KLEINE BEITR.~GE ZUR BESTIMMUNG DES IEP VON PROTOPLASTEN

VI. DAS AUFSUCHEN V0N FXLLUNGEN NACH EINWIRKUNG AZIDIMETRISCH ABGESTUFTER PUFFER- UND SALZL/)SUNGEN

V o n H A N S P F E I F F E R (Bremen)

Eingegangen am 29. J a n u a r 1932

1. P r inz ip des Ver fahrens . - - Nach allgemeiner Auffassung ist die Ladung yon Elektrosomen eine Funktion ihres Dispersit/itsgrades. Da nun bei jenen Ampholyten, deren elektrisch neutrale Teilehen infolge ihrer Lyophobie nicht 15sungsstabil sind, mit entsprechender D ispersi- t ~ t s a b n a h m e beim isoelektrischen Punkte (IEP) der Eintritt einer Kolloidflockung verbunden ist (7, S. 825), indem nach der Theorie M. v. S~OLVC~OWSKIS 1) die Attraktionskr~fte zwischen den Teilchen naeh erfolgter Entladung n ich t mehr du rch e l ek t r i s ehe AbstoSungs- kr~tfte k o m p e n s i e r t werden (5, S. 1590), so mug sieh die Ann~herung an den IEP in beginnender Flockung ausdrfieken. Ziemlich zahlreieh sind denn aueh die vorliegenden Beobachtungen mikroskopiseher Aus- f~llungen, welche in diesem Sinne interpretiert werden kOnnen, selbst bei Verwendung unverletzter Zellen 2). Ffir unseren Zweck kommen freilich Flockungen dureh meehanisehe oder thermische Einfliisse und vie]fach

z) Die Deutung der flockenden Wirkung irgendwelcher Agenzien mit einer E r- n i e d r i g u n g der Dielektrizit/~tskonstante dutch Wo. OSTWALD mag vorl/~ufig unberiick- sichtigt bleiben. Ebenso mag eine Bezugnahme auf die offenbar der -Flockung verwandte Erscheinung der Koazervat ion (fliissige Entmischung in Systemen lyophiler Kolloide), deren Begriff H. G. BU~GENBSRG DE JO~G und H. R. KEvvT eingefiihrt haben, an dieser Stelle noch unterbleiben; doch sei auf das Sammelref. in P r o ~ p l a s m a 15, 110--173, hingewiesen.

2) Von den mancherlei n e p h e I o m e t r i s c h e n und T r i i b u n g s best immungen sehen wir an dieser Stelle ebenso wie yon der gewOhnlich durchgefiihrten Untersuchung yon Prel3s/~ften auf die zur Koagulat ion erforderliche Alkoholmenge vOllig ab (5, S. 1591 f.).

238 P f e i f f e r

auch solehe dutch Salzbehandlung nicht direkt in Betracht, sondern nut Ausf~tllungen in Abh~tngigkeit vonder CH des Mediums. Eigentlieh sollte sogar die CH der dispersen Phase die Komplement~trbedingung ftir den Flockungsvorgang sein, doeh l~tBt sieh ein solehes Ziel natttrlieh nieht er- ftillen. Auch hat die angenommene Beziehung eigentlieh nut for ver- dtinnte, sehwaeh soNatisierte Sole ihre volle Bereehtigung (5, S. 1593). Indessen liegt eine erhebliehe Zahl von Versuehen vor, in denen Flockungs- optima bestimmter pH-Bereiche in g u t e r [ ~ b e r e i n s t i m m u n g m i t an- d e r e n B e f u n d e n stehen, die hergebraehterweise gleiehfalls als eine Ann~iherung an den IEP gedeutet zu werden pflegen (5, S. 1593 ; 7, S. 826). Immerhin sehien es wfinsehenswert, die Lage tier Ploekungsoptima nicht nur mit jener der Viskosit~tts- und Quellungsminima, wie bei den meistens zitierten Arbeiten, zu vergleichen, sondern aueh mit Ergebnissen des eigentlieh grundlegenden Verfahrens zur Ermittlung des IEP (8, S. 590), n~tmlieh mit solchen der M i k r o k a t a p h o r e s e .

2. Ar t und B e h a n d l u n g des Mate r i a l s . - - Von den kfirz- lich mikrokataphoretisch untersuehten Objekten sind deswegen auch die naekten Protoplasten aus Beerenperikarpien yon Solanum nigrum und Vitis vinifera, sowie die dort benutzte unterg~trige Rasse der Saccharomyces cerevisiae (8, S. 596) zur Erzeugung yon F/illungen in abgestuften C~- Bereichen herangezogen worden. Im CTegensatz.zu STRUGGE~ (10, S. 4~56), tier allein Natriumazetatgemische einer CH zwischen 2,1" 10 -G und 6,9 �9 10 -5 (6 Stufen) auf Wurzelhaarzenen yon Hordeum einwirken liel3, sind hier daneben Versuche mit Misehungen derselben P u ff e r mit isotonisehen LSsungen f~t l lender Salze angestellt worden. Diese zweite Reihe tier Versuehe /ihnelt weitgehend Experimenten yon RUNNSTRS~ (9, S. 227f., 230f.), tier die Puffer mit NaSGN und NaC1 (zugleieh) vermengte, oder jenen yon HAM~ARSTEN und TEOREI~L (2) , welehe start des Rhodanion alas zufolge exakter Kolloiduntersuchungen yon Wo. 0STWALD und t~U- DOLF KStILER naeh f~tllender und entmischender Wirkung vSllig tiberein- stimmende Sulfosalizylation benutzten (2, S. 234f.).

Weiter n~hern sich die neuen Versuehe jenen yon M. II. L~wIs und L. D. FEnTO~ (3, S. 410), die an Gewebekulturen naeh Einwirken verschiedener S/iuren bei oder wenig unterhalb pH 4,6 eine Ausf~llung konstatierten, oder jenen yon ADDOMS (1), der im An- schlul3 an weitere Untersuchungen yon E. D. I~EALD, L. KAHLE:NltERG und 1~. H. T~VE die Einwirkung von N~hrlSsungen (mit KH2PO4-Zusatz ) verschiedener CH auf Wurzel- haare yon Triticum mittels Kardioidkondensors untersuchte. Neben anderen Aus- f~llungsversuchen mit S/~uren (M. H. JACOBS) kSnnten endlich als verwandt alle die iiberaus zahlreichen unter Verwendung yon Salzen gen~nnt werden, welche die Li tera tur heute schon aufzuweisen hat.

KMne Beitr~ge zur Bestimmung des IEP yon Protoplasten. VI 9,39

Die N a t r i u m a z e t a t e s s i g s i i u r e g e m i s e h e , welehe hier naeh Vor- sehrif ten yon G. S. WALPOLE dargestellt worden sind, haben den Vorteil prakt iseher Ionenkonstanz. Die verlangten pH-Stufen ergeben sieh leicht dureh Misehen best immter Volumina 0,2 tool. Essigs~iure mit gewissen Volumina 0,2 tool. Nat r iumazeta t in der folgenden Weise:

16,4 em s S~iure + 3,6 em ~ Salz . . . . . p i t 4,0

14,7 . . . . q- 5,3 . . . . �9 . . . . ,, 4,2 12,6 . . . . q- 7,4 . . . . �9 . . . . ,, 4,4 10,2 . . . . q- 9.8 . . . . . . . . . ,, 4,6

8,0 . . . . q - 1 2 , 0 . . . . . . . . . ,, 4,8 5,9 . . . . + 14,1 . . . . . . . . . ,, 5,0 4,9. . . . . + 15,8 . . . . . . . . . ,, 5,2

Zur Darstellung der gepufferten S a l z g e m i s c h e sind etwa 2 Vo]. tier auch rein benutz ten Puffer mit 5 Vo]. einer im Vorversuch ffir das betreffende 0b jek t isotonisch befundenen SalzlSsung zu misehen. Naeh eigenen Erfahrungen haben sieh vor a]lem das Na- und K-l~hodanid und vielfaeh aueh das Chlorid und Sulfat des Na als geeignet erwiesen.

M6gliehst gleieh beschaffene Objekte kommen nun in eine Serie .gesetzm~igig abgestufter Medien einer dieser Versuchsreihen. Die ver- g]eichende Beobachtung erfolgt unter Berficksiehtigung gleicher Einwir- kungszeiten (z. B. 10 oder 20 Min. usw. naeh vorgenommener Uberffihrung) and Temperaturkonstanz ohne Weehsel des Beobaehtungsmediums im k o a x i a l e n D u n k e l f e l d e mi t einem P a r a b o l o i d k o n d e n s o r nach H. SI~DE~TOPF," der s ta t t des gew6hnliehen Kondensorsystems in die Sehiebhfilse des Beleuehtungsapparates gebraeht und dureh destilliertes Wasser (oder ImmersionsS1) blasenfrei mit dem 0b jek t t rager verbunden wird. Bei den ftir die Beobachtung erforderlichen Troekensys temea hoher 0ffnungszahl oder Immersionssystemen wird die Apertur herabgesetzt , indem eine P a r a b o l o i d b l e n d e in die Fassung der 0b jek t ive yon oben eingehSngt wird. Die Beleuehtung erfordert eine starke L i e h t - q u e l l e , etwa eine Glfihlampe , ,Nitra 3", welehe bei 100 Volt Spannung und einem Verbraueh yon 100 Wa t t bis zu 180 K. K. liefert. Er- forderlieh ist die Benutzung stets derselben Liehtquelle ftir alle unter- einander vergliehenen Beobaehtungen. Indem die Dunkelfeldbeleuehtung dureh totale Reflexion des yon dem Planspiegel gesandten Liehtes am Deekglase hervorgerufen werden sell, ist die u yon S p e z i a l - ob j e k t t r~ ige rn ffir Dunkelfehlbeleuehtung (C. REIC~EaT, wien) reeht zweekmttl3ig.

240 P f e i f f e r

Bei diesen ist die Beobachtungsfl~che in der Mitre des Objekttragers erh6ht und yon einer kreisfSrmigen Rinne umgeben, und das Deekglas wird durch Adhesion auf die Pr~paratfl~che gepreBt, so dab die iiberschfissige Fliissigkeit in die Rinne abfliel3t und das Pr~parat, wie uus optischen Grtinden verlangt, eine ~ul3erst diinne Schicht bildet.

Da~ bei den Versuehen t r a u n ] a t i s c h e , pho t i s che und t h e r - n]isehe Einfliisse ausgeschaltet werden n]~issen, folgt schon aus den yon exakten Untersuchungen tier Ko]loidforseher her bekannten funktio- nellen Abhangigkeiten der Flockungserscheinung.

3. Ube rb l i ck der Ergebnisse . - - Inden] die MSglichkeit yon Fehlbeobachtungen wesentlich dutch zahlenm~13ige Vern]ehrung der Be- funde herabgesetzt wird, ist in allen F~llen eine n]ehffache Wieder- holung tier Versuche an den]selben Objekt anzustreben. Wegen des beschr~tnkten Raun]es sei indessen auf die Anfiihrung einer vollst~tn- digen, jeweils in be iden Reihen angestellten und je einige Male wiederholten Versuchsserie als Beispiel verzichtet. Entsprechend tier Auleinanderfolge der beiden Yersuchsreihen k0nnten nacheinander die ffillend wirkenden C~-Zonen der reinen und der mit SalzlOsungen ver- setzten Puffer n]itgeteilt werden. Wegen der grol~en Ubereinstin]n]ungen. in beiden Reihen ist abet eine gemeinsan]e Zusamn]enfassung bereehtigt. - -

In Puffer- und Salzl0sungen geringerer CH finder n]an die Zellen der Saccharomyces und die nackten Protop]asten der Beerenperikarpien in] Innern optisch leer. Je welter man aber in vergleichender Beob- aehtung zu Medien hSherer CH gelangt, um so n]ehr bekommen die Objekte in] Innern Bin eigenttin]liches A u f l e u e h t e n der Teilchen. Es treten zahlreiche leuchtende Punkte auf, welche sich in lebhafter Te i l ehenbewegung befinden und zun]al an Objekten in den Salz- 1Gsungen schlie$1ich dutch ihre Dimension aufzufallen beginnen und ihre Entstehung durch ZusammenschluI3 kleinerer Partikel verraten. Je weiter die CH des Mediun]s gesteigert wird, un] so n]ehr w~ichst anfangs das Leuchten und nin]n]t die Zahl der sich bewegenden Teilehen zu. Tells schon bei pH 5,0 (SalzlSsungen), in]n]er aber bei pH 4,8 hGrt die Teilehenbewegung in den Protoplasten yon Solanum auf, w~hrend die entsprechenden Stadien unter Verwendung der reinen Puffergen]isehe bei Vitis un] pH 4,4--4,2 (in den gepufferten SalzlSsungen bei pH 4,6--4,4), bei Saccharomyces selten bei pH 5,0 und gew6hnlich bei pH <_ 4,8 ]iegen.

Kteine Beitr~ge zur Bestimmung des IEP yon Protoplasten. VI 241

Die dureh den Stillstand der Teilehenbewegung gekennzeiehnete Bildung des s t a r r e n Koagels liegt also bei den drei Objekten an- n~thernd in derselben Zone, welehe F~tllungsart aueh gew/ihlt wird (Puffer, Salze). Geringe Unterschiede in dem C, rade der {}bereinstimmung sind vielleieht auf untersehiedliehe Salzempfindliehkeit der Objekte zuriiek- zufiihren. Daneben haben aueh versehiedene St/imme der Saccharomyces ebenso wie zu versehiedenen Zeiten besehaffte und untersuehte Proto- plasten der Beerenperikarpien :hinsichtlich Begrenzung und Breite der Zonen st~trkerer F~tllung geringe Untersehiede aufzuweisen, aueh wenn sieh stets in sukzessiver Folge die gleiehen Phasen beginnender und vollendeter F/illung aufzeigen lassen. Alle diese Feinheiten ~indern aber niehts an dem Ergebnis, naeh dem wir die den IEP ausdriiekende P~tllungszone fiir Solanum nigrum etwa zw.isehen pit 5,0 und 4,8 (Ca 10-5--1,6 �9 10-5), ftir Vitis vini/era zwisehen pH 4,6 und 4,2 (CH 2,5 �9 10--5--6,3 �9 10 -5) und Itir Saccharomyces cerevisiae zwisehen pit 4,9 und ;*,7 (Ca 1,3.10-5--2 �9 10 5) anzusetzen haben.

Bei gewShnlieher t I e l l f e l d b e l e u c h t u n g sind die zu bemerkenden Untersehiede, wie zu erwarten, viel geringer. H6ohstens die sehlieBliehe Koagulation ist dutch mehr oder minder stark i~usgepri~gte T r i ib u n g des gellinhalts einigermagen gekermzeiehnet.

Bemerkenswert erseheint, dab im Sinne yon M. A. VAn HE~WERDE~ die F/illung mittels einwirkender H- und S~lzionen des Mediums nieht yon vornherein irreversibel zu sein braueht. Sofern die Objekte naeh ktirzerer E i n w i r k u n g s d a u e r (anseheinend maximal bis 20 Min.) in ihr natiirliehes Medium (Sdanum- und Fitis-Protoplasten in verdiinnten, filtrierten Zellsaft der Beeren oder ann~ihernd neutral reagierendes Leitungswasser, Saccharomyces-Zellen in neue Bierwitrze) zuriiekgebraeht und wom6glieh mit diesen Fltissigkeiten ausgewasehen werden, tritt zufolge Dunkelfeldbeobaehtungen eine R e g e n e r a t i o n des Kol loid- geffiges ein, welehe bis zu anseheinend v611iger Reparation der opti- sehen Leere fiihren kann. Diese MSgliehkeit ist aber zugleieh be- sehr'ankt auf FSlle nieht zu grol3er Ann/ iherung an die als I E P benaehbart angenommenen F~tllungszonen des jeweiligen Objekts.

4. E ignung und A b w a n d l u n g des Verfahrens . - - Beim Vergle ieh der soeben (s. oben) als Zone um den IEP ermittelten Fallungswerte mit den Ergebnissen der m i k r o k a t a p h o r e t i s e h e n Be- stimmungen an denselben Objekten (8, S. 598f.) ergibt sieh eine befriedi-

249. P f e i f f e r

gende l~bereinstimmung 1), CTleichzeitig scheint for die Ermittlung tier Ausf~llungszonen neben f~llenden Puffergemischen auch die Verwendung azidimetrisch abgestufter L 0 s u n g e n yon A l k a l i r h o d a n i d e n in ~hn- l i c h e m Mal3e g e e i g n e t zu sein. Ob wit dieses Ergebnis darauf zu- rtickznftihren haben, dab auch die Puffergemische bereits ein Salz enthalten, muI3 unentschieden bleiben. Ebensowenig reichen die wenigen Versuche zur Beurteilung der M0glichkeit aus, ob .die teilweise nicht zu verkennende, geringe A b w e i c h u n g zwischen den kataphoretisch und den durch F~ltung gewonnenen Werten mit einem bei den letzteren Versuchen nicht zu vermeidenden ,, S al z f e hl e r" zureichend erkl~rt werden.

Nach allgemeiner Ansicht wird das -F ~,l 1 u n g s o p~ i m u m durch das ~ a x i m u m d e r K u r v e des D i s s o z i a t i o n s r e s t e s (L. MmH~ELIS) bestimmt. Indem die beiden Ionen des Natriumazetats unserer Puffergemische ihre in inverser Richtung verschie- bende Wirkung einigermal~en kompensieren, muB sich das F, lockungsoptimum bis zum Zusammenfallen dem elektrophoretisch definierten I E P nS, hern, w~hrend sich weiterer Salzzusatz in einer gewissen Verschiebung des Flockungsoptimums auswirken wird. Durch exakte Untersuchungen unorganisierter Kolloide ist allerdings eine anf/~nglich hemmende Wirkung gerade der Rhodansalze auf die Koagulation (BR. JmOE~SO~S, R. WELLHEIM U. ~.) oder, wie man einen solcken Einflul3 statt dessert beschreiben kSnnte, eine aufladende Wirkung solcher Neutrals~lze in geringer Konzentration gerade in der Zone beim I E P (W. A. BELIWZm~) bekannt geworden, so dab die E i g n u n g d e r b e n u t z t e n R h o d a n s a l z e zum F~llen der Zellkolloide nicht unverst~,ndlich bleibt.

Bei einer etwa beabsichtigten A b w a n d l u n g des V e r f a h r e n s durch Verwendung auch anderer Sa]ze ist abet immerhin Vorsicht zu wahren. Eine Variation mSchte unsere ~ethode indessen grunds~itzlich dadurch erlauben, dal3 das K r i t e r i u m der F l o c k u n g noch ve r - I e i n e r t wird, wie beispielsweise durch Anwendung der yon J. PEKAREK in dieser Zeitschrift in mehreren Nitteilungen empfohlenen B e s t iIn m u n g der a b s o l u t e n V i s k o s i t ~ t dutch gessung der Bl~owNschen Mole- knlarbewegung mit ttilfe tier ,i~ietho~te der mittleren, doppelseitigen Erstpassagezeiten" (4, S. 518f.). Nicht allein das Fehlen genilgender Vertrautheit des Verf.s mit jener Methode, sondern auch dig mangelnde Eignung der hier benutzten, vorher kataphoretiseh untersuchten Ver- suchsobjekte ft~r dieselbe (sofern nicht Minstlich die zur Nessung be- nStigten CTranulis eingef~ihrt werden sollen) hindern aber heute noch eine Erprobung des Verfahrens zur Ermittlung auch des IEP.

~) D~sselbe gilt fiir die Protoplasten yon Solanum nigrum durch Vergleich mit Werten, die durch Anwendung der von A. PlSC~I~a~R beschriebenen Bestimmung des Adsorptionsminimums fiir bestimmte Farbstoffpaare (s. 6, S. 1571 f.) gefunden wurden. Doch mSge davon abgesehen werden, da dies Veffahren zu jenem vielleicht in ver- wandtschaftlicher Beziehung steht.

Kleine Beitrage zur Bestimmung des IEP yon Protoplaaten. VI .243

In anderer Weise kOnnte auch der T o x i z i t ~ t t s g r a d bestimmter auf die 0bjekt~. einwirkender Medien einen Maf~stab fiir die Ann~therung an den IEP ergeben, wie an anderen 0bjekten schon W. J. ROBBINS gezeigt hat und aus gewissen Versuchsergebnissen yon N. K. KOI~TZOFF,

J. GRAY, F. VL~s m. J. DRAeOIU und M. ROSE, H. W. SMIT/r m. G.H. A. CLOWES U. V. a. gleichfalls abgeleitet werden kann. Uber eine solche Abwandlung der GrunderscheinUng mag indessen der folgende Beitrag berichten.

Z u s a m m e n f a s s u n g

Die im Dunkelfelde mikroskopierten F ~ 11 u n g e n an Zellkolloiden mittels azidimetrisch abgestufter Natriumazetat p u f f e r oder in solchen gel6ster A 1 k a l i - r h o d a n i d e ergeben an den kiirzlich (8) mikrokataphoretisch untersuchten Objekten eine befriedigende Ubereinstimmung fiber die Lage des als I E P gedeuteten Wertes. Die Grenzen der R e v e r s i b i l i t i i t der Fgllungen werden aufgesucht und die Griinde ffir die befriedigende Brauchbarkeit des Verfahrens bei der S a I z a u s f ~ l l u n g be- sprochen. Endlich werden die E i g n u n g der Methode fiir die gestellte Aufgabe und die M6glichkeiten der V a r i a t i o n des Verfahrens diskutiert.

L i t e r a t u r

1. ADDOlVIS, RUTH M., The effect of the hydrogen ion on the protoplasm of the root hairs of wheat. Amer. Journ. Bot. 10, 211--220, 1923.

2. HAMMARSTEN, EINAR und TEORELL, TORSTEN, Ausfiillung yon EiweiB-Nucleins~ure mit Lanthan- und Sulfosalizy]s~iureionen. Aeta Med. Scand. 68, 226m238, 1928.

3. L~wis, WAR~EN, H., und L~wIs, ~/[A:aGARET R., Behavior of cells in tissue cultures. In: EDMUND V. COW:DRY, General cytol6gy, S. 383--447. Chicago (Univ. Press), 1924.

4. PEKAREK, J., Absolute Viskosit~itsmessung mit Hilfe der Brownschen Molekular- bewegung Io Protoplasma 10, 510--532, 1930.

5. PFEIFF~R, H., Der isoelektrische Punkt (IEP) von Protopl~sten und seine Er- mittlung. In: E. ABDERttALDEN, Handb. biol. Arbeitsmeth. (V), 2/2, 1563--1596, 1929.

6. - - , l)ber einig~Experimente mit ' Indicatoren-und-anderen FarbstOffen an Plasma- tropfen und nackten Protoplasten aus reifen Beeren yon Solanum nigrum. Cyto- logia 2, 67--76, 1930.

7. - - , The isoelectric point of cells and tissues. Transact. Faraday Soc. 26, 822--836, 1930.

8. - - , Kleine Beitrgge zur Bestimmung des I E P yon Protoplasten V. Protoplasma 15, 590--602, 1932".

9. R~SN~STR6M, Jo~s , Uber die Vergnderung der Plasmakolloide bei der Entwicklungs- anregung des Seeigeleies II . Protoplasma 5, 201--310, 1928.

10. S~UOGER, SIEGFR., Untersuchungen fiber den Einflul] der Wasserstoffionen auf das Protoplasma der Wurzelhaare yon Hordeum vulgate L. (I). Sitz.-Ber. Akad. Wien, ~I~th.-phys. K1. (1), 185, 453--478, 1926.