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Handbuch Angewandte Limnologie – 27. Erg.Lfg. 4/10 1

Methodische Grundlagen Probenahme und Analyse PhytoplanktonIII-4.3.1

III-4.3.1Probenahme und Analyse des Phytoplanktonsin Seen und Flüssen zur ökologischen Bewertunggemäß der EU-WRRLBRIGITTE NIXDORF, EBERHARD HOEHN, URSULA RIEDMÜLLER, UTE MISCHKE und ILKA SCHÖNFELDER

2 Handbuch Angewandte Limnologie – 27. Erg.Lfg. 4/10

Probenahme und Analyse Phytoplankton Methodische GrundlagenIII-4.3.1

Inhalt

III-4.3.1 Probenahme und Analyse des Phytoplanktons in Seen und Flüssenzur ökologischen Bewertung gemäß der EU-WRRL

Vorwort ................................................................................................................................................... 3

1 Anforderungen an Probenahme in Seen zur ökologischen Bewertung derPhytoplankton-Biozönosen im Rahmen der EU-WRRL ............................................................................ 3

1.1 Beprobung Phytoplankton in Seen ........................................................................................................... 31.1.1 Probenahme und Beprobungsfrequenz .................................................................................................... 31.1.2 Zeitraum der Beprobungen und Analysenumfang ................................................................................... 71.1.3 Entnahme und Konservierung der Phytoplanktonproben (Lugol-Proben) .............................................. 7

2 Probenahmevorschrift für Diatomeenproben ........................................................................................... 92.1 Probenahme von Diatomeen aus dem Pelagial .......................................................................................... 92.1.1 Variante 1: Anreicherung über Membranfiltration direkt nach der Probenahme ..................................... 92.1.2 Variante 2: Anreicherung und Konservierung mit Formalin ..................................................................... 92.2 Probenahme von Diatomeenresten im Profundalschlamm ....................................................................... 9

3 Taxonomische Analyse und Utermöhl-Methode (Mikroskopie) ............................................................ 103.1 Geräteanforderungen ............................................................................................................................. 103.2 Probenvorbereitung ............................................................................................................................... 113.3 Anforderung an die mikroskopische Auswertung von Phytoplanktonproben ....................................... 123.3.1 Erstellung einer Zählliste ........................................................................................................................ 123.3.2 Zählstrategie für die quantitative Auswertung ....................................................................................... 123.4 Bestimmung von Zellvolumina ............................................................................................................... 133.5 Berechnung der Taxonbiovolumina ....................................................................................................... 133.6 Präparate und Auswertung .................................................................................................................... 133.6.1 Probenaufbereitung und Präparation der profundalen Diatomeen ........................................................ 143.6.2 Aufbereitung der pelagischen Diatomeenproben .................................................................................... 143.6.3 Auszählung der Diatomeen .................................................................................................................... 153.7 Auswertung der Phytoplanktonzählungen und Biovoluminabestimmung .............................................. 16

4 Beprobung und mikroskopischen Auswertung des Phytoplanktons aus Fließgewässern zurökologischen Bewertung im Rahmen der EU-WRRL ............................................................................. 17

4.1 Einleitung ............................................................................................................................................... 174.2 Beprobungsvorschrift Phytoplankton in Fließgewässern ....................................................................... 174.2.1 Auswahl an Probestellen ........................................................................................................................ 174.2.2 Probenahme und Beprobungsfrequenz .................................................................................................. 184.2.3 Charakterisierung der Probenstellen ...................................................................................................... 194.2.4 Chemische und physikalische Kenndaten der Wasserproben ................................................................. 194.2.5 Entnahme und Konservierung der Phytoplanktonproben (-Lugolproben) ............................................ 194.3 Taxonomische Analyse und Utermöhl-Verfahren (Mikroskopie) für die Bewertung von Fließgewässern .... 19

5 Zusammenfassung und Ausblick ........................................................................................................... 20

6 Literatur ................................................................................................................................................. 216.1 Zitierte Literatur .................................................................................................................................... 216.2 Vorschriften und Normen ...................................................................................................................... 23



Vorwort

Die EU-Wasserrahmenrichtlinie (EU-WRRL 2000) beschäf-tigt Wasserforscher und Behörden in einer erfreulichenWeise: Erstmalig werden ökologische und Gewässertyp be-zogene Bewertungsverfahren im nationalen Rahmen entwi-ckelt und auf europäischer Ebene angepasst. Seit 1999 sinddie Autoren dieses Beitrages in Projekten zur Erstellung ei-nes Bewertungsverfahrens für das Phytoplankton in natür-lichen Seen und Flüssen eingebunden.Für Deutschland existiert bislang keine einheitliche Vorga-be bzw. Normung hinsichtlich der Probenahme, Untersu-chungsfrequenz, der quantitativen Erfassung und der taxo-nomischen Auflösung des Phytoplanktons. Eine guteGrundlage zur Vereinheitlichung solcher Vorgaben bildetdie Technische Information Nr. 7 von HOEHN et al. (1998):„Erfassung und Bewertung von Planktonorganismen“ derArbeitsgemeinschaft Trinkwassertalsperren e. V. (ATT) inDeutschland (ATT TI7).Die Verfahrensentwicklung zur Bewertung und Probenahmeund -aufbereitung in Seen begann mit einer umfassendenLiteraturstudie zu Klassifizierungsverfahren von Seen (KNOPF

et al. 2000) und Flüssen (NIXDORF et al. 2000) anhand desPhytoplanktons. Diese internationale Literaturrecherche er-gab, dass zwar gute Ansätze aus anderen Ökoregionen Euro-pas vorhanden sind, diese sich jedoch nicht einfach auf dienaturräumlichen Verhältnisse in Deutschland übertragenlassen oder nicht den vielfältigen Anforderungen der EU-WRRL genügen. Folglich beauftragte die Länderarbeitsge-meinschaft Wasser die Autoren, ein WRRL-konformesBewertungssystem zu entwickeln, das aus vorhandenenÜberwachungsdaten gewonnen werden sollte. Allerdingsmachte die Zusammenführung dieser heterogenen Daten-bestände deutlich (MISCHKE et al. 2004), wie dringend eineVereinheitlichung der Probenahmen und der mikroskopi-schen Erfassung erfolgen muss, da die einzelnen Bundeslän-der hierfür bisher sehr unterschiedliche Strategien prakti-zierten. Im Abschlussbericht NIXDORF et al. (2005, 2006)und MISCHKE & BEHRENDT (2007) wurden im Ergebnis dieersten Vorschläge für ein multimetrisches Bewertungssystemmittels Phytoplankton sowie zu seiner einheitlichen metho-dischen Erfassung beschrieben.

III-4.3.1Probenahme und Analyse des Phytoplanktonsin Seen und Flüssen zur ökologischen Bewertunggemäß der EU-WRRLBRIGITTE NIXDORF, EBERHARD HOEHN, URSULA RIEDMÜLLER, UTE MISCHKE UND ILKA SCHÖNFELDER

In diesem Beitrag werden Anforderungen an die Probenah-me, die Aufbereitung und Konservierung von Proben ausSeen und Flüssen (Kap. 2 und 4) und die mikroskopischeAuswertung von Phytoplanktonproben nach einheitlichenKriterien vorgestellt (Kap. 3).Das vorgeschlagene Probenahmeverfahren fließt zugleichauch in die Entwicklung einer Europäischen Norm ein (CEN2008a). Wir hoffen sehr, dass diese Zusammenfassung derProjektergebnisse als hilfreiche Anleitung zur Untersuchungund Bewertung unserer Gewässer anhand des Phytoplank-tons dienen wird und sind für weitere Anregungen dankbar.

1 Anforderungen an Probenahme in Seen zur ökolo-gischen Bewertung der Phytoplankton-Biozönosenim Rahmen der EU-WRRL

1.1 Beprobung Phytoplankton in Seen

1.1.1 Probenahme und Beprobungsfrequenz

Die Seen werden nach ihren topographischen und morpho-metrischen Eigenschaften entsprechend der Vorgabe derLAWA (1999) an einer oder mehreren Messstellen beprobt.In der Praxis wird als Probenahmestelle in den meisten Ge-wässern die tiefste Stelle bevorzugt.Die Probenahmefrequenz in Seen soll mindestens 6 x proJahr in der Vegetationsperiode April bis Oktober betragen.Die Monate März und November können in Ausnahmefäl-len in den Beprobungszeitraum einbezogen werden (s. MISCH-KE et al. 2008). Mindestens vier der Beprobungstermine müs-sen in der Zeit von Mai bis September liegen. Die Tiefenvertei-lung des Phytoplanktons ist in Seen sehr ungleich und ineinem hohen Maß von der Lichtdurchdringung (euphotischeZone) und von der Temperaturschichtung abhängig. Es wirdempfohlen, die Tiefenverteilung des Phytoplanktons anhandvorheriger Tiefenchlorophyllmessungen durch eine Fluores-zenzsonde (Angaben unter http://www.tu-cottbus.de/fakultaet4/de/gewaesserschutz/infos/workshop.htmL) zu ermitteln.Die Epilimniontiefe (Zepi) geschichteter Seen wird definiertals die erwärmte obere durchmischte Wassersäule mit relativhomogener Temperaturverteilung während der Sommersta-



gnation. Sie wird nach unten durch das Metalimnion (thermi-sche Sprungschicht) begrenzt, dem Horizont mit der größtenTemperatur bedingten vertikalen Dichteänderung in einemStandgewässer (Temperaturgradient ≥ 1°/m). Die durchlich-tete Gewässerschicht, die euphotische Zone (Zeu) errechnetsich vereinfachend aus der 2,5-fachen Sichttiefe (Bereich von1,2–2,7-fach, REYNOLDS 1984). Sie ist in klaren Seen meistgrößer und in trüben Seen meist kleiner als die Epilimnion-schicht. Deshalb ist die Beprobung der euphotischen Zonein klaren Seen besser auf die vertikale Verteilung des Phyto-planktons angepasst als die Beprobung des Epilimnions. Beider Messung der Sichttiefe (SCHWOERBEL 1994) sind stören-de Lichtreflexionen an der Wasseroberfläche zu vermeiden(EN ISO 7027: 1999). Bei Standorten mit größerer Höheüber der Wasseroberfläche (z. B. hohe Schiffsbordwand) hilfthier ein Sichtrohr (Secchiskop) oder Sichtkasten.In Abhängigkeit vom Durchmischungs- und Durchlich-tungsregime wird jeweils eine Mischprobe aus den folgen-den Wasserschichten entnommen:a) in polymiktischen Seen (zmax i.d.R. ≤ 10 m, in der Sommer-phase liegt die Temperatur über Grund > 8 °C) aus der ge-samten Wassersäule bis etwa 1 m über Grund, in tieferenFlachseen jedoch maximal bis in 6 m Tiefe, in 0,5–1 m Ab-ständen. Dabei werden temporäre Einschichtungen bei wind-armem Sommerwetter nicht berücksichtigt.b) in mono- oder dimiktischen Seen (Zmax i.d.R. > 10 m)während der Vollzirkulation aus der durchmischten Schichtbis zur mittleren Tiefe des Sees, im norddeutschen Tieflandjedoch maximal nur bis in 10 m Tiefe. Für besonders tiefeSeen (z. B. Bayern, Baden-Württemberg) kann bei Vollzir-kulation eine gesonderte Strategie zur Probenahme festge-legt bzw. beibehalten werden (0–20 m Beprobung bzw. eu-photische Tiefe), bei Stagnation werden zwei Zustände fürdie Probenahme unterschieden (vgl. Abb. 1):b1) in trüben Seen (Zeu<Zepi) wird bei Stagnation eine epilim-nische Mischprobe entnommen.b2) in klaren (Zeu>Zepi) Seen wird entweder eine Probe ausder euphotischen Zone (A) oder alternativ aus der epilimni-schen Zone + metalimnisches Maximum (DCM = deep chlo-rophyll maximum) entnommen (B):A) nur eine Mischprobe aus der gesamten euphotischen ZoneoderB) eine Epilimnion-Mischprobe sowie eine Mischprobe ausder darunter liegenden restlichen euphotischen Zone, diedas Tiefenmaximum des Phytoplanktons (DCM) enthält.Gibt es im Tiefenprofil mehrere, gestaffelte Temperatur-sprünge, ist stets der tiefste und am meisten ausgeprägte alsuntere Grenze des Epilimnions maßgeblich (nicht gemeintist hiermit jedoch ggf. die Grenze zum Monimolimnion inmeromiktischen Seen). Die Abgrenzung des Epilimnions wirdanhand des Wendepunktes des Temperaturkurvenverlaufesund nicht wie häufig definiert (z. B. DOKULIL et al. 2001)nach 1 °C/m Temperaturgradient vorgenommen.Erläuterung: In klaren Seen kann das Phytoplankton unter-halb der Sprungschicht ein Maximum ausbilden, das mit ei-ner epilimnischen Mischprobe nicht erfasst würde. Die Tiefen-verteilung des Phytoplanktons kann anhand vorheriger Chlo-rophyllmessungen durch eine Fluoreszenzsonde ermittelt

werden. In besonderen Fällen kann sich ein Tiefenchlorophylla-Maximum (DCM) auch noch in größeren Tiefen als der2,5-fachen Sichttiefe entwickeln, d. h. die euphotische Zoneerstreckt sich bis in größere Tiefen. Vertikal wandernde Arten(z. B. Planktothrix rubescens) können sich in Tiefen mit extre-mem Schwachlicht einschichten. Diese DCM können z. B. miteiner Chlorophyll-Sonde erkannt werden, werden aber in derRoutinebeprobung nach EU-WRRL nicht berücksichtigt.Bei Schwefelwasserstoffbildung und Nährstofffreisetzungenim Hypolimnion ist wegen der Beeinflussungen (Anreicherun-gen) der chemischen Proben mit den freigesetzten Nährstof-fen die epilimnische Mischprobe vorzuziehen oder die chemi-sche Probenahme von der biologischen zu entkoppeln, d. h.chemische Probenahme aus dem Epilimnion; Phytoplank-tonprobe aus der euphotischen Zone.Es ist unbedingt zu beachten, dass die während der Stagna-tionsphasen auftretenden Sauerstoffmaxima unterhalb desEpilimnions mit erfasst werden. Andererseits darf die eupho-tische Probe nicht in das sauerstofffreie Hypolimnion hin-einreichen. In der Phytoplanktonprobe können dadurchArtefakte auftreten, wie z. B. eine zu hohe Dichte an organi-schen Partikeln oder Schwefelbakterien, die die mikrosko-pische Bearbeitung behindern. In solchen Proben kann derAnteil schlecht erhaltener Planktonalgen hoch sein, wobeiunklar ist, ob dies auf eine schlechte Fixierung zurückzu-führen ist oder ob es zu einer Anreicherung bereits abgestor-bener und in das obere Hypolimnion sedimentierter Plank-tonalgen in der Probe kommt. Die Fixierung solcher Probenkann möglicherweise auch durch einen hohen Gehalt anSchwefelwasserstoff (H2S) beeinträchtigt sein. Die euphoti-sche Zone sollte daher in Seen mit meta- oder hypolimnischenSauerstoffmaxima nicht tiefer als einen Meter über das O2-Maximum hinaus beprobt werden, wenn in dieser Tiefe dannbereits kein Sauerstoff mehr gemessen wird. In Seen ohne aus-geprägtes Sauerstoffmaximum sollte die tiefste Probeentnahmeauf jeden Fall 1 m über der sauerstofffreien Schicht enden.Zu Variante B: Eine getrennte mikroskopische Auszählungund chemische Analytik dieser beiden Proben wird empfoh-

Abb. 1: Zwei Varianten der Beprobungsbereiche in „klaren“(Zeu>Zepi) dimiktischen Seen während der Stagnations-phase



len, da damit eine Vermischung der Plankter aus dem Tiefen-chlorophyllmaximum (DCM) mit denen aus dem Epilimni-on verhindert wird. Gleichzeitig wird damit eine LAWA-Trophie-Index konforme Auswertung ermöglicht, da fürdiese das Epilimnion gefordert ist (LAWA 1999). Zur Re-duzierung des Arbeitsaufwandes für die mikroskopischeAnalyse ist eine Tiefen gewichtete Vermischung der beidenProben für das Bewertungsverfahren mittels Phytoplank-ton zulässig (entspricht dann Variante A).Die Probenahme erfolgt unter Verwendung herkömmlicherSchöpfertypen (Friedinger- oder Van-Dorn-Fallschöpfer,Limnos-Schöpfer). Ruttner-Schöpfer sind wegen Einström-behinderungen aufgrund der horizontalen Deckelstellungnicht für die Schöpfprobenahme geeignet. Volumengewich-tete Mischproben sind wegen der Berücksichtigung dermorphometrisch bedingten Volumenanteile innerhalb dereinzelnen Tiefenlamellen einer Mischprobe aus gleichen Tie-fenanteilen vorzuziehen, aber in der wasserwirtschaftlichenRoutine oft nicht zu realisieren. Deshalb wird folgende Ver-fahrensweise des Mischprobenansatzes vorgeschlagen: Poly-miktische Flachseen und Epilimnia mit geringerer Tiefe indimiktischen Seen mit Ausdehnungen bis in ca. 5 m, maxi-mal 6 m Wassertiefe werden in 0,5–1 m Schritten beprobt.Tiefe Seen können während der Vollzirkulation in Abhän-gigkeit von der Tiefe in 0,5–2 m-Intervallen beprobt wer-

den, wobei äquidistante Abstände eingehalten werden müs-sen. Bei nicht äquidistanten Proben-Abständen müssen dieAliquotvolumen entsprechend gewichtet werden, was immergewisse Fehler mit sich bringen kann.Die entnommenen Proben aus den einzelnen Tiefenstufen wer-den in einem Gefäß (Kanister, Eimer) gesammelt. Zuvor mussdie Gesamtmenge aller Proben, die als Mischproben über die-sen Tiefenbereich abgefüllt werden sollen, bekannt sein.Wir empfehlen eine Mindestentnahme von 2 L für Chloro-phyll, 1 LLebendprobe bzw. für Diatomeenpräparation,250 mL Phytoplankton mit Lugol’scher Lösung fixiert, 2 LNährstoffproben = 5,25 L Gesamtmenge. Dazu sollte eineReserve und Spülwasser in der gleichen Größenordnungeingerechnet werden, so dass mindestens 10 L Probewasserentnommen werden. Dieses Sammelgefäß soll möglichst imSchatten stehen oder abgedeckt werden. Durch vorsichti-ges, gleichmäßiges Umrühren (Empfehlung ca. 2 min) wirddie Mischprobe in dem Gefäß homogenisiert, um eine gleich-mäßige Verteilung der Algensuspension zu gewährleisten.Die biologischen (Phytoplankton, Chlorophyll-a) und che-mischen (Nährstoff-) Proben werden anschließend mit ei-nem Messbecher in die einzelnen Probegefäße gefüllt. Esempfiehlt sich, die Probemenge großzügig zu kalkulieren unddas „Restwasser“ für unvorhergesehene Störfälle in dasLabor zu transportieren.

Abb. 2:Probenahmeschema für tiefe, geschich-tete Seen



Als optimale Methode wird die Misch-Probenahme mit ei-nem integrierenden bzw. summierenden Schöpfer empfoh-len, weil damit die Mischprobe stufenlos genommen undsomit lückenlos und zeitsparend erzeugt wird. FolgendeIntegrationsschöpfer werden häufig verwendet:• Summenschöpfer System UWITEC: Der von Fa. UWITEC

(Mondsee, Österreich) entwickelte Summenschöpfer ar-beitet nach dem Kolbenhubprinzip. 5 L Probenmengewerden mit einem Kolben in den Schöpfer gesaugt. DerKolben wird über Zahnräder entsprechend der abgewi-ckelten Kettenlänge (= Absenktiefe) bewegt. Es sind 20 m(250 mL/m) oder 10 m (500 mL/m) als Arbeitstiefe mög-lich. Der Schöpfer kann auch hypolimnische Misch-proben bilden.

• Summenschöpfer System Schröder: Der Wasserschöpfer(nach SCHRÖDER 1969) dient der lückenlosen Entnahmevon vertikalen Sammelproben von der Oberfläche biszu Tiefen von maximal 21 m. Der Sammler besteht auseinem unten offenen und oben geschlossenen Zylinderaus organischem Glas. In diesem Zylinder befindet sichein Hohlkörper von hyperbolischer Trichterform, deram Zylinderdach befestigt ist. Beim langsamen Eintau-chen des Gerätes dringt Wasser in den Zylinder unddurch ein geöffnetes Ventil in den Trichter ein. Durch diehyperbolische Trichterform erfolgt das Eindringen pro-portional zur Tiefe. Die eingeschlossene Luft wird ebensoin Abhängigkeit von der Tiefe komprimiert. Beim ra-schen Heraufziehen schließt das vorbeiströmende Was-ser das Ventil. Das in den Trichter eingedrungene Was-ser bleibt zurück. Die im Trichter und Zylinder kompri-mierte Luft drückt das in den Zylinder eingedrungeneWasser heraus und strömt zum Teil selbst aus. Der Zylin-der wird wegen seines Auftriebes in ein Metallgestell ein-gebaut. Die zulässige Sinkgeschwindigkeit: ist < 1 m/s.Das Entnahmevolumen beträgt 40 mL/m. Der Schöpferwurde früher bei der Firma Züllig (Schweiz) hergestellt.

• Summenschöpfer System Hydrobios: Fa. Hydro-Bios hateinen sog. „intelligenten Wasserschöpfer“ entwickelt, der

als integrierender Wasserschöpfer einzusetzen ist. Dieserarbeitet mit dem Kolbenprinzip und hat 5 L Volumen,mit einer elektronischen Steuerung, welche die Einsatz-möglichkeiten wesentlich erweitert. Die Elektronik wur-de als Ableger aus den ozeanographischen Geräten vonHydro-Bios entwickelt und ist dort seit vielen Jahrendauerhaft im Einsatz. Es kann in einem Einsatz ein inte-grierendes Profil bis 100 m Wassertiefe gefahren wer-den, es können frei wählbare Anfangs- und Endtiefeneingestellt werden, aus denen dann jeweils das ganze Vo-lumen als Probe zur Verfügung steht. Der Schöpfer mussdabei langsam abgesenkt werden. Die gewünschte Pro-bentiefe wird vor dem Einsatz über ein wasserdichtesHandheld eingegeben und der Schöpfer ins Wasser ge-lassen. Die Elektronik steuert die Probenahme druckab-hängig, damit immer das gleiche Volumen über die Was-sersäule aufgenommen wird. Dadurch wird die Proben-ahme aus verschiedenen Tiefen sehr einfach und mussevtl. auch nicht zusammengemischt werden. Falls dauer-haft mehr oder weniger als 5 L Probenvolumen ge-wünscht sind, kann der Schöpfer auch mit anderem Vo-lumen hergestellt werden.

• Rohrschöpfer System Pauli: Von Pauli (Limnol. Inst. Univ.Konstanz) entwickelter Wasserschöpfer zur Gewinnungeiner Mischprobe der kompletten Wassersäule. Längenin 1 m oder 2 m. Man arbeitet sich in 1 m- bzw. 2 m-Stufen von oben nach unten durch die Wassersäule undsammelt die kompletten Schöpferinhalte auf dem Bootin einem größeren Sammelgefäß (20–40 L). Zwei Voll-gummibälle verschließen das Rohr, indem sie durch einZuggummi auf die Rohrenden gepresst werden. DieGummibälle werden herausgezogen und auf eine Spann-vorrichtung gehängt, die in der entsprechenden Tiefedurch ein Fallgewicht ausgelöst wird. Schöpferinhalt jenach Länge und Durchmesser des Rohres ca. 1,7–3,5 L.Es gibt keine kommerziellen Hersteller, Einzelanfertigun-gen werden auf Anfrage bei Julius Pietruske, Institut fürSeenforschung Langenargen, realisiert.

Abb. 3: Entnahme integrierter Wasserproben: a. Summenschöpfer UWITEC (Mondsee, Österreich, www.uwitec.at) Foto: R. Nieder-reiter; b. Summenschöpfer System Schröder, Foto: B. Rapp; c. Summenschöpfer Hydro-Bios (HYDRO-BIOS GmbH, Kiel-Holtenau, Deutschland, www.hydrobios.de), Foto: J. v. Borries & U. Fischer; d. Rohrschöpfer (nach Pauli), Foto: S. Schmidt-Halewicz



Probenahmen mit Stechrohren und Schläuchen mit Pumpensollten wegen der schlechten Vergleichbarkeit der Ergebnissemit anderen Methoden nicht durchgeführt werden.

1.1.2 Zeitraum der Beprobungen und Analysenumfang

Da das Phytoplankton hinsichtlich Artenzusammensetzungund Dichte kurzfristig stark schwanken kann und in vielenSeen die hinsichtlich Störungsfaktoren empfindlichste Le-bensgemeinschaft darstellt, sollte es nach Möglichkeit zumin-dest im ersten Bewirtschaftungszeitraum mehrere Jahre (mög-lichst 3–5 Jahre hintereinander) untersucht werden. Damitkann eine Einschätzung über die Schwankungsbreite diesesParameters vorgenommen und somit eine größere Sicherheithinsichtlich der Bewertung und zukünftiger Entwicklungs-trends erzielt werden.Zusammen mit dem Phytoplankton müssen chemische undphysikalische Parameter erfasst werden, um die Phytoplank-tonergebnisse auf der Basis von Kausalanalysen interpretie-ren zu können (s. Tab. 1).In der Regel sollten vor Ort Temperatur, Sauerstoffhaushalt(Konzentration und Sättigung), pH-Werte, Leitfähigkeitenund das Redoxpotenzial im Vertikalprofil gemessen wer-den. Es sollten stets anerkannte aktuelle DIN-/EN-/ISO-Normen Anwendung finden. Die Angabegenauigkeit (signi-fikante Stellenzahl) richtet sich nach den entsprechendenVorgaben in den entsprechenden Methodennormen. Wer-den Messmethoden verwendet, deren Bestimmungsgrenzenoberhalb der in der Tabelle angegebenen Werte liegen, dür-fen diese nur verwendet werden, solange die damit alle er-zielten Messergebnisse deutlich oberhalb deren jeweiligenspezifischen Bestimmungsgrenze liegen. Werden mit unemp-findlicheren Messmethoden Werte unterhalb deren Bestim-mungsgrenze gefunden, müssen empfindlichere Methoden ge-wählt werden. Insbesondere bei nährstoffarmen sowie ionen-armen Gewässern ist stets die empfindlichste Methode zuverwenden.Für H2S erfolgt die Vor-Ort-Analytik aus der Wasserprobe0,5 m über dem Seeboden. Dabei sollte ein Reagenziensatzzur Vor-Ort-Bestimmung mit einem Messbereich von 0,1–5,0 mg/L eingesetzt werden, z. B. ein Microquant Reagenzien-satz (Merck 1.14777.0001). Bei höheren Schwefelwasser-stoffkonzentrationen sind die Wasserproben vor der Be-stimmung mit destilliertem Wasser zu verdünnen (z. B. 1:2)und die Konzentration entsprechend zu berechnen. Bei An-oxie im Hypolimnion ist zumindest der qualitative Nach-weis der H2S-Konzentration erforderlich. Dies erfolgt durchdie Wahrnehmung eines Geruchs wie „faule Eier“. Der olfak-torische Sinn des Menschen (Nase) hat eine niedrigere Nach-weisgrenze für Schwefelwasserstoff als die meisten chemi-schen Analyseverfahren.Nährstoffe, hier vor allem die Konzentrationen der gelöstenanorganischen sowie die Gesamtkomponenten des Phos-phors, Stickstoffs und Siliziums sind aus den Unterprobender Mischungsansätze (epilimnische oder euphotische bzw.Mischprobe bis zur mittleren Tiefe des Sees) zu analysierenund entsprechend der standardisierten Methoden zu erfas-sen. Die chemischen Analysen können ggf. auch konventio-

nell als (genügend hoch aufgelöstes) Tiefenprofil erhobenwerden, sofern damit zugleich die Untergrenze des Epilim-nions bzw. der euphotischen Tiefe genau erfasst wird. DieBestimmung von Chlorophyll-a muss jedoch immer aus der-selben Mischprobe wie für das Phytoplankton erfolgen (Tab.1). Es sollte sichergestellt sein, dass die Proben möglichstnoch am selben Tag im chemischen Labor eingehen und dieAnalysen spätestens am Morgen des nächsten Tages begin-nen. Die Filtration (Chlorophyll, Nährstoffe) sollten noch ambesten am Tag der Probenahme durchgeführt werden.Bei eutrophen dimiktischen Gewässern ist für die trophi-sche Einschätzung der Seen die Kenntnis der hypolimnischenPhosphor-, Ammonium- und Schwefelwasserstoffkonzen-trationen von großer Bedeutung. In geschichteten Seen soll-ten deshalb zumindest möglichst am Ende der Stagnationvertikale Nährstoffprofile bestimmt werden, da die Intensi-tät der P-Freisetzung trophierelevante Stoffumsetzungenwiderspiegelt Als Alternative können auch Proben währendder Sommerstagnation bei jeder Probenahme 0,5–1 m Pro-ben über Grund genommen werden. Die „kleinste“ Lösungist die Entnahme einer über Grund-Probe am Ende der Som-merstagnation, um Angaben zur maximalen Konzentra-tionsanreicherung von Nährstoffen zu erhalten.

1.1.3 Entnahme und Konservierung derPhytoplanktonproben (Lugol-Proben)

Die Mischproben aus der Beprobung der einzelnen Tiefen-stufen bzw. aus dem Summenschöpfer werden sanft gemischt(Rühren). Dabei ist darauf zu achten, dass jedes Umfüllender Wasserprobe in Messbecher und jedes Umschütten denpH-Wert der Probe verändern kann. Dies kann zum Zer-platzen der unfixierten Zellen und zum Auseinanderfallender Kolonien von Flagellaten und anderen sensiblen Artenführen. Der Inhalt des Summenschöpfers muss vor derProbenabfüllung vollständig in ein Gefäß gegeben werden,damit mögliche Schichtungen der Probe im Schöpfer besei-tigt werden. Mit einem Messbecher wird eine Teilprobe ausder gut durchmischten Gesamtprobe entnommen und eineTeilmenge des Messbecherinhaltes zur Spülung verworfen.Die Phytoplanktonproben werden in Enghals-Klarglas-flaschen nur bis 1–2 cm unterhalb der Öffnung bzw. zu 80–90 % gefüllt, um die spätere Homogenisierung der Probe zuermöglichen. Ein Überfüllen der Flaschen führt dazu, dassdie Probe zur Teilprobenentnahme nicht homogen suspen-diert (aufgeschüttelt) werden kann.Die Entnahme und Abfüllung von Phytoplanktonprobenaus der Mischprobe erfolgt aus eu- bis hypertrophen Seenin 100 mL Klarglasflaschen, und bei oligo- bis eutrophenSeen in 250 mL Klarglasflaschen.In sehr klaren Gewässern mit einer Sichttiefe über 10 m müs-sen 500 mL der Mischprobe entnommen werden. Die Pro-be wird in der Glasflasche mit einer alkalischen Lugol’schenLösung mit Na-Acetat fixiert (mod. nach UTERMÖHL 1958).Generell gilt bei der Abfüllung der Phytoplanktonproben:Im Zweifelsfall eher größere Volumina fixieren!Herstellung von Lugol’scher Lösung: 10 g Kaliumjodid wer-den in 20 mL Wasser gelöst und dazu 5 g Jod (doppelt subli-



Tab. 1: Physikalisch-chemische und biologische Parameter bei der Probenahme des Phytoplanktons in Seen

Parameter Probestellen: tiefste Stelle im See Methode Bestimmungsgrenzen

Temperatur, O2 (Pflichtparameter)

Sondenmessung: in m-Stufen bis 20 m, unterhalb 20 m: 2–5 m-Stufen möglich Tiefen-Sonden 0-35°C; 0,0 mg/L

Sichttiefe (Pflichtparameter) Secchi-Scheibe mind. 15 cm, max 20 m

Lichtklima: Attenuation

In Flachseen in 0,5–1 m-Stufen In tiefen Seen in m-Stufen bis ca. 3* SD

Photonenflussdichte mit sphärischem Quantensensor

pH-Wert, Leitfähigkeit

Tiefensonden oder auch aus Schöpferproben möglich, im Epi- und Metalimnion in m-Stufen, unterhalb Metalimnion 2–5 m-Stufen möglich

Elektrometrie pH 3-12.; 5 µS/cm

Redoxpotential

Tiefensonden oder auch aus Schöpferproben möglich, im Epi- und Metalimnion und an der Grenze zur Anoxie in m-Stufen, unterhalb der chemischen Sprungsschicht 2–5 m-Stufen

Elektrometrie

o-PO4-P Photometrie 2 µg/L

Gesamt-P (Pflichtparameter) Photometrie 5 µg/L

NH4

+-N Photometrie 5 µg/L

NO2

--N Photometrie 2 µg/L

NO3

--N

epilimnische/euphotische Mischproben lt. Probenahme, Hypolimnion, über Grund

IC/Photometrie 0,02 mg/L

H2S Hypolimnion, über Grund

Qualitativer Nachweis (Geruchsprobe/Bleiacetat-papier), quantitativer Nachweis mit Schnelltest

0,1 mg/l

Gesamt-N (Kjeldahl-N)

epilimnische/euphotische Mischproben lt. Probenahme, Hypolimnion, über Grund

Aufschluss unter Rückfluss-kühlung NH4 Photometrie 0,05 mg/L

SiO2-Si epilimnische/euphotische Mischproben lt. Probenahme, Hypolimnion, über Grund ICP / AES 0,05 mg/L

Ca epilimnische/euphotische Mischproben lt. Probenahme, Hypolimnion, über Grund ICP / AES 0,5 mg/L

Mg epilimnische/euphotische Mischproben lt. Probenahme, Hypolimnion, über Grund ICP / AES 0,5 mg/L

Säurekapazität pH 4,3

epilimnische/euphotische Mischproben lt. Probenahme, Hypolimnion, über Grund Titrimetrie 0,05 mmol/L

Chlorophyll-a (Pflichtparameter)

epilimnische/euphotische Mischproben lt. Probenahme

Photometrie 0,1 µg/L

Phytoplankton (Pflichtparameter)

epilimnische/euphotische Mischproben lt. Probenahme

Utermöhl: ATT TI7 und Spezi-fikationen in dieser Arbeit -

Diatomeenanalyse (Pflichtparameter)

epilimnische/euphotische Mischproben lt. Probe-nahme, regelmäßig. Aus dem Profundalsediment, einmalig

diese Arbeit -



miert) hinzugefügt. Nach gänzlicher Lösung erfolgt die wei-tere Zugabe von 50 mL Wasser und 5 g Natriumazetat undAufbewahrung in 100 mL-Enghalsfläschchen aus Neu-tralglas mit einem eingeschliffenen, gut passenden Glasstop-fen oder Augentropfenpipettenfläschchen aus der Apothe-ke. Die im Chemikalienhandel vertriebene Lugol´sche Lö-sung z. B. von MERCK/VWR ist hierfür nicht geeignet, dadiese eine zu geringe Konzentration aufweist, wodurch dieProbe zu sehr verdünnt würde.Es werden auf 240 mL Probe zunächst 8–10 Tropfen (ca.0,5 mL) der konzentrierten Lugol’schen Lösung als Fixie-rungsmittel zugegeben und die verschlossene Flasche sanftzur Vermischung geschwenkt bis sich eine cognacfarbeneFixierung ergibt. Falls die Färbung dann noch zu hell ist,müssen ggf. noch einige Tropfen zugegeben werden. Einecognacfarbene Fixierung ist die Zielgröße und nicht einebestimmte Tropfenanzahl. Die mit Lugol fixierten Probendürfen beim Transport nicht in direkter Sonne stehen undsich nicht erwärmen.Hinweis zur Probenaufbewahrung: Die mit Lugol fixiertenPhytoplanktonproben sollen in den Enghals-Glasflaschen(4°C, frostfrei) und im Dunkeln nicht länger als sechs Mo-nate bis zur Auswertung aufbewahrt werden (s. EN 15204).Der nach EN 15204 vorgesehene Zusatz von Formaldehydfür längere Lagerzeiten kann aus Gründen des deutschenArbeitschutzes nicht empfohlen werden. Die Proben solltenmöglichst erschütterungsfrei gelagert werden. Die Flaschensollten wegen der Gefahr undichter Verschlüsse sowie Ver-ringerung der Diffusion von Jod durch den Kunststoffdeckelaufrecht lagern. Wegen der Jod-Diffusion durch die Wände,sowie dem damit verbundenen Verlust der Durchsichtigkeitder Flaschen dürfen keine Kunststoffflaschen verwendetwerden.Flaschen aus Klarglas sollten genommen werden, um beiLagerung die Färbung bzw. Entfärbung der Probe kontrollie-ren zu können. Bei Entfärbung müssen die Proben nachfi-xiert werden. Vorsicht, nicht zu stark nachfixieren (cognac-farben).Für eine optimale taxonomische Bestimmung kann es nütz-lich sein, eine Lebendprobe (mind. 500 mL, kühl und dun-kel halten!) zur späteren Anreicherung in Utermöhlkammernzu entnehmen, wenn diese spätestens am Tag nach der Pro-benahme vom mikroskopischen Bearbeiter analysiert wer-den kann. Die Entnahme einer Netzprobe (20–30 µm) alsLebendprobe wird ebenfalls empfohlen, wenn diese spätes-tens am Tag nach der Probenahme mikroskopisch ausgewer-tet werden kann. Lugol-fixierte Netzproben (10 µm) solltenfür das Erkennen von Entwicklungsstadien entnommen wer-den, da hierdurch seltenere Formen angereichert werden.

2 Probenahmevorschrift für Diatomeenproben

2.1 Probenahme von Diatomeen aus dem Pelagial

2.1.1 Variante 1: Anreicherung über Membranfiltrationdirekt nach der Probenahme

Für die Analyse der pelagischen Diatomeen wird eine Filtra-tion vor Ort bzw. anschließend im Labor vorgenommen.

Dazu werden bei Sichttiefen unter 2 m 500 mL und bei Sicht-tiefen über 2 m 1000 mL aus der integrierten Probe filtriert.Sollte der Filter schon bei geringeren Probenvolumina ver-stopfen, so ist dieses geringere Volumen ausreichend, sofernsich bereits ein deutlicher brauner oder grün-brauner Belagauf dem Filter gebildet hat. Sind dies aber weniger als400 mL, sollte die Probe auf zwei oder mehr Filter verteiltwerden. Das filtrierte Volumen ist zu protokollieren. Für dieFiltrationen können Membranfilter, Celluloseacetatfilter oderCellulosenitratfilter verwendet werden. Die Filter sollten ei-nen Porendurchmesser ≤ 2 µm haben. Die Filter werden inbeschrifteten Petrischalen trocken gelagert (nicht im Kühl-schrank). Bei der späteren Präparation werden diese Filterim Becherglas zuerst mit H2O2 behandelt, wobei sich dabeidie Algenbeläge vom Filter ablösen. Anschließend erfolgtder Aufschluss mit KMnO4 und HCl (vgl. Kap. 3.5.2)

2.1.2 Variante 2: Anreicherung und Konservierungmit Formalin

Alternativ werden bei Sichttiefen unter 2 m 500 mL, bei Sicht-tiefen über 2 m 1000 mL Probe ins Labor gebracht unddort in Klarglasflaschen zur Sedimentation mindestens 32 h(maximal 48 h) kühl, dunkel und erschütterungsfrei (auf-recht) aufbewahrt. Danach ist die Flasche nur noch vorsich-tig zu bewegen, um das Sediment nicht mehr aufzuwirbeln.Anschließend wird der Überstand vorsichtig abgesaugt (dazueine Pasteurpipette über einen Silikonschlauch anschließen).Das Pipettenende ist dabei immer kurz unter den Flüssig-keitsspiegel zu halten und mit dessen Absinken mitzufüh-ren. Das nach diesem Vorsedimentationsprinzip (s. ATT TI7)auf 50 100 mL eingeengte Probenkonzentrat wird anschlie-ßend mit Formalin (5 % Endkonzentration) fixiert. Diesefixierten Proben können dann bis zur Präparation der Dia-tomeen ca. 1 Jahr gelagert werden.Wenn eine Lebendprobe genommen wurde, kann von die-sem Material sofort anschließend unfixiert der Aufschluss(s. Kap. 3.5.2) durchgeführt werden, wodurch der Einsatzvon Formalin entfällt (Arbeitsschutz).

2.2 Probenahme von Diatomeenresten imProfundalschlamm

Die Schalen der im Freiwasser, am Gewässergrund und aufMakrophyten wachsenden Diatomeen bilden wesentlicheBestandteile der sich am Seegrund bildenden Sedimente. DieMudde an der tiefsten Stelle eines Sees enthält eine zumeistgut zeitlich geordnete Abfolge der Diatomeenflora des Sees.Eine Probe aus dem obersten Zentimeter des Profundal-schlamms von der tiefsten Stelle eines dimiktischen Sees ent-hält durchschnittlich ca. 80 % planktischer und ca. 20 %benthischer Formen. In polymiktischen Seen kann der An-teil benthischer Formen überwiegen.Aus der Zusammensetzung der Diatomeenreste von Profun-dalproben lassen sich Rückschlüsse auf die mittleren Nähr-stoffkonzentrationen im Pelagial und im Benthal des Seesund damit auf die Trophie des Untersuchungsgewässers zie-



hen. Für die Untersuchung der Diatomeen im Profundal-schlamm genügen ca. 10 mL halbflüssigen Materials (sog.Präsediments) von der Sedimentoberfläche. Der obersteZentimeter integriert in etwa die Diatomeen der letzten 3(2–6) Jahre. Insofern sollten Probenahmen aus allen Jah-reszeiten zu gleichen Ergebnissen führen und der Zeitpunktder Probenahme während der Saison kann beliebig gewähltwerden. Es wird trotzdem empfohlen, die Probenahme imSpätherbst nach der letzten Phytoplanktonbeprobung durch-zuführen, um eine bessere Vergleichbarkeit zu den pelagi-schen Diatomeen des jeweiligen Untersuchungsjahres zu er-zielen.Die Probenahme erfolgt von einem Boot aus, das über dertiefsten Stelle des Sees verankert wird. Sehr gut geeignet zurEntnahme von Profundalproben sind Röhrensammler. Diesebestehen aus einem möglichst durchsichtigen Kunststoff-rohr (Polyethylenterephtalat („Makrolon“), PVC oder Ple-xiglas), das auf mindestens 20–30 cm Länge senkrecht insSediment eingedrückt wird. Der Durchmesser des Rohrssollte mindestens 4 cm betragen, damit ein möglichst großerZentralbereich des Sedimentkerns ungestört bleibt und nichtdurch Wandreibung beeinflusst wird. Entscheidend ist, dassdas Kunststoffrohr vor dem Herausziehen aus dem Sedi-ment verschlossen wird. Bei Sedimentstechern mit langenRohren und lediglich oberseitigem Verschluss, wie sie inFlachseen zum Einsatz kommen können, ist es hilfreich, dasRohr bis in die stärker verfestigte Mudde zu drücken. Diesebildet einen relativ festen Pfropfen am Boden des Rohrs undverhindert in Verbindung mit dem hydraulischen Dicht-schluss der Oberkante das Herausrutschen des Sediment-kurzkerns. Die Eintauchtiefe des Rohrs in das Sediment solltejedoch nur soweit reichen, dass ein Wasserüberstand vonmindestens 3 cm über dem frischen Präsediment immer imRohr verbleibt. Bei beschwerten Fallrohren (z. B. UWITEC-Corer der Fa. Niederreiter, Mondsee oder Piston-Corer),wie sie gewöhnlich in tiefen Seen zum Einsatz kommen, istzusätzlich ein unterer Verschlussmechanismus wichtig, da-mit der Sedimentkurzkern ungestört ins Boot gebracht wer-den kann. Eckman-Birge-Greifer sind für diese Beprobunggrundsätzlich nicht geeignet.Entnommen wird eine Menge von ca. 10 mL frischen halb-flüssigen Grundschlamms vom Zentrum der obersten Zen-timeterlamelle des Bohrkerns, wozu am besten ein Sediment-kernteiler von UWITEC verwendet wird, der das feine Ab-trennen der obersten Lage (1 cm) ermöglicht. Notfalls kannein Esslöffel aus Edelstahl zur Probenentnahme verwen-det werden. Die Sedimentoberfläche darf im Corer nichtdirekt an der Oberkante des Rohrs anstehen. Zur Proben-entnahme muss dann die Oberkante des Sedimentkernsmit einem entsprechenden Stempel mit größter Vorsichtlangsam von unten bis zur Rohroberkante empor gedrücktwerden.Nur die ca. 10 mL der halbflüssigen Probe werden ohnezusätzliches Wasser in einen in jedem Drogeriefachgeschäfterhältlichen Polyethylen-Gefrierbeutel mit einem Fassungs-vermögen von ca. 1 Liter gefüllt. Dieser wird nach dem Ein-füllen der Probe fest zugeknotet, wobei möglichst wenig Lufteingeschlossen bleiben sollte. Der verknotete Beutel wird ineinen zweiten gleich großen Gefrierbeutel gegeben. Bevor

dieser ebenfalls verknotet wird, wird ein ca. 5 x 8 cm großesEtikett aus stabilem weißem Laserdruckerpapier mit Blei-stift (Härtegrad B) beschriftet und zwischen die beiden Beutel-wände so platziert, dass es von außen möglichst lesbar ist.Auf dem Etikett notiert werden sollten der Name des Seesmit dem nächstgelegenen größeren Ort, die Probenahme-tiefe, das Probenahmedatum und möglichst auch der Namedes Sammlers, in der Form des nachstehenden Beispiels:

Die Proben sollten kühl (< 10 °C) und stoßfrei in einemstabilen, innen glatten oder gepolsterten Gefäß transpor-tiert werden. So können weit über 20 Beutel mit Probenzusammen in einem Behälter transportiert werden, die sichgegenseitig stabilisieren und schützen.Die doppelt eingetüteten, verknoteten Proben werden samteingeschlossenem Etikett im Gefrierschrank aufbewahrt undsind darin praktisch unbegrenzt haltbar. Vor der Aufberei-tung sollten sie möglichst nicht aufgetaut werden. Am zweck-mäßigsten ist es, nach Entfernung der Gefrierbeutelhülle dengefrorenen Schlammwürfel direkt in das für die Probenauf-bereitung vorgesehene Becherglas zu geben, in dem späterder saure Aufschluss erfolgen soll.

3 Taxonomische Analyse und Utermöhl-Methode(Mikroskopie)

Für das Bewertungsverfahren wird eine quantitative Bestim-mung des Phytoplanktons in Sedimentationskammern mitDiametralzählung (auch Transekt- oder Streifenzählung ge-nannt) nach der Utermöhl-Methode (UTERMÖHL 1958) aneinem inversen Mikroskop gefordert (s. EN 15204).

3.1 Geräteanforderungen

Die mikroskopische Ausrüstung sollte mindestens folgen-den Umfang haben:• Umkehrmikroskop (s. EN 15204) mit Objektträgertisch

zur Aufnahme von Sedimentationszählkammern mit ei-nem Durchmesser von 25–27 mm

• Fototubus mit Ausgang für Foto- bzw. Video- oder Digi-talkamera

• 10- bis 12,5-fach Okulare mit einem Zählfeld oder ei-nem verstellbaren Zählstreifen sowie mit einer feinenMessskala mit 200 Einheiten (Messokular)

• Objektive: 10-fach Phaco NA 0,25; 20- oder 25-fachPhaco, NA 0,45; 40-fach Phaco, NA 0,65 und/oder In-terferenz (DIC); 100-fach Phaco. NA 1,25.

• Kondensor mit NA mindestens 0,5 und 7 mm Arbeits-



abstand (größer als die Bauhöhe der Zählkammer) fürPhaco-Objektive (auch für Objektiv 100 x)

• Runde Utermöhl-Sedimentationszählkammern mit aus-tauschbarem Glasboden mit einer Dicke 0,16 bis 0,2 mm(z. B. Hydrobios, Verbundkammern (ehem. Zeiss-Ober-kochen + Jena, heute Thalheim Spezial Optik) oder ver-gleichbare Fabrikate mit einem Durchmesser 25–27 mm).Kleinere Kammerdurchmesser als 25 mm sind nicht zu-lässig, da dadurch das maximal mögliche Sedimentier-volumen der Röhren begrenzt wird und das Verhältnisvon der Kammerfläche zur ausgezählten Diametralstrei-fenfläche ungünstiger wird. Falls das Kammervolumenwerksmäßig nicht angegeben ist, müssen der Kammer-durchmesser und die Kammerhöhe (mit eingebautemBodenglas!) auf 0,01 mm mit einer genauen Präzisions-schieblehre ermittelt werden. Die Kombination verschie-dener Fabrikate darf nur erfolgen, wenn Kammer- undRöhrendurchmesser genau gleich sind. Das sich damitergebende Sedimentationsvolumen muss dann neu be-rechnet werden. Für kombinierte Röhrenkammern z. B.von Hydrobios gilt das auf den Röhren angegebene Volu-men nur in Verbindung mit der entsprechenden Hydro-bios-Plattenkammer.

• Gläser zur Abdeckung der Kammer (42 mm x 42 mmund 1,2 mm dick) und runde Deckscheiben (Durchmes-ser 33 mm, 3 mm dick) zur Abdeckung der Sedimenta-tionsröhren

• Runde Kammer- bzw. Röhrenaufsätze mit kalibriertenVolumen von 10 mL, 25 mL und 50 mL (Kombinations-volumen s.o.)

3.2 Probenvorbereitung

Die Probenvorbereitung dient der erforderlichen Anreiche-rung der fixierten Originalprobe in einer Zählkammer, umeine ausreichende Anzahl von Zellen auf der festgelegtenZählfläche der Kammer bei optischer Vergrößerung am Um-kehrmikroskop zu erhalten. Die runden Kammeraufsätzewerden nach dem Sedimentationsvorgang (4 Stunden procm Röhrenhöhe, s. auch Tab. 2) von der darunter liegendenZählkammer abgeschoben.100 mL-Röhren sind wegen der unvollständigen Sedimen-tation ungeeignet und dürfen allenfalls für Großalgen ver-wendet werden (HOEHN et al. 1998).Da die Zellkonzentration in Abhängigkeit von der Taxazu-sammensetzung, dem Gewässertyp und der Saison sehr starkschwanken kann, sind Orientierungswerte zur Auswahl des

benötigten Absetzvolumens hilfreich. Die Chlorophyll-a-Kon-zentration der Probe ist als Biomasseindikator des Phyto-planktons dazu am besten geeignet, und muss deshalb dembiologischen Bearbeiter vor der mikroskopischen Analyseübergeben werden. Die ATT TI7 (HOEHN et al. 1998) bietetdazu folgenden Vorschlag zur Orientierung (Tab. 3).

Tab. 2: Absetzzeit der Lugol-fixierten Proben

Kammervolumen Höhe der Kammer Absetzzeit

mL cm Std.

2 1 4

10 2 8

25 4,5 18

50 9,5 38

Tab. 3: Wahl der Kammeraufsatzvolumina in Abhängigkeit vonder Chlorophyll-a-Konzentration

Chlorophyll a-Konzentration Kammeraufsatzvolumen

0–0,5 µg/l 2 x 50 mL-Kammeraufsatz

0,5–2 µg/l 50 mL-Kammeraufsatz

2–5 µg/l 25 mL-Kammeraufsatz

5–10 µg/l 10 mL-Kammeraufsatz

> 10 µg/l Probe verdünnen

Setzt man bei hohen Algendichten nur das Zählkammervo-lumen unverdünnt ohne Röhrenaufsatz an, muss die Gleich-verteilung der Partikel geprüft werden, da diese durch Zu-sammenballung von Organismenfäden erheblich gestört seinkann. Deshalb ist für Proben, in denen fädige Algenarten(z. B. Oscillatoriales; Aulacoseira) häufig sind, eine Verdün-nung der Probe erforderlich. Es hat sich für eine bessereGleichverteilung bewährt, die Probe vorab in einem Messzy-linder mit Gummistopfen definiert zu verdünnen (z. B. 1 TeilProbe auf 19 Teile entgastes Wasser, zur Entgasung dasWasser abkochen oder mit Ultraschall behandeln, Leitungs-wasser verwendbar – jedoch nicht destilliertes Wasser, dadie Zellen sonst wegen des osmotischen Druckes zerplat-zen). Die verdünnte, vorsichtig durch Umschwenken homo-genisierte Probe wird danach wieder in einem 10 mL-Röhren-raufsatz zur Sedimentation angesetzt.Cyanobakterien, z. B. Planktothrix, können zur Flotation(Auftreiben) neigen, wodurch bei der Utermöhl-ZählungMinderbefunde entstehen. Durch eine kurze Ultraschallbe-handlung (ca. 20 sec) werden die Gasvakuolen der Zellenaufgebrochen ohne dass bereits andere Zellen zerstört wer-den, wodurch ein hoher Anteil aller Fäden sedimentiert. Oftreicht aber auch aus, diese Lugol-fixierten Proben vor derBearbeitung längere Zeit zu lagern (4 Wochen), da mit derJod-Einlagerung die Organismen schwerer werden.Eine Aufkonzentrierung der Probe durch Zentrifugation istfür die quantitative Bestimmung nicht zu empfehlen, da eszu Verlusten durch Wandeffekte und zum Zerplatzen fragi-ler Algenzellen führt. Hierfür eignet sich besser das Verfah-ren der Vorsedimentation (ATT TI7).Die Hinweise zur Probenvorbereitung, insbesondere desFüllens der Kammern (Temperaturangleichung aller verwen-deten Materialen und Proben etc.) und der Überprüfungder Partikelgleichverteilung in den abgesetzten Kammern ausdem EN 15204 sowie ATT TI7 müssen beachtet werden.



3.3 Anforderung an die mikroskopische Auswertungvon Phytoplanktonproben

3.3.1 Erstellung einer Zählliste

Vorab wird eine erweiterbare Taxaliste erstellt, in der diemöglichen vorkommenden bzw. dominanten Arten bereitsenthalten sind. Auch sollten darin die Bezeichnungen undID-Nummern der harmonisierten Taxaliste zum Phytoplank-ton Deutschlands integriert sein. Zu verwendende Bestim-mungsliteratur findet sich in MAUCH et al. (2003).Die taxonomische Differenzierung soll nach dem in der Taxa-liste enthaltenen Mindestbestimmbarkeitsniveau erfolgen(MISCHKE& KUSBER 2006), wobei darin noch unterschiedli-che Bestimmungstiefen innerhalb einer Gattung angebotenwerden. Um den Bestimmungsaufwand zu begrenzen, wirddas höchste Bestimmungsniveau, i.d.R. die Artbestimmung,mindestens für alle biomassedominanten Taxa (Definitions.w.u.) gefordert, da diese bei der Bewertungsberechnungdurch ihren hohen Dominanzwert ausschlaggebend sind.Für die subdominanten Taxa kann auch das Gattungsniveauverwendet werden, sofern in dieser Gattung keine einzelne Artals Indikatortaxon für das Bewertungsverfahren ausgewie-sen wurde (s. diesbezügliche Spalten in der harmonisiertenTaxaliste). Diese Gattungen sind durch die Spalte „Ungeeig-netes Bestimmungsniveau“ ausdrücklich als unzulässig ge-kennzeichnet. Die Zählliste sollte zusätzlich Größenklassenfür solche Taxa enthalten, deren Zelldimensionen stark va-riieren können (z. B. Peridinium cinctum; s. Ausweisung inder Taxaliste), um die Berechnung des Biovolumens zu er-leichtern. Für das Bewertungsverfahren werden Taxa heran-gezogen, die unter definierten Bedingungen der UTERMÖHL-Methode (Mindestzählfläche und -objektzahl) quantitativerfasst d. h. ausgezählt wurden. Insofern ergibt sich keinevollständige Bestandsaufnahme aller Taxa, da immer nurein bestimmter Flächenbereich einer Zählkammer durch-mustert wird (PADISAK et al. 1999).

Hinweise für die Bestimmungsliteratur:Mit der harmonisierten Taxaliste des Phytoplanktons (HTL;MISCHKE & KUSBER 2009) wird jedem Taxon ein aktuellesund akzeptiertes Bestimmungswerk zugeordnet, mit dem esbestimmt werden sollte (s. Kürzel in Spalte „ID-Werk, Seite“in der HTL und Arbeitsblatt „Bestimmungswerke“). Wennder akzeptierte Name des Taxons in der HTL abweichend,weil aktueller als in dem Bestimmungswerk ist, dann wirdder im Bestimmungswerk geführte Name in der HTL-Spalte„Detail Bestimmungswerk“ nochmals ausdrücklich genanntund zusätzlich in der Synonymeliste geführt und die Umbe-nennung erläutert (s. Kusber 2009). Zu nomenklatorischenFragen kann man sich auf der Internetplattform „algaterra“informieren (s. KUSBER 2009).Als Standardbestimmungswerke werden in der harmonisier-ten Taxaliste (seit Version 11.09.2006) die zu verwenden-den Bücher und Veröffentlichungen zu den einzelnen Algen-ordnungen in der Liste „Bestimmungswerke“ aufgeführt.Grundsätzlich ist die Nomenklatur und Systematik in derharmonisierten Taxaliste mit der „Taxaliste der Gewässeror-ganismen Deutschlands – zur Kodierung biologischer Be-funde“ (MAUCH et al. 2003) und aktuelle Download-Versio-

nen bis Mai 2009) abgeglichen. Eine Kodierung allein nachder DV-Liste nach MAUCH et al. (2003) für eine spätere auto-matisierte Auswertung der Ergebnisse ist jedoch nur mög-lich, wenn die Codierung der harmonisierten Taxaliste(Taxon_ID) auf diese Befundeliste übertragen wird, da dortsehr viel mehr Taxa geführt werden.Die harmonisierte Taxaliste wird ergänzt durch eine Liste vonhäufigen synonymen Bezeichnungen (s. Arbeitsblatt „Syno-nyme“ KUSBER 2009), die durchsucht werden kann, wenn ge-suchte Taxonnamen in der Hauptliste zu fehlen scheinen.Da das Bewertungsverfahren auch eine Bewertung auf demNiveau von Algenklassen und Ordnungen durchführt, isteine allgemein akzeptierte Systematik des Phytoplanktonsnotwendig, um alle Taxa für die Berechnungen einheitlich zugruppieren. Die harmonisierte Taxaliste enthält eine Listedes verwendeten System (s. Arbeitsblatt „Systematik“) so-wie die taxaspezifische Zuordnung aller Taxa in der Haupt-liste (s. Spalten im Arbeitsblatt „harmonisierte Taxaliste“).Demzufolge werden z. B. die Volvocales den Chlorophyceaezugeordnet.

3.3.2 Zählstrategie für die quantitative Auswertung

Die Zählstrategie soll sowohl kleinzellige als auch großzelligeArten mit ähnlicher statistischer Nachweisgrenze sicher er-fassen und den Zählaufwand möglichst klein halten unddennoch die Zählung innerhalb der statistischen Fehlerbreitevon 20 % halten (vgl. ROTT et al. 2007). Um die erforderli-chen Indikatortaxa sicher zu erfassen, sollen als Minimum10 Taxa mit einer vorgegebenen Stichprobe (Objektzahl undZählfläche) ausgezählt werden, die den Hauptteil des Gesamt-biovolumens stellen (ca. 90 %). Jede biomassedominanteArt stellt in der Regel mehr als 4 % am Gesamtbiovolumen.Nach diesen Anforderungen ist die Zählstrategie in Anleh-nung an die ATT TI7 und den Anforderungen der WRRLso zu wählen, dass• mindestens 400 Objekte insgesamt gezählt werden,• mindestens 15–20 Arten erfasst werden, womit i.d.R.

die biomassedominanten Taxa gefunden werden. In eu-trophen Gewässern kommen meist immer mindestens20 bis 30 Arten vor. Bei sehr artenarmen Planktonbiozö-nosen in ultraoligotrophen Seen können auch z. T. weni-ger Arten zu finden sein, jedoch sollen auch hier mindes-tens 10 Taxa erfasst werden,

• die Auszählung bei zwei verschiedenen mikroskopischenVergrößerungen erfolgt: a) bei ca. 400-facher Vergröße-rung für Arten mit kleinen Zellen mit mindestens 60Zellen je Art bei den (nach der Zählzahl) dominantenArten auf einer kleinen Kammerfläche (zwei Zählstrei-fen) und b) bei ca. 200-facher Vergrößerung auf einergroßen Kammerfläche (halbe bis gesamte Kammer) fürKolonien (z. B. Fragilaria crotonensis) und große Panzer-flagellaten (z. B. Ceratium) mit mindestens 20 Zellen jedominanter Art (nach der Zählzahl) erfolgt,

• die Zählung der biomassedominanten Taxa mit einemweiten Größenspektrum in Größenklassen erfolgt: FürPhytoplanktonarten, deren Individuen erheblich in derZellgröße variieren, sollen Größenklassen ihrer größten



Zelldimension (z. B. Durchmesser oder Zelllänge) imZählprotokoll gebildet werden und die Individuen denGrößenklassen bereits bei der Zählung nach Zellgrößedurch die Verwendung der Messskala im Okular zuge-ordnet werden. Die Zellzahl und das Biovolumen derGrößenklassen eines Taxons werden im Endergebnisaufsummiert und nur einer Taxon-Kennnummer zuge-ordnet (Ausnahme Centrales, Cryptomonas),

• die Artbestimmung der Diatomeen anhand von extraangefertigten Schalenpräparaten vorgenommen wird:Viele Diatomeenarten können in der Sedimentations-kammer nicht sicher bestimmt werden. Deshalb sollteder Anteil der Arten in einem Diatomeenschalenpräparatals relativer Anteil an einer Größenklasse bestimmt undanschließend dem Zählergebnis der gleichen Größen-klasse proportional zugeordnet werden,

• das Biovolumen anhand von Standardzellvolumina be-rechnet wird: Das Taxon-Biovolumen ergibt sich aus derMultiplikation des mittleren Zellvolumens und der Zell-häufigkeit. Das Gesamtbiovolumen stellt die Summe al-ler Taxa-Biovolumina pro Liter Probe dar (ohne hetero-trophe Flagellaten).

Die Bestimmung der Zellhäufigkeiten erfolgt grundsätzlichauf der Basis von Einzelzellen. Dazu sind bei fädigen und beisehr größenvariablen Formen besondere Zählstrategien er-forderlich:Fädige Taxa werden in Einheiten (z. B. 10 µm lange Stückeoder in µm Fadenlänge) gezählt (PADISAK et al. 1999). Zur Be-rechnung werden die Einzellängen der Trichome (Fadenstü-cke) aufsummiert. Dann muss die Zelllänge von mindestens20 Zellen bestimmt werden. Aus der Fadengesamtsummewird durch Division mit der mittleren Zelllänge die Anzahlan Einzelzellen errechnet.Zählkategorien in Größenklassen werden für größenvariableTaxa gebildet (Beispiel“ Cryptomonas“ oder „centrale Diato-meen“). Diese Taxa sind in der Mindestbestimmbarkeitslis-te extra ausgewiesen. Es ist für die einzelnen Größenklassenwie für die wenig größenvariablen Taxa erlaubt, Standard-biovolumina für das Zellvolumen zu verwenden, die aus ei-genen Vermessungen oder aus der Literatur entnommensind. Werden die größenvariablen Taxa hingegen nicht inGrößenklassen ausgezählt, ist immer die Ermittlung des mitt-leren Zellvolumens durch die Vermessung von mindestens20 Zellen je Taxon erforderlich.Die Zellzahl (Zellen/mL) ermittelt sich für jedes Taxon (ZZx)nach der Formel (ATT TI7):ZZx (n/mL) = Anzahl ausgezählter Zellen x Gesamtfläche

der Kammer [n x mm2]/absedimentiertesProbenvolumen x ausgezählte Kammerflä-che [mL x mm2]

Neben den mindestens 10 dominanten Taxa werden auchalle weiteren, auf der festgelegten Zählfläche ermittelten Taxaim Ergebnisprotokoll mit einer Zellzahl berechnet, auch wenndie Anzahl der ausgezählten Zellen dieser selteneren Taxaunterhalb von 20 liegt.

3.4 Bestimmung von Zellvolumina

Die Bestimmung des artspezifischen Zellvolumens eines Ta-xons, das sog. Verdrängungsvolumen, basiert auf der be-

kannten Formel-Berechnung eines geometrischen Körpers,welcher der Zellform der Art möglichst ähnlich ist. Eineumfangreiche Formelsammlung und eine Beschreibung derVorgehensweise finden sich in ROTT (1981), ATT TI7 (HOEHN

et al. 1998) sowie in dem CEN-Entwurf „Biovolumen“(CEN 2008b). In ATT TI7 sind einige Formeln falsch, diesesind in CEN (2008b) korrigiert. Durch Vermessung derDimensionsachsen von mindestens 20 Zellen der gleichenArt, der Berechnung des Zellvolumens jeder einzelnen ver-messenen Zelle und einer Medianwertbildung über alle ver-messenen Zellen ergibt sich das selbst ermittelte Standard-zellvolumen (MBV) für ein Taxon. Dieser Standardwert kannauch für weitere Termine verwendet werden.Eine Überprüfung von verwendeten Standardzellvolumina(d. h. Ergänzung von neuen Messungen und damit eine neueMedianwertberechnung) ist immer dann nötig, wenn einTaxon über 50 % das Gesamtbiovolumens bildet sowie beiallen größenvariablen Taxa. Für Letztere wird eine Zählungin Größenklassen empfohlen, wodurch eine Änderung dermittleren Zellgröße durch die unterschiedliche Zuordnungzu den Größenklassen bereits bei der Zählung erfasst wird.Für die Größenklassen kann wiederum ein Standardbio-volumen für das Klassenmittel berechnet und für alle Termi-ne eingesetzt werden.Die Standardvolumina für nicht sehr größenvariable Taxakönnen auch aus Literaturangaben von ähnlichen Gewässer-typen entnommen werden (s. GEIß LER & KIES 2003, HOEHN

et al. 1998, KRIENITZ 1990, POHLMANN & FRIEDRICH 2001,PADISAK et al. 1999). Dies ist vor allem dann zulässig, wennbei seltenen Arten keine ausreichende Anzahl von Messun-gen gewährleistet ist.

3.5 Berechnung der Taxonbiovolumina

Zur Berechnung der Taxonbiovolumina (Biovolumen allerZellen einer Art in der Probe) wird die ermittelte Zellzahl mitdem Standardzellvolumen (MBV in µm3) oder mit dem selbstermittelten, mittleren Zellvolumen eines Taxons multipliziert.Taxonbiovolumen [mm3/L] = Zellzahl [n/mL] x MBV [µm3]/1.000.000.Folgende mathematische Zusammenhänge werden dabeizum allgemeinen Verständnis aufgeführt (s. Kasten Folge-seite):

3.6 Präparate und Auswertung

Die Diatomeen sind eine wichtige Phytoplanktongruppe inSeen. Ihre Artenzusammensetzung hat einen hohen Indika-tionswert, besonders für oligotrophe bis schwach eutropheSysteme. Da viele Arten Lugol-fixiert in den Sedimentations-kammern nicht bestimmt werden können, müssen dazu Dia-tomeenschalenpräparate angefertigt werden. Das Diatomeen-präparat dient zum einen zur Bestimmung des relativen An-teils der Diatomeen (insb. der solitären, centrischen) an denbei der Utermöhl-Zählung gebildeten Größenklassen und zumanderen zur Dokumentation der Bestimmung der planktischen(insb. pennaten) Formen, die bereits bei der Zählung in der



µm³/Ind. * Ind./ml = µm³/ml wenn dabei gelten muss: 1 mm³ = 1 mm * 1 mm * 1 mm = 1.000 µm * 1.000 µm * 1.000 µm = 1.000.000.000 µm³ = 109 µm³ 1 µm³/ml = (1/1.000.000.000) mm³ / (1/1.000) l = 10-9/10-3 mm³/l = (1/1.000.000) mm³/l = 10-6 mm³/l 1.000.000 µm³/ml = 1 mm³/l ⇒ 106 µm³/ml = 1 mm³/l Herleitung der Beziehung von Biomasse zu Biovolumen: bei Annahme Dichte der Organismen wie Wasser = 1,0 g/cm³ (Lohmann 1906/1908): 1 g = 1 cm³ = 1 ml = (10 mm * 10 mm * 10 mm) = 1.000 mm³ (1/1.000) g = 1 mg = 1 mm³ = (1/1.000) ml = 1 µl 1.000 µg = 1 mm³ 1 µg = (1/1000) mm³ = (1/1.000) µl 1 µg = ((1.000 µm * 1.000 µm * 1.000 µm) /1.000) = 1.000.000 µm³ ⇒ Biomassen- und Biovolumen-Angaben: ⇒ 1 µg/l = 1 mm³/m³ ⇒ 1 mg/l = 1 cm³/m³ = 1 mm³/l

Utermöhl-Sedimentationskammer direkt erfasst und be-stimmt wurden (z. B. Fragilaria ulna var. acus).

3.6.1 Probenaufbereitung und Präparationder profundalen Diatomeen

Die Präparation der Diatomeenschalen erfolgt in Anlehnungan KRAMMER & LANGE-BERTALOT (1986 1991) und BATTARBEE

(1986) durch einen heißen Sedimentaufschluss mit Salzsäu-re und Wasserstoffperoxid (SCHÖNFELDER 1997). Das Mate-rial wird anschließend gewaschen und zentrifugiert, eine gutdurchmischte, verdünnte Suspension auf Deckgläschengleichmäßig verteilt, im Muffelofen bei 450°C getrocknetund auf Objektträgern in Naphrax (Brechungsindex n. D.1,69) eingebettet. Für die Auszählung und Bestimmung wer-den von jeder Probe zwei Streupräparate angefertigt.Die mikroskopische Auswertung erfolgt mit einem Durch-lichtmikroskop mit Phasenkontrast oder differenziellemInterferenzkontrast (Nomarski DIC) bei einer Endvergröße-rung von 12,5 x 63 fach bzw. 12,5 x 100 fach und numeri-schen Aperturen der Kondensoren und Objektive von 1,40.Es werden zufällig gewählte, aber sich nicht kreuzende Tran-sekte ausgezählt. Routinemäßig werden in jeder Probe min-destens 400 Diatomeenobjekte gezählt. Eine anschließendeDurchmusterung jedes Präparates dient dem Nachweis wei-terer Taxa, die aufgrund ihrer Seltenheit in der Routinezäh-lung nicht gefunden werden können.Für die Determinationen werden das Bestimmungswerk vonKRAMMER & LANGE-BERTALOT (1986 1991) sowie Monogra-phien und Artneubeschreibungen der Bibliotheca Diatomo-logica und Iconographia Diatomologica (LANGE-BERTALOT

1993; LANGE-BERTALOT & METZELTIN 1996) sowie relevanteEinzelveröffentlichungen (z. B. CASPER et al. 1992, KLEE &STEINBERG 1987, SCHEFFLER et al. 2003, SCHEFFLER et al. 2005)verwendet.

3.6.2 Aufbereitung der pelagischen Diatomeenproben

Als Einbettungsmittel wird Naphrax verwendet, da nur die-ses Material den erforderlichen hohen Brechungsindex auf-weist. Das gebrauchsfertige Harz ist in Toluol gelöst. Es wirdin Deutschland nicht vertrieben. Der Bezug ist nur ohneToluolzusatz über den Mikroskopiehandel in Großbritan-nien möglich (z. B. www.brunelmicroscopes.co.uk.). Im La-bor muss dann Toluol unter leichter Erwärmung (40°C)zugemischt werden. Wegen der Giftigkeit von Toluol müs-sen beim Arbeiten mit diesem Material die entsprechendenArbeitsschutzbestimmungen (Abzug!) eingehalten werden.Nach der Aushärtung des Harzes ist das Toluol verdampft,wodurch die weitere Benutzung ohne Abzug bei der Mikro-skopie möglich wird.

Variante 1: Anreicherung über Membranfiltration direkt nachder Probenahme

Falls direkt im Gelände oder im Labor eine Anreicherungauf Filter(n) erzeugt wurde, werden diese Filter zur Präpara-tion im Becherglas zuerst mit H2O2 behandelt, wobei sich dieAlgenbeläge vom Filter ablösen und anschließend nach demAufschlussverfahren weiterbehandelt (Diatomeen-Präpara-tion nach VAN DER WERFF 1955). Die Proben werden durchZentrifugation aufkonzentriert und mehrmals gewaschen.

Berechnung derTaxonbiovolumina



Variante 2: Anreicherung und Konservierung mit Formalin

1000 mL Probe (aus der Mischprobe) werden nach demVorsedimentationsprinzip (s. ATT TI7) auf ca. 50 mL ange-reichert und in kleine Flaschen (50–100 mL) überführt undmit Formalin (Endkonzentration 5 %) fixiert. Die Anreiche-rung sofort nach der Probenahme im Dunklen und kühlansetzen. Von dieser fixierten Anreicherung kann dann spä-ter entsprechend dem Ergebnis der Diatomeen in der Uter-möhlzählung nach ausgiebigem Schütteln ein Aliquot zurPräparation entnommen werden.Die Proben aus beiden Varianten werden in Wasserstoffper-oxid und mit Kaliumpermanganat als Farbkontrolle für dasVorhandensein von organischen Resten bis zur Entfärbungaufgekocht (s. KLEE & STEINBERG 1987).Bei Verzicht auf die Zugabe von K2Cr2O7 oder KMnO4 ausGründen des Arbeitsschutzes muss man jedoch damit rech-nen, dass in den Präparaten noch organische Reste bleiben,welche eine korrekte Bestimmung behindern. Die Schalenwerden in Naphrax als Streupräparat auf Objektträgernbei ca. 120–150°C eingebettet.

Aufbereitung von Diatomeenproben nach der Wasserstoff-peroxid-Methode von Van der Werff (1955)

Material und Geräte: hohe 250 mL-Bechergläser, 30 %igesH2O2, temperaturregulierbare Heizplatte (± 5°C), Kalium-dichromat, HCl-Konz., Tischzentrifuge + Zentrifugengläser,Schraubdeckelgläschen.Durchführung: Frische oder fixierte Diatomeenproben (ca.25 mL) werden in hohe 250 mL Bechergläser überführt undmit H2O auf ca. 50 mL aufgefüllt. Etwa 50 mL H2O2 (Ver-hältnis 1 Teilprobe +1 Teil H2O2 konz.) werden zugegebenund die Proben mindestens über Nacht stehen gelassen. Aufeiner Heizplatte werden die Suspensionen zuerst 30 min bei80°C erwärmt, danach 3,5 4 Stunden bei 100°C. DieTemperaturangaben bezeichnen die Einstellung der Heizplat-te, nicht die Temperatur der Flüssigkeiten in den Becherglä-sern! Droht die Flüssigkeit einzukochen, so muss mit H2Overdünnt werden. Ca. alle 30 min sollten die Bechergläserfür ein gleichmäßiges Ablaufen der Reaktion kurz ge-schwenkt werden. Nach Beendigung des Kochvorgangs gibtman, noch auf der Heizplatte, pro Probe ca. eine Spatel-spitze KMnO4 oder K2Cr2O7 zur vollständigen Oxidationzu. Hierbei empfiehlt sich diese Zugabe sehr langsam, d. h.körnchenweise durchzuführen, da heftige Reaktionen ent-stehen können. Droht eine Probe überzukochen muss sievorübergehend von der Heizplatte entfernt werden. Nachder hierbei vor sich gehenden, beendeten Farbreaktion nimmtman die Bechergläser von der Heizplatte, versetzt die Sus-pensionen mit etwas H2O-dest und dann mit einigen Trop-fen HCl; eine weitere Farbreaktion kann stattfinden. Jetztwerden die Proben nochmals kurz erwärmt und dann end-gültig zum Abkühlen beiseite gestellt. Das organische Mate-rial ist auf diese Art und Weise fast vollständig entfernt wor-den. Der Inhalt der Bechergläser wird nun ca. 15 min bei2000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und noch drei-mal mit H2O-dest gewaschen und zentrifugiert. Der Über-stand wird verworfen, die abgesunkenen Diatomeenschalenin ein Schraubdeckelgläschen überführt. Abfälle mit K2Cr2O7müssen als Chemikalienabfälle (Chromate) entsorgt werden.

Herstellen der Objektträger-Präprarate nach Klee & Stein-berg (1987) und BAFU (2006)

Material und Geräte: Heizplatte, Mikropipette, Naphrax(Vorsicht enthält Toluol), Objektträger, Runde Deckgläser(18 mm Ø).Durchführung: Gewaschenes Material verdünnen bis es leichtmilchtrüb aussieht. Ggf. mehrere Verdünnungsstufen an-setzen. Ca. 300 µl (Mikropipette auf gut entfettetes (durcherhitzten) Deckgläschen (18 mm Ø) zügig auftropfen undüber Nacht ggf. mehrere Tage (mind. 12–24 h) eintrocknenlassen. Wenn auf dunklem Untergrund der weißliche Belagnicht mehr glänzt, sind die Deckgläschen fertig. 1–2 TropfenNaphrax auf einen Objektträger geben und diesen auf einerHeizplatte bei ca. 150°C kurz erhitzen (Toluol entweicht).Bei starker Blasenbildung Hitze verringern. Deckglas mit ei-ner feinen Pinzette mit den Algen nach unten auf den Na-phrax-Tropfen und auf eine kühle Unterlage legen. KleineLuftblasen durch vorsichtiges Andrücken entfernen. VorGebrauch 12 h abkühlen lassen.

3.6.3 Auszählung der Diatomeen

Die Diatomeenanalyse für Pelagialproben ist lediglich als einHilfsmittel zu verstehen, um für die quantitativen Diato-meen-Daten aus der Utermöhlzählung mit Hilfe eines Prä-parates eine verbesserte taxonomische Tiefe zu erzielen (s.Tab. 4). Darin unterscheidet sich die hier beschriebeneDiatomeenanalyse für Pelagialproben grundlegend von derdes Phytobenthos, in der alle Diatomeentaxa erfasst undauf der Ebene der relativen Häufgkeit der Schalen ausgewer-tet werden. Im Schalenpräparat müssen die Diatomeen in-nerhalb der Größen- und Formenklassen wie bei der Uter-möhlzählung hinsichtlich Art und relativem Anteil spezifi-ziert werden, sofern sie nicht leicht bestimmbare Arten sind,die im Utermöhl-Mikroskop bestimmt werden können (s.dazu in MISCHKE & KUSBER 2009; allgemeines Mindestbe-stimmbarkeitsniveau). Die Bearbeitung der Diatomeenprä-parate und der Utermöhl-Proben sollte nach Möglichkeitim selben Labor erfolgen, da nur so gewährleistet ist, dassdie taxonomische Zuordnung von Größen- und Formen-klassen bzw. Sammeltaxa in der erforderlichen engen Ab-sprache der Bearbeiter untereinander durchgeführt werdenkann. Das Ergebnis der Utermöhlzählung muss vor der mi-kroskopischen Bearbeitung des Diatomeenpräparats vor-liegen (s. Tab. 3).Die Diatomeenzellen werden als Objekte gezählt. Unter die-sen sind i.d.R. Zellen zu verstehen, die jeweils aus zwei Scha-lenhälften bestehen. Eine Unterscheidung, ob es sich bei ei-nem Objekt um eine einzelne Schalenhälfte oder um beide(noch) zusammenhängende Schalenhälften einer Zelle han-delt, ist im Lichtmikroskop auch bei einer hoch auflösendenObjektivvergrößerung bei pelagischen Diatomeen meist nurschwer möglich. Bei dem relativ sanften Aufschlussverfahrennach VAN DER WERFF (1955) trennen sich die Schalenhälfteni.d.R. nur in geringerem Anteil. Im Routinebetrieb der Dia-tomeenauszählung ist der Grad dieser Aufschluss beding-ten Schalenauftrennung jeweils für die einzelnen Arten nichtfeststellbar. Es wird daher vereinfacht davon ausgegangen,



dass in den jeweiligen Größen- und Formenklassen dieserAuftrennungsgrad für alle darin erfassten Diatomeenartengleich ist. Unter dieser Annahme ist es für die spätere Über-tragung der relativen Häufigkeiten auf die Daten der Uter-möhlzählung unerheblich, ob ein Objekt als jeweils zwei Scha-lenhälften (gemäß EN 14407, Kap. 7c bzw. BAFU 2006) oderals eine Zelle erfasst wird.Die Auswertung von mindestens 200 Objekten erfolgt aneinem Lichtmikroskop bei 1000-facher Vergrößerung (Ob-jektiv 100 x, Ölimmersion). Bei der Übertragung der Datenvon der Zählung des Diatomeen-Präparates auf die quantita-tiven Daten der Utermöhlzählung werden zu den mindestens200 Counts nicht die Diatomeen mitgerechnet, die bereits inder Utermöhlkammer leicht zu erkennen sind (z. B. Asterio-nella formosa, Fragilaria crotonensis etc.), sondern nur die,für deren Taxonomie eine Präparation erforderlich ist (insb.Centrales vgl. Tab. 4). Die Diatomeen-Arten, die keine Prä-paration erfordern, sind in der harmonisierten Taxaliste ge-kennzeichnet. Bei Massenentwicklungen von solchen in derUtermöhlkammer sicher erkennbaren Diatomeen-Arten,sind die Taxa, deren Bestimmung ein Präparat erfordert,dann häufig nur selten vertreten. Es können von diesen dannmeist keine 200 Objekte gefunden werden. Um solche Pro-ben noch rationell bearbeiten zu können, bricht man in die-sen Fallen die Zählung nach 2 Std. (reine Durchmusterungs-zeit) ab, auch wenn dann nur deutlich unter 200 dieserObjekte erfasst wurden.Solitäre Centrales müssen immer im Präparat bestimmt undgezählt werden. Pennate Formen werden – sofern sie nichtbereits in der Utermöhlzählung bestimmt werden können(s. Tab. 4) – nur dann näher bestimmt und gezählt, wenndiese Taxa mehr als 4 % des Biovolumens ausmachen.Diese Regelung erfordert die Biomasseberechnung für alleTaxa einschließlich der Diatomeen als Grundlage für dieBestimmung der 4 % Vorgabe vor der Auswertung der Glüh-präparate.

Auch bei Proben aus Stagnationsphasen können mitunter200 Objekte nicht erreicht werden. Mit einem Ansatz derentsprechenden Konzentration würden in diesen Fällenzugleich störende mineralische Partikel angereichert, die diemikroskopische Erfassung der Diatomeen unmöglich ma-chen. Die Auszählung erfolgt in den gleichen Größenklassenwie die quantitative Auszählung in den Utermöhl-Kammernam Umkehrmikroskop. Da Schalen der Centrales kleiner5 µm im Durchmesser infolge ihrer geringen Größe unddünnem Kieselskelett häufig nur schwer bestimmbar sind,wird diese Größenklasse nicht nach Arten aufgeschlüsselt.Nachdem die relative Artenzusammensetzung in den Schalen-präparaten ermittelt ist, wird das Ergebnis der taxonomi-schen Zusammensetzung auf die quantitativen Ergebnisseder Utermöhl-Zählung aus den gleichen Größenklassenübertragen. Im Endprotokoll werden die Größenklassendurch die Artbiovolumina ersetzt (vgl. Tab. 5).Aus Tab. 5 wird ersichtlich, dass es für das (quantitative)Endergebnis nicht wichtig ist, im Präparat solche Diatomeen-arten zu bestimmen, deren Größen- bzw. Formenklassen beider Utermöhlzählung nicht gefunden wurde, da diese durchÜbertragung auf die Utermöhlzählung nicht quantifiziertwerden können.

3.7 Auswertung der Phytoplanktonzählungenund Biovoluminabestimmung

Die Auswertung der Zählungen kann in einer dafür vorbe-reiteten Datei eines Tabellenkalkulationsprogramms (Excel)erfolgen, sofern die dort verwendeten Zählkategorien denvorgegebenen Taxa und Größenklassen entsprechen. Andern-falls müssen weitere Zählkategorien mit eigens bestimmtenmittleren Zellvolumina angefügt werden. Ziel ist eine Taxa-Befundeliste, die der Formatvorlage für das accessbasierteAuswertungstools PhytoSee entspricht (s.a. MISCHKE 2008).

Kodierung der Befunde:

Die Auswertung der Zählergebnisse (Biodaten) mittels Indi-katorlisten erfordert die Kodierung der Arten und weitererTaxa nach der harmonisierten Taxaliste Phytoplankton(MISCHKE & KUSBER 2009). Eine automatisierte Berechnungist nur möglich, wenn jeder Zählkategorie eine aus der har-monisierten Taxonliste vorgegebene Taxon-Identitätsnum-mer zugeordnet wird. Damit erhält jedes Zählergebnis dieZuordnung zum Mindestbestimmbarkeitsniveau und denVerbreitungswerten der Indikatorarten und -gruppen, so-wie eine DV-Nummer der Taxaliste der GewässerorganismenDeutschlands (MAUCH et al. 2003, Stand Internet VersionMärz 2009).Werden Zählkategorien gewählt, die auf dem Mindestbe-stimmbarkeitsniveau beruhen, wie z. B. Aulacoseira granu-lata, stellen sie ein Aggregat mehrerer untergeordneter Taxamit eigenen ID-Nummern dar. In diesem Fall wird für dieZählkategorie eine der möglichen ID-Nummern verwendetund die der ähnlichsten Kategorie die ID 78 für Aulacosei-ra granulata eingesetzt. Weicht der selbst ermittelte Taxonna-me von dem unter dieser gewählten ID in der Taxonlisteaufgeführten Taxanamen ab, wird dieser in einer Zusatz-

Gruppe/Taxa Bearbeitungsmodus in der Diatomeenanalyse

Centrales:

Cyclotella, Stephanodiscus, Cyclostephanos und weitere Gattungen

bestimmen und zählen

Aulacoseira nur bestimmen; bei mehreren Aulacoseira Arten diese bestimmen und alle Aulacoseira-Arten zählen

Pennales:

Asterionella formosa nicht zählen; nur Vermerk über Vorkommen

Tabellaria flocculosa nicht zählen; nur Vermerk über Vorkommen

Fragilaria die Fragilaria -Arten bestimmen und zählen, die nicht in der Utermöhl-Probe erkennbar sind

Tab. 4: Bearbeitungstiefe von bestimmten Diatomeentaxa bzw.-gruppen bei der Auszählung der planktischen Diato-meenpräparate



spalte „Taxonanmerk“ eingetragen wie in der Formatvor-lage zum Auswertungsprogramm vorgesehen. Die Aufsum-mierung aller Taxa, die zu einem Indikatortaxon gruppiertsind, erfolgt in einem späteren Schritt mit der Auswertungs-software automatisch über die Tabelle „Indikat_PTSI“.Als Zwischenergebnis der Datenvorbereitung erhält maneine Liste mit den Spalten: Messort; Datum; Taxon-ID oderDV-Nr; Taxonname; mittleres Zellvolumen; Zellzahl (Zel-len/mL); Zählkategorie und spezifisches Biovolumen. JederKombination aus Messort und Datum muss eine eindeutigenumerische Probennummer zugeordnet werden (s. laufen-de Nr. im PhytoSee-Programm).Zur automatischen Index- und Bewertungsberechnung mit-tels des Auswertungsprogramms PhytoSee müssen die Datenvorbereitet werden: Sie müssen der Formatvorlage in der Da-tei Formatvorlage_PhytoSee_Auswertungsprogramm_5_09.xls. entsprechen (s. MISCHKE et al. 2009a). Die Auswer-tungssoftware PhytoSee 4.0 (MISCHKE et al. 2009a) berech-net die für das Bewertungsverfahren erforderlichen Mittel-werte aus den chemischen und biologischen Eingangsdaten.Die Berechnung folgt der Verfahrensbeschreibung für Seenmittels Phytoplankton (MISCHKE et al. 2008) mit Modifika-tion für die Bewertung der Flussseen in MISCHKE et al. (2009b)und für künstliche und stark veränderte Gewässer sowie denSeen der Mittelgebirge vorläufig nach HOEHN et al. (2009).Die Bewertung kann sich im Detail durch Ergebnisse auslaufenden Forschungsprojekten der LAWA (2009–2011)noch verändern. Es wird ggf. dann eine aktualisierte Aus-wertungsprogrammversion zur Verfügung gestellt.Die aktuelle Version des Programms PhytoSee.mdb, die An-leitung mit Formatvorgaben in Excel und die harmonisierteTaxaliste stehen kostenlos zum Download auf folgenderInternetseite im Downloadbereich zur Verfügung: http://www.igb-berlin.de/abt2/mitarbeiter/mischke.

4 Beprobung und mikroskopischen Auswertung desPhytoplanktons aus Fließgewässern zur ökologi-schen Bewertung im Rahmen der EU-WRRL

4.1 Einleitung

Mit dem Handbuch zum Bewertungsverfahren von Fließ-gewässern mittels Phytoplankton (MISCHKE & BEHRENDT

2007) wurde erstmals eine einheitliche Vorgabe hinsichtlichder Auswahl der Probenstellen, Probenahmefrequenz, dermikroskopischen Auswertungsstrategie und der erforderli-chen Bestimmungstiefe zur Umsetzung der EU-Wasser-rahmenrichtlinie in Deutschland gemacht. Diese Vorschriftwird im Folgenden aufgeführt, gekürzt um solche Abschnit-te, die mit der Vorschrift für die stehenden Gewässer iden-tisch sind.

4.2 Beprobungsvorschrift Phytoplanktonin Fließgewässern

4.2.1 Auswahl an Probestellen

Die Probenahme des Phytoplanktons ist nur in ausgewähl-ten Fließgewässertypen nötig. Eine Beprobung von Bächenund kleinen Flüssen mit einem Einzugsgebiet kleiner als1.000 km² ist in der Regel nicht erforderlich.Durch Ableitung der Neigung zur Phytoplanktonbildungim Referenzzustand wurden solche Gewässertypen zur Be-wertung ausgewählt, die auch natürlicherweise Planktonführen. Weitere Rahmenbedingungen, die für die Biomasse-bildung und taxonomische Zusammensetzung des Phyto-planktons in den ausgewählten Gewässertypen relevantsind, sind in den Steckbriefen zu den Fließgewässertypenund deren Anhang (POTTGIESSER & SOMMERHÄUSER 2008)sowie in den Kurzdarstellungen Phytoplankton (MISCHKE

2009) als Interpretationshilfe dargestellt.Es wird mit Hilfe der Chlorophyll-a-Konzentration als Hilfs-größe zur Erfassung der biologischen Kenngröße Phyto-planktonbiomasse ein Wert von mehr als 20 µg/L Chloro-

Tab. 5: Fallunterscheidungen zur Übertragung auf die quantitativen Daten

Diatomeen-Gruppe Utermöhl-Zählung Diatomeenpräpate-Zählung Auswertung

Centrales gefunden (in Größenklasse)

gefunden in der selben Größenklasse und bestimmt

Diatomeenergebnis auf Utermöhl-Daten übertragen

Centrales nicht gefunden gefunden und bestimmt keine Auswertung, da nicht quantifizierbar

Centrales gefunden (in Größenklasse) nicht gefunden „diverse Centrales“ dieser

Größenklasse

Pennales gefunden (Größen- und Formenklasse)

gefunden in der selben Größen- und Formenklasse und bestimmt

Diatomeenergebnis auf Utermöhl-Daten übertragen

Pennales nicht gefunden gefunden und bestimmt keine Auswertung, da nicht quantifizierbar

Pennales gefunden (Größen- und Formenklasse bzw. Gattung)

nicht gefunden „diverse Pennales“ bzw. „Gattung sp.“ dieser Größen- und Formenklasse



phyll-a im Saisonmittel (April Oktober) als Kriterium füreine Beprobung des Phytoplanktons vorgeschlagen.Messstellen an bewertungsrelevanten Fließgewässertypensollten auch bei Unterschreitung von 20 µg/L mindestens ineinem Untersuchungsjahr hinsichtlich Phytoplankton be-probt werden.Das Bewertungssystem beruht auf der Auswertung von Phy-toplankton an wenigen Probenstellen am Mittel- (Typ 15,17 9. 2, 10, 23, s. Tab. 6) und Unterlauf der Flüsse (Typ 20,22.3, 23).Künstlich erweiterte und befestigte Fließgewässerabschnitte(Hafenbecken; Schleusen; Orte direkt vor und nach Stau-stufen etc.) sind als Probenstellen für das Phytoplanktonungeeignet, da sich die Fließgeschwindigkeit an diesen Or-ten erheblich verändert und deshalb zu Einschichtungen oderSedimentation des Phytoplanktons führen kann. Erweiterun-gen der Flussbreite auf mehr als das Doppelte und Vertiefun-gen des Gewässers um mehr als ein Drittel werden als kri-tisch eingeschätzt. Beprobungen von Brücken sind zulässig,sofern die strömungszugewandte Seite der Brücke gewähltwird. Bei Bogenbrücken ist es sinnvoll, eine Mischprobe ausallen Brückensegmenten in der Strommitte herzustellen.

4.2.2 Probenahme und Beprobungsfrequenz

Zwischen einzelnen Jahren können die zufälligen Schwan-kungen, die von den Witterungsbedingungen und den hy-drologischen Gegebenheiten verursacht werden, sehr großsein. Daher erlauben nach LAWA-UAK „PlanktonführendeFließgewässer“ (2002) die Werte einzelner Jahre keine Aus-

sagen über den Zustand eines Gewässers. Der LAWA-UAK(2002) empfiehlt Auswertezeiträume von 3–5 Jahren alssinnvoll und praktikabel. Die über diesen Zeitraum ermit-telten Bewertungsergebnisse indizieren den ökologischen Zu-stand mit höherer Sicherheit.Für jedes Untersuchungsjahr ist möglichst eine monatlicheBeprobung des Phytoplanktons inklusive einer Chlorophyll-a-Messung im Zeitraum von April bis Oktober durchzu-führen, so dass als Minimum 6 Termine in die biologischeBewertung eingehen. Eine 14-tägige Beprobung wird für dieChlorophyll-a-Bestimmung und für die Nährstoffbestim-mung empfohlen. Weiterhin wird empfohlen, diese 14-tägigenBeprobungen ebenfalls mit einer Phytoplanktonprobenahmezu verbinden, um die taxonomische Zusammensetzung zuerfassen. Es ist zur Reduktion der Probenzahl erlaubt, einemonatliche Mischprobe aus mehreren fixierten Einzelprobeneines Monats (14-tägig oder wöchentlich) vor der mikros-kopischen Analyse herzustellen, da die saisonale Dynamikder Zusammensetzung des Phytoplanktons nicht in das Be-wertungsverfahren eingeht. Mischproben von größeren Zeit-räumen sind nicht erlaubt.Die Wasserproben werden mit einem Ruttner- oder einemVan-Dorn-Fallschöpfer oder anderen Probenahmeschöp-fern, die die Entnahme aus der Tiefe plusminus 50 cm mitMittelpunkt in 0,5 m Wassertiefe zulassen, in der Regel auseiner Wassertiefe von 0,5 m in der Strommitte entnommen.In langsam- fließenden Fließgewässern kann es zu vertika-len Einschichtungen des Phytoplanktons im Wasserkörperkommen. Bei sichtbaren Aufrahmungen (z. B. durch Micro-cystis) und einer Sichttiefe unter 1 m wird eine zweite Probevon der Gewässeroberfläche genommen und mit der 0,5 m

FG-Typ Name des Fließgewässertyps Kriterium für Subtyp Phytoplanktonbewertung

Biomassebildung je TP-Einheit

15.1+17.1 Sand-, lehm- und kiesgeprägte Tieflandflüsse mit kleinem EZG

EZG 1000–5000 km2 niedrig

15.2+17.2 Sand-, lehm- und kiesgeprägte Tieflandflüsse mit großem EZG

EZG > 5000 km2 hoch

20.1 Sandgeprägte Ströme des Tieflandes mit großer Abflussspende

> 10 L/s/km2 (Q/EZG) niedrig

20.2 Sandgeprägte Ströme des Tieflandes mit kleiner Abflussspende

< 10 L/s/km2 (Q/EZG) sehr hoch

9.2 Große Flüsse des Mittelgebirges hoch

10.1 Kiesgeprägte Ströme des Mittelgebirges mit großer Abflussspende

> 10 L/s/km2 (Q/EZG) niedrig

10.2 Kiesgeprägte Ströme des Mittelgebirges mit kleiner Abflussspende

< 10 L/s/km2 (Q/EZG) sehr hoch

23 Rückstau- bzw. brackwasserbeeinflusste Ostseezuflüsse

EZG > 500 km2 sehr hoch

Tab 6: Bewertungsrelevante Fließgewässertypen von planktonführenden Fließgewässern mit den definierten Sub-Typen (FG-Typ)für die Phytoplanktonbewertung



Probe zu einer Mischprobe vereint. Die Phytoplanktonprobeund die Wasserprobe zur Chlorophyll-a-Analyse müssenaus der gleichen Schöpfprobe stammen.

4.2.3 Charakterisierung der Probenstellen

Morphologische und hydrologische Kenndaten der Proben-stellen

Die Probenstellen müssen hinsichtlich ihrer Morphometrieund Hydrologie durch folgende Parameter charakterisiertwerden:• Abfluss (m³/s),• Einzugsgebietsgröße (km²),• Wassertiefe bei Normalabfluss (m),• Flussbreite bei Normalabfluss (m),• Flusskilometer gemessen ab der Quelle (km) (empfohlen),• Hoch- und Rechtswerte der Probenstelle (empfohlen),• Hohe Ufervegetation vorhanden – wenn ja, geschätzte

Beschattung der Gewässeroberfläche zu < 50 % oder> 50 % (empfohlen Gewässerkartierung).

Gewässertypisierung

Die Zuordnung der Probenstellen zu einem Fließgewässer-typ soll gemäß der Karte „Biozönotisch begründete Fließ-gewässertypen in der BRD“ (POTTGIESSER & SOMMERHÄUSER

2004) erfolgen und kann von dieser durch weitere Detail-kenntnisse der Bundesländer über die Probenstelle begrün-det davon abweichen. Zusätzlich ist die Kenntnis des mittle-ren Normalabflusses (MQ m³/s) sowie die Einzugsgebiets-größe (km2) für die Bewertung sowie für die Zuordnung zuden Phytoplankton spezifischen Subtypen erforderlich. DieAbflussspende (HD) errechnet sich aus dem Abfluss, MQ(L/s) dividiert durch die Einzugsgebietsgröße (EZG, km2).Eine Bewertung mittels Phytoplankton ist nur für die bewer-tungsrelevanten Fließgewässertypen (s. Tab. 6) zur Umset-zung der europäischen Wasserrahmenrichtlinie erforderlich.Die Subtypenunterteilung innerhalb der Bewertung mittelsPhytoplankton sieht die in Tab. 6 davon abweichende Sub-typen und Kriterien dafür vor. Da die Gewässer der Typen15.1 und 17.1 mit Einzugsgebieten zwischen 100 und1000 km2 natürlicherweise nicht planktonführend sind,werden diese durch eine Untergrenze von 1000 km2 ausge-schlossen.Gewässerabschnitte von nicht bewertungsrelevanten Gewäs-sertypen, wie von kleinen Bächen und Flüssen, können beihydromorphologischer (Aufstau, Teiche etc.) und struktu-reller Degradation (fehlende natürliche Uferbeschattung)ebenfalls planktonführend sein. Sie können testweise demähnlichsten bewertungsrelevanten Gewässertyp zugeordnetwerden, um eine Bewertung durchzuführen. Die Beurteilung,ob damit ein plausibles Ergebnis erreicht wird, liegt dannjedoch außerhalb des durch das vorliegende Verfahren defi-nierten Rahmens und seiner Gültigkeit.

4.2.4 Chemische und physikalische Kenndatender Wasserproben

Zusammen mit dem Phytoplankton müssen für das Bewer-tungsverfahren folgende chemische und physikalische Para-meter des Wassers erfasst werden:• Bestimmung der Chloridkonzentration nach DIN,• Photometrische Bestimmung der Chlorophyll-a-Konzen-

tration nach DIN,• Chlorophyll-a-Bestimmung aus der Mischprobe für die

Phytoplanktonanalyse.Gemeinsam mit Chlorophyll-a ist die Extinktion 436 nmErsatzgröße für die nach WRRL geforderte Beurteilung deralgenbürtig beeinträchtigten Sichttiefe.Es werden folgende, weitere Messgrößen zur Interpretationempfohlen:• Bestimmung der Gesamtphosphor-Konzentration nach

DIN,• Photometrische Bestimmung der Extinktion bei 436 nm

nach DIN (Messung der unfiltrierten Probe ergibt „schein-bare Färbung“ und Messung der filtrierten Probe ergibt„tatsächliche Färbung“. Beide Messungen sollen durch-geführt werden.),

• Sichttiefe mit Secchi-Scheibe (bei Grundsicht Gewässer-tiefe notieren),

• Wassertemperatur, Gesamthärte, Säurekapazität,• Bestimmung des gelösten Phosphors – SRP-Konzentra-

tion nach DIN,• Trübungswert mit Sonde, falls keine Extinktion bei

436 nm bestimmt werden kann,• Bestimmung der Gesamtstickstoff-Konzentration nach

DIN,• Photometrische Bestimmung der gelösten Silizium-Kon-

zentration nach DIN.

4.2.5 Entnahme und Konservierung der Phytoplankton-proben (-Lugolproben)

Es erfolgt die Entnahme einer Probe aus der 0,5 m Probeoder aus der Mischprobe.Es gelten hinsichtlich der Probenflaschen, -fixierung und-aufbewahrung die gleichen qualitätssichernden Anforde-rungen wie für das Phytoplankton aus Seen (Details s. Kap.2.2.3). Es sollten immer klare Enghals-Glasflaschen mitSchraubverschluss und zur Fixierung eine Lugol’sche Lö-sung verwendet werden (s. EN 15204). Von einer Lagerunglänger als sechs Monate bis zur mikroskopischen Auswer-tung wird dringend abgeraten, da es zu Zersetzungsprozes-sen trotz Fixierung kommen kann.

4.3 Taxonomische Analyse und Utermöhl-Verfahren(Mikroskopie) für die Bewertung von Fließgewässern

Für das Bewertungsverfahren PhytoFluss ist eine quantita-tive Bestimmung des Phytoplanktons in Sedimentationskam-mern mit Diametralzählung nach der UTERMÖHL-Methode(UTERMÖHL 1958 und EN 15204) an einem inversen Mikro-skop erforderlich.



Nach Lagerung der Probe wird diese auf ihre sachgerechteFixierung mit Lugol’scher Lösung überprüft: Falls die Pro-ben nicht mehr cognac-farbig, sondern entfärbt sind, mussdies protokolliert und eine Meldung an den Verantwortli-chen der Probenlagerung und den Bearbeiter der Phyto-planktonanalytik erfolgen. Entfärbte Proben können Zerset-zungsprozesse aufweisen, die unsystematisch das Gesamt-biovolumen reduzieren.Die Geräteanforderungen, die Probenvorbereitung, die mi-kroskopische Zählstrategie und Erstellung einer Zählliste,die Hinweise für die Bestimmungsliteratur, für die Bestim-mung von Zellvolumina und Berechnung von Taxabiovo-lumina sowie die Kodierung der Taxa sind mit den Anforde-rungen für das Seenverfahren identisch (s. Kap. 3.3).Vom Seenverfahren weicht das Fließgewässerverfahren Phy-toplankton lediglich in zwei Punkten ab:Verfahrensspezifische Mindestbestimmungstiefe: Die verfah-rensspezifische Bestimmungstiefe verlangt für das Fließgewäs-serverfahren in weniger Fällen die Artbestimmung als in Seen,häufiger ist die Bestimmung auf Gattungsniveau ausreichend.In der harmonisierten Taxaliste ist die Mindestbestimmungs-tiefe für jedes Taxon aufgeführt (s. Anhang in MISCHKE &BEHRENDT 2007) und wird auch in den überarbeiteten digita-len Fassungen der Taxaliste nochmals gesondert ausgewie-sen (s. MISCHKE & KUSBER 2009).Auswertung: Für die automatisierte Auswertung der Phyto-planktonbefunde ist zwar die Kodierung mittels der glei-chen Taxaliste wie für Seen erforderlich (s. MISCHKE & KUSBER

2009), es wird als Auswertungsprogramm jedoch das Access-basierte Programm PhytoFluss genutzt (BÖHMER & MISCHKE,2008, 2009, passend zur Taxaliste mit Stand Mai 2009).Die Phytoplanktonbefunde müssen für das Auswertungs-programm einer Formatvorlage entsprechen, wie sie in derExcel Datei:Informationen_zur_Software_PhytoFluss_mit_Eingabeformat.xlszur Verfügung steht.Zur automatischen Index- und Bewertungsberechnung wer-den die so vorbereiteten Daten in die Datenbank PhytoFluss.mdb importiert. Diese, als Auswertungssoftware vorberei-tete Datenbank berechnet die für das Bewertungsverfahrenerforderlichen Saisonmittel aus den chemischen und biolo-gischen Eingangsdaten und gibt die Bewertungsergebnisseals eine Excel- Exportdatei aus.Das Programm PhytoFluss.mdb, die Anleitung mit Format-vorgaben in Excel und die harmonisierte Taxaliste stehenkostenlos zum Download auf folgender Internetseite zur Ver-fügung: http://www.igb-berlin.de/abt2/mitarbeiter/mischke.

5 Zusammenfassung und Ausblick

In diesem Beitrag sind die Ergebnisse zehnjähriger gemein-samer Projektarbeiten im Rahmen der Implementierung derEU-Wasserrahmenrichtlinie zur Bewertung von Seen undFlüssen anhand der Qualitätskomponente „Phytoplankton“eingeflossen. Ziel der eigentlichen Arbeiten war die Erstel-lung von Bewertungsverfahren, die in MISCHKE & NIXDORF

(2008), HOEHN et al. (2009), BEHRENDT & MISCHKE (2007)veröffentlicht sind. Als wesentliche Voraussetzung für eine

Bewertung hat sich jedoch die Notwendigkeit einer vergleich-baren Beprobung der Gewässer und der Aufbereitung undAuswertung der Proben erwiesen. Wesentliche Änderungenzu den bislang bestehenden vielgestaltigen Probenahmevor-schriften sind:• Mindestens 6 Probenahmen in der Vegetationsperiode

von April bis Oktober werden vorgeschrieben.• Die Entnahme von Mischproben anstelle von punktuel-

len Proben von stehenden Gewässern aus distinkten Tie-fen wird für alle durchmischten Gewässerschichten vor-gegeben. Das betrifft in flachen polymiktischen Seen dengesamten Wasserkörper, unabhängig davon, ob sichtemporäre vertikale Schichtungen einstellen können. Inmono- und dimiktischen Seen werden während der Voll-zirkulationsphasen Mischproben mindestens bis zurmittleren Tiefe des Sees entnommen. Während der Som-merstagnation wird in trüben geschichteten Seen dasEpilimnion und in klaren Seen die euphotische Zonebeprobt.

• Als wichtigste Neuerung werden künftig bei allen Be-probungen die biologischen und chemischen Unterpro-ben aus einer Mischprobe entnommen (Ausnahme beiAusbildung von Tiefenchlorophyllmaxima (DCM = deepchlorophyll maximum) oder Durchführung von chemi-schen Tiefenprofilen.

• Eine ausführliche Anleitung zur Entnahme von Diato-meenproben aus dem Profundal wurde vorgestellt.

• Die quantitative taxonomische Analyse der Phytoplank-tonproben nach dem Utermöhl-Verfahren ist in allenSchritten nachvollziehbar beschrieben worden, ebensodie Auswerteprozedur, die eine einheitliche Auswertungzum ökologischen Zustand der Gewässer erlaubt.

• Die Erfordernisse (Kodierung, Taxanamen) und das zuerreichende Niveau bei der taxonomischen Bestimmungaller Phytoplanktontaxa, und zusätzlich bei der Aus-wertung der Diatomeen aus dem Profundal und demPelagial sind ausführlich beschrieben worden.

• Daneben sind auch hinweise und Links zu wichtigen undaktuellen Ergebnissen der planktonrelevanten Bepro-bung und taxonomischen Auswertung gegeben worden.

• Ziel der vorliegenden Erhebung war die Vereinheitlichungder Probenahme und -auswertung für die Bewertungvon Seen und Flüssen anhand des Phytoplanktons. ImRahmen dieser Studien fanden eine Vielzahl von Dis-kussionen und mehrere Workshops zur Probenahmestatt, die zu einer gemeinsamen Probenahmestrategieführten. Dabei konnten nicht alle limnologisch relevan-ten Probleme bzw. Fragen gelöst werden. Das betrifftz. B. die Quantifizierung der Tiefen-Chlorophyll-Maxi-ma in klaren und tiefen Seen. Da dieser produktionsrele-vante Prozess in der Bewertung auch keine Berücksichti-gung fand, ist die hier dargelegte Strategie als ein Kom-promiss zur groben Erfassung der DCM zu werten.

• Die saisonalen Schwankungen und Ausprägungen in derPhytoplanktonbiomasse (Frühjahrs- und Herbstmaxima,winterliche Biomasseentwicklung) können mit dieser Pro-benahmevorschrift ebenso wenig in zeitlicher und räumli-cher Auflösung ausreichend erfasst werden, wie die Er-scheinungen von Phytoplanktonblüten (Cyanobakterien).



• Welche Rolle das Picophytoplankton für die trophischeEinschätzung unserer Gewässer spielt, muss mit dembisherigen Verfahren ebenso unbeantwortet bleiben wiedie Rückkopplungen mit dem Zooplankton, das es alseigenständiger Parameter keine Berücksichtung in derWRRL fand, obwohl viel versprechende Ansätze existie-ren (DENEKE 2008, GROß E et al. 1998).

• Diese Defizite betreffen jedoch in erster Linie die Bewer-tung der Gewässer. Grundlage für ein solches objektivesVerfahren ist in jedem Fall eine nach einheitlichen Prinzi-pien gestaltete Probenahme und Aufbereitung der Pro-ben. Wir hoffen, mit dieser Verfahrensanleitung eine Ver-besserung und Optimierung der Probenahme und -aus-wertung von Phytoplanktonproben in Seen und Flüssenerreicht zu haben.

• Die hier vorgestellten Vorschriften für Probenahme undfür die mikroskopische Auswertung basieren auf NIX-DORF et al. (2008) und MISCHKE & BEHRENDT (2007) zurErhebung der Überwachungsdaten für die Bewertungs-verfahren Phytoplankton zur Umsetzung der EU-Was-serrahmenrichtlinie in stehenden Gewässern (MISCHKE

et al. 2008, HOEHN et al. 2009). Sie wurden in einemPraxistest der Bundesländer gestestet und von der Län-derarbeitsgemeinschaft Wasser allgemein akzeptiert.Während bereits einige Elemente Eingang in europäi-sche Normen gefunden haben, wie das Utermöhl-Ver-fahren zur quantitativen Erfassung des Phytoplanktons(EN 15204), steht eine europäische Normung der Pro-benahme und der Biovolumenbestimmung sowie die Be-reitstellung einer operativen europäischen Taxaliste nochaus. Falls diese für die Unterstützung der EU-Wasser-rahmenrichtlinie geplanten Normen inhaltlich von derhier vorliegenden deutschen Vorschrift abweichen, wirdes zukünftig erforderlich sein, durch Modifikation die-ser Vorschriften zu einer Harmonisierung zu kommen.

Danksagung

Die vorgestellten Konzepte und Ergebnisse wurden zu gro-ßen Teilen im Rahmen zweier Projekte (LAWA/DVWK„Leitbildbezogenes Bewertungsverfahren für Phytoplank-ton in Seen“ OK 5.90 und LAWA-Projekt „BundesweiterPraxistest Bewertungsverfahren Phytoplankton in natürli-chen Seen zur Umsetzung der WRRL“ O 5.05) erarbeitet.Folgende Einrichtungen haben neben den Erfahrungen derInstitute den Autoren ihre Erfahrungen mit der Proben-ahmevorschrift innerhalb des „Praxistest PhytoplanktonSeen“ übermittelt: das Bayerische Landesamt für Umwelt,Landesanstalt für Umwelt, Messungen und NaturschutzBaden-Württemberg (LUBW), Niedersächsisches Landesamtfür Ökologie, Umweltministerium Mecklenburg-Vorpom-mern, Landesumweltamt Brandenburg, Landesamt für Na-tur und Umwelt Schleswig-Holstein, Landesamt für Um-welt, Wasserwirtschaft und Gewerbeaufsicht Rheinland-Pfalz, Landesamt für Natur- Umwelt und VerbraucherschutzNordrhein-Westfalen, Landesbetrieb für Hochwasserschutzund Wasserwirtschaft Sachsen Anhalt – Fachgebiet Ökolo-gie mit StAU Magdeburg, die Berliner Senatsverwaltung für

Gesundheit, Umwelt und Verbraucherschutz Berlin, Bran-denburg Technische Universität Cottbus/Bad Saarow. DieDaten wurden durch zahlreiche Labore und Institute ermit-telt, die hier nicht alle namentlich genannt werden können.Wir bedanken uns vor allem bei den Kolleginnen und Kolle-gen, die uns in zahlreichen Diskussionen inhaltliche Hilfe-stellungen gegeben haben. Das betrifft insbesondere alleMitglieder des LAWA-Unterarbeitskreises „ÖkologischeBewertung von Seen und Interkalibrierung Seen“ sowie de-ren Mitarbeitern bzw. Unterauftragnehmern, u. a. Frau Dr.Bahnwart, Herrn Dr. Täuscher und Herrn Dr. Arp, die unsim Praxistest Daten und hilfreiche und kritische Anmerkun-gen übermittelt haben.Bei der Entwicklung der Vorschrift zum Phytoplankton inFließgewässern gilt allen Mitgliedern des Unterarbeitskreisesder Länderarbeitsgemeinschaft Wasser „Biologische Bewer-tung Fließgewässer und Interkalibrierung nach EU-WRRL“,und Experten besonderer Dank, namentlich Annette Holm,Eva Bellack, Klaus Roch, Folker Fischer, Mechthild Banning,Martina Jährling, Kerstin Jenemann, Antje Köhler, MonikaSchmidt, Barbara Guhl, Jörg Schönfelder, Marina Carstens,Martin Dittrich, Hartmut Vobis, Susanne Wanner und KlausWendling, die die LAWA-Projekte (O 6.03, O 3.05) in viel-fältiger Weise sehr kooperativ und freundlich unterstützthaben.Den zahlreichen und sehr kooperativen Experten und An-wendern in Deutschland möchten wir zusätzlich ausdrück-lich für die konstruktiven Hinweise danken. Sie haben allewesentlich zu dem vorliegenden Beprobungs- und Auswer-tungsvorschriften Phytoplankton beigetragen.Frau Beate Müller vom Lehrstuhl Gewässerschutz der BTUCottbus sei ganz herzlich gedankt bei der Verwaltung derProjekte und ihrem Einsatz bei der Erstellung der Berichteund Manuskripte, die wesentlich zum nötigen „Feinschliff“beigetragen haben.

6 Literatur

6.1 Zitierte Literatur

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III-4.3.1 Probenahme und Analyse des Phytoplanktons in ... · 2 Handbuch Angewandte Limnologie –...

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