U 67-11252 KLINISCHE UND EXPERIMENTELLE UNTERSUCHUNGEN

ÜBER DYNAMIK UND WIRKUNGSWEISE DES ADRENOCORTICOTROPINS

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DR. MED. PETER G SCRIBA

AUS DER I I •MEDIZINISCHEN KLINIK DER UNIVERSITÄT MÜNCHEN DIREKTOR PROFESSOR DR.DR» GUSTAV BODECHTEL

KLINISCHE UND EXPERIMENTELLE UNTERSUCHUNGEN ÜBER DYNAMIK UND WIRKUNGSWEISE DES ADRENOCORTICOTROPINS

ALS HABILITATIONSSCHRIFT ZUR ERLANGUNG DER VENIA LEGENDI

UND ERNENNUNG ZUM PRIVATDOZENTEN

IN DER MEDIZINISCHEN FAKULTÄT DER

LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITÄT ZU MÜNCHEN

v o r g e l e g t v o n DR.MED. PETER 0. SCRIBA

aus Hamburg 1966

M i t Unterstützung der Deutschen Forschungsgerneinschaft und des US Department of H e a l t h , E d u c a t i o n and W e i f a r e

H a b i l i t a t i o n s d a t u m : 18.1.1967

Datum der Ernennung zum P r i v a t d o z e n t e n J 1 9 . 1 . 1 9 67

Fotodruck: Mikrokopie GmbH, 8 München 22, Bruderstraße 9

Meinen akademischen L e h r e r n und meinen Förderern

Mein besonderer Dank g i l t meinem v e r e h r t e n k l i n i s c h e n L e h r e r , H e r r n P r o f . D r . D r . G . B o d e c h t e l , für d i e U n t e r ­stützung, d i e er meiner A r b e i t z u t e i l werden ließ und für<-den freizügigen G e i s t , i n dem i n s e i n e r K l i n i k w i s s e n s c h a f t l i c h g e a r b e i t e t werden d u r f t e . Meinen M i t ­a r b e i t e r n , F r a u D. S e i b e r t , Fräulein M. F r i e s , H e r r n R. Hacker und H e r r n F. Kluge danke i c h für d i e e r f r e u ­l i c h e Zusammenarbeit, für den Fleiß und für d i e Gewis­s e n h a f t i g k e i t , m i t denen s i e a r b e i t e t e n . H e r r n P r i v . Doz. Dr.K. Schwarz s e i für anregende D i s k u s s i o n e n der e n d o k r i n o l o g i s c h e n Probleme h e r z l i c h gedankt, H e r r n Prof«Dr« P. Eymer für s e i n e f r e u n d l i c h e Unterstützung d i e s e r A r b e i t .

I N H A L T S V E R Z E I C H N I S S e i t e

E I N L E I T U N G 1 M E T H O D E N 5

I . AGTH-BESTIMMUNG DURCH MESSUNG DES ANSTIEGES DER CORTICOSTERON-INKRETION IM NEBENNIEREN-VENENBLUT DER AKUT HYPÖPHYSEKTOMIERTEN RATTE 1• Hypophysektomie 5 2. A r t e r i e n - und Venenkatheter 5 3« Co r t i o o s t e r o n b e s t l m m u n g im Nebennieren-

venenplasma der R a t t e 8 4« F l u o r i m e t r i s e h e Bestimmung der sog.

1 1 - H y d r o x y o o r t i c o s t e r o i d e 8 5. ACTH-BeStimmung : Standardlösungen und

mensohliohes Plasma 9 6. P u n k t i o n des Bulbus c r a n i a l i s venae J u g u l a r i s 10 7. A p p l i k a t i o n von ACTH-Standard- oder Plasma­

proben b e i der hypophysektomierten R a t t e . Auswertung und S t a t i s t i k 10

I I . SACCHAROSEDICHTEGRADIENTENZENTRIPUGATION 16 I I I . PRÄPARAT ION VON POLYSOMEN UND RIBOSOMEN 19 I V . INTRAVENÖSE GLUKOSEBELASTUNGEN 22

E R G E B N I S S E I . BESTIMMUNG VON ACTH-SPIEGELN IM MENSCHLICHEN

PLASMA 23 I I . VERSUCHE ZUM WIRKUNGSMEOHANISMUS DES ACTH 33

1. ACTH UND PROTEINSYNTHESE DER NEBENNIERE 33 a) BIOCHEMIE DER PROTEINSYNTHESE 34 b) PROTEINSYNTHESE IM NEBENNIERENHOMOGENAT 35 c) METHODIK 38 d) VORVERSUCHE 40 e) EINFLIES VON ACTH AUF DIE AKTIVITÄT DER

LÖSLICHEN ZELLFRAKTION 42 f ) NATUR DES STIMULIERENDEN FAKTORS IN DER

LÖSLICHEN ZELLFRAKTION 44 g) EINFLUSS VON ACTH AUF DIE AKTIVITÄT DER

MIKROSOMEN 50 h) KINETISCHE VERSUCHE MIT AMINOACYLTRANS-

FERASE UND POLYSOMEN AUS SCHWEINENEBEN­NIEREN 50

2. BEZIEHUNGEN ZWISCHEN PROTEINSYNTHESE UND CORTICOSTEROIDSYNTHESE a) EINFLUSS VON ACTH UND CYKLISCHEM

31,51-ADENOSINMONOPHOSPHAT IN VITRO 55 b) CORTICOSTEROID- UND PROTEINSYNTHESE NACH

HYPOPHYSEKTOMIE 59 I I I . SUPPRESSION DER ENDOGENEN CORTICOSTEROIDINKRETION

DURCH KURZZEITIGE CORTICOIDTHERAPIE 62

D I S K U S S I O N 65 Z U S A M M E N F A S S U N G . 78 L I T E R A T U R I

- 1 -

E I N L E I T U N G

Unter den Fächern der I n n e r e n M e d i z i n i s t d i e k l i n i s c h e E n d o k r i n o l o g i e i n ganz besonderem Maße von leistungsfähigen und s p e z i a l i s i e r t e n L a b o r a t o r i e n abhängig. Unter diesem Ge­s i c h t s p u n k t s o l l d i e s e A r b e i t aus dem G e b i e t der k l i n i s c h e n und e x p e r i m e n t e l l e n E n d o k r i n o l o g i e v e r s t a n d e n werden. Im Zentrum unseres I n t e r e s s e s und d i e s e r S c h r i f t s t e h t das A d r e n o c o r t i c o t r o p i n , dessen mannigfache f u n k t i o n e l l e V e r ­knüpfungen s c h e m a t i s c h i n Abb. 1 a d a r g e s t e l l t s i n d . D r e i F r a g e s t e l l u n g e n k l i n i s c h e r und e x p e r i m e n t e l l e r N atur haben uns i n den l e t z t e n J a h r e n besonders beschäftigt, und d i e s e s o l l e n h i e r e i n l e i t e n d k u r z a u f g e z e i g t werden.

Abb. 1 a: Schematische D a r s t e l l u n g der F r a g e s t e l l u n g e n d i e s e r S c h r i f t

r n o p i N JC F A C T O « \ ,

S Y N T H E S E

I N K R E T I O N

\ HEMM WIRKUNG 1

ADRENOCORTICOTROPIN S Y N T H E S E I N K R E T I O N j

C O R T I C O S T E R O I D E I

C O R T I C O I D E

B U L B U S C R A N . V A E . J U G U L A R I S

T R A N S P O R T A B B A U A U S S C H E I D U N G \/ENA

C U B I T A L I S

0 DIAGNOSTIK INKRETIONSRATE BIOLOGISCHE HALBWERTSZEIT

C O H T I C O S T E U O I O I : -S Y N T H E S E

INK R E T ION

N N H - W A C I I S T U M

• H O T K I N S Y N T H E S K etc.

(2) WIRKUNGSMECHANISMUS IN DER NEBENNIERE

Die R e g u l a t i o n der I n k r e t i o n von ACTH und C o r t i c o s t e r o i d e n , sowie des sog. C o r t i o o t r o p i n - R e l e a s i n g - F a c t o r s s i n d Gegen­s t a n d z a h l r e i c h e r D a r s t e l l u n g e n u n t e r dem G e s i c h t s p u n k t d e r K y b e r n e t i k ( v g l . 1, 2) gewesen, so daß w i r auf e i n e W i e d e r ­h o l u n g v e r z i c h t e n möchten. Es kann heute a l s g e s i c h e r t g e l ­t e n , daß aus dem Hypothalamus stammende F a k t o r e n (CRP) d i e Synthese und d i e I n k r e t i o n von ACTH im Hypophysenvorder-l a p p e n b e e i n f l u s s e n (3 - 2 2 ) .

Man hat d i e S t r u k t u r mehrer s o l c h e r Substanzen m i t CRF-Oharakter aufklären können (4, 8 ) . I m p l a n t a t i o n s v e r s u c h e m i t C o r t i c o s t e r o i d e n und ACTH sprechen dafür, daß d i e s e S u b s t a n ­zen aus dem Hypothalamus stammen ( 3 , 12 - 15, 20) und über Pfortadergefäße i n den Hypophysenvorderlappen gelangen kön­nen ( 3 , 16). Man vermutet e i n e n Rückkopplungsmechanismus zwischen CRP und ACTH ( 4 , 21, 2 2 ) . Nach neueren U n t e r s u c h u n ­gen w i r d das ACTH beim Menschen i n der R - Z e l l e , b e i der R a t t e i n a z i d o p h i l e n Z e l l e n s y n t h e t i s i e r t ( 5 , 23* 24)» Aus dem Hypophysenvorderlappen g e l a n g t das ACTH über d i e d i e Hypophyse umgebenden Sinus und d i e B l u t l e i t e r der Dura mater zum Bulbus c r a n i a l i s venae. j u g u l a r i s ( 3 , 140, 141). Es l a g nahe zu vermuten, daß d i e ACTH-Spiegel im Plasma aus dem Bulbus c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s höher s e i n würden a l s d i e S p i e g e l im Plasma aus dem übrigen venösen S t r o m g e b i e t , z.B. aus der Vena c u b i t a l i s . Das e r s t e der uns i n t e r e s s i e r e n ­den Probleme (Abb. 1 a) war, ob man aus dem U n t e r s c h i e d der P l a s m a s p i e g e l , welche w i r m i t t e l s e i n e r b i o l o g i s c h e n Be­s t immungsmetho de - C o r t i c o s t e r o n - A n s t i e g im Nebennieren-venenblut der akut hypophysektomierten R a t t e - erfaßten, ei n e Verbesserung der D i a g n o s t i k b e i bestimmten e n d o k r i n e n Erkrankungen e r z i e l e n , sowie I n f o r m a t i o n über I n k r e t i o n s ­r a t e n und b i o l o g i s c h e H a l b w e r t z e i t e n endogenen A d r e n o c o r t i o o -t r o p i n s e r h a l t e n könnten. Das g e l i n g t zumindest für erhöhte ACTH-Spiegel im Plasma, wie s i e b e i manchen Erkrankungen v o r ­l i e g e n . Auf d i e k l i n i s c h e Bedeutung d i e s e r d i f f i z i l e n Metho­de i s t im E r g e b n i s t e i l näher eingegangen worden.

Das B l u t i s t für das AOTH T r a n s p o r t o r g a n und l i e f e r t es den für d i e b i o l o g i s c h e H a l b w e r t z e i t e n t s c h e i d e n d e n Vorgängen

~ 3 -

wie V e r t e i l u n g , Abbau und Aussche i d u n g aus« Nur e i n sehr k l e i n e r T e i l des ACTH g e l a n g t auf dem a r t e r i e l l e n Wege i n d i e Nebenniere, um d o r t s e i n e s p e z i f i s c h e n Wirkungen a u s z u ­üben« E i n e ganze Reihe von Wirkungen des ACTH auf d i e Neben­n i e r e n r i n d e s i n d bekannt« ACTH s t e i g e r t d i e D u r c h b l u t u n g der Ne b e n n i e r e n r i n d e (116 - 120), es führt zu e i n e r Ausschüttung von Askorbinsäure und C o r t i c o s t e r o i d e n , sowie z u e i n e r S t e i ­gerung der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e i n der Nebenniere« Daneben i s t ACTH der für d i e Größe der Nebenniere v e r a n t w o r t l i c h e P a k t o r (263, 263a und b ) . Läßt s i c h für a l l e d i e s e E f f e k t e e i n gemeinsamer Wirkungsmechanismus des ACTH f i n d e n ? D i e s e Präge i s t das z w e i t e Thema u n s e r e r Untersuchungen (Abb« 1a)« Wir kommen, wie im E r g e b n i s t e i l ausgeführt, zu dem Schluß, daß d i e genannten Wirkungen des ACTH d i s s o z i i e r b a r s i n d und daß d i e nPrimärWirkung" des ACTH noch unbekannt ist«

Der Wirkungsmechanismus von Hormonen i s t Gegenstand sehr z a h l r e i c h e r Untersuchungen i n den v e r s c h i e d e n s t e n L a b o r a ­torien« Besondere Aufmerksamkeit h a t man i n den l e t z t e n J a h r e n der Wirkung d e r Hormone auf d i e P r o t e i n s y n t h e s e bzw. auf d i e Synthese von Nucleinsäuren i n den Z i e l o r g a n e n oder -geweben gewidmet (25 - 3 1 ) . Es i s t i n diesem Rahmen n i c h t möglich, d i e P r o b l e m a t i k a l l e r d i e s e r Untersuchungen e i n z e l n z u d i s k u t i e r e n , es s e i nur auf entsprechende U n t e r ­suchungen zum Wirkungsmechanismus des T e s t o s t e r o n s (32 - 3 6 ) , der Oestrogene (37 - 4 1 ) . der C o r t i c o s t e r o i d e (42 - 47)» der Schilddrüsenhormone (48 - 54 ) , des I n s u l i n s (55 - 6 0 ) , des Wachstumshormons (61 - 63 ) , des t h y r e o t r o p e n Hormons (64) und schließlich des A d e n o c o r t i c o t r o p i n s (s«u«; v e r w i e s e n . D i e s e n Untersuchungen l i e g t im a l l g e m e i n e n d i e V o r s t e l l u n g zu Grunde, daß Hormone über d i e I n d u k t i o n der Synthese von Enzymproteinen i h r e v e r s c h i e d e n a r t i g e n b i o l o g i s c h e n E f f e k t e bewirken« I n t e r e s s a n t e biochemische Untersuchungen über d i e I n d u z i e r b a r k e i t der P r o t e i n s y n t h e s e s i n d auf d i e s e Weise entstanden«

Unser I n t e r e s s e g a l t a l s o dem Mechanismus, du r c h den ACTH d i e P r o t e i n s y n t h e s e i n der Nebenniere b e s c h l e u n i g t und der Präge, ob e i n Zusammenhang zwischen der Wirkung des ACTH auf d i e P r o t e i n s y n t h e s e und auf d i e C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e besteht« Daß d i e s e Untersuchungen n i c h t nur e x p e r i m e n t e l l e s , sondern auoh k l i n i s c h e s I n t e r e s s e haben, wurde o f f e n b a r , a l s w i r uns m i t der P u n k t i o n der Nebenniere nach Hypophysek-tomie bzw. u n t e r S u p p r e s s i o n durch exogene C o r t i c o i d e be­schäftigten.

Dem K l i n i k e r i s t es s e i t langem bekannt, daß exogene O o r t i c o i d e zu e i n e r S u p p r e s s i o n der F u n k t i o n des Hypophysen-vord e r l a p p e n - N e b e n n i e r e n r i n d e n - S y s t e m s führen. D i e O o r t i c o i d e w i r k e n ebenso wie d i e endogenen C o r t i c o s t e r o i d e hemmend a u f Synthese und Ausschüttung des C o r t i c o t r o p i n - R e l e a s i n g - F a c t o r s (10, 18, 20, 65 - 72, 166). Exogene O o r t i c o i d e s c h e i n e n f e r n e r auch unabhängig von der S u p p r e s s i o n der CEF- und ACT H - I n k r e t i o n d i r e k t s u p p r i m i e r e n d auf d i e N e b e n n i e r e n r i n d e zu w i r k e n (19, 72, 166). Es i s t u m s t r i t t e n , ob O o r t i c o i d e oder C o r t i c o s t e r o i d e d i r e k t bremsend auf den Hypophysenvorder­l a p p e n w i r k e n (10, 19 - 22, 6 5 ) . Im Zusammenhang m i t dem Suppressionsphänomen haben w i r uns für d i e D i s s o z i i e r b a r k e i t der ACTH-Wirkung auf d i e C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e und auf d i e P r o t e i n s y n t h e s e i n der Nebenniere nach Hypophysektomie i n t e r e s s i e r t .

E i n etwas ungewöhnlicher Weg, d i e s u p p r i m i e r e n d e Wirkung von O o r t i c o i d e n auf d i e Hypophysen-NebenfTierenrindenfunktion zu untersuchen (Abb. 1 a ) , ergab s i c h im Zusammenhang m i t un­s e r e n früheren Untersuchungen über den Wert d e r i . v . G l u c o s e -B e l a s t u n g £ür d i e E r f a s s u n g e i n e s l a t e n t e n D i a b e t e s m e l l i t u s (79t 8 0 ) . Während d i e m e i s t e n der v o r l i e g e n d e n Untersuchun­gen (66 - 72) über d i e S u p p r e s s i o n s w i r k u n g von C o r t i c o i d e n b e i P a t i e n t e n durchgeführt wurden, d i e r e l a t i v hohe Dosen über längere Zeiträume e r h i e l t e n , haben w i r d i e Wirkung e i n e r wenige Tage dauernden P r e d n i s o l o n - B e h a n d l u n g u n t e r s u c h t . Nach A b s e t z e n e i n e r s o l c h e n Behandlung i s t d i e f l u o r i m e t r i s c h erfaßte endogene C o r t i c o s t e r o i d p r o d u k t i o n s u p p r i m i e r t (74, 82) und d i e m i t t e l s i . v. Grlucose-Belastung erfaßte Glucose-T o l e r a n z vorübergehend erhöht ( 8 1 ) . Da d i e H a l b w e r t z e i t der O o r t i c o i d e wenige Stunden beträgt (73) i n t e r p r e t i e r e n w i r d i e Erhöhung der G l u c o s e - T o l e r a n z a l s Z e i c h e n e i n e r flüchtigen l a t e n t e n N e b e n n i e r e n r i n d e n s u f f i z i e n z .

Die enge Verknüpfung von k l i n i s c h e r und e x p e r i m e n t e l l e r E n d o k r i n o l o g i e s o l l a l s o an den im f o l g e n d e n eingehend darge­s t e l l t e n E r g e b n i s s e n z u den genannten d r e i F r a g e s t e l l u n g e n (Abb. 1 a) a u f g e z e i g t werden.

M E T H O D E N

AOTH-BESTIMMUNG DURCH MESSUNG DES ANSTIEGES DER CORTICOSTERON-INKRETION IM NEBENNIERENVENENBLUT DER AKUT HYPOPHYSEKTOMIERTEN

RATTE.

1» Hypophysektomie Die Hypophysektomie der R a t t e wurde b e i uns auf dem p a r a ­p h a r y n g e a l e n Wege (104) durchgeführt. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (190.- 230 g) e r h i e l t e n u n t e r k u r z e r A e t h e r -n a r k o s e 0,8 ml 2,5#ige. Avertin® -Lösung ( T r i b r o m a e t h a n o l i n Amylenhydrat, Bayer-Leverkusen) pro 100 g Körpergewicht i n t r a ­p e r i t o n e a l , was zu einem etwa 25 M i n u t e n a n h a l t e n d e n T o l e r a n z ­s t a d i u m führte. Die e i n z e l n e n S c h r i t t e der Hypophysektomie s i n d i n Abb. 1-7 f e s t g e h a l t e n . Nach einem paramedianen H a u t s c h n i t t an der l i n k e n H a l s s e i t e wurde der l i n k e Musculus d i g a s t r i o u s d a r g e s t e l l t . Unter Verwendung e i n e r O p e r a t i o n s l u p e m i t 10f a c h e r Vergrößerung ( L e i t z ) wurde l a t e r a l des S e h n e n s p i e g e l s des M. d i g a s t r i c u s s a g i t t a l i n d i e T i e f e b i s auf den P r o c e s s u s mesopteryg oideus gegangen. Von dem P r o c e s s u s g e l a n g t man d u r c h d i e M u s k u l a t u r auf d i e l e i c h t bläuliche S y n c h o n d r o s i s spheno-o c c i p i t a l i s , auf d i e e i n e i n der Medianen von dem Poramen o c c i p i t a l e magnum nach r o s t r a l v e r l a u f e n d e C r i s t a s e n k r e c h t a u f t r i f f t . R o s t r a l vom S c h n i t t p u n k t wurde m i t einem K u g e l b o h r e r m i t der Hand v o r s i c h t i g das Sphenoid b i s auf d i e Dura d u r c h ­b o h r t und m i t einem r e c h t w i n k l i g abgebogenen, s p i t z z u l a u f e n ­den G l a s r o h r (Öffnung der S p i t z e 1 mm) u n t e r Sog von e i n e r Wasserstrahlpumpe d i e Hypophyse u n t e r Schonung der Membrana t e c t o r i a h e r a u sgesaugt. D i e Haut wurde d u r c h 2 Michel-Klammern v e r s c h l o s s e n . - Nach der ACTH-BeStimmung (s.u.) wurde d i e V o l l ­ständigkeit der Hypophysektomie durch I n s p e k t i o n der Membrana t e c t o r i a nach D a r s t e l l u n g der Schädelbasis von oben v e r i f i z i e r t (Abb. 1 - 7 ) .

2» A r t e r i e n - und Venenkatheter Nach Hypophysektomie nimmt d i e E m p f i n d l i c h k e i t , m i t der d i e R a t t e auf ACTH m i t g e s t e i g e r t e r Corticosteron-Ausschüttung r e a g i e r t , i n n e r h a l b weniger Stunden s c h n e l l ab ( 1 0 1 ) . Das i s t der Grund, warum man kleinstmögliche AOTH-Mengen an der akut hyp o p h y s e k t o m i e r t e n R a t t e bestimmen muß. Vor kurzem wurde a l l e r ­d i n g s von OHSAWA (115) m i t g e t e i l t , daß d i e E m p f i n d l i c h k e i t von R a t t e n , d i e 24 Stunden v o r h e r hypophysektomiert worden waren und 2 Stunden v o r der ACTH-Be Stimmung 10 mE ACTH i . V . e r h a l ­t e n h a t t e n , g l e i c h gut s e i . Be± uns wurde 60 - 70 M i n u t e n nach der Hypophysektomie i n UrethaifS) - Narkose (10 #ige Lösung, Merck, 1,2 ml/1oo g R a t t e s.c«) d i e l i n k e A. f e m o r a l i s i n der Po s s a i n g u i n a l i s kanüliert und der K a t h e t e r (Gefäßkatheter OR, Braun - Melsungen, m i t einem K u p f e r d r a h t a l s .Mandrin) 7 cm w e i t i n d i e A o r t a geschoben, so daß d i e K a t h e t e r s p i t z e c a . 1 cm

Abb 2 Abb. 3

ZU DEN ABBILDUNGEN

1 Situs noch Eröffnung der H a l s f a s -cien. Eingehen bei der Pfeilspitze lateral vom Sehnenspiegel des M. digastricus

2 Processus mesopterygoideus dar­gestellt

3 Bohrfeld an der unteren Schädelba -sis freipräpariert. Synchondrosis spheno- occipitalis und Crista sind deutlich zu erkennen. Unterhalb der Synchondrose ist zur Verdeutlichung der anatomischen Verhältnisse weiter als notwendig freipräpariert

4 Bohrloch bis auf die Dura mater

5 Hypophyse herausgesaugt nach

Aufreissen der Dura

6 Schädelbasis von oben : Hypophyse in situ

7 Schädelbasis von oben Hypophyse entfernt Beide Nervi optici sind zu erken­nen

Vergrößerung von Abb 1.6.7 etwa 5-fach von Abb 2.3.4.5 etwa 15-fach

HYPOPHYSECTOMIE VON

RATTEN AUF DEM PARA­

PHARYNGEALEN W E G

Abb 6 Abb 7

o b e r h a l b der D u r c h t r i t t s t e l l e der A o r t a d u r c h das Diaphragma (Abb. 8) und s i c h e r o b e r h a l b der d i e Nebenniere versorgenden A r t e r i e n l a g ( 1 1 6 ) .

Abb. 8: Schema der A r t e r i e n und Venenkatheter der R a t t e . I n Anlehnung an (107, 116).

AORTA

KUMSCHLUSS ODE* BLUTENTNAHME

Der a r t e r i e l l e K a t h e t e r d i e n t e z u r A C T H - A p p l i k a t i o n ( s . u . ) j d i e s e M o d i f i k a t i o n wurde gewählt, um d i e E m p f i n d l i c h k e i t der

Methode zu s t e i g e r n (107)» Sodann wurde d i e r e c h t e und d i e l i n k e V. f e m o r a l i s k a t h e t e r i s i e r t (CLAY-ADAMS-Polyaethylen-K a t h e t e r , PB 10, F a . V o g e l , G i e s s e n / L a h n ) , wobei der l i n k e Venenkatheter 5 cm w e i t , der r e c h t e b i s i n d i e Vena i l i a c a communis vorgeschoben wurde. S o f o r t nach Einführung wurden a l l e K a t h e t e r m i t H e p a r i n d u r c h g e s p r i t z t , insgesamt e r h i e l t e n d i e T i e r e 50 E H e p a r i n pro 100 g R a t t e (0,5 ml Vetren©, Promonta, Hamburg, pro 100 g ) . Schließlich wurde l a p a r o t o m i e r t , d i e S p i t z e des l i n k e n F e m o r a l i s k a t h e t e r s i n der Vena cava a u f ­gesucht und über d i e l i n k e Nierenvene s o w e i t wie möglich i n die l i n k e Nebennierenvene h i n e i n d i r i g i e r t ( 1 2 3 ) • D i e g e l e g e n t ­l i c h v o r der K a t h e t e r s p i t z e einmündende Vena p h r e n i c a i n f e r i o r wurde n i c h t l i g i e r t . D ie Bauchhöhle wurde d u r c h Kompressen f e u c h t und das T i e r b e i c a . 35°C ( I n f r a r o t l a m p e ) g e h a l t e n . Wenn n i c h t gerade B l u t entnommen wurde, waren d i e Venenkatheter ( r e c h t e und l i n k e V. f e m o r a l i s ) k u r z g e s c h l o s s e n ( v g l . s c h e m a t i ­sche D a r s t e l l u n g , Abb. 8 ). Nach dem V e r s u c h wurde d i e Lage der K a t h e t e r k o n t r o l l i e r t .

3# Cortioosteron-Bestimmung im Nebennierenvenenplasma der R a t t e Das aus der Nebennierenvene stammende B l u t wurde ohne Sog i n Hämatokritröhrchen aufgefangen, b i s zum Ende des Versuches b e i + 4 0 aufgehoben und d i e Gesamtblut- und -plasmamenge nach Z e n t r i f u g a t i o n (15 M i n . x 1000 x g) ab g e l e s e n . D i e Plasmamenge wurde m i t Wasser auf 1,0 ml gebracht und b i s zur C o r t i c o s t e r o n -Bestimmung b e i - 18° 0 aufgehoben. Unter geringfügiger Abän­derung der Methode von ZENKER und BERNSTEIN (122) wurde der öorticosterongehalt des Rattennebennierenplasmas f l u o r i m e t r i s c h bestimmt. - B e k a n n t l i c h i s t der Q u o t i e n t C o r t i s o l zu C o r t i c o -s t e r o n b e i der R a t t e k l e i n e r a l s 0,05 ( 1 2 1 ) . - D ie Plasma­proben (1 ml) wurden m i t C h l o r o f o r m (15 ml) e x t r a h i e r t , der wässerige Überstand (5 M i n . x 800 x g) abgesaugt und der C h l o r o f o r m e x t r a k t m i t 1,5 ml 0,1 fi NaOH gewaschen. Zu je 6 ml C h l o r o f o r m e x t r a k t wurden 3 ml F l u o r e s z e n z r e a g e n s (2,4 Volumen k o n z e n t r i e r t e Schwefelsäure und 1,0 Volumen 50$iges (V/V) wässeriges Äthanol) gegeben, 15 Sek. geschüttelt und 5 Min. x 800 x g z e n t r i f u g i e r t . D i e überstehende Chloroformphase wurde abgesaugt und nach 2 S t d . d i e F l u o r e s z e n z m i t dem F l u o r e s z e n z ­z u s a t z zum Photometer Eppendorf ( N e t h e l e r & H i n z GmbH, Ham­burg) u n t e r Verwendung des Primärfilters von 405 + 4 3 5 nm, des Sekundärfilters 500 - 3000 nm und des v e r k l e i n e r t e n S t a n ­dards Nr. 5816 gemessen. Doppelwerte der Plasmaproben wurden i n zwei Reihen von E i n z e l w e r t e n i n der R e i h e n f o l g e der E x t r a k ­t i o n gemessen. Weitere E i n z e l h e i t e n der Methode werden ander­w e i t i g m i t g e t e i l t (173, 174).

4. Flu o r i m e t r i sehe Bestimmung der sog. 11-Hydroxy c o r t i c o s t e r o i d e , Da ACTH-Spiegel, insbesondere wenn s i e erhöht s i n d , nur dann s i n n v o l l zu i n t e r p r e t i e r e n s i n d , wenn d i e zum Z e i t p u n k t der Messung des ACTH-Spiegels gegebene P i a s m a - C o r t i s o l - K o n z e n t r a -t i o n bekannt i s t (101,* 102;, haben w i r nach der Methode von

deMOOR und STEENO ( 1 7 5 ) , sowie MATTINGLY und M i t a r b . (176) und w e i t e r e n V e r f a s s e r n (177 - 183) d i e sog. 11-Hydroxy-c o r t i c o s t e r o i d e f l u o r i m e t r i s o h bestimmt. D i e Bezeichnung 1 1 - H y d r o x y c o r t i c o s t e r o i d e i s t n i c h t ganz k o r r e k t ; für d i e P r a x i s i s t w i c h t i g z u w i s s e n , daß b e i der Verwendung d i e s e r Methode im m e n s c h l i c h e n Plasma im w e s e n t l i c h e n C o r t i s o l und C o r t i c o s t e r o n erfaßt werden, wobei das C o r t i c o s t e r o n i n ge­r i n g e r e r Menge v o r l i e g t , dafür aber e i n e stärkere F l u o r e s z e n z g i b t . - Zwei ml Plasma wurden m i t 15 ml M e t h y l e n c h l o r i d über­s c h i c h t e t und i n einem s i c h langsam drehenden Ro t o r 20 M i n . l a n g e x t r a h i e r t . Nach Absaugen der wässrigen Phase wurde der M e t h y l e n c h l o r i d - E x t r a k t m i t 2 i l 11 NaOH 20 Sek. l a n g ge­schüttelt, 10 M i n . später d i e Natr o n l a u g e abgesaugt und 8 ml des M e t h y l e n c h l o r i d - E x t r a k t e s m i t 4 ml F l u o r e s z e n z r e a g e n s (7 Volumen k o n z e n t r i e r t e Schwefelsäure und 3 Volumen a b s o l u ­t e r A e t h y l a l k o h o l ) 20 Sek. h e f t i g geschüttelt. Nach Absaugen des überstehenden M e t h y l e n c h l o r i d s wurde das F l u o r e s z e n z ­reagens i n ei n e Glasküvette geschüttet und genau 13 M i n . nach Zugabe des M e t h y l e n c h l o r i d s zum F l u o r e s z e n z r e a g e n s d i e F l u o r e s z e n z wie oben gemessen. A l s Sta n d a r d d i e n t e b e i d i e s e n Bestimmungen C o r t i s o l , so daß d i e Angabe der gefundenen Werte i n gamma C o r t i s o l p ro 100 ml Plasma e r f o l g t e (Versuche m i t M. MÜLLER - BARDORFF und W. HOCHHEUSER ( 8 2 ) , N o r m a l b e r e i c h : ca 5 - 23 gamma für 9 Uhr morgens).

5. ACTH-Be Stimmung: Standardlösungen und m e n s c h l i c h e s Plasma I n den m e i s t e n L a b o r a t o r i e n , d i e s i c h m i t der b i o l o g i s c h e n ACTH-BeStimmung beschäftigen, mißt man ACTH Standards an einem K o l l e k t i v akut h y p o p h y s e k t o m i e r t e r R a t t e n und d i e un­bekannten Proben an einem anderen K o l l e k t i v (101 - 103, 105, 106, 108 - 115, 132). W ir waren m i t der S t r e u b r e i t e des C o r t i c o s t e r o n - A n s t i e g e s im Nebennierenvenenblut der R a t t e nach ACTH n i c h t z u f r i e d e n und haben daher v e r s u c h t , durch Berücksichtigung der i n d i v i d u e l l e n E m p f i n d l i c h k e i t der e i n ­z e l n e n R a t t e gegen ACTH d i e R e p r o d u z i e r b a r k e i t der Methode zu v e r b e s s e r n . D i e R a t t e n e r h i e l t e n daher e i n e oder zwei k l e i n e Standardmengen ACTH ( b i s 0,05 m E) v o r der I n j e k t i o n des zu bestimmenden Plasmas ( 1 0 7 ) . - Zur H e r s t e l l u n g der ACTH-Standardlösuggen wurde s y n t h e t i s c h e s Beta-1-24 C o r t i o o -t r o p i n (SynaothenE^ Oiba) oder der i n t e r n a t i o n a l e A r b e i t s ­s t a n d a r d für C o r t i c o t r o p h i n (WH0, 1962, Nat.IiBt.Med.Research, M i l l H i l l , London, NW 7) m i t 0,001 N rHCl-0,9 $ NaCl-Lösung, der i n den e r s t e n Versuchen 0,2 # Humanalbumin z u g e s e t z t war, gelöst. Der Z u s a t z von Humanalbumin u n t e r b l i e b später, da w i r wie andere A u t o r e n k e i n e U n t e r s c h i e d e f e s t s t e l l e n k onnten (13 1 ) . Die Verdünnung e r f o l g t e i n der Kälte, d i e Standardlösungen wurden b e i mindestens -18°C für den Z e i t r a u m von höchstens 5 Tage aufgehoben. Nach diesem Z e i t r a u m h a t t e n e i n g e f r o r e n e Standardlösungen n a c h w e i s l i c h an Aktivität v e r ­l o r e n . S t a n d a r d - und Plasmaproben waren b e i jedem u n t e r s u c h ­t e n P a t i e n t e n etv/a g l e i c h l a n g e i n g e f r o r e n . - D i e b i o l o g i s c h e Testung des B e t a - 1 - 2 4 - C o r t i c o t r o p i n s von C i b a h a t t e g e z e i g t , das man m i t e i n e r b i o l o g i s c h e n Aktivität von 100 - 110 E/mg rechnen kann (124 - 130). A l l e Angaben von ACTH-Spiegeln im

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Plasma e r f o l g e n i n E i n h e i t e n s t a t t i n mg, da das den V e r ­g l e i c h m i t den Werten des I n t e r n a t i o n a l e n S t a n d a r d s und den Werten ande r e r A u t o r e n (101, 102, 106 - 115) e r l e i c h t e r t • -D i e ACTH- und Corticosteroiä>Inkretion u n t e r l i e g t beim Menschen b e k a n n t l i c h einem Tagesrhythmus, d i e höchsten Wer­t e werden i n den frühen Morgenstunden gefunden (136, 1 3 7 ) , so daß w i r das z u untersuchende B l u t j e w e i l s morgens um 6 Uhr abnahmen*

6* P i m V t i o n des Bulbus c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s Das venöse B l u t des Hypophysenvorderlappens fließt über d i e d i e Hypophyse umgebenden S i n u s und d i e größeren S i n u s d e r Dura ab* D i e s e münden b e i d e r s e i t s i n den B u l b u s c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s , w e l c h e r d i e P o s s a j u g u l a r i s des F e l s e n ­b e i n s erfüllt (140, 1 4 l ) . | D i e Vena j u g u l a r i s erhält e r s t im O a r o t i s d r e i e c k z a h l r e i c h e ' w e i t e r e venöse Zuflüsse (141) • Durch P u n k t i o n des Bulbus c r a n i a l i s vae. j u g u l a r i s , wie das j a auch b e i der Messung der H i r n d u r c h b l u t u n g g e s c h i e h t (138, 139), erhält man e i n "hypophysäres11 V e n e n b l u t , welches a l l e r d i n g s b e r e i t s d u r c h etwa 15 $» des Herzminutenvolumens (139) verdünnt i s t . - Unter Lokalanästhesie wurde i n S e i t e n ­l a g e r u n g des Kopfes b e i l e i c h t angezogenem K i n n e i n e etwa 6 cm l a n g e Kanüle m i t Ma n d r i n c a . 1 cm u n t e r h a l b des P r o c e s s u s mastoideus am v o r d e r e n Hand des Musculus s t e r n o -c l e i d o m a s t b i d e u s m i t e i n e r Neigung von etwa 40° i n R i c h t u n g auf den Bulbus c r a n i a l i s vae. j u g u l a r i s vorgeschoben. Nach P u n k t i o n des Baibus wurde 15 M i n . g e w a r t e t , um den " S t r e s s " d i e s e r P u n k t i o n a b k l i n g e n zu l a s s e n , und dann B l u t aus dem Bul b u s und aus e i n e r C u b i t a l v e n e m i t h e p a r i n i s i e r t e n S p r i t z e n entnommen* Das B l u t wurde s o f o r t im E i s b a d z u r Kühlzentrifuge ge b r a c h t und b e i + 4°C 10 Min* b e i 1000 x g z e n t r i f u g i e r t . Das so e r h a l t e n e Plasma wurde i n mehrere P r o b e n a u f g e t e i l t , b e i -18°C e i n g e f r o r e n und b i s z u r Be­stimmung aufgehoben. Die Stabilität des ACTH im B l u t b e i 37° und b e i 2°0 i s t u m s t r i t t e n (142 - 144, 134, 145), so daß w i r d a r a u f bedacht waren, das Plasma b e i n i e d r i g e n Tempera­t u r e n z u gewinnen und möglichst s c h n e l l zu v e r a r b e i t e n . (Versuche m i t P. DIETERLE, 173).

7. A p p l i k a t i o n von ACTH S t a n d a r d - odBr Plasmaproben b e i der hypophysektomierten R a t t e . Auswertung und S t a t i s t i k

V orversuche h a t t e n d i e aus der L i t e r a t u r (101, 102) wohlbe­kannte Tatsache bestätigt, daß spätestens 90 M i n u t e n nach der Hypophysektomie d i e C o r t i c o s t e r o n i n k r e t i o n i n das Ne-benn i e r e n v e n e n b l u t auf e i n e n B a s i s s p i e g e l (Abb* 9) abge­sunken i s t ( c a * 0,020 Gamma C o r t i c o s t e r o n p r o 4 M i n * ) * Da d i e E m p f i n d l i c h k e i t der O o r t i c o s t e r o n s y n t h e s e der Neben­n i e r e gegenüber AOTH h i e r a u f s c h n e l l abnimmt. (112, 115, 119), haben w i r b e i a l l u n s eren Bestimmungen 90 Mi n * nach Hypophyse aktomie m i t der A p p l i k a t i o n der Standardlösung von AGTH begonnen*

- 11 ~

Abb. 9: E i n s t e l l u n g der C o r t i c o s t e r o n - B a s i s - S e k r e t i o n nach Hypophysektomie Hypophysektomie und O o r t i c o s t e r o n b e s t i m m u n g im Nebennierenvenenblut, wie oben beschrieben«

CORTICOSTERON PRO 4 MIN.

0.600r

• i i i l l 1

W 20 30 kO 50 60 70 MIN. NACH HYPOPHYSEKTOMIE

M i t t e l s e i n e s Gerätes z u r k o n t i n u i e r l i c h e n I n f u s i o n ( P e r f u s o r , Fa. Braun, Melsungen) wurden 1 ml der z u u n t e r ­suchenden Lösung i n n e r h a l b von 94 Sek. über den A o r t e n ­k a t h e t e r (Abb. 8) i n f u n d i e r t . Vor j e d e r I n f u s i o n e i n e r Standardlösung oder e i n e s Plasmas wurde e i n - oder zweimal 4 M i n . l a n g B l u t aus dem Nebennierenvenenkatheter entnom­men, um z u k o n t r o l l i e r e n , ob d i e G o r t i c o s t e r o n s e k r e t i o n a u f d i e Basishöhe abgesunken war. Genau 3 M i n . nach B e g i n n der I n f u s i o n der Testlösung b i s 11 M i n . danach wurde B l u t

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aus der Nebennierenvene z u r C o r t i c o s t e r o n b e s t i m m u n g e n t ­nommen. Der Z e i t r a u m zwischen der 3* und 11. Minute wurde nach Vorversuchen gewählt. D i e s e h a t t e n g e z e i g t (Abb.10).

Abb. 10: Dauer der Wirkung v e r s c h i e d e n e r Dosen ACTH auf d i e C o r t i c o s t e r o n - I n k r e t i o n .

daß nach i n t r a a r t e r i e l l e r I n f u s i o n s t e i g e n d e r Dosen von ACTH vbei k o n t i n u i e r l i c h e r Bestimmung der C o r t i c o s t e r o n -Ausschüttung i n das Nebennierenvenenblut i n 4-minütigen I n t e r v a l l e n w e s e n t l i c h länger anhaltende A n s t i e g e der Oorticosteron-Ausschüttung e r f o l g e n ( 1 0 1 ) . W i l l man an einem T i e r , wie oben erwähnt, zwei oder d r e i ACTH-Bestim-mungen durchführen, so würde der B l u t v e r l u s t b e i längeren Entnahmeperioden für das T i e r j e d o c h zu groß. Es s e i f e s t ­g e h a l t e n , daß b e i der 8-minütigen Sammelperiode ( 3 . - 11.Min.) a l s o nur e i n T e i l und v o r a l l e m i n Abhängigkeit von der D o s i s wechselnd k l e i n e r A n t e i l der S t e i g e r u n g der O o r t i ­costeron-Ausschüttung durch ACTH erfaßt wurde. Abb. 10 z e i g t

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f e r n e r , daß man 20 M i n . nach I n f u s i o n e i n e r Standardmenge von 0,05 mE AOTH damit rechnen kann, daß d i e C o r t i c o s t e r o n -Ausschüttung wieder auf d i e B a s i s zurückgekehrt i s t . Daher gaben w i r b e i den m e i s t e n u n s e r e r Bestimmungen 24 M i n . nach I n f u s i o n der Standardmenge von 0,05 mE d i e zu u n t e r ­suchenden Plasmen. Auch nach der I n f u s i o n von 1 ml Plasma wurde von der 3» b i s z u r 11. M i n . Nebennierenvenenblut aus dem K a t h e t e r gesammelt und der C o r t i c o s t e r o n g e h a l t im Plasma,wie oben b e s c h r i e b e n , bestimmt. I n der L i t e r a t u r b estehen e r h e b l i c h D i s k r e p a n z e n um d i e Ab­grenzung d i e s e r Sammelperiode (101, 102, 107, 108, 113, 119). Pur ungünstig h a l t e n w i r , wie nach Abb.10 verständlich, daß manche A u t o r e n e i n e k o n s t a n t e Blutmenge (0,6 ml) sammeln und d i e Z e i t r e g i s t r i e r e n . - Es i s t j a aus der L i t e r a t u r bekannt (116 - 120) und war auch b e i unseren Versuchen z u beobachten, daß ACTH d i e Durchblutung der Nebenniere s t e i ­g e r t . Man weiß f e r n e r , daß b e i konstantem ACTH-Spiegel e i n e S t e i g e r u n g der D u r c h b l u t u n g zu e i n e r S t e i g e r u n g der C o r t i -c o s t e r o i d s e k r e t i o n führt (117, 118). Man s i e h t nun auch nach i n t r a a r t e r i e l l e r I n f u s i o n von 1 ml p h y s i o l o g i s c h e r Koch­salzlösung b e r e i t s , wenn auch g e r i n g e r e , S t e i g e r u n g e n der Neb e n n i e r e n d u r c h b l u t u n g . Wie e r h e b l i c h d i e s e r P a k t o r s e i n muß, wenn man wie manche A u t o r e n b i s zu 5 ml m e n s c h l i c h e s Plasma pro R a t t e i n j i z i e r t (108, 109, 114a), i s t e i n l e u c h t e n d . Die Wirkung von ACTH-Dosen i s t nur b e i I n f u s i o n g l e i c h e r Volumina bzw. möglichst g l e i c h e r N e b e n n i e r e n d u r c h b l u t u n g z u b e u r t e i l e n . Schließlich kann wegen der D u r c h b l u t u n g s s t e i g e ­r u n g d i e Wirkung von ACTH auf d i e C o r t i c o s t e r o n - S y n t h e s e nur b e i E r f a s s u n g der Zunahme der C o r t i c o s t e r o n - M e n g e , n i c h t aber der C o r t i c o s t e r o n - K o n z e n t r a t i o n im Nebennierenvenenblut (112) erfaßt werden. Trägt man d i e gegebene D o s i s ACTH und den A n s t i e g der C o r t i -costeron-Ausschüttung i n der Nebennierenvene gegenüber 0,9 i° N a C l - I n f u s i o n e n d o p p e l t l o g a r i t h m i s c h gegeneinander a u f (Abb»11). so erhält man e i n e l i n e a r e E i c h k u r v e von 0,01 -0,5 mE ACTH. Die D o s i s w i r k u n g s k u r v e i s t nur für d i e s e n Be­r e i c h l i n e a r , s i e w i r d e r s t b e i höchsten Dosen (> 1,0 mE) f l a c h e r . B e i b i o l o g i s c h e n Bestimmungsmethoden i s t an s i c h m i t e i n e r l i n e a r e n Beziehung zwischen dem Logarithmus der D o s i s und der Wirkung zu rechnen. E i n e s o l c h e Beziehung wurde für den B e r e i c h unsere^ E i c h k u r v e (Abb» 11) n i c h t gefunden, auch dann n i c h t , wenn^wie i n Abb #11 d i e S t e i g e r u n g der C o r t i c o s t e r o n - I n k r e t i o n von der 3. b i s z u r 11.Minute, s o n d e r n d i e gesamte S t e i g e r u n g der C o r t i c o s t e r o n - I n k r e t i o n , wie i n Abb. 10 d a r g e s t e l l t , gegen den Logarithmus der ACTH-Dosis a u f g e t r a g e n wurde. Es wurde schon b e t o n t , daß b e i u n s e r e r Versuchsanordnung nur e i n i n Abhängigkeit von der Größe der D o s i s wechselnder T e i l der Wirkung erfaßt wurde ( s . o . ) . / -B e i der Prüfung der E m p f i n d l i c h k e i t der Methode z e i g t e s i c h , daß zwischen der D o s i s 0,01 mE ACTH ( n » 95) und e i n e r Koch­s a l z i n f u s i o n (n a 10) e i n nur sehr schwach s i g n i f i k a n t e r U n t e r s c h i e d bestand (0,15> p > 0 , 1 0 ) . Dagegen f a n d s i c h e i n s i g n i f i k a n t e r U n t e r s c h i e d zwischen der Wirkung von 0,025 mE

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Abb. 11: E i c h k u r v e D o s i s ACTH und A n s t i e g der C o r t i c o s t e r o n -I n k r e t i o n

Angegeben s i n d d i e M i t t e l w e r t e ( x ) und Standardabweichun­gen der M i t t e l w e r t e (<5 - ) von (n) a l s t e c h n i s c h geglückt anzusehenden Bestimmungen.

am/ig Corticostvon

pro 8 Min.

mf ACTH

ACTH (n = 23) und 0,01 mE ACTH (p < 0,0025), sowie der W i r ­kung von 0,025 mE ACTH und e i n e r K o c h s a l z i n f u s t i o n ( p < 0 , 0 l ) . Danach l i e g t d i e E m p f i n d l i c h k e i t s g r e n z e der Methode zwischen 0,010 und 0,015 mE ACTH. Der R e g r e s s i o n s k o e f f i z i e n t b e t r u g b = 0,74 ( 8 4 ) . - Nach dem V o r s c h l a g von GADDUM (85, 113) wurde der Index der G e n a u i g k e i t der Method* (lambda) a l s

- 15 ~

Quo t i e n t von Standardabweichung der e r r e c h n e t e n Kurve und R e g r e s s i o n s k o e f f i z i e n t z u X » 0,07 b e r e c h n e t , was a l s r e c h t z u f r i e d e n s t e l l e n d e r Wert angesehen werden d a r f . Der K o r r e l a ­t i o n s k o e f f i z i e n t i s t s i g n i f i k a n t v on N u l l v e r s c h i e d e n r = 0,421 ( I r r t u m s w a h r s c h e i n l i o h k e i t 0,001). Die P l a s m a s p i e g e l an ACTH wurden aus dem A n s t i e g der C o r t i ­c o s t e r o n - I n k r e t i o n über d i e E i c h k u r v e (Abb.11), i n E i n z e l ­fällen u n t e r Berücksichtigung der i n d i v i d u e l l e n E m p f i n d l i c h ­k e i t der R a t t e n , e r m i t t e l t . Da j a h r e s z e i t l i c h e Schwankungen der E m p f i n d l i c h k e i t der R a t t e n bekannt s i n d , s e i angefügt, daß a l l e Plasmabestimmungen i n -der Z e i t vom 5*11.65 b i s 31.3.66 e r f o l g t e n . Der Z e i t a u f w a n d der g e s c h i l d e r t e n Methode i s t so groß, daß zwei e i n g e a r b e i t e t e P e r s o n e n an zwei Tagen a c h t T i e r e , das s i n d j e a c h t ACTH-Standardwerte und a c h t Plasmen, o p e r i e r e n bzw. u n t e r s u c h e n können.

I I . SACCHAROSEDICHTEGRADIENTENZENTRIPUGATION

S a c c h a r o s e - D i c h t e - G r a d i e n t e n wurden nach dem von BRITTEN und ROBERTS (187) angegebenen P r i n z i p h e r g e s t e l l t . E i n e i n ­f a c h e r G l a s a p p a r a t , wie i n Abb.12 s c h e m a t i s c h d a r g e s t e l l t ,

Abbe 12: Apparat zur H e r s t e l l u n g von Sa c c h a r o s e - D i c h t e -G r a d i e n t e n - Be s c h r e i b u n g s. Text

Preßluft

—GUskapitlare A B o O

O.B cm

5.5 cm8 h

Tolvolumen

i.Scm ~FSttm»

wurde b e i geschlossenem Hahn I und I I gefüllt. I n den Schenk e l A wurden 3,45 ml (Sotvolumen A = 0,95 ml p l u s Nutzvolumen A = 2,5 ml) 13 # Saccharose, 0,005 M M g C l 2 ,

- 17 -

0,025 M K C l i n 0,05 M T r i s - H C L - P u f f e r pH 7,5 gefüllt* I n den S c h e n k e l B kamen 0,35 (Totvolumen) p l u s 2,5 ml der g l e i c h e n Lösung ohne Sac c h a r o s e . Vor dem v o r s i c h t i ­gen A n s t e l l e n der Preßluft ( s . Schema), welche e i n e Durchmischung des I n h a l t s von Sc h e n k e l A s i c h e r s t e l l t e , s o l l e n d i e Plüssigkeitsspiegel i n den S c h e n k e l n A und B g l e i c h hoch s t e h e n ( l i n k e Hälfte Abb• 1 2 ) . Hahn I wurde dann vollständig geöffnet, Hahn I I dagegen nur so wenig, daß b e i k o n t i n u i e r l i c h e m Ausfluß d i e Füllhöhe des G r a d i e n ­t e n im Zentrifugenröhrchen von 4,5 cm i n 6 - 7 M i n u t e n e r r e i c h t wurde. Je d r e i G r a d i e n t e n d i e s e r A r t wurden im Swinging Bücket R o t o r SW 39 der Spinoo Model L U l t r a z e n ­t r i f u g e ( F a . Beckman I n s t r . ) 2 Stunden b e i 37500 UPM z e n t r i f u g i e r t , wodurch e i n e S t a b i l i s a t i o n der G r a d i e n t e n e r r e i c h t wurde. - S e t z t man der Lösung im S c h e n k e l A z.B. N i l b l a u s u l f a t zu, so läßt s i c h d i e Konzentrationsabnahme an N i l b l a u s u l f a t und damit an Saccharose von unten nach oben i n den so h e r g e s t e l l t e n G r a d i e n t e n nach P u n k t i o n des Bodens der Zentrifugenröhrchen und tr o p f e n w e i s e m A u f f a n g e n i n F r a k t i o n e n nach Verdünnung p h o t o m e t r i s c h bestimmen. Abb. 13 z e i g t , daß man e i n e n etwa l i n e a r e n G r a d i e n t e n v o n

Abb.13: Prüfung d e r Linearität von S a c c h a r o s e - D i c h t e - G r a d i e n t e n durch Z u s a t z von N i l b l a u s u l f a t

60\—

FSlIkSk» 1.5cm

18 -

13-5 $> Saccharose erhält, wenn man d i e r i c h t i g e Füllhöhe für d i e Zentrifugenröhrchen (Abb.12) wählt. - Auf s o l c h e n G r a d i e n t e n l a s s e n s i c h ( s . auch ERGEBNISSE) ungefähre Molekulargewichtebestimmungen von Enzymproteinen d u r c h ­führen (Abb.14) und Gewebshomogenate nach dem M o l e k u l a r ­gewicht f r a k t i o n i e r e n (Abb. 16, 1 8 ) .

Abb.14s Molekulargewichtsbestimmungen von Enzymen nach MARTIN und AMES ( 1 9 4 ) .

Es wurde 17 Stunden b e i +2°C und 37 500 UPM z e n t r i f u g i e r t . L actatdehydrogenase (A 4 ) , P y r u v a t k i n a s e (A &), O i t r a t s y n t h a s e ( o — o ) , a l l e Enzyme wurden von Boehringer bezogen und d i a l y s i e r t . D i e O i t r a t s y n t h a s e wurde von Dr. L.Weiss m i t S t e a r y l - O o A i n k u b i e r t (• • ).

- 19 -

I I I . PRÄPARAT ION VON POLYSOMEN UND RIBOSOMEN

Nach dem V o r s c h l a g v o n WETTSTEIN und M i t a r b e i t e r n (230) wurden Homogenate von f r i s c h e n Schweinenebennieren ( s . Legende z u Tab.3) 10 Min u t e n b e i 15 000 x g z e n t r i f u -g i e r t . Zu 9 T e i l e n 15 000 x g Überstand wurde 1 T e i l 10 # Na t r i u m d e s o x y c h o l a t i n 0,05 M T r i s - H C l pH 8,2 b e i 0°C u n t e r Rühren t r o p f e n w e i s e z u g e s e t z t . I n C e l l u l o s e N i t r a t e Tubes NO. 302235 der Pa. Beckman I n s t r . wurden k a l t e (0°C) 2 M ( I ) und 0,5 M ( I I ) Saccharose-Lösung sowie der D e s o x y c h o l a t - b e -h a n d e l t e Überstand ( I I I ) übereinander g e s c h i c h t e t (Abb.15)•

Abb.15: Schematische D a r s t e l l u n g der Präparation von Polysomen Auf 2,25 ml Lösung I (2 M Saccharose, 0,005 M M g C l Q , 0,025 M K C l , 0,05 M T r i s - H C l - P u f f e r ph 7,5) wurden^ 2,25 ml Lösung I I (0,5 M Saccharose, E l e k t r o l y t e wie oben) v o r s i c h t i g d a r a u f g e s c h i c h t e t . Darauf kamen 4,5 ml NaDOO-be-h a n d e l t e r 15 000 x g Überstand ( I I I ) von Schweinenebennieren-homogenaten ( s . T e x t ) .

Uml

2.25ml

2.25ml

vor

m i i

4 S M . zentrifugieren

nach

} Fettschicht weiß

rot

• gelb

—Polysomen

- 20 -

Nach 4 S t d . Z e n t r i f u g a t i o n ( S p i n c o Model L) im R o t o r Nr.40 b e i 37 500 UPM und +2°0 befanden s i c h d i e Polysomen a l s g e l a r t i g e r l e i c h t gelbbräunlicher N i e d e r s c h l a g am Boden. Das Sediment ließ s i c h i n 0,5 ml Medium A ( v g l . Tab.3) durch s e h r v o r s i c h t i g e s Plümpern lösen.

Ribosomen wurden m i t den übrigen i n 4,5 ml e n t h a l t e n d e n P a r t i k e l n des D e s o x y c h o l a t - b e h a n d e l t e n 15 000 x g Überstandes von Schweinenebennierenhomogenaten (s.o.) i n 4 Stunden durch 4,5 ml e i n e r Lösung von 1 M Sa c c h a r o s e , 0,005 M MgClg, 0,025 M KOI und 0,05 M T r i s - H C l - P u f f e r pH 7,5 s e d i m e n t i e r t . Abb• 16 z e i g t d i e S e d i m e n t a t i o n von so gewonnenen Polysomen und "Ribosomen", welche h i e r i n S a c c h a r o s e - f r e i e m Medium A (s.Tab.3) gelöst wurden. Es wurden 1 8 - 2 0 F r a k t i o n e n von jedem S a c c h a r o s e - D i c h t e - G r a d i e n t e n nach 20 M i n u t e n Z e n t r i ­f u g a t i o n im Rot o r SW 39 b e i 37 500 UPM und +2°C gesammelt und d i e A b s o r p t i o n b e i 260 und 280nm nach 1 : 15 Verdünnung im S p e k t r a l p h o t o m e t e r PMQ I I von Z e i s s gemessen.

- 21 -

Abb. 16: D i c h t e g r a d i e n t e n z e n t r i f u g a t i o n v o n Polysomen (• • ) und Ribosomen (o o ) . G e z e i g t i s t d i e A b s o r t i o n b e i 260 nm. D i e Polysomen w e i s e n neben v e r m u t l i c h durch D e s i n t e g r a t i o n b e i der Präparation entstandenen Ribosomen (70 - 80 S) e i n e etwas höhere A b s o r p t i o n i n den F r a k t i o n e n Nr. 10 b i s 16 a u f (285)# F e r n e r f i n d e t s i c h b e i den Polysomen, n i c h t aber b e i Ribosomen, e i n Sediment ( A b s o r p t i o n der F r a k t i o n Nr. 1 - 3 ) , das v e r m u t l i c h aus noch konglome-r i e r t e n aber a k t i v e n Polysomen b e s t e h t ( 2 8 5 ) .

0.3 n r0.3

0.1 Fraktioh Nr.

0.2- -0.2

0.1 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19

unten oben

- 22 -

IV* INTRAVENÖSE GLUKOSEBELASTUNGEN

Die Methode der i . V . G l u k o s e b e l a s t u n g wurde von uns früher ausführlich d a r g e s t e l l t und d i e v o r l i e g e n d e L i t e r a t u r d i s ­k u t i e r t (79, 8 0 ) . Unter Grundumsatzbedingungen wurden dem P a t i e n t e n morgens 0,5 g Glukose pro kg KG i n n e r h a l b von 3 - 5 Min. i n j i z i e r t . Nüchternblutzucker und i n 10-minüti­gen Abständen nach der G l u k o s e i n j e k t i o n gewonnene B l u t ­zucker wurden e n z y m a t i s c h bestimmt. D i e Berechnung des sog. G l u k o s e a s s i m i l a t i o n s k o e f f i z i e n t e n k^ e r f o l g t e nach g r a p h i ­scher E r m i t t l u n g der H a l b w e r t s z e i t der Glukose nach der Fo r m e l : k - I S ^ L . a °^22

— k t d i e aus der G l e i c h u n g : c ( t ) a * ° ( o ) # e

wie früher b e s c h r i e b e n (79, 80) a b g e l e i t e t w i r d . Durch M u l t i p l i k a t i o n des k-Wertes m i t 100 erhält man den kß-Wert, d i e G l u k o s e e l i m i n a t i o n i n # pro M i n . zum Z e i t p u n k t der H a l b w e r t s z e i t , bzw. den sog. G l u k o s e a s s i m i l a t i o n s ­k o e f f i z i e n t e n . Unsere Befunde über N o r m a l b e r e i c h und d i a g n o s t i s c h e Bedeutung d i e s e r Methode wurden a n d e r w e i t i g b e s c h r i e b e n ( 8 0 ) .

E R G E B N I S S E

BESTIMMUNG VON ACTH-SPIEGELN IM MENSCHLICHEN PLASMA

Das I n t e r e s s e der K l i n i k e r an e i n e r zuverlässigen Bestimmung von ACTH-Spiegeln im Plasma i s t naturgemäß groß. Das von uns angewandte, u n t e r "METHODEN" b e s c h r i e b e n e V e r f a h r e n , d i e ACTH-Aktivität über den A n s t i e g der C o r t i c o s t e r o n - I n k r e t i o n im N e b e n n i e r e n v e n e n b l u t der akut h y p o p h y s e k t o m i e r t e n R a t t e z u bestimmen, i s t s e i t e i n i g e n J a h r e n i n v e r s c h i e d e n e n L a ­b o r a t o r i e n i n der Hoffnung angewandt worden, den ACTH-Spiegel im Plasma des Normalen s i c h e r e r f a s s e n z u können (101, 102, 106 - 114a). Wie u n t e r "METHODEN" b e r e i t s erwähnt, haben w i r v e r s u c h t , d i e E m p f i n d l i c h k e i t der Methode d u r c h I n f u s i o n der Testlösung (ACTH-Standard oder Plasma) i n d i e A o r t a der R a t ­t e zu erhöhen, und d i e G e n a u i g k e i t der Methode d u r c h Kon­s t a n t h a l t u n g des Volumens, i n dem d i e Testlösungen a p p l i ­z i e r t wurden, und d u r c h Berücksichtigung der i n d i v i d u e l l e n E m p f i n d l i c h k e i t der hyp o p h y s e k t o m i e r t e n R a t t e n gegenüber den ACTH-Standardlösungen zu v e r b e s s e r n . Wir können den O p t i ­mismus mancher A u t o r e n bezüglich der q u a n t i t a t i v e n Erfaß-b a r k e i t n o r m a l e r ACTH-Spiegel im Plasma nach s t a t i s t i s c h e r Überprüfung u n s e r e r E r g e b n i s s e n i c h t t e i l e n . I n Tab. 1 s i n d d i e von uns gefundenen P l a s m a s p i e g e l im B l u t aus der Vena c u b i t a l i s bzw. dem Bulbus c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s zusammen­g e s t e l l t . D i e m e i s t e n Werte l a g e n u n t e r 0,01 mE/ml, a l s o u n t e r h a l b der E m p f i n d l i c h k e i t s g r e n z e der Methode ( s i e h e "METHODEN"). Etwas höhere Werte, wie s i e b e i e i n z e l n e n P a t i e n t e n gefunden wurden, s i n d b e i der k l e i n e n Z a h l der Be­stimmungen, d i e auf Grund der b e g r e n z t e n H a l t b a r k e i t des ACTH i n e i n g e f r o r e n e n Plasmaproben ( s i e h e "METHODEN") d u r c h ­zuführen s i n d , n i c h t s i g n i f i k a n t von dem B e r e i c h der d o p p e l ­t e n Standardabweichung des N u l l w e r t e s ( K o c h s a l z i n f u s i o n ) v e r s c h i e d e n . D i e M i t t e l w e r t e der ACTH-Spiegel im Plasma von Nebennierengesunden, d i e i n der u n t e r s t e n S p a l t e der T a b e l l e angegeben s i n d , s i n d sowohl im Bulbus c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s m i t und ohne Dexamethason-Suppression, a l s auch i n der Vena c u b i t a l i s k l e i n e r a l s 0,01 mE/ml. D ie Methode i s t

- 24 -

somit i n der von uns durchgeführten Form für d i e E r f a s s u n g normaler ACTH-Spiegel n i c h t g e e i g n e t . Die Schlüsse, d i e man aus diesem Befund auf d i e b i o l o g i s c h e H a l b w e r t s z e i t des endogenen ACTH beim Nebennierengesunden dennoch z i e h e n kann, s i n d i n der DISKUSSION besprochen.

Tab. 1: ACTH-Plasmaspiegel b e i Nebennierengesunden

ACTH mE/ml Plasma " C o r t i s o l " f

P a t i e n t Bulbus c v . j u g .

V . c u b i t . B.c.v.j . nach

Dexame-t h a s o n

v o r nach

Dexamethason

K.M. 36J. m. Ver d a c h t auf Myopathie

<0 ,01 (2)

^0,01 (2)

<0 , 0 1 (3)

16,0 8,0

B.O. 47 J . m. v e g e t a t i v e Beschwerden

0.015 ( D

^0,01 (2)

<0,01*) (2)

32,0 25,0

H.M. 20 J . m. Zustand nach Schädeltrauma

0.01 (2)

0,01 (2)

0,025 (2)

24,0 15,0

H.P. 19 J . m. Alimentäre A d i p o s i t a s (171)

0 , 0 2 5 (2)

<0,01 (2)

0,025 (2)

16,0 8,0

K . J . 49 J . m. J a c k s o n -E p i l e p s i e

<0.01 b )

0,015 (2)

<0,01 (3)

36,5 23,0

B. J . 46 J . m. t r a u m a t i s c h e E p i l e p s i e

- ^0,01 (6)

0.015*) (4)

23,0 18,0

W.B. 52 J . m. P r o s t a t a -H y p e r t r o p h i e

<0,01 b )

0,02 (2)

<0,01 (2)

30,0 21,0

M i t t e l w e r t e CO,01 (n-13)

<0,01 (n=18)

<0,01 (n=18)

29,4 16,9

Die T a b e l l e z e i g t d i e gefundenen P l a s m a s p i e g e l der e i n z e l ­nen P a t i e n t e n . Pur jeden P a t i e n t e n wurde der M i t t e l w e r t von (n) t e c h n i s c h a l s gelungen anzusehenden Bestimmungen ange­geben. Die B l u t e n t n a h m e n e r f o l g t e n um 6 Uhr morgens bzw. i n der 3« s e n k r e c h t e n S p a l t e e i n e Stunde nach I n f u s i o n von 4 mg Dexamethason i n n e r h a l b 4 M i n . z u r S u p p r e s s i o n . D ie m i t

- 25 -

einem S t e r n *) versehenen Werte i n der 3.sen k r e c h t e n S p a l t e stammen aus der Vena c u b i t a l i s . D i e M i t t e l w e r t e der A n s t i e g e der C o r t i c o s t e r o n m e n g e n im Nebennieren­v e n e n b l u t der R a t t e nach I n f u s i o n von 1 ml Plasma der P a t i e n t e n d i e n t e n z u r E r m i t t l u n g der M i t t e l w e r t e der ACTH-Spiegel im Plasma ( u n t e r s t e Z e i l e ) . D i e E i n z e l h e i ­t e n der Methoden s i n d i n K a p i t e l METHODEN b e s c h r i e b e n . D i e Werte für gamma# C o r t i s o l im Plasma l i e g e n etwas höher a l s der N o r m a l b e r e i c h für 9 Uhr ( s i e h e Bestimmung der sog. 1 1 - H y d r o x y c o r t i c o s t e r o i d e u n t e r METHODEN). B e i den Diagn o s e n h a n d e l t es s i c h um Abschlußdiagnosen.

Es h a t n i c h t an Versuchen anderer A u t o r e n g e f e h l t , m i t etwas anderen Methoden den N o r m a l s p i e g e l von ACTH z u bestimmen. Dabei s i n d zwei Wege am ehes t e n e r f o l g v e r s p r e c h e n d . Die A r ­b e i t s g r u p p e von 1IDDLE h a t e i n V e r f a h r e n angegeben, ACTH aus größeren Plasmamengen a n z u r e i c h e r n und m i t e i n e r b i o l o ­g i s c h e n Bestimmungsmethode zu bestimmen (101, 109, 110). Auch andere A u t o r e n haben d i e s e Möglichkeit u n t e r s u c h t (108, 111). D i e Ausbeuten l i e g e n b e i d i e s e n A n r e i c h e r u n g s v e r f a h r e n z w i s c h e n 44 und 124 Zu diesem F e h l e r a d d i e r t s i c h der F e h l e r der b i o l o g i s c h e n Bestimmungsmethoden. Immerhin v e r ­dankt man d i e s e n Untersuchungen d i e V o r s t e l l u n g , daß der n o r ­male P l a s m a s p i e g e l an ACTH zw i s c h e n 0,3 und 0,6 mE/100 ml Plasma l i e g t . ( V g l . Abb. 2 4 ) . - E i n e n ganz anderen Weg g i n g e n U n t e r s u c h e r , d i e s i c h des P r i n z i p s der ra d i o - i m m u n o l o g i s e h e n Bestimmung von Peptidhormonen für d i e ACTH-BeStimmung be­d i e n t e n (133 - 135). Die s e A u t o r e n b e r i c h t e n über e i n e ganz a u s g e z e i c h n e t e E m p f i n d l i c h k e i t d i e s e s V e r f a h r e n s (0,001 mE). Es wurden zunächst a l l e r d i n g s um 3 Zehnerpotenzen höhere N o r m a l s p i e g e l gefunden, a l s s i e b e i den b i o l o g i s c h e n B e s t i m ­mungsmethoden geschätzt wurden ( 1 3 4 ) . E i n w e i t e r e r Einwand gegen d i e s e s V e r f a h r e n kommt aus der A r b e i t s g r u p p e von FORSHAM ( 1 3 5 ) . E i n s y n t h e t i s c h e s P e p t i d aus den Aminosäuren Nr.22 - 39 der Sequenz des vollständigen B e t a - 1 - 3 9 - C o r t i c o -t r o p i n s z e i g t e d i e v o l l e immunologische Aktivität, ohne daß i r g e n d e i n e b i o l o g i s c h e Aktivität nachweisbar war.

Di e erhöhten ACTH-Spiegel im Plasma von P a t i e n t e n m i t be­stimmten Erkrankungen der Nebennieren s i n d dagegen mit der von uns verwandten Methode e i n d e u t i g z u e r f a s s e n . Solche

- 26 -

ACTH-Spiegel s i n d m i t den dazugehörigen C o r t i s o l w e r t e n des Plasmas (sog . 1 1 - H y d r o x y c o r t i c o s t e r o i d e s i e h e METHODEN) i n Tab« 2 zusammengefaßt. Wir besprechen im f o l g e n d e n k u r z d i e Kr a n k e n g e s c h i c h t e n u n s e r e r P a t i e n t e n sowie unsere Befunde und d i s k u t i e r e n der Übersichtlichkeit h a l b e r an d i e s e r S t e l l e d i e einschlägige L i t e r a t u r .

Tab• 2: ACTH-Plasmaspiegel von "Nebennierenkranken 1 1

ACTH mE/ml Plasma

P a t i e n t Bulbus 3 . v . j .

V . c u b i t . B.c.v. i . nach Dexa­methason

v o r naoh Dexamethason

B.S. 48 J . m 67,3 kg

M. ADDISON 0,45 (4)

0 , 2 7

(3) 0,28 (3)

4,0 8,0

Gr.J . 18 J . m. 55,5 kg

M. ADDISON 0,26 (2)

0,24 (2)

0,02 (2)

7,0 7,0

E.T. 44 J . w-Cushing-Syndrom B i l a t e r a l e adeno matöse Hyper­p l a s i e

<0,01 - (2)

<:0,01 (2)

<0,01 (2)

38,0 30,0

E.L. 19 J . m. 50,5 kg

Zustand nach t o t 0,20 (4)

a-

0,045 (3)

<0,01 (3)

5,0 8,0

" C o r t i s o l " y io

l e r A d renalektomie wegen Cushing-Syn-d r o m s ( b i l a t e r a l e H y p e r p l a s i e ) V e r ­dacht auf chromo-phobes Adenom d. HVL M.E. 44 J . 0,09

82,0 kg (2) Zustand n . t o t a l e r A d r e n a l e k t o m i e weg. Cushing-Syndr oms ( b i l a t e r a l e Hyper­p l a s i e )

0,13 (3)

0,07*) (2)

(10,0) (17,0)

L . J • 61 J . m. B r o n c h i a l - C a / x sekundäre NNR-In-s u f f i z i e n z , metaj-s t a t . Zerstörung des HVL

3,0 6,0

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Tab. 2: P o r t s .

ACTH mE/ml Plasma tt C o r t i s o l " f r #

P a t i e n t Bulbus V . c u b i t . B . c . v . J . c . v . j . nach Dexa­

methason

v o r nach Dexamethason

W.F. 21 J . w. A d r e n o g e n i t a l e s

0,48 (3)

0,065 (2)

"22,0" "14,0"

Syndrom 6 5 > 5 k g

Wie i n Tab.1 s i n d d i e Diagnosen und d i e M i t t e l w e r t e der ACTH-Spiegel im Plasma der P a t i e n t e n aus (n) Bestimmungen angegeben. Der m i t ¥) versehene Wert (M.E.) stammt aus der Vena c u b i t a l i s . D ie Blutentnahmen e r f o l g t e n um 6 Uhr morgens bzw. 1 Stunde nach i . v . I n f u s i o n von 4 mg Dexamethason i n n e r ­h a l b von 4 Min. ( 3 . S p a l t e ) , a l s o gegen 7 Uhr 20. ACTH-Be-stimmung s i e h e METHODEN. Die i n gamma pro 100 ml Plasma ange­gebenen C o r t i s o l - W e r t e ( s o g . 1 1 - H y d r o x y c o r t i c o s t e r o i d e , s i e h e METHODEN) l i e g e n b e i den N N R - i n s u f f i z i e n t e n P a t i e n t e n u n t e r ­h a l b des N o r m a l b e r e i c h e s für 9 Uhr morgens ( s i e h e METHODEN, Ausnahme M.E.). B e i den N N R - i n s u f f i z i e n t e n P a t i e n t e n kommt es v e r m u t l i c h a l s F o l g e der Dexamethason-Infusion z u einem geringfügigen A n s t i e g der f l u o r i m e t r i s c h bestimmten " C o r t i s o l " -Werte. Die n e b e n n i e r e n i n s u f f i z i e n t e n P a t i e n t e n (B.S., G.J., E.L., M.E.(?) und L.J.) e r h i e l t e n b i s c a . 22 Stunden v o r dem U n t e r s u c h u n g s z e i t p u n k t (6 Uhr) d i e b e i i h n e n übliche C o r t i s o l -S u b s t i t u i t i o n s t h e r a p i e .

Man weiß s e i t e i n i g e n J a h r e n , daß b e i P a t i e n t e n m i t Morbus ADDISON d i e ACTH-Spiegel im Plasma k u r z nach A b s e t z e n der S u b s t i t u i t i o n s b e h a n d l u n g s t a r k erhöht s e i n können (101, 102, 108, 137, 167). Das i s t zunächst e r s t a u n l i c h , da a l l e d i e s e P a t i e n t e n j a im a l l g e m e i n e n u n t e r e i n e r a l s a u s r e i c h e n d be­t r a c h t e t e n S u b s t i t u t i o n s b e h a n d l u n g m i t C o r t i s o l s t e h e n . Be­denkt man aber d i e r e l a t i v k u r z e n H a l b w e r t s z e i t e n o r a l a p p l i z i e r t e r C o r t i c o s t e r o i d e ( 7 3 ) , so w i r d v o r s t e l l b a r , daß d i e o r a l e S u b s t i t u t i o n s b e h a n d l u n g z.B. m i t morgens 20 mg und na c h m i t t a g s 10 mg C o r t i s o l p.o. zu e r h e b l i c h e n Schwankungen des P l a s m a c o r t i s o l s p i e g e l s führen muß und d i e k o n t i n u i e r ­l i c h e C o r t i s o l - I n k r e t i o n der N e b e n n i e r e n r i n d e n i c h t v o l l ­w e r t i g zu e r s e t z e n vermag. So w i r d es auch b e i " k o r r e k t " durchgeführter S u b s t i t u t i o n s b e h a n d l u n g im l a u f e der 24 Stunden e i n e s Tages immer w i e d e r zu Phasen des r e l a t i v e n C o r t i s o l m a n ­g e l s kommen.

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Der I . P a t i e n t der Tab«,2 (B.S.) l i t t s e i t 1952 an einem t u ­berkulös bedingtem M. ADDISON. E r h a t t e , b i s er zu uns kam, ei n e an s i c h a l s v e r a l t e t zu bezeichnende Behandlung mit D e a o x y c o r t i c o s t e r o n e r h a l t e n . I n t e n s i v e P i g m e n t a t i o n und v e r k a l k t e O h r k n o r p e l (THORN's Zeichen) sprachen dafür, daß d i e N e b e n n i e r e n r i n d e n i n s u f f i z i e n z n i c h t v o l l w e r t i g s u b s t i ­t u i e r t war. Die ACTH-Werte d i e s e s P a t i e n t e n waren extrem erhöht, und zwar sowohl im Bulbus c . v . j . , a l s auch i n der Vena c u b i t a l i s und waren d u r c h d i e s c h n e l l e Dexamethason-I n f u s i o n nur t e i l w e i s e zu s u p p r i m i e r e n . -Der 2 . P a t i e n t m i t einem M. ADDISON (G.J.) e r k r a n k t e nach der V o r g e s c h i c h t e Ende 1964 m i t e i n e r N e b e n n i e r e n r i n d e n i n s u f f i ­z i e n z , deren e r s t e s Z e i c h e n i n t e r e s s a n t e r w e i s e e i n d e u t l i c h e s N a c h l a s s e n der K o n z e n t r a t i o n s - und Merkfähigkeit war ( 1 7 2 ) . B e i diesem P a t i e n t e n waren d i e erhöhten ACTH-Spiegel im Plasma durch d i e Dexamethason-Infusion (Tab.2) f a s t vollständig z u s u p p r i m i e r e n , wie das aus der L i t e r a t u r für d i e k o n t i n u i e r ­l i c h e r wirkende o r a l e C o r t i o o s t e r o i d - B e h a n d l u n g bekannt i s t (101, 167).

Wir f a s s e n d i e z.T. e x z e s s i v hohen ACTH-Spiegel b e i A d d i s o n -P a t i e n t e n a l s o a l s Ausdruck der t r o t z " a u s r e i c h e n d e r " Sub­s t i t u t i o n s b e h a n d l u n g m i t C o r t i c o s t e r o i d e n gestörten R e g u l a ­t i o n ( 1 , 2) des P l a s m a s p i e g e l s der C o r t i c o s t e r o i d e a u f . D i e Antwort des R e g l e r s i s t , - um im B i l d e zu b l e i b e n -, d u r c h s e i n e ständige Überbeanspruchung verstärkt.

Beim Cushing-Syndrom m i t b i l a t e r a l e r H y p e r p l a s i e der Neben­n i e r e n r i n d e wurden zumeist normale ACTH-Spiegel im Plasma gefunden (101, 102, 114a, 108 - 110), i n manchen Fällen waren d i e ACTH-Spiegel auch geringfügig erhöht (109, 111, 167). Für d i e Überlegungen zur P a t h o p h y s i o l o g i e d i e s e r Form der C u s h i n g 1 sehen Erkrankung haben d i e Befunde der A r b e i t s g r u p p e von PFEIFFER (102, 114a, 164) i n l e t z t e r Z e i t e r h e b l i c h e Be­deutung e r l a n g t . Danach s i n d d i e ACTH-Spiegel im Plasma b e i den m e i s t e n P a t i e n t e n m i t b i l a t e r a l e r H y p e r p l a s i e n i c h t e r ­höht, weisen aber e i n F e h l e n der b e i Gesunden üblichen Tages­r h y t h m i k a u f . Im I n t e g r a l i s t d i e T a g e s s e k r e t i o n damit dooh erhöht, i h r e Berechnung g i b t Werte, d i e i n der Größenordnung d e r j e n i g e n ACTH-Menge l i e g t , welche über 24 Stunden gegeben e i n e Erhöhung der C o r t i s o l - S p i e g e l e r z i e l t , wie man s i e b e i P a t i e n t e n m i t Cushing-Syndrom f i n d e t ( 1 6 5 ) .

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Ei n e 44-jährige P a t i e n t i n m i t einem Cushing-Syndrom, welches nach der Anamnese s e i t etwa 10 J a h r e n (!) b e s t a n d , wurde von uns u n t e r s u c h t . Zwischen der z w e i z e i t i g durchgeführten Adr e n a l e k t o m i e f a n d e n s i c h S p i e g e l u n t e r 0,01 mE ACTH pro ml Plasma, a l s o u n t e r h a l b u n s e r e r N a c h w e i s b a r k e i t s g r e n z e . D i e P l a s m a c o r t i s o l w e r t e d i e s e r P a t i e n t i n waren ebenso wie d i e C o r t i s o l a u s s c h e i d u n g e n im 24 S t d . U r i n auch nach der e i n s e i ­t i g e n A d r e n a l e k t o m i e noch d e u t l i c h erhöht.

Die Tat s a c h e , daß d i e ACTH-Spiegel b e i d i e s e n Fällen n i c h t oder nur u n w e s e n t l i c h erhöht s i n d , s o l l t e unbedingt im Zu­sammenhang m i t den P l a s m a c o r t i s o l w e r t e n d i e s e r P a t i e n t e n be­u r t e i l t werden. F i n d e t man doch b e i den P a t i e n t e n m i t Cushing-Syndrom erhöhte C o r t i s o l w e r t e im Plasma, d i e b e i nichtgestörter R e g u l a t i o n der C o r t i s o l i n k r e t i o n e i g e n t l i c h zu e i n e r E r n i e d r i g u n g der ACTH-Spiegel im Plasma führen s o l l t e n (101, 102). Normale oder l e i c h t erhöhte ACTH-Spiegel im Plasma s i n d somit b e i d i e s e n P a t i e n t e n a l s p a t h o l o g i s c h anzusehen.

Im J a h r e 1958 b e s c h r i e b e n NELSON und M i t a r b . den e r s t e n F a l l , b e i dem man d i e E n t w i c k l u n g e i n e s ohromophoben Adenoms des Hypophysenvorderlappens nach t o t a l e r A d r e n a l e k t o m i e wegen e i n e s Cushing-Syndroms m i t b i l a t e r a l e r H y p e r p l a s i e beobach­t e t e und e x z e s s i v hohe ACTH-Spiegel im Plasma f a n d ( 1 5 9 ) . S e i t h e r wurden immer w i e d e r Beobachtungen s o l c h e r Fälle m i t g e t e i l t (156 - 158, 160, 161).

E i n 19-jähriger Mann (E.L.) i s t s e i t dem 15.Lebensjähr i n u n s e r e r Beobachtung. E r wurde wegen e i n e s t y p i s c h e n C u s h i n g -Syndroms m i t b i l a t e r a l e r H y p e r p l a s i e der N e b e n n i e r e n r i n d e t o t a l a d r e n a l e k t o m i e r t . Das führte zu e i n e r vollständigen R e m i s s i o n des K r a n k h e i t s b i l d e s und zu e i n e r Umkehr der v o r ­her l a t e n t d i a b e t i s c h e n S t o f f w e c h s e l l a g e i n e i n e erhöhte G l u k o s e t o l e r a n z (81, 172). J e t z t f i n d e t s i c h b e i dem P a t i e n ­t e n e i n e i n t e n s i v e P i g m e n t a t i o n und e i n d o p p e l t k o n t u r i e r t e r S e i l a b o d e n . Nach der Tomographie i s t d i e S e l l a e i n s e i t i g v e r ­größert, so daß w i r den P a t i e n t e n u n t e r dem V e r d a c h t auf das V o r l i e g e n e i n e s ohromophoben Adenoms w e i t e r beobachten. Wie aus Tab.2 e r s i c h t l i c h , s i n d d i e ACTH-Spiegel b e i diesem P a t i e n t e n extrem hoch. Dexamethason führte zu einem A b s i n k e n auf n i c h t mehr s i c h e r meßbare S p i e g e l . D i e s e S u p p r i m i e r b a r -k e i t der ACTH-Spiegel i s t , s o w e i t s i e u n t e r s u c h t wurde, b e i den m e i s t e n d e r i n der L i t e r a t u r m i t g e t e i l t e n Fälle nachzu­w e i s e n gewesen (159 - 165).

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Es s e i noch k u r z auf d i e andere Form des Cushing-Syndroms, d i e primär n e b e n n i e r e n b e d i n g t e , eingegangen. D i e erhöhte, autonome C o r t i s o l i n k r e t i o n von Nebennierenadenomen oder -carcinomen führt i n d i e s e n Fällen zu e i n e r S u p p r e s s i o n des Hypophysen-Nebennierenrinden-Systems. M o r p h o l o g i s c h f i n d e t s i c h e i n e A t r o p h i e der übrigen N e b e n n i e r e n r i n d e , f u n k t i o n e l l b e i E n t f e r n u n g des Tumors e i n e H y p o f u n k t i o n der N e b e n n i e r e n r i n d e und der Hypophyse (72, 137, 166). Nach den Untersuchungen der A r b e i t s g r u p p e von LIDDLE (72) e r h o l t s i c h i n d i e s e n Fällen zunächst d i e Hypophysenvor-d e r l a p p e n f u n k t i o n . D i e ACTH-Spiegel s i n d vorübergehend erhöht. Die U n t e r f u n k t i o n der Nebe n n i e r e n r i n d e kann dage­gen monatelang w e i t e r b e s t e h e n und j e d e r ACTH-Therapie t r o t z e n (166, eigene Beobachtung). Wir verdanken H e r r n Dr. R. FROESCH, Zürich, d i e Plasmen von d r e i P a t i e n t e n , b e i denen v o r mehreren Monaten Nebennierenrinden-adenome, d i e das B i l d e i n e s Cushing-Syndroms h e r v o r g e r u f e n h a t t e n , e n t f e r n t worden waren. Die P l a s m a c o r t i s o l w e r t e waren b e i d i e s e n P a t i e n t e n u n t e r h a l b des Normalbereiches (2,5 Gamma# i n einem und 5 Gamma# i n zwei w e i t e r e n Fällen) • Die ACTH-S p i e g e l im Plasma aus der Vena c u b i t a l i s waren i n zwei Fällen erhöht (0,02 und 0,03 mE pro ml Plasma). I n der D i s k u s s i o n w i r d auf d i e S u p p r e s s i o n des Hypophysen-Neben-n i e r e n r i n d e n s y s t e m s d u r c h v e r s c h i e d e n l a n g dauernde exoge­ne oder endogene Erhöhung des S p i e g e l s an P l a s m a c o r t i c o -s t e r o i d e n noch einmal eingegangen.

Tab. 2 z e i g t noch e i n e w e i t e r e P a t i e n t i n , b e i der w i r ex­trem hohe ACTH-Spiegel im Plasma fanden (W.F.).Hier bestand e i n a d r e n o g e n i t a l e s Syndrom, das schon v o r J a h r e n d i a g n o ­s t i z i e r t worden war, aber i n f o l g e der I n d o l e n z der P a t i e n ­t i n b i s l a n g n i c h t b e h a n d e l t wurde. B e k a n n t l i c h h a n d e l t es s i c h b e i t y p i s c h e n Fällen m e i s t um e i n e Störung der 21 - H y d r o x y l i e r u n g , was zu e i n e r v e r m i n d e r t e n C o r t i s o l ­p r o d u k t i o n , e i n e r vermehrten ACTH-Ausschüttung und e i n e r erhöhten Androgenproduktion i n der Nebenniere führt. Unt e r V e r z i c h t auf ein e ausführliche Besprechung der k o m p l i z i e r t e n

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P a t h o p h y s i o l o g i e d i e s e r Erkrankung s e i h i e r nur auf d i e e r ­höhte ACTH-Produktion b e i P a t i e n t e n m i t a d r e n o g e n i t a l e m Syndrom eingegangen ( 1 0 1 ) . Wir fanden, wie i n Tab,2 a u f g e ­führt, extrem hohe S p i e g e l im Plasma aus dem Bulbus c r a n i a ­l i s vae. j u g u l . und etwa um d i e Hälfte n i e d r i g e r e S p i e g e l i n der Vena c u b i t a l i s . Durch Dexamethason war der ACTH-Spiegel im Bulbus c r a n i a l i s vae. j u g u l . um e i n e Zehnerpotenz z u sen­ken. - Aus der L i t e r a t u r i s t der A n s t i e g der Plasma-ACTH-S p i e g e l auch b e i der k u r z z e i t i g e n B l o c k i e r u n g e i n e r w e i t e r e n H y d r o x y l i e r u n g (11-ß-Hydroxylierung) du r c h M e t o p i r o n (SU 4885) bekannt (101, 102, 108, 153 - 155). D i e s e ACTH-Anstiege wa­r e n j e d o c h r e l a t i v mäßig und e r s t etwa 8 Stunden nach V e r a b ­f o l g u n g des M e t o p i r o n s zu beobachten.

K l i n i s c h i n t e r e s s a n t e G e S i c h t s p u n k t e bot auch d i e Krankenge­s c h i c h t e des P a t i e n t e n L . J . (Tab.2). D i e s e r P a t i e n t wurde b e i uns wegen e i n e s B r o n c h i a l c a r c i n o m s b e o b a c h t e t . Adynamie, aus­geprägte Hypotonie und Hyponatriämie ließen uns e i n e Neben-n i e r e n r i n d e n i n s u f f i z i e n z d i a g n o s t i z i e r e n . Dazu paßten d i e d e u t l i c h e r n i e d r i g t e n P l a s m a c o r t i s o l w e r t e . Zu u n s e r e r Über­rasc h u n g fanden w i r weder im Bulbus c r a n i a l i s v a e . j u g u l . noch i n der Vena c u b i t a l i s meßbare Plasma-ACTH-Spiegel, d i e b e i unseren A d d i s o n - P a t i e n t e n (B.S. und G.J.) d e u t l i c h e r ­höht waren. B e i der A u t o p s i e f a n d s i c h d i e Erklärung d i e s e s Befundes. Der Hypophysenvorderlappen war d u r c h M e t a s t a s e n des B r o n c h i a l c a r c i n o m s vollständig zerstört, während d i e Nebennieren nur k l e i n e M e t a s t a s e n a u f w i e s e n . Es h a n d e l t e s i c h somit um e i n e sekundäre N e b e n n i e r e n r i n d e n i n s u f f i z i e n z . Daran war k l i n i s c h auch schon gedacht worden, da d i e s e r P a ­t i e n t k e i n e r l e i vermehrte P i g m e n t a t i o n a u f w i e s und b e i A d d i s o n - P a t i e n t e n j a n i c h t nur das ACTH, dessen endogene MSH-Wirkung r e l a t i v g e r i n g i s t (168, 169), sondern auoh MSH vermehrt ausgeschüttet w i r d (169, 170). F e r n e r h a t t e n e i n e ausgeprägte Kälteempfindlichkeit und B r a d y c a r d i e , sowie e i n e Verlangsamung der A c h i l l e s s e h n e n r e f l e x e e i n e sekundäre Hypothyreose vermuten l a s s e n .

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Es i s t zwar b e d a u e r l i c h , daß man m i t der b i o l o g i s c h e n Be­s t immungsmetho de i n der von uns angewandten Form normale ACTH-Spiegel im Plasma d i r e k t n i c h t zuverlässig messen kann« Für d i e K l i n i k i n t e r e s s a n t e E r g e b n i s s e l a s s e n s i c h , wie g e z e i g t , m i t d i e s e r Methode jedo c h b e i P a t i e n t e n m i t erhöhten ACTH-Spiegeln f i n d e n . I n der DISKUSSION wurde auf dynamische G e s i c h t s p u n k t e , auf d i e I d k r e t i o n s r a t e und d i e b i o l o g i s c h e H a l b w e r t s z e i t des endogenen ACTH, eingegangen. Wir meinen z e i g e n z u können, warum mit der von uns verwandten Methode b e i normalen ACTH-Spiegeln k e i n e D i f f e r e n z e n z w i ­schen den ACTH-Spiegeln im Plasma aus dem Bulbus c r a n i a l i s vae. j u g u l . u n d der V. c u b i t a l i s zu f i n d e n s i n d .

- 33 -

I I - VERSUCHE ZUM WIRKUNGSMECHANISMUS DES ACTH

1 0 ACTH UND PROTEINSYNTHESE DER NEBENNIERE

ACTH wurde zunächst a l s d e r j e n i g e P a k t o r "beschrieben, der nach Hypophysektomie das Gewicht der Nebenniere erhält (263, 263 a, b ) . Es i s t e i n l e u c h t e n d , daß e i n Hormon, welches das Gewicht der Nebenniere s t e i g e r t (263 - 268), auch e i n e S t e i g e r u n g der Nucleinsäure-(269 - 276) und der P r o t e i n ­synthese (277 - 286) i n der Nebenniere b e w i r k t . Der Be­sprechung u n s e r e r Befunde über den bioche m i s c h e n Mechanis­mus der S t e i g e r u n g der P r o t e i n s y n t h e s e i n der Nebenniere durch ACTH s e i e i n e k u r z g e h a l t e n e D a r s t e l l u n g der augen­b l i c k l i c h e n Anschauungen über d i e Biochemie der P r o t e i n ­synthese v o r a n g e s t e l l t (201 - 257).

Abb. 17s Schema der Biochemie der P r o t e i n s y n t h e s e A T P - A d e n o s i n t r i p h o s p h a t , AMP«Adenosinmonophosphat, PP»Pyrophosphat, t-RNS=Transfer-Ribonucleinsäure, m-RNS=Messenger-Ribonucleinsäure

A M I N O S Ä U R E + A T P A M I N O A C Y L *vA M P + P P ^

A M E N O A C Y L ' v A M P + t - R N S ^ A M I N O A C Y L - t - R N S + A M P

> 105 000 x g Ü

L Ö S L I C H E

Z E L L F R A K T I O N

M I K R O S O M E N

105 000 x g S E D .

M K R O S O M E N -

H A L T I G E

Z E L L F R A K T I O N

15 000 x g Ü

P R O T E I N

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HOAGLAND, ZAMECNIK und M i t a r b e i t e r (211, 213) z e i g t e n , daß Aminosäuren z u e r s t m i t ATP a k t i v i e r t werden und der A m i n o a o y l r e s t dann auf e i n e transfer-Ribonucleinsäure übertragen w i r d (Abb. 17)* Die sog. "pH 5-Enzyme" oder auch Aminoacyl-t-RNS-Synthetasen k a t a l y s i e r e n d i e s e b e i d e n S c h r i t t e . Der nächste S c h r i t t i s t d i e Übertragung des A m i n o a c y l r e s t e s auf d i e an Ribosomen bzw. Polysomen i n Synthese b e f i n d l i c h e n P e p t i d k e t t e n . H i e r i s t der A n g r i f f s ­punkt der Transferenzyme ( A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e n ) • Abb. 17 z e i g t d i e s e Verhältnisse sc h e m a t i s c h und macht f e r n e r an­s c h a u l i c h , welche P a k t o r e n i n der sogenannten löslichen Z e l l f r a k t i o n (105 000 x g Überstand) bzw. i n der m i k r o s o -m e n h a l t i g e n Z e l l f r a k t i o n (15 000 x g Überstand) zu f i n d e n s i n d (301, 302).

a) BIOCHEMIE DER PROTEINSYNTHESE Es e r s c h e i n t zweckmäßig, über d i e s e n zusammenfassenden Abs a t z h i n a u s e i n e etwas d e t a r i e r t e r e , wenn auch b e i weitem n i c h t umfassende Zusammenstellung der Befunde über d i e Biochemie der P r o t e i n s y n t h e s e h i e r einzufügen. E i n i g e Über­s i c h t s a r b e i t e n zu diesem Thema s e i e n z i t i e r t (201 - 210). Die A k t i v i e r u n g der Aminosäuren u n t e r B i l d u n g von Am i n o a c y l -AMP und d i e B i l d u n g der e n e r g i e r e i c h e n Oxyester zwischen der Aminosäure und der 3 f-Hydroxylgruppe der R i b o s e der endständigen Adenosylgruppe der Transferribonucleinsäuren wurden b e r e i t s erwähnt (204, 211 - 218). Beide S c h r i t t e werden von den Aminoacyl-RNS-Synthetasen k a t a l y s i e r t , d i e b e i pH 5 gefällt werden können. ATP und GTP s i n d für d i e P r o t e i n s y n t h e s e b e i I n k u b a t i o n der pH 5-Enzyme m i t i s o l i e r ­t e n Mikrosomen e r f o r d e r l i c h (212). D i e K e n n t n i s über den Ort der P e p t i d s y n t h e s e hat s i c h e b e n f a l l s i n den l e t z t e n J a h r e n w e i t e r e n t w i c k e l t . Mikrosomen können nach Homogeni­s a t i o n von Lebergewebe i n i s o t o n e n Rohrzuckerlösungen, - zur E r h a l t u n g der M i t o c h o n d r i e n s t r u k t u r (186) -, durch Z e n t r i f u g a t i o n des 15 000 x g-Überstandes b e i 105 000 x g s e d i m e n t i e r t werden (184, J 8 5 ) . Durch D e s o x y c h o l a t z u s a t z können aus den Mikrosomen,die a l s Bruchstücke des E r g a s t o -lasmas a u f z u f a s s e n s i n d , d i e Ribosomen i s o l i e r t werden 219 - 222). Der Q u o t i e n t Ribonucleinsäure zu P r o t e i n be­

trägt b e i Mikrosomen 0,25, b e i Ribosomen 1,0 (220, 222). Die S e d i m e n t a t i o n s a n a l y s e z e i g t für Ribosomen e i n e n S-Wert von etwa 70 (221, 223 - 227). Durch P h e n o l e x t r a k t i o n oder D e t e r g e n t i e n l a s s e n s i c h d i e Ribosomen i n k l e i n e r e P a r t i k e l (30 S und 50 S) z e r l e g e n . D i e s e D i s s o z i a t i o n e r f o l g t auch

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nach Senkung der M a g n e s i u m i o n e n k o n z e n t r a t i o n d u r c h D i a l y s e ( 2 2 6 ) . E l e k t r o n e n m i k r o s k o p i s c h e Untersuchungen z e i g t e n be­r e i t s 1960, daß Dimere der 70 S-Ribosomen m i t einem S-Wert von 100 e x i s t i e r e n ( 2 2 4 ) . Neuere Untersuchungen z e i g t e n , daß P e n t a - b i s Heptamere von 73 S Ribosomen, welche auch Polysomen oder Ergosomen genannt werden, w e s e n t l i c h a k t i v e r a l s d i e monomeren 73 S Ribosomen Aminosäuren i n Eiweiß einbauen. Man i s t der A u f f a s s u n g , daß 5-7 oder mehr Ribosomen m i t einem Molekül e i n e r Messenger-Ribonucleinsäure zusam­mengehalten werden (225, 228 - 230«). - E r s t e H inweise auf d i e E x i s t e n z e i n e r Ribonucleinsäure m i t r e l a t i v hohem Mole­k u l a r g e w i c h t (500 0 0 0 ) , m i t s c h n e l l e m Umsatz und e i n e r Basenzusammensetzung, d i e der Desoxyribonucleinsäure e n t ­s p r i c h t , ergaben Versuche m i t B a k t e r i e n , d i e m i t Phagen i n f i z i e r t wurden (205, 232 - 236). Man s p r i c h t der Messenger-Ribonucleinsäure (m-RNS) e i n e e n t s c h e i d e n d e R o l l e b e i der q u a l i t a t i v e n und q u a n t i t a t i v e n R e g u l a t i o n der P r o t e i n s y n t h e ­se z u . Die R o l l e s y n t h e t i s c h e r P o l y n u c l e o t i d e für d i e E r ­f o r s c h u n g des sog. Amino-Acid-Code kann h i e r nur angedeutet werden (207, 237;, - Auch i n Säugetierorganen s c h e i n t m-RNS für d i e P r o t e i n s y n t h e s e von e n t s c h e i d e n d e r Bedeutung z u s e i n . Die Verhältnisse l i e g e n h i e r a l l e r d i n g s etwas anders a l s b e i den p h a g e n i n f i z i e r t e n B a k t e r i e n . D i e m-RNS h a t e i n e B r h e b l i c h größere Stabilität ( 2 3 8 ) . S i e läßt s i c h aus N u c l e o l e n b e i P h e n o l e x t r a k t i o n i n der I n t e r p h a s e an­r e i c h e r n , - stammt a l s o aus dem Z e l l k e r n . Wenn es auch mög­l i c h war, m i t p h e n o l e x t r a h i e r t e n F r a k t i o n e n aus Leber z.B. d i e Albuminsynthese im z e l l f r e i e n System aus E h r l i c h A s z i t e s - Z e l l e n z u s t i m u l i e r e n ( 2 4 0 ) , so e r s c h e i n e n andere B e r i c h t e über das Vorkommen e i n e s m-RNS ähnlichen F a k t o r s im Zytoplasma vom Methodischen her eher z w e i f e l h a f t (241, 242), - Nach der k u r z e n Besprechung der R o l l e der m-RNS muß noch erwähnt werden, daß für d i e Übertragung der Aminoacylgruppe von der Aminoacyl-t-RNS a u f d i e i n Synthese b e f i n d l i c h e P e p t i d k e t t e Transferenzyme ( A m i n o a c y l t r a n s -f e r a s e n ) notwendig s i n d . Man kennt zwei s o l c h e A m i n o a c y l -t r a n s f e r a s e n , von denen e i n e s t a b i l , d i e andere r e l a t i v un­s t a b i l i s t . S i e l a s s e n s i c h d u r c h Ammonsulfatfällungen f r a k t i o n i e r e n (217, 243 - 250). Für d i e P r o t e i n s y n t h e s e i n m i k r o s o m e n h a l t i g e n Systemen s c h e i n t d i e A m i n o a c y l t r a n s -f e r a s e I a l l e i n e a u s z u r e i c h e n ( 2 4 4 ) , v e r m u t l i c h w e i l d i e T r a n s f e r f a k t o r e n t e i l w e i s e an Mikrosomen oder Ribosomen ge­bunden s i n d ( 2 1 7 ) . Neben der Komplexbildung zwischen Aminoacyl-t-RNS und Ribosomen, sowie der P e p t i d s y n t h e s e an Ribosomen w i r d von den T r a n s f e r f a k t o r e n auch d i e H y d r o l y s e der Aminoacyl-t-RNS, a l s o d i e enzymatische D e a c y l i e r u n g k a t a l y s i e r t ( 2 1 7 ) . D i e s e H y d r o l y s e läßt s i c h d u r c h Puromycin-z u s a t z s t e i g e r n , da Puromycin ebenso wie Ohlorampheniool den A m i n o a c y l - T r a n s f e r s p e z i f i s c h hemmt (251, 2 5 4 ) . Schließ­l i c h s e i noch erwähnt, daß auch ohne Ribosomen, nämlich im Z e l l k e r n , i n M i t o c h o n d r i e n und i n der sog. löslichen Z e l l ­f r a k t i o n Aminosäuren i n P r o t e i n e i n g e b a u t werden können (254 - 257).

b) PROTEINSYNTHESE IM NEBENNIERENHOMOGENAT

Ausgangspunkt für unsere Untersuchungen war d i e Beobachtung v o n PARESE und REDDY ( 2 7 8 ) , daß nach ACTH-Behandlung der E i n b a u von 1 4 C - G l y c i n i n P r o t e i n im 15 000 x g Überstand der Homogenate von R a t t e n n e b e n n i e r e n g e s t e i g e r t i s t . D i e ursprüngliche M i t t e i l u n g d i e s e r A u t o r e n , daß d i e A k t i v i ­tät der Mikrosomen der Nebennieren ACTH-behandelter T i e r e g l e i c h d e r j e n i g e n der K o n t r o l l t i e r e s e i , wurde später v o n PARESE (281 - 283) k o r r i g i e r t . Danach s i n k t d i e Aktivität der Mikrosomen nach ACTH-Behandlung zunächst für e i n i g e Stunden ab, um dann später gegenüber K o n t r o l l e n a n z u s t e i g e n ( 2 8 6 ) . D i e kr e u z w e i s e I n k u b a t i o n von Mikrosomen und lös­l i c h e r Z e l l f r a k t i o n von Nebennieren ACTH- und unbehandelter R a t t e n z e i g t dagegen schon zwei Stunden nach Beginn der ACTH-Behandlung und zu jedem danach u n t e r s u c h t e n Z e i t p u n k t e i n e gegenüber K o n t r o l l e n höhere Aktivität i n der löslichen Z e l l f r a k t i o n (284, 286). Daher g a l t unser I n t e r e s s e i n e r s t e r L i n i e der Natur des P a k t o r s im 105 000 x g-Überstand der Nebennieren ACTH-behandelter R a t t e n , welcher für d i e i n v i t r o P r o t e i n s y n t h e s e o f f e n b a r g e s c h w i n d i g k e i t s b e s t i m m e n d i s t . - Sehr v e r e i n f a c h t wurden d i e s e Untersuchungen d u r c h d i e Beobachtung, daß n i c h t nur d i e m i k r o s o m e n h a l t i g e n Z e l l ­f r a k t i o n e n der Nebennieren von K o n t r o l l r a t t e n , sondern auch von Hunden und von Schweinen auf den Zus a t z der lös­l i c h e n Z e l l f r a k t i o n der Nebennieren ACTH- und unbehandelter R a t t e n i n g l e i c h e r Weise ansprechen ( 2 8 4 ) . So w i r d der E i n ­bau von ^ C - G l y c i n i n 0,4 ml 15 000 x g-Überstand von Nebennierenhomogenaten von Kon t r o l l r e f c t e n , Hunden oder Schwei­nen v o n 0,4 ml 105 000 x g-Überstand von Nebennierenhomoge­n a t e n von K o n t r o l l r a t t e n und w e i t d e u t l i c h e r , von ACTH-behan-d e l t e n R a t t e n i n g l e i c h e r Weise s t i m u l i e r t (Tab.3). D i e s e r V e r s u c h z e i g t , daß der für d i e i n v i t r o P r o t e i n s y n t h e s e geschwindigkeitsbestimmende P a k t o r n i c h t s p e z i e s s p e z i f i s c h i s t . B e i den n i c h t u n e r h e b l i c h e n Gewichtsmengen der Neben­n i e r e n , d i e für unsere Untersuchungen benötigt wurden, war es e i n e e r h e b l i c h e E r l e i c h t e r u n g , daß für d i e Präparation der m i k r o s o m e n h a l t i g e n Z e l l f r a k t i o n n i c h t mehr d i e k l e i n e n Nebennieren der R a t t e n verwandt werden mußten.

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Tab.3* Einfluß der löslichen Z e l l f r a k t i o n (105 000 x g Ü) der Nebennieren ACTH-behandelter R a t t e n auf d i e m i k r o s o m e n h a l t i g e F r a k t i o n (15 000 x g Ü) der Nebennieren von K o n t r o l l r a t t e n vom Hund und vom Schwein«

Testlösung =

Medium A

mikrosome K o n t r o l l -

R a t t e

n h a l t i g e Z e l l f i

Hund

* a k t i o n i

Schwein Testlösung =

Medium A

241 257 192

Lös­l i c h e Z e l l ­f r a k ­t i o n R a t t e

Kon­t r o l ­l e

553 292 593 Lös­l i c h e Z e l l ­f r a k ­t i o n R a t t e

ACTH 870 531 926

Männliche Sprague-Dawley-Ratten. (200-250 g) wurden d u r c h D e k a p i t a t i o n getötet, d i e Nebennieren von anhängenden F e t t - und Bindegewebe b e f r e i t und etwa 2 M i n . nach dem Tod des T i e r e s i n e i s k a l t e r 0,9 # NaCl gesammelt. Nach ge­nau zweiminütiger Homogenisation (200 mg Nebenniere p r o ml Medium A nach LITTLEFIELD und KELLER ( 2 1 9 ) , d.h. 0,25 M Saccharose, 0.025 M K C l , 0,005 M M g C l 2 , 0,05 M T r i s - H C l -P u f f e r pH 7,5) im POTTER-ELVEJHEM Homogenisator (188) m i t T e f l o n - P i s t i l l wurde der 10 M i n . x 15000 x g Überstand a l s m i k r o s o m e n h a l t i g e F r a k t i o n h e r g e s t e l l t . - Sohweinenebennie-r e n wurden im S c h l a c h t h o f etwa 10 M i n u t e n nach dem Tod des T i e r e s entnommen und schon b e i der Entnahme vollständig v o n a l l e m F e t t - und Bindegewebe b e f r e i t , was nach S c h l i t z e n der K a p s e l möglich ist» Ho m o g e n i s i e r t wurde wiederum u n t e r s e h r k o n s t a n t g e h a l t e n e n Bedingungen (4 x 10 Sek. i n einem k l e i ­nen Messerhomogenisator und 1 Minute im POTTER-ELVEJHEM)• Der 15 000 x g Überstand h a t k e i n e g e r i n g e r e Aktivität, wenn d i e Schweinenebennieren wochenlang b e i - 18°C aufgeho­ben werden ( 2 8 4 ) . A l l e S c h r i t t e wurden b e i 0 b i s 3° C d u r c h ­geführt. - ACTH-Behandlung: Die R a t t e n e r h i e l t e n d r e i Tage v o r dem V e r s u c h morgens und abends i.m. j e 20 E Depot-ACTH (Schweine-ACTH der F i r m a Upjohn Co), i n späteren Ve r s u c h e n j e 5 E s y n t h e t i s c h e s ß 1-24 C o r t i o o t r o p i n i n Depotform ( C i b a 36 716-Ba). - Zur Gewinnung der löslichen Z e l l f r a k t i o n wurden 100 mg Nebennieren von K o n t r o l l r a t t e n oder von ACTH-be h a n d e l t e n T i e r e n pro ml Medium A wie oben h o m o g e n i s i e r t und d i e Homogenate 120 M i n . b e i 105 000 x g (Model L S p i n c o -U l t r a z e n t r i f u g e der Fa.Beckman I n s t r . ) z e n t r i f u g i e r t . - D i e I n k u b a t i o n s b e d i n g u n g e n z u r Messung des Einbaus von 14-C-G l y c i n i n P r o t e i n s i n d im Text b e s c h r i e b e n . P r o t e i n b e s t i m ­mungen nach LOWRY (189) wurden regelmäßig am 15 000 x g Ü (15 mg/ml) und am 105 000 x g Ü (im M i t t e l 3 mg/ml) durchge­führt. - I n d i e s e r T a b e l l e s i n d I P M - M i t t e l w e r t e . v o n j e d r e i Inkubationsansätzen der 3 v e r s c h i e d e n e n Versuche (Ratte,Hund, Schwein) angegeben.

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c) METHODIK Es s o l l h i e r noch k u r z auf d i e Methodik der I n k u b a t i o n d e r Z e l l f r a k t i o n e n z u r Messung des Einbaus r a d i o a k t i v e r Amino­säuren i n P r o t e i n e eingegangen werden. Soweit n i c h t ausdrück­l i c h anders vermerkt,wurden 0,4 ml der m i k r o s o m e n h a l t i g e n Z e l l f r a k t i o n (15 000 x g Überstand), d i e a l s o das Äquivalent von 80 mg Schweinenebennieren i n Medium A (Tab.3) e n t h i e l ­t e n , i n einem Gesamtvolumen von 1,05 ml m i t 1 ̂ uöi 1 4 - C - G l y c i n i n k u b i e r t . Die s p e z i f i s c h e Aktivität des verwandten 14-ö-Glycins war 2,78, i n späteren Versuchen 70 mCi/mMol. Da d i a l y s i e r t e 15 000 x g Überstände ohne Zu s a t z von Amino­säure gemisehen zum I n k u b a t i o n s a n s a t z ( T a b . 4 ) p r a k t i s c h k e i n e n G l y c i n e i n b a u z e i g t e n , nach Z u s a t z von j e 1 yuMol von 19 Amino­säuren (284) jedoch etwa d i e g l e i c h e Menge 14-C*»Glycin wie dur c h den n i c h t d i a l y s i e r t e n 15 000 x g Überstand e i n g e b a u t wurde, kann angenommen werden, daß d i e G l y c i n k o n z e n t r a t i o n

-4 im I n k u b a t i o n s g e m i s c h i n der Größenordnung von 10 b i s 10 M l i e g t , was etwa dem G e h a l t von Organen, z.B. von H i r n ­gewebe an f r e i e m G l y c i n e n t s p r i c h t ( 1 9 0 ) . Die B e s c h l e u n i g u n g e n des G l y c i n e i n b a u s , d i e man nach Zusatz von 0,4 ml der T e s t ­lösungen, a l s o des 105 000 x g Überstandes von Ra t t e n n e b e n -nierenhomogenaten i n Medium A, bzw. e i n z e l n e r F r a k t i o n e n aus d i e s e r löslichen Z e l l f r a k t i o n - l e t z t e r e wurden i n jedem F a l l gegen Medium A d i a l y s i e r t - f i n d e t , können n i c h t auf der B a s i s höherer s p e z i f i s c h e r Aktivitäten des 1 4 - C - G l y c i n s e r ­klärt werden. Im G e g e n t e i l , d i e s p e z i f i s c h e Aktivität dürfte b e i Z usatz der löslichen Z e l l f r a k t i o n a b s i n k e n . Der Zuwachs an eingebautem G l y c i n i s t a l s o i n W i r k l i c h k e i t höher a l s es i n der Zunahme der IPM zum Ausdruck kommt (Tab. 3 und 5 ) . -Es wurde bewußt darauf v e r z i c h t e t , den G l y c i n e i n b a u i n Mol pro mg P r o t e i n oder entsprechend anzugeben, da d i e Gesamt-G l y c i n k o n z e n t r a t i o n im I n k u b a t i o n s a n s a t z n i c h t genau bekannt war und, um tatsächlich gemessene Werte angeben zu können. -Die H-CGlycin-Lösungen müssen f r i s c h s e i n , bzw. e i n g e f r o ­r e n aufgehoben werden, da s i c h s o n s t i n i h n e n , v e r m u t l i c h durch B a k t e r i e n , Produkte b i l d e n , d i e s i c h wie Eiweißkörper

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gegenüber der üblichen Waschprozedur (s.u.) v e r h a l t e n und den B l i n d w e r t ( = N u l l - M i n u t e n w e r t ) für d i e G l y c i n i n k o r p o r a -t i o n erhöhen ( 2 7 8 ) . Für den chromatographischen Nachweis waren d i e s e V e r u n r e i n i g u n g e n j e d o c h zu g e r i n g . W ir fanden, daß mehr a l s 99 # der Radioaktivität u n s e r e r 1 4 - C - G l y c i n -Lösungen s i c h c h r o m a t o g r a p h i s c h ( n - B u t a n o l : E i s e s s i g : H 2 0 = 5 : 1 : 4 ) wie G l y c i n v e r h i e l t e n . - Dem I n k u b a t i o n s g e m i s c h (Tab.4) wurden außerdem ( i n 1,05 ml Gesamtvolumen) 10^/uMole Pho s p h o e n o l p y r u v a t , 1^/uMol A d e n o s i n t r i p h o s p h a t , 0,25/uMole G u a n o s i n t r i p h o s p h a t und c a . 60yug d i a l y s i e r t e P y r u v a t k i n a s e z u g e s e t z t und d a b e i f o l g e n d e E n d k o n z e n t r a t i o n e n e i n g e s t e l l t : 0,005 M Mg + +, 0,017 M K +, o,05 M T r i s - H C l - P u f f e r pH 7,5 und 0,25 M Saccharose. - Es wurde 60 M i n u t e n b e i 37°0 i n k u b i e r t , nachdem Vorversuche g e z e i g t h a t t e n , daß der G l y c i n e i n b a u 120 M i n u t e n l a n g etwa l i n e a r verläuft. Nach der I n k u b a t i o n wurden 4 ml k a l t e s Wasser und 5 ml 20 $> f r i s c h e k a l t e T r i -chloressigsäure zu dem I n k u b a t i o n s g e m i s c h gegeben. D i e aus­gab. 4 s Inkubationsansätz für 1 ^ C - G l y c i n - E i n b a u i n P r o t e i n

' ^ C - G l y o i n Phosphoenolpyruvat (PEP) A d e n o s i n t r i p h o s p h a t (ATP) G u a n o s i n t r i p h o s p h a t (GTP) P y r u v a t k i n a s e 15 000 x g Überstand von Schweinenebennieren Testlösung

LV = 1,05 ml , 37°0 , 60 M i n .

gefällten P r o t e i n e wurden nach 15 M i n u t e n (0°0) s e d i m e n t i e r t und f o l g e n d e r Waschprozedur u n t e r z o g e n : j e 10 ml a b s o l . A l ­k o h o l , 2 x 10 ml 5 1* TCE b e i 90°C z u r E x t r a k t i o n der N u o l e i n -säuren (19 9 ) , 10 ml k a l t e 5 # TCE, 10 ml Äthylaoetat z u r L i p i d e x t r a k t i o n und 10 ml a b s o l . A l k o h o l . D i e Proteinrück-

1/uCi (0,36 bzw. 0,014/uMol) 10 /uMol 1 /uMol 0,25 /uMol

c a . 60 ^/ug

80 mg -Äquivalent z.B. Medium A

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stände wurden u n t e r Vakuum g e t r o c k n e t , über Nacht i n 2 ml Hyaminehydroxide ( P a c k a r d I n s t r . ) b e i 60°C gelöst und schließlich m i t 18 ml Sointillationsflüssigkeit (0,3 # PPO« 2 , 5 - d i p h e n y l o x a z o l , 0,06 # Dirnethyl-POPOP = 1,4-bis-2-(4-Me-t h y l - 5 - P h e n y l o x a z o l y l ) - B e n z o l i n T o l u o l ) i n Zählgläser über­führt und im Plüssigkeitsscintillationszähler ( N u c l e a r -Chikago, bww. P a c k a r d I n s t r . ) b e i e i n e r Zählausbeute von ca. 65 # gezählt. B l i n d w e r t e , d.h. Inkubationsansätze, denen TCE s o f o r t nach dem S t a r t z u g e s e t z t wurde, l i e f e n b e i jedem V e r s u c h m i t und wurden von den E r g e b n i s s e n sub­t r a h i e r t . Unberücksichtigt b l i e b b e i d i e s e r Versuchsanordnung d i e Tatsach e , daß etwa 1/20 der Ra t t e n n e b e n n i e r e Nebennierenmark (200) i s t und daß e r h e b l i c h e U n t e r s c h i e d e der ACTH-Wirkung auf d i e v e r s c h i e d e n e n Zonen der Ne b e n n i e r e n r i n d e bestehen (265 - 267, 270, 275). Würde man d i e gefundene Änderung der Aktivität der A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e (s.u.) auf s p e z i f i s c h durch ACTH b e t r o f f e n e S t r u k t u r e n b e z i e h e n können, so wäre damit zu rechnen, daß der beobachtete E f f e k t w e s e n t l i c h d e u t l i c h e r wäre.

d) VORVERSUCHE

Folgende Vorversuche s o l l t e n d i e B r a u c h b a r k e i t des g e s c h i l ­d e r t e n Systems für d i e Messung der i n v i t r o P r o t e i n s y n t h e s e überprüfen. Da s i e z.T. b e r e i t s m i t g e t e i l t wurden ( 2 8 4 ) , f a s s e n w i r uns k u r z . Ohne ATP und das ATP r e g e n e r i e r e n d e System wurden nur 10 # des Einbaus des i n Tab.4 angegebenen vollständigen I n k u b a t i o n s a n s a t z e s m i t Medium A a l s T e s t ­lösung gefunden. Zusatz der d o p p e l t e n und d r e i f a c h e n Menge an ATP, PEP und P y r u v a t k i n a s e s t e i g e r t d i e G l y c i n i n k o r p o r a -t i o n n i c h t . Wurde GTP weggelassen, so f a n d s i c h k e i n e V e r ­minderung des G l y c i n e i n b a u s , v e r m u t l i c h w e i l GTP i n der mikrosomenhaltigen N e b e n n i e r e n f r a k t i o n a u s r e i c h e n d v o r h a n ­den oder im I n k u b a t i o n s a n s a t z g e b i l d e t wurde. M i t d i a l y -s i e r t e m 15 000 x g Überstand von Schweinenebennieren fanden

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w i r a l l e r d i n g s b e i Weglassen des GTP e i n e n i c h t s i g n i f i k a n t e Abnahme von 10 - 15 # (p <0,2). Es i s t uns a l s o n i c h t ge­lun g e n , d i e GTP-Abhängigkeit der i n v i t r o - P r o t e i n s y n t h e s e (212, 249) im Nebennierenhomogenat z u z e i g e n , obwohl d i e s e o r i e n t i e r e n d e n Versuche e i n e s o l c h e s i c h e r n i c h t a u s s c h l i e s -sen. Zusatz von j e 1^uMol von 19 n i c h t m a r k i e r t e n Amino­säuren (ohne G l y c i n ) führte zu k e i n e r S t e i g e r u n g des Amino­säureeinbaus, woraus g e s c h l o s s e n werden d a r f , daß d i e Amino-säurekonzentration im Homogenat n i c h t g e s c h w i n d i g k e i t s b e ­stimmend für d i e P r o t e i n s y n t h e s e war. M i t der d o p p e l t e n Men­ge an 15 000 x g Überstand (Schweinenebennieren) wurde etwa d o p p e l t so v i e l ^ C - G l y c i n i n P r o t e i n e i n g e b a u t , was noch e i n m a l z e i g t , daß a l l e C o f a k t o r e n und S u b s t r a t e i n für d i e P r o t e i n s y n t h e s e a u s r e i c h e n d e r K o n z e n t r a t i o n im I n k u b a t i o n s ­a n s a t z vorhanden waren. R e d u z i e r t e s G l u t a t h i o n (10"^M) h a t t e k e i n e n s i c h e r e n bzw. e i n e n hemmenden (10~^ M) Einfluß auf d i e P r o t e i n s y n t h e s e (284, 244, 249)«

Ohne 15 000 x g Überstand, von Schweinenebennieren wurde mi t 0,| ml 105 000 x g Überstand von Nebennieren ACTH-be-h a n d e l t e r R a t t e n nur c a . 10 # (27 IPM) des 1 4 0 - G l y c i n e i n -baus des i n Tab.4 angegebenen Systems gefunden. - I n w e i t e ­r e n V o r v e r s u c h e n (m i t P.KRAUSE) wurde gefunden, daß d i e i n der Legende z u Tab.3 g e s c h i l d e r t e n H o m o g e n i s a t i o n s v e r f a h r e n o f f e n b a r d i e M i t o c h o n d r i e n der Nebennieren n i c h t vollständig i n t a k t l a s s e n (192, 193). Der Geh a l t an Glutamatdehydrogenase e i n e s t y p i s c h e n Homogenats war durch zusätzliche Homogenisa­t i o n m i t dem U l t r a t u r r a x nur zu v e r d o p p e l n , und b e t r u g auch b e i e i n f a c h e r Homogenisation von R a t t e n n e b e n n i e r e n m i t dem Potter-Elvejhem-Homogenisator b e r e i t s 50 $> des Ge h a l t e s der üblichen Schweinenebennierenhomogenate. Der G e h a l t des Schweinenebennierenhomogenates an Lactatdehydrogenase änder­t e s i c h dagegen b e i zusätzlicher Homogenisation m i t dem U l t r a t u r r a x n i c h t .

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e) EINLUSS VON ACTH AUF DIE AKTIVITÄT DER LÖSLICHEN ZELLFRAKTION

Die Behandlung von R a t t e n m i t den i n der Legende z u Tah«3 angegebenen extrem hohen ACTH Dosen führte zu s i g n i f i k a n t e r Zunahme der d i e i n v i t r o P r o t e i n s y n t h e s e s t i m u l i e r e n d e n Aktivität i n der löslichen Z e l l f r a k t i o n der R a t t e n n e b e n n i e r e (Tab.5)•

14 Tab» 5: S t i m u l a t i o n des Einbaus von C-G-lycin i n P r o t e i n

i n der m i k r o s o m e n h a l t i g e n Z e l l f r a k t i o n (15 000 x g Ü) von Schweinenebennieren durch d i e lösliche Z e l l f r a k ­t i o n (105 000 x g Ü) der Nebennieren von ACTH-be-h a n d e l t e n und K o n t r o l l r a t t e n

Testlösung Medium A Kontroll-Über-sta n d

ACTH-Überstand

IPM ( x i 6 ) 207 * 24,9 631 i 60,7 1010 i 87,0

P <0,001 <0,001

Die Gewinnung der Z e l l f r a k t i o n e n und d i e I n k u b a t i o n e n s i n d i n der Legende z u Tab.3 sowie im Text b e s c h r i e b e n . Angege­ben s i n d d i e M i t t e l w e r t e von 9 Versuchen m i t der S t a n d a r d ­abweichung er. Berechnung der S i g n i f i k a n z m i t dem t - T e s t ( 8 4 ) .

Die Werte i n der T a b e l l e wurden nach dreitägiger i.m. ACTH-Behandlung gefunden; d i e s e E r g e b n i s s e e r h i e l t e n w i r , a l l e r d i n g s n i c h t ganz so d e u t l i c h ausgeprägt, auch schon 12 Stunden nach i.m. ACTH-Behandlung. FARESE (286) hat i n ­zwischen, wie unten noch näher ausgeführt, b e r e i t s 2 und 4 Stunden nach i.m. A C T H - a p p l i k a t i o n e i n e S t e i g e r u n g der Aktivität i n der löslichen Z e l l f r a k t i o n b e s c h r i e b e n . -Es i s t wichtig,dem Nebennierengewicht der R a t t e Beachtung zu schenken Die dreitägige i.m. ACTH-Behandlung führte im M i t t e l zu einem A n s t i e g des Nebennierengewichtes um 49 #

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(10 Versuche m i t insgesamt 124 K o n t r o l l t i e r e n und 86 ACT I i -R a t t e n ) . Das Gewicht e i n e s Nebennierenpaares der K o n t r o l l ­r a t t e n s o l l t e z w i s c h e n 30 und 35 mg l i e g e n * Werden d i e R a t t e n u n t e r ungünstigen Bedingungen (Kälte, Unruhe) ge­h a l t e n , so f i n d e n s i c h z.T. w e s e n t l i c h höhere Nebennieren­g e w i c h t e , welche b i s nahe an d i e Gewichte der ACTH-behan-d e l t e n T i e r e h e r a n r e i c h e n . J e d e r " s t r e s s " führt b e i der n i c h t h y p o p h y s e k t o m i e r t e n R a t t e zu ACTH-Ausschüttung, so daß es schließlich s c h w i e r i g w i r d , d i e Wirkung des exogenen ACTH von der des endogenen zu u n t e r s c h e i d e n . Aus diesem Grunde konnten w i r d i e K o n t r o l l t i e r e natürlich auch n i c h t m i t P l a c e b o - I n j e k t i o n e n behandeln.

D i e Wirkung der i.m. ACTH-Behandlung auf d i e i n v i t r o P r o t e i n s y n t h e s e wurde sowohl b e i Verwendung natürlicher ACTH-Präparate a l s auch e i n e r Depotform des s y n t h e t i s c h e n ß^~ 2^Corticotropins ( j a b . 3 ) gefunden. Daß w i r tatsächlich e i n e n für ACTH s p e z i f i s c h e n E f f e k t s t u d i e r t e n und n i c h t d i e Wirkung e i n e r V e r u n r e i n i g u n g i n den ACTH-Präparaten wie z.B. Wachstumshormon (271 ) . zeigten Versuche, b e i denen hy p o p h y s e k t o m i e r t e n R a t t e n über v i e r Stunden 2 E s y n t h e t i ­sches ( T r i a c o s a p e p t i d , 83) oder 1,5 E h o c h g e r e i n i g t e s natürliches ACTH (Oxycel-ACTH, W i l s o n ) i n f u n d i e r t wurde (Tab . 6 ) .

Tab.6: Einfluß von ACTH-Infusionen b e i hyp o p h y s e k t o m i e r t e n R a t t e n auf d i e lösliche Z e l l f r a k t i o n der Nebenniere.

Testlösung G l y c i n e i n b a u 0,4 ml Medium A

0,35 ml 105 000 x g Ü von P l a c e b o -i n f u n d i e r t e n T i e r e n

0,35 ml 105 000 x g Ü von ACTH i n f u n ­d i e r t e n T i e r e n

183* 3 IPM 356 + 10,7 IPM

527 * 19,5 IPM

In k u b a t i o n s b e d i n g u n g e n wie i n der Legende zu Tab.3 und im Tex t b e s c h r i e b e n . D i e R a t t e n wurden 14 Tage v o r h e r hypo-p h y s e k t o m i e r t . W e i t e r e t e c h n i s c h e E i n z e l h e i t e n wie Methodik der I n f u s i o n i n d i e V. j u g u l a r i s e t c . s . ( 2 8 4 ) . IPM s i n d a l s x - 6 - (84) angegeben (0;02 > p > 0,01 ) •

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f ) NATUR DES STIMULIERENDEN FAKTORS IN DER LÖSLICHEN ZELLFRAKT ION

Es g a l t nun zunächst d i e Frage zu klären, we l c h e r Natur der F a k t o r i n der löslichen Z e l l f r a k t i o n i s t . Dabei s t a n d , nachdem Farese und REDDY (278) b e r e i t s g e z e i g t h a t t e n , daß d i e B i l d u n g von Aminoacyl-t-RNS i n Rattennebennierenhomoge-n a t e n m i t und ohne ACTH-Vorbehandlung g l e i c h s c h n e l l ab­läuft, für uns d i e Frage im Vordergrund, ob der F a k t o r , der n i c h t d i a l y s i e r b a r war und b e i 55°C i n a k t i v i e r t wurde, e i n Enzymprotein, a l s o z.B. A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e oder e i n e Messenger-Ribonucleinsäure, a l s o e i n N u c l e o p r o t e i n , i n der löslichen Z e l l f r a k t i o n s e i . Im f o l g e n d e n s e i e n unsere Be­funde (284) zu diesem Punkt d a r g e s t e l l t .

Es s e i v o r a u s g e s c h i c k t , daß zwischen den 105 000 x g-Über-ständen der Nebennierenhomogenate ACTH- und unbehandelter R a t t e n bezüglich des G e h a l t e s an s t i m u l i e r e n d e m F a k t o r k e i n q u a l i t a t i v e r , sondern nur e i n q u a n t i t a t i v e r U n t e r s c h i e d be­s t e h t . Wie Tab.5 z e i g t , i s t der F a k t o r nach ACTH-Behandlung i n etwa d o p p e l t e r Aktivität, bezogen a uf das g l e i c h e Neben­n i e r e n g e w i c h t , vorhanden. A l l e im f o l g e n d e n g e s c h i l d e r t e n C h a r a k t e r i s t i k a g e l t e n sowohl für d i e k l e i n e r e Aktivität im Kontrollüberstand a l s auch für d i e größere Aktivität im 105 000 x g-Überstand der Nebennieren ACTH-behandelter R a t t e n .

M i t H i l f e der D i c h t e g r a d i e n t e n z e n t r i f u g a t i o n ließ s i c h z e i g e n , daß der für d i e P r o t e i n s y n t h e s e g e s c h w i n d i g k e i t s b e ­stimmende F a k t o r etwas v o r dem H a u p t a n t e i l der b e i 260 und 280 nm a b s o r b i e r e n d e n B e s t a n d t e i l e der löslichen Z e l l f r a k ­t i o n s e d i m e n t i e r t (Abb. 18). - E i n e grob angenäherte Be­stimmung des M o l e k u l a r g e w i c h t e s d i e s e s F a k t o r s wurde m i t t e l s der v e r g l e i c h e n d e n D i c h t e g r a d i e n t e n z e n t r i f u g a t i o n durchge­führt. Diese von MARTIN und AMES (194) v o r g e s c h l a g e n e Tech­n i k e r l a u b t d i e Berechnung des M o l e k u l a r g e w i c h t e s e i n e r un­bekannten Substanz aus der S e d i m e n t a t i o n g l e i c h z e i t i g zen-t r i f u g i e r t e r P r o t e i n e m i t bekanntem M o l e k u l a r g e w i c h t ( v g l .

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Abb. 1 8 i S e d i m e n t a t i o n des s t i m u l i e r e n d e n F a k t o r s im 105 000 x g-Überstand b e i D i c h t e g r a d i e n t e n -z e n t r i f ugat i on.

Der 105 000 x g-Über s t a n d von 200 mg Nebenniere ACTH-b e h a n d e l t e r R a t t e n wurde auf einem 6 - 2 0 #igen D i c h t e ­g r a d i e n t e n 19 Stunden l a n g b e i + 1°0 und 37500 RPM im SW 39 R o t o r z e n t r i f u g i e r t . Die Technik der D i c h t e g r a ­d i e n t e n z e n t r i f u g a t i o n m i t anschließender F r a k t i o n i e r u n g des G r a d i e n t e n i s t u n t e r "METHODEN11 b e s c h r i e b e n . D i e Ab­s o r p t i o n der gewonnenen F r a k t i o n e n b e i 260 und 280 nm und d i e S t i m u l a t i o n des 1 ^ 0 - G l y c i n e i n b a u s i n P r o t e i n i n dem i n Tab.4 g e s c h i l d e r t e n System nach Z u s a t z von 0 t3 ml j e d e r F r a k t i o n des D i c h t e g r a d i e n t e n s i n d i n d i e s e r Ab­b i l d u n g d a r g e s t e l l t .

o i 1 1 1 1 i 1 1 i

10 20 30 40 44 unten m m oben

Abb.14). U n t e r d e r V o r a u s s e t z u n g , daß das s p e z i f i s c h e T e i l ­chenvolumen der unbekannten und der Bezugssubstanzen g l e i c h i s t , was g e r e c h t f e r t i g t e r s o h e i n t , da d i e m e i s t e n P r o t e i n e s p e z i f i s c h e T e i l c h e n v o l u m e n zwischen 0,70 und 0,75 c m V ß haben (194 - 197), g i l t d i e G l e i c h u n g .

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S-Wert S-Wert.

MG1

MG.

Wir verwandten a l s B e z u g s p r o t e i n e P y r u v a t k i n a s e und Lak-tatdehydrogenase (Abb.19).

Abb.19* Molekulargewichtsbestimmung d u r c h v e r g l e i c h e n -de D i c h t e g r a d i e n t e n z e n t r i f u g a t i o n .

Auf S a c c h a r o s e d i c h t e g r a d i e n t e n (5-13 #), d i e wie u n t e r "METHODEN" b e s c h r i e b e n , h e r g e s t e l l t wurden, wurde 105 000 x g-Oberstand von Nebennieren ACTH-behandelter R a t t e n - i n anderen Versuchen auch von K o n t r o l l r a t t e n - und d i a l y s i e r t e P y r u v a t k i n a s e 16 1/2 Stunden b e i 37500 RPM und + 1°C z e n t r i -f u g i e r t . D i e Bestimmung der Besc h l e u n i g u n g des 1 4 - C - G l y c i n -e i n b a u s i n P r o t e i n e r f o l g t e wie i n der Legende zu Tab.3. 4 angegeben. Die Bestimmung des Enzymproteins e r f o l g t e m i t der LOWRY-Methode ( 1 8 9 ) . Pur d i e P y r u v a t k i n a s e wurde e i n M o l e k u l a r g e w i c h t von 237 000 und e i n S 2o w- V e r* v o n 10»04 (197) angenommen. I n entsprechenden ' Ver s u c h e n wurde d i a l y s i e r t e Lactatdehydrogenase b e n u t z t , für d i e e i n Mole­k u l a r g e w i c h t von 140 000 und e i n S o n ^-Wert von 7,2 ange­geben i s t (195, 196). ^ u ' w

- , 600

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Nach d i e s e r Methode l i e g t das M o l e k u l a r g e w i c h t des für d i e i n v i t r o P r o t e i n s y n t h e s e g e s c h w i n d i g k e i t s b e s t i m m e n d e n Pak­t o r s zwischen 1,0 und 1,4 x 1 0 5 und der S 2 Q y-Wert ( S e d i ­m e n t a t i o n s k o e f f i z i e n t ) z w i s c h e n 6 und 7, a l s o w e s e n t l i c h n i e d r i g e r a l s das für m-RNS angegebene (205) M o l e k u l a r g e ­w i c h t von 500 000. - W e i t e r e Versuche (284) z e i g t e n , daß der P a k t o r durch V o r i n k u b a t i o n m i t T r y p s i n i n a k t i v i e r t wer­den konnte, während V o r i n k u b a t i o n m i t R i b o n u c l e a s e d i e Ak­tivität n i c h t zerstörte. -

Nachdem d i e g e s c h i l d e r t e n Versuche dafür sp r a c h e n , daß der P a k t o r e i n P r o t e i n war, haben w i r den d i a l y s i e r t e n 105 000 x g-Überstand von Nebenaieren ACTH b e h a n d e l t e r R a t t e n m i t t e l s A nionenaustauschchromatographie auf D i -äthylaminoäthylcellulosesäulen (198) a u f g e t r e n n t . D i e s e s System war von TAKANAMI (248 - 250) für d i e R e i n i g u n g von L e b e r a m i n o a c y l t r a n s f e r a s e angegeben. Abb. 20 z e i g t , daß

14 der geschwindigkeitsbestimmende P a k t o r für den ^ C - G l y o i n -e i n b a u i n unserem System s i c h auf DEAE-Cellulose-Säulen wie L e b e r a m i n o a z y l t r a n s f e r a s e (217, 218, 248 - 250) v e r ­h i e l t und b e i G r a d i e n t e n e l u t i o n z w i s c h e n 0,17 und 0,3 molarem C h l o r i d h i n t e r dem H a u p t a n t e i l der P r o t e i n e von der Säule e l u i e r t wurde. Etwa 95 # der wiedergefundenen Aktivität fanden s i c h i n diesem B e r e i c h . D i e Ausbeute l a g b e i d i e s e r Chromatographie zwischen 53 und 70 i* b e i e i n e r 3-7-fachen A n r e i c h e r u n g im V e r g l e i c h zu d i a l y s i e r t e m 105 000 x g-Überstand. Die Aktivität i s t b e i 0°C t a g e l a n g h a l t b a r , e i n g e f r o r e n dagegen n i c h t . D i e chemische Untersuchung des m i t t e l s A n i o n e n a u s t a u s c h -chromatographie a uf DEAE-Cellulose-Säulen gewonnenen P a k t o r s z e i g t e , daß p r a k t i s c h das gesamte Trockengewicht a l s P r o t e i n bestimmbar war und daß Ribonucleinsäurebe-stimmungen N u l l w e r t e ergaben, so daß nach der E m p f i n d l i c h k e i t der Methode behauptet werden kann, daß d i e s e s Präparat

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Abb» 20t D E A E - C e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h i e der löslichen Z e l l f r a k t i o n von Nebennieren ACT^-behandelter R a t t e n

105 000 x g-tfberstand des Homogenats von 1473 mg Neben­n i e r e n ACTH-behandelter R a t t e n ( v g l . Legende Tab.3) wurde d i a l y s i e r t und auf d i e Diäthylaminoäthylcellulose-Säulen a u f g e t r a g e n . D i e E l u t i o n e r f o l g t e m i t P u f f e r I (Abb.21). Nach dem_Vorlauf wurde e i n e G r a d i e n t e n e l u t i o n m i t KOI, deren Linearität du r c h flammenphotometrisehe K a l i u m b e s t i m ­mungen geprüft wurde, und schließlich e i n Nachwaschen m i t 1 M KCl-Lösung a n g e s c h l o s s e n (Abb.21). Die Bestimmung der E x t i n k t i o n b e i 260 und 280 nm und der B e s c h l e u n i g u n g des 14 - C - G l y c i n e i n b a u s i n dem u n t e r Tab.4 angegebenen System z e i g t e , daß d i e Aktivität i n den Proben Nr.5 und 6 e l u i e r i ; wurde, i n welchen d i e A b s o r p t i o n b e i 280 nm höher war a l s d i e b e i 260 nm ( Q u o t i e n t = 1,7). Die höchste s p e z i f i s c h e Aktivität f a n d s i c h i n F r a k t i o n 6. Der u n t e r e T e i l d i e s e r Abb. g i b t d i e Gesamtaktivität w i e d e r , der P r o t e i n g e h a l t war i n Probe Nr. 5 * 5,0 mg und i n Probe Nr.6: 3,36 mg (2 8 4 ) . I n Probe 8 wurden durch 1 M K C l Nucleinsäuren e l u i e r t .

K t 23

Probe

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weniger a l s 1 # Ribonucleinsäure e n t h i e l t (Tab» 7 ) .

Tab.7* P r o t e i n g e h a l t des s t i m u l i e r e n d e n P a k t o r s naoh D E A E - C e l l u l o s e Chromatographie

Vor E x t r a k t i o n Nach E x t r a k t i o n

Trocken­gewicht 2,6 mg 2,7 mg

LOWRY-P r o t e i n 2,5 mg 2,4 mg

Nach Bestimmung des Trockengewichtes e i n e r Mischung aus Probe 5 und 6 (Abb#20) wurde der Rückstand i n Wasser a u f ­genommen, i n 5 % i g e r k a l t e r Trdichloressigsäure gefällt, m i t absolutem A l k o h o l und Äthylacetat gewaschen, 2 x 15 M i n u t e n b e i 90°C m i t 5 # i g e r Trichloressigsäure e x t r a h i e r t (199) und noch e i n m a l m i t Äthylalkohol gewaschen. Darauf f o l g t e d i e Bestimmung des Trockengewichtes und des P r o t e i n ­g e h a l t e s (LOWRY-Methode, 189)» Die k a l t e n und heißen Trichloressigsäureextrakte wurden m i t der Methode von SCHNEIDER (199) bzw. DISCHE (199a) auf i h r e n G e h a l t an RNS u n t e r s u c h t .

14 Schließlich f a n d s i c h , daß der E i n b a u von C-Leuoin i n a n a l o g e r Weise wie der von ^ C - G l y c i n b e s c h l e u n i g t wurde (28 4 ) . Wurden dem i n Tab.4 angegebenen vollständigen System s t e i g e n d e Mengen des m i t t e l s Anionenaustauschchroma-t o g r a p h i e gewonnenen P a k t o r s z u g e s e t z t , so ließ s i c h d i e i n v i t r o P r o t e i n s y n t h e s e l i n e a r zu der zugegebenen Menge um ei n e Zehnerpotenz s t e i g e r n . Diese E r g e b n i s s e z e i g e n , daß w i r h i e r e i n B e i s p i e l für d i e S t i m u l a t i o n der i n v i t r o P r o t e i n s y n t h e s e im Homogenat e i n e s Organs durch vorausgehende i n vivo - B e h a n d l u n g m i t einem Hormon haben, b e i der d i e B e t e i l i g u n g e i n e r Messenger-Ribonucleinsäure zunächst n i c h t nachweisbar i s t .

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g) EINPLUSS VON ACTH AUF DIE AKTIVITÄT DER MIKROSOMEN

An diesem Punkte mußte man d i e Aufmerksamkeit w i e d e r den Untersuchungen über d i e Aktivität der Mikrosomen der Neben­n i e r e nach ACTH-Behandlung zuwenden. PARESE (282) h a t t e z e i g e n können, daß nach ACTH-Behandlung d i e Aktivität der Mikrosomen für den ̂ C - G l y c i n e i n b a u zunimmt und n i c h t , wie ursprünglich m i t g e t e i l t ( 2 7 8 ) , k o n s t a n t b l e i b t . Danach war k l a r , daß nach ACTH-Behandlung (3 Tage) sowohl d i e lösliche Z e l l f r a k t i o n der Nebenniere, a l s auch d i e Mikrosomen. sowie durch Desoxycholatbehandlung gewonnene Ribosomen b e i k r e u z ­w e i s e r I n k u b a t i o n den G l y c i n e i n b a u gegenüber K o n t r o l l e n be­s c h l e u n i g t e n . W e i t e r e Untersuchungen (285) ergaben, daß d i e ACTH-Behandlung sowohl den Ge h a l t der Nebenniere an R i b o ­somen a l s auch an Polysomen, welche a l s d u r c h m-RNS z u ­sammengehaltene Polymere der Ribosomen (229 - 231) a u f g e ­faßt werden (s.o.) s t e i g e r t . Daraus wurde g e s c h l o s s e n , daß ACTH d i e Menge der für d i e Ribosomen verfügbaren m-RNS erhöht. Wir haben uns daher m i t der Präge beschäftigt, ob und wenn welche P a k t o r e n der löslichen Z e l l f r a k t i o n für d i e Aktivität e i n e r gegebenen Menge an Polysomen und damit an m-RNS v e r a n t w o r t l i c h s i n d . Wir fanden, daß b e i I n k u b a t i o n der etwa d o p p e l t e n Menge von Polysomen, wie s i e im üblichen Zellhomogenat (15 000 x g Überstand) zu e r w a r t e n i s t , m i t einem 105 000 x g Überstand, der d i e für d i e P r o t e i n s y n t h e s e notwendige Aminoacyl-t-RNS o f f e n s i c h t l i c h i n a u s r e i c h e n d e r Menge s y n t h e t i s i e r t e , der Aminosäureeinbau i n P r o t e i n d u r c h den von uns a l s Aminoacyl t r a n s f erase angesprochenen P a k t o r l i n e a r zur z u g e s e t z t e n Menge s t i m u l i e r t wurde.

h) KINETISCHE UNTERSUCHUNGEN MIT AMINOACYLTRANSPERASE UND POLYSOMEN AUS SCHWEINENEBENNIEREN

E i n etwas anderer e x p e r i m e n t e l l e r Weg mußte gewählt werden, um d i e q u a n t i t a t i v e n Beziehungen zwischen Polysomen und A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e zu un t e r s u c h e n . Wie oben g e z e i g t (Tab. 3. 5 ) . i s t der s t i m u l i e r e n d e P a k t o r im 105 000 x g Überstand von Nebennieren von K o n t r o l l r a t t e n , wenn auch i n

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g e r i n g e r e r Aktivität a l s nach ACTH-Behandlung vorhanden. D e s g l e i c h e n i s t e r im 105 000 x g Überstand von Schweine­nebennieren n a c h w e i s b a r . Unser e r s t e s Z i e l war daher, d i e ­sen F a k t o r aus den i n b e l i e b i g e r Menge zugänglichen Schwei­nenebennieren a n z u r e i c h e r n . Dazu haben w i r zunächst 105 000 x g Überstand m i t e i n e r U l t r a f i l t r a t i o n s m e t h o d e u n t e r Verwendung von Kollodiumhülsen (191) e i n g e e n g t . D i e du r c h d i e s e K o n z e n t r a t i o n zu e r z i e l e n d e A n r e i c h e r u n g ergab e i n Präparat, das den G l y c i n e i n b a u i n der m i k r o s o m e n h a l t i g e n Z e l l f r a k t i o n von Schweinenebennieren angenähert p r o p o r t i o n a l z u r e i n g e s e t z t e n Menge s t i m u l i e r t e . D i e Mengen und der R e i n ­h e i t s g r a d des s t i m u l i e r e n d e n F a k t o r s wurden j e d o c h a l s un­z u r e i c h e n d b e t r a c h t e t .

Deshalb m o d i f i z i e r t e n w i r das oben b e s c h r i e b e n e chromato­g r a p h i s c h e V e r f a h r e n z ur A n r e i c h e r u n g der A m i n o a c y l t r a n s -f e r a s e ;

Es wurden 13,7 g f r i s c h e Schweinenebennieren, wie i n der Legende zur Tab.3 b e s c h r i e b e n , i n 68,5 ml Medium A (Tab.3) h o m o g e n i s i e r t und der 105 000 x g x 90 M i n . Überstand h e r ­g e s t e l l t . Davon wurden 3 x 15 ml (75 $>) auf Sephadex-G-25 Säulen (h = 20 cm, d » 1,2 cm) a u f g e t r a g e n und m i t P u f f e r I (0,03 M K C l , 0,02 M T r i s - H C l - P u f f e r pH 7,5) e l u i e r t ; es wurden j e 25 ml E l u a t gesammelt, wobei d i e A b s o r p t i o n b e i 254 nm m i t dem U v i c o r d - U l t r a v i o l e t - A b s o r p t i o m e t e r (LKB) r e g i s t r i e r t wurde. Jedes E l u a t wurde d a r a u f m i t der o.g. U l t r a f i l t r a t i o n s m e t h o d e u n t e r Verwendung von Kollodiumhül­sen der Fa. Membran F i l t e r g e s e l l s c h a f t Göttingen (191) b e i einem Vakuum von c a . 50 mm Hg (Ölpumpe) auf c a . 2ml e i n g e ­e n g t . D i e K o n z e n t r a t e wurden 20 M i n . b e i 105 000 x g z e n t r i -f u g i e r t und der Überstand auf e i n e r DEAE-Cellulosesäule m i t t e l s G r a d i e n t e n e l u t i o n f r a k t i o n i e r t . Nach 100 ml V o r l a u f ( P u f f e r I ) wurde e i n G r a d i e n t aus g l e i c h e n Mengen ( j e 150 ml P u f f e r I und P u f f e r I i i 0,5 M K C l , 0,02 M T r i s - H C l -P u f f er pH 7,5) a n g e s c h l o s s e n , dessen Linearität m i t einem Leitfähigkeitsanzeigegerät überprüft wurde. Schließlich wurde noch m i t 1 M K C l (50 ml) naohgewasohen. Das E l u a t der DEAE-Cellulosesäule wurde m i t einem Radi-Rao (LKB) f r a k ­t i o n i e r t (41 F r a k t i o n e n a 11 ml) und d i e A b s o r p t i o n b e i 254 nm m i t dem U v i c o r d r e g i s t r i e r t . Die F r a k t i o n e n wurden - wie aus der Abb.21 e r s i c h t l i c h - r e k o m b i n i e r t (Proben I - X) und m i t t e l s U l t r a f i l t r a t i o n (s.o.) a u f c a . 1 ml e i n ­geengt. D i e Proben I - X wurden schließlich gegen Medium A d i a l y s i e r t , m i t Medium A auf 2 ml aufgefüllt und der P r o t e i n ­g e h a l t der Proben nach LOWRY (189) e r m i t t e l t . A l l e b i s h e r angegebenen S c h r i t t e e r f o l g t e n b e i 0 b i s 2°C. Z i r k a 60 Stunden

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Abb. 21t DEAE-Oellulose-Chromatographie von A m i n o a o y l t r a n s -f e r a s e aus Schweinenebennieren

Erklärung im T e x t .

nach Versuchsbeginn, h.d. nach dem S c h l a c h t e n der Schweine wurden a l i q u o t e Mengen (etwa 1/10 der Proben, z.T. k o m b i n i e r t , m i t dem i n Tab.4 b e s c h r i e b e n e n System (mik r o s o m e n h a l t i g e Z e l l f r a k t i o n von Schweinenebennieren) g e t e s t e t . D i e Abb.21 g i b t d i e Gesamtaktivität der Proben I b i s X w i e d e r , d.h. d i e e r r e c h n e t e (Je samt S t i m u l a t i o n des 1 4 - C - G l y c i n e i n b a u s . - Vorversuohe u n t e r Verwendung von DEAE-Sephadex für d i e Anionenaustauschchromatographie z e i g t e n , daß d i e s e Säule weniger g e e i g n e t war, den s t i m u l i e r e n d e n P a k t o r anzu­r e i c h e r n .

Sodann haben w i r uns m i t der I s o l i e r u n g von Polysomen aus Schweinenebennieren beschäftigt ( s i e h e METHODEN). D i e s e wurden b e i den im f o l g e n d e n b e s c h r i e b e n e n Versuchen dann natürlich p a r a l l e l zu dem T r a n s f e r f a k t o r präpariert.

Zunächst wurden m i t k o n s t a n t e r Menge 105 000 x g Überstand (lösliche Z e l l f r a k t i o n ) s t e i g e n d e Mengen von Polysomen i n ­k u b i e r t (Tab.8). M i t s t e i g e n d e n Mengen an Polysomen f a n d s i o h nur e i n mäßiger A n s t i e g des G l y c i n e i n b a u s , woraus w i r

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schlössen, daß e i n P a k t o r des 105 000 x g ÜberStandes ge­sch w i n d i g k e i t s b e s t i m m e n d war»

Tab.8* "^C-Grlyoineinbau durch Polysomen b e i I n k u b a t i o n m i t 105 000 x g Überstand von Schweinenebennieren.

Polysomen, ml - 0.1 0.2 0.4 IPM 179 240 269 337

Präparation der Polysomen s i e h e "METHODEN". 0,1 ml P o l y ­somen - entsprechend 160 mg Schweinenebennieren - wurden m i t 0,4 ml 105 000 x g Überstand von f r i s c h e n Schweine­ne b e n n i e r e n i n k u b i e r t . I n k u b a t i o n s b e d i n g u n g e n wie i n Tab.4 u n t e r Weglassen des 15 000 x g Überstandes. Bestimmung des 14-0-Grlycineinbaus wie oben b e s c h r i e b e n , angegeben s i n d M i t t e l w e r t e von zwei I n k u b a t i o n e n .

Dann haben w i r k o n s t a n t e Mengen von Polysomen m i t k o n s t a n t e n Mengen der löslichen Z e l l f r a k t i o n (105 000 x g Überstand) und v e r s c h i e d e n e n Mengen der m i t t e l s Anionenaustauschchroma-t o g r a p h i e (Abb.21) a n g e r e i c h e r t e n A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e i n k u b i e r t (Tab.9). Wie d i e T a b e l l e z e i g t , i s t u n t e r den gewählten Inkubationsbedingungen d i e A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e für den G l y c i n e i n b a u d u r c h Polysomen g e s c h w i n d i g k e i t s b e s t i m ­mend. - Dieses E r g e b n i s wurde b e i I n k u b a t i o n von Polysomen m i t T r a n s f e r f a k t o r , w e l c h e r , wie oben b e s c h r i e b e n , aus Nebennieren ACTH b e h a n d e l t e r R a t t e n gewonnen wurde, bestätigt* Wir kommen zu dem Schluß, daß ACTH d i e P r o t e i n s y n t h e s e , a l s E i n b a u m a r k i e r t e r Aminosäuren erfaßt, im Nebennieren-homogenat b e s c h l e u n i g t , indem zunächst d i e Aktivität an A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e i n der Nebenniere zunimmt, und e r s t später d i e Aktivität und Menge der Polysomen a n s t e i g t , für d i e a l l e r d i n g s der G e h a l t an A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e w e i t e r g e s c h w i n d i g k e i t s b e s t i m m e n d b l e i b t . Unter der V o r a u s s e t z u n g , daß d i e im I n k u b a t i o n s a n s a t z i n Sättigung angebotenen S u b t r a t e und C o f a k t o r e n der P r o t e i n s y n t h e s e auch i n v i v o i n der Z e l l e n i c h t g e s c h w i n d i g k e i t s b e s t i m m e n d s i n d , i s t a l s o d i e Zunahme der P r o t e i n s y n t h e s e nach ACTH-Behandlung

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Tab*9* ^ C - G l y o i n e i n b a u durch Polysomen, S t i m u l i e r u n g d u r c h " A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e " .

Probe Nr. (Abb.21) Polysomen Probe e

0,2 ml i n g e s e t z t

0,4 ml

V + 270 (55)

208 0

V I + 515 176

1288 0

V I I + 754 342

1835 0

V I I I + 210 108

331 0

I X + 225 206 i

0

Es wurden 0,1 ml Polysomen (Präparation s i e h e METHODEN), d i e 160 mg f r i s c h e n Schweinenebennieren e n t s p r a c h e n und 0,78 mg P r o t e i n (LOWRY, 189) sowie c a . 1,8 mg ENS (199, 199a) e n t h i e l t e n m i t 0,3 ml 105 000 x g Überstand von f r i s c h e n Schweinenebennieren (= 60 mg AquValent) i n k u ­b i e r t . D i e Inkubationsbedingungen e n t s p r a c h e n denen von Tab.4 u n t e r Weglassen des 15 000 x g Uberstandes von Schweinenebennieren. Von den Proben V b i s IX (Abb.21)wur-den 0,2 ml und 0,4 ml z u g e s e t z t . Die Proben e n t h i e l t e n V: 3,8 mg, V I : 3,5 mg, V I I : 2,8 mg, V I I I : 0,33 mg, IX : 0,3 mg P r o t e i n pro ml. Bestimmung des 1 4 - C - G l y o i n e i n -baues (IPM) wie oben b e s c h r i e b e n . Auf das Gesamtvolumen von 1,05 ml wurde m i t Medium A ergänzt. 105 000 x g Über­s t a n d a l l e i n e : 335 IPM, Polysomen + 105 000 x g Ü: 209 IPM, Polysomen a l l e i n e 5 IPM. - Entsprechende E r g e b n i s s e f a n ­den s i c h b e i Verwendung e i n e r " A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e " , d i e u n t e r Weglassen der G e l f i l t r a t i o n (Sephadex-G 25) gewonnen wurde.

l i n e a r von der Zunahme der Aminoacyltransferase-Aktivität abhängig. - Es wurde b i s h e r n i c h t geklärt, ob e i n e A k t i v i ­täts- oder Mengenzunahme, a l s o Neusynthese, der A m i n o a c y l -

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t r a n s f e r a s e v o r l i e g t . D i e s e Präge könnte man m i t V e r s u c h e n angehen, b e i denen d i e P r o t e i n s y n t h e s e i n v i v o z.B. d u r c h Puromycin b l o c k i e r t und dann d i e ACTH-wirkung auf d i e A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e geprüft würde. S o l c h e Versuche s c h e i ­t e r n b i s h e r an der Toxicität des Puromycin i n v i v o .

2. BEZIEHUNGEN ZWISCHEN PROTEINSYNTHESE UND CORTICOSTEROIDSYNTHESE

a) EINPLUSS VON ACTH UND CYKLISCHEM 3 1 , 5 '-ADENOSINMONO-PHOSPHAT IN VITRO

Die Präge nach der Beziehung zwischen dem Mechanismus d u r c h den ACTH d i e C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e s t e i g e r t und der Wirkung des ACTH auf d i e P r o t e i n s y n t h e s e der Nebenniere i s t i n d e r EINLEITUNG schon g e s t e l l t worden. Zum Verständnis der e i g e ­nen Befunde s e i h i e r noch e i n m a l k u r z a u f d i e L i t e r a t u r eingegangen. FERGUSON und andere A u t o r e n (291 - 296) h a t t e n z e i g e n können, daß nach B l o c k i e r u n g der P r o t e i n s y n t h e s e durch Puromycin i n . N e b e n n i e r e n s c h n i t t e n ACTH i n v i t r o d i e C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e n i c h t s t i m u l i e r t . FERGUSON schloß aus s e i n e n E r g e b n i s s e n , daß d i e P r o t e i n s y n t h e s e für d i e Be­s c h l e u n i g u n g der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e d u r c h ACTH notwen­d i g s e i . - BRANSOM und REDDY (297) h a t t e n , wie ältere A u t o r e n (298), i n e i n e r ähnlichen Versuchsanordnung m i t v i e r g e t e i l t e n R a t t e n n e b e n n i e r e n , d i e m i t ACTH i n k u b i e r t wurden, gefunden, daß ACTH b e i d i e s e n I n k u b a t i o n e n den E i n ­bau r a d i o a k t i v e r Aminosäuren i n N e b e n n i e r e n p r o t e i n be­s c h l e u n i g t . Auffälligerweise war d i e s e r Befund nur z u e r ­heben, wenn das Inkubationsmedium k e i n e Glukose e n t h i e l t . -I n l e t z t e r Z e i t haben HALKERSTONE und M i t a r b . ( 2 9 9 , 300) gerade das G e g e n t e i l b e r i c h t e t , nämlich daß ACTH i n diesem System ( I n k u b a t i o n von v i e r g e t e i l t e n R a t t e n n e b e n n i e r e n ) e i n e S t e i g e r u n g der Corticosteroidausschüttung (und Synthesej

2 9 3 , 3 0 1 , 302) b e w i r k t und den E i n b a u von r a d i o a k t i v e n

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Aminosäuren v e r m i n d e r t . Das g l e i c h e E r g e b n i s wurde für d i e I n k u b a t i o n von R a t t e n n e b e n n i e r e n v i e r t e l n m i t c y k l i s c h e m 31 951 -Adenosinmonophosphat m i t g e t e i l t . -

Auch w i r w i s s e n schon s e i t e i n i g e r Z e i t , daß b e i der I n ­k u b a t i o n von R a t t e n n e b e n n i e r e n v i e r t e l n ACTH den E i n b a u von r a d i o a k t i v e n Aminosäuren n i c h t b e s c h l e u n i g t , sondern eher l e i c h t s e n k t , während d i e Corticosteroidausschüttung be­s c h l e u n i g t w i r d (Abb. 2 2 ) .

Abb. 2 2 i Einfluß des ACTH auf d i e Corticosteronausschüttung und den E i n b a u von 1 4 - C - G l y c i n i n P r o t e i n b e i i n v i t r o I n k u b a t i o n von R a t t e n n e b e n n i e r e n v i e r t e l n .

R a t t e n n e b e n n i e r e n wurden von P e t t und Bindegewebe b e f r e i t und i n 0,9 # i g e r Naöl (0°0) gesammelt und im Gefäß gewogen. Nach e i n i g e r Übung l a s s e n s i c h d i e Nebennieren m i t R a s i e r k l i n ­gen i n etwa g l e i c h große V i e r t e l s c h n e i d e n . D i e V i e r t e l wur­den s y s t e m a t i s c h auf d i e Inkubationsgefäße v e r t e i l t ( 8 V i e r ­t e l pro Gefäß) und i n K r e b s - R i n g e r - B i k a r b o n a t p u f f e r , dessen pH durch Begasung m i t 95 # O2, 5 $> OO2 auf pH 7,5 gebracht wurde, i n k u b i e r t . Das Inkubationsmedium e n t h i e l t 1 /uOi 14-CWGlyoin. D i e ACTH-Konzentration (ß1-24-6ortico4;ropin, Ciba) war 0,5 E/ml Inkubationsmedium. Der G l y c i n e i n b a u

ug B /mg Protein

1J5-

0.1 *

0.05-

PLUS ACTH : o

MINUS ACTH : •

•

0 100 300 500 700 900 1100 IPM/mg Protein

(iPM/mg Ra t t e n n e b e n n i e r e ) wurde wie oben b e s c h r i e b e n (S.39 ) bestimmt. Nach der I n k u b a t i o n (60 M i n u t e n , 37°C) wurde 1 ml

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Inkubationsmedium m i t 15 ml C h l o r o f o r m e x t r a h i e r t und f l u o r i m e t r i s c h d i e C o r t i c o s t e r o n k o n z e n t r a t i o n bestimmt ( s i e h e Methoden der ACTH-BeStimmung). - B e i e i n i g e n V e r ­suchen wurden d i e N e b e n n i e r e n v i e r t e l z u e r s t e i n e Stunde ohne ACTH und 1 4 - C * G l y c i n aber m i t 100 mg# Glukose v o r -i n k u b i e r t , dann das Medium gewechselt und wie oben i n ­k u b i e r t .

D ie A b b i l d u n g z e i g t I n k u b a t i o n e n von R a t t e n n e b e n n i e r e n ­v i e r t e l n ohne Glu k o s e . Entsprechende Werte fanden s i c h b e i I n k u b a t i o n von R a t t e n n e b e n n i e r e n v i e r t e l n m i t ACTH oder o y k l i s c h e m V ,5'-AMP (1,3 x 10~ 5M) b e i Zusatz von Glukose (100 mg

W e i t e r e A u t o r e n (292, 293, 295, 303) fand e n entweder k e i n e B e s c h l e u n i g u n g des Aminosäureeinbaus i n P r o t e i n oder sogar e i n e mehr oder weniger d e u t l i c h e Hemmung i n diesem i n v i t r o System. Man s i e h t daraus, wie s c h w i e r i g d i e I n t e r p r e t a t i o n s o l o h e r i n v i t r o - I n k u b a t i o n e n (291 - 306) s e i n kann und wie s c h w i e r i g es manchmal i s t , d i e E r g e b n i s s e anderer Au­t o r e n auch b e i p e i n l i c h e r Beachtung der methodischen De­t a i l s zu r e p r o d u z i e r e n . Wir waren m i t der R e p r o d u z i e r b a r ­k e i t des G l y c i n e i n b a u s und der C o r t i c o s t e r o i d p r o d u k t i o n b e i den h i e r angeführten i n v i t r o I n k u b a t i o n e n n i c h t r e c h t z u f r i e d e n und bauen unseren Schluß, daß d i e S t i m u l i e r u n g der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e zumindest n i c h t auf e i n e r Be­s c h l e u n i g u n g der Gesamt p r o t e i n s y n t h e s e der Nebenniere d u r c h ACTH b e r u h t , auf w e i t e r e Befunde ( s . u . ) .

Die Wirkung von o y k l i s c h e m 31# 5 1-Adenosinmonophosphat auf d i e Nebenniere i s t i n t e r e s s a n t , s e i t HAYNES und BERTHET (301) i h r e Hypothese präsentierten, daß ACTH über e i n e S t e i ­gerung der K o n z e n t r a t i o n an o y k l i s c h e m 3' ̂ - AMP, ein e A k t i ­v i e r u n g der P h o s p h o r y l a s e und e i n e Erhöhung des G e h a l t e s an NADPH w i r k e (301, 307). Daß NADPH für d i e H y d r o x y l i e r u n g e n i n der N e b e n n i e r e n r i n d e e r f o r d e r l i c h i s t , weiß man s e i t 1955 (329, 308). Z a h l r e i c h e A u t o r e n haben d i e s e Hypothese geprüft und haben entweder E r g e b n i s s e e r h a l t e n , d i e zu i h r p a s sen (309 - 315) oder n i c h t ohne w e i t e r e s m i t i h r v e r e i n ­bar s i n d (316 - 326). E i n e ausführliche D i s k u s s i o n d i e s e r Befunde i s t i n diesem Rahmen n i c h t möglich. Wie schon früher von uns r e f e r i e r t ( 2 6 1 ) , s p r i c h t v i e l e s gegen d i e Annahme, daß d i e Erhöhung des Angebotes an NADPH a l l e i n d i e B e s c h l e u ­n i g u n g der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e b e w i r k t . W i c h t i g e r e r ­s c h e i n t d i e T a t s a c h e , daß c y k l i s c h e s 3 ,,5 ,-AMP und ACTH

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i n v i e l e r H i n s i c h t g l e i c h a r t i g w i r k e n und u n s e r e s Wissens b i s h e r k e i n E f f e k t des ACTH auf d i e Nebenniere bekannt i s t , der d u r c h c y k l i s c h e s AMP n i c h t zu i m m i t i e r e n gewesen wäre« Man weiß a l s o schon s e i t längerer Z e i t , daß c y k l i s c h e s AMP i n v i t r o d i e C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e i n N e b e n n i e r e n s c h n i t t e n erhöht. I n jüngster Z e i t haben j a p a n i s c h e A u t o r e n z e i g e n können, daß sehr hohe K o n z e n t r a t i o n e n (20 mg i n 12 Minuten) an o y k l i s c h e m AMP b e i hyp o p h y s e k t o m i e r t e n R a t t e n a l s o i n v i v o d i e Corticosteronausschüttung s t e i g e r n (327)» B e i e i n e r etwa 600-fach (120-fach) n i e d r i g e r e n D o s i s , d i e a l l e r ­d i n g s immer noch 0,1 bzw. 0,5^uMol b e t r u g , f a n d e n w i r g e r i n g ­fügige A n s t i e g e der Ausschüttung an C o r t i c o s t e r o n im Neben­n i e r e n v e n e n b l u t der hypophysektomierten R a t t e (Abb.23).

Abb»23* Einfluß von o y k l i s c h e m 3 f,5'-Adenosinmonophosphat auf d i e C o r t i c o s t e r o n - I n k r e t i o n der hypophysekto-m i e r t e n R a t t e

Der akut hypophysektomierten R a t t e (s.METHODEN) wurde c y k l i ­sches 3 f,5'-Adenosinmonophosphat der P i r m a Sigma Chemical Comp., wie du r c h den P f e i l v e r a n s c h a u l i c h t , i n d i e A o r t a i n f u n d i e r t (Abb.8)• Bestimmung der Corticosteronausschüttung im Nebennierenvenenblut der R a t t e , wie u n t e r METHODEN be­s c h r i e b e n . D i e Anspreohbarkeit der R a t t e auf sehr hohe ACTH-Dosen war normal ( v g l . Abb.10).

Corticosteron

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Wie ausgeführt, b e s c h l e u n i g t c y k l i s c h e s AMP b e i I n k u b a t i o n von R a t t e n n e b e n n i e r e n v i e r t e l n den E i n b a u von Aminosäuren n i c h t . Auch im d i a l y s i e r t e n m i k r o s o m e n h a l t i g e n Überstand v o n Schweinenebennieren (15 000 x g-Überstand) f i n d e t s i c h k e i n e S t e i g e r u n g der P r o t e i n s y n t h e s e nach Z u s a t z von o y k l i s c h e m AMP (Tab.10). Der Einfluß von i n v i v o - I n j e k t i o n e n von o y k l i s c h e m AMP auf d i e P r o t e i n s y n t h e s e im R a t t e n n e b e n n i e r e n -homogenat w i r d z . Z t . von REDDY und M i t a r b . (persönliche M i t t e i l u n g ) u n t e r s u c h t .

Tab.10: Einfluß von o y k l i s c h e m 3 1,5 1-Adenosinmonophosphat auf d i e 1 4 - 0 - ( x l y c i n i n k o r p o r a t i o n im 15 000 x g Ü

c y k l i s c h e s AMP - +

d i a l y s i e r t e m i k r o ­somenhaltige Z e l l ­f r a k t i o n

225 240

n i c h t d i a l y s i e r t e m i k r o s o m . h a l t i ge Z e l l f r a k t i o n

279 244

Dem üblichen Te s t s y s t e m (Tab.4) wurde c y k l i s c h e s AMP ( 1 0 ~ 4 M) der F i r m a Sigma Chemical Comp, z u g e s e t z t . B e i dem V e r s u c h m i t d i a l y s i e r t e m 15 000 x g Uberstand von Schweineneben­n i e r e n wurden j e 1 /uMol von 19 Aminosäuren zugegeben. Ange­geben s i n d M i t t e l w e r t e von j e 2 I n k u b a t i o n e n .

b) CORTICOSTEROID- UND PROTEINSYNTHESE NACH HYPOPHYSEKTOMIE

Nach Hypophysektomie der R a t t e s i n k t d i e C o r t i c o s t e r o n -i n k r e t i o n i n n e r h a l b von 60 b i s 90 M i n u t e n auf sehr n i e d r i g e S p i e g e l ab (112, 323, 324), wie auch w i r es fande n (Abb.9)* W e i t e r nimmt d i e A n s p r e c h b a r k e i t der C o r t i c o s t e r o n i n k r e t i o n auf ACTH b e i der R a t t e nach Hypophysektomie i n n e r h a l b v o n Stunden b e r e i t s e r h e b l i c h ab (101, 115, 119). Wir f a n d e n dagegen b e i I n k u b a t i o n der löslichen Z e l l f r a k t i o n (105 000 x g-Überstand) der Nebennieren h y p o p h y s e k t o m i e r t e r

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R a t t e n 30 S t d . nach der Hypophysektomie m i t mikrosomenhal-t i g e r F r a k t i o n (15 000 x g-Überstand) von Schweineneben­n i e r e n e i n e B e s c h l e u n i g u n g des 1 ^ C - G l y c i n e i n b a u s , wie w i r s i e sonrit nur nach ACTH-Behandlung von R a t t e n sahen. Der Ge h a l t an s t i m u l i e r e n d e m F a k t o r i n der löslichen Z e l l f r a k ­t i o n war zudem 30 S t d . nach der Hypophysektomie durch ACTH-Infusionen n i c h t w e i t e r z u erhöhen (Tab.11). Wir schließen daraus, daß der " S t r e s s 1 1 der Hypophysektomie (105) und d i e da b e i e r f o l g e n d e ACTH-Ausschüttung zu e i n e r zumin­d e s t 30 Stunden anhaltenden S t e i g e r u n g der P r o t e i n s y n t h e s e führt, während d i e C o r t i c o s t e r o n s y n t h e s e schon sehr v i e l eher abnimmt. -

Tab»11: Aktivität der löslichen Z e l l f r a k t i o n der Neben-n i e r e 30 Stunden nach Hypophysektomie

Testlösung Medium A lösliche Pl a c e b o

Z e l l f r a k t i o n ACTH

IPM 197 848 786

30 Stunden nach Hypophysektomie wurden R a t t e n j e 1,7 E Oxycel-ACTH ( W i l s o n ) , bzw. P l a c e b o i n n e r h a l b von 210 Minu­t e n i n d i e V . j u g u l a r i s i n f u n d i e r t . D i e lösliche Z e l l f r a k ­t i o n wurde,wie i n der legende zu Tab.3 b e s c h r i e b e n , m i t dem üblichen I n k u b a t i o n s s y s t e m (Tab.4) g e t e s t e t . Angegeben s i n d M i t t e l w e r t e von j e 2 I n k u b a t i o n e n .

A n d e r e r s e i t s fanden w i r b e i R a t t e n , d i e 14 Tage v o r h e r hypophysektomiert wurden, nach ACTH-Infusion e i n e d e u t l i c h e Zunahme der A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e - Aktivität (Tab.6), a l s o e i n e " c o r t i c o t r o p h e " Wirkung auf d i e P r o t e i n s y n t h e s e , während nach den Untersuchungen von STAEHELIN und M i t a r b . (119) 10 Tage nach Hypophysektomie 3 E ACTH/kg i . v . k e i n e n A n s t i e g der Cortioosteronausschüttung b e w i r k t e n .

Di e im vorangehenden g e s c h i l d e r t e n Befunde sprechen unseres E r a c h t e n s gegen e i n e B e t e i l i g u n g der "über a l l e s " - P r o t e i n -

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sy n t h e s e , d.h. a l s o der m i t t e l s des ^"C-Aminosäureneinbaus zu messenden Summe von P r o t e i n s y n t h e s e und -abbau, an d e r S t e i g e r u n g der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e d u r c h ACTH. Damit i s t natürlich n i c h t a u s g e s c h l o s s e n , daß ACTH zu e i n e r S t e i g e r u n g der Synthese e i n z e l n e r Enzyme, welche für d i e Be s c h l e u n i g u n g der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e d i r e k t oder i n ­d i r e k t e r f o r d e r l i c h s i n d (309, 312, 321, 328), führt und au f diesem Wege d i e P r o t e i n s y n t h e s e doch für d i e S t e i g e r u n g der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e d u r c h ACTH notwendig i s t .

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I I I . SUPPRESSION DER ENDOGENEN CORTICOSTEROIDINKRETION DURCH KURZZEITIGE CORTICOID-THERAPIE

Di e G l u k o s e t o l e r a n z von P a t i e n t e n , d i e u n t e r e i n e r o r a l e n C o r t i c o i d t h e r a p i e standen, haben w i r m i t H i l f e der i . v . G l u k o s e b e l a s t u n g u n t e r Berechnung der sog. G l u k o s e a s s i m i l a ­t i o n s k o e f f i z i e n t e n (kß-Werte), wie u n t e r METHODEN b e s c h r i e b e n , u n t e r s u c h t . Acht P a t i e n t e n e r h i e l t e n 30 mg P r e d n i s o l o n pro Tag über e i n e n Z e i t r a u m von 9 Tagen. Es wurde d a r a u f geach­t e t , daß d i e P a t i e n t e n jeden Morgen um 6 Uhr 10 mg und dann i n 4-stündigen Abständen j e 5 mg einnahmen. Die l e t z t e T a b l e t t e e r h i e l t e n d i e P a t i e n t e n somit um 22 Uhr. E s h a n d e l -t e s i c h um stationäre P a t i e n t e n , d i e v o r den G l u k o s e b e l a ­stungen nüchtern b l i e b e n und i h r B e t t n i c h t v e r l a s s e n d u r f ­t e n , b i s der G l u k o s e t o l e r a n z t e s t beendet war. E i n e e r s t e i . v. G l u k o s e b e l a s t u n g ( I ) wurde v o r dem Begi n n der P r e d n i -solon-Behandlung durchgeführt. E i n e z w e i t e i . v . Glukosebe­l a s t u n g ( I I ) f o l g t e am 4»Tag der C o r t i c o i d t h e r a p i e morgens um 8 Uhr, das war zwei Stunden nach der l e t z t e n P r e d n i s o l o n — Gabe (6 Uhr morgens, 10 mg). E i n e d r i t t e ( I I I ) i . v . G l u k o s e ­b e l a s t u n g wurde am 7«Tag der C o r t i c o i d t h e r a p i e e b e n f a l l s um 8 Uhr mogens durchgeführt, nachdem am vorausgehenden Abend um 18 Uhr d i e l e t z t e P r e d n i s o l o n - T a b l e t t e (5 mg) eingenommen worden war. D i e G l u k o s e b e l a s t u n g I I fa n d somit zwei Stunden nach C o r t i c o i d e n t z u g , d i e G l u k o s e b e l a s t u n g I I I ca 14 Stunden nach C o r t i c o i d e n t z u g s t a t t .

Tab. 12 z e i g t , daß d i e V e r a b r e i c h u n g von 30 mg P r e d n i s o l o n pro Tag, i n der b e s c h r i e b e n e n Weise, k e i n e n s i g n i f i k a n t e n Einfluß auf d i e k &-Werte, d.h. auf d i e G l u k o s e t o l e r a n z , h a t t e , wenn d i e l e t z t e P r e d n i s o l o n - D o s i s zwei Stunden v o r der i . v . G l u k o s e b e l a s t u n g gegeben wurde ( I I ) . Ca. 14 Stunden nach der l e t z t e n Prednisolon-Gabe waren d i e k^-Werte gegen­über den Ausgangswerten je d o c h s i g n i f i k a n t erhöht ( I I I ) . E i n i g e Werte l a g e n d a b e i e r h e b l i c h über dem N o r m a l b e r e i c h ( M i t t e l w e r t m i t z w e i f a c h e r Standardabweichung) der sog. G l u c o s e a s s i m i l a t i o n s k o e f f i z i e n t e n , der von uns b e i einem N o r m a l k o l l e k t i v e r m i t t e l t wurde und zwischen 1,04 und 2,16

Tab. 12« Wirkung von Prednisolon-Behandlunff und -Entzug auf d i e G l u k o s e t o l e r a n z (kp-Werte;

TAG 1 4 7

i . v . G l u k o s e ­b e l a s t u n g I I I I I I

P r e d n i s o l o n k e i n b i s 2 S t d . v o r i.v.GB

b i s 14 S t d . v o r i.v.GB

*o ± ® 1.59 * 0.58 1.37 - 0.30 2.33 - 0.65

S i g n i f i k a n z der m i t t l e r e n D i f ­f e r e n z e n

I - I I I I - I I I - I I I

p-Werte > 0.1 £ 0.0025 <. 0.025

Die P r e d n i s o I o n - B e h a n d l u n g i s t im Text angegeben, d i e Durchführung der i . v . G l u k o s e b e l a s t u n g und d i e Berechnung der k(j-Werte s i n d u n t e r METHODEN b e s c h r i e b e n . M i t t e l w e r t e der kß-Werte m i t der e i n f a c h e n Standardabweichung und d i e S i g n i f i k a n z (p-Werte) wurden nach (84) b e r e c h n e t . - I n w e i t e r e n Versuchen e r h i e l t e n 12 andere P a t i e n t e n nach dem im Text b e s c h r i e b e n e n Schema P r e d n i s o l o n . D i e Glukosebe­l a s t u n g e n I I und I I I wurden b e i e i n i g e n d i e s e r P a t i e n t e n i n umgekehrter R e i h e n f o l g e durchgeführt, ohne daß eine Än­derung des E r g e b n i s s e s e i n t r a t . B e i d i e s e n P a t i e n t e n war d i e G l u k o s e t o l e r a n z (k$-Werte) 26 Stunden nach Beendigung e i n e r 9-tägigen P r e d n i s o l o n - B e h a n d l u n g wieder normal, d.h. n i c h t s i g n i f i k a n t von den Ausgangswerten v e r s c h i e d e n . E r ­höhte k(j-Werte wurden auch b e i manchen, aber n i c h t b e i a l l e n P a t i e n t e n 1 2 - 1 5 Stunden nach Beendigung e i n e r Lang-z e i t b e h a n d l u n g (mehrere Wochen b i s Monate) m i t P r e d n i s o l o n gefunden.

l i e g t ( 8 0 ) . E i n e erhöhte G l u k o s e t o l e r a n z i s t e i n Z e i c h e n der m a n i f e s t e n oder l a t e n t e n N e b e n n i e r e n r i n d e n i n s u f f i z i e n z ( 8 1 ) , wie das dem K l i n i k e r j a schon lange geläufig i s t . Wir fanden d i e s e Erhöhung der G l u k o s e t o l e r a n z c a . 14 Stunden

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nach E n t z u g e i n e r über wenige Tage gehenden P r e d n i s o l o n -Behandlung, a l s o zu einem Z e i t p u n k t , z u dem k e i n e r der u n t e r s u c h t e n P a t i e n t e n i r g e n d w e l c h e s o n s t i g e n Z e i c h e n der N e b e n n i e r e n i n s u f f i z i e n z b o t . Wir müssen demnach das An­s t e i g e n der G l u k o s e t o l e r a n z a l s e i n Prühzeichen der Neben-n i e r e n r i n d e n i n s u f f i z i e n z a u f f a s s e n (78, 8 1 ) . I n d i e s e r A u f f a s s u n g werden w i r bestärkt durch E r g e b n i s s e u n s e r e s A r b e i t s k r e i s e s ( 8 2 ) , d i e z e i g t e n , daß d i e f l u o r i m e t r i s c h bestimmten sog. 1 1 - H y d r o x y c o r t i c o s t e r o i d e im Plasma ( s i e h e METHODEN) für c a . 24 Stunden nach Beendigung e i n e r 3-tägigen Behandlung m i t 30 mg P r e d n i s o l o n pro Tag noch s u p p r i m i e r t waren bzw. zu diesem Z e i t p u n k t wieder a n s t i e g e n . P l u o r i m e -t r i s c h werden b e k a n n t l i c h im w e s e n t l i c h e n d i e endogenen C o r t i c o s t e r o i d e erfaßt ( 7 4 ) . D i e exogenen O o r t i c o i d e haben e i n e b i o l o g i s c h e H a l b w e r t s z e i t von der Größenordnung we n i g e r Stunden ( 7 3 ) , so daß man tatsächlich m i t e i n e r l a t e n t e n N e b e n n i e r e n r i n d e n i n s u f f i z i e n z um d i e 14. Stunde nach C o r t i c o i d - E n t z u g rechnen kann.

Selbstverständlich w i r d d i e G l u k o s e t o l e r a n z von e i n e r ganzen R e i h e a n d e r e r P a k t o r e n wie z.B. vom I n s u l i n beeinflußt. I n diesem Zusammenhang s e i e n Untersuchungen erwähnt, d i e z e i g t e n , daß ACTH beim a d r e n a l e k t o m i e r t e n T i e r e i n e S t e i g e ­r u n g der I n s u l j n d n k r e t i o n b ewirken und zu Hypoglykämien führen kann (75 - 7 7 ) .

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D I S K U S S I O N

Die k l i n i s c h e Bedeutung der Bestimmung von ACTH-Spiegeln im Plasma aus dem Bulbus c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s und aus der Vena c u b i t a l i s wurde b e r e i t s u n t e r ERGEBNISSEN besprochen« Wir haben uns h i e r noch m i t den dynamischen G e s i c h t s p u n k t e n der A C T H - I n k r e t i o n zu beschäftigen. D i e f o l g e n d e n Ausführungen s o l l e n weniger a l s genaue B e s t i m ­mungen der b i o l o g i s c h e n H a l b w e r t s z e i t und der I n k r e t i o n s ­r a t e des endogenen ACTH aufgefaßt werden, a l s v o r a l l e m erklären, warum k e i n e D i f f e r e n z e n z w i s c h e n den Plasma­s p i e g e l n aus dem Bulbus c r a n . vae. j u g . und aus der V. c u b i t . b e i normaler A C T H - I n k r e t i o n zu f i n d e n waren. B e t r a c h t e n w i r zunächst d i e Probleme, d i e m i t der Bestimmung der b i o l o g i s c h e n H a l b w e r t s z e i t des ACTH zusammenhängen.

Das Produkt aus V e r t e i l u n g s v o l u m e n für ACTH (152) und ACTH-Spiegel i n mE/l Plasma e r g i b t d i e Gesamtmenge an ACTH (mE) im V e r t e i l u n g s v o l u m e n . Durch M u l t i p l i k a t i o n m i t 0,5 erhält man d i e Menge an ACTH i n mE, d i e i n e i n e r H a l b ­w e r t s z e i t e l i m i n i e r t w i r d (= Zähler). D i e s e ACTH-Menge w i r d im G l e i c h g e w i c h t pro H a l b w e r t s z e i t von der Hypophyse e r s e t z t und v e r t e i l t s i c h auf d i e j e n i g e Plasmamenge, d i e i n e i n e r HWZ durch das H i r n k r e i s l a u f g e b i e t fließt und a l s Produkt von HWZ, Hämatokrit und H i r n d u r c h b l u t u n g s v o l u m e n (0,8 1 B l u t pro M i n . nach KETY und SCHMIDT (138) und BERNSMEIER und M i t a r b e i t e r n (139)) berechnet w i r d . Die D i f f e r e n z der ACTH-Spiegel aus Bulbus c r a n . vae. j u g u l . und V. c u b i t . e r r e c h n e t s i c h dann nach der F o r m e l :

A ACTH = V o l ' A C T H * A C T H P l a s m a * °»5

HP1 HWZ ACTH

1 x mE 1

A ACTH 27,5 x 0 , 5 * A C T H p i a s m a

0,44 x HWZ 'ACTH

1 M i n

mE 1

x M in

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31,25 x A O T H p i a s m a

HWZ 'ACTH

/uE ml

V o l ACTH

A ACTH =

Dabei i s t :

A ACTH = Zunahme des ACTH-Spiegels im H i r n k r e i s l a u f i n mikro E pro ml oder mE/l. V e r t e i l u n g s v o l u m e n für ACTH nach WOLF und M i t a r ­b e i t e r n (152) für 1 3 1J-ß 1~ 2 4-Corticotropin 43 1> des Körpergewichts, a l s o b e i 64 kg » c a . 27,5 L i ­t e r . (64 kg war das m i t t l e r e Körpergewicht der fünf P a t i e n t e n (Tab.2) m i t erhöhten ACTH-Plasma-s p i e g e l n . )

H k r i t . = Hämatokrit = c a . 45 $>

A C T H p l a s m a = p e r i p h e r e r P l a s m a s p i e g e l an ACTH

HP1 = Plasmadnrohfluß pro M i n . du r c h das Sohädelinnere » H i r n d u r o h b l u t u n g x ( 1 0 ^ Q k r i t ) » 0,8 x j ^ - 1

pro M i n . (138, 139) HWZ^ 0 T H = b i o l o g i s c h e H a l b w e r t s z e i t des ACTH i n M i n u t e n .

V o r a u s g e s e t z t w i r d , daß der ACTH-Spiegel im Plasma aus der Vena c u b i t a l i s r e p r e s e n t a t i v für das gesamte V e r t e i l u n g s v o l u ­men i s t . D i e s e Annahme i s t j a Voraussetzung für d i e Berechnung des f i k t i v e n V e r t e i l u n g s v o l u m e n s durch r e t r o g r a d e E x t r a p o l a ­t i o n aus dem A b f a l l der P l a s m a k o n z e n t r a t i o n des ̂ J - A C T H ( 1 5 2 ) , D i e s e s V e r t e i l u n g s v o l u m e n i s t e i n e r e c h n e r i s c h e Größe, d i e ana t o m i s c h n i c h t ohne w e i t e r e s z u d e f i n i e r e n i s t . W i r haben h i e r d i e Angabe von WOLF und M i t a r b e i t e r n übernommen, das V e r t e i l u n g s v o l u m e n für ACTH s e i 43 $ des Körpergewichte (1 5 2 ) , was v i e l l e i c h t etwas v i e l e r s c h e i n t . Pur Parathormon wurde a l l e r d i n g s e i n ähnliches V e r t e i l u n g s v o l u m e n angegeben, nämlich 36,4 $> des Körpergewichts (151) • Selbstverständlich i s t das V e r t e i l u n g s v o l u m e n für ACTH n i c h t b e i jedem P a t i e n t e n = 27, 5 1. Wir müssen a l s o f e r n e r v o r a u s s e t z e n , daß V e r t e i -

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lungsvolumen für ACTH und H i r n d u r o h b l u t u n g i n ähnlicher Weise vom Gewicht, bzw. der Körperoberfläche abhängen, um auf eine K o r r e k t u r d i e s e s F e h l e r s v e r z i c h t e n z u können. Schließlich muß man v o r a u s s e t z e n , daß a l l e s ACTH den Schä­delinnenraum über d i e B u l b i c r a n i a l e s vae. j u g u l . verläßt und s i c h i n der k u r z e n Z e i t b i s z u r Passage des Bulbus l e ­d i g l i c h im Plasma verteilt» S o l l t e e i n i n s Gewicht f a l l e n d e r T e i l des venösen B l u t e s aus dem Hypophysenvorderlappen a u f anderen Wegen ( z . B . Rete venosum foram. o v a l . ) das Schädel­i n n e r e v e r l a s s e n , so würden w i r z u l a n g e H a l b w e r t s z e i t e n für endogenes ACTH berechnen. W e i t e r e Voraussetzungen s i n d , daß der V e r t e i l u n g s r a u m von endogenem ACTH g l e i c h dem vom ^ J-ACTH i s t und d i e P l a s m a s p i e g e l im venösen B l u t nach

Passage der t e r m i n a l e n Hirnstrombahn n i c h t höher oder n i e d r i g e r a l s z.B. i n der Vena c u b i t a l i s s i n d . T r e f f e n a l l e d i e s e Voraussetzungen z u , was zumindest b e i e i n i g e n Gegen­s t a n d des Z w e i f e l s s e i n kann, so bestünde h i e r e i n e Mög­l i c h k e i t , d i e H a l b w e r t s z e i t des endogenen ACTH zu e r m i t ­t e l n (Abb. 24).

Wir haben i n v o l l e m Bewußtsein der U n s i c h e r h e i t e n d i e s e r Überlegungen aus der b e i v i e r P a t i e n t e n m i t erhöhten ACTH-Spiegeln (Tab.2) gemessenen m i t t l e r e n D i f f e r e n z z w i s c hen Bulbus c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s und Vena c u b i t a ­l i s e i n e m i t t l e r e H a l b w e r t s z e i t von 48 M i n u t e n für endo­genes ACTH ausgerechnet (Abb.24). D i e s e r Wert stimmt m i t denen der L i t e r a t u r für exogenes m a r k i e r t e s oder n i c h t m a r -k i e r t e s , a l s o b i o l o g i s c h gemessenes ACTH größenordnungs-mässig nur z.T. überein, d i e m e i s t e n m i t g e t e i l t e n H a l b ­w e r t s z e i t e n waren kürzer (102, 133, 142 - 152). Immerhin fanden PPEIPPER und M i t a r b e i t e r (102) b e i I n f u s i o n von 25 E ar t f r e m d e n ACTH i n 4 S t d . , u n t e r Verwendung e i n e r b i o l o g i ­schen Bestimmungsmethode, welche der unseren ähnlich i s t , e i n e H a l b w e r t s z e i t von 29 M i n . und b e r i c h t e t e n f e r n e r , daß d i e H a l b w e r t s z e i t von i n j i z i e r t e m ACTH kürzer und d o s i s ­abhängig s e i . -

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Abb« 24: Diagramm z u r E r m i t t l u n g der b i o l o g i s c h e n H a l b w e r t s z e i t von endogenem ACTH aus dem p e r i p h e r e n ACTH-Spiegel und dessen D i f f e r e n z zum ACTH-Spiegel im Bulbus c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s

Die Überlegungen, d i e zur Anlage d i e s e s Diagramms führten, s i n d im Text ausgeführt. S e t z t man den m i t t l e r e n p a t h o l o ­g i s c h erhöhten ACTH-Plasma-Spiegel der v i e r P a t i e n t e n (B.S., G.J., E.L. und W.P., Tab,2) m i t 259 mE/l Plasma (aus der V . c u b i t , ) und d i e m i t t l e r e p o s i t i v e D i f f e r e n z m i t 169/uE/ml Plasma (im Bulbus c . v . j . ) e i n ( p < 0,05). so berechnet s i c h e i n e b i o l o g i s c h e H a l b w e r t s z e i t von 48 Minuten. - B e i einem "normalen" ACTH-Spiegel von 0,006 mE pro ml Plasma hätten w i r e i n e meßbare D i f f e r e n z im Bulbus c . v . j . f i n d e n müssen, wenn d i e H a l b w e r t s z e i t kürzer a l s 3,8 Mi n u t e n wäre.

NELSON und M i t a r b e i t e r (142, 167) b e r i c h t e n , daß d i e H a l b ­w e r t s z e i t für Schweine-ACTH etwas länger a l s wenige M i n u t e n s e i und u n t e r s c h i e d e n z wischen e i n e r " e r s t e n Phase", d i e

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e i n e r a n f a n g l i c h e n V e r t e i l u n g des exogenen O o r t i o o t r o p i n s e n t s p r e c h e n könnte, und e i n e r z w e i t e n Phase des C o r t i c o -tropin-Schwundes, aus der s i c h e i n e etwas längere H a l b w e r t s ­z e i t auch für exogenes ACTH e r m i t t e l n lasse» - YALOW und M i t a r b e i t e r (133) maßen m i t H i l f e der von i h n e n angegebenen r a d i o i m m u n o l o g i s c h e n Bestimmungsmethode für ACTH d i e Ge­s c h w i n d i g k e i t , mit der s i c h b e i einem a d r e n a l e k t o m i e r t e n P a t i e n t e n m i t anfänglich hohen ACTH-Spiegeln nach C o r t i s o l -A p p l i k a t i o n e i n n i e d r i g e r e r ACTH-Spiegel e i n s t e l l t e und e r ­r e c h n e t e n u n t e r der Annahme, daß d i e s e C o r t i s o l g a b e d i e AC T H - I n k r e t i o n des Hypophysenvorderlappens s c h l a g a r t i g ab­s t e l l t e , e i n e H a l b w e r t s z e i t für ACTH von c a . 10 b i s 15 Mi n u ­t e n . - Wir h a l t e n d i e Annahme, daß C o r t i s o l oder,wie b e i uns,Dexamethason-Gaben d i e A C T H - I n k r e t i o n des Hypophysen­v o r d e r l a p p e n s plötzlich und vollständig u n t e r b r e c h e , für sehr a n f e c h t b a r . U n t e r s t e l l t man aber wie YALOW und M i t a r ­b e i t e r (133) d i e s e Annahme, so s i e h t man, daß beim Ver­g l e i c h des M i t t e l w e r t e s der Plasma-ACTH-Spiegel im B l u t aus der Vena c u b i t a l i s , w e l c h e r b e i den fünf von uns u n t e r ­s u c h t e n P a t i e n t e n m i t erhöhten ACTH-Spiegeln (Tab.2) 0,233 mE/ml b e t r u g , m i t dem M i t t e l w e r t der ACTH-Spiegel e i n e Stunde nach Dexamethasongabe (4 mg), w e l c h e r 0,089 mE/ml war, e i n e b i o l o g i s c h e H a l b w e r t s z e i t von c a . 50 Minut e n für endogenes ACTH n i c h t ganz u n w a h r s c h e i n l i c h i s t . Wir möchten den von uns e r r e c h n e t e n Wert von c a . 40 - 50 Min u t e n den­noch nur a l s größenordnungsmäßige Abschätzung der Halb­w e r t s z e i t (86) von endogenem ACTH v e r s t a n d e n w i s s e n .

G e l t e n für normale, a l s o w e s e n t l i c h n i e d r i g e r e ACTH-Spiegel d i e g l e i c h e n H a l b w e r t s z e i t e n wie für erhöhte S p i e g e l , was nach der L i t e r a t u r über hohe Dosen von exogenem ACTH f r a g ­l i c h i s t (102, 149), so kann es nach Abb.24 n i c h t verwun­dern, daß b e i der mangelnden E m p f i n d l i c h k e i t der Bestimmungs­methode für ACTH im Bulbus c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s k e i n e s i g n i f i k a n t höheren Werte a l s i n der P e r i p h e r i e (Vena c u b i t a l i s ) gefunden wurden. Es e r s c h e i n t umgekehrt der Schluß g e r e c h t f e r t i g t , daß d i e b i o l o g i s c h e H a l b w e r t s z e i t

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von endogenem ACTH b e i normal hohen S p i e g e l n größer a l s 3,8 M i n . s e i n muß (Abb.24), da w i r so n s t D i f f e r e n z e n hätten f i n d e n müssen. Wir berechneten b e i fünf P a t i e n t e n m i t erhöhten ACTH-Spie­g e l n (B.S., G.J., E.L., M.E., W.P., Tab.2) e i n e n m i t t l e r e n Plasma-ACTH-Spiegel von 0,233 mE ACTH pro ml Plasma aus der Vena c u b i t a l i s . Im Plasma aus dem Bulbus c r a n i a l i s vae. j u g u l . waren d i e ACTH-Spiegel b e i d i e s e n P a t i e n t e n im M i t t e l um 0,127 mE ACTH pro ml höher (p < 0,05). Un t e r Verwendung der oben b e s c h r i e b e n e n Formel e r r e c h n e t s i c h u n t e r Annahme e i n e r H i r n d u r c h b l u t u n g von 0,8 1 pro M i n . (138, 139) e i n e A C T H - I n k r e t i o n von c a . 80 E pro Tag. Die naturgemäß wesent­l i c h n i e d r i g e r e A C T H - I n k r e t i o n s r a t e b e i normalen ACTH-Spie­g e l n (150) können w i r , wie ausgeführt, n i c h t e r r e c h n e n .

Der Wirkungsmechanismus des ACTH hat schon sehr v i e l e F o r ­scher i n t e r e s s i e r t . Anatomen, P h y s i o l o g e n , B i o c h e m i k e r und n i c h t z u l e t z t E n d o k r i n o l o g e n haben an diesem Thema g e a r b e i ­t e t . Wir w o l l e n im f o l g e n d e n v e r s u c h e n , d i e Gründe für den k l i n i s c h e n E n d o k r i n o l o g e n zu v e r d e u t l i c h e n , d i e i h n über d i e a l l g e m e i n e N o t w e n d i g k e i t , d i e E r k e n n t n i s s e der Grundlagen­f o r s c h u n g auf i h r e k l i n i s c h e Anwendbarkeit h i n im Auge zu b e h a l t e n , h i n a u s dazu v e r a n l a s s e n , s i c h s e l b s t a k t i v m i t d i e s e n Fragen a u s e i n a n d e r z u s e t z e n .

Welche Möglichkeiten für den Wirkungsmechanismus des ACTH kann man s i c h t h e o r e t i s c h v o r s t e l l e n ?

1• Es könnte s e i n , daß ACTH d i e Permeabilität der Zellmem­bra n ändert und d i e s e r E f f e k t zur E n t f e r n u n g e i n e s Hemm­f a k t o r s der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e oder zu g e s t e i g e r t e r Zufuhr e i n e s e r f o r d e r l i c h e n S u b s t r a t e s führt. HECHTER und M i t a r b . haben tatsächlich Permeabilitätsänderungen der Z e l l ­membran un t e r dem Einfluß von ACTH beobachtet ( 2 5 9 ) . Im Zusammenhang m i t d i e s e r Hypothese i s t natürlich dem schon s e i t v i e l e n J a h r e n bekannten hohen Gehalt der Nebenniere an

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Ascorbinsäure immer w i e d e r Beachtung geschenkt worden (288 - 290). Schon e i n e Minute nach intravenöser Verab­f o l g u n g von ACTH s t e i g t der Ascorbinsäuregehalt im Neben­n i e r e n v e n e n b l u t s t e i l an, während d i e C o r t i c o s t e r o i d e etwa 3 Minuten nach der ACTH-Verabfolgung vermehrt ausgeschüttet werden (287). Es hat s i c h j e d o c h b i s h e r n i c h t z e i g e n l a s s e n , daß Ascorbinsäure der p o s t u l i e r t e Hemmfaktor, nach dessen E n t f e r n u n g d i e C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e b e s c h l e u n i g t i s t , wäre. So bewirken w i e d e r h o l t e ACTH-Gaben immer wieder e i n e n A n s t i e g der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e und - i n k r e t i o n , ohne daß d i e Nebenniere, d i e b e i der e r s t e n ACTH-Gabe aus­geschüttete Ascorbinsäure b e r e i t s w i e d e r g e s p e i c h e r t h a t . Nach Hypophysektomie kommt es i n n e r h a l b von Stunden zu einem A b s i n k e n der E m p f i n d l i c h k e i t , m i t der d i e Nebenniere auf k l e i n e ACTH-Dosen m i t e i n e r S t e i g e r u n g der Ausschüttung an C o r t i c o s t e r o i d e n r e a g i e r t , während ACTH noch 10 Tage nach der Hypophysektomie e i n e S t e i g e r u n g der Ascorbinsäure-ausschüttung sowie der D u r c h b l u t u n g der N e b e n n i e r e n r i n d e b e w i r k t (119). - STAUDINGER kommt i n s e i n e r Übersicht (283) zu dem Schluß, daß d i e Ascorbinsäure k e i n e Bedeutung für d i e S t e r o i d h y d r o x y l i e r u n g e n i n der Nebenniere h a t und daß d i e akute ACTH-Reaktion der N e b e n n i e r e n r i n d e n i c h t von der Ascorbinsäurekonzentration abhängig i s t . - Es s e i noch e r ­wähnt, daß ACTH keineswegs nur d i e Ausschüttung von C o r t i c o s t e r o i d e n , sondern auch d i e Synthese s t e i g e r t (293, 301, 302). - Es f e h l t b i s h e r a l s o der Beweis für den Zusam­menhang zwischen Permeabilitätssteigerung durch ACTH und A n s t i e g der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e .

2. V i e l Beachtung i s t der Möglichkeit geschenkt worden, daß ACTH i n der N e b e n n i e r e n r i n d e n z e l l e vermehrt für d i e C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e notwendige S u b s t r a t e b e r e i t s t e l l t (258, 316). Nachdem b e i P e r f u s i o n s u n t e r s u c h u n g e n gefunden wurde, daß ACTH i n e r s t e r L i n i e an der Umwandlung von C h o l e s t e r i n i n D e l t a - 5 - P r e g n e n o l o n a n g r e i f t ( 2 5 8 ) , d i s k u ­t i e r t e man d i e Möglichkeit, daß z.B. m i t o c h o n d r i a l e s C h o l e ­s t e r i n u n t e r der Wirkung von ACTH vermehrt z ur Verfügung st e h e . Das führt z u der Präge, du r c h welche Mechanismen

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möglicherweise S u b s t r a t e für d i e C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e vermehrt z u r Verfügung stehen könnten»

3. Die v e r s c h i e d e n e n S c h r i t t e der Synthese der C o r t i c o ­s t e r o i d e f i n d e n o f f e n s i c h t l i c h i n v e r s c h i e d e n e n s u b z e l l u ­lären Räumen s t a t t (290, 308, 329). Man kann s i c h v o r s t e l ­l e n , daß ACTH zu Änderungen der Beziehungen zwischen den intrazellulären Räumen führt und auf d i e s e Weise den Aus­t a u s c h von S u b s t r a t e n v e r b e s s e r t und d i e C o r t i c o s t e r o i d ­synthese b e s c h l e u n i g t . I n diesem Zusammenhang s e i e n e l e k t r o ­nenmikroskopische Befunde, wie ei n e "Verlängerung" von M i t o c h o n d r i e n und Bläschenbildung des en d o p l a s m a t i s c h e n R e t i c u l u m s nach ACTH erwähnt (2 6 7 ) .

4* Besondere Aufmerksamkeit hat man der Möglichkeit gewid­met, daß ACTH C o f a k t o r e n , welche für d i e C o r t i c o s t e r o i d ­synthese notwendig s i n d , i n ve r m e h r t e r Menge bereitstellt« Die Hypothese von HAYNES (301, 307), daß ACTH über e i n e A k t i v i e r u n g der P h o s p h o r y l a s e , v e r m i t t e l t d u r c h e i n e n An­s t i e g von o y k l i s c h e m Adenosinmonophosphat,den Gehalt an r e d u z i e r t e m N i k o t i n a d e n i n d i n u c l e o t i d p h o s p h a t , welches für d i e S t e r o i d h y d r o x y l i e r u n g e r f o r d e r l i c h i s t , vermehrt, wur­de im E r g e b n i s t e i l b e r e i t s erwähnt. H i e r s e i e n noch e i n m a l Befunde, welche gegen d i e s e Hypothese sprechen zusammenge­s t e l l t o KORITZ und PERON z e i g t e n , daß d i e S t e i g e r u n g e n der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e durch NADPH und durch ACTH a d d i t i v s i n d (316, 320). Die Oxyd a t i o n von 1 4"C-Glukose z u 1 4*G0 2

w i r d durch ACTH n i c h t beeinflußt (317) oder g e r i n g g e s t e i ­g e r t (318), während b e i vermehrtem A n f a l l von endogenem Glukose-6-Phosphat eher e i n e Abnahme d e r 1 4 C 0 2 P r o d u k t i o n zu erwarten wäre. Während e i n i g e A u t o r e n nach ACTH e i n e Ab­nahme des Glykogengehaltes der Nebenniere sahen (310), f a n ­den andere A u t o r e n k e i n e Abnahme (293, 318). Nach Hypophys­ektomie s i n k t d i e Corticosteronausschüttung b e i der R a t t e i n n e r h a l b von e i n e r h a l b e n b i s e i n e r Stunde ab, während der G e h a l t an r e d u z i e r t e m NADP s i c h 72 Stunden l a n g n i c h t ändert (323, 324). Schließlich w i r d durch Puromycin d i e

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S t e i g e r u n g der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e und -aussohüttung durch ACTH und d u r c h c y k l i s c h e s Adenosinmonophosphat, n i c h t aber d u r c h NADPH-Zusatz b l o c k i e r t (293)« 5. So b l e i b t schließlich noch d i e Möglichkeit zu erwägen, ob ACTH d i e Aktivität oder den G e h a l t an Enzymen, d i e für d i e S t e r o i d s y n t h e s e notwendig s i n d , b e e i n f l u s s e n kann» D i e ­se Möglichkeit e r g i b t s i c h u.a. aus Beobachtungen, daß ACTH z.B. d i e 1 1 - B e t a - H y d r o x y l i e r u n g z.T. sogar s e l e k t i v b e s c h l e u n i g t (313, 328). Es i s t auch b e r i c h t e t worden, daß s i c h u n t e r ACTH das Verhältnis von C o r t i s o l - zu C o r t i -costeronausschüttung ändern kann (331, 332). Wie erwähnt, i s t im P r i n z i p sowohl d i e A k t i v i e r u n g e i n e s Enzyms, a l s auch s e i n e Neusynthese u n t e r dem Einfluß von ACTH denkbar.

Nach d i e s e n grundsätzlichen Erwägungen über t h e o r e t i s c h denkbare Meohanismen, d u r c h d i e ACTH d i e C o r t i c o s t e r o i d ­synthese b e s c h l e u n i g e n könnte, muß man f e s t s t e l l e n , daß t r o t z a l l e r Bemühungen, den Wirkungsmechanismus des ACTH aufzuklären, d i e s e r i n w e s e n t l i c h e n Punkten immer noch völlig u n k l a r i s t .

Unser besonderes I n t e r e s s e g a l t der l e t z t e n der erwähnten Möglichkeiten. FERGUSON h a t t e g e z e i g t , daß d i e B l o c k i e r u n g der Neusynthese von P r o t e i n durch Puromycin e i n e S t e i g e r u n g der C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e durch ACTH v e r h i n d e r t (291 - 294). Dabei s c h i e n uns i n t e r e s s a n t , daß e i n e r s e i t s Puromycin den T r a n s f e r von Aminoacylgruppen von A m i n o a c y l - t - R i b o n u c l e i n -säure a u f Ribosomen b l o c k i e r t (251, 252), und a n d e r e r s e i t s der für d i e P r o t e i n s y n t h e s e im Homogenat von Nebennieren ge­schwindigkeitsbestimmende S c h r i t t , w e l c h e r d u r c h ACTH-Be­handlung b e s c h l e u n i g t w i r d (278, 284), eben d i e s e r A m i n o a o y l -t r a n s f e r i s t . - B e i B l o c k i e r u n g der Ribonucleinsäuresynthese durch A c t i n o m y c i n i s t d i e S t e i g e r u n g der C o r t i c o s t e r o i d ­synthese durch ACTH i n t e r e s s a n t e r w e i s e n i c h t b l o c k i e r t ( 2 9 4 ) .

H i e r s e i noch e i n e k u r z e Bemerkung über zwei w i c h t i g e P r i n z i p i e n , n a c h der a l l e Beobachtungen über Wirkungen und

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Wirkungsmechanismen von Hormonen b e u r t e i l t werden, e i n g e ­schoben. Gemeint s i n d d i e Beachtung d e r z e i t l i c h e n R e i h e n ­f o l g e der v e r s c h i e d e n e n d u r c h das Hormon ausgelösten E f f e k ­t e und schließlich der D o s i s , durch, welche s i e ausgelöst werden können. ACTH b e w i r k t schon wenige M i n u t e n n a c h intravenöser V e r a b f o l g u n g e i n e S t e i g e r u n g der C o r t i c o s t e r o i d -ausschüttung und -Synthese i n der N e b e n n i e r e n r i n d e , d i e man auch schon b e i " p h y s i o l o g i s c h e n " Dosen s i e h t . A l l e uns be­kan n t e n Befunde über Wirkungen des ACTH auf das Gewicht und a u f den Gehalt an P r o t e i n , Ribonucleinsäure und Desoxy-ribonucleinsäure der Nebenniere stammen aus Untersuchungen, b e i denen hohe, pharmakologische Dosen verwandt wurden. Das geschah häufig a b s i c h t l i c h , um e i n d e u t i g e E f f e k t e zu e r z i e l e n , s o l l t e aber b e i Überlegungen über den • p h y s i o l o ­g i s c h e n " Virkungsmechanismus n i c h t v e r g e s s e n werden.

Man s o l l t e f e r n e r an d i e Möglichkeit denken, daß das ACTH n i c h t nur e i n e Primär Wirkung, deren F o l g e a l l e späteren Veränderungen i n der Nebenniere s i n d , sondern mehrere,unter Umständen voneinander unabhängige,Effekte h a t . So wurde i n der L i t e r a t u r auch zwischen S o f o r t e f f e k t e n auf d i e C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e und-Ausschüttung und Späteffekten, wie z.B. d i e " a d r e n o c o r t i c o t r o p h e " Wirkung auf das Gewicht, sowie den G e h a l t an P r o t e i n , Ribonucleinsäure, Desoxy-ribonucleinsäure, u n t e r s c h i e d e n .

Wie im E r g e b n i s t e i l näher ausgeführt, kann d i e von FERGUSON (291 - 293) gegebene I n t e r p r e t a t i o n , d i e S t e i g e r u n g der O o r t i o o s t e r o i d i n k r e t i o n d u r c h ACTH s e i nur b e i e r h a l t e n e r P r o t e i n s y n t h e s e möglich, nur m o d i f i z i e r t a u f r e c h t e r h a l t e n werden. S e l b s t b e i v o r s i c h t i g e r Auslegung der i n v i t r o Versuche m i t I n k u b a t i o n von N e b e n n i e r e n s c h n i t t e n muß man f e s t s t e l l e n , daß es möglich i s t , i n v i t r o d i e C o r t i c o s t e r o i d ­s y n t h e s e zu b e s c h l e u n i g e n ohne Zunahme der Aminosäureinkor-p o r a t i o n i n P r o t e i n , bzw. b e i Abnahme d i e s e r . Die Möglich­k e i t , daß ACTH d i e Synthese e i n e s s p e z i f i s c h e n E n z y m p r o t e i n s s t e i g e r t und auf diesem Wege d i e C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e

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s t e u e r t , i s t durch d i e Beobachtung n i c h t a u s g e s c h l o s s e n , daß d i e B i l a n z der P r o t e i n s y n t h e s e n e g a t i v i s t , wie das aus der Minderung des Einbaues r a d i o a k t i v e r Aminosäuren i n P r o t e i n im i n v i t r o - V e r s u c h zu f o l g e r n i s t *

Damit erh e b t s i c h d i e Frage, welche bi o c h e m i s c h e n Mecha­nismen für d i e b e i i n v i v o V e r a b r e i c h u n g von ACTH z w e i f e l ­l o s z u beobachtende S t e i g e r u n g der P r o t e i n s y n t h e s e z u g r u n ­de l i e g e n . ACTH und Nebenniere b i e t e n e i n besonders schönes B e i s p i e l für d i e Untersuchung der " t r o p h e n " Wirkung e i n e s Hormons auf s e i n Z i e l o r g a n , dessen P r o t e i n s y n t h e s e nur der E r h a l t u n g s e i n e r S t r u k t u r bzw. der Anpassung an erhöhte Anforderungen d i e n t und n i c h t , wie z.B. im F a l l e der Lebe r , d i e Aufgabe h a t , P r o t e i n e für n i c h t z e l l e i g e n e A u f ­gaben zu s y n t h e t i s i e r e n . Man kann d i e P r o t e i n s y n t h e s e n i c h t ohne Beachtung des Nucleinsäurestoffwechsels b e s p r e c h e n . Wenn man s i c h an d i e z e i t l i c h e R e i h e n f o l g e des A u f t r e t e n s der b i o c h e m i s c h e n Veränderungen h a l t e n w i l l , so muß man zunächst d i e E r g e b n i s s e von BRANSOM und CHAEGAFF (274) e r ­wähnen, d i e 30 M i n u t e n nach i n t r a p e r i t o n e a l e r I n j e k t i o n von 20 E ACTH e i n e B e s c h l e u n i g u n g der Ribonucleinsäure-synthese sahen. - D i e B e s c h l e u n i g u n g der P r o t e i n s y n t h e s e im Homogenat i s t 2 Stunden nach intramusculärer ACTH-In-j e k t i o n (286) und 4 Stunden nach I n f u s i o n e i n e s s y n t h e t i ­schen ACTH-Peptides (284) beobachtet worden, wobei i n b e i ­den Fällen frühere Z e i t p u n k t e n i c h t u n t e r s u c h t wurden. Zu diesem Z e i t p u n k t i s t d i e B e s c h l e u n i g u n g der P r o t e i n s y n t h e s e im Nebennierenrindenhomogenat ausschließlich auf e i n e Zu­nahme der Aktivität e i n e s n i c h t d i a l y s i e r b a r e n F a k t o r s i n der löslichen Z e l l f r a k t i o n zu b e z i e h e n , w e l c h e r den A m i n o c y l -t r a n s f e r von t-HNS auf Ribosomen b e s c h l e u n i g t (278, 284, 286). D i e im E r g e b n i s t e i l d a r g e s t e l l t e C h a r a k t e r i s i e r u n g d i e s e s F a k t o r s - I n a k t i v i e r u n g b e i 55°C oder d u r c h T r y p s i n , Stabilität gegen R i b o n u o l e a s e , M o l e k u l a r - G e w i c h t und Sedi m e n t a t i o n s k o e i E l z i e h t , chromatographisches V e r h a l t e n a u f DEAE-Cellulosesäulen und P r o t e i n n a t u r - s p r i c h t dafür, daß es s i c h um A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e h a n d e l t . Es i s t uns a l l e r -

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d i n g s n i c h t gelungen, i n Versuchen, b e i denen w i r 1 4C-Leucyl-t-Ribonucleinsäure, d i e w i r m i t t e l s P h e n o l ­e x t r a k t i o n und Alkoholfällung präparierten (.210, 218), m i t m i k r o s o m e n h a l t i g e r Z e l l f r a k t i o n von Schweineneben­n i e r e n i n k u b i e r t e n , den T r a n s f e r von ̂ 4 C - L e u c y l g r u p p e n d i r e k t zu z e i g e n , v e r m u t l i c h w e i l i n diesem I n k u b a t i o n s ­a n s a t z eine sehr s c h n e l l e H y d r o l y s e des A m i n o a c y l r i b o -nucleinsäureesters a b l i e f . PARESE (286) konnte kürzlich m i t genau d i e s e r Versuchsanordnung tatsächlich e i n e mäßige Be s c h l e u n i g u n g des L e u c i n t r a n s f e r s beobachten.

I n den e r s t e n 2 - 4 Stunden nach intramusculärer ACTH-In-j e k t i o n s i n k t nach PARESE (286) d i e Aktivität der M i k r o ­somen und der r i b o s o m a l e RNS-Gehalt l e i c h t ab, um dann ab der 6.Stunde a n z u s t e i g e n . Zu späteren Z e i t p u n k t e n i s t dann sowohl d i e Aktivität, a l s auch der Ribonucleinsäure-g e h a l t der Ribosomen g e s t e i g e r t (281, 282). B i e s e S t e i g e ­r u n g der mikrosomalen Aktivität s c h e i n t auf e i n e r Zunah­me an Polysomen (285) zu beruhen, d i e man, wie erwähnt, a l s Polymere der Ribosomen, d i e an e i n e r Messenger-Ribonucleinsäure zusammengehalten werden, auffaßt. V i e l ­l e i c h t i s t d i e S p e k u l a t i o n n i c h t ganz abwegig, daß nach ACTH i n der Nebenniere zunächst k e i n e q u a l i t a t i v anderen P r o t e i n e s y n t h e t i s i e r t werden müssen, so daß e i n e S t e i g e ­r u n g des Gehaltes oder der Aktivität an Aminoacyltransf e»ase den Bedürfnissen g e r e c h t w i r d . Im f o l g e n d e n kommt es dann, b e i länger ei n w i r k e n d e n hohen ACTH-Spiegeln, zur Notwendig­k e i t auch q u a l i t a t i v neue P r o t e i n e z u s y n t h e t i s i e r e n , was d i e Synthese von Messenger-Ribonucleinsäure und d i e vermehr­t e B i l d u n g von Polysomen e r f o r d e r l i c h maoht.

E r s t nach r e l a t i v l a ngdauernder V e r a b f o l g u n g von ACTH kommt es z u einem chemisch nachweisbaren A n s t i e g des Desoxy-ribonucleinsäuregehaltes der Nebenniere (268, 269, 271). Man benötigt etwa 5 - 7 Tage intramusculärer ACTH-Behandlung, ehe s i c h der Desoxyribonucleinsäuregehalt dann a l l e r d i n g s s p r u n g h a f t v e r d o p p e l t . Der Desoxyribonucleinsäuregehalt e i n e s Gewebes g i l t a l s gutes Maß für d i e ZaffiLder vorhandenen Z e l l -

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k e r n e . H i s t o l o g i s c h e und biochemische Befunde stimmen dahingehend überein, daß das ACTH zunächst e i n e Hyper­t r o p h i e und dann e i n e H y p e r p l a s i e der Nebenniere be­w i r k t * Dazu passen d i e Befunde, daß i n Adenomen der Ne b e n n i e r e n r i n d e Desoxyribonucleinsäure erhöht i s t (273) Für d i e K l i n i k i s t f e r n e r w i c h t i g , daß e i n e C o r t i c o i d ­t h e r a p i e den Ribonucleinsäuregehalt der Nebenniere noch ausgeprägter a l s das Gewicht der Nebenniere senkt (273)» Die Therapie m i t C o r t i c o i d e n b e w i r k t a l s o zunächst e i n e f u n k t i o n e l l e S u p p r e s s i o n der N e b e n n i e r e n r i n d e , e r k e n n t ­l i c h an der v e r m i n d e r t e n Corticosteroidausschüttung nach ACTH oder S t r e s s , sodann s t e l l t s i c h e i n e " b i o c h e m i s c h e " S u p p r e s s i o n - A b s i n k e n des RNS-Gehaltes u.a. - e i n , und schließlich kommt es zur m o r p h o l o g i s c h e n - s t r u k t u r e l l e n A t r o p h i e und Gewichtsabnahme der N e b e n n i e r e n r i n d e .

Im K a p i t e l EINLEITUNG und ERGEBNISSE wurde b e r e i t s erwähnt, wie l a n g d i e S u p p r e s s i o n der C o r t i c o s t e r o i d p r o d u k t i o n d e r Nebe n n i e r e n r i n d e nach langandauernder endogener oder exogener Erhöhung der C o r t i c o s t e r o i d - oder C o r t i c o i d - S p i e -g e l im Plasma a n h a l t e n kann ( 6 7 - 7 2 , 137, 166). Für den K l i n i k e r i s t d i e S u p p r e s s i o n der F u n k t i o n des Hypophysen-Nebennierenrindensystems u n t e r k u r z z e i t i g e r C o r t i c o i d ­t h e r a p i e e b e n f a l l s w i c h t i g (67, 68, 81, 8 2 ) . Wie im E r g e b ­n i s t e i l ausgeführt, läßt s i c h l e t z t e r e m i t t e l s f l u o r i m e -t r i s c h e r Bestimmung der endogenen C o r t i c o s t e r o i d p r o d u k t i o n und i n einem T e i l der Fälle auch a l s Erhöhung der G l u k o s e ­t o l e r a n z bzw. der sog. G l u k o s e a s s i m i l a t i o n s k o e f f i z i e n t e n e r f a s s e n . Zu e r h o f f e n d e Verbesserungen der e n d o k r i n o l o g i s c h e n Methoden, insbesondere auch der ACTH-BeStimmung, werden i n Zukunft v e r m u t l i c h w e i t e r e s L i c h t i n d i e s e i n t e r e s s a n t e n Zusammenhänge b r i n g e n .

Z U S A M M E N F A S S U N G

1 • E i n e " b i o l o g i s c h e Bestimmungsmethode für ACTH-Spiegel im menschlichen Plasma wurde geprüft« Gemessen wurde der ACTH-bedingte A n s t i e g der C o r t i c o s t e r o n - I n k r e t i o n im Plasma aus der Nebennierenvene der akut hypophysektomier­t e n R a t t e . Die Methode wurde i n s o f e r n m o d i f i z i e r t , a l s v e r s u c h t wurde, d i e E m p f i n d l i c h k e i t d u r c h I n f u s i o n der Testlösungen i n d i e A o r t a der R a t t e zu v e r b e s s e r n und d i e G e n a u i g k e i t durch Berücksichtigung der i n d i v i d u e l l e n A C T H - E m p f i n d l i c h k e i t der hypophysektomierten R a t t e zu erhöhen. Die s t a t i s t i s c h e Auswertung der E r g e b n i s s e e i n e s großen V e r s u c h s m a t e r i a l s , (mehr a l s 250 St a n d a r d -Bestimmungen) z e i g t , daß d i e E m p f i n d l i c h k e i t s s c h w e l l e der Methode zwischen 0,01 und 0,015 mE ACTH l i e g t . Damit s i n d N o r m a l s p i e g e l im mens c h l i c h e n Plasma d i r e k t n i c h t oder nur ungenau zu e r f a s s e n . Der G e n a u i g k e i t s i n d e x der Methode war m i t X = 0,07 v e r g l e i c h s w e i s e r e c h t z u ­f r i e d e n s t e l l e n d .

2. Es wurde v e r s u c h t , d i e d i a g n o s t i s c h e B r a u c h b a r k e i t der Methode dadurch zu v e r b e s s e r n , daß neben perip h e r e m B l u t vom P a t i e n t e n (Vena c u b i t a l i s ) B l u t aus dem Bulbus c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s u n t e r s u c h t wurde. Im Bul b u s c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s i s t das venöse B l u t aus dem Hypophysenvorderlappen e r s t durch c a . 15 $ des Herzminu­tenvolumens verdünnt. Es konnte e i n e Beziehung z w i s c h e n D i f f e r e n z der ACTH-Spiegel im B l u t des Bulbus c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s und der Vena c u b i t a l i s , den P l a s m a s p i e g e l n i n der Vena c u b i t a l i s und der b i o l o g i s c h e n H a l b w e r t s z e i t des endogenen ACTH a u f g e s t e l l t werden. Aus der T a t s a c h e , daß w i r b e i normalen ACTH-Spiegeln i n der Vena c u b i t a l i s k e i n e s i g n i f i k a n t höheren ACTH-Spiegel im Bulbus c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s fanden, läßt s i c h an Hand der Empfind­l i c h k e i t s g r e n z e der Methode schließen, daß d i e b i o l o g i s c h e

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H a l b w e r t s z e i t des endogenen ACTH größer a l s 3,8 M i n . s e i n muß»

3« K l i n i s c h i n t e r e s s a n t e Beobachtungen ließen s i c h b e i P a t i e n t e n m i t erhöhten ACTH-Spiegeln machen» B e r i c h t e t w i r d über zwei A d d i s o n - P a t i e n t e n , e i n e P a t i e n t i n m i t einem a d r e n o - g e n i t a l e n Syndrom und zwei P a t i e n t e n m i t t o t a l e r A d r e n a l e k t o m i e wegen e i n e s Cushing-Syndroms, von denen e i n e r d i e Z e i c h e n e i n e s ACTH-produzierenden ohromophoben Hypophysenvorderlappenadenoms a u f w i e s . E i n e P a t i e n t i n m i t einem Cushing-Syndrom m i t b i l a t e r a ­l e r adenomatöser H y p e r p l a s i e und e i n P a t i e n t m i t e i n e r sekundären N e b e n n i e r e n r i n d e n i n s u f f i z i e n z h a t t e n n i c h t s i c h e r meßbare ACTH-Spiegel»

4« Aus den D i f f e r e n z e n der ACTH-Spiegel zwischen Bulbus c r a n i a l i s venae j u g u l a r i s und Vena c u b i t a l i s ließen s i c h b e i der Gruppe der P a t i e n t e n m i t erhöhten ACTH-Spiegeln größenordnungsmäßig e i n e m i t t l e r e b i o l o g i s c h e H a l b ­w e r t s z e i t für endogenes ACTH von 48 M i n . und e i n e m i d ­i e r e tägliche I n k r e t i o n s r a t e von 80 E ACTH e r r e c h n e n .

5* Versuche zum biochemischen Mechanismus der S t i m u l a t i o n der P r o t e i n s y n t h e s e der Nebenniere d u r c h ACTH z e i g t e n , daß e i n h i t z e l a b i l e r (55°C), n i c h t d i a l y s i e r b a r e r , durch T r y p s i n , aber n i c h t durch R i b o n u c l e a s e i n a k t i v i e r b a r e r P a k t o r m i t einem ungefähren M o l e k u l a r g e w i c h t ( v e r g l e i ­chende D i c h t e g r a d i e n t e n - Z e n t r i f u g a t i o n ) von 1,0 -1,4 x 10^ ( S e d i m e n t a t i o n s k o n s t a n t e = S-Wert 6 - 7 ) , der s i c h b e i Anionenaustausch-Chromatographie auf DEAE-Cellulosesäulen wie L e b e r - A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e v e r h i e l t , für den E i n b a u von 14-C-Aminosäuren im Nebennierenhomo-genat g e s c h w i n d i g k e i t s b e s t i m m e n d i s t . W e i t e r e E r g e b n i s s e sprechen dafür, daß d i e s e r P a k t o r A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e i s t . ACTH-Behandlung von R a t t e n v e r d o p p e l t d i e Aktivität

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d i e s e s P a k t o r s i n der löslichen Z e l l f r a k t i o n der Ra t t e n n e b e n n i e r e . D i e Spezifität d i e s e s E f f e k t e s wurde i n Versuchen m i t s y n t h e t i s c h e n AOTH-Peptiden überprüft.

6» E i n e B e t e i l i g u n g von Messenger-Ribonucleinsäure an der g e s t e i g e r t e n P r o t e i n s y n t h e s e im Homogenat konnte dagegen d i r e k t n i c h t g e z e i g t werden. Der E i n b a u von 1 4 - C - G l y c i n i n P r o t e i n durch Polysomen aus Schweinenebennieren, welche b e k a n n t l i c h a l s m i t einem Molekül mRNS zusammen­g e h a l t e n e Polymere von Ribosomen aufgefaßt werden, w i r d b e i Zusatz von A m i n o a c y l t r a n s f e r a s e aus Schweineneben­n i e r e n l i n e a r z u r z u g e s e t z t e n Menge s t i m u l i e r t .

7. Versuche über d i e Beziehungen der O o r t i c o s t e r o i d - und P r o t e i n s y n t h e s e i n der Nebenniere u n t e r dem Einfluß von ACTH sprechen gegen e i n e o b l i g a t e B e t e i l i g u n g der a l s E i n b a u von 14-0-Aminosäuren faßbaren Summe von P r o t e i n ­s ynthese und -abbau an der S t e i g e r u n g der C o r t i c o s t e r o i d ­synthese durch ACTH-» So läßt s i c h b e i i n v i t r o Inkuba­t i o n e n von R a t t e n n e b e n n i e r e n - V i e r t e l n m i t ACTH d i e C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e s t i m u l i e r e n , b e i g l e i c h z e i t i g e r Abnahme der 14-C-Aminosäare-Inkorporation i n P r o t e i n . 30 Stunden nach Hypophysektomie i s t d i e P r o t e i n s y n t h e s e d u r c h den S t r e s s der O p e r a t i o n noch s t i m u l i e r t bzw, d i e Aminoacyltransferase-Aktivität durch ACTH n i c h t z u s t e i g e r n , während d i e C o r t i c o s t e r o i d - I n k r e t i o n schon längst a b g e f a l l e n i s t . 14 Tage nach Hypophysektomie i s t d i e Aminoacyltransferase-Aktivität durch ACTH-Infusionen z u v e r d o p p e l n , während d i e C o r t i c o s t e r o i d - I n k r e t i o n gegen ACTH refraktär i s t . Die D i s s o z i i e r b a r k e i t der E f f e k t e s p r i c h t u.E. gegen e i n e u n m i t t e l b a r e k a u s a l e Verknüpfung von O o r t i c o s t e r o i d - und P r o t e i n s y n t h e s e , ob­wohl natürlich d i e Synthese e i n e s s p e z i f i s c h e n für d i e C o r t i c o s t e r o i d s y n t h e s e e r f o r d e r l i c h e n Enzymproteins i n der n e g a t i v e n B i l a n z der P r o t e i n s y n t h e s e n i c h t erkennbar s e i n muß. E i n "primärer11 ACTH-Effekt, der a l l e n anderen

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b i s h e r bekannten E f f e k t e n k a u s a l übergeordnet wäre, i s t noch n i c h t bekannt.

80 Während e i n e langdauernde C o r t i c o i d t h e r a p i e oder d i e Hypophysektomie zu e i n e r s t r u k t u r e l l e n A t r o p h i e d e r N e b e n n i e r e n r i n d e m i t länger a n h a l t e n d e r R e s i s t e n z der C o r t i c o s t e r o i d - I n k r e t i o n gegen ACTH führen, b e w i r k t e i n e K u r z z e i t - B e h a n d l u n g m i t C o r t i c o i d e n b e i P a t i e n t e n n u r e i n e flüchtige f u n k t i o n e l l e S u p p r e s s i o n der N e b e n n i e r e n ­r i n d e . Nach dem A b s e t z e n d i e s e r Behandlung p e r s i s t i e r t d i e Senkung der f l u o r i m e t r i s c h meßbaren endogenen C o r t i c o s t e r o i d - I n k r e t i o n für etwa 24 Stunden. P a r a l l e l dazu w i r d vorübergehend e i n e erhöhte G l u k o s e t o l e r a n z b e i d er i , v . G l u k o s e b e l a s t u n g erkennbar, d i e a l s Aus­druck e i n e r l a t e n t e n N e b e n n i e r e n r i n d e n i n s u f f i z i e n z i n ­t e r p r e t i e r t w i r d .

L I T E R A T U R V E R Z E I C H N I S

E I N T E I L U N G :

REGULATION DER ACTH-INKRETION i Nr. 1 - 2 4 und 64 - 86 WIRKUNGSMECHANISMUS ANDERER HORMONE : Nr. 25 - 63

(Übersichten) : Nr. 2 5 - 3 1 ACTH-BESTIMMUNG : METHODEN UND KLINIK 2 Nr. 101 - 183

(Übersichten) : Nr.101 - 103 SONSTIGE METHODEN : Nr.184 - 200 BIOCHEMIE DER PROTEINSYNTHESE 2 Nr.201 - 257

(Übersichten) 2 Nr.201 - 210 WIRKUNGSMECHANISMUS DES ACTH 2 Nr.258 - 332

(Übersichten) 2 Nr.258 - 262

1. WIENER, N.2 2. HOLZER, H.:

3. HARRIS, G.W.:

4# GUILLEMIN, R. *

5* MoSHAN, W.H. and M.W. HARTLEY

6. SAPPRAN, M.f

A. V. SCHALLY and B. G. BENPEY

7* GUILLEMIN, R., W.E. DEAR, B. NICHOLS and H.S. LIPSCOMB2

8. SCHALLY, A.V., H.S» LIPSCOMB and R. GUILLEMIN:

9. VERNIKOS -DANELLIS, J . i

10. d e r s . :

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15. CORBIN, A., G. MANGILI, M. MOTTA andL. MARTINI:

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18. CLAYTON, G.W., L.LIBRIK, R . I . GARDNER and R.GUILLEMIN:

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- I I I -

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31. DREWS, J . und A. WACKER:

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- V -

53. TISHLER, P.V. and S.H. INGBAR:

53a.RUEGANER, W.R., G.H. NEWMAN, D.A. RICHERT and W.M. WESTERFIELD

54« WESTEREIELB, W.W., D.A. RICHERT and W.R. RUEGAMER:

55. KRAHL, M.E.:

56. MANCHESTER, K.L. and I.G. WOOL:

57. CARLIN, H. and 0. HECHTER:

58. WOOL, I.G.:

59. FRITZ, G.R. and E. KNOBIL:

60. WEBER, G., N.B. STAMM and E.A. FISHER:

61. KORNER, A.:

62. KOSTYO, J . L . :

63. KORNER, A.:

64. CREEK, R.O.

C o r r e l a t i v e e f f e c t s of puromycin on 131-1 metabolism and amino a c i d i n c o r p o r a t i o n by c a l f t h y r o i d s l i c e s . E n d o c r i n o l o g y , 1 6 , 295 (1965) S p e c i f i c i t y of the e^-glycerophosphate dehydrogenase and m a l i c enzyme response t o t h y r o x i n e . E n d o c r i n o l o g y , 22» 707 (1965) New assay procedure f o r t h y r o x i n e a n a l o g s . E n d o c r i n o l o g y , 72, 802 (1965)

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- V I -

65. EGDAHL, H.H.:

66. BIERICH, J.R., D. SCHÖNBERG und E. ECKLER:

67. RAIMONDO, V.C.D., and P.H.FORSRAM:

68. NICHOLS, T., C A . NUGENT and E.H. TYLER:

69. JANCHES, M., U.GOLDBERG, L.SEGAL, L. JAIMOVTCH, P.CATOGGIO and P.A.de l a BALZE:

70. LANDON, J.,V.WYNN, V.H.T. JAMES and J.B.WOOD:

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71. DANOWSKI, T.S., J.V.BONESSI, G. SABEH, R.D. SUTTON, M.W. WEBSTER and M.E. SARVER:

72. GRABER, A.L., R.L. NEY, W.E. NICHOLSON, D.P. ISLAND and G. W. LIDDLE:

73. RAITH, L. und H. J . KARL:

74. VOGEL, H.G.:

7 5 . GENOTH, S., and H.E. LEBOVITZ:

76. LOVE, T.A., K.E. SUSSMANN and R.P. TIMMER:

77. WOEBER, K.A. and R.ARKY:

A d r e n a l response t o i n f u s e d c o r t i c o t r o p i n i n s u b j e c t s r e c e i v i n g g l u c o c o r t i c o i d s . J . C l i n . E n d o c r i n o l . 2J[, 602 (1965) P r o b a b i l i t i e s o f p i t u i t a r y - a d r e n a l r e s p o n s i v e n e s s a f t e r Steroid t h e r a p y . Ann. I n t . Med. 61, 11 (1964)

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- V I I ~

78. COMRD, V . l

79. SCRIBA, P.C. und K. SCHWARZ:

80. SCRIBA, P.C. K. SCHWARZ und G.G. HOPMANN:

81. SCHWARZ, K., P.C. SCRIBA und G.G. HOPMANN:

82. HOCHHEUSER, W., M.MÜLLER-BARDORPP P.C. SCRIBA und K. SCHWARZ:

83. HOPMANN, K . i

84. DIEM, K.:

85. GADDUM, J.H.:

86. WILBRANDT, W.:

101. LIDDLE, G.W., D. ISLAND and C.K. MEADOR:

102. PPEIPPER, E i P . , P. GARMENDIA, E. VATJBEL und K. RETIENE:

103* HEDNER, P.:

104. PREUD, J . :

105. SYDNOR, K.L. and G. SAYERS:

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- V I I I -

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107. GIRARD, P. and V.K. VANCE:

108. VANCE, V.K., W.J. REDDY, D.H. NELSON and G.W. THORN:

109. NEY, R.L., N. SHIMIZU, W.E. NICHOLSON, D.P. ISLAND and G.W. LIDDLE:

110. WILLIAMS, W.L., D. ISLAND, R.A.A. OLDPIELD and G.W.LIDDLE:

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114. PURVES, H.D. and N.E.SIRETT:

114a«RETIENE, K., A.ESPINOZA, K.H. MARX und E.F. PFEIFFER:

115. OHSAWA, N.:

116. HARRISON, R.G. and M.J. HOEYi

117. URQUHART, J . :

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118. PORTER, J . C and M.S.KLAIBER:

119. STAEHELIN, M., P. BARTHE and P.A. DESAULLES:

120. STARK, E.,B.VARGA Z.ACS and M.PAPP:

121. BUSH, I.E.:

122. ZENKER, N. and D.E. BERNSTEIN:

123. MUNSON, P.L. and W. TOEPEL:

124. SCHULER, W., B. SCHÄR und P. DESAULLES:

125. SCHWYZER, R. und H.KAPPELER:

126. SCHWYZER, R. und P. SIEBER:

127. BARTHE, P., P.A. DESAULLES, B. SCHÄR and M. STAEHELIN:

128. KARL, H.J.:

129. WIEBEL, J . und J.R. BIERICH:

130. RERUP, C :

C o r t i c o s t e r o n e s e c r e t i o n i n r a t s as a f u n c t i o n of ACTH i n p u t and a d r e n a l b l o o d f l o w . Amer. J . P h y s i o l . 209, 811 (1965) On the mechanism o f the a d r e n a l g l a n d response t o a d r e n o c o r t i c o t r o p h i c hormone i n hypophysectomized r a t s . A c t a E n d o c r i n . £0, 55 (1965) ,Adr e n a l b l o o d f l o w response t o a d r e n o c o r t i c o t r o p h i c hormone and o t h e r Stimuli i n the dog. Pflügers Aren, g e s . P h y s i o l . 2 8 5 . 296 (1965) S p e c i e s d i f f e r e n o e s i n a d r e n o c o r t i c a l s e c r e t i o n . J . E n d o c r i n . 95 (1953) The e s t i m a t i o n of s m a l l amounts of c o r t i c o s t e r o n e i n r a t plasma. J . b i o l . Chem. 221» 695 (1958) D e t e c t i o n s o f minute amounts o f a d r e n o c o r t i c o t r o p i c hormone by the e f f e o t on a d r e n a l venous a s c o r b i c a c i d . E n d o c r i n o l o g y , 6J> 785 (1958) Zur Pharmakologie e i n e s ACTH-wirksamen, v o l l s y n t h e t i s c h e n P o l y p e p t i d s des ß 1 - 2 4 - C o r t i c o t r o p i n s , C i b a 30920-Ba, Synacthen. Schweiz. Med. Wschr. 21t 1 0 2 7 (1963) Synthese e i n e s T e t r a c o s a p e p t i d e s m i t hoher c o r t i c o t r o p e r W i r k s a m k e i t : ß 1 - 2 4 - C o r t i c o t r o p i n . H e l v e t i c a Chim. A c t a . £6, 1550 (1963) T o t a l S y n t h e s i s o f a d r e n o c o r t i c o t r o p h i c hormone• Nature 122, 172 (1963) B i o l o g i c a l a c t i v i t y of s y n t h e t i c ß-corticotropin. Nature 202, 908 (1964)

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132. GUILLEMIN, R., C. PORTIER and H.S. LIPSCOMB:

133. YALOW, R.S., S.M. GLICK, J.ROTH and S.A.BERSON:

134. PELBSR, J.P., A . J . MOODY, A. VILLANUEVA et A. VANOTTI:

135. IMURA, H., L.L.SPARKS, G.M. GRODSKY and P.H. PORSHAM:

136. GALICICH, J.H., P. HALBERG, L.A. PRENCH and F. UNGAR:

137. GRABER, A.L., J.R, GIVENS, W.E. NICHOLSON, D. P. ISLAND and G. W. LIDDLE:

138. KETY,S.S. and C.P. SCHMIDT:

139. BERNSMEIER, A., U. GOTTSTEIN und W. RUDOLPH:

140. ANDERSON, E.:

141. v. LANZ, T. und W. WACHSMUTH:

142. MEAKIN, J.W., J.E. BETHUNE, R.H. DESPOINTES and D.H. NELSON:

143. MEAKIN, J.W., W.H. TINGEY and D.H. NELSON:

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217. NATHANS, D. and F. LIPMANN:

218. LAMMFROM, H. and R.F. SQUIRES:

219. LITTLEFIELD, J.W. and E.B.KELLER:

220. KORNER, A.:

221. KURLAND, O . G r . :

222. CAMPBELL, P.N., C. COOPER and M. HICKS:

223. TISSIERES, A., D. SCK&ESSINGER and P.GROS:

224. HUXLEY, H.E. and dZUBAYt

225. SPYRIDES, G.J. and P.LIPMANN:

226. LAMMFROM, H. and E.R. GLOWACKI:

227. BISHOP, J.O.:

228. RISEBROUGH, R.W., A. TISSrfcRES and J.D. WATSON:

229. JACKSON, R . J . , A . J . MUNRO and A. KORNER:

230. WETTSTEIN; P.O., T.STAEEELIN and H.NOLL:

230a.GIERER, A.:

Amino a c i d t r a n s f er from aminoacyl-RNA t o p r o t e i n on ribosomes of E . c o l i . P r o c . N a t . A c a d . S e i . 41, 497 (1961) S t u d i e s on t r a n s f e r o f amino a c i d s t o ribosomes. B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 6^, 421 (1962) I n c o r p o r a t i o n o f 1^G-amino a c i d s i n t o r i b o n u c l e o p r o t e i n p a r t i c l e s from the EHRLICH mouse a s c i t e s tumor. J.biol.Chem.224, 13 (1957)

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X V I I I -

231. CAMPBELL, P.N., Gr» SERCK-HANSSEN and E.LOWE:

232. VOLKIN, E. and L. ASTRACHAN:

2 3 3 . BRENNER, S. f

P. JACOB and M.MESELSON:

234. HALL, B.D. and S. SPIEGELMANN:

235. RUECKERT, R.R. and W. ZILLIG:

2 3 6 . GIERER, A. and G. SCHRAMM:

237. SPEYER, J.P., P. LENGYEL, C. BASILIO and S. OCHOA:

238. SCOTT, R.B. and R.A. MALT:

2 3 9 . SIBATANI, A., S.R. de KLOET, V.G. ALLFREY and Ä.E.MIRSKY:

240. NIU, M.C., C.C. C6RD0VA, L.C. NIU and C.L. RABBILL:

241. M.B.HOAGLAND:

242. HOAGLAND, M.B. and B.A. ASKONAS:

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- X I X -

243. BISHOP , J.O. and R.S.SCHWEET:

244. FES SEMEN* J.M. and K.MOLDAVE:

244a. MESSENDEN, J.M» and K.MOLDAVE:

245. MESSENDEN, J.M., J.CAIRNCROSS and K. MOLDAVE:

246. SLAPIKOFF, S., J.M. FESSENDEN and K. MOLDAVE:

247. GASIOR, E. and K. MOLDAVE:

248. TAKANAMI, M. and T. OKAMOTO:

249. TAKANAMI, M.:

250. TAKANAMI, M.:

251. YARMOLINSKY, M.B. and G.L.de l a HABA:

252. ZAMECNIK, P.C.:

253. FRANKLIN, T . J . :

254. DECKER, K., K.E.FRANZ und M.FRANZ

P a r t i c i p a t i o n o f two enzyme f r a o t i o n s i n the t r a n s f e r o f amino a c i d s from aminoacyl-RNA t o r e t i c u l o c y t e r i b o s o m e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . £4, 617 (1961) S t u d i e s on amino a c y l t r a n s f e r from s o l u b l e RNA t o r a t l i v e r r i b o n u c l e o -p r o t e i n - p a r t i c l e s : E f f e c t o f s o l u b l e and microsomal extracts. B i o c h e m i s t r y ±, 485 (1962) S t u d i e s on amino a c y l t r a n s f e r from s o l u b l e r i b o n u c l e i c a c i d t o ribosomes. J.biol.Chem. 238. 1479 (1963) S t u d i e s on p o l y n u c l e o t i d e - s t i m u l a t e d amino a c y l t r a n s f e r from s o l u b l e RNA to r a t l i v e r ribosomes. P r o c . N a t . A c a d . S o i . £2> 8 2 (1963) Enzymatic i n c o r p o r a t i o n of amino a c i d from amino a c y l s o l u b l e r i b o n u c l e i c a c i d i n t o ribosomal nucleic a c i d and r i b o s o m a l p r o t e i n . J.biol.Chem. 238. 3670 (1963) R e s o l u t i o n o f a m i n o a c y l - t r a n s f e r r i n g enzymes from r a t l i v e r by m o l e c u l a r s i e v e chromatography. J.biol.Chem. 240. 3346 (1965) I s o l a t i o n of an enzyme catalyzing the t r a n s f e r of amino a c i d s from s o l u b l e RNA t o microsomal r i b o n u c l e o p r o t e i n . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 44, 379 ( i 9 6 0 ) T r a n s f e r of amino acids from s o l u b l e RNA t o ribosome. I . I s o l a t i o n of an enzyme catalysing the t r a n s f e r r e a c t i o n . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 51. 85 (1961) T r a n s f e r of amino a c i d s from s o l u b l e RNA t o ribosome. B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 61, 432 (1962) I n h i b i t i o n by puromycin of amino a c i d i n c o r p o r a t i o n i n t o p r o t e i n (Str.alböniger) P r o c . N a t . A c a d . S e i . 1721 (1959) U n s e t t l e d q u e s t i o n s i n the f i e l d of p r o t e i n s y n t h e s i s . Biochem.J. 85, 257 (1962) The e f f e c t of Chlortetracycline on t h e t r a n s f e r of l e u c i n e and " t r a n s f e r " r i b o n u c l e i c a c i d t o r a t - l i v e r ribosomes i n v i t r o . Biochem.J. CJQ, 624 (1964) V e r g l e i c h e n d e Untersuchungen über d i e Wirkung von Puromycin und A m i n o n u o l e o s i d auf d i e P r o t e i n s y n t h e s e . K l i n . W s c h r . £2, 583 (1964)

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257. d e r s .

258. SABA, N.:

259. HECHTER, 0. and Gr. LESTER:

260. FORTIER, C :

261. SCRIBA, P.C.:

262. HILF, R.:

263. EVANS, H.M.:

263a.ANSELMIN0, K . J . , F. HOFFMANN und Lo HEROLD:

263b.COLLIP, J.B., E.Mo ANDERSON and D.L. THOMSON:

264. WEBER, G., R.L. SINGHAL, S.K. SRIVASTAVA, H.J.HIRD and J . FURTH:

264a.WEXLER, B.C.:

265. STUDZINSKI, G.IP., D.O.F. HAY and T.SYMINGTON:

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286. PARESE, R.V.:

287. LIPSCOMB, H.S. and D.H. NELSON:

288. SCHNEIDER, W. und H.J. STAUDINGER:

289. SHARMA, S.K., R.M. JOHNSTONE and J.H. QUASTEL:

E f f e c t o f ACTH on a d r e n a l p r o t e i n s y n t h e s i s • E n d o c r i n o l o g y 71, 294 (1963) ACTH and a d r e n a l p r o t e i n s y n t h e s i s . F e d e r . Prooed 22, No.30 (1963) Zum bioch e m i s c h e n Mechanismus der S t i m u l a t i o n der P r o t e i n s y n t h e s e der Nebenniere durch a d r e n o c o r t i c o t r o p e s Hormon. 11. Sympos. Dt. Ges. E n d o k r i n o l . S p r i n g e r V e r l a g , Berlin-Oöttingen-H e i d e l b e r g , 206 (1964) Changes i n 1 4 " C - g l y c i n e - i n c o r p o r a t i n g a c t i v i t i e s o f r a t a d r e n a l microsomes and s o l u b l e c e l l f r a c t i o n d u r i n g p r o l o n g e d a d r e n o c o r t i c o t r o p i n a d -m i n i s t r a t i o n . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . £1, 515 (1964) F u r t h e r s t u d i e s on the S t i m u l a t i o n o f a d r e n a l p r o t e i n s y n t h e s i s by ACTH: An e f f e c t on microsomes and r i b o s o m e s . E n d o c r i n o l o g y 74, 579 (1964) Q u a n t i t a t i v e comparison o f the e f f e c t s o f ACTH a d m i n i s t r a t i o n on the a c t i v i t i e s o f s o l u b l e c e l l f r a c t i o n and microsomes f o r i n c o r p o r a t i o n of amino a c i d i n t o p r o t e i n . E n d o c r i n o l o g y J69 795 (1965) A d r e n o c o r t i c o t r o p h i n and a d r e n a l p r o t e i n s y n t h e s i s . E n d o c r i n o l o g y 2£, 745 (1965) Changes i n a d r e n a l polysomes f o l l o w i n g ACTH a d m i n i s t r a t i o n . E n d o c r i n o l o g y 21» 128 (1965) E a r l y e f f e c t s o f ACTH on a d r e n a l p r o t e i n s y n t h e s i s . E n d o c r i n o l o g y J 8 , 125 (1966) Dynamic changes i n a s c o r b i o a c i d and c o r t i c o s t e r o i d s i n a d r e n a l v e i n b l o o d a f t e r ACTH. E n d o c r i n o l o g y 6j5, 144 ( i 9 6 0 ) Zum Wirkungsmechanismus von V i t a m i n 0. K l i n . W s c h r . 42, 879 (1964) C o r t i c o s t e r o i d s and a s c o r b i o a c i d t r a n s p o r t i n a d r e n a l c o f t e x i n v i t r o . Biochem. J . £2, 564 (1964)

- X X I I I -

290. SWBAT, M.L. and M.J. BRYSON:

291. FERGUSON, J . J . j r . :

292. FERGUSON, J . J . j r . J

293. FERGUSON, J . J . j r .

FERGUSON, J . J . j r . and Y.MORITA:

294.

295. FARESE, R.V.;

2 9 6 . KITTINGER, G.W.

2 9 7 . BRANSOME, E.D. W.J.REDDY:

and

DAVISON, 0. and F.G. HOFMANN:

S t e r o i d 11-ß o x y g e n a t i o n , a s c o r b i c a c i d , e p i n e p h r i n e and adrenochrome i n t e r r e l a t i o n s i n the a d r e n a l g l a n d . E n d o c r i n o l o g y 26, 773 (1965) ACTH-responsivenees , p r o t e i n s y n t h e s i s and puromycin. Fed e r . Proced . 22. No. 2211 (1963) Puromycin and a d r e n a l r e s p o n s i v e n e s s t o ACTH. B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 51,616(1962 P r o t e i n s y n t h e s i s and a d r e n o c o r t i c o t r o p i n r e s p o n s i v e n e s s . J.biol.Chem. 238. 2754 (1963) RNA-synthesis and a d r e n o c o r t i c o t r o p i n r e s p o n s i v e n e s s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8J_, 348 (1964) I n h i b i t i o n of s t e r o i d o g e n i c e f f e c t of ACTH and i n c o r p o r a t i o n o f amino a c i d i n r a t a d r e n a l p r o t e i n i n v i t r o by chloramphenico 1 . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 82, 699 (1964) Pyromycin i n h i b i t i o n of i n v i t r o c o r t i c a l hormone p r o d u c t i o n by r a t a d r e n a l g l a n d . S t e r o i d s 4, 539 (1964) Hormonal e f f e o t s i n v i t r o on amino a c i d i n c o r p o r a t i o n i n t o r a t a d r e n a l p r o t e i n : ACTH and growth hormone. A r c h . B i o c h i m . B i o p h y s . 10JL, 21 (1963) E f f e c t o f ACTH on uptake of S 5 5 - l a b e l e d «Systeine by r a t a d r e n a l g l a n d s . Proc.Soc.Exp.Biol.Med. ^2, 151 (1956)

298.

299. HALKERSTONE, I . D . K . , I n h i b i t i o n o f p r o t e i n s y n t h e s i s i n r a t M. FEINSTEIN and 0.HECHTER:

300. HALKERSTONE,I.D.K M. FEINSTEIN and 0. HECHTER:

301. HAYNES, R . C . j r . L. BERTHET*:

302. PJ&RON, F.G. and S.B. KORITZ:

303. KORITZ, S.B., F.G.PERON and R•I»DORFMANN:

a d r e n a l glands by a d r e n o c o r t i c o t r o p h i n and c y c l i o 3 j 5 - a d e n o s i n monophosphate. E n d o c r i n o l o g y ]±f 649 (1-964) F u r t h e r o b s e r v a t i o n s on the i n h i b i t i o n o f a d r e n a l p r o t e i n s y n t h e s i s by ACTH i n v i t r o . E n d o c r i n o l o g y 26> 801 (1965)

and S t u d i e s on the mechanism of a c t i o n o f ACTH. J.biol.Chem. 22£, 115 (1957) On the exogenous r e q u i r e m e n t s f o r the a c t i o n of ACTH i n v i t r o on r a t a d r e n a l g l a n d s . J.biol.Chem. 233. 256 (1958) I n f l u e n c e of ACTH on o o r t i c o i d p r o d u c t i o n a n d g l y o i n e - 1 - c H i n c o r p o r a t i o n i n t o p r o t e i n by r a t a d r e n a l s . J^biol.Chem. 226. 643 (1957)

- XXIV -

304. PfiRON, F.G. and S.B. KORITZt

305. SAFFRAN, M. and A.V. SOHALLY:

306. PäRON, F.G.*

307. HAYNES, R.C.J

308. GRANT, J.K. and A.C. BROWNIE:

309. HILP, Ro, C. BREUER, and A.B0RMAN2

309a.HILTON, J.G., O.R. KRUESI, R.I. NEBELJKOVIö and L.P. SOIAN.

310. GREENBERG, L.J. and D.GLIOKl

311. WILLIAMS, H.E., P.L.JOHNSON and J.B. FIELDt

312. PALCOVIO, M., L. MAOHO and J . POORi

313. ROBERTS, S., J.E. OREANOE and D.D.FOWLER:

314.SUTHERLAND, E.W. and T.W.RALL :

315. MoKERNS, K.W.:

On the l o o a l i z a t i o n o f S t i m u l a t i o n i n v i t r o by oaloium i o n and f r e e z i n g o f o o r t i o o i d p r o d u o t i o n by r a t a d r e n a l homogenates. J.biol . C h e m . 255, 1625 ( i 9 6 0 ) I n v i t r o b i o a s s a y of c o r t i o o t r o p i n : M o d i f i o a t i o n and S t a t i s t i c a l t r e a t m e n t . E n d o c r i n o l o g y £6, 523 (1955) E f f e o t of oaloium i o n s on c o r t i c o s t e r o i d o -g e n e s i s . BJD3him.Biophys.Acta. ^ 0 , 62 (1964) The a c t i v a t i o n of a d r e n a l Phosphorylase by ACTH. J.biol.Chem. 233. 1220 (1958) R o l e o f fumarate and TPN i n S t e r o i d 11-ß-hydroxylation. B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 18, 433 (1955) Adrenals adenine n u c l e o t i d e m e t a b o l i z i n g enzymes : a l t e r a t i o n s i n d u c e d by ACTH t r e a t m e n t . Aren.Biochem.Biophys. 319 (1961) A d r e n o c o r t i c a l and m e d u l l a r y responses t o adenosin-3'5-monophosphate. E n d o c r i n o l o g y 68, 908 (1961)

S t u d i e s i n h i s t o o h e m i s t r y . 68.Determi­n a t i o n o f g l y c o g e n i n miProgramm samples o f t i s s u e s . Q u a n t i t a t i v e h i s t o l o g i c d i s t r i b u t i o n i n the r a t a d r e n a l and i n f l u e n c e o f ACTH . B i o o h e m i s t r y 1, 452 (1962) I n v i t r o s t u d i e s on the e f f e c t o f ACTH i n r a t and bovine a d r e n a l g l a n d s • E n d o c r i n o l o g y J±, 293 (1962) E f f e c t o f ACTH on the a c t i v i t y of a d r e n a l glucose-6-phosphate m e t a b o l i z i n g enzymes i n the r a t . P h y s i o l o g i a Bohemoslovenioa 1J5, 358 (1964) S t i m u l a t i o n o f S t e r o i d 0-11 ß-hydroxylase a o t i v i t y i n a d r e n a l homogenates by o y o l i o 3?5-adenosin monophosphate. Nature 203. 759 (1964) The p r o p e r t i e s o f an adenine r i b o n u c l e o t i d e produced w i t h o e l l u l a r p a r t i o l e s , ATP, M g + + and e p i n e p h r i n e or g l u c a g o n . J.Amer.Chem.Soo. 22> 3608 (1957) A d d i t i o n a l s t u d i e s on the mechanism o f a o t i o n o f ACTH. Canad.J.Biochem. 4J5, 923 (1965)

- XXV -

316. KORITZ. S.B. and P . a . PERÖN:

317» PIELD, J.B., I . PASTAN, B. HERRING and P. JOHNSON:

318. VANOE, V.K., P. GIRARD and G.P. CAHILL:

319. CHANCE, B., B. SCHOENER and J . J . PERGUSON,jr.i

320. KORITZ, S.B.:

321. HILP, R. and P.P. BURNETT:

522. KUHN, 0. and J.M.KISSANE:

323. HARDING, W.B. and D.H. NELSON:

324. HARDING, Jf.B. and D.H. NELSON:

325. LANDAU, B.R.t

326. COHEN, R.B. and L.A. PAGUNDES:

327. IMUBA, H., S. MATSUKURA, H. MATSUYAMA, T. SETSUDA and T. MIYAKE:

S t u d i e s on the mode of a o t i o n of a d r e n o o o r t i c o t r o p h i c hormone. J.biol.Chem. 230. 343 (1958) S t u d i e s of pathways o f glu o o s e m e t a b o l i s m of e n d o c r i n e t i s s u e s . E n d o c r i n o l o g y 62, 801 (1960)

E f f e c t o f ACTH on g l u c o s e m e t a b o l i s m i n r a t a d r e n a l i n v i t r o . E n d o c r i n o l o g y 71, 113 (1962) I n v i v o induced Oxydation by ACTH of reduoed p y r i d i n e n u c l e o t i d e . Nature ijjjg., 776 (1962) Some o b s e r v a t i o n s on Stimulation i n v i t r o o f c o r t i c o i d p r o d u c t i o n by adenosine 3j5-monophosphate i n r a t adr e n a l s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 60, 179 (1962) T r i p h o s p h o p y r i d i n e n u c l e o t i d e - l i n k e d enzymes i n the regenerating r a t adrenal g l a n d : E f f e c t of a d r e n o c o r t i c o -t r o p h i n . Aren.Biochem.Biophys. 104, 106 (1964) Q u a n t i t a t i v e h i s t o c h e m i s t r y o f Älucose-6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluoonate dehydrogenase i n r a t a d r e n a l c o r t e x : E f f e c t o f ACTH, Cortisone and sodium d e p r i v a t i o n . E n d o c r i n o l o g y 25.» 741 (1964) E f f e c t of hypophysectomy on NADP and NADPH c o n c e n t r a t i o n and o o r t i o o s t e r o i d s e c r e t i o n i n r a t a d r e n a l . E n d o c r i n o l o g y 21» 501 (1964) E f f e c t o f E f f o o t hypophysectomy on s e v e r a l r a t a d r e n a l NADPH-generating and ©xidizing Systems. E n d o c r i n o l o g y 25.» 506 (1964) Mechanism of a c t i o n of ACTH New Engl.J.Med. 271, 1 2 8 6 (1965) O b s e r v a t i o n s on P h o s p h o r y l a s e a o t i v i t y d i s t r i b u t i o n i n the a d r e n a l o o r t e x : E f f e c t of ACTH. E n d o c r i n o l o g y 28, 220 (1966) A d r e n a l s t e r o i d o g e n i c e f f e c t o f adenosine 3j5-monophosphate and i t s d e r i v a t i v e s i n v i v o . E n d o o r i n o l o g y 76, 933 (1965)

- XXVI -

328. GRANT, J.K. and T. SYMINGTON:

329 . SWEAT, M.L. and M.D. LIBSCOMB:

330. DORFMANN, R . I . :

3 3 1 . KARL, H.J. und L.RAITH:

332. KRUM, A.A. and R.E. GLENN:

E f f e c t o f ACTH t h e r a p y on the i n v i t r o 11-ß h y d r o x y l a t i o n of the d e s o x y c o r t i ­c o s t e r o n e by human a d r e n a l homogenates. J . o l i n . E n d o c r i n . H , 933 (1957) A transhydrogenase and reduced t r i p h o s p h o p y r i d i n e n u c l e o t i d e i n v o l v e d i n o x i d a t i o n o f d e s o x y c o r t i c o s t e r o n e t o c o r t i c o s t e r o n e by a d r e n a l t i s s u e . J.Amer.Chem.Soc. 7 1 , 5185 (1955) M e t a b o l i s m of a d r e n a l c o r t i o a l hormones. i n "The a d r e n a l c o r t e x " H r s g . H.D.MOON, P.Hoeber I n c . , New Y o r k 1961 D i e C o r t i c o s t e r o n s e k r e t i o n beim Menschen. I I I . D i e S e k r e t i o n s r a t e n v o n C o r t i c o s t e r o n und C o r t i s o l b e i S t i m u l i e r u n g der N e b e n n i e r e n r i n d e m i t ACTH. K l i n . W s c h r . 4 4 , 303 (1966) A d r e n a l Steroid s e c r e t i o n i n r a b b i t s f o l l o w i n g p r o l o n g e d ACTH a d m i n i s t r a t i o n . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 118. 225 (1965)

L e b e n s 1 a u f

A l s e r s t e s K i n d des Prof.Dr.med.Karl S o r i b a ( D i r e k t o r des P a t h o l o g i s c h e n I n s t i t u t e s der Städtischen K r a n k e n a n s t a l t e n Bremen) und s e i n e r E h e f r a u E d i t h a , geb.Lueg wurde i c h am 1 9 . 8 . 1 9 3 5 i n Hamburg geboren. Das A b i t u r bestand i c h Ostern 1954 nach Besuch des Johanneums i n Hamburg,

Das Physikaum bestand i c h im August 1956 i n Hamburg mit der Note g u t , das m e d i z i n i s c h e Staatsexamen im Sommer 1959 i n P r e i b u r g mit der Note sehr g u t . Meine Promotion e r f o l g t e im November 1959 mit der Note summa cum l a u d e . Der T i t e l der D i s s e r t a t i o n l a u t e t e : " V e r s u c h e zum biochemischen Wirkungsme­chanismus von c a r z i n o s t a t i s c h wirksamen Äthyleniminverbindun-gen ".

Vom Sommer 1957 b i s Anfang 1961 war i o h zunäohst a l s Doktorand, später a l s A s s i s t e n t im Biochemischen I n s t i t u t d e r Universität P r e i b u r g M i t a r b e i t e r von Herrn P r o f . D r . H . H o l z e r . S e i t Dezember 1961 b i n i c h w i s s e n s c h a f t l i c h e r A s s i s t e n t an der I I . M e d i z i n i ­schen K l i n i k der Universität München.

Von J u n i 1962 b i s J u l i 1963 war i c h a l s post d o c t o r a l r e s e a r c h f e l l o w des U . S . P u b l i c H e a l t h S e r v i c e e i n J a h r i n Boston,Mass. I c h habe d o r t a l s r e s e a r c h a s s i s t a n t an der Harvard M e d i c a l Sohool im L a b o r a t o r i u m von Dr.George W.Thorn im P e t e r Bent Brigham H o s p i t a l a l s M i t a r b e i t e r von D r . W i l l i a m J.Reddy gear­b e i t e t . Im Oktober 1962 habe i c h das Examen des E d u c a t i o n a l C o u n c i l f o r F o r e i g n M e d i c a l Graduates bestanden.

S e i t August 1963 b i n i c h wieder w i s s e n s c h a f t l i c h e r A s d s t e n t und S t a t i o n s a r z t an der I I . M e d i z i n i s c h e n K l i n i k d e r Universität Münohen. S e i t Ende 1963 habe i c h ausserdem e i n L a b o r a t o r i u m , i n dem k l i n i s c h e und e x p e r i m e n t e l l e e n d o k r i n o l o g i s c h e Fragen b e a r b e i t e t werden. S e i t Mai 1966 b i n i c h zusätzlich mit der L e i t u n g des k l i n i s c h - c h e m i s c h e n L a b o r a t o r i u m s der K l i n i k be­t r a u t .

Ic h b i n s e i t 1961 v e r h e i r a t e t , meine Frau Marisa,geb.Mikorey, und i o h haben d r e i K i n d e r .