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HPLC für Neueinsteiger

Autor: Dr. Stavros Kromidas (2000)

Novia Chromatographie- und Messverfahren GmbH Industriepark Höchst Gebäude B 845 D-65926 Frankfurt am Main Tel. +49 (0) 69 305-43843 Fax +49 (0) 69 30 9159 [email protected] www.novia.de

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Dieses Dokument ist für Anwender konzipiert, die das erste Mal mit einer HPLC-

Auf den folgenden Seiten finden Sie einen einfachen Leitfaden für Ihre ersten Schritte mit der HPLC. Er soll nicht das Studium der Theorie in Lehrbüchern ersetzen, vor allem kann er nicht die Handhabung der Geräte einzelner Hersteller erläutern. Er soll Ihnen einfach einen ersten Überblick über die Arbeit mit einer HPLC-Anlage geben und den Einstieg erleichtern.


Inhaltsangabe Abschnitt Thema Seite 01 Was ist überhaupt HPLC 4 02 Aus welchen Teilen besteht eine HPLC-Anlage 5 03 Wie funktionieren die einzelnen Teile einer HPLC-Anlage 6 04 Aufbau einer Gesamtanlage 9 05 Notwendige Arbeiten vor den Messungen 11 06 Die erste Messung 14 07 Verlassen einer HPLC-Anlage 15 08 Checkliste für die RP-HPLC 16 09 Checkliste: Das muss ich immer machen 18 10 Checkliste: Das darf ich nie tun 19 11 Fließschema: Wie wird eine HPLC-Anlage in 20 Betrieb genommen? 12 Bezeichnung von HPLC Materialien 23 13 Abkürzungen aus dem Bereich der Chromatographie 26 (Auswahl) 14 Von IUPAC empfohlene Symbole für die 28 Chromatographie (Auswahl) 15 Lösungsmittelgemische gleicher Elutionsstärke für 29 die RP-Chromatographie (nach L. Synder) 16 Lehrbücher über die HPLC 30 17 Adressen von HPLC-Firmen (Deutschland) 32


Was ist überhaupt HPLC?

HPLC In den 60er Jahren datieren die Anfänge der HPLC, High Pressure Liquid Chromatography (Hochdruck(flüssigkeits)chromatographie). Dank der verbesserten Säulenmaterialien und Geräten ist seit Ende der 70erJahre die Rede von High Performance Liquid Chromatography (Hochleistungs(flüssigkeits)chromatographie). Den Boom erlebte diese Trenntechnik Anfang der 80er Jahre.

Trennungs-; mobile Phase, stationäre Phase

Die HPLC ist eine schnelle Trenntechnik. Dabei wird das zu trennende Gemisch mit Hilfe eines Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches (Eluent/Mobile Phase) zur Säule gebracht. Das ist ein Rohr, meist aus rostfreiem Stahl, das mit der so genannten stationären Phase gefüllt ist. Die stationäre Phase (sie wandert im Gegensatz zur mobilen Phase nicht, deswegen

he bestimmte Gruppen gebunden sein können. Diese Gruppen

Je nach Art der Substanz wird sie unterschiedlich lang festgehalten. Durch verschiedene Trennmechanismen, bedingt durch die auf dem Kieselgel gebundenen Gruppen, findet so die Trennung der Substanzen des zu untersuchenden Gemisches statt. Abhängig von der Probe kommt als Mechanismus z. B. Adsorption durch Van der Vaals-Kräfte, Ionenaustausch, Ausschluss in die Frage. Die Probensubstanzen werden hoffentlich unterschiedlich lang am Säulenmaterial festgehalten und verlassen die Säule nach unterschiedlichen Zeiten. Die Trennung kann durch den Einsatz verschiedener stationärer Phasen (Säulenmaterialien siehe Abschnitt 12) und Lösungsmittelgemische beeinflusst werden. Die einzelnen Probekomponenten werden anschließlich vom Detektor registriert, er gibt diese Informationen an die Auswerteinhalte weiter, das Ergebnis ist ein Chromatogramm. Die Anzahl der Peaks entspricht der Anzahl der aufgetrennten Probekomponenten, die Fläche ist deren Menge proportional.


Aus welchen Teilen besteht eine HPLC-Anlage?

Aufbau einer HPLC-Anlage

Sie besteht aus 5 Modulen: Eine oder mehrere Pumpen zur Förderung des Eluenten durch

die Anlage, Injektor (Hand- oder Autoinjektor) mit Hilfe dessen die Probe in

die Anlage gelangt Säule an der die Trennung stattfindet, Detektor zur Registrierung der Probenkomponenten, Rechner zum Steuern der Anlage und als Auswerteeinheit


Wie funktionieren die einzelnen Teile einer HPLC-Anlage?

Pumpe Das Lösungsmittel bzw. Laufmittelgemisch wird aus einem Vorratsgefäß angesaugt und gelangt durch ein Einlassventil in den Kolbenraum der Pumpe. Der Kolben komprimiert den Eluenten und drückt ihn durch das Auslassventil in den Teil der HPLC-Anlage, die den Injekor, die Säule und den Detektor enthält. Eine Pumpe enthält oft zwei Kolben (Doppelkolbenpumpe). Während der eine das Laufmittel ansaugt, drückt der zweite Kolben das zuvor angesaugte Laufmittel durch das Auslassventil in die HPLC-Anlage. Dieser Vorgang wird mittels modernster Mechanik und Elektronik exakt gesteuert, sodass ein konstanter Fluss möglichst ohne Druckveränderungen gewährleistet wird. Vor Verlassen der Pumpe wird das Laufmittel noch durch einen Druckaufnehmer geleitet. Dort wird der Druck gemessen. Der Druckbereich variiert je nach Säule und eingesetztem Laufmittel von 50 bis 350 bar (70 bar= 1000 PSI). In Spezialfällen (dünne Säulen, kleines Säulenmaterial) kann dieser Druckbereich aber auch überschritten werden. Dieser Druck sollte bei Betrieb im Auge behalten werden, da durch ihn indirekt Verstopfungen, Flussschwankungen oder Leckagen erkannt werden können.

Injektor Mittels des Injektors wird die Probe in die HPLC-Anlage eingebracht. Er befindet sich im Eluentenstrom direkt hinter der Pumpe. Die Probe muss dabei mit Druckbereich der Anlage gebracht werden. Der am häufigsten eingesetzte Handinjektor ist das so genannte Rheodyneventil. Es ist im Prinzip ein Sechswegeventil. An zwei Einlässen ist eine Schleife angebracht. Sie kann zum einem eine fest definierte Menge (meist 10 oder 20 µl) fassen und wird mit der Probe überfüllt, oder man gibt mit einer exakten Spritze definierte Probenvolumina in die Schleife. Durch umlegen eines Hebels wird der Eluentenstrom durch die Aufgabeschleife geleitet und spült so die Probe auf die Säule. Bei einem Autoinjektor ist dieser Vorgang automatisiert. Wie das genau geschieht unterscheidet sich allerdings von Hersteller zu Hersteller.


UV-Detektor Der am häufigsten in der HPLC eingesetzte Detektor ist der UV-

Detektor. Die Einsatzgebiete reichen von Applikationen in der Pharmaindustrie, über die klinische Chemie, Lebensmittelchemie, Umweltanalytik bis hin zur Biochemie. Arbeitsweise: UV Licht einer bestimmten Wellenlänge wird in eine Durchflussküvette eingestrahlt und dahinter auf einer Photodiode wieder aufgefangen und als elektrisches Signal ausgegeben. Der Lichtstrahl wird durch Spiegel durch die Messküvette und eine Vergleichsküvette gelenkt. Eluent und Probe absorbieren das Licht unterschiedlich, das ergibt ein sich veränderndes elektrisches Signal. Diese Differenz wird als Peak angezeigt. Aus diesen Peaks setzt sich das entstehende Chromatogramm zusammen. Je nach UV-Absorptionsverhalten (chromophore Gruppe) der Probe wird die Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes ausgewählt. Den UV-Detektor gibt es in vielen Ausführungen:

Festwellen-detektor

Festwellendetektor: Als Lichtquelle wird meist eine Quecksilberlampe, seltener auch eine Zink- oder Kadmiumlampe eingesetzt. Die für die jeweilige Applikation benötigte Wellenlänge wird mittels geeigneter Filter eingestellt. Die gebräuchlichste Wellenlänge ist hierbei 254 nm, da die Quecksilberlampe hier ein sehr intensives Maximum hat, was eine sehr gute Nachweisgrenze bedingt. Dank seiner hohen Empfindlichkeit bei dieser Standardwellenlänge eignet sich diese Form des Detektors besonders für Arbeiten im Spurenbereich. Ansonsten wird er kaum noch eingesetzt.

Variabler Detektor

Variabler Detektor: Die Lichtquelle hierbei ist eine Deuteriumlampe. Nur wird hier die gewünschte Wellenlänge mit einem optischen Gitter aus dem Kontinuum gefiltert. Der variable UV-Detektor kann als Standarddetektor für einen Großteil der HPLC-Anwendungen angesehen werden.

PDA/DAD Photodiodenarraydetektor (PDA oder DAD) Die Lichtquelle ist auch hierbei eine Deuteriumlampe. Aber hier wird keine einzelne Wellenlänge herausgefiltert, sondern der gesamte Wellenlängenbereich (oder ein vom Anwender zu bestimmender Bereich) wird durch die Messküvette geschickt.

-Detektoren wird das gesamte aus der Küvette austretende Licht nicht durch eine einzelne Diode aufgefangen, sondern von einer ganzen Reihe von Photodioden (die Anzahl unterscheidet sich bei den verschiedenen Herstellern). Das Licht wird nach Verlassen der Durchflussküvette mit Hilfe eines Gitters so aufgespalten, dass nur ein oder genau definierte Wellenlängenbereiche auf eine Photodiode fallen. Nach wiederum fest definierter Zeit (meist einstellbar, im Millisekundenbereich) werden die Dioden ausgelesen und die Daten gespeichert. Es entsteht so über einen Wellenlängenbereich ein dreidimensionales Chromatogramm.


Brechungs- indexdetektor (RI)

Für Substanzen, die keine UV-Absorption zeigen, wie z. B. für aliphatische Polymere, wird dieser Detektor eingesetzt. Er misst den Unterschied des Brechungsindexes zwischen reinem Laufmittel und mit Probe vermischtem Laufmittel. Die Lichtquelle ist auch hier eine Halogenlampe. In eine Vergleichsküvette wird reines Laufmittel gespült. Durch die Messküvette wird der Eluentenstrom geleitet. Mit Hilfe eines Spiegelsystems wird der Lichtstrahl abwechselnd durch die Vergleichsküvette und die Messküvette geleitet. Befindet sich Probe im Eluentenstrom ändert sich der Brechungsindex des Laufmittel/Probegemischs. Dieses wird registriert. So entsteht hierbei das Chromatogramm. Das Haupteinsatzgebiet dieses Detektors ist in der Polymerchemie, Mineralöl- und Zuckeranalytik zu finden.

Fluoreszenz- detektor

Dieser Detektor nützt die Fähigkeit bestimmter Substanzen und Verbindungen aus, Fluoreszenzsignale auszusenden. Abhängig von der zu detektierenden Verbindung wird mit einer bestimmten Wellenlänge eingestrahlt, die die Verbindung zur Fluoreszenz anregt. Die eingestrahlte Wellenlänge wird mit Hilfe von Filtern oder einem Gitter aus einem Lichtkontinuum (welche Lampe eingesetzt wird ist abhängig von der benötigten Wellenlänge) herausgefiltert. Ein bekanntes Einsatzgebiet des Fluoreszenzdetektors ist die

Nachsäulenreaktionen (z. B. Aminosäuren-Bestimmung) eingesetzt. Elektro- chemischer Detektor (ECD)

Bei dieser Variante von Detektor handelt es sich um eine Rarität. Durch Anlegen eines Potentials werden hierbei die Problemkomponenten oxidiert oder in Ausnahmefällen auch reduziert. Die Veränderung des Potentials zeigt dann die Anwesenheit einer Problemkomponente an. Das Einsatzgebiet dieses Detektors findet sich hauptsächlich in der klinischen Chemie, z. B. zur Bestimmung der Katecholamine.


Der Aufbau einer Gesamtanlage

modulare Anlage

Herstellerabhängig sind die HPLC-Anlagen unterschiedlich aufgebaut. Zu Beginn der HPLC gab es meist modulare Anlagen. Bei dieser Bauweise sind Pumpe, Injektor, Detektor als einzelne Geräte hintereinander angeordnet.

Kompaktgerät Eine weitere Möglichkeit besteht darin die einzelnen Bestandteile einer HPLC-Anlage in einem Gerät unterzubringen. Dann spricht man von einer Kompaktanlage. Diese sind in letzter Zeit etwas beliebter geworden. Neben den rein bautechnischen Unterschieden einer HPLC-Anlage muss man noch Unterschiede in der Arbeitsweise beachten.

Isokratische HPLC-Anlage

Man unterscheidet hierbei zwischen isokratischen und Gradienten Betrieb einer Anlage. Bei einer isokratischen Anlage wird während eines HPLC-Laufes nur mit einer Zusammensetzung des Eluenten gearbeitet. D. h. die Wechselwirkung zwischen Laufmittel und stationärer Phase ist über die gesamte Zeit der Trennung konstant. Man kann damit vor allem ähnliche Substanzen gut trennen. Diese Art der Durchführung ist vor allem in der Routine besonders robust und sollte, so es möglich ist, für alle Trennaufgaben angestrebt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass man für diese Arbeitsweise nur eine Pumpe zur Eluentenförderung benötigt.

Gradient Bei einer Gradiententrennung wird die Zusammensetzung des Eluenten kontinuierlich über die Zeit geändert. Man erreicht so eine permanente Verstärkung der Wechselwirkung zwischen Eluent und stationärer Phase. Die Probesubstanzen werden so schneller von den Austauschplätzen an der stationären Phase verdrängt. Man ist damit in der Lage auch Substanzkomponenten sehr unterschiedlicher Polarität noch in akzeptabler Zeit zu trennen. Da bei dieser Arbeitsweise am Anfang einer Trennung eine andere Zusammensetzung des Eluenten vorliegt als am Ende muss man stets darauf achten, dass am Anfang einer Trennung das System im Gleichgewicht ist (=Equilibrierung) Die Mischung des Laufmittels kann gerätetechnisch auf verschiedene Arten durchgeführt werden.

Niederdruck-gradient

a) Die Mischung der verschiedenen Eluenten wird durch ein Proportionierventil vor einer Pumpe durchgeführt, die Mischung mit einer Pumpe durch die Anlage gefördert. Man spricht dann von einem Niederdruckgradienten. (Die Mischung geschieht auf der Normaldruck- oder Niederdruckseite der Anlage, also vor der Pumpe.)

Hochdruck- gradient

b) Jeder Eluent wird von einer Pumpe gefördert und die Mischung erfolgt auf der Druckseite der Anlage. Eine Mischkammer steht dafür zur Verfügung. Eine solche Anlage wird als Hochdruckgradient bezeichnet.

Wieso ? Bei der Förderung des Eluenten durch die HPLC-Anlage baut sich Druck auf. Den Hauptanteil bewirkt hierbei die Säule. Abhängig vom Säulenmaterial, dessen Größe und Form, der Säulenlänge und des eingesetzten Eluenten (unterschiedliche Viskosität) ergeben sich


Drücke von 50 bis ca. 350 bar. Probeaufgabe-system

Das Probeaufgabesystem kann entweder ein Handinjektor oder manuelles Ventil (meist von der Firma Rheodyne) oder ein automatischer Probengeber (Autosampler) sein.

Säule In der Abfolge kommt dann die Säule, das Herzstück der Aufgabe, an der die Trennung nach verschiedenen Mechanismen stattfindet. Die Säulen können mit den unterschiedlichsten Materialien gefüllt sein. Die Art der stationären Phase wird nach dem von Ihnen zu bearbeitenden Trennproblem ausgesucht. Möglicherweise arbeiten

18-chemisch modifiziertes Kieselgel. Hierbei sind auf der Oberfläche des Kieselgels C18-Ketten aufgebaut. Es sollte immer eine konstante Temperatur gewährleistet sein, um reproduzierbare Ergebnissen zu erhalten.

Detektor Als Detektor finden Sie meist einen UV Detektor vor, manchmal in der Variante eines Diodenarray Detektors (DAD oder PDA). In Abschnitt 2 finden Sie eine Auflistung der gebräuchlichsten Detektoren und die Grundsätze deren Arbeitsweise.

Auswerte-system qualitative Analyse quantitative Analyse

Als Auswertesystem steht heute meist ein Rechner mit entsprechender Software hinter der Anlage, Integratoren gehören zu der älteren Generation der Auswertesysteme. Führen Sie eine qualitative (=Substanzen), die in Ihrer Probe enthalten sind, trennen. Soll eine quantitative Analyse durchgeführt werden, muss mit Hilfe von Standards die genaue Konzentration bzw. Menge der einzelnen in der Probe vorliegenden Substanzen bestimmt werden. Die Auswertung wird meist über die Fläche, selten über die Höhe der Peaks durchgeführt. Neben seiner Aufgabe als Auswertegerät steuert der Rechner oft auch die gesamte Anlage, angefangen von den Pumpen, über den Probengeber bis zum Detektor und evtl. andere Peripheriegeräte wie Fraktionssammler und Säulenofen. Für weitergehende Informationen und Übungenbieten wir Ihnen

- -Fo


Notwendige Arbeiten vor den Messungen

Verkabelung einer HPLC-Anlage

Bevor man nun eine erste Messung starten kann, müssen einige grundsätzliche Arbeiten durchgeführt werden. Das Gerät sollte an einem Ort aufgestellt sein, an dem es auch leicht von hinten zugänglich ist. Die elektrische Verkabelung der einzelnen Module untereinander sollte an beiden Enden der Kabel beschriftet werden, so dass bei späteren eventuell nötigen Umbauten ein problemloser Zusammenbau möglich ist. Ändern Sie vorerst nichts an diesen Verbindungen! Grundsätzlich sollten Sie die elektrische Verkabelung im Auge behalten, es können sich schon mal Verbindungen lockern und so zu Wackelkontakten oder

Kapillaren Der Eluent wird von Kapillaren von einem Modul zum nächsten

geführt. Sie können aus Stahl oder PEEK (Polyetheretherketon) sein. Der Innendurchmesser dieser Kapillaren sollte zwischen Pumpe und Injektor 0,5 1 mm betragen, ab Ausgang Injektor nur noch maximal 0,2 mm. Manche Detektoren, wie z. B. Fluoreszenzdetektoren, benötigen zum problemlosen Arbeiten einen gewissen Rückdruck. Dieser wird durch eine dem Detektor nachgeschaltete Kapillare mit 0,1 oder 0,2 mm Innendurchmesser aufgebaut. Dadurch bleiben evtl. vorhandene Luftbläschen im Eluenten, die Chromatographie bleibt ohne störende Luftpeaks. Das ist die so genannte Restriktorkapillare oder Restriktor.

Verbindungs-stücke

Die Verbindungsstücke, Ferrules und Fittings, sollten alle von einem Hersteller stammen, da die verschiedenen Marken sich doch geringfügig in den Dimensionen unterscheiden können. Das führt zu kleinen Totvolumina, die die gewünschte Trennung unnötig verschlechtern. Grundsätzlich muss dazu betont werden, dass man

aubungen anziehen soll, da sonst das

Detektor stecken bleibt. Wenn Sie schon Gewalt anwenden müssen, um ein Leck abzudichten, dann bitte nur sanfte Gewalt.

noch nicht?

Zustand einer HPLC-Anlage

Als erstes muss sichergestellt werden, dass die Anlage sauber ist. Folgende Fragen dazu: Hat jemand vor Ihnen mit der HPLC-Anlage gearbeitet, wenn ja, mit welchem Lösungsmitteln, hat er eine Säule im System gelassen, oder sie ausgebaut?

Säubern/ Spülen

Wenn Sie nicht wissen was vor Ihnen mit der Anlage geschehen ist, sollten Sie diese ohne Säule mit einer 50/50 Mischung aus Isopropanol(IsoOH)/Wasser bei einem Fluss von 1 ml/min für ca. 10 min spülen. Dabei sollten Sie einige Male auch den Eluenten injizieren, um sicherzustellen, dass auch kein alter Eluent mehr im Probeaufgabesystem ist. Jetzt können Sie den in Ihrer Methode vorgeschriebenen Eluenten in die Anlage bringen.

Nachfolgend werden die wichtigsten HPLC-Tätigkeiten etwas

genauer beschrieben, für den Fall, dass Sie keinerlei Beschreibung zur Hand haben. Ansonsten gilt generell folgende Prämisse: Wenn


Sie nach einer existierenden Methode arbeiten müssen, halten Sie zunächst stur an der Beschreibung fest!!! Ihre Kreativität und Experimentierfreude können im HPLC-Labor von unschätzbarem Nutzen sein, aber bitte, alles zu seiner Zeit.

Welche Säule? Welche Säule muss ich in die HPLC-Anlage einbauen?

Reversed Phase Normal Phase

Die zu verwendende Säule steht sicherlich in der Beschreibung der von Ihnen zu bearbeitenden Methode. Steht Ihnen diese Hilfe nicht

am häufigsten verwendete Säulenmaterial (stationäre Phase) ist mit C18 modifiziertes Kieselgel. Man spricht dann von Reversed Phase-Chromatographie. Die hierbei am meisten verwendeten Eluenten sind Mischungen aus Wasser und Methanol bzw. Acetonitril. Hinzu kommen oft Additiva (=Zusätze) oder Puffer. Müssen Sie auf Grund Ihrer Probe nichtmodifizierts Kieselgel als

Das ist allerdings nur in ca. 5 10% der Routinemethoden der Fall. Die wichtigsten Eluenten sind hier Hexan und Heptan mit entsprechenden Mischungen und Additiva. Was andere Trennmechanismen betrifft, seien hier nur einige Namen erwähnt: Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Ausschlusschromatographie.

Herstellung des Laufmittels (Eluent)

Wie stelle ich den Eluenten her? Welche Eluenten Sie brauchen, steht in Ihrer Methode. Auch welche Chemikalien und welche hochreinen Lösungsmittel Sie zu seiner Herstellung verwenden müssen. Die Bezeichnung solcher

-Firmen erhältlich, wie z. B. Baker, Merck, Promochem, Riedel de Haen, usw.

Elutionskraft (siehe Anhang)

In der HPLC werden verschiedene Eluenten eingesetzt, um die Stärke der Wechselwirkung zwischen Probe und stationärer Phase beeinflussen zu können. Ist die Elutionskraft eines Eluenten stärker, kommen die Peaks der zu trennenden Substanzen früher. In der Reversed Phase Chromatographie nimmt die Stärke eines Eluenten von Wasser über Methanol, Acetonitril, THF zu. Die Eluenten sollten Sie immer auf die gleiche Art und Weise herstellen. Wenn in Ihrer Vorschrift nicht genau steht, wie Sie den Eluenten herstellen müssen, dann achten Sie dabei bitte bei der Herstellung eines RP-Eluenten auf folgende Reihenfolge:

Fließschema: Puffer- herstellung

Den Puffer (p. a. Qualität) in der gewünschten Konzentration herstellen (den Messkolben noch nicht auffüllen),

den pH-Wert einstellen (Achtung: nur zwischen pH 2 und 8, da bei höheren pH-Werten sich das Säulengrundmaterial auflöst und im stark Sauren sich die Bindungen zwischen Basismaterial und C18 Kette lösen.

Messkolben genau auffüllen, Puffer in einem Messzylinder in der gewünschten Menge


abfüllen, Methanol bzw. Acetonitril in einem anderen Messkolben

abmessen, erst dann mischen.

Entgasen

Diese Vorgehensweise garantiert, dass Sie Ihre Eluenten immer reproduzierbar herstellen und keine Probleme mit der Volumenkontraktion bekommen. Eluenten sollten immer in genügender Menge (ca. 1 Liter) hergestellt und entgast werden. Das Entgasen ist mit Helium möglich oder durch den in die HPLC-Anlage eingebauten Degasser. Wenn Sie Puffer einsetzen, sollten Sie diese membranfiltrieren. Das Vorratsgefäß sollte gut abgedeckt

fungieren.


Die erste Messung

Equilibrieren Probenvor- bereitung

Nachdem Sie Ihre Anlage, wie beschrieben, vorbereitet haben, kann Ihr Eluent an Ihre Anlage angeschlossen werden. Jetzt müssen Sie Ihrer Anlage etwas Zeit lassen, ins Gleichgewicht zu kommen (equilibrieren). Dabei werden noch von der Herstellung der Säule vorhanverlässt die Anlage. Während dieser Zeit können Sie Ihre Proben vorbereiten. Wenn Sie Glück haben, müssen Sie diese nur im Eluenten lösen, ansonsten müssen Sie die in Ihrer Methode beschriebene Prozedur möglicherweise im Eluenten wieder ausfällt. Sollte das nämlich in der Anlage passieren, dann haben Sie eine Weile mit deren Reinigung zu tun oder müssen sogar teure Teile auswechseln.

Standard- chromatogramm

In der Zwischenzeit ist Ihr System equilibriert. Die hierfür benötigte Zeit bewegt sich zwischen einigen Minuten (einfache Analyse, z. B. UV-Detektion) und einigen Stunden (Spurenanalyse, z. B. elektrochemischer Detektor). Um zu testen, ob die gesamte Anlage voll funktionsfähig ist, injizieren Sie am besten eine Standardlösung. Diese ist in der Regel vorgegeben, falls nicht, nehmen Sie eine Mischung aus Nitromethan, Crysen, Perylen. (Säule: C18, Eluent: MeOH/H2O, 50/50 v/v). Betrachten Sie nun das Chromatogramm. Ist die Basislinie ruhig, zeigt sich keine Drift, sind die Peaks symmetrisch und sieht das Chromatogramm nach der nochmaligen Injektion genauso wie bei der ersten aus, dann können Sie davon ausgehen, dass Ihr Gesamtsystem in Ordnung ist.

Sequenz Gemäß der vorliegenden Vorschrift injizieren Sie jetzt, nach einer

und Standards und werten die sich ergebenden Chromatogramme aus. Nehmen Sie sich Zeit, wenn Ihre Methode einen Gradientenlauf enthält. Ein neuer Lauf sollte frühestens erst nach 5

10 min gestartet werden. Sie sichern so, dass Ihr System bei jeder Injektion im Gleichgewicht ist. Müssen Sie eine neue RP-Säule einsetzen, so spülen Sie diese vor dem ersten Einsatz mit Methanol oder Acetonitril. Beachten Sie bitte dabei, dass Ihre Anlage pufferfrei ist. Am Besten, Sie spülen die Anlage erst mit einem Isopropanol/Wassergemisch und stellen dann auf Methanol um. Genauso verfahren Sie, wenn Sie wieder zu Ihren Originalbedingungen zurückkehren wollen.


Verlassen einer HPLC Anlage

Ende einer Messserie Eluenten Kreislauf Stilllegen einer HPLC-Anlage

Zum Schluss geben wir Ihnen noch einige Tipps für das richtige Verlassen einer Anlage: 1. Wenn Sie wissen, dass Sie am nächsten Tag weiterarbeiten, ist

es am sinnvollsten, dass Sie alle Geräte bis auf die Pumpe ausstellen, evtl. muss der PC auch eingeschaltet bleiben. Die Pumpe lassen Sie bei einem kleinen Fluss von 0,1 bis 0,3 ml/min weiterlaufen. Dabei sollten Sie für genügend Eluent sorgen, damit die Anlage nicht trockenläuft, oder noch besser den Eluenten im Kreislauf pumpen. D. h. Sie führen die Auslasskapillare des Detektors in das Vorratsgefäß zurück. Am nächsten Morgen müssen Sie nur Ihren Fluss einstellen und können mit der Arbeit beginnen.

2. Möchten Sie Ihre Anlage für längere Zeit stilllegen, so spülen

Sie bei Bedarf zuerst mit Wasser Ihren Puffer aus der gesamten Anlage, anschließend spülen Sie mit ca. 20-30 ml Methanol oder Acetonitril. Jetzt können Sie die Säule ausbauen, mit Endstücken verschließen, damit sie nicht austrocknet, und unter diesem Lösungsmittel längere Zeit lagern.

Damit Sie das Wichtigste auf einen Blick haben, folgt eine

r it einem HPLC-Gerät

notwendig. Fügen Sie diese in die zwei Schemata ein oder modifizieren Sie diese einfach. Vielleicht hat Ihr(e) Vorgänger(in) diese Schritte irgendwo schriftlich festgehalten. Entwickeln Sie Ihre eigenen Arbeitshilfen, mit denen Sie sich sicher fühlen. Bereits nach kurzer Zeit werden diese Schritte für Sie zur Selbstverständlichkeit.


Checkliste für die RP-HPLC

Was muss ich vor Beginn der Messung beachten?

Elektrische Verkabelung Hat sich nichts gelockert?

Kapillaren Tropft es irgendwo?

Schläuche und Eluentengefäße

Luftblasen aus den Einlassschläuchen entfernen, indem man das Lösungsmittel mit einer Spritze

. Abdeckbares Eluentengefäß verwenden, damit

nichts hineinfallen kann und die Verdunstung des Eluenten minimiert wird.

Pumpen Pumpe einschalten und einen Blick auf das

Abfallgefäß werfen. Tropft es dort hinein? Wenn dies nicht der Fall ist, überprüfen Sie, ob der Eluent durch den Einlassschlauch fließt. Häufigste Ursache für fehlenden Fluss ist Luft in der Pumpe.

Tropft es irgendwo oder ist es feucht (Dichtstellen anfassen), sieht man Kristallablagerungen bei pufferhaltigen Eluenten? Sind die Pumpengeräusche die gewohnten?

Eluent Immer mit HPLC-grade Lösungsmittel ansetzen.

Genügende Menge vorbereiten. Pufferkonzentrationen sollten in der Regel

zwischen 20 und 50 mMol liegen. Eluenten mit Puffer immer membranfiltrieren, mit

Helium entgasen oder Degasser verwenden. Möglichst keine aggressiven Komponenten (z. B.

Trichloressigsäure) dem Eluenten zusetzen.

Injektor Beim manuellen Injektor sicherstellen, dass ein Gefäß unter dem Überlauf steht. Injektionsspritzen sauber halten, um Kontaminationen zu vermeiden, ggf. mit Iso-OH spülen.

Bei manchen Probengebern (Autosampler) muss eine Waschflüssigkeit angeschlossen sein. Bei RP-Trennungen am besten 10 20 % Methanol in das Wasser zusetzen, um Pilzwachstum zu verhindern.

Säule Immer nach einem konstanten Schema

einfahren.

Detektor Wenn Sie mit einem UV-Detektor arbeiten,


kontrollieren Sie, ob die Lampe genügend Energie hat. Beachten Sie dabei die Herstellerangaben.

Abfall Genügend großes Auffanggefäß bereitstellen.

Auswerteeinheit Sind die eingestellten Integrationsparmeter sowie

Datenaufnahmegeräte (sample-rate) OK?


Checkliste: Das muss ich immer machen

Arbeitsweise konstant halten Vom Einschalten des Gerätes bis zum Ausschalten,

immer alles gleich machen, bzw. Änderungen notieren. z. B.: Eluent gleich ansetzen (zuerst das Wasser, dann

den organischen Anteil). Säule gleich anfahren, auch Reihenfolge und

Konzentration streng beachten.

diesem Fall: Hersteller, Qualität, Charge usw., auch auf eingesetztes Spülmittel, Wasser achten).

Bei Änderungen alles notieren.

Puffer filtrieren immer die gleichen Filter verwenden (siehe Herstellung eines Eluenten)

Eluent entgasen (siehe Herstellung eines Eluenten)

Diagnostik-Werte überprüfen In Geräte eingebaute Diagnosemöglichkeiten nutzen, überprüfen ob sie in Ordnung sind (festgelegte Werte)

Häufiges Überprüfen der Anlage auf Funktionstüchtigkeit

Am einfachsten durch Vergleichschromatogramm


Checkliste: Das darf ich nie tun

Druck über 400 bar Es können Leckagen entstehen, die

Packungsqualität kann nachlassen.

Puffer in der Anlage stehen lassen

Salze können ausfallen, Verstopfung der Anlage

Verschraubungen (Fittings) zu fest anziehen

Fittings können abbrechen

Zu schnell reagieren kein Aktionismus, erst mal Gleichgewicht einstellen lassen und sich folgende Frage stellen:

- Habe ich irgendetwas auch eine winzige Kleinigkeit anders gemacht?

- Ist das Problem wiederholbar? - Was und warum kann ich etwas definitiv

ausschließen?

In folgender Reihenfolge aktiv werden: - Problem einkreisen, fragen, reagieren.

- Reversed Phase Säulen in Wasser lagern

Bakterienwachstum


Fließschema:

Wie wird eine HPLC-Anlage in Betrieb genommen?

Zuerst checken, in welchem Zustand das System ist. Ist der für Ihre Methode geeignete Eluent schon eingefahren (unten), muss das System auf die gewünschte Methode umgestellt werden? Oder ist Ihnen diesbezüglich nichts bekannt?

Spülen Sie im letztgenannten Fall die Anlage mit einem Gemisch aus Wasser und Isopropanol bei ausgebauter Säule, dabei machen Sie nichts Verkehrtes. Dann Wasser/Methanol- oder Acetonitrilgemisch (je ca. 10 ml) einfahren, von dieser Mischung auf Ihren benötigten Eluenten übergehen. Wenn Sie mit organischen Lösungsmitteln arbeiten werden, ist ein Zwischenspülschritt mit Methanol und Methylenchlorid notwendig. Vorsicht: Bei Puffern nie direkt auf reines organisches Lösungsmittel umstellen oder umgekehrt! Ansonsten fällt das Puffersalz aus und es kommt zu Verstopfungen in der Anlage.

Falls die Anlage umgefahren werden muss, zuerst den im System vorhandenen Eluenten ausspülen. Ist es Puffer, mit Wasser spülen, ansonsten Gemisch Wasser/Methanol oder Wasser/Acetonitril.

Benötigte Säule einbauen.

Ist es eine neue RP-Säule mit Methanol konditioniert? Enthält Ihr Eluent Puffer, wieder zuerst ein Wasser/Methanol oder Wasser/Acetonitril-Gemisch durch die Anlage pumpen, erst dann kommt der Eluent.


Falls Ihr System einsatzbereit war, können Sie hier weitermachen.

Benötigte Eluenten nach Vorschrift vorbereiten, bei Puffer membranfiltrieren, entgasen an den Einlassschlauch der Pumpe anschließen, evtl. vorhandene

Kontrollieren, ob Abfallgefäß hinter dem Detektor vorhanden ist. Beim Injektor prüfen, ob Abfallgefäß unter dem Überlauf steht, bei automatischem Probengeber falls erforderlich Spülflüssigkeit anschließen.

Die Geräte in der Reihenfolge Pumpe, Injektor, Detektor, Auswerteeinheit anschalten.

Pumpe immer in 0,2 ml/min-Schritten auf gewünschten Fluss bringen.

Sich Zeit lassen, damit die Säule ins Gleichgewicht kommen kann. In der Zwischenzeit die Proben vorbereiten. Testen, ob beim Mischen von Eluent und gelöster Probe etwas ausfällt. Wenn ja, versuchen, die Probe anders zu lösen.


Ist alles in Ordnung, können Sie jetzt einen Standard injizieren. Stimmt das sich ergebende Chromatogramm mit einem Vergleichschromatogramm überein, stimmen Peakhöhe und Retentionszeit, so ist Ihr System in Ordnung und Sie können mit Ihren Messungen beginnen.

Möchten Sie Ihre Arbeit für heute beenden, am nächsten Tag aber weiterarbeiten, lassen Sie den Eluenten bei niedrigem Fluss, ca. 0,2 ml/min, im Kreislauf laufen. Schalten Sie alle Geräte bis auf die Pumpe aus.

Möchten Sie das System längere Zeit nicht verwenden, spülen Sie den verwendeten Eluenten aus dem System. Ist es Puffer, zuerst mit Wasser und dann mit Methanol oder Acetonitril je ca. 20 30 ml. Bauen Sie die Säule aus und schreiben Sie die Bedingungen auf, wie sie behandelt wurde.

Schalten Sie die Geräte in der Reihenfolge Auswerteeinheit, Detektor, Injektor, Pumpe aus. Beim Ausschalten der Pumpe gehen Sie wieder in 0,2 ml-Schritten nach unten.


Bezeichnung von HPLC-Materialien

Bei etlichen Säulenmaterialien kann man deren Eigenschaften schon den Bezeichnungen entnehmen. Dagegen gibt es auch pfiffige Namenskreationen, die nichts über Eigenschaften und Spezifikationen verraten. Es gibt Materialbezeichnungen ohne jegliche Informationen, z. B. INTERCHROM, ASAHIPAK und andere, die doch etwas über sich aussagen: z. B. LiChrospher, Intertil. Dieses Thema kann hier zwar nicht ausführlich behandelt werden aber nachfolgend finden Sie hoffentlich einige Hilfen für sich. Aufgeführt sind Zahlen, Buchstaben, Silben, Präfixe, Suffixes aus der Säulenbezeichnung, die einige Hinweise geben.

Zur Bezeichnung von HPLC-Materialien

Natur des Füllmaterials

- Sil, Si, Silica, -spher, -sorb Kieselgel - Alox, A, Alumina Aluminiumoxid - HP, HA Hydroxylaptit - CEL Cellulose - GEL Polymer - Kieselgel nach einem neueren Verfahren

hergestellt und im Vergleich zu einem

Metallionenkontamination. Physikalische Eigenschaften des Füllmaterials

- spher rundes (sphärisches) Material - sorb irreguläres (gebrochenes,

unregelmäßiges) Material - WP Wide Pore, z. B. 300 Å

Porendurchmesser - NPB, NPR Non porous beads bzw. resins: Nicht

poröses Material 100, 120, 300, 1000, 4000 Eine große Zahl: Porenweite

(Durchmesser der Materialteilchen), wichtig bei der Trennung großer Moleküle

3, 5, 10 Eine kleine Zahl: Korngröße, z. B. 5µm mittlerer Teilchendurchmesser

Modifizierte Materialien

RPX Reversed Phase, x=2,8,18: Länge der Alkylkette

OD(S), C18, RP18, 18 Octadecylsilan: C18-Alkylkette ODS I, II, III (oder 1, 2, 3) Wie bei den Autos sind das die

Leider ist keine Systematik in der Bezeichnung


al doppelt endcapped und ein anderes Mal wiederum wurde das Verfahren für die Modifizierung des Kieselgels verbessert

OS, C8 Octasilan, C8-Alkylkette APS, NH, NH2, Amino Aminopropylsilica, Modifizierung mit einer

(CH2)3NH2-Gruppe PH, Phenylgruppe e, E -

Material

Eignung für ein bestimmtes Trennproblem

- Sugarpac für Zuckertrennungen - TSKgel DNA-NPR für DNA-Fragmente und Nukleinsäuren - PepMAP C18 für Peptide

Folgende Buchstabenreihenfolgen weisen auf Ionenaustauschersäulen hin:

AX, SAX, WAX, SCX, WCX, SC, CX, IEC, IEX

strong anion exchanger, weak cation exchanger, ion exchange chromatography ion exchanger usw.

Namen von besonders behandelten Materialien; geeignet zur Trennung von basischen Substanzen:

Beispiele: Inertsil Symmetry Select B deactivated phase

(keine Metallionen vorhanden) -pur, purospher Besonders saubere Phase (auch hier

keine Metallionen)

Alkylkette, damit sind Rest-Silanol-Gruppen geschützt)

SB Stable Bond (stabil gebunden) SP Sterically Protected (sterisch geschützt) AB Acid Bases (für Säulen und Basen

geeignet) BDS Based Deacivated Silica (für Basen nicht

aktiv, also geeignet)

Sollten Sie tatsächlich mehr über Ihre Säule erfahren wollen, rufen Sie bei Ihrem Lieferanten an. Angenommen, Ihr Gesprächspartner kennt sich aus, versuchen Sie es nach dem HHH-Prinzip (höfliche Hartnäckigkeit hilft), durch Ihren Charme, durch ein


interessantes Gespräch auf wissenschaftlicher Basis, oder durch den direkten Hinweis auf Ihre bereits jetzt beträchtlichen und vor allem zukünftigen Umsätze. Viel Erfolg!


Abkürzungen aus dem Bereich der Chromatographie (Auswahl)

Abkürzung Begriff (Englisch bzw. Deutsch)

AC Affinity Chromatography

(Affinitätschromatographie)

CC Computational Chromatography (Computerchromatographie oder Computergraphie)

CE Capillary Electrophoresis (Kapillarelektrophorese)

(C)EC Capillary Electrochromatography (Kapillarelektorchromatographie)

CIA Capillary Ion Analysis (Kapillar-Ionen-Analyse)

CLC Capillary Liquid Chromatography (Kapillar-LC) Chiral Liquid Chromatography (Chiral LC)

CZE Capillary Zone Electrophoresis (Kapillarzonenelektorphorese)

FIA Flow-Injection Analysis (Fließ-Injektions-Analyse)

FPLC Fast Protein Liquid Chromatography

GC Gas Chromatography (Gaschromatographie)

GFC Gel Filtration Chromatography (Gelfiltrationschromatographie)

GLC Gas-Liquid Chromatography Gas-Flüssig-Chromatographie

GPC Gel Permeation Chromatographie (Gelpermeationschromatographie)

I(L)C Ion (Liquid) Chromatography (Ionenchromatographie)

IEC Ion Exchange Chromatography (Ionenaustauschchromatographie)


IPC Ion Pair Chromatography (Ionen paar-Chromatographie)

LC Liquid Chromatography (Flüssigkeitschromatographie)

LC-MS/LC-ESI-MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry/ Liquid Chromatography Electrospray Interface Mass Spectrometry (HPLC-Massenspektrometrie-Kopplung mit einem Elektrospray Interface)

NPC Normal Phase Chromatography (Normalphasen-Chromatographie oder Adsorptionschromatographie)

PIC Paired Ion Chromatography (Ionenpaarchromatographie)

RPC Reversed Phase Chromatography (Umkehrphasenchromatographie)

SEC Size Exclusion Chromatography (Ausschluss-Chromatographie)

SFC Supercritical Fluid Chromatography (Überkritische Chromatographie)

SFE Supercritical Fluid Extraction (Überkritische Extraktion)

SPE Solid Phase Extraction (Festphasenextraktion)

SPME Solid Phase Micro Extraction (Mikrofestphasenextraction)


Von IUPAC empfohlene Symbole für die Chromatographie (Auswahl)

Im Jahre 1993 erschienen in Pure & Appl. Chem., Vol 65, No. 4, pp. 819-872 Empfehlungen von der IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)

im Symbole, Begriffe und Erläuterungen zur Chromatographie. Nachfolgend sind die wichtigsten Größen mit dem entsprechenden Symbol zusammengestellt. Größe englische Bezeichnung Symbol Trennfaktor separation factor (Bis 1993: Selektivitätsfaktor selectivity factor Fläche area A Durchmesser diameter d Diffussionskoeffizient diffusion coefficient D Flussrate flow rate (volumetric) F Bodenhöhe plate height H Viskosität ciscosity Gleichgewichts (Verteilungs-) konstante (Koeffizient)

equilibrium (distribution) coefficient K

Retentionsfaktor retention factor k (Bis 1993: Kapazitätsfaktor capacity factor Länge length L Bodenzahl plate number N Dichte density Druck pressure p relativer Druck pressure, relative P Radius radius r Temperatur temperature (absolute) T Zeit time t lineare Geschwindigkeit velocity (linear) u (Retentions) Volumen volume V Masse (Gewicht) mass (weight) W Peakbreite peak width w


Lösungsmittelgemische gleicher Elutionsstärke für die RP-Chromatographie (nach L. Snyder)

Mit Hilfe folgender Tabelle können Sie Mischungen gleicher Elutionsstärke herstellen. Z. B. könne Sie mit den Mischungen 50/50 MeOH/H2O, 40/60 ACN/H2O und 30/70 THF/H2O ungefähr die gleiche Retentionszeit erwarten wenn keine spezifischen Wechselwirkungen stattfinden. Weiterhin ist folgende Faustregel ersichtlich: Eine 10 %ige Änderung des organischen Anteils im Eluenten führt zu einer Veränderung der k-Werte und der Retentionszeiten um Faktor 2 3. Dies erlaubt einige Vorhersagen bei Optimierungsversuchen.

MeOH/H2O

ACN/H2O THF/H2O k

0 0 0 100 10 6 4 40 20 14 10 16 30 22 17 6 40 32 23 2,5 50 40 30 1 60 50 37 0,4 70 60 45 0,2 80 73 53 0,06 90 8 63 0,03

100 100 72 0,01


Lehrbücher über HPLC Reihenfolge nach Erscheinungsjahr

R. E. Kaiser/E. Oeleich: Optimierung in der HPLC

Alfred-Hüthig-Verlag, 1979, ISBN 3-7785-0594-7

C. Gertz: HPLC-Tipps und Tricks LCD Analytical GmbH, 1989, zu beziehen bei dem Autor: Dr. Christian Gertz, Schmalenbeckstr. 1 c, 58093 Hagen

N. Vonk, B. G. I. Baars, H. Schnaller:

Troubleshooting in der HPLC Fehlersuche in der HPLC Birkhäuser Verlag, 1990, ISBN 3-527-28195-9

G. Aced, H. I. Möckel: Liquidchromatography (Deutsch) VCH Weinheim, 1991, ISBN 3-527-28195-9

V. Meyer: (1) Praxis der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Diesterweg Salle Verlag, 7. Auflage, 1992, ISBN 3-7935-5452-X

W. Gottwald: (1) RP-HPLC für Anwender VCH Weinheim, 1993, ISBN 3-527-28518-0

K. K. Unger: Handbuch der HPLC, Teil 1 GIT Verlag, 2. Auflage, 1995, ISBN 3-92886519-6

S. Lindsay: Einführung in die HPLC Verlag Vieweg, 1996, ISBN 3-528-06759-4 (aus dem Englischen übersetzt von Stefan Lamotte und Manfred Treitz)

Merck KGaA Chromatographie Chronologie einer Analysenthechnik GIT Verlag, 1996, ISBN 3-928865-21-8

V. Meyer: (2) Fallstricke und Fehlerquellen in der HPLC in Bildern Alfred Hüthig Verlag, 1996, ISBN: 3-7785-2417-8

S. Kromidas (2) HPLC Tipps Hoppenstedt Verlag, 1997, ISBN

G. J. Eppert Flüssigchromatographie HPLC Theorie und Praxis Verlag Vieweg, 1997, ISBN 3-528-06770-5

(1) für Grundlagen (2) Tipps für die Praxis


Empfehlenswertes Wörterbuch: H. P. Angelé Dictionary of Chromatography (English, German, French,

Russian), Alfred Hüthig Verlag, 1984, ISBN 3-7785-0926-8

Aus der Fülle der in Englisch erschienenen HPLC-Bücher seien folgende drei herausgegriffen: L. R. Snyder, I. I. Kirkland:

Introduction to Modern Liquid Chromatography Wiley-Interscience, 1988

J. W. Dolan, L. R. Snyder:

Troubleshooting LC Systems Humana Press 1989

U. Neue: Wiley-Interscience, 1997


Adressen von HPLC-Firmen (Deutschland)

Firma Anschrift Telefon Fax Abimed Analysen-technik GmbH

Postfach 88 11 11 40736 Lanenfeld

02173-8905-0 8905-77

Alltech GmbH Münchner Str. 14 82008 Unterhachingen

089-615250-0 615250-19

Amicon GmbH Königsholz 75 58453 Witten

02302-96060-0 800905

Applied Biosystems GmbH

Brunennweg 13 64331 Weiterstadt

06150-1010 101-101

Axel Semrau GmbH & Co.

Stefansbeck 42 45549 Sprockhövel

02339-6037-0 6030

Industrievertretung Michael Baumann LC Tech-Chromatographie

Hochgernstr. 12 84403 Dorfen

08081-4920 4990

bai GmbH Heimrodstr. 10 64625 Bensheim

06251-76076 76010

Beckmann Instruments GmbH

Frankfurter Ring 115 80807 München

089-3887-0 3887-490

Besta Technik für Chromatographie GmbH

Höhenstr. 35 69259 Wilhelmsfeld

06220-7017 7019

Bio-Rad GmbH Heidemannstr. 164 80939 München

089-31884-0 31884100

Bischoff Analysen-technik GmbH

Höhenstr. 35 69259 Wilhelmsfeld

06220-7017 7017

Bodenseewerk Perkin-Elmer

Postfach 10 17 61 88647 Überlingen

07551-810 1612

Chrompack GmbH Berner Str. 53 60437 Frankfurt

069-500019-0 500019-50

Chromtech GmbH Buchwiese 3 65510 Idstein

06126-1686 oder 1651

1686

Conchrom GmbH & Co. KG

Möckernstr. 10 28201 Bremen

0421-6440673 6440674

CS-Chromatogra-phie Service GmbH

Am Wehebach 26 52379 Langwehe

02423-2001 2004

Deutsche Metrohm GmbH & Co.

In den Birken 3 70772 Filderstadt

0711-77088-0 77088-55

Dionex GmbH Am Wörtzgarten 10 65510 Idstein

06126-991-0 991-277

ERC GmbH Dahlienweg 6 93087 Alteglofsheim

09543-8277 8820

GAT Gamma Analysetechnik

Friedhofstr. 26 27576 Bremerhaven

0471-9089-0 890990

Grom GmbH Herrenberger Str. 54 71083 Herrenberg

07032-73261 76115


Gynkotek HPLC Landsberger Str. 65 82110 Germeringen

089-849370 849-3777

Hamilton Deutschland GmbH

Postfach 11 05 65 64220 Darmstadt

06151-9802-0 891733

Hewlett Packard GmbH

Hewlett-Packard-Str. 8 76337 Waldbronn

07243-602-0 0180-5326244

602-212 0180-316144

ICT Internationale Chemie Technik GmbH

Norsk-Data-Str. 3 61352 Bad Homburg

06172-94680 946899

Jasco GmbH Robert-Borsch-Str. 11 64823 Groß-Umstadt

06078-74949 74006

Knauer GmbH 14163 Berlin 030-81608-0 8015010 Kontron Instruments GmbH

Werner-von-Siemens-Str. 1 85375 Neufahrn

08165-922-0 922-307

Kronlab Chromatographie

Dörntelsberg 5a 74889 Sinsheim

07261-64993 3387

Kupfer Chromatographie

An der Tuchleiche 19 64319 Pfungstadt

06157-7858 7858

LATEK Labortechnik Lilienthalstr. 13 69214 Eppelheim

06221-760097 766479

Macherey-Nagel GmbH & Co. KG

Postfach 10 13 25 52313 Düren

02421-969-0 969-199

Dr. A. Maisch / High Performance LC

Pfalzgrafenring 19 72119 Ammerbuch

07073-50357 4216

MedChrom Im Breitspiel 11 69126 Heidelberg

06221-315577 357220

Merck GHaA Frankfurter Str. 280 64293 Darmstadt

06151-781339 727495

Molnar Institut Chromatographie-technik GmbH

Schneeglöckchenstr. 47 10407 Berlin

030-4215590 421559-99

Muder & Wochele Chroamographie-technik GmbH

Wiesenweg 11 a 10365 Berlin

030-5577270 55772788

Chromatographie Handel Müller GmbH

Haag 5 83413 Fridolfing

08685-313 7407

MZ-Analysen-technik GmbH

Wöhlerstr. 2 6 55120 Mainz

06131-686619 625143

NOVIA GmbH Industriepark Höchst Geb. B 845 65926 Frankfurt

069-305-43843 9754-15

OmniChrom Alte Reisfelder Str. 6 46514 Schermbeck

02856-845 1008

Pharmacia Biotech Europe GmbH

Munzinger Str. 9 79111 Freiburg

0761-4903-308 4903-309

Polymer Standards Service GmbH

Wöhlerstr. 4 55120 Mainz

06131-96239-0 96239-11

Schambeck SFD GmbH

Rhöndorfer Str. 51 53604 Bad Honnef

02224-92396 923936


SEPSERV Seperaton Service Berlin

Helmholtzstr. 2 9 10587 Berlin

030-3930991 3934925

Shimadzu Europa GmbH

Albert-Hahn-Str. 6 47269 Duisburg

0203-7687 766625

Sigma Aldrich Chemie GmbH

Grünwalderweg 30 82041 Deisenhofen

089-6513-1350 6513-1398

SunChrom GmbH Max-Planck-Str. 22 61381 Friedrichsdorf

06172-7004 5895

Supelco s. Sigma Alldrich

Sykam GmbH Talhofstr. 32 82203 Gilching

08105-8003 23262

TECHLAB GmbH Ecessener Str. 2 38173 Erkerode

05305-930203 930208

Thermo Seperation Products GmbH

Boschring 12 63329 Egelsbach

06103-408-0 408-222

TosoHaas GmbH Zettachring 6 70567 Stuttgart

0711-13257-0 13257-89

Varian GmbH Alsfelder Str. 6 64229 Darmstadt

06151-703-0 703-237

VDS optilab Chromatographie-technik GmbH

Graf von Zeppelin Str. 5 56410 Montabaur

02602-917224 917225

Wicom Bürstadt 06206-79970 79975 Waters GmbH Hauptstr. 87

65760 Eschborn 06196-400600 482388

YMC Europe GmbH Alte Raesfelder Str. 6 46514 Schermbeck

02856-845 1881

Ziemer Klaus GmbH Pommernstr. 96 68309 Mannheim

0621-709034 709364

Zinsser Analytic GmbH

Eschborner Landstr. 135 60489 Frankfurt

069-789106-0 78910680

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