion hervorgeht. Letzteres kann unter MAILLARD-Bedingungen durch Eliminierung von Wasser zu Methylglyoxal 9 weiterreagieren.

Abbildung 8: Hydrolytische β-Dicarbonylspaltung von 1-Desoxyglucoson 8a.54;55

Acetol 11 und Glycerinsäure 12 können durch hydrolytische β-Dicarbonylspaltung (β-DC) aus 1-Desoxyglucoson 8a gebildet werden.54;55 Vor der Spaltung muss sich 8a in sein 2,4-Tautomer umlagern. In Folge des nucleophilen Angriffs an C-4 wird die Bindung zwischen C-3 und C-4 gespalten und es entstehen die beiden C3-Körper. Eine Spaltung kann auch ausgehend vom Angriff an C-2 des 2,4-Tautomers erfolgen, was zur Bildung von Essigsäure und Erythrose führen würde.

2.1.3.3 Der STRECKER-Abbau

Obwohl die MAILLARD-Reaktion allgemeingültig als aminosäurekatalysiert gilt, trifft dies strenggenommen nur für die initiale Phase zu, da in der intermediären und in der finalen Phase verschiedene Reaktionen auftreten, die zum Abbau oder zur Umwandlung von Aminokomponenten führen, so dass diese der Katalyse unzugänglich werden. Eine der wichtigen Reaktionen dieser Art ist der STRECKER-Abbau, in dessen Verlauf Aminosäuren zu aromarelevanten Aldehyden umgesetzt und α-Dicarbonylverbindungen zu Enaminolen reduziert werden.56 Alternativ können in Anwesenheit von redoxaktiven Metallionen statt STRECKER-Aldehyden auch die korrespondierenden Säuren gebildet werden.

Für die zuvor vorgestellten Aminokomponenten L-Prolin 2a, L-Alanin 2b und L-Lysin 2c (Abbildung 2) ergeben sich unterschiedliche Reaktivitäten. Während 2a als sekundäres Amin nicht zum STRECKER-Abbau befähigt ist, können 2b und 2c in ihre korrespondierenden STRECKER-Aldehyde abgebaut werden. 2c kann jedoch nicht mit der zusätzlichen ε-Aminofunktion reagieren, da die Nachbarschaft der Aminokomponente zu einer Säurefunktion nötig ist. Der Mechanismus ist beispielhaft an L-Alanin 2b und 3-Desoxyglucoson 7a in Abbildung 9 dargestellt.


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Abbildung 9: Der STRECKER-Abbau am Beispiel von L-Alanin 2b und 3-Desoxyglucoson 7a. Adaptiert nach HOFMANN et al.56

Den einleitenden Schritt der Reaktion stellt der nucleophile Angriff des Aminostickstoffs von 2b

an den Carbonylkohlenstoff von 7a an C-1 dar, woraus ein Imin hervorgeht. Dieser Schritt entspricht formal der initialen Phase der MAILLARD-Reaktion nur unter Beteiligung eines α-Dicarbonyls anstelle eines reduzierenden Kohlenhydrats (vergleiche Abbildung 3). Eine AMADORI-Umlagerung (vergleiche Abbildung 4) ist aufgrund des nachbarständigen Carbonyls jedoch nicht möglich. Die Alternative im Sinne des STRECKER-Abbaus ist die Decarboxylierung der Säurefunktion mit anschließender Hydrolyse des entstandenen Imins zum Strecker-Aldehyd 13 und dem α-Aminoketon 14.56

2.1.3.4 Übersicht der heterocyclischen Intermediate

Die meisten Intermediate der MAILLARD-Reaktion mit intaktem Kohlenhydratgrundgerüst liegen, wie zuvor beschrieben, in komplexen Isomerengemischen vor, in denen die verschiedenen furanoiden oder pyranoiden Halbacetale dominieren. Die Eliminierung von Wasser aus diesen


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Verbindungen führt zur Bildung stabiler fünf- bzw. sechsgliedriger Sauerstoffheterocyclen mit unterschiedlicher Substitution (Abschnitt 2.1.3.5). Über eine Reihe von später vorgestellten Mechanismen kann auch Stickstoff in die Ringsysteme integriert werden (Abschnitt 2.1.3.6). Obwohl bereits die Kohlenhydrate, die AMADORI-Produkte und die α-Dicarbonyle in Form ihrer Halbacetalisomere als Heterocyclen aufgefasst werden können, sind im Kontext dieser Arbeit als Heterocyclen nur Substanzen zu verstehen, die in wässriger Lösung zumindest bei Raumtemperatur nicht im Gleichgewicht mit ihrer offenkettigen Form vorliegen. Eine Übersicht der in dieser Arbeit relevanten Heterocyclen und der entsprechenden Vorstufen ist in Abbildung 10 gegeben.

Abbildung 10: Herkunft der in dieser Arbeit relevanten Sauerstoff- und Stickstoffheterocyclen.

Sowohl die Osone 6 als auch die 3-Desoxyosone 7 der D-Glucose 1a und der Maltose 1b bilden vorwiegend fünfgliedrige Aromaten in Form von Furfural 15, 5-Hydroxymethylfurfural (HMF 16) und 2-Acetylpyrrol 17. Die 1-Desoxyosone 8 werden vorrangig zu Pyran-4-onen sowie Furan-3-onen abgebaut und vollständig konjugierte Fünfringe sind von geringerer Bedeutung. Während die Mono-


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und Disaccharidderivate von 6 und 7 die gleichen Folgeprodukte aufweisen, liefern 1-Desoxyglucoson 8a und 1-Desoxymaltoson 8b ein unterschiedliches Produktspektrum. Haupt-abbauprodukt von 8a ist 3,5-Dihydroxy-6-methyl-2,3-dihydro-4H-pyran-4-on (DHHM) 18, während 8b

in erster Linie den Aromaten Maltol 23 bildet. Weiterhin wird 8a in geringeren Mengen zu Isomaltol 19a, 2-Acetylfuran 20, Norfuraneol 21 und Furaneol 22 abgebaut. Aus 8b entsteht neben Maltol 23

auch O-Glucosylisomaltol 19b als typischer Indikator für die MAILLARD-Reaktion von Disacchariden. Durch hydrolytische Spaltung ist es möglich, dass 19b in 19a überführt wird.57 In Anwesenheit von Aminokomponenten kann 19b außerdem zu den entsprechenden Pyridinonen 24 weiterreagieren.

Die größere Vielfalt von Abbauprodukten, die aus 1-Desoxyosonen im Vergleich zu Osonen oder 3-Desoxyosonen hervorgeht, ist möglicherweise auf die zuvor angesprochenen Unterschiede in der Isomerenverteilung zurückzuführen. Während für 1-Desoxyglucoson zahlreiche 5- und 6-Ringe bekannt sind,45 bildet zum Beispiel Glucoson weniger Isomere und viele davon liegen in wässriger Lösung als Hydrate vor, was ihre Reaktivität herabsetzt.46

2.1.3.5 Bildungswege der Sauerstoffheterocyclen

Im folgenden Abschnitt wird die Bildung der zuvor vorgestellten Sauerstoffheterocyclen im Detail diskutiert. Die Bildung der meisten ringförmigen MAILLARD-Produkte ist direkt aus den α-Dicarbonylverbindungen mit vollständig erhaltenem Kohlenhydratgrundgerüst möglich, wie im Fall von HMF 16 aus 3-Desoxyosonen 7. Voraussetzung für die Bildung von Furfural 15 aus Osonen 6 (Abbildung 11) ist eine hydrolytische β-Dicarbonylspaltung um den Kohlenstoffgrundkörper auf C5 zu reduzieren.43;58;59

Abbildung 11: Bildung von 3-Desoxypentoson 26 aus Osonen 6.43;58;59

Unter Bildung von Ameisensäure entsteht so das Endiol 25.2 der D-Arabinose 25.1. Ausgehend vom Disaccharid wird aus 25.2 sofort D-Glucose 1a eliminiert, ohne das sich, wie beim Monosaccharid, das Kohlenhydrat 25 durch Bildung eines Halbacetals 25.1 stabilisiert. Diese unterschiedliche Reaktivität ist darin begründet, dass D-Glucose 1a eine deutlich bessere Abgangsgruppe als Wasser ist. Daher ist die Bildung von 3-Desoxypentoson 26 als Vorstufe für Furfural 15 aus Maltoson 6b begünstigt.43;58 Unter MAILLARD-Bedingungen reagiert jedoch auch 25

über zuvor beschriebene Mechanismen zu 26 weiter.


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3-Desoxypentoson 26 wird nach dem in Abbildung 12 beschriebenen Mechanismus weiter zu Furfural 15 abgebaut.60 Zuerst erfolgt eine Enolisierung und Wassereliminierung an C-4, woraus sich ein 3,4-Didesoxypentoson ergibt. Nach einem Ringschluss zwischen der Hydroxyfunktion an C-5 und dem Carbonylkohlenstoff an C-2 wird aus dem resultierenden fünfgliedrigen Halbacetal nach erneuter Eliminierung von Wasser das vollständig sp2-konjugierte Furanderivat 15 gebildet. Die Bildung von HMF 16 aus 3-Desoxyosonen 7 erfolgt analog zum Mechanismus der Bildung von Furfural 15.59;61 Durch den C6-Körper von 7 ergibt sich gegenüber 15 die zusätzliche Hydroxymethylfunktion an C-5. Analog zu Furfural 15 ist auch die Bildung von HMF 16 aus den oligomeren Zuckern begünstigt, da die Eliminierung von Maltose oder D-Glucose aus 3-Desoxyosonen 7 deutlich einfacher abläuft als die Eliminierung von Wasser.62 Da 16 in vergleichsweise hohen Konzentrationen bei der thermischen Behandlung verschiedener Lebensmittel gebildet wird, lässt es sich einfacher nachweisen als seine Vorstufen. Aus diesem Grund kann es als Erhitzungsindikator beispielsweise in der Qualitäts- und Authentizitätskontrolle von Milch63 oder Honig64 herangezogen werden.

Abbildung 12: Bildung von Furfural 15 aus 3-Desoxypentoson 26.43;58–60 Die Bildung von HMF 16 aus 3-Desoxyosonen 7 erfolgt analog dazu.59;61

Der Abbau der 1-Desoxyosone 8a und 8b zu den Pyran-4-onen 18 bzw. 23 ist vergleichend in Abbildung 13 dargestellt. Bei beiden Derivaten geht die Reaktion von dem pyranoiden Isomer des entsprechenden 1-Desoxyosons 8 aus. Im Fall des Monosaccharids (R = H) kann an C-4 durch eine vinyloge β-Eliminierung Wasser abgespalten werden, wodurch sich direkt DHHM 18 ergibt.65;66 Dies ist bei 1-Desoxymaltoson (R = Glc) 8b nicht möglich, da die Hydroxyfunktion an C-4 durch einen Glucosylrest blockiert ist, weshalb nur an C-5 Wasser eliminiert werden kann, wobei das Pyran-3-on 27 entsteht. Nach einer Keto-Enol-Umlagerung wird durch Acetalspaltung der Glucosylrest entfernt und schließlich geht Maltol 23 aus der Reaktion hervor.65 Theoretisch ist die Bildung von Maltol 23 auch durch Dehydratisierung von DHHM 18 denkbar, jedoch hat diese Reaktion unter lebensmittelnahen Bedingungen keine Bedeutung. So konnten KIM et al.52 in Modellreaktionen ausgehend von 18 weniger als 1 % 23 detektieren.


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Abbildung 13: Bildung von DHHM 18 und Maltol 23 aus 1-Desoxyosonderivaten 8.2;65;66

Obwohl DHHM 18 nicht in Maltol 23 überführt werden kann, sind geringe Mengen an 23 beim Abbau von Hexosen in Anwesenheit von Aminosäuren nachweisbar. YAYLAYAN et al.65 erklären dies über einen alternativen Mechanismus aus dem AMADORI-Produkt 5a (Abbildung 14). Ausgehend vom pyranoiden Isomer der AMADORI-Verbindung 5a erfolgt zuerst die Eliminierung von Wasser an C-2. Das entstandene Zwischenprodukt 28 kann entweder direkt über eine ortho-Eliminierung (o-E) des Amins zu DHHM 18 abgebaut werden oder zu 29 dehydratisieren, um dann über ortho-Eliminierung Maltol 23 zu bilden. Zwar ist auch auf diesem Reaktionsweg die Bildung von 18 gegenüber 23 bevorzugt, aber während die Eliminierung von Wasser aus 18 nahezu ausgeschlossen werden kann, ist die Eliminierung von Wasser aus 28 zumindest möglich.65


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Abbildung 14: Bildung von DHHM 18 und Maltol 23 aus dem AMADORI-Produkt 5a.65

Neben den Pyran-4-onen bilden 1-Desoxyosone 8 wie auch die Osone 6 und 3-Desoxyosone 7 Furane. So sind aus 1-Desoxyglucoson 8a zum Beispiel die strukturell sehr ähnlichen Verbindungen Isomaltol 19a und 2-Acetylfuran 20 zugänglich (Abbildung 15). Beide Substanzen entstehen wie Furfural 15 und HMF 16 (vergleiche Abbildung 12) durch Wassereliminierung aus den entsprechenden fünfgliedrigen Halbacetalen.52 19a kann direkt aus einem furanoiden Isomer von 8a gebildet werden, indem nach Ringschluss an C-3 und C-5 Wasser eliminiert wird, während die Hydroxyfunktion an C-4 erhalten bleibt. Der Abbau zu 20 setzt die Reduktion der α-Dicarbonylfunktion von 8a und anschließend die Abspaltung von Wasser an C-4 voraus, wodurch 1,4-Didesoxyglucoson 30 entsteht. Die Bildung des Furankörpers läuft analog zum zuvor beschriebenen Mechanismus ab: aus dem fünfgliedrigen Halbacetal von 30 wird zweimal Wasser an C-3 und C-5 eliminiert und es entsteht 20.


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Abbildung 15: Bildung von Isomaltol 19a und 2-Acetylfuran 20 aus 1-Desoxyglucoson 8a.52

Ein weiteres charakteristisches Abbauprodukt von Disacchariden sind O-Glycosylderivate des Isomaltols. So entsteht aus Maltose 1b bzw. dem entsprechenden 1-Desoxymaltoson 8b

O-Glucosylisomaltol 19b, wie in Abbildung 16 dargestellt, und aus Lactose auf einem vergleichbaren Weg O-Galactosylisomaltol.67–70

Abbildung 16: Bildung von O-Glucosylisomaltol 19b aus 1-Desoxymaltoson 8b.68

Maltol 23 und Glucosylisomaltol 19b teilen sich das Pyran-3-on 27 als relevante Zwischenstufe, welches aus 8b, wie in Abbildung 13 beschrieben, entsteht. Das pyranoide Halbacetal von 27 lagert


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sich im Verlauf der Reaktion in die offenkettige Form um und bildet nach Ringschluss ein furanoides Isomer aus. Im letzten Schritt wird über vinyloge β-Eliminierung an C-3 Wasser abgespalten und es entsteht O-Glucosylisomaltol 19b. Zumindest für das Galactosylderivat konnte in Milchprodukten bei Erhitzung keine Freisetzung von Isomaltol 19a festgestellt werden.70 19a wird folglich primär aus Monosacchariden gebildet.

Abbildung 17: Bildung von Norfuraneol 21 und Furaneol 22 aus 1-Desoxyglucoson 8a. Das Furan-3-on 31 sowie Acetylformoin 32 können als Zwischenstufen isoliert werden.52;71

1-Desoxyglucoson 8a bildet zusätzlich zu den beschriebenen Pyran-4-onen (Abbildung 13) und Furanen (Abbildung 15) zahlreiche Furan-3-one, deren Bildungswege in Abbildung 17 zusammengefasst sind. Alle Furan-3-one werden aus dem furanoiden Isomer von


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1-Desoxyglucoson 8a gebildet, das aus dem Ringschluss zwischen der Hydroxyfunktion an C-5 und dem Carbonylkohlenstoff an C-2 hervorgeht. Durch Eliminierung von Wasser an C-2 des entsprechenden 3,4-Endiols entsteht das Furan-3-on 31, aus dem nach Abspaltung von Formaldehyd und anschließender Keto-Enol-Tautomerie Norfuraneol 21 hervorgeht.71 Alternativ kann aus dem furanoiden Isomer von 8a Wasser an C-6 eliminiert werden, was zur Bildung von Acetylformoin 32 in seiner Halbacetalform führt.71 Durch Reduktion von 32 und Dehydratisierung an C-2 entsteht Furaneol 22.52

Eine Besonderheit der Furan-3-one ist, dass diese Verbindungen aufgrund von Keto-Enol-Tautomerie in wässriger Lösung als Isomerengemische vorliegen. Von Bedeutung sind dabei die beiden Ketoformen, welche im Fall von 22 identisch sind, da sowohl C-2 als auch C-5 mit Methylgruppen substituiert sind. Für 21 ergeben sich jedoch unterscheidbare Isomere aufgrund der unsymmetrischen Substitution an beiden Kohlenstoffen, wie auch für 31 und 32.

Abbildung 18: Bildung von Furaneol 20 aus Methylglyoxal 9 und Acetol 11.72

Ein weiterer Bildungsweg von 22, der keinen Reduktionsschritt voraussetzt, geht von den zuvor beschriebenen Spaltprodukten Methylglyoxal 9 (siehe Abbildung 7) und Acetol 11 (siehe Abbildung 8) aus.72 Beide C3-Körper reagieren im Sinne einer Aldolreaktion zu einem 1,6-Didesoxyoson, welches nach Keto-Enol-Umlagerung und Ringschluss zwischen der Hydroxyfunktion an C-5 und dem Carbonylkohlenstoff an C-2 ein Halbacetal bilden kann. Nach Wassereliminierung an C-2 in Analogie zur Reaktion in Abbildung 17 entsteht Furaneol 22. Das für diesen Mechanismus nötige Acetol 11 muss nicht aus 1-Desoxyglucoson 8a gebildet werden, sondern kann auch durch eine CANNIZARRO-Reaktion aus Methylglyoxal 9 hervorgehen, wobei als Nebenprodukt Brenztraubensäure gebildet wird.

2.1.3.6 Bildungswege der Stickstoffheterocyclen

Auch stickstoffhaltige Heterocyclen, wie zum Beispiel Pyrrole oder Pyridinone,73–76 sind als wichtige Produkte der MAILLARD-Reaktion beschrieben. Im Verlauf ihrer Bildung werden Aminokomponenten als Heteroatome in den jeweiligen Cyclus integriert und stehen somit nicht mehr oder nur mit verminderter Reaktivität als Nucleophile in der initialen Phase zur Verfügung. Grundsätzlich gibt es zwei Wege, aus denen die Stickstoffheterocyclen entstehen: am Stickstoff


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unsubstituierte Pyrrole gehen aus Enaminolen hervor, die in der STRECKER-Reaktion gebildet wurden,77 während Derivate, die noch einen Aminosäurerest tragen, aus der Reaktion von Sauerstoffheterocyclen mit Aminosäuren gebildet werden.68;78 Die Bildungswege der in dieser Arbeit relevanten Stickstoffheterocyclen (Abbildung 10) werden im Folgenden vorgestellt.

Abbildung 19: Bildung von 2-Acetylpyrrol 17 aus 3-Desoxyglucoson 7a.77

Die Bildung von 2-Acetylpyrrol 17 geht, wie in Abbildung 19 beschrieben, von 3-Desoxyglucoson 7a bzw. dem α-Aminoketon 14, das durch den STRECKER-Abbau aus 7a hervorgeht (Abbildung 9), aus. 14 lagert sich durch Keto-Enol-Tautomerie in das entsprechende 4,5-Endiol um, welches nach Wassereliminierung an C-6 durch Ringschluss zwischen der Aminofunktion an C-1 und dem Carbonylkohlenstoff an C-4 ein Halbaminal bildet. Analog zu 2-Acetylfuran 20 (vergleiche Abbildung 15) entsteht durch Eliminierung der beiden Hydroxyfunktionen der Aromat 17.77

Pyrrole können nicht nur aus α-Aminoketonen gebildet werden, sondern auch direkt durch die Reaktion von Aminosäuren mit 3-Desoxyosonen entstehen. So kann auf diesem Weg zum Beispiel aus HMF 16 und L-Lysin 2c Pyrralin gebildet werden.78

Ein weiterer Bildungsweg von Stickstoffheterocyclen ist die Reaktion von Sauerstoffheterocyclen mit Aminosäuren. Dabei werden die jeweiligen Ringe geöffnet und es kommt unter Erhalt des Aminosäurerests zum Austausch des Ringsauerstoffs gegen Stickstoff. Eine solche Reaktion ist unter anderem für O-Glucosylisomaltol 19b beschrieben, wobei in diesem speziellen Fall nicht nur eine Aminosäure in den Ring integriert, sondern auch der Glucosylrest entfernt wird und schließlich der Fünf- in einen Sechsring umlagert (Abbildung 20).


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Abbildung 20: Bildung von Pyridin-4-onderivaten 24 aus O-Glucosylisomaltol 19b.68

Da O-Glucosylisomaltol 19b über eine Carbonylfunktion außerhalb des Rings verfügt, welche in das π-System des Aromaten integriert ist, ist es als MICHAEL-Akzeptor in der Lage von Nucleophilen an C-6 angegriffen zu werden. Im Rahmen der MAILLARD-Reaktion kommen dafür Aminosäuren oder Proteine in Frage, insbesondere aber ε-Aminofunktionen wie die von L-Lysin 2c. Nach der Addition der Aminokomponente an C-6 bildet sich das Carbonyl an C-2 über Keto-Enol-Tautomerie erneut aus, wobei der Ring geöffnet wird. Das freie Elektronenpaar des Amins an C-6 greift anschließend das Carbonyl an C-2 nucleophil an, wodurch sich ein sechsgliedriger Stickstoffheterocyclus bildet. Nach Wassereliminierung an C-2 bildet sich ein Pyridiniumderivat, welches sich durch Abspaltung des Glucosylrestes in ein stabiles Pyridin-4-on 24 umlagert.68 Eine typische Verbindung dieser Art ist das Maltosin,79 welches aus der Reaktion von O-Glucosylisomaltol mit der ε-Aminofunktion von L-Lysin hervorgeht.

Eine Verbindungsklasse, die zumindest erwähnt werden soll, stellen die Pyrazine dar. Sie gehen aus der Kondensation von je zwei α-Aminoketonen hervor und können je nach Struktur der Ausgangsverbindungen bis zu vier unterschiedliche Substituenten tragen.80–82

2.1.4 Die finale Phase

In der finalen Phase der MAILLARD-Reaktion werden durch unterschiedliche Polymerisations- und Kondensationsreaktionen sämtlicher zuvor entstandener Intermediate braungefärbte, hochmolekulare Verbindungen gebildet, welche allgemeinhin als Melanoidine bezeichnet werden. Bei diesen handelt es sich nicht um eine oder einige wenige Strukturen, sondern vielmehr um eine Vielzahl von Strukturen und Substrukturen, die gleichzeitig vorliegen und deren genauer Aufbau bis


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heute nicht oder nur teilweise aufgeklärt ist. Eine strukturelle Gemeinsamkeit dieser Polymere ist jedoch ein chromophores System, welches die hohe Extinktion verursacht und durch den zunehmenden Verlust von Wasser aus den Edukten im Laufe der MAILLARD-Reaktion gebildet wird.

Vereinzelt gelang die Identifikation von Melanoidinstrukturen durch die starke Limitation der Edukte und entsprechend gerichtete Reaktionswege in Modellsystemen.83;84 Ein zweiter Ansatz ist die Synthese oder Isolation von Melanoidinen mit anschließender Hydrolyse,85 Pyrolyse86–89 oder enzymatischer Spaltung90 der Polymere, um aus den freigesetzten Produkten Rückschlüsse auf die Struktur der Ausgangspolymere zu ziehen. Grundsätzlich lassen sich in der Literatur zwei Typen von Melanoidinen finden, die in dieser Arbeit, aufgrund der eingesetzten Edukte, relevant sind: Polymere mit einem Rückgrat aus Kohlenhydratderivaten (Abbildung 21) sowie Polymere auf Basis von sauerstoff- und stickstoffhaltigen Heterocyclen (Abbildung 22).

Abbildung 21: Beispiele für Strukturvorschläge von Melanoidinen mit intakten C6-Kohlenhydratkörpern auf Basis von AMADORI-Produkten (M1)89 und auf Basis von 3-Desoxyosonen (M2, M3).85;91

Die meisten Strukturvorschläge, die auf offenkettigen C6-Intermediaten beruhen, beinhalten AMADORI-Produkte 5 oder 3-Desoxyosone 7 (siehe Abbildung 5 für die Strukturen der entsprechenden Monomere), wobei für letztere Strukturen mit und ohne Integration von Aminokomponenten postuliert sind. Bei dem in Abbildung 21 gezeigten Vorschlag M1 von YAYLAYAN et al. 89 erfolgt die Verknüpfung über die Aminofunktion eines AMADORI-Produktes durch Bildung eines Imins mit der Carbonylfunktion einer zweiten AMADORI-Verbindung. Die positive Ladung des Iminiumions kann durch eine negative Ladung an der Säurefunktion der involvierten Aminosäure (R‘) ausgeglichen werden.

Ein mögliches Melanoidingrundgerüst M2, das nur auf 3-Desoxyosonen beruht, wurde von CÄMMERER und KROH85 formuliert, wobei eine C=C-Bindungsknüpfung zwischen C-1 und C-3 erfolgt und ein vollständig konjugiertes Rückgrat entsteht. Der Einbau von AMADORI-Verbindungen ist während der Bildung des Polymers an C-2 beschrieben, während Aminosäuren nachträglich durch einen nucleophilen Angriff an C-3 im Sinne einer MICHAEL-Addition integriert werden können. Der Vorschlag M3, der Aminokomponenten als Bestandteil des Grundgerüsts benötigt, verknüpft zwei 3-Desoxyosonmoleküle über den Aminoanteil jeweils an C-1.91 Der so entstandene Baustein aus zwei Kohlenhydratkomponenten und einer Aminokomponente wird dann von C-2 zu C-3 eines nächsten Bausteins verknüpft. In diesem Polymer ergibt sich ebenfalls ein durchgängiges Doppelbindungssystem, welches die Triebkraft für seine Bildung darstellen könnte. CÄMMERER und


21

KROH weisen außerdem darauf hin, dass auch wenn die formulierte Struktur auf 3-Desoxyosonen beruht, die Integration unterschiedlicher Kohlenhydratderivate aus der MAILLARD-Reaktion denkbar ist. Dies trifft genauso auf die anderen Strukturvorschläge zu und wahrscheinlich liegen Melanoidine stets als Kombinationen aus verschiedenen Intermediaten und verschiedenen Verknüpfungsmustern vor.

Abbildung 22: Beispiele für Strukturvorschläge von Melanoidinen83;84 bzw. Melanoidinsubstrukturen90;92;93 auf Basis von Furanen und Pyrrolen.

Weitere Strukturvorschläge basieren auf der Kondensation unterschiedlich substituierter Furane und Pyrrole, wobei zum einen lineare M4 und verzweigte Polymere M5 entstehen können und zum anderen weniger systematisch aufgebaute polycyclische Substrukturen, wie M6 oder M7 (Abbildung 22). Die ersten linearen Polymere aus HMF wurden von HEYNS et al.86 postuliert und später von KATO et al.87 und TRESSL et al.83;84 aufgegriffen. Letztere konnten außerdem in Modellreaktionen mit 2-Desoxypentose lineare Oligomere M4 des 2-Hydroxymethylpyrrols nachweisen und in Reaktionen von Pentosen oder Hexosen verzweigte Oligomere M5 aus Furan und Pyrrol-2-aldehyd. HOFMANN90;92;93 gelang es mehrere kleinere, jedoch stark gefärbte Melanoidinfragmente zu identifizieren, welche über ihre Aminosäureseitenketten (N–R‘) mit anderen Melanoidinen oder Proteinen verknüpft und so Bestandteil hochmolekularer MAILLARD-Produkte sein könnten.


22

2.1.5 Übersicht

Die in dieser Arbeit relevanten Reaktionswege sind in Abbildung 23 zusammengestellt, wobei auf die Darstellung ausgewählter Pfade zu Gunsten der Übersichtlichkeit verzichtet wurde.

Abbildung 23: Zusammenfassung der zuvor beschriebenen Reaktionswege in Anlehnung an HODGE.1

Im Rahmen der MAILLARD-Reaktion werden reduzierende Kohlenhydrate in Anwesenheit von Aminokomponenten in AMADORI-Produkte umgesetzt (Abschnitt 2.1.2). Diese können entweder durch Spaltungsreaktion zu kurzkettigen Säuren, Aldehyden oder α-Dicarbonylen abgebaut werden (Abschnitt 2.1.3.2) oder durch Eliminierung von Wasser bzw. durch Oxidation C6-α-Dicarbonyle bilden (Abschnitt 2.1.3.1). Die verschiedenen Sauerstoffheterocyclen entstehen durch Abspaltung von Wasser aus den cyclischen Halbacetalen der C6-α-Dicarbonylverbindungen (Abschnitt 2.1.3.5), während die Stickstoffheterocyclen aus Reaktionen von Aminokomponenten mit α-Dicarbonylen oder Sauerstoffheterocyclen hervorgehen (Abschnitt 2.1.3.6). Die durch den STRECKER-Abbau gebildeten α-Aminoketone (Abschnitt 2.1.3.3) können direkt in Pyrrole oder Pyrazine umgesetzt werden. Die Melanoidine als Endprodukte der MAILLARD-Reaktion entstehen schließlich durch vielfältige Kondensationsreaktionen aller zuvor gebildeten Intermediate (Abschnitt 2.1.4).


23

2.2 Die oxidative Stabilität von Lebensmitteln

Die MAILLARD-Reaktion läuft, wie zuvor beschrieben, bei der Prozessierung von zahlreichen Lebensmitteln ab und übt dabei einen starken Einfluss auf die stoffliche Zusammensetzung und die Eigenschaften der hergestellten Produkte aus. In den folgenden Abschnitten soll daher in die Thematik der oxidativen Stabilität und wie diese durch Antioxidantien beeinflusst werden kann, eingeführt werden. Ein weiterer Abschnitt beschäftigt sich damit, welche der vorgestellten MAILLARD-Intermediate anti- und prooxidativ wirken können.

2.2.1 Antioxidantien

Definitionsgemäß sind Antioxidantien Verbindungen, die in geringen Konzentrationen in der Lage sind, die Oxidation von leichtoxidierbaren Substanzen zu verhindern oder signifikant zu verzögern.94 Sie sind einerseits endogen im Lebensmittel vorhanden (zum Beispiel Ascorbinsäure, Tocopherole oder Polyphenole) und können anderseits im Rahmen der gesetzlichen Regelungen zugesetzt werden (zum Beispiel Gallate, Butylhydroxytoluol oder Butylhydroxyanisol). Die Mechanismen, nach denen sie wirken, sind vielfältig, wobei jedoch Redoxprozesse sowie das Abfangen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder anderen freien Radikalen bei der Betrachtung antioxidativer Eigenschaften häufig im Vordergrund stehen.

In beiden Fällen wird das Antioxidans selbst oxidiert, wobei die Elektronenübertragung auf zwei möglichen Wegen erfolgen kann: dem protonengekoppelten Elektronentransfer (HAT) und dem Einzelelektronentransfer (SET).95 Der HAT-Mechanismus entspricht der Wasserstoffabstraktion durch Radikale X•, wobei es gleichzeitig zur Übertragung des Radikals auf das Antioxidans A kommt (Abbildung 24).

Abbildung 24: Protonengekoppelter Elektronentransfer (HAT).95

Nach dem SET-Mechanismus (Abbildung 25) werden Elektron und Proton nicht zeitgleich, sondern zeitlich versetzt übertragen und nicht zwangsläufig auf das gleiche Ziel, wie im Fall von Metallionen, die für ihre Reduktion zwar Elektronen aufnehmen, aber keine Protonen akzeptieren können. Daher läuft die Reduktion von anorganischen Oxidationsmitteln immer nach dem SET-Mechanismus, während Radikale sowohl über SET als auch über HAT abgefangen werden können.95

Abbildung 25: Einzelelektronentransfer (SET).95

Auf struktureller Ebene lassen sich die radikalfangenden und reduzierenden Eigenschaften vieler Antioxidantien formal auf die Oxidation einer Endiolfunktion zu einer α-Dicarbonylgruppe zurückführen. Aufgrund des starken Reduktionsvermögens dieser Struktureinheit werden Verbindungen, die sie tragen, nach VON EULER als Reduktone bezeichnet.96 Ein typisches Beispiel für


24

eine solche Substanz ist Ascorbinsäure 33, aber auch Polyphenole oder Tocopherole wie Trolox 34 können nach dieser ursprünglichen Definition als Reduktone bzw. als deren vinyloge Homologe verstanden werden (Abbildung 26). Nach der heute gängigen Definition97 sind jedoch nur Substanzen eingeschlossen, die in Nachbarschaft zum Endiol eine Carbonylfunktion tragen, welche das Endiol stabilisiert, was eine Abgrenzung zu den Polyphenolen ermöglicht.

Abbildung 26: Oxidation des Reduktons Ascorbinsäure 33 (Reduktonstruktur in rot)98–100 im Vergleich zur Oxidation des als Referenzantioxidans genutzten Trolox 34.101

Die Oxidation von Reduktonen im Sinne des SET-Mechanismus wurde von verschiedenen Forschergruppen98–100 am Beispiel der Ascorbinsäure beschrieben und ist in Abbildung 27 in allgemeiner Form dargestellt. Als vinyloge Säuren liegen Reduktone in wässriger Lösung bereits deprotoniert vor, weshalb die Abgabe des ersten Protons entfällt. Im ersten Oxidationsschritt werden das zweite Proton und ein Elektron getrennt voneinander abgegeben, wodurch das Redukton zum Radikal wird und zeitgleich eine negative Ladung trägt. Das Molekül ist durch das π-System in der Lage das Radikal zu delokalisieren und verhindert so seine weitere Übertragung. Durch die Abgabe des zweiten Elektrons kann sich das System über die Bildung eines Triketons stabilisieren und hat seinen oxidierten Zustand erreicht.

Abbildung 27: Zweistufige Oxidation eines Reduktons.98–100

Weitere Eigenschaften von Antioxidantien sind die Fähigkeit zur Komplexbildung mit redoxaktiven Metallionen, die Regeneration anderer verbrauchter Antioxidantien oder die Inhibition von oxidativ wirkenden Enzymen.94;102;103 Da diese Wirkmechanismen eher indirekt oxidative Prozesse unterdrücken, werden Substanzen, die diese besitzen, zur Abgrenzung von direkt wirkenden Antioxidantien auch als Synergisten bezeichnet.


25

2.2.2 Reduktone in der MAILLARD-Reaktion

Im Laufe der MAILLARD-Reaktion entstehen zahlreiche Zwischenprodukte mit Reduktonstruktur, darunter verschiedene α-Dicarbonyle und Heterocyclen (Abbildung 28). Für Glucoson 6a, 1-Desoxyglucoson 8a, DHHM 18 und Maltol 23 konnten reduzierende Eigenschaften bereits in verschiedenen antioxidativen Testsystemen im Vergleich zu Trolox gezeigt werden.35;34 Dabei wurde festgestellt, dass die α-Dicarbonyle wahrscheinlich aufgrund ihrer komplexen Isomerenverteilung deutlich langsamer reagieren als die Reduktonether 18 und 23. Darüber hinaus gelang es nachzuweisen, dass 18 und Derivate von Furaneol 22 reduzierende Eigenschaften in Gegenwart von Eisen(III)- oder Kuper(II)-ionen besitzen.104–108 Im Gegensatz dazu zeigen Maltol 23 und strukturverwandte Stoffe wie Isomaltol 19a und Pyridinone 24 synergistische Eigenschaften indem sie Metallionen komplexieren (Abbildung 29).109–113

Abbildung 28: Reduktone und Reduktonether, die in der MAILLARD-Reaktion gebildet werden.

Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich die in der MAILLARD-Reaktion gebildeten Reduktone, was ihre reduzierenden Eigenschaften betrifft, ähnlich wie Ascorbinsäure verhalten, auch wenn sie bisher nicht unter vergleichbaren Bedingungen untersucht wurden. Erstaunlich ist das ambivalente Verhalten gegenüber redoxaktiven Metallionen, besonders, da alle Reduktone über jene Strukturmerkmale verfügen, die in den Verbindungen 19a, 23 und 24 Elektronen für die Komplexbildung zur Verfügung stellen (vergleiche Abbildung 28 und Abbildung 29). Die Wechselwirkung erfolgt stets über die Carbonylfunktion und die freie Hydroxyfunktion der jeweiligen Reduktonate, wobei mit Kupfer(II)-ionen 1:2-Komplexe und mit Eisen(III)-ionen 1:3-Komplexe gebildet werden. Aufgrund der notwendigen Deprotonierung der betroffenen Hydroxygruppe ist die Bildung der Komplexe pH-abhängig, wobei im stark Sauren keine Komplexe vorliegen und mit steigendem pH-Wert die Anzahl der pro Ion beteiligten Liganden von 1:1 bis 1:2 bzw. 1:3 zunimmt.112


26

Abbildung 29: 1:1-Komplexe der korrespondierenden Anionen von Isomaltol 19a, Maltol 23 und Pyridinon 24 mit n-valenten Metallionen (Mn+).109–113

Neben den vorgestellten Verbindungen existieren zahlreiche weitere Substanzen mit Reduktonstruktur oder ähnlichen funktionellen Gruppen, welche zur Gesamtheit der reduzierenden114–120 und komplexierenden5 Eigenschaften von MAILLARD-Reaktionsgemischen beitragen.

2.2.3 Radikalgenerierung durch Reduktone

Reduktone sind nicht nur für ihre antioxidativen Eigenschaften bekannt, sondern können unter bestimmten Umständen auch prooxidativ wirken. Dieses Verhalten ist für Ascorbinsäure ausführlich in der Literatur beschrieben und beruht auf ihrer Wechselwirkung mit Metallionen.100;121;122 Während die Übertragung von Elektronen und Protonen auf Oxidationsmittel oder Radikale zu Spezies führen, die meist chemisch inaktiv sind und nicht ohne weiteres wieder oxidiert werden können (A in Abbildung 30), ist dies bei Metallionen nicht der Fall (B). Ihre Reduktion schaltet sie selbst zwar als Oxidationsmittel aus, doch ihre reduzierte Form kann in Anwesenheit von Sauerstoff über verschiedene Prozesse zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führen und folglich ein prooxidatives Milieu schaffen (C).

Abbildung 30: Antioxidative und prooxidative Wirkmechanismen von Reduktonen.

Allerdings sind die Reduktone auf Kosten ihrer antioxidativen Kapazität in der Lage ihre selbstinduzierte Radikalgenerierung zu einem gewissen Teil zu kompensieren, vorausgesetzt ihre Konzentration ist höher als die der redoxaktiven Metallionen. Nähern sich die


27

Konzentrationsverhältnisse an, steigt die Wahrscheinlichkeit, dass die gebildeten Radikale direkt mit oxidierbaren Lebensmittelbestandteilen abreagieren, ohne dass die Oxidation durch noch vorhandene Reduktone verhindert werden kann.121

Für die Radikalgenerierung (C) durch Elektronenübertragung von Kupfer(I)- oder Eisen(II)-ionen auf verschiedene Sauerstoffspezies werden in der Literatur verschiedene Wege diskutiert, wobei der FENTON-123 und der HABER-WEISS-Reaktion,124 sowie ähnlich gearteten Reaktionen, besondere Bedeutung zugesprochen wird. 100;121;122 In beiden Reaktionen gehen aus Wasserstoffperoxid durch Metallionenkatalyse die besonders reaktiven Hydroxylradikale hervor, welche verschiedenste Biomoleküle innerhalb kürzester Zeit oxidativ schädigen können.125 Das nötige Wasserstoffperoxid kann aus Sauerstoff gebildet werden, indem in mehreren Schritten je zwei Elektronen und zwei Protonen auf das Molekül übertagen werden. Alle genannten Elektronenübertragungen sind von Metallionen in ihrer reduzierten Form abhängig und werden daher durch den Reaktionsweg B drastisch beschleunigt. In MAILLARD-Reaktionsgemischen und thermisch behandelten Lebensmitteln konnten dementsprechend Wasserstoffperoxid und verschiedene Radikalspezies nachgewiesen werden.126–130

2.3 Bier als Lebensmittelmatrix

Die Qualität des Lebensmittels Bier ist in mehrerer Hinsicht von der MAILLARD-Reaktion abhängig, weswegen es sich als Matrix zur Übertragung der in Modellsystemen erzielten Ergebnisse dieser Arbeit auf ein reales Lebensmittel eignet. Während der Herstellung wird das Malz als Träger von Kohlenhydraten und Aminokomponenten je nach gewünschter Farbe des fertigen Bieres unterschiedlich stark thermisch behandelt und auch in den Prozessschritten nach dem Maischen werden die gelösten Bestandteile über längere Zeiträume erhitzt oder heißgehalten. Die Bildung von MAILLARD-Reaktionsprodukten trägt dabei zu Farbe, Geschmack und Geruch des Endproduktes bei und die gebildeten Reduktone üben, gemäß der in Abschnitt 2.2 geschilderten Mechanismen, einen nachweislichen Einfluss auf die oxidative Stabilität aus.27;129;131;132

2.3.1 Bierherstellung

In Deutschland ist die Bierherstellung nach dem Vorläufigen Biergesetz § 9133 geregelt. So dürfen für untergäriges Bier nur Gerstenmalz, Hopfen, Hefe und Wasser verwendet werden, was im Wesentlichen den Vorgaben des Reinheitsgebotes von 1516 entspricht. Für obergäriges Bier können darüber hinaus Malze aus anderen Getreidesorten und Saccharose (aus Zuckerrohr oder Zuckerrübe), Invertzucker oder D-Glucose sowie Färbemitteln, die aus diesen Zuckern hergestellt wurden, verwendet werden. Der Zusatz von Hopfen kann in jedem Fall zerkleinert, in Pulverform oder als Extrakt erfolgen.

Der gesamte Prozess kann grundsätzlich in die drei Schritte der Malzbereitung, der Würzebereitung und der Gärung gegliedert werden.134 Bei der Malzbereitung wird das jeweilige Getreide geweicht und kontrolliert zum Keimen gebracht. Ziel ist es durch die Aktivierung von Enzymen, vor allen den α- und β-Amylasen, die im Mehlkörper des Getreidekorns gespeicherte Stärke in reduzierende Zucker zu überführen, die einerseits vergärbar sind und andererseits im Rahmen der MAILLARD-Reaktion reagieren können.134–136 Von besonderer Bedeutung sind Maltose, D-Glucose sowie Maltodextrine. Die Keimung wird durch das Darren beendet. Dabei wird der


28

Wassergehalt im Grünmalz von 43–47 % auf 2,5–4,5 % gesenkt, indem je nach gewünschter Malzart ein Temperaturgradient von etwa 50 bis 105 °C durchlaufen wird.134 Helle Malze werden schnell getrocknet und bei etwa 85 °C abgedarrt, während dunklere Malze langsamer getrocknet und bei 105 °C abgedarrt werden. Darüber hinaus gibt es Spezialmalze, die den zuvor beschriebenen Malzen anteilig beigemischt werden, um bestimmte sensorische Eigenschaften zu erzielen. Bei diesen wird zwischen Karamellmalzen, die erst bei Feuchte verzuckert und dann bei über 150 °C abgedarrt werden, und Röstmalzen, die trocken bei bis zu 220 °C geröstet werden, unterschieden.134

Das fertige Malz wird geschrotet und durch Mischen mit Brauwasser in eine Maische überführt. Durch ständiges Rühren und einem gezielt gesteuerten Temperaturverlauf wird die Restaktivität der malzeigenen Enzyme genutzt, um die Extraktausbeute zu erhöhen. Dazu werden verschiedene Rasten im optimalen Wirkbereich der jeweiligen Enzyme zwischen 50 bis 75 °C durchgeführt. Bei der Trennung von Würze und Treber, dem Läutern, dienen die unlöslichen Bestandteile des Malzschrots als natürlicher Filter, indem sie sich auf dem Siebboden des Läuterbottichs absetzen. Zur Verbesserung der Extraktion wird der Treber zusätzlich mit Brauwasser gewaschen.134

Die aufgefangene Würze wird nach dem Läutern unter Zugabe des Hopfens für 70 bis 120 min gekocht und dabei durch Verdampfung auf den gewünschten Extraktgehalt eingestellt. Durch die Würzekochung werden außerdem die relevanten Bestandteile des Hopfens, wie die Bitterstoffe, gelöst bzw. gebildet, es kommt zur Deaktivierung sämtlicher Enzyme und es werden vor der Gärung alle unerwünschten Mikroorganismen ausgeschaltet.135

Zur Gärung wird die gekühlte Hefe in Tanks abgefüllt und mit der jeweiligen Hefe versetzt. Untergärige Biere (Pilsner-, Export- und Lagerbiere) werden zur Hauptgärung für 7 bis 8 Tage zwischen 8 und 9 °C gelagert und anschließend zur Nachgärung für weitere 4 bis 8 Wochen bei etwa 0 °C. Bei obergärigen Bieren (Weißbier, Altbier, Ale) dauert die Lagerung bei 16 bis 20 °C hingegen nur etwa 3 Tage. Eine Nachgärung ist nicht zwangsweise erforderlich und kann auch in Flaschen erfolgen. Die Hefen bilden Ethanol und Kohlensäure, die neben den Aromanoten des Hopfens und der Röstprodukte zu den wertgebenden Bestandteilen des Getränks zählen.134;135

Im letzten Schritt wird das fertige Bier filtriert um Hefebestandteile zu entfernen, bei Bedarf pasteurisiert und schließlich abgefüllt, wobei die enthaltene Kohlensäure die Verwendung eines Isobarmeters notwendig macht.134;135

ZIELSTELLUNG

29

3 Zielstellung Die oxidative Stabilität von Lebensmitteln kann durch die Bildung von MAILLARD-

Reaktionsprodukten maßgeblich beeinflusst werden, da in allen Phasen der Reaktion neben farbigen Produkten auch reduzierende Verbindungen entstehen.9 Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Beitrag von ausgewählten heterocyclischen Intermediaten zu beiden Eigenschaften von MAILLARD-Reaktionsgemischen zu untersuchen. Dabei sollen zum einen die entsprechenden Zwischenprodukte sowie strukturverwandte Verbindungen isoliert untersucht und zum anderen komplexe Reaktionsgemische, in denen sie vorliegen, analysiert werden.

Dazu ist im ersten Schritt eine möglichst umfassende Analyse antioxidativer Eigenschaften typischer Verbindungen mit verschiedenen Methoden notwendig. Hintergrund soll sein, die Unterschiede zwischen MAILLARD-Intermediaten ohne Reduktonstruktur (zum Beispiel HMF oder Furfural) und mit Reduktonstruktur (zum Beispiel Furaneol oder Maltol) zu ermitteln. Außerdem wird der Vergleich zum Redukton Ascorbinsäure erfolgen und die Bedeutung der Reduktonstruktur ausgewählter Zwischenprodukte durch die Einführung von Schutzgruppen überprüft. Schließlich sollen die Erkenntnisse mit Hilfe von strukturell ähnlichen Substanzen abgesichert werden. Als Modellverbindungen für typische Produkte der MAILLARD-Reaktion dienen Furane (HMF, Furfural, O-Glycosylisomaltol, Isomaltol, 2-Acetylfuran), Pyrrole (2-Acetylpyrrol), Furan-2-one (Sotolon, Abhexon), Furan-3-one (Norfuraneol, Furaneol), Pyran-4-one (Maltol, DHHM) und Pyridin-4-one (Maltosin). DHHM, O-Glycosylisomaltol und Isomaltol müssen für diesen Zweck gezielt dargestellt werden. Die antioxidativen Eigenschaften aller Substanzen werden mit Methoden charakterisiert, die sich auf das Reduktionsvermögen (FCR-, CUPRAC-, Phenanthrolinassay), das Abfangen von Radikalen (TEAC-, ESR-Assay) und die Bildung von Komplexen (ESR-Spektroskopie) stützen.

Um den Anteil der verschiedenen Heterocyclen zur Farbe und zu antioxidativen Eigenschaften abschätzen zu können, werden Modellversuche durchgeführt, die die Bedingungen typischer Prozesse in der Lebensmittelverarbeitung, wie Kochen oder Rösten, abbilden. Es sollen einerseits Ansätze ausgehend von reduzierenden Kohlenhydraten und andererseits ausgehend von bestimmten Sauerstoffheterocyclen auf ihre Zusammensetzung und Eigenschaften untersucht werden. Als Kohlenhydrat wird dabei das Disaccharid Maltose, aufgrund seiner hohen Relevanz in Lebensmitteln, im Mittelpunkt stehen und sowohl mit dem Monosaccharid D-Glucose als auch mit dem Trisaccharid Maltotriose verglichen. Um ein umfassendes Bild der Komposition der Reaktionsgemische erhalten zu können, werden die drei relevanten maltosespezifischen α-Dicarbonylverbindungen Maltoson, 1-Desoxymaltoson und 3-Desoxymaltoson in Form ihrer Chinoxalinderivate synthetisiert. Diese Verbindungen stellen wichtige Vorstufen der verschiedenen heterocyclischen Intermediate dar und komplettieren das Bild bei der Untersuchung ihrer Bildungswege. Die Bräunung, die radikalfangenden (TEAC-Assay) und Eisen(III)-reduzierenden Eigenschaften (Phenanthrolinassay) sollen dann den Konzentrationen der jeweils gebildeten Heterocyclen gegenübergestellt und deren Einfluss auf diese abgeschätzt werden. Die weitere Umsetzung der Zwischenprodukte zu Farbstoffen unterschiedlicher Molekülgröße wird mittels GPC analysiert. Um die antioxidativen Eigenschaften der verschiedenen Molekülgewichtsfraktionen beurteilen zu können, soll zudem eine Kopplung der GPC mit dem TEAC-Assay entwickelt werden.

ZIELSTELLUNG

30

Im letzten Schritt, sollen die zuvor gewonnenen Erkenntnisse auf das Lebensmittel Bier übertragen werden, in dessen Herstellungsprozess die MAILLARD-Reaktion der Maltose neben Farbe, Aroma und Geschmack auch Einfluss auf die oxidative Stabilität nimmt.27;129;131;132 Dabei soll aufgeklärt werden, ob in der Lebensmittelmatrix die Reaktionswege der Maltose oder der D-Glucose, welche zuvor in den Modellversuchen isoliert betrachtet wurden, dominieren. Außerdem wird der Vergleich zum Produktspektrum der Röst- (trocken) und Kochmodelle (wässrig) erfolgen, um den Einfluss beider Teilschritte während der Bierherstellung abzuleiten. Die Analytik soll sich an den Untersuchungen der Modellsysteme orientieren und ist daher auf den Nachweis der α-Dicarbonyle, der Heterocyclen sowie den hochmolekularen Verbindungen und den antioxidativen Eigenschaften fokussiert.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

31

4 Ergebnisse und Diskussion Der erste Abschnitt dieses Kapitels befasst sich mit den antioxidativen Eigenschaften der

heterocyclischen Intermediate der MAILLARD-Reaktion. Im zweiten und dritten Abschnitt wird primär die Bildung dieser Verbindungen beim Abbau von Maltose in Anwesenheit von L-Alanin betrachtet. Im Fokus stehen dabei die antioxidativen Eigenschaften sowie die Farbe der Reaktionsgemische und die Frage, welchen Beitrag die heterocyclischen Verbindungen dabei leisten. Um diese Frage eingehend beantworten zu können, werden im vierten Abschnitt die direkten Folgereaktionen ausgesuchter Reduktone und HMF untersucht. Im letzten Abschnitt werden alle Ergebnisse der Modelle der Lebensmittelmatrix des Biers gegenübergestellt.

4.1 Antioxidative Eigenschaften der Heterocyclen

Die antioxidativen Kapazitäten der in dieser Arbeit relevanten heterocyclischen MAILLARD-Reaktionsprodukte mit und ohne Reduktonstruktur (Abschnitt 2.1.3.4) wurden mit fünf antioxidativen Assays ermittelt. Zusätzlich wurden das Komplexierungsverhalten gegenüber Kupfer(II)-ionen sowie die Radikalbildung durch FENTON-ähnliche Prozesse mit Hilfe der ESR-Spektroskopie untersucht. Als Referenz diente in allen Assays das wasserlösliche Tocopherolderivat Trolox, welches als Standard für die Untersuchung antioxidativer Verbindungen etabliert ist.95;102;137 Zum Vergleich wurde außerdem Ascorbinsäure mitgeführt, um die Reaktivität eines gut untersuchten Reduktons mit jener der Reduktonether zu vergleichen.

Darüber hinaus wurden Substanzen, die keine oder nur eine untergeordnete Rolle in der

MAILLARD-Reaktion spielen, die aber strukturelle Ähnlichkeiten zu den MAILLARD-Intermediaten aufweisen, einbezogen (Abbildung 31 und Tabelle 1). Zu den ausgewählten Verbindungen gehören unter anderem Sotolon 35 und Abhexon 36, welche durch Aldolreaktion oder -kondensation aus Säuren und Aldehyden gebildet werden.138;139 Als Isomere der Furaneolderivate 22a und 37 verfügen sie über die gleichen funktionellen Gruppen, sind jedoch definitionsgemäß keine Reduktonether. Ethylfuraneol 37 und Ethylmaltol 38 unterscheiden sich durch eine zusätzliche CH2-Gruppe von 22a und 23a, teilen aber ihre Reduktonfunktion. Kojisäure 39 kann als Derivat von Maltol angesehen werden, wobei sich die Position der Methylgruppe unterscheidet und diese im Fall von 39 eine Hydroxyfunktion trägt. Neben dem MAILLARD-Reaktionsprodukt Maltosin 24 wurde das unsubstituierte Pyridinon 40 und das als Eisenchelator bekannte Deferipron 41 verwendet, um den Einfluss des Substituenten am Stickstoff zu untersuchen. Die Verbindungen 24 und 40 wurden dazu freundlicherweise von Dr. Michael Hellwig aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. Thomas Henle der TU Dresden zur Verfügung gestellt.

Die ausgewählten Reduktonether 19a, 22a und 23a wurden außerdem acetyliert, um die Hydroxygruppe als Teil der Reduktonfunktion zu blockieren und so Rückschlüsse auf mögliche Reaktionsmechanismen zu ziehen. O-Galactosylisomaltol 19c, welches als Zwischenstufe in der Isomaltolsynthese dargestellt wurde, wurde aus dem gleichen Grund untersucht.


32

Abbildung 31: Übersicht der untersuchten heterocyclischen MAILLARD-Reaktionsprodukte und strukturell verwandter Substanzen. Die entsprechenden Namen und Substitutionsmuster sind in Tabelle 1 gegeben.

Die antioxidative Kapazität, als Maß für die antioxidative Wirksamkeit einer Verbindung im Verhältnis zu einer Referenzsubstanz wie Trolox, wird häufig mit Testsystemen bestimmt, die sich die reduzierenden und radikalfangenden Eigenschaften von Antioxidantien zu Nutze machen. In dieser Arbeit wurden für die Untersuchung der in Abbildung 31 genannten Verbindungen, die folgenden Assays verwendet: der TEAC-Assay zur Bestimmung der Unterdrückung der Bildung von ABTS-Radikalkationen, der FCR-Assay zur Bestimmung der Reduktion des FCR als anorganisches Oxidationsmittel, eine ESR-Methode zur Bestimmung des Abbaus von freien Radikalen, der CUPRAC-Assay zur Messung der Reduktion von Kupfer(II)-ionen und der Phenanthrolinassay zur Messung der Reduktion von Eisen(III)-ionen.


33

Tabelle 1: Namen und Substitutionsmuster der Verbindungen in Abbildung 31. H bezeichnet Wasserstoffreste, Me Methylreste, Et Ethylreste, Ac Acetylreste, Gal Galactosylreste und ε-Lys L-Lysinreste (über die ε-Aminofunktion gebunden).

Nr. Name Alkylrest

RA Pyrrolrest

RP Schutzgruppe

RS

15 Furfural - - - 16 Hydroxymethylfurfural (HMF) - - - 20 2-Acetylfuran - - -

19a Isomaltol - - H 19c O-Galactosylisomaltol - - Gal 19d O-Acetylisomaltol - - Ac 17 2-Acetylpyrrol - - - 35 Sotolon Me - - 36 Abhexon Et - - 21 Norfuraneol H - H 22 Furaneol Me - H

22b O-Acetylfuraneol Me - Ac 22c O-Diacetylfuraneol Me - Ac 37 Ethylfuraneol Et - H

23a Maltol Me - H 23b O-Acetylmaltol Me - Ac 38 Ethylmaltol Et - - 39 Kojisäure - - - 18 Dihydrohydroxymaltol (DHHM) - - - 40 Hydroxymethylpyridinon (HMPO) - H - 41 Deferipron - Me - 24 Maltosin - ε-Lys -

Aufgrund der besonderen Bedeutung der metallreduzierenden Eigenschaften im Kontext der FENTON-ähnlichen Reaktionen von Reduktonen wie Ascorbinsäure werden der CUPRAC- und der Phenanthrolinassay von den anderen Methoden getrennt betrachtet. Wie bereits angesprochen, wurden das reduzierende und komplexierende Verhalten in Gegenwart von Kupfer(II)-ionen mit speziellen Methoden weiter untersucht, wobei nur ausgewählte Reduktone zum Einsatz kamen.

4.1.1 Reduzierende und radikalfangende Eigenschaften

Die Ergebnisse des TEAC- und FCR-Assays sowie der ESR-Methode sind in Abbildung 32 zusammengefasst. Verbindungen die 1000 mmol TE/mol erreichen (gepunktete Linie), entsprechen in ihrer antioxidativen Wirkung der Referenzsubstanz Trolox.


34

Abbildung 32: Antioxidative Kapazitäten ermittelt mit dem TEAC- und FCR-Assay sowie der ESR-Methode aller untersuchten Verbindungen (Strukturen in Abbildung 31). Verbindungen, die 1000 mmol TE/mol erreichen (gepunktete Linie), verhalten sich identisch zu Trolox.

Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass alle Verbindungen ohne Reduktonstruktur, wie die Furane Furfural, HMF und 2-Acetylfuran sowie 2-Acetylpyrrol keine reduzierenden oder radikalfangenden Eigenschaften aufweisen. Ausnahmen sind die Furan-2-one Sotolon und Abhexon. Die Reduktone besitzen in den verschiedenen Assays zum Teil sehr unterschiedliche antioxidative Kapazitäten. Ascorbinsäure erreicht zum Beispiel Kapazitäten von (272 ± 73) mmol TE/mol (TEAC), (1745 ± 206) mmol TE/mol (FCR) und (939 ± 19) mmol TE/mol (ESR). Ähnliche Unterschiede können insbesondere für die Pyran-4-one und Pyridin-4-one festgestellt werden, wobei sich letztere von der Tendenz her gleich verhalten. So werden jeweils im FCR-Assay die höchsten und im ESR-Assay die niedrigsten Werte gemessen. In der Gruppe der Pyran-4-one verhalten sich nur Maltol und Kojisäure ähnlich, während DHHM und Ethylmaltol unterschiedliche Tendenzen aufweisen. Die Furan-3-one Norfuraneol, Furaneol und Ethylfuraneol zeigen hingegen weniger stark ausgeprägte Unterschiede in den drei Assays und untereinander.

Die unterschiedliche Reaktivität im TEAC-Assay von Maltol und Ethylmaltol im Vergleich zu Norfuraneol, Furaneol und Ethylfuraneol, kann möglicherweise durch sterische Hinderung verursacht werden. Das ABTS-Radikalkation, auf dem diese Methode basiert, ist ein vergleichsweise großes Molekül und die Wasserstoffabstraktion setzt eine räumliche Nähe zum Antioxidans voraus. Im Fall von Ethylmaltol könnte die längere Alkylkette eine Behinderung verursachen. Ethylfuraneol kann hingegen durch Enolisierung (vergleiche Abbildung 17) die Reduktonfunktion sowohl in Nachbarschaft zur Methyl- als auch zur Ethylfunktion ausbilden. Somit ergibt sich gegenüber Ethylmaltol keine sterische Hinderung im Vergleich mit dem jeweiligen Methylderivat. Unterstützt wird diese These dadurch, dass das Maltolderivat Kojisäure sich analog zu Maltol verhält, obwohl es über einen räumlich größeren Substituenten verfügt. Dieser ist jedoch nicht in räumlicher Nähe zur

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35

Reduktonfunktion. Darüber hinaus zeigen Maltol und Ethylmaltol in den anderen Assays ähnliche antioxidative Kapazitäten.

Die Einführung von Acetylschutzgruppen schwächt die radikalfangenden und reduzierenden Eigenschaften der entsprechenden Reduktonether deutlich, da die Reduktonfunktion blockiert wird. Das in der MAILLARD-Reaktion von Lactose relevante O-Galactosylisomaltol zeigt in Analogie zu den O-Acetylderivaten in allen Assays ebenfalls deutlich geringere Kapazitäten als das freie Isomaltol.

Die niedrigsten antioxidativen Kapazitäten unter den Reduktonethern zeigt Isomaltol, welches in allen Assays deutlich geringere Werte erreicht als Trolox und lediglich im TEAC-Assay mit Ascorbinsäure vergleichbar ist. Diese veränderte Reaktivität ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass sich die Carbonylfunktion, im Gegensatz zu den anderen Reduktonethern, außerhalb des Rings befindet und die dem Carbonyl nähere Hydroxyfunktion den Ether bildet. Sotolon und Abhexon verfügen als Isomere von Furaneol bzw. Ethylfuraneol über die gleichen funktionellen Gruppen nur in veränderter Anordnung. So besitzen beide zwar ein Enol, das durch ein Carbonyl stabilisiert wird, aber keine Endiolfunktion, weshalb sie formal nicht zu den Reduktonen zählen. Ihre schwachen antioxidativen Eigenschaften beziehen sie wahrscheinlich über die Abgabe je eines Protons und eines Elektrons ihrer freien Hydroxyfunktion. Im Gegensatz zu den Reduktonethern bleibt die Oxidation aber auf dieser Stufe stehen. Das alkalische Milieu im FCR-Assay dürfte diese Reaktion unterstützen und so könnte erklärt werden, warum beide Furan-2-one in diesem Assay höhere antioxidative Kapazitäten erreichen als bei den anderen Methoden.

Die verwendete ESR-Methode gibt insgesamt Aufschluss darüber, dass die festgestellten Unterschiede in den antioxidativen Kapazitäten der untersuchten Antioxidantien kinetisch bedingt sind, da in diesem Assay die zeitliche Abhängigkeit der antioxidativen Reaktion direkt beobachtet wird. Dabei konnte festgestellt werden, dass der Punkt nach 30 min Messzeit, welcher zur vergleichenden Berechnung der antioxidativen Kapazität herangezogen wurde, nicht in allen Fällen den Endpunkt der Reaktion darstellt. Schnelle Antioxidantien wie der eingesetzte Standard Trolox oder das Vergleichsredukton Ascorbinsäure reagieren innerhalb von 30 min nahezu vollständig ab, wobei ihr antioxidatives Potenzial, in diesem Fall gemessen als die Geschwindigkeit mit der FRÉMYs Salz abgebaut wird, innerhalb weniger Minuten gegen Null strebt. Vergleichbare Kinetiken können für die Reduktonether Norfuraneol, Furaneol, Ethylmaltol und DHHM beobachtet werden, im Fall der Pyran-4-one und Pyridin-4-one ist nach 30 min noch ein antioxidatives Potenzial messbar.

Ähnlich verhält es sich mit dem TEAC-Assay, hier wird zwar keine Zeitabhängigkeit gemessen, sondern nur der Wert nach exakt 6 min verwendet, aber anhand der fortschreitenden Farbveränderung in der Küvette nach der Messung kann zumindest qualitativ beobachtet werden, dass die Reaktion weiterläuft. Verbindungen, die niedrigere antioxidative Kapazitäten als Trolox aufweisen, reagieren also tendenziell langsamer und Verbindungen, die höhere antioxidative Kapazitäten erreichen, entsprechend schneller. Beim FCR-Assay kommt zusätzlich der Einfluss des pH-Werts dazu, da dieser nicht mit Phosphatpuffer auf 7,4 eingestellt wird, wie im Fall vom TEAC-Assay und der ESR-Methode, sondern mit 7,5 %iger Natriumcarbonatlösung. Unter basischen Bedingungen laufen antioxidative Reaktionen unter Umständen verstärkt ab, da diese, wie in Abschnitt 2.2.1 beschrieben, häufig die Deprotonierung der beteiligten Hydroxyfunktionen voraussetzen.


36

4.1.2 Reduktion von Metallionen

Die Ergebnisse der metallreduzierenden Eigenschaften im CUPRAC- und im Phenanthrolinassay sind in Abbildung 33 zusammengefasst. Für die metallreduzierenden Methoden ergeben sich andere Resultate, da neben dem Reduktionsvermögen auch Komplexbildungseigenschaften in den Assays eine Rolle spielen. MAILLARD-Reaktionsprodukte ohne Reduktonstruktur zeigen, wie schon im FCR-, TEAC- und ESR-Assay, auch im CUPRAC- und Phenanthrolinassay keine Aktivität. Von den Reduktonethern wirken in Gegenwart von Metallionen nur die Furan-3-one sowie DHHM reduzierend, während die restlichen Pyran-4-one sowie die Pyridin-4-one und Isomaltol inaktiv bleiben. Dies ist darauf zurückzuführen, dass diese Verbindungen stabile Komplexe mit Kupfer(II)- und Eisen(III)-ionen bilden, wie bereits in der Literatur bekannt.109–113 Anhand dieser Ergebnisse kann vermutet werden, dass nur Furan-3-one und DHHM ähnlich wie Ascorbinsäure zum Redoxcycling über FENTON-ähnliche Reaktionen befähigt sind und somit prooxidativ wirken können.

Abbildung 33: Antioxidative Kapazitäten ermittelt mit dem CUPRAC- und Phenanthrolinassay aller untersuchten Verbindungen (Strukturen in Abbildung 31). Verbindungen, die 1000 mmol TE/mol erreichen (gepunktete Linie), verhalten sich identisch zu Trolox.

Im Gegensatz zu den Assays, die auf radikalfangenden und reduzierenden Eigenschaften basieren, ergeben sich in beiden metallreduzierenden Testsystemen ähnliche antioxidative Kapazitäten für alle wirksamen Analyten mit Ausnahme von DHHM. Dies ist darauf zurückzuführen, dass beide Methoden auf dem gleichen Mechanismus beruhen und die Reaktionszeiten deutlich länger gewählt sind als beim TEAC-, FCR- und ESR-Assay. Daher wird mit höherer Wahrscheinlichkeit der Endpunkt der antioxidativen Reaktion erreicht als in den Assays auf Basis von radikalfangenden und reduzierenden Eigenschaften. Das Referenzredukton Ascorbinsäure erreicht im Rahmen des Fehlers daher identische Werte wie Trolox und die Furan-3-one Norfuraneol, Furaneol und


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Phenanthrolin


37

Ethylfuraneol erreichen 60 bis 70 % des Reduktionsvermögens der Referenz. Für die acetylierten Derivate von Furaneol zeigt sich erneut eine deutlich reduzierte Aktivität (vergleiche Abbildung 32).

Da grundsätzlich alle Reduktonether über die Strukturmerkmale verfügen, welche für die Komplexbildung von Bedeutung sind, muss die unterschiedliche Reaktivität durch andere Faktoren ausgelöst werden. Ein offensichtlicher Unterschied von metallreduzierenden Verbindungen wie Furaneol und DHHM zu Komplexbildnern wie Maltol und Isomaltol liegt in der Hybridisierung der Kohlenstoffatome im jeweiligen Ringsystem. Während diese im Fall von Maltol und Isomaltol vollständig sp2-hybridisiert sind und ein konjugiertes π-System bilden, befindet sich im Ring von DHHM und Furaneol mindestens ein sp3-hybridisiertes Kohlenstoffatom. Möglicherweise sind die Aromaten weniger anfällig gegenüber Oxidationsreaktionen, weil sie bestrebt sind, ihr konjugiertes Doppelbindungssystem zu erhalten, statt sich einer wahrscheinlich notwendigen Ringöffnung im Rahmen der Oxidation zu unterziehen. Aufgrund dieser Stabilität könnten sie eher in der Lage sein, über ihre Hydroxy- und Carbonylfunktionen Metallionen zu komplexieren. Unterstützt wird diese These durch die Beobachtung, dass sowohl die Furan-3-one und DHHM deutlich schneller mit FRÉMYs Salz abreagieren als die restlichen Pyran-4-one und die Pyridin-4-one, was insgesamt für eine schlechtere Oxidierbarkeit der letzteren Verbindungen spricht.

Ein weiterer Faktor sind unterschiedliche Bindungswinkel und Bindungslängen. Für die Furan-3-one ergeben sich grundsätzlich andere Winkel als für die Pyran-4-one, da es sich um fünf- bzw. sechsgliedrige Ringsysteme handelt. DHHM ist zwar ebenfalls ein Sechsring, sollte aber im Gegensatz zum Aromaten Maltol nicht vollständig planar sein, wodurch sich ebenfalls andere Bindungswinkel ergeben. Außerdem verfügt DHHM über eine zusätzliche Hydroxyfunktion, welche unter Umständen die Komplexbildung erschweren könnte, da sie als zusätzlicher Elektronendonor in räumlicher Nähe zur Carbonylfunktion zur Verfügung steht.

4.1.3 Gewichtetes Mittel (WAAOC)

Die Ergebnisse, insbesondere die der TEAC-, FCR- und ESR-Assays, verdeutlichen, dass es notwendig ist, mehr als ein Testsystem zur Beurteilung von antioxidativen Eigenschaften heranzuziehen, da jede Methode auch bei strukturell sehr ähnlichen Verbindungen stark substanzabhängig ist. Auf dieses Problem wurde in den vergangenen Jahren verstärkt in der Literatur hingewiesen.95;102 Um trotz der Anwendung verschiedener Assays übersichtliche Ergebnisse ohne die Überbewertung einzelner Testsysteme zu generieren, schlagen TABART et al.137 vor, einen gewichteten Mittelwert zu berechnen (weighted average antioxidant capacity, WAAOC). Dabei werden die Ergebnisse aller Substanzen für jeden Assay separat gemittelt und die einzelnen Ergebnisse in einem Assay auf ihren jeweiligen Mittelwert normiert. Die normierten Ergebnisse einer Substanz können schließlich gemittelt werden, ohne dass das Ergebnis durch Assays beeinträchtigt wird, die grundsätzlich sehr große oder sehr kleine Ergebnisse erzielen.

Um jedoch weiterhin zwischen Substanzen unterscheiden zu können, die Metallionen reduzieren oder komplexieren, wurden nicht die Ergebnisse aller fünf Methoden nach dieser Berechnung gemittelt, sondern die metallreduzierenden Assays getrennt behandelt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 34 zusammengefasst.

Nach der getrennten Berechnung der WAAOC lassen sich die Ergebnisse der fünf Methoden in komprimierter Form wiedergeben und alle untersuchten heterocyclischen Intermediate können in


38

drei Gruppen eingeteilt werden. Die erste Gruppe umfasst Substanzen ohne oder mit blockierter Reduktonstruktur, wie Furfural, HMF, 2-Acetylfuran, 2-Acetylpyrrol sowie die geschützten Reduktonether, die keine bzw. gegenüber den ungeschützten Derivaten stark verminderte antioxidative Eigenschaften zeigen. Die zweite Gruppe von Substanzen verhält sich analog zum Referenzredukton Ascorbinsäure und ist in allen Assays aktiv. Zu dieser Gruppe zählen die ungeschützten Furan-3-one und DHHM. Die dritte Gruppe zeichnet sich dadurch aus, keine Metallionen reduzieren zu können, aber antioxidativ in Gegenwart von Radikalen oder anderen Oxidationsmitteln zu reagieren. Dies trifft auf alle Pyran-4-one außer DHHM, alle Pyridin-4-one, Isomaltol sowie die Furan-2-one zu.

Abbildung 34: Ergebnisse als WAAOC getrennt nach reduzierenden/radikalfangenden Eigenschaften und Reduktion von Metallionen aller untersuchten Verbindungen (Strukturen in Abbildung 31). Verbindungen, die 1,0 erreichen (gepunktete Linie), verhalten sich identisch zu Trolox.

Neben der verbesserten Übersichtlichkeit ist ein weiterer Vorteil der Anwendung des gewichteten Mittels, dass sich die großen Unterschiede in den Ergebnissen der einzelnen Assays relativieren. Die WAAOC der Reduktonether bewegt sich, mit Ausnahme der schwachen Antioxidantien, etwa ± 40 % um die WAAOC des Referenzreduktons. In einzelnen Methoden, wie dem TEAC-Assay, erreichen die Pyridinone hingegen 4- bis 6-fach höhere antioxidative Kapazitäten als Ascorbinsäure, da letztere in diesem Assay nur einen Bruchteil der Wirkung von Trolox erreicht.

Dennoch manifestieren sich bestimmte Unterschiede zwischen verschiedenen Substanzen bzw. Substanzgruppen. Die in allen Assays aktiven Reduktonether Norfuraneol, Furaneol, Ethylfuraneol und DHHM zeigen jeweils WAAOCs zwischen 50 und 80 % der jeweiligen WAAOC von Ascorbinsäure. Im Gegensatz dazu zeigen die komplexbildenden Pyranone, Pyridinone und Isomaltol eine sehr große Varianz in ihren antioxidativen Eigenschaften und ihre WAAOCs reichen von unter 20 % (Isomaltol) bis zu ungefähr 150 % (Maltosin) der WAAOCs von Ascorbinsäure.

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39

4.1.4 Komplexbildung mit Kupfer(II)-ionen

Die Komplexierung von Kupfer(II)-ionen durch ausgewählte Reduktone wurde zusätzlich zum CUPRAC-Assay mit Hilfe der ESR-Spektroskopie untersucht. Obwohl Eisen(III) in Lebensmittelproben von größerer Bedeutung ist als Kupfer(II), wurde letzteres für die Durchführung der Versuche ausgewählt, da Eisen(III) aufgrund seiner ubiquitären Verbreitung deutliche Schwierigkeiten bei der ESR-Messung bereitet. Kupfer(II)-Proben liefern ein deutlich besseres Signal-Rausch-Verhältnis und wie die zuvor vorgestellten Experimente zeigen, verhalten sich die eingesetzten Verbindungen hinsichtlich ihrer komplexbildenden bzw. reduzierenden Eigenschaften gegenüber Eisen(III)- und Kupfer(II)-ionen nahezu identisch.

Die Reduktone Isomaltol, Maltol, DHHM und Furaneol wurden im molaren Verhältnis von 2:1 mit Kupfer(II)-ionen inkubiert, wobei jeweils eine Probe mit Wasser und eine Probe mit Phosphatpuffer bei pH 7,4 verdünnt wurden. Die entsprechenden Spektren bei pH 7,4 sind in Abbildung 35 dargestellt. Im leicht Basischen fällt Kupfer(II) als Hydroxid aus, weshalb im Spektrum des Blindwertes kein Signal zu messen ist. Starke Komplexbildner wie Isomaltol oder Maltol sind in der Lage Kupfer(II)-ionen auch bei diesem pH-Wert in Lösung zu halten, weshalb sich für die entsprechenden Proben Komplexsignale im ESR-Spektrum ergeben. Furaneol und DHHM sind dazu nicht in der Lage, weshalb in ihrer Anwesenheit Kupfer(II), wie auch in der Blindprobe, ausfällt, und folglich keine Komplexe messbar sind.

Ohne Puffer ergeben sich für die wässrigen Lösungen der Reduktone in Anwesenheit von Kupfer(II)-ionen leicht saure pH-Werte im Bereich zwischen 3,0 und 4,0. Unter diesen Bedingungen ist ein geringer Anteil der Reduktone deprotoniert, weshalb sich nur entsprechend schwächere ESR-Signale messen lassen (Daten nicht gezeigt).

Isomaltol

Blindwert

Maltol

DHHM

Furaneol

150 mT

Abbildung 35: ESR-Spektren von Kupfer(II)-Komplexen ausgewählter Reduktonether im Phosphatpuffer bei pH 7,4.


40

Für Sotolon und Abhexon konnten niedrige antioxidative Kapazitäten mit dem TEAC-Assay ermittelt werden, wohingegen keine metallreduzierenden Eigenschaften feststellbar waren. Mittels ESR-Spektroskopie kann jedoch keine Komplexbildung für die Substanzen nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

4.1.5 Prooxidatives Verhalten

Die Radikalgenerierung über Redoxcycling konnte bereits für DHHM,104 Norfuraneol,106 Furaneol,105;140 Ethylfuraneol141 und 4-Hydroxy-2-(hydroxymethyl)-5-methylfuran-3(2H)-on107 durch ESR-spin-trap-Experimente gezeigt werden. Entsprechend gelang es den jeweiligen Autoren zum Teil die mögliche Mutagenität dieser Reduktonether durch DNA-Strangbruchexperimente nachzuweisen. Entsprechend sind Metallchelatoren wie Deferipron in der Lage, die Radikalgenerierung zu unterdrücken.142 Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung zu den Beobachtungen im CUPRAC- und Phenanthrolinassay im Rahmen dieser Arbeit. Um die prooxidative Wirkung der eingesetzten reduzierenden Substanzen unter identischen Bedingungen vergleichen zu können, wurden ausgewählte Reduktonether sowie deren acetylierte Derivate mit der spin trap N-tert-Butyl-α-phenylnitron (PBN) inkubiert. Kurzlebige Radikale, die in FENTON-ähnlichen Prozessen gebildet werden, können an die Doppelbindung von PBN addieren. Ihr radikalischer Charakter wird dabei auf die spin traps übertragen, welcher sich dann mittels ESR-Spektroskopie nachweisen lässt. In Abbildung 36 sind die ESR-Spektren ausgewählter Proben dargestellt.

Der Blindwert, PBN in Phosphatpuffer, zeigt nach Inkubation kein PBN-Signal, da es unter diesen Bedingungen nicht zur Radikalgenerierung kommt. Reduktonether ohne komplexbildende Eigenschaften wie Norfuraneol, Furaneol und Ethylfuraneol (nur das Spektrum mit Furaneol ist dargestellt) zeigen hingegen starke ESR-Signale mit der typischen Form von PBN-Radikaladdukten. O-Acetylfuraneol zeigt aufgrund der blockierten Hydroxyfunktion ein deutlich schwächeres Signal. Das leichte Restsignal könnte auf die Abspaltung der Schutzgruppe unter den gewählten Bedingungen oder auf die Enolisierung des Carbonyls und die Oxidation des entsprechenden Endiols zurückzuführen sein. O-Diacetylfuraneol konnte aufgrund seiner schlechten Wasserlöslichkeit nicht unter gleichen Bedingungen getestet werden. Die Komplexbildner Maltol und Ethylmaltol (nur das Spektrum mit Maltol ist dargestellt) erzeugen keine PBN-Signale im Spektrum, wie aufgrund ihres Verhaltens in den metallreduzierenden Assays zu erwarten war. Überraschend ist, dass sowohl Isomaltol als auch O-Acetylisomaltol vergleichbar kleine PBN-Signale induzieren. Dies ist möglicherweise auf den Abbau der Verbindungen bei 50 °C im Phosphatpuffer und den Reaktionen der Folgeprodukte zurückzuführen, denn im Gegensatz zu allen anderen Proben, färbten sich die Lösungen von Isomaltol und dem geschützten Derivat nach 2 h gelb.


41

DHHM erzeugt ein deutlich schwächeres PBN-Signal als die Furaneolderivate, was den geringeren reduzierenden Eigenschaften, die im CUPRAC-Assay gemessen werden konnten, entspricht. Möglicherweise verhält sich DHHM aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit zu Maltol ambivalent gegenüber Metallionen und zeigt sowohl reduzierende als auch komplexierende Eigenschaften.

4.1.6 Oxidationsmechanismus

Durch die bisher beschriebenen Experimente konnte gezeigt werden, dass insbesondere die Furan-3-one und DHHM ein durchaus ähnliches Verhalten zu Ascorbinsäure zeigen, obwohl in den Heterocyclen eine der Hydroxyfunktionen an der Bildung eines intramolekularen Ethers beteiligt ist und somit nicht ohne weiteres im Sinne des in Abschnitt 2.2.1 beschriebenen Oxidationsmechanismus reagieren kann. Es liegt also die Vermutung nahe, dass die freie Hydroxyfunktion von entscheidender Bedeutung ist, was durch Einführung von Acetylschutzgruppen bestätigt werden konnte.

Außerdem kann die Bedeutung der Carbonylfunktion in Nachbarschaft zum Endiol durch die Veresterung von Furaneol, aus der sowohl O-Mono- als auch O-Diacetylfuraneol hervorgehen, abgeleitet werden. Furaneol unterliegt in wässrigen Lösungen, wie zuvor in Abschnitt 2.1.3.5 beschrieben, über Keto-Enol-Tautomerie der Umlagerung in verschiedene Isomere. Dies ist mittels NMR-Spektroskopie an, in Deuteriumoxid gemessenen, Proben über den im Spektrum sichtbaren

Blindwert

Isomaltol

O-Acetylisomaltol

Furaneol

O-Acetylfuraneol

Maltol

O-Acetylmaltol

DHHM

10 mT

Abbildung 36: ESR-Spektren von PBN-Addukten nach Inkubation von ausgewählten Reduktonethern bzw. ihren acetylierten Derivaten mit PBN für 2 h bei 50 °C im Phosphatpuffer bei pH 7,4.


42

H/D-Austausch nachzuvollziehen. Theoretisch ist eine Enolisierung, welche zu einem oxidierbaren Endiol führen würde, auch im Furaneolmonoester denkbar und tatsächlich können für das einfach acetylierte Derivat reduzierende Eigenschaften gemessen werden. Die WAAOC ist im Verhältnis zu Furaneol jedoch um ungefähr 80 % niedriger (siehe Abbildung 34), was auf eine schlechte Enolisierbarkeit des Monoesters hinweisen könnte und insofern nachvollziehbar, da in diesem keine nachbarständige Carbonylfunktion vorhanden ist, die das Endiol stabilisieren kann. NMR-Experimente bestätigen diese Theorie, da sich im Vergleich zu Furaneol nur ein langsamer H/D-Austausch zeigt. Das Signal des entsprechenden Protons nimmt innerhalb von vier Wochen um etwa 75 % ab, während der vollständige Austausch im ungeschützten Derivat innerhalb von wenigen Tagen erreicht ist. Der Diester, welcher über keine freien Hydroxyfunktionen verfügt, zeigt dementsprechend keinerlei Aktivität. Diese Ergebnisse bestätigen, dass zumindest unter sauren oder neutralen pH-Bedingungen oxidierbare Endiole nur in Nachbarschaft zu Carbonylen, welche zur Stabilisierung des Systems beitragen, gebildet werden. Dies deckt sich mit der Beobachtung aus früheren Untersuchungen, die zeigen konnten, dass Kohlenhydrate, obwohl sie grundsätzlich Endiole bilden können, in antioxidativen Assays nicht reduzierend wirken.35

Abbildung 37: Möglicher Reaktionsweg der Oxidation von Furaneol zu Methylglyoxal 9 und Milchsäure 43.

Um weitere Erkenntnisse über die Oxidation der Reduktonether zu gewinnen, wurden diese mit Iod, FRÉMYs Salz und ABTS-Radikalkationen umgesetzt, um die resultierenden Lösungen anschließend mit verschiedenen Methoden auf Oxidationsprodukte zu untersuchen. Anhand dieser und den zuvor vorgestellten Ergebnissen wurde ein möglicher Mechanismus für den oxidativen Abbau von Furaneol 22a entwickelt, welcher in Abbildung 37 dargestellt ist. Die Resultate in den antioxidativen Assays


43

legen nahe, dass die Oxidation durch die Abstraktion eines Protons und eines Elektrons initiiert wird. In jüngerer Literatur105;140 schlagen die jeweiligen Autoren vor, dass der Ring des Furanons 22a vor der eigentlichen Oxidation durch Hydrolyse geöffnet wird. Dies ist jedoch unwahrscheinlich, da Reduktonether wie Furaneol und DHHM sowohl in Wasser als auch in Phosphatpuffer bei pH 7,4 über einen längeren Zeitraum stabil sind (Abbildung 81 im Anhang) und unter diesen Bedingungen in der Lage sind Iod, FRÉMYs Salz oder ABTS-Radikalkationen zu reduzieren bzw. abzubauen. Eine Hydrolyse von Furaneol ist zwar durchaus in der Literatur beschrieben aber nur in wässriger Lösung bei Temperaturen von 160 °C.143 Daher spielt diese Reaktion bei der Prozessierung von Lebensmitteln mit Sicherheit eine Rolle, jedoch nicht bei der Lagerung von Lebensmitteln oder generell unter milden Bedingungen bzw. in den verwendeten antioxidativen Assays. Ausgehend von den vorliegenden Daten scheint die Hydrolyse eher im Zuge der Oxidation induziert zu werden, anstatt davor abzulaufen.

Die radikalische Zwischenstufe 42, die aus der Abstraktion des Protons und Elektrons hervorgeht, kann sich über ihr π-System durch Mesomerie stabilisieren. Durch Wasseraddition im Laufe des zweiten Elektronentransfers wird schließlich das offenkettige Triketon Acetylformoin 32 gebildet, welches auch in anderen Publikationen als Intermediat vorgeschlagen wird.105;140 Sowohl in der offenkettigen Form als auch in Halbacetalform ist 32 ein Redukton bzw. Reduktonether, doch eine erneute Oxidation zum entsprechenden Tetraketon (Abbildung 82 im Anhang), wie von YAMASHITA et al.140 vorgeschlagen, ist unwahrscheinlich. Denn bereits das Triketon 32 ist eine hochgradig instabile Verbindung,144 die auf anderen Wegen abgebaut werden kann. Die erneute Oxidation von Acetylformoin 32 würde außerdem zwei weitere Protonen und zwei weitere Elektronen freisetzen, weshalb Furaneol insgesamt doppelt so viele Reduktionsäquivalente wie Trolox oder Ascorbinsäure besitzen sollte. Dies entspricht jedoch nicht den Ergebnissen der reduzierenden und metallreduzierenden Assays. Außerdem stimmen die tatsächlich identifizierten Oxidationsprodukte mit den Spaltprodukten des Triketons 32 und nicht mit denen des Tetraketons überein.

Als Hauptabbauprodukt von mit Iod oxidiertem Furaneol kann mittels GC-MS nach Silylierung das entsprechende TMS-Derivat der Milchsäure 43 gefunden werden. Methylglyoxal 9 ist nur in Spuren als Chinoxalinderivat mittels HPLC nachweisbar. Beide Verbindungen sind typische Reaktionsprodukte von β-Dicarbonylspaltungsreaktionen und diese spezielle Kombination deutet auf die hydrolytische Spaltung von 32 hin, wobei der Angriff an C-4 erfolgen müsste. Der geringe Anteil an Methylglyoxal 9 im Verhältnis zu Milchsäure 43 lässt sich dadurch erklären, dass intermediär ein hochreaktives Keten gebildet werden könnte, welches entweder über Keto-Enol-Tautomerie in 9

umlagern oder nach Addition von Wasser 43 bilden kann. Ein analoger Mechanismus wurde von VOIGT et al.66 für das entsprechende Triketon vorgeschlagen, das aus 1-Desoxyglucoson nach Oxidation hervorgeht. Auch wenn die Bildung eines Ketens unwahrscheinlich erscheint, wird diese These durch die fast ausschließliche Bildung von Milchsäure 43 gestützt. Die Spaltung ausgehend von einem Angriff an C-2 (Abbildung 82 im Anhang) scheint weniger von Bedeutung zu sein, da die entsprechenden Spaltprodukte Ameisensäure und 3-Hydroxy-2-oxobutanal bzw. 2,3-Hydroxybutter-säure nicht bzw. nur in Spuren nachweisbar sind.


44

Abbildung 38: Oxidationsprodukte von Norfuraneol 21, Furaneol 22a und Ethylfuraneol 37.

Der beschriebene Mechanismus kann auch auf andere Furan-3-one übertragen und die entsprechenden Spaltprodukte nachgewiesen werden (Abbildung 38). Ausgehend von den unsymmetrisch substituierten Furaneolderivaten Norfuraneol 21 und Ethylfuraneol 37 werden zu gleichen Anteilen Milchsäure 43 sowie Glycolsäure 44 bzw. 2-Hydroxybuttersäure 45 gebildet.

Abbildung 39: Oxidationsprodukte DHHM 18, Maltol 23a und Ethylmaltol 38.

Auch für die Pyran-4-one können Spaltprodukte nachgewiesen werden, die dem zuvor vorgestellten Mechanismus folgen (Abbildung 39). Das gemeinsame Spaltprodukt von DHHM 18 und Maltol 23a ist Milchsäure 43. Zusätzlich wird im Fall von 18 Glycerinsäure 46 und im Fall von 23a 3-Hydroxyacrylsäure 47 gebildet. Letztere ist nicht als Standard zu erwerben, konnte aber mit Hilfe der GC-MS in Proben von 23a neben 43 gefunden werden. Der unbekannte Peak wurde über die NIST-Datenbank als 2-Hydroxyacrylsäure identifiziert, welche als Isomer von 47 viele gemeinsame Fragmente aufweist. Die Oxidation von Ethylmaltol 38 führt zu 47 und zu 2-Hydroxybuttersäure 45. Zwar kann 47 aus Mangel an einem verfügbaren Standard nicht zweifelsfrei zugeordnet werden, doch ergibt sich durch die restlichen Substanzen ein klares Muster.


45

Abbildung 40: Oxidation von DHHM nach BECK et al.145 und adaptierter Mechanismus für Furaneol.

Glycerinsäure 46 und Milchsäure 43 konnten zuvor bereits von BECK et al.145 als Oxidationsprodukte von DHHM 18 identifiziert werden. Außerdem gelang den Autoren der Nachweis eines Esters 47 beider Säuren und sie formulierten ein Triketon sowie sein cyclisches Halbacetal als Zwischenstufen der Reaktion (Abbildung 40). 47 geht aus hydrolytischer β-Dicarbonylspaltung des cyclischen Triketons hervor und kann durch Hydrolyse in die freien Säuren gespalten werden. Dieser Mechanismus lässt sich auch auf die anderen Pyran-4-one übertragen, kann aber nicht unverändert auf die Furan-3-one angewendet werden. In ihrem Fall ist die Bildung eines cyclischen Halbacetals, aus dem heraus eine β-Spaltung formuliert werden kann, nicht möglich. Theoretisch wäre aus der cyclischen Form von 32 eine Art α-Spaltung denkbar, diese ist jedoch, wie in Abschnitt 2.1.3.2 geschildert, in der Literatur umstritten. Die Produkte dieser Reaktion wären Milchsäure und ein Keten, welches nach Hydrolyse ebenfalls Milchsäure bilden kann. Dies entspricht dem Produktspektrum der β-Spaltung des offenkettigen Isomers von 32 (Abbildung 37). Dieser, wenn auch nach momentanem Literaturstand fragwürdige Weg, könnte auf alle Furan-3-one übertragen werden.

4.1.7 Elektrochemische Oxidation

Das Spektrum der Oxidationsprodukte ausgewählter Reduktonether wurde zusätzlich mit Hilfe der Kopplung einer elektrochemischen Zelle und eines ESI-Massenspektrometers untersucht. Zur Oxidation der Verbindungen wird eine Spannung an der Zelle angelegt und ein Gradient durchlaufen, welcher sich bei den eingesetzten Verbindungen üblicherweise zwischen 0 und 2,2 V bewegt. Bei minimaler Spannung können im Massenspektrometer die Ionenspuren der Ausgangsverbindung detektiert werden und mit steigender Spannung ist der oxidative Abbau sowie die Bildung von Oxidationsprodukten direkt messbar. Aufgrund der geringen zeitlichen Verzögerung zwischen der Bildung der Abbauprodukte und der Messung können tendenziell auch hochreaktive Zwischenstufen erfasst werden. Eine Limitierung der Methode besteht darin, dass zumindest bei der verwendeten Anlage, keine MS-MS-Experimente möglich sind, um die Identität der einzelnen Molekülpeaks über gezielte Fragmentierung abzusichern. Außerdem müssen die Intensitäten der ESI-MS-Signale nicht


46

direkt mit den relativen Konzentrationen der jeweiligen Produkte korrelieren, sondern sind von der Ionisierbarkeit der jeweiligen Verbindungen abhängig. Daher dienen diese Daten nur als Unterstützung der in Abschnitt 4.1.6 diskutieren Ergebnisse.

In Abbildung 41 sind die Ionenspuren über vier Zyklen von Furaneol, dem potenziellen Triketon und der Abbauprodukte Methylglyoxal und Milchsäure aufgetragen. Ein Zyklus entspricht dem Zeitraum in dem der Spannungsgradient einmal vollständig durchlaufen wird, in diesem Fall von 0,0 V zu 2,2 V und wieder zurück auf 0,0 V. Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, werden pro Lauf mehrere Zyklen aufgezeichnet.

Abbildung 41: Ionenspuren von Furaneol, dem korrespondierenden Triketon, Methylglyoxal und Milchsäure einer EC-MS-Messung über vier Zyklen (I–IV).

Furaneol wird mit steigender Zeit und entsprechend mit steigender Spannung, oxidativ abgebaut, wodurch das Ausgangssignal der korrespondierenden Ionenspur am Detektor abfällt. Sinkt die Spannung, steigt das Furaneolsignal wieder an und erreicht bei korrekt gewählten Einstellungen die Ausgangsstärke. Analog zur sinkenden Signalintensität von Furaneol kann ein Anstieg der

050000

100000150000200000250000300000

0 10 20 30

Sign

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t

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I II III IV

0

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Sign

alin

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sitä

t

Triketon

I II III IV

01000200030004000500060007000

0 10 20 30

Sign

alin

ten

sitä

t

Zeit in min

Milchsäure

Methylglyoxal

I II III IV


47

Massenspuren 144 und 144+1, was den Nominalmassen des positiv-ionisierten Triketons und des H-Addukts des Triketons entspricht, festgestellt werden. Die maximale Signalintensität des Triketons wird vor dem Minimum von Furaneol erreicht. Die Spaltprodukte Methylglyoxal und Milchsäure werden als Folgeprodukte des Triketons zeitlich verzögert gebildet und ihre Massenspuren erreichen das jeweilige Maximum in etwa bei der minimalen Furaneolkonzentration. Mit sinkender Spannung und steigendem Furaneolgehalt fallen die Intensitäten der Abbauprodukte wieder. Grundsätzlich können also, anhand der jeweiligen Nominalmassen, die Zwischen- und Endprodukte des zuvor postulierten Reaktionsmechanismus wiedergefunden werden (vergleiche Abbildung 37).

Im Vergleich zur chemischen Oxidation mit Iod kann mittels der EC-MS-Experimente ein breiteres Produktspektrum erfasst werden (Abbildung 83 im Anhang). In den zuvor vorgestellten Versuchen wird als Abbauprodukt über den postulierten Weg nahezu ausschließlich Milchsäure gebildet. Nach der elektrochemischen Oxidation wird Methylglyoxal als Umlagerungsprodukt des postulierten Ketens gefunden. Außerdem können die Spaltprodukte, die aus der hydrolytischen β-Spaltung zwischen C-2 und C-3 hervorgehen, nachgewiesen werden (Essigsäure und 3-Hydroxy-2-oxobutanal). Die Massenspur von Brenztraubensäure deutet darauf hin, dass zudem die oxidative α-Spaltung bei der elektrochemischen Oxidation abläuft. In Kombination mit dem Signal für 2-Hydroxypropanal bzw. Hydroxyaceton könnte sogar davon ausgegangen werden, dass neben dem 1,2,3-Triketon auch ein 1,2,4-Tautomer vorliegt, welches durch hydrolytische β-Spaltung in die beiden genannten C3-Körper gespalten wird. Die elektrochemische Oxidation läuft folglich weniger gerichtet ab, als die chemische Oxidation. Für Maltol und Norfuraneol können, den gleichen Mechanismen folgend, die analogen Produkte gefunden werden, was den Ergebnissen, wenn sie auch nur auf dem Nachweis von Molekülsignalen beruhen, eine gewisse Sicherheit verleiht.

4.1.8 Einordnung der Ergebnisse

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass sich Reduktonether wie die Furan-3-one und DHHM analog zu Ascorbinsäure verhalten. Sie zeigen einerseits vergleichbare antioxidative Kapazitäten und sind andererseits in der Lage über die Wechselwirkung mit Metallen prooxidativ zu wirken. Maltol, Isomaltol und Maltosin hingegen sind aufgrund ihrer reduzierenden und komplexbildenden Eigenschaften ausschließlich antioxidativ. Als Antioxidantien innerhalb der MAILLARD-Reaktion kommt allen Reduktonethern eine höhere Bedeutung zu als den α-Dicarbonylverbindungen 1-Desoxyglucoson und Glucoson, welche deutlich schwächere antioxidative Kapazitäten im Vergleich zu Trolox besitzen.35 Im folgenden Teil der vorliegenden Arbeit werden daher die Konzentrationen von Norfuraneol, Furaneol, DHHM, Maltol und Isomaltol in verschiedenen Modellansätzen gemeinsam mit der antioxidativen Aktivität der Reaktionsgemische ermittelt, um ihren Beitrag zu dieser abschätzen zu können.

Der Abbau der heterocyclischen Reduktone führt im Gegensatz zu Ascorbinsäure nicht zu einem stabilen Triketon (Dehydroascorbinsäure) sondern zu hochreaktiven offenkettigen Tricarbonylverbindungen, welche durch β-Dicarbonylspaltungsreaktionen direkt in kurzkettige Säuren überführt werden.


48

4.2 Modellreaktionen reduzierender Kohlenhydrate in wässriger Lösung

Im Verlauf der Arbeit wurden zahlreiche Modellsysteme, bestehend aus wässrigen Lösungen von Kohlenhydraten mit und ohne Zusatz von Aminosäuren, angefertigt und untersucht. Sinn dieser Modelle war es, die komplexe stoffliche Zusammensetzung der Lebensmittelmatrix auf die wesentlichen Komponenten zu reduzieren, um so die ablaufenden Reaktionen entsprechend einzuschränken und die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern. Die meisten Reaktionen wurden bei pH 5 und pH 8 betrachtet, aber aufgrund der größeren Bedeutung im Lebensmittel werden nachfolgend in erster Linie die Ergebnisse bei einem pH-Wert von 5 vorgestellt. Neben Farbbildung und Bestimmung der antioxidativen Eigenschaften wird insbesondere auf die Bildung von heterocyclischen Intermediaten und ihren Vorstufen eingegangen.

4.2.1 Farbbildung

Die Reaktivität der eingesetzten Kohlenhydratkomponenten im Rahmen der MAILLARD-Reaktion kann anhand der auftretenden Bräunung beurteilt werden, welche sich unter anderem durch eine einfache photometrische Messung bei 420 nm erfassen lässt. In Abbildung 42 ist die Bräunung in Abhängigkeit der eingesetzten Zucker mit äquimolarem Zusatz von L-Alanin bei 130 °C und pH 5 dargestellt. Es zeigt sich, dass die Reaktivität der reduzierenden Kohlenhydrate mit steigendem Polymerisationsgrad sinkt und so haben Reaktionsgemische von D-Glucose eine stärkere Bräunung als von Maltose oder Maltotriose. Der Unterschied in der Bräunung zwischen dem Di- und Trisaccharid fällt jedoch deutlich geringer aus als zu D-Glucose, welche nahezu doppelt so stark bräunt, wie die anderen beiden Zucker. Gemeinsam ist allen drei Systemen, dass die Extinktion ab etwa 60 min nahezu linear steigt.

Abbildung 42: Farbbildung von D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5.

Der Einfluss der Aminokomponente auf die Bräunung ist in Abbildung 43 dargestellt. Die in Abwesenheit von Aminosäuren stattfindenden Karamellisierungsreaktionen führen über die gesamte

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Zeitspanne von 300 min bei 130 °C und pH 5 zu keiner messbaren Bräunung. In Gegenwart von Aminosäuren kommt es hingegen zu einer starken Farbbildung, die abhängig von der eingesetzten Aminokomponente unterschiedlich ausgeprägt ist.

Abbildung 43: Farbbildung von Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.

L-Prolin und L-Alanin zeigen bis zu einer Bräunungszeit von 180 min eine ähnliche Farbentwicklung, doch nach 300 min ist die Extinktion der Proben mit L-Alanin etwa 1,6-fach stärker. Das geringere Bräunungspotenzial von L-Prolin lässt sich darauf zurückführen, dass es sich um ein sekundäres Amin handelt und daher die Nucleophilie im Vergleich zum primären Amin L-Alanin geringer ist. Proben mit L-Lysin zeigen eine deutlich stärkere Bräunung als die der anderen beiden Aminosäuren, da L-Lysin aufgrund der zusätzlichen primären ε-Aminofunktion eine höhere Reaktivität aufweist. Die Extinktion nach 300 min ist fast drei Mal so hoch wie mit L-Alanin und fast fünf Mal so hoch wie mit L-Prolin. Diese Ergebnisse entsprechen grundsätzlich dem, was bereits in der Literatur beschrieben ist.146

Bei einem pH-Wert von 8 und ansonsten identischen Bedingungen zeigen sich die gleichen Tendenzen, nur mit dem Unterschied, dass die Bräunung der Systeme mit Aminosäure deutlich gesteigert ist (Abbildung 84 im Anhang).

4.2.2 Antioxidative Eigenschaften

Neben der Farbbildung wurden auch die Veränderungen der antioxidativen Eigenschaften untersucht, wobei sich ähnliche Zusammenhänge in Abhängigkeit der Bräunungszeit und der Edukte ergeben. So zeigen zum Beispiel Systeme mit L-Lysin höhere antioxidative Aktivitäten im TEAC-Assay als Systeme mit L-Alanin und diese zeigen wiederum höhere Aktivitäten als Systeme mit L-Prolin oder ohne Aminosäure. Wird die antioxidative Aktivität gegen die Farbe aufgetragen, ergibt sich ein linearer Zusammenhang, was darauf hindeutet, dass eine Abhängigkeit zwischen beiden Größen besteht. Abbildung 44 zeigt eine entsprechende grafische Darstellung, die sämtliche Proben der wässrigen Modellsysteme miteinbezieht. Aufgrund der geringeren Anzahl von stark gebräunten Proben ist die Dichte an Wertepaaren in diesem Bereich deutlich geringer und der Zusammenhang

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weniger offensichtlich. Bei der gesonderten Betrachtung der nur schwach gebräunten Proben ([Abs[420] x F] < 10) würde sich ein steilerer Anstieg ergeben. Grundsätzlich kann aber von einer Verknüpfung beider Größen ausgegangen werden, die nicht nur für die in dieser Arbeit beschriebenen Versuche gilt, sondern in der Literatur für zahlreiche Kombinationen von Kohlenhydraten und Aminokomponenten unter verschiedensten Bedingungen nachgewiesen werden konnte.34;25;147–149

Abbildung 44: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem TEAC-Assay) in Abhängigkeit der Farbe aller wässrigen Modellsysteme (n = 66).

Die lineare Korrelation gilt sowohl für die antioxidativen Aktivitäten, die mit dem TEAC-Assay bestimmt wurden (Abbildung 44), als auch für die antioxidativen Aktivitäten aus dem Phenanthrolinassay (Abbildung 85 im Anhang). Entsprechend besteht auch ein linearer Zusammenhang zwischen den metallreduzierenden und den radikalfangenden Eigenschaften (Abbildung 86 im Anhang). Aus dem Anstieg kann dabei abgeleitet werden, dass bei gleicher Farbe radikalfangende und metallreduzierende Substanzen im Verhältnis von etwa 1:0,28 vorhanden sind. Es sind also weniger als ein Drittel der Reduktone in der Lage Metalle zu reduzieren bzw. die metallreduzierenden Eigenschaften dieser Verbindungen werden durch Komplexbildner unterdrückt. Anhand der Ergebnisse aus Abschnitt 4.1 kann daher davon ausgegangen werden, dass stets ein relevanter Anteil von Pyranonen, Pyridinonen und verwandten Strukturen vorliegt. Dadurch bedingt ist die prooxidative Wirkung der Reaktionsmischungen durch Redoxcycling stets geringer als die antioxidative Aktivität. Gleichzeitig bedeuten diese Beobachtungen aber auch, dass bei der Anwesenheit von Reduktonen immer mit prooxidativen Einflüssen zu rechnen ist, da ein gewisser Anteil der metallreduzierenden Fähigkeiten nicht unterdrückt werden kann.

4.2.3 Abbau und Bildung von Kohlenhydraten

Der Abbau der Ausgangskohlenhydrate gibt neben der Bildung von Farbe und antioxidativen Verbindungen Aufschluss über die Reaktivität innerhalb verschiedener MAILLARD-Systeme. Anhand der Ergebnisse der Bräunungsmessungen könnte davon ausgegangen werden, dass D-Glucose gefolgt

R² = 0,9044

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von Maltose und Maltotriose das reaktivste Kohlenhydrat ist und entsprechend den stärksten Zuckerabbau aufweisen sollte. Beim Vergleich der Systeme in Abhängigkeit der eingesetzten Aminosäure wäre in der Reihenfolge L-Lysin, L-Alanin und L-Prolin eine abfallende Reaktivität zu erwarten. Für die nahezu farblosen Modelle ohne Aminosäure sollte der geringste Zuckerabbau gemessen werden können.

Wie in Abbildung 45 zu sehen, entspricht der Abbau der jeweils eingesetzten Zucker nach 300 min bei 130 °C und pH 5 weitgehend der Erwartung. Der Maltoseabbau ist in den Systemen ohne Aminokomponente und mit L-Prolin mit 6 bzw. 10 % am geringsten. Die Mittelwerte unterscheiden sich nicht statistisch signifikant voneinander, jedoch ist der Abbau für das System mit L-Prolin im Rahmen des Fehlers messbar, während dies für die Modelle ohne Aminosäure nicht der Fall ist. Entsprechend der stärkeren Bräunung kann für Maltose in Modellen mit L-Alanin eine Konzentrationsabnahme von 26 % gemessen werden. In den Systemen D-Glucose/L-Alanin und Maltose/L-Lysin sinkt die Konzentration der jeweiligen Zucker um 30 bzw. 32 %, wobei kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Mittelwerten besteht. Das Modell Maltotriose/L-Alanin zeigt einen Abbau der Kohlenhydratkomponente von etwa 15 % und ist damit in Analogie zur Bräunung vergleichbar mit den Modellen Maltose und Maltose/L-Prolin.

Neben dem Abbau der Ausgangsstoffe kann auch die Bildung anderer Kohlenhydrate beobachtet werden. So können Maltose und Maltotriose durch Hydrolyse gespalten werden und die eingesetzte bzw. freigesetzte D-Glucose kann über die LOBRY-DE-BRUYN-ALBERDA-VAN-EKENSTEIN-Umlagerung zu D-Fructose isomerisieren.150 Außerdem wird D-Glucose in der MAILLARD-Reaktion von Maltose bei der Bildung von heterocyclischen Intermediaten wie HMF und Furfural abgespalten (Abschnitt 2.1.3.5) bzw. kann durch die Hydrolyse des Disaccharids oder seiner Abbauprodukte freigesetzt werden. Die Bildung von D-Glucose in den Maltosemodellen ist in Abbildung 46 dargestellt.

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Abbildung 45: Abbau der eingesetzten Kohlenhydratkomponenten nach 300 min bei 130 °C und pH 5. Die graue Linie entspricht der Ausgangskonzentration von 200 mmol/L. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05.

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Abbildung 46: Bildung von D-Glucose in den Modellsystemen mit Maltose und Maltotriose nach 300 min bei 130 °C und pH 5. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05.

Maltose bildet in Kombination mit L-Lysin, L-Alanin, L-Prolin und ohne Aminosäure im Verlauf von 300 min bei 130 °C und pH 5 zwischen 10 und 35 mmol/L D-Glucose, wobei zu beachten ist, dass diese Konzentrationen nicht der gesamten freigesetzten D-Glucose entsprechen, da diese sofort im Rahmen der MAILLARD-Reaktion bzw. Karamellisierung wieder abgebaut werden kann. Wie aus Daten zur Bräunung und dem Kohlenhydratabbau ersichtlich wird, reagiert D-Glucose unter gleichen Bedingungen schneller als Maltose und dennoch akkumulieren nicht unerhebliche Konzentrationen des Monosaccharids. So liegen zum Beispiel im System mit L-Lysin etwa 27 % der abgebauten Maltose als D-Glucose vor, der restliche Anteil wurde in MAILLARD-Reaktionsprodukte umgesetzt. Im Fall von L-Alanin entspricht die nachgewiesene D-Glucose 18 % und im Fall von L-Prolin 23 % der abgebauten Maltose. Auch wenn die Abnahme der Maltosekonzentration in den Modellen ohne Aminosäure im Rahmen des Fehlers nicht signifikant ist, so kann durch die ermittelte D-Glucosekonzentration mindestens von einem Abbau von 4 % ausgegangen werden. Der signifikant höhere Gehalt des Monosaccharids im Modell ohne Aminokomponente gegenüber dem Modell mit L-Prolin ist wahrscheinlich auf den langsameren Abbau und die damit verbundene Akkumulation von D-Glucose unter Karamellisierungsbedingungen zurückzuführen und nicht auf eine verstärkte Bildung.

Im System Maltotriose/L-Alanin sind nach 300 min etwa (8,0 ± 0,1) mmol/L D-Glucose und (17 ± 1) mmol/L Maltose nachweisbar. Da die hydrolytische Spaltung von Maltotriose zu gleichen Teilen beide Kohlenhydrate ergibt und die freigesetzte Maltose zusätzlich in zwei Mol D-Glucose gespalten werden kann, bestätigt der geringe D-Glucosegehalt den schnelleren Abbau des Monosaccharids im Rahmen der MAILLARD-Reaktion. Ein weiterer Grund für den höheren Anteil an Maltose gegenüber D-Glucose könnte sein, dass Maltose bei der Bildung von HMF und Furfural aus Maltotriose abgespalten wird und gleichzeitig keine D-Glucose sondern die jeweiligen Sauerstoffheterocyclen entstehen.

Durch die bereits angesprochene LOBRY-DE-BRUYN-ALBERDA-VAN-EKENSTEIN-Umlagerung werden im Modellsystem D-Glucose/L-Alanin nach 300 min (9 ± 1) mmol/L D-Fructose gebildet, was etwa 5 % der anfangs enthaltenen D-Glucose entspricht. Im Maltose/L-Alanin- und Maltose/L-Lysin-Modell können,

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entsprechend des niedrigen Gehalts an D-Glucose, jeweils Spuren von D-Fructose nachgewiesen werden. Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, das D-Fructose in wässrigen Systemen unter identischen Bedingungen schneller reagiert als D-Glucose,34 weshalb der geringe Anteil an freiwerdender D-Fructose in allen Modellen schnell wieder abgebaut werden sollte.

4.2.4 Bildung von MAILLARD-Reaktionsintermediaten

Der Ablauf der MAILLARD-Reaktion in den kohlenhydratbasierten Modellen wurde durch die gezielte Analytik von α-Dicarbonylverbindungen und heterocyclischen Intermediaten genau verfolgt. Zur Bestimmung der α-Dicarbonyle wurden diese mit ortho-Phenylendiamin derivatisiert, die entstandenen Chinoxaline per RP-HPLC getrennt und mit Hilfe eines Diodenarraydetektors (DAD) unter Verwendung authentischer Standards identifiziert und quantifiziert. Dabei konnte zum einen auf einen vorhandenen Chinoxalinmixstandard bestehend aus Glucoson, 1-Desoxyglucoson, 3-Desoxyglucoson, 3-Desoxypentoson, 1,4-Didesoxyglucoson, Glyoxal, Methylglyoxal sowie Diacetyl zurückgegriffen werden und zum anderen wurden die maltosespezifischen α-Dicarbonylverbindungen Maltoson, 1-Desoxymaltoson und 3-Desoxymaltoson gezielt dargestellt. Das Chinoxalin von 1-Desoxymaltoson wurde nur zur Bestimmung der Retentionszeit und Aufnahme des DAD-Spektrums eingesetzt und die Quantifizierung über Maltoson vorgenommen. Ebenso wurde ein vorhandener 3-Desoxygalactosonstandard nur zur Identifikation verwendet und 3-Desoxygalactoson in den Proben über 3-Desoxyglucoson bestimmt.

In den Modellsystemen mit Maltotriose als Kohlenhydratkomponente konnten Peaks mit den entsprechenden Retentionszeiten und Chinoxalinspektren der maltosespezifischen α-Dicarbonyle gefunden werden, ohne dass unbekannte Peaks auftauchten, die von Maltotriosederivaten stammen könnten. Da davon auszugehen ist, dass sich die Polarität zwischen den Maltose- und Maltotriosederivaten der α-Dicarbonyle nicht so stark ändert wie bei den D-Glucose und Maltosederivaten, koeluieren diese wahrscheinlich. Wenn daher im Folgenden Konzentrationen von maltosespezifischen α-Dicarbonylverbindungen für Maltotriosemodelle angegeben werden, so handelt es sich daher möglicherweise um die Summe aus Maltotriose- und Maltosederivaten.

Die heterocyclischen Intermediate wurden nach Extraktion mit Ethylacetat aus den Reaktionslösungen mittels GC-MS analysiert, um einen Überblick der gebildeten Komponenten zu erhalten. HMF und Furfural wurden ohne Aufarbeitung mit einer RP-HPLC-DAD-Methode bestimmt. Die Heterocyclen werden mit den α-Dicarbonylverbindungen gemeinsam diskutiert, da ihr Auftreten in den Proben als Vorstufen bzw. Folgeprodukte stark miteinander verknüpft ist.

4.2.4.1 Bildung von α-Dicarbonylverbindungen

Bevor die Bildung und die Reaktionswege der Osone, 1-Desoxyosone und 3-Desoxyosone sowie ihrer Folgeprodukte im Detail betrachtet werden, wird zuvor ein Vergleich hinsichtlich der Bildung von α-Dicarbonylen aus D-Glucose und Maltose vorgenommen, um diese Ergebnisse in verfügbare Literaturdaten einzuordnen. MORITA et al.151 gelang Mitte der Achtziger Jahre der Nachweis von Maltoson, 1-Desoxymaltoson und 3-Desoxymaltoson in Form ihrer jeweiligen Chinoxalinderivate aus Maltose unter leicht sauren Bedingungen. Als Lösungsmittel wurde 80 % Methanol verwendet und das Disaccharid direkt mit ortho-Phenylendiamin als Aminokomponente und Derivatisierungsreagenz unter Stickstoffatmosphäre umgesetzt. Diese Bedingungen ermöglichen zwar grundsätzliche


54

Aussagen zum Mechanismus und bestätigen die Existenz der maltosespezifischen α-Dicarbonylverbindungen, doch sie sind nicht repräsentativ für die Matrix von Lebensmitteln. In einer Studie, die 1989 veröffentlicht wurde, beschreiben BECK et al.152 die Bildung der beiden Disacchariddesoxyosone aus AMADORI-Produkten der Maltose. Die Modellinkubationen wurden zwar in Wasser bzw. Phosphatpuffer durchgeführt, aber die eingesetzten Aminokomponenten Propylamin und Piperidin sind wiederum untypisch für Lebensmittel. Umfangreiche Untersuchungen zur MAILLARD-Chemie der Maltose, auf welche sich auch Teile der theoretischen Grundlagen stützen (Abschnitt 2.1.3.1), wurden von SMUDA et al.43 in jüngerer Vergangenheit durchgeführt. Den Autoren gelang es, neben den drei genannten maltosespezifischen α-Dicarbonylen zahlreiche weitere α-Dicarbonylverbindungen zu identifizieren und viele, der von D-Glucose bekannten Reaktionswege, auf Maltose zu übertragen. Die Bedingungen der durchgeführten Maltoseinkubationen waren eher mild und entsprechen beschleunigten Lagerungsversuchen oder beschleunigten Versuchen unter physiologischen Bedingungen (50 °C; 100 mM Phophastpuffer pH 7,4; 7 Tage). Als Aminokomponente wurde L-Lysin im Verhältnis 1:1 zum Kohlenhydrat eingesetzt (42 mmol/L), was die Ergebnisse in einem gewissen Rahmen zu dieser Arbeit vergleichbar macht. Neben der deutlich höheren Temperatur in der vorliegenden Untersuchung ist ein weiterer kritischer Unterschied zu den Daten von SMUDA et al.43 der in deren Experimenten genutzte Phosphatpuffer. Er beeinflusst den Verlauf der Reaktion in dem zum einen der pH-Wert leicht basisch gehalten wird, während dieser in ungepufferten Systemen im Verlauf der MAILLARD-Reaktion immer absinkt. Zum anderen katalysiert er die Ringöffnung verschiedener Intermediate, wodurch die Reaktion generell beschleunigt wird.153 Doch gerade wegen dieser Unterschiede ist der Vergleich im Weiteren von Interesse.

Die Konzentrationen der α-Dicarbonylverbindungen mit vollständig erhaltenem Kohlenstoffgrundgerüst aus der MAILLARD-Reaktion von D-Glucose bzw. Maltose mit L-Alanin nach 120 min bei 130 °C und pH 5 sind in Abbildung 47 gegenübergestellt. Unter identischen Bedingungen werden aus beiden Kohlenhydraten das jeweilige Oson, das 1-Desoxyoson und das 3-Desoxyoson gebildet, wobei die Summe der drei Verbindungen im Fall D-Glucose insbesondere durch die höhere 3-Desoxyglucosonkonzentration größer ist. Letzteres wird im Gegensatz zu Glucoson und 1-Desoxyglucoson auch aus Maltose gebildet, aber auch bei Berücksichtigung seiner Konzentration bleibt die Summe für Maltose deutlich kleiner. Dies entspricht der Erwartung aufgrund der schwächeren Bräunung des Disaccharids im Verhältnis zum Monosaccharid.

Der Gehalt des jeweiligen Osons ist mit (26 ± 6) und (31 ± 7) mmol/L im Rahmen des Fehlers identisch. Die Konzentration von 1-Desoxymaltoson ist absolut gegenüber 1-Desoxyglucoson signifikant erhöht und das Verhältnis zwischen der jeweiligen 1- und 3-Desoxykomponente verändert sich von D-Glucose zu Maltose deutlich. Während es im Fall des Disaccharids fast 1:1 ist, ist es beim Monosaccharid 1:6, womit sich sowohl unterschiedliche Bildungs- als auch Abbaukinetiken andeuten, welche in den folgenden Kapiteln genauer behandelt werden. Die Trends des L-Alaninmodells sind auch für die Modelle der anderen Aminosäuren gültig, nur das die Konzentrationen mit L-Prolin im Allgemeinen niedriger und mit L-Lysin höher sind.


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Abbildung 47: Bildung von Glucoson, 1-Desoxyglucoson und 3-Desoxyglucoson aus D-Glucose und L-Alanin sowie von Maltoson, 1-Desoxymaltoson und 3-Desoxymaltoson aus Maltose und L-Alanin nach 120 min bei 130 °C und pH 5. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05.

Die Ergebnisse dieser Arbeit unterscheiden sich, aufgrund der stark abweichenden Bedingungen, drastisch von den durch SMUDA et al.43 gemachten Beobachtungen. Bei 50 °C konnte nach sieben Tagen 1-Desoxymaltoson als Hauptkomponente identifiziert werden, während geringe Mengen Maltoson und Spuren von 3-Desoxymaltoson nachgewiesen werden konnten. Die Konzentration von 1-Desoxyglucoson war um mehr als eine Zehnerpotenz geringer als die des Disaccharidderivats und entsprechend niedriger war auch der Gehalt an Glucoson. 3-Desoxyglucoson konnte in ähnlich geringen Konzentrationen wie das Disaccharidderivat nachgewiesen werden. Während sich bei 130 °C und pH 5 in erster Linie die Gehalte des jeweiligen 3-Desoxyosons unterscheiden, bestehen im System bei 50 °C und pH 7,4 grundlegende Unterschiede im α-Dicarbonylspektrum ausgehend von D-Glucose154 und Maltose43 (vergleiche Abbildung 47 und Abbildung 87 im Anhang). Es kann folglich von einer deutlichen Verlagerung der Reaktionswege in Abhängigkeit der Bedingungen gesprochen werden. Dennoch zeigen die bekannten Literaturdaten wie auch die Resultate dieser Arbeit, dass aus Maltose primär α-Dicarbonylverbindungen mit intaktem Kohlenhydratgrundgerüst hervorgehen.

Neben den bereits angesprochenen Verbindungen werden bei 130 °C und pH 5 aus beiden Kohlenhydraten ähnliche Mengen an 3-Desoxygalactoson (knapp unter 100 µmol/L) und 1,4-Didesoxyglucoson (knapp unter 10 µmol/L) gebildet. Ein deutlicher Unterschied ergibt sich im Gehalt von 3-Desoxypentoson, welches in Modellen mit D-Glucose nur in Spuren nachweisbar ist und aus Maltose in einer Konzentration von 48 µmol/L entsteht.

4.2.4.2 Bildung von HMF aus 3-Desoxyosonen

Bei der Analyse der α-Dicarbonylverbindungen kann in allen Maltosemodellen unter den jeweils gewählten Bedingungen 3-Desoxymaltoson als Hauptkomponente identifiziert werden. Dabei ergeben sich, wie in Abbildung 48 dargestellt, in Abhängigkeit der eingesetzten Aminosäure Trends, die denen der bisherigen Analysen entsprechen. So bildet Maltose mit L-Lysin die höchsten 3-Desoxymaltosonkonzentrationen im Vergleich der drei Aminokomponenten ((459 ± 13) µmol/L

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nach 300 min), während mit L-Prolin am wenigsten gebildet wird ((59 ± 7) µmol/L) und sich die Modelle mit L-Alanin dazwischen einordnen ((139 ± 5) µmol/L). Innerhalb der ersten 60 min ist in allen Fällen bereits mehr als die Hälfte der Endkonzentration (300 min) gebildet und die messbaren Konzentrationen steigen in den letzten drei Stunden langsamer an. Da die finalen Konzentrationen, aufgrund des Charakters der α-Dicarbonyle als Intermediate, nicht nur von deren Bildung, sondern auch von deren Folgereaktionen abhängig sind, ist ihre Stagnation nicht zwangsweise ein Zeichen für verminderte Aufbaureaktionen, sondern kann auch auf den verstärkten Abbau hindeuten. Da die Ausgangsstoffe in Form der reduzierenden Kohlenhydrate auch nach 300 min in allen Fällen noch zum Großteil vorhanden sind, ist eher von letzterem auszugehen.

Eine Besonderheit, die den bisherigen Trends widerspricht, ist der Konzentrationsverlauf von 3-Desoxymaltoson der sich aus den Modellen ohne Aminosäure ergibt. Während dieses System die geringste Bräunung, den niedrigsten Zuckerabbau und die schwächsten antioxidativen Eigenschaften aller Maltosemodellsysteme aufweist, zeigt es bei 30 min Erhitzungszeit sogar die höchsten Konzentrationen an 3-Desoxymaltoson. Ab 60 min werden identische Mengen wie bei Anwesenheit von L-Lysin detektiert und ab 120 min fallen die Konzentrationen unter dieses Niveau. Die Endkonzentration ist mit (310 ± 35) µmol/L aber immer noch höher als die Konzentrationen, die mit Aminokatalyse durch L-Alanin oder L-Prolin erreicht werden. Aufgrund der geringen Bräunung ist jedoch in diesem Fall eher von einer verstärkten Akkumulation des 3-Desoxymaltosons bedingt durch die langsame Weiterreaktion des α-Dicarbonyls auszugehen.

Abbildung 48: Bildung von 3-Desoxymaltoson aus Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.

Das Konzentrationsverhalten von 3-Desoxymaltoson lässt sich besser einordnen, wenn es im Kontext der Bildung seines Folgeproduktes HMF gesehen wird (Abbildung 49). Dabei kann unabhängig von der Aminokomponente festgestellt werden, dass die Konzentration von 3-Desoxymaltoson langsamer zunimmt, sobald ab 30 bis 60 min der Gehalt von HMF zu steigen beginnt. Wie schnell 3-Desoxymaltoson umgesetzt wird, ist daran ersichtlich, dass die HMF-Konzentration um den Faktor 8 (L-Prolin) bis 14 (L-Lysin) höher ist als die seiner Vorstufe. Im Gegensatz zum 3-Desoxymaltosongehalt steigt der Gehalt von HMF ab 30 min linear an, was darauf schließen lässt, dass der Heterocyclus langsamer als das α-Dicarbonyl Folgereaktionen eingeht.

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Abbildung 49: Bildung von HMF aus Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.

Trotz der höheren intermediären Konzentration an 3-Desoxymaltoson des Systems ohne Aminokomponente verläuft die Bildung von HMF bis 180 min identisch zum System mit L-Alanin, aber erreicht nach 300 min mit (1700 ± 40) µmol/L eine geringfügig niedrigere Konzentration. Daraus lässt sich schließen, dass der höhere Gehalt der α-Dicarbonylvorstufe ohne Aminosäure tatsächlich in der langsameren Abbaureaktion zu HMF begründet ist. Das System mit L-Prolin weist analog zur im Vergleich geringsten 3-Desoxymaltosonkonzentration auch den niedrigsten HMF-Gehalt auf. Dieser Reaktionspfad scheint im Fall des sekundären Amins selbst gegenüber dem System ohne Aminosäure gehemmt zu sein.

In der MAILLARD-Reaktion der Maltose kann HMF nicht nur aus 3-Desoxymaltoson 7b, sondern auch aus 3-Desoxyglucoson 7a gebildet werden, welches entweder von der freigesetzten D-Glucose stammen kann oder zusammen mit 3-Desoxygalactoson 49 als Nebenprodukt beim Abbau von 3-Desoxymaltoson 7b entsteht (Abbildung 50). Das gemeinsame Zwischenprodukt, das die drei genannten 3-Desoxyosone auf ihrem Weg zum HMF verknüpft, ist 3,4-Didesoxyglucoson-3-en 48. Während 48 durch Addition von Wasser in die beiden C6-α-Dicarbonyle überführt werden kann, ist die Rückreaktion zu 3-Desoxymaltoson 7b durch Addition von D-Glucose sehr unwahrscheinlich. Dafür sollte die entsprechende Eliminierungsreaktion zu 48 im Vergleich zu den Monosaccharidderivaten deutlich bevorzugt ablaufen, da D-Glucose eine bessere Abgangsgruppe als Wasser ist.62

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Abbildung 50: Abbau von 3-Desoxymaltoson 7b zu HMF 16 über 3,4-Didesoxyglucoson-3-en 48 als Zwischenstufe. Als Nebenprodukte werden 3-Desoxyglucoson 7a und 3-Desoxygalactoson 49 gebildet.

Anhand der gemessenen HMF-Konzentrationen in den Modellen, ausgehend von den drei Kohlenhydraten D-Glucose, Maltose und Maltotriose in Kombination mit L-Alanin, kann abgeleitet werden, dass Maltose und Maltotriose bzw. die korrespondierenden 3-Desoxyosone tatsächlich mehr HMF bilden (Abbildung 51). Obwohl das System mit D-Glucose als Kohlenhydratkomponente am meisten 3-Desoxyosone beinhaltet, weist es die geringste Menge an HMF auf. Die Modelle mit Maltose und Maltotriose bilden jeweils nur knapp die Hälfte an 3-Desoxyosonen, aber zeigen signifikant höhere HMF-Gehalte, wobei das System mit Maltose eine 70 % größere und das mit Maltotriose eine 45 % größere Konzentration erreicht. Dass Maltotriose trotz identischer Intermediärkonzentration an 3-Desoxykomponenten signifikant weniger HMF bildet als Maltose, mag darauf zurückzuführen sein, dass sich Maltose und D-Glucose in ihrer Qualität als Abgangsgruppe gegenüber Wasser nicht stark unterscheiden, aber die Reaktionsträgheit vom Disaccharid zum Trisaccharid zunimmt. Die grafischen Darstellungen der Konzentrationsverläufe beider α-Dicarbonylkomponenten sowie von HMF in Abhängigkeit der Zeit sind im Anhang als Abbildung 90 bis Abbildung 94 zu finden.

Darüber hinaus kann festgestellt werden, dass ausgehend von D-Glucose 3-Desoxyglucoson und -galactoson nach 300 min ungefähr im Verhältnis 7:1 vorliegen, während im Fall von Maltose und Maltotriose etwa ein Verhältnis von 2:1 festgestellt werden kann (Abbildung 51 und Abbildung 88 im Anhang). Diese Beobachtung ist darauf zurückzuführen, dass in den Systemen der Oligosaccharide nur geringe Mengen an D-Glucose vorliegen und die Bildung der C6-3-Desoxyosone in ihrem Fall fast ausschließlich über 3,4-Didesoxyglucoson-3-en erfolgt. In den D-Glucosemodellen ist hingegen immer


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ein deutlicher Überschuss an 3-Desoxyglucoson vorhanden, da dieses direkt aus dem Monosaccharid bzw. dem entsprechenden AMADORI-Produkt gebildet wird.

Abbildung 51: Gegenüberstellung der Konzentrationen von allen 3-Desoxyosonen und HMF für die Modellsysteme D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin nach 300 min bei 130 °C und pH 5. Die Summe von 3-Desoxymaltoson, 3-Desoxyglucoson und 3-Desoxygalactoson ist als ∑ 3-DX angegeben. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05 (die p-Werte wurden nur innerhalb der Gruppen 3-DM, 3-DG, 3-DGal, ∑ 3-DX und HMF berechnet).

Das Verhältnis der beiden 3-Desoxyverbindungen zueinander ist nicht statisch, sondern verändert sich im Verlauf der Bräunung. Alle Systeme mit Maltose zeigen nach 30 min Erhitzungszeit etwa gleich hohe Konzentrationen beider α-Dicarbonyle (Abbildung 89 im Anhang), was darauf hindeutet, dass sie zu etwa gleichen Anteilen aus dem ungesättigten 3,4-Desoxyoson hervorgehen. Doch das Verhältnis verschiebt sich mit zunehmender Erhitzungszeit zu Gunsten von 3-Desoxyglucoson, wobei je nach eingesetzter Aminokomponente nach 300 min die 1,5- (ohne Aminosäure) bis 3-fache (L-Lysin) Menge des D-Glucosederivats vorliegt. Eine wahrscheinliche Erklärung für diese Verschiebung ist, dass im Laufe der Bräunung vermehrt 3-Desoxyglucoson aus der freigesetzten D-Glucose gebildet wird.

Grundsätzlich zeigt sich, dass 3-Desoxymaltoson die dominante α-Dicarbonylkomponente und ihr Folgeprodukt HMF der quantitativ bedeutendste Heterocyclus in der MAILLARD-Reaktion von Maltose in wässriger Lösung bei 130 °C ist. Ab 60 min stagniert die intermediäre Konzentration sämtlicher 3-Desoxyosone aufgrund des einsetzenden Abbaus der α-Dicarbonyle zu HMF. Der stetige Anstieg der HMF-Konzentration deutet darauf hin, dass HMF langsamer weiterreagiert als seine Vorstufen. Die signifikant höheren HMF-Gehalte in den Modellen von Maltose und Maltotriose legen nahe, dass die Bildung der relevanten Zwischenstufe aufgrund der besseren Abgangsgruppen in Form von Kohlenhydraten im Vergleich zur Entstehung aus 3-Desoxyglucoson bevorzugt abläuft.

4.2.4.3 Abbauprodukte der 1-Desoxyosone

Die 1-Desoxyosone sind nach den 3-Desoxyosonen die quantitativ bedeutendsten α-Dicarbonylverbindungen in den untersuchten Modellsystemen, wobei aus Maltose nahezu

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ausschließlich 1-Desoxymaltoson hervorgeht und die Bildung von 1-Desoxyglucoson nur eine untergeordnete Rolle spielt. Lediglich im System mit L-Lysin kann nach 180 min Erhitzungszeit 1-Desoxyglucoson nachgewiesen werden, wobei nach 300 min nur eine Konzentration von (34 ± 3) µmol/L erreicht wird. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass 1-Desoxyglucoson in Maltosemodellen nur aus freigesetzter D-Glucose gebildet werden kann, während 3-Desoxyglucoson auch durch die zuvor beschriebene Umlagerung aus 3-Desoxymaltoson hervorgeht. Da aber die Konzentration an D-Glucose im Modell mit L-Alanin nach 300 min Erhitzungszeit nur (18,4 ± 0,3) mmol/L entspricht und selbst im korrespondierenden D-Glucosesystem (200 mmol/L) höchstens (93 ± 8) µmol/L 1-Desoxyglucoson nachweisbar sind, wird ersichtlich, warum 1-Desoxyglucoson in Maltosesystemen nicht in relevanten Mengen auftritt.

Die gebildeten Mengen an 1-Desoxymaltoson in Abhängigkeit der Aminokomponente folgen wieder dem Trend der Bräunung, wobei in Modellen ohne Aminosäure nur Spuren gebildet werden und die gefundenen Gehalte von L-Prolin über L-Alanin zu L-Lysin zunehmen (Abbildung 52). Während die Konzentration in den Modellen mit L-Prolin im Verlauf von 300 min nahezu linear auf (99 ± 11) µmol/L ansteigt, flachen die Kurven der L-Alanin- und L-Lysinsysteme sichtbar ab und es werden Gehalte von (162 ± 3) bzw. (272 ± 16) µmol/L erreicht. Damit zeigt sich, wie auch bei den 3-Desoxyosonen, der verstärkte Abbau zu den entsprechenden Folgeprodukten.

Abbildung 52: Bildung von 1-Desoxymaltoson aus Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.

Wie in Abschnitt 2.1.3.4 gezeigt, geht aus den 1-Desoxyosonen eine große Anzahl an heterocyclischen Intermediaten unterschiedlicher Verbindungsklassen hervor, wobei die Pyran-4-one als die Hauptabbauprodukte bekannt sind. Die Bildung von DHHM und Maltol im Verlauf der MAILLARD-Reaktion von Maltose mit verschiedenen Aminosäuren ist in Abbildung 53 und Abbildung 54 dargestellt. Obwohl sich die nachweisbaren Konzentrationen von 1-Desoxymaltoson und 3-Desoxymaltoson um den Faktor 2 unterscheiden, lassen sich die Pyran-4-one im Vergleich zu HMF nur in 10-fach geringeren Mengen nachweisen. Mit Ausnahme des Maltolgehalts im System Maltose/L-Alanin, deutet sich für die anderen Systeme ein Abflachen der Konzentrationsanstiege beider Reduktonether im Verlauf der Erhitzungszeit an. Dies spricht neben den deutlich geringen Quantitäten für einen stärkeren Abbau der Pyran-4-one im Vergleich zu HMF.

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Abbildung 53: Bildung von DHHM aus Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.

Die Trends der DHHM-Bildung entsprechen dem Bräunungspotenzial der verschiedenen Modellsysteme und so werden mit L-Lysin (237 ± 10) µmol/L, mit L-Alanin (138 ± 3) µmol/L und mit L-Prolin (113 ± 1) µmol/L gebildet. Das Entstehen von DHHM legt nahe, dass in Anwesenheit aller eingesetzten Aminokomponenten intermediär 1-Desoxyglucoson gebildet wird, auch wenn es nur im Fall von L-Lysin nachweisbar ist. Wie bereits angesprochen bildet sich in Modellen mit L-Alanin ab 30 min Maltol, wobei die Konzentration nahezu linear ansteigt und nach 300 min mit (171 ± 2) µmol/L die höchste Konzentration von allen betrachteten Kombinationen aus Maltose und einer Aminokomponente erreicht. In den Systemen mit L-Prolin und L-Lysin werden mit (87 ± 7) bzw. (112 ± 6) µmol/L geringere Konzentrationen gebildet und ohne Anwesenheit einer Aminosäure ist weder Maltol noch DHHM nachweisbar.

Abbildung 54: Bildung von Maltol aus Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.

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Außer den beiden Pyran-4-onen werden noch die Furane Isomaltol und 2-Acetylfuran als Abbauprodukte von 1-Desoxyosonen in der Literatur beschrieben. Der Reduktonether Isomaltol kann nur bei Anwesenheit von L-Lysin in einer Konzentration von (34 ± 5) µmol/L nach 300 min nachgewiesen werden. Die Konzentrationsentwickung von 2-Acetylfuran in Abhängigkeit der eingesetzten Aminokomponente ist in Abbildung 95 im Anhang dargestellt. Die zu beobachtenden Trends entsprechen denen von DHHM, wobei jedoch insgesamt um etwa Faktor 2,5 bis 3 niedrigere Gehalte nachgewiesen werden können. Der im Gegensatz zur Isomaltolbildung notwendige Reduktionsschritt (siehe Abschnitt 2.1.3.5) kann durch die Oxidation der zuvor gebildeten Reduktone, wie den Osonen oder 1-Desoxyosonen sowie der Reduktonether, in Form der Pyran-4-one und Isomaltol, erfolgen. 1,4-Didesoxyglucoson kann als entsprechende Zwischenstufe nachgewiesen werden, wobei sich, analog zu HOLLNAGEL,155 nur geringfügige Unterschiede der intermediären Konzentrationen von Modellen mit D-Glucose und Maltose ergeben (Abbildung 96 im Anhang).

Die Furan-3-one Furaneol und Norfuraneol konnten nicht bzw. nur in Spuren nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass sie im Vergleich zu den anderen Heterocyclen in der MAILLARD-Reaktion der Maltose nur eine untergeordnete Rolle spielen.

Zusammenfassend lässt sich für die 1-Desoxyosone festhalten, dass sie nach den 3-Desoxyosonen intermediär die höchsten Konzentrationen in den Maltosemodellen erreichen. Allerdings sind in ihrem Fall nur die Maltosederivate nachweisbar, da die Bildung von 1-Desoxyglucoson ausschließlich aus D-Glucose erfolgt und nicht auch aus dem entsprechenden α-Dicarbonylderivat des Disaccharids möglich ist. Da aber auch ausgehend von Maltose DHHM nachweisbar ist, muss auch in den Modellen des Disaccharids 1-Desoxyglucoson aus freigesetzter D-Glucose gebildet werden, welches jedoch sofort wieder abgebaut wird. Die DHHM-Konzentration ist unter gleichen Bedingungen jedoch geringer als im Modell auf Basis von D-Glucose. Als maltosespezifisches Abbauprodukt wird in etwa 50 % niedrigeren Konzentrationen zusätzlich das Pyranon Maltol gebildet. 2-Acetylfuran kann in Maltosemodellen mit Aminosäure in geringen Konzentrationen gefunden werden und ist in D-Glucosemodellen nicht nachweisbar. Furaneol und Isomaltol können nur in Kombination mit L-Lysin in Spuren detektiert werden.

Die antioxidativen Eigenschaften der Reaktionsgemische können nicht allein auf die nachgewiesenen Reduktone und Reduktonether zurückgeführt werden. Ihre Konzentrationen steigen zwar tendenziell mit zunehmender Bräunungszeit und damit gemeinsam mit der Bräunung an, erreichen aber selbst kombiniert nur Konzentrationen von weniger als 1 mmol/L, während die antioxidative Aktivität der Modelle in Troloxäquivalenten im zweistelligen mmol/L-Bereich liegt. Wenn, basierend auf den Ergebnissen der isolierten Substanzen (siehe vorhergehende Untersuchungen35 und Abbildung 32), davon ausgegangen wird, dass die antioxidativen MAILLARD-Reaktionsprodukte zum Teil geringere antioxidative Kapazitäten als Trolox im TEAC-Assay aufweisen, so ist die Differenz noch größer. Neben den untersuchten Verbindungen müssen folglich zahlreiche weitere Verbindungen mit antioxidativen Eigenschaften vorliegen, wobei insbesondere die polymeren, farbgebenden Melanoidine eine Rolle spielen sollten.

4.2.4.4 Bildung von Furfural aus Osonen

Das quantitativ in vergleichbaren Mengen zu den Pyran-4-onen gebildete Furan Furfural ist ein typisches Abbauprodukt der Osone. Sowohl ausgehend von D-Glucose als auch von Maltose ist


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3-Desoxypentoson dabei die relevante Zwischenstufe, welche, wie auch die bisher beschriebenen α-Dicarbonylverbindungen, als Chinoxalinderivat quantifiziert werden kann. Da die Peaks der Analyten Glucoson, Maltoson und 1-Desoxymaltoson nicht Basisliniengetrennt sind und diese Verbindungen in sehr unterschiedlichen Konzentrationen auftreten, ist es nur bedingt möglich mit Hilfe eines Diodenarraydetektors genau zu quantifizieren. 1-Desoxymaltoson ist etwa in 4- bis 7-fach höheren Gehalten als Maltoson in den Proben enthalten und kann daher mit einem geringen Fehler neben den Osonen bestimmt werden (vergleiche Abbildung 52), während die Konzentration der Letzteren nicht oder nur mit großen Abweichungen erfasst werden kann. Die höchsten Gehalte werden im Modellsystem ohne Aminosäure gebildet, wobei die Maltosonkonzentration nach 60 min auf rund 50 µmol/L ansteigt und anschließend absinkt. Jeweils niedrigere Mengen an Maltoson können in Modellen mit L-Alanin und L-Prolin nachgewiesen werden. Im System mit L-Lysin kann das α-Dicarbonyl sogar nur zwischen 30 und 60 min bestimmt werden, wobei die gemessenen Konzentrationen am geringsten von allen Maltosemodellen sind.

Eine Besonderheit stellt die Beobachtung dar, dass Maltoson in geringen Konzentrationen von etwa 10 µmol/L bereits in den nicht erhitzten Proben nachgewiesen werden kann, während alle anderen α-Dicarbonylverbindungen erst unter Hitzeeinwirkung gebildet werden. Damit deutet sich an, dass die metallkatalysierte Oxidation von Maltose bzw. dem entsprechenden AMADORI-Produkt auch bei Raumtemperatur abläuft. Analog dazu kann auch die Bildung von Glucoson aus D-Glucose in den Kontrollproben festgestellt werden. In diesen Modellen stellt sich nach 180 min Erhitzungszeit eine Konzentration von 30 µmol/L ein, welche anschließend leicht sinkt.

Abbildung 55: Bildung von 3-Desoxypentoson aus D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5.

Aus beiden Osonen kann über die zuvor beschriebenen Mechanismen 3-Desoxypentoson gebildet werden (siehe Abschnitt 2.1.3.5), wobei SMUDA et al.43 davon ausgehen, dass dessen Bildung aus Maltoson verstärkt abläuft. Grund ist, dass vergleichbar zum Abbau von 3-Desoxymaltoson, die Eliminierung von D-Glucose, aufgrund der besseren Eigenschaften als Abgangsgruppe im Vergleich zu Wasser, bevorzugt abläuft. Dass die Reaktion im Fall des Disaccharids tatsächlich in Richtung 3-Desoxypentosonbildung verschoben wird, kann in den Modellreaktionen mit L-Alanin in Kombination mit verschiedenen Kohlenhydraten nachvollzogen werden (Abbildung 55). Während das

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C5-α-Dicarbonyl in den MAILLARD-Modellen von D-Glucose nur in geringen Konzentrationen von weniger als 5 µmol/L nachweisbar ist, zählt es in den Systemen mit Maltose und Maltotriose zu den dominanten Komponenten. Im Fall der beiden oligomeren Kohlenhydrate steigt der 3-Desoxypentosongehalt bis 180 min nahezu linear und erreicht mit knapp unter 50 µmol/L bei identischen Bedingungen fast den 10-fachen Gehalt im Vergleich zu Modellen mit D-Glucose. Nach 300 min Erhitzungszeit differenzieren sich das Di- und Trisaccharid, wobei Maltose eine Endkonzentration von (92 ± 3) µmol/L und Maltotriose von (52 ± 2) µmol/L erreicht. Wie zuvor beim Abbau von 3-Desoxymaltoson scheinen die Vorteile von Maltose gegenüber D-Glucose als Abgangsgruppe marginal zu sein, während die Reaktionsträgheit des Trisaccharids möglicherweise größere Bedeutung hat.

Obwohl das System ohne Aminokomponente im Vergleich zu den MAILLARD-Modellen die höchsten Maltosonkonzentrationen aufweist, können intermediär nur Spuren des Abbauproduktes 3-Desoxypentoson nachgewiesen werden (Abbildung 97 im Anhang). Die Modelle mit L-Alanin und L-Prolin folgen dem üblichen Trend der Bräunung und bilden jeweils höhere Gehalte des C5-α-Dicarbonyls. In Kombination mit L-Lysin werden in den ersten 120 min ähnliche Konzentrationen wie mit L-Alanin erreicht, doch die Konzentrationen steigen anschließend langsamer an und bleiben mit (21 ± 1) µmol/L unterhalb der Modelle von L-Prolin ((35 ± 4) µmol/L). Somit deutet sich im L-Lysinsystem im Vergleich zu den anderen Modellen ein verstärkter Abbau zu Furfural an, welcher im Weiteren allerdings nur bedingt nachvollziehbar ist.

Abbildung 56: Bildung von Furfural aus D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5.

Trotz des niedrigen 3-Desoxypentosongehalts zeigt das System mit D-Glucose und L-Alanin im Verlauf der Bräunung ähnliche Furfuralkonzentrationen wie das entsprechende Maltotriosesystem und es werden nach 300 min (45 ± 13) bzw. (62 ± 4) µmol/L erreicht (Abbildung 56). Dieser Zusammenhang lässt sich mit den zur Verfügung stehenden Daten nur schwer erklären, da die Abbaureaktionen des C5-α-Dicarbonyls von der jeweiligen Kohlenhydratkomponente unabhängig sein sollten. Grund für die Unterschiede könnten Folgereaktionen mit spezifischen Abbauprodukten des Mono- oder Trisaccharids sein, die im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht wurden. Die Endkonzentration in Kombination mit Maltose ist mit (143 ± 10) µmol/L mehr als doppelt so hoch wie

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die der anderen beiden Zucker und korrespondiert mit dem im Vergleich größeren Gehalt der Vorstufe 3-Desoxypentoson.

Die Furfuralbildung in Abhängigkeit von Aminosäuren folgt einem ähnlichen Trend wie die Bildung der Vorläuferverbindung 3-Desoxypentoson (Abbildung 97 im Anhang): Maltose mit L-Alanin entwickelt die höchste Konzentration von (143 ± 10) µmol/L gefolgt von Modellen mit L-Lysin, welche bis 180 min identische Gehalte aufweisen, aber nach 300 min nur (90 ± 9) µmol/L erreichen. Der schnelle Abbau von Furfural in Kombination mit L-Lysin im Vergleich zu den anderen Aminokomponenten kann auf spezielle Reaktionen der ε-Aminofunktion zurückzuführen sein. Möglich wäre die Bildung von Pyrrolderivaten vergleichbar mit γ-Aminobuttersäure156;157 oder spezifischer Abbauprodukte wie dem Furpipat, welches durch Kondensation von L-Lysin mit der Aldehydfunktion von Furfural gebildet wird.158 Schnelle Folgereaktionen von Furfural würden es aus dem Gleichgewicht der Bildungsreaktion entziehen, was zu dem verstärkten Abbau passt, der für die Vorstufe 3-Desoxypentoson beobachtet wird.

Die Osone sind in MAILLARD-Modellen der Maltose im Vergleich zu den Desoxyosonen nur in geringen Konzentrationen nachweisbar, während ihr Hauptabbauprodukt in Form von 3-Desoxypentoson entscheidenden Anteil am Spektrum der quantifizierbaren α-Dicarbonylverbindungen hat. Ähnlich zu den 1-Desoxyosonen ist Glucoson in Maltosesystemen nicht nachweisbar, was seiner hohen Reaktivität geschuldet sein mag. Vergleichbar zu HMF wird Furfural aus Di- und Trisacchariden in höheren Gehalten gebildet als aus D-Glucose, da die Kohlenhydrate bessere Abgangsgruppen sind als Wasser.43;58;62

4.2.5 Bildung von hochmolekularen Verbindungen

Um Rückschlüsse über die Bildung von hochmolekularen Verbindungen aus den eingesetzten Edukten zu erhalten, wurden die Proben nach 300 min Erhitzungszeit mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) untersucht. Dazu wurden die jeweiligen Lösungen direkt eingesetzt, ohne die Melanoidine zuvor aufzukonzentrieren oder zu isolieren. Die Detektion der verschiedenen Molekülgewichtsdomänen erfolgte über die Absorption bei 420 nm (Abs[420]), um braungefärbte Produkte der MAILLARD-Reaktion zu erfassen, und über den Brechungsindex (RI), um auch ungefärbte Verbindungen zu detektieren. Die eingesetzten Trennsäulen separieren linear verknüpfte Kohlenhydrate zwischen Molekulargewichten von etwa 342 Da (Saccharose; 21 min Retentionszeit) bis 1,66 MDa (Pullulanstandard P-1600; 15 min Retentionszeit). Ein Beispiel für eine Kalibrierung mit Pullulanen und Saccharose ist in Abbildung 100 im Anhang gegeben. Bei etwa 10 MDa ist die Ausschlussgrenze der Säulen erreicht, was in etwa einer Retentionszeit von 13 min entspricht. Diese Werte stellen jedoch nur eine Orientierung dar, da neben der Molekülmasse unter anderem der Verzweigungsgrad und die Ladung des Polymers Einfluss auf die Retentionszeit haben. Die Bestimmung des exakten Molekulargewichts unbekannter und inhomogener Polymere wie den Melanoidinen ist also mittels GPC nicht möglich. Da jedoch unter konstanten Bedingungen gemessen wird, können die Chromatogramme qualitativ verglichen werden. Innerhalb dieser Arbeit werden, in Bezug auf das verwendete System, Domänen mit einer Retentionszeit von mehr als 20 min als niedermolekular und Domänen mit einer Retentionszeit von unter 15 min als hochmolekular bezeichnet. Die Domänen, die von den hoch- und niedermolekularen Verbindungen eingegrenzt werden, sind entsprechend mittelmolekular.


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Die Abs[420]-Chromatogramme in Abhängigkeit der Kohlenhydratkomponente sind in Abbildung 57 dargestellt und die RI-Chromatogramme sind in Abbildung 101 im Anhang zu finden. Für alle drei Zucker ergeben sich jeweils ähnliche Domänen und es sind in erster Linie Unterschiede in deren Ausprägung erkennbar. Die Gesamtfläche unter den Kurven verhält sich vom Trend her analog zur gemessenen Bräunung, wobei sie bei D-Glucosemodellen am größten ist und von Maltose zu Maltotriose abnimmt. Aus den RI-Chromatogrammen wird deutlich, dass die Restkonzentration der Kohlenhydrate und der Aminokomponente bei etwa 20 min quantitativ auch nach 300 min in der Reaktionsmischung dominiert. Im mittelmolekularen Bereich können mittels RI-Detektor zwei Domänen bei 16 und 17 min detektiert werden, wobei primär die Domäne bei 16 min zur Bräunung beiträgt. Der Bereich der hochmolekularen Verbindungen weist im RI-Chromatogramm keine diskreten Domänen auf, stattdessen flacht das Signal von 15 zu 11 min stetig ab, was auf die Bildung zahlreicher Verbindungen mit unterschiedlichen Molekulargewicht und/oder Strukturen hindeutet. Trotz ihrer geringen Quantität tragen diese Polymere erheblich zur Farbe der Reaktionsmischungen bei, wie aus den Abs[420]-Chromatogrammen abzulesen ist. In diesen zeigen alle Kohlenhydratmodelle mit L-Alanin Domänen bei 13 und 14 min, die zwar weniger diskret sind als die Domäne bei 16 min, aber trotz niedrigerer Peakhöhe eine größere Fläche aufweisen.

Abbildung 57: GPC-Abs[420]-Chromatogramme der Modelle von D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin nach 300 min bei 130 °C und pH 5.

Bei Variation der Aminosäure in Kombination mit Maltose lassen sich kaum ähnliche Domänen finden, wie aus den Abs[420]- (Abbildung 58) und RI-Chromatogrammen (Abbildung 102 im Anhang) deutlich wird. Daraus kann geschlossen werden, dass die Aminosäure erheblichen Einfluss auf die Art der im Rahmen der MAILLARD-Reaktion gebildeten Polymere hat. Mit L-Lysin entstehen unter den gewählten Bedingungen vorwiegend mittelmolekulare Verbindungen und es zeigt sich eine schmale Domäne bei 19 min und eine breite bei 17 min, wobei sich Quantität und Farbbeitrag proportional verhalten. Dies ist, wie zuvor beschrieben, bei Anwesenheit von L-Alanin nicht der Fall. Der quantitativ nahezu vernachlässigbare Anteil an hochmolekularen Verbindungen leistet in diesem Fall einen überproportionalen Beitrag zur messbaren Bräunung. Dies ist sofern verwunderlich, da davon ausgegangen werden könnte, dass L-Lysin aufgrund seiner zwei primären Aminofunktionen als Quervernetzer wirken kann und so Polymere mit besonders hohem Molekülgewicht bildet. Entweder ist dies nicht der Fall und Maltose reagiert mit L-Lysin gerichtet zu kleineren Polymeren oder die

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entstehenden Polymere sind aufgrund der Querverzweigung trotz ihres höheren Molekülgewichts gegenüber den Maltose/L-Alanin-Melanoidinen kompakter und zeigen deshalb höhere Retentionszeiten. Weiterhin ist eine Beeinflussung der Retentionszeit durch mehr freie, geladene Aminofunktionen im Fall von L-Lysin denkbar. Nur mit Hilfe der GPC lassen sich die genauen Unterschiede in der Struktur der verschiedenen Melanoidinfraktionen nicht aufklären, es ist aber zumindest offensichtlich, dass starke strukturelle Unterschiede vorhanden sein müssen.

Abbildung 58: GPC-Abs[420]-Chromatogramme der Modelle von Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin nach 300 min bei 130 °C und pH 5.

Das Modell mit L-Prolin zeigt gemäß seiner schwächeren Bräunung nur eine farbgebende Domäne an der oberen Grenze des mittelmolekularen Bereichs, welche jedoch in ihrer Intensität deutlich schwächer ist als jene, der anderen Aminosäuremodelle. Im Karamellisierungsmodell (ohne Aminosäure) sind mit Ausnahme der Signale der Ausgangsstoffe weder mit dem RI-Detektor noch bei 420 nm weitere Peaks messbar, was aufgrund der geringen Farbbildung zu erwarten war.

4.3 Modellreaktionen reduzierender Kohlenhydrate im trockenen System

Die Verarbeitung von Lebensmitteln umfasst neben Kochprozessen, bei welchen ein hoher Wassergehalt vorausgesetzt ist und die mit den zuvor beschriebenen wässrigen Modellen abgebildet wurden, auch Prozessschritte in denen nahezu trocken oder mit niedrigem Wassergehalt erhitzt wird. Typische Beispiele sind das Backen, Braten oder Rösten von Nahrungsmitteln bzw. deren Bestandteilen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche im trockenen System sind an das Rösten von Malz angelehnt, wie es zur Herstellung dunkler Biere bzw. zur Herstellung von Spezialmalzen verwendet wird. In den Modellen wurde neben Maltose und L-Alanin als Reaktanten Cellulose als inertes Füllmaterial verwendet. Zur Analyse wurde jeweils eine definierte Menge des erhitzten Feststoffs in Wasser aufgenommen und die resultierende Lösung analog zu den wässrigen Modellen untersucht.

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4.3.1 Farbbildung

Die Farbbildung ist, wie auch bei den wässrigen Modellen, ein entscheidendes Merkmal der trockenen MAILLARD-Modelle. Doch während die wässrigen Proben für die Absorptionsmessung bei 420 nm lediglich verdünnt werden müssen, ist es nötig die trockenen Proben überhaupt erst zu lösen. Aufgrund des Verlustes einer unbekannten Menge von Wasser, Kohlenstoffoxiden, Ammoniak und flüchtigen MAILLARD-Reaktionsprodukten können beim Lösen des Rückstands keine mit den wässrigen Proben vergleichbaren Konzentrationsverhältnisse geschaffen werden und daher sind auch die gemessenen Farbwerte nicht direkt vergleichbar. Denn auch wenn die hergestellten Lösungen der trockenen Modelle niedrigere Absorptionen erreichen als die wässrigen Proben (vergleiche Abbildung 42 und Abbildung 59), kann im Trockenen im Allgemeinen von einer erhöhten Reaktivität ausgegangen werden. So wurden von HOLLNAGEL155 im Rahmen ihrer Dissertation Versuche mit Maltose und L-Glycin unter vergleichbaren Bedingungen im wässrigen und trockenen Milieu durchgeführt. Im Wässrigen wurde nach 30 min bei 100 °C rund die fünffache Menge des Ausgangskohlenhydrats im Vergleich zum Trockenen gefunden. Dies wurde durch die räumliche Nähe der Reaktanten und dem einfacheren Ablaufen der Eliminierung von Wasser im quasi-wasserfreien Milieu begründet.

Bei den im Trockenen durchgeführten Untersuchungen steigt die Bräunung nicht wie im Wässrigen mit der Bräunungszeit konstant an, sondern ab 200 °C werden nach 15 min Farbstoffe gebildet, die nicht mehr wasserlöslich sind und die Farbe der Lösungen sinkt daher wieder ab (Abbildung 59). Eine Erklärung für dieses Verhalten könnte sein, dass die resultierenden Melanoidine aufgrund der vermehrten Eliminierung von Wasser und dem Ablaufen von Oxidationsreaktionen einen zunehmend ungesättigten Charakter annehmen und daher ihre Löslichkeit herabgesetzt wird. Bei 220 °C ist dieser Effekt so stark ausgeprägt, das die Farbe ab 15 min geringer ist als bei 180 °C und bei 30 min unter das Niveau von 160 °C absinkt.

Abbildung 59: Farbbildung von Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur.

Die Bildung von unlöslichen Melanoidinen kann im wässrigen Milieu zwar auch in Form von einer leichten Trübung bzw. eines geringfügigen Niederschlags beobachtet werden, aber dabei trat

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keine Abnahme der Bräunung der löslichen Bestandteile auf. Unter Kochbedingungen ist der Verlust von Farbstoffen folglich eher zu vernachlässigen, während sich für Röstprozesse die Möglichkeit starker Verluste bei der Farbausbeute andeutet. Es kann regelrecht von einer „Überröstung“ gesprochen werden, denn obwohl die Farbe im Feststoff weiter zunimmt, steht diese in Lösung nicht mehr zur Verfügung.


Die Modelluntersuchungen in wässriger Lösung zeigen, dass eine Korrelation zwischen Farbbildung und antioxidativen Eigenschaften besteht (vergleiche Abschnitt 4.2.2). Wie erwartet, kann ein solcher Zusammenhang auch für die im Trockenen durchgeführten Versuchsreihen beobachtet werden, wobei sowohl die antioxidative Aktivität, ermittelt mit dem TEAC-Assay (Abbildung 60), als auch mit dem Phenanthrolinassay (Abbildung 103 im Anhang) mit der Bräunung korrelieren. Dementsprechend stellt sich auch ein linearer Zusammenhang zwischen den Ergebnissen beider Assays ein, wobei erneut nur etwa 30 % der antioxidativen Intermediate Eisen(III)-ionen reduzieren (Abbildung 104 im Anhang).

Abbildung 60: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem TEAC-Assay) in Abhängigkeit der Farbe aller trockenen Modellsysteme (n = 16).

Im Fall der Modelle unter Röstbedingungen bedeutet die Korrelation von Farbe und antioxidativer Aktivität, dass zum einen die reduzierenden Eigenschaften mit der Bräunung zunehmen, aber zum anderen auch, dass bei einsetzender Entfärbung der Lösung diese wieder sinken. Somit kann eine direkte Verknüpfung der (löslichen) Farbstoffe und der antioxidativen Bestandteile in der MAILLARD-Reaktion nachgewiesen werden. Zur Erklärung dieses Zusammenhangs gibt es zwei Möglichkeiten: (1) die antioxidativen Eigenschaften gehen primär von den hochpolymeren Melanoidinen aus und sobald diese unlöslich werden, sinkt die antioxidative Aktivität der Lösung entsprechend; (2) die antioxidativen Eigenschaften gehen von Intermediaten aller Molekülgroßen aus und die unlöslichen Polymere werden durch Reaktionen all dieser Intermediate gebildet. Unabhängig von dieser Fragestellung bleibt zu klären, ob die gebildeten unlöslichen

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Melanoidine weiterhin über eine antioxidative Funktionalität verfügen und diese nur aufgrund der mangelnden Löslichkeit und Mobilität des Polymers nicht wirken können oder ob die entsprechenden funktionellen Gruppen im Rahmen dieser Reaktionen verloren gehen. Aufgrund der Diversität der in der MAILLARD-Reaktion vorhanden Strukturen und ablaufenden Reaktionen muss grundsätzlich davon ausgegangen werden, dass je nach Reaktionsbedingungen zu unterschiedlichen Anteilen alle beschriebenen Fälle vorliegen. Mögliche Hinweise auf diese These werden in den beiden nachfolgenden Unterkapiteln, welche sich mit dem Nachweis der Intermediate und der Bestimmung der Molekülgewichtsfraktionen beschäftigen, diskutiert.

4.3.3 Bildung von MAILLARD-Intermediaten

Die Analytik von MAILLARD-Reaktionsintermediaten in den wässrigen Extrakten der Modellreihen im trockenen System wurde analog zu den wässrigen Modellen durchgeführt. Im Fokus standen erneut die α-Dicarbonylverbindungen sowie ihre heterocyclischen Abbauprodukte.

4.3.3.1 Bildung von α-Dicarbonylverbindungen

Das Spektrum an nachweisbaren α-Dicarbonylverbindungen ist in den Modellen unter Röstbedingungen deutlich überschaubarer als in Modellen im wässrigen Milieu. Dies ist darauf zurückzuführen, dass bei Temperaturen ab 160 °C die α-Dicarbonyle zwar schneller gebildet werden, aber auch schneller abreagieren und so kaum als Zwischenstufen fassbar sind. So können unter diesen Bedingungen nur 3-Desoxymaltoson (Abbildung 61) und 3-Desoxyglucoson (Abbildung 62) sowie 1-Desoxymaltoson (Abbildung 105 im Anhang) nachgewiesen werden. Die Gehalte der genannten Verbindungen folgen nach 5 min Reaktionszeit zwischen 160 und 200 °C dem Trend, dass mit höheren Temperaturen höhere Konzentrationen nachweisbar sind. Bei 220 °C sind bereits geringere Mengen als bei 200 °C vorhanden und mit steigender Erhitzungszeit kehrt sich der Trend für alle Temperaturen um. Im Fall von 3-Desoxymaltoson können nach 30 min Gehalte von (1,4 ± 0,2) µmol/g (160 °C), (0,2 ± 0,1) µmol/g (180 °C) und < 0,1 µmol/g (200 und 220 °C) festgestellt werden. Es deutet sich folglich an, dass mit zunehmender Temperatur der Abbau der α-Dicarbonylverbindungen schneller stattfindet als ihre Bildung. Eine Rolle spielt dabei wahrscheinlich, dass bei höheren Temperaturen die Kohlenhydratkomponente entsprechend schneller verbraucht und die Bildungsrate der direkten Folgeprodukte limitiert wird.

Während sich die Desoxyosone mit vollständigem Maltosegrundgerüst sogar in ihren absoluten Gehalten sehr ähnlich verhalten (vergleiche Abbildung 61 und Abbildung 105 im Anhang), kann das D-Glucosederivat des 3-Desoxyosons nur in deutlich geringeren Mengen gefunden werden und es ergeben sich leicht andere Zusammenhänge (Abbildung 62). So ist 3-Desoxymaltoson bereits ab 15 min bei 160 °C in größeren Mengen vorhanden als bei allen anderen Temperaturen, während im Fall von 3-Desoxyglucoson das Modell bei 180 °C die höchste Konzentration nach 15 min aufweist. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass sich das Gleichgewicht von Bildungs- und Abbaurate bei 3-Desoxyglucoson erst bei höheren Temperaturen bzw. längeren Erhitzungszeiten hin zum beschleunigten Abbau verschiebt.


71

Abbildung 61: Bildung von 3-Desoxymaltoson aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur.

Abbildung 62: Bildung von 3-Desoxyglucoson aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur.

Ein möglicher Grund dafür ist, dass das Monosaccharidderivat unter den gewählten Bedingungen nur aus D-Glucose 1a gebildet werden kann und nicht etwa auch aus 3,4-Didesoxyglucoson-3-en 48 (vergleiche Abbildung 50 und Abbildung 63), dem Abbauprodukt von 3-Desoxymaltoson 7b. Bei Temperaturen ab 160 °C im trockenen System steht das zur Addition notwendige Wasser nicht zur Verfügung, was auch daraus abgeleitet werden kann, dass 3-Desoxygalactoson 49 im Gegensatz zu den Modellen im Wässrigen nicht nachgewiesen werden kann. D-Glucose 1a als Edukt von 3-Desoxyglucoson wird unter anderem durch den Abbau von 3-Desoxymaltoson 7b zu 3,4-Didesoxyglucoson-3-en 48 frei und steht daher erst zeitlich verzögert zur Verfügung. Dadurch erklärt sich möglicherweise die spätere Verschiebung des Gleichgewichts zwischen Bildung und Abbau im Vergleich der beiden 3-Desoxyosone.

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Abbildung 63: Abbau von 3-Desoxymaltoson 7b zu HMF 16 über 3,4-Didesoxyglucoson-3-en 48 im trockenen System. 3-Desoxyglucoson 7a wird nur aus freigesetzter D-Glucose 1a gebildet und nicht über Wasseraddition an 48. 3-Desoxygalactoson 49 wird nicht gebildet.

Weitere C6-α-Dicarbonyle spielen unter den gewählten Bedingungen keine Rolle, was im Widerspruch zu den Ergebnissen von HOLLNAGEL et al.159 steht, die 1,4-Didesoxyglucoson durch eine Art peeling off-Mechanismus als wichtigste α-Dicarbonylkomponente in der MAILLARD-Reaktion der Maltose im Trockenen identifizieren konnten. Im Unterschied zu diesen Experimenten wurde in der vorliegenden Arbeit aber eine andere Aminoverbindung, Cellulose als Füllmaterial und höhere Temperaturen eingesetzt. Außerdem wurde OPD als Derivatisierungsreagenz nicht vor (Präderivatisierung) sondern nach der Reaktion (Postderivatisierung) zugegeben, da es bei Präderivatisierung als Aminokomponente im Rahmen der MAILLARD-Reaktion wirken kann und durch die Bildung von Chinoxalinderivaten die α-Dicarbonyle der Reaktion entzieht und so das Reaktionsgleichgewicht beeinflusst. Die Bildung von relevanten Mengen an 1,4-Didesoxyglucoson durch einen peeling off-Mechanismus kann deshalb bei in dieser Arbeit gewählten Bedingungen ausgeschlossen werden.

4.3.3.2 Bildung von heterocyclischen Intermediaten

Entsprechend der wenigen, nachweisbaren α-Dicarbonylverbindungen können auch weniger heterocyclische Folgeprodukte identifiziert werden. Dabei ist HMF als Abbauprodukt der 3-Desoxyosone die quantitativ bedeutendste Verbindung und wird, wie auch im Wässrigen, in Gehalten gebildet, die etwa um eine Zehnerpotenz höher sind als die von 3-Desoxymaltoson. Mit der Bildung von HMF geht erneut stets eine Verringerung der intermediären Konzentration der


73

3-Desoxyosone einher, was ihren Charakter als hochreaktive Zwischenprodukte unterstreicht. IhrGehalt wird im Wesentlichen von der schnellen Weiterreaktion zu HMF bestimmt, weshalb sichabhängig von der Temperatur ein indirekter Zusammenhang ergibt. Die HMF-Konzentration hingegenist wieder direkt von der Temperatur abhängig, wobei sich, anders als im Wässrigen, kein linearerAnstieg nach der verzögerten Bildung ergibt, sondern die Konzentration sich nach dem initialenSprung nur geringfügig erhöht (Abbildung 64).

Abbildung 64: Bildung von HMF aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur.

Furfural wird in den Modellreihen bei 200 und 220 °C in nur zehnfach niedrigerer Konzentration als HMF detektiert (Abbildung 106 im Anhang). Doch der Nachweis dieses Furanderivats legt nahe, dass auch, wenn die entsprechenden Vorläufer in Form der Osone und 3-Desoxypentoson intermediär nicht erfasst werden können, diese dennoch gebildet worden sein müssen. Gründe dafür können eine Verschiebung zu Gunsten der Eliminierungreaktionen gegenüber der Oxidation bei hohen Temperaturen und wasserfreien Bedingungen sowie eine wesentlich höhere Abbau- als Bildungsrate sein.

Etwas andere Zusammenhänge zeigen sich für die Pyran-4-one Maltol (Abbildung 107 im Anhang) und DHHM (Abbildung 65). Für Maltol sind zwischen 160 und 200 °C mit steigender Temperatur steigende Gehalte zu beobachten, während bei 220 °C nach 30 min der Gehalt unter das Niveau von 180 °C sinkt, was auf den vermehrten Abbau bzw. die langsamere Bildung aus 1-Desoxymaltoson hindeutet. Die Konzentration von DHHM steigt nur zwischen 160 und 180 °C abhängig der Temperatur an, wobei das Pyran-4-on jeweils erst ab 30 min (160 °C) bzw. 15 min (180 °C) nachweisbar ist. Auch wenn bei 200 und 220 °C bereits nach 5 min DHHM quantifiziert werden kann, sinken die Gehalte im Verlauf der weiteren Röstzeit und erreichen nach 30 min (1,57 ± 0,04) µmol/g (200 °C) und (1,16 ± 0,03) µmol/g (220 °C). Beide Pyran-4-one sind in einem ähnlichen Konzentrationsbereich von 0,6 bis 1,8 µmol/g nachweisbar, obwohl 1-Desoxyglucoson als Vorstufe für DHHM in keiner Probe detektiert werden kann und 1-Desoxymaltoson als Vorstufe von Maltol in ähnlichen Gehalten gefunden wird wie 3-Desoxymaltoson. Wie im Fall der Osone kann folglich die Bildung von 1-Desoxyglucoson nur durch den Nachweis des Folgeproduktes DHHM indirekt gezeigt werden. Dies ist wahrscheinlich auf die erhöhte Reaktivität des

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Monosaccharidderivates zurückzuführen und konnte auch in den wässrigen Modellen beobachtet werden.

Abbildung 65: Bildung von DHHM aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur.

Im Vergleich zu den Furanen HMF und Furfural als Folgeprodukte der 3-Desoxyosone und der Osone deutet sich also, wie auch im Wässrigen, eine höhere Reaktivität der Pyran-4-one und ihrer Vorstufen, den 1-Desoxyosonen, an. Im Gegensatz zu den Modellen unter Kochbedingungen kann jedoch im Trockenen für alle Heterocyclen die Weiterreaktion zu Folgeprodukten abgeleitet werden, da für keine Verbindung die Konzentration linear ansteigt.

Die Konzentrationen der Reduktonether Maltol und DHHM sowie der Maltolvorstufe 1-Desoxymaltoson genügen, wie auch unter wässrigen Bedingungen, nicht aus, um die gemessenen antioxidativen Aktivitäten der Modellsysteme zu erklären. Bei höheren Temperaturen können zwar zum Teil auch geringe Gehalte der Pyran-4-one festgestellt werden, aber eine direkte Korrelation zur Abnahme von Farbe und antioxidativen Eigenschaften ergibt sich nicht. Die Frage, welche Intermediate primär für die Bildung der unlöslichen Polymere verantwortlich sind, kann mit diesen Daten jedoch nicht geklärt werden. Es deutet sich zwar bei höheren Temperaturen ein verstärkter Abbau an, aber ob die Heterocyclen direkt in unlösliche Polymere integriert werden oder stufenweise mit anderen Intermediaten zu Melanoidinen mit wachsendem Molekülgewicht reagieren, ist nicht direkt abzuleiten.


Die GPC-Analytik der Modelle im trockenen System wurde analog zu den wässrigen Proben durchgeführt. Zusätzlich wurde zur Beurteilung der radikalfangenden Eigenschaften eine TEAC-Kopplung entwickelt, bei der ABTS-Radikalkationenlösung nach der Säule zum Fluss der GPC zugeführt und die Entfärbung der Lösung bei 600 nm mit einem UV/Vis-Detektor gemessen wird. Diese Methode erlaubt eine Verknüpfung zwischen Molekülgröße, Farbe und antioxidativen Eigenschaften einzelner Domänen und ermöglicht somit genauere Aussagen als die gewöhnliche Farbmessung und der TEAC-Assay.

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Um den Einfluss der Temperatur zu bewerten, sind in Abbildung 66 die GPC-Abs[420]-Chromatogramme aller vier Modellreihen zwischen 160 und 220 °C bei 15 min Reaktionszeit dargestellt. 15 min wurden als Vergleichszeitpunkt gewählt, da bei dieser Zeit in allen Modellen deutliche Domänen erkennbar sind. Das Gesamtintegral der jeweiligen Chromatogramme folgt in etwa dem Trend der Bräunung (Abbildung 59) und so zeigen die Domänen bei 160 und 220 °C insgesamt die schwächsten und bei 180 und 200 °C die stärksten Signale. Mit wenigen deutlichen Ausnahmen sind bei allen Temperaturen die gleichen Domänen nachweisbar, wobei sich je eine Hauptdomäne im niedermolekularen Bereich (21 min), zwei bis vier dicht beieinanderliegende Domänen im mittel- bis hochmolekularen Bereich (15 bis 16 min) und eine im hochmolekularen Bereich (12 min) befinden. Ansonsten tritt zwischen 180 und 220 °C eine Molekülgewichtsfraktion bei 19 min auf und bei 180 °C eine zusätzliche bei 18 min. Die Temperaturunterschiede rufen jedoch im Trockenen keine derartigen Verschiebungen der Molekülgewichtsverteilung hervor, wie die Variation der Aminokomponente im Wässrigen. Neben den genannten farbgebenden Fraktionen kann in den RI-Chromatogrammen außerdem eine Domäne bei 27 min detektiert werden, deren Quantität hingegen dem Trend der Bräunung mit steigender Temperatur zunimmt (Abbildung 108 im Anhang). Wie schon in den RI-Chromatogrammen der wässrigen Modelle werden die größten RI-Signale von den Edukten verursacht (Retentionszeit von 21 min), nur mit dem Unterschied, dass in den Proben der Röstversuche ein deutlicher Abbau zu erkennen ist (Daten nicht gezeigt).

Im Vergleich zum Maltose/L-Alaninmodell in wässriger Lösung (Abbildung 57) fällt auf, dass sich nur im Trockenen im Bereich zwischen 18 und 25 min sehr breite, bräunungsintensive Domänen bilden. Im Bereich mit Retentionszeiten unter 18 min weisen die Proben beider Systeme Domänen auf, aber es lassen sich keine direkten Überschneidungen finden. Insbesondere die dominante, schmale Domäne, welche bei den in Lösung gebräunten Modellen nach einer Retentionszeit von 16 min eluiert, lässt sich in den Röstmodellen nicht wiederfinden. Der größte Farbbeitrag geht im wässrigen System von den breiten Domänen im hochmolekularen Bereich aus, während unter wasserfreien Bedingungen die schmalen, überlagerten Domänen um 15 min diese Rolle einnehmen.

Abbildung 66: GPC-Abs[420]-Chromatogramme der Modelle von Maltose mit L-Alanin nach 15 min in Abhängigkeit der Temperatur.

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Die radikalfangenden Eigenschaften der Röstproben nach 15 min verhalten sich im Wesentlichen analog zur messbaren Bräunung (vergleiche Abbildung 66 und Abbildung 67), was der zuvor beobachteten Korrelation von Bräunung und antioxidativer Aktivität in beiden Systemen entspricht. Im Detail ergeben sich jedoch geringfügige Unterschiede. So weist die Domäne bei etwa 15 min temperaturunabhängig einen schwächeren Radikalabbau im Verhältnis zur Bräunung auf, als die Domäne bei 21 min. Die bräunenden Domänen bei 18 und 19 min zeigen einen kaum messbaren Radikalabbau. Bei etwa 28 min ist zusätzlich eine Domäne mit antioxidativer Aktivität erkennbar, die sich jedoch nicht eindeutig einem Peak der RI- oder Abs[420]-Chromatogramme zuordnen lässt. Möglich wäre eine Verbindung zum RI-Signal bei 26 min, doch neben dem starken Versatz in der Retentionszeit, korrelieren die Intensitäten der Signale in keiner Weise.

Abbildung 67: GPC-ABTS●+-Chromatogramme der Modelle von Maltose mit L-Alanin nach 15 min in Abhängigkeit der Temperatur.

Die Abnahme von Bräunung und antioxidativen Eigenschaften über den gesamten Molekülgewichtsbereich deutet an, dass die Bildung der unlöslichen Polymere bei erhöhtem Energieeintrag durch hohe Temperaturen oder lange Erhitzungszeiten von Reaktionen aller vorhandenen Intermediate ausgeht. Ein Teil des Farbverlustes könnte auch auf die Bildung der zuvor erwähnten farblosen, niedermolekularen Fraktion zurückzuführen sein (Retentionszeit von 27 min in Abbildung 108 im Anhang). Es handelt sich dabei um die einzige Moleküldomäne, die mit steigender Temperatur zunimmt, während gleichzeitig andere Domänen abgebaut werden. Daraus kann natürlich nicht eindeutig geschlossen werden, ob diese Fraktion tatsächlich aus dem Abbau von mittel- und hochmolekularen Verbindungen stammt oder direkt aus frühen Intermediaten entsteht. Da es sich aber um ein sehr diskretes Signal handelt, kann davon ausgegangen werden, dass es von einer Gruppe von Verbindungen stammt, die sich strukturell sehr ähnlich sind und möglicherweise aus einer sehr gerichteten Reaktion hervorgehen. Unter Umständen handelt es sich um Moleküle, die aus den hochpolymeren Melanoidinen abgespalten werden, während diese ihren unlöslichen Charakter annehmen. Als unlösliche Bestandteile können die hochpolymeren Melanoidine selbst nicht mittels GPC erfasst werden, weshalb Aussagen zum Erhalt oder Verlust ihrer antioxidativen Eigenschaften an dieser Stelle nicht möglich sind.

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4.4 Modellreaktionen heterocyclischer MAILLARD-Intermediate in wässriger Lösung

Um den Beitrag zur Farbbildung und zu den antioxidativen Eigenschaften der heterocyclischen Intermediate innerhalb der MAILLARD-Reaktion genauer beurteilen zu können, wurden HMF, als quantitativ stärkste Komponente, sowie die Reduktonether Maltol, Furaneol, DHHM und Isomaltol in Modellversuchen mit L-Alanin umgesetzt. Um den realen Konzentrationsverhältnissen näher zu kommen und weil diese Verbindungen zum Teil deutlich schlechter löslich sind als die Kohlenhydrate, wurden sie in geringeren Konzentrationen (20 mmol/L) eingesetzt. Die restlichen Bedingungen wurden identisch zu denen der Kohlenhydratmodelle im wässrigen Milieu gewählt.

4.4.1 Farbbildung

Die heterocyclischen Intermediate zeigen in Kombination mit L-Alanin starke Unterschiede in ihrem Bräunungsverhalten (Abbildung 68). Während für Maltol nach 300 min Erhitzungszeit keine Farbentwicklung messbar ist, entwickelt die Reaktionslösung von Isomaltol in etwa die Hälfte der Absorption des korrespondierenden D-Glucosemodells (vergleiche Abbildung 42), trotz der zehnfach niedrigeren Ausgangskonzentration. Das Potenzial zur Farbentwicklung von Isomaltol ist bereits in den Kontrollproben sichtbar (0 min), in welchen Absorptionen gemessen werden können, die denen von HMF nach 300 min entsprechen. Nach Erhitzung bei 130 °C ergibt sich zwischen HMF und Isomaltol ein Unterschied in der Farbintensität um ungefähr den Faktor 7. DHHM und Furaneol erreichen jeweils eine schwächere Bräunung als HMF.

Abbildung 68: Farbbildung der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05.

Wird die Farbbildung in Abhängigkeit der Zeit betrachtet (Abbildung 109 im Anhang), so fällt auf, dass die Absorption im Fall von Furaneol, DHHM und HMF nahezu linear zunimmt. Im Gegensatz dazu strebt die Bräunung der Isomaltolproben bereits nach 300 min deutlich einem Maximum

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entgegen. Dies könnte darauf hindeuten, dass die vorhandene Menge an Isomaltol im Laufe von 300 min vollständig in Farbstoffe bzw. in die entsprechenden Vorstufen umgesetzt wird.


Die antioxidativen Eigenschaften der heterocyclischen Intermediate wurden bereits in Abschnitt 4.1 ausführlich beschrieben. Die Proben aus den Modellversuchen wurden mit zwei der fünf Methoden (TEAC- und Phenanthrolinassay) ebenfalls auf ihre radikalfangenden bzw. metallreduzierenden Eigenschaften untersucht. Ausgehend von den Ergebnissen der isoliert untersuchten Substanzen (siehe Abbildung 32) könnte erwartet werden, dass die mit dem TEAC-Assay ermittelten antioxidativen Aktivitäten der Kontrollproben (0 min) der Modellversuche in der Reihenfolge HMF, DHHM, Isomaltol, Furaneol, Maltol zunehmen. Tatsächlich verhalten sich die jeweiligen Sauerstoffheterocyclen aber in Anwesenheit von L-Alanin und durch Einstellung des pH-Wertes auf 5 deutlich anders (Abbildung 69). Nur HMF, als einzige Verbindung ohne Reduktonstruktur, zeigt in beiden Fällen kaum messbare antioxidative Eigenschaften. Maltol und Furaneol haben mit jeweils etwa 14 mmol TE/L die gleiche antioxidative Aktivität. DHHM mit (26 ± 1) mmol TE/L und Isomaltol mit (61 ± 2) mmol TE/L zeigen deutlich stärkere radikalfangende Eigenschaften. Relativ betrachtet kehren sich die Verhältnisse für die untersuchten Reduktonether folglich um. Der besonders starke Anstieg der antioxidativen Eigenschaften von Isomaltol im Vergleich zu den anderen Reduktonethern ist möglicherweise auf bei Raumtemperatur ablaufenden Reaktionen zurückzuführen, welche auch die starke Bräunung ohne thermische Behandlung hervorrufen.

Abbildung 69: Antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem TEAC-Assay) der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05.

Die Veränderungen der antioxidativen Aktivität im Verlauf der Erhitzungszeit von 300 min lassen sich mit Hilfe der Ergebnisse der Bräunungsmessung einordnen. Für Maltol, das keine messbare Farbzunahme verursacht, kann auch keine Ab- oder Zunahme der antioxidativen Eigenschaften beobachtet werden. Die Farbbildung der Reduktonether Furaneol, DHHM und Isomaltol ist direkt mit

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einer Abnahme der radikalfangenden Eigenschaften verknüpft, wobei die Differenz in der antioxidativen Aktivität gemeinsam mit der messbaren Absorption steigt. Über den zeitlichen Verlauf betrachtet ergibt sich sogar ein indirekter Zusammenhang zwischen Farbe und antioxidativen Eigenschaften der einzelnen Heterocyclen. Im Anhang ist die Korrelation beider Größen beispielhaft für Isomaltol in Abbildung 110 dargestellt. Im Gegensatz zu den Kohlenhydraten, für die es möglich ist eine direkte Korrelation bei verschiedenen Edukten und Bedingungen aufzustellen, können für die Sauerstoffheterocyclen nur Korrelationen für die einzelnen Modellreihen gezeigt werden. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die Reaktionen in ihrem Fall deutlich gerichteter sind und daher Farbe sowie antioxidative Aktivität von einer kleineren Anzahl von Verbindungen mit vergleichbaren Eigenschaften bestimmt werden. In den Kohlenhydratmodellen führt die große Bandbreite an Abbauprodukten zu Eigenschaften, die sich viel eher allgemeingültig beschreiben lassen.

Der Abbau von HMF, welches über keinerlei antioxidative Eigenschaften verfügt, bringt Produkte hervor, die in der Lage sind, antioxidativ zu wirken. Allerdings ist die antioxidative Aktivität der HMF-Reaktionslösungen nach 300 min immer noch um ein vielfaches kleiner als die der Reaktionslösungen der Reduktonether. Analog zu den Modellen der Kohlenhydrate kann für HMF eine direkte Korrelation zwischen Farbe und antioxidativer Aktivität aufgestellt werden (Abbildung 111 im Anhang).

Da aus den Reduktonethern vorwiegend Produkte mit schwächeren antioxidativen Eigenschaften hervorgehen und aus HMF nur in einem sehr geringen Umfang Verbindungen mit reduzierenden Eigenschaften gebildet werden, stellt sich die Frage, weshalb in der Summe die antioxidative Aktivität beim Abbau von Kohlenhydraten dennoch steigt. Dafür gibt es mehrere mögliche Erklärungen: (1) antioxidative Farbstoffe gehen nicht direkt aus den fünf untersuchten Sauerstoffheterocyclen hervor, sondern werden auf anderen Wegen aus den Zuckern gebildet, (2) antioxidative Farbstoffe werden in Anwesenheit anderer Intermediate aus den fünf untersuchten Sauerstoffheterocyclen gebildet, (3) antioxidative Farbstoffe werden aus den quantitativ weniger relevanten heterocyclischen Verbindungen gebildet und (4) antioxidative Eigenschaften und Farbe sind nicht in den gleichen Verbindungen vereint, sondern werden von unterschiedlichen Verbindungen verursacht.

Punkt (4) scheint aufgrund der GPC-Untersuchungen in Abschnitt 4.3.4 unwahrscheinlich. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es nicht nur eine grundsätzliche Korrelation von antioxidativen Eigenschaften und Farbe gibt, sondern dass diese auch konkret für verschiedene Molekülgewichtsfraktionen gilt. Da eine geringe Quantität von Intermediaten nicht immer mit einer langsamen Bildung, sondern auch mit einem schnellen Abbau zusammenhängen kann, kann Punkt (3) nicht ausgeschlossen werden. So werden zum Beispiel Pyrazine als Bestandteile von Melanoidinen diskutiert, doch sie scheinen dort quantitativ nur von untergeordneter Bedeutung zu sein.88;160 In der Literatur sind außerdem verschiedene Reaktionen beschrieben, die zu farbigen Verbindungen führen, an denen mehr als eine heterocyclische Komponente beteiligt ist. So bildet zum Beispiel Norfuraneol mit verschiedenen Furan-2-aldehydderivaten Kondensationsprodukte (siehe M1 und M2 in Abbildung 22).92;161 Reaktionen dieser Art werden in den angefertigten Modellsystemen ausgeschlossen, sollten aber in komplexen Reaktionsgemischen eine wichtige Rolle spielen, womit Punkt (2) berücksichtigt werden muss. Ebenso wichtig ist die Bildung von antioxidativen und farbgebenden Verbindungen auf Wegen, die nicht über die Sauerstoffheterocyclen führen, welche in Abschnitt 2.1.4 diskutiert wurden.


80

Mit dem Phenanthrolinassay ergeben sich grundsätzlich ähnliche Zusammenhänge, nur mit dem Unterschied, dass grundsätzlich kleinere antioxidative Kapazitäten bestimmt werden konnten und dass die Komplexbildner Maltol und Isomaltol keine bzw. gegenüber dem TEAC-Assay stark verringerte Aktivitäten zeigen (Abbildung 112 im Anhang). Die für Isomaltol bestimmten metallreduzierenden Eigenschaften sind wahrscheinlich auf die gefärbten Abbauprodukte zurückzuführen, welche bereits in der Kontrollprobe nachweisbar sind.

4.4.3 Abbau der Heterocyclen

Neben der Farbbildung und den antioxidativen Eigenschaften wurde auch der Abbau der Sauerstoffheterocyclen untersucht. Damit ist es möglich die jeweils abgebauten Stoffmengen ins Verhältnis zu diesen beiden Eigenschaften zu setzen, wobei zuerst auffällt, dass es keinerlei Zusammenhang zwischen Farbe und Konzentrationsabnahme gibt (vergleiche Abbildung 68 und Abbildung 70). So kann für HMF kein signifikanter Unterschied in der Ausgangskonzentration und der Konzentration nach 300 min Erhitzungszeit ermittelt werden und dennoch zeigt es die zweitstärkste Bräunung von allen Systemen. Der nicht bestimmbare Abbau von HMF (wahrscheinlich um 3 %) führt folglich zur Bildung eines sehr potenten Farbstoffs. Im Gegensatz dazu liefern Furaneol und DHHM geringere Farbintensitäten als HMF bei wesentlich stärkerem Abbau von 78 % bzw. 97 %. Selbst Isomaltol, das absolut die höchste Bräunungsintensität aufweist, zeigt bei 100 %igem Abbau relativ zu HMF ein kleineres Bräunungspotenzial. Wie zuvor vermutet, kann die langsamere Farbzunahme in den Isomaltolproben ab etwa 60 bis 120 min (Abbildung 68) auf den schnellen Abbau der Verbindung zurückgeführt werden. Ab 180 min (Abbildung 113 im Anhang) ist der Reduktonether vollständig aufgebraucht und die weitere Farbbildung ist auf die Weiterreaktion der zuvor gebildeten direkten Abbauprodukte zurückzuführen.

Auffallend ist, dass Furaneol bereits in der Kontrollprobe (0 min) zu fast 25 % abgebaut ist, was darauf hindeutet, dass der Reduktonether in Kombination mit einer Aminokomponente bei pH 5

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Abbildung 70: Abbau der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05.


81

bereits bei Raumtemperatur bzw. bei Lagerungsbedingungen abgebaut wird. Ohne Zusatz von Aminosäure und/oder pH-Einstellung bzw. in Phosphatpuffer ist Furaneol über einen längeren Zeitraum stabil (Abbildung 81 im Anhang). Im Fall der Reduktonether können unter aeroben Bedingungen und bei Anwesenheit von Metallionen auch oxidative Reaktionen zum Abbau beitragen. Wie sich schon anhand der Messung der Bräunung angedeutet hat, ist Maltol unter den gewählten Bedingungen stabil und dementsprechend konnte keine Abnahme der Ausgangskonzentration beobachtet werden.


Die GPC-Analytik der heterocyclischen Modellsysteme gibt genaueren Aufschluss über die Molekülgrößenverteilung beim Abbau der jeweiligen Sauerstoffheterocyclen und den Beitrag der einzelnen Domänen zur Farbe des Gesamtsystems. In den Abs[420]-Chromatogrammen wiederholen sich die Trends der Bräunungsmessung (Abbildung 71). Für die nahezu farblose Reaktionslösung von Maltol können entsprechend nur farbgebende Molekülgewichtsfraktionen mit sehr kleinen Peakflächen identifiziert werden. Eine befindet sich im hochmolekularen Bereich bei 12 min und eine weitere an der Grenze vom hoch- und mittelmolekularen Bereich bei 15 min. Beide Domänen sind auch in den RI-Chromatogrammen in Abbildung 114 im Anhang wiederzufinden und zeigen ein ähnliches Verhältnis von Farbe zu Quantität. Die dominante, ungefärbte Fraktion bei etwa 20 min stammt, wie üblich, von den Edukten.

Abbildung 71: GPC-Abs[420]-Chromatogramme der Modelle der jeweiligen Heterocyclen mit L-Alanin nach 300 min bei 130 °C und pH 5.

HMF und DHHM geben jeweils bei etwa 16 min eine schwache sowie zwischen 17 und 18 min mehrere stärkere, farbgebende Domänen. In den RI-Chromatogrammen kann diesen Fraktionen jeweils nur ein breiter Peak mit starkem Fronting zugeordnet werden, welcher sein Maximum bei etwa 18 min hat. Farbe und Quantität verhalten sich bei beiden Verbindungen etwa proportional zueinander und in der stärker gefärbten Probe von DHHM können jeweils größere Signale in den Chromatogrammen gefunden werden. Anhand dieser Ergebnisse kann geschlussfolgert werden, dass beide Verbindungen ein etwa ähnliches Produktspektrum aufweisen.

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82

Im Fall von HMF stammt der größte Farbbeitrag, im Gegensatz zu beiden Reduktonethern DHHM und Furaneol, von hochmolekularen Verbindungen. Diese geben im Abs[420]-Chromatogramm mehrere breite Peaks zwischen 12 und 13 min. Entsprechend des nicht quantifizierbar geringen Abbaus von HMF können mit dem RI-Detektor nur sehr schwache Signale im gleichen Bereich gefunden werden. Im Vergleich zu den mittelmolekularen Domänen, welche von Furaneol und DHHM gebildet werden, leisten diese Molekülgewichtsfraktionen im Verhältnis zu ihrer Quantität einen überproportionalen Farbbeitrag. Eine Besonderheit ist außerdem, dass mehrere farbgebende Domänen bei Retentionszeiten von 23, 25 und 27 min im niedermolekularen Bereich zu finden sind.

Isomaltol bildet, ähnlich wie DHHM und Furaneol, primär mittelmolekulare Abbauprodukte. Das RI-Signal dieser Domäne ist von der Retentionszeit, der Form und sogar der Größe nahezu identisch zum Signal der DHHM-Probe, liefert aber deutlich mehr Farbe. Zusätzlich muss eine weitere, im RI-Chromatogramm kaum sichtbare, Molekülgewichtsfraktion vorhanden sein, die für die starke Färbung zwischen 15 und 18 min verantwortlich ist. Neben diesen mittelmolekularen Verbindungen ist im hochmolekularen Bereich eine weitere Domäne bei 13 min vorhanden, die ebenfalls bei geringer Quantität einen starken Farbbeitrag leistet.

Die gemachten Beobachtungen lassen sich mit aus der Literatur bekannten Daten erklären. Das Produktspektrum, welches beim thermischen Abbau aus den untersuchten Sauerstoffheterocyclen hervorgeht, ist bereits in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben und in Abbildung 72 zusammenfassend dargestellt. Lediglich für Maltol, welches im Wässrigen bei 130 °C nur minimal abgebaut wird und dementsprechend auch nur kaum Farbe bildet, sind keine Daten vorhanden.

Furaneol und DHHM werden zu vergleichbaren Substanzgruppen abgebaut, wobei zum einen durch Oxidations-, Reduktions- und Eliminierungsschritte Derivate der Ausgangsverbindungen entstehen und zum anderen aus Spaltungsreaktionen unterschiedlich substituierte α-Dicarbonyl- und α-Hydroxycarbonylverbindungen hervorgehen.52;162 Im Fall von Furaneol gelang auch der Nachweis von Alkylpyrazinen, welche nach dem STRECKER-Abbau aus den jeweiligen α-Dicarbonylen gebildet werden können.162 Dies wäre auch im Fall von DHHM denkbar, aber in den entsprechenden Experimenten wurden keine Aminokomponenten eingesetzt.52 All diese primären Abbauprodukte sind nicht farbgebend, was erklärt, warum trotz der starken Konzentrationsabnahmen von Furaneol und DHHM nur eine schwache Bräunung messbar ist (vergleiche Abbildung 68 und Abbildung 70). Die Bildung der gefärbten Domänen, welche mittels GPC gemessen werden können, muss folglich auf die Reaktion der Abbauprodukte zurückzuführen sein. Möglich wäre die Verknüpfung von Enolen der Ausgangsverbindungen oder der Abbauprodukte mit den Carbonylfunktionen der Spaltprodukte im Sinne von Aldol(kondensations)reaktionen.92;161 Da beide Reduktonether ein sehr ähnliches Spektrum an primären Abbauprodukten aufweisen, ist auch eine große Ähnlichkeit der resultierenden Polymere zu erwarten. Ein Hinweis, dass dies tatsächlich der Fall ist, liefern die Überschneidungen in der Molekülgewichtsverteilung von Proben beider Verbindungen (Abbildung 71). Da sich die farbigen Bestandteile im mittelmolekularen Bereich befinden, ist davon auszugehen, dass es sich eher um Oligomere handelt. Dies ist insofern nachvollziehbar, da die verfügbaren Monomere nicht linear verknüpft werden können und so eher heterogene Kondensationsprodukte zu erwarten sind, die aufgrund der begrenzten Verknüpfungspunkte nicht zu echten Polymeren wachsen können.


83

Abbildung 72: Ausgewählte Produkte des thermischen Abbaus von Furaneol 22,162 DHHM 18,52 HMF 16163 und Isomaltol 19a.164

Für HMF ist neben dem Abbau zu verschiedenen Furanderivaten62 auch die direkte Bildung von Kondensationsprodukten beschrieben.86;163 Über das entsprechende Dimer kann HMF Ketten bilden oder über die Integration von 5-Methylfurfural auch verzweigte Polymere. Diese Reaktionen laufen in wässriger Lösung nur in einem geringen Umfang ab, wie an der, im Rahmen des Fehlers, konstanten HMF-Konzentration ersichtlich ist, führen aber zu einer starken Färbung. Da HMF im Unterschied zu Furaneol und DHHM bzw. deren Abbauprodukten linear verknüpft werden kann, ergibt sich die Möglichkeit, dass Kondensationsprodukte mit großen Molekülmassen gebildet werden können. Dies konnte mit Hilfe der GPC-Analytik nachgewiesen werden.

Für Isomaltol ist der Abbau zu einem C4-Furanon unter Abspaltung von Essigsäure beschrieben. Dieses Abbauprodukt kann mit Isomaltol zu einer Art Dimer kondensieren, welches eine rötliche Färbung besitzt.164 Diese Reaktion findet im Sauren bereits bei milden Bedingungen (50 °C) statt und könnte die starke Farbbildung und den raschen Abbau von Isomaltol erklären (vergleiche Abbildung 68 und Abbildung 70). Das diskrete Signal im GPC-Abs[420]-Chromatogramm innerhalb des mittelmolekularen Bereichs bei etwa 18 min könnte von diesem Dimer stammen, während die breite


84

Domäne zwischen 15 und 18 min sowie die Fraktion bei 13 min auf größere Kondensationsprodukte hinweisen.

4.5 Bierproben

Die Ergebnisse der vorherigen Abschnitte sollen im Folgenden auf die Zusammenhänge im Lebensmittel Bier übertragen werden. Dazu wurden zwölf verschiedene Biere mit unterschiedlicher Herstellungsart und Farbe analog zu den Modellversuchen analysiert. Darunter befinden sich in erster Linie Biere, die nach dem deutschen Reinheitsgebot gebraut sind, wie ein Pilsner, zwei Bockbiere, drei Weizenbiere und weitere, sowie ein (nicht-alkoholisches) Malzbier, ein Red Ale und ein Stout. Bier eignet sich besonders gut für diesen Vergleich, da der Abbau von Maltose und D-Glucose im Wässrigen während des Maischens und der Würzekochung von Bedeutung ist. Die ebenfalls untersuchten wässrigen Extrakte der trockenen Systeme können als Modelle für dunkle Biere betrachtet werden. Wie bei der Vorstellung der Edukte (Abschnitt 2.1.1) erwähnt, zählen L-Prolin und L-Alanin zu den wichtigsten Aminosäuren in der Biermatrix.33

Zu den wichtigen Fragestellungen, die in den nächsten Abschnitten beantwortet werden sollen, zählen die Übertragbarkeit allgemeiner, aus den Modellen bekannter Zusammenhänge auf das Lebensmittel, wie die Korrelation von Farbe und antioxidativen Eigenschaften, und ob die Abbauprodukte von Maltose oder von D-Glucose dominieren.

4.5.1 Farbe

Bei der Auswahl der Biere stand im Vordergrund, ein möglichst großes Farbspektrum abzudecken, um mögliche farbabhängige Korrelationen analog zu den Modellversuchen beobachten zu können. Eine Übersicht der verwendeten Biere und ihrer Farben gibt Abbildung 73. Die dunkelsten Biere zeigen eine Bräunung, die der Farbe der Proben mit Maltose und L-Alanin nach 300 min bei 130 °C und pH 5 nahe kommt. Bei der Bierherstellung werden üblicherweise jedoch nur Koch- bzw. Heißhaltezeiten bei knapp unter 100 °C von 1,5 bis 2 h erreicht. Die Melanoidine, die dem jeweiligen Bier die typische Farbe verleihen, werden zumeist beim Maischprozess aus dem Malz extrahiert. Teilweise wird die gewünschte Farbe aber auch über den Zusatz von Röstmalzbier eingestellt, wobei auch dieses seine starke Bräunung aus dem Malz bezieht. Daher spielen beim Vergleich der Modelle und der Bierproben im wässrigen System besonders die Verhältnisse der ersten zwei Stunden eine Rolle. Die Extrakte der im Trockenen durchgeführten Versuche bilden die Bedingungen beim Einmaischen von dunklem Braumalz bzw. von Röstmalz ab.


85

Abbildung 73: Farben der zwölf untersuchten Biere in aufsteigender Reihenfolge. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05.

Da die Farbe von Bieren typischerweise in EBC-Einheiten angegeben wird, welche bei 430 nm bestimmt werden165 und nicht wie die in dieser Arbeit durchgeführten Bräunungsmessungen bei 420 nm, sind im Anhang in Abbildung 115 die Farben in EBC-Einheiten zu finden. Relativ betrachtet sind die Werte praktisch identisch, absolut unterscheiden sie sich in erster Linie durch einen Faktor von 25, welcher in der Berechnung der EBC-Einheiten enthalten ist. Zum ungefähren Vergleich zur Bierfarbe können die in dieser Arbeit angegebenen Bräunungswerte mit 25 multipliziert werden.


Die Untersuchung der antioxidativen Eigenschaften der zwölf Bierproben mit dem TEAC-Assay (Abbildung 74) zeigt, dass sich kein direkter Zusammenhang mit der Farbe (Abbildung 73) ergibt. Grund dafür ist die wesentlich komplexer zusammengesetzte Matrix der Proben. Die oxidative Stabilität von Bier wird neben den MAILLARD-Reaktionsprodukten auch von polyphenolischen Antioxidantien und während der Gärung gebildetem Schwefeldioxid beeinflusst.166 Da diese Stoffe keinen oder nur einen geringen Einfluss auf die Bräunung haben und die untersuchten Proben sich in der Auswahl der Rohstoffe sowie dem Herstellungsverfahren unterscheiden, ist in diesem Fall eine Korrelation unwahrscheinlich.

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Abbildung 74: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem TEAC-Assay) der zwölf untersuchten Bierproben. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05.

Anders verhält es sich im Fall des Phenanthrolinassays, welcher die metallreduzierenden Eigenschaften erfasst. Polyphenole, die wie einige der MAILLARD-Reaktionsprodukte Metallionen komplexieren, werden mit dieser Methode nicht erfasst. Daher ist in Abhängigkeit der Farbe zumindest ein erkennbarer Aufwärtstrend in der antioxidativen Aktivität vorhanden (Abbildung 75). Werden beide Größen gegeneinander aufgetragen, ergibt sich ein Bestimmtheitsmaß von 0,66 (Abbildung 116 im Anhang), welches im Vergleich zu den Modellversuchen nur auf eine moderate Korrelation hinweist. Bei der Entfernung von drei Bieren, die nicht nach deutschem Reinheitsgebot gebraut sind (Red Ale, Stout, Malzbier), steigt das Bestimmtheitsmaß auf 0,78 (Daten nicht gezeigt). Werden nur die sechs nach deutschem Reinheitsgebot gebrauten Gerstenmalzbiere betrachtet, ergibt sich ein Bestimmtheitsmaß von 0,91 (Abbildung 116 im Anhang). Für die Korrelation zwischen Bräunung und der antioxidativen Aktivität, ermittelt mit dem TEAC-Assay, resultieren ähnliche Beobachtungen, wobei sich in diesem Fall für die sechs Gerstenmalzbiere ein deutlich niedrigeres Bestimmtheitsmaß von 0,73 ergibt (Daten nicht gezeigt).

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Abbildung 75: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) der zwölf untersuchten Bierproben. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05.

Anhand dieser Ergebnisse kann abgeleitet werden, dass bei ähnlichen Herstellungsverfahren und Rohstoffen, wie in den Modellversuchen, tatsächlich ein Zusammenhang zwischen Bräunung und antioxidativen Eigenschaften besteht. Kommen neben den MAILLARD-Reaktionsprodukten in unterschiedlichem Umfang weitere Einflussfaktoren dazu, so ist eine Korrelation nicht mehr gegeben.

Im Vergleich zwischen beiden Assays fallen aufgrund der Selektivität gegenüber bestimmten Antioxidantien im Gegensatz zu den Modellsystemen deutliche Unterschiede auf. Dementsprechend ergibt sich für die Bierproben auch keine Korrelation zwischen den beiden Methoden. Jedoch zeigt sich tendenziell ein größerer Unterschied zwischen den antioxidativen Aktivitäten. In den Modellversuchen, sowohl im wässrigen als auch im trockenen System, waren die Ergebnisse im Phenanthrolinassay etwa um 70 % niedriger als im TEAC-Assay. Bei den Bierproben beträgt die Differenz 90 %. Auch diese Beobachtung kann wahrscheinlich auf komplexierende Polyphenole in den Bierproben zurückgeführt werden. Dementsprechend ist in den Bieren mit einem geringeren prooxidativen Potential zu rechnen als in den wässrigen Modellsystemen.

4.5.3 Gehalt an MAILLARD-Intermediaten

MAILLARD-Reaktionsprodukte, wie verschiedene α-Dicarbonylverbindungen,58;167;168 Furfural,58;169 HMF169;58 oder im späteren Verlauf gebildete Intermediate wie Maltosin,165 konnten bereits in Bier nachgewiesen werden. Im Folgenden werden daher in erste Linie Vergleiche zu den bekannten Daten sowie Verknüpfungen zu anderen Teilen dieser Arbeit gezeigt.

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88

4.5.3.1 Gehalt an α-Dicarbonylverbindungen

In allen zwölf Bierproben können α-Dicarbonylverbindungen nachgewiesen werden, wobei die Hauptkomponente 3-Desoxyglucoson ist. Das Verhältnis von 3-Desoxyglucoson und 3-Desoxy-maltoson bewegt sich, im Gegensatz zu den wässrigen Maltosemodellen, in denen beide Verbindungen zu etwa gleichen Anteilen vorliegen, zwischen 6:1 und 10:1 (Abbildung 76). Im Fall des mit D-Glucose-/D-Fructosesirup gesüßten Malzbiers liegt das Verhältnis sogar bei 16:1. Dies spricht dafür, dass die MAILLARD-Reaktion der D-Glucose neben Maltose im Brauprozess eine große Bedeutung besitzt. Beim Vergleich der Verhältnisse von 3-Desoxyglucoson und -galactoson fällt auf, dass diese in den Bierproben mit etwa 2:1 bis 3:1 dichter an den Werten der Maltosemodelle (etwa 2:1) als an denen der D-Glucosemodelle (etwa 7:1) liegen. Der Einfluss von Maltose bzw. 3-Desoxymaltoson auf die erhöhte Bildung von 3-Desoxygalactoson ist folglich auch in der Lebensmittelmatrix vorhanden.

Abbildung 76: Konzentrationen der 3-Desoxyosone in den zwölf untersuchten Bierproben.

Die 1-Desoxyosone sind in einem ähnlichen Konzentrationsbereich nachweisbar wie 3-Desoxymaltoson, wobei nur das D-Glucosederivat in allen Proben gefunden werden kann, während das Maltosederivat im Red Ale und im Weizen mit Röstmalzzusatz nicht nachzuweisen ist (Abbildung 77). Grundsätzlich sind die Konzentrationen beider Verbindungen jeweils auf einem ähnlichen Level in den einzelnen Proben, mit Ausnahme von drei Bieren, in denen hohe Gehalte von 1-Desoxyglucoson (> 20 µmol/L) und gleichzeitig keine bzw. nur ein geringer Gehalt von 1-Desoxymaltoson bestimmt werden können. Die Konzentrationen der beiden Reduktone korrelieren, wie auch die der 3-Desoxyosone, nicht mit den antioxidativen Eigenschaften oder der Farbe der Bierproben.

Die in den Modellversuchen nur in geringen Konzentrationen nachweisbaren Osone können, mit Ausnahme von Glucoson im Malzbier, nicht in den Bierproben bestimmt werden. Wie auch der im Verhältnis höhere 3-Desoxyglucosongehalt, kann die Glucosonkonzentration von (35 ± 6) µmol/L im Malzbier auf die Süßung mit D-Glucose und D-Fructose zurückgeführt werden. 3-Desoxypentoson als Abbauprodukt der Osone ist in Konzentrationen nachweisbar, die etwa 10 bis 30 % höher sind als die

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der 1-Desoxyosone in denselben Proben (Abbildung 117 im Anhang). Auch dies ist eine Gemeinsamkeit zu den Maltosemodellen, in denen das C5-α-Dicarbonyl verglichen mit den D-Glucosemodellen eine wichtige Rolle spielt. Dementsprechend kann in den Malzbierproben im Verhältnis zu 3-Desoxyglucoson weniger 3-Desoxypentoson gefunden werden als in anderen Bieren.

Abbildung 77: Konzentrationen der 1-Desoxyosone in den zwölf untersuchten Bierproben.

Die Gehalte der maltosespezifischen α-Dicarbonylverbindungen lassen sich nur mit einer Publikation von RAKETE et al.58 vergleichen, welche sich im Speziellen mit Pilsner Bieren auseinandersetzt. Für das im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchte Pilsner Bier kann eine Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieser Veröffentlichung festgestellt werden, mit dem Unterschied, dass die Autoren mit Hilfe von LC-MS-Messungen auch in der Lage waren Glucoson und Maltoson zu quantifizieren (> 1 µmol/L). Die von DEGEN et al.168 angegebenen Gehalte an 3-Desoxyglucoson von 111 bis 333 µmol/L und an 3-Desoxygalactoson von bis zu 98 µmol/L für zehn verschiedene Biere passen ebenfalls zu den in dieser Arbeit bestimmten Konzentrationen.

4.5.3.2 Gehalt an heterocyclischen Intermediaten

Der Nachweis der unterschiedlichen 3-Desoxyosone lässt vermuten, dass in allen Bieren, analog zu den Modellen, HMF nachgewiesen werden kann. Tatsächlich ist dies aber nur im dunklen Bock mit (12 ± 2) µmol/L und im Stout mit (42 ± 5) µmol/L der Fall. Die Konzentrationen des Furans liegen deutlich unter denen seiner Vorstufen, während in den wässrigen Maltosemodellen der HMF-Gehalt meist um etwa den Faktor 10 höher ist als jener der korrespondierenden α-Dicarbonyle. Diese Feststellung deckt sich jedoch mit bereits veröffentlichten Daten, in denen in Lebensmitteln ebenfalls nur ähnliche oder niedrigere HMF- als 3-Desoxyosonkonzentrationen nachgewiesen werden konnten.168

Von den Pyran-4-onen konnte ausschließlich DHHM, das Abbauprodukt von 1-Desoxyglucoson, in den Proben gefunden werden. Vor dem Hintergrund, dass Maltol deutlich stabiler ist als DHHM und sowohl im Wässrigen als auch im Trockenen in ähnlichen Konzentrationen beider Reduktonether gefunden wurden, scheint eine schnellere Weiterreaktion im Rahmen der MAILLARD-Reaktion

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90

unwahrscheinlich. Möglich wäre, dass Maltol in Komplexen gebunden vorliegt und deshalb analytisch nicht erfasst werden kann oder mit anderen Bestandteilen im Malz oder Bier abreagiert.

4.5.4 Analyse der hochmolekularen Verbindungen

Trotz der starken Unterschiede hinsichtlich der verwendeten Rohstoffe und der Herstellungsverfahren können mit Hilfe der GPC-Analytik für alle zwölf Biere Überschneidungen in der Molekülgewichtsverteilung sowie klare Trends in Abhängigkeit der Farbe abgeleitet werden. Dies ist insofern nachvollziehbar, dass insbesondere die farbgebenden Fraktionen vorwiegend von Zuckerabbauprodukten gebildet werden. Die Abs[420]-Chromatogramme von vier ausgewählten Bieren der Farbpalette sind in Abbildung 78 dargestellt, die entsprechenden RI-Chromatogramme sind im Anhang in Abbildung 118 zu finden.

Abbildung 78: GPC-Abs[420]-Chromatogramme von vier der untersuchten Biere.

Von quantitativ größter Bedeutung ist in allen Bieren die Domäne, die bei etwa 20 min ihr Maximum zeigt und sich mit abflachender Intensität über den gesamten mittelmolekularen Bereich erstreckt. Im Pilsner Bier gibt die gefärbte Fraktion bei etwa 19 min ein schwaches Signal bei 420 nm. Die Intensität dieser Domäne erhöht sich im stärker gefärbten Klosterbier und weitere Domänen bei 18 min sowie im hochmolekularen Bereich bei 10 min kommen hinzu. Die beiden prägnanten Molekülgewichtsfraktionen verschieben sich mit zunehmender Farbintensität der Biere in Richtung größerer Molmassen. Das dunkle Bier bezieht verstärkt Farbe aus der hochmolekularen Fraktion, obwohl diese quantitativ eine untergeordnete Rolle spielt. Der Farbbeitrag dieser Domäne ist im Schwarzbier schließlich wichtiger als die einzelnen Anteile der restlichen Fraktionen. Die Molekülgewichtsverteilung der färbenden Bestandteile im Bier ist somit nicht mit den Verhältnissen in den verschiedenen Modellen zu vergleichen. Während im Bier hochmolekulare Verbindungen und Substanzen an der Grenze zum niedermolekularen Bereich dominieren, sind in den Modellen eher mittelmolekulare Domänen relevant.

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Schwarzbier

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Klosterbier

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ZUSAMMENFASSUNG

91

5 Zusammenfassung In der Literatur ist die pro- und antioxidative Wirkung von MAILLARD-Reaktionsgemischen

beschrieben, die zumeist auf das Reduktionsvermögen sogenannter Reduktone zurückgeführt wird. Diese Verbindungen besitzen, analog zu Ascorbinsäure, eine stabilisierte Endiolfunktion, welche durch ihre Oxidation Elektronen und Protonen auf Oxidationsmittel oder Radikale übertragen kann. In früheren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass α-Dicarbonylverbindungen mit Reduktonstruktur sowie die Reduktonether Maltol und DHHM über antioxidative Eigenschaften verfügen, wobei letztere einen deutlich schnelleren Radikalabbau zeigten. 34;35 Aus diesem Grund wurden Maltol und strukturverwandte Verbindungen als potentiell starke Antioxidantien in der MAILLARD-Reaktion in den Mittelpunkt des ersten Teils dieser Arbeit gerückt.

Die antioxidativen Eigenschaften von heterocyclischen Intermediaten der MAILLARD-Reaktion können, nach den gewonnenen Erkenntnissen, direkt mit der Reduktonstruktur in Verbindung gebracht werden. Einerseits verfügen von den untersuchten Substanzen ausschließlich die Reduktonether über ähnliche antioxidative Kapazitäten wie Trolox oder Ascorbinsäure und anderseits führt das gezielte Blockieren der Reduktonfunktion zu einer signifikanten Abnahme der antioxidativen Eigenschaften. Trotz der gemeinsamen Reduktonstruktur zeigen die Reduktonether zum Teil starke Unterschiede in ihrer Reaktivität, welche sich auf andere Bestandteile der Molekülstruktur zurückführen lassen. Auffällig ist zum Beispiel, dass Maltol, Isomaltol und Maltosin im Gegensatz zu den Furan-3-onen und DHHM in Anwesenheit von Metallionen keine reduzierenden Eigenschaften besitzen. Mittels ESR-Spektroskopie konnte das aus der Literatur109–113 bekannte Komplexierungsverhalten als Ursache bestätigt werden.

Das Pyran-4-on DHHM verhält sich trotz seiner starken Ähnlichkeit zu Maltol in allen Untersuchungen eher wie die Furan-3-one, sowohl was die Reaktionsgeschwindigkeit beim Radikalabbau als auch die Bildung von Komplexen betrifft. Da grundsätzlich alle Reduktonether über die zur Komplexierung und zur Reduktion von Metallionen notwendigen funktionellen Gruppen verfügen, kann in Gegenwart von Metallionen von einer Konkurrenz beider Eigenschaften ausgegangen werden. Die stabilen aromatischen Systeme sind eher bestrebt ihren Zustand zu erhalten, weshalb ihr Reduktionsvermögen in den Hintergrund tritt. Verbindungen, die nicht über ein vollständig konjugiertes Ringsystem verfügen, wie DHHM oder die Furan-3-one, werden eher oxidiert.

Unterschiedliche Alkylsubstituenten führen zur Beeinflussung der Reaktivität, wenn sich durch die Position der Alkylgruppe eine sterische Hinderung ergibt, wie im Fall von Ethylmaltol. Die Anordnung der relevanten Strukturmerkmale der Reduktonfunktion innerhalb des Moleküls spielt ebenfalls eine Rolle. So zeigt Isomaltol, in dem die Hydroxyfunktion in α-Position zum Carbonyl den Ether bildet, deutlich geringere antioxidative Kapazitäten als die anderen Reduktonether. Sotolon und Abhexon, die formal keine Reduktonstruktur besitzen, verfügen aber über ein stabilisiertes Enol, das zumindest ein Proton und ein Elektron abstrahieren kann. Dies erklärt die beobachtete schwache antioxidative Wirkung beider Verbindungen unter alkalischen Bedingungen im FCR-Assay.

Neben den antioxidativen Eigenschaften wurde auch das prooxidative Verhalten ausgewählter Reduktonether mittels ESR-Spektroskopie untersucht. Das Reduktionsvermögen gegenüber Metallionen der Furan-3-one und DHHM führte dabei in spin-trap-Experimenten mit PBN zur Bildung

ZUSAMMENFASSUNG

92

von Radikalen. Die geschützten Derivate sowie der Komplexbildner Maltol zeigten keine Radikalgenerierung. Isomaltol wurde bei den gewählten Inkubationsbedingungen thermisch abgebaut und verhielt sich dementsprechend anders als Maltol.

Durch die Umsetzung von ausgesuchten Reduktonethern mit Oxidationsmitteln und die Analyse der Abbauprodukte konnte ein Reaktionsmechanismus entwickelt werden, der über die Oxidation der Heterocyclen direkt zu kurzkettigen organischen Säuren führt. Anhand des Musters der Spaltprodukte verschiedener Reduktonether kann davon ausgegangen werden, das Tricarbonylverbindungen die möglichen Zwischenstufen sind. Die hydrolytische β-Dicarbonylspaltung dieser Tricarbonyle und die Hydrolyse des jeweiligen Ketens führen zum nachgewiesenen Produktspektrum. Die entsprechenden Massenspuren der hochreaktiven Triketone konnten mittels EC-MS-Kopplung erfasst werden. Über die elektrochemische Oxidation wurden zusätzlich zu den korrespondierenden Spaltprodukten der hydrolytischen β-Dicarbonylspaltung auch die Produkte der oxidativen α-Spaltung gefunden, welche bei der chemischen Oxidation keine Rolle spielt.

Insgesamt konnte mit diesen Untersuchungen nachgewiesen werden, dass die heterocyclischen MAILLARD-Reaktionsprodukte Norfuraneol, Furaneol, Maltol, DHHM, Maltosin und Isomaltol über antioxidative Eigenschaften verfügen. Sie können folglich zur antioxidativen Aktivität von MAILLARD-Reaktionsgemischen beitragen und in Lebensmitteln die oxidative Stabilität erhöhen. In Anwesenheit von Metallionen sind jedoch auch prooxidative Effekte möglich.

Der Zweite Teil der Arbeit fokussierte sich auf die Bildung und den Abbau der heterocyclischen Zwischenprodukte und ihrer Vorstufen, den α-Dicarbonylverbindungen, unter MAILLARD-Bedingungen. In den entsprechenden Modellsystemen sollte ein möglicher Bezug zwischen der Konzentration der Intermediate, der Farbe und den radikalfangenden sowie metallreduzierenden Eigenschaften hergestellt werden.

Die Reaktionswege von Maltose innerhalb der MAILLARD-Reaktion sind grundsätzlich bereits in der Literatur beschrieben.43;58;170 Mit denen im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche konnten jedoch einige neue Zusammenhänge erkannt sowie bekannte bestätigt werden. So wurde erstmals die Bildung von 3-Desoxymaltoson, 3-Desoxyglucoson und 3-Desoxygalactoson sowie ihres gemeinsamen Abbauprodukts HMF aus Maltose und D-Glucose unter identischen Bedingungen untersucht. Als Aminokomponente beim Vergleich der Reaktivität der verschiedenen Kohlenhydrate diente L-Alanin. In Kombination mit Maltose wurden zusätzlich L-Prolin und L-Lysin eingesetzt. Die wichtigsten identifizierten Intermediate dieser Versuche sind mit ihren entsprechenden Konzentrationen, in denen sie nach 300 min bei 130 °C und pH 5 vorlagen, in Abbildung 79 zusammengefasst. Zu Gunsten der Übersicht sind nur die Hauptreaktionswege ohne notwendige Reaktionspartner oder Nebenprodukte dargestellt.

ZUSAMMENFASSUNG

93

Abbildung 79: MAILLARD-Reaktion von D-Glucose 1a mit L-Alanin 2b und von Maltose 1b mit L-Prolin 2a, L-Alanin 2b oder L-Lysin 2c. Die Konzentrationen der entsprechenden Verbindungen sind in µmol/L nach 300 min bei 130 °C und pH 5 angegeben (orange mit 2a, schwarz mit 2b, blau mit 2c). Folgeprodukte: Glucoson/Maltoson 6a/b, 3-Desoxyglusoson/-maltoson 7a/b, 3-Desoxygalactoson 49, 1-Desoxyglucoson/-maltoson 8a/b, 3-Desoxypentoson 26, Furfural 15, HMF 16, DHHM 18, Maltol 23.

ZUSAMMENFASSUNG

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Unter den gewählten Bedingungen werden aus D-Glucose und Maltose primär α-Dicarbonylverbindungen gebildet, die das vollständig erhaltene Rückgrat ihrer Ausgangsprodukte aufweisen. Die einzigen C6-α-Dicarbonyle, die in relevanten Mengen aus Maltose entstehen, sind 3-Desoxyglucoson und -galactoson. Diese gehen über 3,4-Didesoxyglucoson-3-en aus 3-Desoxymaltoson hervor, wie am Verhältnis der beiden C6-Körper zueinander abgeleitet werden kann. Im frühen Verlauf der Reaktion (30 min) ist ihr Verhältnis nahezu 1:1, da bei Addition von Wasser an das ungesättigte Didesoxyoson die Bildung beider Derivate etwa gleichwahrscheinlich ist. Ausgehend von D-Glucose liegt hingegen immer ein deutlicher Überschuss von 3-Desoxyglucoson vor, da 3-Desoxygalactoson nur über die Umwandlung aus dem D-Glucosederivat gebildet werden kann. Im Laufe des Abbaus von Maltose wird das Disaccharid zum Teil hydrolytisch zu D-Glucose gespalten, wobei nach 300 min 18 mmol/L des Monosaccharids nachgewiesen werden konnten. Mit einem wachsenden Anteil von D-Glucose nimmt die Relevanz der C6-α-Dicarbonyle im Maltosemodell zu und der Anteil von 3-Desoxyglucoson gegenüber -galactoson steigt entsprechend. Beide Verbindungen sind jedoch nur Nebenprodukte, denn aus 3,4-Didesoxyglucoson-3-en wird primär HMF gebildet.

Ausgehend vom Disaccharid läuft die HMF-Bildung bevorzugt ab, da D-Glucose die bessere Abgangsgruppe im Vergleich zu Wasser ist. Der HMF-Gehalt ist nach 300 min im Maltosemodell fast doppelt so hoch, obwohl intermediär die summierte Konzentration der 3-Desoxyosone niedriger ist. Ähnlich verhält es sich mit Furfural, welches aus dem Disaccharid ebenfalls in deutlich höheren Mengen entsteht. Ausgehend von beiden Kohlenhydraten können die Osone als entsprechende Vorstufen zwar nicht oder nur in geringen Mengen quantifiziert werden, aber 3-Desoxypentoson gehört in Maltosesystemen zu den dominanten α-Dicarbonylverbindungen, während es aus D-Glucose nur in Spuren gebildet wird.

DHHM geht aus beiden Kohlenhydraten hervor und wird, dem Konzentrationsverhältnis zu 1-Desoxyglucoson nach, sehr schnell gebildet. Im Gegensatz dazu entsteht Maltol ausschließlich aus Maltose und wird deutlich langsamer gebildet, da es fast in der gleichen Konzentration wie 1-Desoxymaltoson nachgewiesen wurde.

Gemessen am Abbau von Maltose ist L-Prolin weniger reaktiv als L-Alanin und L-Lysin reaktiver als L-Alanin. Der gleiche Trend kann anhand der Bräunungsmessung abgeleitet werden. Der stärkere bzw. schwächere Abbau des Kohlenhydrats führt im Allgemeinen auch zur Bildung von mehr bzw. weniger Intermediaten. Allerdings war in den Modellen mit L-Lysin weniger Furfural und Maltol nachweisbar als in den L-Alaninmodellen, was dafür spricht, dass die jeweiligen Heterocyclen in Kombination mit L-Lysin schneller abgebaut werden und/oder die Vorstufen alternative Reaktionswege einschlagen.

Die Analyse der Molekülgewichtsverteilung zeigt, dass die Aminosäure einen deutlich höheren Einfluss auf die Art der gebildeten Farbstoffe hat als die Kohlenhydratkomponente. In Kombination mit L-Alanin entstehen stark ausgeprägte hochmolekulare Domänen, während mit L-Lysin eher mittelmolekulare Fraktionen zur Bräunung beitragen. Mit D-Glucose, Maltose und Maltotriose werden in Anwesenheit von L-Alanin fast identische Domänen in unterschiedlicher Gesamtintensität gebildet.

Im Trockenen ergibt sich mit Maltose in Kombination mit L-Alanin ein ähnliches Produktspektrum, nur das aufgrund des mangelnden Wassers keine C6-3-Desoxyosone aus 3-Desoxymaltoson gebildet werden.

ZUSAMMENFASSUNG

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In allen kohlenhydratbasierten Systemen ist es möglich, die Bräunung und die antioxidative Aktivität der Reaktionsgemische zu korrelieren, wobei sowohl radikalfangende als auch metallreduzierende Eigenschaften nachgewiesen werden können. Damit kann gezeigt werden, dass zumindest unter den gewählten Bedingungen, neben farbgebenden MAILLARD-Reaktionsprodukten gleichzeitig antioxidativ wirksame Verbindungen entstehen. Durch die metallreduzierenden Bestandteile sind die Reaktionsgemische aber auch potenziell prooxidativ, allerdings ist der Anteil der metallreduzierenden Substanzen um 70 % geringer als der Anteil der radikalfangenden Verbindungen. Die Konzentrationen der nachgewiesenen Reduktonether sind jedoch zu gering, um die gesamte gemessene antioxidative Aktivität der jeweiligen Proben zu erklären. Durch die Entwicklung einer GPC-TEAC-Kopplung war es außerdem möglich zu zeigen, dass Farbe und antioxidative Eigenschaften von Fraktionen unterschiedlicher Molekülgrößen abhängig sind. Darüber hinaus besteht auch in den verschiedenen Größendomänen eine Proportionalität zwischen beiden Eigenschaften. Im trockenen System kann bei Temperaturen über 180 °C beobachtet werden, dass die Konzentration der löslichen Farbstoffe und der Antioxidantien gemeinsam abnimmt, wobei alle Molekülgewichtsfraktionen betroffen sind.

Bei der isolierten Umsetzung von Maltol, Furaneol, DHHM, HMF und Isomaltol unter MAILLARD-Bedingungen wurde festgestellt, dass die Verbindungen in genannter Reihenfolge einen steigenden Beitrag zur Farbe leisten. Maltol und HMF sind am stabilsten und zeigten keinen quantifizierbaren bzw. nur einen minimalen Abbau, während Furaneol innerhalb von 300 min großteilig, DHHM nahezu vollständig und Isomaltol vollständig abgebaut wurden. Im Unterschied zu den Kohlenhydratmodellen ergibt sich also kein Zusammenhang zwischen Farbbildung und Abbau. So bildet insbesondere HMF nur eine kleine Menge an Abbauprodukten, unter denen aber hochpotente Farbstoffe sind. Isomaltol zeigt bei gleicher Restkonzentration wie DHHM eine deutlich stärkere Farbbildung. Diese Ergebnisse können mit den bekannten Abbauprodukten der jeweiligen Intermediate erklärt werden. Für den Abbau von Maltol existieren beispielsweise keine Daten, Furaneol und DHHM sind dafür bekannt, vorwiegend farblose Produkte zu bilden, während für HMF und Isomaltol farbige Kondensationsprodukte beschrieben sind.

Im Fall der vier Reduktonether besteht ein indirekter linearer Zusammenhang von Farbe und antioxidativer Aktivität, was darauf hindeutet, dass ihre Reduktonfunktion nicht in den Folgeprodukten erhalten bleibt. Im Gegensatz dazu bildet HMF schwach antioxidative Produkte, wobei die antioxidative Aktivität der Reaktionsmischungen weit unter der Aktivität der Reduktonether liegt. Allerdings können sich die untersuchten Substanzen beim Abbau in komplexen Reaktionsmischungen anders verhalten, da hier Reaktionen mit anderen Intermediaten möglich sind, wie zum Teil in der Literatur beschrieben.92;161 Daher wäre es sinnvoll, in zukünftigen Untersuchungen die Reduktonether in Kombination mit den quantitativ relevanten Verbindungen wie HMF oder Furfural umzusetzen, um die antioxidative Aktivität von potentiellen Kondensationsprodukten mit intakter Reduktonstruktur zu untersuchen.

Aus den isolierten Modellen kann folglich nur der Farbbeitrag der Abbauprodukte abgeleitet werden, aber kein Erhalt der antioxidativen Eigenschaften. Allerdings war es möglich, insbesondere für Maltol und in einem gewissen Zeitrahmen auch für Furaneol sowie DHHM, eine Stabilität bei thermischer Belastung nachzuweisen. So kann gefolgert werden, dass diese antioxidativen MAILLLARD-Reaktionsprodukte, wenn sie einmal gebildet wurden, nicht sofort wieder abgebaut werden und daher auch im Lebensmittel, speziell bei milderen Lagerungsbedingungen, stabil bleiben.

ZUSAMMENFASSUNG

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Im letzten Teil der Arbeit wurden die Ergebnisse aus den Modellversuchen mit den Verhältnissen im Bier verglichen, da in diesem Lebensmittel neben D-Glucose und einigen anderen Monosacchariden in erster Linie Maltose und weitere D-Glucoseoligomere enthalten sind. Außerdem kommen die Prozessschritte während der Herstellung den in den Modellsystemen gewählten Bedingungen nahe. In Bier können daher die aus diesen Versuchen bekannten Produkte nachgewiesen werden, wobei die quantitative Zusammensetzung der α-Dicarbonylverbindungen zwischen der von D-Glucose- und der von Maltosemodellen liegt. So wurden zwar in allen Bierproben die maltosespezifischen Abbauprodukte nachgewiesen, aber 3-Desoxyglucoson ist analog zu den D-Glucosemodellen die vorherrschende Komponente. Der Einfluss von Maltose auf das Produktspektrum kann jedoch am Verhältnis von 3-Desoxyglucoson zu 3-Desoxygalactoson abgeleitet werden, welches deutlich dichter am System von Maltose als am System von D-Glucose liegt. Die hohen Gehalte von HMF oder Furfural der Modellversuche können im Lebensmittel nicht wiedergefunden werden. Außerdem zeigt sich der Einfluss von Bestandteilen der Lebensmittelmatrix auf die antioxidativen Eigenschaften. Eine Korrelation zwischen Bräunung und der antioxidativen Aktivität aus dem TEAC-Assay ist nicht möglich. Mit den metallreduzierenden Eigenschaften ergibt sich jedoch eine mäßige Korrelation, da sich hier der Einfluss, der zumeist komplexierend wirkenden Polyphenole, nur bedingt zeigt.

EXPERIMENTELLER TEIL

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6 Experimenteller Teil Im Folgenden sind die durchgeführten Synthesen, die Modellreaktionen sowie die

entsprechende Probenaufarbeitung, die analytischen Methoden, die verwendeten Geräte und benutzten Chemikalien aufgeführt.

6.1 Synthesen

Im Verlauf der Arbeit wurden verschiedene Chinoxaline zur Quantifizierung von maltosespezifischen α-Dicarbonylverbindungen synthetisiert. Außerdem wurden die Heterocyclen O-Galactosylisomaltol, Isomaltol und DHHM als Standards für die entsprechende Analytik und als Ausgangsprodukte für Modellversuche dargestellt. Durch Acetylierungsreaktionen wurden verschiedene Reduktonether geschützt.

6.1.1 Phenylmaltosazon

Die Synthese wurde mit leichten Modifikationen nach einer Vorschrift von OIKAWA et al.171 durchgeführt.

M in g/mol eq. n in mmol m bzw. V

Maltose-Monohydrat 360,31 1,0 83 30,0 g

Phenylhydrazin 108,14 3,7 305 30,0 mL

Wasser 200 mL

Essigsäure (konzentriert) 16,0 mL

Durchführung

30,0 mL Phenylhydrazin werden in 100 mL Wasser gelöst und mit 16 mL Essigsäure versetzt. Nach Zugabe von 30,0 g Maltose-Monohydrat in 100 mL Wasser wird die Mischung für 2 h unter Rückfluss erhitzt. In die noch heiße Lösung werden über den Rückflusskühler 300 mL Wasser gegeben.


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Aufarbeitung

Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung auf 6 °C gekühlt, um das Rohprodukt weiter auszufällen. Der Rückstand wird abfiltriert und mit Eiswasser und Hexan gewaschen. Das Produkt wird luftgetrocknet, mit Wasser in einen Kolben überführt und gefriergetrocknet.

6.1.2 Maltoson-Chinoxalin

Die Entschützung des Phenylmaltosazons sowie die Derivatisierung zum entsprechenden Chinoxalinderivat von Maltoson wurde nach SMUDA et al.43 durchgeführt.


Phenylmaltosazon 576,56 1,0 3,0 1,536 g

Salzsäure (37 Gew.-%) 36,46 2,9 8,5 0,705 mL

Natriumnitritlösung (2 mol/L) 67,00 2,0 5,9 2,95 mL

Natriumacetat 82,03 2,0 5,9 0,484 g

ortho-Phenylendiamin 108,14 1,0 3,0 0,319 g

Ethanol 10 mL

Wasser 5 mL

Durchführung

1,536 g Phenylmaltosazon werden in 10 mL Ethanol, 5 mL Wasser und 0,705 mL Salzsäure gelöst und für 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Innerhalb von 20 min werden 2,95 mL Natriumnitritlösung zur Reaktionsmischung gegeben. Anschließend wird die Lösung für 3,5 h bei 30 °C gerührt. Nach Zugabe von 0,484 g Natriumacetat wird der Rückstand abfiltriert und mit Ethanol gewaschen. Das Ethanol wird im Vakuum bei 35 °C entfernt. Die wässrige Phase wird filtriert, das


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Filtrat sechs Mal mit je 70 mL Trichlormethan extrahiert, mit 0,319 g ortho-Phenylendiamin versetzt und für 1 h bei 70 °C sowie 12 h bei Raumtemperatur gerührt.

Aufarbeitung

Nach Filtration wird das Reaktionsgemisch drei Mal mit je 25 mL Trichlormethan extrahiert. Die wässrige Phase wird für 20 min mit 2,1 g Aktivkohle gerührt und die Aktivkohle im Anschluss abfiltriert (erst Faltenfilter, dann Spritzenfilter; Nylon; 0,2 µm). Die Lösung wird unter Vakuum bei 35 °C auf ein Drittel des ursprünglichen Volumens eingeengt und gefriergetrocknet. Der Rückstand wird erst säulenchromatographisch (Kieselgel 60; Dichlormethan/Methanol, 5:2, v/v) und dann mittels semipräparativer RP-HPLC (Methanol/Wasser, 2:8, v/v) gereinigt.

Analytische Daten

1H NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 3,22 (m, 1H); 3,28 (m, 1H); 3,60 (m, 2H); 3,65 – 3,68 (m, 1H); 3,72 – 3,77 (m, 3H); 3,86 (m, 1H); 4,28 (m, 1H); 4,68 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 5,29 (d, J = 2,4 Hz, 1H); 7,77 (m, 2H); 7,93 (m, 2H); 8,97 (s, 1H). 13C NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 60,3; 62,5; 69,3; 71,5; 72,2; 72,5; 72,7; 72,8; 81,8; 99,9; 127,8; 127,9; 130,8; 131,2; 140,4; 140,5; 143,8; 155,5. RP-HPLC-DAD (analytisch; α-Dicarbonyle): tR = 26,2 min.

6.1.3 3-Desoxymaltoson-Bis(benzoylhydrazon)

Die Synthese wurde in modifizierter Form nach den Vorschriften für 3-Desoxyglucoson von EL

KHADEM et al.172 und MADSON et al.173 sowie für Maltoson nach BARTH174 durchgeführt.


Maltose-Monohydrat 360,31 1,0 139 50,0 g

para-Toluidin 107,16 0,9 128 13,75 g

Benzhydrazid 136,15 2,2 303 41,25 g

Natriumchlorid 25,0 g

Wasser 475 mL

Essigsäure (konzentriert) 25 mL


100

Durchführung

50,0 g Maltose-Monohydrat, 13,75 g para-Toluidin und 25,0 g Natriumchlorid werden in 475 mL Wasser und 25 mL Essigsäure unter Rühren bei 60 °C für 12 h unter Argonatmosphäre gelöst. Nach Zugabe von 13,75 g Benzhydrazid wird für weitere 48 h bei 60 °C unter Argonatmosphäre gerührt.

Aufarbeitung

Nach dem Abkühlen wird das Reaktionsgemisch über Nacht bei – 21 °C gelagert. Die eiskalte Suspension wird vakuumfiltriert und mit Eiswasser gewaschen. Der Rückstand wird getrocknet und es ergeben sich 2,141 g eines bräunlichen Feststoffes (3 % Ausbeute).

6.1.4 3-Desoxymaltoson-Chinoxalin

Die Entschützung des Bis(benzoylhydrazons) sowie die Derivatisierung zum entsprechenden Chinoxalinderivat des 3-Desoxymaltosons wurde nach SMUDA et al.43 durchgeführt.


3-Desoxymaltoson-Bis(benzoylhydrazon) 560,56 1,0 3,8 2,141 g

Salzsäure (37 Gew.-%) 36,46 2,8 10,8 0,895 mL

Natriumnitritlösung (2 mol/L) 67,00 2,0 7,5 3,75 mL

Natriumacetat 82,03 2,0 7,5 0,615 g


Ethanol 40 mL

Wasser 20 mL


101

Durchführung

2,141 g 3-Desoxymaltoson-Bis(benzoylhydrazon) werden in 40 mL Ethanol, 20 mL Wasser und 0,895 mL Salzsäure gelöst und für 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Innerhalb von 20 min werden 3,75 mL Natriumnitritlösung zur Reaktionsmischung gegeben. Anschließend wird die Lösung für 7 h bei 30 °C gerührt. Nach Zugabe von 0,615 g Natriumacetat wird der Rückstand abfiltriert und mit Ethanol gewaschen. Die wässrige Phase wird filtriert, das Filtrat fünf Mal mit je 80 mL Dichlormethan extrahiert, mit 0,406 g ortho-Phenylendiamin versetzt und für 1 h bei 70 °C sowie 12 h bei Raumtemperatur gerührt.

Aufarbeitung

Nach Filtration wird das Reaktionsgemisch vier Mal mit je 75 mL Dichlormethan extrahiert. Die wässrige Phase wird für 20 min mit 2 g Aktivkohle gerührt und die Aktivkohle im Anschluss abfiltriert (erst Faltenfilter, dann Spritzenfilter; Nylon; 0,2 µm). Die Lösung wird unter Vakuum bei 35 °C auf ein Drittel des ursprünglichen Volumens eingeengt und gefriergetrocknet. Der Rückstand wird erst säulenchromatographisch (Kieselgel 60; Dichlormethan/Methanol, 5:2, v/v) und dann mittels semipräparativer RP-HPLC (Methanol/Wasser, 2:8, v/v) gereinigt.

Analytische Daten

1H NMR (700 MHz, D2O): δ [ppm] = 3,20 – 3,29 (m, 3H); 3,32 (m, 1H); 3,54 – 3,58 (m, 2H); 3,62 – 3,74 (m, 4H); 3,83 (m, 1H); 4,25 (m, 1H); 4,75 (d, J = 3,8 Hz, 1H); 7,78 (m, 2H); 7,95 (m, 2H); 8,77 (s, 1H). 13C NMR (700 MHz, D2O): δ [ppm] = 35,5; 60,3; 62,6; 69,4; 71,3; 72,4; 72,8; 73,4; 78,4; 99,1; 127,4; 127,9; 130,4; 131,1; 140,0; 140,9; 146,7; 154,4. RP-HPLC-DAD (analytisch; α-Dicarbonyle): tR = 34,7 min.

6.1.5 1-Desoxymaltoson-Chinoxalin

Die Isolation des Chinoxalinderivats von 1-Desoxymaltoson aus einer Maltose/L-Lysin-Reaktionsmischung wurde nach SMUDA et al.43 durchgeführt.


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Maltose-Monohydrat 360,31 1,0 2,10 0,756 g

L-Lysin-Hydrochlorid 182,65 1,0 2,10 0,384 g


Phosphatpuffer (0,1 mol/L; pH 7,4) 50 mL

Durchführung

0,756 g Maltose-Monohydrat, 0,384 g L-Lysin-Hydrochlorid und 0,027 g ortho-Phenylendiamin werden in 50 mL Phosphatpuffer gelöst und für 5 h unter Rückfluss erhitzt.

Aufarbeitung

Die Reaktionslösung wird gefriergetrocknet, der Rückstand in 10 mL Wasser aufgenommen und per semipräparativer RP-HPLC (Methanol/Wasser, 1:4, v/v) das 1-Desoxymaltoson-Chinoxalin von der Matrix abgetrennt.

Analytische Daten

1H-NMR (500 MHz, D2O): δ [ppm] = 2,18 (dd, J = 1,8 Hz, J = 12,5 Hz, 1H); 2,64 (m, 1H); 2,79 (s, 3H); 2,89 (dd, J = 4,0 Hz, J = 12,5 Hz, 1H), 3,16 (t, J = 9,9 Hz, 1H); 3,29 (dd, J = 5,2 Hz, J = 12,0 Hz, 1H); 3,46 (m, 2H); 3,65 (t, J = 9,6 Hz, 1H); 4,22 (m, 1H); 5,05 (d, J = 7,6 Hz, 1H); 5,18 (d, J = 4,0 Hz, 1H); 7,75 (m, 2H); 7,90 (m, 1H); 7,97 (m, 1H). 13C-NMR (150 MHz, D2O): δ [ppm] = 21,5; 58,7; 61,5; 68,8; 71,7; 72,1; 72,7; 74,2; 80,4; 101,8; 127,0; 127,3; 130,5; 131,3; 139,8; 140,3; 153,1; 153,7. RP-HPLC-DAD (analytisch; α-Dicarbonyle): tR = 25,4 min.

6.1.6 Dihydrohydroxymaltol

Das Pyranon DHHM wurde mit Modifikationen nach den Vorschriften von KIM et al.,52 VOIGT et

al.66 und DAVIDEK et al.175 synthetisiert.


103


D-Glucose 180,16 1,0 200 36,03 g

Piperidin 85,15 1,0 200 19,8 mL

Essigsäure 60,05 1,0 200 11,4 mL

Ethanol 180 mL

Durchführung

36,03 g D-Glucose und 19,8 mL Piperidin werden in 150 mL Ethanol gelöst und für 90 min unter Rückfluss erhitzt. Über den Rückflusskühler wird ein Gemisch aus 30 mL Ethanol und 11,4 mL Essigsäure langsam zugetropft und die Mischung wird für weitere 22 h unter Rückfluss gerührt.

Aufarbeitung

Nach dem Abkühlen wird die Suspension im Vakuum bei 35 °C auf ein Drittel des ursprünglichen Volumens eingeengt, der Rückstand abfiltriert und mit 250 mL iso-Propanol gewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum bei 35 °C bis zur Trockene eingeengt und der Rückstand in 200 mL Wasser aufgenommen. Nach Zugabe von 60 g Natriumchlorid wird der pH-Wert auf 4,0 eingestellt und das Produkt über Nacht mittels Rotationsperforator (300 mL) mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird säulenchromatographisch (Kieselgel 60; Petrolether/Ethylacetat, 1:1, v/v) und durch Vakuumdestillation (0,1 mbar; 180 °C; Fraktion zwischen 120 und 127 °C) gereinigt. Nach Überschichtung des Rückstands mit 50 mL Diethylether kristallisiert über Nacht bei –20 °C das Produkt aus. Die Kristalle werden vom Lösungsmittel getrennt und die Kristallisation wird mit 20 mL Diethylether wiederholt. Es ergeben sich 1,933 g Produkt als beigefarbener, geruchloser Feststoff (7 % Ausbeute).

Analytische Daten

1H-NMR (500 MHz, Methanol-d4): δ (ppm) = 2,03 (s, 3H); 4.07 (dd, J = 11,15 Hz; J = 9,60 Hz, 1H); 4.17 (dd, J = 9,63 Hz; J = 4,68 Hz, 1H); 4,32 (dd, J = 11,18 Hz; J = 4,68 Hz, 1H). 13C-NMR (125 MHz, Methanol-d4): δ (ppm) = 15,5; 69,0; 72,7; 132,8; 161,1; 189,2. GC-MS (Heterocyclen): tR = 24,30 min; m/z = 144 [M+, 57 %], 101 (49), 73 (31), 55 (24), 43 (100).


104

6.1.7 O-Galactosylisomaltol

Die Synthese wurde mit geringfügigen Modifikationen nach FOX et al.176 durchgeführt.


Lactose-Monohydrat 360,31 1,0 500 180 g

Piperidin 85,15 1,0 500 50 mL

Essigsäure 60,05 1,0 500 29 mL

Triethylamin 50 mL

Ethanol 150 mL

Durchführung

180 g Lactose-Monohydrat werden in 150 mL Ethanol suspendiert. Nach der Zugabe von 50 mL Piperidin wird die Suspension auf 78 °C erhitzt und unter Rühren werden über einen Tropftrichter langsam 29 mL Essigsäure zugegeben. Nach Zugabe von 25 mL Triethylamin wird die Lösung für 36 h bei 78 °C gerührt, wobei nach 12 h 25 mL Triethylamin nachgelegt werden.

Aufarbeitung

Das Reaktionsgemisch wird 1 h mit Eis gekühlt, anschließend vakuumfiltriert und der Rückstand mit Ethanol gewaschen. Der bräunliche Filterkuchen wird in Ethanol aufgenommen und erneut filtriert. Der nun beigefarbene Rückstand wird in einen Kolben überführt und das Lösungsmittel bei 35 °C im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt (39,02 g; 27 % Ausbeute) wird in kleinen Portionen (ca. 2,5 g) in Methanol umkristallisiert, wonach sich ein weißer Feststoff ergibt.

Analytische Daten

1H-NMR (500 MHz, D2O): δ (ppm) = 2,35 (s, 3H) 6,54 (d, J = 2,12 Hz, 1H); 3,71 – 3,74 (m, 3H); 3,81 – 3,86 (m, 2H); 3,96 (d, J = 3,35 Hz, 1H); 5,06 (d, J = 7,80 Hz, 1H); 6,62 (d, J = 2,05, 1H) 7,62 (d, J = 2,05 Hz, 1H). 13C-NMR (125 MHz, D2O): δ (ppm) = 26,1; 60,7; 68,3; 70,2; 72,5; 75,9; 101,9; 104,4; 137,5; 148,7; 154,1; 189,2. ESI-MS: m/z = 289 [M+H, 2 %], 127 [Isomaltol+H, 100 %], 311 [M+Na, 91 %], 327 [M+K, 28 %], 306 [M+NH4, 3 %].


105

6.1.8 Isomaltol

Die Synthese wurde mit geringfügigen Modifikationen nach FOX et al.176 durchgeführt.


O-Galactosylisomaltol 288,25 1,0 9,0 2,606 g

β-Galactosidase (13,4 U/mg) 0,022 g

Wasser 100 mL

Durchführung

2,606 g O-Galactosylisomaltol werden in 100 mL Wasser gelöst. Nach Zugabe von 22 mg β-Galactosidase wird die Lösung für 24 h bei Raumtemperatur gerührt.

Aufarbeitung

Das Reaktionsgemisch wird spritzenfiltriert (Nylon; 0,2 µm) und dreimal mit je 200 µL Ethylacetat extrahiert. Die vereinigte organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel bei 35 °C im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird bei 90 °C sublimiert (Kreislaufkühler mit –29 °C Solltemperatur und unter Hochvakuum). Das Sublimat wird in Ethylacetat aufgenommen und das Lösungsmittel bei 35 °C im Vakuum entfernt, wonach sich 0,878 g Produkt ergeben (77 % Ausbeute).

Analytische Daten

1H-NMR (500 MHz, Dichlormethan-d2): δ (ppm) = 2,42 (s, 3H); 6,34 (d, J = 2,04 Hz, 1H); 7,36 (d, J = 2,03 Hz, 1H). 13C-NMR (125 MHz, Dichlormethan-d2): δ (ppm) = 24,4; 104,7; 137,0; 146,2; 156,7; 189,8. GC-MS: tR = 18,50 min; m/z = 126 [M+, 68 %], 111 (100), 83 (8), 55 (23), 43 (28).


106

6.1.9 Acetylierung mit Essigsäureanhydrid

Die freien Hydroxyfunktionen ausgewählter Reduktonether wurden durch Umsetzung mit Essigsäureanhydrid nach einer Vorschrift von SASAKI et al.177 durch Acetylgruppen geschützt. Die Synthese ist nachfolgend exemplarisch an Maltol beschrieben.


Maltol 126,11 1,0 39,0 4,918 g

Essigsäureanhydrid 102,09 1,0 39,0 3,7 mL

4-(Dimethylamino)-pyridin 122,17 0,005 0,2 0,020 g

Dichlormethan (wasserfrei) 50 mL

Pyridin (wasserfrei) 50 mL

Durchführung

4,918 g Maltol und 20 mg 4-(Dimethylamino)-pyridin werden in 50 mL Dichlormethan und 50 mL Pyridin gelöst und die Lösung wird in einem Eisbad auf 0 °C gekühlt. 3,7 mL Essigsäureanhydrid werden langsam unter ständigem Rühren über einen Tropftrichter zugegeben und das Reaktionsgemisch wird anschließend für 10 min bei 0 °C und 6 h bei 80 °C gerührt.

Aufarbeitung

Die noch heiße Lösung wird in 60 mL eiskalte Salzsäurelösung (0,5 mol/L) gegeben und drei Mal mit 20 mL Diethylether extrahiert. Die vereinigte organische Phase wird je zwei Mal mit 20 mL Essigsäurelösung (0,5 mol/L) und 20 mL Natriumhydrogencarbonatlösung (gesättigt) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel bei 35 °C im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Kieselgel 60; Ethylacetat/Petrolether, 1:1, v/v) gereinigt.


107

Analytische Daten – O-Acetylmaltol

1H-NMR (500 MHz, D2O): δ (ppm) = 2,31 (s, 3H); 2,34 (s, 3H); 6,53 (d, J = 5,65 Hz, 1H); 8,06 (d, J = 5,65 Hz, 1H). 13C-NMR (125 MHz, D2O): δ (ppm) = 14,5; 19,6; 115,5; 137,3; 157,5; 163,4; 171,0; 175,0. GC-MS: tR = 28,33 min; m/z = 168 [M+, 4 %], 126 (100), 71 (33), 55 (17), 43 (87).

Analytische Daten – O-Diacetylfuraneol

1H-NMR (500 MHz, Dichlormethan-d2): δ (ppm) = 2,16 (s, 3H); 2,24 (s, 3H). 13C-NMR (125 MHz, Dichlormethan-d2): δ (ppm) = 10,9; 20,0; 128,0; 138,0; 167,8. GC-MS: tR = 27,81 min; m/z = 212 [M+, 17 %], 170 (35), 128 (99), 127 (26), (31), 43 (100).

6.1.10 Acetylierung mit Acetylchlorid

Die freien Hydroxyfunktionen ausgewählter Reduktonether wurden durch Umsetzung mit Acetylchlorid nach einer Vorschrift von SASAKI et al.177 durch Acetylgruppen geschützt. Die Synthese ist nachfolgend exemplarisch an Isomaltol beschrieben.


Isomaltol 126,11 1,0 14,0 1,765 g

Acetylchlorid 78,50 1,0 14,0 1,0 mL

4-(Dimethylamino)-pyridin 122,17 0,005 0,07 0,009 g

Dichlormethan (wasserfrei) 20 mL

Pyridin (wasserfrei) 20 mL

Durchführung

1,765 g Isomaltol und 9 mg 4-(Dimethylamino)-pyridin werden in 20 mL Dichlormethan und 20 mL Pyridin gelöst und die Lösung wird in einem Eisbad auf 0 °C gekühlt. 1,0 mL Acetylchlorid werden langsam unter ständigem Rühren mit einer Spritze zugegeben und das Reaktionsgemisch wird anschließend für 10 min bei 0 °C und für 3 h bei Raumtemperatur gerührt.


108

Aufarbeitung

Die noch heiße Lösung wird in 60 mL eiskalte Salzsäurelösung (0,5 mol/L) gegeben und drei Mal mit 60 mL Diethylether extrahiert. Die vereinigte organische Phase wird je zwei Mal mit 60 mL Essigsäurelösung (0,5 mol/L) und 60 mL Natriumhydrogencarbonatlösung (gesättigt) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel bei 35 °C im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (Kieselgel 60; Ethylacetat) gereinigt.

Analytische Daten – O-Acetylisomaltol

1H-NMR (500 MHz, Dichlormethan-d2): δ (ppm) = 2,35 (s, 3H); 2,45 (s, 3H); 6,67 (d, J = 2,00 Hz, 1H); 7,52 (d, J = 2,00 Hz, 1H). 13C-NMR (125 MHz, Dichlormethan-d2): δ (ppm) = 20,6; 26,8; 108,6; 140,8; 143,1; 144,5; 167,2; 185,4. GC-MS: tR = 26,02 min; m/z = 168 [M+, 7 %], 126 (54), 111 (77), 43 (100), 42 (5).

Analytische Daten – O-Acetylfuraneol

1H-NMR (500 MHz, D2O): δ (ppm) = 1,44 (d, J = 7,25 Hz, 3H); 2,22 (s, 3H); 2,27 (s, 3H); 4,83 (q, J = 7,10 Hz, 1H). 13C-NMR (125 MHz, D2O): δ (ppm) = 13,6; 15,3; 19,5; 82,8; 128,2; 171,0; 185,5; 199,2. GC-MS: tR = 25,88 min; m/z = 170 [M+, 5 %], 128 (32), 85 (38), 72 (10), 57 (28), 43 (100).


109

6.2 Modellreaktionen in wässriger Lösung

Der Abbau verschiedener Kohlenhydrate und Heterocyclen unter MAILLARD- bzw. Karamellisierungsbedingungen wurde in wässrigen Modellsystemen bei 130 °C, verschiedenen pH-Werten (5 und 8) und Reaktionszeiten (0 min; 30 min; 60 min; 120 min; 180 min; 300 min) untersucht. Die eingesetzten Kombinationen und die jeweils angelegten Bedingungen sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Tabelle 2: Zusammensetzung der wässrigen Modellsysteme (Konzentrationen und Einwaagen sind auf ein Volumen von 20 mL bezogen; Maltose wurde als Monohydrat eingesetzt).

Kohlenhydrat Heterocyclus

Konzentration in mmol/L

Einwaage in g

Aminosäure Konzentration

in mmol/L Einwaage

in g pH-

Wert

D-Glucose 200 0,7206 L-Alanin 200 0,3564 5 und 8

Maltose 200 1,4412 - - - 5 und 8

Maltose 200 1,4412 L-Alanin 200 0,3564 5 und 8

Maltose 200 1,4412 L-Prolin 200 0,4605 5 und 8

Maltose 200 1,4412 L-Lysin 200 0,5848 5 und 8

Maltotriose 200 2,0178 L-Alanin 200 0,3564 5

HMF 20 0,0504 L-Alanin 20 0,0356 5

Maltol 20 0,0504 L-Alanin 20 0,0356 5

Furaneol 20 0,0513 L-Alanin 20 0,0356 5

DHHM 20 0,0577 L-Alanin 20 0,0356 5

Isomaltol 20 0,0504 L-Alanin 20 0,0356 5

Durchführung

Zur Anfertigung der Modelle werden die Edukte entsprechend ihrer Ausgangskonzentration in ein Becherglas eingewogen und nach Zugabe von 20 mL Wasser mit einer Vollpipette unter Rühren gelöst. Der pH-Wert wird am pH-Meter mit Salzsäure- bzw. Natriumhydroxidlösung auf (5,0 ± 0,1) bzw. auf (8,0 ± 0,1) eingestellt. Je 2,5 mL der fertigen Lösung werden mit einer Spritze in eine Spießampulle gegeben, welche durch Abschmelzen der Spitze versiegelt wird. Die Ampullen werden für eine definierte Zeit (30 min; 60 min; 120 min; 180 min; 300 min) bei (130 ± 1) °C in einem Heizblock inkubiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden je 500 µL der Reaktionsmischung mit 500 µL ortho-Phenylendiaminlösung (50 mmol/L) derivatisiert (24 h unter Lichtsausschluss bei Raumtemperatur). Der Rest der Lösung wird für weitere Untersuchungen unbehandelt bei –21 °C gelagert. Die Blindproben (0 min) werden analog behandelt.

Die Anfertigung der Proben erfolgt in dreifacher Ausführung. Jeder Ansatz wird untersucht und die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.


110

6.3 Modellreaktionen im trockenen System

Zur Nachbildung von Röstprozessen wie dem Mälzen oder der Röstmalzherstellung wurden Modellsysteme mit geringem Wassergehalt, nachfolgend trockene Systeme genannt, angefertigt. Als Kohlenhydrat wurde Maltose, als Aminokomponente L-Alanin und als Füllmaterial Cellulose eingesetzt.

Durchführung

0,5000 g Maltose-Monohydrat (2,1 mmol), 0,1116 g L-Alanin (2,1 mmol), 8,3884 g mikrokristalline Cellulose und 1,0 mL Wasser werden in einem Mörser homogenisiert. 1,5 g des Gemisches werden in ein 20 mL Headspace-Vial überführt und für eine definierte Zeit (5 min; 15 min; 30 min) bei (160 ± 1) °C, (180 ± 1) °C, (200 ± 1) °C und (220 ± 1) °C in einem Aluminiumblock im Trockenschrank inkubiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden je 0,50 g des Feststoffs in 5,0 mL Wasser aufgenommen und für 1 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Suspension wird zentrifugiert und der Überstand analog zu den wässrigen Modellen behandelt.

Die Anfertigung der Proben erfolgt in dreifacher Ausführung. Jeder Ansatz wird untersucht und die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.

6.4 Lebensmittelproben

Aliquote von zwölf kommerziell erhältlichen Bieren werden spritzenfiltriert (Nylon; 0,2 µm) und analog zu den Proben der wässrigen Modellsysteme behandelt. Alle Analysen erfolgen in Dreifachbestimmung und die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben.

6.5 Oxidation ausgewählter Reduktonether

Ausgewählte Reduktonether wurden im Wässrigen mit Iod, Kaliumnitrosodisulfonat oder Eisen(III)-ionen inkubiert, um in qualitativen Versuchen ihr Spektrum an Oxidationsprodukten zu ermitteln.

Durchführung (Kaliumnitrosodisulfonat und Eisen(III)-ionen)

Es werden wässrige Lösungen der Reduktonether mit einer Konzentration von 20 mmol/L angefertigt. In je 20 mL dieser Lösungen (0,4 mmol Redukton) werden 0,2147 g (0,8 mmol), 0,2683 g (1,0 mmol) oder 0,5366 g (2,0 mmol) Kaliumnitrosodisulfonat bzw. 0,3232 g (0,8 mmol) Eisen(III)-nitrat-Nonahydrat aufgenommen. Nach Inkubation für 12 h bei Raumtemperatur in 100 mL-Schraubdeckelgefäßen werden die Proben bei –21 °C gelagert. Bei der Umsetzung von Reduktonethern, die nur langsam mit Kaliumnitrosodisulfonat reagieren, kann Phosphatpuffer (50 mM; pH 7,4) zur Stabilisierung des Radikals verwendet und die Inkubationszeit verlängert werden.


111

Durchführung (Iodlösung)

Es werden wässrige Lösungen der Reduktonether mit einer Konzentration von 20 mmol/L angefertigt. Zu je 10 mL dieser Lösungen werden langsam und unter Rühren 4 mL Iod-/Iodidmaßlösung (50 mmol/L) mit einer Spritze zugegeben. Nach der Zugabe von je 1 mL Iodlösung wird der pH-Wert mit Natriumhydroxidlösung auf pH 5 eingestellt und nach 4 mL auf pH 7 justiert.

6.6 Analytische Methoden

Die in den vorhergehenden Kapiteln beschriebenen Syntheseprodukte, Modellsysteme und Oxidationsprodukte wurden mit verschiedenen analytischen Methoden untersucht, welche im Folgenden vorgestellt werden.

6.6.1 Bestimmung der Farbe

Die Farbmessung der Proben aus den Modellversuchen und der Lebensmittel wird spektralphotometrisch bei 420 nm durchgeführt. Die Proben werden mit Wasser verdünnt, sodass die jeweilige Extinktion unter 1,4 liegt. Die ermittelten Extinktionen werden zur Vergleichbarkeit aller Proben mit ihrem Verdünnungsfaktor multipliziert und als Bräunungsindices angegeben. Alle Messungen wurden in Quarzküvetten gegen Wasser als Blindwert durchgeführt.

6.6.2 Bestimmung der antioxidativen Kapazität

Die antioxidative Kapazität der verschiedenen Heterocyclen wurde mit den im Folgenden beschriebenen fünf Methoden durchgeführt. Zur Kalibrierung wurde jeweils Trolox als Referenz verwendet und alle Ergebnisse wurden als „mmol Troloxäquivalente pro mol Substanz“ (mmol TE/mol) angegeben.

6.6.2.1 TEAC-Assay

Der in dieser Arbeit zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität verwendete TEAC-Assay beruht auf Bildung von blau-grün-gefärbten Radikalkationen des 2,2‘-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonats) (ABTS) durch den Radikalstarter Kaliumperoxodisulfat (KPDS) bzw. auf der Unterdrückung der Radikalbildung durch ein Antioxidationsmittel. Das eingesetzte Antioxidans reagiert dabei direkt mit dem Radikalstarter oder mit im Verlauf des Assays gebildeten ABTS-Radikalkationen bis zur Erschöpfung seiner Konzentration. Die durch den Überschuss an KPDS gebildeten Radikalkationen können im Vergleich zur Referenz photometrisch gemessen werden.102


112

Reagenzien

10 mmol/L Trolox-Stammlösung in Ethanol (125,2 mg Trolox auf 50 mL) Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit pH 7,2 bis 7,4 (8,766 g Natriumchlorid, 0,714 g

Dikaliumhydrogenphosphat und 0,123 g Kaliumdihydrogenphosphat in 1 L membranfiltriertem Wasser)

10 mmol/L KPDS-Lösung in PBS (135 mg KPDS auf 50 mL) 0,5 mmol/L ABTS-Lösung in PBS (55 mg ABTS auf 200 mL)

Kalibrierreihe

Aus der mit PBS 1:10-verdünnten Trolox-Stammlösung werden in Mikroreaktionsgefäßen (1,5 mL) gemäß dem Schema in Tabelle 3 die einzelnen Kalibrierlösungen hergestellt.

Tabelle 3: Pipettierschema für die Trolox-Kalibrierreihe.

Standard Konzentration

in mmol/L

Volumen an verdünnter Trolox-Stammlösung

in µL

Volumen an PBS

in µL

1 0,05 50 950

2 0,10 100 900

3 0,20 200 800

4 0,30 300 700

5 0,40 400 600

6 0,50 500 500

Durchführung

Es werden jeweils 150 µL Probe (bzw. Kalibrierlösung) in Mikroreaktionsgefäßen (1,5 mL) vorgelegt. Sollte es notwendig sein, werden die Proben zuvor mit PBS verdünnt. Anschließend werden alle Proben mit 750 µL ABTS-Lösung versetzt und homogenisiert. Die Zugabe von jeweils 300 µL KPDS-Lösung erfolgt samt Homogenisierung der jeweiligen Probe im Abstand von genau 15 s. Die Absorption der Proben wird in Halbmikroküvetten (Kunststoff) nach exakt 6 min im Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 734 nm gegen eine leere Küvette gemessen. Die Quantifizierung erfolgt stets gegen die mitgeführte Kalibrierung.

6.6.2.2 FCR-Assay

Der FCR-Assay basiert auf der Reduktion des FOLIN–CIOCALTEU-Reagenz‘ (FCR) durch ein Antioxidans im Alkalischen. Dabei wird ein bläulicher Farbstoff gebildet, welcher photometrisch im Vergleich zur Referenz gemessen werden kann.102


113

Reagenzien

10 mmol/L Trolox-Stammlösung in Ethanol (125,2 mg Trolox auf 50 mL) 1:10 verdünntes FCR (25 mL FCR auf 250 mL) 7,5 %ige Natriumcarbonatlösung (7,5 g Natriumcarbonat auf 100 mL)

Kalibrierreihe

Aus der mit Wasser 1:5-verdünnten Trolox-Stammlösung werden in Mikroreaktionsgefäßen (1,5 mL) gemäß dem Schema in Tabelle 4 die einzelnen Kalibrierlösungen hergestellt. Als Blindwert dient Wasser.



in mmol/L


in µL

Volumen an Wasser

in µL

1 0,2 100 900

2 0,5 250 750

3 1,0 500 500

4 1,5 750 250

5 2,0 1000 0

Durchführung

Es werden jeweils 150 µL Probe (bzw. Kalibrierlösung oder Blindwert) in Mikroreaktionsgefäßen (1,5 mL) vorgelegt. Sollte es notwendig sein, werden die Proben zuvor mit Wasser verdünnt. Alle Proben werden mit 750 µL verdünnter FCR-Lösung versetzt und homogenisiert. Anschließend erfolgt die Zugabe von 600 µL Natriumcarbonatlösung und nach erneuter Homogenisierung die Inkubation der Proben bei 35 °C für 15 min. Die Absorption der Proben wird in Halbmikroküvetten (Kunststoff) im Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 736 nm gegen den Blindwert gemessen. Die Quantifizierung erfolgt stets gegen die mitgeführte Kalibrierung.

6.6.2.3 ESR-Methode

Die eingesetzte ESR-Methode basiert auf dem Abbau des stabilisierten Radikals Kaliumnitrodisulfonat (FRÉMYs Salz) durch ein Antioxidans. Das bei einem phosphatgepuffertem pH-Wert von 7,4 stabile Radikal kann aufgrund seines ungepaarten Elektrons mit Hilfe von ESR-Spektroskopie gemessen werden. Die Fläche des Signals korreliert mit der Radikalkonzentration und somit ist die Messung des Radikalabbaus durch ein Antioxidans im Vergleich zur Referenz möglich.178


114

Reagenzien

10 mmol/L Trolox-Stammlösung in Ethanol (125,2 mg Trolox auf 50 mL) 50 mmol/L Phosphatpuffer mit pH 7,4 Kaliumnitrosodisulfonatstammlösung in Phosphatpuffer (ungefähr 300 mg

Kaliumnitrosodisulfonat auf 100 mL)

Kalibrierung

Die Trolox-Stammlösung wird 1:40 mit Wasser verdünnt (Kalibrierlösung). Die Kaliumnitrosodisulfonatstammlösung wird mit Phosphatpuffer so verdünnt (Radikalarbeitslösung; etwa 1:10), dass beim in der Durchführung beschriebenen Einsatz der Kalibrierlösung ein (50 ± 10) %iger Radikalabbau verursacht wird.

Durchführung

Für die Messung des Radikalabbaus werden die in Tabelle 5 aufgeführten Geräteeinstellungen verwendet.

Tabelle 5: Einstellungen des ESR-Spektrometers zur Messung des Radikalabbaus.

Parameter Wert

Feld 338,8 mT

Scanbereich 7,0 mT

Scanzeit 30 s

Modulationsamplitude 0,150 mT

Mikrowellenabschwächung 10 dB

Signalverstärkung 6x101

Messintervall 60 s

Messzeitraum 30 min

Die Proben werden präpariert, indem 100 µL Radikalarbeitslösung und 100 µL Probe (bzw. Kalibrierlösung oder Puffer für den Blindwert) für 10 s mit einem Vortexmischer homogenisiert und anschließend in eine ESR-Kapillare überführt werden. Die 30-minütige Messzeit startet exakt in dem Moment, in dem Radikalarbeitslösung und Probe zusammengegeben werden. Der Wert bei 0 min entspricht dem Blindwert. Über das Flächenverhältnis der Werte bei 30 min und bei 0 min kann der jeweilige Radikalabbau berechnet werden.

6.6.2.4 CUPRAC-Assay (Multiplattenmethode)

Der CUPRAC-Assay basiert auf der Reduktion von Kupfer(II)-ionen durch ein Antioxidans und der Bildung eines farbigen Komplexes aus Kupfer(I)-ionen und je zwei Molekülen Bathocuproindisulfonat (BCS). Die Bildung dieses Komplexes kann photometrisch im Verhältnis zur Referenz bestimmt werden.102


115

Reagenzien

10 mmol/L Trolox-Stammlösung in Ethanol (125,2 mg Trolox auf 50 mL) 10 mmol/L Kupfer(II)-lösung (24,9 mg Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat auf 10 mL) 0,63 mmol/L BCS-Lösung (4,3 mg Natrium-BCS auf 12 mL)

Kalibrierreihe




in mmol/L


in µL

Volumen an Wasser

in µL

1 0,000 0 1000

2 0,010 100 900

3 0,025 250 750

4 0,040 400 600

5 0,055 550 450

6 0,070 700 300

7 0,085 850 150

8 0,100 1000 0

Durchführung

Es werden jeweils 50 µL Wasser in eine Kavität einer 96-Loch-Mikrotiterplatte vorgelegt und mit 100 µL BCS-Lösung und 50 µL Probe (bzw. Kalibrierlösung oder Blindwert) versetzt. Nach Messung der initialen Absorption bei 490 nm werden je 50 µL der 1:40 verdünnten Kupfer(II)-lösung (0,25 mmol/L) zugegeben. Nach 30 min Inkubationszeit wird erneut die Absorption bei 490 nm gemessen. Sollte es notwendig sein, werden die Proben zuvor mit Wasser verdünnt. Die Quantifizierung erfolgt stets gegen die mitgeführte Kalibrierung.

6.6.2.5 Phenanthrolinassay (Multiplattenmethode)

Der Phenanthrolinassay basiert auf der Reduktion von Eisen(III)-ionen durch ein Antioxidans und der Bildung eines farbigen Komplexes aus Eisen(II)-ionen und je zwei Molekülen Phenanthrolin. Die Bildung dieses Komplexes kann photometrisch im Verhältnis zur Referenz bestimmt werden.102


116

Reagenzien

10 mmol/L Trolox-Stammlösung in Ethanol (125,2 mg Trolox auf 50 mL) 10 mmol/L Eisen(III)-lösung (101,0 mg Eisen(III)-nitrat-Nonahydrat auf 25 mL) 6,66 mmol/L Phenanthrolinlösung (60,0 mg Phenanthrolin auf 50 mL)

Kalibrierreihe


Durchführung

Es werden jeweils 120 µL Wasser in eine Kavität einer 96-Loch-Mikrotiterplatte vorgelegt und mit 40 µL Phenanthrolinlösung und 50 µL Probe (bzw. Kalibrierlösung oder Blindwert) versetzt. Nach Messung der initialen Absorption bei 510 nm werden je 40 µL der 1:5 verdünnten Eisen(III)-lösung (2 mmol/L) zugegeben. Nach 180 min Inkubationszeit wird erneut die Absorption bei 510 nm gemessen. Sollte es notwendig sein, werden die Proben zuvor mit Wasser verdünnt. Die Quantifizierung erfolgt stets gegen die mitgeführte Kalibrierung.

6.6.3 Bestimmung der antioxidativen Aktivität

Die antioxidative Aktivität als Summenparameter aller Antioxidantien in einer Probe wurde mit den nachfolgend beschriebenen Methoden ermittelt. Zur Kalibrierung wurde jeweils Trolox als Referenz verwendet und alle Ergebnisse wurden als „mmol Troloxäquivalente pro mL Probe“ (mmol TE/mL) angegeben. 102

6.6.3.1 TEAC-Assay (Multiplattenmethode)

Die Basis der TEAC-Methode zur Ermittlung der antioxidantiven Aktivität ist der Abbau des zuvor erzeugten ABTS-Radikalkations durch die in der Probe enthaltenen Antioxidantien.

Reagenzien

10 mmol/L Trolox-Stammlösung in Ethanol (125,2 mg Trolox auf 50 mL) Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit pH 7,2 bis 7,4 (8,766 g Natriumchlorid, 0,714 g

Dikaliumhydrogenphosphat und 0,123 g Kaliumdihydrogenphosphat in 1 L Wasser) 3,5 mmol/L Kaliumperoxodisulfatlösung in Wasser (24 mg KPDS auf 25 mL) 10 mmol/L ABTS-Lösung in Wasser (137 mg ABTS auf 25 mL)

Die ABTS-Radikalkationenlösung wird erzeugt indem die ABTS- und die KPDS-Lösung im Verhältnis 1:1 gemischt und über Nacht unter Lichtausschluss inkubiert werden. Anschließend wird die Lösung mit PBS so verdünnt (Radikalarbeitslösung; etwa 12:100), dass beim in der Durchführung beschriebenen Einsatz durch den Blindwert eine Extinktion von unter 1,4 erreicht wird.


117

Kalibrierung

Aus der mit PBS 1:100-verdünnten Trolox-Stammlösung werden in Mikroreaktionsgefäßen (1,5 mL) gemäß dem Schema in Tabelle 6 die einzelnen Kalibrierlösungen hergestellt, wobei PBS-Puffer statt Wasser zum Verdünnen verwendet wird. Als Blindwert dient PBS.

Durchführung

Es werden jeweils 100 µL Probe (bzw. Kalibrierlösung oder Blindwert) in eine Kavität einer 96-Loch-Mikrotiterplatte vorgelegt und die initiale Absorption bei 734 nm gemessen. Nach Zugabe von 100 µL Radikalarbeitslösung und 120 min Inkubationszeit wird erneut die Absorption bei 734 nm gemessen. Sollte es notwendig sein, werden die Proben zuvor mit Wasser verdünnt. Die Quantifizierung erfolgt stets gegen die mitgeführte Kalibrierung.

6.6.3.2 Phenanthrolinassay (Multiplattenmethode)

Der Phenanthrolinassay zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität wird analog zur Methode in Abschnitt 6.6.2.5 durchgeführt.

6.6.4 Messung von Kupfer(II)-Komplexen mittels ESR

Mittels ESR-Spektroskopie können Kupfer(II)-Komplexe aufgrund ihres ungepaarten Elektrons gemessen werden, wobei die Intensität des ESR-Signals mit der Konzentration des Komplexes korreliert und die Lage des Signals Aufschluss über die Art des Komplexes geben kann.

Reagenzien

10 mmol/L Kupfer(II)-lösung (249,7 mg Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat auf 100 mL) 50 mmol/L Phosphatpuffer mit pH 7,4

Durchführung

Für die Messung von Kupfer(II)-Komplexen werden die in Tabelle 7 aufgeführten Geräteeinstellungen verwendet.

Tabelle 7: Einstellungen des ESR-Spektrometers zur Messung von Kupfer(II)-Komplexen.

Parameter Wert

Feld 312,0 mT

Scanbereich 150,0 mT

Scanzeit 30 s




Durchläufe 16


118

Es werden Komplexlösungen mit einer Ligandenkonzentration von 20 mmol/L hergestellt, indem die entsprechende Menge an Reduktonether mit der Kupfer(II)-lösung aufgenommen wird. 250 µL Komplexlösung werden mit 750 µL Puffer bzw. Wasser gemischt und in eine ESR-Kapillare überführt. Von den so vorbereiteten Proben wird ein Spektrum mit den vorgenannten Einstellungen vorgenommen. Außerdem werden zur Korrektur der Spektren stets ein Blindwert (Wasser) und eine Probe mit Kupfer(II)-lösung ohne Ligand gemessen.

6.6.5 Messung von Radikaladdukten mittels ESR

Die Radikalgenerierung durch FENTON-ähnliche Reaktionen wurde mit Hilfe von spin traps semiquantitativ untersucht. Dazu wurden Reduktone mit N-tert-Butyl-α-phenylnitron (PBN) inkubiert, welches in der Lage ist, mit verschiedenen kurzlebigen Radikalen mit der ESR messbare Addukte zu bilden.

Reagenzien

50 mmol/L Phosphatpuffer mit pH 7,4 100 mmol/L PBN-Lösung in Phosphatpuffer (177 mg PBN auf 10 mL)

Durchführung

Für die Messung der PBN-Addukte werden die in Tabelle 8 aufgeführten Geräteeinstellungen verwendet.

Tabelle 8: Einstellungen des ESR-Spektrometers zur Messung von PBN-Addukten.

Parameter Wert

Feld 338,6 mT

Scanbereich 7,0 mT

Scanzeit 30 s




Durchläufe 16

100 µL PBN-Lösung werden mit 100 µL Probe (20 mmol/L) gemischt und vor der Messung 2 h bei 50 °C inkubiert. Es wird ein Blindwert mit Wasser statt Probe mitgeführt.


119

6.6.6 Bestimmung von α-Dicarbonylverbindungen mittels RP-HPLC-DAD

Die zuvor mit ortho-Phenylendiamin derivatisierten Proben wurden mit Hilfe von RP-HPLC-DAD auf Chinoxalinderivate zwölf verschiedener α-Dicarbonylverbindungen untersucht (Tabelle 9). 1-Desoxymaltoson und 3-Desoxygalactoson wurden mit Hilfe authentischer Standards identifiziert, aber über Maltoson bzw. 3-Desoxyglucoson quantifiziert.

Tabelle 9: Übersicht der analysierten Chinoxalinderivate.

Name molare Masse

in g/mol

Einwaage

in mg

Volumen

in mL

Retentions-zeit

in min

1-Desoxymaltoson-Chinoxalin 396,39 - - 25,4

Maltoson-Chinoxalin 412,40 4,8 10 26,2

Glucoson-Chinoxalin 250,25 5,3 25 28,3

3-Desoxymaltoson-Chinoxalin 396,39 4,8 10 34,7

1-Desoxyglucoson-Chinoxalin 234,26 5,3 25 36,0

3-Desoxyglucoson-Chinoxalin 234,26 5,1 25 40,6

3-Desoxygalactoson-Chinoxalin 234,26 - - 41,2

3-Desoxypentoson-Chinoxalin 204,23 5,0 25 46,0

1,4-Didesoxyglucoson-Chinoxalin 218,26 5,3 25 53,8

Glyoxal-Chinoxalin 130,15 5,3 25 55,4

Methylglyoxal-Chinoxalin 144,18 5,3 25 63,6

Diacetyl-Chinoxalin 158,20 5,1 25 65,9

Reagenzien

50 mmol/L ortho-Phenylendiaminlösung in Wasser/Methanol (54 mg ortho-Phenylendiamin in einer Mischung aus 5 mL Wasser und 5 mL Methanol)

Kalibrierung

Zur Kalibrierung werden zwei getrennte Mixstandards gemeinsam verdünnt. Die Chinoxaline von Maltoson und 3-Desoxymaltoson bilden den Mixstandard 2 und die verbleibenden acht Chinoxaline den Mixstandard 8. Das Verdünnungsschema ist in Tabelle 10 dargestellt.


120

Tabelle 10: Pipettierschema für die Herstellung der Chinoxalinkalibrierreihe.

Verdünnungs-faktor

Volumen Wasser

in µL

Volumen Methanol

in µL

Volumen

Mixstandard 2 in µL

Volumen

Mixstandard 8 in µL

25 825 95 40 40

33 ⅓ 825 115 30 30

50 825 135 20 20

66 ⅔ 825 145 15 15

100 825 155 10 10

RP-HPLC-DAD

Die Einstellungen und der Laufmittelgradient sind in Tabelle 11 und Tabelle 12 gegeben.

Tabelle 11: Einstellungen der analytischen α-Dicarbonyl-HPLC.

Parameter Wert

Laufmittel Methanol/Wasser

Flussrate 0,5 mL/min

Injektionsvolumen 40 µL

Säulenofentemperatur 35 °C

Detektion 190 – 600 nm

Quantifizierung 318 nm

Tabelle 12: Laufmittelgradient der analytischen α-Dicarbonyl-HPLC.

Zeit in min

Anteil Methanol in %

Anteil Wasser in %

0 17,5 82,5

15 17,5 82,5

35 28,0 72,0

55 49,0 51,0

60 95,0 5,0

65 95,0 5,0

70 17,5 82,5

82 17,5 82,5

Durchführung

Die Proben werden, wie in Abschnitt 6.2 beschrieben, behandelt.


121

6.6.7 Bestimmung von heterocyclischen MAILLARD-Intermediaten mittels GC-MS

Die Bestimmung von heterocyclischen Verbindungen als Abbauprodukte in den Kohlenhydratmodellen wurde nach Extraktion mit Ethylacetat mittels GC-MS vorgenommen.

GC-MS

Die Einstellungen und der Temperaturgradient sind in Tabelle 13 und Tabelle 14 gegeben.

Tabelle 13: Einstellungen der Heterocyclen-GC.

Parameter Wert

Trägergas Helium

Fluss 2,0 mL/min

Split 1:5


Injektionstemperatur 200 °C

Interfacetemperatur 270 °C

Ionenquellentemperatur 200 °C

Ionisierungsenergie 70 eV

Lösungsmittelschnittzeit 12,5 min

Massenscanbereich 35 – 250 m/z

Tabelle 14: Temperaturgradient der Heterocyclen-GC.

Temperaturanstieg in °C/min

Solltemperatur in °C

Haltezeit in min

- 30 3

5 120 0

13 180 0

20 300 5

Durchführung

Zu 800 µL Probe werden 100 µL Ethylmaltollösung (10 mmol/L) als interner Standard zugegeben. Die Lösung wird drei Mal mit 800 µL Ethylacetatlösung extrahiert, wobei jeweils 600 µL der organischen Phase entnommen werden. Die vereinigte organische Phase wird unter Stickstoffstrom auf ungefähr 300 µL eingeengt und in GC-Vials überführt.


122

6.6.8 Bestimmung von heterocyclischen MAILLARD-Intermediaten mittels RP-HPLC-DAD

Die Bildung von HMF und Furfural in den Kohlenhydratmodellen sowie der Abbau der jeweiligen Edukte in den Heterocyclenmodellen wurde mit RP-HPLC-DAD bestimmt.

RP-HPLC-DAD


Tabelle 15: Einstellungen der Heterocyclen-HPLC.

Parameter Wert

Laufmittel Methanol/Phosphatpuffer (5 mM; pH 6,0)



Säulenofentemperatur 35 °C

Detektion 190 – 600 nm

Quantifizierung 285 nm

Tabelle 16: Laufmittelgradient der Heterocyclen-HPLC.

Zeit in min

Anteil Methanol in %

Anteil Wasser in %

0 5 95

5 5 95

15 20 80

20 20 80

25 95 5

35 95 5

40 5 95

45 5 95

Durchführung

Die Proben können direkt zur Analyse eingesetzt werden. Falls notwendig, werden sie zuvor verdünnt oder spritzenfiltriert (Nylon; 0,2 µm).


123

6.6.9 Bestimmung von organischen Säuren als Trimethylsilylderivate mittels GC-MS

Die Bestimmung der organischen Säuren Milchsäure, Brenztraubensäure, Glycolsäure, Glyoxylsäure, Glycerinsäure und 2-Hydroxybuttersäure als Oxidationsprodukte der Reduktonether wurde nach Derivatisierung mittels GC-MS vorgenommen.

GC-MS


Tabelle 17: Einstellungen der TMS-GC.

Parameter Wert

Trägergas Helium

Fluss 1,0 mL/min

Split 1:10







Modus Scan


Tabelle 18: Temperaturgradient der TMS-GC.



Haltezeit in min

- 80 1

5 240 20

10 320 4

Durchführung

Das Lösungsmittel von 200 µL Probe und 100 µL des internen Standards in Form einer wässrigen Lösung von Bernsteinsäure (5 mmol/L) wird unter Stickstrom entfernt. Der Rückstand wird in 50 µL Pyridin und 50 µL Silylierungsreagenz (Trimethylsilylchlorid/N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid, 1:99, v/v) aufgenommen. Die Proben werden über Nacht bei Raumtemperatur derivatisiert, anschließend mit 300 µL Ethylacetat verdünnt und mit der GC-MS analysiert.


124

6.6.10 Bestimmung von organischen Säuren als Dodecylester mittels GC-MS

Die Bestimmung von Ameisensäure, Essigsäure und Propionsäure als Oxidationsprodukte der Reduktonether wurde nach Derivatisierung mittels GC-MS vorgenommen.

GC-MS


Tabelle 19: Einstellungen der DDCF-GC.

Parameter Wert

Trägergas Helium

Fluss 1,64 mL/min

Split 1:30







Modus Scan


Tabelle 20: Temperaturgradient der DDCF-GC.



Haltezeit in min

- 100 0

50 200 0

10 270 2

5 300 20

Durchführung

100 µL Probe und 50 µL Pyridin werden mit 50 µL Dodecylchloroformiat zur Derivatisierung gemischt. Nach 5 min werden die Proben mit 200 µL Hexan extrahiert, 100 µL der organischen Phase abgenommen und vor der GC-MS-Analyse mit 200 µL Hexan verdünnt.


125

6.6.11 Bestimmung von Zuckern mittels HPLC-PAD

Die Restgehalte der jeweiligen Zucker in den Kohlenhydratmodellen sowie die Bildung von D-Glucose aus Maltose sowie von Maltose und D-Glucose aus Maltotriose wurde mit Hilfe von HPLC-PAD ermittelt.

HPLC-PAD


Tabelle 21: Einstellungen der Zucker-HPLC.

Parameter Wert

Laufmittel A 0,15 mol/L Natriumhydroxidlösung

Laufmittel B 0,15 mol/L Natriumhydroxidlösung 1 mol/L Natriumacetat



Potenzial E1 / E2 / E3 0,10 V / 0,60 V / –0,06 V

Zeiten t1 / t2 / t3 420 ms / 60 ms / 420 mS

Messzeitbereich 1 (16,67 ms)

Tabelle 22: Laufmittelgradient der Zucker-HPLC für die Bestimmung Maltotriose.

Zeit in min

Anteil Laufmittel A in %

Anteil Laufmittel B in %

0 100 0

5 100 0

60 78 22

88 65 35

98 0 100

102 0 100

105 100 0

120 100 0

Durchführung

Die Proben können nach Verdünnung (1:250 bis 1:1000) zur Analyse eingesetzt werden. D-Glucose und Maltose können mit einer isokratischen Methode bestimmt werden (nur Laufmittel A), während für Maltotriose ein Laufmittelgradient verwendet werden muss (Tabelle 22).


126

6.6.12 Bestimmung der Molekülgewichtsverteilung und der antioxidativen Aktivität mittels GPC-online-TEAC

Mit Hilfe von Gelpermeationschromatographie wurde die Molekülgewichtsverteilung verschiedener Modelle sowie einiger Lebensmittel analysiert. Über eine online-Kopplung mit dem TEAC-Assay konnte zeitgleich die antioxidative Aktivität der einzelnen Fraktionen abgeschätzt werden.

GPC-online-TEAC

Der schematische Aufbau und die Einstellungen sind in Abbildung 80 und Tabelle 23 gegeben.

Abbildung 80: Schematischer Aufbau der GPC-online-TEAC-Anlage.

Tabelle 23: Einstellungen der Heterocyclen-HPLC.

Parameter Wert

Laufmittel Wasser

Radikallösung 1:8 mit PBS-Puffer verdünnte ABTS-Radikalkationenlösung (siehe 6.6.3.1)

Flussrate (Laufmittel) 1,0 mL/min

Flussrate (ABTS-Radikalkationenlösung) 0,3 mL/min

Injektionsvolumen 10 – 40 µL

Temperatur der Reaktionskapillare 70 °C

Detektion (nach der Säule) 420 nm

Detektion (nach Beimischung der Radikallösung) 600 nm

Durchführung

Die Proben können direkt zur Analyse eingesetzt werden.

Pumpe

Laufmittel

Detektion

RI / 420 nm

Detektion

RI / 420 nm

Trennsystem Ofen Detektion

RI / 420 nm


127

6.6.13 EC-ESI-MS-Messungen

Mit Hilfe der EC-ESI-MS-Kopplung war es möglich, die elektrochemischen Abbauprodukte der zu untersuchenden Substanzen nach Oxidation in einer Durchflusszelle direkt mittels ESI-MS zu analysieren.

EC-ESI-MS

Die Einstellungen sind in Tabelle 24 gegeben.

Tabelle 24: Einstellungen der EC-ESI-MS.

Parameter Wert

Laufmittel Methanol/Ammoniumacetatlösung (5 mmol/L)


EC

Modus scan

Potenzialminimum 0,0 V

Potenzialmaximum 1,8 – 2,2 V (substanzabhängig)

Anstieg (rate) 10 mV/s

Maximale Stromstärke (range) 20 mA

ESI

Modus positiv

Gasfluss 12 L/min

Einlasstemperatur 350 °C

Einlassspannung 3000 V

MS

Modus scan


Durchführung

Es werden Lösungen der Reduktonether im Laufmittel mit einer Konzentration von 100 µmol/L angesetzt und nach Pulsung der Elektrode mit dem System gemessen.


128

6.6.14 ESI-MS-Messungen

Die Molekülmasse von O-Galactosylisomaltol wurde mit Hilfe von ESI-MS nach Direktinjektion bestimmt.

ESI-MS

Die Einstellungen sind in Tabelle 25 gegeben.

Tabelle 25: Einstellungen der ESI-MS.

Parameter Wert

Laufmittel Methanol/Ammoniumacetatlösung (5 mmol/L)


ESI

Modus positiv

Gasfluss 30 L/min

Einlasstemperatur 270 °C

Einlassspannung 3000 V

MS

Modus Scan


Durchführung

Es wird eine Lösung von O-Galactosylisomaltol in Methanol mit einer Konzentration von 10 mmol/L angesetzt, in Methanol/Wasser (1:1, v/v) verdünnt und nach Direktinjektion gemessen.


129

6.7 Geräte

Tabelle 26: Im Verlauf der Arbeit verwendete Geräte.

Gerät Hersteller und Typ

EC-ESI-MS Spritzenpumpe Ofen EC-Zelle Arbeitselektrode Massenspektrometer Software (EC) Software (ESI-MS)

Antec SP2 - ROXY Dual Piston Syringe Pump Antec ROXY Potentiostat Antec ROXY µ-PrepCell 2x 100 µm Spacer (entspricht 44 µL Zellvolumen) Magic Diamond Agilent 6130 Single Quadrupole LC/MS Antec ROXY Dialogue v2.02.199 Agilent ChemStation B.01.01

ESI-MS (Direkteinlass) Ionenquelle Software

Thermo Scientific TSQ Vantage System Ion Max Source (H-ESI II probe) Thermo Xcalibur v2.1.0

ESR-Spektrometer Software

Magnettech MiniScope MS100 Magnettech MiniScope Control v6.51

GC-MS Probengeber Injektor GC-System Säule Massenspektrometer Software

Shimadzu AOC-20s Shimadzu AOC-20i Shimadzu GC-2010 Supelco SLB-5ms 60 m Shimadzu GCMS-QP2010 Plus Shimadzu GCMSsolution v2.71

GPC-TEAC Pumpe (Laufmittel) Pumpe (Radikallösung) Probengeber Säule Ofen (Nachsäulenderivatisierung) Detektor (RI) Detektor (UV-Vis A) Detektor (UV-Vis B) Kommunikationsmodul Software

Shimadzu LC-10AD Shimdazu LC-10AT Merck AS 4000 2x Agilent PL aquagel-OH MIXED-H 8 µm W.O. Electronics BFO 04 f1 Shimadzu RID-6A Shimadzu SPD-10A Shimadzu SPD-10A VP Shimadzu CBM-20A Shimadzu LabSolutions v5.71 SP1

HPLC (analytisch; α-Dicarbonyle) Entgaser Pumpe Probengeber Säulenofen

Shimadzu DGU-20A Shimadzu LC-20AD Shimadzu SIL-10AF Shimadzu CTO-20A


130

Säule Detektor Kommunikationsmodul Software

Macherey-Nagel EC250/4,6 Nucleodur C18 100-5 Shimadzu SPD-M20A Shimadzu CBM-20A Shimadzu LCsolution v1.22 SP1

HPLC (semipräparativ; α-Dicarbonyle) Entgaser Schaltventil Pumpe Säulenofen Säule Detektor Kommunikationsmodul Software

Shimadzu DGU-4A Shimadzu FCV-10AL Shimadzu LC-9A W.O. Electronics BFO 04 f1 Phenomenex Luna 250/10 C18 100-5 Shimadzu SPD-M6A Shimadzu CBM-10A Shimadzu Class-LC10 v1.64A

HPLC (Heterocyclen) Entgaser Schaltventil Pumpe Probengeber Säulenofen Säule Detektor Kommunikationsmodul Software

Knauer DG-1300 Shimadzu FCV-10AL Shimadzu LC-9A Shimadzu SCL-6B und SIL-6B Shimadzu CTO-6B Macherey-Nagel EC 250/4,6 Nucleosil C18 120-5 Shimadzu SPD-M10A Shimadzu CBM-10A Shimadzu Class-LC10 v1.64A

HPLC (Zucker) Pumpe Probengeber Säule Detektor Kommunikationsmodul Software

Shimadzu LC-20AD SP Perkin Elmer series 200 autosampler 2x Dionex CarboPac PA100 250/4 Dionex Pulsed Amperometric Detector Ag-Arbeitselektrode Ag/AgCl-Referenzelektrode Shimadzu CBM-20A Shimadzu LabSolutions v5.71 SP1

Multiplattenlesegerät Software

Tecan Infinite M200 Tecan i-Control

NMR-Spektrometer 500 MHz 700 MHz Software

Bruker Avance III 500 MHz Bruker Avance III 700 MHz Bruker TopSpin v3.5pl2

pH-Meter Schott Geräte CG 820

Thermoblock Behr Behrotest ET 1

Trockenschrank Heraeus Instruments UT 6


131

UV-Vis-Spektrometer (Bräunung) Software

Analytik Jena Spekord 200 Plus Winaspect plus

UV-Vis-Spektrometer (antioxidative Assays) Software

Bio-Tek Instruments UVIKON XL Lab Power Junior v2.06-0103

Zentrifuge Herlme Z 160 M

6.8 Chemikalien

Tabelle 27: Im Verlauf der Arbeit verwendete Chemikalien.

Chemikalie Hersteller Reinheit in %

Abhexon Sigma-Aldrich 97

ABTS Sigma-Aldrich ≥ 98

Acetylchlorid Acros organics 99

2-Acetylfuran Acros organics 99

2-Acetylpyrrol Sigma-Aldrich 99

L-Alanin Acros organics 99

Ameisensäure Merck 98

Ammoniumacetat Fisher Scientific 99

Ascorbinsäure Acros organics 97

Deferipron Sigma-Aldrich 99

Deuteriumoxid Acros organics 99,9

Dichlormethan VWR chemicals ≥ 99

Dichlormethan-d2 Acros organics 99,8

Dikaliumhydrogenphosphat Merck ≥ 98

Dodecylchloroformiat TCI chemicals 90

Eisen(III)-nitrat-Nonahydrat Merck ≥ 98

Essigsäure Roth 100

Essigsäureanhydrid Sigma-Aldrich 99

Ethanol VWR chemicals 99,5

Ethylacetat VWR chemicals ≥ 98

Ethylfuraneol Sigma-Aldrich 96

Ethylmaltol Acros organics 98

FOLIN–CIOCALTEU-Reagenz (2 mol/L) Sigma-Aldrich

Furaneol Acros organics 98

Furfural Sigma-Aldrich 99

Furfurylalkohol Sigma-Aldrich 98


132

β-Galactosidase (13,4 units/mg) Sigma-Aldrich

D-Glucose Roth ≥ 99,5

Glycerinsäure-Dihydrat-Hemicalciumsalz Sigma-Aldrich 97

Glycolsäure Acros organics 99

Hexan Roth 98

HMF Acros organics 98

Kaliumdihydrogenphosphat Merck ≥ 99

Kaliumnitrosodisulfonat Sigma-Aldrich

Kaliumperoxodisulfat Sigma-Aldrich ≥ 99

Kieselgel 60 Merck

Kojisäure Sigma-Aldrich 99

Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat Sigma-Aldrich 98

Lactose-Monohydrat Merck

L-Lysin Acros organics 98

L-Lysin-Hydrochlorid Serva 98,5

Maltol Sigma-Aldrich ≥ 99

Maltose-Monohydrat Sigma-Aldrich ≥ 99

Maltotriose-Hydrat Sigma-Aldrich 95

Methanol VWR chemicals ≥ 99

Methanol-d4 Euriso-top 99,8

5-Methylfurfural Acros organics ≥ 98

Natriumacetat Sigma-Aldrich 98

Natriumbathocuproinsulfonat Sigma-Aldrich

Natriumcarbonat Merck 99,9

Natriumchlorid Merck ≥ 99,5

Natriumlactat Sigma-Aldrich 98

Natriumnitrit Sigma-Aldrich ≥ 99

Natriumsulfat Roth 99

Norfuraneol Sigma-Aldrich 97

Petrolether Fisher Scientific

1,10-Phenanthrolin Sigma-Aldrich ≥ 99

ortho-Phenylendiamin Fluka ≥ 99

Piperidin Acros organics 99

L-Prolin Acros organics 99

2-Propanol VWR chemicals 100

Propionsäure Acros organics 99


133

Salzsäure Bernd-Kraft-GmbH 37

Sotolon Sigma-Aldrich 97

para-Toluidin Merck ≥ 99

Trichlormethan VWR chemicals ≥ 99

Trimethylsilylchlorid und N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid (1:99, v/v) Sigma-Aldrich ≥ 98,5

Trolox Sigma-Aldrich 97

wässrige Iodmaßlösung (0,05 mol/L) Roth

wässrige Natriumhydroxidlösung (1 mol/L) Merck

wässrige Salzsäurelösung (1 mol/L) Bernd-Kraft-GmbH

LITERATUR

134

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ABBILDUNGSVERZEICHNIS

146

8 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Strukturen der eingesetzten Kohlenhydratkomponenten D-Glucose 1a, Maltose 1b

und Maltotriose 1c. ....................................................................................................... 3 Abbildung 2: Strukturen der eingesetzten Aminokomponenten L-Prolin 2a, L-Alanin 2b und L-Lysin

2c. .................................................................................................................................. 3 Abbildung 3: Bildung des Glycosylamins 4 aus dem Kohlenhydrat 1 (R = H für Glucose; R = Glc für

Maltose; R = Mal für Maltotriose).2;32 ............................................................................ 4 Abbildung 4: Die AMADORI-Umlagerung und das Gleichgewicht der offenkettigen AMADORI-

Verbindung 5 mit seinen cyclischen Isomeren.2;37 ........................................................ 4 Abbildung 5: Enolisierung und Abbau des AMADORI-Produkts zu α-Dicarbonylverbindungen.2;40–43 .. 6 Abbildung 6: Mögliche Spaltungsreaktionen in der MAILLARD-Reaktion.47 ......................................... 7 Abbildung 7: Retro-Aldol-Reaktion von 3-Desoxyglucoson 7a.48 ........................................................ 7 Abbildung 8: Hydrolytische β-Dicarbonylspaltung von 1-Desoxyglucoson 8a.54;55 ............................. 8 Abbildung 9: Der STRECKER-Abbau am Beispiel von L-Alanin 2b und 3-Desoxyglucoson 7a. Adaptiert

nach HOFMANN et al.56 .................................................................................................... 9 Abbildung 10: Herkunft der in dieser Arbeit relevanten Sauerstoff- und Stickstoffheterocyclen. .... 10 Abbildung 11: Bildung von 3-Desoxypentoson 26 aus Osonen 6.43;58;59 ............................................. 11 Abbildung 12: Bildung von Furfural 15 aus 3-Desoxypentoson 26.43;58–60 Die Bildung von HMF 16 aus

3-Desoxyosonen 7 erfolgt analog dazu.59;61 ................................................................. 12 Abbildung 13: Bildung von DHHM 18 und Maltol 23 aus 1-Desoxyosonderivaten 8.2;65;66................. 13 Abbildung 14: Bildung von DHHM 18 und Maltol 23 aus dem AMADORI-Produkt 5a.65 ...................... 14 Abbildung 15: Bildung von Isomaltol 19a und 2-Acetylfuran 20 aus 1-Desoxyglucoson 8a.52 ........... 15 Abbildung 16: Bildung von O-Glucosylisomaltol 19b aus 1-Desoxymaltoson 8b.68 ............................ 15 Abbildung 17: Bildung von Norfuraneol 21 und Furaneol 22 aus 1-Desoxyglucoson 8a. Das Furan-3-

on 31 sowie Acetylformoin 32 können als Zwischenstufen isoliert werden.52;71 ........ 16 Abbildung 18: Bildung von Furaneol 20 aus Methylglyoxal 9 und Acetol 11.72 .................................. 17 Abbildung 19: Bildung von 2-Acetylpyrrol 17 aus 3-Desoxyglucoson 7a.77 ........................................ 18 Abbildung 20: Bildung von Pyridin-4-onderivaten 24 aus O-Glucosylisomaltol 19b.68....................... 19 Abbildung 21: Beispiele für Strukturvorschläge von Melanoidinen mit intakten

C6-Kohlenhydratkörpern auf Basis von AMADORI-Produkten (M1)89 und auf Basis von 3-Desoxyosonen (M2, M3).85;91 ................................................................................... 20

Abbildung 22: Beispiele für Strukturvorschläge von Melanoidinen83;84 bzw. Melanoidinsubstrukturen90;92;93 auf Basis von Furanen und Pyrrolen. ........................ 21

Abbildung 23: Zusammenfassung der zuvor beschriebenen Reaktionswege in Anlehnung an HODGE.1

..................................................................................................................................... 22 Abbildung 24: Protonengekoppelter Elektronentransfer (HAT).95 ..................................................... 23 Abbildung 25: Einzelelektronentransfer (SET).95................................................................................. 23 Abbildung 26: Oxidation des Reduktons Ascorbinsäure 33 (Reduktonstruktur in rot)98–100 im

Vergleich zur Oxidation des als Referenzantioxidans genutzten Trolox 34.101 ............ 24 Abbildung 27: Zweistufige Oxidation eines Reduktons.98–100 .............................................................. 24 Abbildung 28: Reduktone und Reduktonether, die in der MAILLARD-Reaktion gebildet werden. ...... 25


147

Abbildung 29: 1:1-Komplexe der korrespondierenden Anionen von Isomaltol 19a, Maltol 23 und Pyridinon 24 mit n-valenten Metallionen (Mn+).109–113 ................................................ 26

Abbildung 30: Antioxidative und prooxidative Wirkmechanismen von Reduktonen......................... 26 Abbildung 31: Übersicht der untersuchten heterocyclischen MAILLARD-Reaktionsprodukte und

strukturell verwandter Substanzen. Die entsprechenden Namen und Substitutionsmuster sind in Tabelle 1 gegeben. .......................................................... 32

Abbildung 32: Antioxidative Kapazitäten ermittelt mit dem TEAC- und FCR-Assay sowie der ESR-Methode aller untersuchten Verbindungen (Strukturen in Abbildung 31). Verbindungen, die 1000 mmol TE/mol erreichen (gepunktete Linie), verhalten sich identisch zu Trolox. ...................................................................................................... 34

Abbildung 33: Antioxidative Kapazitäten ermittelt mit dem CUPRAC- und Phenanthrolinassay aller untersuchten Verbindungen (Strukturen in Abbildung 31). Verbindungen, die 1000 mmol TE/mol erreichen (gepunktete Linie), verhalten sich identisch zu Trolox.36

Abbildung 34: Ergebnisse als WAAOC getrennt nach reduzierenden/radikalfangenden Eigenschaften und Reduktion von Metallionen aller untersuchten Verbindungen (Strukturen in Abbildung 31). Verbindungen, die 1,0 erreichen (gepunktete Linie), verhalten sich identisch zu Trolox. ...................................................................................................... 38

Abbildung 35: ESR-Spektren von Kupfer(II)-Komplexen ausgewählter Reduktonether im Phosphatpuffer bei pH 7,4. .......................................................................................... 39

Abbildung 36: ESR-Spektren von PBN-Addukten nach Inkubation ausgewählter Reduktonether bzw. ihren acetylierten Derivaten nach 2 h bei 50 °C im Phosphatpuffer bei pH 7,4. ........ 41

Abbildung 37: Möglicher Reaktionsweg der Oxidation von Furaneol zu Methylglyoxal 9 und Milchsäure 43. ............................................................................................................. 42

Abbildung 38: Oxidationsprodukte von Norfuraneol 21, Furaneol 22a und Ethylfuraneol 37. .......... 44 Abbildung 39: Oxidationsprodukte DHHM 18, Maltol 23a und Ethylmaltol 38. ................................ 44 Abbildung 40: Oxidation von DHHM nach BECK et al.145 und adaptierter Mechanismus für Furaneol.

..................................................................................................................................... 45 Abbildung 41: Ionenspuren von Furaneol, dem korrespondierenden Triketon, Methylglyoxal und

Milchsäure einer EC-MS-Messung über vier Zyklen (I–IV). ......................................... 46 Abbildung 42: Farbbildung von D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und

pH 5. ............................................................................................................................. 48 Abbildung 43: Farbbildung von Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder

L-Lysin bei 130 °C und pH 5. ......................................................................................... 49 Abbildung 44: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem TEAC-Assay) in Abhängigkeit der Farbe

aller wässrigen Modellsysteme (n = 66). ..................................................................... 50 Abbildung 45: Abbau der eingesetzten Kohlenhydratkomponenten nach 300 min bei 130 °C und

pH 5. Die graue Linie entspricht der Ausgangskonzentration von 200 mmol/L. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05. ........................................... 51

Abbildung 46: Bildung von D-Glucose in den Modellsystemen mit Maltose und Maltotriose nach 300 min bei 130 °C und pH 5. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05. ............................................................................................................................. 52

Abbildung 47: Bildung von Glucoson, 1-Desoxyglucoson und 3-Desoxyglucoson aus D-Glucose und L-Alanin sowie von Maltoson, 1-Desoxymaltoson und 3-Desoxymaltoson aus Maltose und L-Alanin nach 120 min bei 130 °C und pH 5. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05. .................................................................................. 55


148

Abbildung 48: Bildung von 3-Desoxymaltoson aus Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5. ........................ 56

Abbildung 49: Bildung von HMF aus Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5. ..................................................... 57

Abbildung 50: Abbau von 3-Desoxymaltoson 7b zu HMF 16 über 3,4-Didesoxyglucoson-3-en 48 als Zwischenstufe. Als Nebenprodukte werden 3-Desoxyglucoson 7a und 3-Desoxygalactoson 49 gebildet. ................................................................................. 58

Abbildung 51: Gegenüberstellung der Konzentrationen von allen 3-Desoxyosonen und HMF für die Modellsysteme D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin nach 300 min bei 130 °C und pH 5. Die Summe von 3-Desoxymaltoson, 3-Desoxyglucoson und 3-Desoxygalactoson ist als ∑ 3-DX angegeben. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05 (die p-Werte wurden nur innerhalb der Gruppen 3-DM, 3-DG, 3-DGal, ∑ 3-DX und HMF berechnet). ..................................................... 59

Abbildung 52: Bildung von 1-Desoxymaltoson aus Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5. ........................ 60

Abbildung 53: Bildung von DHHM aus Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5. ..................................................... 61

Abbildung 54: Bildung von Maltol aus Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5. ..................................................... 61

Abbildung 55: Bildung von 3-Desoxypentoson aus D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. .................................................................................................... 63

Abbildung 56: Bildung von Furfural aus D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. ..................................................................................................................... 64

Abbildung 57: GPC-Abs[420]-Chromatogramme der Modelle von D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin nach 300 min bei 130 °C und pH 5. ...................................... 66

Abbildung 58: GPC-Abs[420]-Chromatogramme der Modelle von Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin nach 300 min bei 130 °C und pH 5. ............................................................................................................................. 67

Abbildung 59: Farbbildung von Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur. ..................................................................................................................................... 68

Abbildung 60: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem TEAC-Assay) in Abhängigkeit der Farbe aller trockenen Modellsysteme (n = 16). ..................................................................... 69

Abbildung 61: Bildung von 3-Desoxymaltoson aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur. .................................................................................... 71

Abbildung 62: Bildung von 3-Desoxyglucoson aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur. .................................................................................... 71

Abbildung 63: Abbau von 3-Desoxymaltoson 7b zu HMF 16 über 3,4-Didesoxyglucoson-3-en 48 im trockenen System. 3-Desoxyglucoson 7a wird nur aus freigesetzter D-Glucose 1a gebildet und nicht über Wasseraddition an 48. 3-Desoxygalactoson 49 wird nicht gebildet. ....................................................................................................................... 72

Abbildung 64: Bildung von HMF aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur. ................................................................................................................. 73

Abbildung 65: Bildung von DHHM aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur. ................................................................................................................. 74

Abbildung 66: GPC-Abs[420]-Chromatogramme der Modelle von Maltose mit L-Alanin nach 15 min in Abhängigkeit der Temperatur. ................................................................................ 75


149

Abbildung 67: GPC-ABTS●+-Chromatogramme der Modelle von Maltose mit L-Alanin nach 15 min in Abhängigkeit der Temperatur. .................................................................................... 76

Abbildung 68: Farbbildung der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05. ........................... 77

Abbildung 69: Antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem TEAC-Assay) der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05. .................................................................... 78

Abbildung 70: Abbau der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05. .................................... 80

Abbildung 71: GPC-Abs[420]-Chromatogramme der Modelle der jeweiligen Heterocyclen mit L-Alanin nach 300 min bei 130 °C und pH 5. ................................................................ 81

Abbildung 72: Ausgewählte Produkte des thermischen Abbaus von Furaneol 22,162 DHHM 18,52 HMF 16163 und Isomaltol 19a.164 .......................................................................................... 83

Abbildung 73: Farben der zwölf untersuchten Biere in aufsteigender Reihenfolge. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05. ............................................................. 85

Abbildung 74: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem TEAC-Assay) der zwölf untersuchten Bierproben. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05. ................ 86

Abbildung 75: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) der zwölf untersuchten Bierproben. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05. ............................................................................................................................. 87

Abbildung 76: Konzentrationen der 3-Desoxyosone in den zwölf untersuchten Bierproben. ........... 88 Abbildung 77: Konzentrationen der 1-Desoxyosone in den zwölf untersuchten Bierproben. ........... 89 Abbildung 78: GPC-Abs[420]-Chromatogramme von vier der untersuchten Biere. ........................... 90 Abbildung 79: MAILLARD-Reaktion von D-Glucose 1a mit L-Alanin 2b und von Maltose 1b mit L-Prolin

2a, L-Alanin 2b oder L-Lysin 2c. Die Konzentrationen der entsprechenden Verbindungen sind in µmol/L nach 300 min bei 130 °C und pH 5 angegeben (orange mit 2a, schwarz mit 2b, blau mit 2c). Folgeprodukte: Glucoson/Maltoson 6a/b, 3-Desoxyglusoson/-maltoson 7a/b, 3-Desoxygalactoson 49, 1-Desoxyglucoson/-maltoson 8a/b, 3-Desoxypentoson 26, Furfural 15, HMF 16, DHHM 18, Maltol 23. .. 93

Abbildung 80: Schematischer Aufbau der GPC-online-TEAC-Anlage. ............................................... 126 Abbildung 81: Stabilität von Furaneol und DHHM in Wasser und Phosphatpuffer mit pH 7,4 über

6 h. ............................................................................................................................. 153 Abbildung 82: Oxidation des Triketons (Acetylformoin) zum Tetraketon und das Produktspektrum

beider Verbindungen nach hydrolytischer β-Dicarbonylspaltung und Hydrolyse der jeweiligen Ketene. ..................................................................................................... 153

Abbildung 83: Mögliche Spaltungsreaktionen des Triketons (Acetylformoin) auf Grundlage des mittels EC-MS nachgewiesenen Produktspektrums. ................................................. 154

Abbildung 84: Farbbildung von Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 8. ....................................................................................... 154

Abbildung 85: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) in Abhängigkeit der Farbe aller wässrigen Modellsysteme (n = 66). ................................................... 155

Abbildung 86: Die metallreduzierenden Eigenschaften (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) in Abhängigkeit der radikalfangenden Eigenschaften (ermittelt mit dem TEAC-Assay) aller wässrigen Modellsysteme (n = 66). ................................................................... 155

Abbildung 87: Bildung von Glucoson, 1-Desoxyglucoson und 3-Desoxyglucoson aus D-Glucose und L-Lysin sowie von Maltoson, 1-Desoxymaltoson und 3-Desoxymaltoson aus Maltose


150

und L-Lysin nach 7 d bei 50 °C und pH 7,4 (100 mmol/L Phosphatpuffer) nach GOBERT et al.154 und SMUDA et al.43 ......................................................................................... 156

Abbildung 88: Verhältnis von 3-Desoxyglucoson zu 3-Desoxygalactoson in Systemen aus D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. ..................................... 156

Abbildung 89: Verhältnis von 3-Desoxyglucoson zu 3-Desoxygalactoson in Systemen aus Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5 ................................................................................................................................... 157

Abbildung 90: Bildung von 3-Desoxyglucoson aus D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. .................................................................................................. 157

Abbildung 91: Bildung von 3-Desoxygalactoson aus D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. .................................................................................................. 158

Abbildung 92: Bildung von 3-Desoxyglucoson aus Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5. ................................................... 158

Abbildung 93: Bildung von 3-Desoxygalactoson aus Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5. ................................................... 159

Abbildung 94: Bildung von HMF aus D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. ........................................................................................................................... 159

Abbildung 95: Bildung von 2-Acetylfuran aus Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.................................................................. 160

Abbildung 96: Bildung von 1,4-Didesoxyglucoson aus D-Glucose und Maltose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. ................................................................................................................... 160

Abbildung 97: Bildung von 3-Desoxypentoson aus Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5. ................................................... 161

Abbildung 98: Bildung von Furfural aus Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.................................................................. 161

Abbildung 99: Farbbildung der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Das System Maltol/L-Alanin zeigt keine messbare Bräunung und wurde der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt. ................................................................ 162

Abbildung 100: GPC-Kalibrierung mittels Pullulanstandards und Saccharose im Bereich zwischen 342 Da und 1,66 mDa. ............................................................................................... 162

Abbildung 101: GPC-RI-Chromatogramme der Modelle von D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin nach 300 min bei 130 °C und pH 5. .............................................................. 163

Abbildung 102: GPC-RI-Chromatogramme der Modelle von Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin nach 300 min bei 130 °C und pH 5. ................................................................................................................................... 163

Abbildung 103: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) in Abhängigkeit der Farbe aller trockenen Modellsysteme (n = 16). .................................................. 164

Abbildung 104: Die metallreduzierenden Eigenschaften (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) in Abhängigkeit der radikalfangenden Eigenschaften (ermittelt mit dem TEAC-Assay) aller trockenen Modellsysteme (n = 16). ................................................................... 164

Abbildung 105: Bildung von 1-Desoxymaltoson aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur. .................................................................................. 165

Abbildung 106: Bildung von Furfural aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur. ............................................................................................................... 165

Abbildung 107: Bildung von Maltol aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur. ............................................................................................................... 166


151

Abbildung 108: GPC-RI-Chromatogramme der Modelle von Maltose mit L-Alanin nach 15 min in Abhängigkeit der Temperatur. .................................................................................. 166

Abbildung 109: Farbbildung der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Das System Maltol/L-Alanin zeigt keine messbare Bräunung und wurde der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt. ................................................................ 167

Abbildung 110: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem TEAC-Assay) in Abhängigkeit der Farbe der Modelle mit Isomaltol und L-Alanin bei 130 °C und pH 5 (n = 6). ....................... 167

Abbildung 111: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem TEAC-Assay) in Abhängigkeit der Farbe der Modelle mit HMF und L-Alanin bei 130 °C und pH 5 (n = 6)................................ 168

Abbildung 112: Antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05. .................................................................. 168

Abbildung 113: Abbau der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Das System Maltol/L-Alanin zeigt keinen messbaren Abbau und wurde der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt. ................................................................ 169

Abbildung 114: GPC-RI-Chromatogramme der Modelle der jeweiligen Heterocyclen mit L-Alanin nach 300 min bei 130 °C und pH 5. .................................................................................... 169

Abbildung 115: Farbe der zwölf untersuchten Biere in EBC-Einheiten. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05. ................................................................................ 170

Abbildung 116: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) in Abhängigkeit der Farbe der zwölf untersuchten Biere (alle Punkte und hellgraue Regressionsgrade) und der sechs mit Gerstenmalz nach deutschem Reinheitsgebot gebrauten Biere (schwarze Punkte und schwarze Regressionsgrade). ................................................ 170

Abbildung 117: Konzentration von 3-Desoxypentoson in den zwölf untersuchten Bierproben. ....... 171 Abbildung 118: GPC-RI-Chromatogramm von vier der untersuchten Biere. ...................................... 171

TABELLENVERZEICHNIS

152

9 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Namen und Substitutionsmuster der Verbindungen in Abbildung 31. H bezeichnet

Wasserstoffreste, Me Methylreste, Et Ethylreste, Ac Acetylreste, Gal Galactosylreste und ε-Lys L-Lysinreste (über die ε-Aminofunktion gebunden). ............................................... 33

Tabelle 2: Zusammensetzung der wässrigen Modellsysteme (Konzentrationen und Einwaagen sind auf ein Volumen von 20 mL bezogen; Maltose wurde als Monohydrat eingesetzt). ..... 109

Tabelle 3: Pipettierschema für die Trolox-Kalibrierreihe. ............................................................... 112 Tabelle 4: Pipettierschema für die Trolox-Kalibrierreihe. ............................................................... 113 Tabelle 5: Einstellungen des ESR-Spektrometers zur Messung des Radikalabbaus. ....................... 114 Tabelle 6: Pipettierschema für die Trolox-Kalibrierreihe. ............................................................... 115 Tabelle 7: Einstellungen des ESR-Spektrometers zur Messung von Kupfer(II)-Komplexen. ........... 117 Tabelle 8: Einstellungen des ESR-Spektrometers zur Messung von PBN-Addukten. ...................... 118 Tabelle 9: Übersicht der analysierten Chinoxalinderivate. ............................................................. 119 Tabelle 10: Pipettierschema für die Herstellung der Chinoxalinkalibrierreihe. ................................ 120 Tabelle 11: Einstellungen der analytischen α-Dicarbonyl-HPLC. ....................................................... 120 Tabelle 12: Laufmittelgradient der analytischen α-Dicarbonyl-HPLC. .............................................. 120 Tabelle 13: Einstellungen der Heterocyclen-GC. ............................................................................... 121 Tabelle 14: Temperaturgradient der Heterocyclen-GC. .................................................................... 121 Tabelle 15: Einstellungen der Heterocyclen-HPLC. ........................................................................... 122 Tabelle 16: Laufmittelgradient der Heterocyclen-HPLC. ................................................................... 122 Tabelle 17: Einstellungen der TMS-GC. ............................................................................................. 123 Tabelle 18: Temperaturgradient der TMS-GC. .................................................................................. 123 Tabelle 19: Einstellungen der DDCF-GC. ............................................................................................ 124 Tabelle 20: Temperaturgradient der DDCF-GC. ................................................................................ 124 Tabelle 21: Einstellungen der Zucker-HPLC. ...................................................................................... 125 Tabelle 22: Laufmittelgradient der Zucker-HPLC für die Bestimmung Maltotriose. ......................... 125 Tabelle 23: Einstellungen der Heterocyclen-HPLC. ........................................................................... 126 Tabelle 24: Einstellungen der EC-ESI-MS. .......................................................................................... 127 Tabelle 25: Einstellungen der ESI-MS. ............................................................................................... 128 Tabelle 26: Im Verlauf der Arbeit verwendete Geräte. ..................................................................... 129 Tabelle 27: Im Verlauf der Arbeit verwendete Chemikalien. ............................................................ 131

ANHANG

153

10 Anhang

Abbildung 81: Stabilität von Furaneol und DHHM in Wasser und Phosphatpuffer mit pH 7,4 über 6 h.

Abbildung 82: Oxidation des Triketons (Acetylformoin) zum Tetraketon und das Produktspektrum beider Verbindungen nach hydrolytischer β-Dicarbonylspaltung und Hydrolyse der jeweiligen Ketene.

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6

rela

tive

Ko

nze

ntr

atio

n in

%

Zeit in h

Furaneol in Wasser

Furaneol in Puffer

DHHM in Wasser

DHHM in Puffer

ANHANG

154

Abbildung 83: Mögliche Spaltungsreaktionen des Triketons (Acetylformoin) auf Grundlage des mittels EC-MS nachgewiesenen Produktspektrums.

Abbildung 84: Farbbildung von Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 8.

0

5

10

15

20

25

30

35

0 50 100 150 200 250 300

Farb

e (A

bs[

42

0]

x F)

Zeit in min

Mal/Lys

Mal/Ala

Mal/Pro

Mal

ANHANG

155

Abbildung 85: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) in Abhängigkeit der Farbe aller wässrigen Modellsysteme (n = 66).

Abbildung 86: Die metallreduzierenden Eigenschaften (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) in Abhängigkeit der radikalfangenden Eigenschaften (ermittelt mit dem TEAC-Assay) aller wässrigen Modellsysteme (n = 66).

R² = 0,9004

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 10 20 30

anti

oxi

dat

ive

Akt

ivit

ät in

mm

ol T

E/L


y = 0,2863x + 0,2943 R² = 0,8648

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50

anti

oxi

dat

ive

Akt

ivit

ät (

Ph

enan

thro

lin)

in m

mo

l TE/

L

antioxidative Aktivität (TEAC) in mmol TE/L

ANHANG

156

Abbildung 87: Bildung von Glucoson, 1-Desoxyglucoson und 3-Desoxyglucoson aus D-Glucose und L-Lysin sowie von Maltoson, 1-Desoxymaltoson und 3-Desoxymaltoson aus Maltose und L-Lysin nach 7 d bei 50 °C und pH 7,4 (100 mmol/L Phosphatpuffer) nach GOBERT et al.154 und SMUDA et al.43

Abbildung 88: Verhältnis von 3-Desoxyglucoson zu 3-Desoxygalactoson in Systemen aus D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Glc/Ala Mal/Ala

Ge

hal

t in

mm

ol/

mo

l Ko

hle

nh

ydra

t

Oson

1-Desoxyoson

3-Desoxyoson

0123456789

10

0 50 100 150 200 250 300

Ve

rhäl

tnis

3-D

G z

u 3

-DG

al

Zeit in min

Glc/Ala

Mal/Ala

Maltri/Ala

ANHANG

157

Abbildung 89: Verhältnis von 3-Desoxyglucoson zu 3-Desoxygalactoson in Systemen aus Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5

Abbildung 90: Bildung von 3-Desoxyglucoson aus D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 50 100 150 200 250 300

Ve

rhäl

tnis

3-D

G z

u 3

-DG

al

Zeit in min

Mal/Lys

Mal/Ala

Mal/Pro

Mal

0

100

200

300

400

500

600

700

0 50 100 150 200 250 300

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

L

Zeit in min

Glc/Ala

Mal/Ala

Maltri/Ala

ANHANG

158

Abbildung 91: Bildung von 3-Desoxygalactoson aus D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5.

Abbildung 92: Bildung von 3-Desoxyglucoson aus Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150 200 250 300

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

L

Zeit in min

Glc/Ala

Mal/Ala

Maltri/Ala

020406080

100120140160180200

0 50 100 150 200 250 300

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

L

Zeit in min

Mal/Lys

Mal/Ala

Mal/Pro

Mal

ANHANG

159

Abbildung 93: Bildung von 3-Desoxygalactoson aus Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.

Abbildung 94: Bildung von HMF aus D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 50 100 150 200 250 300

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

L

Zeit in min

Mal/Lys

Mal/Ala

Mal/Pro

Mal

0

500

1000

1500

2000

2500

0 50 100 150 200 250 300

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

L

Zeit in min

Glc/Ala

Mal/Ala

Maltri/Ala

ANHANG

160

Abbildung 95: Bildung von 2-Acetylfuran aus Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.

Abbildung 96: Bildung von 1,4-Didesoxyglucoson aus D-Glucose und Maltose mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5.

0102030405060708090

100

0 50 100 150 200 250 300

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

L

Zeit in min

Mal/Lys

Mal/Ala

Mal/Pro

Mal

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 50 100 150 200 250 300

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

L

Zeit in min

Glc/Ala

Mal/Ala

ANHANG

161

Abbildung 97: Bildung von 3-Desoxypentoson aus Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.

Abbildung 98: Bildung von Furfural aus Maltose ohne Aminokomponente sowie mit L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin bei 130 °C und pH 5.

0

20

40

60

80

100

120

0 50 100 150 200 250 300

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

L

Zeit in min

Mal/Lys

Mal/Ala

Mal/Pro

Mal

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 50 100 150 200 250 300

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

L

Zeit in min

Mal/Lys

Mal/Ala

Mal/Pro

Mal

ANHANG

162

Abbildung 99: Farbbildung der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Das System Maltol/L-Alanin zeigt keine messbare Bräunung und wurde der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt.

Abbildung 100: GPC-Kalibrierung mittels Pullulanstandards und Saccharose im Bereich zwischen 342 Da und 1,66 MDa.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0 50 100 150 200 250 300

Farb

e (

Ab

s[4

20

] x

F)

Zeit in min

Isomaltol/Ala

HMF/Ala

DHHM/Ala

Furaneol/Ala

y = 3E+14e-1,303x R² = 0,9913

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

14 15 16 17 18 19 20 21

Mo

leku

larg

ewic

ht

in D

a


ANHANG

163

Abbildung 101: GPC-RI-Chromatogramme der Modelle von D-Glucose, Maltose und Maltotriose mit L-Alanin nach 300 min bei 130 °C und pH 5.

Abbildung 102: GPC-RI-Chromatogramme der Modelle von Maltose ohne Aminokomponente sowie in Anwesenheit von L-Prolin, L-Alanin oder L-Lysin nach 300 min bei 130 °C und pH 5.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

5 10 15 20 25

Sign

alin

ten

sitä

t


Glc/Ala

Mal/Ala

Maltri/Ala

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

5 10 15 20 25

Sign

alin

ten

sitä

t


Mal/Lys

Mal/Ala

Mal/Pro

Mal

ANHANG

164

Abbildung 103: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) in Abhängigkeit der Farbe aller trockenen Modellsysteme (n = 16).

Abbildung 104: Die metallreduzierenden Eigenschaften (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) in Abhängigkeit der radikalfangenden Eigenschaften (ermittelt mit dem TEAC-Assay) aller trockenen Modellsysteme (n = 16).

R² = 0,9678

0,00

0,01

0,01

0,02

0,02

0,03

0,0 1,0 2,0 3,0

anti

oxi

dat

ive

Akt

ivit

ät in

mm

ol T

E/g


y = 0,2985x - 0,0003 R² = 0,9595

0,00

0,01

0,01

0,02

0,02

0,03

0,0 0,0 0,0 0,1 0,1

anti

oxi

dat

ive

Akt

ivit

ät (

Ph

enan

thro

lin)

in m

mo

l TE/

g

antioxidative Aktivität (TEAC) in mmol TE/g

ANHANG

165

Abbildung 105: Bildung von 1-Desoxymaltoson aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur.

Abbildung 106: Bildung von Furfural aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 5 10 15 20 25 30

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

g

Zeit in min

220 °C

200 °C

180 °C

160 °C

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 5 10 15 20 25 30

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

g

Zeit in min

220 °C

200 °C

180 °C

160 °C

ANHANG

166

Abbildung 107: Bildung von Maltol aus Maltose mit L-Alanin im Trockenen in Abhängigkeit der Temperatur.

Abbildung 108: GPC-RI-Chromatogramme der Modelle von Maltose mit L-Alanin nach 15 min in Abhängigkeit der Temperatur.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

0 5 10 15 20 25 30

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

g

Zeit in min

220 °C

200 °C

180 °C

160 °C

0200400600800

100012001400160018002000

5 10 15 20 25 30

Sign

alin

ten

sitä

t


220 °C

200 °C

180 °C

160 °C

ANHANG

167

Abbildung 109: Farbbildung der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Das System Maltol/L-Alanin zeigt keine messbare Bräunung und wurde der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt.

Abbildung 110: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem TEAC-Assay) in Abhängigkeit der Farbe der Modelle mit Isomaltol und L-Alanin bei 130 °C und pH 5 (n = 6).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0 50 100 150 200 250 300

Farb

e (

Ab

s[4

20

] x

F)

Zeit in min

Isomaltol/Ala

HMF/Ala

DHHM/Ala

Furaneol/Ala

R² = 0,9646

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0

anti

oxi

dat

ive

Akt

ivit

ät in

mm

ol T

E/L


ANHANG

168

Abbildung 111: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem TEAC-Assay) in Abhängigkeit der Farbe der Modelle mit HMF und L-Alanin bei 130 °C und pH 5 (n = 6).

Abbildung 112: Antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05.

R² = 0,9776

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

anti

oxi

dat

ive

Akt

ivit

ät in

mm

ol T

E/L


0

2

4

6

8

10

12


anti

oxi

dat

ive

Akt

ivit

ät in

mm

ol T

E/L

0 min

300 min

a a

b b

c

d

c, f

e f

f

ANHANG

169

Abbildung 113: Abbau der jeweiligen heterocyclischen Intermediate mit L-Alanin bei 130 °C und pH 5. Das System Maltol/L-Alanin zeigt keinen messbaren Abbau und wurde der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt.

Abbildung 114: GPC-RI-Chromatogramme der Modelle der jeweiligen Heterocyclen mit L-Alanin nach 300 min bei 130 °C und pH 5.

0

5

10

15

20

25

0 50 100 150 200 250 300

Ko

nze

ntr

atio

n in

mm

ol/

L

Zeit in min

HMF/Ala

Furaneol/Ala

DHHM/Ala

Isomaltol/Ala

0

3000

6000

9000

12000

15000

5 10 15 20 25 30

Sign

alin

ten

sitä

t


Isomaltol/Ala

HMF/Ala

DHHM/Ala

Furaneol/Ala

Maltol/Ala

ANHANG

170

Abbildung 115: Farbe der zwölf untersuchten Biere in EBC-Einheiten. Für Werte, die den gleichen Buchstaben tragen, ist p ≥ 0,05.

Abbildung 116: Die antioxidative Aktivität (ermittelt mit dem Phenanthrolinassay) in Abhängigkeit der Farbe der zwölf untersuchten Biere (alle Punkte und hellgraue Regressionsgrade) und der sechs mit Gerstenmalz nach deutschem Reinheitsgebot gebrauten Biere (schwarze Punkte und schwarze Regressionsgrade).

0

20

40

60

80

100

120Fa

rbe

in E

BC

-Ein

he

ite

n

R² = 0,6586

R² = 0,9091

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

anti

oxi

dat

ive

Akt

ivit

ät in

mm

ol T

E/L

Farbe (Abs[420 nm] x F)

a b c d e

f g

h i

j k k

ANHANG

171

Abbildung 117: Konzentration von 3-Desoxypentoson in den zwölf untersuchten Bierproben.

Abbildung 118: GPC-RI-Chromatogramm von vier der untersuchten Biere.

05

1015202530354045

Ko

nze

ntr

atio

n in

µm

ol/

L

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

5 10 15 20 25

Sign

alin

ten

sitä

t


Schwarzbier

dunkles Bier

Klosterbier

Pilsner

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