Aus der Chirurgischen Klinik und Poliklinik

der Universitt Wrzburg

Chirurgische Klinik I

Direktor: Prof. Dr. med. A. Thiede

In-Vitro-Untersuchungen an mikroverkapseltem humanem

Nebenschilddrsengewebe: Vorarbeiten zur Therapie

des permanenten Hypoparathyreoidismus

mittels Allotransplantation ohne Immunsuppression

Inaugural Dissertation

zur Erlangung der Doktorwrde der

Medizinischen Fakultt

der

Bayerischen Julius-Maximilians-Universitt zu Wrzburg

vorgelegt von

Vasiliy Moskalenko

aus Minsk, Weirussland

Wrzburg, im Mrz 2004

Referentin: Professor Dr. rer. nat. K. Ulrichs

Korreferent: Professor Dr. med. A. Thiede

Dekan: Professor Dr. med. S. Silbernagl

Tag der mndlichen Prfung: 14. Juli 2004

Der Promovend ist Arzt

Inhaltverzeichnis 1 Einleitung . 1 2 Fragen .. 7

3 Material und Methoden . 8

3.1 Untersuchungsmaterial . 8

3.2 Chemikalien und Medien . 8

3.3 Alginat .. 8

3.4 Gewebeprparation ... 9

3.4.1 Herstellung von Gefrierschnitten . 9

3.4.2 Hmalaun-Eosin Frbung . 9

3.4.3 Mechanische Gewebezerkleinerung unter dem Dissektionsmikroskop ... 10

3.4.4 Mechanische Gewebezerkleinerung mittels Siebpassage 10

3.4.5 Enzymatische Gewebezerkleinerung mit Kollagenase 10

3.5 Vitalitt des Nebenschilddrsengewebes . 11

3.5.1 Trypanblaufrbung ... 11

3.5.2 Fluoreszein-Diacetat Frbung .. 11

3.6 Verkapselungsapparatur ....... 12

3.7 Produktion leerer Barium-Alginatkapseln 13

3.8 Mikroverkapselung von Nebenschilddrsenpartikeln .. 14

3.9 Mikroverkapselung von Nebenschilddrsenzellen/Zellclustern .. 15

3.10 In-Vitro-Funktion von Nebenschilddrsengewebe ... 15

3.10.1 In-Vitro-Funktion von frischem hyperplastischem Nebenschilddrsen-

gewebe ... 15

3.10.2 In-Vitro-Funktion von kryokonserviertem Nebenschilddrsengewebe .... 15

3.10.3 In-Vitro-Funktion von mikroverkapseltem Nebenschilddrsengewebe ... 16

3.11 Bestimmung des Parathormons 17

3.12 Mechanische Stabilitt der Barium-Alginat-Mikrokapseln... 17

3.13 Lichtmikroskopische Auswertung und Fotodokumentation.. 17

4 Ergebnisse .... 18 4.1 Morphologische und physiologische Untersuchungen des

Spendergewebes.. 18

4.1.1 Makroskopische und mikroskopische Untersuchungen des

Spendergewebes.. 18

4.1.2 In-Vitro-Funktion von frischem hyperplastischem humanem Neben-

schilddrsengewebe .. 20

4.1.3 In-Vitro-Funktion von kryokonserviertem humanem Nebenschild-

drsengewebe .... 21

4.2 Untersuchungen zur Optimierung der Gewebeprparation ... 23

4.2.1 Mechanische Gewebezerkleinerung unter dem

Dissektionsmikroskop ... 23

4.2.2 Mechanische Gewebezerkleinerung mittels Siebpassage ..... 25

4.2.3 Enzymatische Gewebezerkleinerung mit Kollagenase . 25

4.3 Untersuchungen zur optimalen Methode der Mikroverkapselung

des Nebenschilddrsengewebes ... 26

4.3.1 Mikroverkapselung der Gewebepartikeln 26

4.3.2 Mikroverkapselung von Einzelzellen und Zellclustern ... 28

4.4 In-Vitro-Funktion des mikroverkapselten Nebenschilddrsengewebes .. 30

4.4.1 Frisches mikroverkapseltes Nebenschilddrsengewebe .. 30

4.4.2 Kultiviertes mikroverkapseltes Nebenschilddrsengewebe .... 31

4.4.3 Mikroverkapselte Zellen und Zellcluster ..... 32

4.5 Untersuchungen zur mechanischen Stabilitt der Mikrokapseln ..... 34

4.5.1 Einfluss der Zelldichte auf die mechanische Stabilitt

der Alginat-Mikrokapseln ........................................ 34

4.5.2 Einfluss der Zellcluster auf die mechanische Stabilitt

der Alginat-Mikrokapseln . 35

5 Diskussion .... 37

6 Zusammenfassung .. 49

7 Literaturverzeichnis ... 52

Danksagung

Lebenslauf

Abkrzungsverzeichnis A. bidest. Aqua bidestillata

A. dest. Aqua destillata

Ba Barium

FDA Fluoreszein-Diacetat

GMP good medical practise

h Stunde(n)

min Minute(n)

PI Propidium Jodid

PTH Parathormon

s. o. siehe oben

s. u. siehe unten

xg ein Vielfaches der Erdanziehung

1

1 Einleitung

Der permanente Hypoparathyreoidismus (Nebenschilddrsenunterfunktion) ist eine irrever-

sible Reduktion des intakten Parathormons und des Gesamtkalziums im Blutserum des Pati-

enten mit eingeschrnkter bzw. fehlender Funktion der Nebenschilddrsen. Obwohl ein pri-

mrer permanenter Hypoparathyreoidismus in Form eines autoimmunen Hypoparathyreoi-

dismus, des DiGeorge Syndroms oder des Kenny-Linarelli Syndroms vorliegen kann, ist der

sekundre Hypoparathyreoidismus als Folge des chirurgischen Eingriffs an der Schilddrse

oder den Nebenschilddrsen die hauptschliche Ursache dieser Erkrankung. Laut statisti-

schem Bundesamt werden in Deutschland 1.000 neu erkrankte Patienten pro Jahr gezhlt. Die

Inzidenz des permanenten Hypoparathyreoidismus bei Operationen an den Schilddrsen be-

trgt 0,5-4% und hngt von den Operationsindikationen und von der chirurgischer Technik ab

[63, 64].

Der permanente Hypoparathyreoidismus kann verschiedene klinische Beschwerden wie Te-

tanie, Knochendeformationen, Haar- und Nagelwuchsstrungen, depressive Stimmungslagen

und Herzstrungen verursachen [40]. Die Standardtherapie des Hypoparathyreoidismus be-

steht aus der bedarfsabhngigen Substitution von Kalzium und Vitamin D. Obwohl lebensbe-

drohende Situationen eines Patienten, wie z. B. die hypokalzmische Krise, die mit schmerz-

haften tonischen Krmpfen der Muskulatur, Parsthesien und seltener mit Stimmritzenkrmp-

fen einhergehen, mit dieser Therapie sehr gut behandelbar sind und ihnen damit auch vorge-

beugt werden kann, bleibt die Kalzium/Phosphat-Homostase unreguliert. Die chronische

Hypokalzmie und das langfristige Fehlen des Parathormons fhren zur Verschlechterung des

Allgemeinbefindens und verschiedenen psychischen Strungen [5]; intrakranielle Verkalkun-

gen, Katarakte, sekundre Candida- und Onychomykosen sind bei diesen Patienten ebenfalls

zu beobachten [40]. Auf der anderen Seite ist diese konservative Therapie mit einigen Kom-

plikationen behaftet (osmotische Diarrhe, Nephrolithiasis und Verkalkungen von verschie-

denen Geweben usw.) [24, 43]. Diese Nachteile der Substitutionstherapie sind der Grund fr

die Suche nach neuen, physiologischeren Behandlungsformen des permanenten Hypoparathy-

reoidismus.

Die bis heute durchgefhrten randomisierten klinischen Studien mit humanem rekombinan-

tem Parathormon (PTH-1-34) deuteten darauf hin, dass die Wiederherstellung der Kalzium-

2

Homostase nach der subkutanen Injektion des Hormons grundstzlich mglich ist: Kalzi-

umwerte im Serum und Urin der Patienten liessen sich in normalen Grenzen nachweisen [65,

72, 73]. Dennoch blieben die Phosphatwerte ber dem normalen Niveau [72]. Da das Pa-

rathormon unstabil war, traten Flle von Hypokalzmie whrend der Substitutionstherapie auf

[72]. Ausserdem wurden einzelne Nebenwirkungen whrend dieser Therapie, wie Nocturia,

Erbrechen, Hyperkalzmie und andere beobachtet [72, 73]. Obwohl keine negativen Vernde-

rungen in den Knochen nach 3-jhriger PTH-Behandlung der 19 Patienten erkennbar waren

[73], besteht jedoch das Risiko des dosisabhngigen Osteosarkoms bei solchen Patienten [74].

Um eine physiologischere Substitution des Parathormons zu erzielen, und um die potenzielle

Gefahr der Komplikationen fr den Knochen zu verringern, sollen neue Therapieanstze er-

probt werden: z. B. die PTH pump Therapie, die Gabe langfristig wirkender Parathormone

und mehrmalige PTH-Injektionen [73]. Es scheint jedoch, dass die Transplantation des Ne-

benschilddrsengewebes und die regulierbare De-Novo-Synthese des Parathormons eine sehr

viel bessere Alternative zur artifiziellen Hormon-Substitution bei der konservativen Therapie

des permanenten Hypoparathyreoidismus bieten.

Die ersten Untersuchungen zur experimentellen Therapie der Tetanie nach Schilddrsenope-

rationen mittels Transplantation des Schilddrsen-Nebenschilddrsen-Gewebes wurden von

Anton von Eiselsberg (Professor der Chirurgie, Allgemeines Krankenhaus, Wien), Schler

von Theodor Billroth, im Jahr 1892, und 5 Jahre spter nach der Entdeckung der Neben-

schilddrsen im Jahr 1887 von Ivar Victor Sandstrm (medizinischer Student an der Universi-

tt Uppsala), durchgefhrt; dies, obwohl die genauen Ursachen der Tetanie weitgehend unklar

waren [66]. Die ersten klinischen Versuche, die akuten Symptome des chronischen postopera-

tiven Hypoparathyreoidismus zu behandeln, erfolgten im Jahr 1907 von W. S. Halsted (Johns

Hopkins Hospital) mittels einer Injektion von Nebenschilddrsenextrakt und Kalzium. An-

schliessend konnten H. Pfeiffer und O. Mayer die ersten klinischen Erfolge nach Autotrans-

plantation der Epithelkrperchen im Jahr 1907 zeigen [66]. Seitdem wurden zahlreiche expe-

rimentelle und klinische Transplantationen autogenen bzw. allogenen Gewebes zur Therapie

bzw. Prophylaxe des Hypoparathyreoidismus nach Schilddrsen/Nebenschilddrsenope-

rationen von verschiedenen Gruppen durchgefhrt.

Obwohl die Autotransplantation der Nebenschilddrsen eine Routineprozedur geworden ist,

ist ihre Allotransplantation bis heute noch kein Standardverfahren. Die ehemaligen Vermu-

3

tungen, dass die Epithelkrperchen immunologisch privilegiert seien, bewa