Klonierung und Charakterisierung Apoptose-assoziierter ... · Kolon-, Pankreas-, Prostata- und...

Aus der Klinik für Kleine Haustiere

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und

dem Zentrum für Humangenetik

der Universität Bremen

Klonierung und Charakterisierung

Apoptose-assoziierter Gene des Hundes

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Janina Carola Meyer

aus Bremen

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. I. Nolte

Prof. Dr. J. Bullerdiek

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. I. Nolte

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. O. Distl

Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2005

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

2. Literaturübersicht 4

2.1. Apoptose 4

2.2. Maligne Zelltransformation und Tumorwachstum 6

2.3. Der Hund als Modell in der Tumorforschung 8

2.4. Der Karyotyp des Hundes und die Kartierung des Hundegenoms 10

2.5. Protein Kinase B gamma 14

2.6. FAS-activated Serin/Threonin-Kinase 16

2.7. Survivin 18

3. Veröffentlichungen, Ergebnisse 20

3.1. The protein kinase B, gamma (AKT3) gene maps to canine chromosome 7 20

3.2. The FAS-activated serine/threonine kinase gene (FASTK) maps to canine

chromosome 16 23

3.3. The canine protein kinase B, gamma (AKT3) and the canine FAS-activated

serine/threonine kinase (FASTK) 26

3.4. Reevaluation of canine Survivin mRNA-sequence data 33

4. Diskussion 36

5. Zusammenfassung 47

6. Summary 49

7. Literaturverzeichnis 51

7.1. Literaturverzeichnis 51

7.2. Im Rahmen dieser Arbeit entstandene Veröffentlichungen 62

8. Anhang 63

9.1 Klone aus der caninen cDNA-Bank des Zentrums für Humangenetik 63

9.2 Teile caniner mRNAs hergestellt durch PCR an cDNA aus ZMTH3 65

9.3 Canine mRNAs abgeleitet aus den genomischen Contigs der NCBI Datenbank 67

9.4 Humane FASTK Sequenz 73

Abkürzungsverzeichnis

A Adenin

aa Aminosäure

Abb. Abbildung

AKT3 Protein Kinase B gamma

APAF1 Apoptosis Activating Factor 1

BAC Bacterial Artificial Chromosome

Bidest. Bidestilliert

BIR Baculovirus IAP Repeat Domain

bp Basenpaare

C Cytosin

Caspase Cystein Aspartyl-Specific Proteases

CDE Cell Cycle-Dependent Element

cDNA komplementäre DNA

CDS Coding Sequence

CFA Canis familiaris autosome

CHR Cell Cycle Gene Homology Region

c-myc zelluläres myc

Da Dalton

dATP Desoxyadenosin-5´-Triphosphat

dCTP Desoxycytidin-5´-Triphosphat

dGTP Desoxyguanosin-5´-Triphosphat

dH2O Aqua dest.

DIABLO Direct IAP Binding Protein with Low pI

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxy-Nukleosid-5´-Triphosphat

dTTP Desoxythymidin-5´-Triphosphat

E. coli Escherichia coli

EGF Epidermal Growth Factor

FADD Fas-associated Death Domain Protein

FASTK FAS-activated Serin/Threonin-Kinase

FCA Felis catus Chromosom

FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

Fos FBJ murine Osteosarkoma

GTG G-Banden nach Verwendung von Trypsin und Giemsafärbung

HSA Homo Sapiens Chromosom

Hsp70 Heat-Shock Protein 70

IAP Inhibitor of Apoptosis

kb Kilobase

M Molar

MgCl2 Magnesiumchlorid

mM Millimolar

mmol Millimol

mRNA messenger RNA

myc Myelocytomatosis

µ mikro

n nano

NCBI National Center for Biotechnology Information

ORF Open Reading Frame

PCR Polymerase Kettenreaktion

PH Pleckstrin Homology

RH Radiation Hybrid

RING Really Interesting New Gene

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

rpm Umdrehungen pro Minute

RRM RNA Recognition Motif

Sp1 Specific protein 1

Taq DNA Polymerase isoliert aus Thermus aquaticus

TGFβ Transforming Growth Factor beta

TNF Tumor Nekrose Faktor

U Unit

UTR Untranslated Region

UV Ultraviolett

V Volt

ZMTH3 Zelllinie Mammatumor Hund 3

Einleitung

1

1. Einleitung

Bereits seit langem werden Tiermodelle zur Erforschung der Grundlagen menschlicher

Krankheiten eingesetzt. Seit einigen Jahren steigt der Widerstand der Bevölkerung gegen

Tierversuche im Allgemeinen. Gesucht werden Alternativen zum Tierversuch sowie

Methoden zur Eingrenzung des benötigten Tieraufkommens. Dies gilt auch und im

Besonderen für die Tumorforschung. Die Auswahl von Haustieren, wie dem Hund, als

Modellorganismus kann dabei die Nachteile von Nagetiermodellen reduzieren. Einerseits ist

der Grad der medizinischen Versorgung des Hundes und damit auch das Datenmaterial,

einzigartig neben der des Menschen (OSTRANDER et al. 2000), zusätzlich sind Hunde

ähnlichen Umweltbedingungen ausgesetzt wie der Mensch (VAIL u. MACEWEN 2000).

Auch in Bezug auf Körpergröße und Stoffwechsel stehen Hunde dem Menschen näher als

Nager und erlauben somit eine bessere Übertragbarkeit der Forschungsergebnisse.

Andererseits bietet der Hund eine nahezu einmalige Populationsstruktur. Durch die

Abgrenzung der Rassen voneinander kommt es zum gehäuften Auftreten genetisch bedingter

Erkrankungen in einzelnen Rassen, die in vielen Fällen autosomal-rezessiv auftreten und

innerhalb der Rasse weitervererbt werden (OSTRANDER et al. 2000).

In der Tumorforschung können spontan auftretende Tumore des Hundes als Modell für die

Tumorentstehung beim Menschen dienen (HAHN et al. 1994), da es phänotypisch

Ähnlichkeiten bei den Erkrankungen gibt und auch Histologie und Biologie verschiedener

caniner Tumore annähernd identisch zu humanen Tumoren sind (MACEWEN 1990). Die

Häufigkeit von Tumoren beim Hund ist ca. doppelt so groß wie beim Menschen und es

kommt zu einer schnelleren Entwicklung der Tumore bedingt durch den höheren

Stoffwechsel (HAHN et al. 1994). Durch das spontane Auftreten von Tumoren beim Hund

mit vergleichsweise hoher Inzidenz, kann auf im Labor induzierte Tumore weitestgehend

verzichtet werden, da z.B. durch das Anlegen einer Gewebebank ausreichend Material für die

Forschung zur Verfügung stehen würde. Auch die Entnahme von nicht betroffenem

Normalgewebe als Referenz ist weniger problematisch als beim Menschen. Die schnellere

Generationsfolge, die bei reinrassigen Hunden in der Regel gut dokumentierte Ahnenfolge

und das gehäufte Auftreten bestimmter Tumore in einzelnen Rassen bieten weitere Vorteile.

Doch nicht nur der Mensch profitiert von der Erforschung genetischer Parallelen in der

Tumorgenese des Hundes. Tumorerkrankungen sind heute die häufigste Todesursache bei

Hund und Katze und die chemotherapeutische Behandlung erkrankter Tiere gewinnt

zunehmend an Bedeutung (NOLTE u. NOLTE 2002). Durch den Nachweis desselben

Einleitung

2

Genproduktes als Krankheitsursache können möglicherweise beim Menschen bereits

etablierte Behandlungsmethoden auf den Hund übertragen werden. Ein Ansatz der

vergleichenden Tumorforschung zwischen Mensch und Hund geht deshalb von bekannten,

beim Menschen häufig betroffenen Genen aus. Grundvoraussetzung für die detaillierte

genetische Analyse einer Spezies ist die Kenntnis der Genomorganisation (SWITONSKI et al.

2004). Seit mehreren Jahren gibt es Bemühungen das canine Genom näher zu

charakterisieren. Im Jahr 2003 und 2004 wurde die Sequenzierung des vollständigen caninen

Genoms zweier unterschiedlicher Hunde veröffentlicht (Datenbank: NCBI, GenBank Acc.

Nos. AAEX01000000, AACN000000000). SWITONSKI et al. (2004) geben einen Überblick

über den aktuellen Stand der Forschung.

Im Rahmen dieser Arbeit sollen ausgewählte Gene, die beim Menschen bekanntermaßen im

Zusammenhang mit Apoptoseinduktion oder –inhibition stehen, für den Hund charakterisiert

werden, um anschließend ihre Qualifikation als Targetgene für die Tumorbehandlung besser

beurteilen zu können. Ausgewählt wurden drei Gene, zwei Proteinkinasen und das IAP

Mitglied Survivin.

Die Protein Kinase B gamma (AKT3) als Mitglied der AKT Serin/Threonin-Proteinkinase

Familie ist beteiligt an einer Reihe biologischer Prozesse inklusive Zellwachstum und

Differenzierung, Stoffwechsel, Apoptose und Proliferationsprozessen. AKT3 wird sowohl in

Tumor- als auch in Normalgewebe exprimiert (GENECARD AKT3). Durch die Regulation

Apoptose-relevanter Proteine kann AKT3 zu einem wichtigen Gen bei der Tumorbekämpfung

avancieren (MASURE et al. 1999, ZINDA et al. 2001, NICHOLSON u. ANDERSON 2002).

Die FAS-activated Serin/Threonin-Kinase (FASTK) ist ein Mitglied der Serin/Threonin-

Proteinkinase Familie und arbeitet über einen ähnlichen Signalweg wie AKT3. FASTK ist am

Apoptosesignalweg durch die Phosphorylierung von TIA-1 beteiligt und reguliert so die

Translation von mRNAs, deren Proteine für Proliferation und/oder Überleben von Zellen

bedeutsam sind (TIAN et al. 1995, ANDERSON 1997).

Survivin hingegen ist ein Mitglied der IAP Familie und ein Apoptoseinhibitor. Aus diesem

Grund könnte seine Expression einen wichtigen Wachstumsvorteil in Tumorzellen zur Folge

haben. Survivin wird in Fetalgewebe und in vielen menschlichen Tumoren, wie z.B. Lungen-,

Kolon-, Pankreas-, Prostata- und Mammatumoren sowie High-Grade Non-Hodgkin

Lymphomen exprimiert, jedoch nicht in adultem Normalgewebe (AMBROSINI et al. 1997).

Es wird vermutet, dass Survivin auch zur Chemoresistenz von Tumoren beiträgt.

Einleitung

3

Die Charakterisierung der genannten drei Gene beim Hund beinhaltet die Identifizierung von

BAC-Klonen, eine Untersuchung der chromosomalen Lokalisation mittels Fluoreszenz-in-

situ-Hybridisierung, die Analyse der mRNA und Proteinsequenz über PCR und Datenbanken

sowie den Vergleich der caninen Daten mit denen des Menschen.

Literaturübersicht

4

2. Literaturübersicht

2.1. Apoptose

Apoptose ist eine besondere Form des Zelltodes. Sie ist vor allem dadurch charakterisiert,

dass es sich um ein aktives zelluläres Geschehen handelt. Apoptotischer Zelltod bedarf

zumindest in den ersten Phasen energieliefernder Prozesse und der Synthese von Proteinen

(BIELKA u. BÖRNER 1995).

In der Aktivierungsphase (D1-Phase) kommt es zu einer noch reversiblen genetischen

‚Umprogrammierung’ mit der Aktivierung der Expression verschiedener Gene, z.B. c-myc, c-

fos, von TGFβ, hsp70 und Calmodulin. Dies hat eine Erhöhung der intrazellulären

Konzentration an Ca++ und die Aggregation des Chromatins zur Folge. Es kommt zur

Schrumpfung des Zytoplasmas. In der Fragmentationsphase (F-Phase) kommt es zur

Aktivierung einer Ca++-abhängigen Endonuklease und zur Spaltung der DNA zwischen den

Nukleosomen. Die Damagephase (D2-Phase) führt zu einer Vernetzung von

Membranproteinen durch Transglutaminase; zur Auflösung der Kernstruktur und zur

Fragmentierung der Zellen unter Ausbildung membranumgrenzter, so genannter apoptotischer

Körperchen (apoptotic bodies) (IGNEY u. KRAMMER 2002). Es folgt die Phagozytose der

‚apoptotic bodies’ durch benachbarte Epithelzellen und Makrophagen sowie der Abbau durch

Ubiquitin und lysosomale Enzyme. Die letzten Phasen gehen mit einer Aussonderung

apoptotischer Zellen aus ihren Zellverbänden einher. Im Gegensatz zu passiv erfolgenden

Zellnekrosen verläuft die Apoptose ohne entzündliche Prozesse im umgebenden Gewebe

(BIELKA u. BÖRNER 1995).

Apoptose wird als ein Prozess angesehen, der vielfältig im Organismus auftritt und

beispielsweise der Aussonderung ‚kranker’ Zellen dienen soll, wie z.B. präneoplastischer

Zellen oder Tumorzellen. Jede Zelle in einem multizellulären Organismus hat das Potential

durch Apoptose zugrunde zu gehen. Tumorzellen haben oft einen fehlerhaften

Apoptosesignalweg (IGNEY u. KRAMMER 2002).

Grundsätzlich gibt es zwei Signalwege für Apoptose. Den ‚extrinsic pathway’ von außerhalb

der Zelle über ‚death’ Rezeptoren an der Zelloberfläche und den ‚intrinsic pathway’ auch

mitochondrialer Signalweg genannt. ‚Death receptors’ gehören zur Tumor Nekrose Faktor

Rezeptor Superfamilie und sind charakterisiert durch eine intrazelluläre ‚death domain’. Über

FADD (Fas-associated death domain protein) kommt es zur Aktivierung verschiedener

Literaturübersicht

5

Cystein Aspartyl- spezifischer Proteasen (Caspase-8, -10, -3, -6, -7) (IGNEY u. KRAMMER

2002, RIEDL u. SHI 2004).

Bei der Apoptose führt der mitochondriale Signalweg über die Stimulation der äußeren

Mitochondrienmembran zur Freisetzung von Cytochrom c, z.B. über den p53 Signalweg.

Darauf folgt die Bindung an APAF1 (apoptosis activating factor 1) und die Bildung eines

‚Apoptosoms’, welches den Apoptose Signalweg mit verschiedenen Cystein-Aspartyl-

spezifischen Proteasen (Caspase-9, -3, -6, -7) induziert. Die Aktivierung der Caspasen führt

zu den oben beschriebenen Veränderungen in der Zelle (IGNEY u. KRAMMER 2002).

Caspasen stehen im Zentrum der Apoptose. Es gibt Initiator-Caspasen und Effektor-Caspasen.

Die verschiedenen Caspasen sind strukturell homolog und haben ähnliche Substratspezifität.

Sie zerstören eine unter der Kernmembran liegende Proteinstruktur, die an der Organisation

des Chromatingerüstes beteiligt ist. Kontaktstellen der extrazellulären Matrix werden durch

Abbau von Proteinen unterbrochen. Sie nehmen kritische Funktionen in den Adhäsionsstellen

wahr und durch den Abbau kommt es zum Herauslösen aus dem Zellverband. Proteine, die an

der Replikation und Reparatur der DNA sowie am Spleißen der mRNA beteiligt sind, werden

durch Caspasen inaktiviert (WAGENER 1999).

Literaturübersicht

6

2.2. Maligne Zelltransformation und Tumorwachstum

Die Entwicklung von Zellen zu Tumorzellen wird als Transformation, die Entstehung

bösartiger Tumore als maligne Transformation bezeichnet (BIELKA u. BÖRNER 1995).

Tumore können sowohl durch Aktivierung als auch durch Inaktivierung kritischer Gene

verursacht werden. Die Hemmung wichtiger Pro-Apoptose Proteine sowie die Expression von

Anti-Apoptose Proteinen führt zu einer irreversiblen Veränderung der normalen

Zellteilungsprozesse. Dies erfolgt, z.B. durch die Mutation von Genen, die für die Regulation

der Zellteilung verantwortlich sind und führt in der Regel zu unkoordiniertem, räumlich und

zeitlich unbegrenztem Wachstum. Im Tumor ist der Anteil sich teilender Zellen, die so

genannte Wachstumsfraktion, größer als im Normalgewebe. Das maligne Wachstum von

Zellen führt, klinisch unbehandelt, in der Regel zum Tod des Individuums (BIELKA u.

BÖRNER 1995). Tumore sind in der Regel monoklonalen Ursprungs, d.h. sie entstehen aus

einer einzelnen ‚Normalzelle’ und ihren Tochterzellen. Klonales Wachstum bedeutet, dass die

Eigenschaften der Malignität vererbt werden und somit genetisch fixiert sein müssen. Die

transformierte Zelle unterscheidet sich von ihren normalen Gegenstücken dadurch, dass sie

nicht mehr in der Lage ist, auf die Vielzahl der Stimuli, mit denen die Zelle ständig

konfrontiert ist, in adäquater Weise zu reagieren. Dies führt zu einem autonomen Verhalten

der Zellen, welches unabhängiges zeitliches und räumliches Wachstum einschließt. Bevor

eine Tumorerkrankung manifest wird, müssen in der Regel mehrere mutagene Ereignisse

eintreten, die jeweils einen Selektionsvorteil für die mutierte Zelle ergeben (WAGENER

1999). Die Charakterisierung der kritischen Gene für die Tumorentstehung trägt zum

Verständnis der Ursachen und Auswirkungen von Veränderungen wie Punktmutation oder

Deletion bei. Auch Umwelteinflüsse können DNA-Veränderungen auslösen. Die genannten

Veränderungen können z.B. durch chemische Karzinogene oder Strahlung entstehen. Ebenso

können Viren oder familiäre genetische Disposition eine Rolle spielen. Auch Alter,

Geschlecht und individuelle genetische Veranlagung können für die Ausbildung bestimmter

Tumore relevant sein. Mutationen führen nicht nur zu erhöhter Proliferation, sondern tragen

auch zur Chemoresistenz der Tumorzellen bei, was gravierende klinische und therapeutische

Probleme verursacht (WAGENER 1999, NOLTE u. NOLTE 2002).

Solange ein Tumor auf seinen Ausgangspunkt beschränkt ist (Primärtumor), kann die

Erkrankung in vielen Fällen durch einen operativen Eingriff geheilt werden. Viele Tumore

weisen jedoch die Tendenz auf, lokal invasiv zu wachsen und nach Einbruch in die

Gefäßbahnen sekundäre Tumore (Metastasen) zu bilden (LÖFFLER u. PETRIDES 1998). Die

Literaturübersicht

7

Eigenschaft von Tumoren Metastasen zu bilden ist ein Kriterium für die Bewertung des

Malignitätsgrades eines Tumors. Am Vorgang der Metastasierung sind wahrscheinlich

bestimmte Gene bzw. ihre Produkte beteiligt. Invasion und Metastasierung kommen durch

Proteine zustande, die die Anhaftung von Tumorzellen an zelluläre oder extrazelluläre

Matrixbestandteile des Wirtes fördern, die die Proteolyse von Wirtsbarrieren wie z.B.

Basalmembranen durch Tumorzellen stimulieren, die die Tumorzellfortbewegung

unterstützen und die die Proliferation im Zielorgan der Metastasierung ermöglichen (KELEG

et al. 2003). Diese Proteine werden auch von nicht transformierten Zellen gebildet, werden

hier aber durch Proteine antagonisiert, die ihre Produktion, Regulation oder Wirkung

blockieren können. Verlust oder Veränderung von Proteinen, die für Zelladhäsionsprozesse

essentiell sind, begünstigen die Absiedlung von Tumorzellen aus Primärgeschwülsten, die

dann über Blut- oder Lymphbahnen verbreitet in anderen Organen und Geweben Metastasen

bilden.

Für die erfolgreiche Metastasierung muss eine Zelle oder eine Gruppe von Zellen imstande

sein, den Primärtumor zu verlassen, Anschluss an die Zirkulation zu gewinnen, in das

Zielorgan zu extravadieren und als sekundäre Kolonie dort zu proliferieren (HERRLICH et al.

1993). Hierbei spielt die Neubildung von Gefäßen im Primärtumor eine entscheidende Rolle,

denn so gelangen die zur Metastasierung fähigen Tumorzellen in die Nähe des Blut- und

Lymphkreislaufs. Metastasierung ist auch ein selektiver Prozess, denn weniger als 0,01 % der

zirkulierenden Tumorzellen sind in der Lage metastatische Kolonien zu bilden (LÖFFLER u.

PETRIDES 1998).

Die Aufklärung der für die Entstehung von Tumorzellen verantwortlichen Vorgänge und der

besonderen biologischen Aktivitäten von Tumorzellen wird wichtige Erkenntnisse für die

Prävention und Behandlung von Krebserkrankungen liefern (LÖFFLER u. PETRIDES 1998).

Literaturübersicht

8

2.3. Der Hund als Modell in der Tumorforschung

Der Hund bietet einmalige Einblicke in genetisch bedingte Erkrankungen des Menschen.

Obwohl es heute über 300 verschiedene Hunderassen auf der Welt gibt, unterscheiden sie sich

in ihrer genetischen Ausstattung kaum (OSTRANDER et al. 2000). Auf Grund von

Mitochondrien-DNA-Analysen wird angenommen, dass eine relativ geringe Anzahl von

Mutationen für die Ausbildung der verschiedenen Hunderassen verantwortlich ist, denn die

Untersuchungen zeigten, dass der Haushund und der graue Wolf sich in ihrer Mitochondrien-

DNA nur in 0,2 % unterscheiden und man geht davon aus, dass die DNA aller Hunderassen

nahezu 99,9 % übereinstimmt (WAYNE 1993, KUSKA 1999).

Der kleine genetische Pool vieler Rassen und die Paarung verwandter Individuen führen zum

erhöhten phänotypischen Auftreten rezessiver Erbkrankheiten innerhalb einer oder weniger

Rassen. Sie sind damit einer Untersuchung innerhalb dieser Rassen gut zugänglich

(OSTRANDER et al. 2000). Auch die medizinische Versorgung und Überwachung des

Hundes ist in ihrer Intensität einmalig in der Tierwelt. Bis zum Jahr 2000 wurden über 370

verschiedene genetisch bedingte Erkrankungen des Hundes dokumentiert. Davon haben 58 %

phänotypisch homologe Erkrankungen beim Menschen. Für eine Reihe von Erkrankungen (41

im Jahr 2000) wurde bereits dasselbe Genprodukt wie beim Menschen als Krankheitsursache

nachgewiesen (OSTRANDER et al. 2000). Ein weiterer Vorteil gegenüber dem

Nagetiermodell ergibt sich, da ca. 46 % der genetisch bedingten Erkrankungen beim Hund

gehäuft oder sogar ausschließlich innerhalb einer Rasse vorkommen, so dass die

Wahrscheinlichkeit das betroffene Gen (Risikoallel) in eben dieser Rasse zu detektieren

steigt. Hunderassen bieten damit alle Vorteile einer geographisch isolierten humanen

Population, allerdings mit einem höheren Grad der Isolation und weit besserer Dokumentation

der Abstammung (OSTRANDER u. KRUGLYAK 2000).

Für die Tumorforschung ist das spontane Auftreten von Tumoren beim Hund mit doppelter

Häufigkeit im Vergleich zum Menschen, bei ähnlicher phänotypischer Ausbildung eine gute

Möglichkeit, Untersuchungen an nicht induzierten Tumoren durchzuführen (spontanes

Tiermodell) (HAHN et al. 1994). Die histopathologische Erscheinung, Biologie und auch das

Therapieverhalten von Hundetumoren sind den Tumoren des Menschen weit ähnlicher als im

Nagetiermodell. Abgesehen von der spontanen Entstehung haben bestimmte Tumore wie zum

Beispiel Lymphome oder Osteosarkome in der Hundepopulation eine signifikant höhere

Inzidenz, als beim Menschen. Für einen Flatcoated Retriever liegt das Risiko in seinem Leben

an einem Osteosarkom oder einem Histiozytom zu erkranken bei ca. 40 % (KUSKA 1999).

Literaturübersicht

9

Für den Hund steht demnach ein breites Spektrum an Untersuchungsmaterial für die

Tumorforschung zur Verfügung.

Grundsätzlich wird angenommen, dass der Hund von den Fortschritten in der genetischen

Forschung schneller profitieren wird als zum Beispiel der Mensch (KUSKA 1999). Schon

heute werden kommerzielle Gentests für z.B. die von Willebranderkrankung in bestimmten

Rassen angeboten, so dass Züchter gezielt Hunde aus dem Zuchtprogramm ausschließen

können, die diese oder eine andere Erkrankung bekanntermaßen vererben würden. So wird

versucht genetisch bedingte Erkrankungen aus den Rassen ‚herauszuzüchten’. Durch die

kürzere Generationszeit und die erhöhte Anzahl von Nachkommen ist diese Strategie

wesentlich früher erfolgreich als es z.B. beim Menschen der Fall wäre, wo eine solche

Selektion schon aus ethischen Gründen nicht möglich wäre (KUSKA 1999).

Literaturübersicht

10

2.4. Der Karyotyp des Hundes und die Kartierung des Hundegenoms

Der Karyotyp des Hundes gehört zu den kompliziertesten beim Säugetier bekannten

Karyotypen. Er besteht aus 76 akrozentrischen Autosomen, einem bzw. zwei X-

Chromosomen und ggf. dem Y-Chromosom. Die Sexchromosomen sind metazentrisch, wobei

das X-Chromosom das größte und das Y-Chromosom das kleinste Chromosom in einer Reihe

von sich in Größe und Form sehr ähnelnden Chromosomen ist (REIMANN et al. 1996).

Der Karyotyp des Hundes nach Giemsa-Banding wurde erstmals von SELDEN et al. (1975)

(Abb.1) beschrieben. Sie führten aus, dass die 76 Autosomen schwer homologen Paaren

zugeordnet werden können, da sie alle akrozentrisch oder telozentrisch sind und sich nur

wenig in der Größe unterscheiden. Es folgten verschiedene Veröffentlichungen über den

caninen Karyotyp mit unterschiedlicher Bandentechnik und Anordnung der Chromosomen

(MELLINK u. BOSMA 1989, GRAPHODATSKY et al. 1995, REIMANN et al. 1996

(Abb.1), BREEN et al. 1999a, REIMANN et al. 1999, BREEN et al. 1999b), aber keine

konnte sich gegenüber den anderen durchsetzen, was eine konventionelle Karyotypanalyse

schwierig machte. Heutzutage werden hauptsächlich die Nomenklaturen von BREEN et al.

(1999b) und REIMANN et al. (1999) verwendet.

Abb.1: Schematische Darstellung der Nomenklatur von SELDEN et al. (1975) (links),

REIMANN et al. (1996) (Mitte) und ein Karyotyp nach GTG-Banding (rechts)

Literaturübersicht

11

Das Committee for the standardized karyotype of the dog veröffentlichte 1996 für die

Chromosomen CFA 1-21, X und Y einen standardisierten Karyotyp (SWITONSKI et al.

1996). Für die kleineren Chromosomen des Hundes (CFA 22-38) entschied man sich

schließlich für die Nomenklatur von REIMANN et al. (1996) (Abb.1), wodurch zusammen

mit den Zuordnungen von SWITONSKI et al. (1996) ein Karyotyp des Hundes mit insgesamt

460 standardisierten Banden entstand (Abb.2).

Abb.2: Ein Ideogramm des caninen Karyotyps von REIMANN et al. (1996) mit 460

nummerierten Banden

Literaturübersicht

12

Aufgrund des komplexen Karyotyps und der Schwierigkeiten bei der Zuordnung einzelner

Chromosomen, insbesondere von Chromosom 22-38, beschloss das DOGMAP

CONSORTIUM (1999) neben der Standardisierung des caninen Karyotyps die Kartierung des

Hundegenoms über ‚linkage map’ und eine ‚cytogenetic map’ zu forcieren. Das Erstellen

einer zytogenetischen Karte beinhaltet überwiegend die Arbeit mit Fluoreszenz-in-situ-

Hybridisierung und ‚radiation hybrid map’“ (PRIAT et al. 1998, VIGNAUX et al. 1999,

ROBERTS et al. 2003). 2003 veröffentlichten GUYON et al. eine umfassende ‚Radiation

Hybrid Map’ mit 3270 Markern.

Der 1. Versuch einer Kartierung verschiedener DNA Sequenzen des Hundes mittels ‚linkage

map’ geht auf LINGAAS et al. (1997) zurück. Es folgten Veröffentlichungen von

MELLERSH et al. (1997), WERNER et al. (1999) und NEFF et al. (1999).

Ein weiterer Schritt zur näheren Analyse des caninen Genoms ist die Kombination von

‚cytogenetic map’ und ‚linkage map’ beginnend mit MELLERSH et al. (2000). Es folgten

SARGAN et al. (2000) und BREEN et al. (2001). BREEN et al. stellten 2004 ‚An integrated

4249 marker FISH/RH map of the canine genome’ vor.

In diesem Zusammenhang ist auch der Vergleich Hund zu Mensch von Bedeutung. BREEN et

al. (1999a) fanden mittels FISH 68 hochkonservierte Segmente bei Mensch und Hund. YANG

et al. (1999) verglichen den Karyotyp des Hundes sowohl mit dem des Menschen als auch mit

dem der Katze. Daraus ging hervor, dass die meisten caninen Chromosomen Homologien zu

Teilen von einem bzw. mehreren humanen Chromosomen haben (Abb.3).

Literaturübersicht

13

Abb.3: Eine vergleichende Darstellung der Chromosomen des Menschen (HSA), des Hundes

(CFA) und der Katze (FCA) nach YANG et al. (1999).

Ein nächster Punkt in der Analyse des caninen Genoms war die Analyse der vollständigen

genomischen Sequenz des Hundes, wie sie inzwischen in der NCBI Datenbank unter den

GenBank Acc. Nos. AAEX01000000 und AACN000000000 veröffentlicht ist.

SWITONSKI et al. (2004) geben einen Überblick über die Entwicklung der Forschung zum

Hundegenom und Erkrankungen des Hundes mit ihren humanen Gegenstücken.

Ziel dieser Arbeit ist die Charakterisierung caniner Apoptose-assoziierter Gene. In den

folgenden Kapiteln werden die drei im Fokus der Arbeit stehenden Gene auf Grundlage der

beim Menschen zur Verfügung stehenden Daten kurz beschrieben.

Literaturübersicht

14

2.5. Protein Kinase B gamma (AKT3)

Die AKT Serin/Threonin-Proteinkinase Familie vermittelt ‚survival’ Signale und ist

überexprimiert bei verschiedenen Erkrankungen des Menschen wie z.B. AKT2 in

Ovarialkarzinom-Zelllinien und Ovarial-Primärtumoren sowie in Mamma- und Pankreas-

Karzinomen (CHENG et al. 1992, ZINDA et al. 2001, IGNEY u. KRAMMER 2002). Die

Protein Kinase B (AKT) bildet drei sehr homologe Mitglieder aus PKBalpha (AKT1),

PKBbeta (AKT2) und PKBgamma (AKT3) (NICHOLSON u. ANDERSON 2002).

Anders als AKT1 und AKT2 scheint AKT3 keine entscheidende Rolle im Insulinstoffwechsel

zu spielen, was es zu einem besseren Zielgen für die Erforschung neuer Chemotherapeutika

macht als AKT1 und AKT2, da eine Beeinflussung des Insulinstoffwechsels z.B. bei

Diabetikern nicht zu befürchten ist (MASURE et al. 1999).

Die Protein Kinase B gamma beim Menschen reguliert als Serin/Threonin-Kinase die

Funktion einer Reihe zellulärer Proteine. Diese Proteine sind an Stoffwechsel, Apoptose und

Proliferationsprozessen beteiligt. Die Expression wird aktiviert durch Hormone, extrazelluläre

Matrixkomponenten und Wachstumsfaktoren, wie z.B. dem epidermalen Wachstumsfaktor

(EGF) (NICHOLSON u. ANDERSON 2002). Die Überexpression des Epidermalen

Wachstumsfaktor Rezeptors (EGFR) und in der Folge eine steigende Produktion des

Liganden in bestimmten Tumoren wie z.B. dem ösophagealen Plattenepithelkarzinom

(esophageal squamous cell carcinoma) wird von OKANO et al. (2000) beschrieben. AKT3

wird sowohl in Tumor- als auch in Normalgewebe exprimiert (ZINDA et al. 2001). Beim

adulten Menschen gibt es eine hohe Expression in Gehirn-, Lungen-, und Nierengewebe

(GENECARD AKT3). MASURE et al. (1999) haben die Expression in verschiedenen

Tumorzelllinien nachgewiesen. ZINDA et al. (2001) beschreiben die Expression in humanen

Mamma- und Prostatakarzinomen sowie in diversen anderen Normal– und Tumorgeweben.

Das Vorkommen in einer Reihe von Tumorgeweben zusammen mit der Regulation des

Zellstoffwechsels macht AKT3 als Targetgen für die Tumorforschung interessant. Es wird

vermutet, dass AKT die Proliferation der Zellen und in der Folge auch die Tumorprogression

fördert (NICHOLSON u. ANDERSON 2002).

Das humane AKT3 liegt auf Chromosom 1q43-44 und hat eine Größe von 355 022 Basen

(GENECARD AKT3). Es sind für den Menschen zwei Splicevarianten beschrieben

(BRODBECK et al. 2001). Die mRNA-Sequenz der Transkriptvariante 1 umfasst 3588 Basen

(Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_005465) und besteht aus 13 Exons. Der Protein

Literaturübersicht

15

codierende Bereich geht von Base 82 bis Base 1521. Das Protein hat eine Größe von 479

Aminosäuren (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NP_005456.1) mit einem berechneten

Molekulargewicht von 55774 Dalton und beinhaltet eine PH Domäne, eine Kinase Domäne

und einen C-Terminal ‚Tail’ mit Phosphorylierungsort (GENECARD AKT3). Die

Transkriptvariante 2 von AKT3 umfasst 1703 Basen (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_181690) und besteht aus 14 Exons, wobei Exon 2-12 mit Transkriptvariante 1 identisch

sind (ENSEMBL EXON INFORMATION AKT3). Der Protein codierende Bereich geht von

Base 82 bis Base 1479. Das Protein hat eine Größe von 465 Aminosäuren (Datenbank: NCBI,

GenBank Acc. No. NP_859029) und ein berechnetes Molekulargewicht von 54031 Dalton.

Abgesehen von dem verkürzten COOH-Ende sind die funktionalen Domänen mit der

Transkriptvariante 1 identisch.

Literaturübersicht

16

2.6. FAS-activated Serin/Threonin-Kinase

FASTK ist eine durch Stress aktivierte Serin/Threonin-Kinase die in den Apoptosesignalweg

involviert ist. FASTK ist durch Serin und Threonin Reste phosphoryliert und wird durch

Dephosphorylierung aktiviert. Die Aktivierung erfolgt durch TNFα, UV-Strahlung,

Hitzeeinwirkung und Ceramide, jedoch nicht durch mitogene Reize über den T-Zell-

Rezeptor-Komplex (TIAN et al. 1995). Nach der Aktivierung phosphoryliert FASTK TIA-1,

welches die DNA-Fragmentation vorbereitet. TIA-1 ist ein DNA bindendes Protein aus der

RRM (RNA recognition motif) Familie, das zwischen Zellkern und Zytoplasma pendelt.

Normalerweise befindet es sich im Zellkern. Im Zuge von Stress-aktivierter Apoptose

akkumuliert sich TIA-1 im Zytoplasma, wo es sich mit den Ribosomen des rauhen

Endoplasmatischem Retikulum assoziiert. TIA-1 bindet spezifisch an mRNAs, die für

Proteine der zellulären Proliferation codieren und unterbricht dort wahrscheinlich die

Translation als Reaktion auf Umweltstress. Die durch FASTK vermittelte Phosphorylierung

von TIA-1 reguliert also möglicherweise die Translation von mRNAs, die für Proteine

codieren, die zu Proliferation und Überleben der Zelle beitragen (TIAN et al. 1995,

ANDERSON 1997).

Das humane FASTK liegt auf Chromosom 7q35 und hat eine Größe von 4271 Basen

(GENECARD FASTK). Für den Menschen sind zwei Splicevarianten beschrieben. Andere

Varianten existieren, aber ihre Länge wurde bisher nicht vollständig ermittelt. Die mRNA der

Transkriptvariante 1 umfasst 1866 Basen (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_006712). Die Sequenz der Transkriptvariante 4 mit 1443 Basen (Datenbank: NCBI,

GenBank Acc. No. NM_033015) ist ebenfalls bekannt. Die mRNA der Transkriptvariante 1

(Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_006712) besteht aus 10 Exons und der Protein

codierende Bereich geht von Base 99 bis Base 1748. Das Protein hat eine Größe von 549

Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 61104 Dalton und einer Leucin-

reichen Region als funktionelle Domäne. Die Transkriptvariante 4 besteht aus 9 Exons und

der Protein codierende Bereich beginnt mit Base 99 und endet mit Base 1325 (Datenbank:

NCBI, GenBank Acc. No. NM_033015). Das Protein hat eine Größe von 408 Aminosäuren

mit einem berechneten Molekulargewicht von 45851 Da (Datenbank: NCBI, GenBank Acc.

No. NP_148936). Der Unterschied zwischen beiden Varianten liegt im Intron 1, wo

Transkriptvariante 1 ein zusätzliches Exon hat, das bei Transkriptvariante 4 fehlt. FASTK

wird exprimiert in Herz-, Gehirn-, Plazenta-, Lungen-, Leber-, Skelettmuskel-, Nieren- und

Pankreasgewebe (GENECARD FASTK).

Literaturübersicht

17

Zu Beginn der Arbeit 2003 war in der NCBI Datenbank eine humane FASTK Sequenz mit

2569 Basen als FASTK mRNA veröffentlicht (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_025096). Diese wurde später durch die oben aufgeführten Sequenzen NM_006712 und

NM_033015 ersetzt. Es handelt sich bei der Sequenz NM_025096 wahrscheinlich um eine

Exon-Intron-Sequenz von FASTK. Diese Sequenz wurde als Ausgangssequenz für die

Sondenherstellung von FASTK genutzt und später als Referenzsequenz für die genomische

Sonde und die BAC-DNA von FASTK verwendet.

Literaturübersicht

18

2.7. Survivin

Unter den Regulatoren der Apoptose nehmen die IAP (Inhibitor of Apoptosis) Proteine eine

besondere Stellung in der Steuerung zwischen Zelltod und Überleben ein. IAP Proteine

binden an Caspase -3 und -7 und hemmen sie durch die Blockade der Substratbindungsstelle

(RIEDL u. SHI 2004). Damit wirken sie z.B. durch Chemotherapie induzierter Apoptose

entgegen. IAPs werden inhibiert durch DIABLO (direct IAP binding protein with low pI),

welches aus dem Mitochondrium freigesetzt wird (IGNEY u. KRAMMER 2002).

Survivin ist das kleinste Mitglied der IAP Genfamilie und ist charakterisiert durch eine

einzelne ‚baculovirus iap repeat domain’ (BIR) und eine -COOH –terminus ‚α-helix coiled’

Domäne, welche den RING Finger ersetzt, der für andere IAP Mitglieder charakteristisch ist.

Survivin wird in verschiedenen fetalen und Tumorgeweben, wie z.B. Lungen-, Kolon-,

Pankreas-, Prostata- und Mammatumoren sowie High-Grade Non-Hodgkin Lymphomen,

exprimiert, jedoch nicht in normalem adultem Gewebe (AMBROSINI et al. 1997,

GENECARD Survivin). Survivin ist damit sehr Tumor-Typ spezifisch. Es kommt zur

Expression von Survivin in verschiedenen menschlichen Tumoren in der G2-Phase des

Zellzyklus und zur Interaktion mit dem mitotischen Spindelapparat (LI et al. 1998). Die

Unterbrechung der Survivin-Tubulin Interaktion oder der Bindung der BIR Domäne an

Caspase -3 und -7 führt in der Zellkultur zu einem Anstieg der Caspase-3 Aktivität und zur

Induktion von Apoptose (LI u. ALTIERI 1999).

In Neuroblastomen korreliert die Expression von Survivin mit einem aggressiveren und

ungünstigeren Krankheitsverlauf (IGNEY u. KRAMMER 2002).

Die Expression von Survivin erfordert den Einbau von typischen CDE/CHR G1

Repressionsbestandteilen und die Transkriptionsaktivität von Sp1. Die Unterbrechung dieser

Aktivierungswege ist möglicherweise ein Weg die Überexpression von Survivin in

Tumorzellen zu blockieren.

Das humane Survivin Gen liegt auf Chromosom 17q25 und hat eine Größe von 10428 Basen.

Bisher sind zwei Isoformen veröffentlicht (ENSEMBL EXON INFORMATION Survivin).

Die mRNA von Survivin α umfasst 1619 Basen (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_001168) und besteht aus 4 Exons. Der Protein codierende Bereich geht von Base 50 bis

Base 478. Das Protein hat eine Größe von 142 Aminosäuren und ein berechnetes

Molekulargewicht von 16389 Da. Die mRNA von Survivin β umfasst 600 Basen (Datenbank:

NCBI, GenBank Acc. No. AB028869) und beinhaltet 5 Exons. Das zusätzliche Exon befindet

Literaturübersicht

19

sich im Intron 2. Der Protein codierende Bereich geht von Base 27 bis Base 524. Das Protein

hat eine Größe von 165 Aminosäuren und ein berechnetes Molekulargewicht von 18635

Dalton. Die Proteine sind abgesehen von den zusätzlichen Aminosäuren von Survivin β von

Position 75-97 gleich. Survivin wird nur in fetalem Gewebe und verschiedenen

Tumorgeweben exprimiert, nicht in adultem Normalgewebe (GENECARD Survivin).

The protein kinase B, gamma (AKT3) gene maps to canine chromosome 7

20

3. Veröffentlichungen, Ergebnisse 3.1 The protein kinase B, gamma (AKT3) gene maps to canine chromosome 7

The protein kinase B, gamma (AKT3) gene maps to canine

chromosome 7

H. Murua Escobar1,2, J. Meyer1,2, S. Winkler1, C. Schelling3, G. Dolf4, I. Nolte2

and J. Bullerdiek1

1 Center for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Strasse ZHG,

28359 Bremen, Germany 2 Small Animal Clinic, School for Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15,

D-30173 Hannover, Germany 3 Department of Animal Science, Swiss Federal Institute of Technology Zurich and Faculty

of Veterinary Medicine, University of Zurich, 8092 Zurich, Switzerland

4 Institute of Animal Genetics, Nutrition and Housing, University of Berne,

Bremgartenstrasse 109a, 3012 Berne, Switzerland

Animal Genetics, 35(4), 354 - 355


21

Introduction: The protein kinase B, gamma (AKT3) protein is an intracellular

serine/threonine kinase involved in regulating cell survival. This protein phosphorylates and

regulates the function of many cellular proteins involved in processes that include

metabolism, apoptosis and proliferation 1,2., making it a promising target for drug discovery to

treat cancer. Expression of the human gene is found in normal and tumour tissues. The

assignment of the canine AKT3 gene was still unknown. In this study, we mapped the AKT3

gene to canine chromosome (CFA) 7q17 by FISH.

BAC clone and probe: In order to generate an AKT3 DNA probe, PCR amplification of

genomic DNA from a two year old Golden retriever was performed using primers that

spanned part of exon 13 (primer up: AGA CAG TAG CAG CAG CAG CA and dn: ATG

ACG AGG ACG GTA TGG AC ). Primers were designed with NCBI Sequence AY575066,

which shows 80.3 % homology to human AKT3 mRNA (NM_005465) PCR conditions: Total

volume 50 µl including 34,5 µl Aqua Bidest, 5µl 10 x Buffer, 3 µl MgCl2, 2 µl dNTP´s, 2 µl

of each Primer, approx. 50 ng genomic DNA and 0,5 µl Taq-Polymerase. Thermocycler

conditions: 10 min at 94°C, 35 cycles of 1 min 94°C, 1 min at 75°C, 2 min at 72°C and a final

extension of 10 min at 72°C. The resulting amplicon (AY575065) of 303 bp was verified by

sequencing. The PCR conditions were used to screen a canine BAC library3 (URL:

http://www.dogmap.ch) for AKT3 positive clones. To rule out false-positive BAC screening

results, the initial PCR was repeated, cloned and sequenced for verification of BAC 10 C 05-

4.

Fluorescence in situ hybridization: Metaphase preparations and fluorescence in situ

hybridization (FISH) were performed as described previously4. Ten metaphases were

examined and all demonstrated hybridization of the AKT3 probe on both chromatids of CFA

7s.

Comments: It has been reported that the canine chromosome 7 at least shares homology with

the human chromosomes (HSA) 1 and 18. While the homologies with HSA 1 are located at

the long (q) arm of the chromosome the homologies with HSA 18 are shown to be distributed

over both arms5. The human AKT3 gene is located at HSA 1q43-44. According to Yang et al.5

exactly this region shares homology with CFA 7. We mapped the canine AKT3 gent to CFA

7q17 following Reimann et al.6.


22

References:

1 Masure S et al. (1999) Eur J Biochem 265, 353-60.

2 Nicholson KM et al. (2002) Cell Signal 14, 381 – 95.

3 Schelling C, et al. (2002) J Anim Breed Genet 119, 400-401

4 Murua Escobar H et al. (2001) Cytogenet Cell Genet 94, 194-5.

5 Yang F et al. (1999) Genomics 62, 189-202.

6 Reimann N et al. (1996) Cytogenetics Cell Genetics 73, 140-144.

Figures

Figure 1: Metaphase spread after fluorescence in situ hybridization with signals on both

chromosome 7s (right) and GTG- banding (left)

The FAS-activated serine/threonine kinase gene (FASTK) maps to canine chromosome 16

23

3.2 The FAS-activated serine/threonine kinase gene (FASTK) maps to canine

chromosome 16

The FAS-activated serine/threonine kinase gene (FASTK)

maps to canine chromosome 16

J. Meyer1,2, H. Murua Escobar1,2, S. Bartnitzke1, C. Schelling3, G. Dolf4, I.

Nolte2 and J. Bullerdiek1

1 Center for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Strasse ZHG,


D-30173 Hannover, Germany 3 Department of Animal Sciences, Swiss Federal Institute of Technology Zurich and

Vetsuisse-Faculty Zurich, University of Zurich, Tannenstraße 1, 8092 Zurich,

Switzerland 4 Institute of Animal Genetics, Nutrition and Housing, Vetsuisse-Faculty Berne, University

of Berne, Bremgartenstrasse 109a, 3012 Berne, Switzerland

Animal Genetics, 35(6), 497


24

Introduction: FAS-activated serine/threonine kinase (FASTK) is activated by TNF-α, UV

irradiation, heat shock and ceramide but not by mitogenic stimuli transmitted via the T-cell

receptor complex. This observation indicates that FASTK is a stress-activated

serine/threonine kinase involved in signalling apoptosis. FASTK is constitutively

phosphorylated on serine and threonine residues and is activated by dephosphorylation. It is

rapidly dephosphorylated and concomitantly activated to phosphorylate TIA-1 in response to

FAS ligation. Activation of FASTK and phosphorylation of TIA-1 precede the onset of DNA

fragmentation, suggesting that phosphorylated TIA-1 might signal downstream events in the

apoptotic program.1

FASTK-mediated phosphorylation of TIA-1 plays a key role in apoptosis and regulates the

translation of mRNAs encoding proteins essential for survival and/or proliferation.

The assignment of the canine FASTK gene was still unknown. In this study, we mapped the

FASTK gene to canine chromosome (CFA) 16q14 by FISH.

BAC clone and probe: In order to generate a FASTK DNA probe, PCR amplification of

genomic DNA from a two year old Golden Retriever was performed using primers that

spanned part of exon 3 (primer 2405: GGT CAC CCT GAG CCC CAT GT and 1935: GGT

ACC CTC CCC GGT CCT GT). Primers were designed with NCBI Sequence AY723514,

which shows 83 % homology to human FASTK mRNA (NM_025096)

PCR conditions: Total volume 50 µl including 34,5 µl Aqua Bidest, 5µl 10 x Buffer, 3 µl

MgCl2, 2 µl dNTP´s, 2 µl of each Primer, approximat 50 ng genomic DNA and 0,5 µl Taq-

Polymerase. Thermocycler conditions: 10 min at 94°C, 35 cycles of 1 min 94°C, 1 min at

75°C, 2 min at 72°C and a final extension of 10 min at 72°C. The resulting amplicon of 479

bp was verified by sequencing (AY 667454). PCR conditions were used to screen a canine

BAC library2 (URL: http://www.dogmap.ch) for FASTK positive clones. To rule out false-

positive BAC screening results, a PCR using the initial primer pair used for the screening

probe was performed, cloned and sequenced for verification of BAC S075P24D10, Klone 1.

Fluorescence in situ hybridization: Metaphase preparations and fluorescence in situ

hybridization (FISH) were performed as described previously3. Ten metaphases were

examined and all demonstrated hybridization of the FASTK probe on both chromatids of CFA

16q14.


25

Comments: We mapped the canine FASTK gene to CFA 16q14 following Reimann et al4. It

has been reported that the canine chromosome 16 at least shares homology with the human

chromosomes (HSA) 4, 7, and 8. The human FASTK gene is located at HSA 7q36.1.

According to Yang et al.5 exactly this region shares homology with CFA 16.

References:

1 Tian Q et al. (1995) J exp Med 182, 865-74.

2 Schelling C et al. (2004) J Anim Breed Genet, in press

3 Murua Escobar H et al. (2001) Cytogenet Cell Genet 94, 194-5.

4 Reimann N et al. (1996) Cytogenet Cell Genet 73, 140-144.

5 Yang F et al. (1999) Genomics 62, 189-202.

Figures

Figure 1: Metaphase spread before (GTG- banding, left) and after fluorescence in situ

hybridization with signals on both chromosome 16q14 (right)

The canine protein kinase B, gamma (AKT3) and the canine FAS-activated serine/threonine kinase (FASTK)

26

3.3 The canine protein kinase B, gamma (AKT3) and the canine FAS-activated

serine/threonine kinase (FASTK)

The canine protein kinase B, gamma (AKT3) and the canine

FAS-activated serine/threonine kinase (FASTK)

J. Meyer1,2, H. Murua Escobar1,2, R. Nimzyk1, I. Nolte2 and J. Bullerdiek1

1 Centre for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Strasse ZHG,


30173 Hannover, Germany

Journal of Heredity zur Veröffentlichung eingereicht


27

Abstract

The dogs genome organisation was extensively studied in the last ten years. Knowledge of the

genome organisation of a species of interest is required for detailed genetic analyses,

including the identification of genes causing diseases

Similar to human cancer is one of the cardinal causes of death in dogs. The cancer research in

dogs has shown significant analogies between canine and human cell metabolism. In this

studie we characterised canine protein kinase B, gamma (AKT3) and FAS-activated

serine/threonine kinase (FASTK) knowing that their human counterparts are involved in

apoptosis and therefore may play a role in tumourigenesis. We found high similarity between

predicted canine and human mRNA and protein structure of AKT3 and FASTK.

Introduction

The dogs genome organisation was extensively studied in the last ten years. Knowledge of the

genome organisation of a species of interest is required for detailed genetic analyses,

including the identification of genes causing diseases (Switonski et al. 2004). In the last years

a growing number of scientists in genetics used the advantage that many canine diseases have

human orthologues on a genetic base and favoured the dog as model system beneath the

mouse. Our intention was to characterise canine protein kinase B, gamma (AKT3) and the

FAS-activated serine/threonine kinase (FASTK) genes knowing that the human counterparts

are involved in apoptosis and therefore may play a role in tumourigenesis. The human protein

kinase B, gamma is a member of the AKT serine/threonine protein kinase family which

mediates survival signals and is overexpressed in different diseases e.g. ovarian, breast and

prostate carcinomas (Cheng et al. 1992, Zinda et al. 2001). AKT3 is involved in regulating

cell survival by inhibiting pro-apoptotic genes. It phosphorylates and regulates the function of

many cellular proteins involved in processes that include cell growth, metabolism, apoptosis,

proliferation and differentiation (Masure et al. 1999). Human AKT3 is expressed in normal

and tumour tissue (Zinda et al. 2001). Its expression is activated by hormones, extracellular

matrix components and growth factors e.g. the epidermal growth factor (EGF) whose

overexpression in certain cancers as the esophageal squamous cell carcinoma is well

described (Okano et al. 2000, Nicholson et al. 2002). Human AKT3 is located on HSA 1q43-

44 and consists of 355 351 bases. The mRNA spans 3588 bases and consists of thirteen exons

(NM_005465). The protein is composed of 479 aminoacids with a calculated weight of 55774

Da and contains a pleckstrin homology domain (PH domain), a kinase domain and a C-

terminal ‘tail’ (NP_005456).The molecular characterisation of the canine AKT3 gene was still


28

at the beginning although the function in regulating cell survival makes it a promising target

for drug discovery to treat cancer. For characterising canine AKT3 at first we mapped the gene

to CFA 7 by FISH (Murua Escobar et al. 2004) and searched NCBI database for the genomic

sequence of canine AKT3. Additionally we investigated the canine FASTK gene in the same

manner. Human FAS-activated serine/threonine kinase is a member of the serine/threonine

protein kinase family. As it is activated by TNF-α, UV irradiation, heat shock but not by

mitogenic stimuli transmitted via the T-cell receptor complex it is indicated that FASTK is a

stress-activated serine/threonine kinase which is involved in signalling apoptosis. FASTK is

activated by dephosphorylation and phosphorylates TIA-1 in response to FAS ligation.

Activation of FASTK and phosphorylation of TIA-1 precede the onset of DNA fragmentation

and plays a key role in apoptosis (Tian et al. 1995). TIA-1 is a DNA binding protein which

shuttles between the nucleus and the cytoplasm. Normally it is in the nucleus. During

apoptosis it accumulates in the cytoplasm nearby the rough endoplasmatic reticulum. TIA-1

regulates the translation of mRNAs encoding proteins essential for proliferation and/or cell

survival. It probably disturbs the translation of these proteins as a reaction to environmental

stress (Anderson 1997). Human FASTK is located on HSA7q35 and spans 4249 bases. For

human two transcript variants encoding different isoforms have been found for FASTK. Other

variants exist, but their full length natures have not yet been determined. Transcript variant 1

spans 1866 bases and consists of ten exons (NM_006712). The protein of transcript variant 1

includes 549 aminoacids and has a calculated weight of 61104 Da (NP_006703). Transcript

variant 4 spans 1443 bases and the protein consists of 408 aminoacids with a calculated

weight of 45851 Dalton (NM_033015, NP_148936). Although both AKT3 and FASTK might

be important for drug discovery and tumour therapy for the dog as well as for human its

molecular characterisation in dogs was not carried out. To characterise canine AKT3 and

FASTK we searched for the chromosomal localisation (Meyer et al. 2004, Murua Escobar et

al. 2004), the genomic sequence, mRNA- and protein sequences.


29

Material and Methods

BAC- screening and FISH-mapping were performed as described previously (Murua Escobar

et al. 2004; Meyer et al. 2004). In order to generate canine mRNA- sequences for AKT3 and

FASTK we blasted our previous results (AY575066, AY575065, AY 667454, AY723514) of

canine AKT3 and FASTK and the human exon sequences of both genes with ‘the genome

sequence of canis familiaris’ (AAEX01000000, AACN000000000). In silico composing of

the mRNA and protein prediction was done using ‘spidey’, ‘est2genome’ and ‘getorf’

software. Identity comparison to the human counterpart was made using NCBI sequences

NM_005465, NP_005456, NM_006712, NP_006703, NM_033015 and NP_148936 for AKT3

and FASTK transcript variant 1 and 4.

Results

As blast search results in NCBI database for the genomic sequences of AKT3 and FASTK we

found AAEX01012878.1, AAEX01012879.1, AAEX01012880.1 and AACN010097585.1 for

AKT3 and AAEX01041292.1 for FASTK. From this data we deduced a mRNA - sequence and

a proteinsequence. The protein of AKT3 comprises a pleckstrin homology domain, a kinase

domain and a C-terminal ‘tail’. For FASTK we located a leucin rich region in the protein.

Discussion

Similar to human cancer is one of the cardinal causes of death in dogs. The cancer research in

dogs has shown significant analogies between canine and human cell metabolism. Human

AKT3 is involved in regulating cell survival. It regulates the function of many cellular

proteins involved in processes that include cell growth, metabolism, apoptosis, proliferation

and differentiation. Its function in regulating cell survival makes it a promising target for drug

discovery to treat cancer (Masure et al. 1999). On the other hand activation of FASTK and

phosphorylation of TIA-1 precede the onset of DNA fragmentation and plays a key role in

apoptosis. TIA-1 regulates the translation of mRNAs encoding proteins essential for

proliferation and/or cell survival (Tian et al. 1995).

Both proteins are involved in the apoptotic program and mistakes in the apoptotic program

lead to proliferation of neoplastic cells and therefore to cancer. Otherwise tumourcells with a

deficient apoptotic pathway may be stimulated by induction of one of these genes to

apoptosis.

We mapped the canine AKT3 gene to CFA 7q17 by FISH following the nomenclature of

Reimann et al. 1996 (Murua Escobar et al. 2004). According to Yang et al. 1999 canine


30

chromosome 7 at least shares homologies with human chromosome 1 and 18. The human

AKT3 gene is located at HSA 1q43-44. The homologies between CFA 7 and HSA 1 are

exactly in the region we mapped AKT3. To compose the genomic sequence of canine AKT3

we searched NCBI database and found some contiguous sequences (AAEX01012878.1,

AAEX01012879.1, AAEX01012880.1 and AACN010097585.1) similar to human AKT3 and

our previously generated canine AKT3 sequences e.g. AY575066 and AY575065. The

deduced canine AKT3 mRNA-sequence has an overall identity of 88% with human mRNA

(NM_005465). The coding sequence is 95% similar to human (NM_005465). The deduced

canine protein sequence comprises 479 aminoacids with 98,7% identity to human

(NP_005456) and the same functional domains. Secondary to characterise canine FASTK

gene we mapped it to CFA16q14 by FISH following the nomenclature of Reimann et al. 1996

(Meyer et al. 2004). The human FASTK gene is located at HSA 7q36.1. According to Yang et

al. 1999 canine chromosome 16 shares homologies with human chromosome 4, 7, and 8. The

homologies between CFA 16 and HSA 7 are exactly in the region we mapped FASTK. To

compose the genomic sequence of canine FASTK we searched NCBI database and found one

matching sequence (AAEX01041292.1) similar to human FASTK (NM_006712,

NM_033015) and our previously generated canine FASTK sequences (AY 667454 and

AY723514). The deduced canine mRNA-sequence of FASTK with an overall identity of

about 90% to human mRNA (NM_006712, NM_033015) is containing ten exons. The coding

sequence of transcript variant 1 is 91% similar to human (NM_006712). The deduced canine

protein sequence of transcript variant 1 comprises 549 aminoacids with 93.8% identity to

human protein (NP_006703) and the same leucin rich region. The canine protein sequence of

transcript variant 4 consists of 408 aminoacids an has 94.9% identity to human (NP_148936).

The similarity between human and canine proteins of AKT3 and FASTK lead to the

conclusion that metabolism and signalpathways are even similar.


31

References

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Masure S, Haefner B, Wesselink JJ, Hoefnagel E, Mortier E, Verhasselt P, Tuytelaars A,

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Bullerdiek J, 2004. The FAS-activated serine/threonine kinase gene (FASTK) maps to canine

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Murua Escobar H, Meyer J, Winkler S, Schelling C, Dolf G, Nolte I, and Bullerdiek J, 2004.

The protein kinase B, gamma (AKT3) gene maps to canine chromosome 7. Anim Genet.

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Reevaluation of canine survivin mRNA-sequence data

33

3.4 Reevaluation of canine survivin mRNA-sequence data

Reevaluation of canine survivin mRNA-

sequence data

J. Meyer1,2, H. Murua Escobar1,2, R. Nimzyk1, J. Bullerdiek1 and I. Nolte2

1 Centre for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Strasse ZHG,


30173 Hannover, Germany

Correspondence to:

Dr. J. Bullerdiek, Centre for Human Genetics, University of Bremen,

Leobener Strasse ZHG, 28359 Bremen, Germany

Phone: +49-421-218-4239

Fax: +49-421-218-4239

E-mail: [email protected]

in preparation


34

Introduction: Apoptosis plays a key role in tissue homeostasis. Malfunction of apoptosis has

been related to carcinogenesis by abnormally prolonging cell survival, facilitating the

accumulation of mutated cells, and promoting resistance to immunosurveillance. The

molecular pathways leading to apoptotic cell death are highly conserved evolutinarily and

controlled by proteins that either promote or counteract apoptotic cell death. To assume that

apoptosis inhibition may be a general feature of neoplasia, the impairment of apoptotic cell

death might significantly affect resistance of cancer to chemotherapy and irradiation.

Survivin is a member of the Inhibitor of Apoptosis (IAP) family. It is characterised by a single

BIR (baculovirus iap repeat) domain and a –COOH terminus α-helix coiled domain, but lacks

a carboxy-terminal RING finger. Survivin is expressed in most common human cancers of

lung, colon, pancreas, prostate and breast but not in normal, terminally differentiated adult

tissue. Survivin inhibits processing of procaspase-7 and procaspase-3 which plays a key role

in promoting the apoptosis signal.

The antiapoptotic properties of survivin might mediate a significant growth advantage to

tumours and possibly also contribute to chemoresistance of cancer as survivin possibly

interacts with the cytotoxic effects of chemotherapeutic agents. Also there might be a

correlation between the expression of survivin and a clinically unfavourable course of disease,

proposing survivin expression as a potential prognostic factor. This makes survivin a

promising new target for apoptosis-based therapy in cancer and lymphoma. Our intention was

to characterise canine survivin knowing that the human counterpart is involved in apoptosis

inhibition and therefore may play a role in tumourigenesis.

Material and Methods: In order to generate a canine mRNA-sequence for survivin we blasted

a canine cDNA-sequence similar to survivin and the human exon sequences of survivin with

the genome sequence of canis familiaris according to contig AAEX01000000 and

AACN000000000 of NCBI database. In silico analyses of the mRNA and protein prediction

were done using ‘spidey’, ‘est2genome’ and ‘getorf’ software. Identity comparison to the

human counterpart was made using NCBI sequence NM_001168.

Results: As blast search results in NCBI database for the genomic sequence of survivin

according to our canine cDNA-sequence we found AAEX01050028. From this data we

deduced an mRNA-sequence with 711 bases and four exons. This sequence is 99 % identical

to NCBI sequences NM_001003348, AB180206 and AY741504, but only 83 % similar to

NM_001003019 and AB095108. The protein is composed of 142 aminoacids and comprises a


35

BIR (baculovirus iap repeat) domain. This protein is 100 % identical to NCBI sequences

NM_001003348 and AB 180206.

Discussion: Similar to human cancer is one of the major causes of death in dogs. Canine

oncology has revealed significant analogies between canine and human cell metabolism.

Human survivin is a member of the IAP family and therefore an apoptosis inhibitor.

Expression of survivin might provide a significant growth advantage in tumours and possibly

also contributes to chemoresistance of some cancers. To compose the genomic sequence of

canine survivin we searched NCBI database and found one contigous sequence

(AAEX01050028) similar to human survivin. The deduced canine survivin mRNA-sequence

is 99 % similar to NCBI sequences NM_001003348, AB180206 and AY741504, but only 83

% identical to NCBI NM_001003019 and AB095108 so we conclude that our result and

NCBI sequences NM_001003348, AB180206, AY741504 comprise the real mRNA-sequence

of canine survivin and NM_001003019 and AB095108 does not.

Our deduced canine sequence has an overall identity of 83 % to human survivin mRNA

(NM_006811). The coding sequence is 90% similar to human (NM_006811). The deduced

canine protein sequence comprises 142 aminoacids with 91.5 % identity to human

NM_006811 and a BIR domain. There are twelve different aminoacids between canine and

human survivin protein. Two of them in the area of BIR. The similarity between human and

canine proteins of survivin leads to the conclusion that metabolism and signalpathway may be

similar.

References

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Diskussion

36

5. Übergreifende Diskussion

In den 30er Jahren des letzten Jahrhunderts führte Otto Warburg biochemische

Untersuchungsmethoden in die Tumorforschung ein und machte vor allem Störungen der

Atmungskette und des Glucosestoffwechsels für die Malignität der Zellen verantwortlich

(WARBURG et al. 1965, WARBURG et al. 1967). In der Folge wurde nach möglichen

biochemischen Unterschieden zwischen Krebs- und Normalzellen gesucht, was in den 80er

Jahren in der Entdeckung der Onkogene einen ersten Höhepunkt fand (SPANDIDOS 1983,

AARONSON 1991). Das Auffinden molekularer Unterschiede zwischen Normal- und

Tumorzellen ist nicht nur die Grundlage zum Verständnis der malignen Transformation,

sondern eröffnet auch neue Wege zur Entwicklung von Tumortherapeutika. Die molekularen

Ursachen und Ausprägungen von Tumoren sind sehr vielschichtig. Tumore der einzelnen

Gewebe unterscheiden sich, es kommen unterschiedliche Tumore in einem Gewebe vor und

der einzelne Tumor kann Subpopulationen von unterschiedlich veränderten Zellen aufweisen.

Auch kann eine Krebserkrankung beim einzelnen Patienten einen individuell

unterschiedlichen Verlauf nehmen. Das Problem bei der Tumortherapie war und ist die

mangelnde Spezifität der Therapeutika (LÖFFLER u. PETRIDES 1998).

Ähnlich wie beim Menschen ist Krebs eine der Haupttodesursachen des Hundes (NOLTE u.

NOLTE 2002). In Autopsien gestorbener Hunde wurde altersunabhängig bei 23 % sowie bei

einem Alter des Tieres von über 10 Jahren bei 45 % aller Tiere Krebs als Todesursache

festgestellt (BRONSON 1982). Die Krebsinzidenz des Hundes ist gegenüber dem Menschen

sogar erhöht (HAHN et al. 1994). Früher wurden Tumore fast ausschließlich chirurgisch

behandelt. Inzwischen wird in der Regel eine Kombination von Chemotherapie,

Strahlentherapie und/oder Chirurgie angewendet (NOLTE u. NOLTE 2002).

Zu den dringlichen Problemen in der klinischen Onkologie gehören auch die Frühdiagnose

und Therapiekontrolle von Tumorerkrankungen. Die ideale Tumormarkersubstanz wäre ein

stabiles Molekül, das ausschließlich von Tumorzellen sezerniert wird und im Plasma und/oder

Urin nachweisbar ist (LÖFFLER u. PETRIDES, 1998). Hier gibt es einige hoffnungsvolle

Kandidaten unter anderem Survivin (SMITH et al. 2001). Bis zur Etablierung sensiblerer

Systeme bedient sich die veterinärmedizinische Diagnostik moderner Methoden wie z.B.

digitales Röntgen, Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT)-

Techniken (REEVES u. KRESSLER 2004). Die Möglichkeiten eine Tumorerkrankung in

vivo und bereits im Frühstadium zu diagnostizieren haben sich in den letzten Jahren

Diskussion

37

verbessert, jedoch muss zur radiologischen Diagnostik der Tumor immer noch ca. 3 x größer

sein, als es theoretisch für einen der oben genannten Tumormarker der Fall sein müsste

(LÖFFLER u. PETRIDES 1998). Mit der Früherkennung steigt auch das Bedürfnis der

Patientenbesitzer nach umfassenden Therapien sowohl chirurgischer als auch konventioneller

Natur. Wie auch in anderen Bereichen der Veterinärmedizin beim Kleintier wird hier in vielen

Fällen auf Humanarzneimittel zurückgegriffen (MOORE u. KITCHELL 2003). In Anbetracht

der nachgewiesenen Ähnlichkeiten zwischen humanen und caninen Tumoren in Phänotyp,

Histologie und Biologie (HAHN et al. 1994) ist dieses Vorgehen durchaus Erfolg

versprechend. Da mit der klassischen Zytostatikatherapie nur ein kleiner Anteil der

Krebserkrankungen heilbar ist, werden große Hoffnungen in gentherapeutische Ansätze bei

Tumorerkrankungen gesetzt (LÖFFLER u. PETRIDES 1998).

Fehler im Apoptosesignalweg können zur Proliferation neoplastischer Zellen führen (RIEDL

u. SHI 2004). Da Chemotherapie und Strahlentherapie in der Regel Apoptose induzieren

sollen, sind Zellen mit fehlerhaftem Apoptosesignalweg durch diese Therapieformen nur

schwer zu erreichen. Die Resistenz dieser Zellen gegenüber Apoptose ist auch für die

fehlerhafte Überwachung durch das Immunsystem verantwortlich. Die Resistenz von

Tumorzellen gegenüber Apoptose stellt ein klinisch relevantes Problem dar (IGNEY u.

KRAMMER 2002).

In den letzten Jahren wurden eine Reihe von Mechanismen der Apoptoseinduktion und damit

verbundene Resistenzmechanismen der Apoptose in Tumorzellen aufgedeckt. Dies führt

klinisch zu neuen zytotoxischen Wirkstoffen, die die blockierten Signalwege umgehen

können. Die Therapeutika der Zukunft sind z.B. Antisense-Moleküle, Ribozyme, Aptamere,

Nucline oder RNA-Interferenz (KAWASAKI et al. 2004). Eine Kombination verschiedener

Therapiestrategien kann den Erfolg erhöhen, da verschiedene Zellen eines Tumors oder auch

nur eine einzelne Zelle unterschiedliche Resistenzmechanismen gegen Apoptose vereinen

können (IGNEY u. KRAMMER 2002).

Ein wichtiger Punkt auf dem Weg zur spezifischen Tumortherapie ist die Charakterisierung

der an der Tumorgenese beteiligten Gene und die Art ihrer Beteiligung (WAGENER 1999).

Die bisherige Tumorforschung beim Hund hat die große Ähnlichkeit der molekularen

Mechanismen bei Hund und Mensch aufgezeigt (OSTRANDER et al. 2000). Zur näheren

Betrachtung einzelner Gene als Targetgene für die Tumortherapie ist es notwendig die

Diskussion

38

entsprechenden Gene genauer zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden

molekulargenetische Untersuchungen caniner Apoptose-assoziierter Gene durchgeführt. Im

Mittelpunkt der Arbeit standen drei Gene, die beim Menschen als Tumor- und

Krankheitsrelevant bekannt sind und zwar Protein Kinase B gamma (AKT3), FAS-activated

Serin/Threonin-Kinase (FASTK) und Survivin.

AKT3 beim Menschen ist eine intrazelluläre Serin/Threonin-Kinase, die an der Regulation

des Zellstoffwechsels im Zusammenhang mit Proliferation, Differenzierung und Überleben

der Zelle beteiligt ist. Die Beteiligung am Apoptosesignalweg macht es zu einem möglichen

Zielgen für die Tumortherapieforschung (MASURE et al. 1999).

Daher war ein Ziel dieser Arbeit die Charakterisierung des caninen AKT3. Im Vorfeld wurde

eine im Zentrum für Humangenetik erstellte canine cDNA-Bank katalogisiert und die

einzelnen Klone wurden soweit möglich humanen Genen zugeordnet. Die Homologie

zwischen dem Klon CFT-01884-P09A05 (Abb.4 im Anhang) und der mRNA des humanen

AKT3 beträgt 89 % für Transkriptvariante 1 (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_005465) und 77 % für Transkriptvariante 2 (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_181690). Die Unterschiede zwischen der caninen Sequenz (Abb. 4 im Anhang) und

Transkriptvariante 2 von AKT3 (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_181690) liegen

überwiegend im Bereich ab Base 1440 des humanen AKT3 bis zum Ende der Sequenz. In

diesem Bereich differiert die humane AKT3 Variante 2 (Datenbank: NCBI, GenBank Acc.

No. NM_181690) stark von Variante 1 (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_005465),

während die canine Sequenz (Abb.4 im Anhang) keine erhöhten Abweichungen zu

Transkriptvariante 1 des humanen AKT3 (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_005465) zeigt. Der cDNA Klon (Abb.4 im Anhang) enthält mit an Sicherheit grenzender

Wahrscheinlichkeit ein Äquivalent der Transkriptvariante 1 des humanen AKT3 (Datenbank:

NCBI, GenBank Acc. No. NM_005465).

Ausgehend von genomischer DNA vom Hund wurde eine canine AKT3-Sonde hergestellt

(Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. Ay 575067), die zu 86 % homolog zur humanen

mRNA von AKT3 Transkriptvariante 1 ist (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_005465). Die Homologie zur Transkriptvariante 2 von AKT3 (Datenbank: NCBI,

GenBank Acc. No. NM_181690) ist sehr gering, da sich die beiden humanen Varianten

gerade in diesem Teil der Sequenz stark unterscheiden. Daraus folgt, dass auch hier die

Diskussion

39

Transkriptvariante 1 von AKT3 (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_005465)

amplifiziert wurde. Mit den PCR-Daten zu dieser Sonde wurde die canine BAC-Library

DogMap in der Schweiz (DOGMAP CONSORTIUM) durchsucht und Sequenzen von AKT3

wurden in BAC SO27P10C05 Klon 4 + 5 sowie BAC SO43P08A11 Klon 1 + 2 identifiziert.

Mit BAC-DNA als Sonde wurde das canine AKT3 mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

auf CFA 7q17 lokalisiert (Murua Escobar et al. 2004). Das humane AKT3 befindet sich auf

HSA 1q43-44 (GENECARD AKT3). Nach YANG et al. (1999) teilt das canine

Chromosom 7 Homologien mit den humanen Chromosomen 1 und 18 (Abb.3). Die

Homologien zwischen CFA 7 und HSA 1 betreffen danach exakt die Region, in der das

canine AKT3 beschrieben wurde (MURUA ESCOBAR et al. 2004).

Für die weitere Charakterisierung des caninen AKT3 wurde die NCBI Datenbank

(Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. AAEX01000000, AACN000000000) mit den

erstellten caninen AKT3-Sequenzen (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. AY575066,

AY575065, Abb.4, 5 im Anhang) und den Sequenzen der humanen Exons von AKT3

(Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. NM_005465, NM_181690) auf die canine

genomische Sequenz von AKT3 durchsucht. Die canine genomische Sequenz von AKT3

befindet sich in den Contigs AAEX01012878.1, AAEX01012879.1, AAEX01012880.1 und

AACN010097585.1 der NCBI Datenbank. Nach NCBI Angaben liegen die Sequenzen auf

dem caninen Chromosom 7. Diese Aussage deckt sich mit dem Ergebnis der Fluoreszenz-in-

situ-Hybridisierung (MURUA ESCOBAR et al. 2004). Die Homologie der einzelnen Exons

der humanen AKT3 Sequenzen (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_005465,

NM_181690) im Vergleich zu den caninen Sequenzen (Abb.11, 12 im Anhang) liegt

zwischen 92 % und 99 %. Die Homologien der Introns liegen zwischen 41,4 % und 62,3 %.

Der Durchschnittswert beträgt bei den Introns 52 %.

Teil dieser Arbeit war die Charakterisierung der caninen mRNA von AKT3. Abbildung 11

(Anhang) zeigt eine mittels in silico Analyse erstellte mRNA des Hundes. Hierfür wurden

Sequenzen aus Abbildung 7 und 8 (Anhang) sowie Teile der genomischen Sequenz von

Chromosom 7 des Hundes (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. AAEX01012878.1,

AAEX01012879.1, AAEX01012880.1. und AACN010097585.1) herangezogen und mit der

Software ‚spidey’ und ‚est2genome’ die canine mRNA-Sequenz von AKT3 (Abb.11 im

Anhang) in Anlehnung an die humane Transkriptvariante 1 (Datenbank: NCBI, GenBank

Acc. No. NM_005465) bestimmt. Die so erstellte canine mRNA-Sequenz ist zu 88 %

Diskussion

40

homolog zur AKT3-Sequenz des Menschen (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_005465, Transkript Variante 1). Die canine mRNA der möglichen Transkriptvariante 2

von AKT3 (Abb.12 im Anhang) ist zu 93 % identisch mit der humanen Variante 2

(Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_181690). Die Homologie der caninen mRNA-

Sequenz von AKT3 (Abb.11 im Anhang) zur Sequenz der Transkript Variante 1 des

Menschen (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_005465) beträgt insgesamt 88 %. Der

ORF ist zu 95 % identisch mit dem Humanen, 5´UTR und 3´UTR sind zu 95 % bzw. 81 %

homolog.

Die canine mRNA von AKT3 (Abb.11, 12 im Anhang) ist außerdem zu 85 % bzw. 87 %,

88 % und 83 % bzw. 56 % homolog zu den Sequenzen von Maus, Ratte und einer

genomischen Teilsequenz des Rhesus Affen. (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos.

NM_011785, NM_031575, BV165988).

Aus der caninen mRNA (Abb.11, 12 im Anhang) wurden die in Abbildung 13 und 14

(Anhang) aufgeführten caninen Proteinsequenzen für AKT3 abgeleitet. Die Sequenz zu

Transkriptvariante 1 umfasst 479 Aminosäuren und hat ein berechnetes Molekulargewicht

von 55658 Dalton (Abb.13 im Anhang). Sie ist zu 98,7 % identisch mit der des Menschen

(Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_005465) und zu 99 %, 98,4 % und 98,6 % gleich

in den funktionalen Domänen. Es gibt nur an 3 Stellen Aminosäureaustausche und zwar in

den Positionen 6, 270 bis 273 und 460. Die PH Domäne mit 101 Basen geht von Position 6

bis 107, die Kinase Domäne mit 254 Basen von Position 151-405, das C-Terminale Ende mit

72 Basen geht von Aminosäure 406 bis 478. Diese Aufteilung ist identisch mit der des

Menschen (INTERPRO). Bei Transkriptvariante 2 von AKT3 (Abb.14 im Anhang) kommt es

in Position 6 und 270-273 zu denselben Differenzen wie bei Variante 1, die Veränderung in

Position 460 ist jedoch verschoben auf Position 458 und die humane AKT3-Sequenz der

Variante 2 (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_181690) variiert in den folgenden

Aminosäuren von Transkriptvariante 1. Die Homologie zwischen caninem und humanem

AKT3 Protein der Transkriptvariante 2 beträgt 98,7 %. Die caninen Proteinsequenzen von

AKT3 (Abb.13 und 14 im Anhang) sind zu 97,9 bzw. 98,5 % und 98,4 bzw. 98,5 % homolog

zu denen von Maus und Ratte (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. NP_035915,

NP_113763.1). Der Vergleich Hund zu Maus ergibt, dass an den Positionen, an denen die

Hundesequenz Unterschiede zum Menschen zeigt, die Sequenz der Maus identisch mit der

des Menschen ist.

Diskussion

41

FASTK ist am Apoptosesignalweg durch die Aktivierung von TIA-1 beteiligt. TIA-1 hemmt

die Translation von mRNAs, die für Proteine codieren, die in Zellstoffwechsel und

Proliferation involviert sind (TIAN et al. 1995). Für das humane FASTK sind bisher 2

Transkriptvarianten vollständig bekannt (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. NM_006712

und NM_033015).

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des caninen FASTK. Die Homologie

zwischen dem Klon CFT-01522-P118C12 aus der caninen cDNA-Bank des Zentrum für

Humangenetik (Abb.5) und der mRNA des humanen FASTK beträgt 83 % für beide

Varianten (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. NM_006712, NM_033015), da die canine

Sequenz im hinteren Teil der mRNA liegt. Dieser Bereich ist beim Menschen für beide

Transkriptvarianten identisch.

Zur Erforschung der chromosomalen Lokalisation des caninen FASTK wurde eine

genomische canine Sonde zum Screenen der caninen BAC-Library DogMap (DOGMAP

CONSORTIUM) hergestellt. Diese Sonde ist nur zu 65 % homolog zu den humanen mRNA

Transkriptvarianten 1 und 4 von FASTK (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_006712, NM_033015), allerdings besteht eine 81 %ige Homologie zur humanen

FASTK-Sequenz aus Abbildung 21 (Anhang) (ehemals: Datenbank: NCBI, GenBank Acc.

No. NM_025096). Diese Sequenz galt zu Beginn der Arbeit als FASTK mRNA

Transkriptvariante 3, wurde aber inzwischen durch Variante 1 und 4 ersetzt. Der Struktur

nach handelt es sich um eine Exon-Intron-Sequenz, was zu unserer genomischen Sonde passt.

Durch das Screening konnte für FASTK ein BAC-Klon identifiziert werden. Mit BAC-DNA

als Sonde wurde das canine FASTK mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf CFA

16q14 lokalisiert (Meyer et al. 2004). Nach YANG et al. (1999) teilt das canine Chromosom

16 Homologien mit den humanen Chromsomen 4, 7 und 8 (Abb.3). Das humane FASTK ist

auf HSA 7q36.1 lokalisiert (GENECARD FASTK). Die Homologien zwischen HSA 7 und

CFA 16 liegen somit in genau der Region, in der das canine FASTK beschrieben wurde

(MEYER et al. 2004).

Für die weitere Charakterisierung wurde die genomische Sequenz von Canis familiaris

(Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. AAEX01000000, AACN000000000) mit den

caninen FASTK Sequenzen in Abbildung 9 und 10 (Anhang) sowie den humanen Exon

Sequenzen von FASTK (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_006712, NM_033015)

Diskussion

42

verglichen. Die genomische Sequenz des caninen FASTK befindet sich in Contig

AAEX01041292.1 der NCBI Datenbank.

Die Homologien der einzelnen Exons im Vergleich Hund und Mensch liegen zwischen 91 %

und 95 %. Die der Introns zwischen 20,5 % und 46,1 %. Die durchschnittliche Homologie der

Introns beträgt 34,1 %.

Aus den Sequenzen in Abb. 9 und 10 (Anhang) sowie aus den Daten von Contig

AAEX01041292.1 der NCBI Datenbank wurde die canine mRNA von FASTK für beide beim

Menschen bekannten Transkriptvarianten (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_006712, NM_033015) abgeleitet (Abb.15, 16 im Anhang). Bei FASTK unterscheiden

sich die Transkriptvarianten sowohl beim Menschen als auch beim Hund im Anfangsbereich

der Sequenz durch ein zusätzliches Exon von 427 Basen hinter dem Exon 1 bei

Transkriptvariante 1 (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_006712). Die mRNA der

Transkriptvariante 1 des Hundes (Abb.15 im Anhang) ist zu 90 % homolog zur mRNA der

Transkriptvariante 1 des Menschen (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_006712). Die

canine Transkriptvariante 4 (Abb.16 im Anhang) ist zu 89 % identisch mit der Variante 4 des

Menschen (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_033015). Die FASTK mRNA ist

außerdem noch bei der Maus bekannt (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_023229).

Diese Sequenz ist zu 83 % homolog zur Transkriptvariante 1 (Abb.15 im Anhang) und zu

81 % homolog zur Transkriptvariante 4 des Hundes (Abb.16 im Anhang). Die FASTK

Transkriptvarianten 1 und 4 des Menschen (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_006712, NM_033015) sind insgesamt zu 90 % bzw. 89 % identisch mit denen des

Hundes (Abb.15, 16 im Anhang), die CDS ist zu 91 % bzw. 90 % homolog und die 5´UTR

und 3´UTR Sequenzen sind zu 84 % bzw. 80 % gleich mit denen des Menschen.

Die Proteinsequenz der Transkriptvariante 1 des Menschen (Datenbank: NCBI, GenBank

Acc. No. NM_006712) ist zu 93,8 % homolog zu der Caninen in Abbildung 17 (Anhang). Die

Transkriptvarianten 4 von Mensch (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_033015) und

Hund (Abb.18 im Anhang) haben eine Homologie von 94,9 %. Als funktionale Domäne gibt

es eine Leucin-reiche Region in beiden Sequenzen an Position 277 bzw.136 mit einer Länge

von 167 Aminosäuren. Im Vergleich zum Menschen gibt es bei Transkriptvariante 1 des

Hundes 34 Aminosäureaustausche und bei Transkriptvariante 4 21. Die zusätzlichen

Aminosäureaustausche in Variante 1 liegen im Bereich 1-141 den die Variante 4 beim

Menschen nicht besitzt. Im hinteren, homologen Teil sind die Aminosäureaustausche gleich

Diskussion

43

bzw. die Proteine von Mensch und Hund sind dort jeweils zu 100 % identisch (INTERPRO).

Innerhalb der Leucin-reichen Region gibt es zwischen Mensch und Hund drei

Aminosäureaustausche.

Die Homologie der Proteine von Hund (Abb.17, 18 im Anhang) und Maus (Datenbank:

NCBI, GenBank Acc. No. NP_075718.1) beträgt für die Transkriptvariante 1 89,5 % und für

Transkriptvariante 4 90,0 %.

Survivin ist ein Mitglied der IAP Familie und ein Apoptoseinhibitor. Die Expression von

Survivin scheint Tumorzellen wichtige Proliferationsvorteile zu bieten. Es wird außerdem

vermutet, dass Survivin zur Chemoresistenz von Tumoren beiträgt (MAHOTKA et al. 1999).

Die noch nicht vollständig aufgeklärten molekularen Mechanismen von Survivin verhindern

bisher die Entwicklung von effektiven Survivin Antagonisten (CALDAS et al. 2005). Die

Charakterisierung von Survivin für den Hund erscheint deshalb besonders relevant.

Die Homologie des Klon CFT-00328-P15F05 aus der cDNA-Bank des ZHG (Abb.6 im

Anhang) zur humanen mRNA von Survivin α (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_001168) beträgt 82 %. Die Homologie zu Survivin β (Datenbank: NCBI, GenBank Acc.

No. AB028869) beträgt 85 %. Es gibt allerdings eine eindeutige Lücke in der caninen

Sequenz an der Stelle, an der das humane Survivin β ein zusätzliches Exon im Vergleich zu

Survivin α hat. Bei der caninen cDNA handelt es sich also mit hoher Wahrscheinlichkeit um

eine Variante des humanen Survivin α. Sie ist außerdem weitestgehend identisch mit der

caninen Survivin Sequenz NM_001003348 aus der NCBI Datenbank.

Zur Charakterisierung des caninen Survivin wurden die Contigs AAEX01000000 und

AACN000000000 aus der NCBI Datenbank mit den caninen Survivin Sequenzen aus

Abbildung 6 und der NCBI Datenbank (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. AB095108,

AY741504 und NM_001003348) sowie der Sequenz der humanen Exons von Survivin

(Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. NM_001168, AB028869), auf die canine

genomische Sequenz von Survivin durchsucht. Die genomische Sequenz des caninen Survivin

befindet sich auf Contig AAEX01050028 der NCBI Datenbank. Nach NCBI Angaben liegt

die Sequenz auf dem caninen Chromosom 18. Nach YANG et al. (1999) (Abb.3) teilt das

canine Chromosom 18 Homologien mit den humanen Chromosomen 7 und 11. Das humane

Survivin liegt auf HSA 17q25 (GENECARD Survivin), so dass hier auf Grundlage der

Diskussion

44

Datenbank keine Übereinstimmung bezüglich der chromosomalen Lokalisation verzeichnet

werden konnte.

Der genomische Contig AAEX01050028 aus der NCBI Datenbank umfasst lediglich die

kürzere Variante des caninen Survivin (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. AB180206,

AY741504 und NM_001003348). Mit der längeren Variante (Datenbank: NCBI, GenBank

Acc. Nos. AB095108, NM_001003019), welche dem humanen Survivin α (Datenbank:

NCBI, GenBank Acc. No. NM_001168) zu 98 % gleicht, gab es keine vollständige

Übereinstimmung. Die Homologien der einzelnen Exons der humanen Survivin Sequenz

(Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No. NM_001168, AB028869) im Vergleich zur caninen

Sequenz (Abb.19) betragen zwischen 76 % und 95 %. Die Homologien der Introns liegen

zwischen 23,8 % und 45,8 %. Im Durchschnitt sind die Introns zu 31,5 % homolog.

Die Charakterisierung der mRNA für das canine Survivin erfolgte, da eine PCR an cDNA

nicht erfolgreich war, als in silico Analyse mithilfe des Survivin Klons CFT-00328-P15F05

(Abb.6 im Anhang) aus der caninen cDNA-Bank des ZHG. In der NCBI Datenbank sind

inzwischen fünf canine Survivin mRNA Sequenzen veröffentlicht (Datenbank: NCBI,

GenBank Acc. Nos. AB095108, AY741504, NM_001003348, NM_001003019, AB180206).

Diese haben eine Länge von 591, 640 bzw. 1630 Basen. Der cDNA-Klon CFT-00328-P15F05

ist zu 99 % homolog zu den kürzeren Varianten des caninen Survivin (Datenbank: NCBI,

GenBank Acc. Nos. AY741504, NM_001003348, AB180206). Das canine Survivin aus

Abbildung 19 (Anhang im Anhang) ist außerdem zu 84 %, 73 %, 75 %, 91 % und 80 %

homolog zu den Survivin mRNA Sequenzen von Katze, Maus, Ratte, Rind und Schwein

(Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. NM_001009280, NM_009689, NM_022274,

NM_001001855, NM_214141).

Der Protein codierende Bereich geht bei allen verglichenen Proteinsequenzen (Katze, Maus,

Ratte, Rind, Schwein (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos. NM_001009280, NM_009689,

NM_022274, NM_001001855, NM_214141) jeweils über 428 Basen, so dass alle Varianten

ein Protein mit 142 Aminosäuren ausbilden. Die Homologie der einzelnen caninen Proteine

liegt zwischen 91,5 % und 99,3 %. Die Homologie zum Protein des Menschen (Datenbank:

NCBI, GenBank Acc. No. NM_001168) variiert im selben Bereich. Die Homologien des

Proteins bei Katze, Maus, Ratte, Rind und Schwein (Datenbank: NCBI, GenBank Acc. Nos.

NM_001009280, NM_009689, NM_022274, NM_001001855, NM_214141) liegen zwischen

84,3 % bei der Maus und 96,5 % bei der Katze im Vergleich zum Hund (Abb.20 im Anhang).

Diskussion

45

Die Proteinsequenzen des Hundes (Abb.20 im Anhang) und des Menschen (Datenbank:

NCBI, GenBank Acc. No. NM_001168) unterscheiden sich in zwölf Aminosäuren und

besitzen beide eine funktionelle BIR Domäne von Position 18 bis 88 (INTERPRO). Zwei

Aminosäureaustausche liegen innerhalb der funktionellen Domäne an Position 19 und 36.

Fehler im Apoptosesignalweg spielen bei der Tumorentstehung sowohl beim Hund als auch

beim Menschen eine Rolle. Unkoordiniertes, zeitliches und räumliches Wachstum entsteht

durch eine Veränderung der normalen Zellteilungsprozesse, z.B. durch die Hemmung

wichtiger Pro-Apoptose Proteine oder die verstärkte Expression von Anti-Apoptose Proteinen

(IGNEY u. KRAMMER 2002). Die Entwicklung neuer Tumortherapeutika findet bei der

Regulation dieser Proteine einen Ansatz. Sinnvoll wäre es, ein Gen bzw. Genprodukt in den

Mittelpunkt der Forschung zu nehmen, welches in einer Vielzahl von Tumoren wichtige

regulative Funktionen ausübt, so dass einzelne Medikamente in ein ‚multiagent’

Therapieregime integriert werden können (RASSNICK 2003) oder ein Therapieschema für

verschiedene Tumore über ein einzelnes Medikament entwickelt werden kann (NOLTE u.

NOLTE 2002).

Die große Ähnlichkeit im Stoffwechsel von Hund und Mensch bietet bei der Entwicklung von

Tumortherapeutika einige Vorteile. In der Vergangenheit wurden in der Humanmedizin

etablierte Tumortherapeutika einzeln oder in Kombination auch beim Hund angewendet

(HELFAND et al. 1994, FAN 2003, POULSON et al. 2004). Der Hund als spontanes

Tiermodell kann allerdings auch eigenständig für die Erprobung neuer Medikamente

verwendet werden (CHUN u. DE LORIMIER 2003). Aufgrund der Ähnlichkeiten im

Metabolismus zwischen Hund und Mensch wäre eine Übertragung der Ergebnisse auf den

Menschen wahrscheinlich mit ähnlich guten Ergebnissen möglich wie die derzeit

überwiegende Übertragung vom Menschen auf den Hund.

Die intensive Forschung im Bereich Apoptose und Apoptose-Mechanismen führte zur

Identifikation einer Reihe von Proteinen, die als Apoptose-Inhibitoren eine Rolle bei der

Tumorenstehung spielen könnten. Eines dieser Proteine ist Survivin (JAATTELA 1999).

Auch FASTK und AKT3 sind als Serine/Threonin-Kinasen am Apoptosestoffwechsel

beteiligt und deren Gene sind so mögliche Zielgene für die Tumortherapieforschung. Das

Verständnis der molekularen Mechanismen dieser Proteine kann die Forschungen zur

Sensitivierung von Tumorzellen gegenüber Chemotherapie und zur selektiven Behandlung

von Tumorzellen ohne Zerstörung des umgebenden Normalgewebes unterstützen

(JAATTELA 1999).

Diskussion

46

Insgesamt betrachtet wird die Charakterisierung tumorrelevanter Gene beim Hund zur

Entwicklung neuer Tumortherapeutika sowohl für den Menschen als auch für den Hund

beitragen. Die in dieser Arbeit untersuchten Gene zeigen sowohl in der mRNA als auch in der

Proteinsequenz eine hohe Homologie zu den entsprechenden Genen des Menschen. Die

Entwicklung und Erprobung von auf den Informationen zu diesen Genen beruhenden

Therapeutika für den Hund, lassen sich mit hoher Wahrscheinlichkeit gut auf den Menschen

übertragen und umgekehrt. Die Durchführung von Expressionsstudien z.B. an Tumorproben

aus den beim Menschen bekanntermaßen AKT3, FASTK und/oder Survivin exprimierenden

Geweben und auch an Normalgewebe könnte diese These noch untermauern und eine noch

genauere Vorhersage über die Eignung dieser Gene als Targetgene für die

Tumortherapieforschung ermöglichen. Die bisherigen Ergebnisse lassen speziell für AKT3

eine positive Prognose zu.

Zusammenfassung

47

6. Zusammenfassung

Janina Meyer

Klonierung und Charakterisierung Apoptose-assoziierter Gene des Hundes

Bereits seit langem werden Tiermodelle zur Erforschung der Grundlagen menschlicher

Krankheiten eingesetzt. Im Falle der Tumorenstehung bietet das spontane Tiermodell Hund

Vorteile gegenüber dem Nagetiermodell. Der Hund zeigt mit dem Menschen vergleichbare

Eigenschaften in Physiologie und Stoffwechsel bei den meisten Organsystemen und auch im

Medikamentenstoffwechsel. Das Vorkommen von Tumoren beim Hund, doppelt so häufig

wie beim Menschen, mit Ähnlichkeiten in Phänotyp, Histologie und Biologie sowie die

natürliche Entstehung bieten Vorteile gegenüber induzierten Tumoren im Nagetiermodell.

Die Charakterisierung Apoptose-assoziierter Gene des Hundes kann eine wichtige Rolle bei

der Entwicklung neuer Tumortherapeutika spielen, da die Mechanismen der Tumorentstehung

bei Mensch und Hund ähnlich sind.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei beim Menschen bekanntermaßen in den

Apoptosesignalweg involvierte Gene für den Hund näher untersucht und charakterisiert. Für

die Gene Protein Kinase B gamma, FAS-activated Serin/Threonin-Kinase und Survivin

wurden jeweils die genomische Sequenz, die mRNA-Sequenzen und die Proteinsequenzen

beim Hund analysiert und mit den Sequenzen des Menschen verglichen. Soweit vorhanden

wurde auch ein Vergleich mit den Sequenzen anderer Säugetierspezies durchgeführt. Für

Protein Kinase B gamma und FAS-activated Serin/Threonin Kinase wurden außerdem die

chromosomale Lokalisation und ein BAC Klon aus der BAC-Bank des DogMap Konsortiums

bestimmt.

Für Protein Kinase B gamma (AKT3) wurde ein cDNA Klon aus der caninen cDNA-Bank

des Zentrums für Humangenetik und ein BAC Klon aus der BAC-Bank des DogMap

Konsortiums ermittelt. Außerdem wurde die Lokalisation des Gens auf CFA 7q17 festgelegt.

Mehrere Contigs aus der NCBI Datenbank enthalten Teile der genomischen DNA-Sequenz

von AKT3. Anhand dieser Sequenzen wurden mRNA und Proteinsequenzen für das canine

AKT3 abgeleitet und mit dem Menschen verglichen. Die Homologie der mRNA liegt bei

88 % bzw. 93 % für die humanen Transkriptvarianten. Die Homologie der Proteine beträgt

98,7 %.

Zusammenfassung

48

Für die FAS-activated Serin/Threonin-Kinase (FASTK) wurden ebenfalls ein cDNA Klon

und ein BAC Klon ermittelt. Die chromosomale Lokalisation wurde auf CFA 16q14

festgelegt. In der NCBI Datenbank gibt es einen Contig mit der genomischen Sequenz von

FASTK. Die abgeleitete mRNA ist zu 90 % bzw. 89 % identisch mit den humanen

Transkriptvarianten. Die Homologie der Proteine beträgt 93,8 % bzw. 94,9 %.

Für das canine Survivin befindet sich ein cDNA Klon in der cDNA-Bank des Zentrums für

Humangenetik. In der NCBI Datenbank gibt es einen Contig mit der caninen genomischen

Sequenz von Survivin. Die daraus abgeleitete mRNA und Proteinsequenz wurde sowohl mit

bereits bekannten caninen Sequenzen als auch mit humanen verglichen und wären zu 91,5 %

bis 99,3 % homolog.

Die Entwicklung und Erprobung von auf den Informationen zu diesen Genen beruhenden

Tumortherapeutika für den Hund, lassen sich mit hoher Wahrscheinlichkeit gut auf den

Menschen übertragen und umgekehrt.

Summary

49

7. Summary

Janina Meyer

Cloning and characterization of canine apoptosis associated genes

Already for a long time animal models have been used for the investigation of the etiology of

human diseases. The dog shows comparable characteristics with humans in physiology and

metabolism in most organ systems as well as in the drug metabolism. The occurrence of

tumours in dogs, twice as frequently as in humans, with similarities in phenotype, histology

and biology as well as the natural development offer advantages compared to induced

tumours in the rodent model system.

The characterisation of apoptosis-associated genes of the dog may play an important role in

the development of new tumour therapeutics, since the mechanisms of the tumour

development are similar with humans.

In the context of this thesis three genes well-known to be involved in the apoptotic pathway in

humans were examined in detail and characterized for the dog. For the genes protein kinase B

gamma, FAS-activated serine/threonine kinase and Survivin in each case the genomic

sequence, the mRNA sequences and the protein sequences were analyzed for the dog and

compared with the human sequences. When available, sequences of other mammal species

were compared. In addition to protein kinase B gamma and the FAS-activated

serine/threonine kinase the chromosomal localization and a BAC clone from the BAC-library

of the DogMap consortium were assessed.

For protein kinase B gamma (AKT3) a cDNA clone from the canine cDNA-library of the

centre for human genetics and a BAC clone from the BAC -library of the DogMap

consortium were determined. Furthermore, the localization of the gene was specified on CFA

7q17. Several Contigs from the NCBI data base contain parts of the genomic DNA sequence

of AKT3. On the basis of these sequences, mRNA and protein sequences for the canine

AKT3 were derived and compared with human. The homology of mRNA is 88 % and 93 %

for the human transcriptvariants. The homology of the proteins amounts to 98,7 %.

For FAS-activated serine/threonine kinase (FASTK), a cDNA clone and a BAC clone was

determined likewise. The chromosomal localization was specified on CFA 16q14. In the

NCBI data base there is one Contig with the genomic sequence of FASTK. The derived

Summary

50

mRNA is to 90 % and 89 % identical to the human transcript variants. The homology of the

proteins amounts to 93,8 % and 94,9 % respectively.

For the canine Survivin, a cDNA clone is in the canine cDNA-library of the centre for human

genetics. In the NCBI data base there is one Contig with the canine genomic sequence of

Survivin. From it the derived mRNA and protein sequence were compared both with already

well-known canine sequences as well as with humans and they were about 91,5 % to 99,3 %

similar.

The development and testing of tumour therapeutics for the dog based on this genetic

information can with high probability be transferred to humans.

Literaturverzeichnis

51

8. Literaturverzeichnis 8.1 Literaturverzeichnis

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and colon.

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62

8.2 Im Rahmen dieser Arbeit entstandene Veröffentlichungen

MEYER, J., H. MURUA ESCOBAR, S. BARTNITZKE, C. SCHELLING, G. DOLF,

I. NOLTE u. J. BULLERDIEK (2004):

The FAS-activated serine/threonine kinase gene maps to canine chromosome 16.

Anim. Genet. 35(6), 497

MEYER, J., H. MURUA ESCOBAR, R. NIMZYK, I. NOLTE u. J. BULLERDIEK

The canine protein kinase B, gamma (AKT3) and the canine FAS-activated serine/threonine

kinase (FASTK).

J. Hered. (eingereicht)

MURUA ESCOBAR, H., J. MEYER, S. WINKLER, C. SCHELLING, G. DOLF, I. NOLTE

u. J. BULLERDIEK (2004):

The protein kinase B, gamma (AKT3) gene maps to canine chromosome 7.

Anim. Genet. 35(4), 354-355

MEYER, J., H. MURUA ESCOBAR, R. NIMZYK, J. BULLERDIEK u. I. NOLTE

Reevaluation of canine survivin mRNA-sequence data.

in preparation

Anhang

63

9. Anhang

Im den folgenden Seiten sind die caninen und humanen Sequenzen aufgeführt, die bisher

nicht in der NCBI Datenbank veröffentlicht wurden.

9.1. Klone aus der caninen cDNA-Bank des Zentrums für Humangenetik

TTTTTGACTTCCAAGATTGTAAAATTACCTCTTAAAGTTGCTAGAATAGTAAGACAGTAGCA

GCAGCAGCATGAGACCGTAGACGGAGATACAATTTCATGCAAAAACAAACAAGTGTGTTTGC

GTACATGTGTGTTCTTGTGGGGGTGAGAGTGGGCTGGGGTGTCTGGAGGCGCTCCTGCTTTG

TAAGAGCTACGACTGCTGTGATGTCCAGGAATCGTCTTCAGGAAGAAATCTGGGATGACAGT

GAAGGAGCAGAACGAGGGCCTTACTCCCGGCCGCTGGCGGAGTAGGAGAACTGAGGGAAGTG

CGGCCGCCGCTCGTTGTCCACGCAGTCCATACCGTCCTCGTCATACTTTTCAGGTGGTGTTA

TTGTAATAGTCTGCGCTGTAAATTCTTCATCGAAATATCTGGTATCTGTCTCAGATGTTACT

TGAGGCTTAAAAGGAGGTACAAGCTTTTTATCGTATACATCTTGCCAATTGACTCCAGAGAA

GAAACTGTGCCTCATAATTTCTTTTGCATCATCTGGGCCCCCGCCAAGGCGTTTATTTGGAT

CCTTTATCAAGAGCCCCGAAAGCAATGATTTTGCATCTGAAGAGAGTGTTCGAGGGAATTTT

AATGTCTTCCATTAGTATTAGTTCAAAAAGCTTCTCATGATCCTGATTGTAGAAAAGGTAAC

CTCCCCACACATCATTTCATACATGACGACCCCCAGTCCCCCCCAATCCACGGCTTCGGCCA

TATCATTGGCTTCTAACACCTTTGGTGCCCAGATACTTTGGTGGGCCACAAG

Abb.4: CFT-01884-P09A05: Klon zu AKT3

TTTTTGGGGAAAGAAAGGGACTTTAATGAGAAATCAAAATATAGAGAGCCAAAGTGCAAATT

GTCCACCCCCTTTGGGGGTCACCCTGAGCCCCATGTACATTCCCTTACCCCCCTTTAAGCCC

CCAACGGAGGCCCAAGGGCTGGAGCTTCTGCCTCAAGTAGCTTTTGAGCTGTGGCAGGCCTT

TTTGTGACTCCAGTTCCTCGAAAGGTAACGGCAGGAGCTGGTAGCCCATTAAGCCCAAGTGC

CGCTCCCGGAGGGCCCGGGAGCCCAACAACACTTGGCCATCCCGGCAGAAATGCCAGCGTTC

TTGCAGCATCAACACCACCCTTTGGGCGGGGTCATGGGTAGTGGACTGAGAAGCAACCTGGC

CCTGGGGACAGGACCGGGGAGGGTACCGTAGGAAAGGGTCCTGGGTCCTCACAGGAAGCACA

ACACCGGAGCTGCTGACGCAAAACAAGAAGTCTGTGCAGTAGCTCGTGC

Abb.5: CFT-01522-P118C12: Klon zu FASTK

Anhang

64

TTTTTAAAGAGAGAACCGGTCACTGTACTCGCAGCACCAGCCGCACAGAGAGAAGTCGCCCC

TGGCGCCACTTTCAAGAAGAAAACAGAAGTATAGTTTAACATTCTAATTTTGAATTGTGGCC

GTTCTCCTTTCCTAAGGCACAGTGAAGGGGTCCCCAGCAGAGCTGGTCACACTGAGGAGTGC

ACCCCAGTGATGGCACGTTCTTCTTGGGGACCAGCATGCCGCACAGGAGCTATTCTGCGGCG

GCCAGCTGCTCAATGGCACAGCGCACTTTCTTTGCGGTCTCTTCGAATTCTTTCTGCTTGTT

GTTGGTTTCCTTTGCAATTTTGTTCTTGGCTCTTTCTTTGTCCAGTTTCAAAAATTCACTGA

GGGTTAATTCTTCAAATGCTTCTTGACAGAAAGGAAAGCACAACCAGATGAATGTTTTTTAT

GCTCCTCTATAGGGTCATCATCTGGCTCCCAGCCTTCCAGCTCCTTGAAGCAGAAGAAACAC

TGGGCCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGTGGGACAGTGGATGAAGCCGGCCTCTGCCATCCGGTC

CGGGGTGCAGGCGCAGCCCTCCAGGAACGGCCAGTTCTTGAACGTAGAGACGCGGTGGTCCT

TGAGGTAGAGCTGCCAGGCGGGGGGCAGCGACGAAGCGCCCATCCCGCCGCCGCCACAGCAG

AGCGCGGCCCGATTCAAACCCGAGGGTTGGCGGCTCGTGC

Abb.6: CFT-00328-P15F05: Klon zu Survivin

Anhang

65

9.2 Teile caniner mRNAs hergestellt durch PCR an cDNA aus ZMTH3

ATGACGAGGACGGTATGGACTGCGTGGACAACGAGCGGCGGCCGCACTTCCCTCAGTTCTCC

TACTCCGCCAGCGGCCGGGAGTAAGGCCCTCGTTCTGCTCCTTCACTGTCATCCCAGATTTC

TTCCTGAAGACGATTCCTGGACATCACAGCAGTCGTAGCTCTTACAAAGCAGGAGCGCCTCC

AGACACCCCAGCCCACTCTCACCCCCACAAGAACACACATGTACGCAAACACACTTGTTTGT

TTTTGCATGAAATTGTATCTCCGTCTACGGTCTCATGCTGCTGCTGCTACTGTCTTACTATT

ACGACGACGACGATGACAGA

CTAGCAACTTTAAGAGGTAATTTTACAATCTTTGGAAGTCATGAGCCCACCATTGTTCATTT

GTGCACCAA

Abb.7: Sequenz mit 381 Basen nach PCR an caniner cDNA aus ZMTH3

ATGACGAGGACGGTATGGACTGCGTGGACAACGAGCGGCGGCCGCACTTCCCTCAGTTCTCCTACTCC

GCCAGCGGCCGGGAGTAAGGCCCTCGTTCTGCTCCTTCACTGTCATCCCAGATTTCTTCCTGAAGACG

ATTCCTGGACATCACAGCAGTCGTAGCTCTTACAAAGCAGGAGCGCCTCCAGACACCCCAGCCCACTC

TCACCCCCACAAGAACACACATGTACGCAAACACACTTGTTTGTTTTTGCATGAAATTGTATCTCCGT

CTACGGTCTCATGCTGCTGCTGCTACTGTCTTACTATTCTAGCAACTTTAAGAGGTAATTTTACAATC

TTTGGAAGTCATGAGCCCACCATTGTTCATTTGTGCACCAGTTGTCATCTTTCGATCTTTTAGTTTTT

GTTTTTCCCTAACAGTGAAGGCTAAtctcATKtAGATACACTGATTCTAGGTACATTTTTTAACTTTC

TAGAAGATAAATCAAAAACTAATTAGACTAAGAAGATTTAGTTTATAATTCAGAACAAACAATTGTGG

CAGGGTGGTGATGTGCATATGCAGAATTTTAGGAAGGCACAGGAGATCAGTGCGTACCATGGGGATCT

CGCACCCAGACCTGGCCGGAATCCATAGGGAAGCATCTGAGAGAAGGACCGAACAACTGTTGAGCTAG

AGCGATAGATACACACGTAGTCCCTGTTGGACACTGCTGAGGAAGCCCGCTATTCCACCTGGACATCC

AGATTTCACGGGCGGTCGTTGGCAAGATGAACACTGTTCTTCCAGGGAAGGAGGCATATGCACAGCAG

AGGCAAGGTCGCTTACAGGCTCTATGACACGATTTGCACCAGAGAGCATTcCCCCCCCCAACCCCCAC

CCCGTGCTTGGAAACCTTTTTCCCTTCTTGATATTTATCACCTCTGATGGCTGAAGAATGTAGACAGG

TATAATGATCCTGCTTTTCACCAAAATTCGTACACCAAGGTAAACAGGTGTTTGCCTTATTTGTTTTA

AGTTTTGACTTTCAGTTCTTCGTGGATTAGCTTTTTCTCGGATGTTAAACCTTTGAATGTCCTTTTAT

GATTTTGTTTATATTGCAGTAGTATTTATTTCTTAGTGAAGARAAATTGTGTGTCATGTTAGCAAATG

CAGCTCCAACTTACATGAACTAGACTCACTGCAGTTTATTTTGACCCATGTGCAAGGAATGTACACGC

CAATGAGAATCATGCACTTTTTCTCCTTTGTAACAAAATCTGATGAGGCTCTGAAATTGTACATATTG

GTTAGAATTTGGCTTTGGG AAC

CAATCTTAAACCGAAACCC

Abb.8: Sequenz mit 1311 Basen nach PCR an caniner cDNA aus ZMTH3

Anhang

66

GGTGGCTAGCCGATGAGGAGGCCGCGGGGGGAGCCCGGCTCCCGGGCCCCGAGACCGACTGA

GGGAGCGACCTGCGCGGGGCCTGGGGAGCCATGGTCTCCATCACCCAACTCCATGCTTCGAC

CCCTGCTCTCTGCCCAGGCCTCTGCTGCTCGGCTGTCTGGCCTGCTGCTGCTCCCGCCAGTA

CAGCCCTGCTGTCTGGGGCCCAGCAAGTGGGGGGACCAGCCTCCTGGAGGAGGCCTCCATGC

AGGCCCCGTGCAGGGGCTACAGCGGCTTCTGGAACAGGCGAGGAGCCCTGGGGAGCTGCTGC

GTTGGCTGGGCCAGAACCCCACCAAGGTGCGCGCCCATCACTACCCTGTGGCACTTCGTCGT

CTGGGTCAGCTCTTGGGGTCTCAGCCACGGCCCCCTCCCGTGGAGCAGCCACACTACAGGAC

TTGACCGCTCATCATCCGAAACTGCCCCTCCT

AGTAGTAGGCTTTGACGGGGAGGA

Abb.9: Sequenz des caninen FASTK aus einer PCR an cDNA aus ZMTH3 und einer Länge

von 466 Basen.

CCAGGGCCAGGTTGCTTCTCAGTCCACTACCCATGACCCCGCCCAAAGGGTGGTGCTGATGC

TGCGAGAACGCTGGCATTTCTGCCGGGATGGCCAAGTGCTGCTGGGCTCCCGGGCCCTCCGG

GAGCGGCACCTGGGCCTGATGGGCTACCAGCTCCTGCCGCTACCCTTCGAGGAACTGGAGTC

ACAGAGAGGCCTGCCACAGCTCAAAAGC

CGGACGGTGTCGAGTTTTCG

Abb10: Sequenz des caninen FASTK aus einer PCR an cDNA aus ZMTH3 und einer Länge

von 214 Basen.

Anhang

67

9.3. Canine mRNAs abgeleitet aus den genomischen Contigs der NCBI Datenbank und

die dazugehörigen Proteinsequenzen GCAGCAGCAGAGAATCCAAACCCCAAAGCTGATACCACAAAGTAGCATTTCTCCAAGTTGGGGGCTCAGAGGGGAGCCAT

CATGAGCGATGTTACCGTTGTGAAAGAAGGCTGGGTTCAGAAGAGG

GGAGAATATATAAAAAACTGGAGGCCAAGATATTTCCTTTTGAAGACAGATGGCTCATTCATAGGATATAAAGAGAAACCTCAAGATGTGGATTTACCTTATCCCCTCAA

AATGCCAGTTAATGAAAACAGAACGACCAAAGCCAAACACATTTATTATCAGATGTCTCCAGTGGACCACTGTTATAGAGAGAACATTTCATGTAGATACTCCAGAGGAA

GGAAGAGTGGACAGAAGCTATTCAGGCGGTAGCAGACAGACTTCAGAGACAAGAAGAGGAGAGAATGAATTGTAGTCCAACTTCACAAATTGATAATATAGGGGAGGAAG

ACAATGAATGATTTTGACTATTTGAAACTACTAGGTAAAGGCACTTTTGGGAAAGTTATTTTGGTTCGAGAGAAGGCAAGTGGGAAATACTATGCTATGAAGATTCTGAA

GATGAAGTGGCACATACTCTAACGGAAAGCAGAGTGTTAAAGAACACTCGACACCCCTTTTTAACA

TCCTTGAAATATTCCTTCCAGACAAAAGACCGTTTGTGTTTTGTGATGGAATATGTTAATGGGGGAGAG

CTGTTTTTCCATTTGTCGAGAGAGCGGGTGTTCTCCGAGGACCGCACACGTTTCTATGGTGCAGAAATTGTCTCTGCCTTGGACTATCTACATTCCGGAAAGATTGTGTA

TTACTACACAGTTGGAGAATTTGATGCTGGATAAAGATGGCCACATAAAAATTACAGATTTTGGACTTTGCAAAGAAGGGATTACAGATGCAGCCACCATGAAGACATTC

GTGTTAGAAGACAATGACTATGGCCGAGCCGTGGATTGGTGGGGACTGGGGGTCGTCATGTATGAAATGATGTGTGGGAGGTTACCTTTCTACAATCAGGATCATGAGAA

CCTTGGCGGGGGCCCAGATGATGCAAAAGAAATTATGAGGCACAGTTTCTTCTCTGGAGTCAATTGGCAAGATGTATACGATAAAAAG

CTTGTACCTCCTTTTAAGCCTCAAGTAACATCTGAGACAGATACCAGATATTTCGATGAAGAATTTACAGCGCAGACTATTACAATAACACCACCTGAAAAGT

ATGACGAGGACGGTATGGACTGCGTGGACAACGAGCGGCGGCCGCACTTCCCTCAGTTCTCCTACTCCGCCAGCGGCCGGGAGTAAGGCCCTCGTTCTGCTCCTTCACTG

TAATTTTACAATCTTTGGAAGTCATGAGCCCACCATTGTTCATTTGTGCACCAGTTGTCATCTTTCGATCTTTTAGTTTTTGTTTTTCCCTAACAGTGAAGGCTAATCTC

GAAGGACCGAACAACTGTTGAGCTAGAGCGATAGATACACACGTAGTCCCTGTTGGACACTGCTGAGGAAGCCCGCTATTCCACCTGGACATCCAGATTTCACGGGCGGT

TACACCAAGGTAAACAGGTGTTTGCCTTATTTGTTTTAAGTTTTGACTTTCAGTTCTTCGTGGATTAGCTTTTTCTCGGATGTTAAACCTTTGAATGTCCTTTTATGATT

GGAGAAGAGATGCTGGCACTGAACCCCTTGGTGCTCAAAGTGAGAAAATCCCCAGGTCTCCGTGCTGAGGGGTTAAGGAGATGGAAGGATGGAAGGATGTTGCTGTTGCT

AAGAACACCTCCAACTTTTCTTTTTCTGTATATACTCATGTCCCCAGATTCCAACATTTCTCACTGAAAGGGGACATGTATGCAAACCTCATCTTTCTCCTTCATTAATG

AGATGTCTTAGCCTCGGACGCTGGAGTGTGGATCTGTAGACGAGACACCACTGCTGGCGGTGGGCAGGCCACTGGGACTGACGGGGGTCAAAGGGCATTTTACTAAGGCA

Abb.11: Canine mRNA von AKT3 Transkriptvariante 1 aufgeteilt in 13 Exons

Anhang

68

GCAGCAGCAGAGAATCCAAACCCCAAAGCTGATACCACAAAGTAGCATTTCTCCAAGTTGGG

GGCTCAGAGGGGAGCCATCATGAGCGATGTTACCGTTGTGAAAGAAGGCTGGGTTCAGAAGA

GGGGAGAATATATAAAAAACTGGAGGCCAAGATATTTCCTTTTGAAGACAGATGGCTCATTC

ATAGGATATAAAGAGAAACCTCAAGATGTGGATTTACCTTATCCCCTCAACAACTTTTCAGT

GGCAAAATGCCAGTTAATGAAAACAGAACGACCAAAGCCAAACACATTTATTATCAGATGTC

TCCAGTGGACCACTGTTATAGAGAGAACATTTCATGTAGATACTCCAGAGGAAAGGGAAGAG

TGGACAGAAGCTATTCAGGCGGTAGCAGACAGACTTCAGAGACAAGAAGAGGAGAGAATGAA

TTGTAGTCCAACTTCACAAATTGATAATATAGGGGAGGAAGAGATGGATGCTTCCACAACCC

ATCATAAAAGAAAGACAATGAATGATTTTGACTATTTGAAACTACTAGGTAAAGGCACTTTT

GGGAAAGTTATTTTGGTTCGAGAGAAGGCAAGTGGGAAATACTATGCTATGAAGATTCTGAA

GAAAGAAGTGATTATTGCAAAGGATGAAGTGGCACATACTCTAACGGAAAGCAGAGTGTTAA

AGAACACTCGACACCCCTTTTTAACATCCTTGAAATATTCCTTCCAGACAAAAGACCGTTTG

TGTTTTGTGATGGAATATGTTAATGGGGGAGAGCTGTTTTTCCATTTGTCGAGAGAGCGGGT

GTTCTCCGAGGACCGCACACGTTTCTATGGTGCAGAAATTGTCTCTGCCTTGGACTATCTAC

ATTCCGGAAAGATTGTGTACCTTACTACACAGTTGGAGAATTTGATGCTGGATAAAGATGGC

CACATAAAAATTACAGATTTTGGACTTTGCAAAGAAGGGATTACAGATGCAGCCACCATGAA

GACATTCTGTGGCACACCAGAGTATCTGGCACCAGAGGTGTTAGAAGACAATGACTATGGCC

GAGCCGTGGATTGGTGGGGACTGGGGGTCGTCATGTATGAAATGATGTGTGGGAGGTTACCT

TTCTACAATCAGGATCATGAGAAGCTTTTTGAACTAATACTAATGGAAGACATTAAATTCCC

TCGAACACTCTCTTCAGATGCAAAATCATTGCTTTCGGGGCTCTTGATAAAGGATCCAAATA

AACGCCTTGGCGGGGGCCCAGATGATGCAAAAGAAATTATGAGGCACAGTTTCTTCTCTGGA

GTCAATTGGCAAGATGTATACGATAAAAAGCTTGTACCTCCTTTTAAGCCTCAAGTAACATC

TGAGACAGATACCAGATATTTCGATGAAGAATTTACAGCGCAGACTATTACAATAACACCAC

CTGAAAAGTGTCAGCAATCAGATTGTCGCATGCTGGGTAACTGGAAAAAAAAAAAAAAATCG

GCTTCCTACAGCACACTCACCCCTGGAAATGTAGGCTTTGGATTAAATTTAGAGTTGCACAA

CTACCCAGAACTGTTCTGGAAAGAAGTTGAATGTGTCAGGCACCCTTCCTCACTGACCAAAG

GCACCGTTGCACCCAGGCATCCCTATTTTCACAAAGAAAGGATTTTAAAAGCTGAGATGTAT

TTCAAACTCCAGGCTAC

Abb.12: Canine mRNA von AKT3 Transkriptvariante 2

Anhang

69

MSDVTVVKEGWVQKRGEYIKNWRPRYFLLKTDGSFIGYKEKPQDVDLPYPLNNFSVAKCQLM

KTERPKPNTFIIRCLQWTTVIERTFHVDTPEEREEWTEAIQAVADRLQRQEEERMNCSPTSQ

IDNIGEEEMDASTTHHKRKTMNDFDYLKLLGKGTFGKVILVREKASGKYYAMKILKKEVIIA

KDEVAHTLTESRVLKNTRHPFLTSLKYSFQTKDRLCFVMEYVNGGELFFHLSRERVFSEDRT

RFYGAEIVSALDYLHSGKIVYLTTQLENLMLDKDGHIKITDFGLCKEGITDAATMKTFCGTP

EYLAPEVLEDNDYGRAVDWWGLGVVMYEMMCGRLPFYNQDHEKLFELILMEDIKFPRTLSSD

AKSLLSGLLIKDPNKRLGGGPDDAKEIMRHSFFSGVNWQDVYDKKLVPPFKPQVTSETDTRY

FDEEFTAQTITITPPEKYDEDGMDCVDNERRPHFPQFSYSASGRE

Abb.13: Proteinsequenz für das canine AKT3 Transkriptvariante 1 mit 479 Aminosäuren

MSDVTVVKEGWVQKRGEYIKNWRPRYFLLKTDGSFIGYKEKPQDVDLPYPLNNFSVAKCQLM

KTERPKPNTFIIRCLQWTTVIERTFHVDTPEEREEWTEAIQAVADRLQRQEEERMNCSPTSQ

IDNIGEEEMDASTTHHKRKTMNDFDYLKLLGKGTFGKVILVREKASGKYYAMKILKKEVIIA

KDEVAHTLTESRVLKNTRHPFLTSLKYSFQTKDRLCFVMEYVNGGELFFHLSRERVFSEDRT

RFYGAEIVSALDYLHSGKIVYLTTQLENLMLDKDGHIKITDFGLCKEGITDAATMKTFCGTP

EYLAPEVLEDNDYGRAVDWWGLGVVMYEMMCGRLPFYNQDHEKLFELILMEDIKFPRTLSSD

AKSLLSGLLIKDPNKRLGGGPDDAKEIMRHSFFSGVNWQDVYDKKLVPPFKPQVTSETDTRY

FDEEFTAQTITITPPEKCQQSDCRMLGNWKKKKKSASYSTLTPGNVGFGLNLELHNYPELFW

KEVECVRHPSSLTKGTVAPRHPYFHKERILKAEMYFKLQA

Abb.14: Proteinsequenz für das canine AKT3 Transkriptvariante 2 mit 536 Aminosäuren

GATTGGCGTCCGGGCCGCGGTCCGGGGGTTGCTGGGAAGATGGCGGACTCGGTGGCCTGCCGATGAGGAGGCCGCGGGGGGAGCCCG

GGTCTCCATCACCCAACTCCATGCTTCGACTCCTGCTCTCTGCCCAGGCCTCTGCTGCTCGGCTGTCTGGCCTGCTGCTGCTCCCGC

TGTGGCACTTCGTCGTCTGGGTCAGCTCTTGGGGTCTCAGCCACGGCCCCCTCCCGTGGAGCAGGCCACACTACAGGACTTGAGTCA

GCTTCCCATCAGATGGGCCCCTGATGTGTGCCCTGGAGCAGGAGAGAAGGTTTCGCCTCCCTCCGAAGCCACCTCCCACCCTGCAAC

AGGCCAGGCCAGAGGAACTGACTCCTCACGTCATGGTGCTCCTGGCCCAGCACCTGGCCCGGCACCGGTTGCGGGAGCCCCAGCTTC

GTGGTACAGAAGTTGGTCCTGCCCTTTGGGCGGCTGAACTACTTGCCTCTGGAACAGCAGTTTATGCCCTGTCTTGAGAGGATCCTG

GCACTCCTCATGCCTTCATTGTGCGGCGCTACCTCTCCCTGCTAGACACGGCTGTGGAGCTGGAGCTTCCAGGATACCGGGGTCCCC

TCACAAGGATATAGTAGCGGAGGGGCTGCGCCAGCTGCTGGGGGAAGAAAAGTACCGGCAGGACCTGACGGTGCCTCCAGGCTACTG

ACTTCCTGCTCTGCGTCAGCAGCTCCGGTGCTGTGCTTCCTGTGAGGACCCAGGACCCCTTCCTACCGTACCCTCCCCGGTCCTGTC

CAGGGTGGTGCTGATGCTGCGAGAACGCTGGCATTTCTGCCGGGATGGCCAAGTGCTGCTGGGCTCCCGGGCCCTCCGGGAGCGGCA

CTACCCTTCGAGGAACTGGAGTCACAGAGAGGCCTGCCACAGCTCAAGAGCTACCTGAGGCAGAAGCTCCAGGCCTTGGGCCTCCGC

AAAGTCCCTTTCTTTCCCC

Anhang

70

Abb.15: Canine mRNA von FASTK Transkriptvariante 1 aufgeteilt in 10 Exons

Anhang

71

GATTGGCGTCCGGGCCGCGGTCCGGGGGTTGCTGGGAAGATGGCGGACTCGGTGGCCTGCCGATGAGGAGGCCGC

GGGGGGAGCCCGGCTCCCGGGCCCCGAGACCGACTGAGGGAGCGACCTGCGCGGGGCCTGGGGAGCCATGCTTCC

CATCAGATGGGCCCCTGATGTGTGCCCTGGAGCAGGAGAGAAGGTTTCGCCTCCCTCCGAAGCCACCTCCCACCC

TGCAACCTGTCCTGCACGGTGGGCAAAGATTGGAAGCTGCTCTGAGCTGCCCTCATTTCCTGAGGCGTCCACGGC

AGCACCTCATCCGCAGCCTGGCAGAGGCCAGGCCAGAGGAACTGACTCCTCACGTCATGGTGCTCCTGGCCCAGC

ACCTGGCCCGGCACCGGTTGCGGGAGCCCCAGCTTCTGGAAGCCATTGCCCATTTCCTGGTGGTCCAGGAAGCCC

AGCTCAGCAGCAAGGTGGTACAGAAGTTGGTCCTGCCCTTTGGGCGGCTGAACTACTTGCCTCTGGAACAGCAGT

TTATGCCCTGTCTTGAGAGGATCCTGGCTCGG

GAAGCAGGGGTGGCCCCCCTGGCCACTGTCAACATCTTGATGTCACTGTGCCAGCTGCGGTGCCTACCCTTCCGA

GCTCTGCACTTTGTCTTTTCCCCAGGCTTCATCAACCACATCAGTGGCACTCCTCATGCCTTCATTGTGCGGCGC

TACCTCTCCCTGCTAGACACGGCTGTGGAGCTGGAGCTTCCAGGATACCGGGGTCCCCGTCTTCCCCGAAGGCAG

CAAGTGCCCATCTTCCCCCAGCCACTCATCACTGACCGTGCCCGCTGCAAGTACAGTCACAAGGATATAGTAGCG

GAGGGGCTGCGCCAGCTGCTGGGGGAAGAAAAGTACCGGCAGGACCTGACGGTGCCTCCAGGCTACTGCACAGAC

TTCCTGCTCTGCGTCAGCAGCTCCGGTGCTGTGCTTCCTGTGAGGACCCAGGACCCCTTCCTACCGTACCCTCCC

CGGTCCTGTCCCCAGGGCCAGGCTGCCTCTCAGTCCACTACCCATGACCCCGCCCACAGGGTGGTGCTGATGCTG

CGAGAACGCTGGCATTTCTGCCGGGATGGCCAAGTGCTGCTGGGCTCCCGGGCCCTCCGGGAGCGGCACCTGGGC

CTGATGGGCTACCAGCTCCTGCCGCTACCCTTCGAGGAACTGGAGTCACAGAGAGGCCTGCCACAGCTCAAGAGC

TACCTGAGGCAGAAGCTCCAGGCCTTGGGCCTCCGCTGGGGGCCTGAAGGGGGGTGAGGGGATGTACATGGGGCT

CAGGGTGACCCCCAAAGGGGGTGGACAATTTGCACTTTGGCTCTCTATATTTTGATTTCTCATTAAAGTCCCTTT

CTTTCCCC

Abb.16: Canine mRNA von FASTK Transkriptvariante 4

MRRPRGEPGSRAPRPTEGATCAGPGEPWSPSPNSMLRLLLSAQASAARLSGLLLLPPVQPCC

LGPSKWGDQPPGGGLHAGPVQGLQRLLEQARSPGELLRWLGQNPTKVRAHHYPVALRRLGQL

LGSQPRPPPVEQATLQDLSQLIIRNCPSFDIHTIHVCLHLAVLLGFPSDGPLMCALEQERRF

RLPPKPPPTLQPVLHGGQRLEAALSCPHFLRRPRQHLIRSLAEARPEELTPHVMVLLAQHLA

RHRLREPQLLEAIAHFLVVQEAQLSSKVVQKLVLPFGRLNYLPLEQQFMPCLERILAREAGV

APLATVNILMSLCQLRCLPFRALHFVFSPGFINHISGTPHAFIVRRYLSLLDTAVELELPGY

RGPRLPRRQQVPIFPQPLITDRARCKYSHKDIVAEGLRQLLGEEKYRQDLTVPPGYCTDFLL

CVSSSGAVLPVRTQDPFLPYPPRSCPQGQAASQSTTHDPAHRVVLMLRERWHFCRDGQVLLG

SRALRERHLGLMGYQLLPLPFEELESQRGLPQLKSYLRQKLQALGLRWGPEGG

Abb.17: Canine Proteinsequenz von FASTK Transkriptvariante 1

Anhang

72

MRRPRGEPGSRAPRPTEGATCAGPGEPCFPSDGPLMCALEQERRFRLPPKPPPTLQPVLHGG

QRLEAALSCPHFLRRPRQHLIRSLAEARPEELTPHVMVLLAQHLARHRLREPQLLEAIAHFL

VVQEAQLSSKVVQKLVLPFGRLNYLPLEQQFMPCLERILAREAGVAPLATVNILMSLCQLRC

LPFRALHFVFSPGFINHISGTPHAFIVRRYLSLLDTAVELELPGYRGPRLPRRQQVPIFPQP

LITDRARCKYSHKDIVAEGLRQLLGEEKYRQDLTVPPGYCTDFLLCVSSSGAVLPVRTQDPF

LPYPPRSCPQGQAASQSTTHDPAHRVVLMLRERWHFCRDGQVLLGSRALRERHLGLMGYQLL

PLPFEELESQRGLPQLKSYLRQKLQALGLRWGPEGG

Abb.18: Canine Proteinsequenz von FASTK Transkriptvariante 4

CCGCCAACCCTCGGGTTTGAATCGGGCCGCGCTCTGCTGTGGCGGCGGCGGGATGGGCGCTTCGTCGCTGCCC

ATGGCAGAGGCCGGCTTCATCCACTGTCCCACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCA

AGAGGAGCATAAAAAACATTCATCTGGTTGTGCTTTCCTTTCTGTCAAGAAGCAGTTTGAAGAATTAACCCTC

GCAAAGGAAACCAACAACAAGCAGAAAGAATTCGAAGAGACCGCAAAGAAAGTGCGCTGTGCCATTGAGCAGC

AGAATGTTAAACTATACTTCTGTTTTCTTCTTGAAAGTGGCGCCAGGGGCGACTTCTCTCTGTGCGGCTGGTG

Abb.19: Canine mRNA Sequenz von Survivin mit 4 Exons

MGASSLPPAWQLYLKDHRVSTFKNWPFLEGCACTPDRMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFK

ELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLSEFLKLDKERAKNKIAKETNNKQKEF

EETAKKVRCAIEQLAAAE

Abb.20:Survivin Protein des Hundes mit 142 Aminosäuren

Anhang

73

9.4. Humane FASTK Sequenz GGGAAGATGGCGGACTCGGTGGCTAGCCGATGAGGAGGCCGCGGGGGGAACCCGGCCCCCGGGCCCCGAGACCGACTGAGGGA

GCGACCTGCGCAGGGCCCGGGGAGTCATGTAGGGGTGGCGCCTGCGGGGAGGGCTGCGGGAGGGCAGCGGGAGCTGGTGTTAG

CGGCAGCGGCCACGGTCTCCTGGCGTCCCTGGGCCGGGGTGGGTGTTGGGGCCCCCGACTTCGCCGACTCCGCGCCATCGCAA

AGCGGTGCACTCGGGCTCCACGCGCGCCCTGCGAGGTGGGCGCTGCGTTTTCATTTCACGGGTGAGGAGACTTAGAGAGACGA

AGCCACTTGTCCAAGGTCACGCCGCTGGTGAGTGGGAGCGCCCAGCATGGAACCCAGCACCGTCCAGCCGCGGAGCCCGCGTT

CCACCCTCTGTGCCGCCGCCGCCTCCTGTGGGAGAGGGAGGTGGTCGGGAGAGTGCACGCCGGTGCCGCCTGGGCTCCAGACT

GGGCGCGACCACTAACCCGGTTAATGACCTCGGGCTTAACTTAACCCCTTCGCTGCTCTGGGCCTGCGTTTCTCCACCGGTGA

AATGAGGGTCTCCATCACCCAACTCCATGCTTCGAGTCCTGCTCTCTGCTCAGACCTCCCCTGCTCGGCTGTCTGGCCTGCTG

CTGATCCCTCCAGTACAGCCCTGCTGTTTGGGGCCCAGCAAATGGGGGGACCGGCCTGTTGGAGGAGGCCCCAGTGCAGGTCC

TGCGCAAGGACTGCAGCGGCTTCTGGAACAGGCGAAGAGCCCTGGGGAGCTGCTGCGCTGGCTGGGCCAGAACCCCAGCAAGG

TGCGCGCCCACCACTACTCGGTGGCGCTTCGTCGTCTGGGCCAGCTCTTGGGGTCTCGGCCACGGCCCCCTCCTGTGGAGCAG

GTCACACTGCAGGACTTGAGTCAGCTCATCATCCGAAACTGCCCCTCCTTTGACATTCACACCATCCACGTGTGTCTGCACCT

TGCAGTCTTACTTGGTGGTACAGAAGTTGGTCCTGCCCTTTGGGCGACTGAACTACCTGCCCCTGGAACAGCAGTTTATGCCC

TGCCTTGAGAGGATCCTGGCTCGGGAAGCAGGGGTGGCACCCCTGGCTACAGTCAACATCTTGATGTCACTGTGCCAACTGCG

GTGCCTGCCCTTCAGAGCCCTGCACTTTGTTTTTTCCCCTGGCTTCATCAACTACATCAGTGGTACGCAGCCAGGATGGCTGG

CTGGGCCCCTGAGGGCTGGAGAGGCAGGGGAGCAGGGTGGCCTGCAGCCCAGAGCCCCAGTCCCCGCCTCCCCACAGGCACCC

CTCATGCTCTGATTGTGCGTCGCTACCTCTCCCTGCTGGACACGGCCGTGGAGCTGGAGCTCCCAGGATACCGGGGTCCCCGC

CTTCCCCGAAGGCAGCAAGTGCCCATCTTTCCCCAGCCTCTCATCACCGACCGTGCCCGCTGCAAGTACAGGTGGATGGGGCA

GCCTGGGGCAAGGGGAGGGGCCAGCCTGGGACCAGCAGAGTGGAAAAGCCAGAGGGACCATGAAGCGCCAAAGCTAAGGAGCT

CTCGGCCACCATAAAACTGGGCCCTGAAGCAGCAGAGGGCTTTGCCCAGGGTGGTGGCACTAGACTGGGACAGATTAGGATGA

GGTGCCGGGCCCTTCCTGCTACTGGTGTCCTTTCTCCTCAGTCACAAGGACATAGTAGCTGAGGGGTTGCGCCAGCTGCTGGG

GGAGGAGAAATACCGCCAGGACCTGACTGTGCCTCCAGGCTACTGCACAGGTGAGCAAGGGGCAGGCGGCAGGCCCGGGGAGA

CGGAGCCCTGGCTAAGGCCGCCGGCCCTGCTCCCCTCCAGACTTCCTGCTGTGCGCCAGCAGCTCTGGTGCTGTGCTTCCCGT

GAGGACCCAGGACCCCTTCCTGCCATACCCACCAAGGTCCTGCCCACAGGGCCAGGCTGCCTCTAGCGCCACTACTCGAGACC

CTGCCCAGAGGTAAAGGAGGCAGGGTGGGGGAGCCCTGGCCACCTTGCCCGCCATGCCCTGAGCCACGTCCCTCCCCCTGCAG

GGTGGTGCTGGTGTTGCGGGAACGCTGGCATTTCTGCCGGGACGGCCGGGTGCTGCTGGGCTCGAGGGCCCTGAGGGAGCGGC

ACCTAGGCCTGATGGGCTACCAGCTCCTGCCGGTGAGTGGCCCTGGCCTGGCCCGTGGCGCATCCTCACTCCCAGCCTGCGGG

TAACCTGCCGCCCTCTCCTCTCCCCACAGCTACCCTTCGAGGAACTGGAGTCCCAGAGAGGCCTGCCCCAGCTCAAGAGCTAC

CTGAGGCAGAAGCTCCAGGCCCTGGGCCTGCGCTGGGGGCCTGAAGGGGGCTGAGGGGTTGATGTGGGGTTCAGGATGGCCCC

CCCATGGGGGGTGGATGATTTGCACTTTGGTTCCCTGTGTTTTGATTTCTCATTAAAGTTCCTTTCCTTCCCCGTTGTGAATC

TCAGTTTTGGGACGGGGAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Abb.21: Sequenz des humanen FASTK (ehemals Datenbank: NCBI, GenBank Acc. No.

NM_025096)

MLRVLLSAQTSPARLSGLLLIPPVQPCCLGPSKWGDRPVGGGPSAGPAQGLQRLLEQAKSPG

ELLRWLGQNPSKVRAHHYSVALRRLGQLLGSRPRPPPVEQVTLQDLSQLIIRNCPSFDIHTI

HVCLHLAVLLGGTEVGPALWATELPAPGTAVYALP

Abb.22: Proteinsequenz zu Abbildung 43

74

Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. I. Nolte und Prof. Dr. J. Bullerdiek für die Überlassung des

interessanten Themas und die jederzeit gewährte Hilfe und fachliche Unterstützung bei der

Erstellung der Arbeit.

Ein besonderer Dank geht an Dr. H. Murua Escobar für seine ständige Hilfsbereitschaft und

geduldige Beantwortung meiner Fragen und Anliegen sowie an Dr. Rolf Nimzyk für seine

Hilfe im Bereich der Bioinformatik.

Klonierung und Charakterisierung Apoptose-assoziierter ... · Kolon-, Pankreas-, Prostata- und...

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