Kultivierung von E. coli im Fermenter zur Produktion von

Glycerol-Dehydrogenase

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joachim-czichos.de/

PDB 5ZXL 

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Einleitung:

Escherichia coli ist ein Gram-negatives, stäbchenförmiges, peritrich begeißeltes, nicht sporenbildendes

Bakterium, das zur Gruppe der Enterobacteriaceae gehört. Entdeckt wurde es 1885 von Theodor Escherich als

Darmbakterium. Daher dient E. coli auch zum Nachweisfäkaler Verunreinigungen im Trinkwasser [Schlegel

1992]. E. coli ist der molekularbiologisch am besten untersuchte Organismus und ist damit zu einem

Modellorganismus in Molekular-und Mikrobiologie geworden [Roempp 1999]. Das Genom von E. coli K12 ist

vollständig sequenziert [Blattner et al. 1997]. Das Bakterium ist anspruchslos und zeichnet sich durch schnelles

Wachstum auf komplexen Nährmedien mit einer maximalen Verdopplungszeit von 20 min bei 37°C und pH6,8

aus. Auf synthetischen Nährmedien aus Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle und Mineralsalzen ist es einfach zu

kultivieren. Als fakultativ anaerobes Bakterium kann E. coli unter aeroben und anaeroben Bedingungen

wachsen [Madigan et al. 1997]. Aufgrund dieser Eigenschaften und der zur Verfügung stehenden

molekulargenetischen Methoden wird E. coli häufig als Biokatalysator in biotechnologischen Prozessen

verwendet. Mit der fermentativen Produktion von Insulin hat E. coli industrielle Bedeutung erlangt. Darüber

hinaus wird es beispielsweise zur Produktion von Aminosäuren, Enzymen oder heterologen Proteinen wie

Interferonen oder Somatostatin verwendet [Roempp1999].

Glycerin-Dehydrogenase [Tang et al. 1979] ist eine metallabhängige Alkoholdehydrogenase, die besonders im

Glycerin-Metabolismus eine Rolle spielt. Die Glycerin-Dehydrogenase ist ein Homo-Oktamer bestehend aus

acht identischen Monomer-Untereinheiten, die wiederum aus einer einzelnen Polypeptidkette von 367

Aminosäuren bestehen. Das aktive Zentrum besteht aus einem gebundenen Metallion, einem Bindungszentrum

für den Nicotinamid-Ring und einer Bindungsstelle für das Substrat. Untersuchungen haben gezeigt, dass das

aktive Zentrum ein Zn2+-Ion als Cofaktor enthält. Diese Zinkionen bilden tetraedrische Dipol-Wechselwirkungen

zwischen den Aminosäureresten Asp173, His256 und His274, sowie einem Wassermolekül aus.

Das Enzym katalysiert die Dehydrierung von Glycerin zu Dihydroxyaceton unter ATP-unabhängigen

Bedingungen und es oxidiert selektiv eher die Hydroxylgruppe am C2-Atom, um ein Keton zu bilden, anstatt

eine terminale Hydroxylgruppe zu oxidieren, um dafür ein Aldehyd zu bilden [Leichus & Blanchard, 1994]. Es

kann durch Dihydroxyaceton-Zugabe in der stationären Phase stärker induziert werden [Truninger & Boos,

1994].

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Industrielle Bedeutung

Glycerin ist ein Nebenprodukt bei der Herstellung von Biodiesel. Als die Biodiesel-Produktion exponentiell

stieg, wurde das Rohglycerin bei der Umesterung von pflanzlichen Ölen in großen Mengen erzeugt. Trotz der

breiten Verwendung von reinem Glycerin in der Lebensmittelindustrie, Kosmetik, Pharmazie und vielen anderen

Industrien, ist es vergleichsweise kostspielig, das Rohglycerin auf den höchsten Reinheitsgrad aufzureinigen. In

der Biotechnologie kann die modifizierte enzymatische Stoffumsetzung des Rohglycerins zu einer breiten Palette

an Produkten führen, z. B. 1,3-Propandiol, 1,2-Propandiol, Bernsteinsäure, Dihydroxaceton, Wasserstoff,

Polyglycerin und Polyester. Dihydroxyaceton findet z.B. als künstliches Bräunungsmittel in der Kosmetik

Verwendung.

Exponentielles Wachstum einer Kultur

Das Wachstum einer Bakterien- oder Hefekultur verläuft nicht linear, sondern die Anzahl und Biomasse der

Mikroorganismen nehmen exponentiell zu, nämlich mit jeder Generation um den Faktor zwei (21, 22,...). Dabei

entstehen innerhalb von 10 Generationen aus einer Zelle etwa 1000 (210 = 1024) Nachkommen, innerhalb von 20

Generationen etwa 1 Million usw. Tatsächlich wird das Wachstum fast immer und schnell durch Mangel an

Nährstoffen begrenzt. Normalerweise teilen sich die Zellen in einer Kultur nicht synchron. Das heißt, die

Zellzahl nimmt nicht ruckartig entsprechend den Zweierpotenzen zu, sondern kontinuierlich.

Ganz sicher gilt dieses für den Zuwachs an Biomasse (meist als Trockenmasse bestimmt), Protein oder gebildete

Produkte, denn die Zellen wachsen, bevor sie sich teilen. Neugebildete Enzyme erhöhen sofort die

Stoffwechselaktivität und damit den zweiten Zuwachs. Bei unendlich kurzen Zeitabständen würde als

Zuwachsfaktor die natürliche Zahl e = 2.718... erreicht, die zur Beschreibung von exponentiellen

Wachstumsprozessen oft benötigt wird (oft in Form des natürlichen Logarithmus zur Basis e: loge = ln, wobei

gilt: ln e = 1).

Die mathematische Beschreibung von Wachstumsprozessen ist einfach. Der momentane Zuwachs an x

(Biomasse, Protein etc.) zu einem Zeitpunkt t wird geschrieben als dx/dt und hängt ab von der aktuellen

vorhandenen Menge an x und der Wachstumsrate µ. Er wird beschrieben durch:

dx/dt = µ x [1] Integriert über einen größeren Zeitraum von t0 bis t (Kontostand nach einiger Zeit) ergibt sich unter Verwendung des natürlichen Logarithmus: ln(xt) = ln(x0) + µ (t-t0) [2] bzw. In exponentieller Schreibweise : xt = x0

. e µ(t-t0) [3]

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Abbildung 2: Wachstumskurve einer Batch-Kultur

Will man aus einem gemessenen Zuwachs die Wachstumsrate bestimmen, kann die logarithmische Form der Gleichung folgendermaßen umgeformt werden: ln(xt/x0) ln(xt) – ln (x0) µ = _____________ = ___________________ t – t0 t – t0 [4] Für die Verdopplungszeit td (die Zeit t – t0, für die xt/x0 = 2 ist) ergibt sich einfach: ln 2 µ = __________

td [5] bzw. ln 2 td = __________

µ [6]

Wachstumskurve

Zeitachse (linear)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Mes

swer

te (

loga

rith

mis

ch)

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

2

3

4

5

6

7

8

9

0.1

1

10

xt

x0

t0 t

µ =ln xt - ln x0

t - t0

Anlauf- (lag)

Phase

logarithmische (log)

Phase

stationäre

Phase

Absterbe-

Phase

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Als Ertrag kann die Biomasse, die Produktmenge oder in diesem Fall die Gesamtunits an GlyDH aus dieser Fermentation angegeben werden.

Der Ertragskoeffizient ergibt sich dann aus erhaltenem Produkt pro eingesetztem Substrat, d.h. Units GlyDH

pro g verbrauchter Glucose.

Aufgabe:

In einem Fermenter wird Escherichia coli K12 kultiviert und dabei die Wachstumsrate, die Verdopplungszeit

und die Gesamtaktivität (Ausbeute/Ertrag) bestimmt. Dabei werden die Substratabnahme, die Bakterienmasse

und –Dichte, der Proteingehalt sowie die die Gesamtunits Glycerol-Dehydrogenase gemessen.

Wachstumskurven für OD, TG und Proteinkonzentration erstellen und die Raten/Verdopplungszeiten

vergleichen.

Vorbereitung:

Die Praktikanten sollen sich anhand der angegebenen Literatur über das Funktionsprinzip von Fermentern, das

bakterielle Wachstum und die Glycerol-Dehydrogenase informieren.

Literatur:

Madigan, M.T., Martinko, J.M., Stahl, D.A., Clark, D.P. (2013) Brock Mikrobiologie, Pearson, San

Francisco, CA, USA

Fuchs, G. (Hrsg.) („Schlegel“) (2007) Allgemeine Mikrobiologie, Thieme Verlag, Stuttgart

Cypionka, H. (2010) Grundlagen der Mikrobiologie, Springer Verlag, Berlin

Fiechter, A. (1981) Batch and continuous culture of microbial, plant and animal cells. in: Rehm, H.J., Reed, G.

(Hrsg.): Biotechnology, Vol 1, pp. 453-505, Verlag Chemie, Weinheim F1 35.1

Clark, D.P., Pazdernik, N.J. (2009) Molekulare Biotechnologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg

Rennberg, R., (2010) Biotechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg

Antranikian, G. (Hrsg.) (2006), Angewandte Mikrobiologie, Springer Verlag, Berlin

Hass, V.C., Pörtner, R. (2009), Praxis der Bioprozesstechnik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg

Schmidt, F.R. (2005) Optimization and scale up of industrial fermentation processes. Appl. Microbiol.

Biotechnol. 68, 425–435.

Schlegel, H.G.: Allgemeine Mikrobiologie. 7. Auflage. Stuttgart: Thieme Verlag,1992

Roempp: Lexikon Chemie. Bd.Version 2.0. Stuttgart: Thieme Verlag, 1999

Madigan, M.T.; Martinko, J.M.; Parker, J.: Brock Biology of Microorganisms. 7. Edition. Jew Jersey: Prentice Hall International, Inc., 1997

Blattner, F.R.; Plunkett, G.; Bloch, C.a.; Perna, N.T.; Burland, V.; Riley, M.; Collado-Vides, J. ; Glasner, J.D.; Rode, C.K.: The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. In: Science 277 (1997),S. 1453-1474

C.T. Tang, F.E. Ruch, Jr, and C.C. Lin: Purification and properties of a nicotinamide adenine dinucleotide-linked dehydrogenase that serves an Escherichia coli mutant for glycerol catabolism. J Bacteriol. 1979 Oct; 140: 182–187. Betty N. Leichus, John S. Blanchard: Isotopic Analysis of the Reaction Catalyzed by Glycerol Dehydrogenase. In: Biochemistry. 33, Nr. 48, 1994, S. 14642–14649 Truninger, V., Boos, W.: Mapping and Cloning of gidA, the Structural Gene of the Escherichia coli Glycerol Dehydrogenase. J. Bact, 1994, P. 1796-1800

Czichos, J. (2004) What's so funny about microbiology,

http://www.joachim-czichos.de/

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Durchführung Vorbereitung:

Der Bioreaktor wird zusammengebaut, mit 1100 ml Lösung A befüllt und 45 min bei 121°C autoklaviert.

Desweiteren müssen autoklaviert werden:

- ein in Alufolie eingewickelter Trichter zum Einfüllen von B und C und zum Animpfen

- Lösung B und C

Vorkultur:

Die Vorkultur wird mit einer Einzelkolonie des Stammes beimpft und über Nacht auf dem Schüttler inkubiert.

Kultivierung im Chemostaten:

Kultivierungsbedingungen: Temperatur: E. coli: 28°C,

Rührerdrehzahl: E. coli: 600 Upm

Belüftung: 2 vvm (Einstellung „3“ am Rotameter bei 1,5 l Volumen)

(vvm: Volumen Luft x Volumen Flüssigkeit-1 x Minute-1)

pH-Kontrolle

(Antischaum-Kontrolle)

Der Fermenter wird nach dem Zeitplan mit 2-5 ml Vorkultur angeimpft (je nach Wachstum, wird vom Betreuer

festgelegt) und entsprechende Proben gezogen. Für die Trockengewichtsbestimmung werden zunächst 30 ml

Kultur und später, wenn die Kultur dicht gewachsen ist, entsprechend weniger Volumen über einen Filter

abgesaugt. Für die O.D.- und Glukosebestimmung werden 2 ml gebraucht: 1 ml zur Extinktionsmessung und 1

ml wird in Reaktionsgefäßen abzentrifugiert. Der Überstand wird eingefroren. Eine Probe von 10 ml wird für

die Proteinbestimmung genommen, abzentrifugiert, 2 x mit KPO4-Puffer gewaschen und das Pellet

eingefroren. Bei P5 und P6 werden 50 ml für Proteinbestimmung und GlyDH-Aktivität benötigt. Am

nächste Morgen (8:00 Uhr) wird mit Dihydroxiaceton induziert (10 ml einer sterilen DHA-Lösung von 20 g/100

ml). Drei Stunden später wird der Fermenter abgeerntet (Zellen 2 x waschen (JLA-10.500 Rotor, 5000 x g, 10

min), das Pellet in 30 ml 20 mM KPO4-Puffer (pH 7,0) resuspendiert, in 50 ml Falcon gegeben, 15 min bei 5000

x g zentrifugiert und das Pellet eingefroren.

Die eingefrorenen Pellets von P1,P2,P4 aus der Wachstumskurve werden auftaut und anschließend der

Proteingehalt bestimmt. Die geernteten Zellen aus 50 ml P5 und P6 werden aufgeschlossen und Proteingehalt

sowie GlyDH-Aktivität bestimmt.

Auswertung Das Protokoll sollte im Stil von Veröffentlichungen in FEMS Microbiol. Lett. (deutsch oder

englisch)

geschrieben werden und folgende Daten enthalten: - Wachstumskurve, bei der die OD450, das Trockengewicht, die Glukosekonzentration und die

Proteinkonzentration halblogarithmisch gegen die Zeit aufgetragen werden

- Alle Messwerte/Eichkurven und die daraus berechneten Ergebnisse, wie Wachstumsrate, Verdopplungszeit,

Ertrag, Ertragskoeffizient (für Bakterienmasse und GlyDH-Aktivität)

- Grafik der Fermentationswerte aus der Iris-Datei

Abstract = Zusammenfassung der Ergebnisse, Einleitung = Theoretischer Hintergrund mit Literaturzitaten,

Material und Methoden: nur Änderungen gegenüber dem Script, Ergebnisse: Text, Tabellen und Grafiken,

Diskussion = Würdigung der Ergebnisse vor dem Hintergrund der Literatur mit Zitaten, Literaturverzeichnis)

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Methoden

Nährmedium: Lösung A 1000 ml Volumen 1500 ml Volumen

Na2HPO4 x 12 H2O 9.0 g 13.50 g

KH2PO4 1.5 g 2.25 g

NH4Cl 1.0 g 1.50 g

Hefeextrakt 0.5 g 0.75 g

Spurenelementlsg. SL 4 1.0 ml 1.50 ml

Vitaminlösung 1.0 ml 1.50 ml

mit H2Odeion auffüllen auf 600.0 ml (pH 7,0) 1100.00 ml

Lösung B

FeCl3 x 6 H2O 1.2 mg 1.8 mg

CaCl2 x 2 H2O 20.0 mg 30.0 mg

MgSO4 x 7 H2O 200.0 mg 300.0 mg

mit H2Odeion auffüllen auf 100.0 ml 100.0 ml

Lösung C

Glucose 8.0 g 12.0 g

mit H2Odeion auffüllen auf 300.0 ml 300.0 ml

Lösung A, B, C getrennt autoklavieren und in den Fermenter füllen

Spurenelementlösung SL 4 (PFENNIG und LIPPERT, 1966; 10-fach konzentriert)

EDTA 5,0 g FeSO4 x 7 H2Odeion 2,0 g

ZnSO4 x 7 H2Odeion 0,1 g

MnCl2 x 4 H2Odeion 0,03 g

H3BO3 0,3 g

CoCl2 x 6 H2Odeion 0,2 g

CuCl2 x 2 H2Odeion 0,01 g

NiCl2 x 5 H2Odeion 0,02 g

Na2MoO4 x 2 H2Odeion 0,03 g

Vitaminlösung (SCHLEGEL, 1985; 10-fach konzentriert)

Biotin 2 mg

Nicotinsäure 20 mg

Thiamin 10 mg

4-Aminobenzoesäure 10 mg

Pantothenat 5 mg

Pyridoxamin 50 mg

Cyanocobalamin 20 mg H2Odeion ad 100 ml

Die Vitaminlösung wird unmittelbar nach der Herstellung sterilfiltriert und anschließend bei 4° C aufbewahrt.

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Messung der Bakterienmasse: Die Entwicklung der Bakterienmasse im Bioreaktor wird durch Messung der optischen Dichte bei 450 nm

verfolgt (1 ml Proben). Die Messung erfolgt gegen steriles Medium. Die Bakteriensuspension muss

gegebenenfalls soweit verdünnt werden, dass die optische Dichte unter 0.3 liegt.

Trockengewichtsbestimmung: Membranfilter (Porengröße: 0.45 µm) werden über Nacht im Trockenschrank getrocknet (Menbranfilter auf

Cellulose-Filter in Glaspetrischalen legen) und nach Abkühlung ausgewogen. Die Filter werden in die

Filtrierapparatur montiert und 30 ml (bei gut gewachsener Kultur 10-5 ml) Bakteriensuspension filtriert. Es wird

mit ca. 20 ml deion. Wasser gewaschen, ein erkennbares Filtrat muss vorhanden sein. Anschließend werden die

Filter über Nacht im Trockenschrank getrocknet und danach ausgewogen. Kontrolle: 20 ml deion. Wasser

filtrieren.

Bestimmung der Glukosekonzentration:

Zur Bestimmung der Glukosekonzentration werden 1 ml Proben aus dem Bioreaktor bei 13000 x g in

Reaktionsgefäßen abzentrifugiert und anschließend durch eine Membran mit einer Ausschlussgröße von 10.000

Dalton zentrifugiert, um die Proteine weitgehend abzutrennen. Die gereinigten Proben werden in Autosampler-

Vials eingefroren (beschriften!) und später zusammen mit der HPLC (siehe unten) analysiert.

Zellaufschluss für geerntetes Pellet (Proben 5 und 6):

Zellaufschluss E. coli: - Geerntete Zellen 2 x waschen (JLA-10.500 Rotor, 5000 x g, 10 min):

- Pellets in 100 ml 20 mM KPO4-Puffer (pH 7,0) resuspendieren

15 min bei 5000 x g und 4°C abzentrifugieren

- Pellets in 30 ml 20 mM KPO4-Puffer (pH 7,0) resuspendieren,

gelöstes Pellet in 50 ml Falcon geben.

15 min bei 5000 x g, 4°C zentrifugieren

- Pellets wiegen und in 5 ml/g feuchte Zellen 20 mM KPO4-Puffer (pH 7,0) erneut resuspendieren,

1 Spatelspitze DNase zugeben.

- Zellen im Ultraschall (6 x 15 s, 22 Micron mit Zwischenkühlung) aufschließen.

- Zelltrümmer durch 10 minütige Zentrifugation bei 4°C, 9.000 x g (Falcon) abtrennen.

- Rohextrakt abnehmen und erneute 10 min bei 13.000 x g und 4°C in Eppis zentrifugieren.

Gesamtvolumen bestimmen, 100 µl vom Rohextrakt für Protein- und Aktivitätstest entnehmen,

Glycerol-Dehydrogenase-(GlyDH) Aktivität:

Die Rohextrakte werden auch für die GlyDH-Aktivitätsuntersuchung eingesetzt. Die Messung erfolgt in

Quarzglas-Küvetten mit 1 cm Schichtdicke im Photometer bei 340 nm. Es wird die Extinktionsabnahme durch

NAD-Bildung gemessen, die bei der Reduktion des Hydroxy-Ketons entsteht. Die Kurve wird mit dem PC

aufgenommen und E/min bestimmt.

Reaktionsansatz (1 ml) für Dihydroxyacaton-Reduktion:

Puffer (100 mM TrisHCl; pH 6,5, 1 mM ZnCl2) 500 µl

NADH-Lösung (45 mM Stammlösung in H2O) 20 µl

Rohextrakt 100 µl

H2O 280 µl

Start mit Dihydroxyaceton (1 M Stammlösung) 100 µl

Tris-Puffer frisch ansetzen!

- 9 -

Katalytische Aktivität

SI-Einheit: Katal (früher: Unit)

1 Katal ist als die Enzymmenge definiert, die einen Umsatz von 1 mol pro Sekunde katalysiert.

1 Unit entspricht der Enzymmenge, die einen Umsatz von 1 µmol pro Minute katalysiert.

Spezifische katalytische Aktivität

Einheit: Katal/g (Unit/mg)

Die spezifische Aktivität entspricht der auf den Proteingehalt bezogenen katalytischen Aktivität. Sie ist ein Maß

für die Reinheit der Enzympräparation.

Die Volumenaktivität U/ml wird nach folgender Formel berechnet:

E * VKüvette

U/ml = ______t_____________ E * Vk

* VProbe * d * t * Vp * d

E t-1: Extinktionsänderung min-1; : Extinktionskoeffizient; VKüvette: Gesamtvolumen der Küvette: 1 ml;

VProbe: Probevolumen: 0,1 ml; d: Schichtdicke der Küvette: 1 cm; NADH (340 nm) = 6,3 ml * µmol-1 * cm-1

Die spezifische Aktivität ist die Volumenaktivität dividiert durch den Proteingehalt [U/mg].

HPLC-Bestimmung:

Die Analytik von Glukose wird mit einer Ionen-Verteilungs-Chromatographie mit H2O als Eluent durchgeführt.

Die Säule (Nucleogel Sugar 810 Ca, 300 x 7,8 mm, Fa. Macherey & Nagel) wird bei einer Temperatur von 80

°C gehalten und die Elution erfolgt bei einer Flußrate von 0,5 ml/min. Die Detektion wird mit einem

Brechungsindexdetektor (Wissenschaftlicher Gerätebau Dr. Ing. Knauer, Berlin) durchgeführt, an den ein

Integrator (Chromatopac C-R6, Fa. Shimadzu, Koyoto, Japan) angeschlossen ist.

Die Identifizierung der Substanzen erfolgt durch den Vergleich der Retentionszeiten und Konzentrationen

können nach Kalibrierung der HPLC bestimmt werden. Für Glukose wird eine Kalibrierungskurve (1, 5, 10

mg/ml) aufgenommen.

Proteinbestimmung nach der Biuret-Methode:

Lösungen für Biuret-Proteinbestimmung

A: B:

K-Na-Tartrat 6.25 g NaOH 16.0 g

CuSO4 x 5 H2O 1.25 g Aqua deion. 100.0 ml

KJ 3.125 g Vorsicht mit Natronlauge! Unbedingt

NaOH 5.0 g Augenschutz benutzen!

Bestandteile getrennt in Aqua

deion. lösen, in der angegebenen

Reihenfolge mischen und auf

500 ml auffüllen.

Die Proteinbestimmung wird zum Schluss des Versuchs mit allen Proben zusammen durchgeführt. Das Pellet der

10 ml Proben 1,2 und 4 wird in 5 ml H2O aufgenommen und in ein Glaszentrifugenröhrchen gegeben. Die Zellen

=

- 10 -

werden in einer Tischzentrifuge 10 min bei 3800 U/min abzentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig

abgegossen und das Sediment in 5 ml H2O aufgenommen, 0,5 ml Lösung B zugegeben und 5 min gekocht

(Glasmurmeln auf die Gläser legen!). Wenn die Proben abgekühlt sind, wird 2 ml Lösung A zugegeben, gut

gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden die Proben wieder 10 min bei 3800

U/min abzentrifugiert. Vom Überstand werden je 250 µl der Proben nach dem Schema unten in eine

Mikrotiterplatte pipettiert und im Reader bei einer Extinktion bei 560 nm gemessen. Als Leerwert dient der

gleiche Ansatz mit 5 ml Wasser.

Für die Ultraschall-aufgeschlossenen Proben 5 und 6 sowie die Eichgerade mit Rinderserumalbumin wird

folgender Ansatz gewählt:

- 1 ml Proteinlsg.* + 4 ml H2O + 0,5 ml Lsg. B

- nach Kochen 2 ml Lsg. A zugeben und 30 min inkubieren

Die Eichkurve wird im Bereich von 0 - 1 mg/ml (10, 50, 100, 250, 500, 1000 µg/ml) aufgenommen, in einer

Grafik aufgetragen und zur Umrechnung der Proteinbestimmungwerte aus der Wachstumskurve benutzt.

*je 1 ml der Eichkurvenkonzentrationen oder je 1 ml der Rohextrakt-Verdünnungen der Proben 5 und 6

Pipettierschema für Microtiterplatten (Proteinbestimmung)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B 10 50 100 250 500 1000

C

D 1a 1b

E 2a 2b Leer-wert

F 4a (0)

4a (10)

4a (50)

4a (0)

4a (10)

4a (50)

G 5a (0)

5a (10)

5a (50)

5a (0)

5a (10)

5a (50)

H 6a (0)

6a (10)

6a (50)

6a (0)

6a (10)

6a (50)

Reihe B: Eichkurve [µg/ml] Reihen D-H: Doppelmessung der Proben E 10: Leerwert (x): -fache Verdünnung

- 11 -

Aktivitätsberechnungen:

Glukose: 8 g/L (= 8 mg/ml); Ertrag: U/L pro verbrauchter Glukose g/L U/g Glukose

50 mL Probe, zentrifugieren+ 4 mL Aufschlußpuffer→ 4mL Rohextrakt

Aktivitätsbestimmung U/mL0.1 mL RE/ KüvetteU/mL x 10 (x Verdünnung )  U/mL REx 4 U pro 50 mL Kultur x 20 = U/L Kultur (Gesamtaktivität)

ProteinbestimmungVerdünnung 10x, 50x, 100x, Wenn 100x in der Eichkurve liegt:Bestimmte mg/mL * 100mg/ml RE

Spezifische Aktivität: U/mL RE

mg/mL RE= U/mg

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Zeitplan

1. Woche 2. Woche

Mo

Zusammenbau des Fermenters Medium herstellen Autoklavieren Lsg herstellen:

Waschpuffer 20 mM KPO4

DHA-Lsg 20g/100ml (steril, eine Gr.) Filterpapiere in Trockenschrank Eichung Glukose (2 Gruppen) Vorkultur animpfen

Mo

Zusammenbau des Fermenters Medium herstellen Autoklavieren Lsg herstellen:

Waschpuffer 20 mM KPO4 DHA-Lsg 20g/100ml (steril, eine Gr.) Filterpapiere in Trockenschrank Eichung Glukose (2 Gruppen) Vorkultur animpfen

Di

Filter wiegen

9°° Ferm. animpfen mit E. coli K12 [OD, Glukose, Prot., TG] (P1) 12°° [OD, Glukose, Prot., TG] (P2) 15°° [OD, Glukose] (P3) 18oo [OD, Glukose, Prot., TG] (P4)

Eichung Glukose (weitere Gruppe) TG Filter in TS

Di

Filter wiegen

9°° Ferm. animpfen mit E. coli K12 [OD, Glukose, Prot., TG] (P1) 12°° [OD, Glukose, Prot., TG] (P2) 15°° [OD, Glukose] (P3) 18oo [OD, Glukose, Prot., TG] (P4)

Eichung Glukose (weitere Gruppe) TG Filter in TS

Mi

8oo Induzieren mit DHA, [OD, Glukose, TG + 50 ml für Prot. und GlyDH Bestimmung] (P5) 11°° [OD, Glukose, TG + 50 ml für Prot. und GlyDH Bestimmung] (P6)

Fermenter-Ernte Aufschluß von P5 + P6 Lsg für GlyDH-Test Aktivitätsbestimmung TG Filter in TS

Mi

8oo Induzieren mit DHA, [OD, Glukose, TG + 50 ml für Prot. und GlyDH Bestimmung] (P5) 11°° [OD, Glukose, TG + 50 ml für Prot. und GlyDH Bestimmung] (P6)

Fermenter-Ernte Aufschluß von P5 + P6 Lsg für GlyDH-Test Aktivitätsbestimmung TG Filter in TS

Do

TG Filter wiegen HPLC-Messung Glukoseproben Proteineichgerade Proteinbestimmung HPLC-Messung Glukoseproben

Do

TG Filter wiegen HPLC-Messung Glukoseproben Proteineichgerade Proteinbestimmung HPLC-Messung Glukoseproben

Fr

Auswertung Abschlussbesprechung

Fr

Auswertung Abschlussbesprechung

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Minifors Fermenter

Zuluft

Abluft

pO2-Elektrode

pH-Elektrode

Rotameter

Rührer

Pumpenköpfe

Vorrats- Flaschen

Probe- nahme

Temperaturfühler

- 14 -

- 15 -

Kurzanleitung Minifors (im Zweifelsfall Manual/Betreuer befragen!)

Zusammen- oder Abbau:

- Kabelverbindungen dürfen beim Schrauben nicht verdrillt oder geknickt werden (Zerstörung der Isolierung Crazy Data!)

- Pumpenköpfe vorsichtig aufsetzen und abnehmen (Einrasthebel zusammendrücken)

- Verbindung zum Antrieb hochklappen

- Schrauben am Heizblech lösen und Blech abnehmen

- Bei abgenommenen Kabeln, Pumpenköpfen, Luftleitungen und Wasserleitungen kann die Platte mit Fermenter und Vorratsflaschen nach oben von der Konsole genommen werden (der Einraststift am hinteren Blech muss aus der Verankerung gehoben werden)

- Drei Handschrauben am Deckel lösen und abnehmen

- Der Fermenterdeckel muss immer so auf dem Tisch liegen, dass die Rührwelle in die Luft zeigt!

- Gefäß kann entnommen, gereinigt oder mit Medium gefüllt werden

- Deckel wieder aufsetzen

- Alle Verbindungen nur mit der Hand anziehen (keine Werkzeuge!)

- Unter den Blindstopfen muss eine Dichtung sein

- pH Elektrode eichen und einbauen (siehe Seite 5)

- Antischaum Sonde (mit innen liegender Zudosierung), mit mindestens 1 cm Abstand zum oberen oder unteren Anschlag einbauen (sonst Kurzschluss und permanente Zudosierung)

- O2 Elektrode einbauen

- Vorratsflaschen füllen

- Probennehmer anbauen

- Zum Autoklavieren

- Zuluftschlauch mit kräftiger Metallklemme verschließen

- Alle Verbindungen zu Vorratsflaschen und Probennehmer verschließen

- Abluftleitung verschließen

- !!!!!! Einen Blindstopfen zum Druckausgleich öffnen !!!!!!!

- Rührwellenkopf mit neuer Alufolie abdecken (es darf keine Feuchtigkeit eindringen)

- Elektrodenanschüsse mit neuer Alufolie abdecken (es darf keine Feuchtigkeit eindringen)

- Oliven/Filter bei Gasver- und Entsorgung, an den Vorratsflaschen und am Probennehmer mit Alufolie abdecken

- Autoklavieren (2 l mindestens 40 min)

- 16 -

Nach dem Autoklavieren

- gelösten Blindstopfen sofort nach Öffnen des Autoklaven aufschrauben

- Platte mit Fermenter in die Konsole einbauen (der Einraststift am hinteren Blech muss in den Verankerungschlitz greifen)

- Verbindung zum Antrieb herunterklappen und Heizblech anschrauben

- Verschluss an der Entlüftung öffnen

- Wasseranschlüsse an den Kühler der Entlüftung anbringen und Wasser aufdrehen

- Belüftung an der Konsole auf niedrigen Wert stellen, Verbindung zum Fermenter herstellen und erst dann die Metallklemme lösen (sonst kann Medium zurücksteigen!)

- Pumpenköpfe auf den entsprechenden Pumpen einrasten und Klemmen zu Vorratsflaschen öffnen, Schläuche füllen (siehe Seite 5)

- Verbindungen zu Messelektroden aufschrauben (Kabel nicht verdrillen oder knicken)

- Anschlüsse für Antischaum am Deckel und dem Messfühler einstecken

- Temperaturfühler bis ganz unten in die entsprechende Hülse stecken

- O2-Elektrode eichen (siehe Seite 6)

- Laptop anschließen

- Fermentationsparameter über Konsole oder Laptop einstellen

- Getrennt autoklavierte Lösungen zugeben

- Animpfen und Fermentation starten

Nach dem Ernten

- Wasser und Luft abstellen

- Alle Verbindungen lösen

- Platte mit Fermenter ausbauen

- Elektroden ausbauen, waschen und wie vorgeschrieben aufbewahren

- Fermenter auseinanderbauen (der Fermenterdeckel muss immer so auf dem Tisch liegen, dass die Rührwelle in die Luft zeigt)

- Alles vorsichtig aber gründlich waschen

- Die Schläuche der Pumpen mit Wasser durchspülen

- Trocknen lassen und wieder zusammenbauen

Die Gleitringdichtung des Rührers muss einmal monatlich mit Glycerin geschmiert werden (siehe Manual!)

- 17 -

Manuelle Einstellungen

F-Taste wählt Funktionen:

RPM (Drehzahl), °C, pH, pO2, AF (Antischaum), Pumpen

RPM (Drehzahl)

- Mit Drehzahl (Sollwert) einstellen

- Mit An/Aus stellen (Rührer)

Blättern

- Cas (Cascade) wird verwendet für pO2 gesteuerte Fermentation.

- cHi ist der schnellste Rührwert, mit einstellen

- cLo ist der langsamste Rührwert, mit einstellen

- OUT Reglerausgang 0-100%

- (für O2-Zufütterung muss eine Flasche angeschlossen sein und o2 im Pumpenmenu auf AUT gestellt sein)

°C (Temperatur)

- Mit Temperatur (Sollwert) einstellen

- Mit An/Aus stellen (Temperaturegelung)

Blättern

- OUT Reglerausgang 0-100%

- 18 -

pH

- Mit gewünschten pH-Wert (Sollwert) einstellen

- Mit An/Aus stellen (Pumpensteuerung)

Blättern

- OUT Reglerausgang 0-100%

- CAL

- +,+ 2 Punkt Eichung

- Elektrode in 1. Referenzpuffer, warten bis die Anzeige stabil ist, Wert mit einstellen

- Enter mit

- Elektrode in 1. Referenzpuffer, warten bis die Anzeige stabil ist, Wert mit einstellen

- Enter mit

- PF Proportionalfaktor (wird nicht verstellt)

- iF Integralfaktor (wird nicht verstellt)

- dEb deadband ≙ Fenster ohne pH-Regelung; gewünschter pH-Wert

hier eingestelltem Wert

- aLr Alarmgrenzen in Parameter Einheiten (pH oder pO2)

Während der Kalibrierung muss der Temperaturfühler in die pH-Standardlösung eingetaucht sein.

Die Elektrode nach Gebrauch abspülen, mit der Silkonkappe (mit 3 M KCl gefüllt) verschließen und in der Schachtel aufbewahren.

Pumpen

Blättern

- Aci Säurepumpe

- bas Basepumpe

- AF Antischaumpumpe

- FEd Fütterungspumpe

- Pumpzeiten mit einstellen; mit An/Aus wird die Pumpe gestartet (AUT) und die Schläuche können gefüllt werden (mit +)

- o2 in AUT-Stellung heißt: O2-Zugabe, wenn Flasche angeschlossen

- 19 -

pO2

- Mit gewünschten pO2-Wert einstellen

- Mit An/Aus stellen (Belüftung über Rührergeschw./O2-Ventil steuern)

Blättern

- OUT Reglerausgang 0-100%

- CAL Kalibrierung kann erst erfolgen, wenn die Elektrode im Medium 4-6 Stunden lang bei eingeschalteter Konsole polarisiert/inkubiert wurde

- +,+ 2 Punkt Eichung

- Medium mit N2 begasen, warten bis Anzeige stabil ist, 0% Wert einstellen

- Enter mit

- Medium mit O2 (oder Luft) begasen, warten bis die Anzeige stabil ist, 100% Wert einstellen

- Enter mit

Oder:

- + 1 Punkt Eichung

- Medium bei gewünschter Temperatur und höchster Drehzahl mit Luft (oder O2) begasen, warten bis die Anzeige stabil ist, 100% Wert einstellen

- Enter mit

- PF Proportionalfaktor (normal 1; Wert erhöhen, wenn der Rührer nicht schnell genug nachgeregelt wird, bis 5)

- iF Integralfaktor (normal 0; Wert erhöhen, wenn der Rührer nicht schnell genug nachgeregelt wird, Einfluss geringer als PF)

- dEb deadband ≙ Fenster ohne pO2-Regelung; gewünschter pO2-Wert

hier eingestelltem Wert

- aLr Alarmgrenzen in Parameter Einheiten (pH oder pO2)

Elektrode vorsichtig behandeln – die Silkonmembran darf nicht durch mechanische Einwirkung verletzt werden! Deshalb immer nach Ausbau sofort die grüne Kappe aufsetzen.

Elektrode in der Schachtel aufbewahren.

AF (Antischaum)

- Mit An/Aus stellen (Pumpensteuerung)

Blättern

- dT Wartezeit in sec. (etwa 5, um zu warten ob der Schaum zusammenfällt)

- Pt Pumpzeit in sec. (etwa 2, Pumpzeit zwischen den Warteintervallen)

- 20 -

Datenbearbeitung

- Programm „History“ aufrufen und entsprechendes File laden

- „File“ und „Generate Report“ anklicken

- Gewünschte Parameter auswählen

- Weiter

- Weiter

- Gewünschten Datentakt angeben

- Fertigstellen

- Datenspalten markieren, kopieren und in gewünschtes spreadsheat einfügen

- In Sigmaplot Zeitachse generieren:

- „Transforms“ und „User-Defined“ anklicken

- col(x)=data(von,bis,Schritt) ≙ col(x)=data(0,Anzahl der Zeilen * Datentakt,Datentakt)

- Umrechnung auf Stunden z.B. col(x)=col(x)/60, wenn der Datentakt in Minuten angegeben war

- 21 -

Manuelle Steuerung einer Fermentation am Computer (Seite 78)

- kann nur bei gestartetem Fermenter benutzt werden - Parameter müssen am Fermenter gestartet sein (nicht auf „OFF“) - Aktiven Parameter mit rechter Maustaste anklicken - Häckchen bei „Setpoint remote“ (Häckchen bei „Sensor data“ belassen) - Setpoint ändern, Apply und OK - → Parameter wird geändert

Steuerung einer Fermentation ohne Bedingungen (Seite 77)

- Im Startmenü unter Infors „Follow File Generator“ auswählen - Fermenter wählen - Parameter auswählen - Auf Tabellen-Taste drücken - Eingabe von Beginn (+ Wert) - Eingabe von Ende (+ Wert) - Nächster Parameter - Eingabe von Beginn (+ Wert) - Eingabe von Ende (+ Wert) - Etc. - Tabelle schließen - Über Taste „Hinzufügen“ können zusätzliche Punkte einfach erstellt werden - Über Taste „Punkte bearbeiten“ entsprechend geändert werden (drag) - Auf diese Art den Verlauf aller Parameter definieren - Methode abspeichern - Beim Start einer Fermentation Methode in „Follow File“ aufrufen

Steuerung einer Fermentation mit Bedingungen (Control sequence)

(kann nur bei gestartetem Fermenter geschrieben werden)

- Öffnen über „Edit“ „Control sequence“ und “Edit current” (meist leer) oder “Import” (Aufruf einer fertigen Sequenz, die geändert werden kann)

- Gewünschte Kontrollsequenz erstellen (IRIS NT ab Seite 79) - Wenn die Sequenz fertig ist, Fenster schließen und „apply“ wählen - Zurück im Standard Menü kann die Sequenz über „Edit“ „Control sequence“

und “Export” abgespeichert werden (Extention .seq) (Vielleicht auch über „save as“ Seite 80)

- Beim Start einer Fermentation Sequenz in „Control sequence“ aufrufen