Immunhistochemischer Nachweis des...

Immunhistochemischer Nachweis

des Retinoblastomgenproduktes

und seine Bedeutung als

Prognosefaktor bei Patientinnen

mit primärem Mammakarzinom

Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin

genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Nele Fischer geb. Mundt

aus Hamburg

Berichter: Herr Professor Dr.med. Stefan Biesterfeld

Herr Universitätsprofessor Dr.med. Christian Mittermayer Tag der mündlichen Prüfung: 30. November 2006

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

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Inhaltsverzeichnis

1.Einleitung ______________________________________________________________ 4

1.1 Epidemiologie des Mammakarzinoms __________________________________________4

1.2 Ätiologie des Mammakarzinoms _______________________________________________4

1.3 Prognostische Faktoren ______________________________________________________7

1.4 Potentielle neue Prognosefaktoren _____________________________________________9

1.5 Problemstellung ___________________________________________________________11

2. Methoden _____________________________________________________________ 13

2.1 Material / Patientenkollektiv _________________________________________________13

2.2 Methoden_________________________________________________________________13 2.2.1 Stadieneinteilung ______________________________________________________________ 13 2.2.2 Malignitätsgradierung___________________________________________________________ 16 2.2.3 Biochemischer Östrogen- und Progesteronrezeptorstatus _______________________________ 16 2.2.4 Immunhistochemische Darstellung des Rb-Proteins ___________________________________ 17

3. Ergebnisse ____________________________________________________________ 23

3.1 Allgemeine Daten __________________________________________________________23

3.2 Univariate Überlebensanalyse________________________________________________24 3.2.1 Gesamtüberleben ______________________________________________________________ 25 3.2.2 Beziehung zwischen Gesamtüberleben und Staging ___________________________________ 26 3.2.3 Beziehung zwischen Überleben und Grading_________________________________________ 30 3.2.4 Beziehung zwischen Überleben und dem Hormonrezeptorstatus__________________________ 35 3.2.5 Beziehung zwischen dem Überleben und der immunhistochemischen Analyse des

Retinoblastomgen-Proteins (Rb) _______________________________________________________ 37

3.3 Multivariate Analyse: Cox-Modell ____________________________________________41

3.4 Korrelationen Rb-bezogener Parameter untereinander und mit klinisch-

morphologischen Parametern ___________________________________________________48 3.4.1 Korrelation zwischen RbPP und RbSI ______________________________________________ 48

3

3.4.2 Korrelation zwischen Rb-Parametern und klinisch-morphologischen Parametern_____________ 49

4. Diskussion ____________________________________________________________ 51

4.1 Anerkannte Prognosefaktoren _______________________________________________52

4.2 Das Retinoblastomgen- Protein (pRb) in der Prognostik des Mammakarzinoms ______56

4.3 Multivariate Überlebensanalyse ______________________________________________66

5. Zusammenfassung______________________________________________________ 68

6. Technischer Anhang ____________________________________________________ 70

7. Datensammlung________________________________________________________ 72

8. Literatur______________________________________________________________ 82

9. Danksagungen_________________________________________________________ 99

10. Lebenslauf __________________________________________________________ 100

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1.Einleitung

1.1 Epidemiologie des Mammakarzinoms

Maligne Erkrankungen nehmen in der Todesursachenstatistik der Bundesrepublik

Deutschland die zweite Position nach den Herz-Kreislauf-Erkrankungen ein. Bei

etwa jeder siebten Frau der westlichen Welt wird die Diagnose Brustkrebs gestellt.

Damit ist das Mammakarzinom die bei Frauen häufigste bösartige Tumorerkran-

kung.

Nach dem jüngsten Bericht der European Society for Medical Oncology (ESMO)

beträgt die jährliche Erkrankungsrate an Brustkrebs in den Ländern der Europäi-

schen Union 105 / 100.000. Die Mortalität wird mit 40 / 100.000 pro Jahr angegeben

[European Society for Medical Oncology (ESMO), 2001]. Auf Deutschland übertra-

gen ergibt sich daraus eine Absolutzahl neu diagnostizierter Mammakarzinome von

etwa 80.000 und Todesfälle von etwa 32.000 jährlich.

Aussagen über Verlauf und Heilungsaussichten der Krankheit machen zu können,

ist für die Betroffenen von großer Bedeutung und kann dazu beitragen, die schwe-

ren therapeutischen Eingriffe zu ertragen und begründete Hoffnung auf Heilung zu

erhalten.

1.2 Ätiologie des Mammakarzinoms

Wie bei den meisten Karzinomen ist es auch beim Mammakarzinom nicht möglich,

das auslösende Agens im Einzelfall zu benennen. Allerdings sind Risikofaktoren

bekannt, die eine Karzinomentwicklung begünstigen.

Die positive Familienanamnese ist ein bekannter Risikofaktor für die Manifestation

der Erkrankung [Anderson et. al.1977; Petrakis et al. 1977]. Für Töchter von präme-

1. Einleitung

5

nopausal erkrankten Müttern, die ein unilaterales Karzinom entwickelt hatten, erhöht

sich das Risiko um das 3-fache, bei bilateraler Erkrankung sogar um das 9-fache.

Fällt die Ersterkrankung einer Frau in die Postmenopause, dann erhöht sich das

Risiko für die folgende Generation nur um das 1,5-fache.

Hormonelle Faktoren spielen in der Pathogenese des Brustkrebses eine wichtige

Rolle. Das Risiko der Karzinomentstehung korreliert mit der kumulativen Exposition

gegenüber Östrogen und möglicherweise auch Progesteron. Frauen mit früher Me-

narche (12. Lebensjahr und früher) und einem rasch regelmäßigen Menstruations-

zyklus tragen ein signifikant höheres Risiko [Henderson et. al. 1974]. Auch ein ho-

hes Menopausenalter (> 55 Jahre) beeinflusst das Brustkrebsrisiko: 40 Jahre Zy-

klusaktivität und mehr zeigen ein doppelt so hohes Risiko wie 30 Jahre und weniger

[Trichopoulos et al. 1972]. Frühe Schwangerschaften (< 20 Jahre) und eine größere

Zahl von Kindern wirken sich risikomindernd aus [MacMahon et al. 1973].

Die Hypothese, dass die Einnahme oraler Kontrazeptiva das Brustkrebsrisiko er-

höht, wird kontrovers diskutiert. Es gibt Studien, die ihnen keinen negativen Effekt

zuschreiben [Arthes et al. 1971; Vessey et al. 1971; Marchbanks et al. 2002], aber

auch solche, die bei frühzeitiger und langer Einnahme ein erhöhtes Karzinomrisiko

feststellen [Olsen et al. 1991].

Epidemiologische Untersuchungen deuten darauf hin, dass Ernährungsgewohnhei-

ten das Mammakarzinomrisiko beeinflussen. Übergewicht geht insbesondere in der

Postmenopause mit einer erhöhten Erkrankungshäufigkeit einher [La Guardiana et

al. 2001]. Die Hauptbedeutung der Ernährung liegt im Kaloriengehalt. Ein gesteiger-

ter Fettkonsum, der zu einem erhöhten Östrogenmetabolismus führt, wird als Ursa-

che der höheren Mammakarzinomraten diskutiert [Van’ter Veer et al. 1991].

Die Theorie, dass Viren eine kokarzinogene Wirkung besitzen, wird durch einige

Arbeiten unterstützt [Hollmann et al. 1972; Sumidaie et al. 1988]. So wurden virus-

ähnliche Partikel in Frauenmilch und humanen Mammakarzinomen nachgewiesen.

Zudem konnte ein gemeinsames Antigen des Mammatumorvirus der Maus (M-MTV)

und des verdächtigen Mammakarzinomvirus des Menschen (H-MTV) isoliert wer-

den. Es gelang die molekulare Hybridisierung zwischen den Nukleinsäuren des mu-

1. Einleitung

6

rinen Mammakarzinomvirus sowie denen von Mammakarzinomen der Frau. Das

Vorkommen dieser Bestandteile scheint in Familien mit erhöhtem Brustkrebsrisiko

gehäuft zu sein.

Neben hormonellen, umwelt- und ernährungsbedingten Einflüssen spielen auch ge-

netische Faktoren für die Entwicklung eines Mammakarzinoms eine Rolle. Lediglich

bei 5%-10 % der Frauen mit Mammakarzinomen liegt eine genetische Disposition

vor. In sogenannten Tumorfamilien hingegen erkranken mehrere Verwandte ersten

Grades über Generationen hinweg an Brustkrebs. In den letzten Jahren (1994/95)

wurden Gene identifiziert, die für das familiär bedingte Mammakarzinom verantwort-

lich sind; BRCA1 und BRCA2 („ Breast cancer gene1 bzw. 2“) sind Tumorsuppres-

sorgene, die die Zelle vor maligner Entartung schützen. Voraussetzung für die Ent-

stehung eines Karzinoms ist der komplette Verlust des Suppressorgens, das in

Form von zwei Allelen vorliegt. Wird die mutierte Form eines Allels des Tumorsup-

pressorgens mit der Keimbahn vererbt, führt eine spontane Mutation im zweiten Al-

lel auf zellulärer Ebene zur Aufhebung der Tumorsuppression und damit zur Trans-

formation der Zelle. Für Trägerinnen von Mutationen im BRCA1–Gen besteht ein

ca. 45%iges Risiko, an Brustkrebs zu erkranken, bis zum Alter von 50 Jahren und

ein 60-85%iges Risiko bis zum Alter von 75 Jahren. Keimbahnmutationen im

BRCA2-Gen gehen vermutlich ähnlich häufig mit einem Mammakarzinom einher

[Zimmermann 2002]

Zusammenfassend kann man sagen, dass die Ätiologie multifaktoriell ist und we-

sentliche Bestandteile noch ungeklärt sind. Eine sichere Abschätzung des Risikopa-

tientenkollektivs ist zur Zeit noch nicht möglich, so dass keine geeigneten Scree-

ning-Verfahren zur Verfügung stehen.

1. Einleitung

7

1.3 Prognostische Faktoren

Die Bestimmung von Prognosefaktoren beim Mammakarzinom hat das Ziel, den

Krankheitsverlauf für die individuelle Patientin abzuschätzen. Durch jeden unabhän-

gigen Parameter wird die Prognose in ihrer Sicherheit verstärkt. Die Aussagekraft

jedes einzelnen Parameters hingegen ist limitiert und sollte in ihrem Wert nicht über-

interpretiert werden.

Die individuellen Prognosen für das Überleben der Patientinnen ergeben sich an-

hand gesicherter Krankheitserkenntnisse. Die Prognose entspricht jedoch keiner

Verlaufsgarantie, sondern einer Vorhersage in die Zukunft auf der Basis von in der

Vergangenheit an klinischen Verläufen gesammelten Erkenntnissen, so daß man

die Grenzen der Vorhersagekraft nicht aus den Augen verlieren sollte.

Die prädiktiven Faktoren ermöglichen möglicherweise auch ein Abschätzen eines

möglichen Therapieerfolges adjuvanter Verfahren. Idealerweise sollten dement-

sprechend z.B. Patientengruppen erfasst werden, die gegen Teiltherapien resistent

sind. Darüber hinaus könnten innerhalb bestimmter Patientengruppen Subgruppen

identifiziert werden, die von einer speziellen modifizierten Therapie profitieren dürf-

ten.

Prognosefaktoren mit gesicherter klinischer Relevanz sind der TNM-Status (Tumor-

größe, axillärer Lymphknotenbefall, Fernmetastasierung, peritumorale Lymphangio-

sis carcinoma, Gefäßinvasion), die Morphologie (Grading, histologischer Typ) und

die Steroidhormonrezeptoren (Östrogenrezeptor, Progesteronrezeptor).

Übereinstimmend werden von diesen Markern in den Consensus-Statements des

NIH (2000), der American Association of Clinical Oncology (ASCO 1996) und der

EORTC-Receptor-and-Biomarker-Group (1995) nur folgende zur routinemäßigen

Bestimmung empfohlen: Tumorgröße, Nodalstatus, histologischer Typ, Grading und

1. Einleitung

8

Steroidhormonrezeptorstatus.

Zusätzlich werden das Alter und der Menopausenstatus im klinischen Alltag als

Prognosefaktoren angewendet.

Bis heute ist der axilläre Lymphknotenstatus der stärkste Prognosefaktor für Rezidiv

und Überleben. Für nodal-negative Karzinome ist die Tumorgröße ein wichtiger er-

gänzender prognostischer Indikator, während bei den nodal-positiven Patientinnen

in der multivariaten Analyse die Tumorgröße vom Lymphknotenbefall „überdeckt“

wird. Zusätzlich korreliert die Anzahl der befallenen Lymphknoten direkt mit dem

Risiko eines Rezidives und des Todes.

Auch morphologische Kriterien sind von hoher prognostischer Bedeutung. Es be-

steht eine eindeutige Abhängigkeit zwischen histologischem Grading und dem rezi-

divfreien Überleben. So haben nodal negative Patientinnen mit G3-Tumoren eine

ebenso schlechte Prognose wie nodal positive Patientinnen (1-3 positive Lymphkno-

ten) und einem G1- oder G2-Grading [GABG III-Studie].

Bestimmte, allerdings insgesamt seltene histologische Subtypen wie tubuläre, papil-

läre und muzinöse Karzinome haben eine signifikant bessere Prognose als klassi-

sche duktale oder lobuläre Karzinome.

Der Östrogen- und Progesteronrezeptorstatus zeigt eine eigenständige Relevanz für

das Gesamtüberleben. Die Patientinnen mit positivem Rezeptorstatus leben signifi-

kant länger. Als prädiktive Faktoren lassen sie bei Positivität eine gute Wirksamkeit

einer hormonellen Therapie erwarten [McCarty et al. 1990, Anderson et al. 1991,

Railo et al. 1993, Sauer 1993, Esteban et al. 1994].

Überdies haben prämenopausale Patientinnen eine ungünstigere Prognose als

postmenopausale Frauen. Nach der St.Gallen-Konsensus-Konferenz 1998 wird au-

ßerdem das Alter einer Patientin < 35 Jahre als Hochrisikofaktor angesehen [Shan-

non, Smith, 2003].

1. Einleitung

9

1.4 Potentielle neue Prognosefaktoren

Die Anforderungen an einen neuen Prognosefaktor, der sinnvoll Eingang in die Rou-

tinediagnostik finden sollte, sind hoch, da die Berücksichtigung nicht relevanter Fak-

toren nur zu einer Verunsicherung der betroffenen Patientin und ihrer behandelnden

Ärzte führte. Voraussetzung für die Anerkennung eines neuen Prognoseparameters

ist, dass seine Relevanz statistisch einwandfrei ist und in unabhängigen Studien

Reproduzierbarkeit belegt werden kann.

Vom College of American Pathologists wurde 1994 eine Subklassifizierung der rele-

vanten Prognosefaktoren durchgeführt [Hermanek et al]:

Gruppe I: TNM-Klassifikation, Histologischer Typ, Grading, Steroidrezeptoren

Gruppe IIa: Proliferationsmarker (Ki67, MIB-1), Mitose-Index, PRF

Gruppe IIb: p53, c-erbB-2, vaskuläre Invasion, Angiogenese

Gruppe III: weitere Faktoren

Aus der Vielzahl der potentiellen Prognosefaktoren -weit über 100 Parameter wer-

den in der Literatur diskutiert- sollen hier nun einige exemplarisch vorgestellt wer-

den:

o Tumorassozierte Proteolysefaktoren wie der Plasminogenaktivator vom Uro-

kinasetyp (uPA) und sein Inhibitor PAI-1 (Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ

1) sind die einzigen neuen Faktoren, für die alle Kriterien zur Evaluierung

prognostischer Faktoren erfüllt sind [McGuire 1991].

uPA und PAI-1 tragen zur Invasions- und Metastasierungsfähigkeit von Tu-

morzellen bei. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Konzentrationen von

uPA und PAI-1 im Primärtumor mit einem erhöhten Metastasierungsrisiko

und einem kürzeren Gesamtüberleben einhergehen Nodal-nagative Patien-

tinnen mit niedrigem uPA und PAI-1 im Tumor haben eine sehr gute Progno-

1. Einleitung

10

se, so dass eine adjuvante Chemotherapie bei diesen Patientinnen nicht in-

diziert scheint [Harberg et al. 1999, Jänicke et al. 2001]. Die Bestimmung von

uPA und PAI-1 erfolgt auf biochemischem Weg an Tumorfrischmaterial; im-

munhistochemische Verfahren sind wegen offenbar derzeit noch nicht lösba-

rer methodischer Probleme, die sich in einer schlechten Reproduzierbarkeit

niederschlagen, verlassen worden.

o Eine Überexpression des Onkogens HER-2/neu (synonym: c-erbB-2) tritt bei

20-25% aller Patientinnen mit Mammakarzinom auf und ist mit einem ag-

gressiveren Verlauf der Tumorerkrankung korreliert. Retrospektive Analysen

deuten darauf hin, dass eine HER-2/neu-Überexpression mit einer Tamoxi-

fenresistenz einhergeht Eine frühzeitige Bestimmung des HER-2/neu-Status

ist vor allem wertvoll im Hinblick auf eine spätere Therapie mit dem humani-

sierten Antikörper Herceptin (Trastuzumab), der gegen das HER-2/neu-

Onkoprotein gerichtet ist. Er wird derzeit bei metastasierten Mammakarzino-

men eingesetzt. Das mediane Überleben, das Gesamtüberleben, die media-

ne Zeit zur Progression und die Dauer des Ansprechens waren durch die

Kombination von Chemotherapie mit Trastuzumeb im Vergleich zu einer

Chemotherapie allein signifikant verlängert [Slamon et al. 2001]. Auch in der

Monotherapie zeigte Trastuzumab bei vorbehandelten Patientinnen noch ob-

jektive Ansprechraten von 15% in der „Second-“ und „Third-Line“-Therapie

[Cobleigh et al. 1999].

o MIB-1 ist ein monoklonaler Antikörper gegen das Ki-67 Antigen. Das nukleä-

re Antigen Ki-67 wird in allen aktiven Phasen des Zellzyklus exprimiert, somit

werden auch proliferierende Zellen ohne histologisch ersichtliche Kerntei-

lungsfiguren erkannt. In nicht aktiven Zellen hingegen ist Ki-67 nicht nachzu-

weisen [Gerdes et al. 1984,1991]. Eine signifikante Korrelation zwischen dem

Überleben und der Ki-67-Proliferation konnte in verschiedenen Studien ge-

zeigt werden [Pietilainen et al.1996, Querzolin et al. 1996, Sundblad et al.

1996]. Das Überleben nimmt mit Zunahme der Proliferationsfraktion ab.

o Das Tumor-Suppressor-Gen p53 wirkt negativ regulierend auf die Zellprolife-

1. Einleitung

11

ration und spielt insbesondere in der Zelldifferenzierung und dem Zellunter-

gang eine wichtige Rolle [Clarke et al, 1993]. Eine positive Korrelation zwi-

schen p53-Expression; aggressivem Tumorwachstum, negativem Östrogen-

und Progesteronrezeptorstatus und fortgeschrittenem Tumorstadium konnte

gezeigt werden [Bebenek et al. 1998, Radhakrishna Pillai et al. 1998].

o Der immunzytochemische Nachweis disseminierter epithelialer Tumorzellen

im Knochenmark hat als fakultativer Faktor bereits Einzug in die TNM-

Klassifikation gefunden. Nachgewiesen werden Zytokeratinkomponenten, da

sie zum Zytoskelett epithelialer Zellen und davon abstammender Tumorzel-

len gehören und in den Zellen der Hämatopoese nicht exprimiert werden. Pa-

tientinnen mit nachgewiesenen disseminierten Tumorzellen im Knochenmark

haben ein gering erhöhtes relatives Risiko für ein rezidivfreies Überleben

[Funke et al., 1998].

1.5 Problemstellung

Wie schon erläutert, gibt es nur wenige neuere Prognosefaktoren beim Mammakar-

zinom, deren klinischer Nutzen gezeigt werden konnte. Zielsetzung dieser Arbeit

war es, die Expression des Retinoblastomgen-Proteins (Rb) im Hinblick auf seine

prognostische Relevanz an einem gut definierten Patientenkollektiv von Mamma-

karzinomen mit Langzeitverlauf zu untersuchen.

Das Retinoblastom-Gen war das erste Tumorsuppressorgen, welches beim Men-

schen beschrieben wurde. Es liegt auf dem Chromosom 13q14 und kodiert für ein

nukleäres Phosphoprotein (105 kD), das an die DNA bindet und die Zellteilung

hemmt. Das Rb-Protein besitzt verschiedene, funktionell bedeutende Domänen

(Abb. 2.3.1). Die N-terminale Domäne vermittelt die Oligomerisierung von Rb-

Proteinen. Die sog. Rb-Tasche liegt weiter C-terminal. Die Bedeutung der Rb-

1. Einleitung

12

Bindungstasche wird u.a. dadurch deutlich, dass sämtliche in menschlichen Tumo-

ren gefundene Punktmutationen die Bindungstasche betreffen. Mutierte Rb-Proteine

finden sich sowohl in Mamma- als auch z.B. in Blasen-, Prostata- und kleinzelligen

Bronchialkarzinomen.

Das Rb-Gen liegt an einer entscheidenden Schaltstelle, die Proliferation, Differen-

zierung und Apoptose reguliert. Die Tatsache, dass die durch Rb inaktivierten E2F-

Transkriptionsfaktoren in vielen Zellsystemen für den Eintritt in die S-Phase des

Zellzyklus essentiell sind, spricht dafür, dass die Störungen von Rb-Signalwegen

eine wichtige Bedingung für ungeregelte Proliferation von Tumorzellen sind.

Abb. 1.5.1: Domänen und zelluläre Bindungsproteine des Rb-Gens. NLS, nukleäre Lokalisationssequenz; DEADG, Erkennungssequenz für Caspasen (nach Wang, 1997 bzw. Mulligan und Jacks, 1998)

Mit einem monoklonalen Antikörper gegen das Retinoblastomgen-Protein wurde

das Rb-Protein in den untersuchten Fällen immunhistochemisch nachgewiesen.

Die prognostische Validität dieser Untersuchung wurde anhand von Überlebensana-

lysen im Vergleich mit anderen prognostischen Faktoren bestimmt.

13

2. Methoden

2.1 Material / Patientenkollektiv

Für die immunhistochemische Färbung mit dem monoklonalen Antikörper des Reti-

noblastom-Gens dieser retrospektiven Studie wurde Tumormaterial von in der Zeit

von 1988 bis 1990 in das Institut für Pathologie der RWTH Aachen eingesandten

Mammakarzinomen von Patientinnen mit primärem unilateralem Mammakarzinom

ohne vorherige maligne Erkrankung verwendet. Alle Patientinnen wurden nach sei-

nerzeit etablierten stadienorientierten Standardtherapien behandelt. Danach wurde

die betroffene Brustdrüse entweder komplett oder partiell reseziert und eine

Lymphonodektomie durchgeführt, zum Teil gefolgt von adjuvanter Chemotherapie,

Radiotherapie oder anti-östrogener Hormontherapie mit Tamoxifen.

Das Kollektiv bestand ursprünglich aus 125 Fällen, von denen für die hier vorgestell-

te Arbeit nur noch 101 Fälle zur Verfügung standen. Der Grund hierfür war, dass

das in Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete Material des Ursprungskollektivs

auch schon anderen Fragestellungen diente und für eine adäquate Beurteilung in

einigen Fällen kein ausreichendes Tumorgewebe mehr vorhanden war. Von den

untersuchten Tumoren waren 46 als duktal, 15 als lobulär und 22 als Mischformen

bzw. Sonderformen nach der WHO eingestuft.

2.2 Methoden

2.2.1 Stadieneinteilung

Verwendet wurde in dieser Arbeit die gebräuchliche Einteilung der Mammakarzino-

me nach der UICC (UICC, 1987):

2. Methoden

14

Postoperative Tumorgröße (pT)

pT0: kein Anhalt für Primärtumor

pTis: Carcinoma in situ

pT1: Tumorgröße < 2 cm

pT1a: Tumorgröße bis 0,5 cm

pT1b: Tumorgröße bis 1 cm

pT1c: Tumorgröße bis 2 cm

pT2: Tumorgröße von 2 bis 5 cm

pT3: Tumorgröße > 5 cm

pT4: Tumoren jeder Größe mit Haut- oder Thoraxinfiltration

pT4a: Infiltration der Brustwand

pT4b: mit Ödem, Ulzeration oder Satellitenmetastase der Haut

pT4c: Kriterien 4a und 4b gemeinsam

pT4d: inflammatorisches Mammakarzinom

pTx: Primärtumor kann nicht beurteilt werden

Postoperativer Lymphknotenstatus (pN)

pN0: keine Lymphknotenmetastasen

pN1: Metastasen in homolateralen axillären Lymphknoten

pT1a: nur Mikrometastasen bis 0,2 cm

pT1b: Metastase größer als 0,2 cm

pN2: Metastasen in homolateralen axillären Lymphknoten, die untereinander oder

an anderen Strukturen fixiert sind

pN3: Metastasen in supra- oder infraklavikulären Lymphknoten

Fernmetastasierung (M)

M0: kein Anhalt für Fernmetastasierung

M1: Nachweis von Fernmetastasierung

2. Methoden

15

Die drei Einzelgrößen lassen sich als postoperatives TNM-Stadium wie folgt zu-

sammenfassen:

Postoperatives TNM-Stadium (pTNM)

pTNM1: pT1 pN0 M0

pTNM2: pT2-3 pN0 M0 und pT1-2 pN1 M0

pTNM3: pT4 pN0 M0, pT3-4 pN1 M0 und pT1-4 pN2-3 M0

pTNM4: pT1-4 pN0-3 M1

Eine weitere wichtige Stadieneinteilung ist die UICC-Stadieneinteilung unter Ver-

wendung der TNM-Klassifikation:

UICC-Stadieneinteilung

Stadium 0: Tis N0 M0

Stadium I: T1 N0 M0

Stadium IIa: T0 N1 (Mikrometa.) M0

T1 N1 (Mikrometa.) M0

T2 N0 M0

Stadium IIb: T2 N1 M0

T3 N0 M0

Stadium IIIa: T0 N2 M0

T1 N2 M0

T2 N2 M0

T3 N1, N2 M0

Stadium IIIb: T4 jedes N M0

jedes T N3 M0

Stadium IV: jedes T jedes N M1

2. Methoden

16

2.2.2 Malignitätsgradierung

Es wurde die gebräuchliche histomorphologische Gradierung nach Bloom und Ri-

chardson (1957) verwendet. Die Beurteilung erfolgte durch einen Pathologen an

HE-gefärbten Routinepräparaten des jeweiligen Mammakarzinoms. Dabei wurden

definitionsgemäß das histomorphologische Erscheinungsbild (tubuläre Differenzie-

rung), das zytologische Erscheinungsbild (Kernpleomorphie) sowie die mitotische

Aktivität (Häufigkeit der Mitosen) subjektiv beurteilt.

Für jedes der drei Beurteilungsmerkmale werden mit abnehmender Differenzierung

ein bis drei Punkte vergeben, wodurch sich ein Minimalwert von drei und ein Maxi-

malwert von neun ergeben. Daraus ergibt sich als Gradierung:

G1: drei bis fünf Punkte

G2: sechs bis sieben Punkte

G3: acht bis neun Punkte

2.2.3 Biochemischer Östrogen- und Progesteronrezeptorstatus

Die Rezeptorbindungskapazität der Mammakarzinome wurde in der Frauenklinik für

Gynäkologie und Geburtshilfe der RWTH Aachen auf biochemischem Wege mit Hil-

fe eines Radioligandenassays bestimmt. Dazu wurde aus 0,3 g bis 0,5 g schweren,

unfixierten Anteilen der Tumoren das Zytosol gewonnen und mit ³H-markiertem 17-

ß-Östradiol bzw. Progesteron ORG 2058 inkubiert. Die spezifische Rezeptorbin-

dungskapazität ergab sich aus der Differenz zwischen der totalen und der unspezifi-

schen Bindungskapazität. Die maximale Bindungskapazität wurde anhand eines

Scatchard-Plots bestimmt und wurde entsprechend den international anerkannten

Vorgaben ab 10 fmol/mg zytosolischem Protein für den Östrogen- und ab 20

fmol/mg zytosolischem Protein für den Progesteronrezeptor als positiv gewertet.

2. Methoden

17

2.2.4 Immunhistochemische Darstellung des Rb-Proteins

Die im Mittelpunkt dieser Arbeit stehende Untersuchung des Proliferationsverhal-

tens der Mammakarzinome im Zusammenhang mit der Expression des Retinobla-

stomproteins wurde mit Hilfe einer immunhistochemischen Methode vorgenommen.

Hierfür wurde die Avidin-Biotin-Affinitätskonjugatmethode (sog. Drei-Stufen-

Sandwich-Technik) verwendet.

Abb. 2.2.3.1: Schematische Darstellung der immunhistochemischen Färbemethode der Avidin-Biotin-Affinitätskonjugatmethode (aus: Böcker et al., 1997)

Dabei kommt es zu vom Prinzip her zu einer Bindung des Primärantikörpers an das

zelluläre Antigen. An den Primärantikörper bindet im zweiten Schritt der mit Biotin

markierte Sekundärantikörper. Im nächsten Schritt wird das Markermolekül in Form

eines löslichen Peroxidase-Konjugates an den Biotinanteil des Sekundärantikörpers

gebunden, um die Färbung zu verstärken. Zur Sichtbarmachung der Peroxidasebin-

dung erfolgt eine Inkubation mit DAB, wodurch ein wasserunlösliches braunes Pro-

2. Methoden

18

dukt entsteht, dass die Antigen-Antikörper-Komplexe nach einer Gegenfärbung mit

Hämalaun direkt lichtmikroskopisch zu beurteilen erlaubt.

Zur Qualitätssicherung müssen bei jedem Färbegang Negativkontrollen mitgeführt

werden, bei welcher die Behandlung mit dem primären bzw. dem sekundären Anti-

körper unterlassen wird. Sinn dieser Art von Negativkontrolle ist die Detektion un-

spezifischer Bindungen.

2.2.4.1 Erstellen der Präparate

Die verwendeten Reagenzien werden auf Seite 70 im Anhang (Kapitel 6) im Detail

beschrieben.

Herstellung der Paraffinschnitte

Von den in Paraffin eingebetteten Tumorpräparaten wurden 3-4 µm dicke Paraffin-

schnitte aus dem Bereich des größten Tumordurchmessers angefertigt. Diese wur-

den auf silanisierte Objektträger aufgebracht und über Nacht in einem Brutschrank

bei 37 °C aufbewahrt. Vor dem eigentlichen Färbevorgang wurden die Präparate

erneut für eine Stunde bei 60 °C getrocknet. Probleme mit der Haftung der Präpara-

te ließen sich so minimieren.

Entparaffinierung in absteigender Alkoholreihe

Dieser Arbeitsschritt erfolgte durch zweimaliges Einstellen der Präparate in Xylol für

jeweils 5 Minuten, zweimaliges kurzes Einstellen der Präparate in 100% Alkohol,

zweimaliges kurzes Einstellen in 96% Alkohol sowie einmaliges kurzes Eintauchen

in jeweils 70% und 50% Alkohol. Schließlich wurden die Präparate mit destilliertem

Wasser gespült.

2. Methoden

19

Blockierung der endogenen Peroxidase

Über 30 Minuten wurden die Präparate in einem 1%-igen H2O2-Methanol-Gemisch

behandelt, um eine unspezifische Peroxidasereaktion zu verhindern. Schließlich

wurden die Schnitte dreimal in Leitungswasser gespült.

Mikrowellenvorbehandlung der Präparate („antigen retrieval“)

Zur Demaskierung des Antigen wurden die Präparate über dreimal 5 Minuten in ei-

nem Citatpuffer (10mM Tri-Natriumcitrat-Dihydrat, pH 6,0) in der Mikrowelle auf 600

Watt gekocht und nach 15-minütigem Abkühlen kurz in verdünnter TBS-Lösung ge-

spült, deren pH-Wert mit 2N HCl zwischen 7,4-7,6 eingestellt wurde.

Auftragen des primären Antikörpers

Die Schnitte wurden mit PBS-Pufferlösung auf Coverplates aufgespannt. Dann wur-

den die Präparate im Normalserum in einem Verhältnis von 1:10 in 2%-iger Milch-

pulver/ PBS-Lösung 15 Minuten eingestellt. Das Einstellen der Objektträger in die-

ses Reagenz verhindert die unspezifische Bindung des Retinoblastomprotein-

Antikörpers.

Bei dem verwendeten Primärantikörper handelt es sich um einen monoklonalen An-

tikörper (Klon G3-245, DPC Biermann) der Klasse IgG 1, der sich gegen das Epitop

in der Region zwischen den Aminosäuren 300-380 des Retinoblastomgen-Proteins

richtet. Pro Schnitt wurden 100 µl des im Verhältnis 1:10 verdünnten Antikörpers

aufgetragen und für eine Stunde im Brutschrank bei 37 °C inkubiert. Anschließend

wurden die Präparate für 5 Minuten mit 2%-iger Milchpulver/ PBS-Lösung gespült.

Aufragen des sekundären Antikörpers

Als sekundärer Antikörper diente ein biotinylierter Horse-Anti-Mouse-Antikörper. Pro

Schnitt wurden 100 µl des im Verhältnis 1:100 mit 2%-iger Milchpulver/ PBS-Lösung

für 30 Minuten inkubiert. Danach wurden die Präparate mit TBS gespült.

2. Methoden

20

Auftragen der Avidin-Biotin-Lösung

Zur Verstärkung der Reaktion erfolgte die Inkubation mit einer Avidin-Biotin-Lösung.

Beide Komponenten wurden laut Vorschrift jeweils 1:50 verdünnt. Dann wurden die

Schnitte für 30 Minuten im Avidin-Biotin-Peroxidase-Reagenz inkubiert, damit eine

Kopplung der Lösung mit dem biotinyliertem Sekundärantikörper erfolgt. Danach

wurden die Präparate wieder mit TBS gespült.

Entwickeln in DAB und Gegenfärbung

Zur Sichtbarmachung der Peroxidase und damit des Rezeptors erfolgte eine Inku-

bation mit DAB (50 µg DAB in 50 ml 0,05 molarem Tris/HCl-Puffer sowie 50 µl 10%-

iges H2O2) für 5 Minuten. Durch die Reaktion von H2O2 mit DAB entstand ein was-

serunlösliches braunes Produkt. Mit Leitungswasser und destilliertem Wasser wur-

den die DAB-Reste von den Präparaten abgespült. Die Schnitte wurden dann kurz

mit Hämalaun gegengefärbt und mit Leitungswasser gebläut. Es folgte die Behand-

lung in der aufsteigenden Alkoholreihe und anschließendes Einstellen der Präparate

in Xylol. Zum Schluss wurden die Schnitte mit Kanadabalsam eingedeckelt.

2.2.4.2 Beurteilung der Präparate mit dem semiquantitativen Remmele-Score

Die Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Mammakarzinomschnitte wurde

mit Hilfe eines Leitz Orthoplan-Mikroskops bei 400facher Vergrößerung (Objektiv:

40x/0,65, Okular: 10x GW Periplan 18, Gesichtsfeldfläche 0,159 mm²) durchgeführt.

Als Bewertungsgrundlage für die semiquantitative Auswertung des immunhistoche-

mischen Nachweises von dem Retinoblastomgen-Protein diente der auch in ande-

ren Publikationen angewandte Immunreaktive Score (IRS) [Gohring et al., 1996,

Beckmann et al., 1996]. Diese Bewertungsgrundlage für die Rb-Expression erfolgte

in Anlehnung an den für die Beurteilung immunhistochemisch dargestellter Östro-

gen- bzw. Progesteronrezeptoren auch in der Krankenversorgung üblichen IRS, den

sogenannten Remmele-Score (Remmele und Stegner 1987).

2. Methoden

21

Die eine Komponente des IRS ist der geschätzte Prozentsatz immunreaktiver Zellen

(Rb-PP):

Rb-PP-Einteilung:

0 = keine positiven Zellen

1 = < 10% positive Zellen

2 = 10-50% positive Zellen

3 = 51-80% positive Zellen

4 = > 80% positive Zellen

Darüber hinaus wurde die Färbeintensität bestimmt (SI = Staining Intensity):

Rb-SI-Einteilung:

0 = keine Färbereaktion

1 = schwache Färbereaktion

2 = mäßige Färbereaktion

3 = starke Färbereaktion

Der immunreaktive Score (Rb-IRS) errechnet sich aus dem Produkt von Rb-PP und

Rb-SI und kann somit die Werte 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9 oder 12 annehmen. Ein fester

Schwellenwert für Positivität des Rb-IRS ist in der Literatur nicht definiert; statt des-

sen wurden in der Überlebensanalyse (s.u.) verschiedene Schwellenwerte erprobt.

2.2.5 Statistische Auswertung der Ergebnisse

Die statistischen Untersuchungen wurden mit dem Programmpaket BMDP (Unter-

programme 1D, 1L, 2D, 2L, 4F) des Department of Biomathematics (BMDP) der

University of California, Statistical Software Inc., Los Angeles, USA (Dixon 1981)

vorgenommen.

2. Methoden

22

An biometrischen Grunddaten standen alle Parameter der deskriptiven Statistik, d.h. Modalwert, Median, Mittelwert, Minimal- und Maximalwert, Varianz, Standardabwei-chung und Variationskoeffizient sowie Angaben zu allen gewünschten Perzentilen zur Verfügung. (BMDP 1D, BMDP 2D).

Beziehungen zwischen kategorisierten Parametern wurden in Mehr-Felder-Tafeln

dargestellt mittels des Pearson Chi2-Test (BMDP 4F) bzw. des Spearman-Rang-

Korrelationstests (BMDP 3S) auf statistische Signifikanz getestet.

Univariate Überlebensanalysen erfolgten unter Berechnung von Kaplan-Meier-

Überlebenskurven (Kaplan und Meier 1958), die mit dem Wilcoxon-Breslow-Test auf

statistische Signifikanz überprüft wurden (BMDP 1L) (Breslow 1970). Angeschlos-

sen wurden multivariate Überlebensanalysen mit Cox-Modellen (Cox 1972) im "for-

ward stepping"-Modus (BMDP 2L), deren Ergebnisse wiederum mithilfe von Kaplan-

Meier-Kurven in einem selbst entwickelten Verfahren validiert wurden.

Statistische Signifikanz wurde jeweils für ein a-Niveau von = 0,05 (Cox-Modelle: =

0,10) angenommen, entsprechend einer Irrtumswahrscheinlichkeit von = 5%

(=10%), die Nullhypothese fälschlich zu verwerfen.

Wegen der in dieser Studie vorliegenden multiplen Testproblematik, welche immer

dann auftritt, wenn anhand eines Kollektivs mehrere statistische Tests bezüglich

verschiedener Zielparameter durchgeführt werden, wurde die statistische Auswer-

tung explorativ angesetzt. Um die als signifikant nachgewiesenen Thesen von dem

hier vorliegenden Kollektiv auf die Grundgesamtheit zu verallgemeinern, sind daher

weitere Studien notwendig.

23

3. Ergebnisse

3.1 Allgemeine Daten

Alter der Patientinnen

Das Alter der 101 Patientinnen betrug bei der Diagnosestellung 58,9 ± 14,4 Jahre. Die jüngste Patientin war 32 und die älteste 95 Jahre. Die Altersverteilung wird in Tabelle 3.1.1 und Abbildung 3.1.1 dargestellt. Tabelle 3.1.1: Altersverteilung des Patientenkollektivs

Alter bis 40 bis 50 bis 60 bis 70 bis 80 > 80

Anzahl 11 11 35 21 12 11

0

5

10

15

20

25

30

35

40

bis 40 bis 50 bis 60 bis 70 bis 80 über 80

Alter

abso

lute

Häu

fig

keit

Abbildung 3.1.1: Altersverteilung des Patientenkollektivs

3. Ergebnisse

24

Menopausenstatus Der Menopausenstatus ist eingeteilt in normal, prä- und postmenopausal und Seni-um: Normal: 18 Fälle Prämenopausal: 8 Fälle Postmenopausal: 28 Fälle Senium: 47 Fälle Histologie Die 101 Fälle sind nach den WHO-Richtlinien in folgende histologische Gruppen eingeteilt: Duktale Karzinome: 64 Fälle Lobuläre Karzinome: 15 Fälle Sonderformen: 22 Fälle

3.2 Univariate Überlebensanalyse

Im Folgenden sind die Überlebensdaten der Patientinnen für die einzelnen Parame-

ter zum einen in der Form von Mehr-Felder-Tafeln dargestellt. Hierbei werden die

medianen Überlebenszeiten der verschiedenen Gruppen innerhalb des jeweiligen

Parameters miteinander verglichen und auf ihre Signifikanz hin untersucht. Zum

anderen sind die Überlebensdaten der Frauen für die einzelnen Parameter mit Hilfe

von Kaplan-Meier-Kurven analysiert. Hierbei werden unterschiedliche Patienten-

gruppen und deren Überleben in Absterbekurven dargestellt.

Die graphische Darstellung veranschaulicht die statistische Aussage über den pro-

gnostischen Wert der einzelnen Parameter in Bezug auf das Gesamtüberleben be-

ziehungsweise die 5- und 10-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit.

3. Ergebnisse

25

3.2.1 Gesamtüberleben

Insgesamt konnten die Überlebensdaten aller 101 Patientinnen ermittelt werden.

Danach lebten gegen Ende des Beobachtungszeitraumes noch 53 Patientinnen

(mittlere Beobachtungsdauer: 10,6 ± 1,0 Jahre), 45 waren nach 3,9 ± 2,8 Jahren

gestorben. Die Überlebensdaten von drei Patientinnen waren nach 6,2 ± 1,0 Jahren

nicht weiter zu ermitteln gewesen. Die 5-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit lag

bei 65,4 %, die für 10 Jahre bei 48,8 %. Das mediane Überleben betrug 9,2 Jahre.

Abbildung 3.2.1: Gesamtüberleben der 101 Patientinnen

3. Ergebnisse

26

3.2.2 Beziehung zwischen Gesamtüberleben und Staging

Die Tabellen bzw. Abbildungen 3.2.2.1 bis 3.2.2.4 zeigen den Einfluss der einzelnen

Staging-Parameter auf das Überleben.

Tabelle 3.2.2.1: Überleben in Beziehung zur Tumorgröße (pT) (p = 0,0398)

pT 1 2 3 4

Anzahl der Patienten 16 61 17 7

verstorbene Patienten 5 33 10 5

mittl. Überleben (Jahre) 9,6 7,7 6,2 4,4

5-Jahres-ÜLW (%) 87,5 68,9 47,1 28,6

10-Jahres-ÜLW (%) 68,2 48,0 41,2 28,6

Abbildung 3.2.2.1: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur Tumorgröße (pT)

3. Ergebnisse

27

Tabelle 3.2.2.2: Überleben in Beziehung zum Lymphknotenstatus (pN) (p = 0,0005)

pN 0 1

Anzahl der Patienten 49 51

verstorbene Patienten 17 35

mittl. Überleben (Jahre) 9,2 6,0

5-Jahres-ÜLW (%) 79,6 51,0

10-Jahres-ÜLW (%) 68,9 30,5

Abbildung 3.2.2.2: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier für den Lymphknotenstatus (pN)

3. Ergebnisse

28

Tabelle 3.2.2.3: Überleben in Beziehung zur Fernmetastasierung (M) (p = 0,0013)

M 0 1




5-Jahres-ÜLW (%) 68,5 25,0

10-Jahres-ÜLW (%) 52,7 0,0

Abbildung 3.2.2.3: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur Fernmetastasierung (M)

3. Ergebnisse

29

Tabelle 3.2.2.4: Überleben in Beziehung zum Staging (pTNM) (p = 0,0002)

pTNM 1 2 3 4




5-Jahres-ÜLW (%) 100,0 69,1 38,5 25,0

10-Jahres-ÜLW (%) 90,9 50,6 30,8 0,0

Abbildung 3.2.2.4: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zum Staging (pTNM)

3. Ergebnisse

30

Abschließend lässt sich feststellen, dass die drei Komponenten des TNM-Systems

(pT, pN und M) sowie auch das zusammengefasste TNM-Stadium statistisch signifi-

kante Aussagen zum Überleben der Patientinnen ermöglichen.

Die größte praktische Relevanz kommt dabei dem Lymphknotenstatus zu; Patien-

tinnen ohne Lymphknotenmetastasen verfügen über eine wesentlich bessere Pro-

gnose als Patientinnen, die bereits bei Diagnosestellung eine axilläre Metastasie-

rung aufweisen.

3.2.3 Beziehung zwischen Überleben und Grading

Neben dem Staging soll auch auf das Grading als weiteren wichtigen Prognosefak-

tor des Mammakarzinoms eingegangen werden.

Die Kriterien sind tubuläre Differenzierung, Kernpleomorphie und Mitoseaktivität,

und werden in den Tabellen 3.2.3.1 bis 3.2.3.3 dargestellt. Daraus ergibt sich das

Grading, welches der Tabelle 3.2.3.4 zu entnehmen ist. Die Überlebenskurven sind

in den Abbildungen 3.2.3.1 bis 3.2.3.4 wiedergegeben.

Die histomorphologische Gradierung korreliert deutlich mit den Überlebensdaten. Es

lassen sich unterschiedliche Patientengruppen bilden, deren Überleben signifikant

mit zunehmender Entdifferenzierung abnimmt. Der Effekt tritt allerdings zwischen

G1- und G2-Fällen erst relativ spät ein.

Auch mit der Mitoserate lassen sich statistisch signifikante Ergebnisse erzielen. Bei

den Einzelkomponenten tubuläre Differenzierung und Kernpleomorphie ist die Kor-

relation nicht signifikant. Bei zunehmender Kernpleomorphie (KP2 vs. KP3) ist aller-

dings graphisch ein Überlebensunterschied zu erkennen.

3. Ergebnisse

31

Tabelle 3.2.3.1: Überleben in Beziehung zur tubulären Differenzierung (TD) (p =

0,1319)

TD 1 2 3

Anzahl der Patienten 4 27 58

verstorbene Patienten 0 13 35

mittl. Überleben (Jahre) 11,8 7,9 6,9

5-Jahres-ÜLW (%) 100,0 70,4 56,9

10-Jahres-ÜLW (%) 100,0 55,3 40,7

Abbildung 3.2.3.1: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur tubulären Differenzie-

rung (TD)

3. Ergebnisse

32

Tabelle 3.2.3.2: Überleben in Beziehung zur Kernpleomorphie (KP) (p = 0,0609)

KP 1 2 3




5-Jahres-ÜLW (%) 71,4 77,8 55,8

10-Jahres-ÜLW (%) 71,4 57,7 41,5

Abbildung 3.2.3.2: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur Kernpleomorphie (KP)

3. Ergebnisse

33

Tabelle 3.2.3.3: Überleben in Beziehung zur Mitoserate (MIT) (p = 0,0030)

MIT 1 2 3




5-Jahres-ÜLW (%) 77,3 63,6 35,3

10-Jahres-ÜLW (%) 65,5 38,7 26,5

Abbildung 3.2.3.3: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur Mitoserate

3. Ergebnisse

34

Tabelle 3.2.3.4: Überleben in der Beziehung zu der Gradierung (Grad) (p = 0,0028)

Grad 1 2 3




5-Jahres-ÜLW (%) 76,5 73,9 48,7

10-Jahres-ÜLW (%) 70,6 55,9 31,5

Abbildung 3.2.3.4: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur Gradierung (Grad)

3. Ergebnisse

35

3.2.4 Beziehung zwischen Überleben und dem Hormonrezeptorstatus

Die Tabellen bzw. Abbildungen 3.2.4.1 und 3.2.4.2 zeigen den Einfluss der beiden

Hormonrezeptorexpressionen auf das Überleben.

Tabelle 3.2.4.1: Überleben in Beziehung zum Östrogenrezeptorstatus (ER) (p = 0,2871)

ER 0 1




5-Jahres-ÜLW (%) 56,0 68,4

10-Jahres-ÜLW (%) 47,7 49,1

Abbildung 3.2.4.1: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zum Östrogenrezeptor (ER)

3. Ergebnisse

36

Tabelle 3.2.4.2: Überleben in Beziehung zum Progesteronrezeptorstatus (PR) (p = 0,0378)

PR 0 1




5-Jahres-ÜLW (%) 54,2 75,5

10-Jahres-ÜLW (%) 43,5 53,5

Abbildung 3.2.4.2: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zum Progesteronrezeptor (PR)

3. Ergebnisse

37

Zusammenfassend zeigt sich bei beiden Hormonrezeptoren ein gewisser Effekt auf

das Überleben, welcher aber nur beim Progesteronrezeptor über die gesamte Be-

obachtungsdauer erhalten bleibt. Der Überlebensvorteil für ER-positive Patientinnen

hingegen ist nur innerhalb der ersten ca. fünf Jahre nach Diagnosestellung nach-

weisbar.

3.2.5 Beziehung zwischen dem Überleben und der immunhistochemischen Analyse des Retinoblastomgen-Proteins (Rb)

In der univariaten Kaplan-Meier-Überlebensstatistik wurde die klinische Relevanz

der immunhistochemischen Analyse der Retinoblastomgen-Proteinexpression un-

tersucht, und zwar sowohl für die Einzelkomponenten (RbPP, RbSI), als auch für

den analog nach dem Remmele-Score gebildeten immunreaktiven Score (RbIRS).

Die Tabellen 3.2.5.1 bis 3.2.5.3 zeigen die Beziehung zwischen dem Überleben und

den drei Parametern, in den Abbildungen 3.2.5.1 bis 3.2.5.3 sind die entsprechen-

den Kaplan-Meier-Überlebenskurven dargestellt.

Für das Gesamtüberleben bestand keine statistische Signifikanz (p > 0,05) in Bezug

auf die untersuchten Parameter. Es zeigt sich jedoch die Tendenz, dass bei einem

Prozentsatz von mehr als 50% positiven Zellen (RbPP 3-4) die 5- und 10-Jahres-

Überlebenswahrscheinlichkeit deutlich abnimmt.

Bei Betrachtung der Faktoren Färbeintensität und IRS lassen sich keine Tendenzen

in Bezug auf das Überleben erkennen.

3. Ergebnisse

38

Tabelle 3.2.5.1: Überleben in Beziehung zum Prozentsatz Rb-positiver Zellen (RbPP) (p = 0,1971)

RbPP 0 - 1 2 3 - 4




5-Jahres-ÜLW (%) 63,2 75,8 45,5

10-Jahres-ÜLW (%) 48,2 57,1 27,3

Abbildung 3.2.5.1: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zum Prozentsatz Rb-positiver Zellen (RbPP)

3. Ergebnisse

39

Tabelle 3.2.5.2: Überleben in Beziehung zur Rb-Färbeintensität (RbSI) (p = 0,8765)

RbSI 1 2 3




5-Jahres-ÜLW (%) 63,4 70,4 56,0

10-Jahres-ÜLW (%) 52,2 47,8 48,0

Abbildung 3.2.5.2: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur Rb-Färbeintensität (RbSI)

3. Ergebnisse

40

Tabelle 3.2.5.3: Überleben in Beziehung zum immunreaktiven Score (RbIRS) (p =

0,9726)

RbIRS IRS 0-1 IRS 2-3 IRS > 3




5-Jahres-ÜLW (%) 60,0 66,7 66,7

10-Jahres-ÜLW (%) 46,8 51,3 47,3

Abbildung 3.2.5.3: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zum immunreaktiven Score (RbIRS)

3. Ergebnisse

41

3.3 Multivariate Analyse: Cox-Modell

Mit Hilfe des Cox-Modells werden die einzelnen klinisch relevanten Parameter (Sta-

ging, Grading, Hormonrezeptorstatus) und die Komponenten der immunhistochemi-

schen Analyse des Retinoblastomgen-Proteins (Prozentsatz positiver Zellen, Färbe-

intensität, immunreaktiver Score) in Bezug auf ihre prognostischen Fähigkeiten und

ihre Unabhängigkeit voneinander untersucht. Dabei werden nur die Parameter mit

zueinander unabhängiger prognostischer Relevanz aufgenommen.

Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen (Tab.3.3.1 bis 3.3.5) schrittweise

dargestellt. Vor Schritt 1 (Tab. 3.3.1) kamen in erster Linie dem Lymphknotenstatus

(p = 0,0003) und dem Grading (p = 0,0014) hohe univariate Relevanz zu.

Tab.3.3.1: Multivariates Cox-Modell unter Einbeziehung der klinischen Parameter, des Hormonrezeptorstatus und der Rb-basierten Parameter; n = 100. Ausgangssituation vor Schritt 1.

Variable Chi² enter Chi² remove p-Wert

pN 12,99 0,0003

Grad 10,25 0,0014

pT 6,43 0,0112

PR 3,35 0,0672

RbIRS 0,56 0,4544

RbPP 0,34 0,5625

ER 0,21 0,6439

RbSI 0,19 0,6637

Als relevanteste Größe wurde zunächst in Schritt 1 der Lymphknotenstatus in das

Cox-Modell aufgenommen (Tab. 3.3.2). Danach verfügte der PR-Status (p = 0,0128)

über die höchste verbliebene univariate Relevanz, die etwas höher war als die der

Gradierung (p = 0,0138).

3. Ergebnisse

42

Tab.3.3.2: Multivariates Cox-Modell unter Einbeziehung der klinischen Parameter, des Hormonrezeptorstatus und der Rb-basierten Parameter; n = 100. Schritt 1.


pN 12,99 0,0003

PR 6,20 0,0128

Grad 6,06 0,0138

pT 3,00 0,0834

ER 1,44 0,2294

RbIRS 0,17 0,6769

RbPP 0,09 0,7623

RbSI 0,01 0,9345

Im Schritt 2 wurde entsprechend der PR-Status aufgenommen (Tab. 3.3.3). Darüber

hinaus kamen nun noch pT (p = 0,0282) und der Gradierung (p = 0,0307) eine

verbleibende univariate prognostische Relevanz zu. Sie wurden in den Schritten 3

und 4 im Cox-Modell berücksichtigt (Tab. 3.3.4 und 3.3.5).



pN 15,84 0,0001

PR 6,20 0,0128

pT 4,82 0,0282

Grad 4,67 0,0307

RbIRS 0,44 0,5065

RbPP 0,20 0,6538

RbSI 0,13 0,7179

ER 0,00 0,9486

3. Ergebnisse

43



pN 12,54 0,0004

PR 8,02 0,0046

pT 4,82 0,0282

Grad 3,53 0,0604

RbIRS 0,80 0,3710

RbPP 0,61 0,4351

RbSI 0,05 0,8229

ER 0,01 0,9310

Tab.3.3.5: Multivariates Cox-Modell unter Einbeziehung der klinischen Parameter, des Hormonrezeptorstatus und der Rb-basierten Parameter; n = 100. Endsituation nach Schritt 4.


pN 9,01 0,0027

PR 6,20 0,0128

pT 3,68 0,0552

Grad 3,53 0,0604

RbPP 0,77 0,3802

RbIRS 0,68 0,4111

ER 0,10 0,7501

RbSI 0,03 0,8721

Danach verfügte kein weiterer Parameter über eine ausreichende univariate pro-

gnostische Relevanz (p > 0,10), um in das Cox-Modell aufgenommen werden zu

können.

In Tab. 3.3.6 sind die statistischen Kenndaten in der Entwicklung des Cox-Modells

dargestellt. Sie demonstrieren über den Anstieg der Chi²-Werte für das global Chi²

von 13,07 auf 27,79 die Relevanz der Modell-Ergebnisse.

3. Ergebnisse

44

Tab.3.3.6: Multivariates Cox-Modell unter Einbeziehung der klinischen Parameter, des Hormonrezeptorstatus und der Rb-basierten Parameter. Übersicht über die Entwicklung der statistischen Kenngrößen von Schritt zu Schritt.

Schritt Improvement Chi² p-Wert Global Chi² p-Wert

1 (pN) 12,99 < 0,001 13,07 < 0,001

2 (PR) 6,20 0,013 19,16 < 0,001

3 (pT) 4,82 0,028 24,09 < 0,001

4 (Grad) 3,53 0,060 27,79 < 0,001

Zur Validierung des Cox-Modells am konkret zugrundeliegenden Datensatz kom-

men zwei Methoden in Betracht, die hier kombiniert angewendet wurden. Da die

beiden zuerst aufgenommenen Größen (pN, PR) jeweils in nur zwei Ausprägungen

vorliegen, bot sich an, sie in ihren vier Kombinationsmöglichkeiten pN0/PR+,

pN0/PR-, pN1/PR+ und pN1/PR- in einer gemeinsamen Kaplan-Meier-Kurve darzu-

stellen. Hierbei ergab sich eine relativ gleichmäßigen Verteilung der Patientinnen

auf die vier Gruppen (Tab. 3.3.7, Abb. 3.3.1)

Tab. 3.3.7: Überleben in Beziehung zum Lymphknotenstatus unter Berücksichtigung des Progesteronrezeptorstatus. N0: p = 0,7081, N1: p = 0,0016

N0/PR- N0/PR+ N1/PR- N1/PR+




5-Jahres-ÜLW (%) 72,0 87,5 34,8 64,3

10-Jahres-ÜLW (%) 72,0 74,8 17,4 53,1

3. Ergebnisse

45

Abb. 3.3.1: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur kombinierten Darstellung des

Lymphknotenstatus und des Progesteronrezeptorstatus

Der Verlauf der Kaplan-Meier-Kurven in Abbildung 3.3.1 veranschaulicht deutlich

die schlechtere Prognose von Patientinnen mit PR-negativen Tumoren, die bei posi-

tivem Lymphknotenbefund (N1, p = 0,0016) allerdings stärker ausgeprägt ist als bei

negativem (N0, p > 0,05).

Die Hinzunahme von pT (4 Ausprägungen) oder des Gradings (3 Ausprägungen) ist

auf die gleiche Weise nicht möglich, da hier 16 bzw. 48 Patientengruppen entstün-

den, die sich statistisch nicht mehr auswerten ließen. Daher wurde als Alternative

ein multivariater Parameter („MP“) entwickelt, der unter Zugrundelegung der im

Cox-Modell ermittelten Koeffizienten der einzelnen Parameter diese in eine additive

3. Ergebnisse

46

mathematische Beziehung setzt. Prinzipiell ist dieses Verfahren für jeden beliebigen

Schritt des Cox-Modells durchführbar, wird hier aber nur für das Endergebnis nach

Schritt 4 im Vergleich zum stärksten Einzelparameter, dem Lymphknotenstatus,

vorgestellt.

Nach Schritt 4 lauten die Koeffizienten für pN 0,91, für PR -0,72, für pT 0,35 und für

den Grad 0,42. Der multivariate Parameter MP ist entsprechend definiert als

MP = 0,91 * pN – 0,72 * PR + 0,35 * pT + 0,42 * Grad.

Auf diese Weise wurde jeder Patientin eine neue Maßzahl zugeordnet. Anhand der

Datenverteilung des MP wurden zwei Gruppen im Verhältnis 49:51, d.h. angepasst

an die Verteilung des Lymphknotenstatus, gebildet. In die Gruppe MP0 fallen die 49

Patientinnen mit den niedrigeren MP-Werten, in die Gruppe MP1 die 51 Patientin-

nen mit den höheren MP-Werten. Die entsprechende Tabelle 3.3.8 und die Abbil-

dung 3.3.2 geben Aufschluß über Datenverteilung und Überlebenskurven.

Tab. 3.3.8: Überleben in Beziehung zum Lymphknotenstatus (Chi² = 12,25, p = 0,0005) bzw. zu MP (Chi² = 25,35, p < 0,0001)

Parameter N0 N1 MP0 MP1




5-Jahres-ÜLW (%) 79,6 51,0 86,3 42,9

10-Jahres-ÜLW (%) 68,9 30,5 69,6 28,4

3. Ergebnisse

47

Abb. 3.3.2: Überlebenskurve nach Kaplan-Meier zur kombinierten Darstellung des Lymphknotenstatus N0 und des multivariaten Parameters MP; schraf-fiert: N, durchgezogen: MP

Die Validierung des Cox-Modells nach Schritt 4 läßt nicht nur in Tabelle 3.3.8 höhe-

re 5- bzw. 10-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeiten und längeres mittleres Über-

leben für MP0 gegenüber N0 und für MP1 gegenüber N1 erkennen, sondern auch in

Abbildung 3.3.2 stärker auseinander weichende Überlebenskurven zwischen den

jeweils verglichenen Gruppen N0/MP0 und N1/MP1. Andererseits zeigt sich, dass

der Lymphknotenstatus insgesamt ein so starker Parameter ist, dass sich hier keine

entscheidenden Unterschiede im Überlebensverhalten der Patientengruppen ablei-

ten lassen. Wichtiger dürfte die Aussage aus Tab. 3.3.7 und Abb. 3.3.1 sein, dass in

der Gruppe der N1-Patientinnen der PR-Status eine statistisch signifikante Auftren-

nung in zwei Gruppen unterschiedlichen Überlebens möglich ist (p = 0, 0016,).

3. Ergebnisse

48

3.4 Korrelationen Rb-bezogener Parameter untereinander und mit klinisch-morphologischen Parametern

Abschließend soll die Beziehung von Rb-bezogenen Größen untereinander und mit

den übrigen prognostisch überprüften Parametern dargestellt werden.

3.4.1 Korrelation zwischen RbPP und RbSI

Eine eventuelle Korrelation zwischen RbPP und RbSI wurde in Mehr-Felder-Tafeln

mit verschiedenen Grenzziehungen für die beiden Parameter untersucht. Dabei ließ

sich im Pearson Chi²-Test stets eine signifikante Beziehung nachweisen. Exempla-

risch zeigt dies Tabelle 3.4.1.1 für den Fall, daß jeweils die Ausprägungen 0 und 1

sowie für RbPP auch die Ausprägungen 3 und 4 in einer Gruppe zusammengefaßt

sind (p < 0,0001).

Korrelationen zwischen RbPP oder RbSI mit dem immunreaktiven Score (RbIRS)

wurden nicht berücksichtigt, da der RbIRS aufgrund seiner Definition (RbPP * RbSI)

eine von vornherein abhängige Größe und keine Grundgröße darstellt.

Tab. 3.4.1.1: Beziehung zwischen dem Prozentsatz positiver Zellen (RbPP) und der

Färbeintensität (RbSI); p < 0,0001

RbSI

RbPP

0 und 1 2 3 total

0 und 1 20 33 4 57

2 2 20 11 33

3 und 4 0 1 10 11

Total 22 54 25 101

3. Ergebnisse

49

3.4.2 Korrelation zwischen Rb-Parametern und klinisch-morphologischen Pa-rametern

Nachdem (s.o.) zwischen RbPP und RbSI eine enge statistische Beziehung besteht,

werden im folgenden nur noch exemplarische Korrelationen von RbPP mit klinisch-

morphologischen Parametern dargestellt; für RbSI ergab sich stets ein annähernd

analoges Resultat.

Ein Zusammenhang zwischen RbPP und dem TNM-Stadium (Tab. 3.4.2.1) und sei-

nen Komponenten pT, pN und M lag nicht vor (p > 0,05); mit dem Grading war hin-

gegen eine statistisch signifikante Korrelation gegeben (Tab. 3.4.2.2, p = 0,0275).

Tab.3.4.2.1: Beziehung zwischen RbPP und dem TNM-Stadium (p > 0,05)

pTNM RbPP

1 2 3 4 Total

0 und 1 5 35 9 7 56

2 6 24 2 1 33

3 und 4 0 9 2 0 11

Total 11 68 13 8 100

Tab. 3.4.2.2: Beziehung zwischen RbPP und dem Grading (p = 0,0275)

Grad

RbPP

1 2 3 total

0 und 1 8 26 22 66

2 7 19 7 33

3 und 4 2 1 8 11

Total 17 46 37 100

3. Ergebnisse

50

Eine signifikante Beziehung fand sich darüber hinaus auch zwischen RbPP und der

Mitoseaktivität (p = 0,0117).

Zum Östrogen- bzw. Progesteronrezeptorstatus bestand hingegen keine signifikante

Korrelation (Tab. 3.4.2.3 und 3.4.2.4; p > 0.05).

Tab. 3.4.2.3: Beziehung zwischen RbPP und dem ER-Status (p > 0,05)

ER-Status

RbPP

negativ positiv total

0 und 1 14 43 57

2 6 27 33

3 und 4 5 6 11

Total 25 76 101

Tab. 3.4.2.4: Beziehung zwischen RbPP und dem PR-Status (p < 0,05)

PR-Status

RbPP

negativ positiv total

0 und 1 27 30 57

2 16 17 33

3 und 4 5 6 11

total 48 53 101

51

4. Diskussion

Die Entscheidung zur systemischen adjuvanten Therapie des primären Mammakar-

zinoms wird immer noch obligat anhand der Prognosefaktoren mit gesicherter klini-

scher Relevanz wie Tumorgröße, Lymphknotenstatus, histologischem Tumortyp,

Differenzierungsgrad, Hormonrezeptorstatus und Alter der Patientin gefällt [Empfeh-

lungen für die adjuvante Therapie, St.Gallen / Schweiz 2001]. Das Mammakarzinom

ist aber eine Erkrankung, bei der es wegen der vielen verschiedenen Untergruppen

und der unterschiedlichen Therapieansätze besonders wichtig ist, für die betroffene

Patientin ein individuelles Risikoprofil zu entwickeln. Ziel dabei ist, für jede Frau das

richtige Therapieregime zu erkennen und damit eine Unterversorgung oder eine

ungerechtfertigt übermäßig toxische Therapie zu vermeiden. Deswegen ist es sinn-

voll, zu den etablierten bzw. ohnehin bei der routinemäßigen Aufarbeitung des Tu-

mormaterials anfallenden Größen weitere zu erproben, von denen man sich even-

tuelle neue Aufschlüsse versprechen kann.

Entsprechend ist in der vorliegenden Studie retrospektiv die Expression des Retino-

blastomgenprodukts als potentieller Prognosefaktor hinsichtlich seiner prognosti-

schen Relevanz untersucht worden. Die mit dieser Anwendung erzielten Ergebnisse

sollen im folgenden mit vorhandenen Konzepten aus der Literatur in Beziehung ge-

setzt werden, wobei zunächst auf die derzeit allgemein anerkannten Parameter ein-

gegangen werden soll.

4. Diskussion

52

4.1 Anerkannte Prognosefaktoren

Zu den anerkannten Prognoseparametern gehören insbesondere das TNM-

Stadium, die histologische Gradierung, der Hormonrezeptor- und der Menopausen-

status auf deren Ergebnisse sich im Routinefall die primäre Therapiewahl für die

betroffene Patientin stützt.

Tumorstadium

Die prognostischen Fähigkeiten der Stadieneinteilung nach der TNM-Klassifikation

[UICC,1997] wurden schon in vielen klinischen Studien mit hohen Fallzahlen be-

schrieben [Railo et al. 1993 (n = 327), Niezabitowski et al. 1995 (n = 108), Sundblad

et al. 1996 (n = 238), Eissa et al. 1997 (n = 100), Fernandez-Acenero et al. 1997 (n

= 112), Gago et al. 1998 (n = 205), Mehta et al. 1998 (n = 79), Raabe et al. 1998 (n

= 1335), Narita et al. 1998 (n = 100)].

Die Primärgröße des Tumors korreliert mit dem axillären Lymphknotenbefall. Bei

Patientinnen mit nodal negativen Karzinomen ist die Größe des Primärtumors der

wichtigste prognostische Faktor, während bei nodal positiven Patientinnen der axil-

läre Lymphknotenbefall im Vordergrund steht. Bei einem No-Status und einer Tu-

morgröße unter 1 cm beträgt die 5-Jahresüberlebensrate ca. 95%, sie sinkt auf 75%

für den T2-Tumor der Größe 2-5 cm und nur noch 60% bei einer Tumorgröße >5 cm

[Donegan et al.1980]. Die Bedeutung der TNM-Klassifizierung zeigt sich auch in

einer Untersuchung von Ravaioli [2000], welche den primären Metastasennachweis

in Relation zu den Risikogruppen (UICC-Stadieneinteilung des Mammakarzinoms

unter Verwendung der TNM-Klassifizierung, s. Kapitel 1.3) untersuchte. In der Risi-

kogruppe I fanden sich bei 0,9% der Patientinnen Metastasen, in Gruppe II bei 2,9%

und in Risikogruppe III bei 15,5% Metastasen.

Auch in dieser Arbeit konnte mit der Literatur übereinstimmend eine deutliche Korre-

4. Diskussion

53

lation des TNM-Stadiums mit den Überlebenszeiten der Patientinnen nachgewiesen

werden (p = 0,0002). Ferner hatten die Einzelfaktoren einen signifikanten Einfluß

auf das Überleben. Besonders der Lymphknotenstatus (p = 0,0002), aber auch die

Tumorgröße (p = 0,0398) bestätigten sich, wie in den zitierten Literaturdaten, als

sinnvolle Prognosefaktoren [Balslev et al. 1994, Biesterfeld 1988, Clark et al. 1983,

Layfield et al.1996, Lethaby et al. 1996, Gasparini et al. 1994, Pierga et al. 1996,

Baak et al.1985, Railo et al 1993, Alexieva-Figusch et al. 1988].

Gradierung

Als weiterer, anerkannter Prognoseparameter wird das histomorphologische Gra-

ding nach Bloom und Richardson (1957) verwendet. Es soll die Wachstumsge-

schwindigkeit oder maligne Potenz des Tumors wiedergeben. Dazu werden die hi-

stologische und zytologische Ähnlichkeit des Tumorgewebes zu dem gesunden

Gewebe und die mitotische Aktivität beurteilt. Auch wenn die eingeschränkte Re-

produzierbarkeit von 60 bis 70% aufgrund der subjektiven Beurteilung bemängelt

wurde

[Cutler et al. 1966, Champion und Wallace 1971, Le Doussal et al. 1989, Stenkvist

et al. 1983], konnte eine signifikante Korrelation mit der Prognose in vielen großen

Studien bestätigt werden [Bloom et Richardson 1957 (n = 1409), Tomasino et al.

1993 (n = 71), Gasparini et al. 1994 (n = 195), Russo et al. 1994 (n = 71), Schön-

born et al. 1995 (n = 216), Sundblad et al. 1996 (n = 238), Genestie et al. 1998 (n =

825), Hendson et al. 1991 (n = 22616), Lethaby et al. 1996 (n = 370)]. In den 90er

Jahren wurde das dreistufige Grading von Bloom und Richardson durch Arbeiten

von Elston und Ellis [1991,1993] erweitert, so daß Tubulusbildung, Kernpolymorphie

und auch die Mitoseanzahl in einem Scorewert von jeweils 1-3 mit eingeht. Es er-

gibt sich daraus ein Score von 3 bis 9 (G1= 3-5, G2= 6-7, G3= 8-9). Außerdem for-

dern Elston und Ellis eine doppelte Prüfung, am besten durch zwei unabhängige

Pathologen. Ferner bedarf es auch genau festgelegt Kriterien für unterschiedliche

Mikroskope.

4. Diskussion

54

Vorteil des Grading ist, daß es keinen methodischen Aufwand, sondern „nur“ eine

sorgfältige Analyse erfordert [Page et al. 1995] und außerdem können unter den

nodal positive Patientinnen diejenigen identifiziert werden, die von einer Langzeit-

chemotherapie profitieren [Elston et al.1987, Pinder et al. 1998].

In unserer Studie konnte ebenfalls eine signifikante Korrelation mit dem Gesamt-

grading in der univariaten Überlebensanalyse nachgewiesen werden (p = 0,0028).

Es ließen sich unterschiedliche Patientengruppen bilden, deren Überleben mit zu-

nehmender Entdifferenzierung der Tumorzellen abnahm.

Allerdings zeigte von den einzelnen Komponenten nur die Mitoserate eine klare si-

gnifikante Korrelation (p = 0,0030). Auch in der Literatur wird eine hohe Korrelation

für die Mitoserate mit dem Überleben beschrieben [Genestie et al 1998, Parham et

al. 1992]. Ebenso wie in dieser Studie konnten Genestie et al. keinen signifikanten

Zusammenhang zwischen der tubulären Differenzierung und den Überlebensdaten

feststellen.

Hormonrezeptorstatus

Als ebenso anerkannter Prognoseparameter gilt die Bestimmung des Hormonrezep-

torstatus. Dieser wurde in den späten 70er Jahren bis in die frühen 90er Jahre an-

nähernd ausschließlich biochemisch bestimmt; hierzu wurde aus auf einer Kühlkette

gehaltenen Frischmaterial der Rezeptorengehalt des Zytoplasmas extrahiert und als

Konzentration (fmol/mg Protein) angegeben. Aus der Erfahrung wurden bestimmte

Grenzwerte festgelegt, ab welchen Östrogen- bzw. Progesteronrezeptoren als posi-

tiv zu gelten hatten. Nach einer kurzen Zeitperiode in den frühen 90er Jahren, in

den immunhistochemisch anwendbare Antikörper nur für die Nutzung von Gefrier-

schnitten (und somit nur für ausgewählte Fälle) zur Verfügung standen, haben sich

seit ca. 1995 an Paraffinschnitten applizierbare Antikörper durchgesetzt und die bio-

chemische Methode weitgehend verdrängt. Allerdings markieren die Antikörper am

4. Diskussion

55

Kern und stellen somit andere Eigenschaften der Rezeptoren dar, als die am Zyto-

plasma ansetzende biochemische Methode. Die Korrelation beider Methoden liegt,

ausgedrückt als Konkordanzwert, bei 80% für den Östrogenrezeptor und bei nur

58% für den Progesteronrezeptor (Biesterfeld et al. 1997), so dass noch fraglich ist,

in wie weit wirklich die herkömmliche biochemische Methode, obwohl sie kaum noch

angewandt wird, wirklich entbehrlich ist.

Der prognostische Effekt der Hormonrezeptorbestimmung ist in mehreren Arbeiten

gut belegt [DeSombre et al. 1980, Reiner et al. 1990, Schönborn et al. 1995, Moriki

et al. 1995, Haerslev et al. 1996, Gohring et al. 1996, Molino et al. 1997, Gago et

al.1998, Dao et al. 1980, Foekens et al. 1989]. Ein positiver Hormonrezeptorstatus

korreliert unabhängig von der eingeleiteten adjuvanten Therapie mit einer besseren

Prognose der Patientinnen. Zusätzlich erlaubt er eine Aussage über den Nutzen

einer antihormonellen Therapie im Sinne eines prädiktiven Faktors [Ellis et al. 1998].

Allerdings beschreiben auch einige Autoren das Fehlen einer Korrelation sowohl

zwischen dem Östrogenrezeptorstatus [Gaglia et al. 1993, Gasparini et al. 1994,

Mitze et al. 1995], als auch dem Progesteronrezeptorstatus [Gasparini et al. 1994,

Mitze et al. 1995] und dem Überleben.

In dieser Arbeit korrelierte der Hormonrezeptorstatus mit dem Überlebensdaten in dem Sin-

ne, dass Patientinnen mit positivem Status länger lebten als bei Negativem. Dies war jedoch

nur für den Progesteronrezeptorstatus (p = 0,0378) statistisch signifikant, nicht jedoch für

den Östrogenrezeptor (p = 0,2871). Aus prognostischer Sicht ist folglich eine wertvollere

Aussage vom Progesteronrezeptor zu erwarten. Diese Ergebnisse stimmen mit anderen Un-

tersuchungen überein, die den Progesteronrezeptorstatus im Gegensatz zum Östrogenrezep-

tor als besseren Indikator für eine gute Prognose werten [Kovach et al. 1996, Lethaby et al.

1996, Somlo et al. 1997]. Diese Aussage deckt sich auch mit den Ergebnissen der Konsen-

suskonferenz St. Gallen 1998, in der die Bedeutung des Progesteronrezeptorstatus für die

Unterteilung der einzelnen Risikokollektive herausgestellt wurde.

4. Diskussion

56

4.2 Das Retinoblastomgen- Protein (pRb) in der Prognostik des

Mammakarzinoms

Es ist inzwischen anerkannt, dass Tumorsuppressorgene eine wichtige Rolle in der

Entwicklung von menschlichen Karzinomen spielen [Marshall, 1991]. Das Retino-

blastomgen (Rb) war das jeweils erste Gen, welches überhaupt als Tumor-

suppressorgen identifiziert [Lee et al. 1987, Fung et al. 1987] und vollständig cha-

rakterisiert wurde [Hong et al., 1989], und das erste Gen, welches überhaupt als

solches identifiziert wurde [Lee et al. 1987, Fung et al. 1987].

Die Expression des Retinoblastomgen-Proteins und Strukturveränderungen des

Gens wurden schon in einigen Studien untersucht, in der Hoffnung einen neuen un-

abhängigen Prognoseparameter für das Mammakarzinom zu finden. Zunächst soll

in diesem Zusammenhang die Beziehung zwischen dem Überleben und der im-

munhistochemischen Analyse des Retinoblastomgen-Proteins erläutert werden.

In der univariaten Analyse konnte in unserem Patientenkollektiv keine sinnvolle Be-

ziehung zwischen den Überlebensdaten und den Ergebnissen der immunhistoche-

mischen Analyse der Rb-Expression nachgewiesen werden (p > 0.05). Die publizier-

ten Ergebnisse aus der Literatur zeigen, dass auch bei größeren Fallzahlen als der

eigenen keine grundsätzlich abweichenden Ergebnisse zu erwarten sind (Tabelle

4.2.1).

4. Diskussion

57

Tab. 4.2.1: Einfluß der Rb-Protein-Expression auf das Überleben von Mammakarzi-nomen

Autoren Fallzahl (n) p-Wert

Anderson et al. 1996 233 nicht signifikant

Pietiläinen et al. 1995 205 nicht signifikant

Bern et al. 1995 96 nicht signifikant

Sawan et al. 1992 197 nicht signifikant

Dublin et al. 1998 192 nicht signifikant

Yamashita et al. 1993 77 nicht signifikant

Farabegoli et al. 2005 50 nicht signifikant

Pinto et al. 2005 50 nicht signifikant

Im Folgenden sollen Beziehungen zwischen der Rb-Expression und herkömmlichen

Prognoseparametern diskutiert werden.

In der Literatur wird damit übereinstimmend keine signifikante globale Relation zum

Staging beschrieben [Anderson et al. 1996, Pietilainen et al. 1995, Yamashita et al.

1993]. In der Arbeit von Varley et al. [1989] wurde jedoch beobachtet, daß in inva-

siv-duktalen Karzinomen vom Stadium 1 keine Rb-1-Deletionen auftraten. Es konn-

te jedoch keine Beziehung zwischen Rb-1-Deletionen und einer schlechteren Pro-

gnose gefunden werden. Bezüglich der Tumorgröße und dem Rb-Gen gibt es un-

terschiedliche Untersuchungsergebnisse. Eine nicht signifikante Beziehung wurde in

den Arbeiten von Anderson et al. [1996], Pietilainen et al. [1995], Borg et al. [1992],

Yamashita et al. [1993] und Trudel et al. [1992] für pT beschrieben. Im Unterschied

dazu wurde eine signifikante Korrelation zwischen Tumorgröße und Rb-Expression

in der Untersuchung von Spandios et al. [1992] gefunden.

In einer Arbeit von Berns et al. [1995] wurde die Häufigkeit von Rb-Gen-

4. Diskussion

58

Veränderungen mit Hilfe der Southern-Blotting-Methode nachgewiesen. Die Rb-

Veränderungen wurden signifikant (p = 0,01) häufiger in lymphknotennegativen und

kleinen Tumoren (T1 < 2cm) gefunden. Trotz der Beziehung von Rb-Gen-

Veränderungen zu klinischen Faktoren, welche mit einer besseren Prognose ver-

bunden sind, zeigt sich jedoch kein Unterschied zwischen dem Überleben für Pati-

entinnen mit oder ohne Rb-Veränderungen. Im Unterschied zu den eben genannten

Ergebnissen zeigten immunhistochemische Untersuchungen der Rb-Gen-

Expression eine signifikante Korrelation mit einem positiven Lymphknotenstatus

[Derenzini et al. 2004, Sawan et al. 1992, Varley et al. 1989], aber ebenfalls ohne

Beziehung zum Gesamtüberleben. Übereinstimmend mit den Ergebnissen dieser

Arbeiten und auch in guter Korrelation mit unseren Resultaten fanden Anderson et

al. [1996], Trudel et al. [1992], Yamashita et al. [1993] und Dublin et al. [1998] eben-

falls keine signifikante Korrelation zwischen pRb und dem LK-Status.

In einer Studie von Derenzini et al. [2004] an 335 primären Mammakarzinomen

konnte eine signifikante Beziehung zum Überleben und zum Lymphknotenstatus

gezeigt werden.

Mit abnehmender histologischer Differenzierung nimmt üblicherweise auch die Proli-

ferationsrate zu. In unserer Studie lässt sich eine signifikante Beziehung zwischen

dem Grading und dem Prozentsatz der Rb-positiven Zellen nachweisen (p =

0,0275), während RbIRS und RbSI keine signifikanten Resultate erkennen lassen.

Auch die Mitoserate verhält sich signifikant zu dem Prozentsatz positiver Zellen.

Darüber hinaus wurde in einem Vergleich der Ergebnisse mit denen anderer Dokto-

randen am gleichen Patientenkollektiv deutlich, dass eine Beziehung zur Zahl Rb-

positiver Zellen und der Stärke der Rb-Expression mit der mittleren PCNA-

Expression [Schneider 2001] besteht.

Allgemein sind Grading, Mitoserate und die Expression von Proliferationsmarkern

Größen, von welchen man sich eine Aussage zur Aggressivität des Tumors ver-

spricht. Insofern ist eine Beziehung zu einem Protein, welches die Proliferation

hemmt und Zellen beeinflusst, die die Leistungsfähigkeit zur unkontrollierten Ver-

mehrung haben und so zu einem ansteigenden malignen Potential beitragen, nicht

4. Diskussion

59

unerwartet. Auch in der Literatur wurde ein Zusammenhang zwischen Rb-

Veränderungen und schlechter Differenzierung bzw. vermehrter Aggressivität des

Karzinoms beschrieben [Cordon-Cardo et al.1995].

Passend hierzu wurde eine signifikante Beziehung zwischen der anomalen Expres-

sion des Rb-Gens, der Tumordifferenzierung (invasiv-duktales Karzinom G3), der

Kernpleomorphie und dem Auftreten von DNA-Aneuploidie gefunden [Dublin et

al.1998, Pietiläinen et al. 1995]. Nach Pietiläinen et al. besteht zwischen der verän-

derten Gen-Expression und der Zellproliferation ein deutlicher Zusammenhang,

nachweisbar an der erhöhter S-Phase-Fraktion und einer gesteigerten Mitoseaktivi-

tät. Diese Ergebnisse stimmen gut überein mit einer regulatorischen Basisfunktion

für die Zellproliferation, die man dem Rb-Protein zuschreibt. Auch bei Untersuchun-

gen zu strukturellen Gen-Veränderungen mittels RNA-Blotting wurden Deletionen

des Rb-Gens häufiger in fortgeschrittenen Tumoren mit schlechter Differenzierung

gefunden, jedoch ohne eine signifikante Beziehung zu einer schlechteren Prognose

[Varley et al. 1989]. Eine Studie von Borg et al. [1992] zeigte eine Korrelation von

umschriebenen chromosomalen Allelverlusten (LOH) und hoher S-Phasefraktion

sowie DNA-Aneuploidie.

Da Zeichen der schnellen Zellproliferation, die DNA-Aneuploidie und die schlechte

histologische Differenzierung mit der veränderten Rb-Expression bzw. Strukturver-

äderungen im Rb-Gen zusammenhängen, lassen die Resultate vermuten, dass mit

wachsender genetischer Instabilität Mutationen im Bereich des Rb-Gens häufiger

vorkommen, was zu einer Beziehung von der Rb-Veränderungen und malignen hi-

stologischen Kriterien beiträgt. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf

hin, dass die Rolle der Rb-Mutationen zumindest in den frühen Phasen der Brust-

krebsentwicklung fraglich ist.

Es ist jedoch wichtig zu bedenken, daß die Erforschung des Tumorsuppressorgens

Rb an Mammakarzinomen zu nicht ganz einheitlichen Ergebnissen führte, was an

unterschiedlichen Arbeitsmethoden und unzureichenden Kenntnissen über die Tu-

morentstehung und das Rb-Gen (z.B. evtl. zusätzliche Regulation des Rb-Gens auf

der Transkriptionsebene [Strohmeyer et al. 1991] liegen könnte.

4. Diskussion

60

Auch bei erwähnten Arbeiten in der Tabelle 4.2.1 wurden z.B. unterschiedliche Anti-

körper bzw. Antikörpersysteme benutzt. Außerdem war das Scoring-System der Rb-

Protein-Expression nicht einheitlich gewählt. Pietiläinen et al., Yamashita et al. und

Nielsen et al. definierten drei Gruppen mit fehlender (0), anormaler (1) und normaler

(2) Expression. Anderson et al. und Sawan et al. unterschieden eine Kernfärbung

auf einer 5-Punkte Skala (0 bis 4). Die Arbeitsgruppe Dublin et al. differenzierte

ebenfalls drei Fraktionen mit keiner, schwacher oder starker Kernfärbung, wobei nur

eine fehlende Färbung als anormale Expression angesehen wurde. Marsh und Var-

ley [1998] unterschieden normale Färbeintensität (++, +++) von nicht normaler Fär-

bung (+,-). In unserer Arbeit wiederum wurde Remmele-Score verwendet, der ur-

sprünglich für den Östrogenrezeptor entwickelt worden war [Remmele und Stegner

1987], aber breite Verwendung auch bei anderen Markierungen findet. Außerdem

ist die Interpretation der Ergebnisse erschwert durch die von Zelle zu Zelle unter-

schiedliche Proteinexpression.

Der Hormonrezeptorstatus gilt mittlerweile als einer der Standardfaktoren bei der

Ermittlung der Prognose des Mammakarzinoms. In dieser Arbeit konnten keine si-

gnifikanten Korrelationen des Östogenrezeptorstatus zu den Daten der immunhisto-

chemischen Analyse der Rb-Proteinexpression gefunden werden (p > 0,05). Frühe-

re Studien bestätigen dies in den meisten Fällen [Pietiläinen et al. 1995, Yamashita

et al. 1993, Trudel et al. 1992, Borg et al. 1992, Anderson et al. 1996]. Lediglich die

Ergebnisse von Dublin et al. [1998] zeigen ein signifikant häufigeres Fehlen einer

Rb-Proteinexpression in ER-negativen Tumoren.

Einige Autoren halten pRB für einen Down-Regulator der Proliferation von Mamma-

karzinomzellen in Antwort auf ER- [Watts et al. 1995, Attucci et al. 1996, Foster et

al.1996, Lukas et al. 1996, Dees et al. 1997, Hurd et al. 1997] und PR-Bindungen

[Groshong et al.1997, Musgrove et al. 1997]. Die Tumorsuppressorfunktion von pRb

ist abhängig von seiner hypophosphorylierten aktiven Form. In einer Studie konnte

4. Diskussion

61

gezeigt werden, dass die Inkubation von ER- und PR-positiven Mammakarzinomzel-

len in ein östrogenhaltiges Wachstumsmedium eine Zellproliferation und eine Hy-

perphosphorylierung von pRb bewirkt [Moudgil et al. 2001].

Es ist ein Nachteil der immunhistochemischen Untersuchung, daß sie nicht zwi-

schen der hypophosphorylierten (aktiven) und der phosphorylierten (inaktiven) Form

unterschieden werden kann. Außerdem ist, abhängig von der Spezifität des Antikör-

pers, eine positive Kernreaktion nicht eindeutig als Indikator für die Anwesenheit

von funktionsfähigem Protein zu werten. So könnten Missense-Mutationen oder

kleine Deletionen das Epitop unbeeinflusst lassen, so daß diese nicht von dem Anti-

körper erkannt werden. Problematisch scheint auch, daß mit umschriebenen chro-

mosomalen Allelverlusten (LOH) des Rb-Locus nicht unbedingt eine Mutation, Dele-

tion oder verminderte pRb-Expression einhergeht [Borg et al.1992, Wadayama et

al.1994, Berns et al. 1995].

Die Studie von Botos et al. [2002] untersuchte die Hypothese, daß die Verteilung

von funktionierendem Rb und der Kinetik der Rb-Phoshorylierung unterschiedlich ist

in den Zelllinien; unsterbliches Mammaepithel (MCF-10 A), differenziertes, nicht-

metastasiertes Adenokarzinom (MCF-7) und schlecht differenziertem, metastasier-

tem Adenokarzinom (MDA-MB-231) und, daß diese Unterschiede über den zellulä-

ren Phenotyp informieren können. Es zeigte sich eine schnellere Rb-

Phosphorylierung in MCF-7 im Vergleich zu MCF-10A und eine annährend unregu-

lierte Rb-Dephosphorylierung in der MDA-MB-231-Linie. Diese Ergebnisse unter-

stützen damit die These, daß der Nachweis von hypophoshphoryliertem Rb ein

nützlicherer prognostischer Faktor sein könnte, als das Gesamt-Rb.

Ein Vorteil der immunhistochemischen Methode ist aber, daß die Bewertung der

Komponenten der G1-Phase-Regulation des Zellzyklus direkt in den einzelnen Tu-

morzellen auf der Ebene der Proteine erfolgt. Außerdem sind die Ergebnisse nicht

durch Kontamination mit gesunden Zellen beeinflußt und verlassen sich nicht dar-

auf, das Verhalten des Proteins ausschließlich durch die genetische Information

voraus zusagen.

4. Diskussion

62

Der Progesteronrezeptorstatus zeigt in dieser Arbeit ebenfalls keine signifikante

Korrelation zu den Rb-Parametern. Auch in der Literatur wird dies beschrieben [Mil-

de-Langosch et al. 2001, Anderson et al. 1996, Pietiläinen et al. 1995, Yamashita et

al. 1993, Borg et al. 1992]. Bemerkenswert ist die von Anderson et al. [1996] beo-

bachtete signifikante Korrelation zwischen einer fehlenden pRb-Expression und ei-

nem fehlenden Ansprechen auf eine endokrine Therapie. Allerdings zeigte sich kei-

ne Beziehung zwischen fehlender Rb-Expression und dem Vorhandensein von Ös-

trogen- oder Progesteronrezeptoren. Die Möglichkeit, daß die immunhistologische

pRb-Färbung eine zusätzliche vorhersagende Information zur endokrinen Therapie

liefern könnte, ist verlockend, hier sind jedoch zunächst weitere Studien erforderlich.

Eine signifikante Korrelation konnte zwischen der Färbeintensität (p = 0,0053) und

dem IRS (p = 0,0017) des pRb und der Apoptose gezeigt werden. Diese Beobach-

tung läßt sich durch die Funktion des Rb-Proteins erklären. Wie schon erwähnt, ist

das Proteinprodukt des Retinoblastomgens ein Schlüsselregulator für das Schicksal

der Zelle. Dieser Regulator vermittelt zwischen verbundenen Signalwegen und

spielt eine wichtige Rolle für die Apoptose oder den programmierten Zelltod. Die

Anti-Apoptosefunktion des Rb-Proteins konnte für gesunde und Krebszellen gezeigt

werden. Tatsächlich führt ein Knock-Out des Rb-Gens oder die Expression von vira-

len Onkoproteinen, welche das Rb-Protein inaktivieren zur Apoptose [Morgenbesser

et al. 1994, Pan et al. 1994, Almasan et al. 1995, Truchet et al. 2000]. In der Litera-

tur wurde bisher keine immunhistochemische Auswertung des Rb-Proteins mit der

Apoptose korreliert.

4. Diskussion

63

Tab.4.2.2: Literaturübersicht der Ergebnisse der immunhistochemischen Auswer-tung der Retinoblastomgen-Expression in Mammakarzinomen

Autor Fallzahl (n) Ergebnis

Anderson et al. 1996 233 verminderte Gen-Expression in 21% der Fälle

Pietiläinen et al. 1995 205 abnorme Gen-Expression in 36,6 % der Fälle

Sawan et al. 1992 197 Rb-Gen-Expression in 28% der Fälle negativ

Nielsen et al. 1997 79 keine Gen-Expression in 9% der Fälle

Yamashita et al. 1993 77 in 16% verminderte und in 16% der Fälle keine Ex-pression

Dublin et al. 1998 192 abnorme Gen-Expression in 17% der Fälle

Marsh, Varley 1998 28 Verminderte Expression von pRb in 37% der Fälle

Derenzini et al. 2004 335 hyperphoshoryliertes/ fehlendes pRb in 23,6%

Pinto et al. 2005 50 pRb+ 26% der Fälle

Faßt man die Ergebnisse zusammen, so wurden Veränderungen in 9% bis 36,6%

der Fälle ermittelt. Ähnliche Zahlenwerte zwischen 13% und 25% ergeben sich für

genetische strukturelle Veränderungen auf der Rb-Gen-Ebene (Tab. 4.2.3).

Tab. 4.2.3: Literaturübersicht der Ergebnisse von Rb-Gen-Veränderungen in Mam-makarzinomen

Autor Fallzahl (n) Ergebnis

Bern el al. 1995 96 Strukturveränderungen in 24% der Fälle

Varley et al. 1989 77 Deletion des Rb-Gens in 17% der Fälle

Borg et al. 1992 90 Strukturveränderungen in 25% der Fälle

Bootsma et al. 1993 79 Strukturveränderungen in 13% der Fälle

4. Diskussion

64

Von diesen unterschiedlichen Daten ausgehend ist es schwierig, einen speziellen

Schluss über die Rolle des Rb-Gens beim primären Mammakarzinom zu ziehen. Da

ein Rb1-Allelverlust nicht immer assoziiert ist mit einem Verlust der pRb-Expression

[Borg et al 1992], könnten andere Gene, welche ebenfalls auf dem Chromosom 17q

lokalisiert sind, in Zusammenhang stehen mit der Entwicklung oder dem Fortschrei-

ten von menschlichen Karzinomen. Bedeutend für diese Theorie ist die Auffindung

eines Gens von Schott et al. [1994], welches proximal vom Rb1-Gen (lokalisiert

13q12-q13) lokalisiert ist und den Namen Brush-1 trägt. Es konnte gezeigt werden,

daß umschriebene chromosomale Allelverluste (LOH) dieses Gens in Beziehung

stehen zu einem verminderten Brush-mRNA-Niveau, wohingegen das Rb1-mRNA-

Level unverändert erscheint.

Die zentrale Rolle des Rb-Gens in der Zellproliferation durch die Regulation des

G1/S-Übergangs wurde schon beschrieben [Weinberg, 1995]. Bei der Festlegung

der Zelle zur weiteren Proliferation wird pRb inaktiviert durch die Phosphorylierung

durch cyclin-abhängige Kinasen, dadurch werden Faktoren freigesetzt, welche den

S-Phase Eintritt bewirken.

Viele Studien für unterschiedliche Karzinome haben eine hohe Frequenz von Muta-

tionen im Rb-Gen, Veränderungen im Kontrollmechanismus der Rb-

Phorphorylierung und anormale Expression von pRb aufgedeckt. Eine dieser Ver-

änderungen könnte der entscheidende Schritt in der Krebsentwicklung sein [Lukas

et al. 1995].

Die Bedeutung der Rb-Inaktivierung im Krebs konnte auch durch das Einbringen

von Wildtyp-Rb in Tumorzelllinien mit einem Rb-Verlust nachgewiesen werden; die

Wachstumsrate sank unter beschränkten Serumbedingungen, die Fähigkeit, Koloni-

en im Agar zu bilden, war aufgehoben und die Tumorentwicklung bei Nacktmäusen

war vermindert oder komplett unterdrückt [Huang et al. 1988, Takahasi et al.1991,

Wang et al. 1993].

Cyclin D1, cdk4/6 und p16 bilden ein regulierendes Element in der G1-Phase und

4. Diskussion

65

jede dieser Komponenten ist eine potentielle Zielscheibe für die Fehlregulierung in

der Krebsentstehung mit der Konsequenz der Steigerung der Phosphorylierung und

Inaktivierung von pRb.

Im Mammakarzinom sind die Cyclin-D1-Genamplifikation [Adnane et al. 1989,

Schuuring et al.1992, Buckley et al. 1993] und die Rb-Mutationen weit verbreitet. Es

wurde beschrieben, daß Tumorzelllinien mit Rb-Verlust ein sehr niedriges Level von

Cyclin-D1 [Muller et al.1994] und Cyclin-D/CDK [Bates et al. 1994] aufweisen. Die-

ses spricht für eine selbstregulierende Beziehung zwischen Cyclin-D1 und pRb. Der

signifikante Zusammenhang zwischen der Cyclin D1-Expression und dem schlech-

teren Überleben in den Fällen, welche positiv für pRb waren, ist ebenfalls von be-

sonderer Bedeutung im Hinblick auf die komplexen Interaktionen zwischen Cyclin

D1 und Rb [MacIntosh et al. 1995].

Einige Studien haben die entgegengesetzte Beziehung der Expression von p16 und

pRb beschrieben [Otterson et al. 1994, Shapiro et al. 1995, Yeager et al. 1995, Ueki

et al. 1996], was auf die Existenz einer negativen Rückkopplung zwischen diesen

beiden Proteinen hinweisen könnte.

Auch einige andere zellzyklusassoziierte Proteine stehen im Zusammenhang mit

der pRb-Expression. So zeigt die p27-Expression eine deutliche Reduktion der Ex-

pression in der Abwesenheit von pRb [Gillett et al. 1999], für p53 wurde von Ander-

son et al. [1996] und Sawan et al. [1992] keine signifikante Beziehung zur Rb-

Expression gefunden, wohingegen von MacKay et al. [1988] eine Korrelation be-

schrieben wurde. Eine inverse Beziehung zur pRb-Expression zeigte die Protein-

expression von SOCS-2 (suppressor of cytokine signalling 2) [Farabegoli et

al.2005].

Neueren Studien weisen als weitere Einflußgröße nach, daß das Adhäsionsmolekül

CEACAM1 nicht nur an der Aufrechterhaltung normaler Zellarchitektur beteiligt ist,

sondern auch eine Rolle als Tumorsuppressor spielt. In der Arbeit von Bamberger et

al. [2001] korreliert eine hohe CEACAM1-Expression signifikant mit der Expression

4. Diskussion

66

von Rb-Protein. Dies zeigt die Möglichkeit einer Beziehung zwischen Zelladhäsi-

onsmolekülen und der Zellzyklusregulation, welche eine wichtige Rolle in der Ent-

stehung von Mammakarzinomen spielen könnte.

Landberg et al. [2001], welche die Herunterregulierung des potentiellen Tumorsup-

pressorgens IGFBP-rP1 untersuchten, fanden heraus, daß niedriges IGFBP-rP1

assoziiert ist mit einer pRb-Inaktivierung, schlechter Differenzierung, hohem Cyclin

E und fortgeschrittenem Stadium.

In einer Studie, welche den Mechanismus der Umwandlung von benigner Papillo-

matose zu ductalem Carcinom in situ (DCIS) in Beziehung zur Rb-Expression un-

tersuchte, fand man bei milder Papillomatose pRb in 85% (Rb mRNA 90%) der Fäl-

le, in 52% (mRNA 50,5%) bei schwerer Papillomatose und in den DCIS nur bei

22% (mRNA-Expression 20%) der Fälle. Das Rb-Protein könnte also möglicherwei-

se zum Screening von high-risk-Papillomatose genutzt werden und ein neues Ziel

der Gentherapie für präkanzeröse Läsionen der Brust sein [Niu et al., 2004].

Die pRb-Veränderungen in den malignen Tumoren der Brust sind somit sehr viel-

schichtig und noch lange nicht geklärt.

4.3 Multivariate Überlebensanalyse

Bei der multivariaten Analyse durch das Cox-Regressionsmodell waren für das Ge-

samtüberleben der Lymphknotenstatus, der Progesteronrezeptorstatus und die Tu-

morgröße von statistisch signifikanter Bedeutung.

In der Literatur finden sich ähnliche Resultate: Anderson et al. [1996] nehmen eben-

falls den LK-Status als Erstes auf, bei den Ergebnissen von Berns et al. [1995] und

Pietiläinen et al. [1995] wird die Tumorgröße zuerst aufgenommen. In einer Arbeit

von Donegan et al. [1997], welche die Ergebnisse von 13 Autoren zusammenfasst,

wird beschrieben, dass Lymphknotenstatus, Tumorgröße und Grading die Basis für

4. Diskussion

67

prognostische Aussagen bilden. Der Progesteronrezeptor wird ebenfalls als wichti-

ger Prognosefaktor gesehen [Somlo et al. 1997, Reiner et al. 1990]. Auch Clark et

al. [1983] bestätigte den Lymphknotenstatus und den Progesteronrezeptorstatus als

unabhängige Faktoren, die Tumorgröße wird jedoch nicht in das Regressionsmodell

aufgenommen.

Die Parameter des pRb konnten nicht als unabhängige Prognoseparameter be-

schrieben werden. Dies deckt sich mit den Angaben in der Literatur, wo pRb eben-

falls nicht als unabhängiger Parameter aufgenommen wurde [Pietiläinen et al. 1995,

Berns et al. 1995, Dublin et al. 1998, Anderson et al.1996, Yamashita et al. 1993].

Dementsprechend hat die immunhistochemische Analyse des Retinoblastompro-

teins wohl kaum eine Verwendung im klinischen Alltag der Pathologie, um die indi-

viduelle Prognose für Brustkrebspatientinnen zu bestimmen.

Im Hinblick auf die Vielschichtigkeit der Rb-Veränderungen und die zum Großteil

noch ungeklärten Faktoren der Zellzyklusregulation wird sich aber erst in Zukunft

herausstellen, inwieweit und für welche Art von Fällen eine Rb-Genprodukt-

Bestimmung im klinischen Einzelfall sinnvoll sein kann.

68

5. Zusammenfassung

Das Retinoblastomgen (Rb) ist der Prototyp der Tumorsuppressorgene und das

Genprodukt spielt eine wichtige Rolle für den Zellkontrollzyklus und die Differenzie-

rung der Zelle. Die prognostische Aussagekraft des immunhistochemisch bestimm-

ten Retinoblastomgenproteins (pRB) wurde an 101 Fällen von primären Mamma-

karzinomen mit der TNM-Klassifikation, der histomorphologischen Gradierung und

dem Progesteron- und Östrogenrezeptorstatus verglichen.

Zur Darstellung kam die Proteinexpression durch einen spezifischen monoklonalen

Antikörper mittels der Avidin-Biotin-Affinitätskonjugat-Methode. Die Auswertung der

gefärbten Mammakarzinomschnitte erfolgte mit Hilfe des Lichtmikroskopes durch

zwei unabhängige Untersucher.

Bei der statistischen Analyse wurde das Staging (pTNM = 0,0011, pT = 0,0238, pN

= 0,0008, pM = 0,0098) in seiner prognostischen Signifikanz bestätigt. Die Gültigkeit

für die etablierten Faktoren der Gradierung konnte ebenfalls gezeigt werden (p =

0,0045). Bei den Hormonrezeptoren erwies sich nur der Progesteronrezeptor als

statistisch signifikanter Parameter (p = 0,021). Bei der pRb-Expression in den Zell-

kernen, sowohl als Prozentsatz positiver Zellen quantifizierbar, als auch in die ver-

schiedenen Färbeintensitäten einteilbar, konnte kein signifikanter Zusammenhang

zu dem Gesamtüberleben festgestellt werden. Folglich ergaben sich auch keine

Korrelationen mit dem immunreaktiven Score. Die Beziehung zwischen RbPP und

dem Grading erwies sich als signifikant (p = 0,0275). Zu den anderen klinischen

Routineparametern zeigte sich kein signifikanter Zusammenhang.

In der multivariaten Analyse durch das Cox-Regressionsmodell wurden der Lymph-

knotenstatus (p = 0,0002), der Progesteronrezeptorstatus (p = 0,0076) und die Tu-

morgröße (p = 0,0110) als unabhängige Prognosefaktoren in das Modell aufge-

nommen. Die Parameter des Retinoblastomgenproteins konnten nicht als unabhän-

gige Faktoren aufgenommen werden.

5. Zusammenfassung

69

Zusammenfassend ist zwar, eine schwache Beziehung zwischen der Zellproliferati-

on, der histologischen Differenzierung und der Expression von pRb vorhanden, al-

lerdings spiegelt sich dieser Zusammenhang nicht in dem Überleben der Patientin-

nen wider, so dass zur Zeit pRb nicht als wesentlicher Prognosefaktor des Mamma-

karzinoms empfohlen werden kann.

70

6. Technischer Anhang

Silanisieren von Objektträgern:

1. Einstellen der Objektträger in Aceton für 5 Minuten

2. Trocknen der Objektträger im Brutschrank bei 60 °C

3. Einstellen der Objektträger in einer 10%igen Mischung von 3-Trieth-

oxysilpropylamid in Aceton für 5 Minuten

4. zweimaliges Spülen der Objektträger in Aceton für 3 Minuten

5. Einstellen der Objektträger in Aqua dest. für 2 Minuten

6. Trocknen der Objektträger im Brutschrank bei 60 °C

Inkubation in Xylol / Absteigende Alkoholreihe: Durch die Inkubation in Xylol

werden die Schnitte entparaffiniert, durch die absteigende Alkoholreihe werden sie

rehydriert.

1. 2 x Xylol für je 5 Minuten

2. 2 x 100 %iger Alkohol (kurz)




6. Spülen mit Aqua dest.

Primärer Antikörper: Retinoblastomgenprotein-Anikörper (IgG1), monoklonal

(Klon:G3-245) von DPC Biermann, Naunheim

Sekundärer Antikörper: Biotinylierter Pferd-anti-Maus-Antikörper (IgG), Fa. Vector

Laboratories, Inc. Burlingame, CA

6. Technischer Anhang

71

Rezept für PBS 0,15 M:

8,00 g NaCl, 0,20 g KCl, 1,16 g Na2HPO4, 0,20 g KH2PO4 ad 1000 ml aqua dest.,

auf pH 7,6 titrieren

Rezept für TBS:

53 g NaCl und 12 g Tris ad 1000 ml aqua dest.

Zum Gebrauch 1:10 verdünnen und auf pH 7,4 einstellen

Weitere verwendete Reagenzien:

- Pferde-Normalserum, Fa.Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA

- ABC Elite Kit Peroxidase, Fa.Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA

- Poly-L-Lysin, Sigma Diagnostics, St. Louis, USA

- Magermilchpulver, Fa. Libbys o.ä.

72

7. Datensammlung

Tabelle 7.1: Auflistung von Alter, Menopausenstatus und Staging

Pat.-Nr. Alter Meno pTNM pT pN M

1 47 2 2 2 0 0

2 51 2 3 3 1 0

3 35 1 2 2 0 0

4 38 1 2 2 1 0

6 56 3 4 3 1 1

7 32 2 2 2 1 0

8 33 1 1 1 0 0

9 41 1 2 2 0 0

10 50 3 1 1 0 0

11 41 1 2 2 0 0

12 53 2 1 1 0 0

13 54 3 1 1 0 0

14 55 3 3 3 1 0

15 55 3 2 2 0 0

17 55 3 2 2 1 0

19 64 4 2 2 0 0

20 66 4 2 2 1 0

21 65 4 2 2 0 0

22 66 4 2 1 1 0

23 63 4 1 1 0 0

24 49 2 2 2 0 0

25 51 3 2 2 0 0

26 62 4 2 2 0 0

27 53 3 3 3 1 0

7. Datensammlung

73


28 34 1 2 2 1 0

31 73 4 2 2 1 0

32 34 1 2 2 0 0

33 54 3 4 3 1 1

34 54 3 2 2 1 0

35 85 4 2 2 1 0

36 58 3 2 2 0 0

37 32 1 2 2 1 0

38 95 4 2 2 0 0

39 65 4 2 2 1 0

40 41 1 3 3 1 0

41 52 3 2 3 0 0

42 39 1 2 2 1 0

43 54 3 2 2 0 0

45 71 4 2 2 0 0

47 74 4 2 1 1 0

49 68 4 1 1 0 0

50 67 4 2 2 0 0

52 63 4 2 2 0 0

53 73 4 1 1 0 0

54 74 4 2 2 0 0

55 66 4 2 2 0 0

56 85 4 2 2 0 0

58 90 4 4 4 0 1

59 54 3 2 3 0 0

60 59 4 3 4 0 0

62 81 4 4 2 0 1

63 54 3 2 2 1 0

7. Datensammlung

74


64 82 4 1 1 0 0

65 64 4 2 2 1 0

66 63 4 2 2 1 0

67 46 1 2 2 0 0

68 89 4 3 4 0 0

69 66 4 4 4 0 1

71 81 4 2 2 1 0

73 50 2 3 3 1 0

74 45 2 2 2 1 0

75 62 4 2 2 1 0

76 52 3 2 3 0 0

77 80 4 2 2 1 0

78 78 4 3 4 1 0

80 53 3 2 1 1 0

81 56 3 2 2 1 0

82 74 4 4 1

86 83 4 4 1 1

87 45 1 2 2 0 0

88 38 1 3 3 1 0

89 61 4 4 3 1 1

90 55 3 2 2 1 0

91 58 3 2 2 1 0

93 58 3 3 3 1 0

95 54 4 2 2 1 0

96 53 3 1 1 0 0

97 72 4 2 2 1 0

100 49 3 3 3 1 0

101 51 3 2 2 1 0

7. Datensammlung

75


102 51 3 2 2 0 0

104 53 1 2 2 1 0

105 76 4 2 2 1 0

106 65 4 2 2 0 0

110 53 2 2 3 0 0

111 59 4 3 3 1 0

112 45 1 2 2 1 0

114 82 4 2 2 0 0

115 74 4 2 1 1 0

116 51 1 3 4 1 0

118 38 1 2 2 0 0

119 57 3 4 3 1 1

121 64 4 2 2 1 0

122 54 3 1 1 0 0

123 69 4 2 2 1 0

124 75 4 2 2 0 0

126 66 4 2 2 0 0

127 63 3 2 2 0 0

128 44 1 2 2 1 0

130 35 1 2 2 1 0

131 77 4 1 1 0 0

7. Datensammlung

76

Erläuterungen zu Tabelle 7.1:

• Pat.-Nr: Patientennummer, geordnet nach dem Zeitpunkt der Diagnosestel-

lung

• Alter: Alter der Patientinnen bei Diagnosestellung

• Meno: 1 = normal, 2 = prä-, 3 = postmenopausal, 4 = Senium

• pTNM: postoperatives TNM-Stadium

• pT: postoperative Tumorgröße

• pN: postoperatives Lymphknotenstadium

• M: Stadium der Fernmetastasierung: 0 = keine Fernmetastasierung, 1 =

Fernmetastasierung

7. Datensammlung

77

Tabelle 7.2: Auflistung von Grading, Hormonrezeptorstatus und Rb-Protein Ergeb-

nissen

Nr. TD KP MIT Grad ER PR Rb PP Rb SI Rb

IRS

1 3 3 3 3 1 0 1 2 2

2 3 3 3 3 0 0 1 3 3

3 1 3 2 2 0 0 2 2 4

4 3 3 2 3 1 1 2 2 4

6 3 3 2 3 1 0 0 0 0

7 2 1 1 1 1 1 2 3 6

8 2 2 2 2 1 1 1 1 1

9 2 2 2 2 1 1 1 2 2

10 1 2 1 1 1 0 2 1 2

11 2 1 1 1 1 1 2 2 4

12 2 3 1 2 0 0 2 1 2

13 2 2 2 1 0 2 2 4

14 3 3 2 3 1 1 1 2 2

15 2 3 3 3 1 1 2 3 6

17 3 2 1 2 1 1 2 3 6

19 2 1 2 1 1 2 3 6

20 2 3 1 2 1 1 2 2 4

21 3 2 1 2 1 1 1 2 2

22 3 2 2 2 1 0 2 2 4

23 1 1 1 1 2 2

24 3 3 2 3 0 0 1 2 2

25 3 2 3 3 0 0 3 3 9

26 2 3 1 2 1 1 1 2 2

27 3 3 2 3 0 0 2 2 4

7. Datensammlung

78


IRS

28 3 3 3 3 1 1 3 3 9

31 3 3 2 3 1 0 0 0 0

32 1 1 1 1 1 1 2 2

33 3 3 2 3 1 1 1 2 2

34 3 3 2 3 1 1 3 3 9

35 3 1 1 1 1 1 3 3 9

36 2 2 2 1 1 0 1 2 2

37 3 3 2 1 1 1 2 3 6

38 3 3 3 3 0 0 1 3 3

39 3 1 3 1 0 2 2 4

40 3 3 1 2 1 1 1 1 1

41 1 1 2 1 1 0 2 3 6

42 3 3 3 3 0 0 2 2 4

43 3 2 1 2 1 1 1 1 1

45 2 3 2 3 1 1 3 3 9

47 3 3 3 3 1 1 1 1 1

49 3 2 1 2 0 0 1 2 2

50 2 3 1 2 1 0 1 2 2

52 3 1 0 0 0 0

53 3 2 1 2 1 0 2 2 4

54 3 2 1 2 1 1 1 2 2

55 3 3 2 3 1 1 1 1 1

56 2 1 1 1 2 2

58 3 3 3 3 1 1 1 2 2

59 2 3 1 2 1 1 1 2 2

60 3 3 2 3 1 0 1 2 2

62 3 2 1 2 0 0 1 2 2

7. Datensammlung

79


IRS

63 3 3 1 2 0 0 1 1 1

64 3 2 1 2 0 1 2 2 4

65 3 2 2 2 1 0 2 2 4

66 3 3 1 2 1 0 1 2 2

67 2 2 1 1 1 1 2 2 4

68 2 2 2 2 1 0 1 2 2

69 3 2 3 3 1 0 1 1 1

71 2 3 2 2 0 0 1 2 2

73 3 2 2 2 1 1 1 2 2

74 3 3 3 3 0 0 3 3 9

75 2 1 1 1 1 0 1 1 1

76 3 3 1 2 1 0 1 2 2

77 2 1 1 1 1 1

78 3 3 2 3 1 1 1 1 1

80 3 3 2 3 1 0 2 2 4

81 2 3 3 1 1 1 2 2

82 3 1 3 1 1 1 2 2

86 1 1 1 2 2

87 2 1 1 1 0 1 0 0 0

88 3 3 3 3 1 0 1 2 2

89 3 2 1 2 1 0 2 2 4

90 3 2 1 2 1 0 2 3 6

91 2 3 3 3 0 0 4 3 12

93 3 3 3 3 0 0 3 3 9

95 3 3 2 3 0 0 1 3 3

96 3 3 2 3 0 0 2 3 6

97 3 2 1 2 1 1 1 2 2

7. Datensammlung

80


IRS

100 2 3 2 2 1 1 2 3 6

101 2 1 0 2 2 4

102 3 3 1 2 1 0 3 3 9

104 2 2 1 1 1 1 1 3 3

105 3 2 2 2 1 1 2 3 6

106 3 3 3 3 0 1 3 3 9

110 3 2 1 2 1 1 2 2 4

111 2 2 1 1 1 1 4 2 8

112 2 2 2 2 1 1 2 2 4

114 2 2 1 1 1 1 2 3 6

115 2 3 3 3 0 0 1 2 2

116 3 2 1 2 1 1 1 1 1

118 1 3 1 1 0 0 1 2 2

119 2 3 2 2 1 1 1 2 2

121 3 3 2 3 1 1 1 2 2

122 2 1 1 1 0 0 0 0

123 3 3 1 2 1 1 1 1 1

124 3 2 3 3 0 0 1 2 2

126 3 2 1 2 1 1 2 2 4

127 3 2 1 2 1 1 2 2 4

128 3 2 1 2 1 1 1 1 1

130 3 3 1 2 0 0 1 1 1

131 2 2 2 2 0 0 1 1 1

7. Datensammlung

81

Erläuterungen zu Tabelle 7.2:

• Nr.: Patientennummer, geordnet nach dem Zeitpunkt der Diagnosestellung

• TD: Angaben zur tubulären Differenzierung

• KP: Angaben zur Kernpleomorphie

• MIT: Angaben zur Mitoserate

• Grad: Angaben zur histomorphologischen Gradierung

• ER: biochemischer Rezeptorstatus: 0 = negativ, 1 = positiv

• PR: biochemischer Rezeptorstatus: 0 = negativ, 1 = positiv

• Rb PP: Semiquantitativ bestimmter Prozentsatz Rb-positiver Zellen

• Rb SI: Semiquantitativ bestimmte Färbeintensität Rb-positiver Zellen

• Rb IRS: Immunreaktiver Score; Produkt von Rb-PP und Rb-SI

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99

9. Danksagungen Vielen Dank an alle, die mir meine Arbeit ermöglicht und erleichtert haben:

Herrn Prof. Dr. med. Stefan Biesterfeld für die gute Betreuung der Arbeit auch über

weitere Distanzen hinaus, so dass außer den fachlichen Fragen auch noch das leib-

liche Wohl berücksichtigt wurde.

Herrn Prof. Dr. med. Ch. Mittermeyer für die Bereitstellung der Räumlichkeiten und

Mittel.

Frau Inge Losen für ihre Hilfe bei der Erstellung der Präparate und beim Erlernen

der immunhistochemischen Färbemethode.

Meinem Mann Robert für die Unterstützung bei den Hindernissen durch den Com-

puter.

Meinen Eltern für die mentale Unterstützung und das Korrekturlesen.

Meinem Sohn Karl, der mir durch die Schwangerschaft genügend Zeit und Muße für

die Fertigstellung der Arbeit verschafft hat.

100

10. Lebenslauf Persönliche Daten

Nele Fischer, geb. Mundt Geb. am 28.12.1975 in Hamburg Verheiratet, ein Sohn (Karl, geb. 2003) Evangelisch-lutherisch

Schulbildung

1982-1986 Grundschule in Oslo (Norwegen), Essen (NRW) und Lachendorf (NS) 1986-1987 Orientierungsstufe in Lachendorf 1987-1993 Gymnasium St-Josef-Schule in Jülich (NRW) 1993-1995 Johannes-Althusius-Gymnasium in Emden (NS)

Abitur Juni 1995 Freiwilliges Soziales Jahr

09/95-08/96 Paracelsusklinik in Neuss (NRW) Studium

10/1996 Studienbeginn Humanmedizin an der RWTH-Aachen 08/1999 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 08/2001 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 10/01-09/02 Praktisches Jahr im St.-Antonius-Hospital in Eschweiler 11/2002 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Berufliche Tätigkeit

Seit 1/2004 Ärztin im Praktikum/Assistenzärztin Anästhesie

St.-Antonius-Hospital Eschweiler

Immunhistochemischer Nachweis des...

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