Identifizierung und Charakterisierung genetischer ... · Mutation im Gen für die OPDA-Reduktase...

Identifizierung und Charakterisierung

genetischer Suppressoren der männlich sterilen

opr3-Mutante in Arabidopsis thaliana

Universität Hohenheim Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen

Prof. Dr. A. Schaller

Diplomarbeit von Dagmar Kleeb

Unter Anleitung von Dr. Annick Stintzi

Stuttgart, Mai 2004

Erklärung: Hiermit versichere ich, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig verfaßt, andere als die

angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die den benutzten Werken wörtlich

oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe.

Zusammenfassung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgte eine Charakterisierung von genetischen Suppressoren der opr3-Mutante von Arabidopsis thaliana. In der opr3-Mutante liegt eine Mutation im Gen für die OPDA-Reduktase 12-Oxo-Phytodiensäure-10,11-Reduktase 3 (OPR3) vor, so daß der Jasmonsäurebiosyntheseweg gestört ist, was zu einem sterilen Phänotyp der opr3-Mutante führt. Die genetischen Suppressoren haben eine zusätzliche Mutation, durch die der fertile Phänotyp des Wildtyps wiederhergestellt wurde. Die Charakterisierung soll dazu beitragen, daß die Signalkaskaden downstream von Jasmonsäure besser verstanden werden. Dazu erfolgte zunächst für die infragekommenden Linien der Nachweis, bei welchen Linien es sich um echte Suppressoren handelt, wobei sechs Linien identifiziert werden konnten. Über ein Kreuzungsexperiment wurde nachgewiesen, daß drei der Suppressor-Mutationen dominant und drei rezessiv waren. Desweiteren erfolgte für alle sechs Linien die Rückkreuzung mit opr3, mit dem Ziel, Nebenmutationen zu eliminieren, als Basis für ein später auszuführendes Mapping durch Kreuzung der Suppressoren mit dem Ecotyp Landsberg erecta, bei dem die betroffenen Gene genau identifiziert werden sollen. Um festzustellen, ob die Suppressor-Mutationen OPDA-abhängig sind, wurde eine opr3/aos-Doppelmutante hergestellt. Außerdem wurden die Suppressoren mit der aos-Mutante gekreuzt. Die hieraus in F2 entstehenden homozygoten Pflanzen sollen später mit der o. g. Doppelmutante gekreuzt werden, um Pflanzen zu erhalten, die in opr3, aos und in der Suppressormutation homozygot sind. Für die phänotypische Charakterisierung der Suppressoren wurden die drei Parameter Blühbeginn, Länge des Haupttriebs und Schotenöffnung gemessen, um eventuelle Abweichungen von der normalen Entwicklung aufzuzeigen. Außerdem wurden mikroskopi-sche Untersuchungen an den jeweils ersten drei bis vier geöffneten Blüten (ausgehend vom Blütenstand des Haupttriebs) ausgeführt, die interessanterweise zeigten, daß bei den verschiedenen Suppressoren bezüglich der Freisetzung von Pollen signifikante Unterschiede im zeitlichen Verlauf festzustellen sind. Desweiteren wurde die Pollenkeimung untersucht, die mit Pollenkeimungsraten zwischen 46,7 und 72,3 % zeigte, daß die Prozesse, die für eine normale Entwicklung von Pollen und Antheren notwendig sind, in allen sechs Suppressoren zwar nicht 100%ig, aber doch im wesentlichen wiedererlangt wurden. Eine molekulare Charakterisierung erfolgte unter Verwendung der molekularen Marker MBP, WIMBP, VSP2 und OPR1, für die eine RT-PCR auf RNA der Suppressoren ausgeführt wurde und PDF1.2, für welches ein Northern Blot ausgeführt wurde. Dabei konnte festgestellt werden, daß in den Blüten dreier Suppressoren der streng jasmonsäureabhängige Marker VSP2 angeschaltet ist.

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Blütenentwicklung 2 1.2 Männliche Sterilität 3 1.3 Octadecanoid-Pathway 5 1.4 Männlich sterile Mutanten im Jasmonsäure-Biosyntheseweg 7 1.5 Männlich sterile Mutanten in der Signalkaskade downstream

von Jasmonsäure 11 1.6 Jasmonsäure als Signalmolekül 12 1.7 Crosstalk 16 1.8 Genetische Suppressoren von opr3 werden eingesetzt, um die

Jasmonsäure-Signalkaskade besser zu verstehen 19 2 Materialien und Methoden 20 2.1 Materialien 20 2.1.1 Enzyme, Puffer, Chemikalien, Lösungen 20 2.1.2 Primer 24 2.1.3 Medien 25 2.1.4 Geräte und Kits 25 2.1.5 Bakterienstämme und Vektoren 26 2.2 Methoden 27 2.2.1 Anzucht der Pflanzen 27

2.2.2 Ernten von Blatt- und Blütenmaterial 27 2.2.3 DNA-Extraktion 28 2.2.4 Kanamycintest und Kontroll-PCR 28 2.2.5 Nachweis über das homozygote Vorhandensein der Mutation,

die die Suppression des opr3-Phänotyps auslöst 29 2.2.6 Blütenentwicklung 29 2.2.7 Pollenkeimung 30 2.2.8 Beobachtungen an der phänotypischen Entwicklung der

Pflanzen 30 2.2.9 Kreuzungen 31 2.2.10 RNA-Extraktion 31 2.2.11 RT-PCR zur Herstellung von cDNA aus RNA und Testgel 33 2.2.12 PCR auf cDNA 34 2.2.13 Mini-Präparation von Vektor-DNA 34 2.2.14 Restriktionsverdau des Vektors 35 2.2.15 Reinigung der PDF1.2 cDNA 35 2.2.16 Northern Blot 36 3 Resultate 38 3.1 Screening auf mögliche Suppressoren 40 3.2 Homozygote Suppressor-Mutation 44 3.3 Sind die Suppressoren dominant oder rezessiv? 45 3.4 Sind die Suppressor-Mutationen OPDA-abhängig? 48 3.4.1 Herstellung einer Doppelmutante: aos x opr3 48

3.4.2 Suppressor x aos 50 3.5 Phänotypische Charakterisierung der Suppressoren 51 3.5.1 Unterschiede der verschiedenen Suppressoren in der

Blütenentwicklung 52 3.5.2 Beobachtungen an der phänotypischen Entwicklung

der Pflanzen 57 3.5.3 Pollenkeimung 59 3.6 Molekulare Charakterisierung der Suppressoren 63 4 Diskussion 73 5 Literaturverzeichnis 79

1 Einleitung 1 __________________________________________________________________________

Kapitel 1

Einleitung

Im Laufe der Evolution haben Pflanzen immer bessere Methoden entwickelt, um ihre

Reproduktion sicherzustellen und sich vor Fremdeinflüssen zu schützen. Die physiologischen

Abläufe, die bei der Entwicklung zur reifen Pflanze und deren Produktion von Samen eine

Rolle spielen, sind hochkomplex. Derzeit sind wir noch weit davon entfernt, diese Vorgänge

vollständig zu verstehen. Es existieren jedoch bereits viele interessante Erkenntnisse, deren

Weiterentwicklung in Zukunft zu einem tieferen Verständnis führen soll.

Eine Schlüsselrolle spielen die Jasmonate (Jasmonsäure und deren Methylester), die als

Wachstumsregulatoren fungieren und als Signalmolekül die Verteidigung bzw. Wundabwehr

auslösen. Sie sind weit über das Pflanzenreich verbreitet und werden in verschiedenen Arten

von Geweben gefunden. Jasmonate beeinflussen so unterschiedliche Prozesse wie

Pollenentwicklung, Fruchtreifung, Wurzelwachstum, Rankenwindung, UV-Schutz, Wund-

reaktion und Resistenz gegenüber Insekten und Pathogenen. Die Produktion von Jasmonaten

führt dazu, daß verschiedene Gene induziert werden, die für die genannten Prozesse sowie für

die Jasmonsäurebiosynthese benötigt werden (Devoto and Turner 2003). In dieser Studie

werden wir unsere Strategie beschreiben, mit der wir besser verstehen wollen, wie

Jasmonsäure zur Reifung des männlichen Gametophyten beiträgt.

1 Einleitung 2 __________________________________________________________________________

1.1 Blütenentwicklung

Will man herausfinden, wie die Blütenentwicklung auf genetischer Ebene reguliert wird, so

ist es besonders interessant zu untersuchen, welche spezifischen Störungen in der Blüten-

morphogenese als Effekt von Mutationen auftreten. Man kann davon ausgehen, daß das

Produkt eines exprimierten Gens, sofern in diesem die Mutation auftritt, mit dem jeweiligen

Entwicklungsschritt zusammenhängt, welcher in der Blütenentwicklung defekt ist. Um diese

Defekte in Mutanten zu untersuchen, muß zunächst ein einheitlicher Standard zugrundegelegt

werden, wobei als Bezugsgröße die natürlichen Entwicklungsschritte einer normal

entwickelten Arabidopsis thaliana-Pflanze verwendet werden. Die Blütenmorphologie einer

Arabidopsis thaliana-Blüte entspricht der einer typischen Brassicacee.

Die Organogenese von der Initiation der Blütenknospenzellen im Apikalmeristem zur fertig

entwickelten Knospe erfolgt in 12 Stadien. In Stadium 1 – 5 bilden sich Blütenprimordium,

Sepalenprimordien, Blütenmeristem, Petalen- und Staminaprimordien. Von Stadium 6 – 12

wachsen diese und in Stadium 12 sind die Petalen so lang wie die langen Staminae. Diese

Analyse stützt sich auf elektronenmikroskopische Aufnahmen (Smyth et al. 1990). In Stadium

13 öffnet sich die Knospe, die Petalen werden sichtbar und die Antheren öffnen sich und

setzen den Pollen frei. Darauf folgt die Verlängerung der Antheren über das Stigma hinaus

(Stadium 14). In Stadium 15 verlängert sich wiederum das Gynoeceum, so daß das Stigma

sich oberhalb der langen Antheren befindet (Smyth et al. 1990). Ab Stadium 13 erfolgt die

Bestäubung.

1 Einleitung 3 __________________________________________________________________________

1.2 Männliche Sterilität

Antherenentwicklung

Die Prozesse bei der Entwicklung der Antheren laufen in zwei Phasen ab. Zunächst läuft ein

Programm zur Gewebespezifizierung ab; dabei wird die Morphology der Anthere etabliert,

indem unterschiedliche Zellen und Gewebstypen ausgebildet werden. Hier findet auch die

Meiose der Microsporenmutterzelle mit anschließenden Mitosen statt, sodaß am Ende der

Phase 1 Microsporentetraden in den Pollensäcken zu finden sind. In Phase 2 läuft ein

Degenerationsprogramm ab, wobei aber zunächst die Pollenkörnerdifferenzierung stattfindet,

die Anthere sich vergrößert und durch Verlängerung des Filaments nach oben geschoben

wird. Daraufhin findet die Degeneration eines Teils des Gewebes statt, einige Zellen sterben

ab und dadurch öffnet sich die Anthere, um die Pollenkörner freizusetzen (Goldberg et al.

1993). Dazu müssen die betroffenen Septumzellen und Stomiumzellen ein im zeitlichen

Verlauf exakt gesteuertes Zelldegenerationsprogramm durchlaufen (Sanders et al. 1999). Die

Septumzellen degenerieren früher als die Stomiumzellen.

Die zellulären und molekularen Prozesse, die der Entwicklung von reifem, funktionsfähigem

Pollen zugrundeliegen, werden derzeit noch nicht vollständig verstanden. Um genauere

Erkenntnisse zu erzielen, ist die Untersuchung von Mutanten sinnvoll, bei denen ein Defekt in

der männlichen Sterilität vorliegt. Es existieren bereits mehrere männlich sterile Arabidopsis

thaliana-Mutanten, mit Mutationen in verschiedenen Stadien der Pollenentwicklung; diese

können als Werkzeug herangezogen werden, um die einzelnen Regulationsmechanismen

detailliert zu analysieren (Sanders et al. 1999). Beispiele hierfür sind die Mutanten ms1

(Wilson et al. 2001), ms2 (Aarts et al. 1997), ms5 (Glover et al. 1998), pop1 (Preuss et al.

1993) und ams1 (Sorensen et al. 2003).

1 Einleitung 4 __________________________________________________________________________

In der dde1/opr3-Mutante zum Beispiel sind die Prozesse der Pollenfreisetzung gestört, da die

zeitlichen Abläufe nicht normal funktionieren. Der Pollen wird bei dde1/opr3 zu spät frei-

gesetzt. Zu diesem Zeitpunkt sind die Stigmapapillen nicht mehr empfänglich für die Bestäu-

bung (Sanders et al. 1999, Sanders et al. 2000).

Durch den Einsatz von T-DNA- oder EMS-Mutagenisierung können große Mengen Pflanzen

gescreent werden, um männlich sterile Pflanzen zu erhalten. Bei diesen treten vielfältige

Defekte auf, die alle zu männlicher Sterilität führen, so z. B. Defekte bei der Ausbildung einer

normalen Antherenmorphologie, Produktion von Mikrosporen, Pollendifferenzierung, beim

Pollenfreisetzungsmechanismus oder dem Zeitpunkt des Öffnens der Antheren. Es können

Mutanten gefunden werden, bei denen die Antheren sich zu spät oder überhaupt nicht öffnen,

oder bei denen kein Pollen gefunden wird. Mindestens ein Drittel der männlich sterilen

Mutanten haben Defekte im Pollenfreisetzungsprozeß, wobei der Pollen selbst meist voll

funktionsfähig ist und sogar für Kreuzungen verwendet werden kann. Bei einem solchen

großangelegten Screening wurden z. B. die Mutanten non-dehiscence 1 oder delayed-

dehiscence1 (Pollen nicht funktionsfähig) gefunden, außerdem die Mutante pollenless3

(Sanders et al. 1999). Bei genauer Charakterisierung der jeweiligen Mutanten und Identi-

fizierung der mutierten Gene, die den Defekt auslösen, können diese Mutanten viel dazu bei-

tragen, ein genaueres Verständnis der physiologischen Schritte zu erlangen.

Männliche Sterilität durch Defekte, die den Jasmonsäure-Signalweg betreffen

Unter den männlich sterilen Linien sind diejenigen auffällig, deren mutierte Gene in den

Jasmonsäure-Biosyntheseweg involviert sind (Sanders et al. 2000; Stintzi and Browse 2000;

Ishiguro et al. 2001, Von Malek et al. 2002). Alle Mutationen, die den Jasmonsäure-

Biosyntheseweg und den darauffolgenden Signalweg (Xie et al. 1998) in irgendeiner Form

unterbrechen, führen zu männlicher Sterilität. Für die männliche Fertilität in Arabidopsis

thaliana ist das Vorhandensein von Jasmonsäure unabdingbar.

1 Einleitung 5 __________________________________________________________________________

1.3 Octadecanoid-Pathway

Abb. 1: Biosyntheseweg der Jasmonsäure. In der opr3-Mutante fehlt das Enzym OPR3, so daß keine Jasmonsäure synthetisiert werden kann.

(3R, 7S)-jasmonic acid (JA)

O

COOH

O OPR 3

3 Cycles of β-oxidation

COOH

12 OPDA REDUCTASE

3-oxo-2(2’[Z]-pentenyl)-cyclopentane-1-octanoic

COOH

α-linolenic acid (18:3)

COOHOOH

13-hydroperoxylinolenic acid

COOHO

12,13-epoxyoctadecatrienoic

(9S,13S)-12-oxo-phytodienoic acid (OPDA)

O

COOH

LIPOXYGENASE

ALLENE OXIDE SYNTHASE

ALLENE OXIDE CYCLASE

opr3

1 Einleitung 6 __________________________________________________________________________

Octadecanoide wie die Jasmonsäure sind in geringen Mengen wirksame bioaktive Kom-

ponenten, die vielfältige Aspekte der pflanzlichen Reaktionen auf ihre biotische und

abiotische Umwelt beeinflussen (Review: Devoto and Turner 2003).

Die Biosynthese der Jasmonsäure (s. Abb. 1) beginnt mit der Oxidation von aus der Chloro-

plastenmembran freigesetzter α- Linolensäure (Review: Schaller F 2001), die in

(9Z,11E,15Z,13S)-13-hydroperoxy-9,11,15-octadecatrienoic acid (13(S)-HPOT) umgewan-

delt wird. Diese Reaktion wird von 13-Lipoxygenase (LOX) katalysiert. 13(S)-HPOT wird

von AOS in ein instabiles Epoxid (12,13(S)-epoxy-9(Z),11,15(Z)-octadecatrienoic acid,

12,13-EOT) umgewandelt, welches von AOC (allene oxide cyclase) zyklisiert wird. Dadurch

entsteht OPDA (12-oxo-10,15(Z)-phytodienoic acid), welche von einer NADPH-abhängigen

OPDA-Reduktase (OPR3) an der 10,11-Doppelbindung reduziert wird, wodurch OPC-8:0 (3-

oxo-2(2´(ZI-pentenyl)-cyclopentane-1-octanoic acid) entsteht. Durch drei β-Oxidationen

entsteht schließlich Jasmonsäure, das Endprodukt des Biosynthesewegs (Schaller F 2000).

AOS katalysiert die Eingangsreaktion in den Octadecanoid-Signalweg. An dieser Stelle tritt

ein Rückkopplungseffekt ein, der beim Vorhandensein von Jasmonsäure ausgelöst wird. Bei

Pflanzen mit konstitutiver AOS-Expression wird das Wachstum eingeschränkt und OPDA

akkumuliert zu wesentlich höheren Konzentrationen als es normalerweise der Fall ist

(Kubigsteltig and Weiler 2003).

AOC mRNA wurde in Tomaten in hohen Konzentrationen in Blütenknospen, Blütenstengeln

und Wurzeln gefunden, was mit erhöhten Mengen an Jasmonsäure, OPDA und Jasmonsäure-

Isoleucin-Konjungat korreliert (Hause et al. 2000). In Arabidopsis thaliana gibt es vier AOC-

Gene, die wohl redundant sein müssen, so daß beim Ausfall eines dieser Gene trotzdem noch

genug AOC produziert wird. Daher konnten bisher noch keine aoc-Mutanten detektiert

werden.

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OPDA ist in Arabidopsis-Blättern zu 90 % in der Chloroplastenmembran lokalisiert, und zwar

in Form von MGD-OPDA (sn1-O-(12-oxophytodienoyl)-sn2-O-(hexadecatrienoyl)-

monogalactosyl diglyceride) und kann aus der Membran durch eine spezifische Lipase

freigesetzt werden. Dies könnte die Ursache dafür sein, daß bei Verwundung extrem schnell

freies OPDA für die Jasmonsäureproduktion zur Verfügung steht (Stelmach et al. 2001). Bis

zur Produktion von OPDA werden alle Schritte von Plastidenenzymen katalysiert. Der einzige

bekannte Ort, an dem β-Oxidation stattfindet, ist aber das Peroxisom, so daß man davon

ausgehen kann, daß OPDA vom Plastid zum Peroxisom transportiert wird (Stintzi and Browse

2000), zumal auch schon bekannt ist, daß OPR3 ebenfalls im Peroxisom lokalisiert ist

(Strassner et al. 2002).

Sowohl in Arabidopsis thaliana als auch in Lycopersicon esculentum wurden verschiedene

OPR-Proteine entdeckt, deren Verwandschaftsgrade bereits aufgeklärt sind. Ein Vergleich der

Wildtyppflanzen und opr3-Pflanzen zeigte, daß es sich bei dem im Peroxisom vorkommenden

OPR-Protein um OPR3 handelt (Strassner et al. 2002). Von den in Arabidopsis thaliana vor-

kommenden Isoformen von OPR ist nur OPR3 in der Lage, dasjenige Stereoisomer von

OPDA zu reduzieren, welches für die Jasmonsäureproduktion benötigt wird (Stintzi and

Browse 2000, Stintzi et al. 2001).

1.4 Männlich sterile Mutanten im Jasmonsäure-

Biosyntheseweg

Wie schon zuvor erwähnt gibt es verschiedene männlich sterile Arabidopsis thaliana-

Mutanten, bei denen keine Jasmonsäure produziert wird.

dad1-Mutante:

Die dad1-Mutante (defective in anther dehiscence) hat Defekte beim Öffnen der Antheren, bei

der Pollenreifung und beim Öffnen der Blüten. Diese können durch die Applikation von

exogener Jasmonsäure aufgehoben werden, was auf eine Unterbrechung des Jasmonsäure-

1 Einleitung 8 __________________________________________________________________________

biosynthesewegs hinweist. Bemerkenswert ist, daß bei Applikation von Linolensäure derselbe

Effekt auftritt. Von der Mutation ist also ein Gen upstream von Linolensäure betroffen. Es

handelt sich bei DAD1 um das lipolytische Enzym, welches die Freisetzung von

Phospholipiden aus der Chloroplastenzellmembran verursacht (Ishiguro et al. 2001).

fad-Mutante:

Durch die Charakterisierung der fad3-2 fad7-2 fad8 Triple-Mutante wurde zum ersten Mal

nachgewiesen, daß Jasmonate für die männliche Fertilität unabdingbar sind. In dieser Mutante

sind die drei Fettsäuredesaturase-Gene außer Funktion gesetzt, die für die Desaturierung von

18:2 (Linolsäure) zu 18:3 (Linolensäure) verantwortlich sind. Deshalb fehlt in der Mutante die

Linolensäure als Vorläufer von Jasmonsäure, daher ist sie männlich steril. Fertilität kann

durch exogene Jasmonsäureapplikation an gerade noch geschlossenen Blüten wiedererlangt

werden. Pollenuntersuchungen zeigen, daß die Pollenkörner sich nicht vollständig entwickeln.

Bei Applikation entweder von α-Linolensäure oder von Jasmonat entwickelt sich der Pollen

normal. Die Untersuchungen zeigen, daß die Linolensäure ein Vorläufer von Oxylipinen ist,

durch die Reifungsprozesse und Pollenfreisetzung reguliert werden (McConn and Browse

1996).

aos-Mutanten:

Zwei Arbeitsgruppen identifizierten unabhängig voneinander eine aos-Mutante:

Die dde2-2-Mutante ist durch eine frame-shift-Mutation in AOS männlich steril. Durch

genetische Komplementation des mutierten Phänotyps konnte die Notwendigkeit von AOS

für die Fertilität bestätigt werden (Von Malek et al. 2002).

Die zweite aos-Mutante hat einen knock-out-Defekt im Gen CYP74A, welches für AOS

(allene oxide synthase) codiert. Der im Wildtyp beobachtete enorme Anstieg der

Jasmonsäurekonzentration ca. 1 h nach Verwundung tritt in der aos-Mutante nicht auf.

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Außerdem sind die Antheren- und Pollenentwicklung defekt, was zu männlicher Sterilität

führt. Wie schon bei dad 1, fad3-2 fad7-2 fad8 und opr3 (s. nächster Abschnitt) kann auch

hier die Fertilität durch exogene Jasmonsäureapplikation wiedererlangt werden. Interessant ist

auch, daß die Transkription des VSP (vegetative storage protein) und der Lipoxygenasen

durch Verwundung im Gegensatz zum Wildtyp nicht induziert werden können. Zudem wurde

an Pflanzen, die AOS konstitutiv exprimieren, festgestellt, daß bis zur doppelten Menge

wundinduzierte Jasmonsäure im Vergleich zum Wildtyp zu finden ist (Park et al. 2002).

opr3-Mutante:

Bei der Charakterisierung der männlich sterilen opr3-Mutante, bei der die Mutation im Gen

für die OPDA-Reduktase 12-Oxo-Phytodiensäure-10,11-Reduktase 3 (OPR3) liegt, wurde

festgestellt, daß alle aufgetretenen Defekte durch die Transformation von OPR3 cDNA

aufgehoben werden können. Außerdem kann bei opr3-Pflanzen durch Applikation von

exogener Jasmonsäure die Fertilität wiederhergestellt werden, was mit OPDA nicht zu

erreichen ist. OPDA kann Jasmonsäure als chemisches Signal für die Antheren- und

Pollenreifung nicht ersetzen (Stintzi and Browse 2000). Desweiteren wurde nachgewiesen,

daß OPR1 und OPR2 nur in sehr geringem Ausmaß 9S,13S-OPDA reduzieren, wohingegen

OPR3 als einziges der drei Isoforme 9S,13S-OPDA sehr effizient reduziert (Schaller F et al.

2000, Strassner et al. 2002). Dies impliziert, daß OPR3 als relevantes Enzym für die Bildung

von Jasmonsäure verantwortlich ist, so daß Untersuchungen an der opr3-Mutante besonders

vielversprechend sind.

Untersuchungen an verwundeten und unverwundeten Blättern jeweils vom Wildtyp und von

opr3 zeigten, daß bei opr3 nach Verwundung keine erhöhte Jasmonsäureproduktion im

Vergleich zu unverwundeten Blättern stattfand, wohingegen beim Wildtyp 3 h nach

Verwundung eine stark erhöhte Jasmonsäuremenge gefunden werden konnte (Stintzi et al.

2001).

1 Einleitung 10 __________________________________________________________________________

Besonderheiten der opr3-Mutante (Stintzi and Browse 2000, Stintzi et al. 2001, Sanders et al.

1999):

• Das Gen für 12-Oxo-Phytodiensäure-10,11-Reduktase 3 ist durch zufällige Insertion

eines T-DNA-Inserts von ca. 17 kb außer Funktion gesetzt worden (s. Abb. 2).

Insert: t-DNA

Exon 4 Exon 3 Exon 2 Exon 1 Abb. 2: Molekulare Struktur des OPR3-Locus in der opr3-Mutante. Die Größenverhältnisse sind nicht repräsentativ. Das 17 kb T-DNA-Insert wird als Dreieck dargestellt. Exons sind als Rechtecke dargestellt, Introns als Linien zwischen den Exons. Die dickere Linie in Intron 2 repräsentiert ein Tnat1-ähnliches Transposon von 1,1 kb, welches im Ws-Ökotyp vorkommt, aber nicht im Columbia-Ökotyp.

• Nach Verwundung wird keine Jasmonsäure produziert, aber 50 % der normalen

OPDA-Menge (Stintzi et al. 2001).

• Solange die Blütenknospe noch geschlossen ist, entwickeln sich die Blütenorgane

normal, aber die Antherenfilamente verlängern sich nicht, um die Antheren oberhalb

des Stigmas zu positionieren.

• Zum Zeitpunkt, an dem die Blüte sich öffnet, findet kein gleichzeitiges Öffnen der

Antheren statt.

• Die Pollenkörner sind überwiegend nicht funktionsfähig, die Pollenkeimungsrate liegt

unter 4 %, im Gegensatz zu 97,6 % beim Wildtyp.

1 Einleitung 11 __________________________________________________________________________

1.5 Männlich sterile Mutanten in der

Signalkaskade downstream von Jasmonsäure

Im Gegensatz zu den Mutanten, die keine Jasmonsäure synthetisieren, zeigen diese Mutanten

keine Reaktion auf Jasmonsäure.

coi1-Mutante:

Das chloroseinduzierende Phytotoxin Coronatin ist ein Analogon zu Methyljasmonat und

verursacht dieselben Effekte, also gehemmtes Wurzelwachstum, erhöhte Anthocyanin-

akkumulation und eine stärkere Expression zweier Proteine von ca. 31 und 29 kD (Feys et al.

1994). Coronatininsensitive Arabidopsis thaliana-Mutanten (coi1) sind nicht nur un-

empfindlich gegenüber Coronatin (die o. g. Effekte sind hier nicht zu finden), sondern zeigen

ebenfalls keine Reaktion auf Jasmonsäure und verwandte Komponenten. Coi1-Mutanten sind

männlich steril, in logischer Konsequenz daraus, daß Jasmonsäure für die Fertilität wichtig ist

(zur Zeit dieser Untersuchungen noch nicht nachgewiesen), coi1 aber auf Jasmonsäure nicht

reagiert (Feys et al. 1994). Im Gegensatz zu opr3 kann die männliche Fertilität nicht durch

Jasmonsäureapplikation wiedererlangt werden. Desweiteren wurde festgestellt, daß die coi1-

Pflanzen abnormen Pollen produzierten. Es wurde vermutet, daß COI1 die Reaktion auf

Methyljasmonat beeinflußt und in der Blütenentwicklung eine Rolle spielt (Feys et al. 1994).

Das von COI1 codierte Protein enthält ein N-terminales F-Box-Motiv und eine LRR-Domäne

(leucine rich repeat) (Xie et al. 1998). F-Box-Proteine bilden zusammen mit Cullin und Skp1

die E3 Ubiquitinligase, die als SCF-Komplex bekannt ist (Turner et al. 2002, Bai et al. 1996).

COI1 hat also mit der Ubiquitinierung und Degradation von Faktoren zu tun, die die Reaktion

auf Jasmonsäure negativ regulieren (Review: Berger 2002). Vermutlich spielt die Degradation

von Proteinen eine große Rolle für die verschiedenen Signalprozesse im Leben von Pflanzen

(Review: Berger 2002). Man kann davon ausgehen, daß die Substanz, die der mit Hilfe von

COI1 gebildeten E3 Ubiquitinligase als Substrat dient, eine Schlüsselrolle bei der Jasmon-

säureregulation spielt (Turner et al. 2002).

1 Einleitung 12 __________________________________________________________________________

jar1-Mutante:

Die jar1-Mutante ist ebenfalls gegen Coronatin und Methyljasmonat resistent. Im Gegensatz

zu coi1 ist jar1 aber fertil. Es wird vermutet, daß es sich bei JAR1 nicht um eine Signaltrans-

duktionskomponente handelt, sondern wahrscheinlich um ein Enzym, welches Jasmonsäure

biochemisch modifiziert (Tiryaki and Staswick 2002, Staswick et al. 2002).

1.6 Jasmonsäure als Signalmolekül

Jasmonsäure induziert als Signalmolekül die Expression verschiedener Gene, die im

folgenden noch genauer erläutert werden. Dabei hat eine Proteinphosphatase aktivierende

Funktion, die Repression erfolgt durch eine Proteinkinase (Jensen et al. 2002, Rojo et al.

1998).

Obwohl opr3-Pflanzen keine Jasmonsäure bilden, konnte eine starke Resistenz gegenüber der

Diptere Bradysia impatiens und dem Pilz Alternaria brassicicola nachgewiesen werden. Die

Induktion der Wundreaktionsgene, von denen man bereits annahm, sie seien jasmonsäure-

abhängig, zeigte sich auch bei opr3, was zu der Vermutung veranlaßt, daß Cyclopentenone

zum Teil die Rolle von Jasmonsäure übernehmen können. Durch die Behandlung von opr3-

Pflanzen mit OPDA konnte eine starke Expression verschiedener Gene gezeigt werden

(Stintzi et al. 2001).

Es wird vermutet, daß durch die Perzeption von Jasmonsäure verschiedene Signalwege

ausgelöst werden können. Einer ist für die jasmonsäureabhängige Staminae- und

Pollenentwicklung verantwortlich, ein anderer ist für die jasmonsäureabhängige Streß- und

Verteidigungsreaktion zuständig und könnte außerdem auch durch OPDA induziert werden

(Stintzi et al. 2001, Turner et al. 2002). Für beide wurde hier gezeigt, daß sie COI1-abhängig

sind.

1 Einleitung 13 __________________________________________________________________________

Downstream von Jasmonsäure dürften die beiden Signalweg mit Hilfe von COI1 in Gang

gesetzt werden, bei einem dritten Weg könnte möglicherweise ein elektrophiler Effekt der

Cyclopentenone eine Rolle spielen. Einen Hinweis dafür, daß OPDA und/oder dnOPDA eine

genregulatorische Aufgabe hat, liefert die Beobachtung, daß OPDA unabhängig von COI1 die

Gene GST1, RNS1 and OPR1 aktivieren kann. Das hierfür benötigte Signalmolekül ist noch

nicht bekannt. Diese Gene können sowohl im Wildtyp als auch in opr3 durch Verwundung

induziert werden und sind nicht jasmonsäureabhängig (Stintzi et al. 2001).

Für die Feinabstimmung der Expression der Verteidigungsgene dürften Cyclopentenone und

Jasmonate gemeinsam und durch verschiedene, bisher noch nicht genau verstandene Wechsel-

wirkungen zusammenspielen.

Wenn auch der Octadecanoid-Biosyntheseweg bis zur Produktion von Jasmonsäure

inzwischen gut verstanden wird, so ist dennoch downstream von Jasmonsäure noch nicht

bekannt, wie die Signalübermittlung weiterläuft. Es wurden einige Proteine gefunden, die

unter verschiedenen Bedingungen von Jasmonsäure induziert werden, und die jetzt als

Markergene verwendet werden, um den Versuch zu unternehmen, die Jasmonsäure-

Signalkaskade zu verstehen. Am eindeutigsten identifiziert wurden MBP, AtVSP, Thi2.1 und

PDF1.2.

Bevor diese Proteine exprimiert werden, ist MPK4 zwischengeschaltet, eine Proteinkinase,

die 2 bis 5 min nach Verwundung induziert wird (Petersen et al. 2002). Mpk4-Mutanten

zeigen auch nach Jasmonsäurebehandlung keine Expression von PDF1.2 und Thi2.1. MPK4

trägt also zur Regulierung der Expression von den durch Jasmonsäure induzierbaren Genen

bei (Petersen et al. 2000).

Über die cex1-Mutante wurde nachgewiesen, daß AtVSP (vegetative storage protein), Thi2.1

(plant defense-related thionin) und PDF1.2 (defensin) bei konstitutiver Jasmonsäure-

expression akkumulieren, da sie ebenfalls konstitutiv exprimiert werden. Das Genexpressions-

muster der cex1-Mutante entspricht dem eines mit exogener Jasmonsäure behandelten

Wildtyps. Somit könnte CEX1 ein negativer Regulator des auf Jasmonsäure folgenden Signal-

1 Einleitung 14 __________________________________________________________________________

wegs sein (Xu et al. 2001). Einen weiteren Hinweis darauf, daß die Expression der o. g.

Proteine durch Jasmonsäure induziert wird, erhält man durch die Beobachtung, daß in der

jasmonsäureinsensitiven coi1-Mutante keines dieser Proteine exprimiert werden kann (Xu et

al. 2001, Xie et al. 1998).

In Arabidopsis thaliana wurden zwei verschiedene cDNAs für VSPs identifiziert. VSP1 und

VSP2 werden sowohl für die Differenzierung von Geweben als auch bei Verwundung

benötigt (Utsugi et al. 1998). Bei der Untersuchung einer cDNA-Bibliothek von mRNAs, die

hauptsächlich in Blütenorganen exprimiert werden, wurden Klone gefunden, die für VSPs

codieren. Diese VSP mRNAs wurden auch in sehr geringen Mengen in Blättern gefunden und

traten bei Verwundung in wesentlich höheren Konzentrationen auf (Utsugi et al. 1996).

Die Expression von MBP-Transkripten erfolgt in verschiedenen Geweben und zeigt v. a. eine

Reaktion auf Verwundung und auf Methyljasmonat (Taipalensuu et al. 1997). Transkripte des

MBP1- und MBP2-Gens werden ausschließlich und in reichlichen Mengen in Blüten

exprimiert, wurden aber nicht bei coi1 gefunden. In unreifen Blüten sind MBP mRNAs in

hohen Konzentrationen vorhanden, und zwar vor allem in den reproduktiven Organen, also im

Gynoeceum und in den Staminae (sowohl in Antheren als auch im Filament). MBP hängt mit

dem Glucosinolat-System zusammen, bei dem Glucosinolate von Myrosinaseenzymen

(Thioglucosidasen) hydrolisiert werden, um Substanzen mit einem weitreichenden Spektrum

biologischer Aktivitäten herzustellen, die für die Pathogenabwehr wichtig sind (Capella et al.

2001).

PDF1.2 wird gemeinhin als Marker verwendet, um die jasmonatabhängigen Verteidigungs-

mechanismen zu charakterisieren. Beim PDF1.2-Promoter hat eine GCC-Box die Schlüssel-

rolle, um die PDF1.2-Reaktion auf Jasmonate auszulösen. In diesem Zusammenhang wurde

der Transkriptionsfaktor AtERF2 (ethylene response factor) identifiziert, der die Trans-

kription von PDF1.2, Thi2.1 und PR4 (basic chitinase) aktiviert.

1 Einleitung 15 __________________________________________________________________________

Diese sind alle im Besitz einer GCC-Box im Promoter. Die ERFs scheinen also nicht nur für

den Ethylen-Signalweg wichtig zu sein, sondern durch die Interaktion mit der GCC-Box auch

für die Regulierung der Gene, die downstream von Jasmonsäure ihren Wirkungsbereich haben

(Brown et al. 2003). Wie die verschiedenen Signalkaskaden, die bei den physiologischen

Abläufen in Pflanzen in Aktion treten, untereinander wechselwirken, ist noch weitgehend

ungeklärt.

Thionine sind basische, cystein-reiche Peptide mit toxischen und antibakteriellen Eigen-

schaften. Thi2.1 kann in Arabidopsis thaliana-Samen durch Methyljasmonat, Verwundung,

Silbernitrat, Coronatin und Sorbitol induziert werden, was zu einer lokalen und systemischen

Expression führt. Für alle diese Fälle konnte nachgewiesen werden, daß die Thi2.1-Induktion

über den Octadecanoid-Signalweg erfolgte. An coi1-Mutanten konnte keine Expression

festgestellt werden (Bohlmann et al. 1998).

Bei der Charakterisierung von 10 cet-Mutanten (constitutive expression of Thi2.1) mit

Mutationen in 5 verschiedenen Loci wurde gezeigt, daß bei einigen eine bis zu 40fache

Überproduktion von OPDA und Jasmonsäure vorlag, andere hatten diesselben Werte wie

Wildtyp-Pflanzen. Zwei Mutanten zeigten eine starke Induktion sowohl des Jasmonsäure-

Signalwegs als auch des Salicylsäuresignalwegs. Es konnte nachgewiesen werden, daß Thi2.1

und Pdf1.2 unabhängig voneinander aktiviert wurden, was eher überrascht, da beide durch

Jasmonsäure induziert werden. Desweiteren konnten spontan auftretende Nekrosen (Zelltod)

beobachtet werden, die oft mit einer Aktivierung des SAR-Signalwegs (systemic acquired

resistance) in Verbindung stehen (Hilpert et al. 2001). Wie die involvierten Signalwege

miteinander interagieren, müssen zukünftige Untersuchungen genauer klären. Die

unabhängige Aktivierung von Thi2.1 und Pdf1.2 läßt vermuten, daß sich der Signalweg

downstream von Jasmonsäure aufgabelt und verschiedene Komponenten von Jasmonsäure

induziert werden.

1 Einleitung 16 __________________________________________________________________________

Über DDRT-PCR (differential display reverse transcription-polymerase chain reaction) wurde

nachgewiesen, daß in jasmonsäurebehandelten opr3-Antheren mindestens vier Gene induziert

werden: Lipoxygenase, desweiteren ein bHLH Transkriptionsfaktor, ein Epithiospecifier-

Protein sowie ein unbekanntes Protein. Vermutlich spielen diese Proteine im Jasmonsäure-

Signalweg und bei einigen Entwicklungsschritten ebenfalls eine Rolle. Vier weitere Proteine,

die erst etwas später induziert werden, ein extensin-ähnliches Protein, ein Peptid-

Transportmolekül und zwei unbekannte Proteine, könnten ebenfalls für die Reifung von

Antheren und Pollen wichtig sein (Mandaokar et al. 2003).

1.7 Crosstalk

Im vorherigen Kapitel wurde bereits angedeutet, daß die verschiedenen Signalkaskaden

miteinander interagieren, und daß die Art und Weise wie dies geschieht, bisher noch in

keinster Weise durchschaubar ist. Wenn schon die hochkomplizierten Abläufe der einzelnen

Signalkaskaden nur mit größtem Aufwand herausgefunden werden können, so wird es durch

deren Interaktion nicht gerade überschaubarer. Beim Versuch, sich an einen diesbezüglichen

Erkenntnisgewinn zumindest anzunähern, konnten aber doch einige interessante Infor-

mationen gewonnen werden.

Bei der Regulierung von Verteidigungsmechanismen und Wundantwort interagieren

Jasmonsäure und Ethylen, die in Arabidopsis thaliana beide bei Verwundung oder Pathogen-

befall gebildet werden. Sowohl Mutanten, die im Octadecanoid-Signalweg gestört sind, als

auch solche, die im Ethylen-Signalweg gestört sind, zeigen gegenüber Pathogenbefall eine

stark erhöhte Anfälligkeit. Offensichtlich sind beide Signalkaskaden für die Resistenz not-

wendig. Der synergistische Effekt könnte durch die Interaktion vieler verschiedener Gene, die

für Abwehrproteine codieren, zustande kommen, z. B. PR5, PDF1.2, und CHI-B (Ellis und

Turner 2001). Wie dies aber genau geschieht, ist momentan noch nicht nachvollziehbar. Im

Falle von VSP wurde gezeigt, daß in ethyleninsensitiven Mutanten die Expression höher ist,

1 Einleitung 17 __________________________________________________________________________

der Ethylensignalweg also die Induktion von VSP unterdrückt. Hier zeigt sich, daß der sonst

synergistische Effekt im Gegenteil auch antagonistische Auswirkungen haben kann (Ellis und

Turner 2001).

Die cev1-Mutante (constitutive expression of VSP1) hat eine erhöhte Jasmonat- und

Ethylenproduktion, eine konstitutive Expression von Streßreaktionsgenen und ist resistent

gegenüber Pilzbefall. CEV1 wird hauptsächlich in Wurzelgewebe exprimiert und die Wurzeln

von cev1 enthalten halb so viel Cellulose wie Wildtyp-Wurzeln. Es wurde nachgewiesen, daß

es sich bei CEV1 um die Cellulose-Synthase CeSA3 handelt. Eine weitere Mutante, rsw1, die

ebenfalls eine Mutation in der Cellulose-Synthase ausweist, hatte eine konstitutive Expression

in VSP (Ellis et al. 2002). Wie die Cellulose-Synthase den Jasmonsäure- und Ethylen-

Signalweg beeinflussen kann, ist noch nicht klar, aber offensichtlich besteht ein

Zusammenhang.

Ein Zusammenhang zwischen dem Jasmonsäure- und dem Ethylen-Signalweg zeigt sich auch

bei der Aktivierung von ERF1 (ETHYLENE RESPONSE FACTOR), der dazu beiträgt, das

Fortschreiten von Krankheiten zu verhindern. Eine schnelle Expression von ERF1 kann

sowohl von Ethylen als auch von Jasmonat einzeln oder synergistisch ausgelöst werden. Eine

Mutation in nur einem der beiden Signalwege verhindert bereits die Induktion von ERF1.

ERF1 reguliert vermutlich die Expression vieler Gene, die auf Ethylen oder Jasmonsäure

reagieren und agiert als Schlüsselelement downstream vom Knotenpunkt zwischen den beiden

Signalwegen (Lorenzo et al. 2003).

Ethylen beeinflußt auch die Antherenentwicklung, insbesondere die Pollenfreisetzung. Bei

ethyleninsensitiven Mutanten wurde nachgewiesen, daß bei diesen zwar eine normale

Entwicklung der Ovarien abläuft, jedoch das Öffnen der Antheren erst mit beträchtlicher

Verspätung stattfindet, so daß der freigesetzte Pollen nicht mehr zur Befruchtung führen kann.

Bei diesen Mutanten kann Ethylenbehandlung zu einer wiederum beschleunigten

Pollenfreisetzung führen. Man kann davon ausgehen, daß Ethylen einen Prozess in Gang

setzt, der in den Antheren direkt vor der Pollenfreisetzung stattfindet (Rieu et al. 2003).

1 Einleitung 18 __________________________________________________________________________

Außerdem wurde an Petunia inflata nachgewiesen, daß die Bestäubung eine Ethylen-

produktion im Stempel verursacht, was bei der Entwicklung des Pollenschlauchs eine Rolle

spielt (Holden et al. 2003).

Ein weiteres Beispiel für crosstalk ist bei der oben bereits erwähnten cet-Mutante zu finden.

Diese wurde für Kreuzungen verwendet, um verschiedene Doppelmutanten mit anderen

Mutanten (z. B. triple fad und coi1) anzufertigen. Bei deren Charakterisierung zeigte sich, daß

die CET-Gene in einer Signalkaskade an einer Stelle agieren, an der sich eine Abzweigung

sowohl zum Jasmonsäuresignalweg als auch zum salicylsäureabhängigen SAR-Signalweg

befindet (Nibbe et al. 2002).

Unsere Herangehensweise, mit der wir versuchen wollen, die Jasmonsäure-Signalkaskade zu

verstehen, unterscheidet sich von den Methoden, die bisher angewandt wurden, um die cet1-

und cev1-Mutanten zu erhalten. In diesen Arbeiten wurde ein jasmonatabhängiger Promoter

(Thionin oder VSP) verwendet, um die Expression eines Reportergens in Gang zu setzen.

Dann, nach Mutagenisierung dieser transgenen Linien, wurde versucht, Pflanzen zu identi-

fizieren, in denen die Expression des Reportergens verändert ist. Wir halten es für

vielversprechender, durch Suppressormutationen in jasmonsäuredefizienten Pflanzen den

Wildtyp-Phänotyp wiederherzustellen, anstatt einer geänderten Genexpression zu folgen.

1 Einleitung 19 __________________________________________________________________________

1.8 Genetische Suppressoren von opr3 werden

eingesetzt, um die Jasmonsäure-Signalkaskade

besser zu verstehen

Da in der opr3-Mutante keine Jasmonsäure gebildet wird, ist die Signalkaskade, die für eine

korrekte Staminae- und Pollenentwicklung verantwortlich ist, downstream von Jasmonsäure

abgeschaltet. Durch die Herstellung von Suppressoren, die durch eine zweite Mutation wieder

fertil sind, muß trotz Abwesenheit von Jasmonsäure die Signalkaskade wieder angeschaltet

sein. In der vorliegenden Arbeit wurden genetische Suppressoren des opr3-Phänotyps

charakterisiert. Diese Charakterisierung erfolgte auf 2 Plattformen; zunächst wurde eine

phänotypische Charakterisierung vorgenommen, desweiteren erfolgte eine molekulare

Charakterisierung.

2 Material und Methoden 20 __________________________________________________________________________

Kapitel 2 Materialien und Methoden

2.1 Materialien 2.1.1 Enzyme, Puffer, Chemikalien, Lösungen DNA-Extraktion aus Pflanzenmaterial DEX-Puffer 0,14 M Sorbitol

0,22 M Tris-HCl, pH 8,0 (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan) 0,222 M EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) 0,8 M NaCl 0,8 % CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) 1 % Sarcosine auf 100 ml aufgefüllt Direkt vor der Extraktion wurden 20 µl β-Mercaptoethanol pro ml DEX hinzugegeben.

Gelelektrophorese 50 x TAE-Puffer 242 g Tris HCl (TAE = Triacetat-EDTA) 57,1 ml CH3COOH 100 ml 0,5 M EDTA pH 8 mit H2O auf 1 l aufgefüllt EtBr wird nach Verdünnen der konzentrierten Lösung zugegeben 14 µg/l 0,8 % Agarose Gel (200 ml) 1,6 g Agarose 200 ml TAE-Puffer (1x)

2 Material und Methoden 21 __________________________________________________________________________ 1,0 % Agarose Gel (200 ml) 2 g Agarose 200 ml TAE-Puffer (1x) 1,2 % Agarose Gel (200 ml) 2,4 g Agarose 200 ml TAE-Puffer (1x) RNA-Extraktion für Mengen ab 1 g Extraktionspuffer (200 ml): 0,2 M Na-tetra-Borat (Borax), pH 9

30 mM EGTA (EGTA = Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)- N,N,N’,N’-tetraacetic acid) 1 % SDS (SDS = Natriumlaurylsulfat) auf 200 ml aufgefüllt und autoklaviert 5 mM DTT (Dithiothreitol)

DTT wurde in 10 ml DEPC-behandeltem Wasser (Diethylpyrocarbonat) gelöst filtersterilisiert, davon wurde 1 ml pro 100 ml Puffer zugegeben. Die Aliquots wurden bei – 20 °C aufbewahrt. EDTA (stock solution), 500 mM 18,612 g auf 100 ml aufgefüllt pH 8 (EDTA geht nur bei pH 8 in Lösung) davon 4 ml in 200 ml Puffer für RNA-Fällung

(= 10 mM) Puffer für RNA-Fällung (200 ml) 4 M LiCl

10 mM EDTA (4 ml aus 500 mM stock solution)

Waschpuffer 2 M LiCl

5 mM EDTA (aus Puffer für RNA-Fällung 1 : 1 mit DEPC- H2O verdünnt)

RNA-Extraktion mit Trizol (nach dem Protokoll des Herstellers) Trizol Invitrogen RT-PCR DNaseI (RNAse-frei) Stratagene, 10 U/µl Oligo (dT) 500 µg/ml dNTPs Fermentas, 10 mM

2 Material und Methoden 22 __________________________________________________________________________ Taq-PCR-Puffer (5 x) 15 mM Mg2+

100 mM (NH4)2SO4 0,08 % Triton 20 % DMSO 250 mM KCl 50 mM Tris/HCl pH 8,3 0,1 M DTT Reverse Transkriptase: Fermentas, 200 U/µl Revert AidTM M-MuLV Elution des Vektorfragments QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN Mini-Präparation von Vektor-DNA Lösung I (50 ml) 25 mM Tris/HCl, pH 7,5 50 mM Glucose 10 mM EDTA Lösung II (25 ml) 0,2 N NaOH 1 % SDS Lösung III (100 ml) 3 M Kaliumacetat: 60 ml 5 M Kac 11,5 ml Eisessig 28,5 ml H2O Lösung IV (50 ml) 3 M Natriumacetat pH 5,2 (mit Eisessig eingestellt) TE-Puffer (100 ml) 10 mM Tris/HCL ph 8,0 1 mM EDTA RNase, pankreatisch (1 ml) Roth

10 mg/ml in TE 10 min bei 85 °C inkubiert (zum Inaktivieren von DNasen) Proteinase K (1 ml) Roth

10 mg/ml H2O

2 Material und Methoden 23 __________________________________________________________________________ Restriktionsverdau SalI (10 U/µl) Fermentas NotI (10 U/µl) Fermentas Puffer 0+ Fermentas Northern Blot Gelpuffer 10x MOPS (500ml) 0,4 M MOPS (4-Morpholinpropansulfonsäure) 100 mM NaOAc 10 mM EDTA mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt autoklaviert Ladepuffer (1 ml) 50 % Glycerol 1 mM EDTA 0,03 % Bromphenolblau autoklaviert 20x SSC 175,3 g NaCl (Salt-Sodium-Citrat) 88,2 g NaCitrat 800 ml ddH2O mit 10M NaOH auf pH 7,0 eingestellt mit ddH2O auf 1 l aufgefüllt Formaldehydgel 1,56 g Agarose (1,2 %) 93,6 ml ddH2O erhitzt 13 ml 10x Gelpuffer 23,4 ml Formaldehyd RNA-Proben 5,5 µl RNA + H2Ofst 1 µl 10x Gelpuffer 3,5 µl Formaldehyd 10 µl Formamid für 15 min auf 65 °C erhitzt, auf Eis abgeschreckt, zentrifugiert 2 µl Ladepuffer 0,2 µl EtBr 50 x Denhardt’s 5 g Ficoll 5 g Polyvinylpyrrolidon 5 g Rinderserumalbumin (BSA) mit ddH20 auf 500 ml

2 Material und Methoden 24 __________________________________________________________________________ Hybridisierungslösung 50% Formamid 5x SSC 50 mM KPP pH 7.0 2x Denhardt’s sss DNA 100 µg/ml 0,5 % SDS Lösung 1 1x SSC 0,5 % SDS Lösung 2 0, 2 SSC 0,5 % SDS Verschiedenes Primer-Oligonucleotide QIAGEN Phenol/Chloroform Mischungsverhältnis 1 : 1 6x DNA-Probenpuffer 0,25 % w/v Bromphenolblau 0,25 % w/v Xylencyanol FF 30 % Glycerin in Wasser Oberflächensterilisation 70 % EtOH, 10 min von Arabidopsis thaliana-Samen abgesaugt

50 % Natriumhypochlorid ca. 2 Tropfen Tween 20 zugegeben, 15 min

5 x in H2Ost. gewaschen in 500 µl sterilen 0,1 % Agar 2.1.2 Primer OPR3-2int403R cgacaaaagccgtttattaaacagtacag 12OPDAR.ATG (55) atgacggcggcacaagggaactc KFLB135 (LB) atgcatagatgcaccgaaatcagcca EF1α;1202R ggctccttctcaatctccttaccagaac EF1α;817 ccagtgggacgtgttgagactggtatga -36VSP2 atcacaaactaaacaataaaccataccat 824VSP2R ggacaatgcgatgaagatagattcttaag -26MBP2 tcagggtattttctgaagttaaagataga MBP2-2359R accatggtccatggacgttatttaacgga -26WIMBP cagatagataaaagaagtcaacaacgatg WIMBP3039R aaagtgtgtaaactatcatcaaaagatac -25OPR1 tcatcaacagttttttacaaaagaaatg TAA OPR1 R aacacactacattacattattgataaca

2 Material und Methoden 25 __________________________________________________________________________ 2.1.3 Medien MS-Medium 4,4 g MS-Fertigmedium, Duchefa (Murashige und Skoog) mit ddH2O auf 1 l aufgefüllt pH 5,8 30 g Saccharose 8 g Agar autoklaviert MSKan Agar MS-Medium (für Petrischalen) 750 µl einer Kanamycin-Stammlösung

(100 mg/ml) zugegeben Pollenkeimungsmedium 17 % Saccharose 1,65 mM Borsäure 2 mM CaCl2 0,6 % Agar (Duchefa) pH 7 (KOH) LBAmp Agar 20 g LB Broth (Duchefa)

12 g Agar (Duchefa) ddH2O ad 1 Liter autoklaviert (20 min) bei Gießtemperatur Zugabe von 1 ml Ampicillin (Duchefa) – Stocklösung

(100 mg/ml, sterilfiltriert) steril in Petrischalen abgefüllt LBAmp Medium 20 g LB Broth (flüssig) ddH2O ad 1 Liter autoklaviert (20 min) Zugabe von 1 ml Ampicillin-Stocklösung 2.1.4 Geräte und Kits Zentrifuge Sorvall® RC 5B Plus Rotoren Sorvall® Type SS-34

Sorvall® Type HS-4 Elektrophoresegerät EasyCast Electrophoresis Systems (für Agarosegele) Owl Scientific, Inc.

2 Material und Methoden 26 __________________________________________________________________________ UV-Vis Photometer CaryVarian Transfer-Membran Nitrozellulose Membran, Schleicher & Schuell Vakuumrotator Savant QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 2.1.5 Bakterienstämme und Vektoren E. coli 37F10 Glycerin-Stock bluescript (pSport) Insert: AT5G44420 (= PDF1.2)


2.2 Methoden 2.2.1 Anzucht der Pflanzen

Samen der jeweiligen Linien wurden in einem Eppendorf-Gefäß in 0,1%igem Agar suspen-

diert und 24 – 72 h bei 4 °C vernalisiert. Anschließend wurden sie auf gedämpfter Erde

ausgebracht und im Gewächshaus unter einer Plastikabdeckung belassen, bis die Keimlinge 4

Blätter hatten. Dann wurde die Abdeckung entfernt.

Vom wt ws, von der opr3- Mutante, der aos-Mutante und den Suppressoren 10, 17.1, 18,

21.2, 22 und 24 wurden über ca. 6 Monate hinweg alle 14 Tage 24 Pflanzen angezogen.

Als Wachstumsbedingungen wurden 22°C und ein Rhythmus von 16 h Tag/8 h Nacht

angestrebt. Im Gewächshaus traten jedoch jahreszeitlich- und wetterbedingte Schwankungen

auf.

2.2.2 Ernten von Blatt-und Blütenmaterial

Das verwendete Blatt- und Blütenmaterial wurde sofort nach Entfernen von der Pflanze mit

Flüssigstickstoff schockgefroren und danach entweder sofort verwendet oder bis zur

Verwendung im – 80 °C-Gefrierschrank aufbewahrt. Besonders bei dem für RNA-Extrak-

tionen verwendeten Material wurde darauf geachtet, daß keine zeitliche Verzögerungen bis

zum Einfrieren eintraten, um Verfälschungen des Ergebnisses zu vermeiden, da mRNA nach

Verwundung sehr schnell gebildet wird.


2.2.3 DNA-Extraktion

Ca. 10 mg Blattmaterial wurden in ein Eppendorfgefäß gegeben. Es wurde entweder

Frischmaterial oder bei – 80 °C eingefrorenes Material verwendet. Die Eppendorfgefäße

wurden in Flüssigstickstoff gestellt und das gefrorene Material zunächst mit einem

Plastikpistill feingerieben.

Dann wurden 100 µl DEX-Puffer zugegeben und das Gewebe mit dem Plastikpistill (der

vorher in Flüssigstickstoff gekühlt worden war) zerrieben. Anschließend wurden 100 µl

Chloroform zugegeben, 10 s durchmischt und bei 65 °C für 30 min inkubiert. Die Proben

wurden 5 min zentrifugiert und die obere, wässrige Phase in ein neues Eppendorfgefäß

überführt. Mit einem gleichgroßen Volumen Isopropanol (100 µl) wurde bei Raumtemperatur

präzipitiert. Danach wurden die Proben nochmals zentrifugiert (bei 14000 g für 5 min). Der

Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde einmal in 70%igem EtOH (300 µl) gewaschen

und der Überstand abgekippt. Eventuell noch vorhandenes restliches Ethanol wurde

abpipettiert. Dann wurde das Pellet getrocknet und anschließend in 30 µl filtersterilisiertem

Wasser resuspendiert.

2.2.4 Kanamycintest und Kontroll-PCR

Die opr3-Mutante weist in OPR3 ein Insert auf, welches eine Kanamycinresistenz trägt. Um

nachzuweisen, daß die Suppressoren nach wie vor homozygot das Insert in OPR3 tragen,

wurden alle verwendeten Suppressoren-Linien auf ihre Kanamycinresistenz getestet. Dazu

wurden jeweils mindestens 100 Samen oberflächensterilisiert und auf MSKan-Platten

ausgebracht. Nur wenn keine sensitiven Pflanzen zu finden waren, konnte die Linie

weiterverwendet werden.


Um sicherzugehen, daß es sich bei vereinzelt auftretenden sensitiven Pflanzen nicht um

Kontaminationen handelt (falscher Samen oder von anderweitigen transgenen Pflanzen

eingeflogenes Pollenkorn), wurde parallel dazu eine PCR ausgeführt, bei der folgende

Primerpaare verwendet wurden:

LB und opr3 int

opr3 int und 55

Bei einem echten Suppressor erscheint in der ersten Spur eine Bande von 1,235 kb, in der

zweiten Spur ist keine Bande zu erkennen, weil das Fragment mit dem T-DNA-Insert mehr

als 17 kb hätte, was natürlich nicht amplifiziert werden kann. Wenn hier nur eine Bande

auftrat, war die Mutation in opr3 homozygot und mit diesen Linien konnte weitergearbeitet

werden.

2.2.5 Nachweis über das homozygote Vorhandensein der

Mutation, die die Suppression des opr3-Phänotyps auslöst

Wenn die Mutation, die die Suppression des opr3-Phänotyps auslöst, heterozygot wäre, würde

eine Segregation von 3 : 1 (fertile : sterile Pflanzen) stattfinden, d. h. von 24 Pflanzen wären

ca. 6 Pflanzen steril. Über ca. 6 Monate wurden von den sechs untersuchten Suppressoren alle

14 Tage je 24 Pflanzen angepflanzt. Nur wenn alle Pflanzen fertil waren, konnte die Linie

weiterverwendet werden.

2.2.6 Blütenentwicklung

Um festzustellen, wann bei den Suppressoren die Pollenfreisetzung stattfindet, wurden jeweils

die ersten 3 – 4 geöffneten Blüten des Haupttriebes von einer Pflanze jeder Suppressorlinie

untersucht. Dazu wurden Sepalen und Petalen wegpräpariert. Die Blüten wurden unter dem

Mikroskop so fotografiert, daß erkennbar war, bei welcher Blüte der Pollen bereits frei-

gesetzt war. Zum Vergleich wurden auch je eine Pflanze vom Wildtyp ws und von opr3

untersucht.


2.2.7 Pollenkeimung

Um den Prozentsatz der keimfähigen Pollen für die verschiedenen Suppressoren festzustellen,

wurde Pollen auf Pollenkeimungsmedium ausgebracht. Dazu wurden von jeder Linie jeweils

die ersten drei geöffneten Blüten, die bereits Pollen freigesetzt hatten, verwendet. Pro Linie

wurden vier Pflanzen ausgewertet, so daß pro Linie die Daten von 12 Blüten zur Verfügung

stehen. Als Vergleich wurden wt ws-Pflanzen und opr3-Pflanzen mit ausgewertet. Vom

Wildtyp wurden nur 2 Pflanzen ausgewertet, also 6 Blüten.

Um den Pollen auftragen zu können, wurden die Sepalen, Petalen und das Gynoeceum

wegpräpariert. Die Staubblätter wurden dann unter einem Binocular vorsichtig auf das

Medium aufgetupft, so daß der Pollen freigesetzt wurde (ca. 200 Pollenkörner pro Blüte). Die

Staubblätter wurden anschließend wie ein Pinsel verwendet, um die Pollenkörner auf eine

Fläche mit ca. 1 cm Durchmesser zu verteilen. Die Platten wurden geschlossen und 24 h bei

Tageslicht stehengelassen.

Am nächsten Tag wurden für jede Blüte die Gesamtzahl der Pollen sowie die Zahl der

gekeimten Pollen ausgezählt. Für jeweils alle Blüten aus einer Linie wurden diese Werte

aufaddiert und die Prozentsätze berechnet. Für jede Linie wurde ein repräsentatives Foto

gemacht.

2.2.8 Beobachtungen an der phänotypischen Entwicklung der

Pflanzen

Vom Wildtyp ws, der opr3-Mutante und den Suppressoren 10, 17.1, 18, 21.2, 22 und 24

wurden jeweils 10 durchschnittliche Pflanzen ausgewählt, um die folgenden Parameter zu

untersuchen:

• Länge des Haupttriebs, Ø nach 50 Tagen

• Blühbeginn nach wie vielen Tagen

• Erste Schote öffnet sich nach wie vielen Tagen

Die Pflanzen wurden täglich untersucht. Die Länge des Haupttriebs wurde nach 50 Tagen

exakt ausgemessen.


2.2.9 Kreuzungen

Beim maternalen Kreuzungspartner wurden von den drei am weitesten entwickelten noch

geschlossenen Blüten Sepalen, Petalen und Staminae entfernt. Beim paternalen Kreuzungs-

partner wurden von den drei jüngsten schon geöffneten Blüten Sepalen, Petalen und

Gynoeceum entfernt. Diese Blüten befanden sich mindestens in Stadium 12, so daß die

Antheren bereits geöffnet waren und Pollen freigesetzt hatten. Um diesen Pollen für die

Kreuzung zu nutzen, wurden die Antheren der an der paternalen Blüte verbliebenen Staminae

auf das an der maternalen Blüte verbliebene Gynoeceum aufgetupft. Anschließend erhielt das

bestäubte Gynoeceum eine Plastikhülle, um das Einfliegen weiterer Pollenkörner von anderen

Pflanzen zu verhindern und um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu erhalten.

2.2.10 RNA-Extraktion

Die RNA-Extraktionen wurden je nach Menge des jeweils vorhandenen Materials nach zwei

verschiedenen Methoden ausgeführt. Für größere Mengen ist die Extraktion mit der längeren

Methode geeignet. Für kleine Mengen (z. B. bei Extraktion aus Blütenmaterial, von dem nicht

viel vorhanden ist) ist diese Methode nicht geeignet, deshalb wurde mit der Trizol-Methode

extrahiert, die aber meist nicht so sauber ist wie die andere Methode. Für beide Methoden

wurde nur autoklaviertes Laborzubehör verwendet, um Kontakt des Materials mit RNase zu

verhindern.

Nach der Extraktion wurde die Ausbeute durch OD260-Messung bestimmt (1 OD260 = 40

µg/ml RNA).


RNA-Extraktion für Mengen ab 1 g

Das Blattmaterial wurde in flüssigem Stickstoff fein zermörsert. Dann wurden 2,5 ml

Extraktionspuffer (50 °C) je Gramm Frischgewicht zugegeben und weiter gemörsert. Die

entstandene Flüssigkeit wurde in ein Oak Ridge-Gefäß überführt und 20 min bei 14000 g mit

dem SS-34 Rotor bei 4 °C zentrifugiert. Dann wurde der Überstand abgenommen, in ein

Falcon-Gefäß überführt, mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform-Gemisch (1 : 1) ver-

setzt und während 5 min stark geschüttelt. Daraufhin wurde nochmals 20 min zentrifugiert,

diesmal bei 4000 rpm und 4 °C. Die obere wässrige Phase wurde nochmals in ein Falcon-

Gefäß überführt und mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform-Gemisch (1 : 1) versetzt,

nochmal 5 min geschüttelt und widerum zentrifugiert. Anschließend wurde die obere wässrige

Phase abgenommen, in ein neues Falcon-Gefäß überführt und das gleiche Volumen

Chloroform zugegeben. Das Falcon-Gefäß wurde wieder 5 min stark geschüttelt und 20 min

bei 4000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde abgenommen, in ein Oak

Ridge-Gefäß überführt und mit einem Volumen kaltem Puffer für RNA-Fällung versetzt. Nun

wurde die Probe auf Eis gestellt und über Nacht im Kältelabor bei 4 °C gefällt.

Am nächsten Tag erfolgte eine Zentrifugation von 30 min bei 12.000 rpm bei 4 °C. Der

Überstand wurde verworfen und das Pellet mit Waschpuffer gewaschen. Daraufhin wurde 30

min bei 12000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde wieder verworfen. Das Pellet

wurde in 200 µl ddH2O gelöst und in ein Eppendorf-Gefäß überführt. Daraufhin erfolgte die

Fällung mit 1/50 Volumen NaCl (5 M) und 2,5fachem Volumen 95%igem EtOH. Die Probe

wurde 30 min auf Eis gestellt und anschließend 25 min bei 14000 rpm und 4 °C zentrifugiert.

Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 75%igem EtOH gewaschen. Danach

wurde 5 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dann wurde nochmal kurz

zentrifugiert und das restliche EtOH vorsichtig abpipettiert. Das Pellet wurde getrocknet und

in 40 µl DEPC-behandeltem Wasser gelöst. Die Lagerung der RNA erfolgte bei – 80 °C.


RNA-Extraktion mit Trizol

Die Probe wurde mit 1 ml Trizol pro 50 – 100 mg Pflanzenmaterial homogenisiert, 5 min bei

Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert. Der Überstand wurde weiterverwendet und mit

0,2 ml Chloroform per ml Trizol versetzt. Die Probe wurde für 15 s stark geschüttelt und für 3

min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde für 15 min bei 12000 rpm und 4 °C

zentrifugiert. Die obere wässrige Phase, in der sich die RNA befand, wurde in ein neues

Eppendorf-Gefäß überführt. Nun wurden 0,5 ml Isopropanol pro ml Trizol zugegeben und für

10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde für 10 min bei 12000 rpm und 4

°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 75%igem EtOH

gewaschen. Dazu wurde 1 ml 75%iges EtOH pro verwendetem ml Trizol verwendet. Die

Probe wurde durchmischt und für 5 min bei 7500 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand

wurde verworfen und das Pellet getrocknet. Am Schluß wurde das Pellet in DEPC-

behandeltem H2O gelöst. Um die schwerlösliche RNA besser lösen zu können, wurde sie für

10 min bei 55 °C inkubiert.

2.2.11 RT-PCR zur Herstellung von cDNA aus RNA und Testgel

Um sicherzustellen, daß in der PCR ausschließlich cDNA als Matritze vorliegt, mußte

zunächst die in der RNA evtl. noch vorhandene DNA beseitigt werden (DNA-Verdau). Dazu

wurde die für die RT-PCR verwendete RNA (1,5 bis 5 µg) mit 0,5 µl DnaseI (RNAse-frei)

versetzt und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Dann wurde die Dnase bei 75 °C für 15 min hitze-

inaktiviert. Anschließend wurde die Reverse Transkription wie folgt durchgeführt:


Es wurden 0,33 µl Oligo (dT) aus einer 500µg/ml-Stammlösung und 1 µl 10 mM dNTPs

dazugegeben und mit Wasser auf 12 µl aufgefüllt. Dann wurde bei 65 °C für 5 min inkubiert.

Anschließend erfolgte die Zugabe von 4 µl 5x First Strand Buffer und von 2 µl 0,1m DTT.

Bei 37 °C wurde für 2 min inkubiert und anschließend 1 µl Reverse Transkriptase (MLV)

zugegeben. Nun wurde bei 37 °C für 50 min inkubiert. Dann wurde bei 70 °C für 15 min

inkubiert, um die Reverse Transkriptase zu inaktivieren.

2.2.12 PCR auf cDNA

Die cDNA wurde auf eine eventuelle Expression von Myrosinase Binding Protein (MBP, 2,4

kb), Wound Inducible Myrosinase Binding Protein (WIMBP, 3 kb), Vegetative Storage

Protein (VSP, 860 bp) und OPR1 (1,2 kb) untersucht. Für den PCR-Ansatz wurde jeweils 1 µl

cDNA verwendet. Zusätzlich zum Primerpaar des jeweils untersuchten Proteins wurde als

interner Standard das Primerpaar für den Elongation Factor (EF, 400 bp) verwendet.

2.2.13 Mini-Präparation von Vektor-DNA

37F10-Klone von E. coli, die einen bluescript-Vektor mit einem PDF1.2-Insert (cDNA)

enthalten, wurden auf einer LBAmp-Platte ausplattiert und über Nacht inkubiert.

Aus 6 Kolonien wurden je 2,5 ml LBAmp Flüssigmedium angeimpft. Diese wurden mit 220

rpm bei 37 °C über Nacht inkubiert. Um die Plasmid-DNA zu erhalten, wurde eine

Minipräparation ausgeführt.

1,5 ml der Über-Nacht-Kultur wurden in Eppendorf-Gefäße überführt und 2 min bei

Raumtemperatur abzentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand verworfen; das Pellet

wurde in 100 µl Lösung I resuspendiert. Nach Zugabe von 150 µl Lösung II wurden die

Proben 5 min auf Eis inkubiert. Dann wurden 150 µl Lösung III zugegeben und nochmals 5

min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde 5 min bei Raumtemperatur abzentrifugiert und der


Überstand in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt. Es folgte eine Ethanolfällung, indem das

zweifache Volumen EtOH zugegeben wurde, 15 min bei – 22 °C inkubiert wurde und 15 min

bei 4 °C abzentrifugiert wurde. Das Pellet wurde in 200 µl TE gelöst, mit 1 µl pankreatischer

RNase versetzt und 30 min bei 37 °C inkubiert. Es wurden 4 µl 10% SDS und 2 µl Proteinase

K (10 mg/ml) zugegeben und 30 min bei 37 °C inkubiert. Nun wurde mit 200 µl

Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert, dann mit 200 µl Chloroform. Nach dem Ausschütteln und

abzentrifugieren (2 min bei voller Drehzahl) wurde die Oberphase vorsichtig abpipettiert und

in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt. Es folgte eine weitere Ethanol-fällung; dazu wurden

1/10 Volumen Lösung IV und das 2,5fache Volumen EtOH zugegeben und 30 min bei – 20

°C inkubiert, bei 4 °C abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Niederschlag wurde

mit 200 µl eiskaltem 70% EtOH gewaschen und 5 min bei 4 °C abzentrifugiert. Das EtOH

wurde abpipettiert, der Niederschlag getrocknet und in 30 µl ddH2O resuspendiert.

2.2.14 Restriktionsverdau des Vektors

Um die im bluescript-Vektor enthaltene PDF1.2 cDNA zu erhalten, wurde ein Restriktions-

verdau mit SalI und NotI ausgeführt.

Dazu wurden jeweils 2 µl DNA mit 0,5 µl SalI, 0,5 µl NotI, 2 µl 10x Puffer und 15 µl H2Ofst.

versetzt. Die Ansätze wurden für 3 h bei 37 °C inkubiert.

2.2.15 Reinigung der PDF1.2 cDNA

Die Proben wurden zum Auftrennen der DNA-Fragmente auf ein 1,0 % Agarose-Gel

aufgetragen. Die PDF1.2-Banden wurden ausgeschnitten und mit dem „QIAquick Gel

Extraction Kit“ aus dem Gel extrahiert. Dabei wurde nach der Anleitung des Herstellers

vorgegangen. Zur Reinigung der DNA wurde eine EtOH-Fällung ausgeführt.


2.2.16 Northern Blot

Um die eventuelle Expression von PDF1.2 zu erhalten, wurde eine Northern Blot Hybridi-

sierung ausgeführt.

RNA-Gel und Transfer

Um zu überprüfen, daß die RNA nicht degradiert war, wurde das Gel vor Ausführung des

Blots kurz auf UV-Licht gelegt und fotografiert.

Zunächst wurden alle verwendeten Materialien und Lösungen gereinigt und möglichst

autoklaviert. Die Gelelektrophorese wurde während 15 min bei 100 V und dann während ca. 5

h bei 80 V in 1x Gelpuffer ausgeführt. Danach wurde das Gel zweimal für 15 min in DEPC-

behandeltem H2O gewaschen. Anschließend wurde das Gel in 10x SSC gewaschen. Der Blot

wurde folgendermaßen aufgebaut: Über eine runde Glasschale, die mit 10x SSC als

Transferpuffer gefüllt war, wurde zunächst eine Glasplatte gelegt. Darauf wurden 2 Lagen

Whatman 3 MM gelegt, deren Enden in den 10x SSC-Puffer eingetaucht wurden. Darauf

wurde das Gel plaziert. Es folgte eine Nitrocellulosemembran, die zuvor in H2O und dann in

10x SSC getaucht worden war. Anschließend folgten nochmal 3 Lagen Whatman 3 MM in

der exakten Größe des Gels und in 10x SSC befeuchtet. Ganz oben wurde ein Stapel

Papierhandtücher plaziert, welcher mit einem kleinen Gewicht (ca. 200 g) beschwert wurde.

Der Transfer erfolgte über Nacht.

Nach dem Transfer wurde der Blot kurz in 2x SSC geschwenkt und dann zwischen dickes,

nasses Papier gelegt, um ein Austrocknen zu verhindern. Die RNA wurde mittels UV-

crosslink bei 1200 J kovalent an die Membran gebunden. Danach wurde der Blot bis zur

weiteren Benutzung feucht bei 4 °C aufbewahrt.


Radioaktive Markierung der Sonde

Die PDF1.2-Sonde (25 ng) wurde mit [α32P]-dCTP radioaktiv markiert. Dazu verwendete

man das RadPrime DNA Labeling System (Invitrogen). Die Sonde wurde mittels einer

Gelfiltration über eine selbst hergestellte Sephadex G50-Säule von den nicht inkorporierten

Nukleotiden gereinigt. Der Einbau des [α32P]-dCTP wurde mit dem Scintillationszähler

überprüft.

Hybridisierung

Die Membran wurde in H2O und in 5x SSC geschwenkt und dann mindestens 2 h bei 42 °C in

der Hybridisierungslösung vorinkubiert. Dann wurde die Sonde 10 min in kochendem Wasser

denaturiert, auf Eis abgekühlt und anschließend zugegeben. Anschließend ließ man sie bei 42

°C und 80 rpm über Nacht hybridisieren. Um unspezifisch gebundene Sonde zu entfernen,

wurde die Membran mit steigender Stringenz zuerst in 1x SSC mit 0,5 % SDS, dann in 0,2x

SSC mit 0,5 % SDS bei 60 °C mehrmals gewaschen. Daraufhin folgte eine Autoradiografie.

3 Resultate 38 __________________________________________________________________________

Kapitel 3

Resultate

In der vorliegenden Arbeit wurden genetische Suppressoren der opr3-Mutante charakterisiert,

bei denen durch eine zweite Mutation der sterile Phänotyp der opr3-Mutante unterdrückt und

somit der fertile Phänotyp des Wildtyps wiederhergestellt wurde. Da in der opr3-Mutante der

Jasmonsäurebiosyntheseweg gestört ist, können mit Hilfe dieser Suppressoren die Gene

gefunden werden, die downstream von Jasmonsäure eine Rolle spielen und deren Funktion

bestimmt werden. Diese Untersuchungen sollen zu einem besseren Verständnis der Signal-

kaskaden, die durch das Vorhandensein von Jasmonsäure ausgelöst werden, beitragen.

Herstellung möglicher Suppressoren mittels EMS-Mutagenisierung

Um ein Screening nach genetischen Suppressoren der opr3-Mutante durchzuführen, wurde

Ethyl-Methan-Sulfonat (= EMS) verwendet. Dieses methyliert in der DNA am Guanin eine

der Bindungsstellen, so daß 6-Ethylguanin entsteht, welches nur noch 2 Bindungsstellen hat

und somit an Thymin bindet, anstatt an Cytosin. So entsteht eine Punktmutation, die zur Folge

hat, daß ein Gen entweder außer Funktion gesetzt wird, teilweise außer Funktion gesetzt wird,

qualitativ verändert wird, oder konstitutiv exprimiert wird.

Führt man ein Ethylmethansulfonat-Sättigungsmutagenese-Experiment aus, ist mit 95%iger

Wahrscheinlichkeit in jedem beliebigen G:C-Basenpaar des Genoms eine Punktmutation zu

finden (nach Jander et al. 2003). Mit dem in der vorliegenden Arbeit ausgeführten Experiment

wurde der Sättigungsbereich nicht erreicht, die Anzahl der Mutationen ist dennoch sehr hoch.

In jedem gefundenen Suppressor ist mit vielen Nebenmutationen zu rechnen, die ebenfalls zu

phänotypischen Veränderungen führen können.

3 Resultate 39 __________________________________________________________________________

Es wurden im Vorfeld der Arbeit zwei unabhängige Screenings von EMS-mutagenisierten

Pflanzen durchgeführt:

Erstes Screening:

• EMS-Mutagenisierung von ca. 50000 opr3-gl1-Samen

• ca. 20000 M1-Pflanzen keimten und wurden während der Blüte mit Jasmonsäure

besprüht, um M2-Samen zu erhalten. Dieser Schritt war notwendig, da in den M1-

Pflanzen die durch EMS verursachten Mutationen nur einen DNA-Strang betreffen

(die Mutation ist hemizygot, deshalb könnten nur dominante Suppressoren oder

eventuelle Kontaminanten fertil sein). Diese Vorgehensweise stellte sicher, daß auch

rezessive Mutationen gefunden werden konnten.

• Es wurden 46 Pools von M2-Samen geerntet

• Aus jedem Pool wurden 3000 M2-Samen gepflanzt. Diese Population von

überwiegend sterilen Pflanzen wurden auf fertile Pflanzen geprüft.

• Daraus wurden 4 echte Suppressoren erhalten, und zwar die Linien 10, 18, 22 und 24

Zweites Screening:

• EMS-Mutagenisierung von ca. 50000 opr3-Samen

• ca. 10000 Pflanzen keimten und wurden während der Blüte, als bereits sichtbar war,

welche fertil und welche steril sind, selektiert; die vier fertilen wurden von den

anderen getrennt, weil es sich um dominante Suppressoren handeln könnte. Ein Blatt

jeder der vier Pflanzen wurde für eine DNA-Extraktion geerntet (s. Material und

Methoden), außerdem wurden die Samen geerntet. Die sterilen Pflanzen wurden mit

Jasmonsäure besprüht, um M2-Samen zu erhalten.

• Es wurden 36 Pools von M2-Samen geerntet.

• Dann wurden 3 Schalen mit jeweils 500 M2-Samen pro pool bepflanzt (ab hier

Bestandteil der vorliegenden Arbeit).

3 Resultate 40 __________________________________________________________________________

• In diesen wurden 70 fertile oder teilweise fertile Pflanzen aus 28 verschiedenen Pools

gefunden, die mögliche Suppressoren sind. Von diesen wurden M3-Samen geerntet.

Außerdem wurde von den fertilen M2-Pflanzen jeweils ein Blatt für eine DNA-

Extraktion geerntet. Mit dieser DNA wurde eine PCR vorgenommen, um zu unter-

suchen, ob es sich um echte Suppressoren oder eventuelle Kontaminationen handelt.

3.1 Screening auf mögliche Suppressoren Bei der EMS-Mutagenisierung wurden verschiedene Linien gewonnen, die als Suppressor in

Frage kommen. Um zu selektieren, welche der fertilen Pflanzen für eine Suppressor-

Charakterisierung verwendet werden können, mußte zunächst nachgewiesen werden, daß

keine Kontaminationen vorliegen, z. B. von zufällig angeflogenen Pollenkörnern auf eine

Pflanze in der vorherigen Generation oder versehentlich eingetragenen anderweitigen Samen.

opr3 ist eine T-DNA-Insertions-Mutante. Bei einem echten opr3-Suppressor ist das T-DNA-

Insert im OPR3-Gen homozygot vorhanden. In einer fertilen M2-Pflanze, die daraus ent-

standen ist, daß ein Wildtyp-Pollenkorn auf einer wieder mutagenisierten M1-Pflanze

gelandet ist, befindet sich das T-DNA-Insert nur auf einer Kopie des OPR3-Gens, so daß

Jasmonsäure produziert werden kann. In fertilen Pflanzen, die durch die Kontamination durch

einen fremden Samen entstanden sind, ist keine T-DNA vorhanden, daher sind diese Pflanzen

im OPR3-Locus wildtypisch. Dies kann durch PCR getestet werden, indem man die passende

Primerkombination verwendet. Ebenso können Kanamycin-Segregationsraten bestimmt

werden, da das NPT II-Gen, welches für die Kanamycinresistenz verantwortlich ist, durch

eines der in der T-DNA vorhandenen Gene codiert wird.

3 Resultate 41 __________________________________________________________________________

LB

opr 3 int 55

Exon 4 Exon 3 Exon 2 Exon 1 Abb. 3: Molekulare Struktur des OPR3-Locus in der opr3-Mutante und Lage der PCR-Primer. Die Größenverhältnisse sind nicht repräsentativ. Das 17 kb T-DNA-Insert wird als Dreieck dargestellt. Exons sind als Rechtecke dargestellt, Introns als Linien zwischen den Exons. Die dickere Linie in Intron 2 repräsentiert ein Tnat1-ähnliches Transposon von 1,1 kb, welches im Ws-Ökotyp vorkommt, aber nicht im Columbia-Ökotyp. Die Pfeile zeigen die Position der verschiedenen Primer, welche für die PCR-Experimente verwendet wurden.

PCR-Ergebnisse

Für den PCR-Test wurde von den fertilen Pflanzen der jeweiligen Linien jeweils ein Blatt

geerntet, um eine DNA-Extraktion auszuführen (s. Material und Methoden). Auf jede Probe

wurden 2 PCR-Reaktionen ausgeführt, entweder mit der Primerkombination opr3int/LB oder

mit opr3int/55 (s. Abb. 3 zur Position der Primer). Wenn das T-DNA-Insert den OPR3-Locus

unterbricht, ist mit der Primerkombination opr3int/LB eine Bande von ca. 1,1 kb zu erwarten.

Da die T-DNA ungefähr 17 kb lang ist, kann bei den von uns angewendeten PCR-

Bedingungen (2 min extension time) mit der Primerkombination opr3int/55 keine Ampli-

fizierung erwartet werden. Wenn aber die T-DNA nicht vorhanden ist, ampflifizieren die

Primer opr3int/55 eine 0,4 kb-Bande, wenn das OPR3-Gen im Columbia Ökotyp auftritt, oder

eine 1,7 kb-Bande, wenn es sich um den Wassilevkia Ökotyp handelt. Zwischen den beiden

Ökotypen ist an diesem Locus ein Polymorphismus vorhanden.

Eine fertile F3-Pflanze, die mit der letzteren Primerkombination eine dieser beiden Banden

zeigt, kann also im OPR3-Locus nicht homozygot mutant sein, ist deshalb kein echter

Suppressor und wird verworfen. Unter den 70 fertilen M3-Pflanzen, für die eine PCR

ausgeführt wurde, zeigten 13 nur bei der Primerkombination opr3int/55 eine Bande, also

handelte es sich um Wildtyp-Kontaminationen. 26 zeigten bei beiden Primerkombinationen

eine Bande und sind deshalb OPR3/opr3. 31 zeigten nur bei der Primerkombination, die den

left border-Primer der T-DNA enthält, eine Bande und sind konsequentermaßen „echte“

Suppressoren.

3 Resultate 42 __________________________________________________________________________ 1 kb- 0,5 kb- 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Abb. 4: 1% Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt. Die PCR-Produkte in Spur 1 kommen durch die Primerkombination opr3int/LB zustande. Die in Spur 2 resultieren aus der Primerkombination opr3int/55. Bei der Kontrolle 1 handelt es sich um eine heterozygote opr3/OPR3 Col, Kontrolle 2 ist eine Negativkontrolle ohne DNA. PCR-Bedingungen: denaturation 20 s bei 95°C, annealing 40 s bei 62 °C, elongation 2 min bei 72°C, 30 Zyklen.

Abbildung 4 zeigt die PCR-Ergebnisse, bei denen die o. g. Primerkombinationen verwendet

wurden, nicht für alle 31, sondern nur für diejenigen Suppressoren, die im Laufe dieser Arbeit

weiter charakterisiert werden. Wie man sieht, kann für jeden Suppressor nur eine Bande

beobachtet werden, und zwar bei der Primerkombination opr3int/LB. Die DNA der

Positivkontrolle stammt von einer fertilen F3-Pflanze, die tatsächlich heterozygot

(OPR3/opr3) ist, und da die Bande in Spur 2 eine Länge von 0,4 kb aufweist, weiß man, daß

die Wildtyp-Kopie von OPR3 aus dem Columbia-Ökotyp stammt.

Anmerkung: Alle vier fertilen M2-Pflanzen, deren Samen vor der Jasmonsäurebehandlung im

zweiten Screening geerntet worden waren, erwiesen sich als Wildtyp-Kontaminationen und

nicht als dominante Suppressoren. Daher wurden sie verworfen.

Abbildung 4 zeigt, daß bezüglich des T-DNA-Inserts in opr3 bei den Suppressoren 10, 17.2,

18, 21.2, 22 und 24 die Voraussetzung für einen echten Suppressor erfüllt ist.

sup 10 sup 18 sup 22 sup 24 sup 17.1

sup 21.2

Kon-trolle 1

Kon-trolle 2

3 Resultate 43 __________________________________________________________________________

Kanamycintest

Das Ergebnis der PCR wurde überprüft, indem die Nachkommen der fertilen Pflanzen auf

kanamycinhaltigem Medium getestet wurden. Durch das T-DNA-Insert wurde eine Kana-

mycinresistenz eingebracht. In homozygoten opr3-Mutanten findet in der nächsten

Generation keine Segregation statt, so daß alle Nachkommen auf Kanamycin wachsen

können. Wäre das T-DNA-Insert nur heterozygot vorhanden, würde eine Segregation von 3 :

1 (resistent : sensitiv) stattfinden. ¼ der Pflanzen würde daher nur zwei kleine Keimblätter

bilden, die kein Chlorophyll haben und würden über dieses Stadium nicht hinauskommen.

Wenn es sich um Wildtyp-Pflanzen handelt, erhält man 100 % sensitive Pflanzen.

100 – 150 M3-Samen von jeder der 70 fertilen Pflanzen wurden oberflächensterilisiert (s.

Material und Methoden) und auf MS-Platten, die 50 µg/ml Kanamycin enthielten, ausplattiert.

Ca. 10 Tage nach Keimung wurden die Kanamycinraten ermittelt. In allen Fällen bestätigten

die gefundenen Daten die PCR-Ergebnisse.

Nachdem diese beiden voneinander unabhängigen Methoden beide zu denselben Schluß-

folgerungen führten, konnten wir darauf vertrauen, daß die Pflanzen, die wir als „echte

Suppressoren“ ausgewiesen haben, dies auch tatsächlich sind. Als eine dritte Methode hätte

man noch entweder die Abwesenheit oder die Anwesenheit des OPR3-Transkripts in den

fertilen Pflanzen durch Ausführung einer RT-PCR oder eines Northern Blots prüfen können.

In der opr3-Mutante konnte tatsächlich kein Transkript für OPR3 gefunden werden (Stintzi

and Browse 2000). Diese Technik ist aber sehr arbeitsintensiv, so daß wir sie nicht in Betracht

gezogen haben.

Die 31 fertilen M3-Pflanzen, die im OPR3-Locus homozygot für das T-DNA-Insert waren,

gehören zu 18 Pools von M2-Samen. Daher muß man zugeben, daß Suppressoren aus

verschiedenen M2-Pools zwar aus unterschiedlichen Mutationsereignissen stammen, aber

dennoch allelisch zueinander sein können. Andererseits könnten fertile Individuen innerhalb

eines Pools „Geschwister“ sein oder auch nicht. Um das Arbeiten mit „Geschwistern“ zu

verhindern, haben wir ein fertiles Individuum pro Pool zufällig ausgewählt und 12 Samen

individuell gepflanzt. Wir überprüften, ob sich bei der Blüte immer noch alle M4-Individuen

3 Resultate 44 __________________________________________________________________________

als fertil erwiesen. Überraschenderweise produzierten nur die Nachkommen von zwei Linien,

nämlich 17.1 und 21.2, eine annehmbare Samenmenge. Die Nachkommen von 7 Linien (die

in der Folge keine weitere Beachtung mehr fanden) produzierten ein paar teilweise ver-

längerte Schoten, die ein paar Samen enthielten, und die Nachkommen von 9 Linien waren

komplett steril, wie opr3.

Falsche positive Linien sind bei genetischen Screens üblich; da opr3 allerdings keinen

schwach ausgeprägten Phänotyp hat, d. h. opr3 produziert niemals irgendwelche Samen, ist es

doch einigermaßen überraschend, daß so viele Linien in der vorherigen Generation eine

annehmbare Samenmenge produzierten. Eine Ursache für die vollständige oder teilweise

Sterilität dieser 16 Linien könnte die hohe Temperatur sein, die im Hochsommer im

Gewächshaus herrschte. Möglicherweise sind diese Linien nur konditional fertil, also nur bis

zu einer maximalen Temperatur, die im Rahmen dieser Arbeit aber nicht genau bestimmt

wurde.

Wir entschieden uns, uns auf die vier zuvor isolierten Suppressoren 10, 18, 22, 24 und die neu

identifizierten 17.1 und 21.2 zu konzentrieren.

3.2 Homozygote Suppressor-Mutation

Für die Charakterisierung sollten nur Linien verwendet werden, welche die Mutation, die die

Suppression des opr3-Phänotyps verursacht, homozygot tragen. Bei den o. g. Linien traten bei

allen Pflanzungen in der nächsten Generation nur fertile Pflanzen auf (es wurden mindestens

300 Pflanzen pro Linie beobachtet). Würde die Suppressor-Mutation nur heterozygot vor-

liegen, würde in der nächsten Generation bei einer dominanten Mutation eine Segregation von

3 : 1 (fertil : steril) stattfinden. Da keine sterilen Pflanzen aufgetreten sind, waren die Linien

10, 17.1, 18, 21.2, 22 und 24 alle homozygot in der Suppressormutation.

3 Resultate 45 __________________________________________________________________________

Bei einem dominanten Suppressor denkt man an eine Mutation, die der Pflanze entweder eine

neue Funktion (gain-of-function-Mutation) oder eine qualitativ veränderte Funktion einbringt.

Diese sind auch heterozygot funktionsfähig. Andererseits findet man in einem rezessiven

Suppressor am häufigsten den Funktionsverlust eines Gens, z. B. eines negativen Regulators,

daher werden (in einer diploiden Pflanze) zwei Kopien dieses Gens benötigt, um eine

Veränderung herbeizuführen. In unserem Screen auf „wiedererlangte“ Fertilität bei opr3-

Pflanzen kann diese nur bei homozygoten Pflanzen beobachtet werden. Dies zeigt die

Notwendigkeit, blühende M1-Pflanzen zu besprühen, um M2-Samen zu erhalten und zu

verhindern, daß diese rezessiven Suppressoren verloren gehen.

3.3 Sind die Suppressoren dominant oder

rezessiv?

Da die Suppressoren homozygot waren, wurde als nächstes bestimmt, ob die Mutationen

dominant oder rezessiv sind. Dazu wurde folgendes Kreuzungsexperiment ausgeführt:

Die sechs Suppressoren-Linien 10, 17.1, 18, 21.2, 22 und 24 wurden mit opr3-Pflanzen

gekreuzt. Dabei dienten opr3-Pflanzen als weiblicher Kreuzungspartner, die Suppressoren

jeweils als männlicher Kreuzungspartner. Durch Kreuzungen der Suppressoren mit opr3

konnte festgestellt werden, welche der Mutationen dominant oder rezessiv sind, je nachdem

wieviele fertile bzw. sterile Pflanzen in F1 auftraten.

Prinzip dieses Nachweises: Bei einem homozygoten Suppressor sind nach Kreuzung mit opr3 in F1 alle Pflanzen

genetisch gleich. Diese können entweder alle fertil oder alle steril sein. Wenn alle fertil sind,

ist die Mutation dominant. Wenn alle steril sind, ist die Mutation rezessiv.

3 Resultate 46 __________________________________________________________________________

Suppressor

Anzahl F1-Pflanzen

steril/fertil

dominant/rezessiv

10

16

steril

rezessiv

17.1

5

steril

rezessiv

18

4

fertil

dominant

21.2

23

steril

rezessiv

22

3

fertil

dominant

24

6

fertil

dominant

Tabelle 1: Nach Kreuzung der Suppressoren mit opr3 ist in F1 zu sehen, welche Linien in der Suppressor-Mutation dominant oder rezessiv sind. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse des Kreuzungsexperiments. Bei den Suppressoren 10, 17.1 und

21.2 traten nur sterile Nachkommen auf, also handelt es sich um rezessive Mutationen. Bei

den Suppressoren 18, 22 und 24 traten nur fertile Nachkommen auf, also handelt es sich um

dominante Mutationen.

Um die Nachkommen der Rückkreuzungen mit den rezessiven Suppressoren nicht zu

verlieren, besprühten wir die sterilen Pflanzen mit Jasmonsäure, um Samen zu erhalten.

Würde ein dominanter heterozygoter Suppressor vorliegen, bei dem die Mutation nur auf

einem Gen vorhanden ist und somit in F1 mit einer Wahrscheinlichkeit von 50 % auftritt,

wäre die Hälfte der Pflanzen fertil, die andere Hälfte müßte steril sein. Dieser Fall ist bei den

Kreuzungen der Suppressoren mit opr3 nicht aufgetreten, was eine weitere Bestätigung der

bisher gefundenen Ergebnisse war. Die verwendeten Suppressoren sind also alle homozygot

3 Resultate 47 __________________________________________________________________________

in der Suppressormutation. Die Zahl der F1-Pflanzen für die Kreuzung mit den dominanten

Suppressoren ist allerdings statistisch nicht ausreichend, um eine sichere Aussage zu treffen.

Rückkreuzung: Suppressor x opr3

Durch die EMS-Mutagenisierung ist damit zu rechnen, daß außer der Suppressor-Mutation

noch mehrere hundert andere Mutationen vorhanden sind, die mit der Unterdrückung des

opr3-Phänotyps nichts zu tun haben. Die o. g. sechs Suppressoren-Linien wurden mehrfach

mit opr3 rückgekreuzt, um unerwünschte Nebenmutationen zu eliminieren. Pro Rück-

kreuzung eliminiert man ungefähr die Hälfte der Nebenmutationen:

BC1: 50 %, BC2: 25 %, BC3: 12,5 % etc. Die opr3-Pflanzen dienten als weiblicher

Kreuzungspartner, die Suppressoren als männlicher Kreuzungspartner.

Linie vorhandene Samen

Suppressor 10 BC1 F1, BC2 F1

Suppressor 17.1 BC1 F1

Suppressor 18 BC1 F1

Suppressor 21.2 BC1 F1

Suppressor 22 BC1 F1, BC2 F1

Suppressor 24 BC1 F1

Tabelle 2: Rückkreuzungen mit opr3. BC1 = 1. Rückkreuzung (backcross), BC2 = 2. Rückkreuzung, F1 = F1-Generation

Von den Suppressoren 10, 17.1, 21.2 und 24 konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit

Samen aus der ersten Rückkreuzung gewonnen werden, von den Suppressoren 18 und 22

konnten sogar bereits Samen aus der zweiten Rückkreuzung gewonnen werden (s. Tab. 2).

Später soll mit diesen Samen ein Mapping durchgeführt werden, um herauszufinden auf

welchem Chromosom und an welcher Stelle im Chromosom sich die Mutation befindet, die

die Suppression des opr3-Phänotyps auslöst.

3 Resultate 48 __________________________________________________________________________

Um ein grobes Mapping anzufertigen, reichen zwei Rückkreuzungen aus. Dabei kann man

immerhin feststellen, auf welchem Chromosom die Mutation liegt und ungefähr an welchem

Ende des Chromosoms. Für ein feines Mapping, bei dem die Position der Mutation auf dem

Chromosom ziemlich exakt festgestellt werden kann, muß man ca. 4 – 5 mal rückkreuzen,

bevor man die Pflanze mit einer Wildtyp-Pflanze eines anderen Ökotyps kreuzt. In unserem

Fall ist opr3 im Ws-Ökotyp und die Kreuzung wird mit Ler (Landsberg erecta) ausgeführt

werden. Zwischen diesen zwei Ökotypen ist eine bemerkenswerte Anzahl von genetischen

Markern identifiziert worden.

Für die Linien 18 und 22 ist also bereits ein grobes Mapping durchführbar. Für das feine

Mapping sowie die anderen Linien müssen weitere Kreuzungen ausgeführt werden.

3.4 Sind die Suppressor-Mutationen OPDA-abhängig?

3.4.1 Herstellung einer Doppelmutante: aos x opr3

In opr3 wurde gezeigt, daß Jasmonsäure und nicht OPDA das Signalmolekül ist, welches bei

der Reifung von Antheren und Pollen involviert ist (Stintzi und Browse 2000). Bei den

Verteidigungsreaktionen agiert aber OPDA ebenso wie Jasmonsäure als Signalmolekül

(Stintzi et al. 2001). Wenn nun in einem Suppressor eine jetzt veränderte Funktion OPDA

(oder einem Derivat von OPDA) ermöglichen würde, anstelle von Jasmonsäure als Signal-

molekül zu agieren, so könnte dies durch das „Entfernen“ der Quelle für OPDA demonstriert

werden. AOS, in Verbindung mit AOC, ist verantwortlich für die Zyklisierung von 13-

Hydroxyperoxylinolensäure zu OPDA. Da im Arabidopsis-Genom nur ein AOS-Gen

vorhanden ist, und eine männlich sterile aos-Mutante (echtes knock-out) verfügbar ist, würde

das Kreuzen des Suppressors mit aos die Methode der Wahl sein, OPDA zu eliminieren. aos

ist aber sowohl im OPR3-Locus als auch im Suppressor-Locus wildtypisch. Daher würde in

der F2-Generation aus einer solchen Kreuzung nur eine von 64 Pflanzen für alle drei Mutatio-

3 Resultate 49 __________________________________________________________________________

nen homozygot sein, die extrem schwierig zu herauszufinden wäre. Eine Alternative ist,

zuerst aos und opr3 zu kreuzen, in F2 eine Doppelmutante zu erhalten (1/16 der Pflanzen)

und anschließend diese Doppelmutante mit dem Suppressor zu kreuzen. In F2 wird 1/16 der

Pflanzen den richtigen Genotyp aufweisen.

Homozygote aos-Pflanzen (wildtypisch für OPR3) und homozygote opr3-Pflanzen (wild-

typisch für AOS) wurden also miteinander gekreuzt. Dabei dienten die aos-Pflanzen als

maternaler Kreuzungspartner, die opr3-Pflanzen als paternaler Kreuzungspartner, nachdem

sie mit Jasmonsäure besprüht worden waren, um funktionsfähigen Pollen zu erhalten. Das

Ziel dieser Kreuzung war die Herstellung einer Doppelmutante, die in opr3 und aos homo-

zygot ist. Die Doppelmutante kann später verwendet werden, um eine eventuelle OPDA-

Abhängigkeit nachzuweisen.

In F1 erhielt man lauter genotypisch gleiche Pflanzen, die alle sowohl in aos als auch in opr3

mutant waren, allerdings nur heterozygot (und deshalb fertil). Nach Selbstung erhielt man in

F2 16 verschiedene Genotypen, von denen in mehreren Stufen diejenigen 15 eliminiert

werden mußten, die nicht den gewünschten Genotyp aufwiesen (s. Tab. 3).

F2

AOS/OPR3

AOS/opr3

aos/OPR3

aos/opr3

AOS/OPR3

AOS/AOS OPR3/OPR3 fertil

AOS/AOS OPR3/opr3 fertil

AOS/aos OPR3/OPR3 fertil

AOS/aos OPR3/opr3 fertil

AOS/opr3

AOS/AOS opr3/OPR3 fertil

AOS/AOS opr3/opr3 steril

AOS/aos opr3/OPR3 fertil

AOS/aos opr3/opr3 steril

aos/OPR3

aos/AOS OPR3/OPR3 fertil

aos/AOS OPR3/opr3 fertil

aos/aos OPR3/OPR3 steril

aos/aos OPR3/opr3 steril

aos/opr3

aos/AOS opr3/OPR3 fertil

aos/AOS opr3/opr3 steril

aos/aos opr3/OPR3 steril

aos/aos opr3/opr3 steril

Tabelle 3: Kreuzungsschema für die F2-Generation aus der Kreuzung zwischen aos und opr3.

3 Resultate 50 __________________________________________________________________________

Zuerst wurden diejenigen eliminiert, die keine Mutation in OPR3 aufwiesen (blau), indem die

Tatsache genutzt wurde, daß diese keine Kanamycinresistenz trugen. Dazu wurden F2-Samen

auf MSKan-Platten ausplattiert, so daß nur die Pflanzen mit Kanamycinresistenz überlebten.

Dadurch wurde bereits ¼ der Genotypen eliminiert.

Von den erhaltenen Pflanzen wurden 48 Stück auf Erde übertragen und großgezogen. Die

fertilen wurden verworfen (gelb). Somit blieben nur noch sechs Genotypen übrig, die alle

steril waren. Von den sterilen Pflanzen wurde Material für eine DNA-Analyse eingefroren,

die Pflanzen wurden mit Jasmonsäure besprüht und geerntet.

Die weiteren Schritte sind nicht mehr Bestandteil der vorliegenden Arbeit, sondern werden in

einer weiterführenden Arbeit ausgeführt, sollen aber der Vollständigkeit halber kurz erläutert

werden: Diejenigen Pflanzen, die in OPR3 heterozygot sind (grau), können nachgewiesen und

eliminiert werden, indem man die DNA mit OPR3-Primern amplifiziert. Alle Pflanzen, die

dann noch übrig sind, sind bereits homozygot in opr3. Über eine PCR auf cDNA mit AOS-

Primern kann man aus den restlichen Pflanzen die Doppelmutante detektieren (rot).

3.4.2 Suppressor x aos

Die o. g. sechs Suppressoren-Linien wurden jeweils mit der homozygoten aos-Mutante ge-

kreuzt. Dabei dienten die aos-Pflanzen als weiblicher Kreuzungspartner, die Suppressoren als

männlicher Kreuzungspartner. Es wurden jeweils sechs Kreuzungen pro Linie angefertigt, so

daß 36 Kreuzungen entstanden sind. Aus jeder Kreuzung wurden F1-Pflanzen großgezogen,

die alle fertil waren und wieder einzeln geernet wurden.

In F2 findet Segregation statt; die F2-Samen der homozygoten Pflanzen werden zur späteren

Verwendung geerntet. Die homozygoten Pflanzen zu finden wird hier wesentlich einfacher

sein, weil man nur dem fertilen Phänotyp zu folgen braucht. Die Suppressoren 10, 18, 22 und

24 sind glabrous (keine Trichome auf den Blättern), ein Merkmal, welches in F2 wieder auf-

3 Resultate 51 __________________________________________________________________________

tritt und als Kontrolle dienen kann, ob die Kreuzung funktioniert hat. Dieser Schritt soll

ebenfalls in einer weiterführenden Arbeit ausgeführt werden.

Die hieraus entstehenden homozygoten Pflanzen sollen später mit der o. g. Doppelmutante

gekreuzt werden.

3.5 Phänotypische Charakterisierung der

Suppressoren:

Für die phänotypische Charakterisierung wäre es ideal gewesen, eine Analyse an bereits

rückgekreuzten Pflanzen vorzunehmen, um sicherzugehen, daß die beobachteten Phänomene

tatsächlich mit der Suppressor-Mutationen zusammenhängen und nicht aus einer Neben-

mutation resultieren. Im zeitlichen Rahmen dieser Arbeit war dies jedoch nicht möglich,

daher wurden M3-Samen verwendet. Ein Beispiel für die massiven Auswirkungen von

Nebenmutationen zeigte sich beim Suppressor 10, bei dessen Nachkommen (M 3) des fertilen

Phänotyps vereinzelt Pflanzen auftraten, die um ca. 30 – 40 % größer waren als die anderen

und als Phänotyp „big“ bezeichnet wurden.

Beim Suppressor 10 konnte außerdem beobachtet werden, daß jeweils die ersten ca. 10

Schoten steril blieben und sich erst danach fertile Schoten ausbildeten. Bei den anderen

Suppressoren war dieses Phänomen nicht zu beobachten. Bei allen sechs Suppressoren waren

die Schoten vollständig verlängert. Die „big“-Mutation ist nicht mit dem fertilen Phänotyp

verknüpft, da nach der Rückkreuzung mit opr3 die Pflanzen, die „big“ und fertil sind,

verschwunden waren.

3 Resultate 52 __________________________________________________________________________

3.5.1 Unterschiede der verschiedenen Suppressoren in der

Blütenentwicklung Bei mikroskopischen Untersuchungen wurde festgestellt, daß die verschiedenen

Suppressoren-Linien beim Öffnen der Antheren Unterschiede im zeitlichen Ablauf aufweisen.

Diese wurden fotografisch dokumentiert und können später, sobald bekannt ist, welche Gene

bei den Suppressoren betroffen sind, weitere Erkenntnisse zu den bei der Pollenfreisetzung

eine Rolle spielenden Prozessen liefern.

Dazu wurden jeweils die ersten drei bis vier geöffneten Blüten betrachtet. Damit sind,

ausgehend von einem Blütenstand die jüngsten, gerade geöffneten Blüten gemeint. Die Blüten

wurden fotografiert und werden in den Abbildungen 5 - 12 gezeigt. Außer den fotografierten

Pflanzen wurden noch ca. 3 – 4 andere Pflanzen pro Linie betrachtet, um die Dokumentation

von zufälligen Abweichungen zu vermeiden. Es handelt sich hierbei aber nicht um statistische

Daten.

Wildtyp: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte Abb. 5: Die ersten drei geöffneten Blüten einer Wildtyp-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt.

Beim Wildtyp sieht man, daß die erste geöffnete Blüte bereits geöffnete Antheren hat. Der

Pollen ist deutlich erkennbar.

3 Resultate 53 __________________________________________________________________________ opr3: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte Abb. 6: Die ersten drei geöffneten Blüten einer opr3-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt.

Bei opr3-Blüten sieht man, wie zu erwarten war, keine freigesetzten Pollen.

Suppressor 10: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte Abb. 7: Die ersten drei geöffneten Blüten einer Suppressor 10-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt.

Beim Suppressor 10 sieht man bei der ersten Blüte noch keine Pollen. Bei der zweiten Blüte

sieht man bei genauer Betrachtung beim linken Staubblatt am Rand wenige Pollen, d. h. die

Freisetzung beginnt gerade. Bei der dritten Blüte hat die Freisetzung bereits vollständig

stattgefunden.

3 Resultate 54 __________________________________________________________________________ Suppressor 17.1: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte 4. geöffnete Blüte Abb. 8: Die ersten vier geöffneten Blüten einer Suppressor 17.1-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt.

Beim Suppressor 17.1 sieht man die Freisetzung erst bei der vierten Blüte. Suppressor 18: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte Abb. 9: Die ersten drei geöffneten Blüten einer Suppressor 18-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt. Beim Suppressor 18 ist der Pollen bei der ersten Blüte schon sichtbar.

3 Resultate 55 __________________________________________________________________________ Suppressor 21.2: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte Abb. 10: Die ersten drei geöffneten Blüten einer Suppressor 21.2-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt. Beim Suppressor 21.2 fangen die Antheren auf dem zweiten Bild an sich zu öffnen. Auf dem

dritten Bild hat die Freisetzung stattgefunden.

Suppressor 22: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte Abb. 11: Die ersten drei geöffneten Blüten einer Suppressor 22-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt. Beim Suppressor 22 hat – wie bei 18 und beim Wildtyp – die Freisetzung bereits in der ersten

geöffneten Blüte vollständig stattgefunden.

3 Resultate 56 __________________________________________________________________________ Suppressor 24: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte 4. geöffnete Blüte Abb. 12: Die ersten vier geöffneten Blüten einer Suppressor 24-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt. Beim Suppressor 24 wird der Pollen erst in der vierten Blüte freigesetzt. Obwohl bei allen Suppressoren die Fertilität wiederhergestellt ist, treten doch bezüglich der

Pollenfreisetzung Unterschiede im zeitlichen Verlauf auf. Bei den verschiedenen Suppressor-

Mutationen könnten unterschiedliche Signalmoleküle betroffen sein, die an unterschiedlichen

Stellen in der Signalkaskade eine Rolle spielen.

Besonders hervorzuheben ist die Gemeinsamkeit der Suppressoren 18 und 22, die auch im

unter Punkt 3.6 genannten Experiment bei den Blüten auftrat.

Offensichtlich liegt hier irgendeine Gemeinsamkeit vor.

3 Resultate 57 __________________________________________________________________________ 3.5.2 Beobachtungen an der phänotypischen Entwicklung der

Pflanzen 10 Pflanzen pro Linie Blühbeginn nach x

Tagen Länge des Haupttriebs Ø nach 50 Tagen

Erste Schote öffnet sich nach x Tagen

sup 10

37,7 Tage

19,7 cm

79,2 Tage

sup 17.1

34,5 Tage

33,9 cm

89,8 Tage

sup 18

39,9 Tage

35,5 cm

90,5 Tage

sup 21.2

36,3 Tage

18,7 cm

79,3 Tage

sup 22

34,9 Tage

26,5 cm

63,4 Tage

sup 24

31,8 Tage

20,4 cm

89,1 Tage

opr3

31,8 Tage

38,2 cm

-

wt ws

35,0 Tage

32,0 cm

73,6 Tage

Tabelle 4: Messungen von den drei Parametern Blühbeginn, Länge des Haupttriebs und Schotenöffnung.

Bei der phänotypischen Charakterisierung wurden drei verschiedene Parameter untersucht,

um eventuelle Abweichungen von der normalen Entwicklung aufzuzeigen (s. Tab. 4). Die

Standardabweichung war vernachlässigbar gering.

3 Resultate 58 __________________________________________________________________________

Um die phänotypischen Unterschiede, die in den Pflanzen aufgrund genetischer Variationen

oder durch den Einfluß von Umweltstreß sichtbar sind, identifizieren und interpretieren zu

können, muß zunächst ein Standard vorhanden sein, der den Vergleich mit einer normal

entwickelten Pflanze zuläßt. Zu diesem Zweck haben die Firmen BASF, Bayer, Ciba-Geigy

und Hoechst das sogenannte BBCH-scale eingeführt, bei dem eine Art genetische Nomen-

klatur zur Verfügung gestellt wird, welche die Entwicklungsstadien exakt kennzeichnet.

Dafür wurden Wildtyppflanzen der Arabidopsis thaliana-Subspecies Columbia (Col-0)

verwendet. In Zusammenhang mit anderweitigen effizienten Untersuchungsmethoden wird

durch den Einsatz dieses Standards eine hohe Verarbeitungsmenge bei der Analyse von

Pflanzengenen erreicht (Boyes et al. 2001, Lancashire et al. 1991). Dieser Standard wurde bei

unseren Beobachtungen zur phänotypischen Entwicklung zugrunde gelegt.

Beim ersten Parameter wurde beobachtet, nach wievielen Tagen der Blühbeginn einsetzt.

opr3 blüht deutlich früher als der Wildtyp (ungefähr drei Tage). Dies wurde wiederholt

beobachtet (auch von A. Stintzi) und tritt noch wesentlich extremer zutage, wenn Pflanzen

unter Kurztagbedingungen gehalten werden. Eine Ursache für diese frühe Blütezeit könnte in

der opr3-Mutante das Fehlen von Jasmonsäure sein. Suppressor 24 blüht relativ früh und hat

dieselben Werte wie opr3. Die anderen Suppressoren haben ähnliche Werte wie der Wildtyp

oder blühen etwas später. Besonders bei den Suppressoren 10 und 18 fällt auf, daß sie deutlich

später blühen als der Wildtyp (drei und fünf Tage später). Die Werte, die zwischen opr3 und

dem Wildtyp liegen, entsprechen der Erwartung, d. h. der normale Phänotyp wurde bei diesen

Pflanzen teilweise wiederhergestellt. Weshalb einige Werte höher liegen als beim Wildtyp, ist

nicht geklärt; wenn Jasmonsäure beim Zeitpunkt der Blüte eine Rolle spielt, könnte es sein,

daß Über- oder Unterstimulierung dieser Signalroute für die beobachtete Verzögerung des

Blühzeitpunktes verantwortlich ist. Ebenso könnten sich Auswirkungen von Nebenmutationen

bemerkbar machen.

3 Resultate 59 __________________________________________________________________________

Beim zweiten Parameter wurde 50 Tage nach dem Ausbringen der Samen die Länge des

Haupttriebes gemessen. Hier fiel vor allem auf, daß die Suppressoren 10, 21.2 und 24 sehr

viel langsamer wachsen als der Wildtyp. Auch Suppressor 22 ist etwas langsamer. Bei den

Suppressoren 17.1 und 18 liegen die Werte zwischen denen des Wildtyps und den Werten von

opr3.

Beim dritten der untersuchten Parameter fiel auf, daß besonders der Suppressor 22 aus dem

Rahmen fällt und die erste geöffnete Schote wesentlich früher erscheint als bei allen anderen

Linien. Bei allen anderen öffnete sich die erste Schote deutlich später als beim Wildtyp, beim

Suppressor 22 jedoch deutlich früher als beim Wildtyp. Hier kann im Gegensatz zu anderen

Versuchen keine Gemeinsamkeit mit Suppressor 18 festgestellt werden. Bei den ersten beiden

Parametern wurden keine signifikanten Besonderheiten gefunden; die extrem verfrühte

Schotenöffnung beim Suppressor 22 ist jedoch äußerst auffällig und sollte für spätere

Arbeiten im Auge behalten werden. Sobald das von der Mutation im Suppressor 22 betroffene

Gen identifiziert ist, wird die Überlegung interessant, wie diese Auffälligkeit mit der Mutation

in Verbindung steht.

3.5.3 Pollenkeimung

Alle unsere Suppressoren sind vollständig fertil und bilden eine normale Samenmenge. Dies

könnte aber auch erreicht werden, wenn der Pollen nicht 100%ig funktionsfähig ist. Die

Pollenkeimung wurde in vitro gemessen (s. Material und Methoden) und die Ergebnisse sind

in Tabelle 5 dargestellt.

Für die Pollenkeimung wurden pro Linie 4 Pflanzen untersucht; beim Wildtyp wurden nur 2

Pflanzen untersucht. Bei jeder Pflanze wurden am Haupttrieb die ersten drei geöffneten

Blüten, ausgehend vom Blütenstand, verwendet. Die Auswertung der Platten fand mindestens

24 h nach Auftragen der Pollen auf das Medium statt.

3 Resultate 60 __________________________________________________________________________

Linie Anzahl

Blüten

Gesamtzahl

gezählte Pollen

Pollenkeimungs-

rate

Grundgesamtheit-

Standardabweichung

wt ws 6 3569 88,2 % 2,6

opr3 12 3000 6,9 % 4,5

sup 10 12 5486 72,3 % 20,4

sup 17.1 12 2845 50,3 % 13,1

sup 18 12 7475 72,1 % 19,3

sup 21.2 12 6217 69,3 % 8,8

sup 22 12 8791 51,2 % 16,7

sup 24 12 7143 46,7 % 13,2 Tabelle 5: Pollenkeimung der untersuchten Suppressoren im Vergleich zum Wildtyp und zu opr3. Die Pollen wurden als gekeimt gezählt, sobald ein Pollenschlauch die zweifache Länge eines

Pollenkorns hatte. Bezüglich der Größe des Pollenschlauchs wurden keine Unterschiede

gemacht. Die Pollenschläuche hatten fast immer eine normale Länge (ungefähr wie beim

Wildtyp), nur bei opr3 waren sie meist kurz (meist nicht länger als ein Pollenkorn).

Die Pollenkeimungsexperimente zeigten beim Wildtyp eine Pollenkeimungsrate von 88,2 %

+/- 2,6, bei opr3 dagegen nur von 6,9 % +/- 4,5. Dies entsprach der Erwartung (Stintzi and

Browse 2000).

Die Pollenkeimungsraten der Suppressoren zeigten Werte, die zwar nicht ganz so hoch waren

wie beim Wildtyp, aber doch weit höher als bei opr3.

Die Pollenkeimungsraten zwischen 46,7 % und 72,3 % zeigten eindeutig, daß die Prozesse,

die für eine normale Entwicklung von Pollen und Antheren notwendig sind, bei den ver-

wendeten Suppressoren im wesentlichen wiedererlangt wurden. Die Anzahl der Pollen, die

einen ganz normalen Pollenschlauch ausbildeten, waren für eine normale Selbstbefruchtung

absolut ausreichend. Die Fotos, die jeweils von einem repräsentativen Spot gemacht wurden,

sind in Abbildung 13 zu sehen.

3 Resultate 61 __________________________________________________________________________

Pollenkeimung Wildtyp ws opr3 88,2 % 6,9 % σx = 2,6 σx = 4,5 n = 6 n = 12

Suppressor 10 Suppressor 17.1 72,3 % 50,3 % σx = 20,4 σx = 13,1 n = 12 n = 12

3 Resultate 62 __________________________________________________________________________

Pollenkeimung Suppressor 18 Suppressor 21.2 72,1 % 69,3 % σx = 19,3 σx = 8,8 n = 12 n = 12

Suppressor 22 Suppressor 24 51,2 % 46,7 % σx = 16,7 σx = 13,16 n = 12 n = 12 Abb. 13: Pollenkeimung in vitro, mind. 24 h nach Auftragen der Pollen auf das Medium: Fotografie eines repräsentativen Spots von wt, opr3, und den Suppressoren 10, 17.1, 18, 21.2, 22 und 24.

3 Resultate 63 __________________________________________________________________________

3.6 Molekulare Charakterisierung der

Suppressoren

Die molekulare Charakterisierung soll dazu beitragen, die jasmonatabhängigen Mechanismen

besser zu verstehen, die downstream vom Jasmonsäurebiosyntheseweg über verschiedene

Signalkaskaden zu den Jasmonsäurereaktionen führt, von denen uns insbesondere die

Vorgänge in der Blüte interessieren. Für diese Analyse wurden als molekulare Marker MBP,

WIMBP, VSP2, OPR1 und PDF1.2 verwendet (s. Einleitung), weil sie jasmonsäureabhängig

sind und nach Jasmonsäurebehandlung exprimiert wurden. Außer MBP, welches in Blüten

konstitutiv exprimiert wird und coi1-abhängig ist (Capella et al. 2001), werden die

verschiedenen genannten Marker in opr3 unterschiedlich exprimiert (Stintzi et al. 2001).

Die molekulare Charakterisierung wurde entweder mittels RT-PCR (reverse transkriptase

polymerase chain reaction) oder Northern Blot ausgeführt. Für die RNA-Extraktion wurden

jeweils Blätter und Blüten als Ausgangsmaterial verwendet. Da in der Blüte für die Antheren-

und Pollenreifung Jasmonsäure benötigt wird, der Jasmonsäurebiosyntheseweg in den

Suppressoren aber gestört ist, ist eine Analyse auf Blüten-RNA besonders interessant und soll

zeigen, welche der o. g. Proteine eventuell trotz Abwesenheit von Jasmonsäure vorhanden

sind, bzw. bei konstitutiv aktiviertem Jasmonsäuresignalweg exprimiert werden.

RT-PCR

Für die RT wurden jeweils 5 µg RNA verwendet, um unter Verwendung von oligo-dT die

cDNA herzustellen (s. Material und Methoden). Um sicherzustellen, daß bei der RT-PCR

keine Verunreinigung mit DNA auftritt, wurde zuerst eine DNase-Behandlung ausgeführt.

Dazu wurden pro 5 µg RNA 5 units RNase-freie DNase zugegeben. Aus diesem Grund kann

man sicher sein, daß die gefundenen Banden nicht aus einer DNA-Kontamination resultierten,

sondern tatsächlich aus cDNA, die man aus RNA erhalten hat. Abbildungen 14 – 18 zeigen

die RT-PCR-Ergebnisse für alle getesteten Marker.

3 Resultate 64 __________________________________________________________________________

Myrosinase Binding Protein (= MBP) Blätter: MBP2 EF1α 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Blüten: MBP2

EF1α

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Abb. 14: 0,8%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt. In allen Spuren wurden zwei Primerkombinationen gleichzeitig benützt, und zwar EF1α;1202R/EF1α;817 sowie –26MBP2/MBP2-2359R. 1 = Suppressor 10 (cDNA), 2 = Suppressor 17.1 (cDNA), 3 = Suppressor 18 (cDNA), 4 = Suppressor 21.2 (cDNA), 5 = Suppressor 22 (cDNA), 6 = Suppressor 24 (cDNA), 7 = opr3 (cDNA), 8 = Wildtyp ws (cDNA), 9 = Acht Stunden nach Verwundung (cDNA), 10 = Kontrolle 1 (pos.: wt ws-DNA), 11 = Kontrolle 2 (neg.: ohne DNA). PCR-Bedingungen: denaturation 20 s bei 95°C, annealing 40 s bei 57 °C, elongation 3 min 30 s bei 72 °C, 33 Zyklen.

3 Resultate 65 __________________________________________________________________________ Woundinducible Myrosinase Binding Protein (= WIMBP) Blätter:

EF1α

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Blüten: EF1α 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Abb. 15: 0,8%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt. In allen Spuren wurden zwei Primerkombinationen gleichzeitig benützt, und zwar EF1α;1202R/EF1α;817 sowie –26WIMBP/WIMBP3039R. 1 = Suppressor 10 (cDNA), 2 = Suppressor 17.1 (cDNA), 3 = Suppressor 18 (cDNA), 4 = Suppressor 21.2 (cDNA), 5 = Suppressor 22 (cDNA), 6 = Suppressor 24 (cDNA), 7 = opr3 (cDNA), 8 = Wildtyp ws (cDNA), 9 = Acht Stunden nach Verwundung (cDNA), 10 = Kontrolle 1 (pos.: wt ws-DNA), 11 = Kontrolle 2 (neg.: ohne DNA). PCR-Bedingungen: denaturation 20 s bei 95°C, annealing 40 s bei 57 °C, elongation 3 min 30 s bei 72 °C, 38 Zyklen.

3 Resultate 66 __________________________________________________________________________

Vegetative Storage Protein (VSP), Blätter 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 Zyklen EF1α ║Suppressor 10 ║Suppressor 17.1║ ║Suppressor 18 ║Suppressor 21.2║ 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 Zyklen EF1α ║Suppressor 22 ║Suppressor 24 ║ ║ opr3 ║ Wildtyp ws ║

3 Resultate 67 __________________________________________________________________________ 21 25 29 33 21 25 29 33 Zyklen EF1α ║ Kontrolle 1 ║ Kontrolle 2 ║ Abb. 16: 1,2%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt. In allen Spuren wurden zwei Primerkombinationen gleichzeitig benützt, und zwar EF1α;1202R/EF1α;817 sowie –36VSP2/824VSP2R. Jeweils vier Spuren nebeneinander von Suppressor 10 (cDNA), Suppressor 17.1 (cDNA), Suppressor 18 (cDNA), Suppressor 21.2 (cDNA), Suppressor 22 (cDNA), Suppressor 24 (cDNA), opr3 (cDNA), Wildtyp ws (cDNA), Kontrolle 1 (pos.: wt ws-DNA), Kontrolle 2 (neg.: ohne DNA). PCR-Bedingungen: denaturation 20 s bei 95°C, annealing 40 s bei 58 °C, elongation 2 min bei 72 °C, 21, 25, 29 und 33 Zyklen.

Vegetative Storage Protein (VSP), Blüten 21 25 29 33 21 25 29 33 Zyklen EF1α ║ Suppressor 10 ║ Suppressor 17.1 ║

3 Resultate 68 __________________________________________________________________________ 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 Zyklen VSP2 EF1α ║Suppressor 18 ║Suppressor 21.2║ ║ Suppressor 22 ║ Suppressor 24 ║ 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 Zyklen

EF1α

║ opr3 ║ Wildtyp ws ║ ║ Kontrolle 1 ║ Kontrolle 2 ║ Abb. 17: 1,2%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt. In allen Spuren wurden zwei Primerkombinationen gleichzeitig benützt, und zwar EF1α;1202R/EF1α;817 sowie –36VSP2/824VSP2R. Jeweils vier Spuren nebeneinander von Suppressor 10 (cDNA), Suppressor 17.1 (cDNA), Suppressor 18 (cDNA), Suppressor 21.2 (cDNA), Suppressor 22 (cDNA), Suppressor 24 (cDNA), opr3 (cDNA), Wildtyp ws (cDNA), Kontrolle 1 (pos.: wt ws-DNA), Kontrolle 2 (neg.: ohne DNA). PCR-Bedingungen: denaturation 20 s bei 95°C, annealing 40 s bei 58 °C, elongation 2 min bei 72 °C, 21, 25, 29 und 33 Zyklen.

3 Resultate 69 __________________________________________________________________________ OPR1 Blätter:

EF1α

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Blüten: EF1α

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Abb. 18: 0,8%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt. In allen Spuren wurden zwei Primerkombinationen gleichzeitig benützt, und zwar EF1α;1202R/EF1α;817 sowie –25OPR1/TAAOPR1R. 1 = Suppressor 10 (cDNA), 2 = Suppressor 17.1 (cDNA), 3 = Suppressor 18 (cDNA), 4 = Suppressor 21.2 (cDNA), 5 = Suppressor 22 (cDNA), 6 = Suppressor 24 (cDNA), 7 = opr3 (cDNA), 8 = Wildtyp ws (cDNA), 9 = Acht Stunden nach Verwundung (cDNA), 10 = Kontrolle 2 (neg.: ohne DNA). PCR-Bedingungen: denaturation 20 s bei 95°C, annealing 40 s bei 57 °C, elongation 1 min 30 s bei 72 °C, 33 Zyklen.

3 Resultate 70 __________________________________________________________________________

Als Kontrollen wurden opr3, wt ws, w 8(= Blätter, 8 h nach Verwundung) und eine

Negativkontrolle ohne cDNA eingesetzt. Bei opr3 sind bei den o. g. Markern keine Banden zu

erwarten, da Jasmonsäure fehlt und somit die von der nachfolgenden Signalkaskade

abhängigen Gene nicht exprimiert werden. Bei wt ws müßte in den Blüten Jasmonsäure

vorhanden sein und somit auch Banden zu sehen sein, zumindest für MBP, VSP und OPR1,

von denen man weiß, daß sie in der Blüte exprimiert werden (Capella et al. 2001, Benedetti et

al. 1995, Biesgen and Weiler 1999), was aber nicht der Fall war. Die Ursache ist ungeklärt. Es

könnte an einem Expressionslevel liegen, welches zu niedrig ist, um im Vergleich zum

Expressionslevel des Elongation Factors noch detektierbar zu sein. Wahrscheinlicher ist aber,

daß es an einem technischen Problem lag, beispielsweise daß die Primer nicht an ihre

Zielsequenz gebunden haben, denn in den Spuren, die zur Kontrolle 1 gehören, bei der die

PCR auf Wildtyp-DNA gemacht worden war, konnte nur bei den Primern für das Myrosinase

Binding Protein (MBP) eine schwache Bande gesehen werden, jedoch nicht für WiMBP und

OPR1. In diesen Kontrollen für Wildtyp-DNA würde man für MBP, WiMBP, OPR1 und VSP

eine Bande mit mehr oder weniger derselben Intensität wie für EF1α erwartet haben. Dies ist

für MBP, WiMBP und OPR1 nicht der Fall, deshalb kann man aus diesen Experimenten keine

Rückschlüsse ziehen. Ein weiteres Indiz für ein technisches Problem zeigt sich, da in der Spur

für w8 ebenfalls keine Banden gefunden werden konnten, obwohl nach Verwundung

eigentlich Jasmonsäure vorhanden ist, und diese Gene wundinduzierbar sind. Die Negativ-

kontrolle enthält keine cDNA und zeigt, daß im Mastermix keine Kontamination aufgetreten

ist.

Bei allen ausgeführten PCRs auf cDNA wurden zusätzlich zum Marker die Primer für den

Elongationsfaktor zugegeben. Für den Elongationsfaktor müssen überall, außer bei der

Negativkontrolle, Banden gefunden werden, da dieser ubiquitär vorkommt. Dies dient als

Kontrolle dafür, daß die PCR prinzipiell erfolgreich und die gleiche cDNA-Menge verwen-

det worden war. Für die verwendeten Primerkombinationen wurde zuvor eine gradient-PCR

im Bereich von 51°C bis 61°C ausgeführt, um den optimalen Temperaturbereich festzustellen,

der bei 57°C lag.

3 Resultate 71 __________________________________________________________________________

Die Bande, die durch den Einsatz von VSP2 entstehen kann, hat eine Länge von 858 bp, wenn

sie aus cDNA entsteht, und hätte eine Länge von 1192 bp, wenn es sich um eine DNA-

Kontamination handeln würde. Bei der PCR mit dem VSP2-Marker wurde diese 858 bp-

Bande bei den Blüten vom Suppressor 18 und vom Suppressor 22 gefunden, außerdem mit

einem sehr niedrigen Expressionslevel beim Suppressor 24. Bei den Suppressoren 10, 17.1

und 21.2 wurde diese Bande nicht gefunden. Bei den Blättern waren ebenfalls keine VSP2-

Banden zu finden, auch nicht bei Suppressor 18 und 22.

Für alle anderen Marker, die getestet wurden, konnte sowohl bei den Blüten als auch bei den

Blättern keine Expression gezeigt werden, vermutlich wegen des zuvor erwähnten tech-

nischen Problems.

Die RT-PCR zeigt, daß nur der streng jasmonsäureabhängige Marker VSP2 angeschaltet ist

und nur in den Blüten, aber nicht in den Blättern, und zwar bei den Suppressoren und nicht in

opr3 und im Wildtyp. Dies ist bei drei Suppressoren der Fall, bei den anderen ist VSP2 nicht

angeschaltet. Dies weist darauf hin, daß die beiden Suppressoren 18 und 22, und in geringe-

rem Ausmaß auch Suppressor 24, VSP2 konstitutiv exprimieren. Bei der cev-Mutante

(constitutive expression of VSP) konnte diese Expression umgekehrt in Blättern, aber nicht in

Blüten beobachtet werden (Ellis and Turner 2001), was die Vermutung nahelegt, daß die

Signalkaskade sich aufzweigt und in der cev-Mutanten eine Mutation im Zweig für die VSP-

Expression in Blättern aufweist, wohingegen unsere Mutation im Zweig für die VSP-

Expression in Blüten aufweist.

Bei den restlichen Suppressoren ist diese „Jasmonsäure“signalkaskade nicht konstitutiv

aktiviert, die beobachtete Fertilität muß also wahrscheinlich eine andere Ursache haben.

3 Resultate 72 __________________________________________________________________________ Northern Blot Der letzte Marker, den wir getestet haben, PDF1.2, ist als wundinduzierbar bekannt, durch

Jasmonsäure oder OPDA. Hier sollte mittels Northern Blot überprüft werden, ob es in den

Suppressoren zu einer konstitutiven Expression dieses Verwundungsmarkers kommt.

Abb. 19: Northern Blot mit Blüten-RNA der Suppressoren 10, 17.1, 18, 21.2, 22 und 24 sowie von opr3 und wt ws,

außerdem von Blättern jasmonsäurebehandelter wt ws- und opr3-Pflanzen. Die auf Nitrocellulose überführte RNA wurde mit

25 µg radioaktiv markierter PDF1.2-Sonde hybridisiert.

Der Northern Blot für PDF1.2 wurde nur für Blüten-RNA ausgeführt, da diese aufgrund der

vorherigen PCR mit dem VSP-Marker am vielversprechendsten zu sein schien. Dennoch

waren keine PDF1.2-Banden zu sehen (s. Abb. 19). Da die beiden Positivkontrollen, die vor

der RNA-Extraktion mit Jasmonsäure besprüht worden waren, Banden aufwiesen, kann davon

ausgegangen werden, daß der Versuch prinzipiell funktioniert hat. Wir können deshalb die

Schlußfolgerung ziehen, daß die Suppressoren die Wundreaktionsgene nicht konstitutiv

exprimieren und somit die Wundreaktion in den Suppressoren nicht „angeschaltet“ ist.

sup 10

sup 17.1

sup 18

sup 21.2

sup 22

sup 24

opr 3 wt ws wt ws + JA

opr 3 + JA

4 Diskussion 73 __________________________________________________________________________

Kapitel 4 Diskussion Die Nullmutation in OPR3 verhindert die Akkumulation von Jasmonsäure in Arabidopsis, die

ihrerseits für den männlich sterilen Phänotyp verantwortlich ist, der in den mutierten Pflanzen

beobachtet wird (Sanders et al. 2000, Stintzi and Browse 2000). Obwohl Jasmonsäure auch

für die pflanzlichen Verteidigungsmechanismen ein kritischer Regulator ist (Review: Berger

2002), wird in opr3 die Fähigkeit, sich gegen Alternaria brassicicola und Bradysia impatiens

zu verteidigen, nicht beeinträchtigt. Man nimmt an, daß OPDA, welches die Verteidigungs-

gene induzieren kann, Jasmonsäure ersetzen kann, wenn es darum geht, Pflanzen vor

Insektenfraß und necrotrophen Pilzen zu schützen (Stintzi et al. 2001).

Der männlich sterile Phänotyp in opr3 ist pleiotroph und beinhaltet eine reduzierte Ver-

längerung des Antherenfilaments während des Blühens, eine Verspätung des Öffnens der

Antheren, so daß die Pollen nicht freigesetzt werden können, außerdem ist der größte Teil des

Pollens nicht funktionsfähig (Stintzi and Browse 2000). Wie Jasmonsäure all diese Prozesse

reguliert ist weitestgehend noch unbekannt, außer im Hinblick auf COI1, welches ein Gen in

der Jasmonsäure-Signalkaskade ist, das alle Reaktionen auf Jasmonsäure kontrolliert, die

zuvor genannt worden sind (Review: Turner et al. 2002).

4 Diskussion 74 __________________________________________________________________________

Um die Jasmonsäuresignalkaskade weiter aufzufächern, haben wir eine genetische An-

näherung unternommen, indem wir auf genetische Suppressoren von opr3 gescreent haben, in

denen trotz fehlender Jasmonsäure die Fertilität wiedererlangt worden ist. Ein ungesättigter

Screen mit 100.000 EMS-mutagenisierten opr3-Samen führte zu ca. 50.000 lebensfähigen

M1-Pflanzen, bei denen wir sechs unabhängige Suppressoren in der M2-Generation

identifizierten. Die Fertilität, gemessen an der Menge der pro Pflanze produzierten Samen,

war für alle Suppressoren ungefähr gleichwertig mit der Samenproduktion beim Wildtyp,

obwohl die Werte der in vitro Pollenkeimungsraten ein breiteres Spektrum zeigten (s.

Resultate).

Die Abwesenheit von 3R,7S Jasmonsäure wurde für zwei Suppressoren nachgewiesen (sup 10

und 22; A. Stintzi, unveröffentlicht) und für die anderen vier Suppressoren erwartet, da es

unwahrscheinlich zu sein scheint, daß EMS, welches Punktmutationen auslöst, die Funktion

des OPR3-Gens, die in der opr3-Mutante durch ein 17 kb T-DNA-Insert unterbrochen wird,

wiederherstellen könnte. Während in Arabidopsis vier weitere Isoforme von OPR existieren,

die untereinander zu mehr als 90 % identisch sind und zu 70 % identisch zu OPR3 sind, ist

deren biologisches Substrat bisher unbekannt. Es handelt sich jedenfalls nicht um 9S,13S

OPDA, welches der Vorläufer der biologisch aktiven 3R,7S Jasmonsäure ist (Review:

Schaller F 2001). Eine Analyse der Kristallstrukturen sowohl von LeOPR1 (Breithaupt et al.

2001) als auch von LeOPR3 (Breithaupt, Schaller, Macheroux and Clausen, Manuskript in

Vorbereitung) zeigt für beide Enzyme eine α8β8-Faßstruktur, in der die Substratbindestelle aus

einem großen, zentralen, hydrophoben Tunnel und einem engen Hohlraum oberhalb des „si

face“ von FMN besteht.

4 Diskussion 75 __________________________________________________________________________

Substrate von OPR1 weisen charakteristischerweise eine α,β ungesättigte Carbonyl-

komponente auf, wie sie auch in OPDA vorkommt. Die Länge und Stereochemie der

Seitenketten schliessen 9S,13S OPDA als Substrat von OPR1 aus. Man könnte sich

vorstellen, daß die Fertilität in den Suppressoren, deren Jasmonsäuregehalt bisher noch nicht

gemessen wurde, dadurch zustande gekommen sein mag, daß in einer der OPR-Isoformen

eine EMS-induzierte Veränderung der Substratspezifität auftrat, durch die dieses Isoform

9S,13S OPDA als Substrat akzeptieren könnte. Selbst wenn aber eine Veränderung der

Substratspezifität für eines der zusätzlich vorhandenen OPRs theoretisch möglich wäre, würde

daraus nicht notwendigerweise auch die Jasmonsäuresynthese resultieren. Sowohl OPR3 als

auch die Enzyme für die β-Oxidation, die für die Verkürzung der octanoyl-Seitenkette von

OPC:8 verantwortlich sind, sind peroxisomale Proteine, während OPR1, 2 und vermutlich

auch 4 und 5 cytosolische Proteine sind (Strassner et al. 2002). Daher würde eine

unterschiedliche Kompartimentierung nicht zulassen, daß die Jasmonsäurebiosynthese über

das OPC:8-Stadium hinausginge. Ein anderer limitierender Faktor dieses Szenarios könnte die

Verfügbarkeit des Substrats sein. 9S,13S OPDA wird im Chloroplasten synthetisiert (Review:

Schaller F 2001), wird aber im Peroxisom benötigt, um von OPR3 zu OPC:8 reduziert zu

werden. Bisher ist noch nicht bekannt, wie OPDA von einem Kompartiment zum anderen

gelangt, und ob der Transfer einen cytoplasmischen Schritt beinhaltet. Allerdings kann man

annehmen, daß OPDA nicht frei durch biologische Membranen diffundiert. Die minimale

Voraussetzung für die Bewegung wäre die Aktivierung in Form eines CoA-Thioesters durch

ein acyl-aktivierendes Enzym. Eine Familie von 63 solcher Enzyme wurde in Arabidopsis

identifiziert (Shockey et al. 2003), und eines davon, welches den Locus für die

Jasmonatantwort (JAR1) definiert, ist in der Lage, Jasmonsäure zu adenylieren, ist aber

inaktiv gegenüber OPDA (Staswick et al. 2002). OPDA könnte ein Substrat für ein

verwandtes Mitglied dieser Familie sein.

4 Diskussion 76 __________________________________________________________________________

Vorausgegangene Arbeiten zeigten, daß 4,5 Didehydroxy-Jasmonat die Fertilität der opr3-

Mutante wiederherstellen kann, und Spuren dieser Substanz wurden einmal in einem der

Suppressoren (sup 10) beobachtet (A. Stintzi, unpublished). Dieses Analogon von Jasmon-

säure kann im Wildtyp oder in opr3 nicht detektiert werden (Stintzi et al. 2001), sollte es aber

vorhanden sein, würde dies vermutlich durch β-Oxidation von OPDA zustande kommen, vor

dem Reduktionsschritt an Position 9, 10. Zu zeigen, ob 4,5 Didehydroxy-Jasmonat für die

wiedererlangte Fertilität in Suppressor 10 verantwortlich ist, wäre möglich, indem man die

Akkumulation von OPDA in der Pflanze verhindert. Dies wird zukünftig mit Hilfe einer

Kreuzung dieses Suppressors mit einer aos/opr3-Doppelmutante getestet werden, in welcher

der Octadecanoid-Pathway nach der 13-Hydroperoxylinolensäure unterbrochen ist.

Vermutet man die Anwesenheit von 4,5 Didehydrojasmonat in Suppressor 10, so ist es pro-

blematisch, daß dieser Suppressor einen rezessiven Phänotyp hat und man würde erwarten,

daß eine Veränderung in der „Proteinspezifität“ zu einer dominanten Mutation führt. Eine

Möglichkeit, die Anwesenheit von 4,5 Didehydrojasmonat mit einem rezessiven Suppressor

in Einklang zu bringen, wäre die Vorstellung einer Inaktivierung eines negativen Regulators,

der den Transport von OPDA zum Peroxisom einschränkt.

Die OPDA-Abhängigkeit der wiedererlangten Fertilität in den Suppressoren kann auch

getestet werden, indem man die Expression von molekularen Markern überprüft, die spezi-

fisch von OPDA hochreguliert werden. OPR1 ist einer davon und wird COI1-unabhängig von

OPDA spezifisch induziert, aber nicht von Jasmonsäure. Unser nicht gelungenes RT-PCR-

Experiment mit dem OPR1-Marker erlaubte uns allerdings nicht, in dieser Hinsicht

irgendwelche Schlüsse zu ziehen.

4 Diskussion 77 __________________________________________________________________________

Wie im Kapitel Resultate gezeigt wurde, haben wir auch erfolgreich auf die Akkumulation

des jasmonsäureabhängigen (aber nicht OPDA-abhängigen) Markers VSP2 getestet. Dieses

Gen wurde in allen dominanten Suppressoren, die wir charakterisiert haben, konstitutiv

exprimiert (bei Suppressor 24 allerdings mit einem sehr niedrigen Expressionslevel); bei den

rezessiven Suppressoren dagegen nicht.

Wie bereits zuvor erwähnt, könnte ein dominanter Suppressor durch eine qualitative Verän-

derung eines Proteins zustande kommen, oder durch eine konstitutive Expression eines

positiven Regulators in einer Signalkaskade. Wir bevorzugen im Falle unseres dominanten

Suppressors die letztere Hypothese, weil die konstitutive Expression von VSP gewebe-

spezifisch ist (Expression in Blüten, nicht in Blättern). Und wir nehmen nicht an, daß eine

qualitative Veränderung (beim Transport oder bei der β-Oxidation) in einer blüten-

spezifischen Expression von VSP2 resultieren würde.

Außer von Jasmonsäure weiß man noch von Ethylen, daß es VSP2 induziert (x) und in die

Entwicklung von Antheren und Pollen involviert ist (x). Und wie bereits in der Einleitung

erwähnt wurde, sind Signalkaskaden keine linearen „Autobahnen“, die eine Antwort auf ein

spezifisches Input liefern, sondern es existieren Verknüpfungen der Signalkaskaden

untereinander, die man gerade erst zu verstehen beginnt. Es hat sich herausgestellt, daß die

lineare, zweidimensionale Darstellung von Signalkaskaden häufig unzureichend ist. Zwischen

den unzähligen Komponenten, die im Hormonsystem der Pflanze vertreten sind, gibt es so

viele Interaktionen, daß man sich dieses System eher wie ein Netz im dreidimensionalen

Raum vorstellen sollte, bei dem jede Substanz die Möglichkeit hat, mit verschiedenen anderen

Substanzen in Kontakt zu treten. Durch dieses Netz könnten Informationen eventuell in alle

Richtungen weitergegeben werden (Gazzarrini und McCourt, 2003).

4 Diskussion 78 __________________________________________________________________________

Wir können nur hoffen, daß es uns in der Zukunft gelingen wird, Modelle zu entwickeln, die

diesen Vorgängen gerecht werden. Möglicherweise könnten einige der Suppressoren eine

Veränderung an einem kritischen Knotenpunkt zwischen den Signalkaskaden aufweisen.

„Positional cloning“ der in den Suppressoren betroffenen Gene wird uns zu weiteren

interessanten Schlußfolgerungen verhelfen.

5 Literaturverzeichnis 79 __________________________________________________________________________

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Danksagung Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Professor Schaller für die Vergabe eines interessanten Themas und für die Möglichkeit, meine Arbeit unter den hervorragenden Bedingungen durchführen zu können, die mir im Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen zur Verfügung gestellt wurden. Meiner Betreuerin Annick Stintzi möchte ich für Vermittlung weitreichender fachlicher Erkenntnisse danken sowie für ihre Bemühungen, mir stets hilfreich zur Seite zu stehen. Desweiteren gilt mein Dank allen anderen Mitarbeitern des Instituts für die vielen hilfreichen Tips und Anregungen, Hilfestellungen und die interessanten Fachgespräche. Den Mitarbeiterinnen des Gewächshauses danke ich für die gute, oft zeitaufwändige Pflege meiner vielen, vielen Pflanzen und für ihre Gastfreundschaft. Vielen Dank auch an diejenigen Familienmitglieder und Freunde, die mir mit moralischer und sonstiger Unterstützung oft sehr viel Rückhalt geboten haben, besonders an meine Tochter Vlora, die sich in einer entbehrungsreichen Zeit rücksichtsvoll und selbständig verhalten hat und so mein Studium mitgetragen hat.

Identifizierung und Charakterisierung genetischer ... · Mutation im Gen für die OPDA-Reduktase...

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