Forschungsbericht 2015 35

Biochemie

Institut für Biophysikalische Chemie

�� Direktor: Prof. Dr. Dietmar MansteinTel.: 0511/532-3702 • E-Mail: Manstein.Dietmar@mh-hannover.de • www.mh-hannover.de/bpc.html�� Keywords: Myosin, Aktin, Tropomyosin, Troponin, Formin, Dynamin, G-Proteine, Apaf-1, Apoptose, Endocytose, Exocytose, UDP-Glucose-

Pyrophosphorylase, 2‘,5‘-Oligoadenylatsynthetase, Allosterie, Enzymkinetik, Wirkstoffdesign, Röntgenstrukturanalyse,

Analytische Ultrazentrifugation, Thermophorese, T-Sprung

Forschungsprofil

Den Forschungsschwerpunkt des Instituts für Biophysikalische Chemie bilden Arbeiten an molekularen Motoren und motilen Prozessen. Ziel der durchgeführten Arbeiten ist ein besseres Verständnis der Rolle von Motorproteinen und ihren Bindungspartnern in physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. Neben ihrer essentiellen Bedeutung für die Muskelkontraktion und verschiedene Transportprozesse, spielen Motorproteine auch eine wichtige Rolle im Rahmen von Signaltransduktionsprozessen und für das korrekte Ablesen und die Erhaltung der Erbinformation. Ver-änderungen der Motoraktivität oder ihrer Regulation sind für eine Vielzahl von Erkrankungen verantwortlich. Zu den vererbbaren Erkrankungen, die durch die Mutation einzelner Motorproteine verursacht werden, zählen Myopathien der Herz- und Skelettmuskulatur, verschiedene Formen von Immunschwäche, neurodegenerative Erkrankungen und Störungen der Sinnesorgane, die zu Blindheit und Taubheit führen. Aufgrund ihres hohen Potentials als humanthera-peutisch relevante Zielproteine sind Untersuchungen von Motorprotein-Wirkstoff-Komplexen ein zentraler Bestandteil unserer Forschungsaktivitäten.

Die methodischen Schwerpunkte, die auch durch eine entsprechende apparative Ausstattung im Laborbereich abgesichert sind, bilden: Die Produktion und Reinigung von komplexen humanen Eiweißmolekülen unter Verwendung von bakteriellen und eukaryontischen Expressionssystemen, Röntgenkristallstrukturanalyse (MR, MIR, MAD, SAD), zeitaufgelöste CD-, UV/VIS und Fluoreszenz Spektroskopie (Stopped-Flow, T-Sprung, Licht-getriggerte Reaktionen), Einzelmolekülmikroskopie, 5D-Lebendzellmikroskpie, höchstaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie (4Pi, PALM), hydro-dynamische Methoden (SAX, DLS, AUC), Kalorimetrie (DSC, ITC), Thermophorese (MST), und Computermodellierung von Proteinen.

In der Lehre sind die wissenschaftlichen Mitarbeiter des Instituts an den Studiengängen Humanmedizin, Zahnmedi-zin, Biologie, Biomedizin, Biochemie und an der Ausbildung von Doktoranden im Rahmen der Graduiertenprogramme der Hannover School for Biomolecular Drug Research und der Hannover Biomedical Research School beteiligt.

Ausgewähltes Forschungsprojekt

Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von humanem DynaminFür viele lebenswichtige intrazelluläre Transportprozesse werden Vesikel benötigt, die von der Plasmamembran oder von Membranen verschiedener Zellorganellen abgeschnürt werden. Die Entstehung bestimmter Vesikel wird durch das Gerüstprotein Clathrin eingeleitet, das sich zunächst käfigartig um eine Membraneinstülpung anlagert. Über diese sogenannte Clathrin-vermittelte Endozytose werden zum Beispiel zahlreiche extrazelluläre Rezeptoren internalisiert oder mit Neurotransmittern gefüllte Vesikel an der präsynaptischen Membran gebildet. Die Abschnürung wird dann durch das Protein Dynamin bewerkstelligt, das der Prototyp der Proteinsuperfamilie der großen GTPasen ist.

Dynamin enthält fünf unterschiedliche Domänen (Abbildung 1a): die N-terminale GTPase-Domäne (G-Domäne), das bundle signalling element (BSE), den Stalk, die Pleckstrin-Homologie-Domäne (PH-Domäne) und die C-terminale prolinreiche Domäne (PRD). Die G-Domäne ist über das BSE, ein Drei-Helix-Bündel, flexibel mit dem ebenfalls helikalen

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Stalk verbunden. Die PH-Domäne bindet an Lipidmembranen, während die PRD Interaktionen mit Proteinwechselwir-kungspartnern vermittelt, die eine SH3-Domäne enthalten.

Im Zytosol liegt Dynamin als Tetramer vor. Dynamin-Tetramere lagern sich bei Bedarf um den Hals eines Mem-branvesikels zu einem großen helikalen Komplex zusammen. Die G-Domänen aus Dynaminmolekülen in benachbarten Helixsprossen bilden dabei Dimere. Durch Hydrolyse von GTP zu GDP wird Energie erzeugt und die Konformation der G-Domänen so verändert, dass die Helixsprossen gegeneinander verschoben werden. Die dadurch verursachte Membrandeformation bewirkt letztlich die Abtrennung des Vesikels.

Wir konnten mit Hilfe von Röntgenstrukturanalyse die dreidimensionale Struktur des Dynamin-Tetramers aufklären und dadurch atomgenau beschreiben, wie die Grundbausteine der Dynamin-Helix im nukleotidfreien Zustand aussehen (Ref. 1). Durch Kombination der Strukturdaten mit den Ergebnissen aus Mutationsstudien, Analyse der Oligomerisie-rungsfähigkeit und Simulationsrechnungen konnten wir die molekularen Abläufe aufklären, die zur Bildung der Helix führen und beschreiben, wie dieser Prozess reguliert wird.

Das Dynamin-Tetramer (Abbildung 1a) besteht aus zwei gleichartigen Dimeren, die sich jeweils über hydrophobe Wechselwirkungen im sogenannten Interface-2 (Ref. 2, 3) bilden. Die Dimere lagern sich dann über Wechselwirkungen im sogenannten Interface-3 zum Tetramer zusammen. Wir konnten durch gerichtete Mutagenese von einzelnen Amino-säuren im Interface-3 die Tetramerisierung stören und damit die Funktion von Dynamin beeinträchtigen (Abbildung 1b-e).

Weiter konnten wir zeigen, dass sich die Dynamin-Helix dadurch bildet, dass sich auch zwischen Tetrameren die im Interface-3 beobachteten Wechselwirkungen bilden. Setzt man Tetramere aneinander, indem man bei jeder der Molekülverbindungen die Geometrie des Interface-3 verwirklicht, ergibt sich eine rechtshändige Helix, deren Ab-messungen erstaunlich gut übereinstimmen mit den Abmessungen einer über Elektronenmikroskopie beobachteten Dynamin-Helix (Ref. 1, 4) (Abbildung 2).

Voraussetzung für die Bildung des Oligomerisierungs-Interfaces ist, dass sich die PH-Domäne in eine andere Lage begibt. Die Wechselwirkungsflächen werden sonst durch die PH-Domänen blockiert. Diese zunächst aus dem Strukturmodell abgeleitete Vermutung konnten wir durch moleküldynamische Rechnungen sowie weitere biochemische Untersuchungen erhärten. Anhand dieser Befunde können wir nun die schädlichen Effekte erklären, die bestimmte Mutationen, die bei den erblichen Krankheiten Morbus Charcot-Marie-Tooth (CMT) und zentronukleare Myopathie (CNM) in Dynamin 2 auftreten können, auf die Funktion des Proteins haben.

Referenzen:

(1) Reubold TF, Faelber K, Plattner N, Posor Y, Ketel K, Curth U, Schlegel J, Anand R, Manstein DJ, Noe F, Haucke V, Daumke O, and Eschenburg S (2015) Crystal structure of the dynamin tetramer. Nature 525, 404-408.

(2) Faelber K, Posor Y, Gao S, Held M, Roske Y, Schulze D, Haucke V, Noe F, and Daumke O (2011) Crystal structure of nucleotide-free dynamin. Nature 477, 556-560.

(3) Ford MG, Jenni S, and Nunnari J (2011) The crystal structure of dynamin. Nature 477, 561-566.

(4) Chen YJ, Zhang P, Egelman EH, and Hinshaw JE (2004) The stalk region of dynamin drives the constriction of dynamin tubes. Nat Struct Mol Biol 11, 574-575.

�� Projektleitung: Eschenburg, Susanne (Dr.); Kooperationspartner: Reubold, Thomas (Dr.), Biophysikalische Chemie, MHH, Manstein, Dietmar J. (Prof. Dr.), Biophysikalische Chemie, MHH, Daumke, Oliver (Prof. Dr.), Max-Delbrück-Zentrum Berlin, Haucke, Volker (Prof. Dr.), Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie Berlin, Noé, Frank (Prof. Dr.), Freie Universität Berlin, Curth, Ute (Prof. Dr.), Biophysikalische Chemie, MHH; Förderung: DFG

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Biochemie

Abb. 1: Struktur des Dynamin-Tetramers. Jedes Dynamin-Monomer ist individuell eingefärbt, im rechten Monomer sind die einzelnen Domänen farblich hervorgehoben; Farbgebung wie in der Domänenstruktur unten links. b-e Biochemische Charakterisierung verschiedener Dynamin-Mutanten mittels analytischer Ultrazentrifugation (b), Lipidbindungs-Assays (c), GTPase-Assays (d) sowie Transferrin-Aufnahme-Assays (e).

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Biochemie

Abb. 2: Gekrümmte Form eines Dynamin-Tetramers. Nur die Stalk-Helices sind als Zylinder gezeigt, das erste Dimer in hellblau, das zweite Dimer in dunkelblau. b Anlagerung von Dynamin-Tetrameren unter Verwendung der Geometrie von Interface-3 ergibt eine rechtshändige Helix, die sich sehr gut in die Elektronendichtekarte einer Cryo-EM-Rekonstruktion der relaxierten Dynamin-Helix einpassen lässt. Um der Klarheit willen sind lediglich die Stalks dargestellt. In der Detaildarstellung sieht man, wie sich die G- und PH-Domänen aneinandergrenzender Moleküle einfügen lassen würden.

Weitere Forschungsprojekte (mit Stichtag 01.12.2015)

Tropomyosin-Regulated Actomyosin-Based Contractility In Nonmuscle Cells�� Projektleitung: Manstein, Dietmar J. (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Gunning, Peter (Prof. Dr.), UNSW, Sydney,

Australien; Raunser, Stefan (Dr.), MPI f Molekulare Physiologie, Dortmund; Brenner, Bernhard (Prof. Dr.), Institut für Molekular- und Zellphysiologie, MHH; Förderung: DFG

Impact of actin isoforms on nonsarcomeric myosin mechano-chemical transduction pathways and cellular localization�� Projektleitung: Manstein, Dietmar J. (Prof. Dr.), Taft, Manuel (Dr.); Kooperationspartner: Henn, Arnon (Prof. Dr.),

Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel; Förderung: Volkswagen-Stiftung

Time-resolved absorption spectroscopy of retinal proteins, phytochromes, and heme proteins�� Projektleitung: Chizhov, Igor (Dr.), Manstein, Dietmar J. (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Gärtner, Wolfgang (Prof.

Dr.) und Zorn, Björn (Dr.), Max-Planck-Institute for Chemical Energy Conversion, Mülheim; Engelhard, Martin (Prof. Dr.), Max Planck Institute of Molecular Physiology, Dortmund; Förderung: Land Niedersachsen, MPG

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Biochemie

Kinetic studies of acto-myosins using caged-ATP laser flash photolysis�� Projektleitung: Chizhov, Igor (Dr.), Manstein, Dietmar J. (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Tsiavaliaris, Georgios. (Prof.

Dr.), Institute for Biophysical Chemistry, MHH; Geeves, Michael A. (Prof. Dr.), Department of Biosciences, University of Kent, Canterbury, U.K.; Förderung: Land Niedersachsen

Mechanismen der Regulation und Funktion von Klasse-1 Myosinen an der Membranen-Zytoskelett Grenzfläche�� Projektleitung: Tsiavaliaris, Georgios. (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Matthias, Gaestel (Prof. Dr.), Institut für

Physiologische Chemie, MHH; Pich, Andreas (Prof. Dr.), Institut für Toxikologie, MHH; Soldati, Thierry (Dr.), University of Geneva, Schweiz; Förderung: DFG

Molekulare und ultrastrukturelle Untersuchungen zur Pathophysiologie der meiotischen non- Disjunction humaner Oozyten�� Projektleitung: Tsiavaliaris, Georgios. (Prof. Dr.); Kooperationspartner: von Kaisenberg, Constantin (Prof. Dr.), Klinik

für Gynäkologie, Geburtshilfe und Reproduktionsmedizin, MHH; Schippert, Cordula (OÄ Dr. med.), Frauenklinik, MHH; Pohl, Uwe (Dr.), Medizinisches Versorgungszentrum wagnerstibbe für Gynäkologie, Reproduktionsmedizin, Zytologie, Pathologie und Innere Medizin GmbH, 31848 Bad Münder; Förderung: Land Niedersachsen

Myosin structure, allostery, and mechano-chemistry�� Projektleitung: Preller, Matthias (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Tsiavaliaris, Georgios (Prof. Dr.), Institute for

Biophysical Chemistry, MHH; Soldati-Favre, Dominique (Prof. Dr.), University of Geneva, Schweiz

Umschalten zwischen Primase- und Polymeraseaktiviät am Folgestrang der bakteriellen Replikationsgabel�� Projektleitung: Curth, Ute (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Pich, Andreas (Prof. Dr.), Institut für Toxikologie, MHH;

Schmieder, Peter (Dr.) und Beerbaum, Monika, Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie (FMP), Berlin; Förderung: DFG

Regulation der prozessiven Aktinfilamentelongation von Ena/VASP Proteinen�� Projektleitung: Faix, Jan (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Dickinson, Richard (Prof. Dr.), University of Florida,

Gainesville, USA; Curth, Ute, (PD, Dr.), Biophysikalische Chemie, MHH; Theresia, Stradal (Prof. Dr.), Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig; Rottner, Klemens (Prof. Dr.), Institut für Genetik, Universität Bonn; Scita Giorgio (Prof. Dr.), IFOM/Universität Milan, Italien; Förderung: DFG

Dissection of formin pathways coordinating polarity with cell migration downstream of Ras signalling�� Projektleitung: Faix, Jan (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Höpfner, Karl-Peter, Prof. Dr. (Genzentrum/LMU München);

Witte, Gregor, Dr. (Genzentrum/LMU München); Weber, Igor, Prof. Dr.(Abteilung Molekularbiologie, Ruder Boskovic Institut, Zagreb, Kroatien); Förderung: DFG

Relating specific biochemical activities of ADF/cofilin family members to their physiological functions�� Projektleitung: Faix, Jan (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Rottner, Klemens, Prof. Dr. (Zoologische Institut/TU

Braunschweig); Witke, Walter, Prof. Dr. (Institut für Genetik/Universität Bonn); Bugyi, Beáta, Dr., (Institut für Biophysik/Universität Pécs, Ungarn); Förderung: DFG

Ena/VASP proteins in cell adhesion and motility�� Projektleitung: Faix, Jan (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Stradal, Theresia, Prof. Dr. (Infektionsbiologie/ HZI

Braunschweig); Rottner, Klemens, Prof. Dr. (Zoologische Institut /TU Braunschweig); Scita, Giorgio, Prof. Dr., (IFOM/Universität Milan, Italien); Förderung: DFG

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Biochemie

Stress fibre contraction and microparticle shedding – the question is how?�� Projektleitung: Latham, Sharissa Louise (Dr.); Kooperationspartner: Manstein, Dietmar J. (Prof. Dr.), Taft, Manuel

(Dr.), Institute for Biophysical Chemistry, Zweigerdt, Robert Dr.); HTTG, MHH; Förderung: HILF

Myosin 1-vermittelter Exozytose von Glucosetransporter-Speicher-Vesikeln�� Projektleitung: Manstein, Dietmar J. (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Buss, Folma (Dr.), Cambridge Institute for

Medical Research, UK; Coluccio, Lynne M (Dr.), Boston Biomedical; Förderung: DFG

Analyse der bestimmenden molekularen Faktoren für die Funktion von Apaf-1�� Projektleitung: Eschenburg, Susanne, Dr.; Kooperationspartner: Carsten Lüder, Prof. Dr., Universität Göttingen;

Christopher W. Akey, Prof. Dr., University of Boston, USA; Förderung: DFG

OriginalpublikationenAbbey M, Hakim C, Anand R, Lafera J, Schambach A, Kispert A, Taft MH, Kaever V, Kotlyarov A, Gaestel M, Menon MB. GTPase domain driven dimerization of SEPT7 is dispensable for the critical role of septins in fibroblast cytokinesis. Sci Rep 2016;6:20007

Anand R, Eschenburg S, Reubold TF. Crystal structure of the GTPase domain and the bundle signalling element of dynamin in the GDP state. Biochem Biophys Res Commun 2016;469(1):76-80

Arndt T, Wedekind D, Jörns A, Tsiavaliaris G, Cuppen E, Hedrich HJ, Lenzen S. A novel Dock8 gene mutation confers diabetogenic susceptibility in the LEW.1AR1/Ztm-iddm rat, an animal model of human type 1 diabetes. Diabetologia 2015;58(12):2800-2809

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Führing JI, Cramer JT, Schneider J, Baruch P, Gerardy-Schahn R, Fe-dorov R. A quaternary mechanism enables the complex biological functions of octameric human UDP-glucose pyrophosphorylase, a key enzyme in cell metabolism. Sci Rep 2015;5:9618

Graumann K, Schaumburg F, Reubold TF, Hippe D, Eschenburg S, Lüder CGK. Toxoplasma gondii inhibits cytochrome c-induced caspase activation in its host cell by interference with holo-apoptosome assembly. Microbial cell 2015;2(5):150-162

Latham SL, Tiberti N, Gokoolparsadh N, Holdaway K, Olivier Couraud P, Grau GE, Combes V. Immuno-analysis of microparticles: probing at the limits of detection. Sci Rep 2015;5:16314

Lee C, Wigren E, Trcek J, Peters V, Kim J, Hasni MS, Nimtz M, Lindqvist Y, Park C, Curth U, Lunsdorf H, Romling U. A novel protein quality control mechanism contributes to heat shock resistance of worldwide-distributed Pseudomonas aeruginosa clone C strains. Environ Microbiol 2015;17(11):4511-4526

Lohöfener J, Steinke N, Kay-Fedorov P, Baruch P, Nikulin A, Tis-hchenko S, Manstein DJ, Fedorov R. The Activation Mechanism of 2‘-5‘-Oligoadenylate Synthetase Gives New Insights Into OAS/cGAS Triggers of Innate Immunity. Structure 2015;23(5):851-862

Platonova E, Winterflood CM, Junemann A, Albrecht D, Faix J, Ewers H. Single-molecule microscopy of molecules tagged with GFP or RFP derivatives in mammalian cells using nanobody binders. Methods 2015;88:89-97

Ramalingam N, Franke C, Jaschinski E, Winterhoff M, Lu Y, Brüh-mann S, Junemann A, Meier H, Noegel AA, Weber I, Zhao H, Merkel R, Schleicher M, Faix J. A resilient formin-derived cortical actin meshwork in the rear drives actomyosin-based motility in 2D confinement. Nat Commun 2015;6:8496

Reubold TF, Faelber K, Plattner N, Posor Y, Ketel K, Curth U, Schlegel J, Anand R, Manstein DJ, Noe F, Haucke V, Daumke O, Eschenburg S. Crystal structure of the dynamin tetramer. Nature 2015;525(7569):404-408

Swaminathan K, Stumpf M, Müller R, Horn AC, Schmidbauer J, Eichinger L, Müller-Taubenberger A, Faix J, Noegel AA. Coronin7 regulates WASP and SCAR through CRIB mediated interaction with Rac proteins. Sci Rep 2015;5:14437

Tsiavaliaris G, Itel F, Hedfalk K, Al-Samir S, Meier W, Gros G, Endeward V. Low CO2 permeability of cholesterol-containing liposomes detected by stopped-flow fluorescence spectroscopy. FASEB J 2015;29(5):1780-1793

Zhao H, Ghirlando R, Alfonso C, Arisaka F, Attali I, Bain DL, Bakhtina MM, Becker DF, Bedwell GJ, Bekdemir A, Besong TM, Birck C, Brautigam CA, Brennerman W, Byron O, Bzowska A, Chaires JB, Chaton CT, Colfen H, Connaghan KD, Crowley KA, Curth U, Daviter T, Dean WL, Diez AI, Ebel C, Eckert DM, Eisele LE, Eisenstein E, England P, Escalante C, Fagan JA, Fairman R, Finn RM, Fischle W, de la Torre JG, Gor J, Gustafsson H, Hall D, Harding SE, Cifre JG, Herr AB, Howell EE, Isaac RS, Jao SC, Jose D, Kim SJ, Kokona B, Kornblatt JA, Kosek D, Krayukhina E, Krzizike D, Kusznir EA, Kwon H, Larson A, Laue TM, Le Roy A, Leech AP, Lilie H, Luger K, Luque-Ortega JR, Ma J, May CA, Maynard EL, Modrak-Wojcik A, Mok YF, Mucke N, Nagel-Steger L, Narlikar GJ, Noda M, Nourse A, Obsil T, Park CK, Park JK, Pawelek PD, Perdue EE, Perkins SJ, Perugini MA, Peterson CL, Peverelli MG, Piszczek G, Prag G, Prevelige PE, Raynal BD, Rezabkova L, Richter K, Ringel AE, Rosenberg R, Rowe AJ, Rufer AC, Scott DJ, Seravalli JG, Solovyova

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Biochemie

AS, Song R, Staunton D, Stoddard C, Stott K, Strauss HM, Streicher WW, Sumida JP, Swygert SG, Szczepanowski RH, Tessmer I, Toth RT 4th, Tripathy A, Uchiyama S, Uebel SF, Unzai S, Gruber AV, von Hippel PH, Wandrey C, Wang SH, Weitzel SE, Wielgus-Kutrowska B, Wolberger C, Wolff M, Wright E, Wu YS, Wubben JM, Schuck P. A multilaboratory comparison of calibration accuracy and the performance of external references in analytical ultracentrifugation. PLoS One 2015;10(5):e0126420

ÜbersichtsarbeitenMansson A, Rassier D, Tsiavaliaris G. Poorly understood aspects of striated muscle contraction. Biomed Res Int 2015;2015:245154

Winterhoff M, Faix J. Actin-filament disassembly: it takes two to shrink them fast. Curr Biol 2015;25(11):R450

Abstracts2015 wurden 30 Abstracts publiziert.

PromotionenAnand, Roopsee (PhD M.Sc.): Biomedical SciencesCharacterization of dynamins in complex with small molecule effectors and protein interaction partners.

Hundt, Nikolas (Dr. rer. nat.): Isoform-specific actomyosin interac-tions in non-muscle cells.

Lohöfener, Jan (Dr. rer. nat. M.Sc. Biochemistry): Structure-function relationships in innate immunity nucleic acid sensing by 2-5-oli-goadenylate synthetase 1.

Pathan-Chhatbar, Salma (PhD Biochemistry M.Sc.): Biochemistry-Isoform-dependent interactions in non-muscle actin-tropomyosin-myosin complexes.

Rajendraprasad, Girish: (PhD Biochemistry M.Sc.): Biomedical Ge-neticsTargeting mechanisms and regulation of myosin-1 functions at the membrane-cytoskeleton interface.