Aus der Klinik für Dermatologie und Venerologie

der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. D. Zillikens

IgE-Antikörper bei blasenbildenden Autoimmundermatosen:

Epitop-mapping beim bullösen Pemphigoid

Inauguraldissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Universität zu Lübeck

- Aus der Medizinischen Fakultät -

vorgelegt von

Sina Katinka Dresow

aus Braunschweig

Lübeck 2007

1. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. Bernhard F. Gibbs Ph.D 2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. Holger Hennig

Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2008

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 25.11.2008

gez. Prof. Dr. med. Werner Solbach

- Dekan der medizinischen Fakultät -

meinen Eltern

INHALTSVERZEICHNIS I

Inhaltsverzeichnis I

Abkürzungen III

1. Einleitung 1

1.1. Struktur der Epidermis und Dermis 1

1.2. Bullöse Autoimmundermatosen 3

1.3. Das bullöse Pemphigoid 5

1.3.1. Epidemiologie und Klinik 5

1.3.2. Diagnose 6

1.3.3. Pathogenese 8

1.4. IgE-Antikörper und -Rezeptoren 13

1.5. Bullöses Pemphigoid und IgE-Antikörper 17

1.6. Ziele dieser Arbeit 19

2. Materialien 21

2.1. Verwendete Laborgeräte 21

2.2. Verbrauchsmaterialien 22

2.3. Chemikalien und Farbstoffe 23

2.4. Puffer und Lösungen 24

2.5. Zellkulturmedien und Zusätze 25

2.6. Verwendete Zelllinien und Bakterienstämme 26

2.7. Patientenseren 26

2.8. Kontrollen 27

2.8.1. Negativkontrollen 27

2.8.2. Positivkontrollen 27

2.9. Antikörper 28

3. Methoden 29

3.1. Zellkultur 29

3.1.1. HaCaT-Zellkultur 29

3.1.1.1. Auftauen von eingefrorenen Zellen 29

3.1.1.2. Subkultivierung der Zellen 30

INHALTSVERZEICHNIS II

3.1.1.3. Bestimmung der Zellzahl 31

3.1.1.4. Einfrieren von Zellen 31

3.2. Expression der rekombinanten GST-Fusionsproteine

hBP180 ICD-A, -B, -C, -D 32

3.2.1. Primärkultur 33

3.2.2. Sekundärkultur 33

3.2.3. Proteinextraktion 34

3.2.4. Affinitätsaufreinigung 34

3.2.5. Dialyse und Gefriertrocknung 37

3.3. Proteinisolierung 37

3.3.1. Proteinisolierung aus dem Mediumüberstand kultivierter Keratinozyten 37

3.3.2. Herstellung der Keratinozytenextrakte 38

3.3.3. Photometrische Messung der Proteinkonzentration 38

3.4. Westernblotanalyse/Epitop-mapping 39

3.4.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 39

3.4.2. Commassie-Brilliant-Blue- und Silberfärbung der SDS-Gele 40

3.4.3. Western-Blot 41

3.4.4. Immundetektion der transferierten Proteine/Epitop-mapping 42

3.4.5. Auswertung der Bandenmuster 43

4. Ergebnisse 44

4.1. Expression und Affinitätsaufreinigung von rekombinanten GST-

Fusionsproteinen 44

4.2. Erstellung des Patientenkollektivs und der Negativkontrollen 46

4.3. Erhöhte Gesamt-IgE-Spiegel im Serum von BP-Patienten 47

4.4. IgE- und IgG-Autoantikörper-Reaktivität gegen die intrazelluläre

Domäne von BP180 und NC16A1-5 50

4.5. IgE-Autoantikörper-Reaktivität gegen LAD-1 aus dem Mediumüber-

stand kultivierter Keratinozyten 55

4.6. IgE-Autoantikörper-Reaktivität gegen BP180 und BP230 in

Keratinozytenextrakten 57

4.7. IgE-Autoantikörper-Reaktivität gegen den C-terminalen Abschnitt von

BP180 (BP4575) 59

INHALTSVERZEICHNIS III

4.8. Übersicht der Epitoperkennung für IgE auf dem intrazellulären und

extrazellulären Abschnitt von BP180 61

5. Diskussion 64

5.1. Expression und Aufreinigung der verschiedenen rekombinanten

BP180 Polypeptide 66

5.2. IgE- und IgG-Autoreaktivität gegen die extrazelluläre Domäne von

BP180 67

5.2.1. Nachweis von IgE-Autoreaktivität gegen den C-terminalen Abschnitt

von BP180 (BP4575) und gegen LAD-1 69

5.3. IgG-Autoreaktivität gegen einen immundominanten Abschnitt auf der

intrazellulären Domäne von BP180 70

5.4. IgE-Autoreaktivität gegen die intrazelluläre Domäne von BP180 71

5.5. IgE-Autoreaktivität gegen das gesamte BP180-Molekül und BP230 74

5.6. IgE-Autoantikörper besitzen mehrere Epitope auf dem BP180-

Molekül 75

5.7. Ausblick 77

6. Zusammenfassung 79

7. Literaturverzeichnis 81

8. Anhang 91

8.1. Abbildung I: Aufbau des pGEX-1 Vektors 91

8.2. Tabelle I: Primer Sequenzen für die PCR zur Herstellung von cDNA-

Fragmenten des humanen Typ XVII Kollagens/BP180 91

8.3. Tabelle ll: Status der Kontrollpersonen 92

8.4. Tabelle III: Immunoblot-Ergebnisse der Kontrollpersonen 92

Erklärung 93

Danksagung 94

Lebenslauf 95

ABKÜRZUNGEN IV

Abkürzungen

Abb. Abbildung AS Aminosäure(n) BMZ Basalmembranzone BP bullöses Pemphigoid BPAg1 bullöses Pemphigoid Antigen 1 (BP180, Synonym: Kollagen Typ

XVII) BPAg2 bullöses Pemphigoid Antigen 2 (BP230) BSA Bovines Serumalbumin cpm Impulse pro Minute (Counts per minute) C-Terminus/ Carboxy-Terminus/terminal terminal DAB Diaminobenzidin ddH2O bidestilliertes Wasser DEJ dermo-epidermale Junktionszone DIF Direkte Immunfluoreszenz DMSO Dimethylsulfoxid EBA Epidermolysis bullosa aquisita E. coli Eschericha coli EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat ELISA Enzymatischer Immuntest (Enzyme Linked Immunsorbent Assay) et al. et alii FKS Fötales Kälberserum GST Glutathion-S-Transferase h Stunde(n) HRP Horse Radish Peroxidase IF Immunfluoreszenz Ig Immunglobulin IIF Indirekte Immunfluoreszenz IL Interleukin IPTG Isopropyl-ß-D-Thiagalactopyranosid KCE Keratinozytenextrakt kDa Kilodalton LAD Lineare IgA Dermatose LBM Luria-Bertani (nach Miller)- Medium mA Milliampere mAk monoklonaler Antikörper min Minute(n) ml Milliliter (m)M (milli)molar NaCl Natriumchlorid NC nicht-kollagenös nm Nanometer N-Terminus/ Amino-Terminus/terminal terminal PBS Phosphat-buffered saline PG Pemphigoid gestationes PMSF Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid PV Pemphigus vulgaris rpm Revolutions per minute

ABKÜRZUNGEN V

RT Raumtemperatur RZB relative Zentrifugalbeschleunigung SDS(-PAGE) Sodium-Dodecyl-Sulfat(-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) Sek. Sekunden SSS Salt-Split-Skin-Technik Tab. Tabelle TBST tris-buffered saline plus tween TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin V Volt VP Vernarbendes Pemphigoid µl Mikroliter °C Grad Celsius

EINLEITUNG 1

1. Einleitung

Autoimmunität ist eine normale Eigenschaft des Immunsystems und kein patholo-

gischer Zustand per se. Auch im gesunden Organismus können Antikörper, B- und

T-Zellen mit Spezifität gegen körpereigene Antigene nachgewiesen werden. In

diesem Fall schützen Mechanismen der peripheren Toleranz, z. B. durch das Feh-

len costimulatorischer Signale, vor einer autoimmunologischen Zerstörung der

Gewebe und Zellen. Die zentrale Toleranz beschreibt die Entwicklung der T-Zellen

im Thymus, wo sie durch positive und negative Selektion die Fähigkeit zur Unter-

scheidung von Selbst- und Nicht-Selbst erlernen. Fehler in der zentralen und peri-

pheren Toleranz führen zu Autoimmunkrankheiten. Diese sind gekennzeichnet

durch nichtinfektiöse Entzündungszustände, die zur lokalen Organzerstörung

(z. B. insulinabhängiger Diabetes) oder zu systemischen entzündlichen Erkran-

kungen (z. B. bullöses Pemphigoid, Vaskulitiden) führen. Eine Vielzahl von Auto-

immunkrankheiten, die unterschiedliche Organe betreffen sind beschrieben. Sero-

logisch sind diese Erkrankungen oft mit dem vermehrten Auftreten von Autoanti-

körpern verbunden. Die Inzidenz dieser Erkrankungen liegt bei etwa 3-4%, wobei

Frauen häufiger als Männer erkranken.

Die Immunpathologie der Autoimmunerkrankungen ist sehr unterschiedlich. Es

gibt primäre Antikörper-vermittelte, Immunkomplex-vermittelte sowie T-Zell-

vermittelte Autoimmunkrankheiten. Laut Definition spricht man von einer Auto-

immunerkrankung wenn folgende drei Kriterien erfüllt sind:

1. Klinische Hinweise, 2. Direkter Beweis: passiver Transfer von Antikörpern, 3.

Indirekter Beweis: Immunisierung mit einem Antigen.

1.1. Struktur der Epidermis und Dermis

Die Haut stellt mit 1,5 bis 2 m2 das flächengrößte und schwerste (bis 10 kg) sowie

funktionell vielseitigste Organ des Körpers dar. Sie dient sowohl als Barriere ge-

gen äußere Einflüsse als auch zur Aufrechterhaltung der physikalischen Unver-

sehrtheit. Die Haut schützt den Körper vor chemischen, mechanischen und ther-

mischen Schäden, ist an der Regulation von Körpertemperatur und Wasserhaus-

halt beteiligt und übernimmt Aufgaben in der Immunabwehr.

Die Epidermis besteht aus mehrschichtigem verhornten Plattenepithel, welches

die unterliegende Dermis bedeckt. Die Epidermis wird hauptsächlich aus Keratino-

zyten gebildet, weiterhin findet man Melanozyten, Merkel-Zellen als Mechanore-

EINLEITUNG 2

zeptoren sowie Lymphozyten. Als antigenpräsentierende Zellen fungieren sog.

Langerhanszellen, die noch inaktive Dendritische Zellen darstellen. Sie befinden

sich in der Epidermis der Haut und in Schleimhäuten und differenzieren sich nach

dem ersten Antigen-Kontakt zu Dendritischen Zellen, die das Antigen in der Der-

mis den T-Lymphozyten präsentieren. Die Dermis besteht vorwiegend aus kom-

paktem, fibroelastischem Bindegewebe, in das ein Netzwerk aus Blutkapillaren

und Nerven, sowie Hautanhangsgebilde integriert sind. Epidermis und Dermis sind

durch die dermo-epidermale Junktionszone (DEJ) fest miteinander verbunden. Die

DEJ ist elektronenmikroskopisch aus fünf unterscheidbaren Zonen aufgebaut (sie-

he Abb.1). Auf der epidermalen Seite liegen die Hemidesmosomen der basalen

Keratinozyten, es folgen die Lamina lucida, die Lamina densa, die Sublamina den-

sa und die Verankerungsfibrillen der papillären Dermis. Die Hemidesmosomen der

basalen Keratinozyten sind scheibchenförmige Plaques, die die Proteine BP230

und Plektin beinhalten. Es bestehen Interaktionen zwischen den intrazellulären

Anteilen der transmembranösen Ankerfilamente BP180 und 64-Integrin und den

Proteinen der hemidesmosomalen Plaques (BP230 und Plektin). Der extrazellulä-

re Anteil von BP180 erstreckt sich über die Lamina lucida in die Lamina densa und

interagiert mit Laminin 5, welches den Kontakt zu Verankerungsfibrillen der Lami-

na/Sublamina densa vermittelt. Die Verankerungsfibrillen bestehen hauptsächlich

aus Typ 7 Kollagen. Sie ragen von der Lamina densa über die Sublamina densa

bis in die papilläre Dermis (Borradori and Sonnenberg, 1999; Georgi et al., 2001).

Die Vernetzung der Keratinozyten in der Epidermis erfolgt über Desmoso-

men. Sie bestehen aus intrazellulär gelegenen Plaques, in die zelleigene Zytoke-

ratinfilamente und transmembranöse Cadherinen wie Desmogleine (Dsg) und

Desmocolline (Dsc) verankert sind. Diese desmosomalen Cadherine besitzen zu-

dem extrazelluläre Anteile über die die einzelnen Keratinozyten miteinander ver-

bunden werden.

EINLEITUNG 3

Lamina

lucida

Lamina

densa

Sublamina

densa

Basale

Keratinozyten

Dsg 1

Dsg 3

Dsc 1

DPZFHD

Kollagen Typ lV

Kollagen Typ Vll

BP180

BP230Plektin

ß4

664-Integrin

Laminin 5 p200

Lamina

lucida

Lamina

densa

Sublamina

densa

Basale

Keratinozyten

Dsg 1

Dsg 3

Dsc 1

DPZFHD

Kollagen Typ lV

Kollagen Typ Vll

BP180

BP230Plektin

ß4

664-Integrin

Laminin 5 p200

Abb. 1: Schematische Darstellung des Desmosoms und der Autoantigene der dermo-epidermalen Junktionszone. Dsg:Desmoglein 1, 3 und Dsc:Desmocollin. DP:desmosomaler Pla-que, HD:Hemidesmosomen, ZF:Zytokeratinfilamente. Plektin und BP230 sind intrazelluläre hemi-

desmosomale Proteine. Plektin interagiert mit der 4-Kette des 64-Integrin, das Kontakt zu Lami-nin 5 hat. Das transmembranöse BP180 interagiert mit BP230 und Laminin 5. Laminin 5 vermittelt den Kontakt zu Verankerungsfibrillen in der Lamina/Sublamina densa. p200 ist ein noch nicht voll-ständig molekularbiologisch charakterisiertes Protein der tiefen Lamina lucida, welches das Anti-gen einer weiteren Sonderform der Pemphigoiderkrankungen darstellt. (Abb. nach Dr. C. Sitaru)

1.2. Bullöse Autoimmundermatosen

Die bullösen Autoimmundermatosen sind organbezogene Autoimmun-

erkrankungen, die durch das Auftreten von Autoantikörpern gegen Strukturpro-

teine der Haut gekennzeichnet sind. Diese Strukturproteine sind in Form von

Desmosomen an die interzelluläre Zellhaftung der Keratinozyten sowie als Hemi-

desmosomen an der Haftung der Epidermis an der Basalmembran und Dermis

beteiligt (Sitaru et al., 2004; Yancey, 1995). Die genaue Ätiologie der Autoantikör-

perbildung bei bullösen Autoimmundermatosen ist immer noch unklar.

Die Einteilung der Autoimmundermatosen erfolgt anhand der betroffenen Ziel-

struktur.

Man unterscheidet dabei 4 Hauptgruppen:

1. Pemphiguskrankheiten:

Pemphigus vulgaris

Pemphigus foliaceus

Paraneoplastischer Pemphigus

IgA-Pemphigus

EINLEITUNG 4

2. Pemphigoidkrankheiten:

Bullöses Pemphigoid

Pemphigoid gestationis

Lineare IgA-Dermatose

Vernarbendes Pemphigoid

Lichen planus pemphigoides

3. Dermatitis herpetiformis Duhring

4. Epidermolysis bullosa acquisita

Die blasenbildenden Autoimmundermatosen unterscheiden sich zum einen in den

Zielstrukturen der Autoantikörper, zum anderen in der pathogenetischen Wirkung

dieser Autoantikörper.

Bei den Pemphiguskrankheiten führt die Bindung der Autoantikörper an Desmo-

gleine zu einem direkten Funktionsverlust der Desmosomen. Dadurch kommt es

zur Auflösung der Zell-Zell-Adhäsionen und zur Ausbildung schlaffer intraepider-

maler Blasen ohne wesentliche Entzündungsreaktion (Amagai et al., 1994; Ama-

gai et al., 1992; Rock et al., 1990).

Im Unterschied dazu führen Autoantikörper beim bullösen Pemphigoid und

der Epidermolysis bullosa acquisita zu einer Entzündungsreaktion, die zu einer

subepidermalen Blasenbildung führt. Die Entzündungsreaktion wird dabei durch

den Fc-Anteil der Autoantikörper vermittelt. So haben F(ab)2-Fragmente im Unter-

schied zu kompletten Antikörpern, sowohl in vitro als auch in vivo keine patho-

genetische Wirkung (Sitaru and Zillikens, 2005). Das Bullöse Pemphigoid ist eine

autoimmune blasenbildende Hauterkrankung, die durch Ablagerungen von IgG

und Komplement C3 an der kutanen Basalmambran, Infiltration der oberen Dermis

durch inflammatorische Zellen und Ablösung der basalen epidermalen Schicht von

der Dermis gekennzeichnet ist.

Die Lineare IgA-Dermatose (LAD) ist eine seltene subepidermale blasenbil-

dende Autoimmunerkrankung mit Ähnlichkeit zum bullösen Pemphigoid. Sie ist

gekennzeichnet durch lineare IgA-Ablagerungen an der DEJ.

EINLEITUNG 5

1.3. Das bullöse Pemphigoid

1.3.1. Epidemiologie und Klinik

Das bullöse Pemphigoid (BP) ist die mit Abstand häufigste Form kutaner blasen-

bildender Autoimmunerkrankungen. Seine Inzidenz wird für Deutschland mit jähr-

lich 6 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohnern angegeben, mit einem Anstieg

ab dem 7. Lebensjahrzehnt (Budinger et al., 1998; Zillikens et al., 1995). In der

Gruppe der über 90-jährigen liegt die Inzidenz bei ca. 40 pro 100.000 Einwohnern

(Jung et al., 1999; Schmidt et al., 2000a). Die Erkrankung ist weltweit verbreitet

und zeigt keine ethnische, geographische oder geschlechtsgebundene Prädisposi-

tion. Beim BP besteht eine Assoziation mit dem HLA-DQB1*0301 Komplex (Bu-

dinger et al., 1998; Delgado et al., 1996). Selten sind Kinder mit der Form des ju-

venilen Pemphigoids betroffen (Chimanovitch et al., 2000). Eine Induktion des bul-

lösen Pemphigoids durch Medikamente ist insgesamt weniger gut belegt als beim

Pemphigus (Smith et al., 1993; Venning and Wojnarowska, 1995). Hinsichtlich der

Assoziation des BP mit malignen Tumoren gibt es widersprüchliche Studienergeb-

nisse (Ahmed et al., 1977; Venning and Wojnarowska, 1990).

Zu Beginn der Erkrankung bestehen häufig erythematöse, z. T. urtikarielle Haut-

veränderungen, verbunden mit starkem Juckreiz (Hadi et al., 1988). Manchmal ist

der Juckreiz einziges Symptom, bevor nach Monaten Blasen auftreten (Alonso-

Llamazares et al., 1998). Später entwickelt sich ein klinischer Befund mit prallen,

teils hämorrhagischen Blasen sowie rupturierten Blasen mit unregelmäßig konfigu-

rierten Erosionen und Verkrustungen auf teils normal aussehender Haut (poikilo-

dermatisches Bild). Im Vergleich zum Pemphigus vulgaris sind die Blasen viel ge-

spannter und widerstandsfähiger, da ihre Blasendecke von der gesamten Epider-

mis gebildet wird. Häufig treten die Bläschen/Blasen in Gruppen an einer Körper-

stelle auf (Abb. 2). Prädilektionsstellen der symmetrischen Eruptionen sind die

seitliche Halspartie, die Axillen, die Beugeseiten der Oberarme und Oberschenkel

(Sison-Fonacier and Bystryn, 1986) sowie die Nabelregion. In einigen Fällen sind

auch die Palmae und Plantae im Sinne eines dyshidrosiformen Hand- und Fußek-

zems betroffen. Die Schleimhäute zeigen seltener Blasen (Kippes et al., 1999).

Das BP kann auch unter dem Bild eines klinischen Ekzems, einer Urtikaria oder

einer Prurigo simplex subacuta ganz ohne Blasenbildung verlaufen (Kippes et al.,

1999; Wever et al., 1995).

EINLEITUNG 6

Zum häufig schlechten Allgemeinbefinden der Patienten tragen Schwäche, Fieber,

Appetitlosigkeit und Gewichtsverlust bei. Die Laborbefunde fallen oft durch eine

sekundäre Anämie, Leukozytose mit leichter Eosinophilie sowie einer erhöhten

Blutsenkungsgeschwindigkeit (BSG) auf.

Das BP verläuft chronisch rezidivierend und meist selbstlimitierend mit einer

Dauer von zwei bis zu fünf Jahren (Hadi et al., 1988; Korman, 1987; Wojnarowska

et al., 2002; Wojnarowska et al., 2001). Exazerbationen der Erkrankung verlaufen

meist milder als die Initialperiode (Ghohestani et al., 2001; Korman, 1998). Nach

Abheilung der Läsionen bleiben häufig inflammatorische Hyperpigmentierungen

bzw. postbullöse Milien zurück.

Abb. 2: Klinischer Befund beim bullösen Pemphigoid: Pralle, teils hämorrhagische Blasen, Erosionen und Krusten auf erythematösem Grund am Unterarm eines Patienten (a). BP unter dem klinischen Bild eines dyshidrosiformen Handekzems (b). Sogenannte prämonitorische Variante, die sich über Jahre unter dem Bild eines Ekzems manifestiert (c). Quelle: mit freundlicher Genehmigung aus dem Archiv der Klinik für Dermatologie und Venerologie der Universität zu Lübeck.

1.3.2. Diagnose

Neben dem klinischen Bild und der dermatohistopathologischen Untersuchung

sind die direkte und indirekte Immunfluoreszenz für die Diagnostik bullöser Auto-

immundermatosen von Bedeutung. Als wichtigster Beweis für bullöse Autoimmun-

dermatosen gilt der Nachweis einer Ablagerung von Autoantikörpern in der Haut.

Beim BP findet sich histopathologisch eine subepidermale Spaltbildung mit dich-

tem Entzündungsinfiltrat (Abb. 3a).

Die direkte Immunfluoreszenz (DIF) periläsionaler Haut zeigt bei 90% der Patien-

ten eine homogene lineare Bindung von IgG und in fast allen Fällen eine C3-

Ablagerung (Kippes et al., 1999; Korman, 1998). Für die DIF sollte die Hautbiopsie

EINLEITUNG 7

periläsionär, d. h. neben einer frischen Blase, aus gesund erscheinender Haut er-

folgen. Wird direkt aus einer Blase biopsiert ist die DIF häufig falsch negativ, da

Autoantikörper und Komplement im Verlauf einer Entzündung durch Makrophagen

abgebaut werden (Sitaru et al., 2004).

Die indirekte Immunfluoreszenz (IIF) dient zum Nachweis zirkulierender Autoanti-

körper, die gegen die DEJ gerichtet sind. In der IIF wird das Patientenserum auf

humane Haut oder Affenösophagus pipettiert. Mittels eines sekundär fluores-

zierenden Antikörpers können bei ca. 70% der BP-Patienten zirkulierende Auto-

antikörper nachgewiesen werden (Abb. 3b) (Jordon et al., 1967). Eine Verbes-

serung der Sensitivität auf über 90% wird in der IIF durch die Vorinkubation des

Haut-/Schleimhautexzidats in 1 M NaCl-Lösung erreicht (sog. Salt-Split-Skin-

Technik) (Kelly and Wojnarowska, 1988). Die Haut wird durch die Vorbehandlung

im Bereich der Lamina lucida künstlich gespalten und der in vivo gebundene Anti-

körper kann so genauer seiner originären epidermalen, dermalen oder gemischten

Bindungsstelle zugeordnet werden (Gammon et al., 1992). Die IgG4-

Autoantikörperklasse dominiert in der IIF, zudem zeigen sich IgG1 und IgG3, IgA,

IgM und IgE an der Basalmembranzone (Bird et al., 1986).

Abb. 3b: Indirekte Immun-fluoreszenz auf 1 M NaCl-separierter humaner Spalthaut beim bullösen Pemphigoid. Die IgG-Serumantikörper binden an der epi-dermalen Seite (Blasendach) des artifiziell erzeugten Spaltes (x 250). Quelle: mit freundlicher Genehmi-gung aus dem Archiv der Klinik für Dermatologie und Venerologie der Universität zu Lübeck.

Abb. 3a: Dermatohistopatholo-gischer Befund beim BP. Typisch sind die subepidermale Blasenbil-dung und das begleitende Entzün-dungsinfiltrat mit dem massiven Ein-strom von eosinophilen Granulozyten (H & E). Quelle: mit freundlicher Genehmi-gung aus dem Archiv der Klinik für Dermatologie und Venerologie der Universität zu Lübeck.

EINLEITUNG 8

Für die genauere Charakterisierung der Spezifität zirkulierender Autoantikörper

werden immunserologische Untersuchungen wie Immunoblot, ELISA und Immun-

präzipitation durchgeführt (Hertl and Schuler, 2002).

Für den Immunoblot werden Extrakte aus Epidermis/Dermis, kultivierten Keratino-

zyten bzw. aus dem Überstand kultivierter Keratinozyten oder rekombinanter For-

men dieser Proteine eingesetzt. Darüber hinaus stehen verschiedene sensitive

und spezifische ELISA-Systeme zum Antikörpernachweis zur Verfügung. Unter

Verwendung einer rekombinanten Form der NC16A-Domäne wurde ein sensitiver

und spezifischer ELISA entwickelt, dessen Titer gut mit der Krankheitsaktivität

beim BP korreliert (Zillikens et al., 1997).

1.3.3. Pathogenese

Erste Hinweise auf eine immunologische Pathogenese des BP finden sich 1967 in

den Arbeiten von Jordan et al., die in der Haut und im Serum von BP-Patienten

Autoantikörper nachweisen konnten (Jordon et al., 1967). In den letzten 25 Jahren

wurde eine Vielzahl von Autoantigenen der DEJ beim BP identifiziert, darunter das

Protein BP230, welches erstmals 1981 als Zielantigen beschrieben wurde (Stanley

et al., 1981). Wenige Jahre später konnte das 180 kDa schwere transmembranöse

Ankerprotein BP180, das für die dermal-epidermale Adhäsion verantwortlich ist

(Giudice et al., 1993), als primäres Autoantigen beim BP identifiziert werden (La-

bib et al., 1986). Verschiedene weitere bullöse Erkrankungen wurden mit einer

gegen BP180 gerichteten Autoimmunantwort assoziiert, darunter vernarbendes

Pemphigoid, Pemphigoid gestationis, Schleimhautpemphigoid, Lineare IgA-

Dermatose und Lichen Planus Pemphigoid (Van den Bergh and Giudice, 2003).

Die Klonierung der cDNA für BP180 ermöglichte die weitere Charakterisierung von

Erkennungssequenzen des Autoantigens (Diaz et al., 1990; Giudice et al., 1992;

Stanley et al., 1988).

BP180, auch als Kollagen Typ XVII oder BPAG2 bezeichnet, ist ein 180 kDa gro-

ßes, integrales, transmembranöses Typ ll-Glykoprotein. Es besteht aus 1497 Ami-

nosäuren (AS) und besitzt eine N-terminale intrazelluläre Domäne (466 AS), eine

hydrophobe transmembranöse Domäne (23 AS) und eine C-terminale extrazellulä-

re Domäne (1008 AS) (Giudice et al., 1992; Zillikens and Giudice, 1999). Der ex-

trazelluläre Abschnitt enthält 15 kollagene Untereinheiten, die von 16 nicht-

EINLEITUNG 9

kollagenen (NC-) Domänen durchsetzt sind (Giudice et al., 1992; Zillikens and

Giudice, 1999) (s. Abb. 4).

Kollagen XVll/BP180 wurde 1996 erstmals aus Rinderhaut aufgereinigt und nach

Rotationsbedampfung im Elektronenmikroskop abgebildet. Strukturell besteht das

BP180 Molekül N-terminal aus einem globulären Kopf im Hemidesmosom, einem

zentralen Stab und einem flexiblen Schwanz, der extrazellulär bis in die Lamina

densa reicht (Hirako et al., 1998; Masunaga et al., 1997) und in einer Schlaufe

endet (Nonaka et al., 2000). In der menschlichen Haut liegt BP180 in zwei moleku-

laren Formen vor. Zum einen als komplettes homotrimeres BP180-Molekül, wel-

ches aus drei 180 kDa-1(XVll)-Ketten besteht. Zum anderen als proteolytisches

Spaltprodukt LAD-1 (120 kDa), das weitestgehend der Ektodomäne von BP180

entspricht (Schacke et al., 1998). Die Spaltung erfolgt durch membrangebundene

Metalloproteasen an der Oberfläche von Keratinozyten innerhalb der sechzehnten

nicht-kollagenen Domäne (NC16A), die sich extrazellulär unmittelbar an die Zell-

membran anschließt. Dabei liegt nach Franzke et al. die Spaltungsregion zwi-

schen AS 528 und 547, während Hirako et al. die Position des N-Terminus bei AS

524 oder 528 vermuten (Franzke et al., 2002; Hirako et al., 2003). Dieses Freiset-

zen der Ektodomäne von BP 180 (Shedding) wird von Proteinasen der ADAMs

Familie katalysiert (Sheddasen). Da der Proteinkinase C-Aktivator PMA (Phorbol-

ester) das Shedding von BP180 stimuliert, ist anzunehmen, dass der Prozess über

bestimmte Proteinkinase C-abhängige Signaltransduktionswege gesteuert wird

(Blumer and Johnson, 1994). Dabei handelt es sich entweder um den MAP-

Kinase-Weg (mitogen activated protein kinase), der über Wachstumsfaktoren und

Zytokine wie TNF- und IL-1 aktiviert wird oder um den SAPK-Weg (stress activa-

ted protein kinase), der durch Zellstresseinwirkung wie z. B. UV-Strahlung ausge-

löst werden kann (Blumer and Johnson, 1994). Über die biologische Bedeutung

dieser proteolytischen Abspaltung wird vermutet, dass sie bei der Zellmigration bei

Wachstum und Wundheilung eine Rolle spielt.

Ein weiteres Fragment der BP180 Ektodomäne (AS 531-1209) mit einem Moleku-

largewicht von 97 kDa (LABD97) kann aus der Epidermis extrahiert werden (Zone

et al., 1990). Beide Fragmente sind Hauptantigene der blasenbildenden Hauter-

krankung lineare IgA-Dermatose, daher der Name LAD-1 (linear IgA disease anti-

gen 1) und LABD97 (linear bullouse disease antigen of 97 kDa).

EINLEITUNG 10

Beim bullösen Pemphigoid stellt die sechzehnte nicht-kollagene Domäne

(NC16A), die sich extrazellulär unmittelbar an die Zellmembran des basalen Kera-

tinozyten anschließt, einen immundominanten Abschnitt von BP180 dar (Giudice

et al., 1993; Giudice et al., 1994; Matsumura et al., 1996; Zillikens et al., 1997).

Das Auftreten von Antikörpern gegen NC16A korreliert mit der Schwere der Er-

krankung (Tanaka et al., 1996) und die Höhe des Antikörpertiters korreliert mit der

Krankheitsaktivität (Bernard et al., 1997; Schmidt et al., 2000b).

Auch in Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass die IgG-Reaktivität gegen die

NC16A-Domäne eine direkte Rolle in der Entstehung und Progression der Er-

krankung spielt (Liu et al., 1993). Zillikens et al. beschrieben NC16A als ein 73

Aminosäuren langes Protein (AS 490-562) mit einem Molekulargewicht von ca. 35

kDa. In einem Klonierungsversuch unterteilten sie NC16A in 5 Abschnitte zu je ca.

15 Aminosäuren. Auf diesen Abschnitten liegen die Epitope MCW0 bis MCW5 (s.

Abb. 4). BP-Seren reagierten überwiegend mit dem 45 AS langen Bereich nahe

der transmembranen Region der NC16A Domäne (Zillikens et al., 1997) (s. Abb.

4). Das 14 Aminosäuren umfassende MCW1 gilt als Hauptepitop (Matsumura et

al., 1996). Darüber hinaus indiziert der Antikörper gegen MCW1 eine Separation

der DEJ in Gefrierschnitten humaner Spalthaut (Sitaru et al., 2002).

0MCW

1 2 3 4 5NC16A

1 3 4 5

2

0MCW

490 507 521 535 549 562

LAD-1

B C DA

HD490 562

5??

1497

1497

1365 1413

BP180

4575

0MCW

1 2 3 4 5NC16A 1 2 3 4 5NC16A

1 3 4 5

2

0MCW

490 507 521 535 549 562

LAD-1

B C DA

HD490 562

5??

1497

1497

1365 1413

BP180

4575

Abb. 4: Schematische Darstellung des humanen BP180-Proteins. Der N-Terminus liegt intra- und der C-Terminus extrazellulär. Die Intrazellulärdomäne wurde in der vorliegenden Arbeit in 4 Abschnitte unterteilt (s. unten), daran schließt sich die transmembranöse Region. Die Ektodomäne besteht aus 15 kollagenen (in Abb. „dick+grau“ hervorgehoben) und 16 nicht-kollagenen Domänen. Die sechzehnte nicht-kollagene Domäne (NC16A) schließt sich extrazellulär direkt an die Zell-membran an. Zillikens et al. unterteilten die NC16A Domäne in 5 Regionen zu je ca. 15 Aminosäu-ren, die Position der Aminosäuren ist oberhalb der grauen Kästchen angegeben. Unterhalb der fünf Regionen sind als Rauten die verschiedenen Epitope MCW 0 bis 5 angegeben (Zillikens et al., 1997).

EINLEITUNG 11

Eine entscheidende Rolle in der Pathogenese des BPs wird Entzündungszellen

und Entzündungsmediatoren zugeschrieben.

Schon 1982 beschrieben Dvorak et al, dass in der Haut klinischer BP-Läsionen

unterschiedliche histopathologische Veränderungen im Krankheitsverlauf zu er-

kennen sind. Danach sind CD4+-mononukleare Zellen (CD: cluster of differentia-

tion) die ersten infiltrierenden Zellen in der BP-Läsion (Dvorak et al., 1982). Sie

beobachteten zuerst eine Veränderung der Mastzellen mit Verlust der intrazellulä-

ren Granula in der papillären und retikulären Dermis. Nachfolgend ist eine Ein-

wanderung von Lymphozyten und später von eosinophilen und basophilen Granu-

lozyten zu verzeichnen. Die Basophilen befinden sich in einem Fibringerüst und

sind teilweise oder komplett degranuliert (Dvorak et al., 1982). Der Nachweis von

Mastzellen in Gefrierschnitten von BP-Biopsien wurde auch von Dimson et al. er-

bracht (Dimson et al., 2003). Mittels Markierung mit anti-human-Mastzell-Tryptase

und anti-human-IgE konnten in allen Hautbiopsien von BP-Patienten IgE-beladene

Mastzellen in der Dermis nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde mittels eines

monoklonalen anti-BP-180-Antikörper, IgE gebundenes BP180 auf der Oberfläche

der Mastzellen nachgewiesen. In experimentellen Versuchen kommt der Mastzell-

degranulation in der Haut eine Schlüsselrolle bei der Infiltration von Neutrophilen

und anschließender subepidermalen Blasenbildung zu (Chen et al., 2002; Chen et

al., 2001). Katayama et al. wiesen erhöhte Histaminspiegel in der Blasenflüssigkeit

der BP-Läsionen nach (Katayama et al., 1984). Dimson et al. konnten außerdem

eine Histaminfreisetzung aus im Blut zirkulierenden Basophilen nach Stimulation

mit rekombinantem BP180 NC16A messen (Dimson et al., 2003). Auch Fairley et

al. wiesen nach Stimulation mit NC16A eine geringe Histaminfreisetzung aus ba-

sophilen Granulozyten nach (Fairley et al., 2005).

Basophile setzen zudem IL-4, IL-13 und CD40L frei. Der CD40Ligand wird

vom CD40-transmembranen Protein auf der Oberfläche von B-Lymphozyten spe-

zifisch gebunden. Ohne Zusammenspiel von CD40L und CD40 können T-Helfer-

Zellen keine B-Zellen aktivieren. Dann ist auch deren Proliferation und Reifung in

Gedächtnis-B-Zellen und Antikörper-sezernierende Zellen unmöglich. T-Helfer

Zellen (Th-1, Th-2) exprimieren den CD4-Corezeptor auf ihrer Oberfläche und er-

kennen Antigene, die ihnen von speziellen antigenpräsentierenden Zellen (dendri-

tische Zellen, Makrophagen, B-Lymphozyten) auf Klasse ll-MHC-Molekülen dar-

EINLEITUNG 12

geboten werden. Durch Ausschüttung von Zytokinen steuern Th-1 und Th-2 Zellen

die Immunantwort.

BP-Läsionen enthalten eine größere Anzahl an T-Lymphozyten, einschließ-

lich T-Helfer-Zellen und zytotoxischen T-Zellen. Darüber hinaus findet man eine

höhere Anzahl an Makrophagen und Langerhanszellen als in normaler humaner

Haut oder Dermatitis herpitiformis Duhring Läsionen (Nestor et al., 1987). Schaller

et al. wiesen im Patientenblut aktivierte T-Zellen nach, deren Menge mit der

Krankheitsaktivität korreliert (Schaller et al., 1990). Es konnte gezeigt werden,

dass während der Initialphase überwiegend Th-1 Zellen an der Zytokinfreisetzung

beteiligt sind (Ghohestani et al., 1998; Laffitte et al., 2001). Th-1 Zellen sezernie-

ren die Zytokine IL-2 und -Interferon, welche Makrophagen und zytotoxische T-

Zelle zur Zerstörung von aufgenommenen Mikroorganismen aktivieren. In der

Phase der Chronifizierung der BP-Läsionen scheinen Th-2 Zellen in der Überzahl

zu sein. Sie stimulieren durch Freisetzung von IL-4, IL-5 und IL-13 die B-Zellen zur

Proliferation und Sekretion von Antikörpern und induzieren den Klassenwechsel

zu IgG4- und IgE-Antikörper (Ghohestani et al., 1998; Laffitte et al., 2005). Diese

Vorgänge weisen auf die Chronifizierung der Erkrankung hin und spiegeln einen

Wechsel in der Th-1/Th-2 Balance wieder (s Abb. 5).

Erst kürzlich konnten Thoma-Uszynski et al. BP180- und BP230-spezifische T-

und B-Zell Proliferationen nachweisen. Sie zeigten, dass BP180 im Gegensatz zu

BP230 immer von T-und B-Zellen erkannt wird, wobei je nach Krankheitsstadien

unterschiedliche Epitope auf dem BP180 Molekül identifiziert werden. Dieser Be-

fund unterstützt die Annahme, dass BP180 aber nicht BP230 als Hauptantigen an

der Krankheitsentwicklung des BP beteiligt ist (Thoma-Uszynski et al., 2006).

Beim BP führt die Bindung der Autoantikörper zu einer Aktivierung des

Komplementsystems an der kutanen Basalmembran. Dadurch entsteht ein che-

motaktischer Gradient, der zur Rekrutierung von Leukozyten führt. Insbesondere

werden die neutrophilen Granulozyten durch die gebundenen Autoantikörper akti-

viert. Sie stoßen reaktive Sauerstoffradikale und proteolytische Enzyme wie Gela-

tinase und Elastase aus, was im Mausmodell zu Blasenbildung führte (Liu et al.,

1995a; Liu et al., 1995b; Liu et al., 1997; Liu et al., 2000; Liu et al., 1998). Auch

Shimanovich et al. zeigten, dass durch eine Inkubation von humanen Gefrier-

schnitten mit IgG aus BP Seren Granulozyten in die DEJ einwandern und eine

subepidermale Spaltung hervorrufen. Sie konnten zeigen, dass Elastase- und Ge-

EINLEITUNG 13

latinase B-Inhibition, die Antikörper-vermittelte dermo-epidermale Separation ver-

hindern (Shimanovich et al., 2004). Dieser Befund impliziert, dass Elastase und

Gelatinase B (auch MPP-9 genannt) essentiell für die Granulozyten gesteuerte

Proteolyse sind, die schließlich zur Trennung der Epidermis und Dermis führt. Die

aus Neutrophilen freigesetzte Elastase induziert durch Spaltung von BP180 direkt

die Blasenbildung (Verraes et al., 2001). Gelatinase B kann von Makrophagen,

Keratinozyten, Throphoblasten und neutrophilen und eosinophilen Granulozyten

sezerniert werden (Lee and Downey, 2001; Westermarck and Kahari, 1999). Es

wird angenommen, dass die Gelatinase B durch eine aus Mastzellen freigesetzte

Chymase C aktiviert wird (Chen et al., 2001). Die aktivierte Gelatinase B fördert

die Blasenbildung entweder durch die Spaltung von Strukturproteinen der DEJ

oder durch die Inaktivierung von Proteaseinhibitoren aus Granulozyten (Liu et al.,

1998; Weiss, 1989).

Eosinophile werden von IL-4 und IL-5 zur Chemotaxis und Differenzierung ange-

regt (Ameglio et al., 1998). IL-4 wird von Th-2 Zellen, aktivierten B-Zellen, Mast-

zellen und basophilen Granulozyten ausgeschüttet.

Da Eosinophile im histologischen Bild einer BP-Blase dominieren (s. Abb. 3a),

muss auf eine entscheidende Beteiligung von IL-4 und damit auch von Basophilen

und IgE-Antikörpern in der Pathogenese des BPs geschlossen werden.

1.4. IgE-Antikörper und -Rezeptoren

Erste Hinweise auf die Existenz eines IgE-Moleküls im Blut einer Allergikers er-

brachten Prausnitz und Küstner (Prausnitz, 1921) wurde das neuartige Antikörper-

Molekül als IgE-Antikörper identifiziert (Ishizaka and Ishizaka, 1967). Es konnte

von den anderen Immunglobulinen IgG, IgM, IgD und IgA getrennt werden und

erhielt seinen Namen IgE aufgrund des Erythems, welches durch ein Allergen auf

sensitiver Haut hervorgerufen wird (Bibel, 1988). Klassischerweise schützen IgE-

Antikörper den Körpers vor Parasiten und sind zudem an der Pathogenese von

Allergieerkrankungen beteiligt. IgE-Antikörper machen mit 50-300 ng/ml im Ver-

gleich zu IgG mit 10 mg/ml nur einen minimalen Anteil der Serum-Antikörper aus

(Sutton and Gould, 1993). Das IgE-Molekül ist ca. 190 kDa schwer und hat eine

mittlere Halbwertszeit von 3 Tagen. IgE-Antikörper sind nicht in der Lage das

Komplementsystem zu aktivieren. Man beobachtet eine stetige Abnahme der IgE-

Antikörper in der zweiten bis achten Lebensdekade.

EINLEITUNG 14

Der IgE-Antikörper bindet an zwei verschiedene Rezeptoren, den high-affinity Re-

zeptor FcRl und den low-affinity Rezeptor FcRll.

FcRl vermittelt die Bindung von IgE-Molekülen auf der Oberfläche von antigen-

präsentierenden Zellen (APC), Gewebe-Mastzellen sowie im Blut zirkulierenden

basophilen Granulozyten. Antigen-Moleküle kreuzvernetzen diejenigen mem-

brangebundenen IgE-Antikörper, die komplementäre Paratope aufweisen. Durch

die Quervernetzung der IgE-Moleküle kommt es u. a. zur Freisetzung von Hista-

min, IL-4, IL-13 und CD40L aus Basophilen (Gibbs, 2005; Sutton and Gould,

1993) sowie von Histamin und einer Vielzahl weiterer Mediatoren (z. B. Protea-

sen, Proteoglykane, TNF, Zytokine wie IL-4, IL-5, IL-8, IL-13) aus Mastzellen

(Gibbs et al., 2001; Gibbs et al., 2000) (s. Abb. 6). Denselben Effekt haben anti-

IgE-Antikörper oder anti-Idiotyp-Antikörper (Gibbs et al., 1996). Die Rezeptoren

können auch direkt mit anti-Rezeptor-Antikörpern kreuzvernetzt werden. Ebenso

führt kovalent verbundenes IgE, wie auch IL-3 konjugiert an C5a zu einer Über-

brückung der Rezeptoren (Dvorak et al., 1981). Eine weitere Möglichkeit der IgE-

abhängigen Stimulation bieten pflanzliche Lectine, parasitäre Antigene und virale

Superantigene (Falcone et al., 1996). Durch Sensibilisierung der Basophilen (Pri-

ming) mit IL-3, GM-CSF und IL-5 sind die Zellen um ein vielfaches empfindlicher

für IgE-vermittelte Stimulation (Baggiolini and Dahinden, 1994; Plaut et al., 1989).

C 1 C 1

V H V H

C 2 C 2

C 3 C 3

C 4

V L V L

C L C L

C 4

Fab - Fragment

Fc - Fragment

Fab - Fragment

Fc - Fragment

Abb. 5: Darstellung des IgE- Antikörpers. Die Antigen-Bindungsstelle ist aus zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten zusammengesetzt. VH: Variable schwere Kette von ungefähr 440 Aminosäuren (h = hea-vy), VL: Variable leichte Kette, die jeweils aus etwa 220 Aminosäuren aufgebaut sind. Die Fc-Region wird ausschließlich durch die schweren

Ketten gebildet (C1- C4). Das Fc-Fragment

des IgE-AK ist abgeknickt und mit einem C4 länger als der IgG-Antikörper. (Abb. nach PD. Dr. B. F. Gibbs)

EINLEITUNG 15

Antigene

Autoantigene

B-Zelle

Basophiler .

IgE

IL-4, IL-13, CD40L

IL-4

Th-2

IL-4

IL-13

CD40L

Th-0

Th-2-

Entwicklung

IL-4

IL-13

Endothel

“AK-class

switching“

IgG IgE

VCAM-1

Einwanderung von

Leukozyten ins Gewebe

Klinische Symptome:

Urtikaria, Rötung, Juckreiz

Histamin

MastzelleAktivierte Gelatinase B

fördert die Blasenbildung

durch Spaltung von

Strukturproteinen der DEJ

bzw. Inaktivierung von

Proteaseinhibitoren (s. Text)

Leukotriene,

Zytokine

Proteasen z.B.

Chymase C

z. B. IL-8 als chemotaktischer Faktor

für neutrophile Granulozyten

Antigene

Autoantigene

B-Zelle

Basophiler .

IgE

IL-4, IL-13, CD40L

IL-4

Th-2

IL-4

IL-13

CD40L

Th-0

Th-2-

Entwicklung

IL-4

IL-13

Endothel

“AK-class

switching“

IgG IgE

VCAM-1

Einwanderung von

Leukozyten ins Gewebe

Klinische Symptome:

Urtikaria, Rötung, Juckreiz

Histamin

MastzelleAktivierte Gelatinase B

fördert die Blasenbildung

durch Spaltung von

Strukturproteinen der DEJ

bzw. Inaktivierung von

Proteaseinhibitoren (s. Text)

Leukotriene,

Zytokine

Proteasen z.B.

Chymase C

Antigene

Autoantigene

B-Zelle

Basophiler .

IgE

IL-4, IL-13, CD40L

IL-4

Th-2

IL-4

IL-13

CD40L

Th-0

Th-2-

Entwicklung

IL-4

IL-13

Endothel

“AK-class

switching“

IgG IgE

VCAM-1

Einwanderung von

Leukozyten ins Gewebe

Klinische Symptome:

Urtikaria, Rötung, Juckreiz

Histamin

MastzelleAktivierte Gelatinase B

fördert die Blasenbildung

durch Spaltung von

Strukturproteinen der DEJ

bzw. Inaktivierung von

Proteaseinhibitoren (s. Text)

Leukotriene,

Zytokine

Proteasen z.B.

Chymase C

z. B. IL-8 als chemotaktischer Faktor

für neutrophile Granulozyten

Abb. 6: Darstellung der IgE-abhängigen Aktivierung der basophilen Granulozyten und Mast-zellen sowie der immunmodulatorischen Wirkung von IL-4 auf die Th-Zellen. FcRI vermittelt die Bindung von IgE auf der Oberfläche von basophilen Granulozyten und wird durch die Querver-netzung zweier IgE-Moleküle aktiviert. Effekte der Zytokin-, Protease- und CD40L-Ausschüttung siehe Text.

Durch die Quervernetzung zweier IgE-Moleküle auf der Oberfläche von basophilen

Granulozyten durch ein Antigen kommt es zur Ausschüttung von IL-4, IL-13, His-

tamin und CD40L aus den Basophilen. Dabei unterstützt IL-4 die Ausreifung der

Th-2-Zelle, die wiederum durch Ausschüttung von IL-4, IL-13 und CD40L die B-

Zelle zur Synthese von Immunglobulinen bzw. Isotypen-switching anregt. IL-4 und

IL-13 sorgen darüber hinaus für die Synthese chemotaktischer Faktoren, wie die

Präsentation von VCAM-1 auf dem Gefäßendothel. Hieran bindet VLA-4, was zur

Einwanderung von T-Zellen, eosinophiler und basophiler Granulozyten selbst in

das betroffene Gewebe führt (Gibbs, 2005) (s. Abb. 6).

FcRll, auch CD23 genannt, ist ein Rezeptor für IgE mit geringer Affinität. CD23 ist

ein 45 kDa Typ ll-Membranprotein. Man unterscheidet zwei Formen des CD23-

Rezeptors, CD23a und CD23b, die sich aufgrund einer 6/7 N-terminalen Amino-

säure unterscheiden. CD23a sitzt auf B-Zellen, Eosinophilen und Langerhanszel-

len. CD23b wird auf Monozyten, Makrophagen und Thrombozyten exprimiert. Die-

ser Rezeptor besitzt je nach Lokalisationsort und Liganden unterschiedliche Funk-

tionen. Der B-Zell FcRlla-IgE-Antigen-Komplex aktiviert zytotoxische Zellen. Da-

rüber hinaus ist CD23 maßgebend an der Feedback-Regulation der IgE-Synthese

beteiligt. IgE und der IgE-Antigen-Komplex inhibieren die Freisetzung von gelös-

tem sCD23 und unterdrücken somit die IgE-Neusynthese (s. Abb. 7a, 7b). Die

EINLEITUNG 16

Produktion von IgE wird gesteigert, wenn sCD23 simultan an CD21 und IgE auf

der Oberfläche von B-Zellen bindet (Aubry et al., 1992; Sutton and Gould, 1993).

Membrangebundenes CD23 ist an der Down-Regulation der IgE-Synthese betei-

ligt. Findet eine Kreuzvernetzung von CD23 auf humanen B-Zellen mit IgE durch

IgE-Antigen-Komplexe oder Anti-CD23-Antikörper statt, wird die B-Zell-

Proliferation und IgE-Synthese gehemmt (Luo et al., 1991; Sherr et al., 1989). Die

Studie von Hibbert et al. zeigte, dass die Bindung von IgE an membrangebun-

denes CD23 eine Abspaltung und Bildung von löslichem CD23 verhindert. Damit

liegt weniger sCD23 vor, welches für die Stimulation der IgE-Synthese benötigt

wird (Hibbert et al., 2005).

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

+

mIgE

mCD23C1

C1

VH

VH

C2C2

C 3C 3

C 4

VL

VL

CL

CL

C 4

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

Antigen-Komplex

CD21

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

+

mIgE

mCD23C1

C1

VH

VH

C2C2

C 3C 3

C 4

VL

VL

CL

CL

C 4

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

Antigen-Komplex

CD21

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

+

mIgE

mCD23C1

C1

VH

VH

C2C2

C 3C 3

C 4

VL

VL

CL

CL

C 4

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

Antigen-Komplex

C1

C1

VH

VH

C2C2

C 3C 3

C 4

VL

VL

CL

CL

C 4

C1

C1

VH

VH

C2C2

C 3C 3

C 4

VL

VL

CL

CL

C 4

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

Antigen-Komplex

CD21CD21

Abb. 7a: Herunterregulation der IgE-Synthese: „Wettstreit“ zwischen CD23 und CD21 um das membrangebundene IgE auf der Oberfläche der B-Zellen. Die Co-Kreuzvernetzung zwischen membrangebundenem CD23 und membrangebundenem IgE durch einen IgE-Allergen-Komplex führt zur Herunterregulation der IgE-Synthese.

mIgE

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

+

CD21

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

sCD23

mIgE

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

+

CD21

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

sCD23

mIgE

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

+

CD21

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

sCD23

mIgE

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

+

CD21

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

sCD23

mIgE

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

+

CD21

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

+

CD21

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

sCD23

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

C1 C1

VH VH

C2 C2

C 3C 3

C 4

VL VL

CL CL

C 4

sCD23

Abb. 7b: Steigerung der IgE-Synthese: Die gelöste Form des CD23 Rezeptors kreuzvernetzt membrangebundenes IgE und CD21 auf der Oberfläche der B-Zelle und führt damit zur Steigerung der IgE-Synthese. Außerdem kommt es durch die Bindung von IgE an membrangebundenes CD23 zur Verhinderung der Protolyse und damit der Bildung von löslichem CD23 (sCD23).

EINLEITUNG 17

Zunehmend werden IgE und Mastzellen wichtige Funktionen bei der Ent-

stehung von Autoimmunerkrankungen und bei der Regulation der Immunantwort

zugewiesen (Frossi et al., 2004). IgE-Autoantikörper wurden bei Patienten mit Au-

toimmunthyreoiditis beschrieben (Guo et al., 1997; Sato et al., 1999). Erhöhte IgE-

Spiegel wurden auch bei Anti-SSA-Antikörper positiven Frauen nach Verlust des

Fetus gemessen (Sekigawa et al., 2004). In beiden Fällen konnte die genaue Rol-

le von IgE nicht aufgeklärt werden. Darüber hinaus weist eine wachsende Zahl

von Studien auf die Bedeutung von IgE-Autoantikörper beim Bullösen Pemphigoid

hin (Chen et al., 2002; Christophoridis et al., 2000; Delaporte et al., 1996; Dimson

et al., 2003; Dopp et al., 2000; Fairley et al., 2005; Provost and Tomasi, 1974).

1.5. Bullöses Pemphigoid und IgE-Antikörper

Das Gesamt-IgE bei BP-Patienten ist in 70% der Fälle erhöht, wobei die BP180

NC16A-Domäne als antigene Determinante für Auto-IgE-Antikörper wirkt (Dimson

et al., 2003). Der IgE-Titer gegen NC16A korreliert sowohl mit der Krankheitsakti-

vität als auch mit der Krankheitsschwere (Delaporte et al., 1996). Fairley et al.

konnten zeigen, dass beim Bullösen Pemphigoid die IgE-Reaktivität gegen den

extrazellulären Teil von BP180 mit der IgG-Reaktivität korreliert. Die IgE-

Antikörper gegen NC16A sind dabei überwiegend gegen die Subdomaine NC16A2

gerichtet (s. Abb. 4). Außerdem beobachteten sie, dass die Histaminfreisetzung

durch basophile Granulozyten mit der IgE-Immunreaktivität gegen NC16A einher-

geht (Fairley et al., 2005). Die Mastzelldegranulation führt zudem zur Ausschüt-

tung von chemotaktischen Faktoren für eosinophile und neutrophile Granulozyten

(Kasahara-Imamura et al., 2001). Die Freisetzung von neutrophilen Elastase und

Matrixmetalloproteinasen, wie Gelatinase B aus Eosinophilen, Neutrophilen und

Makrophagen ist für die Blasenbildung verantwortlich (Gammon et al., 1982;

Stahle-Backdahl et al., 1994; Verraes et al., 2001). In B-Zell Klonen, die Autoanti-

körper gegen BP180 oder BP230 produzieren, kann es zu einem Klassenwechsel

von IgG- zu IgE-Antikörpern kommen (Bernard et al., 1990; Dopp et al., 2000;

Ghohestani et al., 1998). Der Wechsel des Isotypen mit Anlage der IgE-Antikörper

an der Basalmembran mag für die Erhöhung der Eosinophilen im Serum und im

Gewebe und abschließender Aktivierung von Zellen, die den Fc-Rezeptor expri-

mieren verantwortlich sein (Parodi and Rebora, 1992; Schmidt et al., 1995; Soh et

al., 1993), d. h. die IgE-Synthese trägt zur Aktivierung von IgE-tragenden Zellen,

EINLEITUNG 18

wie Eosinophilen und Mastzellen bei (Dubucquoi et al., 1994; Soh et al., 1993).

Gelatinase B wird durch die Bindung von IgE an die FcRl-positiven eosinophilen

Granulozyten freigesetzt und trägt u. a. zur Ablösung der Haut von der Basal-

membran bei, was klinisch als pralle Blase imponiert. Ein weiterer Hinweis für die

Beteiligung von IgE-Antikörpern beim BP wurde von Kraft et al. beschrieben:

Dendritische Zellen können den FcRl unter bestimmten Krankheitsbedingungen

exprimieren und benutzen diesen Rezeptor möglicherweise um IgE-gebundene

Antigene den T-Zellen zu präsentieren (Kraft et al., 1998). Gegen diesen Fc-

Rezeptor-l wurden IgG-Autoantikörper im Serum von BP-Patienten beschrieben

(Fiebiger et al., 1998). Im Gegensatz zu Anti-BP180-IgE-Antikörpern, die eine His-

taminausschüttung bei Mastzellen induzieren (Dimson et al., 2003), verursachen

die IgG-Autoantikörper gegen den FcRl keine Mastzellstimulation (Fiebiger et al.,

1998). Es ist nicht geklärt, wie diese Rezeptor-Antikörper an der Pathogenese des

BP beteiligt sind.

Soh et al. beschreiben die Anreicherung von CD23+-Zellen in dem Infiltrat

der BP-Läsionen (Soh et al., 1993). Schmidt et al. zeigten, dass auch die gelöste

Form des IgE-Rezeptors sCD23 in der Blasenflüssigkeit und im Serum der Patien-

ten erhöht ist. Zudem korreliert der Total IgE-Titer mit freiem sCD23 in den Serum-

Proben von BP-Patienten (Schmidt et al., 1995). CD23 kann als pleiotropes Zyto-

kin betrachtet werden. Delespesse et al. demonstrierten, dass dieser niedrigaffine

Rezeptor CD4+-Zellen stimuliert und als hemmender Faktor für die Einwanderung

von Monozyten/Makrophagen wirkt (Delespesse et al., 1992). Diese beiden Effek-

te erklären, warum in BP-Läsionen CD3+- bzw. CD4+-Zellen 70% der mononuk-

learen Zellen in der Dermis ausmachen, während die Makrophagen an der Basal-

membranzone dominieren (Ambach et al., 1992; Zillikens et al., 1992). Die erhöh-

ten IgE-Spiegel in der Blasenflüssigkeit der Läsionen lassen darauf schließen,

dass IgE aus dem Blut in die Bläschen diffundiert, da B-Zellen in der BP-Läsion

weniger als 1% des Entzündungsfiltrats ausmachen und somit eine lokale IgE-

Sekretion, die mit den erhöhten IgE-Spiegeln im Blut korreliert, unwahrscheinlich

macht (Schmidt et al., 1995).

Kürzlich wurde im Mausmodell gezeigt, dass IgE-produzierende Hybri-

doma-Zellen gegen LABD-97 in implantierter humaner Haut auf SCID-(Severe

Combined Immundeficiency Disorder) Mäusen Blasen hervorrufen. Zudem ließ

sich die Einwanderung von Eosinophilen und eine Mastzelldegranulation in der

EINLEITUNG 19

Läsion nachweisen (Zone et al., 2007). Dieses Phänomen ließ sich jedoch nicht

mit IgG- und IgA-Antikörpern darstellen, was auf die entscheidende Rolle von IgE

beim BP zurückschließen lässt. In früheren Studien galt das in den Keratinozyten

hemidesmosomal gelegene BP230 Protein als hauptsächliche Erkennungsstruktur

der IgE-Autoantikörper (Delaporte et al., 1996; Ghohestani et al., 1998; Soh et al.,

1993).

Neben diesen histologischen und experimentellen Resultaten, weist auch der urti-

karielle Untergrund der Läsionen und die Tatsache, dass die Patienten initial von

starkem Juckreiz geplagt sind daraufhin, dass IgE eine Rolle in der Pathogenese

der Erkrankung spielt.

1.6. Ziele dieser Arbeit

BP180 (Kollagen XVll) ist ein Bestandteil der dermo-epidermalen Junktionszone

und fungiert als Interaktionspartner für hemidesmosomale und extrazelluläre Ma-

trixproteine. BP180 ist das Hauptantigen für Autoantikörper beim bullösen Pem-

phigoid, einer subepidermalen blasenbildenden Autoimmundermatose.

Die klinischen Symptome der BP-Patienten sind gekennzeichnet durch starken

Juckreiz sowie urtikarielle Plaques und weisen damit auf das Mitwirken von Mast-

zellen und basophilen Granulozyten in der Pathogenese dieser Erkrankung hin. In

vorangegangenen Studien wurde von erhöhten Gesamt-IgE-Spiegeln im Blut von

BP-Patienten und von Auto-IgE-Antikörper gegen die NC16A-Domäne berichtet.

Der massive Einstrom von eosinophilen Granulozyten, die u. a. durch IL-4 und

Komplement zur Chemotaxis angeregt werden, weist auf das Mitwirken von IgE-

Antikörpern und Basophilen bei der Blasenentstehung hin.

In mehreren Studien wurde gezeigt, dass BP180 neben NC16A weitere an-

tigene Strukturen sowohl auf der intrazellulären als auch auf der extrazellulären

Domäne enthält. Aus BP-Patientenblut isolierte basophile Granulozyten wurden

mit NC16A stimuliert und führten zu einer kaum messbaren Histaminfreisetzung

und einer nur geringen IL-4-Ausschüttung (mündliche Mitteilung PD Dr. B. F.

Gibbs). In anderen Veröffentlichungen konnte eine Histaminfreisetzung aus Baso-

philen nach Stimulation mit NC16A gemessen werden. Die Befunde lassen vermu-

ten, dass möglicherweise weitere Epitope auf dem BP180 Molekül für IgE-

Autoantikörper existieren. Vor einigen Jahren wurde IgE-Autoreaktivität in BP-

Seren gegen das intrazelluläre Protein BP230 beschrieben. Dies ist ein Hinweis,

EINLEITUNG 20

dass es möglicherweise auch intrazelluläre antigene Bereiche auf BP180 für IgE-

Autoantikörper gibt.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden BP-Seren auf ihre IgE-spezifische Reaktivität

gegen rekombinant hergestellte Abschnitte der intra- und extrazellulären Domäne

von BP180 untersucht. Darüber hinaus wurde LAD-1 aus dem Mediumüberstand

von Keratinozyten und Keratinozytenextrakten auf ihre Antigenität für IgE-

Autoantikörper überprüft.

MATERIALIEN 21

2. Materialien

2.1. Verwendete Laborgeräte

Airsterilisator-US PATS Binder GmbH, Tuttlingen

Begasungsbrutschrank Haereus Instruments GmbH, Hanau

Biophotometer, 8,5 mm Eppendorf AG, Hamburg

Bio Vortex V1 lab4you GmbH, Berlin

Blockthermostat BT 5320 Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH,

Hamburg

Dampfsterilisator Webeco GmbH, Bad Schwartau

Elektrische Feinwaage PT 150 Sartorius AG, Göttingen

Elektrophoresekammer Sub-Cell GT Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Eppendorf Pipetten Eppendorf Referencen, Hamburg

Gefrierkombination (+4 °C, -20 °C) Liebherr-International AG, Bulle, Schweiz

Gefriertruhe C660 (-80 °C) New Brunswick Scientific, England

Gelkassetten Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Inkubator, CERFOMATIS B. Braun Biotech International,

Melsungen

Kühlkammer Viessmann GmbH & Co. KG, Allendorf

Kühlzentrifuge Megafuge 1,0 Haereus Instruments GmbH, Hanau

Laborabzug captairchem Erlab Laboreinrichtungen GmbH &

Co. KG, Wangen

Lyophilisator Leybold-Heraeus, Hanau

Magnetrührer MSH 300 lab4you GmbH, Berlin

Mikroskop Wilovert S Helmut Hund GmbH, Wetzlar

Mini-PROTEAN 3 Gelkammer Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Mini Trans-Blot Cell Gelkassette Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Netzgerät PowerPac HC Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Netzgerät Power Supply EPS 3500 Pharmacia GmbH, Ratingen

Neubauer Zählkammer Brand GmbH & Co. KG, Wertheim

pH-Meter ph526 MultiCal WTW, Weilheim

Schütteltisch Duomax 1030 Heidolph Instruments, Nürnberg

Sonopuls UW 2070 Bandelin electronic, Berlin

MATERIALIEN 22

Sterilbank, Biowizard Kojar W. H. Mahl, Trendelburg

Tischzentrifuge (Rotor: Sorvall 3328) Haereus Instruments GmbH, Hanau

Überkopfschüttler (Kühlraum) Heidolph Instruments, Nürnberg

Vakuumpumpe XF54 23050 Millipore Corporation, Massachusetts,

USA

Wasserbad WTH 500 Hecht-Assistent, Sondheim

Zentrifuge, AvantiJ-25 Beckman Coulter, California, USA

2.2. Verbrauchsmaterialien

Aluminiumfolie Paclan A. Hartenstein Laborbedarf, Würzburg

Blot-Filterpapier Schleicher und Schuell GmbH, Dassel

Blutabnahmesystem SMonovette Sarstedt AG & Co, Nümbrecht

Chromatographie-Säule, Poly-Prep Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Dialyseschlauch Roth, GmbH & Co, Karlsruhe

Einfrierbox, Nalgene, IDL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht

Einmal-Kanülen Becton Dickinson GmbH, Heidelberg

Einmal-Küvetten UVette Eppendorf AG, Hamburg

Erlenmeyerkolben A. Hartenstein Laborbedarf, Würzburg

Gelloader-Spitzen (1-200 µl) A. Hartenstein Laborbedarf, Würzburg

Gewebekultur-Petrischalen Becton Dickinson GmbH, Heidelberg

Glutathion-Sepharose 4 Fast Flow Amersham Biosciences, Piscatway,

USA

Kryoröhrchen (2 ml) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Nitrozellulose Membran (0,45 µm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München

QuixSep, Micro Dialyser Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe

Reaktionsgefäße 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml Eppendorf AG, Hamburg

Serologische-Pipetten 5 ml, 10 ml, 25 ml Biochrom AG, Berlin

Skalpellklingen (einmal) Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe

Zellkulturflaschen 25 cm2 Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Zellkulturflaschen 75 cm2, 175 cm² Becton Dickinson GmbH, Heidelberg

Zellschaber Sarstedt AG & Co., Nümbrecht

Zentrifugenflaschen 500 ml Biochrom AG, Berlin

Zentrifugenröhrchen 1,5 ml, 2 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht

Zentrifugenröhrchen 15 ml, 50 ml Biochrom AG, Berlin

MATERIALIEN 23

2.3. Chemikalien und Farbstoffe

Acrylamid 4K-Lösung (30%) AppliChem, Darmstadt

Ammonium Persulfate (APS) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

β-Mercaptoethanol Merck KGaA, Darmstadt

Bio-Rad Protein Assay Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Borsäure AppliChem, Darmstadt

Bovines Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Bromphenolblau 0,2% Merck Eurolab GmbH, Darmstadt

Coomassie Brilliant Blue (R250) Bio-Rad Laboratories GmbH, München

di-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) Merck KGaA, Darmstadt

di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck KGaA, Darmstadt

Dodecylsulfat Natriumsalz (SDS) Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn

EDTA Dinatriumsalz Dihydrat Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe

Essigsäure 99-100% J. T. Baker, Deventer-Holland

Ethanol 70% Apotheke UKSH, Campus Lübeck

Fast Green Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Glutathion Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Glycerol AppliChem, Darmstadt

Glycin Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe

Kaliumchlorid (K+Cl-) Merck KGaA, Darmstadt

Magermilchpulver Merck KGaA, Darmstadt

Methanol 99,8% J. T. Baker, Deventer, Holland

Natriumchlorid (NaCl-) J. T. Baker, Deventer, Holland

Ortophosphorsäure Merck KGaA, Darmstadt

Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Protein-Standard (farbmarkiert) Bio-Rad Laboratories, California, USA

Salzsäure (HCl) Merck KGaA, Darmstadt

SDS-PAGE-Standard (SDS-6H) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

MATERIALIEN 24

TEMED Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe

Trichloressigsäure (TCA) Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe

Tris Base Merck KGaA, Darmstadt

Tris HCl Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe

Trypan Blue Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Tween 20 (M = 1227,72 g/mol) AppliChem, Darmstadt

Wasserstoffperoxid Merck KGaA, Darmstadt

2.4. Puffer und Lösungen

TBST 2 mM: 12,1 g/l Tris Base; 40 g/l NaCl; Tween20 0,5%

v/v in ddH2O; pH 7,5 mit 2 M HCl eingestellt

PBS 10-fach: 80 g/l NaCl; 2 g/l KCl; 14,4 g/l Na2HPO4; K2HPO4

in ddH2O

Puffer zur Affinitätsaufreinigung/Säulenchromatographie:

Borat-Puffer 0,1 M: 6,183 g/l Borsäure; 29,22 g/l NaCl in ddH2O; pH

8,5 mit 2 M NaOH eingestellt

Essig-Puffer 0,1 M: 6 ml Essigsäure; 29,22 g/l NaCl in ddH2O; pH 4

mit 2 M NaOH eingestellt

Elutionspuffer 20 mM: 0,31 g Glutathion ad 50 ml PBS; pH 9 mit 2 M

NaOH eingestellt

Puffer zur SDS-Gelelektrophorese:

SDS-Probenpuffer 5-fach, reduzierend: 60 mM Tris-HCl pH 6,8; 3% w/v SDS;

50 mM Mercaptoethanol; 10% v/v Glycerol;

0,003% w/v Bromphenolblau

Laufpuffer 5-fach: 15 g/l Tris Base; 72 g/l Glycin; 5 g/l SDS in

ddH2O

Tris-Glycin 10-fach: 144,13 g/l Glycin; 30,3 g/l Tris Base in ddH2O

Transferpuffer: 100 ml Tris-Glycin 10-fach; 200 ml Methanol; 700

ml ddH2O.

MATERIALIEN 25

2.5. Zellkulturmedien und Zusätze

Luria- Bertani-Medium nach Miller (LB-Medium):

Minimales Medium zur Anzucht von E. coli

10 g/l Bacto-Trypton; 5 g/l Hefe Extrakt; 10 g/l NaCl wurden in ddH20 gelöst und

mit 2 M NaOH auf pH 7,5 eingestellt. Anschließend wurde das Medium für 20 min

bei 120 °C und 2 bar autoklaviert. Für die selektive Aufzucht von E.coli enthielt das

LB-Medium Carbenicillin in einer Endkonzentration von 50 µg/ml.

Keratinozyten Growth Medium 2 (KGM2): Firma: PromoCell GmbH, Heidelberg

Kultivierung von HaCaT-Zellen

Vor Verwendung wurde dem Medium Supplement zugegeben, das aus 2 ml BPE-

15 (Bovine pituitary extract); 62,5 ng/500µl hEGF (human epidermal growth fac-

tor); 165 µg/500 µl HC (Hydrocortison); 2,5 mg/500 µl Insulin; 195 µg/500 µl Epi-

nephrin; 5 mg/500 µl Transferrin und 150 µl CaCl2-0,5/0,15 besteht. Ggf. wurden

dem Kulturmedium 100 Units Penicillin/ml und 100 µg Streptomycin/ml zugesetzt.

Zelleinfrierlösung:

Zum Einfrieren von Zelllinien bei -80 °C

10% v/v DMSO (Dimethylsulfoxid) in PBS sterilisiert

50% v/v FCS

40% v/v Keratinozytenwachstumsmedium

Ammoniumsulfat-Puder (APS) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Carbenicillin Dinatriumsalz Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe

Dimethylsulfonat (DMSO) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Dulbecco’s Phosphate Buffer (PBS) PAA Laboratories GmbH, Cölbe

Fötales Kälberserum (FCS) PAA Laboratories GmbH, Cölbe

Hefe-Extrakt Difco Mikrobiology, Kansas City, USA

Isopropyl-D-beta-thyogalactopyranoside AppliChem, Darmstadt

Keratinozytenwachstumsmedium 2 PromoCell GmbH, Heidelberg

L-Ascorbinsäure Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

MATERIALIEN 26

Penicillin/Streptomycin PAA Laboratories GmbH, Cölbe

(10.000 Units/ml/ 10 mg/ml)

Phenylmethylsulfonyl-Fluorid (PMSF) AppliChem, Darmstadt

SupplementPack PromoCell GmbH, Heidelberg

Trypsin/EDTA Lösung 0,05%/ 0,02% (w/v) Biochrom KG,Berlin

Trypton/Pepton Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe

2.6. Verwendete Zelllinien und Bakterienstämme

In der Arbeit wurden Keratinozyten der Linie HaCaT (Human adult low Calcium

high Temperature) verwendet (Boukamp et al., 1988). Herkunft: Dr. med. Fusenig,

DKFZ, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg.

HaCaT-Zellen dienen als Modell für humane Keratinozyten (Boukamp P, 1988;

Ryle, CM 1989). Im Gegensatz zu normalen Keratinozyten wachsen HaCaT-

Zellen in konventioneller Kultur, das bedeutet ohne organotypische Co-Kultur-

bedingungen wie z. B. Fibroblasten.

Für die Expression der rekombinanten Proteine GST-hBP180-ICD-A-D, -NC16A,

und -BP4575 (C-terminaler Abschnitt) wurde der E. coli-Expressionsstamm No-

vaBlue verwendet;

Genotyp: endA1, hsdR17 (rK12-, m K12+), supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, lac,

F´ [proAB+,laclqZM15::Tn10(TetR)]. (Eine genauere Erklärung der Angaben und

Kurzbezeichnungen für den Genotyp findet sich in einschlägiger Literatur über

Mikrobiologie). Herkunft: Merck KGaA -Biosciences, Darmstadt

2.7. Patientenseren

Für die vorliegende Arbeit wurden die Seren von 20 nicht vorbehandelten Patien-

ten mit der Diagnose bullöses Pemphigoid untersucht. Alle Patienten wiesen typ-

ische klinische Manifestationen des bullösen Pemphigoids auf. Mindestens eine

der Screening-Untersuchungen (ELISA, DIF, IIF) musste positiv sein (s. Tab. 3).

Von den 20 Patienten waren 5 männlich und 15 weiblich. Das Alter lag zwischen

57 und 94 Jahren, mit einem Durchschnittsalter von 83 Jahren. Die DIF periläsio-

naler Hautbiopsien und die IIF in Salt-Split-Skin-Technik wurden wie beschrieben

durchgeführt (Zillikens et al, 1996).

MATERIALIEN 27

Die Blutproben wurden den Patienten vor Einleitung der Therapie entnommen. Die

Personen wurden vor der Blutentnahme über die Studie aufgeklärt und haben eine

Einwilligungserklärung zur Verwendung ihrer Seren an dieser Untersuchung un-

terschrieben.

Das Blut wurde 8 min bei 15 °C und 3600 rpm (Zentrifuge Heraeus Megafuge 1,0,

Rotor 7570, durchschnittliche RZB= 600 x g) zentrifugiert und das Serum abpipet-

tiert und aliquotiert. Die Seren wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C

gelagert. 500 µl jeder Serumprobe wurde zur Gesamt-IgE-Bestimmung mittels

Fluoreszenz-Enzym-Immunoassay und SX1-Analyse ins Labor der Immunolo-

gischen Klinik der Universität zu Lübeck gegeben. SX1 ist eine Abkürzung für

Mischallergene und beinhaltet die acht häufigsten Allergene. Bei positiven SX1, d.

h. spezifischen IgE-Werten >0,35 kU/l erfolgte die weitere Aufschlüsselung nach

diesen Allergenen (s. Tab. 4).

2.8. Kontrollen

2.8.1. Negativkontrollen

Als Negativkontrollen dienten insgesamt 10 Seren. Davon stammte ein Serum von

einer durch IIF, DIF und immunserologischer Untersuchung gesicherten PV-

Patientin. Die anderen 9 Kontrollpatienten wurden nicht selektiert bzw. wiesen kei-

nerlei klinische Hinweise auf ein bullöses Pemphigoid auf, so dass diese keinen

diagnostischen Untersuchungen in der Dermatologischen Universitätsklinik zu Lü-

beck unterzogen wurden. Die Geschlechterverteilung männlich:weiblich war 2:8.

Das Alter der Kontrollpersonen lag zwischen 28 und 93 Jahren (s. Tab. I im An-

hang) und ähnelt somit in der Alters- und Geschlechtszusammensetzung der Pa-

tientengruppe. Die Kontrollpersonen waren mit keinerlei Medikamenten, die die

IgE-Reaktivität beeinflussen könnten, vorbehandelt.

2.8.2. Positivkontrollen

Als Positivkontrolle für die rekombinanten an GST gekoppelten Proteine wurde der

polyklonale Kaninchenantikörper SA8009, der gegen GST-Bestandteile von

BP180 gerichtet ist, verwendet. Außerdem dienten vorcharakterisierte BP-Seren

als Kontrolle. Zur Detektion der BP180-Spaltprodukte, LAD1 und LABD97, diente

das Serum eines bekannten LAD-Patienten mit hoher IgA-Reaktivität. Dieses wur-

MATERIALIEN 28

de auch als Positivkontrolle für die Reaktivität gegen Keratinozytenextrakt ver-

wendet.

Der polyklonale Kaninchen-Anti-GST-BP180 NC16A2-4-Antikörper (SA8009) und

die vorcharakterisierten Patientenseren wurden bis zur Verwendung bei -80 °C

gelagert.

2.9. Antikörper

Tab. 1: Verwendete Antikörper mit Angabe der eingesetzten Konzentrationen. AK: Antikörper; *SA8009, (Sitaru et al., 2002).

Antikörper/ Konjugation Spezifität Verdünnung

Polyklonal Kaninchen IgG-HRP (DakoCytomation, Dänemark)

Human IgG

1:500 in TBST/BSA 1%

Monoklonal Maus IgG (Sigma-Aldrich, Deutschland)

Human IgE 1:1000 in TBST/BSA 1%

Polyklonal Kaninchen IgG-HRP (DakoCytomation, Dänemark)

Human IgA 1:200 in TBST/BSA 1%

Polyklonal Kaninchen IgG-HRP (DakoCytomation, Dänemark)

Anti-Maus AK

1:500 in TBST/Magermilch 5%

Polyklonal Kaninchen IgG* (aus immunisierten Kaninchen- Eurogentec, Belgien)

Human BP180 1:200 in TBST/BSA 1%

Polyklonal Ziege IgG-HRP (DakoCytomation, Dänemark)

Anti-Kaninchen AK

1:1000 in TBST/BSA 1%

METHODEN 29

3. Methoden

3.1. Zellkultur

Alle Zellkulturarbeiten wurden unter einer sterilen Werkbank durchgeführt. Nach

kurzer Lüftung und dem Erreichen der vollen Leistung der Werkbank wurde die

Arbeitsfläche mit Ethanol 70%ig ausgewischt. Alle Arbeiten wurden mit sterilen

Instrumenten durchgeführt. Die verwendeten Materialien wie Eppendorf-

Reaktionsgefäße, Pipettenspitzen, PBS, Aqua bidest. wurden im Dampfsterilisator

(Webeco) für 20 min bei 121 °C autoklaviert. Nicht autoklavierbare/hitzelabile Ge-

räte wurden regelmäßig mit 70% Ethanol gereinigt. Zur Vermeidung von Verunrei-

nigungen wurde immer nur mit einer Zelllinie zurzeit unter der Sterilbank gearbei-

tet.

3.1.1. HaCaT-Zellkultur

3.1.1.1. Auftauen von eingefrorenen Zellen

Zum Anlegen einer neuen Flüssigkultur wurden die in Stickstoff gelagerten tiefge-

frorenen HaCaT-Zellen ca. 15-20 min auf Eis aufgetaut und die Kryoröhrchen für

45 Sekunden im 37 °C warmen Wasserbad geschwenkt. Die Zellen wurden erneut

auf Eis gekühlt und die Zellsuspension in Keratinozyten-Growth-Medium 2

(KGM2) resuspendiert und in ein Falkonröhrchen überführt. Nach Zentrifugation

für 7 Minuten bei 20 °C und 1200 rpm (Zentrifuge Heraeus Megafuge 1,0, Rotor

7570, durchschnittliche RZB= 300 x g) wurde das Pellet in frischem vorgewärmten

KGM2 gelöst und ca. 500.000 Zellen in 25 cm2 Zellkulturflaschen ausgesät. Die

Kultivierung der HaCaT-Zellen erfolgte im Begasungsbrutschrank (Heraeus

GmbH) bei 37 °C, 90% Luftfeuchtigkeit und einem CO2-Gehalt von 5%. Zur An-

zucht wurden HaCaT-Zellen als Adhäsionskultur in KGM2 nach Zugabe von Sup-

plement gehalten. Zur Neutralisation des EDTA und Trypsins nach der Umsetzung

in größere Kulturflaschen wurde 10% fetales Kälberserum (FCS) dazugegeben.

Das FCS wurde zuvor bei 56 °C für 30 min hitzeinaktiviert. Um die Kollagensyn-

these der Keratinozyten zu beschleunigen wurde bei einer Zellkonfluenz von 50%

Ascorbinsäure in einer Endkonzentration von 100 µg/ml dazupipettiert.

Um Kontaminierungen zu Erkennen und die Konfluenz der Zellen zu beurteilen,

wurden die Zellkulturen täglich unter dem Mikroskop betrachtet. Ein Medium-

wechsel erfolgte 14 h nach Aussaat in neue Kulturflaschen und dann alle 48 h,

METHODEN 30

sofern die optimale Zelldichte nicht überschritten wurde. Hierzu wurde die Kultur-

flasche leicht geschwenkt und das Nährmedium mit einer Serologischen-Pipette

(Biochrom) abgesaugt. Nicht adhärente bzw. tote Zellen wurden somit entfernt.

Der Zellrasen sollte nicht durch Berühren mit der Pipettenspitze beschädigt wer-

den. Das entnommene Volumen wurde durch frisches zuvor im Wasserbad ange-

wärmtes Keratinozyten-Wachstumsmedium ersetzt.

3.1.1.2. Subkultivierung der Zellen

Die Zelllinie HaCaT unterliegt einem festen Wachstumszyklus, wobei eine kons-

tante Zellteilung nach 7 Tagen erreicht wird. Nach ca. 24 h treten die HaCaT-

Zellen in die exponentielle Wachstumphase ein, dabei hält das unlimitierte Wach-

stum im Mittel 72 h an (Boukamp et al., 1988; Wanner et al., 1999). Bei einer Zell-

konfluenz von 80-90% wurden die Kulturen passagiert, um die Zellen in der expo-

nentiellen Wachstumsphase zu halten. Dazu wurde das Zellkulturmedium wie

oben beschrieben vollständig entfernt. Die Ablösung der HaCaT-Zellen von der

Oberfläche erfolgte durch Zugabe von Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%/0,02% (w/v)).

Die Kulturflaschen wurden mehrmals geschwenkt und für 3-5 min im Brutschrank

inkubiert. Der Grad der Ablösung wurde mikroskopisch kontrolliert, um die Ein-

wirkzeit möglichst gering zu halten und so toxische Effekte des Trypsins zu ver-

meiden. Das Ablösen der Zellen wurde gegebenenfalls mechanisch durch mehr-

faches Klopfen der Kulturflasche unterstützt. Nachdem sich die Zellen zum Groß-

teil gelöst hatten, wurde die enzymatische Proteolyse durch Zugabe von 10% FCS

gestoppt. Die Zellen wurden mittels Serologischer-Pipette in ein steriles 20 ml

Zentrifugenröhrchen überführt und bei 20 °C mit 1200 rpm für 7 min zentrifugiert

(Zentrifuge Heraeus Megafuge 1,0, Rotor 7570, durchschnittliche RZB= 300 x g).

Der Überstand wurde vorsichtig mit Hilfe einer Vakuumpumpe entfernt. Das Zell-

pellet wurde anschließend in frischem Medium resuspendiert und in neue sterile

Zellkulturflaschen ausgesät. Nach ungefähr 6 h sollten die HaCaT-Zellen adhärent

sein, nach weiteren 6 h musste das Medium gewechselt werden, da verbliebene

Reste des Trypsin/EDTA die Zellen schädigen.

METHODEN 31

3.1.1.3. Bestimmung der Zellzahl

Die Zellzählung erfolgte in einer Neubauer-Zählkammer. Der Farbstoff Trypanblau

reichert sich in toten Zellen an und führt zu einer mikroskopisch nachweisbaren

Blaufärbung der Zellen. Gesunde, vitale Zellen erscheinen ungefärbt, da sie in der

Lage sind den Farbstoff über aktive Mechanismen aus dem Zytoplasma auszu-

schleusen. Zur Herstellung der Trypanblaulösung wurden 0,5% (w/v) Trypanblau

und 0,9% (w/v) NaCl in PBS gelöst. Es wurden 20 µl der HaCaT-Zellsuspension

mit 20 µl Trypanblaulösung in einem Reaktionsgefäß gemischt und etwa 5 min bei

RT inkubiert. Dann wurde die Lösung in eine Neubauer-Zählkammer pipettiert und

mindestens 4 Großquadranten ausgezählt. Die Zellzahl wurde nach folgender

Formel berechnet:

mlntenGroßquadraderZahl

Zellzahl

mlZellen 1102 4

3.1.1.4. Einfrieren von Zellen

Zur langfristigen Lagerung der HaCaT-Zellen wurden Gefrierstocks angelegt. Die-

se wurden in flüssigem Stickstoff gelagert und konnten bei Bedarf wieder aufge-

taut werden. Hierzu wurden die HaCaT-Zellen in Kultur in der exponentiellen

Wachstumsphase mit Trypsin/EDTA (0,05%/0,02% (w/v)) gelöst und die Zellzahl

bestimmt. Pro 107 Zellen/ml wurde ein 1,5 ml Kryoröhrchen vorbereitet. Die Zell-

suspension wurde bei 20 °C und 1200 rpm für 7 min (Zentrifuge Heraeus Megafu-

ge 1,0, Rotor 7570, durchschnittliche RZB= 300 x g) zentrifugiert. Das Zellpellet

wurde mit 50% FCS, 40% Keratinozytenwachstumsmedium und 10% Dimethylsul-

foxid (DMSO) suspendiert und je 1 ml gleichmäßig auf die 1,5 ml Kryoröhrchen

verteilt. Das Einfrieren der Zellen erfolgte schrittweise in einer Styroporbox. Zuerst

wurden die Kryoröhrchen 1 h langsam auf -20 °C abgekühlt, dann über Nacht bei

-80 °C eingefroren und daraufhin zur Langzeitkryokonservierung in Behältern mit

flüssigem Stickstoff archiviert.

METHODEN 32

3.2. Expression der rekombinanten GST-Fusionsproteine

hBP180 ICD-A, -B, -C, -D.

Zur Generation der GST-BP180 ICD-A (AS 1-133), -B (AS 103-266), -C (234-398),

-D (367-452) und GST-BP180 4575 (AS 1365-1413) Fusionsproteine wurde das

bakterielle Expressionsystem pGEX-6P-1 (Firma: Amersham Biosciences, Pisca-

taway/USA) verwendet (s. Abb. I, Anhang). Die cDNA Sequenzen, die für die 4

überlappenden Fragmente der intrazellulären Domäne des BP180 (Typ XVII Kol-

lagen) kodieren, wurden wie beschrieben in dem prokaryonten-Expressionsvektor

pGEX-6P-1 eingebaut und in E. coli exprimiert (Sitaru et al., 2005).

1 133

A B C D

490

266

234 398

367 452

B C D

1

103

HD1497

1 133

A B C D

490

266

234 398

367 452

B C D

1

103

HD1497

Abb. 8: Schematische Darstellung der intrazellulären Domäne des humanen BP180-Proteins. Für das Epitop-mapping wurden die überlappenden Fragmente A, B, C, D der intrazellu-lären Domänen hergestellt (siehe Material und Methoden).

Die Primer für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden von MWG Biotech

(Ebersberg, Germany) bezogen (s. Tab. I, Anhang). Die cDNA-Fragmente wurden

durch Reverse Transkription von Gesamt-RNA humaner epidermaler Extrakte ge-

wonnen. Schnittstellen für Bam H l und Sal I wurden durch die Primer eingebaut

(verwendete Primer siehe Anhang). Die Plasmide wurden freundlicherweise von

Dr. Cassian Sitaru zur Verfügung gestellt und enthielten die in Abb. 8 beschrie-

benen Fragmente der BP180 Intrazellulärdomäne zusammen mit der jeweils C-

terminal fusionierten Glutathion-S-Transferase (GST). Der plasmidtragende E.coli-

Stamm für die 4 Abschnitte der ICD und dem C-terminalen Abschnitt BP180 4575

METHODEN 33

war NovaBlue. Als Nährmedium für die E. coli Stämme wurde Luria-Bertani Me-

dium verwendet (LB-Medium).

3.2.1. Primärkultur

Unter der sterilen Werkbank wurden 20 ml LB-Medium in ein 50 ml Zentrifugen-

röhrchen abgefüllt, dazu wurden 20 µl einer 1.000 x Stammlösung Carbenicillin

pipettiert. Die folgenden Arbeiten erfolgten außerhalb der sterilen Werkbank. Von

dem bei -80 °C eingefrorenen Bakterienstock wurde mit einer Filterpipettenspitze

an der obersten Eisschicht leicht gekratzt, um die Spitze dann in das autoklavierte

LB- Medium abzuwerfen. Die angelegte Primärkultur wurde über Nacht im vorge-

wärmten Inkubator (Heraeus) bei 220 rpm und 37°C inkubiert. Dabei war darauf zu

achten, dass der Deckel leicht geöffnet ist, so dass der Sauerstoff den E. coli-

Zellen zum Wachstum zur Verfügung stand.

3.2.2. Sekundärkultur

Nach ca. 12 h wurden jeweils 500 ml des LB-Mediums in zwei 1 Liter-

Erlenmeyerkolben gegeben, Carbenicillin in einer Endkonzentration von 50 µg/ml

zugesetzt und mit je 10 ml der Primärkultur beimpft. Das Antibiotikum diente zur

Stabilisierung der Plasmide. Die Kultur wurde bis zu einer OD600 (optical density

bei 600 nm; Biophotometer, Eppendorf) von 0,5-0,6 im Bakterienschüttler (He-

raeus) bei 220 rpm, 37 °C angezogen. Anschließend wurde die Proteinexpression

durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 0,5 mM induziert und die

Kultur für weitere 3-4 h bei gleichen Konditionen im Schüttler inkubiert.

METHODEN 34

3.2.3. Proteinextraktion

Die rekombinanten Proteine werden von E. coli als lösliches zytoplasmatisches

Protein innerhalb der Zelle abgelagert. Deshalb ist zur Isolierung der rekombinan-

ten Proteine die Lyse der Bakterienzelle notwendig, wobei die Proteine solubilisiert

werden.

Alle Schritte zur Aufreinigung des GST-Fusionsproteins wurden auf Eis oder im

Kühlraum bei 4 °C durchgeführt. 250 ml der Expressionskulturen/Bakterien-

suspensionen wurden in 500 ml Zentrifugenbecher überführt und bei 4 °C für 10

min bei 17.700 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Zellpellet

wurde in 6 ml PBS resuspendiert und evtl. bis zur weiteren Verarbeitung über

Nacht bei -20 °C eingefroren. Nach dem Auftauen der Zellsuspension wurde unter

dem Abzug 1 mM PMSF (348 mg PMSF in 20 ml Isopropanol) dazupipettiert und

die Bakterien bis zur vollständigen Lyse mit Ultraschall bei mittlerer Intensität und

einer Pulsdauer von 20 sec in 3 Zyklen behandelt (Sonopuls HD-70, Bandelin,

Berlin). Zwischen den Zyklen lagen 30 sek. Pausen, in denen nochmals 1 mM

PMSF hinzugefügt wurde. PMSF ist ein Proteaseinhibitor, der beim Aufschluss

kultivierter Zellen unerwünschten Proteinabbau durch ebenfalls im Lysat befind-

liche Serin-Proteasen verhindert.

Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation für 30 min und 13.000 rpm

(Tischzentrifuge Heraeus, Festwinkelrotor Sorvall ‚3328) bei 4 °C entfernt. Die er-

haltenen Überstände wurden in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert und ggf. bis zum

nächsten Verarbeitungsschritt bei -20 °C gelagert.

3.2.4. Affinitätsaufreinigung

Glutathion-S-Transferase (GST) und GST-Fusionsproteine lassen sich mittels Af-

finitätschromatographie aus Bakterienlysat aufreinigen. Das GST bindet dabei an

das an Sepharose 4 Fast Flow gekoppelte Glutathion (Amersham). Es findet je-

doch keine Umsetzung statt, da das zweite Substrat fehlt. Die Elution erfolgt durch

Zugabe hoher Konzentrationen reduzierten Glutathions, das kompetitiv an GST

der Fusionsproteine bindet. Die Säulenchromatographie erfolgt nach dem Proto-

koll des Herstellers Amersham Biosciences bei 4 °C. 5 ml 75% Glutathion-

Sepharose 4 Fast Flow in ddH2O wurden in die Chromatographie-Säule gefüllt.

Nach dem Absetzen der Sepharose wurde die Säule mit 5-10 Säulenvolumina

PBS equilibriert. Das klare Gesamtlysat wurde langsam auf Eis aufgetaut. Danach

METHODEN 35

erfolgte die Inkubation der Glutathion-Sepharose 4 Fast Flow mit dem löslichen

Bakterienlysat für 1 h bei 4 °C auf dem Überkopfschüttler. Anschließend wurde die

Proteinlösung in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen gesammelt und die Säule

zweimal mit 15 ml PBS gewaschen. Die Waschlösungen mit den ungebundenen

Proteinen wurden auf Eis gestellt. Zur Eluierung der gebundenen Fusionsproteine

wurde reduzierter Glutathionpuffer verwendet. Das Eluat wurde in je 1000 µl auf-

geteilt und zunächst bei -80 °C gelagert. Von den verschiedenen Aufreini-

gungsstufen wurden sechzehnmal jeweils 1000 µl Fraktionen entnommen. Die

Qualität der Überexpression und Aufreinigung der bakteriellen Fusionsproteine

GST-BP180 ICD-A, -B, -C, -D erfolgte mittels SDS-PAGE mit anschließender Sil-

ber- und Coomassie-Brilliant-Blue-Färbung und Western-Blot. Von der 1-3 und

jeder zweiten Fraktion wurden je 50 µl mit 20 µl 5x SDS-Probenpuffer versetzt und

auf 97 °C erhitzt. Als Molekulargewichtsstandard wurden 8 µl SDS-PAGE Marker

für Molekulargewichte von 30-200 kDa (SDS-6H, Sigma) auf das Gel aufgetragen

und zur Kontrolle wurde 5 µl reines GST eingesetzt. Die Proteinproben, die bei der

Western-Blot-Analyse die stärksten Banden lieferten bzw. die stärkste Antikörper-

reaktion mit Kaninchen-anti-hBP180 NC16A2-4-GST (SA8009) hervorriefen, wur-

den gemischt, dialysiert und gefriergetrocknet.

Zur Regeneration wurde die Glutathion-Agarose-Säule mit je 10 ml folgender Lö-

sungen gewaschen: Glutathion; PBS pH 7,2; Borat-Puffer; PBS pH 7,2; Essig-

säure- Puffer; PBS pH 7,2. Bis zum nächsten Gebrauch wurde die Säule mit PBS

mit Natriumacidzusatz gefüllt bei 4 °C untergebracht.

METHODEN 36

Induktion der

Proteinexpression

Glutathion Sepharose Fast Flow

3-4 h Inkubation,

10 min zentrifugieren

+ IPTG

2 h Inkubation

E.coli Kultur mit

pGEX-BP180

FragmentenPellet in PBS,

sonifizieren

PBS

Glutathionpuffer

Durchlauf; Waschung 1+2

Entfernung der ungebundenen E.coli-Proteine

Bindung der GST-Fusionsproteine an der GST-Agarose Säule

Isolierung der BP180 Fragmente

Analyse mittels SDS-PAGE

Proteinkonzentration (280 nm)

Immunoblot

E.coli- Protein

Glutathion

GST-Fusionsprotein

Induktion der

Proteinexpression

Glutathion Sepharose Fast Flow

3-4 h Inkubation,

10 min zentrifugieren

+ IPTG

2 h Inkubation

E.coli Kultur mit

pGEX-BP180

FragmentenPellet in PBS,

sonifizieren

PBS

Glutathionpuffer

Durchlauf; Waschung 1+2

Entfernung der ungebundenen E.coli-Proteine

Bindung der GST-Fusionsproteine an der GST-Agarose Säule

Isolierung der BP180 Fragmente

Analyse mittels SDS-PAGE

Proteinkonzentration (280 nm)

Immunoblot

E.coli- Protein

Glutathion

GST-Fusionsprotein

Abb. 9: Herstellung der rekombinanten GST-Fusionsproteine.

METHODEN 37

3.2.5. Dialyse und Gefriertrocknung

Die Dialyse der rekombinant hergestellten Proteine erfolgte gegen PBS pH 7, bei

4 °C über Nacht und langsamen Rühren unter Verwendung von permeablen Cellu-

loseschläuchen (Roth, Karlruhe) mit einer Ausschlussgrenze von 12-14 kDa. Der

PBS-Puffer wurde mindestens dreimal in regelmäßigen Abständen durch frischen

Puffer ersetzt. Nach der Dialyse wurde die Proteinlösung aus dem Dialyse-

schlauch in 50 ml Reaktionsgefäße überführt und bei -80 °C eingefroren. An-

schließend wurden die Proben 48 h gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wurde in

möglichst geringen Mengen PBS gelöst, der Proteingehalt spektralphotometrisch

bei OD280 gemessen und mit PBS auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml ver-

dünnt. Die Lösungen wurden bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.

3.3. Proteinisolierung

3.3.1 Proteinisolierung aus dem Mediumüberstand kultivierter

Keratinozyten

In dem Mediumüberstand kultivierter Keratinozyten befinden sich die proteoly-

tischen Spaltprodukte LAD-1 und LABD97 des hemidesmosomalen Antigens

BP180.

Zum Transfer der Zellen wurde das Medium vollständig abgezogen und auf Eis

gestellt. Die Passage der Zellen erfolgte wie oben beschrieben. Um Zelldebris zu

entfernen wurde der Mediumüberstand 7 min bei 1200 rpm (Zentrifuge Heraeus

Megafugefuge 1,0, Rotor 7570, durchschnittliche RZB= 300 x g) abzentrifugiert.

Der klare Überstand wurde in ein Zentrifugenröhrchen abgefüllt, mit 5 mM EDTA,

1 mM PMSF versetzt und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gesammelt.

600 ml des Keratinozyten-Growth-Medium-Überstandes wurden langsam auf Eis

aufgetaut. Nach vollständigem Auftauen wurden die enthaltenen Proteine mit

Ammoniumsulfat-Puder präzipitiert. Dazu wurde das Salz unter Rühren bei 4 °C in

mehren Schritten langsam hinzugegeben, um eine grobe Ausflockung zu verhin-

dern. Damit eine vollständige Auflösung der Salzkristalle erfolgte, wurde das Prä-

zipitat über Nacht bei 4 °C gerührt.

Am nächsten Tag wurde die Suspension in 30 ml Zentrifugenröhrchen gefüllt und

für 90 min bei 4 °C und 36.300 x g pelletiert. Das Pellet wurde in 500 µl PBS re-

suspendiert und zur Resuspension aller Pellets in die weiteren Röhrchen trans-

METHODEN 38

feriert. Die Proteinsuspension wurde mittels QuixSep, Micro Dialyzer (Roth, Karl-

sruhe) über Nacht bei 4 °C gegen PBS dialysiert (Dialysemembran Ausschluss-

grenze 12-14 kDa), um das Ammoniumsulfat aus der Suspension zu entfernen.

3.3.2 Herstellung der Keratinozytenextrakte

Nach der dritten Passage der HaCaT-Zellen wurde der gleichmäßige Zellrasen mit

einer Lösung aus 2% SDS, 5% Beta-Mercaptoethanol, 2 mmol/l PMSF, 2 mM

EDTA in 62,5 mM Tris HCl (pH 6,8) lysiert. Anschließend wurden die Zellen mit

einem Zellschaber vom Boden der Kulturflasche gelöst und in ein 50 ml-

Zentrifugenröhrchen überführt. Alle Arbeiten wurden auf Eis durchgeführt, die

Zentrifuge wurde auf 4 °C gekühlt. Das Lysat wurde 3 mal für 20 sec sonikiert, zur

Entfernung der Zelldebris bei 20.000 x g zentrifugiert, aufgeteilt und bei -80 °C

gelagert.

3.3.3. Photometrische Messung der Proteinkonzentration

Die Konzentration von LAD-1 im aufgereinigten Mediumüberstand kultivierter Ke-

ratinozyten, sowie die Proteinkonzentration im Keratinozytenextrakt und in der

Suspensionen der rekombinant hergestellten Proteine wurde photometrisch bei

280 nm im Biophotometer (EpendorfAG, Hamburg) ermittelt. PBS-Puffer diente

dabei als Leerwert. Die Proteinkonzentrationen der Proben ließen sich mit der Be-

stimmung des Wertes nach Lambert Beer durch folgende Formel abschätzen:

OD280 × = Protein mg/ml

Es wurde näherungsweise Albumin=0,65 mg/ml verwendet.

Die erhaltenen Protein-Lösungen wurden mit PBS auf 1 mg Protein/ml eingestellt

und bei -80 °C archiviert. Die Probe wurde anschließend mit SDS-Puffer 5-fach zu

4 Teilen Proteinlösung und 1 Teil SDS-Puffer versetzt. Zur qualitativen Kontrolle

wurde ein Teil der Proteine im SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt und im

Immunoblot untersucht.

METHODEN 39

3.4. Westernblot Analyse/Epitop-mapping

3.4.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Auftrennung der Proteinen erfolgte nach der Laemmli-Methode (Laemmli,

1970) unter Verwendung eindimensionaler, diskontinuierlicher Zweikomponenten-

SDS-Polyacrylamid-Gele (Mini-Gele, 10 x 7 cm). Die Proben wurden mit 5-fach

SDS-Probenpuffer verdünnt, 2 min auf 98 °C erhitzt, kurz bei 13.000 rpm zentrifu-

giert (Tischzentrifuge Heraeus, Festwinkelrotor #3328) und bis zum Auftragen auf

Eis gekühlt. Um die Proben zu fokussieren, wurde ein Sammelgel dem eigent-

lichen Trenngel vorgeschaltet. Die SDS-Polyacrylamid-Gele wurden je nach Grö-

ße der aufzutrennenden Proteine verschieden dicht präpariert (s. Tab. 3a, b).

Unmittelbar nach dem Gießen des Trenngels in eine vertikale Gel-Kassette (Mini-

Protean 3 Cell, BioRad) mit 0,75 mm Spacern, wurde das Gel mit Aqua dest. über-

schichtet, um das Trenngel zu pressen und eine gleichmäßige Oberfläche für das

Sammelgel zu erhalten. Nach einer Polymerisationszeit von ca. 5 min wurde das

Wasser abgekippt, das Sammelgel darüber gegossen und ein Probenkamm in das

Sammelgel gedrückt. Für die intrazellulären Domänen von BP180 mit einem Mo-

lekulargewicht von ca. 40 kDa wurden 12%-ige Trenngele und 5%-ige Sammelge-

le verwendet. Die BP180 intrazellulären Domänen A bis D wurden der Reihenfolge

nach auf ein Taschengel geladen. Als Kontrolle wurde GST und NC16A aufgetra-

gen. Zur Abschätzung der Molekulargewichte diente ein farbmarkierter Protein-

standard (Bio-Rad, München) mit folgender Zusammensetzung: Myosin (206

kDa), ß-Galactosidase (133 kDa), Rinder-Serumalbumin (84 kDa), Carbo-

anhydrase (41 kDa), Soybean trypsin inhibitor (31 kDa), Lysozyme (17 kDa), Apro-

tinin (7 kDa). Um den Transfer auf die Nitrozellulosemembran zur kontrollieren,

erfolgte die Färbung der Nitrozellulosemembran mit Fast-Green und die Detektion

der Banden mit dem Kaninchen-Serum SA8009, gewonnen durch Immunisierung

mit hBP180-NC16A2-4 (Sitaru et al., 2002). Je nach Intensität der Bande wurde

die aufgetragene Menge erhöht oder erniedrigt.

Für LAD1, KCE und BP180 4575 wurde ein Preparations-Gel (Prep-Gel) herge-

stellt. Pro SDS-Gel wurden 250 µl/500 µg Protein aufgetragen. Als Standard wur-

de der SDS-PAGE-Molekulargewichtsmarker für 30-200 kDa (SDS-6H, Sigma)

geladen. Die Gelelektrophorese erfolgte in der Mini-PROTEAN 3 Elektrophorese-

Kammer mit SDS-PAGE-Laufpuffer. Bis zum Einlauf der Proteine in das Trenngel

erfolgte die Elektrophorese für 15 min bei 20 mA, danach konstant bei 50 mA so-

METHODEN 40

lange, bis die Farbfront des SDS-Puffers den unteren Gelrand erreicht hatte (ca.

75 min.).

Tab. 3a: Gelzusammensetzung% zur Trennung der unterschiedlichen epidermalen Proteine.

Protein

BP180 ICD (40 kDa )

KCE (180 kDa)

LAD-1 (120 kDa)

BP180 4575 (50 kDa)

% Trenngel 12 7,5 7,5 15

% Sammelgel 5 4 4 5

Tab. 3b: Zusammensetzung der verwendeten SDS-Polyacrylamid-Gele

Gelbestandteile Trenngel Sammelgel

7,5% 12% 15% 4% 5%

Aqua bidest 4,15 ml 2,65 ml 2,35 ml 3,1 ml 2,94 ml

1,5M Tris pH 8,8 1,35 ml 1,35 ml 2,5 ml - -

0,5M Tris pH 6,8 - - - 700 µl 700 µl

30% Acrylamid 2,5 ml 4 ml 5 ml 650 µl 812 µl

100% Glycerol 500 µl 500 µl - 250 µl 250 µl

1M Glycin 1 ml 1 ml - - -

0,5M EDTA pH8 - - - 40 µl 40 µl

10% SDS 400 µl 400 µl 100µl 200 µl 200 µl

TEMED 12 µl 12 µl 12 µl 12 µl 12 µl

10% APS 150 µl 150 µl 12 µl 100 µl 100 µl

3.4.2. Coomassie-Brilliant-Blue- und Silberfärbung der SDS-

Gele

Zur Sichtbarmachung der Proteine in den SDS-Gelen wurden die Trenngele für

1 h unter Bewegung in Coomassie-Brillant-Blau (R250) Färbelösung (2g/l Coo-

massie-Brilliant-Blue R250, 450 ml Methanol, 100 ml Essigsäure 100% ad 1000 ml

ddH2O) gebracht und anschließend über 1 h in Entfärbelösung (450 ml Methanol,

100 ml Essigsäure 100% ad 1000 ml ddH2O.) entwickelt. Das Gel wurde über

Nacht zwischen zwei Blättern Zellophanpapier getrocknet und diente somit zur

Dokumentation der Ergebnisse.

Zusätzlich wurde zur Visualisierung der Proteinbanden eine Silberfärbung durch-

geführt. Diese eignet sich besonders, um die Reinheit eines Proteins zu überprü-

fen (s. Abb. 11). Um die Hintergrundfärbung zu minimieren sowie zur Steigerung

der Sensitivität wurde das SDS-Gel vorher mit Coomassie-Brillant-Blue (R250)

METHODEN 41

angefärbt. Darauf erfolgte die Silberfärbung unter Verwendung eines nach Blum et

al. (Blum et al., 1987) modifizierten Protokolls unter Nutzung der angegebenen

Lösungen und Einhaltung der Inkubationszeiten:

Nach der Fixierung der Proteine mittels 10% Acetat, 30% Ethanol, 60% ddH2O

über 60 min erfolgte die Inkubation in einer Sensibilisatorlösung aus 6,8 g NaAc x

3 H2O (0,5 M), 30 ml Ethanol, 2 ml Glutaraldehyd 25 %ig, 0,6 g Na-Thiosulfat x 5

H2O ad 100 ml ddH20 über 30 min. Anschließend wurde das Gel für 3 x 10 min in

ddH2O gewaschen und danach für 30 min in die Silberfärbelösung gelegt. Zur Ver-

ringerung der Hintergrundfärbung wurde nach der Silberbehandlung kurz mit

ddH2O gewaschen bevor die Entwicklung des Gels mit 2,5 g Na2CO3, 30µl 37%ig

Formalaldehyd (ad 0,01) ad 100 ml ddH2O erfolgte. Unter Beobachtung wurde die

Reaktion nach 5-15 min abgestoppt. Hierbei blieb das Gel für 5-10 min in der Ab-

stopplösung (1,6 g Glycin, 0,42 g Dinatrium-EDTA, ad 100 ml ddH2O) und wurde

daraufhin nochmal für 3 x 10 min mit ddH2O gewaschen.

3.4.3. Western-Blot

Für die nachfolgende Immunreaktion wurden die über SDS-PAGE aufgetrennten

Proteine im Tank-Blot-Verfahren auf eine Nitrozellulosemembran (0,45 µm Poren-

durchmesser, Bio-Rad, München) übertragen. Hierzu wurden nach der Elektro-

phorese die Glasplatten voneinander getrennt und das Sammelgel vom Trenngel

abgetrennt. Auf die Kathodenseite der Blotkassette (cell, Bio-Rad, München) wur-

den zwei Faserkissen, 2 Gel-Blotting Filterpapiere (Schleicher & Schüll), das

Trenngel und die Nitrozellulosemembran sandwichartig aufgebaut. Dabei wurde

darauf geachtet, dass sich zwischen den Schichten keine Luftblasen befanden.

Die Faserkissen und Papiere dienten als Ionenreservoir bei der Elektrophorese (s.

Abb. 10). Die Kassetten wurden zwischen die beiden Flächenelektroden der

Kammer in Transferpuffer eingespannt. Das Methanol im Puffer entfernt das SDS

aus dem Protein-Detergenz-Komplex und erhöht die Bindung der SDS-freien Pro-

teine an die Membran. Der Transfer der Proteine vom Trenngel auf die Nitrozellu-

lose erfolgte bei 30 V und 50 mA bei 4 °C für 12 h. (Towbin et al., 1979). Der Er-

folg des Transfers wurde durch anschließende Färbung mit Fast Green (1g Fast

Green, 100 ml Methanol, 50 ml Essigsäure 100% ad 1000 ml ddH2O) kontrolliert.

Die Membran wurde 2 min in der Färbelösung geschwenkt, dann mit ddH2O wie-

METHODEN 42

der entfärbt, auf Filterpapier getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C

aufbewahrt.

Kathode

Schwamm

Schwamm

Anode

Filterpapier

Filterpapier

SDS- Gel

Nitrozellulose- Membran

Tra

nsfe

r

Kathode

Schwamm

Schwamm

Anode

Filterpapier

Filterpapier

SDS- Gel

Nitrozellulose- Membran

Tra

nsfe

r

Abb. 10: Modell des „Sandwiches“ im Western-Blot.

3.4.4. Immundetektion der transferierten Proteine/

Epitop-mapping

Die Nitrozellulosemembranen mit transferierten LAD-1, KCE, BP180 4575 wurden

in 2-3 mm dicke Streifen geschnitten, beschriftet und in einer Inkubationsschale

gesammelt. Die Membran mit ICD-A, -B, -C, D-, GST, NC16A1-5 wurde als solche

belassen und in eine Gewebe-Petrikulturschale 5 cm gelegt. Die Membranen wur-

den kurz in TBST gewaschen und anschließend für 1 h bei RT in 5% Magermilch-

pulver/TBST-Lösung inkubiert, um unspezifische Bindungen der Antikörper zu

vermeiden. Nach dem Abgießen der Magermilch und Waschen mit TBST erfolgte

die Inkubation mit dem Primärantikörper. Dazu wurde das Serum für die IgG-

Detektion 1:100 mit TBST/BSA 1%, Magermilch 3% verdünnt, für die IgE-

Detektion wurde das Serum 1:2 mit TBST/BSA 1% gemischt. Die Membranen

wurden über Nacht bei 4 °C oder für 3 h bei RT auf einem Schüttler unter leichten

Bewegungen mit dem Primärantikörper inkubiert. Anschließend wurden ungebun-

dene Antikörper durch dreimaliges kurzes Waschen mit TBST und dreimaliges

Waschen für 5 min mit TBST entfernt. Im Anschluss erfolgte die Inkubation mit

den sekundären Antikörpern. Für die IgG-Detektion wurde das Serum 1:500 mit

TBST/BSA 1% verdünnt, für die IgA-Detektion 1:200 sowie für die IgE-Erkennung

1:1000. Diese anti-human-Antikörper verblieben für 1 h bzw. der Maus-anti-human

IgE-Antikörper für 2 h auf der Membran. Anschließend wurde der Waschvorgang

wie oben beschrieben wiederholt. Die Blots zum Nachweis von IgE-Antikörper

wurden noch für 1 h mit einem Kaninchen-anti-Maus-Antikörper-HRP inkubiert.

Dieser Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:500 in TBST/Blockingpuffer

METHODEN 43

5% angesetzt. Alle Inkubationen und Waschschritte erfolgten auf dem Schüttler.

Das an den Zweitantikörper bzw. dritten Antikörper gekoppelte Enzym Meerrettich-

Peroxidase (HRP: „Horse Radish Peroxidase“) erzeugte in Anwesenheit seines

Substrates Chemilumineszenz. Dazu wurde eine Lösung von Diamino-

benzidintetrahydrochlorid (DAB, Merck) angesetzt (1 DAB-Puffertablette wurde in

15 ml Aqua bidest gelöst). Kurz bevor die Lösung über die Membranen gegossen

wurde, musste 20 µl Wasserstoffperoxid (H2O2) zugesetzt werden. Die HRP und

H2O2 katalysieren die Umsetzung von Luminol in seine oxidierte Form, bei der ei-

ne Lumineszenz detektiert werden kann. Die Membranen wurden in der Reak-

tionslösung geschwenkt; beim ersten Auftreten von sichtbaren Banden im Moleku-

largewichtsbereich der entsprechenden Antigene wurde die Enzymreaktion ge-

stoppt, indem die Blots in Aqua bidest. gewaschen wurden. Sämtliche Arbeiten mit

dem DAB-Puffer erfolgten unter dem Laborabzug nach dem Herstellerhinweis.

3.4.5. Auswertung der Bandenmuster

Die Auswertung der Bandenverteilung erfolgte visuell. Die Intensität der Fluores-

zenz der Banden wurde mittels der Anzahl der „+“ beschrieben. Keine Reaktion

der Antikörper gegen das Protein wurden mit „-“ gekennzeichnet. Patientenseren,

die im Immunoblot Banden beim GST-Protein zeigten wurden in der Auswertung

der Ergebnisse nicht miteinbezogen. Um die Beurteilung zu objektivieren, wurden

die Blots verblindet von einer unabhängigen Person ausgewertet. Zur weiteren

statistischen Auswertung wurden der Chi-Quadrat-Test und der Mann-Whitney-U-

Test herangezogen. Der Chi-Quadrat-Vierfeldertest ist ein statistisches Testver-

fahren und dient dazu die Häufigkeit eines Merkmals in zwei statistisch unabhän-

gigen Gruppen zu vergleichen und zugleich die Frage nach der Signifikanz des

Testes zu beantworten. Hiermit lässt sich eine Aussage über die Abhängigkeit der

Reaktion des IgE-Antikörpers mit den ICD A-D, GST und NC16A im Vergleich zu

den Ergebnissen mit dem IgG-Autoantikörper machen.

Der Mann-Whitney-U-Test ist ein parameterfreier statistischer Test. Er dient zur

Überprüfung der Signifikanz der Übereinstimmung zweier Verteilungen, also ob

zwei unabhängige Verteilungen, z. B. der Gesamt-IgE-Spiegel der BP-Seren und

der Negativkontrollen, zu derselben Grundgesamtheit gehören.

ERGEBNISSE 44

4. Ergebnisse

4.1. Expression und Affinitätsaufreinigung von rekombinanten

GST-Fusionsproteinen

Die cDNA Fragmente von 4 Abschnitten der intrazellulären Domäne von BP180

wurden in den Vektor pGEX-6P-1 (Amersham Biosciences) eingebaut (s. An-

hang). Es resultierten vier rekombinante Vektoren, die zur Proteinexpression im

E.coli Stamm NovaBlue kloniert wurden. Die rekombinanten Proteine wurden

durch Bakterienlyse freigesetzt, über eine Glutathion-Säulenchromatographie auf-

gereinigt und im 15% SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Zur Expressions-

kontrolle wurde das Gel anschließend mit Silbernitrat angefärbt (Abb. 11)

LS 1 2 3 4 5

ICD-C

200

11697

66

45

31

[kDa]

LS 1 2 3 4 5

ICD-C

200

11697

66

45

31

[kDa]

Am Beispiel von ICD-C (AS 234-398) lässt sich in Abb. 11 die Instabilität der re-

kombinanten Proteine erkennen. Mehrere stark angefärbte Banden im niederen

Molekulargewichtsbereich lassen auf die Degradierung des Proteins schließen.

Um dieses zu verhindern wurde bei erneuter Expression dieser Proteine der Ein-

fluss von Proteinaseinhibitoren bei der Proteinisolierung untersucht. Dabei zeigte

sich, dass ein kommerzieller Proteinaseinhibitorcocktail im Vergleich zu PMSF +

EDTA einen Abbau weitgehend verhindert (s. Abb. 11).

War die Expressionskontrolle positiv, wurde das Proteineluat gesammelt, gegen

ddH20 dialysiert, gefriergetrocknet und mit PBS auf eine Endkonzentration von 1

mg/ml eingestellt. Die so erhaltenen BP180 Fragmente ICD-A, -B, -C, -D sowie

NC16A1-5 und die GST-Kontrolle wurden elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine

Nitrozellulosemembran übertragen und zur Kontrolle mit Fast-Green angefärbt.

Abb. 11: Silberfärbung des SDS-Page Gel. Kontrolle der Affinität-saufreinigung am Beispiel von ICD-C. LS: Längenstandard; 1: Protein-extrakt aus E.coli, 2: Durchlauf, 3: GST, 4: ICD-C, 5: ICD-C mit comp-lete-mini Proteinaseinhibitor, Ro-che Applied Science, Mannheim. Man bemerke, dass in Spur 4 meh-rere Proteinbanden im niederen kDa-Bereich zu sehen sind, die Degradierungsprodukte des Pro-teins darstellen.

ERGEBNISSE 45

Anschließend wurde als weitere Kontrolle ein Immunoblot mit Kaninchen-anti-

GST-BP180 NC16A2-4 (SA8009) und enzymmarkiertem Ziegen-anti-Kaninchen

als Sekundärantikörper sowie anschließender Visualisierung mittels DAB durchge-

führt (s. Abb. 12). Durch die Immunoblotanalyse konnten die Mengen an gelade-

nem Protein überprüft werden und gegebenenfalls ein Angleichen der Konzen-

trationen der vier Fragmente vorgenommen werden.

1 2 3 4 5 6

31

40[kDa]

31

40

(A)

(B)

1 2 3 4 5 6

31

40[kDa]

31

40

(A)

(B)

31

40[kDa]

31

40

(A)

(B)

In der SDS-PAGE migrierten auf 15%-igen Gelen (Abb. 12) GST-hBP180 ICD-A

bei 41 kDa, GST-hBP180 ICD-B bei 38/43 kDa, GST-hBP180 ICD-C bei 44 kDa

und GST-hBP180 ICD-D bis zu 41 kDa. Am linken Rand in Abbildung 12(A) er-

kennt man den farbmarkierten Molekulargewichtsmarker. Die Fusionsproteine

migrierten somit etwas abweichend zu ihrer berechneten Größe von 41; 44,9;

49,17; 39,29 kDa. In der Fast-Green Färbung wiesen die ICD-Fragmente A, B, C,

und D, wie schon in der Silberfärbung dargestellt (Abb. 11), zusätzliche Banden

mit niedrigerem Molekulargewicht auf. Das rekombinant hergestellte NC16A1-5

färbte sich auf der Mem-bran sehr schwach an, auch zeigten sich keine doppelten

Banden im niederen Molekulargewichtsbereich, was auf weniger proteolytischen

Abbau dieser nicht kollagenösen extrazellulären Domäne hinweist.

In der Kontrolle mit dem Kaninchenserum SA8009 wurde eine Vielzahl von Ban-

den detektiert. Dieser Befund lässt sich durch die Reaktion des Kaninchen-anti-

GST-hBP180 NC16A2-4 AK mit GST-gekoppelten Degradierungsprodukten der

Proteine erklären.

Abb. 12: Beurteilungsreferenz für Immunoblots. Anfärbung der Proteine mit Fast Green (A), analog dazu wurde ein Immunoblot (B) mit dem SA8009-Antikörper durchgeführt. Dieser polyklonale Antikörper detektiert GST bzw. GST-Fusionsptoteine. Links Markierung des Längenstan-dards. Für die Beurteilung der Blots wurden nur bestimmte Ban-den herangezogen (Rahmenmar-kierungen). Spur 1: GST-ICD-A, Spur 2: GST-ICD-B, Spur 3: GST-ICD-C, Spur 4: GST-ICD-D, Spur 5: GST, Spur 6: GST-NC16A. Bei ICD-B wurden 2 Banden als positiv gewertet.

ERGEBNISSE 46

4.2. Erstellung des Patientenkollektivs und der

Negativkontrollen

20 Patienten (15 weibliche und 5 männliche) mit einem Durchschnittsalter von 83

Jahren nahmen an dieser Studie teil. Alle 20 Patienten waren nicht systemisch

immunsuppressiv vorbehandelt. Sie wiesen typische klinische und histologische

Merkmale des BP auf. Zusätzlich wurde jedes Patientenserum wie folgt charak-

terisiert:

1. Durch den Nachweis von IgG-Antikörpern- und C3-Ablagerungen an der Ba-

salmembran (DIF)

2. Durch den Nachweis von zirkulierenden IgG-Antikörpern gegen die Basal-

membran auf Normalhaut (IIF) und auf kochsalzbehandelter Haut (Salt-Split-Skin

IIF)

3. Durch den Nachweis einer Reaktivität im BP180-NC16A-ELISA.

4. Durch eine Immunoblotanalyse mit positiver Reaktivität gegen BP180.

Es zeigten sich bei 18 von 19 mittels DIF untersuchter Patienten IgG-Antikörper

bzw. C3-Ablagerungen an der Basalmembranzone. Mittels IIF am Substrat Affen-

ösophagus konnten bei 16 von 18 untersuchten Patienten initial zirkulierende IgG-

und z. T. IgA-Antikörper nachgewiesen werden. Zudem ließen sich bei allen 19

untersuchten Patienten IgG-Antikörper und zusätzlich bei 5 Seren IgA-Antikörper

im Dach der artifiziell erzeugten Blase nachweisen (IIF in Salt-Split-Skin-Technik

(Gammon et al., 1984)). Der NC16A-ELISA zeigte bei 16 von 18 untersuchten Se-

ren positive Ergebnisse (IgG gebunden >9 U/ml), dabei lagen die gebundenen

IgG-Antikörper bei 16,8 bis >1000 U/ml. In allen Patientenseren wurde somit mit

mindestens einem positiven Ausfall in den durchgeführten autoimmundiagnosti-

schen Tests ein BP bestätigt (s. Tab. 3).

Die 9 Negativkontrollen (normale humane Seren) waren in der Alters-, Ge-

schlechtszusammensetzung vergleichbar mit dem Patientenkollektiv und wiesen

keinerlei klinische Hinweise auf ein bullöses Pemphigoid auf, so dass diese keiner

diagnostischen Untersuchungen unterzogen wurden (s. Tab. II im Anhang).

Das PV-Serum (1 Negativkontrolle) zeigte in der IIF mit Affenösophagus

IgG-Antikörper, die SSS war negativ, der Dsg 1 ELISA war negativ, und der Dsg 3

ELISA waren positiv mit 694 U/ml (normal <14 U/ml). Außerdem zeigte die DIF

IgG- und C3-Ablagerungen im Interzellularraum der Epidermis.

ERGEBNISSE 47

Tab. 3: Patientenergebnisse der Routineuntersuchung in der Autoimmundiagnostik der Dermatologie der Universität zu Lübeck und Würzburg. BP: bullöses Pemphigoid mit Patien-tennummerierung, w: weiblich, m: männlich, IIF: indirekte Immunfluoreszenz mit Affenösophagus als Substrat für den Autoantikörper-Nachweis, SSS: Salt-Split-Skin-Technik, DIF: direkte Immun-fluereszenz, n. u.: nicht untersucht, ELISA mit rekombinanten BP180 NC16A (negativ <9 U/ml), +: positiver Nachweis von IgG-, C3 Ablagerungen an der Basalmembranzone periläsionaler Haut-biopsien.

Patientennr. Geschlecht Alter (J.) IIF SSS ELISA U/ml

DIF

BP-1 w 81 n.u. IgG 3699+ IgG+C3

BP-2 w 80 - IgG n.u. IgG+C3

BP-3 w 84 IgG IgG 264+ n.u.

BP-4 w 81 IgG IgG >1000+ IgG+C3

BP-5 w 76 IgG,IgA IgG,IgA 27,6+ IgG<C3

BP-6 w 93 IgG IgG 92,4+ C3

BP-7 m 83 - IgG 0,2 IgG+C3

BP-8 w 87 IgG IgG,IgA 37,5+ IgG+C3

BP-9 m 89 IgG IgG,IgA 51,7+ IgG<C3

BP-10 w 82 IgG IgG 16,8+ IgG+C3

BP-11 w 94 IgG IgG,IgA 366+ IgG+C3

BP-12 m 92 IgG IgG,IgA 8,4 IgG+C3

BP-13 m 80 n.u. n.u. n. u. IgG+C3

BP-14 w 57 - IgG,IgA 38,2+ IgG+C3

BP-15 m 92 IgG IgG 623+ IgG+C3

BP-16 w 83 IgG IgG 26,5+ IgG<C3

BP-17 w 88 IgG IgG 576.5+ IgG<C3

BP-18 w 92 IgG IgG 141+ -

BP-19 w 66 IgG,IgA IgG,IgA 53,3+ IgG+C3

BP-20 w 83 IgG IgG 92+ C3

4.3. Erhöhte Gesamt-IgE-Spiegel im Serum von BP-Patienten

Die Gesamt-IgE-Spiegel im Blut der untersuchten BP-Patienten und der Negativ-

kontrollen wurden mittels Fluoreszenz-Enzym-Immunoassay bestimmt (Labor der

Immunologie der Universität zu Lübeck). Dabei wurden bei 18 von 20 unbehan-

delten Patienten erhöhte IgE-Spiegel gemessen. Der Mittelwert der Gesamt-IgE-

Spiegel bei den BP-Patienten lag bei 2730 kU/l (im Bereich von 14,3–9430 kU/l

mit einem Ausreißer bei 20835 kU/l). Die Kontrollpersonen wiesen mittlere IgE-

Werte von 67 kU/l auf (Bereich 4,82–92,5 kU/l mit einem Ausreißer bei 397 kU/l).

Die Serum-Gesamt-IgE-Spiegel bei den BP-Patienten war damit im Vergleich zu

der Kontrollgruppe signifikant erhöht (p<0,05 im zweiseitigen Mann-Whitney-U-

Test) (s. Abb. 13).

ERGEBNISSE 48

Abb. 13: Serum Gesamt-IgE-Spiegel bei unbehandelten BP-Patienten (n=20) und gesunder in der Alters- und Geschlechtszusammensetzung vergleichbarer Normalseren als Negativ-kontrollen (n=10). Die Daten sind als Boxplot dargestellt; die Box zeigt das 5% Quartil und das 95% Quartil sowie den Median. Die Whisker zeigen Minimum und Maximum. Ausreißer der jeweili-gen Gruppe sind als Kreuz eingezeichnet. Das Kästchen stellt das arythmetrische Mittel dar.

Erhöhte IgE-Spiegel (d. h. Werte >100 kU/l) sind typisch für eine atopische Dia-

these. Um diese als mögliche Ursache der hier gefundenen IgE-Erhöhung abzu-

klären, wurde ein Atopie-Screening durchgeführt (inhalative Mischallergene, Mi-

schung SX1). Diese Mischung testet spezifisches IgE gegen Lieschgras (g6),

Roggen (g12), Birke (t3), Beifuß (w6), Katzenschuppen (e1), Hundeschuppen

(e5), Cladosporium Herbarum (m2) und Dermatophagoides pteronyssinus (d1).

Über Kreuzreaktivitäten werden fast alle Gras- und die häufigsten Baum und Kräu-

terpollen miterfasst. Bei der Gesamtauswertung zeigte sich, dass 7 der 18 Patien-

ten mit erhöhten Gesamt-IgE-Spiegeln, spezifische IgE-Antikörper gegen die

Mischallergene (SX1) aufwiesen, d. h. das spezifische IgE war >0,35 KU/l (RAST-

Klasse 1). Bei 6 Patienten erfolgte daraufhin eine Aufschlüsselung dieser Aller-

gene. Bei den nicht an BP erkrankten Personen waren 2 von 10 in der SX1-

Untersuchung positiv und wurden genauer klassifiziert.

ERGEBNISSE 49

Die RAST-Klassen-Einteilung richtet sich nach der Höhe des IgE-Antikörpertiters

gegen das untersuchte Antigen (s. Tab. 4). In der RAST-Klassifikation lagen 4 Se-

ren im Bereich der mittleren, nur ein Serum im hohen spezifischen IgE-Bereich.

Tab. 4: Immunologische Diagnostik der BP-Patientenseren und Kontrollseren. Bestimmung der gesamten Immunglobuline der Klasse IgE; Bestimmung spezifischer IgE-Antikörper gegen Mischal-lergene (SX1). Bei positivem Ausfall, d.h. >0,35 KU/l (RAST-Klasse 1), Aufschlüsselung der Mischallergene und wiederum Einteilung in RAST-Klassen. Klassen-Identifikation: <0,35 kU/l RAST-Klasse 0 0,35-0,70 kU/l RAST-Klasse 1 0,70-3,50 kU/l RAST-Klasse 2 3,50-17,50 kU/l RAST-Klasse 3 17,50-50,00 kU/l RAST-Klasse 4 50,00-100,00 kU/l RAST-Klasse 5 >100,00 kU/l RAST-Klasse 6

Patientennr. Geschlecht Alter(J.) Gesamt-IgE (kU/l)

Inhalative Allergene (SX1)

RAST- Klasse

BP-1 w 81 2178.0+ pos. n.u.

BP-2 w 80 14.30 neg. -

BP-3 w 84 9430.00+ neg. -

BP-4 w 81 154.00+ neg. -

BP-5 w 76 4349.0+ pos. 3 für d1

BP-6 w 93 1046.0+ neg. -

BP-7 m 83 3138.0+ pos. 2 für g6

BP-8 w 87 790.00+ neg. -

BP-9 m 89 2785.0+ pos. 2 für d1

BP-10 w 82 842.00+ pos. 5 für t3

BP-11 w 94 658.00+ pos. 0

BP-12 m 92 1902.0+ neg. -

BP-13 m 80 1482.0+ neg. -

BP-14 w 57 123.00+ neg. -

BP-15 m 92 417.00+ neg. -

BP-16 w 83 742.00+ neg. -

BP-17 w 88 20835+ pos. 2 für m2

BP-18 w 92 1734.0+ neg. -

BP-19 w 66 69.90 neg. -

BP-20 w 83 1929.0+ neg.

NHS-1 w 70 397.00+ neg. -

NHS-2 m 28 16.10 neg. -

NHS-3 w 80 92.50 neg. -

NHS-4 m 72 28.60 pos. 1 für d1

NHS-5 w 77 18.60 neg. -

NHS-6 w 93 35.90 pos. 1 für g12

NHS-7 w 85 44.50 neg. -

NHS-8 w 79 19.40 neg. -

NHS-9 w 43 4.82 neg. -

PV-01 K w 45 11.80 neg. -

Mittels zweiseitigem Mann-Whitney-U-Test konnte festgestellt werden, dass es

einen signifikanten Unterschied in der Höhe des Gesamt-IgE-Spiegels bei SX1-

positiven bzw. SX1-negativen Patienten gibt (p<0,05) (s. Abb. 14).

ERGEBNISSE 50

Abb. 14: Gesamt-IgE-Spiegel und SX1: Der Gesamt-IgE-Spiegel und SX1 wurden im Serum der BP-Patienten und Negativkontrollen bestimmt und mittels U-Test auf Signifikanz untersucht. Die Daten sind als Boxplot dargestellt; die Box zeigt das 5% Quartil und das 95% Quartil sowie den Median. Die Whisker zeigen Minimum und Maximum. Ausreißer der jeweiligen Gruppe sind als Kreuz eingezeichnet. Das Kästchen stellt das arythmetrische Mittel dar.

4.4. IgE- und IgG-Autoantikörper-Reaktivität gegen die intra-

zelluläre Domäne von BP180 und NC16A1-5

Um die Autoantikörper-Reaktivität gegen die intrazelluläre Domäne von BP180 zu

charakterisieren wurden vier Abschnitte der ICD rekombinant hergestellt und im

Epitop-mapping eingesetzt. Es wurden die Bindungseigenschaften von IgE- und

IgG-Autoantikörpern gegen die BP180-Intrazellulärdomäne Fragment A, B, C, D

und gegen NC16A1-5 in 20 nachgewiesenen BP-Seren sowie in 10 negativen

Kontrollseren im Immunoblot dargestellt. Die rekombinanten Proteine sind an GST

fusioniert, daher wurde reines GST als Kontrolle im Immunoblot eingesetzt.

IgG-Autoreaktivität gegen unterschiedliche Aminosäurebereiche der intrazellulären

Domäne von BP180 ist beschrieben. Die Untersuchung der IgG-Antikörperreaktion

gegen NC16A1-5 (AS 490-562) und ICD-A (AS 1-133), -B (AS 103-266), -C (AS

234-398), -D (AS 367-452) sollten frühere Befunde bestätigen. Das Hauptziel der

vorliegenden Untersuchung war, ob und in welchem Ausmaß IgE-Antikörper im

Serum von BP-Patienten mit den vier überlappenden Fragmenten der intrazellulä-

ren Domäne von BP180 reagieren. Die Reaktivität von IgE und IgG gegen die ein-

ERGEBNISSE 51

zelnen Epitope der Intrazellulärdomäne bzw. dem NC16A-Abschnitt von BP180

sollten dann auf eine mögliche Korrelation untersucht werden.

Die rekombinanten Proteine GST-hBP180-ICD-A, -B, -C, -D, GST-

hBP180NC16A1-5 und zur Kontrolle GST wurden mittels 15% SDS-PAGE fraktio-

niert, auf eine Nitrozellulosemembran transferiert und mit den zu untersuchenden

Seren inkubiert. Daraufhin erfolgte die Inkubation mit den sekundären Antikörpern:

HRP-konjugierter Maus-anti-Human-IgG- bzw. Maus-anti-human-IgE-Antikörper.

Eine Kreuzreaktion von anti-Maus-IgG mit humanem IgG sowie mit anderen Im-

munglobulinen und den Proteinen auf der Membran wurde ausgeschlossen, indem

der Maus-anti-human-IgE-Antikörper in einem Versuch weggelassen wurde. Für

die IgE- Erkennung musste zusätzlich die Inkubation mit HRP-konjugiertem anti-

Maus-Antikörper durchgeführt werden. Die Sichtbarmachung der Banden erfogte

mit DAB. Die Auswertung der Bandenverteilung erfolgte visuell. Die Intensität der

Fluoreszenz der Banden wurde wie folgt beschrieben: - keine Reaktion; + schwa-

che Reaktion; ++ mittelstarke Reaktion; +++ starke Reaktion der Autoantikörper

gegen das Protein. Die Blots wurden zur weiteren Objekti-vierung verblindet von

einer unabhängigen Person ausgewertet.

Ein BP-Serum zeigte IgE- und IgG-Antikörper-Bindungen an Glutathion-S-

Transferase (GST), ein weiterer Patient wies IgG-Antikörper gegen GST auf. Bei-

de wurden daher nicht in die Auswertung der Ergebnisse mit einbezogen. (s. Abb.

15 und Tab. 5)

ERGEBNISSE 52

35

[kDa]

NHS9

35

35

35

IgG IgE

BP3

BP15

BP4

BP7

NHS2

35

40

40

40

40

40NHS6

40

35

40

35

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

BP6

40

35

35

[kDa]

NHS9

35

35

35

IgG IgE

BP3

BP15

BP4

BP7

NHS2

35

40

40

40

40

40NHS6

40

35

40

35

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

BP6

40

35

Abb. 15: IgE- und IgG-Autoantikörper-Reaktivität gegen die 4 Abschnitte der intrazellulären Domäne von BP180 und NC16A1-5. 1: ICD-A, 2: ICD-B, 3: ICD-C, 4: ICD-D, 5: GST-Kontrolle, 6: NC16A1-5. BP: bullöses Pemphigoid; NHS: normales humanes Serum; rechts markieren die Pfeil-spitzen den Molekulargewichtsbereich.

ERGEBNISSE 53

Von den 18 in die Auswertung einfließenden Patientenseren zeigten 16 IgG-

Reaktivität gegen NC16A1-5. 7 der 18 BP-Seren reagierten mit IgG-Antikörpern

gegen ICD-A. ICD-B war das Proteinfragment gegen das am häufigsten eine

Reaktivität vorlag (14/18); diese Reaktivität war zudem auch im Vergleich mit den

anderen Fragmenten besonders stark. Die IgG-Reaktivität gegen ICD-B war somit

vergleichbar mit der gegen NC16A1-5 (16 Seren NC16A1-5 positiv, 14 Seren ICD-

B positiv). Dabei ist anzumerken, dass die ICD-B Banden nicht immer im 40 kDa-

Bereich lagen, sondern im niederen Molekulargewichtsbereich, was darauf schlie-

ßen lässt, dass Degrationsprodukte des ICD-B Fragments besser erkannt werden

(s. Abb.15).

Gegen den Abschnitt C waren 5 von 18 Seren IgG-Antikörper positiv, 6 von 18

zeigten gegen den Abschnitt D IgG-Reaktivität.

Von den 10 untersuchten normalen humanen Seren konnte nur bei NHS4 eine

IgG-Reaktion gegen ICD-B verzeichnet werden.

Tab. 5: Ergebnisse der visuellen Auswertung der Immunoblots, + schwache Reaktion; ++ mittel-starke Reaktion; +++ stärkste Reaktion. - keine Reaktion. *Serum aus der Wertung genommen, da Reaktion mit GST.

Patient ICD-A ICD-B ICD-C ICD-D GST NC16A

IgG IgE IgG IgE IgG IgE IgG IgE IgG IgE IgG IgE

BP-1 + + + + - + +++ +++ - - +++ +

BP-2 - - - - - - - - - - - -

BP-3 + - + - - - - - - - +++ +

BP-4 ++ ++ + - ++ ++ +++ +++ - - +++ +

BP-5 - - ++ ++ - + ++ + - - + +

BP-6 - - ++ + - - + - - - +++ +

BP-7 - + +++ + ++ ++ +++ ++ - - - -

BP-8 - + - ++ - + - - - - + +

BP-9 + + ++ + - + - + - - + +

BP-10 + - ++ ++ ++ ++ - - - - + +

BP-11 + - + + - - - - - - ++ +

BP-12*

+ - ++ - + - + - + - + -

BP-13 - + ++ + ++ - - - - - + ++

BP-14* + + ++ ++ - ++ - + ++ + + +

BP-15 - ++ - + - ++ - + - - ++ ++

BP-16 - - ++ ++ + - - - - - + +

BP-17 - - + ++ - + - - - - +++ +

BP-18 - - + ++ - + - - - - + ++

BP-19 ++ ++ ++ + - + + + - - + +

BP-20 - - - - - - - - - - ++ -

Pos. Seren

7 8 14 14 5 11 6 7 2 1 16 15

ERGEBNISSE 54

15 von 18 der unbehandelten BP-Seren wiesen IgE-Autoantikörper gegen

NC16A1-5 auf. Darüber hinaus gab es auch starke Reaktionen von IgE gegen die

intrazelluläre Domäne von BP180 (s. Tab. 5). IgE-Autoantikörper gegen Abschnitt

A ließen sich bei 8 von 18 Patienten nachweisen. Die höchste IgE-Reaktivität fand

man, wie beim IgG-Screening, mit 14/18 Seren gegen das ICD-B Fragment. 11

von 18 Seren waren gegen Abschnitt C positiv. ICD-D wurde von 7 Seren mit IgE-

Antikörpern detektiert. Damit zeigte sich gegen ICD-C eine deutlich höhere IgE-

als IgG-Reaktivität der BP-Seren. In den normalen humanen Seren war keine IgE-

Reaktivität gegen die ICDs noch gegen NC16A1-5 und die GST-Kontrolle nach-

zuweisen.

Die Zahl der IgG- bzw. IgE-autoreaktiven BP-Seren ist für die unterschiedlichen

Abschnitte von BP180 in Abb. 16 dargestellt. Zusätzlich ist die Zahl der Seren, die

beide Antikörperklassen gegen das entsprechende Fragment beinhalten, aufge-

führt (IgG- + IgE-autoreaktive BP-Seren).

Für ICD-B, ICD-D und NC16A zeigte sich, dass IgG- und IgE-Reaktivität miteinan-

der einhergingen. Im Gegensatz dazu zeigten für ICD-A nur etwa die Hälfte der

positiven Seren sowohl IgG- als auch IgE-Autoantikörper-Reaktivität. Auch bei

ICD-C zeigte sich nur eine geringe Korrelation der IgE-und IgG-Reaktivität.

IgG/IgE-Reaktivität in BP-Seren

7

14

56

16

8

14

11

7

15

4

12

35

15

0

5

10

15

20

A B C D NC16A

BP180-Fragment

n =

An

zah

l p

os

itiv

e

IgG pos.

IgE pos.

IgG+IgE pos.

*

*

*

Abb. 16: Anzahl der BP-Seren mit IgG bzw. IgE-Reaktivität gegen die unterschiedlichen Frag-mente von BP180 und Anzahl der Seren mit beiden Antikörperisotypen gegen ein Fragment. * Er-gebnis ist signifikant < 0,05 (<5%)

ERGEBNISSE 55

Diese Ergebnisse wurden mittels des Chi-Quadrat-Tests (Chi2-Test) auf Signifi-

kanz untersucht. Die p-Werte für die einzelnen Fragmente sind graphisch in Abb.

17 dargestellt. Wenn man die Ergebnisse des Chi2-Tests über die einzelnen

Fragmente des BP180 aufträgt, zeigt sich eine signifikante Wahrscheinlichkeit

einer Korrelation von IgG mit IgE-Reaktivität bei Abschnitt B, D und NC16A

(p>95%). Dagegen gibt es keine signifikante Korrelation bei ICD-A und ICD-C.

Korrelation IgG/IgE-Reaktivität in BP-Seren

84,56%

99,82% 99,36% 100,00%

61,29%

0,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

100,00%

A B C D NC16A

BP180-Fragmente

Ab

hän

gig

keit

(C

hi2

-Test)

Abb. 17: Darstellung der Korrelationswahrscheinlichkeiten der IgG- mit der IgE-Reaktivität gegen die unterschiedlichen Fragmente der intrazellulären Domäne von BP180 und NC16A1-5 in BP-Seren. Die Auswertung erfolgte mit dem Chi

2-Test.

4.5. IgE-Autoantikörper-Reaktivität gegen LAD-1 aus dem

Mediumüberstand kultivierter Keratinozyten

LAD-1 (AS 5??-1497) und LABD97 (AS 531-1209) stellen proteolytische Spaltpro-

dukte des hemidesmosomalen Antigens BP180 dar. Die Abspaltung erfolgt inner-

halb der NC16A-Domäne (s. Abb. 4). Aus dem Mediumüberstand der Keratinozy-

tenkultur wurden die Proteine wie in Abschnitt 3.3.1. beschrieben isoliert, in einer

10% SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend mittels Tankblot auf eine Nitrozel-

lulosemembran übertragen. Die Qualität der Membran wurde überprüft, indem die

Reaktivität einer Positivkontrolle (Serum eines LAD-Patienten) getestet wurde.

Wenn sich eine deutliche Bande bei 120 kDa zeigte, wurde die Membran in der

IgE-Immunoblotanalyse eingesetzt. Auch hier wurden Kreuzreaktionen des tertiä-

ren Antikörpers mit anderen humanen Antikörpern weitgehend ausgeschlossen,

indem das Serum eines BP-Patienten, das starke IgE-Reaktivität (BP5) gegen

ERGEBNISSE 56

LAD-1 zeigte, unter Weglassung des sekundären Antikörpers erneut untersucht

wurde. Dabei waren keine eindeutigen sichtbaren Reaktionen gegen die aufge-

trennten Proteine und damit keine Reaktion von Maus-anti-human-IgE mit anderen

Immunglobulinen/Antigenen zu verzeichnen.

Als Vergleich wurde ein LAD-Serum 1:50 in TBST auf einem Streifen inkubiert. Die

Detektion erfolgte hier mit HRP-anti-human-IgA 1:200 in TBST. Im Serum des Pa-

tienten mit linearer IgA-Dermatose findet sich eine ausgeprägte Immunantwort

gegen die Spaltprodukte LAD-1 und LABD97 (Spur 1). Das Serum wurde als posi-

tive Kontrolle (K) gewertet (s. Abb. 18).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14 15

LAD-1

LABD97

116

200

97

66

45

BP NHSK [kDa]

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14 15

LAD-1

LABD97

116

200

97

66

45

BP NHSK [kDa]

Abb. 18: IgE-Autoantikörper-Reaktivität gegen BP180 Spaltprodukte. Konzentrierter Über-stand kultivierter Keratinozyten wurde mittels 10% SDS- PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose übertragen und mit Seren von Patienten mit linearer IgA-Dermatose (LAD; Spur 1), bullösem Pem-phigoid (BP; Spur 2 -10) und Seren gesunder Spender (NHS; Spuren 11 - 15) inkubiert. Auf der rechten Seite sind die Positionen der Molekulargewichtsmarker gezeigt. Die Pfeile links deuten auf die Position von LAD-1 und LABD97. 1:LAD, 2:BP12, 3:BP13, 4:BP15, 5:BP1, 6:BP3, 7:BP4, 8:BP5, 9:BP14, 10:BP18, 11:NHS1, 12:NHS3, 13:NHS6, 14:NHS7, 15:NHS8

Es konnte in dieser Studie erstmalig gezeigt werden, dass IgE-Autoantikörper im

Serum von BP-Patienten gegen das native LAD-1 Protein reagieren. 7 der 20 Pa-

tienten zeigten Banden bei 120 kDa. Außerdem lassen sich einige unspezifische

Banden im niedrigeren Molekulargewichtsbereich erkennen

ERGEBNISSE 57

Patient BP180 LAD-1

IgE- Reaktivität

BP-1 +++

BP-2 -

BP-3 +++

BP-4 +

BP-5 -

BP-6 -

BP-7 -

BP-8 -

BP-9 -

BP-10 -

BP-11 -

BP-12 -

BP-13 ++

BP-14 +++

BP-15 +++

BP-16 -

BP-17 -

BP-18 +++

BP-19 -

BP-20 -

Positive Seren1

6/20

Die Seren von gesunden Kontrollpatienten zeigten keine spezifische IgE-

Antikörper-Reaktivität gegen LAD-1 aus Mediumüberstand kultivierter Keratinozy-

ten. Eine Erkennung des Spaltproduktes LABD97 von Auto-IgE-Antikörper aus

Seren von BP-Patienten konnte nicht nachgewiesen werden. Es fiel jedoch die

Reaktivität des LAD1-Serums mit IgA- und vieler BP-Seren mit IgE-Antikörpern

gegen ein Protein im 50 kDa-Bereich auf. Jedoch zeigt auch ein gesundes Kon-

trollserum an dieser Stelle eine Bande.

Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tab. 6 zusammengefasst. Eine repräsentati-

ve Auswahl an Blots ist in Abb. 18 dargestellt.

4.6. IgE-Autoantikörper-Reaktivität gegen BP180 und BP230 in

Keratinozytenextrakten

Neben Keratinozytenkulturüberstanden wurden auch Keratinozytenextrakte getes-

tet. Die Keratinozytenextrakte wurden wie in Abschnitt 3.3.2. beschrieben herge-

stellt, mittels 7,5% SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembran über-

tragen. Es erfolgte eine Inkubation eines Nitrozellulosestreifens mit Serum eines

Patienten mit linearer IgA-Dermatose (LAD) (s. Abb.19). Alle 20 BP-Seren wurden

auf die IgE-Reaktivität gegen Keratinozytenextrakte getestet. Die Detektion der

Tab. 6: Ergebnisse der visuellen Auswer-tung der Immunoblots, + Reaktion; ++ starke Reaktion; +++ stärkste Reaktion. - keine Reaktion. *Serum aus der Wer-tung genommen, da Reaktion mit GST; 1 Anzahl der positiven Seren/totale Anzahl

der getesteten Seren.

ERGEBNISSE 58

Reaktivität erfolgte wie im Falle der Kulturüberstände (Abschnitt 3.4.4. / 4.5.). Eine

mögliche Kreuzreaktion des tertiären Antikörpers mit anderen Immunglobuli-

nen/Antigenen wurde ausgeschlossen, indem der anti-human-IgE-Antikörper weg-

gelassen wurde.

Es wurde die Reaktivität gegen BP180 und BP230 ausgewertet. Die Ergebnisse

sind in Tab. 7 dargestellt. Auffallend ist, dass nur 3 der BP-Seren IgE-Reaktivität

gegen BP180 in Keratinozytenextrakt haben, wobei nur ein Serum stark reagiert.

11 von 20 der ausgewerteten BP-Seren wiesen Banden bei 230 kDa auf. Dieser

Befund lässt auf IgE-Reaktivität mit dem hemidesmosomalen Protein BP230

schließen. Einige Streifen zeigten Banden bei 116 und 97 kDa, d. h. ungefähr bei

LAD1 und LABD97 (s. o.). Darüber hinaus sind im niedrigen Molekulargewichtsbe-

reich viele unspezifische Banden zu sehen. Wie auch schon beim LAD1-

Immunuoblotting liegen im 50 kDa-Bereich bei 6 der BP-Patienten und im LAD-

Serum deutliche Banden vor. Diese Banden bei 50 kDa stellen eventuell verkürzte

Anteile der BP180 Ektodomäne dar. Seren gesunder Kontrollen zeigten keine

spezifische Reaktivität.

116

200

97

66

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112131415

BP NHSK

BP180

[kDa]

BP230

116

200

97

66

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112131415

BP NHSK

BP180

[kDa]

BP230

Abb. 19: IgE-Autoantikörper-Reaktivität gegen epidermale Proteine in Keratinozytenextrak-ten. Auf der rechten Seite sind die Positionen der Molekulargewichtsmarker gezeigt. In Spur 2-10 wurden die Nitrozellulosestreifen mit Seren von Patienten mit bullösem Pemphigoid (BP), in Spur 11 - 15 mit Seren 5 gesunder Spender inkubiert. 1:LAD-1, 2:BP12, 3:BP13, 4:BP15, 5:BP1, 6:BP3, 7:BP4, 8:BP11, 9:BP14, 10:BP18, 11:NHS1, 12:NHS3, 13:NHS6, 14:NHS9, 15:NHS8

ERGEBNISSE 59

Tab. 7: Ergebnisse der visuellen Auswertung der Immunoblots, + Reaktion; ++ starke Reaktion; +++ stärkste Reaktion. - keine Reaktion. *Serum aus der Wertung genommen, da Reaktion mit GST;

1 Anzahl der positiven Seren/totale Anzahl der getesteten Seren.

Patient BP230

in Keratinozytenextrakten BP180

in Keratinozytenextrakten

IgE- Reaktivität IgE- Reaktivität

BP-1 + +

BP-2 + -

BP-3 + -

BP-4 + +++

BP-5 ++ -

BP-6 ++ -

BP-7 - -

BP-8 - -

BP-9 - -

BP-10 + -

BP-11 - -

BP-12 + -

BP-13 - -

BP-14 - -

BP-15 - ++

BP-16 - -

BP-17 + -

BP-18 + -

BP-19 - -

BP-20 + -

Positive Seren1 11/20 3/20

4.7. IgE-Autoantikörper-Reaktivität gegen den C-terminalen

Abschnitt von BP180 (BP4575)

Der C-terminale Abschnitt von BP180 (BP4575) umfasst mit einem Molekularge-

wicht von 45 kDa den Aminosäurebereich 1365-1413. Er liegt in der Lamina densa

in der Haut und endet in einer Schlaufenstruktur (s. Abb. 1 und Abb. 2). Dieses

Protein wurde in E.coli rekombinant hergestellt und mir von Dr. med. C. Sitaru zur

Verfügung gestellt. Mittels Immunoblotanalyse wurde wie in Abschnitt 3.4.3. und

3.4.4. beschrieben die IgE- und IgG-Reaktivität von 20 BP-Seren und 10 Negativ-

kontrollen gegen dieses Fragment untersucht. 10 der 18 ausgewerteten BP-Seren

enthielten IgE-Autoantikörper gegen die rekombinant hergestellte Ektodomäne. In

der Regel wurden auf der Membran eine Doppelbande detektiert, welche auf eine

Degradierung des rekombinanten Proteins hinweist. Als Positivkontrolle diente der

aus immunisierten Kaninchen gewonnene anti-GST-Antikörper (SA8009). Die

NHS/PV-Serum wiesen keine IgE-Reaktivität gegen BP4575 auf. Eine Auswahl

repräsentativer Beispiele ist in Abb. 20 dargestellt. Die Tab. 8 zeigt die Ergebnis-

se der Immunoblotanalyse.

ERGEBNISSE 60

BP NHS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BP4575 45

[kDa]K BP NHS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BP4575 45

[kDa]K

66

Abb. 20: IgE-Autoantikörper-Reaktivität gegen den C-terminalen Abschnitt von BP180 (BP4575). Spur 1 zeigt die Positivkontrolle. In Spur 2-9 wurden die Nitrozellulosestreifen mit BP-Seren inkubiert, in Spur 10-12 mit normalen humanen Seren (NHS). 1: SA8009, 2: BP4, 3: BP6, 4: BP5, 5: BP13, 6: BP3, 7: BP15, 8: BP3, 9: BP17

Patient BP180 4575

IgE- Reaktivität

BP-1 -

BP-2 -

BP-3 +

BP-4 ++

BP-5 +

BP-6 -

BP-7 -

BP-8 -

BP-9 +

BP-10 -

BP-11 +

BP-12 (+++)*

BP-13 ++

BP-14 (+++)*

BP-15 +++

BP-16 -

BP-17 +

BP-18 -

BP-19 -

BP-20 -

Positive Seren1

6/18

Tab. 8: Ergebnisse der visuellen Auswer-tung der Immunoblots, + Reaktion; ++ starke Reaktion; +++ stärkste Reaktion; - keine Reaktion. *Serum aus der Wer-tung genommen, da Reaktion mit GST; 1 Anzahl der positiven Seren/totale An-

zahl der getesteten Seren.

ERGEBNISSE 61

4.8. Übersicht der Epitoperkennung für IgE auf dem

intrazellulären und extrazellulären Abschnitt von BP180

Tab

. 9:

Imm

un

ob

lotu

nte

rsu

ch

un

g 2

0 B

P-S

ere

n:

IgE

-Au

toan

tikö

rper-

Reakti

vit

ät

geg

en

BP

180

BP

, b

ullö

ses P

em

ph

igoid

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1A

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*native P

rote

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Kera

tin

iozyte

nextr

akte

n.

ERGEBNISSE 62

Aus den Ergebnissen der Gesamt-IgE-Bestimmung und den mittels Immunoblot-

analysen bestimmten IgE-Autoantikörper-Reaktivitäten in BP-Seren gegen rekom-

binante Abschnitte von BP180 und gegen isolierte native Proteine aus Keratinozy-

tenkulturen wurde versucht eine Gesetzmäßigkeit festzustellen. Die Tab. 9 fasst

die Ergebnisse der Epitopuntersuchung auf dem BP180 Molekül zusammen. Bei

der Betrachtung der Ergebnisse fällt auf:

1. Die BP-Seren 4, 13, 14, 15 zeigten in der Keratinozytenextrakt-, LAD-1- und

BP180 4575-Untersuchung IgE-Reaktionen. Auffällig dabei ist, dass diese Seren

im Gesamtdurchschnitt eher ein niedriges Gesamt-IgE bei negativem SX1 haben.

2. Das Serum BP4 reagiert mit Autoantikörpern gegen alle untersuchten Proteine,

außer gegen ICD-B und wenig gegen NC16A, dabei hat der Patient nur ein gering-

fügig erhöhtes Gesamt-IgE, bei keiner allergischen Disposition.

3. Patient 17 hat extrem hohe Gesamt-IgE-Werte mit Allergieneigung, reagierte

wenig mit IgE-AK gegen die BP180 Proteine.

4. BP3 hat ein hohes Gesamt-IgE, ein negatives SX1 und hat außer mit LAD1,

BP180 4575 keine IgE-Reaktionen.

5. Patienten, die keine IgE-Reaktivität gegen NC16A zeigten (3 von 18), haben

auch keine Reaktivität gegen die anderen untersuchten Abschnitte auf der extra-

zellulären Domäne von BP180.

6. Nur BP7 reagierte als einziges Serum mit dem gesamten intrazellulären Frag-

ment, jedoch ohne Banden bei NC16A und negativem NC16A-ELISA.

7. Zwei Seren (BP2 und BP20) zeigten gegen keinen der untersuchten Abschnitte

von BP180 IgE-Antikörper.

8. Zu erwähnen ist, dass nur 3 Seren IgE-Reaktivität gegen das gesamte BP180-

Molekül zeigten, jedoch die unterschiedlichen Abschnitte von BP180 in viel größ-

erer Anzahl erkannt wurden.

9. Sehr hohes Gesamt-IgE im Blut bei negativem SX1 ließ keine sichtbare Stei-

gerung der IgE-Reaktivitäten gegen BP180 Fragmente erkennen (siehe BP3). 10.

Auf der anderen Seite führten erhöhte Gesamt-IgE-Spiegel (>20.000 kU/l) mit

Nachweis von spezifischem IgE (BP17) ebenfalls zu Reaktionen gegen BP180

Abschnitte.

11. Bei den Negativkontrollen zeigte sich eine vereinzelte Bande in der IgG-

Reaktion gegen rekombinantes ICD-B, jedoch reagierte dieses Serum nicht mit

IgE-Autoantikörpern gegen diesen Abschnitt. Ansonsten waren keine IgG- und

ERGEBNISSE 63

IgE-Antikörper Reaktionen gegen BP180 im Serum der gesunden Kontrollen

nachzuweisen.

Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass BP180 NC16A nicht die einzige

Antigendomäne für IgE-Autoantikörper beim bullösen Pemphigoid darstellt. Es

konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass zusätzliche Epitope auf der

intrazellulären Domäne sowie auf dem extrazellulären Abschnitt von BP180 exis-

tieren. Es lassen sich aus den vorliegenden Ergebnissen keine Gesetzmäßigkei-

ten für die IgE-Antikörper-Epitoperkennung auf dem BP-180 Molekül erkennen.

Die IgE-Autoreaktivität gegen die untersuchten Abschnitte der BP180-

Intrazellulärdomäne korreliert teilweise mit der IgG-Autoreaktivität in BP-Seren.

DISKUSSION 64

5. Diskussion

Das bullöse Pemphigoid ist eine organspezifische Autoimmunerkrankung, die mit

subepidermaler Blasenbildung der Haut einhergeht. Sie ist eine Erkrankung des

höheren Lebensalters, ihr Verlauf ist chronisch und durch rezidivierende Schübe

gekennzeichnet. Schon lange ist bekannt, dass beim BP die Autoantikörper vor-

rangig gegen das intrazelluläre Protein BP230 (Tanaka et al., 1990) und das

transmembranöse Protein BP180 der Hemidesmosomen gerichtet sind (Giudice et

al., 1992; Labib et al., 1986; Mutasim et al., 1985; Stanley et al., 1988). Beide

Strukturproteine nehmen eine Schlüsselstellung bei der Verankerung basaler Ke-

ratinozyten in der Basalmembran ein (Borradori and Sonnenberg, 1999; Georgi et

al., 2001). Insbesondere den Autoantikörper gegen das BP180 wird eine enorme

pathogene Relevanz beim Verlust der Adhäsion der basalen Keratinozyten zuge-

wiesen.

BP180 ist ein aus 1497 Aminosäuren aufgebautes Glykoprotein und besteht aus

einem intrazellulär gelegenem globulären Kopf, einem zentralen, die Lamina luci-

da durchspannenden Abschnitt und einer extrazellulären flexiblen, schleifenartigen

Struktur in der Lamina densa (Masunaga et al., 1997; Nonaka et al., 2000). Der

extrazelluläre Abschnitt besteht dabei aus 15 unterbrochenen kollagenen Regio-

nen und 16 nicht-kollagenen Domänen (Zillikens and Giudice, 1999). Die sech-

zehnte nicht-kollagene Domäne (NC16A), die sich extrazellulär unmittelbar an die

Zellmembran des basalen Keratinozyten anschließt, stellt den immundominanten

Abschnitt von BP180 dar (Giudice et al., 1993; Giudice et al., 1994; Matsumura et

al., 1996; Zillikens et al., 1997). Neuere Untersuchungen zeigten darüber hinaus,

dass BP180 neben NC16A weitere antigene Strukturen, sowohl auf der extrazel-

lulären, als auch auf der intrazellulären Domäne enthält (Di Zenzo et al., 2004;

Egan et al., 1999; Mariotti et al., 2004; Murakami et al., 1996; Nakatani et al.,

1998; Nie and Hashimoto, 1999; Perriard et al., 1999; Schumann et al., 2000;

Thoma-Uszynski et al., 2006). Dieses erklärt die Beobachtung von Zillikens et al.,

dass die Antikörper-Reaktivität in BP-Seren, die mit der NC16A-Domäne vorinku-

biert waren, nicht vollständig ihre Aktivität gegen die ECD des BP180 verloren (Zil-

likens, Rose et al. 1997).

Die Bindung der Autoantikörper an die Strukturproteine der Haut führt zu einer

Aktivierung von Komplement und dadurch zur Rekrutierung von Leukozyten an

der Basalmembran. Neutrophile Granulozyten stoßen reaktive Sauerstoffradikale

DISKUSSION 65

und proteolytische Enzyme wie Gelatinase B und Elastase aus somit wird die

Funktion der Hemidesmosomen gestört und die Epidermis hebt sich von der Ba-

salmembran ab.

Neben Autoantikörpern der Klasse IgG wurde in der letzten Zeit immer häufiger

auf die pathologische Relevanz der IgE-Autoantikörper beim bullösen Pemphigoid

hingewiesen (Chen et al., 2002; Christophoridis et al., 2000; Delaporte et al.,

1996; Dimson et al., 2003; Dopp et al., 2000; Fairley et al., 2005; Provost and To-

masi, 1974). Gegenüber anderen bullösen Autoimmundermatosen werden beim

BP erhöhte Gesamt-IgE-Werte im Blut gefunden (Arbesman et al., 1974; Bows-

zyc-Dmochowska and Dmochowski, 2002; Dimson et al., 2003) . Durch die IgE-

Antikörper lässt sich der Einstrom von eosinophilen Granulozyten erklären, die im

histologischen Bild einer BP-Blase überwiegen bzw. der Nachweis von basophilen

Granulozyten in Gefrierschnitten der Haut. Erhöhte IgE-Spiegel in der Blasenflüs-

sigkeit von BP-Patienten wurden nachgewiesen. Auch die Bindung zirkulierender

IgE-Antikörper entlang der Basalmembran konnte in einigen BP-Fällen gezeigt

werden (Parodi and Rebora, 1992; Soh et al., 1993).

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit implizieren die pathogenetische Relevanz

der IgE-Autoantikörper gegen BP180. 18 von 20 der untersuchten Patientenseren

zeigten erhöhte Gesamt-IgE-Werte, eine ähnlich hohe Anzahl, wie auch von an-

deren Autoren beschrieben (Arbesman et al., 1974; Bowszyc-Dmochowska and

Dmochowski, 2002; Dimson et al., 2003). Von den Negativkontrollen wies nur eine

Serumprobe erhöhte IgE-Werte auf. Um falsch-positive IgE-Werte aufgrund einer

atopischen Disposition auszuschließen, wurde mittels ImmunoCap 100 (Firma:

Phadia, Freiburg) ein Atopen-Screening (Mischung SX-1) durchgeführt. Die Be-

funde des Sreening legen nahe, dass die erhöhten IgE-Titer und die Erkrankung

mit der blasenbildenden Autoimmundermatose BP zusammenhängen (siehe Ab-

schnitt 4.3.). Da Juckreiz und urtikarielle Plaques der Blasenbildung beim BP häu-

fig vorausgehen, könnte dies im Zusammenhang mit den erhöhten Serum-

Gesamt-IgE-Spiegeln bei unbehandelten BP-Patienten ein Hinweis dafür sein,

dass IgE möglicherweise eine Rolle in der frühen Phase des bullösen Pemphi-

goids zukommt.

Zu erwähnen ist, dass ein erhöhtes IgE auch andere Ursachen haben kann, z. B.

parasitäre Infektion, Hyper-IgE-Syndrom, Erkrankungen mit T-Zell-Dysfunktion

DISKUSSION 66

(AIDS, M. Hodgkin, Non-Hodgkin-Lymphome der T-Zell-Reihe), maligne Tumore,

IgE-Gammopathie, infektiöse Mononukleose und andere virale Erkrankungen.

Zum großen Teil handelte es sich aber um Patienten von der Station 10c der

Dermatologie des UKSH, Campus Lübeck, klinisch lag kein Anhalt für oben ge-

nannte Krankheiten vor.

5.1. Expression und Aufreinigung der verschiedenen

rekombinanten BP180 Polypeptide

In der vorliegenden Arbeit sollten die antigenen Determinanten auf der extrazellu-

lären sowie insbesondere der intrazellulären Domäne von BP180 für Autoantikör-

per der Isotypen IgG und IgE charakterisiert werden und eventuelle Unterschiede

in der Reaktivität beider Antikörperklassen gegen einzelne Abschnitte des BP180

aufgezeigt werden.

Um eine Kartierung der Epitope der intrazellulären Domäne von BP180 durchfüh-

ren zu können, wurde sie willkürlich in vier sich überlappende Fragmente unter-

teilt. Die Proteine wurden in E.coli exprimiert, über Affinitätschromatographie auf-

gereinigt und im Western-Blot ihrer Größe nach aufgetrennt. ICD-A, -B, -C, -D

migrierten um wenige kDa unterschiedlich zu ihrer berechneten Größe. Die Pro-

teine konnten in der Immunoblotanalyse eingesetzt werden, da deutliche Banden

im 40 kDa-Bereich auf der Membran zu erkennen waren. In einem Kontroll-

Western-Blot mit dem Kaninchen Serum SA8009 (Sitaru et al., 2002), gewonnen

durch Immunisierung mit GST-BP180 NC16A2-4, reagierten die Proteine positiv

(s. Abb. 12, Abschnitt 4.1.). Darüber hinaus wiesen die Fragmente A, B, C, D zu-

sätzliche schmale Banden mit niedrigerem Molekulargewicht auf. Diese Banden

lassen sich am ehesten als Degradierungsprodukte der Proteine deuten (s. Er-

gebnisse).

Die Instabilität der Proteinabschnitte der BP180-Intrazellulärdomäne deutet dar-

aufhin, dass durch die willkürliche Unterteilung einer Proteineinheit in vier Frag-

mente die Ausbildung von stabilen Proteindomänen gestört wird. Weiterere Effekte

dieser Unterteilung sind zudem, dass sich zum einen verschiedene konformatio-

nelle Epitope nicht ausbilden können, zum anderen Neoepitope freigelegt werden.

Dennoch zeigten die durchgeführten Experimente, dass die Fragmente A, B, C, D

der intrazellulären BP180 Domäne zur Analyse der Reaktivitäten geeignet waren.

DISKUSSION 67

Der rekombinant hergestellte C-terminale Abschnitt GST-BP180 4575 (AS 1365 -

1413) zeigte in der Immunoblotanalyse eine Doppelbande, welche ebenfalls auf

ein Degradierungsprodukt hinweist. Im Unterschied dazu zeigte rekombinantes

NC16A1-5 eine deutlich höhere Stabilität. In der Dissertation von J. Korn wird aus

den Ergebnissen einer Konformationsanalyse durch einen trypsin-vermittelten Pro-

teinabbau die Vermutung angestellt, dass die nicht-kollagenen Abschnitte eher

gegen einen proteolytischen Angriff von Trypsin geschützt sind als die kollagenen

Abschnitte des BP180 (Korn, 2006). Auch in der vorliegenden Arbeit war im Ge-

gensatz zu kollagenem BP4575 bei NC16A kaum eine Degradierung zu verzeich-

nen.

5.2. IgE-Autoreaktivität und IgG-Autoreaktivität gegen die

extrazelluläre Domäne von BP180

Um die Stellung der IgE- und IgG-Autoantikörper in der Pathophysiologie des bul-

lösen Pemphigoids weiter zu klären, wurden die Antigenbindungsstellen auf der

extrazellulären des Antigens BP180 untersucht.

15 der 18 unbehandelten BP-Patienten wiesen in der vorliegenden Untersuchung

IgE-Autoantikörper gegen NC16A1-5 auf, ein im Vergleich zu anderen Arbeiten

höherer Anteil. Bei Fairly et al. zeigten 5 von 10 unbehandelten BP-Patienten IgE-

Antikörper gegen NC16A1-5. Dabei wird sowohl von IgG als auch von IgE haupt-

sächlich die NC16A2 Subdomäne (Abb. 4) erkannt (Fairley et al., 2005). Dimson

et al. diagnostizierten bei 16 von 23 unbehandelten Patienten mit BP, IgE-

Autoantikörper gegen BP180, davon reagierten 15 Patienten gegen NC16A. Bei

einem BP-Serum wird vermutet, dass dessen IgE-Autoantikörper mit anderen De-

terminanten auf der Ektodomäne reagierten (Dimson et al., 2003). Dopp et al. wie-

sen bei 55% der BP-Seren IgE-Autoantikörper gegen NC16A nach. Sie beschrie-

ben zudem, dass die Höhe der Serum-Titer dieser Immunglobuline die Krank-

heitsaktivität widerspiegelt (Dimson et al., 2003; Dopp et al., 2000; Fairley et al.,

2005). Christophoridis et al. fanden dagegen bei 100% der untersuchten BP-Seren

IgE-Antikörper gegen die Ektodomäne von BP-180 (Christophoridis et al., 2000).

Möglicherweise beruhen diese zum Teil deutlichen Differenzen auf der unter-

schiedlichen Verdünnung der Patientenseren oder sind auf unterschiedliche

Krankheitsstadien des untersuchten Patientenkollektivs zurückzuführen. Auch

DISKUSSION 68

kann es am Testsystem liegen, d. h. am eingesetzten rekombinant hergestellten

Protein.

Wie von Fairley et al. beschrieben ist das spezifische Profil der IgG- und

IgE-Autoantikörper gegen unterschiedliche Abschnitte des NC16A-Moleküls sehr

ähnlich (Fairley et al., 2005). Auch in der vorliegenden Arbeit zeigten 16 der 18

Patienten in der Immunoblotanalyse IgG-Antikörper gegen NC16A. Keiner der Ne-

gativkontrollen zeigte IgG-Banden im 35 kDa-Bereich. Dieses Ergebnis stimmt mit

den Aussagen vieler Studien überein, die NC16A als Hauptantigene Determinante

BP180 beschreiben. Parallel dazu wurde in der Immundiagnostik der Dermatolo-

gie UKSH, Campus Lübeck ein NC16A ELISA durchgeführt. Hierbei wiesen eben-

falls 16 der 18 untersuchten Patientenseren einen positiven NC16A ELISA auf,

wobei ELISA- und Immunblot-Ergebnisse nicht immer korrelieren. Ein Grund da-

für kann eine mögliche Veränderung des Antigens durch die Hitzeeinwirkung im

Rahmen des Immunoblotten sein. Außerdem werden in der ELISA-Diagnostik Ab-

schnitte von NC16A1-5 eingesetzt und das Protein kann daher von BP-Seren im

ELISA und Immunoblot unterschiedlich erkannt werden.

Das C-terminale Ende des BP180 gilt als weiteres Antigen für BP-Autoantikörper.

Es entspricht ungefähr dem Aminosäure-Bereich ab AS 1320 und besitzt eine

Schlaufenstruktur in der Lamina densa (Nonaka et al., 2000). Di Zenso et al. iden-

tifizierten 2 überlappende Epitope auf diesem C-terminalen Anteil des BP180 Mo-

leküls (AS 1331-1387 und AS 1354-1406). 19% der untersuchten BP-Serum-

Proben hatten an diese Abschnitte gebunden (Di Zenzo et al., 2004). Diese Bin-

dungsregion (AS 1331-1406) ist mit denen aus der Studie von Murakami et al.

(AS1365-1413) vergleichbar (Murakami et al., 1998). Auch in der Veröffentlichung

von Nakatani et al. wird die Reaktivität von IgG-Autoantikörper gegen das Fusi-

onsprotein BP180 4575 (AS 1365-1413) beschrieben. Dabei reagierten 23,5% der

BP-Seren mit diesem Abschnitt (Nakatani et al., 1998).

Auch in der vorliegenden Arbeit wurde das BP180-Molekül auf weitere Au-

toantikörper-Bindungsstellen auf dem C-terminalen Abschnitt untersucht. Dabei

wurde mit dem rekombinant hergestellten GST-Fusionsprotein BP180 4575 gear-

beitet. Das Augenmerk wurde in dieser Arbeit auf die IgE-Reaktivität mit diesem

Abschnitt gelegt (s. unten).

DISKUSSION 69

Des Weiteren wurde in dieser Studie die IgE-Reaktivität gegen LAD-1 un-

tersucht. Dieses 120-kDa-Protein entspricht weitgehend der extrazellulären Do-

mäne von BP180 (AS 5??-1497) und entsteht durch proteolytische Abspaltung

aus dem Gesamtprotein. Die Position des N-Terminus des 120 kDa Fragments

kann bis heute nicht eindeutig festgelegt werden (Franzke et al., 2002), es wird die

Aminosäure 524 oder 528 vermutet (Hirako et al., 2003). Im Westernblot konnte

vor einiger Zeit IgG-Autoreaktivität in BP-Seren mit LAD-1 nachgewiesen werden

(Hirako et al., 1998; Pas et al., 1997; Schmidt et al., 2000a; Schmidt et al., 2000b).

5.2.1. Nachweis von IgE-Autoreaktivität gegen den C-terminalen

Abschnitt von BP180 (BP4575) und gegen LAD-1

8 der 18 in dieser Arbeit gewerteten BP-Seren weisen IgE-Autoantikörper gegen

den rekombinant hergestellten C-terminalen Abschnitt BP180 4575 auf. Interes-

sant ist, dass 1 von 3 IgE-Anti-NC16A negativen Seren, eine IgE-Bande gegen

BP180 4575 lieferte (s. Tab. 9) und somit ein Indiz dafür ist, dass neben NC16A

noch andere Epitope auf dem extrazellulären Abschnitt des BP180 Molekül exis-

tieren.

Neben diesen Untersuchungen zur IgG-/IgE–Reaktivität gegen rekombinant her-

gestellte BP180-Fragmenten ist in der vorliegenden Arbeit die IgE-Autoantikörper

Reaktivität in BP-Seren mit dem natürlichen proteolytischen Spaltfragmenten LAD-

1 und LABD97 des BP180 Moleküls im Immunoblot untersucht worden.

Es konnte erstmals gezeigt werden, dass unbehandelte BP-Patienten (7 von 20)

IgE-Autoantikörper gegen LAD-1 aufweisen. Die Negativkontrollen zeigten keine

Reaktivität. LABD97 (AS 531-1209) wurde von den BP-Seren nicht erkannt. Da

das proteolytische Spaltprodukt LAD-1 ein nativ isoliertes Protein darstellt und

nicht rekombinant hergestellt wurde, ist seine Erkennung durch IgE-Autoantikörper

besonders interessant. Da der BP180 4575 (AS 1365-1413) Abschnitt ein Teil der

LAD-1 Domäne (AS 5??-1497) darstellt, würde man vermuten, dass Patienten mit

Reaktivität gegen 4575 auch mit LAD-1 reagieren. Jedoch nur 4 der 8 Patienten

mit Anti-4575-Antikörpern reagierten mit LAD-1. Die 4 anderen Patienten zeigten

nur Banden bei 4575, 2 Patienten hatten IgE-Antikörper gegen LAD und keine

Reaktion bei BP4575. Diese Beobachtung lässt darauf schließen, dass LAD-1

durch die proteolytische Abspaltung seine Form verändert.

DISKUSSION 70

5.3. IgG-Autoreaktivität gegen einen immundominanten

Abschnitt auf der intrazellulären Domäne von BP180

Bereits in früheren Arbeiten ist auch die intrazelluläre Domäne von BP180 als Au-

toantigen für BP-Autoantikörper der Klasse IgG beschrieben worden (Di Zenzo et

al., 2004; Perriard et al., 1999). Dabei gibt es nach Perriard et al. mehrere anti-

gene Determinanten auf dieser Domäne, wobei die zentrale Region der ICD den

immundominante Abschnitt für IgG-Autoantikörper darstellt. 59% der BP-Patienten

mit BP180-Reaktivität enthielten IgG-Autoantikörper gegen ein Fusionsprotein aus

der ICD (AS 114-200) und einer Sequenz des K-Ras Proteins. Die Reaktivität von

IgG-Antikörpern in BP-Seren gegen exprimierte ICD des BP180 wurde weiterhin

durch Immunfluoreszenz ermittelt (Perriard et al., 1999). Übereinstimmend mit

diesen Befunden beschrieb Di Zenso et al, dass 21% der getesteten BP-Seren

IgG-Autoantikörpern gegen die ICD-Aminosäureregion 151-203 besitzen, 10,5%

der Patienten erkannten den Aminosäurebereich 299-354. Diese Resultate spre-

chen stark für die Immunogenität der zentralen Region der ICD. Die Idee wurde

zudem durch ihre Beobachtung gestützt, dass Maus-anti-BP180-Antikörper mit

den AS 151-170 reagierten, ein Indiz, dass dieser Bereich auch von Mäusen als

immunogen erkannt wird (Di Zenzo et al., 2004).

In der vorliegenden Arbeit wurde die IgG-Autoreaktivität in 20 nicht medi-

kamentös vorbehandelten BP-Seren gegen die vier rekombinant hergestellten Ab-

schnitte der BP180-Intrazellulärdomäne im Immunoblot untersucht. 18 Seren wur-

den in der Auswertung berücksichtigt. 2 Seren wurden nicht in die Wertung mit

einbezogen, da diese Antikörper gegen das rekombinante Kopplungsprotein Glu-

tathion-S-Transferase aufzeigten. 7/18 der Patienten lassen Banden bei ICD-A

(AS1-133) und 14/18 bei ICD-B (103-266) erkennen. Abschnitt C (234-398) und D

(367-452) werden von IgG-Autoantikörper in 5/18 bzw. in 6/18 der untersuchten

Patientenseren erkannt. Dieses Resultat ist in guter Übereinstimmung mit früheren

Aussage von Perriard et al, dass BP-Seren mehrere Epitope auf dem intrazellulä-

ren Abschnitt des BP180 Proteins erkennen (Perriard et al., 1999) und zeigt, dass

IgG-Autoantikörper zum größten Teil gegen den zentralen Aminosäurebereich

103-266 der ICD von BP180 gerichtet sind.

Die Beobachtung, dass das unmittelbar an der Zellmembran lokalisierte NC16A

die immundominante Region von BP180 darstellt, lässt vermuten, dass Auto-

Antikörper besonders an ICD-D binden, da diese über die transmembranöse

DISKUSSION 71

Komponente des BP180 am nächsten in Kontakt zu NC16A steht. Diese Überle-

gung wurde anhand der vorliegenden Ergebnisse jedoch nicht bestätigten. Sie

unterstützen vielmehr die Aussage von Anderen, dass der zentrale Aminosäurebe-

reich als Hauptantigendeterminante erkannt wird (Di Zenzo et al., 2004; Perriard et

al., 1999). Diese entspräche dem Abschnitt ICD-B in der vorliegenden Arbeit, mit

dem 14 der 18 untersuchten Patientenseren reagierten.

1 der 10 Kontrollseren wies eine starke IgG-Bande gegen ICD-B Bereich auf. Die-

se Reaktivität gesunder Seren gegen die intrazellulären Bestandteile des BP180

lassen sich möglicherweise durch das Erkennen der rekombinant hergestellten, d.

h. nicht in nativer Form vorliegenden Proteine erklären. Darüber hinaus kann mög-

licherweise auch eine hohe Konzentration an IgG im Blut zu Kreuzreaktionen füh-

ren.

5.4. IgE-Autoreaktivität gegen die intrazelluläre Domäne von

BP180

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass in BP-Seren IgE-

Autoantikörper gegen die BP180-Intrazellulärdomäne existieren.

8 von 18 Patienten haben IgE-Autoantikörper gegen ICD-A, 14/18 Patienten ge-

gen ICD-B und 7/18 gegen ICD-D. Diese Zahl ähnelt der Anzahl der Seren, die mit

IgG-Autoantikörper gegen Abschnitt A, B und D reagierten. Darüber hinaus zeigte

sich in der vorliegenden Untersuchung, dass gegen Abschnitt C sogar mehr IgE-

(11 positiv von 18 Patienten) als IgG-Reaktivität vorhanden ist (5 positiv von 18).

Überraschend ist die fast gleich hohe Reaktivität der Auto-IgE-Antikörper gegen

ICD-B (14/18) und NC16A1-5 (16/18) des BP180 Moleküls.

3 Seren mit z. T. besonders starker IgE-Reaktion gegen die ICD, wiesen keine

IgE-Reaktion mit NC16A auf. Diese Beobachtung, dass es Patienten mit z. T.

starken Reaktionen gegen die ICD jedoch weder IgG- noch IgE-Autoantikörpern

gegen NC16A1-5 bei gleichzeitig negativen NC16A-ELISA gibt, weist daraufhin,

dass außer NC16A auch andere Abschnitte eine immundominante Rolle sowie

eine pathogenetische Relevanz in der Entstehung des BPs spielen.

Gesetzmäßigkeiten in der Kombination der AK-Reaktionen gegen die intra-

zellulären bzw. gegen die extrazellulären BP180-Fragmente konnten anhand der

Daten dieser Arbeit nicht aufgezeigt werden. Auch die Aussage von Perriard et al.,

dass zwischen der extrazellulären und intrazellulären BP-180-Domäne kein Kreuz-

DISKUSSION 72

reaktivität besteht, ist mit den Ergebnissen der Studie vereinbar (Perriard et al.,

1999). Kein Serum der Kontrollgruppe wies Reaktionen mit IgE-Antikörpern gegen

die rekombinant hergestellten intrazellulären Abschnitte auf.

Wie von Fairley et al. beschrieben, ist das spezifische Profil der IgG- und IgE-

Autoantikörper gegen NC16A sehr ähnlich (Fairley et al., 2005). Dimson et al ver-

öffentlichte 2003, dass im Serum des BP-Patienten IgE-Autoantikörper mit den-

selben Zielantigenen wie IgG-Autoantikörper reagierten (Dimson et al., 2003).

Dieses wurde in der vorliegenden Arbeit bestätigt. Ein Großteil der untersuchten

Seren zeigte ein sehr ähnliches Profil in der Reaktion der IgE- und IgG-

Autoantikörper mit den Abschnitten der BP180-Intrazellulärdomäne und NC16A.

Der Chi-Quadrat-Tests zeigte, dass die Ergebnisse der Bindungseigenschaften

der beiden Antikörperklassen gegen die ICD-B, -D und NC16A1-5 mit sehr hohen

Wahrscheinlichkeiten abhängig voneinander sind (siehe Abschnitt 4.4., Abb. 17).

Zu den Ergebnissen ist anzumerken, dass die IgG- und IgE-Untersuchungen in

einigen Fällen zu breiten Banden im Immunoblot mit den ICDs vor allem bei Ab-

schnitt B und D führten (s. Abschnitt 4.4). Dieses lässt darauf schließen, dass BP-

Seren zum Teil auch mit Abbauprodukten der rekombinant hergestellten Proteine

reagierten.

Die Ähnlichkeit des IgG- und IgE-Bindungsmusters gegen BP180 lässt vermuten,

dass beide Isotypen durch klonale Selektion entstanden sind. Das bedeutet, alle

B-Zellen beginnen in der Initialantwort auf ein Antigen mit der Synthese von IgM.

Durch spezifische Signale wie IL-4, IL-13 und die Bindung von CD40 an seinen

Liganden (CD40L) an der Oberfläche von B-Zellen erfolgt ein Wechsel der Anti-

körperklasse, die die B-Zelle exprimiert (Gibbs et al., 1996; Prussin and Metcalfe,

2003). Durch DNA-Umlagerungen ausgetauschter Gen-Segmente wird die Pro-

duktion eines anderen Antikörper-Isotyps hervorgerufen. Da dieses Isotypen-

switching nicht die vollständig determinierende Region der neuen Antikörperklasse

betrifft, wird die Spezifität dieser Antikörper-Klassen die gleiche sein, wie die Im-

munglobuline, die in der primären Immunantwort dominieren. In einigen Fällen

aber kann die somatische Hypermutation der vollständig determinierenden Region

während des Isotypen-switching zu einer unterschiedlichen Bindungsaffinität zum

Zielantigen führen (Chaudhuri and Alt, 2004).

Da die Konzentration von IgE im Serum eines Patienten ungefähr 10.000-

100.000-fach geringer ist als von IgG, wurde zur Inkubation mit den Proteinen eine

DISKUSSION 73

Verdünnung des Serums von 1:100 für die IgG-Detektion bzw. 1:2 für die Detek-

tion von IgE vorgenommen. Die Konzentration an IgG-Antikörpern im 1:2 verdünn-

ten Serum ist daher sehr hoch und die Immunglobuline konkurrieren eventuell um

die Bindungsstellen auf den rekombinanten Proteinen. Da die IgE-Reaktivität so-

mit nicht detektierbar ist, lässt sich erklären, warum die IgG-Reaktivität in einigen

Fällen nicht mit IgE-Reaktivität korreliert.

Für die Sichtbarmachung der gebundenen IgE-Autoantikörper wurden der

sekundäre Antikörper anti-human-IgE von der Maus und ein tertiärer anti-Maus-

HRP-Antikörper verwendet. Die Ergebnisse der IgE-Autoreaktivität gegen die ICDs

und NC16A lassen sich daher möglicherweise auch erklären, dass einer dieser

Detektionantikörper an gebundene humane Antikörper bindet. Auch wäre ein un-

spezifisches Andocken des sekundären bzw. tertiären Antikörpers an die aufge-

trennten Proteinen möglich. Dieses wurde insoweit ausgeschlossen, indem zu Be-

ginn der Versuche eine Membran mit Serum und folgend mit anti-Maus-Antikörper

unter Auslassung des sekundären Antikörpers inkubiert wurde. Auf dieser Mem-

bran waren keine Banden zu verzeichnen. Auch die starke IgG-Reaktion des Kon-

trollserums gegen ICD-B ohne entsprechende Bande im IgE-Blot schließt eine

Kreuzreaktion weitgehend aus.

In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass Autoantikörper in lebende Zellen

eindringen, ihre intrazellulären Ziele erreichen und ihre Funktion erfüllen können

(Alarcon-Segovia 1996). Daher ist es denkbar, dass Autoantikörper gegen die ICD

von BP180 in der Pathogenese des BP von Bedeutung sind. Die ICDs enthalten

Sequenzen, die an der Einbindung des BP180 in den Hemidesmosomalen Plaque

beteiligt sind (Borradori et al., 1997; Hopkinson et al., 1995). Darüber hinaus bein-

haltet die zentrale Region der ICD von BP180 Bindungsstellen, die kritisch für die

Interaktionen des BP180 mit 4-Untereinheit von 64-Integrin sind (Aho and Uitto,

1998; Borradori et al., 1997; Schaapveld et al., 1998). Basierend auf diesen Be-

funden ist es denkbar, dass Autoantikörper gegen die intrazelluläre Domäne von

BP180 in der dermo-epidermalen Spaltbildung beteiligt sind, indem sie die Inter-

aktion von BP180 mit anderen Elementen des Hemidesmosomens stören. An die-

ser Störung könnten nicht nur IgG-und IgE-Antikörper, sondern auch IgE-

assozierte Zellen (sog. allergische Effektorzellen) beteiligt sein. Diese Zellen ver-

ursachen u. a. Symptome wie Juckreiz, Rötung und Urtikaria. Besonders die ba-

DISKUSSION 74

sophilen Granulozyten haben durch Ausschüttung von IL-4, IL-13 und CD40L im-

munmodulatorische Wirkung auf die Th-Zellen (Falcone et al., 2000; Gibbs, 2005;

Gibbs et al., 1996), die in der Pathogenese des BPs mitwirken (Thoma-Uszynski

et al., 2006) (s. Abb. 6).

5.5. IgE-Autoreaktivität gegen das gesamte BP180-Molekül

und BP230

Bei der Betrachtung der Ergebnisse fällt auf, dass die IgE-Reaktivität gegen

BP180 in Keratinozytenextrakten viel geringer ist, als die IgE-Erkennung der un-

terschiedlichen Abschnitte auf dem BP180 Molekül vermuten ließ. Nur 3 von 20

Seren wiesen IgE-Banden gegen BP180 auf, hingegen wird allein schon NC16A

durch 15 von 18 Seren erkannt und auch gegen die ICDs kann eine deutlich höhe-

re IgE-Reaktivität verzeichnet werden. Eine Erklärung dafür könnte sein, dass der

Blot auf Keratinozytenextrakten nicht so sensitiv ist. Vielleicht wurde bei der Her-

stellung der Extrakte der Lysepuffer auch zu lange auf dem Zellrasen belassen,

wodurch evtl. ein beginnender proteolytischer Proteinverdau durch Proteasen

stattfand, so dass BP180 v. a. als Spaltprodukt vorlag. Auch eine Unspezifität der

ICD-Fragmente wäre eine mögliche Erklärung, diese kann jedoch durch die nega-

tiv ausfallenden Normalseren ausgeschlossen werden. Möglicherweise kommt es

durch die willkürliche Abschnittseinteilung der BP180-Intrazellulärdomäne zu einer

Auffaltung der Proteine und somit zu einer neuen bzw. besseren Epitoperkennung.

Auffallend ist auch, dass die Reaktion gegen BP230 in Keratinozytenextrakten fast

viermal so häufig positiv ausfällt wie gegen BP180 (11 positiv von 20). Möglicher-

weise werden intrazellulär gelegene Proteine von IgE-Autoantikörpern verstärkt

erkannt.

Die erhöhte Reaktivität gegen LAD-1 im Vergleich zu BP180 lässt darauf schlie-

ßen, dass LAD-1 durch die proteolytische Abspaltung seine Form verändert und

so vermehrt von Autoantikörpern erkannt wird.

DISKUSSION 75

5.6. IgE-Autoantikörper besitzen mehrere Epitope auf dem

BP180-Molekül

Die Identifikation von mehreren Regionen mit IgE-Antikörper-Reaktivität auf dem

BP180 Molekül konnte in der Arbeit bestätigt werden. Dabei konnten Epitope auf

der IC-Domäne neu beschrieben werden. Eine Vielzahl von Hinweisen zeigen an,

dass im Laufe einer Autoimmunerkrankung die B- und T-Zell-Antworten nicht auf

einzelne immundominante Epitope beschränkt sind, sondern, dass darüber hinaus

zusätzliche Epitope innerhalb eines Proteins erkannt werden (Chan et al., 1998;

Vanderlugt and Miller, 1996). Dieses Phänomen, das als Epitop-spreading be-

zeichnet wird, scheint für die Unterhaltung und Progression der Autoimmunerkran-

kung wichtig zu sein. Die Beobachtung, dass Autoantikörper beim BP zwei Mole-

küle BP180 und BP230 als Ziel haben und darauf eine Vielzahl von Epitopen er-

kennen, lässt vermuten, dass Epitop-spreading ebenfalls beim Krankheitsverlauf

des BP eine Rolle spielt. Zum Epitop-spreading beim BP gibt es unterschiedliche

Hinweise. Es wurde beobachtet, dass Autoantikörper gegen die extrazelluläre

Domäne von BP180 eine Initiatorrolle bei der Entwicklung des BP zukommt, wäh-

rend Antikörper, die gegen zytoplasmatische Antigendeterminanten wie BP230

gerichtet sind, als zweites Ereignis angesehen werden (Giudice et al., 1993; Liu et

al., 1993). Andere Autoren dagegen vermuten aufgrund ihres Epitop-Musters,

dass die Bindung von Autoantikörpern an die ICD in der frühen Phase der Erkran-

kung stattfindet und somit eine bisher unbekannte Bedeutung bei der Auslösung

und Entwicklung der Erkrankung spielen könnten (Di Zenzo et al., 2004). In der

vorliegenden Studie konnte darüber keine Aussage getroffen werden. Um dieses

zu klären, sind weitere Untersuchungen mit BP-Seren unterschiedlicher Erkran-

kungsphasen notwendig.

Die BP180-Intrazellulärdomäne könnte möglicherweise eine pathogenetische Be-

deutung beim BP haben, indem sie „versteckte“ Epitope beinhaltet. Es gibt die

Hypothese, dass bestimmte Epitope eines Proteins nicht vom Immunsystem

wahrgenommen werden, so dass z. B. Autoantikörper hier keine Wirkung zeigen

können, allerdings sich auch keine Toleranz ausbildet. Durch molekulares Mimikry

dieser „versteckten“ Epitope durch z. B. virale oder bakterielle Erreger können An-

tikörper induziert werden. Wenn eine solche „versteckte“ Autoimmunität besteht,

erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass durch intramolekulares Epitop-spreading

echte pathogene Autoantikörper entstehen. Ein solches Geschehen wird u. a. für

DISKUSSION 76

den endemischen Pemphigus foliaceus (Fogo selvagem) angenommen (Li et al.,

2003).

Es ist möglich, dass es sich bei den ICDs ebenfalls um „versteckte“ Epitope han-

delt, gegen die Autoantikörper gebildet werden, die jedoch nicht pathogen sind.

Durch Epitop-spreading auf die NC16A-Domäne bildet sich dann das volle Krank-

heitsbild, das bullöse Pemphigoid, aus.

Thoma-Uszynski et al. demonstrierten mit ihren Ergebnissen, dass BP180

und zu einem geringeren Anteil BP230 die wichtigsten Antigene für autoreaktive T-

Zellen und IgG-Autoantikörper produzierende B-Zellen beim aktiven BP sind. Da-

bei werden das N-terminale Ende, der mittlere Anteil und das C-terminale Ende

des BP180 weitaus konstanter von T-und B-Zellen erkannt, als das BP230 Pro-

tein. Die BP180-Spezifität der T-und B-Zellen ist sehr ähnlich (Thoma-Uszynski et

al., 2006). Sie berichten weiterhin, dass die unterschiedliche Epitoperkennung auf

BP180 vom Krankheitsstadium abzuhängen scheint; beim ausgedehnten Krank-

heitsbild wird hauptsächlich der N-terminale Teil, beim limitierten Krankheitsbefund

eher der zentrale Teil des Moleküls von T- und B-Zellen erkannt.

In der vorliegenden Arbeit konnte keine Korrelation zwischen dem klinischen Sta-

dium, der Schwere der Erkrankung und der Fein-Spezifität des Anti-BP180-

Antikörpers aufgestellt werden. Hier sind weitere Untersuchungen von BP-

Patienten mit unterschiedlich starker Ausprägung der Erkrankung sowie von Se-

ren, die Patienten im Verlauf ihrer Erkrankung entnommen werden, notwendig.

Gesetzmäßigkeit der IgE-Bindungseigenschaften gegen die Ektodomäne

und den Abschnitten des intrazellulären Anteils des BP180 lassen sich nicht er-

kennen (s. Tab. 9). Als Beispiel sei hier das Patientenserum BP7 angeführt: starke

Reaktion der IgE-Autoantikörper mit ICD, aber keine Banden bei der Unter-

suchung mit NC16A und BP180 4575. Dieses bestätigt die Aussage von Perriard

et al., dass zwischen der extrazellulären und intrazellulären Domäne des BP180

Proteins keine Antigenkreuzreaktivität besteht (Perriard et al., 1999).

DISKUSSION 77

5.7. Ausblick

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass IgE-Autoantikörper multip-

le Autoantigene, mehr als bisher angenommen, erkennen und so in der Pathophy-

siologie des bullösen Pemphigoids beteiligt sind. Es wurde dargestellt, dass außer

NC16A weitere Epitope für IgE-Autoantikörper sowohl auf der extrazellulären als

auch erstmalig beschrieben auf der intrazellulären Domäne existieren. Für die

Reaktion der IgG-Autoantikörper konnte eine Erkennung der intrazellulären Do-

mäne bestätigt werden und eine Übereinstimmung mit den dominanten Aminosäu-

rebereichen auf der BP180-Intrazellulärdomäne aus anderen Arbeiten gefunden

werden. Beide Antikörperisotypen reagieren jedoch nicht unabhängig voneinander

gegen die ICDs, so dass für die alleinige Reaktion der IgE-Autoantikörper und de-

ren genauen Relevanz in der Entstehung des BPs keine Aussage getroffen wer-

den kann. Aus den Ergebnissen vorheriger Veröffentlichungen und anhand der

Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lässt sich jedoch stark vermuten, dass auch

Mastzellen und basophile Granulozyten, aktiviert durch spezifische IgE-abhängige

und IgE-unabhängige Trigger, eine Rolle in der Pathogenese des BPs spielen.

Durch die Ausschüttung von IL-4, IL-13 durch Basophile wird die Th2- Immunant-

wort moduliert und es erfolgt ein Antikörperisotypen-switching zu IgE, welches

wiederum basophile und eosinophile Granulozyten aktiviert (Abb. 6).

Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ergeben sich folgende Fragen:

1. Sind die IgE-Autoantikörper gegen Strukturproteine der Haut, die u. a. basophile

und eosinophile Granulozyten aktivieren und die Th2-Immunantwort stimulieren

und somit die weitere Produktion von IgE anregen, die primären Auslöser?

Oder

2. Entstehen die IgE-Autoantikörper erst sekundär, d. h. nach Bindung von IgG an

Strukturproteine der DEJ, Komplementaktivierung und der Einwanderung von

Mastzellen, neutrophiler, eosinophiler und basophiler Granulozyten, die ihrerseits

durch die Ausschüttung von IL-4 ein Antikörperisotypen-switching hervorrufen?

Durch die IgE-Synthese kommt es zu einer weiteren Aktivierung von Fc-Rezeptor

exprimierenden Zellen.

3. Gegen welchen Abschnitt von BP180 werden primär Autoantikörper gebildet,

kommt der BP180-Intrazellulärdomäne eventuell eine sehr viel größere pathoge-

netische Bedeutung zu als bisher angenommen?

DISKUSSION 78

Bei der Beantwortung dieser Fragen könnte ein Nachweis von IgE-

Autoantikörpern gegen BP180 an Gefrierschnitten humaner Haut hilfreich sein.

Auch der histologische Nachweis von basophilen Granulozyten und Mastzellen in

der Haut von BP-Patienten im Bereich von BP-Läsionen könnte weitere Hinweise

geben, in welchem Ausmaß allergische Effektorzellen an der Entstehung des bul-

lösen Pemphigoids beteiligt sind. Zur genaueren Zuordnung der für IgE-Antikörper

pathogenetisch relevanten Krankheitsphase müsste man Patienten im Verlauf be-

obachten. Dabei sollte klinisch auf Juckreiz und Urtikaria geachtet werden. Sero-

logisch sollte man zu unterschiedlichen Zeitpunkten das Gesamt-IgE bestimmen

und wiederholte Immunoblotanalysen durchführen. Weiterhin könnte man vor der

IgE-Diagnostik die IgG-Antikörper aus den BP-Seren entfernen, um Kreuzreaktio-

nen völlig auszuschließen.

Diese Untersuchungen und Beantwortungen der Fragen könnte die Rolle von IgE-

Autoantikörper beim BP und eventuell auch bei anderen Autoimmundermatosen

weiter klären. Damit könnten neue Wege für die pharmakologische Therapie von

blasenbildenden Autoimmundermatosen eröffnet werden.

ZUSAMMENFASSUNG 79

6. Zusammenfassung

Das bullöse Pemphigoid (BP) ist die häufigste subepidermal blasenbildende Auto-

immundermatose beim Menschen. Die Erkrankung ist gekennzeichnet durch IgG-

Autoantikörper gegen das hemidesmosomale Protein BP180 (Typ-XVII-Kollagen),

das für die Verankerung basaler Keratinozyten auf der kutanen Basalmembran

sorgt. Der massiven Einstrom von eosinophilen Granulozyten, der Nachweis von

basophilen Granulozyten und Mastzellen in der Dermis sowie die klinischen Symp-

tome (z. B. Juckreiz) weisen auf die Beteiligung von IgE-Antikörpern in der Patho-

physiologie des BP hin. In der vorliegenden Arbeit sollte mittels Immunoblotdiag-

nostik die Rolle der IgE-Autoantikörper gegen unterschiedliche Epitope auf BP180

aufgeklärt sowie eine mögliche Korrelation der IgE-und IgG-Autoreaktivität über-

prüft werden. Zudem wurde der Serum-Gesamt-IgE-Spiegel der Patienten und

Kontrollen bestimmt und im Zusammenhang mit den Ergebnissen des Epitop-

mappings betrachtet. Dazu wurde die IgE- und IgG-Autoreaktivität gegen ver-

schiedene rekombinant hergestellte intra- (ICD) und extrazelluläre (ECD) Frag-

mente von BP180 sowie gegen aus Keratinozytenkultur isolierte native Abschnitte

von BP180 im Serum von 20 nicht medikamentös vorbehandelten BP-Patienten

und 10 Negativkontrollen untersucht. Die rekombinanten Proteine, hBP180 ICD-A,

-B, -C, -D sowie der C-terminale Abschnitt (BP180 4575), wurden in E.coli expri-

miert. Das proteolytische Spaltprodukt von BP180 (LAD-1) wurde aus dem Me-

diumüberstand kultivierter HaCaT-Zellen isoliert.

Die Gesamt-IgE-Spiegel im Serum der BP-Patienten waren im Vergleich zur Kont-

rollgruppe signifikant erhöht (p<0,05). 15 der 18 ausgewerteten Patienten zeigten

IgE-, 16 IgG-Reaktivität gegen NC16A1-5. Zusätzlich konnten bei 8 der 18 BP-

Seren IgE-Bindungen gegen BP4575 nachgewiesen werden. In der vorliegenden

Arbeit wurde erstmals demonstriert, dass in BP-Seren neben IgG- auch IgE-

Autoantikörper gegen die BP180-ICD existieren. Die Hauptantigendeterminante

liegt dabei auf dem zentralen Abschnitt der ICD (hier ICD-B (AS103-266) 12/18).

Es zeigte sich eine Korrelation der IgE- und IgG-Autoreaktivitäten gegen die Epi-

tope der BP180-ICD Abschnitt B und D. Ebenfalls konnte erstmalig gezeigt wer-

den, dass IgE-Autoantikörper gegen LAD-1 (7 von 20 positiv) gerichtet sind. Die

Kontrollseren zeigten keine IgE-Reaktivität gegen die untersuchten BP180-

Proteine auf. Die Resultate unterstützen die These, dass NC16A nicht das einzige

Epitop für IgE-Autoantikörper beim bullösen Pemphigoid ist. Vielmehr existieren

ZUSAMMENFASSUNG 80

zusätzliche Epitope für IgE-Antikörper auf der ICD und ECD von BP180. Die Hete-

rogenität der Autoimmunantwort gegen BP180, lässt auf ein Epitop-spreading

während des Krankheitsverlaufs schließen. IgE-Autoantikörper spielen vermutlich

eine entscheidende Rolle in der Pathogenese des BPs, indem sie über den Fc-

Rezeptor-I die Aktivität von Leukozyten und Mastzellen beeinflussen.

LITERATURVERZEICHNIS 81

7. Literaturverzeichnis

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ANHANG 91

8. Anhang

8.1. Abbildung I Aufbau des pGEX-6P-1 Vektors (website GE Healthcare-formerly Amersham Biosciences)

8.2. Tabelle l

Die Primer Sequenzen für die PCR zur Herstellung von cDNA-Fragmenten des humanen Typ XVII Kollagen/BP180.

Fragment Bp Primer Sequenz

hCOL17A 400 F:ATCGGATCCATAGAAGGAAGAATGGATGTAACCAAGAAAAAC

R:GATCGTCGACTCAGTCCTCTGGTTGAAGAAGATG

hCOL17B 489 F:ATCGGATCCATAGAAGGAAGAGTTACCCGCCATGCGTATGAA

R:GATCGTCGACTCAGCAGGACGCCATGTTGTTT

hCOL17C 492 F:GATCGGATCCATAGAAGGAAGACACAACAACATGACAACCCA

R:GATCGTCGACTCAAGCATTGTAGGCAGCTTGCTT

hCOL17D 369 F:ATCGGATCCATAGAAGGAAGAGGGAAGGTCTTTACAGCCTCC

R:GATCGTCGACTCACTCCGCCAGAGCAATGAG

Bp= Basenpaare, F= forward primer, R= reverse primer

ANHANG 92

8.3. Tabelle II Status der Kontrollpersonen (Geschlecht, Alter). m = männlich, w = weiblich NHS: normales humanes Serum, PV: Pemphigus vulgaris; K: Kontrolle.

Patientennr. Geschlecht Alter (J.)

NHS-1 w 70

NHS-2 m 28

NHS-3 w 80

NHS-4 m 72

NHS-5 w 77

NHS-6 w 93

NHS-7 w 85

NHS-8 w 79

NHS-9 w 43

PV-1 K w 45

Durchschnitt 7w>2m 72

8.4. Tabelle III Immunoblot-Ergebnisse der Kontrollpersonen, + Reaktion; ++ starke Reaktion; +++ stärkste Reaktion. - keine Reaktion. NHS: normales humanes Serum, PV: Pemphigus vulgaris; K: Kontrolle.

Patient ICD-A ICD-B ICD-C ICD-D GST NC16A

IgG IgE IgG IgE IgG IgE IgG IgE IgG IgE IgG IgE

NHS-1 - - - - - - - - - - - -

NHS-2 - - - - - - - - - - - -

NHS-3 - - - - - - - - - - - -

NHS-4 - - + - - - - - - - - -

NHS-5 - - - - - - - - - - - -

NHS-6 - - - - - - - - - - - -

NHS-7 - - - - - - - - - - - -

NHS-8 - - - - - - - - - - - -

NHS-9 - - - - - - - - - - - -

PV-1 K - - - - - - - - - - - -

.

DANKSAGUNG 93

Erklärung

Die vorliegende Arbeit wurde in der Klinik für Dermatologie und Venerologie der

Universität zu Lübeck unter Aufsicht von Herrn PD Dr. Bernhard F. Gibbs durchge-

führt.

Das Forschungsvorhaben wurde von der Ethikkommission der Universität zu

Lübeck mit dem Schreiben vom 10.09.2004 genehmigt (Aktenzeichen: 04-087).

Ich versichere ausdrücklich, dass ich die vorgelegte Dissertation selbstständig,

ohne fremde Hilfe und nur mit den Quellen und Hilfsmitteln angefertigt habe, wie in

der Arbeit angegeben. Die aus der verwendeten Literatur wörtlich oder inhaltlich

entnommenen Textstellen und alle Angaben, die auf mündlichen Auskünften be-

ruhen, sind als solche kenntlich gemacht. Ich versichere außerdem, diese Disser-

tation bisher nicht einem Fachvertreter an einer anderen Hochschule zur Überprü-

fung vorgelegt zu haben und mich nicht anderweitig um Zulassung zur Promotion

beworben zu haben.

Lübeck, im Oktober 2007 Sina Katinka Dresow

DANKSAGUNG 94

Danksagung

Ich danke Herrn Direktor Prof. Dr. med. D. Zillikens für die Möglichkeit meine

Arbeit an der Klinik für Dermatologie und Venerologie durchführen zu dürfen sowie

für die Bereitstellung des dermatologischen Forschungslabors und für die Förde-

rung der Teilnahme am ESDR-Kongress, Paris, September 2006.

Mein großer Dank gilt Herrn PD. Dr. B. F. Gibbs (jetzt Universität Kent, England)

für die freundliche Überlassung des Themas, für die wissenschaftliche Leitung der

vorliegenden Arbeit, für seine stetige Hilfs- und Diskussionsbereitschaft, sowie für

die Übernahme der Begutachtung.

Herzlich bedanke ich mich bei Dr. Cassian Sitaru für die hilfreichen Ratschläge

während der praktischen Arbeit im Labor.

Ganz besonders möchte ich mich auch bei Dr. Andreas Recke für seine unermüd-

liche Unterstützung und aufmunternden Worte bedanken.

Ein herzliches Dankeschön an alle weiteren Mitarbeiter der Abteilung dermatolo-

gische Forschung, besonders an Bianca Hinz, Marina Kongsbak-Reim, Mircea

Chiriak, Josep Herrero, Ute Hoppe, Sidonia Mihai und Florina Olaru. Sie waren

stets bereit mir mit Rat und Tat zur Seite zu stehen. Die Arbeit in der Abteilung hat

mir viel Freude gemacht und ich habe mich dort sehr wohlgefühlt. Frau Schröder

danke ich für ihr immer offenes Ohr und ihre Hilfsbereitschaft.

Dem Labor des Instituts für Immunologie der Universität zu Lübeck danke ich für

die Durchführung der Gesamt-IgE-Bestimmung im Patienten- und Kontrollserum.

Von ganzem Herzen danke ich meinen Eltern, die mich stets unterstützt und moti-

viert haben. Sie haben mir dieses Studium und diese Arbeit ermöglicht und ich

konnte mich auf ihre Hilfe stets verlassen.

LEBENSLAUF 95

Lebenslauf Persönliche Angaben Name: Sina Katinka Dresow Geburtsdatum: 23.06.1980 Geburtsort: Braunschweig

Schulische Ausbildung 1987-1991: Grundschule in Nusse 1991-1998: Lauenburgische Gelehrtenschule in Ratzeburg 1998-2000: Heilwig-Gymnasium in Hamburg 2000: Reifeprüfung

Universitäre Ausbildung 10/2000-10/2002: Studium der Humanmedizin an der Phillips-Universität

zu Marburg 08/2002: Ärztliche Vorprüfung 10/2002-03/2007: Studium der Humanmedizin an der medizinischen Uni-

versität zu Lübeck 08/2003: Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung 09/2005: Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung 04/2007: Dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung - Approbation

Klinische Ausbildung Praktisches Jahr: Chirurgie 03/2006-07/2006: Kantonsspital Aarberg/Schweiz, Chefarzt Dr. Ch. de Montmollin Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgie 08/2006-10/2006 Kantonsspital Luzern/Schweiz , Chefarzt Dr. Dr. J. Kuttenberger 10/2006-11/2006 Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, Chefarzt Prof. Dr. Dr. P. Sieg Innere Medizin 11/2006-01/2007 Pneumologie und Infektiologie, UK-SH, Campus Lübeck, Leitung Prof. Dr. K. Dalhoff 01/2007-02/2007 Internistische Intensivstation 11a, UK-SH, Campus Lübeck, Leitung Prof. Dr. C. Dodt

LEBENSLAUF 96

Dissertation 10/2004-03/2006 Bearbeitung des experimentellen Themas „IgE-

Antikörper bei blasenbildenden Autoimmundermatosen: Epitop-mapping beim bullösen Pemphigoid“ in der Klinik für Dermatologie und Venerologie der Universität zu Lübeck, Prof. Dr. D. Zillikens. Arbeitsgruppe PD Dr. B. Gibbs.

Publikation/Abstract: Dresow S, Sitaru C, Oostingh GJ, Zillikens D and Gibbs BF (2006) IgE Autoantibodies from Bullous Pemphigoid Patients Target Multiple Antigenic Regions of Typ XVll Collagen. J Invest Dermatol, 126, 22 (Kongress der Eu-ropean Society for Dermatological Research (ESDR), September 2006, Paris, Frankreich).

Mannhagen, im Oktober 2007