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Biochemisches

Praktikum 1

DNA-Analytik

Praktischer Teil

Version Februar 2020

Inhaltsverzeichnis

Sicherheitshinweise DNA-Analytik 1

Arbeitshinweise DNA-Analytik 2

Gießen von Agarosegelen 3

Isolierung genomischer DNA 4

Isolierung genomischer DNA aus Gewebe 6

Isolierung genomischer DNA aus Hefe 8

Analyse genomischer DNA 11

Restriktionsspaltung genomischer DNA 12

Auftrennung genomischer DNA im Agarosegel 13

Isolierung von Plasmid DNA 14

Isolierung von Plasmid DNA, Alkalische Lyse 17

Isolierung von Plasmid DNA, Boiling Methode 18

Analyse von DNA im Agarosegel 19

Kontrolle der Plasmid-DNA im Agarosegel 20

Restriktionsspaltung 21

Restriktionsspaltung der Plasmid-DNA 22

Restriktionskartierung - Auftrennung der Plasmidspaltungen im Agarosegel 24

Transformation von Bakterien 25

Polymerase Kettenreaktion - PCR 29

Optimierung von PCR Bedingungen 31

PCR mit genomischer Hefe-DNA 35

DNA-Längenstandard, Plasmidkarten 38

Anzusetzende Puffer 39

Vorhandene Puffer und Stocklösungen 40

Protokoll zum Grundpraktikum – DNA-Analytik 41

Sicherheitshinweise DNA-Analytik

1

Sicherheitshinweise und Entsorgungsrichtlinien:

Mercaptoethanol

o Der Lyticase-Puffer enthält -Mercaptoethanol:

Mercaptoethanol ist gesundheitsschädlich und riecht “schlecht“; Arbeiten mit

Mercaptoethanol immer im Abzug durchführen;

Flüssige Abfälle, die Mercaptoethanol enthalten, in Sondermüllbehälter (wässrige Abfälle)

sammeln!

Spitzen/Plastikgefäße, die mit Mercaptoethanol kontaminiert sind, im Abzug in

Abfallbehälter sammeln und vor der Entsorgung mindestens 24h abdampfen lassen!

SYBR Safe

o SYBR Safe ist ein Farbstoff, der sich an DNA quantitativ anlagert. Untersuchungen haben

bisher keine kanzerogenen oder genotoxischen Wirkungen gezeigt. Daher ist SYBR Safe

im Vergleich zu Ethidiumbromid eine deutlich sicherere Methode, um DNA zu färben.

Trotz der getesteten „Ungefährlichkeit“ handhaben wir SYBR Safe wie Ethidiumbromid.

D.h. Jeder Kontakt mit der Haut ist zu vermeiden! Beim Handhaben von SYBR Safe

IMMER Handschuhe tragen;

Alle SYBR Safe-haltigen Fest-Anfälle (Agarosegele, verschmutzte Handschuhe,

Wischtücher…) sind als Sondermüll zu sammeln (SYBR-Safe-Abfall, fest). Während der

Arbeit mit SYBR Safe Verspritzen von Agarose möglichst vermeiden. Agarosetropfen

sofort mit einem saugfähigen Tuch aufnehmen. Beim Eintrocknen bilden Agarosereste

Stäube, die SYBR-Safe enthalten und durch die Luft aufgenommen werden können!

Der Agarosegel Laufpuffer wird in speziellen Kanistern gesammelt.

Mikrowelle

o Bei Arbeiten mit der Mikrowelle Vorschrift genau beachten!

Zum Aufkochen der Agarose nur Weithals-Erlenmeyerkolben verwenden; Kolben maximal

zu 1/3 mit Puffer füllen; zur Vermeidung von Siedeverzügen Rührfisch in den Kolben

geben; Agarose stufenweise erhitzen; um Verbrühungen zu vermeiden Handschuhe

tragen;

Alkalische Lyse

o Der Lysispuffer enthält NaOH – ätzend!

Arbeitshinweise DNA-Analytik

2

Arbeitshinweise allgemein:

o während der Arbeit Handschuhe tragen (Schutz der Probe vor Kontamination mit

DNasen)

o für jeden Pipettierschritt frische Spitze verwenden

o Eppis mit Gruppennummer beschriften (Edding)

o Enzyme immer auf Eis lagern

o RNase und Restriktionsenzyme auf Eis lagern!

o Taq-Polymerase und dNTPs auf Eis lagern

o Entsorgungsanweisungen beachten

Arbeitshinweise Mercaptoethanol:

o während der Arbeit Handschuhe tragen

o Arbeiten mit Merctapoethanol nur unter dem Abzug!

o Entsorgungsanweisungen für Mercaptoethanol beachten

Arbeitshinweise SYBR Safe:

o während der Arbeit Nitril - Handschuhe tragen

o Arbeiten mit SYBR Safe nur an den ausgewiesenen Plätzen!

o Entsorgungsanweisungen für SYBR Safe beachten

Arbeitshinweise Bakterien:

- während der Arbeit Handschuhe tragen

- für jeden Pipettierschritt eine frische Spitze verwenden

- Eppis und Platten eindeutig beschriften, Platten auf dem Boden beschriften

- Verschmutzungen mit Bakteriensuspension sofort mit 70 °C Ethanol desinfizieren!

Gießen von Agarosegelen

3

Gießen der Agarosegele für die Auftrennung der DNA-Proben:

- Benötigtes Gelvolumen berechnen

- 1 x TAE Puffer ansetzen (verdünnen aus 50 x TAE) Setzen Sie 1 L 1 x TAE an; Sie brauchen diesen Puffer auch als Laufpuffer und für weitere Agarosegele; wenn Ihnen der 1x TAE Puffer ausgeht, neuen verdünnen;

- Agarose abwiegen für eine Endkonzentration von 0,8 bzw. 1,2 % (bezogen auf 100 % Volumen) und in entsprechend großen Weithals-Erlenmeyerkolben geben;

- Ca. 60 % des benötigten Endvolumen 1 x TAE zugeben, Agarose durch Schwenken suspendieren; Rührfisch in den Kolben geben (verringert Gefahr des Siedeverzugs)

- 2 x in Mikrowelle aufkochen lassen: Wiederholt nur kurz erwärmen, dann Kolben entnehmen und schwenken; Vorsicht: Siedeverzug möglich. Deshalb: Schutzbrille tragen und langsam aufheizen.

- Solange Aufkochen lassen, bis Gellösung klar und frei von ungelösten Partikeln ist – mindestens 2-mal.

- Gellösung auf den Rührer stellen und unter Rühren mit 1 x TAE auffüllen auf Endvolumen; Lösung unter Rühren auf ca. 50 °C abkühlen lassen.

- Gel-„Schiffchen“ in Gießstand einsetzen und fixieren (Betreuer fragen)

- Pro 100 ml Gelvolumen 10 µl SYBR Safe Stocklösung zur Gellösung geben, mischen, Gellösung in die Gel-Schiffchen gießen, Kamm einsetzen;

- Gel ca. 30 min lang aushärten lassen; das Gel muss fest sein, bevor es abgedeckt wird!

- Zur Lagerung (über Nacht) vorsichtig in Alufolie schlagen (im Gießstand); darauf achten, dass der Kamm nicht bewegt wir, da sonst die Taschen beschädigt werden;

- Bis zum Gebrauch am nächsten Tag bei Raumtemperatur (RT) lagern;

Für ein kleines Gel werden 50 ml Gel gegossen und ca. 300 ml Laufpuffer benötigt, für ein großes Gel werden 150 ml Gel gegossen und ca. 1000 ml Laufpuffer benötigt. Der Laufpuffer kann über Nacht aufgehoben werden, wenn die Elektrophoresekammer über Nacht mit dem Deckel verschlossen wird. Entsorgung: Die Gele werden über den Sybr-Safe-Festabfall entsorgt (blaue Tonne neben der Geldokumentation), die Laufpuffer werden in speziellen Kanistern gesammelt. Mit SYBR-Safe kontaminierte Pipettenspitzen müssen getrennt gesammelt werden und so wie die Gele entsorgt werden. Beachten Sie die Sicherheitshinweise zu Sybr-Safe im Skript. Folgende Agarosegele werden während der DNA-Analytik Woche benötigt:

Analyse Plasmid-DNA:

0,8 % Mini-Gel, ein 8er Kamm, jede Gruppe, Laufstrecke ca. 2/3 Gellänge;

Analyse genomische DNA und Restriktionskartierung Plasmid-DNA:

0,8 % Midi-Gel, ein 20er Kamm, jede Gruppe, Laufstrecke ca. 2/3 Gellänge;

PCR-Optimierung:

1,2 % Midi-Gel, zwei 20er Kämme, pro vier Gruppen ein Gel;

PCR auf genomischer Hefe-DNA:

1,2 % Mini-Gel, zwei 8er Kämme, pro zwei Gruppen ein Gel;

Isolierung genomischer DNA

4

Isolierung genomischer DNA

5

Im Genom (=genomische DNA) eines jeden Organismus sind alle Informationen gespeichert

bzw. kodiert, die notwendig sind um diesen Organismus funktionieren zu lassen. Jede Zelle

enthält mindestens eine Kopie dieser Organismus-spezifischen DNA. Obwohl mittlerweile

viele Genome sequenziert sind und damit theoretisch alle Informationen über ihre DNA in

einer Datenbank vorliegen, ist es sowohl im „normalen Leben“ als auch in der medizinischen,

genetischen, molekularbiologischen oder biochemischen Forschung immer wieder notwendig

genomische DNA zu gewinnen.

Abstammungsnachweise oder forensische Tatort Analysen basieren genauso auf der

Untersuchung genomischer DNA, wie die genaue Charakterisierung von Hefe- oder

Mausmutanten, die im Labor für wissenschaftliche Untersuchungen generiert oder verwendet

werden.

Abhängig vom Organismus und der zu untersuchenden Probe kommen verschiedene

Methoden zum Einsatz, um Zellen zu zerstören und die genomische DNA freizusetzen. So

lassen sich viele Bakterien oder vereinzelte Säugetierzellen schon mit milden Detergenzien

zerstören. Andere Zellen, z.B. Hefen, sind durch eine spezielle Zellwand geschützt, die mit

besonderen Methoden geöffnet werden muss, um die genomische DNA freizusetzen.

In der Zelle befindet sich neben der genomischen DNA eine Vielzahl anderer Stoffe

(Proteine, Lipide, Zucker, Salze usw.), die von der DNA abgetrennt werden müssen, um

weitere Analysen zu ermöglichen.

Im Praktikum werden Sie genomische DNA aus zwei verschiedenen Quellen – Hefezellen

und Säugetiergewebe – mit zwei unterschiedlichen Methoden isolieren:

Die Isolierung der genomischen DNA aus Gewebe erfolgt durch Behandlung mit ProteinaseK

in einem speziellen Lysispuffer und anschließender Fällung der DNA zur Reinigung und

Konzentrierung.

ProteinaseK baut Proteine bis zu den einzelnen Aminosäuren ab. Der Abbau der

Membranproteine führt zur Zerstörung der Zellen und der Freisetzung aller Zellinhaltsstoffe.

Zelluläre Proteine werden von ProteinaseK abgebaut, unlösliche Bestandteile (Haare,

Knochen, Sehnen…) können durch Zentrifugation abgetrennt werden. Zur Abtrennung

löslicher Verunreinigungen (Aminosäuren, Salze, Zucker…) wird die DNA mit Alkohol

präzipitiert und anschließend in einem geringeren Volumen Puffer wieder gelöst. So wird

zusätzlich eine Konzentrierung der DNA erreicht.

Hefezellen besitzen eine zweischichtige Zellwand, die aus speziellen Proteinen, langkettigen

Zuckern und Chitin aufgebaut ist. Diese Zellwand kann weder durch Detergenzien noch

durch ProteinaseK abgebaut werden.

Um Hefezellen zu zerstören muss zunächst mit einem speziellen Enzym, Lyticase, die

kovalente Verknüpfung der Zellwandkomponenten abgebaut werden. Um Verunreinigungen,

die mit der Lyticase eingebracht werden, entfernen zu können, erfolgt die enzymatische

Behandlung in einem Sorbitolpuffer, der die zellwandlosen Hefen (= Spheroplasten)

osmotisch stabilisiert und ihr Zerplatzen im wässrigen Puffer verhindert. Nach dem Waschen

werden die Spheroplasten in einem wässrigen Puffer resuspendiert und durch Zugabe von

SDS lysiert. DNA gebundene und zelluläre Proteine werden durch Inkubation bei 70 °C

denaturiert. Durch K+-Ionen (Zugabe von Kaliumacetat) werden die denaturierten Proteine

zusammen mit Dodecylsulfat ausgefällt und können durch Zentrifugation abgetrennt werden.

Durch Präzipitation der DNA mit Alkohol werden lösliche Verunreinigungen abgetrennt und

die DNA konzentriert. Bitte auch Theorieteil zur DNA-Analytik lesen!

Isolierung genomischer DNA aus Gewebe, Tag 1

6

Materialien:

- ca. 30 mg Gewebe

- Gewebe-Lysispuffer

- ProteinaseK Lösung 20 mg/ml

- sterile Eppendorf Tubes 1,5 ml (Eppi)

- Isopropanol

- 70% Ethanol p.A.

- TE 10/1

- Pipetten

- Pipettenspitzen (weiß, gelb, blau)

- Schüttel-Heizblock 55 °C

- Schüttel-Heizblock 42 °C

- Tisch-Zentrifuge

- 3M Na-Acetat

Versuchsdurchführung:

500 µl Gewebe-Lysispuffer zur Gewebeprobe pipettieren (1000 µl Pipette, blaue Spitzen)

2,5 µl ProteinaseK, 20 mg/ml, zugeben, mischen durch schwenken (10 µl Pipette, weiße Spitzen)

inkubieren bei 55 °C über Nacht im Schüttelheizblock bei mittlerer Schüttelfrequenz

Achtung:

Die DNA-Proben für den Versuch „Optimierung von PCR-Bedingungen“ – Pferdefleisch und unbekannte Probe – werden identisch zum Versuch „DNA-Isolierung aus Gewebe“ behandelt und hier mit bearbeitet; der Restriktions-Verdau wird aber nur von der frischen Gewebe-Probe (= im Eisbad) angesetzt!

Jede Gruppe setzt damit 4 Proben zur ProteinaseK Behandlung an:

- Gewebe für Restriktionsverdau der DNA (i.d.R. Maus-Leber, im Eisbad ausgegeben) - PCR Kontrolle nicht-Pferd = Schweinefleisch (im Abzug) - PCR Kontrolle Pferd = Pferdefleisch (im Abzug) - Unbekannte Probe für PCR = i.d.R. Rinderhackfleisch oder Fleischprodukt (im Abzug)

Isolierung genomischer DNA aus Gewebe, Tag 2

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Eppi zentrifugieren 14.000 rpm, 20 min in der Eppendorf-Tischzentrifuge; Zentrifuge mit mehreren Gruppen gemeinsam nutzen; Eppis tariert stellen, falls notwendig, Tara Eppi verwenden

Überstand vorsichtig in frisches Eppi überführen (1000 µl Pipette, blaue Spitze), bei der Probeentnahme auf ein mögliches Pellet achten; dieses nicht mit der Pipettenspitze berühren und aufwirbeln (Pellet ist eventuell „lose“)

500 µl Isopropanol zum Überstand zugeben, mischen: Isopropanol langsam an der Eppi Wand einlaufen lassen und so die wässrige Lösung überschichten; Phasen vorsichtig,

aber gründlich durch Schwenken mischen DNA “knäult“. Bitte danach das Eppi noch mindestens fünfmal invertieren, damit Isopropanol und wässrige Lösung wirklich gut gemischt sind.

zentrifugieren 14.000 rpm, 15 min Tischzentrifuge Zentrifuge mit mehreren Gruppen gemeinsam nutzen; Eppis tariert stellen, falls notwendig, Tara Eppi verwenden

Überstand vorsichtig abnehmen und verwerfen, Pellet nicht mit der Spitze berühren, langsam abpipettieren, das Pellet sollte sich nicht von der Eppi Wand lösen;

1 ml 70 % Ethanol zugeben (Waschschritt), zentrifugieren 14.000 rpm, 10 min, Tischzentrifuge (siehe oben)

Überstand abnehmen und verwerfen (siehe oben), Eppi in Zentrifuge, 10 sec „Quick run“

restlichen Ethanol mit Pipette abnehmen (je nach Menge 10 oder 100 µl Pipette und weiße oder gelbe Spitze)

DNA Pellet sofort in 250 µl TE 10/1 lösen TE zu DNA Pellet geben, im Heizblock bei 42 °C unter leichtem Schütteln inkubieren; Tube gelegentlich „anschnippen“ um Pellet aufzubrechen, nach ca. 30 min. Lösung vorsichtig auf und ab pipettieren, darauf achten, dass ein eventuell noch nicht gelöstes Pellet nicht in der Spitze kleben bleibt und dadurch verloren geht.

sobald sich die DNA vollständig gelöst hat 25 µl 3 M Na-acetat zugeben, mischen, 250 µl

Isopropanol zugeben, mischen >DNA fällt aus; (diese zweite Fällung dient der zusätzlichen Reinigung – Abtrennen von Salzen)

zentrifugieren 14.000 rpm, 15 min Tischzentrifuge (siehe oben)

Überstand vorsichtig abnehmen und verwerfen (siehe oben)

200 µl 70 % Ethanol zugeben, zentrifugieren 14.000 rpm, 10 min, Tischzentrifuge (siehe oben)



DNA Pellet an Luft trocken (Eppi offen ca. 5 min stehen lassen)

DNA lösen in 50 µl TE 10/1

TE auf das DNA-Pellet pipettieren, ca. 30 – 60 min inkubieren bei 42 °C; wenn sich die DNA

gelöst hat, mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren und im Kühlschrank lagern;

Isolierung genomischer DNA aus Hefe, Tag 1

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Materialien:

- Hefe Zellpellet

- Lyticase-Puffer = Y1

- Spheroplasten-Waschpuffer = Y2

- Lyticase Lösung 10 U/µl

- TE 50/100

- 10 % SDS

- 5 M Kaliumacetat

- Isopropanol

- 70 % Ethanol

- TE 10/1

- Pipetten


- Wasserbad 37 °C

- Eisbad

- Tisch-Zentrifugen

- sterile Eppendorf Tubes 1,5 ml

- Heizblock, 70oC und 42oC

- 3 M Na-Acetat

Sicherheitshinweise und Entsorgungshinweise auf Seite 1 beachten! Achtung bei

Arbeiten mit Mercaptoethanol!


Hefe Zellpellet resuspendieren in 500 µl Lyticase-Puffer; (1000 µl Pipette, blaue Spitzen); zum Resuspendieren Puffer mehrmals auf und ab pi-pettieren, vortexen (15 sec, Maximum), und Suspension erneut mehrmals auf und ab pi-pettieren; es soll eine homogene Suspension vorliegen; Achtung: Lyticase-Puffer enthält Mercaptoethanol – giftig! Im Abzug arbeiten!

10 µl Lyticase Lösung, 10 U/µl zugeben (10 µl Pipette, weiße Spitzen); Suspension zum mischen kurz vortexen;

Inkubieren bei 37 °C, 45 min, im Wasserbad, Suspension ca. alle 10 min vorsichtig mischen

zentrifugieren 5.000 rpm, 5 min in der Tischzentrifuge Zentrifuge mit mehreren Gruppen gemeinsam nutzen; Eppis tariert stellen, falls notwendig, Tara Eppi verwenden

Überstand sehr vorsichtig abnehmen, Pellet ist eventuell sehr lose (1000 µl Pipette, blaue Spitzen), mit der Spitze nicht ans Pellet kommen; Überstand in Sondermüll, Spitzen in Abfallbehälter im Abzug;

Pellet vorsichtig resuspendieren in 1 ml Spheroplasten-Waschpuffer. Dieser Schritt dient zum Entfernen des restlichen Mercaptoethanols und Verunreinigungen in der Lyticasepräparation. Puffer zugeben und Eppi vorsichtig schwenken; nicht vortexen, nicht oder nur sehr vorsichtig auf und ab pipettieren; Suspension muss nicht vollständig homogen sein; zu kräftiges Mischen kann zur Zerstörung der sehr empfindlichen Hefe Spheroplasten führen

(Zellen sind nur noch von einer Zellmembran geschützt) geringere Ausbeute an genomischer DNA


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zentrifugieren 5.000 rpm, 5 min in der Tischzentrifuge

Überstand sehr vorsichtig abnehmen (siehe oben, Überstand in Sondermüll!)

Waschschritt mit Spheroplasten-Waschpuffer wiederholen (500 µl Puffer zugeben, vorsichtig resuspendieren, zentrifugieren)

Überstand vorsichtig abnehmen (Überstand in Sondermüll)

Pellet resuspendieren in 500 µl TE 50/100 (1000 µl Pipette, blaue Spitzen), zum resuspendieren auf und ab pipettieren, eventuell vorsichtig vortexen; Spheroplasten müssen diesmal vollständig resuspendiert sein;

50 µl 10 % SDS zugeben, mischen, inkubieren bei 70 °C, 30 min (100 µl Pipette, gelbe Spitzen),

250 µl 5 M K-acetat zugeben, mischen, vorsichtig mischen, nicht vortexen, inkubieren auf Eis, 15 min (1000 µl Pipette, blaue Spitzen);

zentrifugieren 14.000 rpm, 20 min Tischzentrifuge

Überstand überführen in frisches Eppi, 700 µl Isopropanol zugeben, mischen (1000 µl Pipette, blaue Spitzen),

zentrifugieren 14.000 rpm, 10 min, Tischzentrifuge

Überstand abnehmen und verwerfen, 200 µl 70 % EtOH zugeben

zentrifugieren 14.000 rpm, 5 min, Tischzentrifuge

Überstand abnehmen und verwerfen, Eppi in Zentrifuge, 10 sec „Quick run“

Restflüssigkeit abnehmen

DNA Pellet sofort in 500 µl TE 10/1 lösen TE zu DNA Pellet geben, im Heizblock bei 42 °C unter leichtem Schütteln inkubieren;


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nach ca. 30 min oder am nächsten Tag Lösung vorsichtig auf und ab pipettieren, darauf achten, dass ein noch nicht gelöstes Pellet nicht in der Spitze kleben bleibt und dadurch verloren geht.

sobald sich die DNA vollständig gelöst hat 50 µl 3 M Na-Acetat zugeben, mischen, 500 µl

Isopropanol zugeben, mischen >DNA fällt aus; (diese zweite Fällung dient der zusätzlichen Reinigung – Abtrennen von Salzen)

zentrifugieren 14.000 rpm, 15 min Tischzentrifuge

Überstand vorsichtig abnehmen und verwerfen (siehe oben)

200 µl 70 % Ethanol zugeben, zentrifugieren 14.000 rpm, 10 min, Tischzentrifuge



DNA Pellet an Luft trocken (Eppi offen ca. 5 min stehen lassen)

DNA lösen in 50 µl TE 10/1 TE auf das DNA-Pellet pipettieren, ca. 30 – 60 min inkubieren bei 42 °C; wenn sich die DNA gelöst hat, mehrmals vorsichtig auf und ab pipettieren und bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank lagern;

Analyse genomischer DNA

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Die Analyse von Nukleinsäuren (DNA und RNA) erfolgt in der Regel durch Auftrennung in

Agarosegelen und gleichzeitiger Anfärbung der DNA mit einem Fluoreszenzfarbstoff. (Kurze

Nukleinsäuren bis ca. 250 Basen können auch in Polyacrylamidgelen aufgetrennt werden).

Nukleinsäuren besitzen eine gleichbleibende Ladungsdichte, d.h. das Verhältnis von

Molekulargewicht zur Ladung ist konstant. Die unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit im

elektrischen Feld in einer (Agarose-) Gelmatrix beruht auf der Größen-abhängigen Interaktion

der Nukleinsäuremoleküle mit der Gelmatrix. Große Moleküle interagieren stärker und wandern

daher langsamer.

Die Wandergeschwindigkeit ist daher nicht nur von der Größe der Nukleinsäuren, sondern auch

von der Gelmatrix selber abhängig. Je enger vernetzt die Gelmatrix, Agarose, ist, umso

langsamer bewegen sich die Nukleinsäuren. Für große Nukleinsäuren werden daher niedrig

prozentige (0,6 – 0,8%) Agarosegele verwendet, für kürzere Nukleinsäuren höher prozentige

(1,0 – 4,0%).

Das Anfärben der DNA im Agarosegel erfolgt im Praktikum mit SYBR Safe, einem DNA

interagierenden Cyanin-Farbstoff, der sich an die DNA anlagert. Der Farbstoff wird in die

Gelmatrix mit eingegossen. Wenn sich die DNA durch die Agarose bewegt, bindet SYBR Safe

an die DNA. Auf einem UV-Schirm kann dann die DNA über die Fluoreszenz des Farbstoff-

DNA-Komplexes sichtbar gemacht werden.

Für die Größenbestimmung der untersuchten DNA-Fragmente wird auf jedem Gel ein käuflicher

DNA Größenstandard mit aufgetragen und aufgetrennt. Der Vergleich der Laufstrecke der zu

untersuchenden DNA-Fragmente mit diesem Größenstandard erlaubt dann eine

Längenabschätzung. Da die Größenstandards verschiedene DNA-Fragmente in einer

definierten Konzentration enthalten, kann der Vergleich der Fluoreszenzintensität von

Markerbanden mit zu analysierender DNA-Bande auch zu einer groben Mengenabschätzung

verwendet werden.

Bei der Isolierung genomischer DNA wird nicht nur die DNA freigesetzt, sondern auch die in den

Zellen vorhandene RNA. Die im Praktikum verwendeten Methoden können nicht zwischen DNA

und RNA unterscheiden. Deshalb wird mit der DNA auch RNA gefällt. Abhängig vom Zelltyp

kann so viel RNA mit der DNA isoliert werden, dass weitere Analysen durch die RNA gestört

werden. Durch die Behandlung der gereinigten genomischen DNA mit RNase wird die RNA

abgebaut und stört dann weder bei der Analyse im Agarosegel noch bei weiteren

enzymatischen Behandlung der DNA.

Für weiterführende Arbeiten mit (genomischer) DNA ist es oft sinnvoll und notwendig diese in

kleinere, definierte Fragmente zu „zerschneiden“. Hierfür werden Restriktionsendonukleasen (=

Restriktionsenzyme) verwendet. Restriktionsenzyme binden sequenzspezifisch an

doppelsträngige DNA und spalten den DNA-Doppelstrang an spezifischen Stellen. Die Binde-

und Spaltungsstellen der gängigen Restriktionsenzyme sind vier bis acht Basenpaare lang und

meist palindromisch. Wie häufig eine Restriktionsstelle statistisch innerhalb eines DNA-

Fragments vorkommt hängt von der Länge der Erkennungssequenz ab. Die vier Basenpaar

lange Erkennungsstelle von HaeIII sollte daher viel häufiger in genomischer DNA auftreten als

die sechs Basenpaar lange Erkennungssequenz von EcoRI. Bei der Spaltung der beiden

genomischen DNAs mit HaeIII sollten daher statistisch kleinere Fragmente entstehen, als mit

EcoRI.

Bitte auch Theorieteil zur DNA-Analytik lesen!

Restriktionsspaltung genomischer DNA, Tag 2

12

Materialien:

- genomische DNA vom Gewebe (nur von dem Eisbad-Material!) und Hefe-DNA aus Versuch

1.) und 2.)

- Restriktionsendonuklease EcoRI

- Restriktionsendonuklease HaeIII

- EcoRI 10 x Reaktionspuffer (10 x Eco, schwarz beschriftet)

- 10 x Reaktionspuffer R, (10 x R, rot beschriftet)

- H2Obidest (autoklaviert)

- RNaseA 10 mg/ml

- Pipetten

- Spitzen (weiß, gelb)

- Eppendorf Tubes 1,5 ml, steril

- Agarose

- 50 x TAE

- SYBR Safe Lösung

- Agarosegel – Kammern, Kämme

- DNA-Längenstandard GeneRulerTM, 1 kb DNA Ladder

- 5 x DNA Auftragspuffer

- Wasserbad 37 °C

- Eisbad

- Geldokumentationssystem

Sicherheitshinweise und Entsorgungshinweise auf Seite 1 beachten! Achtung bei Arbeiten mit SYBR Safe!


RNase Behandlung und Restriktionsspaltung:

Genomische

DNA

RNase

A 10 x Eco (10 x Puffer)

EcoRI (Restriktions-

enzym)

10 x R (10 x Puffer)

HaeIII (Restriktions-

enzym)

H2O (autoklaviert)

Gewebe 10 µl --- --- --- --- --- 2 µl

Gewebe 10 µl 2 µl --- --- --- --- ---

Hefe 10 µl --- --- --- --- --- 2 µl

Hefe 10 µl 2 µl --- --- --- --- ---

Gewebe 10 µl 3 µl 3 µl 3 µl --- --- 11 µl

Gewebe 10 µl 3 µl --- --- 3 µl 3 µl 11 µl

Hefe 10 µl 3 µl 3 µl 3 µl --- --- 11 µl

Hefe 10 µl 3 µl --- --- 3 µl 3 µl 11 µl

DNA vorlegen, Puffer, RNaseA, Restriktionsenzym und H2Obidest pipettieren, Eppis kurz anzentrifugieren, dann den Spaltungsansatz durch mehrmaliges auf und ab pipettieren mi-schen;

Spaltungsansatz inkubieren bei 37 °C über Nacht, am Mittwoch einfrieren auf –20 °C;

Achtung: Sie benötigen noch einige µl Hefe-DNA für die PCR Reaktion

Auftrennung genomischer DNA im Agarosegel, Tag 4

13

Agarosegelelektrophorese

0,8 % Agarosegel gießen (Tag 3, siehe Vorschrift Seite 3)

Vorbereiten der Apparatur:

- Gel entsprechend Vorschrift auf Seite 3 herstellen und verpacken

- Alufolie und Kamm vorsichtig entfernen, Schiffchen aus dem Gießstand nehmen;

- Eventuell ausgelaufenes oder verspritztes Gel aufnehmen und in SYBR Safe-Abfall fest geben.

- Gelschiffchen in die Kammer einsetzen – Laufrichtung der DNA beachten!

- Puffer vorsichtig in die Gelkammer einfüllen; der Puffer soll ca. 2-3 mm über dem Agarosegel stehen;

Gelauftrag:

Tasche Probe Proben-

menge

Proben-

volumen

Auftrags-

puffer 5 x H2Obidest

END-

volumen

1 Längenstandard 1000 ng 10µl --

2 Gewebe-DNA, - RNase 5 µl 2 µl 3 µl 10 µl

3 Gewebe-DNA, + RNase 5 µl 2 µl 3 µl 10 µl

4 Hefe-DNA, - RNase 5 µl 2µl 3 µl 10 µl

5 Hefe-DNA, + RNase 5 µl 2 µl 3 µl 10 µl

6 Gewebe-DNA/EcoRI 20 µl 5 µl 25 µl

7 Gewebe-DNA/HaeIII 20 µl 5 µl 25 µl

8 Hefe-DNA/EcoRI 20 µl 5 µl 25 µl

9 Hefe-DNA/HaeIII 20 µl 5 µl 25 µl

Konzentration Längenstandard: 100 ng/µl

Proben mit 100 µl Pipette/gelben Spitzen vorsichtig in die Geltaschen füllen, Deckel aufset-zen; (Achtung! Proben aus Versuch Plasmidspaltung werden ebenfalls auf dieses Gel aufgetragen!)

Elektrophorese erfolgt bei 60 – 80 V für ca. 30 min., dann mit 100 – 120 V bis der blaue Farbstoff etwas weiter als zur Mitte des Gels gewandert ist;

Am Ende der Elektrophorese Strom abstellen, Gel mit Träger aus der Kammer nehmen und in Tragschale mit saugfähigem Papier legen (Nitril - Handschuhe!)

Gelbild am Dokumentationssystem erstellen

Gelkammer, Gelträger und Kämme nach Gebrauch sofort mit reichlich Wasser reinigen und trocknen lassen; bitte nicht mit Papierhandtüchern abtrocknen!

Isolierung von Plasmid-DNA

14


15

Plasmide sind kleine, zirkuläre DNA-Moleküle, die in einigen Mikroorganismen (Bakterien,

Hefen) natürlich vorkommen. Sie sind nicht Bestandteil der genomischen DNA (extra-

chromosomal). Um stabil in einer Bakterienkultur erhalten zu bleiben, müssen Plasmide zwei

genetische Grundelemente enthalten: Einen Replikationsursprung (origin), der vom bakteriellen

Replikationapparat erkannt wird und das Plasmid vervielfältigt und ein Gen, das den Bakterien

einen Wachstumsvorteil gegenüber plasmidlosen Bakterien vermittelt.

- Für die Manipulation von DNA bieten Plasmide einige wichtige Vorteile, die sie zu einem

unverzichtbaren Bestandteil aller Labors, die mit DNA arbeiten, gemacht haben:

- Plasmide vereinen auf einer minimalen DNA-Sequenz alle Faktoren (Replikationsursprung,

Markergen), die notwendig sind, um sie stabil in Bakterienzellen zu vermehren.

- Plasmide können in großer Menge (µg – mg) getrennt von der genomischen DNA aus

Bakterien isoliert werden.

- Plasmide lassen sich hoch effizient in speziell präparierte Bakterien einführen

(transfomieren).

- Durch (heute) einfache Verfahren können Plasmide modifiziert und dadurch den

Bedürfnissen des Nutzers angepasst werden. (Einführen verschiedener Markergene, speziell

Antibiotika-Resistenzgene, Einführen von Restriktionsschnittstellen => Klonierungsvektoren,

Einführung von Promotoren => Expressionsvektoren,…)

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien ist im Vergleich zur Isolierung von genomischer

DNA aus Hefe oder Gewebe schnell, einfach und sehr effizient. Im Praktikum werden zwei weit

verbreitete Methoden vorgestellt:

Auf der Isolierung von Plasmid-DNA durch alkalische Lyse basieren die meisten heute

kommerziell erwerbbaren „Kits“ zur Plasmidisolierung. Die Bakterienzellen werden in einer

Pufferlösung, die auch EDTA zur Komplexierung zweiwertiger Kationen enthält, resuspendiert.

Die Zugabe eines NaOH und SDS haltigen Puffers führt zur Denaturierung aller Proteine (und

damit zur Lyse der Zellen) und der DNA (sowohl genomische DNA als auch Plasmid-DNA). Die

Zugabe von Kaliumacetat neutralisiert die Lösung. Die DNA beginnt wieder zu renaturieren,

wobei dieser Prozess bei den kleinen Plasmiden deutlich schneller geht, als bei genomischer

DNA. Da die beiden Einzelstränge eines Plasmids aufgrund der zirkulären Natur miteinander

verlinkt bleiben, finden sich die komplementären Stränge auch schnell wieder. Die Zugabe von

K+-Ionen fällt außerdem das Dodecylsulfat zusammen mit den Proteinen aus. Die genomische

Bakterien DNA wird dabei mit ausgefällt, da sie einerseits kovalent an Membranproteine

gebunden ist und außerdem von denaturierten Proteinen bedeckt ist, die sie bei der Fällung

mitreißen. Das Kalium-dodecylsulfat-Protein-genomische DNA Präzipitat wird durch

Zentrifugation abgetrennt. Die renaturierte Plasmid-DNA befindet sich im wässrigen Überstand

und kann daraus mit Alkohol zur weiteren Reinigung und Konzentrierung ausgefällt werden.

Einhalten der Inkubationszeiten und ein vorsichtiges Mischen (nicht kräftig Schütteln, nicht

vortexen) sind wichtig um ein Freisetzen der genomischen DNA zu verhindern. Wird diese,

durch zu langes Einwirken der NaOH von den gebundenen Membranproteinen gelöst oder

mechanisch (heftiges Schütteln) geschert, geht sie ganz oder teilweise in Lösung und kann

dann nicht mehr von der Plasmid-DNA abgetrennt werden.

Bei der Isolierung von Plasmid-DNA nach der Boiling Methode werden die Bakterienzellen

durch ein Enzym (Lysozym) zusammen mit einem milden Detergenz aufgeschlossen. Proteine

werden durch kurzzeitiges Erhitzen im kochenden Wasserbad denaturiert. Das für die Zelllyse

verwendete Detergenz ist nicht stark genug, um die denaturierten Proteine in Lösung zu halten.


16

Sie fallen zusammen mit Zelltrümmern aus. Auch hier reißen die denaturierten Proteine die

genomische DNA mit. Durch Zentrifugation können daher Zelltrümmer, denaturierte Proteine

und genomische DNA abgetrennt werden. Wie bei der alkalischen Lyse ist das Einhalten der

Inkubationszeiten äußerst wichtig, da bei zu kurzen Zeiten die Zellen nicht lysieren und die

Proteine nicht denaturieren und bei zu langen Zeiten die genomische DNA freigesetzt wird und

in Lösung geht.


Es werden 4 verschiedene Bakterienkulturen ausgegeben (beschriftet mit 9, 12, 16 oder 26),

die jeweils ein unterschiedliches Plasmid tragen.

Pro Gruppe wird ein Plasmid auf zwei verschiedene Methoden isoliert Achten Sie darauf, dass

Ihre beiden Bakterienpellets die gleiche Nummer tragen und notieren Sie sich die Nummer Ihrer

Bakterienkultur!

Isolierung von Plasmid-DNA – Alkalische Lyse, Tag 2

17

Isolierung von Plasmid-DNA durch alkalische Lyse: Materialien:

- Bakterienpellet aus 5 ml Kultur

- Resuspensionspuffer =P1

- Lysispuffer =P2

- Neutralisationspuffer =P3

- Isopropanol

- 70 % Ethanol p.A.

- TE 10/1, steril (autoklaviert)

- RNaseA Lösung 10 mg/ml

- 15 ml Rundbodenröhrchen

- Glaspipetten

- Pipettierhilfe


- Pipetten


- Eisbad

- Tisch-Zentrifugen

- Eppendorf-Zentrifuge für 15ml Röhrchen


Bakterienpellet mit 300 µl Resuspensionspuffer aufnehmen; 1000 µl Pipette, blaue Spitze; Zellpellet resuspendieren durch auf und ab pipettieren; der Resuspensionspuffer enthält keine RNaseA, daher keine Inkubation nach Resuspendierung;

Bakteriensuspension überführen in 1,5 ml Eppi;

300 µl Lysispuffer zugeben, vorsichtig mischen bis Suspension klar wird (nicht schütteln, nicht vortexen! Mischen durch invertieren)

3 – 5 min inkubieren bei RT;

300 µl Neutralisationspuffer zugeben (zwischen der Zugabe von Lysis- und Neutralisations-puffer sollen nicht mehr als 5 min vergehen), vorsichtig, aber vollständig mischen (nicht schütteln, nicht vortexen), inkubieren auf Eis für 5 min

Zentrifugieren bei 14.000 rpm, 10 min in der Tisch-Zentrifuge; Zentrifuge mit mehreren Gruppen gemeinsam nutzen; Eppis tariert stellen,

Klaren Überstand überführen in frisches 1,5 ml Eppi, 600 µl Isopropanol zugeben, gründlich mischen

Zentrifugieren bei 14.000 rpm, 20 min in Tischzentrifuge, Eppis tariert stellen,

Überstand abnehmen und verwerfen; (vorsichtig abgießen oder mit 1000 µl Pipette abnehmen)

200 µl 70 % Ethanol zugeben, zentrifugieren 5 min/14.000 rpm in Tischzentrifuge

Überstand abnehmen und verwerfen; (100 µl Pipette, gelbe Spitze),

Eppi kurz „anzentrifugieren“ (in Tischzentrifuge, 10 sec Quick run)

restliche Flüssigkeit abnehmen;

DNA Pellet 5 min an Luft trocknen (Eppi offenstehen lassen)

DNA Pellet lösen in 45 µl TE 10/1, 5 µl RNase A, 10 mg/ml zugeben

Isolierung von Plasmid-DNA – Boiling Methode, Tag 2

18

Isolierung von Plasmid-DNA nach der Boiling Methode:

Materialien:

- Bakterienpellet aus 5 ml Kultur

- Puffer STET

- Lysozym Lösung, 10 mg/ml

- Isopropanol

- 70 % Ethanol (p.A.)

- TE 10/1, steril (autoklaviert)

- RNaseA Lösung, 10 mg/ml


- Glaspipetten


- Pipetten


- Wasserbad 100 °C

- Tisch-Zentrifugen

- sterile Zahnstocher/Impfnadeln

- Eisbad

- Eppendorf-Zentrifuge für 15ml Röhrchen

Versuchsdurchführung

Bakterienpellet mit 350 µl Puffer STET resuspendieren; 1000 µl Pipette, blaue Spitze; Zellpellet resuspendieren durch auf und ab pipettieren; vor-sichtig pipettieren, nicht vortexen, Puffer enthält Triton X-100 und schäumt;

Bakteriensuspension überführen in 1,5 ml Eppi;

25 µl Lysozym Lösung, 10 mg/ml zugeben, vortexen 3 sec;

Eppi sofort in 100 °C Wasserbad stellen, inkubieren für 40 sec

Eppi zentrifugieren 14.000 rpm, 10 min, Tisch-Zentrifuge; Zentrifuge mit mehreren Gruppen gemeinsam nutzen; Eppis tariert stellen, falls notwendig, Tara Eppi verwenden

Bakterienpellet mit sterilem Zahnstocher (Impfnadel, gelbe Spitze) entfernen;

420 µl Isopropanol zugeben, mischen;

zentrifugieren bei 14.000 rpm, 20 min, Tisch-Zentrifuge

Überstand abnehmen und verwerfen; (vorsichtig abgießen oder mit 1000 µl Pipette, blauer Spitze abnehmen)

200 µl 70 % Ethanol zugeben, zentrifugieren 5 min/14.000 rpm, Tisch-Zentrifuge;

Überstand abnehmen und verwerfen; (100 µl Pipette, gelbe Spitze), Eppi kurz „anzentrifugieren“ (Tisch-Zentrifuge, 10 sec. Quick run)

restliche Flüssigkeit abnehmen

DNA Pellet 5 min an Luft trocknen (Eppi offenstehen lassen)

DNA Pellet lösen in 45 µl TE 10/1, 5 µl RNaseA zugeben

Analyse von DNA im Agarosegel

19

Für lineare DNA-Fragmente gibt es bei der Auftrennung im Agarosegel eine lineare

Abhängigkeit von Fragmentlänge (in Basenpaaren) und Laufstrecke. So ist es möglich einen

linearen DNA-Längenstandard mit auf das Gel aufzutragen und durch Vergleich Rückschlüsse

auf die Länge der zu analysierenden DNA zu ziehen.

Für zirkuläre Plasmid-DNA gilt diese einfache Korrelation von Laufstrecke zu Größe nicht. Hier

ist das Laufverhalten stark von der Form der zirkulären DNA abhängig.

Plasmid-DNA liegt in Bakterien in der Regel verdrillt vor. D.h. der DNA-Ring ist zu einer Art

Superhelix gewunden. Diese sogenannte „supercoiled“ Form der Plasmid-DNA ist sehr kompakt

und nimmt weniger Raum ein, als ein lineares DNA Molekül der gleichen Größe. Im Agarosegel

läuft ein „supercoiled“ Plasmid schneller, als man es ausgehend von seiner Größe erwarten

würde.

Ist nur in einem der DNA-Stränge an einer Stelle das DNA Phosphatrückrat gebrochen, kommt

es zu einer Entspannung des verdrillten zirkulären DNA-Moleküls. Dieser entspannte, „relaxed“

DNA-Zirkel ist im Agarosegel sperriger als das „supercoiled“ Molekül und auch sperriger als ein

vergleichbar großes lineares DNA-Molekül. Das „relaxed“ Plasmid läuft daher langsamer als

das „supercoiled“ und lineare Plasmid.

Einzelstrangbrüche im DNA-Rückrat können durch mechanische Belastung oder geringste

Spuren von Nuklease Aktivität eingeführt werden und sind in einer Plasmid Präparation nicht

vermeidbar. Das Verhältnis von „supercoiled“ zu „relaxed“ Form ist ein Maß für die Qualität der

Plasmid Präparation (viel „supercoiled“ = gut).

Das Auftrennen der gereinigten Plasmid-DNA im Agarosegel gibt somit Aufschluss über die

Qualität der DNA.

Durch Auftragen einer Plasmid-DNA mit bekannter Konzentration kann außerdem die

ungefähre Konzentration der eigenen Plasmid-DNA abgeschätzt werden.

Will man die tatsächliche Größe eines Plasmids im Agarosegel abschätzen, muss man es

zunächst mit einem Restriktionsenzym linearisieren.


Kontrolle der Plasmid-DNA im Agarosegel, Tag 3

20

Kontrolle und Mengenabschätzung der isolierten Plasmid-DNA:

Materialien

- Kontroll-DNA als Mengen-Standard (200 ng/ul, s.u.)

- Plasmid-DNA aus Versuch Seite 15 und 16

- H2Obidest (autoklaviert)

- Pipetten


- Eppendorf Tubes 1,5 ml, steril

- Agarose

- 50 x TAE

- SYBR Safe Lösung 1 mg/ml (?)

- Agarosegel Kammern, Kämme




Sicherheitshinweise und Entsorgungshinweise auf Seite 1 beachten! Achtung bei Arbeiten mit SYBR Safe!


0,8 % Agarosegel gießen – siehe Vorschrift Seite 3

Gelauftrag: Alle Proben werden auf ein Endvolumen von 10 µl eingestellt


menge

Proben-

volumen

Auftrags-


End-

volumen

1 Längenstandard 1000 ng ? --

2 Kontroll-DNA 500 ng ? 2 µl ? 10 µl

3 Plasmid-DNA-AL 2,5 µl 2 µl ? 10 µl

4 Plasmid-DNA-AL 5 µl 2 µl ? 10 µl

5 Plasmid-DNA-B 2,5 µl 2 µl ? 10 µl

6 Plasmid-DNA-B 5 µl 2 µl ? 10 µl

7 Kontroll-DNA 1000 ng 2 µl ? 10 µl

Konzentration DNA Marker: 100 ng/µl

Konzentration Kontroll-DNA: 200 ng/µl

Proben mit 10 µl Pipette/weiße Spitzen vorsichtig in die Geltaschen füllen, Deckel aufsetzen

Elektrophorese erfolgt bei 80 V bis der blaue Farbstoff etwa in die Mitte des Gels gewandert ist;



Gelkammer, Gelträger und Kämme nach Gebrauch sofort mit reichlich Wasser reinigen;

Restriktionsspaltung

21

Restriktionsenzyme spalten DNA sequenz-spezifisch unter Ausbildung definierter Enden. Die

Verteilung der Restriktionsschnittstellen ist für jedes DNA Fragment charakteristisch (da

Sequenz abhängig). Restriktionsanalysen bzw. Restriktionskartierungen können daher zur

Charakterisierung und Identifizierung von DNA-Fragmenten verwendet werden.

Die Ausbildung definierter Enden ermöglicht es nicht nur große DNA-Moleküle in kleinere

Fragmente zu zerschneiden, sondern auch, bei passenden Enden, DNA-Fragmente in neuer

Anordnung wieder zusammen zu fügen. Die im Labor üblicherweise verwendeten

Restriktionsenzyme Typ II haben palindromische Erkennungssequenzen und schneiden

innerhalb dieser Erkennungssequenz symmetrisch. Auf diese Weise werden, je nach Enzym,

„überhängende“ oder „glatte“ Enden erzeugt.

Da Restriktionsenzyme sequenz-spezifisch spalten, sind die Basen an den neu erzeugten

Enden für jedes Restriktionsenzym immer gleich und bekannt.

„Überhängende“ Enden, die vom selben Restriktionsenzym erzeugt wurden, können durch

spezielle Enzyme (Ligasen) wieder zusammengefügt werden. „Überhängende“ Enden, die von

zwei verschiedenen Restriktionsenzymen gebildet wurden, sind nicht kompatibel und lassen

sich nicht miteinander ligieren (von dieser Regel gibt es einige Ausnahmen).

Auf diese Weise kann man z.B. gezielt bestimmte DNA-Fragmente in Plasmide einführen. Ein

mit EcoRI linearisiertes Plasmid hat zwei EcoRI spezifische Enden, die sich mit einem

Fragment, das ebenfalls EcoRI Enden hat, verbinden lassen. So wird das Fragment in das

Plasmid eingefügt. Anschließend kann das Plasmid in Bakterien transformiert und dort vermehrt

werden. Zur Kontrolle, ob das Einfügen des Fragments funktioniert hat, wird das Plasmid wieder

aus Bakterien isoliert und erneut mit EcoRI gespalten. Da durch das Zusammenfügen zweier

EcoRI Enden die EcoRI Erkennungsstelle wieder regeneriert wird, lässt sich anhand der

Spaltprodukte einfach feststellen, ob das Plasmid das Fragment aufgenommen hat oder ob nur

die kompatiblen Plasmidenden zusammengefügt wurden.

„Glatte“ Enden können ebenfalls von Ligasen zusammengefügt werden. Allerdings können bei

„glatten“ Enden auch durch verschiedene Restriktionsenzyme erzeugte Enden miteinander

ligiert werden. In der Regel wird dabei aber keine Restriktionsschnittstelle regeneriert.

Im Praktikum verwenden Sie eines von vier verschiedenen Plasmiden (die DNA haben Sie im

vorherigen Versuch selber isoliert). Die Plasmid-DNA werden Sie mit verschiedenen

Restriktionsenzymen spalten und anschließend auf einem Agarosegel auftrennen und sichtbar

machen.

Die Spaltungsmuster, das Sie finden, sind spezifisch für ein bestimmtes Plasmid. Durch die

Spaltung mit einzelnen Enzymen und unterschiedlichen Kombinationen aus zwei Enzymen,

können Sie aus den Spaltungsmustern eine Restriktionskarte des Plasmids erstellen, die Ihnen

Auskunft darüber gibt, welche Restriktionsschnittstelle wie oft und in welchen Abstand

zueinander auf Ihrem Plasmid vorkommen.


Restriktionsspaltung der Plasmid-DNA, Tag 3

22

Materialien:

- Plasmid-DNA aus 4.) oder 5.); (qualitativ bessere DNA verwenden)

- H2Obidest, autoklaviert

- verschiedene 10 x Reaktions-Puffer

- verschiedene Restriktionsenzyme


- Eppendorf Tubes, steril, 1,5 ml (Eppi)

- Agarose

- 50 x TAE

- SYBR Safe Lösung

- Pipetten

- Pipettenspitzen (weiß, gelb)

- Wasserbad 37 °C

- Tisch-Zentrifugen





- Eisbad


allgemeiner Spaltungsansatz:

x µl Plasmid-DNA

1/10 Vol 10 x Puffer (entsprechend Enzym)

y µl Enzym (maximal 1/10 Vol. des Gesamtansatzes)

z µl H2Obidest, autoklaviert (H2O ad Endvolumen)

Spaltungen:

- Setzen Sie jeweils 1000 ng Plasmid-DNA pro Spaltung ein

- Konzentration der Plasmid-DNA entsprechend Ihrer Berechnung

- Plasmid-DNA falls notwendig verdünnen

- Setzen Sie 10 Units Enzym pro Spaltung ein, bei Doppelspaltungen 10 Units für jedes Enzym

- Konzentration der Enzymlösungen: 10 Units/µl

- Endvolumen der Spaltungsansätze: 20 µl

Enzym 1 Enzym 2 10 x Puffer

EcoRI (schwarz) EcoRI unique (10 x Eco, schwarz)

HinDIII (rot) Fermentas R (10 x R, rot)

NdeI (grün) Fermentas O (10 x O, grün)

EcoRI HinDIII Fermentas R (10 x R, rot)

EcoRI NdeI Fermentas O (10 x O, grün)

HinDIII NdeI Fermentas R (10 x R, rot)

(schwarz, rot, grün = Farbe der Beschriftung auf ausgegebenen Tubes)

Restriktionsspaltung der Plasmid-DNA, Tag 3

23

Eppis für Spaltungen vorbereiten beschriften, in sinnvoller Reihenfolge in Ständer sor-tieren

Plasmid-DNA in Eppis vorlegen (10 µl Pipette, weiße Spitzen)

entsprechenden 10 x Puffer zugeben (10 µl Pipette, weiße Spitzen)

Enzym(e) zugeben, eventuell Eppis kurz zentrifugieren (quick run) um Enzym am Eppi-Boden zu sammeln; (10 µl Pipette, weiße Spitzen)

H20bidest autoklaviert zugeben, mischen durch auf und ab pipettieren (100 µl Pipette, gelbe Spitzen)

Inkubieren bei 37 °C für 2 – 3 h, eventuell auch über Nacht

0,8 % Agarosegel gießen siehe Vorschrift Seite 3

Restriktionskartierung Auftrennung der Plasmidspaltungen im Agarosegel, Tag 4

24

Markerproben vorbereiten (siehe Auftragsschema), Auftragspuffer zu DNA-Proben geben

Auftragsschema:


menge

Proben-

volumen

Auftrags-


End-

volumen

1 Längenstandard 1000 ng ? --

2 Plasmid-DNA, ungesp. 500 ng ? 2µl 10 µl

3 EcoRI-Spaltung 20 µl 5 µl 25 µl

4 HinDIII-Spaltung 20 µl 5 µl 25 µl

5 NdeI-Spaltung 20 µl 5 µl 25 µl

6 EcoRI/HinDIII-Spaltung 20 µl 5 µl 25 µl

7 EcoRI/NdeI-Spaltung 20 µl 5 µl 25 µl

8 HinDIII/NdeI-Spaltung 20 µl 5 µl 25 µl

Elektrophorese bei 60 V für 15 – 30 min, dann bei 120 V bis blauer Farbstoff etwas weiter als die Mitte des Gels gelaufen ist;

Gel dokumentieren

Transformation von Bakterien

25

Transformation von Bakterien

26

Unbehandelte Zellen nehmen DNA gar nicht oder nur sehr schlecht auf. Um Zellen zu

transformieren, d.h. DNA in sie einzubringen, muss die Zellmembran zunächst permeabel

gemacht werden.

Es gibt verschiedene Methoden mit denen unterschiedliche Zelltypen transformiert werden

können. Im Praktikum transformieren wir Bakterien, die zuvor durch Behandlung mit einem

Ca2+-Ionen haltigen Puffer kompetent für die Aufnahme von DNA gemacht wurden.

Kompetente Bakterien sind relativ empfindlich. Sie werden direkt nach dem „kompetent

machen“ in kleine Arbeitsportionen aufgeteilt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Nach

dem Auftauen sollten sie weder heftig gemischt (nicht vortexen) werden, noch zu lange

rumstehen. Besonders wichtig ist es, die Zellen vor der Transformation ständig auf Eis gekühlt

zu halten. Beachtet man diese Regeln nicht, verlieren die Zellen sehr schnell ihre Kompetenz

und die Effizienz der DNA Aufnahme und damit die Anzahl der erhaltenen Bakterienkolonien

sinkt drastisch ab.

Für die Transformation werden die Bakterienzellen mit einer definierten Menge Plasmid-DNA

gemischt und auf Eis inkubiert. Es erfolgt dann ein kurzer Hitzeschock bei 42 Grad. Dieser führt

dazu, dass die DNA in die Zelle aufgenommen wird.

Um den Zellen Zeit zur Erholung zu geben, werden sie kurz auf Eis gestellt und dann mit wenig

Medium ohne Selektionsantibiotikum gemischt und bei 37°C inkubiert. Die Inkubation ohne

Selektionsantibiotikum ermöglicht es den Bakterien das Resistenz vermittelnde Protein (kodiert

auf dem transformierten Plasmid) zu exprimieren. Bei einigen Antibiotika, die die Translation

irreversibel inhibieren, ist dies ein essentieller Schritt. Würde das Resistenzgen nicht vor

Zugabe des Antibiotikums schon als Protein in der Zelle vorliegen, könnte es den Einsatz von

Translations-hemmenden Wirkstoffen auch nicht mehr gebildet werden.

Nachdem die Bakterienzellen Zeit hatten sich vom Transformationsstress zu erholen und das

Resistenzgen zu expremieren, wird der Transformationsansatz verdünnt und Aliquots (=

Portionen) der Verdünnungen auf Medienplatten, die den Selektionsmarker enthalten,

ausplattiert.


Transformation von Bakterien, Tag 4

27

Materialien:

- kompetente Bakterien (Stamm Top10F’)

- Plasmid-DNA pGEX oder pET-ACID

- TE 10/1, steril

- LB flüssig Medium

- LBamp/LBkan Platten

- Glasperlen


- Pipetten


- Eisbad

- Wasserbad 42 °C

- Schüttler 37 °C



Verdünnen der Plasmid-DNA auf 10 ng/µl in 10/1 TE; die Konzentration der ausgegebenen Plasmid-DNA ist auf den Eppis angegeben; bei der Verdünnung falls nötig in „Schritten“ vorgehen – nicht 1 µl Plasmid-DNA 1000 ng/µl in 99 µl

TE geben, sondern 1 µl Plasmid-DNA 1000 ng/µl zu 9 µl TE DNA-Lösung mit 100 ng/µl

Plasmid; von dieser Verdünnung wieder 1 µl zu 9 µl TE geben Konzentration DNA-Lösung 10 ng/µl

50 ng DNA bzw. 5 µl TE vorlegen in je ein Eppi inkubieren auf Eis für 5 min (die 5 µl TE dienen als Negativkontrolle)

Bakterien Suspension auftauen auf Eis nicht schütteln, nicht vortexen

Je 50 µl Bakterien zur DNA bzw. TE geben, mischen durch vorsichtiges pipettieren in-kubieren auf Eis für 30 min

Bakteriensuspension in Wasserbad 42 °C stellen exakt 2 min inkubieren (Heatshock) auf Eis für 5 min

950 µl LB zugeben mischen Bakteriensuspensionen (= Trafoansatz TS in Tabelle unten) inkubieren bei 37 °C im Thermo-Schüttler bei 700 rpm, für 45 min;

Platten vorbereiten: - Beschriften (am Boden!) und Glasperlen (ca. 8 – 10 pro Platte) aufbringen, Platten bis zu Verwendung umgedreht auf dem Deckel liegen lassen)

Plattieren: In der Tabelle angegebene Verdünnungen ansetzen: Transformationsansatz vortexen, 100 µl entnehmen und zu 900 µl LB geben = Verdünnung 10-1; diese 10-1 Verdünnung vortexen, 100 µl entnehmen und zu 900 µl LB geben = Verdünnung 10-2;

Transformation von Bakterien, Tag 4

28

Verdünnungs-

faktor

Verdünnungs-

ansatz

Plattierungs-

volumen

Anzahl

Platten

Plasmid-Trafo:

10-1 100 µl TS + 900 µl LB 100 µl 2

10-2 100 µl 10-1 + 900 µl LB 100 µl 2

Negativkontrolle

0 unverdünnt 100 µl 1

Bakteriensuspension/-verdünnung kurz vortexen (5 sec.), 100 µl auf entsprechende Platte überführen, Deckel schließen, zur Verteilung der Suspension Platte „schütteln“ bis die Flüssigkeit gleichmäßig verteilt ist.; darauf achten, dass die Kugeln sich über die gesamte Fläche der Platte bewegen;

Plattiert wird nur auf LBamp-Platten (pGEX-Trafo) oder nur auf LBkan-Platten (pET-ACID-Trafo)!!

Platten ca. fünf min ruhen lassen, kurz schütteln und Glasperlen in Becherglas abschütten (Glasperlen im Autoklaviermüll entsorgen).

Platten beim Betreuer abgeben (werden über Nacht bei 37 °C inkubiert)

Auswertung der Transformationseffizienz durch Auszählen der Platten und Eintragen der Ergebnisse in Tabelle (Moodle).

Polymerase Kettenreaktion - PCR

29

Polymerase Kettenreaktion - PCR

30

Die Polymerase Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine Methode mit der

DNA-Fragmente schnell und einfach von einer sehr geringen Menge Ausgangsmaterial

ausgehend spezifisch vermehrt werden können.

Dazu kopiert die Methode auf einfache Weise in vitro (im „Reagenzglas“) die Art und Weise

nach der in vivo (in der Zelle) DNA repliziert d.h. vermehrt wird.

Möglich wurde die Methode durch die Entdeckung einer DNA-Polymerase aus einem

thermophilen Organismus (Thermus aquaticus), die Temperaturen von bis zu 100 °C

ausgesetzt werden kann ohne dabei an Funktionalität zu verlieren.

Ausgangspunkt einer PCR Reaktion kann jede DNA aus einer beliebigen Quelle sein. Da DNA-

Polymerasen Primer benötigen, von denen aus sie die Neusynthese des DNA-Stranges

beginnen können, muss die Sequenz des gewünschten DNA-Fragments bekannt sein. Die

Primer müssen komplementär zu den Enden des Zielfragments sein.

Template-DNA, Primer und Taq-Polymerase werden zusammen mit dNTPs in einem speziellen

Puffer gemischt und auf 94 – 98°C erhitzt. Dabei trennt sich die doppelsträngige Template-DNA

in ihre beiden Einzelstränge auf. Beim Abkühlen auf die Annealing Temperatur binden die

Primer an ihre komplementären Stellen an die Einzelstränge. Da die Primer in deutlich höherer

Konzentration im Ansatz vorliegen als die Template-DNA ist dieser Schritt einer

Rehybridisierung der Template-DNA Einzelstränge bevorzugt. Die Taq-Polymerase bindet an

das kurze Primer-Template Doppelstrang DNA Stück. Wird die Temperatur dann auf die

optimale Reaktionstemperatur der Taq-Polymerase (72°C) erhöht beginnt diese mit der

Neusynthese des komplementären Strangs.

Der Zyklus aus Erhitzen zur Trennung der Doppelstrang-DNA, Abkühlen für das Primer-

Annealing und Erwärmen auf 72°C wird in PCR-Maschinen nach vorgegebener

Programmierung 30 – 35 mal wiederholt.

Ob und wie gut das gewünschte DNA-Fragment amplifiziert wird hängt von verschiedenen

Faktoren ab. Neben der Basenzusammensetzung und Länge der Primer, der Länge und

Kopienzahl des Templates beeinflussen auch die Annealing-Temperatur und die

Pufferzusammensetzung die Spezifität und Effizienz einer PCR-Reaktion. Daher müssen PCR-

Reaktionen oftmals optimiert werden.

Im Praktikum werden Sie zwei Parameter variieren, um die optimalen Bedingungen einer PCR-

Reaktion zu finden. Zum einen werden Sie die PCR bei verschiedenen Primer Annealing-

Temperaturen durchführen. Dazu werden wir eine Gradienten-PCR-Maschine verwenden, in

der verschiedene Annealingtemperaturen gleichzeitig getestet werden können.

Außerdem werden Sie die PCR-Reaktion mit zwei verschiedenen Mg2+-Ionen Konzentrationen

durchführen. Mg2+-Ionen schirmen die negativen Ladungen im Phophat-Rückrat der DNA ab

und fördern dadurch die Ausbildung doppelsträngiger DNA.

Sie werden somit testen bei welcher Annealing-Temperatur und welcher Mg2+-Ionen

Konzentration Spezifität und Effizienz der PCR-Reaktion optimal sind.

Als zweites PCR-Experiment werden Sie ein spezifisches Fragment von Ihrer Hefe-DNA, die

Sie selbst isoliert haben, amplifizieren. Hier werden in verschiedenen Kontroll-Ansätzen

einzelne Komponenten der PCR weggelassen, um so Ihre Wichtigkeit zu testen.


Optimierung von PCR Bedingungen, Tag 3

31

Materialien:

- Template DNA

- Primer forward und reverse

- Taq-Polymerase

- dNTPs

- Taq 10 x Puffer

- MgCl2 25 mM


- Pipetten


- Eppendorf Tubes 0,2 und 1,5 ml

- PCR-Maschine

- Agarose

- 50 x TAE

- SYBR Safe Lösung 10 mg/ml


- DNA-Längenstandard Gene RulerTM, 1kb DNA Ladder


- Eisbad


In diesem Versuch beschäftigen wir uns mit einem Thema aus der Lebensmittelchemie – dem Nachweis von Pferdefleisch. Dies geschieht per PCR und beruht i.d.R. auf dem Nachweis von mitochondrialer DNA. Die ausgegebenen Primer können entweder in einer universalen Kombination eingesetzt werden, in der die DNA aller 4 Spezies (Rind, Schwein, Pferd und Maus) nachgewiesen werden kann, oder in einer spezifischen Kombination, bei der nur die DNA von Pferden zu einer Amplifikation führt (Schema s.u.). Um eine optimale Sensitivität und Selektivität zu erreichen muss die Temperatur des Primer-Annealings sowie die Konzentration von Mg2+ optimiert werden. Im Kurs werden wir innerhalb eines Saales verschiedene Magnesium-Konzentrationen ausprobieren und zwischen den Sälen die Temperatur des Primer-Annealings variieren. Bitte bereiten Sie folgende Master-Mixe auf Eis vor: Universal Primer universal antisense (10 µM) 2 µl Primer universal sense (10 µM) 2 µl 10 x Puffer 10 µl dNTP Lösung (10 mM) 2 µl MgCl2 (25 mM) entsprechend Endkonzentration (1, 2, 3 oder 4 mM) Wasser zu 94 µl auffüllen Taq polymerase (5U/ul) 2 µl Endvolumen 96 µl Pferd Primer universal antisense (10 µM) 2 µl Primer horse spec. sense (10 µM) 2 µl 10 x Puffer 10 µl dNTP Lösung (10 mM) 2 µl MgCl2 (25 mM) entsprechend Endkonzentration (1, 2, 3 oder 4 mM) Wasser zu 94 µl auffüllen Taq polymerase (5U/µl) 2 µl Endvolumen 96 µl


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Verteilen Sie dann diese Mischungen auf 4 PCR-Tubes pro Master-Mix (je 24 µl). Geben Sie dann die template-DNA dazu (je 1 µl). Master-Mix Primer universal: A: Kontroll-DNA (Maus) B: Pferdefleisch C: Probe X D: Wasser (neg. Kontrolle) Master-Mix Primer Pferd spezifisch: E: Kontroll-DNA (Maus) F: Pferdefleisch G: Probe X H: Wasser (neg. Kontrolle) Stellen Sie die Tubes in die PCR-Maschine, wir lassen die PCR während des Seminars am Mittwoch laufen und laden gleich anschließend das Gel. PCR-Profil:

1: 94°C 3 min 2: 94°C 20 sec 3:56-62°C 20 sec (Temp. je nach Saal anders!) 4: 72°C 20 sec (Wiederholung Schritt 2-4 35x) 5: 4°C Pause Tragen Sie je 10 µl der PCR-Ansätze mit je 2,5 µl 5x DNA Auftragspuffer auf ein 1.2% Agarose-Gel auf, 4 Gruppen zusammen benötigen ein großes Gel mit zwei 20 er Kämmen. Hier sollten die Magnesium-Endkonzentrationen 1, 2, 3 und 4 mM vertreten sein.

Auftragsschema:

1. Längenstandard 2. Kontroll-DNA Maus universal = Probe A 3. Kontroll-DNA Maus Pferde-spez. = Probe E 4. Pferd universal = Probe B 5. Pferd Pferde-spez. = Probe F 6. Probe X universal = Probe C 7. Probe X Pferde-spez. = Probe G 8. H2O universal = Probe D 9. H2O Pferde-spez. = Probe H


33

Sequenzinformation der Primer und der mitochondrialen DNA:


34

Karte der mitochondrialen DNA (ca. 16000 - 17000 bp)

Zielregion

der PCR

PCR mit genomischer Hefe-DNA, Tag 4

35


36

Materialien:

- genomische Hefe-DNA, aus Versuch 2.)

- Primer Mre11-for (Mre11-f) und Mre11-rev (Mre11-r) (jeweils 10 µM)

- Taq-Polymerase

- dNTPs 25 mM

- Taq 10 x Puffer


- Pipetten


- Eppendorf Tubes, 0,2 ml und 1,5 ml, steril

- PCR-Maschine

- Agarose

- 50 x TAE

- SYBR Safe Lösung 10 mg/ml


- DNA-Längenstandard Gene RulerTM, 1kb DNA Ladder


- Eisbad



PCR-Ansatz:

1 µl genomische Hefe-DNA

1 µl dNTPs, 10 mM

5 µl 25 mM MgCl2

5 µl 10 x Taq Puffer

2 µl Primer Mre11-for (10 pmol/µl = 10 µM)

2 µl Primer Mre11-rev (10 pmol/µl = 10 µM)

1 µl Taq-Polymerase

H20 ad 50 µl

Jede Gruppe pipettiert einen vollständigen PCR-Ansatz mit Ihrer selbst hergestellten Hefe-DNA und vier Kontrollansätze. - Kontrollansatz 1: wie PCR-Ansatz aber ohne genomische DNA - Kontrollansatz 2: wie PCR-Ansatz aber ohne Primer Mre11-for - Kontrollansatz 3: wie PCR-Ansatz aber ohne Primer Mre11-rev - Kontrollansatz 4: wie PCR-Ansatz mit Taq-Polymerase und genomischer DNA vom Kursleiter Das Volumen der fehlenden Komponente wird durch H2O ersetzt

PCR-Ansätze auf Eis pipettieren, Taq Polymerase erst nach Aufforderung durch die Betreuer zugeben

Alle Ansätze in einem Eisbad sammeln, PCR-Maschine anschalten, Programm starten


37

PCR-Programm:

Schritt 1: 98 °C 3 min initiale Denaturierung

Schritt 2: 96 °C 45 sec Denaturierungsschritt im Zyklus

Schritt 3: 56 °C 45 sec Primer Annealing

Schritt 4: 72 °C 45 sec Polymerisation

Schleife von Schritt 4 zu Schritt 2, Anzahl der Zyklen: 34

Schritt 5: 15 °C ohne Zeitlimit

Wenn Blocks 98 °C erreicht haben “Pause“ schalten, PCR-Ansätze in vorgeheizten Block einsetzen, Deckel schließen, festdrehen, auf continue schalten (= “Hot start“)

1,2 % Agarosegel gießen Siehe Vorschrift Seite 3

Nach Beendigung der PCR, Eppis rausnehmen auf Eis

Von jedem PCR-Ansatz 10 µl überführen in frisches 1,5 ml Eppi;

5 x Auftragspuffer zugeben Auftragsschema:

Tasche Probe

1 Längenstandard, 500 ng

2 PCR Ansatz

3 Kontrollansatz 1

4 Kontrollansatz 2

5 Kontrollansatz 3

6 Kontrollansatz 4

analoger Auftrag für die anderen Gruppen

Elektrophorese erfolgt bei 80 V bis blauer Farbstoff ca. 1/2 - 2/3 des Gels gelaufen ist;



DNA-Längenstandard, Plasmidkarten

38

DNA Größenstandard

Fermentas #SM0313

Anzusetzende Puffer

39

Biochemisches Praktikum 1 - Grundpraktikum

DNA-Analytik – Anzusetzende Puffer:

Prozentangaben: fest in flüssig = w/v flüssig in flüssig = v/v

Gewebe-Lysispuffer: 50 ml, 1 x für alle, aliquotiert verteilen Stocklösung/Feststoff

100 mM Tris HCl pH 8,5 1 M Tris HCl, pH 8,5 5 mM EDTA, pH 8,0 0,5 M EDTA, pH 8,0 0,2 % SDS 10 % SDS 200 mM NaCl 5 M NaCl

TE 10/1: 100 ml, 1 x für alle (pro Saal), á 10 ml aliquotiert verteilen

10 mM Tris HCl pH 7,5 1 M Tris HCl, pH 7,5 1 mM EDTA pH 8,0 0,5 M EDTA, pH 8,0

Lyticase-Puffer: aus Spheroplasten-Waschpuffer, jede Gruppe 1 ml

1 M Sorbitol (MW: 182,18) Feststoff 100 mM EDTA, pH 8,0 0,5 M EDTA, pH 8,0 14,3 mM Mercaptoethanol (MW: 78,13; D = 1,12) 100 % herstellen aus Spheroplasten Waschpuffer, Volumenzunahme durch Mercaptoethanol kann vernachlässigt werden.

Spheroplasten Waschpuffer 200 ml, 1 x für alle (pro Saal), á 20 ml aliquotiert verteilen

1 M Sorbitol (MW: 182,18) Feststoff 100 mM EDTA, pH 8,0 0,5 M EDTA, pH 8,0

TE 50/100: 100 ml, 1 x für alle (pro Saal), á 10 ml aliquotiert verteilen

50 mM Tris HCl, pH 7,5 1 M Tris HCl, pH 7,5 100 mM EDTA, pH 8,0 0,5 M EDTA, pH 8,0

50 x TAE: 100 ml, jede Gruppe

2 M Tris (MW: 121,14) Feststoff 1 M Essigsäure (MW: 60,05g; D = 1,05) 100 % (Eisessig) 50 mM EDTA (MW: 292,24 g) Feststoff

Resuspensionspuffer: =P1; 100 ml, 1 x für alle, á 10 ml aliquotiert verteilen

50 mM Tris HCl, pH 8,0 1 M Tris HCl, pH 8,0 10 mM EDTA, pH 8,0 0,5 M EDTA, pH 8,0

Lysis-Puffer: =P2; 100 ml, 1 x für alle, á 10 ml aliquotiert verteilen

200 mM NaOH 1 M NaOH 1 % SDS 10 % SDS

Puffer STET: 100 ml, 1 x für alle, á 10 ml aliquotiert verteilen

10 mM Tris HCl, pH 8,0 1 M Tris HCl, pH 8,0 1 mM EDTA, pH 8,0 0,5 M EDTA, pH 8,0 100 mM NaCl 5 M NaCl 5 % Triton X-100 100 % Triton

Vorhandene Puffer und Stocklösungen

40

Vorhandene Puffer:

1 M Tris HCl, pH 7,5 1 M Tris HCl, pH 8,5 1 M Tris HCl, pH 8,0 0,5 M EDTA, pH 8,0 5 M NaCl 10 % SDS 1 M NaOH ProteinaseK-Lösung 20 mg/ml:

100 mM Tris HCl pH 8,5 200 mM NaCl

Lyticase Lösung 10 U/µl:

1 M Sorbitol 100 mM EDTA, pH 8,0 10 U/µl Lyticase

5 x Auftragspuffer:

10 mM Tris HCl, pH 8,0 50 mM EDTA, pH 8,0 10 % Ficoll 10 % Glycerin 0,01 % Bromphenolblau 0,01 % Xylencyanol

RNase A, 10 mg/ml:

10 mg/ml RNase A 10 mM Tris HCl, pH 7,5 15 mM NaCl

5 M Kaliumacetat-Lösung 5 M Kaliumacetat

Neutralisationspuffer: =P3

2,55 M Kaliumacetat, pH 5,0

Na-Acetat:

3 M Na-acetat, pH, 5,0

Lysozym-Lösung 10 mg/ml:

10 mg/ml Lysozym 50 mM Tris HCl, pH 8,0

LB flüssig:

10 g BactoTrypton 5 g Yeast Extract 5 g NaCl

ad 1000 ml H2Obidest, autoklavieren

LB Platten:

10 g Bacto Trypton 5 g Yeast Extract 5 g NaCl 1,5 g Bacto Agar

ad 1000 ml H2Obidest, autoklavieren

Kanamyzin-Stocklösung:

50 mg/ml Kanamyzin

Ampizillin Stocklösung

50 mg/ml Ampizillin

Protokoll zur Woche DNA-Analytik

41

Protokoll zum Grundpraktikum – DNA-Analytik

Protokoll von:

Name:

Vorname:

Matrikelnummer:

und

Name: Vorname:

Matrikelnummer:

Thema: DNA-Analytik

Zeitraum:

Betreuer/in:


42

Protokoll zum Grundpraktikum Biochemie – Woche DNA-Analytik

Bitte schreiben sie 1 1/2 zeilig mit Schriftgröße 11 – 12 Punkt!

Schreiben Sie zu folgenden Themen jeweils ca. 1 Seiten „Einleitung“. Die Einleitung soll kurz auf die theoretischen Inhalte der Versuche eingehen und mit einer kurzen Zusammenfassung was Sie mit welcher Zielsetzung gemacht haben, enden. Schreiben Sie nicht wesentlich mehr als 1 ½ Seiten; nach 2 Seiten werden wir aufhören zu lesen und zu

korrigieren

Themen:

1. Isolierung genomischer DNA 2. Isolierung von Plasmid-DNA und Restriktionskartierung 3. Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien 4. PCR

1. Isolierung genomischer DNA aus Gewebe und Hefezellen und Analyse der genomischen DNA – Restriktionsspaltung und Auftrennung im Agarosegel

Berechnung der Pufferherstellung:

Endkonzentration eingesetzt: ml Stocklösung / g Feststoff:

50 ml Gewebe-Lysispuffer:

100 mM Tris HCl, pH 8,5

5 mM EDTA, pH 8,0

0,2 % SDS

200 mM NaCl

100 ml TE 10/1:


1 mM EDTA, pH 8,0

200 ml Spheroblasten Waschpuffer:

1 M Sorbitol

100 mM EDTA, pH 8,0

1 ml Lyticase-Puffer:

1 M Sorbitol

100 mM EDTA, pH 8,0

14,3 mM -Mercaptoethanol

100 ml TE 50/100:


100 mM EDTA, pH 8,0


43

100 ml 50 x TAE:

2 M Tris

1 M Essigsäure

50 mM EDTA

Gel-Dokumentation:

Kleben Sie das Bild Ihres Agarosegels ein und beschriften Sie das Bild EXAKT!

Wenn sie sich unsicher sind, fragen Sie was unter exakter Beschriftung zu verstehen ist!

Versuchsauswertung:

1. Schätzen Sie an Hand des Markers im Agarosegel die Größe Ihrer genomischen DNA. Erwarten Sie für genomische DNA diese Größe? Wenn ja, Begründung, wenn nein, woran kann es liegen, dass Ihre genomische DNA nicht das erwartete Laufverhalten zeigt?

2. Schätzen Sie jeweils die Menge der RNaseA behandelten DNA im Agarosegel im Vergleich zu den (Mengen-) definierten Markerbanden und berechnen Sie die Konzentration Ihrer DNAs pro µl und Ihre Gesamtausbeute.

3. Vergleichen Sie die DNA-Präparation aus Gewebe und Hefe. Sehen Sie Unterschiede? Erwarten Sie Unterschiede?

4. Vergleichen Sie die EcoRI und HaeIII Spaltungen der genomischen DNAs. Sehen Sie Unterschiede zwischen den Spaltungen? Wenn ja, warum?

Beantworten Sie die Fragen mit wenigen kurzen Sätzen. Zu Frage 1 und 2 werden auch Zahlen

erwartet. Ja und Nein wird nicht als (einzige) Antwort akzeptiert (auch nicht zu Frage 3)

Sollte Ihr Agarosegel, Ihre DNA-Präparation oder Ihre Spaltung nicht auswertbar sein, verwenden

Sie die Musterlösung (online und Anhang) zur Beantwortung der Fragen.

Dokumentieren Sie aber in jedem Fall Ihr Gel (Bild einkleben) und begründen Sie kurz, warum

Sie die Musterlösung für die Auswertung benutzen.


44

2. Isolierung von Plasmid-DNA, Kontrolle und Mengenabschätzung der isolierten Plasmid-DNA

Berechnung der Pufferherstellung:

Endkonzentration eingesetzt: ml Stocklösung/ g Feststoff:

100 ml Resuspensionspuffer:


10 mM EDTA, pH 8,0

100 ml Lysispuffer:

200 mM NaOH

1 % SDS

100 ml Puffer STET


1 mM EDTA, pH 8,0

100 mM NaCl

5 % Triton X-100

Gel-Dokumentation:

Kleben Sie das Bild Ihres Agarosegels hier ein und beschriften Sie das Bild EXAKT!

Versuchsauswertung

1. Schätzen Sie für beide Methoden die Plasmid-DNA Ausbeute durch Vergleich mit bekannten DNA-Mengen im Gel, berechnen Sie die Konzentration der Plasmid-DNA pro µl und Ihre Gesamtausbeute (für beide Präparationsmethoden durchführen). Geben Sie eindeutig an welche Kontroll-DNA und welche Plasmid-DNA Sie für die Abschätzung verwenden.

2. Vergleichen Sie die Ausbeute und Qualität der Plasmid-DNA aus den zwei verschiedenen Isolierungsmethoden. Welche Methode liefert mehr DNA? Welche Methode liefert die bessere Qualität an Plasmid-DNA? (Qualitätsmerkmale: Verhältnis supercoiled zu nicked DNA; Laufverhalten der DNA – scharfe Banden?)

3. Diskutieren Sie die beiden Methoden hinsichtlich Schnelligkeit, Einfachheit, Ausbeute und Qualität der Plasmid-DNA. Welche Methode würden Sie bevorzugen? Warum?


45

3. Restriktionskartierung von Plasmid-DNA

Gel-Dokumentation:


Versuchsauswertung:

1. Messen Sie die Laufstrecke der einzelnen Markerbanden aus und tragen Sie sie in eine Tabelle mit den Größen in Basenpaaren ein. Berechnen Sie den dekadischen Logarithmus der Größe in Basenpaaren und tragen diese Werte ebenfalls in die Tabelle ein.

2. Tragen Sie die Laufstrecke gegen den dekadischen Logarithmus der Größe in Basenpaaren in ein Diagramm auf Millimeterpapier ein (alternativ Erstellen einer Excel Tabelle und Excel Grafik); erstellen Sie eine Eichkurve. Falls Sie Excel verwenden: Achten Sie darauf, dass die vom Programm erstellte Ausgleichsgrade „sinnvoll“ ist!

3. Messen Sie die Laufstrecke der einzelnen Banden in Ihren verschiedenen Restriktionsansätzen aus und bestimmen Sie mit Hilfe der Eichgerade ihre Größe. (Tabelle erstellen) Achten Sie darauf, dass die aus der Eichgerade abgelesenen Werte in etwa mit den per Augenschein abgeschätzten Werten übereinstimmen. (Vergleich mit Markerbanden)

4. Wie groß ist Ihr Plasmid in bp?

5. Welche(r) Ansätze (supercoiled Plasmid, linearisiertes Plasmid, in mehrere Fragmente gespaltenes Plasmid) eignen sich am besten für die Größenbestimmung und welche(r) eignen sich nicht? Begründung

6. Erstellen Sie eine ungefähre Restriktionskarte Ihres Plasmids, indem Sie die Schnittstellen der verwendeten Restriktionsenzyme und ihren ungefähren Abstand (in bp) zueinander in einen Plasmid-Zirkel eintragen. Erklären/begründen Sie Ihre Restriktionskarte an Hand der Restriktionsspaltungen. Ein Plasmid-Zirkel mit den Resriktionsschnittstellen alleine genügt nicht. Sie müssen begründen, warum Sie die Schnittstellen so angeordnet haben.

Sollte Ihr Agarosegel, Ihre DNA-Präparation oder Ihre Spaltung nicht auswertbar sein, verwenden

Sie die Musterlösung (online) zur Beantwortung der Fragen.

Dokumentieren Sie aber in jedem Fall Ihr Gel (Bild einkleben) und begründen Sie kurz, warum

Sie die Musterlösung für die Auswertung benutzen.


46

4. Transformation von Bakterien

Versuchsauswertung:

1. Zählen Sie die Kolonien pro Platte und notieren Sie die Werte. Bilden Sie den Mittelwert für die einzelnen Verdünnungen und für alle Platten.

2. Berechnen Sie die Transformationseffizienz (Transformanden pro µg DNA) und tragen Sie den Wert in die Tabelle ein.

3. Notieren Sie die Plasmid-Daten und Transformationseffizienzen aller Gruppen und erfassen Sie die Werte in der Tabelle. Berechnen Sie den Mittelwert aller Transformationseffizienzen für die beiden Plasmide.

4. Gibt es signifikante Unterschiede in den Transformationseffizienzen bezogen auf die Gruppen (Vergleich verschiedener Gruppen mit identischem Plasmid).

5. Gibt es signifikante Unterschiede in den Transformationseffizienzen bezogen auf die Plasmide (Vergleich der Mittelwerte der Transformationseffizienz für die verschiedenen Plasmide)?

6. Wenn ja, diskutieren Sie mögliche Ursachen.

Auswertungstabelle Bakterien-Transformation:

Plasmid pGEX Plasmid pET-ACID

Gruppe Transformationseffizienz =

Kolonien pro µg DNA Gruppe

Transformationseffizienz =

Kolonien pro µg DNA

Mittel-

wert

Mittel-

wert


47

5. Polymerase Chain Reaction – PCR

5a) Optimierung von PCR Reaktionen:

Gel-Dokumentation:


1: Wie groß sind die beiden amplifizierten Fragmente (Pferd spezifisch und universal)? 2: Vergleichen Sie die Ergebnisse der einzelnen Kurs-Säle (= Annealing-Temperatur) und der Magnesium-Konzentrationen. Gibt es ein eindeutiges Optimum? Sind systematische Zusammenhänge erkennbar?

5b) Amplifikation eines DNA Fragments von Hefe-DNA

Gel-Dokumentation:


Versuchsauswertung:

1. Bestimmen Sie die Größe des amplifizierten DNA-Fragments

2. Vergleichen Sie die Ergebnisse der verschiedenen Gruppen Sind die PCR Ansätze identisch/ähnlich?

3. Was sehen Sie in den verschiedenen Kontrollansätzen? Falls in den Kontrollansätzen Banden zu sehen sind: Worauf sind diese Amplifikate

zurückzuführen?

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