GVO Analyse-Methoden Theorie und Praxis · © Genetic ID (Europe) GmbH 2014 Proteinnachweis Protein...

© Genetic ID (Europe) GmbH 2015

Donau Soja Kongress Berlin, 07.05.15

GVO Analyse-Methoden

Theorie und Praxis


Genetic ID (Europe) GmbH

• Gegründet im Jahr 2001

• Genetic ID NA das erste GVO-Testlabor in den USA

• ISO 17025 akkreditiert seit 2002

• Labore in den USA und Deutschland

• Global Laboratory Alliance Lizenznehmer auf 4 Kontinenten


GVO:

Gentechnisch

Veränderter

Organismus

Definition GVO


Gentechnische Modifikation

Bakterium

Virus

Pflanze

Tier

Transgene DNA


Gentransfer in eine “normale” Zelle

GVO (Transgene) Pflanze

Normale Zelle

Transgene Zelle

Transgen


Zwei Methoden des Gentransfers


Herbizid-Resistenz (bakterielle Gene, Ackerschmalwand) Insekten-Resistenz (bakterielle Gene, z.b. Bacillus thurngienis) Virus Resistenz (virale Gene) Männliche Unfruchtbarkeit,Wiederherstellung der Fruchtbarkeit Verändertes metabolisches Profil: Fettsäureprofil, Amylopektingehalt (DNA aus Soja, Primel, roter Schimmelpilz, Kartoffel)

Gentechnische Modifikationen verleihen Pflanzen neuartige Eigenschaften


Gentechnisch veränderte Pflanzen: Überblick

Soja Raps Mais Reis

Baumwolle Leinsamen Kartoffel Zuckerrübe

Kürbis/Zucchini Papaya Alfalfa/Luzerne


Futtermittel-relevante GVOs

Soja

Raps Mais


GVO- Nachweis


Zwei Ansätze des GVO-Nachweises

Transgene Zelle

Gen

mRNA

Protein

Zellkern

Nachweis der eingefügten DNA

durch PCR

Nachweis der neuen Proteine durch

immunologische Methoden


Proteinnachweis

Protein • Antikörper -basierte Tests detektieren das rekombinante Protein

• Strip Tests • ELISA

Vorteile: • Schnelle Methode, um nach GVOs vor Ort zu testen (Feld) • Geeignet für einen Initialscreen von Saatgut/Körnern Nachteile: • LOD oft zwischen 0.1 - 1% • Nicht verwendbar für prozessierte Produkte (z.B. Sojaschrot) • Es können Unterschiede im Gehalt der rekombinanten Proteine zwischen

verschiedenen Kultivaren und auch zwischen Geweben auftreten


DNA • Polymerase Chain Reaction (PCR)-Test • Eine Technik zur billionen-fachen Amplifizierung eines spezifischen DNA-

Abschnitts Vorteile: • Hohe Sensitivität und Spezifität • Möglichkeit zum Nachweis aller GVOs • Ermöglicht eine Quantifizierung (für die Einhaltung der EU Verordnung

wichtig!) • Funktioniert sehr zuverlässig bei einem breiten Spektrum von Lebens-

und Futtermittelprodukten • Wird von fast allen Unternehmen in der EU verlangt Nachteile: • Muss in Spezial-Labors durchgeführt werden

DNA-Nachweis


Zusammenfassung

Strip-Test • Schneller Screen vor Ort • Anwendbar bei Saatgut/Körnern/Blättern • Beispiel: Testen einer LKW-Ladung Sojabohnen vor der

Entladung / Schnelltest von Sojapflanzen auf dem Feld

PCR-Test • Hoch sensitiv und spezifisch • Für ein breites Spektrum von Produkten anwendbar • Weltweiter Industriestandard zur Verifizierung von Kontrakten

und Einhaltung von “Kennzeichnungs”-Verordnungen • Beispiel: Testen einer Schiffsladung Sojaschrot vor dem Export


PCR: Grundlagen

Grundlagen der PCR • GVOs enthalten charakteristische, DNA Sequenzen • “Primer” (synthetische, kurze DNA Moleküle) werden zur Suche von GVO-Sequenzen benutzt • Exponentielle Amplifizierung der GVO-Sequenz


Das Enzym Taq Polymerase katalysiert eine Reaktion, die Kopien der erkannten Sequenz produziert. Dies wird durch die Erkennung der angelagerten Primer ermöglicht, die als Schablonen für den neuen DNA-Strang dienen.

Synthesie einer DNA-kopie

Taq Polymerase

Transgene

PCR: Grundlagen


PCR: Grundlagen Primer sind kurze synthetische DNA-Moleküle, die komplementär zur Ziel-Sequenz sind. Beispiel 1: Keine Primerbindung

Beispiel 2: Primerbindung


Taq

Amplifizierung

(meistens 45 Zyklen)

Taq

Taq

Taq

Kettenreaktion, Kopien der Kopien werden synthetisiert

PCR Amplifizierung


Anzahl der DNA Moleküle 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 1 000 000 1 000 000 000 1 000 000 000 000

Anzahl der PCR Zyklen 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 30 40

PCR Amplifizierung


Real Time PCR

• Basiert auf dem Nachweis und Quantifizierung einer fluoreszierenden Reporter Probe (ein zusätzlicher, mit einem fluoreszierenden Farbstoff markierter Primer)

• Signal nimmt direkt proportional mit der Menge des PCR-Produkts zu

• Durch den Einsatz der Probe wird die Sensitivität und Spezifität erhöht


[Kopienzahl GVO-DNA (z.B. RUR)]

[Kopienzahl Spezies-DNA (z.B. Soja)] x 100% = % GVO

Relative Quantifizierung

Quantitative Real Time PCR


GVO-Test Optionen

• Screening Test • Konstrukt-spezifischer Test

• Event-spezifischer Test


Screening Test • “Breitband”Screen, um allg. zu bestimmen, ob irgendein GVO in der Probe

vorhanden sein könnte. Nachweis von typischen GVO-Elementen (Marker). • Beispiel: CaMV 35S Promotor und NOS Terminator

Promotor Soja Genom Soja Genom Charakterist. Gen

Terminator

Transgene DNA

NOS EPSPS 35S

RUR Soja


Konstrukt-spezifische Tests

• Weist das merkmalsgebende Gen nach (z.B. Herbizidresistenz) • Beispiel: EPSPS

Promotor Soja Genom Soja Genom Charakterist. Gen

Terminator

Transgene DNA

NOS EPSPS 35S

RUR Soja


Event-spezifischer Test

• Ermöglicht den 100% Nachweis eines GVO • Varietäten-spezifisch • Beispiel: Übergang zwischen Pflanzengenom und Transgen

Promotor Soja Genom Soja Genom Terminator

Transgene DNA

NOS EPSPS 35S

RUR Soja

Charakterist. Gen


Qualitatives Screening - An-oder Abwesenheit von GVOs - Nachweisgrenze (LOD)= 0.01% - Geeignet wenn eine Ja/Nein Antwort ausreicht - Oft als Vorabscreen - kostengünstig

PCR Test-Optionen


Quantitative Tests - Bestimmung des GVO-Gehalts (möglich bei ausreichender Menge an

Zielspezies-DNA) - Erforderlich für:

- Einhaltung der EU Verordnungen 1829/2003 und 1830/2003 - Verifizierung der Konformität mit Zertifizierungsprogrammen (z.B.

NON-GMO Standard) - Verifizierung von Positivauslobungen (z.B. “Ohne Gentechnik” in D,

“gentechnikfrei erzeugt” in A, “Donau Soja”)

PCR Test-Optionen


GVO Teststrategien

Um den geeignetsten PCR-Test auszuwählen müssen einige Faktoren erwogen werden, wie:

• Ist ein qualitativer Test ausreichend? • Ist eine Quantifizierung notwendig? • Ist es wichtig alle kommerzialisierten GVOs zu detektieren? • Ist der Nachweis eines bestimmten GVOs

notwendig/ausreichend?


Aktuell in Brasilien zugelassene GVO-Soja Varietäten

Handelsname Event-Name Gen Eigenschaft Hersteller

Roundup Ready® GTS 40-3-2 CP4 epsps Glyphosat-R. Monsanto

Intacta RR2 Pro Mon 89788 x

Mon87701 CP4 epsps,

cryIaC Glyphosat-/Insektenresistenz Monsanto

Liberty Link ® A2704-12 pat Glufosinat-R. Bayer

CropScience

BPS-CV127 Cultivance Csr1-2 Imidazolinon-R. BASF

Anmerkung: In Brasilien ist zur Zeit nur Roundup Ready® und Intacta kommerzialisiert, der Anbau der EU-zugelassenen Varietät Liberty Link und Cultivance erfolgt voraussichtlich 2015 oder später.


Beispiel 1: Soja/Soja-haltige Mischfuttermittel

Handelsname Eventname Trait Zusätzliche genetische

Elemente

35SP NOST FMV

Roundup Ready® GTS 40-3-2 cp4 epsps √ √

Intacta RR2 Pro® Mon 89788 x Mon 87701

cp4 epsps cryIAc

√

Teststrategie (Mon40-3-2 und Mon89788) ist ausreichend, um alle kommerzialisierten Varietäten abzudecken. Die Menge Intacta wird in den kommenden Jahren zunehmen Anmerkung: Mon 87701 wird nicht als einzelnes Event vertrieben, sondern nur als Hybrid mit Mon89788


Beispiel 2: Allgemeines Screening

Qualitative PCR Analyse

Test Beispielhaftes Testergebnis

Nachgewiesene GVO Events

35S Promoter Nicht nachgewiesen

Fast alle kommerzialisierte und EU nicht-zugelassene GVOs, z.B. GVO Reis, GVO-Leinsamen

NOS Terminator Nicht nachgewiesen

FMV Promoter Nicht nachgewiesen

z.B. Soja Mon89788, Zuckerrübe H7-1, Raps GT73

Geeignet für Lebensmittelprodukte, Getreide, Saaten, Einzelfuttermittel (z.B. Mais, Raps), Futtermittel ohne Soja (Kreuzkontamination)


GVO-Testpaket Design

Zusammenfassung • Das angemessene GVO-Testpaket sollte sich nach verschiedenen

Faktoren richten: • EU und/oder nationale Verordnungen • Komerzielle Anforderungen • Kundenanforderungen • Sollte alle relevanten GVOs abdecken • Möglichst kosteneffizientes Design


Weitere Faktoren

Beprobung


Überlegungen zur Beprobung

• Probe sollte repräsentativ sein (Beprobung nach internationalen Richtlinien, wie z.B. GAFTA, EU VO 152/2009, EU Empfehlung 2004/787)

• Das analytische Ergebnis bezieht sich auf die Probe, nicht auf das Los

• Hauptursache für Schwankungen von Laborergebnissen


vs.

Beprobungsstrategien: Schüttgüter

2.1 2004_787_EG


Probenahmeintervall

VLOG Standard 13.02


Leitfaden Futtermittelkontrolle (Deutschland)


Grundsatz: Keine gv-Kennzeichnungspflicht im Mischfuttermittel, wenn keine der Einzelfuttermittel kennzeichnungspflichtig ist! D.h. bei Positivbefund (>0,9% GVO) eines soja-haltigen Misch- Futtermittels ist eine Nachbeprobung der Einzelfuttermittel ratsam, da evtl. doch nicht gekennzeichnet werden muss.

Leitfaden Futtermittelkontrolle


Bis zu 5% botanisches Fremdmaterial im Einzelfutter-Mittel laut Futtermittelverordnung erlaubt. Bei botanischen Verunreinigungen mit GVO-haltigem Material wird laut Leitfaden GVO-Wert in Bezug auf das Gesamtfuttermittel berechnet.



...und das Berechnungsbeispiel



www.genetic-id.de www.genetic-id.com

www.global-id-group.com

www.cert-id.eu www.cert-id.com www.cert-id.com.br

www.foodchainadvisors.eu www.foodchainid.com

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