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Laserverfahren in der medizinischen Diagnostik

Ausarbeitung zum Vortrag im Rahmen des Hauptseminars Experimentalphysik

Physikalische Grundlagen in der medizinischen Diagnostik

an der Universität Duisburg-Essen

Standort Duisburg SS 2006

Marcel Ruth Essen, Juli 2006

Betreuer: Dr. Kleinefeld


Hauptseminar Experimentalphysik SS 2006 Seite: 2

GLIEDERUNG:

1. EINLEITUNG / MOTIVATION ............................................................................... 3

2 LASER ................................................................................................................... 4 2.1 Was ist ein Laser? .................................................................................................................................. 4 2.2 Elektromagnetische Strahlung .............................................................................................................. 5 2.3 Kohärenz .................................................................................................................................................. 6 2.4 Absorption, spontane und induzierte Emission .................................................................................. 9 2.5 Lebensdauer, Ratengleichungen ....................................................................................................... 10 2.6 Besetzungsinversion, Lasermedium / aktives Medium ................................................................... 12 2.7 Pumpen .................................................................................................................................................. 13 2.8 Linienbreite ............................................................................................................................................ 14 2.9 Laser-Resonator, Lasermoden ........................................................................................................... 14 2.10 Laserschwelle ..................................................................................................................................... 18 2.11 Laser-Systeme, Helium-Neon-Gas-Laser....................................................................................... 18

3. LASER INDUZIERTE FLUORESZENZ............................................................... 21 3.1 Physikalische Grundlagen ................................................................................................................... 21

3.1.1 Energieniveaus bei Molekülen ............................................................................................... 21 3.1.2 Optische Übergänge................................................................................................................ 23 3.1.3 Franck-Condon-Prinzip ........................................................................................................... 23 3.1.4 Fluoreszenz .............................................................................................................................. 24

3.2 Methode ................................................................................................................................................. 26 3.3 Anwendungen ....................................................................................................................................... 32

3.3.1 HIV und Leukämie Diagnose mit dem Durchflusscytometer ............................................. 33 3.3.2 Speiseröhrenkrebs Diagnostik ............................................................................................... 34 3.3.3 Spermiensortierung mit dem Durchflusscytometer ............................................................. 35 3.3.4 Immunfluoreszenz.................................................................................................................... 35

4. LASERTOMOGRAPHISCHES SCANNEN (LTS)............................................... 36 4.1 Methode ................................................................................................................................................. 36 4.2 Anwendungsbereiche........................................................................................................................... 41

4.2.1 Netzhautscanning (Laser-Scanning Ophthalmoscope)...................................................... 41 4.2.2 Gewebe Laser-Mikroskopie.................................................................................................... 42 4.2.3 Bodyscanning ........................................................................................................................... 43

5. OPTISCHE KOHÄRENZTOMOGRAPHIE (OCT) ............................................... 45 5.1 Physikalische Grundlagen ................................................................................................................... 45

5.1.1 Elektromagnetische Wellen, Intensität, Interferenz ............................................................ 45 5.1.2 Michelson-Interferometer ........................................................................................................ 47 5.1.3 Lichtquellen kurzer Kohärenzlänge, Auflösung ................................................................... 48

5.2 Methode ................................................................................................................................................. 50 5.3 Anwendungsbereiche........................................................................................................................... 53

5.3.1 Ophthalmologie ........................................................................................................................ 53 5.3.2 Dermatologie ............................................................................................................................ 54 5.3.3 Urologie und HNO-Heilkunde................................................................................................. 55 5.3.4 Zahnheilkunde .......................................................................................................................... 55

5.4 Vor- und Nachteile der OCT................................................................................................................ 56

6. RESUME - PERSPEKTIVE ................................................................................. 57

7. QUELLEN- UND LITERATURVERZEICHNIS .................................................... 58



1. Einleitung / Motivation Die Medizin ist stets auf der Suche nach nicht-invasiven Verfahren zur möglichst frühzeitigen Diagnose von Krankheiten. Diese Verfahren sollten zum Einen zuverlässig Informationen über das Untersuchungsobjekt liefern und zum Anderen möglichst unproblematisch sein. D.h. der Patient sollte in möglichst kurzer Zeit möglichst unkompliziert untersucht werden können. Hierbei können unnatürliche, kohärente Lichtquellen eine nützliche Hilfe sein. Solche sind insbesondere der Laser, welcher sich aufgrund einiger Eigenschaften sehr gut für einige An-wendungen eignet: - scharfe Bündelung

Der Laser ist aufgrund der scharfen Bündelung des Strahls für Vermessungs- und Scannverfahren gut geeignet (z.B. Lasertomographisches Scannen).

- räumliche und zeitliche Kohärenz

Durch die hohe Kohärenz der Laserstrahlung ist die Bestimmung geometrischer sehr geringer Längenunterschiede in der Interferometrie möglich (z.B. Optische Kohärenz-tomographie (nutzt hohe räumliche Kohärenz, allerdings gewollt kurze Kohärenzlän-gen modifizierter Laser))

- Monochromasie

Da ein Laser sehr monochromatisch ist, können gezielte Anregungen im zu untersu-chenden Gewebe gemacht werden. Durch die Analyse der vom Gewebe wieder ausge-sandten Fluoreszenzstrahlung können Aussagen über dessen Art gemacht werden (la-serinduzierte Fluoreszenz)

- hohe Energiedichte

Die hohe Energiedichte erlaubt es den Laser über die Diagnostik hinaus auch in der Therapie z.B. als Schneidewerkzeug zum Entfernen von u. a. Tumoren oder als Schweißwerkzeug zum Anschweißen einer losgelösten Netzhaut einzusetzen.

Seit einigen Jahren gibt es Verfahren, die dank dieser Lichtquelle dem Patienten unangeneh-me Eingriffe, die Risiken und Nebenwirkungen haben, ersparen. In diesem Vortrag werden drei unterschiedliche Verfahren dargestellt und die zugrunde liegende Physik sowie Anwen-dungsgebiete erläutert:

Laserfluoreszenzspektroskopie

Lasertomographisches Scannen

Optische Kohärenztomographie



2 Laser 2.1 Was ist ein Laser? Das Wort Laser ist ein Akronym und steht für:

Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation Das bedeutet:

Licht-Verstärkung durch stimulierte Emission von Strahlung Der Laser ist eine Lichtquelle und wirkt als Oszillator und Verstärker für monochromatisches sichtbares, infrarotes und ultraviolettes Licht. Er beruht auf dem gleichen Prinzip wie der im Mikrowellenbereich arbeitende Maser (Microwave Amplification by Stimulated Emission of Radiation). Man kann heutzutage Laser aller Wellenlängen zwischen 1µm und 3mm bauen, wobei ihre Leistung zwischen 1µW und 1TW liegt. Auch die Maße eines Lasers variieren sehr stark, so gibt es Halbleiterlaser, die kleiner als 1mm, und Fusionslaser, die größer als 100m sind. ν λ

Abb.: Frequenz- und Wellenlängen- spektrum elektromagnetischer Strahlung [31]

Die Strahlung eines Lasers ist in der Regel in einem engen Strahl gebündelt, der sich nur auf-grund von Beugungseffekten geringfügig aufweitet (z.B. 600nm Laserstrahl von 2mm Durchmesser auf 3cm Durchmesser in 100m Entfernung). Zudem ist sie unter Umständen auch extrem monochromatisch. Das Verhältnis von abgegebener Strahlungsleistung zu aufgewendeter elektrischer Leistung ist der Wirkungsgrad eines Lasers und liegt häufig bei unter 0,1% (es gibt aber auch Laser mit Wirkungsgraden bis zu 40%). Obwohl die Ausgangsleistung vieler Laser sehr gering ist (z.B. 1mW beim He-Ne-Laser), erreicht man aufgrund der starken Fokussierung sehr hohe Strah-lungsintensitäten (z.B. 1GW/cm2 = 1TW/m2). Diese können bei gepulsten Lasern kurzzeitig Werte von 1019 W/m2 erreichen. Die entsprechenden elektrischen Felder haben dann Stärken von etwa 60 MV/m bzw. 60 GV/m beim gepulsten Laser. Das Licht des Lasers entsteht in der Regel durch Übergänge von Elektronen aus energetisch angeregten Atomzuständen, die durch eine Lichtwelle geeigneter Frequenz stimuliert bzw. induziert werden, während konventionelle Lichtquellen Licht nur durch spontane (zeitlich und räumlich unkorrelierte Übergänge aussenden. Beim Laser überlagert sich das erzeugte Licht mit der erregenden Lichtwelle phasengleich, mit gleicher Polarisation und in gleicher Rich-tung. Die Lichtwelle wird somit kohärent verstärkt. Dieses ist allerdings nur dann möglich, wenn mehr Atome im angeregten, als im Grundzustand vorliegen, da dann die induzierte E-



mission gegenüber der Absorption überwiegt. Dieser Zustand wird als Besetzungsinversion bezeichnet. Bei zwei Niveau-Systemen ist dieses nicht möglich. Hier ist die Wahrscheinlich-keit der Emission genauso groß wie die der Absorption, so dass sich höchstens genauso viele Atome im angeregten Zustand befinden, wie im Grundzustand. Das sog. Lasermedium hat somit also mindestens drei Niveaus. Die Anregung des Lasermediums geschieht durch das sog. Pumpen. 2.2 Elektromagnetische Strahlung Ebenso wie Mikrowellen, Radiowellen, Röntgen- und γ-Strahlung ist Licht eine elektro-magnetische Welle. Auch das Laserlicht ist im gesamten Wellenlängenbereich von 1µm bis 3mm eine elektromagnetische Welle, deren elektrische und magnetische Felder E und B durch die Maxwell-Gleichungen (im Vakuum) beschrieben werden:

( )0ερ

=⋅∇= EEdivrr

( ) 0=⋅∇= BBdivrr

( ) BEErot &rrr−=×∇= ( ) jE

cBBrot

r&rrr02

1 µ+=×∇= Aus den Maxwell-Gleichungen folgen die Wellengleichungen:

( ) BEErot &rrr−=×∇= |⋅ rot

⇒ ( )( ) ( ) ( )BrotEErotrot &rrr−=×∇×∇=

Mit der „bac-cab“– Regel ergibt die linke Seite: ( ) ( ) ( ) ( ) EEEE

rrrr∆+∇=∆−∇∇=×∇×∇

0

0

ερ

ερ

Und die rechte Seite ist: ( ) ( ) ( ) ( )jEBBBrot tct

jE

tt

c

rr

321

rr&r

r&r0

12

021

µµ

+−=×∇−=−×∇=− ∂∂

∂∂

+

∂∂

∂∂

Für ρ = j = 0 gehen die Gleichungen über in:

( ) EErr

∆=∆+∇=0

0

ρ

ερ ( ) ( ) EEjE

tctct

j

tct

rrrrr

2

2

22211

0

01

∂∂

∂∂

∂∂

=

∂∂

∂∂ −=−=+− µ

⇒ EEtc

rr2

2

21

∂∂−=∆ ⇔ 02

1 =+∆ EEc&&rr

Analog folgt die Wellengleichung für das magnetische Feld B:

( ) jEc

BBrotr&rrr

02

1 µ+=×∇= |⋅ rot

⇒ ( )( ) ( )

+×∇=

+=×∇×∇= jE

cjE

crotBBrotrot

r&rr&rrr0202

11 µµ

Mit der „bac-cab“– Regel ergibt die linke Seite: ( ) ( ) ( ) BBBBrrrr

∆=∆−∇∇=×∇×∇0

Und die rechte Seite ist: ( ) ( ) ( ) ( )jBjEjEtc

B

tctc

t

rrr

321

rrr

r

×∇+−=×∇+×∇=+×∇∂∂

−

∂∂

∂∂

∂∂

01

01

01

2

2

222 µµµ



Für ρ = j = 0 geht die Gleichungen über in: ( ) BjBtc

j

tc

rrrr

2

2

22

2

21

0

01

∂∂

=

∂∂ −=×∇+− µ

⇒ BB

tc

rr2

2

21

∂∂−=∆ ⇔ 02

1 =+∆ BBc&&rr

Die Wellengleichungen werden durch die Gleichungen ebener Wellen gelöst:

( ) ( )trkieEtrE ω−⋅=rrrrr

0, und ( ) ( )trkieBtrB ω−⋅=rrrrr

0,

Hierbei sind E0 und B0 die Amplituden, k⋅r-ωt ist die Phase. k ist der Wellenvektor und ω die Kreisfrequenz. Durch Einsetzen in die Maxwellgleichungen lässt sich die Transversalität der elektromagnetischen Wellen zeigen:

00

0

=

==⋅∇ρ

ερE

r ⇒ ( ) ( ) 000 =⋅=⋅⋅=⋅⋅∇ −− EkieEkieE trkitrki

rrrrr rrrr ωω ⇒ Ekrr

⊥

0=⋅∇ Br

⇒ ( ) ( ) 000 =⋅=⋅⋅=⋅⋅∇ −− BkieBkieB trkitrkirrrrr rrrr ωω ⇒ Bk

rr⊥

D.h. das elektrische und das magnetische Feld oszillieren senkrecht zueinander senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Welle, welche durch den Wellenvektor k beschrieben wird.

2.3 Kohärenz Die Fähigkeit unterschiedlicher Wellen stationäre Interferenzerscheinungen hervorzurufen wird - abgeleitet vom lateinischen cohaerere1 - mit Kohärenz bezeichnet. Anders ausgedrückt: Zwei oder mehrere Wellen sind genau dann kohärent, wenn sie zeitlich unveränderliche Inter-ferenzphänomene erzeugen können. Dazu ist eine zeitlich konstante Phasendifferenz der Wel-len nötig.

( ) ( ) ( )ϕω itrki eEeEtrE ⋅=⋅= −01011 ,rrrr rr

( ) ( ) ( )ϕϕϕω ∆+∆+− ⋅=⋅= itrki eEeEtrE 02022 ,rrrr rr

Bei inkohärentem Licht addieren sich in der Regel die Intensitäten zweier unterschiedlicher Lichtquellen, die an der gleichen Stelle auftreffen:

21 III +=

1 cohaerere = zusammenhängen

k

Abb.: Momentanbild einer Elektromagnetischen Welle, die sich in x-Rich-

tung ausbreitet [N9]

B



Bei kohärentem Licht hingegen lassen sich Interferenzen zweier elektromagnetischer Wellen mit gleicher Wellenlänge λ = c / ν, Phasendifferenz ∆φ und Intensitäten I1 und I2 beobachten. Die Intensität an einem Ort ist dann:

∆+++= ϕ

λπ sIIIII 2cos2 2121

Hierbei wird der zusätzliche Term als Interferenz- oder Modulationsterm bezeichnet. s ist die Wegdifferenz zwischen beiden Wellen (siehe auch 5.1). Man unterscheidet zwischen zeitlicher und räumlicher Kohärenz. 1.) zeitliche Kohärenz Ein Maß für die zeitliche Kohärenz elektromagnetischer Wellen ist die Länge eines Wellen-zuges, die sog. Kohärenzlänge Lc. Die Kohärenzlänge ist definiert als maximaler Wellenlän-genunterschied smax, bei dem man den Modulationsterm noch beobachten kann. Da die Ge-schwindigkeit der elektromagnetischen Welle im Vakuum die Lichtgeschwindigkeit c ist, lässt sich aus der Kohärenzlänge die Kohärenzzeit berechnen:

c

cLc

τ= ⇔

cLc

c =τ

Die Kohärenzzeit ist mit der spektralen Frequenzbreite ∆ν der elektromagnetischen Welle verknüpft:

cc Lcππτ

ν22

1==∆

Die Kohärenzlänge Lc der Strahlung einer Lichtquelle wird also umso größer, je kleiner die spektrale Halbwertsbreite ∆ν der emittierten Strahlung ist. Damit ist die zeitliche Kohärenz ein Maß für die spektrale Reinheit der elektromagnetischen Strahlung. Zur Veranschaulichung sind in der folgenden Tabelle Kohärenzlänge Lc, Kohärenzzeit τc und Bandbreit ∆ν einiger Strahlungsquellen im direkten Vergleich dargestellt:

λ = c / ν in [µm]

Lc in [m]

τc in [s]

∆ν / ν

Ne 0,6328 3⋅10-2 1⋅10-10 3,4⋅10-6 Cd 0,6438 3⋅10-1 1⋅10-9 3,4⋅10-7 Niederdruck-

spektrallampenKr 0,60578 1⋅102 3⋅10-7 1,1⋅10-9

Laser He-Ne 0,6328 5⋅105 1,6⋅10-3 2,1⋅10-11 Tabelle: Vergleich der Kohärenz bekannter Spektrallampen mit dem He-Ne-Laser [6]

Abb.: Zeitliche Kohärenz [39]



2.) räumliche Kohärenz Unter räumlicher Kohärenz versteht man die Fähigkeit einer Lichtquelle zur gleichen Zeit an verschiedenen Orten stationäre Interferenzphänomene hervorzurufen. Verdeutlichen kann man dieses anhand des Young’schen Doppelspalt-Experimentes, mit welchem man die räum-liche Kohärenz auch messen kann.

Abb.: Skizzen zur Verdeutlichung der räumlichen Kohärenz [3]

a) räumlich ausgedehnte Lichtquelle LQ, deren Licht auf einen Doppelspalt A fällt b) Wegstrecken des Lichtes zu den beiden Spalten

Hierbei beleuchtet die Strahlung einer parallel zur Doppelspaltebene A in der Länge b ausge-dehnte Lichtquelle die zwei Spalte S1 und S2. Die Intensität im Punkt P in der Beobachtungs-ebene B hängt zum Einen von der Wegdifferenz S1P-S2P und zum Anderen von der Phasen-differenz ∆φ in den beiden Punkten S1 und S2 ab. Die Phasen in den Punkten setzen sich aus den Teilphasen von den einzelnen Flächenelementen df der Quelle unter Berücksichtigung der verschiedenen Weglängen dfS1 bzw. dfS2 zusammen. Schwankt die Phasendifferenz ∆φ zwi-schen den Gesamtamplituden in S1 und S2 bei statistischer Emission der verschiedenen Quel-lenpunkte Q um mehr als π, so wird sich die Interferenzstruktur in Ebene B zeitlich wegmit-teln. Dieses ist der Fall, wenn in Abb. b) die Wegdifferenz ∆SR = b⋅sin(θ/2) größer als λ/2 wird. Die Bedingung für eine kohärente Beleuchtung der Spalte lautet also:

( ) 22sin λθ <⋅=∆ bs Mit ( ) 22sin dR =⋅ θ ⇔ ( ) R

d22sin =θ

⇒ ( ) 222 sin λθ <⋅=⋅ bb Rd ⇒ λ<R

bd

⇒ 222

2 λ<Ω⋅=⋅ dFbRd

Das bedeutet also, dass je größer die Fläche F = b2 der Lichtquelle ist, desto kleiner wird der Raum-winkel dΩ, innerhalb dessen die ausgesandte Strahlung räumlich kohärent ist. Abb.: Räumliche Kohärenz [39]



E E2

E1

hν

Grundzustand

angeregter Zustand

E E2

E1

hν

Grundzustand

angeregter Zustand

E E2

E1

hν

Grundzustand

angeregter Zustand

hν

hν

2.4 Absorption, spontane und induzierte Emission Atome und Moleküle liegen in der Regel im stabilen Grundzustand, d.h. dem energetisch günstigsten Zustand vor. Im Grundzustand können sie keine Energie abgeben. Jedes Atom und Molekül besitzt jedoch weitere Zustände, deren Energien größer als die des Grundzustan-des sind. Durch Zufuhr von Energie können die Atome und Moleküle in einen sog. angereg-ten Zustand übergehen. Diesen Vorgang nennt man Absorption, da die dazu notwendige E-nergie von anderen Teilchen kommt, insbesondere von freien Elektronen, oder Lichtquanten, den sog. Photonen, welche von dem Atom oder dem Molekül absorbiert werden. Absorption: Ein Elektron im Grundzustand absorbiert ein Photon mit der Energie hν und wird damit aus dem Grundzustand E1 in einen energetisch höheren (angeregten) Zustand E2 angehoben. Der umgekehrte Vorgang ist die Emission. Sie geschieht plötzlich und unkorreliert und wird daher als spontane Emission bezeichnet. Hierzu muss sich das Atom oder das Molekül in ei-nem angeregten Zustand befinden, um seine Energie in Form eines Photons wieder ab-zugeben: Spontane Emission: Ein Elektron im angeregten Zustand E2 fällt spontan in einen energetisch tieferen Zustand (z.B. den Grundzustand) E1 zurück und gibt die Energie-differenz ∆E = E2 – E1 = hν in Form eines Photons ab. 1917 postulierte Einstein die induzierte Emission von Licht, was die physikalische Grundlage für den Laser ist. Bei diesem Vorgang bleibt das einfallende und induzierende Photon, anders als bei der Absorption erhalten, und regt das an-geregte Atom oder Molekül zur Abregung an. Das emittierte Photon hat die gleiche Wellen-länge, Phase, Polarisation und Ausbreitungsrichtung wie das induzierende Photon und ver-stärkt dieses somit kohärent. Induzierte Emission: Das einfallende Photon der Frequenz hν regt das das Elektron zur Abregung an, welches bei dem Übergang von E2 nach E1 ein in allen Quantenzahlen dem indu-zierenden Photon entsprechendes Photon aussendet.



2.5 Lebensdauer, Ratengleichungen Die Wahrscheinlichkeit der spontanen Emission, also die Wahrscheinlichkeit, dass pro Se-kunde ein Photon von einem angeregten Atom oder Molekül beim Übergang vom Energieni-veau j nach i spontan emittiert wird, wird durch den sog. Einsteinkoeffizienten Aj→i = Aji be-schrieben. Ist das Energieniveau Ej mit der Besetzungszahl Nj besetzt, so ist die Abnahme der Beset-zungszahl dNj pro Zeitintervall dt gegeben durch:

dtNAdN jjij ⋅⋅−= Durch Trennung der Variablen und anschließende Integration folgt die Gleichung für die Be-setzungsdichte in Abhängigkeit von der Zeit und der anfänglichen Besetzungszahl Nj0 bei t=0:

⇒ ∫∫ ⋅−=t

jij

N

N j

tdANdN

j

j 0

~~~1

0

⇒ tANN

jij

j ⋅−=

0

ln ⇒ tAjj

jieNN ⋅−⋅= 0

Die mittlere Lebensdauer τ0 des angeregten Zustandes Nj ist definiert als der Kehrwert der Summe aller Übergangswahrscheinlichkeiten von diesem Zustand aus:

∑=

jiA1

0τ

Die oben stehende Gleichung wird Ratengleichung genannt und in der Regel in folgender Form geschrieben:

jjij NA

dtdN

⋅=− So kann man für jedes Energieniveau eine Ratengleichung sowohl für die Emission, als auch für die Absorption formulieren. Bei einem durch ein Strahlungsfeld hervorgerufenen, also induzierten Übergang (Absorption oder Emission) ist die Wahrscheinlichkeit für den Über-gang auch stark von der spektralen Energiedichte ρ(ν) des Strahlungsfeldes abhängig und wird daher nicht mit dem Einsteinkoeffizienten Aji, sondern mit ρ(ν)⋅Bij beschrieben:

( ) jjij NB

dtdN

⋅=− νρ

Bij ist auch hier eine Konstante, welche die Wahrscheinlichkeit für den Prozess beschreibt. In einem vereinfachten Modell zur Beschreibung der Vorgänge Emission und Absorption von Licht haben viele gleichartige Atome Elektronen in nur zwei (nicht entarteten) Zuständen. Im Grundzustand haben sie die Energie E1 und im angeregten Zustand die Energie E2. Ist N1 nun die Zahl der Atome im Grundzustand und N2 die Zahl der Atome im angeregten Zustand und trifft eine Lichtwelle mit der Frequenz

( )h

EE 1212

−=ν

und der spektralen Energiedichte ρ(ν) auf die Atome, so wird diese z. T. absorbiert. Bei der Absorption gehen die Elektronen aus dem Grundzustand E1 in den angeregten Zustand E2



über, da die Lichtwelle genau die entsprechende Energie E = hν12 = E2 - E1 besitzt. Pro Zeit-einheit ist die Anzahl der angeregten Atome dabei

( ) 1211 BN

dtdN

νρ=− . In dieser sog. Ratengleichung ist B12 eine Konstante, die die Wahrscheinlichkeit für den Ab-sorptionsprozess, also den Übergang der Atome von 1 nach 2 angibt. In der gleichen Zeit finden umgekehrt aber auch Emissionsprozesse statt, die z. T. spontan sind, und von der endlichen Lebensdauer der angeregten Zustände her rühren. Nach Einstein folgt aus der mikroskopischen Umkehrbarkeit des Absorptionsprozesses, dass auch Übergän-ge von 2 nach 1 durch die einlaufende Lichtwelle induziert werden. Die Anzahl der Atome, die pro Zeiteinheit in den Grundzustand übergehen, ist damit:

( )( )212122 BAN

dtdN

νρ+=− . A21 ist hier die Konstante, welche die Wahrscheinlichkeit für die spontane, und B21 die Kon-stante, welche die Wahrscheinlichkeit für die induzierte Emission angeben. Im thermischen Gleichgewicht der Atome mit der Strahlung sind die sog. Besetzungszahlen N1 und N2 zeitlich konstant, es finden also genauso viele Emissions- wie Absorptionsprozesse statt. Das Verhältnis N2/N1 ist dabei durch den Boltzmann-Faktor gegeben:

−=

Tkh

NN

B

νexp1

2 .

Abb.: Anzahl der Atome eines 2-Niveausystems im angeregten und im Grundzustand bei

unterschiedlichen Temperaturen gemäß der Boltzmann-Verteilung

Da im thermischen Gleichgewicht

dtdN

dtdN 21 −=− ist, gilt für die spektrale Energiedichte ρ(ν):

( ) 1211 BN

dtdN

νρ=− = ( )( )212122 BAN

dtdN

νρ+=−

⇔ ( )

( )( ) 1

2

2121

12

NN

BAB

=+ νρνρ mit

−=

Tkh

NN

B

νexp1

2

⇔ ( )( )

( ) ( ) 12

21

12

21

12

21211BB

BA

BBA

e Tkh

B

+=+

=

− νρνρ

νρν

⇔ ( )νρ

ν

212112 1

ABeB Tk

h

B =−⋅

−

⇔ ( )2112

21

BeB

A

Tkh

B −⋅

= ννρ (spektrale Energiedichte)

E E2

E1

T0 = 0K T2 < T3 < T4 T4 = ∞ T0 < T2 < T3



E E3

E2

hν

Grundzustand

angeregter Zustand

E1

Die Koeffizienten A und B lassen sich nun noch durch den Vergleich mit der Plankschen Strahlungsformel bestimmen:

( )1

12, 5

2

−

⋅=

⋅⋅

TkchS

Be

chTEλ

λπλ (Emissionsvermögen);

mit c = λ ⋅ ν ⇔ λ = c / ν ergibt sich:

213

3

218 B

chA νπ

= und 2112 BB = . Das Zahlenverhältnis von induzierten zu spontanen Emissionsprozessen thermischer Strahler ergibt sich somit zu:

( )

1

1

21

21

−

=Tk

h

BeA

Bν

νρ.

Im sichtbaren Bereich des Spektrums ist dieses Verhältnis sehr klein (10-5 für T = 2000K und λ = 600nm), was bedeutet, dass dort thermische Strahler wie Glühbirnen fast nur durch spon-tane Emissionen Licht abgeben. Zudem ist bei thermischen Strahlern auch nur ein sehr gerin-ger Bruchteil der Atome im angeregten Zustand (N2/N1 ≈ 10-5), und somit die Zahl der Ab-sorptionsprozesse deutlich höher, als die der induzierten Emission. Da (N1 – N2)ρ(ν)B12 also positiv ist, wird die erregende Lichtwelle stets geschwächt. Um die Lichtwelle durch induzier-te Emission zu verstärken, muss N2 > N1 sein, was nur bei der sog. Besetzungsinversion mög-lich ist. 2.6 Besetzungsinversion, Lasermedium / aktives Medium Um eine Besetzungsinversion, also ein überbesetztes, angeregtes Niveau zu realisieren, ist also ein System nötig, das aus mindestens drei Niveaus besteht. Dieses System ist das sog. Lasermedium. Dabei eignet sich noch lange nicht jedes System mit mehr als zwei Niveaus zum Bau eines Lasers, da eine Besetzungsinversion nur dann möglich ist, wenn ein mittleres Niveau metastabil ist und Atome sich somit länger in diesem Zustand, als im angeregten Zu-stand verbleiben. 3-Niveau-Laser:

Zur Erzeugung von Besetzungsinversionen sind zudem nicht nur zwei, sondern mindestens drei Energieniveaus E3 > E2 > E1 notwendig. Die Pumpenergie bewirkt dabei einen Übergang von 1 nach 3, wobei die Inversion N3 > N1 erreicht wird, wenn dieser Übergang optisch verboten ist (nach den Auswahlregeln für Dipolstrahlung). In diesem Fall kann das System nur über den Zustand 2 in den Grundzustand 1 zurückkehren. Durch einen strahlungslosen Übergang von 3 nach 2 (mit kleiner Energiedifferenz) ist dann auch eine Be-setzungsinversion der Zustände 2 und 1 möglich, wobei der Übergang von 2 nach 1 als Laser-Übergang fungiert.



E E4

E3

hν

Grundzustand

angeregter Zustand

E2

E1

4-Niveau-Laser:

Das Strahlungsfeld ρ passt nur genau auf den Übergang 1 → 4, daher werden nicht auch die anderen Niveaus angeregt. Der 4-Niveau-Laser funktioniert ähnlich wie der 3 Niveau Laser, nur mit 4 anstelle von 3 Niveaus. Das „vierte“ Niveau liegt dabei zwischen dem überbesetzten Laser- und dem Grundzustand, so dass die Elektronen beim Laserübergang in dieses Niveau übergehen und erst von dort aus in den Grundzustand zurückkehren. Von dort aus werden sie dann wieder in das Niveau E4 angeregt.

Als Lasermedium kommen viele unterschiedliche Substanzen in Frage. Sie liegen sogar in völlig unterschiedlichen Aggregatzuständen vor. Zum Beispiel:

Lasertyp Lasermedium Aggregatzustand

He-Ne-Laser (Helium,) Neon gasförmig Farbstoff(Dye-)laser Farbstoffmoleküle flüssig Rubin-, Nd:YAG-, Ti-tan-Saphir-Laser

Kristalle (Rubin, Nd:YAG, Titan-Saphir)

fest

2.7 Pumpen Um durch induzierte Emission Lichtverstärkung zu bewirken, muss dem Lasermedium Ener-gie (die sog. Pumpenergie) zugeführt werden. Während bei Flüssigkeiten und Festkörpern diese Energie durch Licht eingestrahlt wird, erfolgt die Zufuhr von Energie bei Gaslasern durch Elektronenstöße in einer elektrischen Gasentladung. Bei einem 3-Niveau-Laser bewirkt die Pumpenergie den Übergang von 1 nach 3, bei einem 4 Niveaulaser den Übergang von 1 nach 4. Der Übergang in andere Niveaus findet nicht statt, da die Pumpenergie genau der Differenz

14.3 EEE bzwPump −=

entspricht. Der Vorgang der Zuführung der Pumpenergie wird mit Pumpen bezeichnet.



Pumpprozesse bei unterschiedlichen Lasern (Übersicht):

Gaslaser Stoßanregung der Atome, Ionen oder Moleküle in Ga-sen und Plasmen

Festkörper- und Farbstofflaser

Anregung durch externe, elektromagnetische Strah-lung, d.h. durch sog. optisches Pumpen

Halbleiterlaser Anregung durch Stromdurchgang, d.h. Ladungsträger-injektion in Halbleitern

chemische Laser Chemische Reaktionen

2.8 Linienbreite Die von einem Lasermedium emittierten Photonen sind nicht 100% monochromatisch. Drei mögliche Prozesse verbreitern das Emissionsprofil: Natürliche Linienbreite: Aufgrund der Heisenbergschen Energie-Zeit-Unschärferelation ist die Energie bei einer Le-bensdauer τ des Zustandes nur auf ∆E = h / 2πτ genau bestimmbar. Daraus resultiert die Un-schärfe der entsprechenden Frequenz ∆ν = ∆E / h = 1 / 2πτ und somit ein verbreitertes Emis-sionsprofil. Stoß- / Druckverbreiterung: Bei manchen Lasermedien ist es möglich, dass durch Stöße strahlungslos Energie den Mole-külen entzogen oder hinzugefügt wird. Dadurch verkleinert bzw. vergrößert sich die Energie-differenz beim Laserübergang und es kommt zur Aufweitung des Emissionsprofils. Die Ener-giedifferenz wird in Rotations-, Vibrations- oder Translationsenergie umgewandelt. Dopplerverbreiterung: Da sich die Atome bzw. Moleküle des Lasermediums je nach Aggregatzustand und Tempera-tur mehr oder weniger in Bewegung befinden geschieht gemäß dem Doppler-Effekt eine Fre-quenzerhöhung bei einer Relativbewegung in Emissionsrichtung und eine Frequenzerniedri-gung bei entgegengesetzter Bewegung. 2.9 Laser-Resonator, Lasermoden In einem Laser wird das Licht durch eine Anordnung zweier Spiegel immer wieder durch das Lasermedium (das Gebiet, in dem Besetzungsinversion herrscht) geleitet. Von dem lateini-schen Wort „resonare“ (= zurücksingen, hallen) abgeleitet, nennt man dieses einen optischen Resonator. Im Resonator wird das Licht beim Hin- und Herlaufen zwischen beiden Spiegeln immer weiter verstärkt, bis der Leistungszuwachs innerhalb des Systems durch die Abnahme der Besetzungsinversion und die immer stärker ansteigenden Verluste ausgeglichen wird.



Um das Laserlicht zur Anwendung aus dem Resonator auszukoppeln, ist mindestens einer der beiden Spiegel teilweise durchlässig. Dabei beschreibt man die Durchlässigkeit der Spiegel mit dem Reflexionskoeffizienten R für die Intensität.

%1001 ==R : totale Reflexion / keine Transmission %00 ==R : totale Transmission / keine Reflexion

(vorausgesetzt es gibt im Spiegel keine Absorption) Wie oben bereits angesprochen, muss bei einem Umgang des Lichtstrahls durch den Resona-tor die Verstärkung die Verluste (inklusive der Auskopplung) mindestens kompensieren oder sogar übertreffen. Somit liegt der Reflexionskoeffizient je nach Laser zwischen etwa 85% und 99%. Hierbei ist die Geometrie der Spiegel keineswegs irrelevant. Sie entscheidet darüber, ob ein Resonator optisch stabil oder instabil ist. Häufig wählt man konfokale Spiegel und erhält da-mit folgendes Strahlungsfeld:

Abb.: Strahlungsfeld eines konfokalen Resonators [6]

Abb.: Strahlungsfeld im Resonator [6]

Fabry-Pérot Resonator mit planaren Spiegeln: Hemi- sphärischer Resonator: Konfokaler Resonator:

stabil instabil



Lasermedien mit sehr hoher Verstärkung können auch mit nur einem Spiegel oder ganz ohne Spiegel „lasern“ (Superstrahler, z.B. Stickstofflaser). Mit dem Resonator lassen sich zudem einige Eigenschaften der Laserstrahlung einstellen:

1) Wellenlänge Die Wellenlänge der Laserstrahlung hängt zunächst vor allem von dem benutzten Laser-medium ab. Gibt es in einem solchen Medium allerdings mehrere Laserübergänge (z.B. He-Ne-Laser (vgl. 2.8 Abb. 2)), so lässt sich einer durch die Länge des Resonators aus-wählen: Die Länge des Resonators L muss um eine Verstärkung zu bewirken einem ganzzahligen Vielfachen der halben Laserwellenlänge entsprechen:

2λ⋅= nL ; ,...3,2,1=n

Genau dann kann sich im Resonator eine stehende Welle ausbilden. Durch die Überlage-rung der induzierten Wellen wird das Licht eben dieser einen Frequenz verstärkt.

Auf ein und dieselbe Resonatorlänge L passen mehrere stehende Wellen, deren Wellen-länge dann aber entsprechend unterschiedlich ist.

Diese unterschiedlichen stehenden Wellen nennt man Resonator-Moden. Da die spektrale Bandbreite ∆ν bei einem atomaren Übergang deutlich breiter als der Mo-denabstand ist, schwingt der Laser in verschiedenen Moden:

Resonatorlänge L

Spiegel 1 Spiegel 2

λ / 2

λ / 2

λ / 2

Spiegel 1 Spiegel 2

Resonatorlänge L



Profil eines spontanen atomaren Übergangs Resonatormoden Ein Laser hat demnach in der Regel ein Modenspektrum, das wie folgt aussieht:

Durch interferometrische Bauteile wie sog. Etalons lässt sich ein Monomodenbetrieb, also ein Betrieb, bei dem der Laser nur die Wellenlänge einer Mode emittiert bewerkstelligen. 2) Polarisation Zwischen den beiden Spiegeln des Resonators gibt es die Möglichkeit das Lasermedium durch einen Glaszylinder räumlich zu begrenzen. Durch kippen der Fenster im Brewster-Winkel lässt sich das Laserlicht linear polarisieren, da, wenn ein Lichtstrahl unter dem Brewster- oder auch Polarisationswinkel auf eine Grenzfläche trifft, der reflektierte Teil vollständig linear polarisiert ist. In diesem Fall bilden reflektierter und transmittierter Strahl einen rechten Winkel.

I

ν

I

ν

Spiegel 1 Spiegel 2

I

ν

Brewsterfenster

Laserschwelle (siehe unten) γthr



2.10 Laserschwelle Da primär durch Auskopplung, aber auch durch andere Prozesse Verluste entstehen, beginnt ein Laser erst ab einer bestimmten Intensität zu arbeiten, bei der diese Verluste kompensiert werden. Diese Intensität nennt man Laserschwelle. Berücksichtigt man die Verluste durch Auskopplung in den Reflektionskonstanten RSpiegel1 und RSpiegl2, sowie sämtliche andere Ver-luste in der Verlustkonstanten α(n), so ist die Intensität nach einem Umlauf in einem Resona-tor der Länge L gegeben durch:

( ) ( ) ( ) ( )( )11

202 SpiegelSpiegelL RReILI ⋅⋅⋅= − νανγ

νν γ(ν) ist hierbei der Verstärkungsfaktor. Da die Verstärkung die Verluste kompensieren muss, also die Intensität nach einem Umlauf gleich geblieben sein muss, gilt:

( ) ( )02 νν ILI ≥ ⇔ ( ) ( )( ) 1112 ≥⋅⋅−

SpiegelSpiegelL RRe νανγ

Da α, RSpiegel1 und RSpiegel2 konstant sind, ist diese Bedingung nur von γ abhängig und da der Laser ab dem, diese Gleichung erfüllenden, Faktor γ zu arbeiten beginnt, bezeichnet man die-sen Wert mit γthr als Laserschwelle:

( ) ( ) ( )11ln21

SpiegelSpiegelthr RRL

⋅⋅−= νανγ

2.11 Laser-Systeme, Helium-Neon-Gas-Laser Es gibt inzwischen viele unterschiedliche Lasersysteme. Nachdem Theodore Maiman 1960 den ersten Laser (einen Rubin-Festkörperlaser) gebaut hatte, folgten zunächst Gaslaser (Stickstoff-, CO2-Laser, He-Ne-Laser) und anschließend Farbstofflaser, bei denen das laserak-tive Medium flüssig ist. In der folgenden Zeit wurde der spektrale Nutzbereich durch die Wei-terentwicklung von Kristalltechnologien stark erweitert und so kamen durchstimmbare und breitbandige Laser (z.B. Titan-Saphir-Laser) auf den Markt. Neben den kontinuierlichen (Dauerstrich oder englisch continious-wave) Lasern wurden Anfang der 80er Jahren Ulta-kurzpulslaser (Impulsdauern von Pico- und Femtosekunden) und Ende der 80er Jahre Halblei-ter-Laserdioden realisiert. In den 90er Jahren folgten Scheiben- und Faserlaser, die aufgrund neuer Pumpgeometrien sehr hohe Laserleistungen (bis 20kW) erzielen. Einsatz in der Medizin: In der Medizin kommen viele verschiedene Lasersysteme sowohl in der Diagnostik, als auch in der Therapie zum Einsatz. Die folgende Tabelle zeigt einige Laser mit ihren Einsatzberei-chen in der Medizin:

Laser Lasertyp Anwendung in der Medizin

Excimer-Laser: Farbstofflaser Hornhautoperationen HL-Laser: Halbleiterlaser Hornhautscanner, Bodyscanner Argon-Laser: Plasmalaser Netzhautanheftung, Cytometrie He-Ne-Laser: Gaslaser Durchflusscytometrie, Konfokalmikroskopie Titan-Saphir-Laser: Festkörperlaser unterschiedliche Operationen Nd: YAG Festkörperlaser Operationen am Auge



Dabei emittieren die meisten Laser bei festen Wellenlängen gemäß der Laserübergänge des jeweiligen Mediums. Ein paar Beispiele sind im folgenden Bild zusammen mit der Kurve der Empfindlichkeit des menschlichen Auges (weiß) gezeigt:

Abb.: Wellenlängen unterschiedlicher Laser und Laserübergänge [33]

He-Ne-Laser Einer der gängigsten Laser ist der Helium-Neon-Gas-Laser, welcher aufgrund der chemischen Symbole für die Elemente Helium (He) und Neon (Ne) kurz nur He-Ne-Laser genannt wird. Auch in der Medizin wird er bei unterschiedlichen Methoden (wie später gezeigt) angewen-det. Er lässt sich gut zur Veranschaulichung der oben erklärten theoretischen Grundlagen ver-wenden: Ein He-Ne-Laser ist grundsätzlich aus einem Glaszylinder aufgebaut, in dessen Inneren sich unter vermindertem Druck das He-Ne-Gasgemisch befindet. In ihm findet auch die elektri-sche Entladung statt. An beiden Enden hat der Zylinder um den Brewster-Winkel gegen die Zylinderachse gekippte Fenster. Somit kann dort nur Strahlung einer bestimmten Polarisati-onsrichtung reflexionsfrei austreten. Außerhalb des Zylinders liegen senkrecht zur Zylinder-achse zwei Spiegel, zwischen denen die Strahlung so in sich reflektiert wird, dass sie den Zy-linder vielfach durchläuft und bei jedem Durchgang Laserstrahlung induziert bzw. durch diese kohärent verstärkt wird. Die Wellenlänge der sich hierbei ausbildenden stehenden Welle hängt vom Abstand der Spiegel ab. Der Zylinder mit den Spiegeln stellt also einen Resonator dar, der die Verstärkung und Emission in einem nur sehr schmalen Frequenzintervall (∆ν ≈ 1Hz) bewirkt. Einer der beiden Spiegel ist zu einem sehr geringen Teil durchlässig, wodurch die Laser-Strahlung kohärent und extrem monochromatisch in den Außenraum gelangt.



Beim He-Ne-Laser wird die Pumpenergie in der Gasentladung durch Elektronenstoß haupt-sächlich den He-Atomen zugeführt, welche so vom Grundzustand in zwei metastabile Zu-stände mit großer Lebensdauer anhoben werden. Durch Stöße (sog. Stöße zweiter Art) wird die Anregungsenergie der He-Atome auf die Ne-Atome übertragen, wobei für die Ne-Atome eine Besetzungsinversion bestimmter Anregungsniveaus (Laserniveaus) gegenüber tiefer lie-genden Energiezuständen (wie dem Grundzustand) erzeugt wird. Die Ne-Atome emittieren dann Laserstrahlung im roten und infraroten Bereich des Spektrums (632,8; 1152 und 3391nm).

Abb.: Typischer Aufbau eines He-Ne-Lasers [8]

Abb.: Energieschema eines He-Ne-Lasers [8]



3. Laser induzierte Fluoreszenz In vielen Fällen lässt sich mit der Betrachtung einer Substanz oder eines Gewebes unter wei-ßem Licht nicht erkennen, um was für eine Art Substanz oder Gewebe es sich handelt. In ei-nigen Fällen hilft hier die Eigenschaft der Fluoreszenz mancher Moleküle, um diese oder Be-reiche, an die sie gekoppelt sind, zu identifizieren. Bei der laserinduzierten Fluoreszenz regt ein Laserstrahl die Moleküle in einen angeregten Zustand an. Anders als beim Laser selber senden die Moleküle bei der Abregung nicht wieder Licht der gleichen Wellenlänge aus, sondern etwas langwelligeres als das des Lasers. 3.1 Physikalische Grundlagen 3.1.1 Energieniveaus bei Molekülen Ähnlich wie bei Atomen gibt es auch bei Molekülen nur diskrete Zustände (Energien) in de-nen sich das Molekül befinden kann. Diese sind jedoch komplexer, da zusätzlich zu den elekt-ronischen Niveaus (wie beim Atom) noch vibratorisch und rotatorische Niveaus hinzukom-men. Die Energieabstände zwischen elektronischen Zuständen sind am größten und liegen bei einigen eV, die zugehörige Strahlung liegt somit im sichtbaren Bereich. Die Strahlung von Schwingungsübergängen liegt mit etwa 3 bis 10µm im mittleren Infrarot. Die Energiediffe-renzen sind bei Rotationsübergängen am geringsten. Die entsprechenden Wellenlängen sind mit ca. 30 bis 150 µm im fernen Infrarot zu finden. Elektronische Niveaus Wie beim Atom besitzen Moleküle elektronische Niveaus, zwischen denen die Elektronen durch Übergänge unter bestimmten Voraussetzungen wechseln können.

Die Energie eines elektronischen Zustandes wird mit Eel.(i) bezeichnet: ( )ielEE = Vibratorische Niveaus Ein Molekül kann im Gegensatz zum Atom auch zu Schwingungen angeregt werden. Dabei schwingen die Atome des Moleküls auf unterschiedliche Art und Weisen, je nach Art des Mo-leküls um den Gleichgewichtsabstand r0. Ein Hantelförmiges Molekül aus zwei Atomen stellt damit in erster Näherung einen harmonischen Oszillator dar. Die quantenmechanische Energie eines solchen ist:

+⋅=

21vEvib ωh

Hierbei ist v die Vibrationsquantenzahl mit v = 0, 1, 2, …

Abb.: harmonischer Oszillator [2]

E



Reale Moleküle weichen aber z. T. stark von diesem Verhalten ab. Da sich die Atome auf-grund der immer stärker werdenden abstoßenden Coulombwechselwirkung nicht beliebig nah kommen können, steigt das reale Potential für r → 0 zwar ebenso wie das Potential des har-monischen Oszillators steil an und geht gegen Unendlich, jedoch verliert auch die anziehende Wechselwirkung ihre Wirkung, wenn die Atome sich zu weit von einander entfernen. Das vibratorische Potential wird daher viel besser durch das sog. Morsepotential beschrieben:

( )( )20

01 rraonDissoziatiMorse eEEE −−−⋅+=

E0 ist die Nullpunktsenergie des Potentials, EDissoziation die Dissoziationsenergie, r0 der Gleichgewichtsabstand und a ein Parameter. Mit Hilfe der Schrödingergleichung ergeben sich die Energieniveaus dann zu:

( )3222

21

421 vOv

EvE

onDissoziativib +

+⋅−

+⋅=

ωω hh

Abb.: Morsepotential mit diskreten Energieniveaus [2] Rotatorische Niveaus Für jeden einzelnen elektronischen Zustand gibt es eine solche vibratorische Potentialkurve mit den entsprechenden vibratorischen Energieniveaus. Diese werden wiederum von mehre-ren rotatorischen Niveaus, die deutlich enger beieinander liegen, überlagert.

Die Rotationsenergie ist gegeben durch: I

JErot 2

ˆ 2r

=

Hierbei ist I das Trägheitsmoment 2RI ⋅= µ mit der reduzierten Masse µ.

Der Drehimpuls ist gequantelt. Die Eigenwerte von J2 sind: ( ) 22 1ˆh

r+→ JJJ

J ist die Drehimpulsquantenzahl: J = 0, 1, 2, 3, … Die quantenmechanisch Rotati-onsenergie eines Moleküls ist damit:

( )I

JJEE Jrot 21 2h+

==

Abb.: Energieniveaus bei Molekülen Den zwei elektronischen Energieni-veaus sind die Vibrationsniveaus und denen die Rotationsniveaus überlagert [7]

r

E



Die Translationsenergie ist nicht gequantelt und wird daher im Termschema nicht dargestellt. Während eines Übergangs kann sie als konstant angenommen werden. Gesamtenergie Die Gesamtenergie setzt sich nun aus allen drei Teilenergien zusammen:

( ) ( )( )

IJJv

EvEEEEE

onDissoziatiielrotvibielGes 2

121

421 222 hh

h+

+

+⋅−

+⋅+=++=

ωω

3.1.2 Optische Übergänge Das Laserlicht ruft eine induzierte Absorption seiner elektromagnetischen Strahlung hervor, wodurch die Moleküle von einem niedrigeren in ein höheres Energieniveau übergehen. Durch strahlungslose Übergänge in ein tiefer gelegeneres Niveau verlieren sie einen Teil der gewon-nen Energie wieder. Anschließend erfolgt ein optischer Übergang in das höchstliegende Ni-veau des elektronischen Grundzustandes, nicht aber in den Grundzustand selber. Bei diesem Übergang gibt das Molekül einen Großteil seiner Energie in Form von elektromagnetischer Strahlung wieder ab. Diese elektromagnetische Strahlung ist das Fluoreszenzlicht. Welche Übergänge geschehen besagen u. a. die vom Atom her bekannten Auswahlregeln. Bei Molekülen gilt:

1±=∆v D.h. es finden nur Übergänge zwischen benachbarten Schwingungsniveaus statt. Dieses gilt streng genommen nur für den harmonischen Oszillator, bei dem anharmonischen Potential sind mit abnehmender Wahrscheinlichkeit auch ∆v = ±2, ±3, … erlaubt.

0=∆S Ebenso wie beim Atom darf der Spin bei einem optischen Übergang nicht um-klappen.

1±=∆J Der Drehimpuls darf sich ebenfalls nur um + oder -1 ändern. Somit ist das Spektrum eines Moleküls viel linienreicher als das eines Atoms, da zu einer Än-derung des elektronischen Zustand ein sog. Bandensystem gehört. Jede einzelnen Bande ent-spricht einem gleichzeitigen Schwingungsübergang beim elektronischen Übergang, und be-steht wiederum aus einzelnen Spektrallinien, zu denen jeweils ein parallel zum elektronischen Übergang und zum Schwingungsübergang stattfindender Rotationsübergang gehört. 3.1.3 Franck-Condon-Prinzip Die Übergänge werden zudem durch das Franck-Condon-Prinzip beschrieben. Dieses besagt, dass ein Übergang so schnell geschieht, dass das Molekül seine momentanen Atomabstände dabei nicht ändern kann. Im E(r)-Diagramm sind die Übergänge daher stets senkrecht. Mit anderen Worten bedeutet das, dass die wahrschein-lichsten Übergänge bei Kernabständen erfolgen, bei denen die Aufenthaltswahrscheinlichkeit in den Schwin-gungszuständen am größten ist.

Abb.: Franck-Condon-Prinzip [30]



3.1.4 Fluoreszenz Bei der sog. Fluoreszenz wird ein Molekül im Grundzustand durch einfallende Strahlung in einen energetisch höheren Zustand versetzt. Ein solches angeregtes Molekül kann auf ver-schiedene Arten die Energie wieder abgeben. Fluoreszierende Moleküle tun dieses auf eine ganz bestimmte Art und Weise:

Zunächst wird ein Teil der gewon-nen Energie innerhalb eines elek-tronischen Niveaus durch strah-lungslose Übergänge in den vibra-tiorischen Grundzustand wieder abgegeben. Anschließend folgt der strahlende Übergang, bei welchem das Molekül einen Großteil der Energie wieder in Form von Strah-lung abgibt. Diese ist jedoch nicht so energiereich wie die anregende Strahlung und somit langwelliger, da zum Einen schon ein Teil der Energie durch die strahlungslosen Übergänge abgegeben wurde und zum Anderen der strahlende Über-gang nicht in den Grundzustand zurückführt. Nach der Strahlungs-abgabe befindet sich das Molekül immer noch in einem angeregten, aber schon im elektronischen Grundzustand. Die weitere Abre-gung erfolgt wieder strahlungsfrei, bis sich das Molekül wieder im Grundzustand befindet. Da die

Wellenlänge der emittierten Fluoreszenzstrahlung für jedes Molekül charakteristisch ist, las-sen sich anhand ihrer Moleküle voneinander unterscheiden. Die strahlungslose Energieabgabe kann bei einem Molekül auf mehrere Arten geschehen:

- Durch Stöße kann Energie an die Umgebung abgegeben werden, während das Mole-kül im gleichen elektronischen Zustand verbleibt.

- Auch strahlungslose Übergänge zwischen elektronischen Energieniveaus sind mög-lich. Sie erfolgen sehr schnell in 10-12s. Dieser Prozess wird mit internal conversion bezeichnet.

- Eine dritte Möglichkeit ist das sog. intersystem crossing, bei dem ein Molekül von ei-nem Singulett- in einen Triplettzustand wechselt, was natürlich mit einer Umkehr des Spins verbunden ist. Dieses ist optisch verboten und geschieht auch nur mit einer sehr geringen Übergangswahrscheinlichkeit.

Die beiden zuletzt genannten Prozesse finden bei der Fluoreszenz nicht statt. In den folgenden Bildern sind die Absorptions- und Emissionsbanden (mit entsprechendem Wellenlängenmaximum) von drei Fluoreszenzmarkern sowie die Wellenlängen der anregen-den Laserstrahlung gezeigt:

Abb.: Fluoreszenzschema im E(r)-Diagramm [6]



Abb.: Fluoreszenzabsorptions- und –Emissionsprofil dreier handelsüblicher Fluoreszenzmolekülen mit jeweili-gem Wellenlängenmaximum und den Wellenlängen der induzierenden Laser (jeweils oben im Bild) in nm [25]

DAPI: Diamidino-2-Phenylindoldihydrochlorid FITC: Fluoreszein Isothiocyanat TRITC: Tetramethylrhodamin Isothiocyanat



3.2 Methode Die medizinisch genutzte laserinduzierte Fluoreszenz nutzt die Tatsache, dass große Biomo-leküle z. T. selbst fluoreszieren oder zumindest eine fluoreszierende, chemische Gruppe durch eine chemische Reaktion angehängt werden kann. Dadurch lassen sich die entsprechenden Moleküle leicht mittels Fluoreszenz identifizieren. Wie später unter 3.3 in den Anwendungen zu sehen ist dieses Verfahren sehr vielfältig. Da sich die Methoden im Großen und Ganzen aber ähneln wird hier exemplarisch nur die Durch-flusscytometrie erläutert. Durchflusscytometrie (Flow Cytometry / FACS): Die Durchflusscytometrie wird in der Literatur z.T. auch mit FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting) bezeichnet, was ein registriertes Markenzeichen der Firma Becton-Dickinson ist, und wie „Tempo“ anstelle von Taschentuch genutzt wird. Der englische Name „Flow Cyto-metry“ bezeichnet die relativ junge Labortechnik der Unterscheidung unterschiedlicher Teil-chen oder Zellen mit Hilfe der Fluoreszenz. Hierbei werden die unterschiedlichen Eigen-schaften der Teilchen / Zellen untersucht, während sie langsam hintereinander durch eine dünne, meist gläserne Messkammer, die sog. Flusszelle (engl.: „Flow Cell“) fließen. In dieser Messkammer werden die Teilchen / Zellen seitlich von einem Laserstrahl zur Fluoreszenz angeregt. Das emittierte Licht wird anschießend analysiert und die Zellen / Teilchen gegebenenfalls durch Coulomb-Wechselwirkung sortiert. Abb.: Prinzipskizze eines Flow Cytometers mit an-schließender Sortierung (rechts) [25] und handelsübliche dichro-itische Fluoreszenzfilter (unten) [29] Die Geräte zur Erstellung durchflusscytometrischer Analysen heißen gemäß der Methode Durchflusscytometer (engl.: Flow Cytometer) oder wie oben beschrieben „FACS-Geräte“ bzw. kurz „FACS“.

Abb. (rechts): Becton Dickinson FACSAria Sorting Flow Cyto-meter [27]

Abb. (links): Durchflusscytometer der Firma Beckman-Coulter mit Computer zur Datenauswertung [23]



Am Anfang einer jeden Messung gelangt die eigentliche Probe durch die Probennadelspitze in eine schneller als die Probe selbst fließende „Hüll-Flüssigkeit“. Die dadurch erfolgende Be-schleunigung bewirkt, dass die Partikel einzeln, nacheinander in Fokus des Laserstrahls ge-langen. Die resultierende Strahlgeschwindigkeit liegt bei etwa 1-10m/s. So gelangen 100-1000 Teilchen pro Sekunde in den Strahl.

Abb. (links): Überfüh-rung der Probe in einzel-ne Partikel durch Be-schleunigung mittels Hüllflüssigkeit [24]

Abb. (rechts): Messkammer eines Durchflusscytometers [23] Die Teilchen / Zellen kommen von oben (grauer Pfeil) und fließen hinter-einander durch die eigentliche Flusszelle (die Strecke innerhalb der Fluss-zelle ist durch einen grauen Strich gekennzeichnet). Dabei werden die Zellen von einem Laser von der Seite bestrahlt (blau eingezeichnet). Die Größe der Kammer beträgt etwa 4 cm x 7 cm.

Im Laserstrahl geschehen zwei Prozesse, welche die Identifizierung der Teilchen ermögli-chen. Das ist zum Einen die Streuung, welche in Vorwärts- und in Seitwärtsstreuung unterteilt wird, und zum Anderen die Fluoreszenz. 1.) Streulicht Ein Teilchen, das in den Laserstrahl gelangt, verursacht eine Streuung des Laserlichtes. Dabei wird umso mehr Licht gestreut, umso größer das Teilchen ist, und umso mehr Strukturen sich in dessen Inneren befinden. Dabei wird das Licht in unterschiedliche Richtungen gestreut. Daher wird das Streulicht in der Regel an zwei Stellen gemessen:

Abb.: Streulichtdetektion [23]



a) Vorwärtsstreulicht (fast in Richtung des ursprünglichen Strahls) (engl.: Forward Light Scatter oder Low Angle Scatter)

Das Vorwärtsstreulicht ist primär von der Größe der Teilchen abhängig; kleine Teil-chen verursachen ein kleines, große Teilchen ein großes Vorwärtsstreulichtsignal.

Abb.: Vorwärtzsstreulichtdetektion [23] b) Seitwärtsstreulicht (etwa im rechten Winkel zum ursprünglichen Strahl) (engl.: Side Scatter, Orthogonal Scatter oder Right Angle Scatter)

Auch das Seitwärtsstreulicht hängt stark von der Größe der Teilchen ab. Zusätzlich ist es aber auch sehr stark von dem Inhalt einer Zelle abhängig. So streut eine Zelle, in der sich sehr viele Lysosomen2 befinden, das Licht deutlich stärker seitwärts, als eine Zelle mit nur sehr wenigen Lysosomen. Da nach Anfärbung der weißen Blutkörper-chen die Lysosomen unter einem Lichtmikroskop als körnige Strukturen sichtbar wer-den, spricht man bei Lysosomenreichen Zellen auch von „körnigen Zellen“. Diese Körner in der Zelle nennt man Granula und die Körnigkeit einer Zelle Granularität. „Körnige Zellen“ (Zellen mit hoher Granularität / vielen Körnern) zeigen im Durch-flusscytometer also eine starke, weniger „körnige Zellen“ eine schwache Seitwärtsstreuung.

Dieses lässt sich am Beispiel weißer Blutkörperchen verdeutlichen:

Lymphozyt Monozyt Neutrophiler Granulozyt

klein, kaum Granula groß, kaum Granula groß, Granula

Abb.: Weiße Blutkörperchen: Lymphozyt, Monozyt und Neutrophiler Granulozyt [23]

2 Lysosomen: kleine, Enzymspeichernde Bläschen



Abb.: Seitwärtsstreulichtdetektion [23] Die Streulicht-Messergebnisse werden der Anschaulichkeit halber in einer sog. Dot-Plot Gra-phik dargestellt. Hierzu trägt man auf der x-Achse die Intensität des Vorwärts- und auf der y-Achse des Seitwärtsstreulicht auf. So lassen sich anhand von Anhäufungen Zellen, die ähnli-che Streulichteigenschaften haben, erkennen. Am rechts stehenden Beispiel Streulicht-Dot-Plot erkennt man deutlich Ansammlungen glei-cher oder ähnlicher Zellen. Dabei entspricht die grüne Ansammlung: Lymphozyten (klein, kaum Granula) → wenig FSC, wenig SSC blaue Ansammlung: Monozyten (groß, kaum Granula) → viel FSC, wenig SSC rote Ansammlung: Neutrophilen Granulozyten (groß, viel Granula) → viel FSC, viel SSC

Ein realer Streulicht-Dot-Plot sieht da-bei nicht wie der oben stehende, son-dern wie in der Abbildung links ge-zeigt, aus. Jeder Punkt entspricht einem gemessenen Ereignis, also in der Regel einer Zelle. Die Farben werden den Punkten erst bei der Auswertung zuge-ordnet und haben nichts mit der Farbe des Streu- oder Fluoreszenzlichtes zu tun. Abb.: realer Streulicht-Dot-Plot (links) und anschaulicher Streulicht-Dot-Plot (Punkte ent-sprechen Teilchen) (oben) [23]



2.) Fluoreszenzlicht Zusätzlich zur Streulichtanalyse, mit der man wie gezeigt weiße Blutkörperchen unterschei-den kann, kommt nun noch die Fluoreszenzlichtanalyse, die eine Untersuchung einer Vielzahl von Merkmalen auf den Blutzellen erlaubt. Hierzu ist folgendes nötig: Um eine Zelle mittels Fluoreszenz auf ein bestimmtes Merkmal hin zu untersuchen, muss diese Zelle (und zwar nur diese Zelle) fluoreszieren. Da die Zellen in der Regel von allein nicht fluoreszent sind, muss der Zelle eine fluoreszierende Gruppe angehängt werden. Damit sich die fluoreszierende Gruppe nicht an alle Arten von Zellen anhängt, geschieht dieses mit einem Antikörper, der genau gegen das Merkmal gerichtet ist, auf welches die Zelle hin un-tersucht werden soll. Die fluoreszierende Gruppe wurde dabei zuvor dem Antikörper ange-hängt. Man nennt diesen Vorgang das Markieren einer Zelle. Wie die Antikörper mit der fluoreszierenden Gruppe versehen werden ist nicht Gegenstand dieses Vortrags. Es sei hier nur erwähnt, dass solche markierten Antikörper, die sich gegen eine große Zahl von Zellmerkmalen richten, bei verschiedenen Firmen käuflich zu erwerben sind. Da jeweils nur Antikörper, die gegen ein bestimmtes Merkmal vorgehen, eingesetzt werden, sind auch nur die entsprechenden Zellen markiert und werden durch die Fluoreszenz beim Durchqueren des Laserstrahls sichtbar. Eine mögliche, grün fluoreszierende Gruppe ist das sog. FITC (Fluoreszein-Isothiocyanat), eine andere, orange-farben fluoreszierende Gruppe ist das sog. PE (Phycorythrin).

Abb.: Handelsübliche Antikörper, die mit einer fluoreszierenden Gruppe versehen wurden [23] links: CD3 Antikörper (gegen T-Lymphozyten), versehen mit FITC (Fluoreszein-Isothiocyanat) rechts: CD19 Antikörper (gegen B-Lymphozyten), versehen mit PE (Phycorythrin)

Das Markieren der Zellen geschieht vor der Messung in einem Reagenzglas und benötigt eine gewisse Zeit, die sog. Inkubationszeit. Anschließend wird die vorbereitete Probe in das Durchflusscytometer gegeben und wie oben beschrieben zerstäubt und gelangt so stark zerkleinert in den Laserstrahl. Durchquert eine Zelle, die mit dem FITC-Antikörper markiert ist, den Laserstrahl, so leuchtet sie grün auf. Eine orange-farben aufleuchtende Zelle ist dann eine mit einem PE-Anikörper markierte Zel-le.

Abb.: Fluoreszenzlichtdetektion [23]



Auch hier werden die Ergebnisse, wie bei den Streulichtsignalen in einem Dot-Plot darge-stellt. Auch hier entspricht jeder Punkt einem gemessenen Ereignis, also einer Zelle. Dabei ist die grüne FITC-Fluoreszenz auf der x-Achse und die orange-farbene PE-Fluoreszenz auf der y-Achse aufgetragen. Die Farben der Punkte haben jedoch nichts mit der Fluoreszenzfarbe zu tun, sie wurden wieder zur besseren Anschaulichkeit bei der Auswertung eingefärbt.

Abb.: Fluoreszenz-Dot-Plot [23]

Abb.: Fluoreszenz-Dot-Plot eines gesunden Patienten Die grün fluoreszierenden Zellen sind die sog. T-Lymphozyten, die orange-farben fluoreszierenden Zellen die B-Lymphozyten. Die Mengenverhältnisse sind die eines gesunden Patienten, also der Normalfall. Die schwarzen Punkte entsprechen unmarkierten Zel-len. Es sind demnach weder T-, noch B-Lymphozyten. In dem oben beschriebenen Prozess wurden lediglich zwei unterschiedliche Typen von Zellen durch den Einsatz von zwei verschie-denen Fluoreszenzmarkern mit der Durch-flusscytometrie voneinander unterschieden. Moderne Durchflusscytometer für den Routi-neeinsatz unterscheiden standardmäßig vier, besonders gute sogar sechs, verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig. Experi-mentelle Geräte schaffen zehn oder mehr Farben gleichzeitig, sind jedoch für den Rou-tineeinsatz nicht geeignet.

Der oben stehende Streulicht-Dot-Plot zeigt deutlich, dass die durch Fluoreszenz in Unterar-ten unterschiedenen Lymphozyten nur einen kleinen Teil der Probe darstellen. Damit die an-deren Teilchen (Monozyten und Neutrophilen Granulozyten) die Darstellung nicht stören, werden sie bei der Auswertung ausgeblendet. Diesen Vorgang nennt man Gaten.

Abb.: Gaten [23] Das Gaten wird von der Software, nach Selektion des Zelltypes im Streulicht-Dot-Plot mit der Mouse, automatisch vorgenommen (siehe Abbildung oben).



Abb.: Blick in das Innere eines Durchflusscytometers Der bläuliche Laserstrahl verläuft horizontal. Das obere Dreieck ist die Spitze, durch welche die Flüs-sigkeit in den Laserstrahl tropft, die rötlichen Punkte sind fluoreszierende Partikel (links) [34] Durchflusscytometer mit anschließender Zellsortie-rung (unten) [26]

Die meisten Durchflusscytometer können neben der reinen Identifi-zierung der Teilchen / Zellen diese auch voneinander trennen und sie so sortieren. Dieses geschieht nach der oben beschrieben Erkennung: Durch einen scharfen Luftstrom wird der quasi kontinuierliche Strahl in einzelne Tropfen aufge-teilt. Der Analysator gibt nach ge-messener Fluoreszenz das Signal zur negativen Ladung des fluores-zierenden Teilchens. Nichtfluores-zierende Teichen werden positiv geladen. In einem geladenen Kon-densator werden die Teichen an-schließend ihrer Ladung entspre-chend aufgrund der Coulomb-Wechselwirkung abgelenkt und so in zwei unterschiedliche Behälter geleitet. In handelsüblichen Durchflusscytometern sind in der Regel drei unterschiedliche Gaslaser verbaut. Wie in den Absorptions- und Emissions-Abbildungen der Fluoreszenz unterschiedli-cher Marker unter 3.1.4 zu erkennen ist, sind mit einem Argon-, Krypton und einem Helium-Neon-Laser Anregungen vom Ultravioletten bis ins sichtbare Rote möglich. Zwar sind diese Gaslaser nicht kontinuierlich durchstimmbar, lassen sich aber wegen der breitbandigen Ab-sorption der Fluoreszenzmarker zur Anregung in diesem Bereich verwenden. Da jedoch kei-ner der drei erwähnten Laser einen Laserübergang im Bereich zwischen 360nm und 460nm hat, besitzen die Durchflusscytometer zusätzlich noch eine bei etwa 400nm emittierende La-serdiode. Die Detektion der Fluoreszenzstrahlung erfolgt mittels Strahlteilern, Filtern und Photomultiplierröhren. 3.3 Anwendungen Die laserinduzierte Fluoreszenz findet in der Medizin zahlreiche Anwendungen. Um eine Vorstellung von dieser Vielfalt zu bekommen, ohne den Rahmen des Vortrags zu sprengen, kommt an dieser Stelle nur eine kurze Auflistung [19]:



• Bei der automatischen Sequenzierung der DNA mit der Sanger-Methode hat jede der vier terminierenden Basen eines DNA-Stückes ihren spezifischen fluoreszierenden Marker. Wenn die markierten DNA-Moleküle getrennt werden, werden die Marker durch UV-Licht angeregt, und die Identität der Marker wird anhand der Wellenlänge des emittierten Lichtes festgestellt.

• Die Verbindung Ethidiumbromid zeigt kaum Fluoreszenz, wenn sie in einer Lösung ihre Konformation frei ändern kann. Durch Bindung an DNA wird die Fluoreszenz je-doch stark erhöht, was sie nützlich bei der Lokalisierung von DNA-Fragmenten macht, z. B. bei der Agarose-Gelelektrophorese.

• Die Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin fluoreszieren bei Anregung durch UV-Licht, wobei auch bei Proteinen und Peptiden, die diese Aminosäuren ent-halten, Fluoreszenz beobachtet werden kann.

• Auf dem DNA-Chip wird Fluoreszenz verwendet. • Fluoreszierende Proteine wie das GFP (Green fluorescent protein) dienen als Marker

für verschiedenste biologische Vorgänge innerhalb der Zellen wie zum Beispiel die Genexpression.

• Die Aktivierung eines fluoreszierenden Akzeptors nach Fluoreszenzanregung eines benachbarten Donors durch Fluorescence resonance energy transfer (FRET) wird in der Biochemie und der Zellbiologie zu Abstandsmessungen im Nanometerbereich ge-nutzt.

• FISH (Fluorescence in situ hybridization) Chromosomenanalyse • Beobachtung einzelner Moleküle mittels Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie • Tumor und Rheuma Diagnostik

Vier weitere mehr oder weniger wichtige Anwendungsgebiete sollen hier trotzdem etwas ge-nauer dargestellt werden: 3.3.1 HIV und Leukämie Diagnose mit dem Durchflusscytometer HIV Diagnose: In dem unten gezeigten Beispiel ist die HIV-Infektion des 30-jähreigen Patienten bereits be-kannt. Um jedoch ein Bild von der Leistungsfähigkeit seiner Abwehrkräfte zu bekommen, wurde die Anzahl der CD4-positiven T-Lymphozyten, den sog. Helferzellen gemäß der oben beschriebenen Methode der Durchflusscytometrie bestimmt. Dabei erkennt man, dass beim HIV-infizierten Patienten eine deutliche Verminderung der Helferzellen im Vergleich zum Normalfall vorliegt.

Abb.: Fluoreszenz-Dot-Plot von gesundem und HIV-Patienten (oben) [23] und große Anzahl weißer Blutkörperchen (rechts) [23]



Leukämie Diagnose: Bei einem 70-jährigen Patienten wurde mikroskopisch eine erhöhte Anzahl weißer Blutkörperchen (14000/µl) festgestellt. Durch eine anschließende durchflusszytometrische Analyse der Lymphozyten lässt sich erkennen, dass es sich dabei fast ausschließlich um B-Lymphozyten handelt. Bei einem gesunden Menschen überwiegen die T-Lymphozyten.

Abb.: Fluoreszenz-Dot-Plot von gesundem und Leukämie-Patienten [23] Von den vielen möglichen Ursachen lässt sich so auf Leukämie (Blutkrebs) schließen, wobei zur näheren Bestimmung noch weitere durchflusszytometrische Analysen mit unterschiedli-chen Markern durchgeführt. 3.3.2 Speiseröhrenkrebs Diagnostik Bei Sodbrennen und Erbrechen können durch Magensäure, die in die Speiseröhre gelangt, deren Schleimhautzellen geschädigt werden, was zu Speiseröhrenkrebs führen kann. Solche geschädigten Zellen oder sogar Tumorzellen lassen sich unter dem weißen Licht eines ge-wöhnlichen Endoskops nicht erkennen. Besprüht man die Speiseröhre jedoch kurz vor der Untersuchung mit einer fluoreszierenden Vorstufe des Zellfarbstoffes, so haftet diese verstärkt an den erkrankten Zellen an. Mit einem Laser am Endoskop werden die Zellen so gezielt zur Fluoreszenz angeregt und können so von den gesunden unterschieden werden. Anhand der Stärke der Fluoreszenz sind sogar Früh- und Vorstadien zu erkennen. (Näheres zu dieser Me-thode siehe HS-Vortrag Endoskopie von Patrick Litzbarski.)

Abb.: Speiseröhrentumore sind unter Weißlicht nicht erkennbar, fluoreszieren unter dem Laser aber rot [10]



3.3.3 Spermiensortierung mit dem Durchflusscytometer Die Laserfluoreszensspektroskopie wird auch zur Diagnose des „Geschlechtes“ der männ-lichen Spermien eingesetzt. Schon in der Vergangenheit versuchten Menschen, das Geschlecht ihres Nachwuchses zu beeinflussen. So drehten sich zum Beispiel im alten Griechenland Männer beim Beischlaf nach rechts, um einen Sohn zu zeugen. Mit dem gleichen Ziel banden sich im 18. Jahrhundert Franzosen den linken Hoden ab. Heute hat die Wissenschaft eine technische Methode entwickelt, die in Form einer Spermien-sortiermaschine realisiert wurde. Hierzu muss man zunächst verstehen, wie das Geschlecht des Kindes zustande kommt. Be-stimmt wird das Geschlecht durch die Gonosomen3 der Eltern. Die Gonosomen werden ihrem Aussehen nach als X- bzw. Y-Chromosomen bezeichnet. Bei der Kombination XX ist das Geschlecht des Kindes weiblich, bei XY männlich. Die Eizelle der Mutter enthält immer ein X-Chromosom, während die Samenzellen in ihrem Kern entweder ein X- oder ein Y-Chromosom tragen. Welches Geschlecht das Kind haben wird, hängt also davon ab, welche der Samenzellen zur Befruchtung der Eizelle gelangt. Hier greift die Spermiensortiermaschine ein, um das Geschlecht zu beeinflussen. Microsort nennt sich dieses Verfahren, welches sich die unterschiedliche Größe der Chromosomen zu-nutze macht, um den männlichen Samen nach X- und Y-Chromosomen aufzuteilen. Da das X-Chromosom bei allen Säugetieren reicher an genetischem Material ist, als das männliche Y-Chromosom, ist "weiblicher" Samen größer. In einem sog. Flow Cytometer werden die Samenzellen mittels fluoreszierender Farbstoffe und einem ultravioletten Laser durch das unter dem Laser hellere Leuchten des größeren X-Samens unterschieden und anschließend getrennt. Die Schwangerschaft erfolgt dann über künstliche Befruchtung. Die Trefferquote liegt bei Töchtern bei etwa 93%, beim ersehnten Sohn bei nur 73%. Das ist zum einen auf die bessere Erkennbarkeit der Samenzellen mit X-Chromosom zurückzuführen, zum andern auf die größere Erfahrung, denn in den USA wün-schen sich wesentlich mehr Eltern Mädchen. Dieses Verfahren wird seit etwa 1985 bei Tieren und seit 1995 in Amerika auch bei Menschen angewendet. Die einzige Auflage ist dabei, dass ein Paar bereits ein gemeinsames Kind hat, bevor es das Geschlecht des zweiten auswählen darf. Die Kosten für einen Versuch betragen etwa 2200 US $. In Deutschland ist wie in einigen anderen Ländern dieses Verfahren verboten, während einige Länder, wenn die Gefahr einer Erbkrankheit besteht, die von fehlerhaften Genen auf einem Geschlechtschromosom ausgeht, eine Ausnahme machen.

Abb.: Künstliche Befruchtung [26] 3.3.4 Immunfluoreszenz In der Immunologie werden Antikörper durch eine chemische Reaktion mit einer fluoreszie-renden chemischen Gruppe versehen. Die Antikörper binden auch mit dieser Gruppe noch an die mikroskopischen Objekte, die sie bekämpfen. Durch Anregung und anschließende Beo-bachtung der Fluoreszenz lassen sich so zum Einen die Orte, an die die Antikörper binden, und zum Anderen sogar die Antikörper-Konzentration quantitativ bestimmen.

3 Gonosomen: Geschlechtschromosomen



4. Lasertomographisches Scannen (LTS) Mit Lasern lassen sich Körper heutzutage in kürzester Zeit präzise vermessen bzw. Oberflä-chen abscannen. Die Analyse der daraus ermittelten Daten gibt Ärzten (insbesondere Ortho-päden) die Möglichkeit Krankheiten für den Patienten unkompliziert und schmerzfrei zu di-agnostizieren. 4.1 Methode In der Medizin gibt es zwei unterschiedliche Laserscanning Methoden, die in unterschiedli-chen Bereichen ihre Anwendung finden: 1) 3D-Laserscanning Beim 3D-Laserscanning werden mit der sog. Lichtschnitttriangulation die Konturen und O-berflächen des Scanobjekts digital mit Kameras erfasst und von einem Computer ausgewertet. Dabei entsteht eine diskrete Menge von 3D-Abtastpunkten, die sog. Punktwolke. Die Koordi-naten der gemessenen Punkte werden aus den Winkeln und der Entfernung in Bezug zum Ursprung (Gerätestandort) ermittelt. Dabei erreichen moderne Lasermessysteme eine Punkte-genauigkeit von bis zu 1mm am Objekt. Es gibt auch Laserscanner mit Phasenmessverfahren. Diese nehmen zusätzlich zu den Punkt-koordinaten die Intensitätswerte der Oberflächen auf.

Abb.: 3D-Laserscan-Prinzip [36]

Das System besteht also aus einer ortsfesten Digitalkamera, die auf das ebenfalls ortsfeste Objekt gerichtet ist. Der von ihr auf das Ob-jekt zeigende feste Vektor wird hier mit c be-zeichnet. Ein Linien-Laser befindet sich von der Kamera aus gesehen am festen Punkt d, kann jedoch seinen Kopf um den Winkel φ drehen. Die Ebene, welche der Laserlinie mit dem Laserursprung bildet, wird von den bei-den Vektoren l1 und l2 aufgespannt. Die Rota-tion des Lasers um seinen Ursprung geschieht um den Vektor l1 mit dem Winkel φ, d.h. l2 ändert sowohl seine Länge, als auch seine Richtung, während l1 seine Richtung stets bei-behält.

Legt man den Ursprung eines kartesischen Koordinatensystems in den Ausgangspunkt des Lasers wie in der Skizze dargestellt, so dreht der Vektor l2 in der xy-Ebene um den Winkel φ, während l1 senkrecht dazu in z-Richtung zeigt. Die beiden Vektoren sind also:

=

100

1l , ( )( )

−=

0cossin

2 ϕϕ

l

Abb.: Laserscanervektoren [36]



Abb.: 3D-Laserscan-Vektoren [36]

Da die Kamera nun nicht nur aus einem De-tektorpunkt, sondern einem 2 dimensionalen Array , einem CCD Chip besteht, gibt es nicht nur einen c Vektor von der Kamera zum Ob-jekt, sondern n × m Stück:

Der CCD Chip liegt nun in einer zur z-Achse parallelen Ebene, d.h. die einzelnen Pixelvektoren sind im Idealfall durch die Optik alle parallel und stehen senkrecht auf dieser Ebene. Sie kön-nen also durch einen Vektor cij in dieser Ebene zu dem Pixel (i,j) und den oben erwähnten c-Vektor ausgedrückt werden.

ccc ijijrrr

+=~

Die Vektoren ijcr~ beginnen also an unterschiedlichen Koordinaten auf dieser Ebene, nämlich den

einzelnen Pixels des CCD Chips. Denkt man sich den Koordinatenursprung in die Mitte des Pixels (0,0) und die Achsen entlang der (0,0→n) bzw. (0→m,0) Linie, so sind die Zeiger auf die Standpunkte gegeben durch die Vektoren cij:

=

0

000 y

xc

=

0

110 y

xc

=

0

220 y

xc

. . . .

=

00 y

xc n

n

=

1

001 y

xc

=

1

111 y

xc

=

1

221 y

xc

. . . .

=

11 y

xc n

n

. . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . .

=

mm y

xc 0

0

=

mm y

xc 1

1

=

mm y

xc 2

2

. . . .

=

m

nnm y

xc

Abb.: Laserlinie im Bild finden [36]

Ein Computerprogramm durchsucht dann das, für einen bestimmten Winkel φ aufgezeichne-tes Bild Zeile für Zeile nach dem Laserreflex. Dieser ist aufgrund der starken Intensität und deutlichen Rotfärbung leicht von den anderen Pixels zu unterscheiden. Das für einen Winkel aufgenommene Bild wird dabei wie in der Abbildung links durchsucht. Das Programm speichert die so ermittelten Vektoren zu den Laserreflexen. Im nebenstehenden Beispiel also:

c06, c15, c25, c34, c44, c54, c65, c75

0 1 2 3 4 … n

0 1 2 3 4 … m



Nun hat der Computer alle Informationen, die er benötigt, um die dreidimensionale Laserlinie zu berechnen. Dazu bedient er sich für jeden einzelnen der oben ermittelten Pixel einfacher Vektoraddition:

21 lldcrrrr⋅+⋅+=⋅ µηλ

cr Richtungsvektor des Kamperapixels

1dr

Positionsvektor des Lasers von der Kamera aus

1lr

Erster Laserstrahlvektor

2lr

Zweiter Laserstrahlvektor Dieses ist ein Gleichungssystem mit drei Unbekannten (λ, η and µ), welches aber eindeutig zu lösen ist, da die Vektoren dreidimensional sind und man somit auch 3 Gleichungen hat.

⋅+

⋅+

=

⋅

z

y

x

z

y

x

z

y

x

z

y

x

lll

lll

ddd

ccc

2

2

2

1

1

1

µηλ

⇒

⋅+⋅+=⋅⋅+⋅+=⋅⋅+⋅+=⋅

xxxx

xxxx

xxxx

lldclldclldc

21

21

21

µηλµηλµηλ

⇒ λ, η, µ

Anschließend wird mit dem nächsten Bild aus der Laserstellung φ + ∆φ genauso verfahren. Hierbei gibt der Schrittmotor die Information, um welchen Winkel ∆φ er sich gedreht hat, an den Computer weiter, so dass jener diese Information mit dem Bild verknüpfen kann. Anschließend werden die aus allen Bildern gewonnenen Daten vom Computer wieder zu einem dreidimensionalen Bild zusammengesetzt. Dabei werden durch das Verbinden der einzelnen Punkte der gewonnenen Punktwolke Maschen geschaffen. Das Einfärben dieser Maschenflä-chen liefert dann die Oberfläche. Für das Verbinden der einzelnen Punkte gibt es in professioneller Scannersoftware komplizierte Algorithmen, um die Ober-fläche möglichst glatt und detailgetreu darzustellen. Ein einfaches System ist es, die benachbarten Punkte zu Drei- oder Vierecken zu verbinden. Unter benachbarten Punkten versteht man, dass ein Punkt in Linie x in einem Bild t in der Nähe eines Punktes der glei-chen Linie x in Bild t+1 liegt. Ebenso liegt ein Punkt in ein und demselben Bild t in Linie x in der Nähe des Punktes in Linie x+1, da die Laserlinie kontinuier-lich ist.

Abb.: Prinzip des Erstellens der Maschen [36]

CCD Chip

1lr

cr

dr

2lr

Laser

Objekt



Durch die gleichzeitige Auf- nahme eines Farbbildes ist es professioneller Scanner-software möglich, die ent-standenen Maschenflächen mit der entsprechenden Far-be auszufüllen und so ein möglichst realistisches drei-dimensionales Modell zu erschaffen. Nicht alle Laserscanner arbeiten mit rotierenden Linienlasern. Bei vielen bewegt sich der La-serkopf linear auf einer Führungsschiene. Die maximale Auflösung eines Laserscanners ist durch die Auflösung der Kamera und die Schrittgenauigkeit des Schrittmotors bestimmt.

Abb.: 3D-Laserscanning mit einem Bo-dyscanner Durch Verbinden der Punkte entstehen Maschen, die mit Farbe aufgefüllt eine reale Oberfläche darstellen [N14]



2) Konfokales Laserscanning (CLSM confocal laser scanning microscope) Das konfokale Laserscanning ist ebenfalls ein dreidimensionales Laserscanning-Verfahren, welches in der Medizin in der Augenheilkunde und in der Mikroskopie eingesetzt wird. Hierbei wird ein Laserstahl über einen Strahlteiler auf das Objekt gelenkt und in die Probe hineinfokussiert. Von dort aus wird er wieder reflektiert und fällt durch das gleiche Objektiv durch den Strahlteiler, den er zum Teil ohne Ablenkung passiert. Hinter dem Strahlteiler be-findet sich eine kleine Punktblende unmittelbar vor dem Detektor. In der Regel sind die De-tektoren Photomultiplier Röhren (Photo-Multiplier-Tubes PMT) oder CCD Chips. Somit lie-gen Anregungs- und Detektionsfokus konfokal, also übereinander. Aufgrund dieser Anord-nung wird nur Licht detektiert, welches aus der Brennebene reflektiert wurde. Optische In-formationen, die nicht aus dieser Ebene kommen werden zweifach unterdrückt:

1) Da die Beleuchtungsintensität außerhalb des Fokus sehr schwach ist, werden Informa-tionen außerhalb der Brennebene erst gar nicht abgefragt.

2) Das aus anderen Ebenen stammende Licht wird nicht auf die Lochblende fokussiert und erscheint dort somit als Scheibe, die fast komplett geblockt wird (gestrichelte Li-nie)

Abb.: Konfokalmikroskop-Prinzip (oben) [19] Die Dicke der Brennebene hängt von der Schär-fentiefe des verwendeten Mikroskops ab. Die nebenstehende Abbildung zeigt deutlich, dass ei-ne größere Öffnung in der Lochblende eine di-ckere Brennebene bewirkt. Diese führt allerdings zu einer geringeren Schärfe. Abb.: Prinzipskizzen eines Konfokal-Mikroskop mit klei-ner (links) und großer (rechts) Lochblende. Links: Nur das aus der Fokusebene reflektierte Licht (blau) löst ein Signal in der Photo-Multiplieer-Röhre (PMT) aus. Rechts: Auch Licht aus höheren Ebenen löst ein Signal aus.



Um nun ein Bild der gesamten Brennebene zu erhalten muss diese Ebene in x- und y-Richtung abgerastert werden. Da nur bei der Untersuchung von Proben im Labor (z.B. Blut-proben) das Untersuchungsobjekt bewegt werden kann, wird bei Untersuchungen am Men-schen der Laserstrahl mit Spiegeln über diese Ebene gelenkt.

Abb.: Konfokales Scannen einer Brennebene: Durch das drehen der x- und y-Spiegel rastert der Laser die gesam-te Ebene ab [25]

Das schnellstmögliche Durchscannen einer Li-nie geschieht mit einem sich drehenden Poly-gonspiegel, da jede Spiegelseite den Laser-strahl über eine Linie führt.

Es wird also nur das das Licht aus der Brennebene detektiert, so dass ein Schnittbild aus nur dieser Ebene entsteht. Verändert man den Fokus, so scannt man eine andere Ebene. Durch das Zusammensetzen dieser Ebenen auf dem Computer erhält man einen dimensionalen Daten-satz.

Es ist auch möglich anstelle eines Lasers weißes Licht zu benutzen, um auch Farbabbildungen mit einem konfokalen Mikroskop zu erhalten. Hierbei lässt sich das Licht allerdings nicht mit so hohen Intensitäten auf das Objekt fokussieren. Dadurch verlängert sich die Beobachtungs-zeit. Um dieses zu kompensieren besitzen konfokale Weißlichtmikroskope in der Regel meh-rere parallele Strahlengänge, wodurch mehrere Stellen auf der Probe gleichzeitig gescannt werden können. 4.2 Anwendungsbereiche 4.2.1 Netzhautscanning (Laser-Scanning Ophthalmoscope) Um die Netzhaut zu scannen benutzt man in der Regel ein Laser-Scanning Ophthalmoscope, welches das auf dem Verfahren des konfokalen Laserscannings basiert. Hiermit lassen sich Tumore, ebenso wie die Form / Krümmung der Hornhaut bestimmen.



Abb.: Prinzipskizze eines konfokalen Laser-Ophthalmoskop (oben) [14] Die Scaneinrichtung besteht aus zwei galvanisch ver-schiebbaren Spiegelen, welche die Fokalebene in x- und in y-Richtung abrastern. Abb.: Kammerwinkeltumor (links) [14] An der starken Reflexion (blau) kann man sehen, dass hier ein optisch dichteres Gewebe vorliegt, woraus man auf einen Tumor schließen kann.

4.2.2 Gewebe Laser-Mikroskopie Nun werden in konfokale Lasermikroskope nicht nur zur in vivo Untersuchung verwendet. Ein sehr großer Teil dieser Mikroskope ist für die Untersuchung einzelner Proben im Labor ausgelegt. Dabei wird die unter 3.2 dargestellte laserinduzierte Fluoreszenz mit der Technik des konfokalen Lasermikroskops verbunden und so die Stärken beider Verfahren ausgenutzt. Der grundsätzliche Aufbau entspricht dem eines gewöhnlichen konfokalen Laser-mikroskops. Der Unterschied liegt darin, dass neben dem normal reflektierten Laser-licht auch aus Fluoreszenz stammendes Licht detektiert werden kann. Dazu strahlt der Laser mit einer bestimmten, zur Fluo-reszenz anregenden Wellenlänge auf den Probenfokus ein, während das aus der Fluo-reszenz dieser Stelle stammende langwelli-gere Licht hinter der Lochblende, wie oben beschrieben, detektiert wird.

Abb.: Prinzip eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops [25]



Hierbei ist es aufgrund der Technik des Konfokalmikroskops möglich, durch das Abrastern der Ebenen bei unterschiedlichen Fokussierungen ein dreidimensionales Fluoreszenzbild des Gewebes zu erzeugen. Medizinern ist es dadurch möglich, in entnommenen Gewebeproben Tumorzellen zu diagnostizieren.

Abb.: Rot fluoreszierende Zellkerne mit grün

fluoreszierenden Zellwänden [25] 4.2.3 Bodyscanning Das 3D Laserscanning findet im Bodyscanning seine Anwendung. Das Bodyscanning ist ein 3D Laserscanningverfahren, bei dem der komplette menschliche Körper mit Hilfe eines La-sers vermessen wird. Hierzu fahren Laserlinien aus vier, um den Patienten herum angeordne-ten Türmen gleichzeitig den Körper von oben nach unten ab. In den Türmen befinden sich ebenfalls die festen digitalen Kameras, welche den Vorgang aufzeichnen. Ein Computerpro-gramm wertet die Bilder aus, indem es anhand der Kameraposition und der Position der La-serlinie den Ort der Reflexion des Laserstrahls (die jeweilige Stelle des menschlichen Kör-pers) berechnet.

Abb. (oben): Frau im Bodyscanner und ihr drei dimensionales digitales Abbild [37]

Abb. (unten): Mit dem dreidimensio-nalen Abbild lassen sich am Computer Bewegungen simulieren und so mögli-che Krankheiten diagnostizieren. [37]

Das Verfahren dauert nur wenige Sekunden, in denen der Patient bewegungslos in der Mitte der Säulen stehen muss. Die gesamte Auswertung samt Diagnose kann vom Arzt anschlie-ßend bequem am Computer geschehen. Ein Orthopäde kann den Patienten so virtuell am Computer drehen und ihn von allen Seiten betrachten, ohne dass der Patient dazu anwesend ist oder vielleicht für ihn anstrengende oder



unangenehme Bewegungen machen muss. So können Haltungsschäden und Längendifferen-zen der Gliedmaßen leicht erkannt und diagnostiziert werden. Dieses Verfahren wird über den medizinischen Einsatz hinaus auch noch in kommerziellen Bereichen genutzt:

1) Zum einen kann man heutzutage häufig beim Fahrradkauf auf diese Technik zurück-greifen, um problemlos das richtige Fahrrad zu finden. Aus den durch das Bodyscan-ning gewonnen Daten lässt sich die optimale Fahrrad und Sitzposition finden und das richtige Zubehör ermitteln, um die Druckbelastung auf die Hals- und die untere Len-denwirbelsäule, Hand- und Kniegelenke sowie die Sitzknochen zu minimieren.

2) Einige Bekleidungsgeschäfte nutzen den Bodyscanner um Körpermaße für Maßge-schneiderte Kleidungsstücke zu gewinnen. Online-Versandhäuser streben an, mit Hilfe dieser Technik, dem Kunden eine virtuelle Warenanprobe am „eigenen Körper“ zu ermöglichen.

Der primäre Kostenfaktor beim Bodyscanning ist der Anschaffungspreis, welcher bei etwa 100.000 Euro liegt. Somit ist es mit 20 – 40 Euro pro Messung ein relativ preiswertes Verfah-ren. Feetscanning: Analog zum Bodyscanning gibt es auch die Möglichkeit lediglich die Füße zu scannen. Dazu stellt sich der Patient mit einem Fuß in den Fußscanner auf eine Glasplatte. Wie beim Bodys-canning wird auch hier der Fuß mit einer Laserlinie abgefahren und der Vorgang von ortsfes-ten Digitalkameras aufgezeichnet. Die Laser und die Kameras befinden sich hier unter dem Fuß sowie seitlich schräg oberhalb des Fußes. Krankhafte Fußformen wie Senkfüße, Knickfü-ße, Spreizfüße oder Kombinationen aus den bereits genannten, können so einfach diagnosti-ziert werden. Die so bereits gewonnenen Daten können direkt zur Erstellung von z.B. Schuh-einlagen genutzt werden.

Abb.: Funktionsprinzipskizze des Fußscanners: In der Mitte befindet sich der zu messende Fuß auf einer Glasplatte. Darunter und links und rechts von ihm liegen die fahrbaren Laser. Das ganze Bild ist aus der Sichtweise einer der Kameras dargestellt. [37]



5. Optische Kohärenztomographie (OCT) Ein diagnostisches Verfahren zur in vivo tomographischen Darstellung von Gewebe, stellt die optische Kohärenztomographie dar. Da aufgrund der starken Lichtstreuung des menschlichen Gewebes konfokale Laserscanner/-mikroskope kaum in das Gewebe eindringen können benö-tigt man eine neue Technik, die in der OCT gefunden wurde. Auch hier ist sind Laser die Lichtquellen, welche das „Hineinschauen in den Menschen“ ermöglichen. Optische Kohärenztomographie heißt auf Englisch Optical Coherence Tomography und wird daher mit OCT abgekürzt. Es handelt sich hierbei um ein nicht-invasives4, bildgebendes Ver-fahren, welches in der Medizin hauptsächlich zur Diagnose von Netzhautkrankheiten einge-setzt wird. 5.1 Physikalische Grundlagen 5.1.1 Elektromagnetische Wellen, Intensität, Interferenz Die Fähigkeit von Wellen sich gegenseitig zu überlagern nennt man Interferenz. Dabei spricht man von konstruktiver Interferenz, wenn sich zwei Wellenberge überlagern und destruktiven Interferenz bis hin zur Auslöschung, wenn sich ein Wellenberg mit einem Wellental überla-gert. Licht als elektromagnetische Welle wird, wie unter 2.1 bereits erwähnt, durch die Gleich-ungen einer ebenen Welle beschrieben:

( ) ( )trkieEtrE ω−⋅=rrrrr

0, , ( ) ( )trkieBtrB ω−⋅=rrrrr

0, Hierbei sind E(r,t) und B(r,t) die Feldstärken am Ort r zur Zeit t, E0 und B0 die Amplituden, k der Wellenvektor (zeigt in Ausbreitungsrichtung) und ω die Kreisfrequenz. Aufgrund der Ge-ometrie des Michelsoninterferometers (siehe unten) wird hier nur die Ortsabhängigkeit in eine Raumrichtung (hier z-Richtung) betrachtet. Zurzeit t = 0 hat das elektrische Feld die Form:

( ) kzieEzE ⋅⋅= 0

rr

Das reelle elektrische Feld E(t) wird nun zum besseren Verständnis durch das komplexe Feld A(t) ersetzt:

( ) ( )∫∞

+⋅=0

2 νν πν deFtA tirr

mit ( ) ( ) ( )νν πν −=⋅= ∗+∞

∞−

−∫ FdtetEF tirrr

2

Somit enthält A(t) nur die Anteile positiver Frequenzen ν des elektrischen Feldes E(t), das durch den Realteil von A(t) bestimmt ist:

( ) ( )( )tAtErr

Re2 ⋅= Die Intensität ist dort dann:

4 Bei nicht-invasiven Verfahren verändert der Messstrahl weder chemische noch sonstige Eigenschaften des Messobjektes.



( ) ( ) ( ) ( ) ( ) dzzEzEzEzEzEIz

⋅⋅==⋅= ∫ ∗∗rrrrr 2

Entsprechend gilt für zwei aufgeteilte Wellen, die Probenwelle EProbe und die Referenzwelle EReferenz mit der zusätzlichen optischen Weglängendifferenz ∆z:

( ) kziobeobe eEzE ⋅⋅= 0PrPr

rr

und ( ) ( )zzkiferenzferezn eEzzE ∆+⋅⋅=∆+ 0ReRe

rr

Gemäß dem Superpositionsprinzip ist die örtliche Feldstärke, die sich aus den jeweiligen Ein-zelfeldern ergibt, gegeben durch:

( ) ( ) ( )zzEzEzzE ferenzobe ∆++=∆ RePr,rrr

Daraus folgt für die Intensität:

( ) ( ) ( ) 2

RePr, zzEzEzzI ferenzobe ∆++=∆rr

( ) ( ) ( ) ( )zzEzEzzEzE ferenzobeferenzobe ∆+⋅⋅+∆++= RePr

2

Re

2

Pr 2rrrr

( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )zzEzEzzEzzEzEzE RPRRPP ∆+⋅⋅+∆+⋅∆++⋅= ∗∗∗rrrrrr

2

( ) ( ) ( )444 3444 21

MI

RPRP zkIIzzIzI ∆⋅+∆++= cos2

IM ist die Intensitätsmodulation und k⋅∆z die Phasendifferenz zwischen Proben und Referenz-licht. Ist die Phasendifferenz gerade ein ganzzahlige Vielfaches von 2⋅π, so sind beide Wellen in Phase und der Modulationsterm und somit auch die Gesamtintensität wird maximal (kon-struktive Interferenz). In dem Fall, dass die Phasendifferenz ein ganzzahliges Vielfaches von π/2 ist, sind die Wellen um 90° phasenverschoben und der Modulationsterm verschwindet. Sind die Phasen um ein ungerades ganzzahliges Vielfaches von π verschoben, so wird der Modulationsterm negativ und die Gesamtintensität minimal (destruktive Interferenz).

Phasendifferenz Gesamtintensität

π2⋅=∆ nzk n = 0, 1, 2, … ⇒ ( ) 1cos =∆zk RPRP IIIII 2++=

( )2

12 π+=∆ nzk n = 0, 1, 2, … ⇒ ( ) 0cos =∆zk RP III +=

( ) π⋅+=∆ 12nzk n = 0, 1, 2, … ⇒ ( ) 1cos −=∆zk RPRP IIIII 2−+= Aus der maximalen und minimalen Gesamtintensität lässt sich der Kontrast bei einer solchen Intensitätsmodulation im Interferometer berechnen:

( )minmax

minmax

IIII

ontrastK+−

= mit RPRP IIIII 2max ++= ,

RPRP IIIII 2min −+=



5.1.2 Michelson-Interferometer

Das Interferometer nach Michelson ist gemäß unten stehender Abbildung aufgebaut. Hierbei wird das Licht aus der Quelle durch einen Strahlteiler in den sog. Probensstrahl und den sog. Referenzstrahl aufgeteilt. Während das Licht des Referenzstrahls den Weg zwischen dem Stahlteiler und einem dielektrischen Spiegel und wieder zurück läuft, legt der Probenstrahl den Weg zur Probe, wo er reflektiert wird, und wieder zurück zum Strahlteiler zurück. Dort werden beide Strahlen wieder zusammengeführt und mögliche Interferenzen werden vom Detektor erfasst.

Abb.: Michelson Interferometer: Die Abbildung zeigt den Strahlengang von der Quelle (Source) bis zum Detektor (Detector) in einem OCT-Michelson Inter-ferometer (links) [18] Prinzipieller Aufbau eines OCT-Michel-son-Interferometers (unten) [16]

Handelt es sich bei dem Licht um monochromatische Laserstrahlung mit großen Kohärenzlängen, so wird ständig eine Intensitätsmodulation, abhängig von der Stellung des Referenzspiegels, detektiert. Dieses geschieht, weil sich das Laserlicht kohärent überlagert und bei Wegdifferenzen von (2n+1)⋅λ/2 destruktiv überlagert, bzw. bei Wegdifferenzen von n⋅λ verstärkt. In der Weißlichtinterferometrie benutzt man aber gezielt breitbandiges Licht, welches eine sehr Kurze Kohärenzlänge aufweist. So kann es nur dann zu Interferenzen kommen, wenn die Wegdifferenz ∆s der beiden Strahlen kleiner als die Kohärenzlänge Lc ist (∆s < Lc). Im menschlichen Körper wird Licht sehr stark mehrfach gestreut, wodurch die Information, der Tiefe der ersten Streuung verloren geht. Um nun mehrfach gestreute Photonen von einfach gestreuten Photonen unterscheiden zu können, wählt man eine Lichtquelle mit einer kurzen Kohärenzlänge. Weil mehrfach gestreute Photonen eine deutlich größere Wegdifferenz zurücklegen, als direkt zurück gestreute Photonen, interferieren sie bei einer kurzen Kohä-renzlänge nicht mehr mit dem Referenzphoton. So lassen sie sich von den direkt zurück gestreuten Photonen unter-scheiden.

Abb.: Streuung der Photonen im menschlichen Gewebe [16]



Dieses wird in der optischen Kohärenztomographie ausgenutzt, um die gewünschten Tiefenin-formationen zu bekommen. Die Interferenz der Signale aus beiden Armen des Michelson-Interferometers ergibt ein Mus-ter, aus dem man die relative optische Weglänge innerhalb eines einzelnen Tiefensignals (A-Scan) ermitteln kann. In den eindimensionalen Rasterverfahren wird der Strahl dann transver-sal in einer oder zwei Richtungen geführt, womit sich ein flächiges Bild (B-Scan) oder ein dreidimensionales Tomogramm (C-Scan) aufnehmen lässt.

Abb.: Gewinnung eines 3D-Datensatzes aus OCT-Schnittbidern [12]

Damit ist die axiale von der lateralen bzw. die longitudinale von transversalen Auflösung ent-koppelt (im Gegensatz zur konventionellen Lichtmikroskopie). Die axiale Auflösung ist damit nur durch die Bandbreite des verwendeten Lichtes begrenzt, d.h. hohe Auflösung (kleine De-tails können aufgelöst werden) wird mit großen Bandbreiten erreicht. Hierzu sind besondere Lichtquellen nötig, da die Kohärenzlänge die Auflösung bestimmt. 5.1.3 Lichtquellen kurzer Kohärenzlänge, Auflösung Die Wahl der Lichtquelle ist für dieses Verfahren also essentiell. Um eine möglichst kleine Kohärenzlänge und somit eine hohe Auflösung zu erreichen, benötigt man Strahlungsquellen mit einer möglichst breiten Spektralverteilung. Diese sollte möglichst Gaußförmig sein. Zu Beginn der OCT 1993 wurden Laserdioden verwendet, die unterhalb der Laserschwelle betrieben wurden, um eine kurze Kohärenzlänge bei einem hohen Kohärenzgrad zu erhalten. Die Zentralwellenlänge lag bei diesen Laserdioden bei 670nm, ihre Lichtleistung war kleiner als 100µW. Die Weiterentwicklung der Lichtquellen führte zum gepulsten Ti:Saphir Laser bei einer Wellenlänge von 800nm, der entsprechend der kurzen Pulsdauer im Femtosekundenbe-reich ebenfalls kurze Kohärenzlängen produzierte. Aus Kosten- und Wartungsgründen wur-den die Lichtquellen mit Hilfe der Halbleiter- und Lasertechnik weiterentwickelt. Heutzutage werden Superlumineszenzdioden (häufig mit SLD abgekürzt) mit einer Zentralwellenlänge zwischen 815 und 835nm sowie 1300nm verwendet. Das Prinzip von Halbleiterlichtquellen ist die sog. Injektionslumineszenz. Dabei erfolgt in einem flussgepolten pn-Übergang eine strahlende Rekombination von Elektronen und Lö-chern. Hierbei werden die Ladungsträger von außen über den Injektionsstrom zugeführt. Mit steigendem Injektionsstrom nimmt die Zahl der pro Zeiteinheit rekombinierenden Ladungs-



träger zu und damit auch die Lichtleistung der Diode. Bei zu großem Injektionsstrom wird die Diode aufgrund der thermischen Überlastung zerstört. Superluminiszenzdioden sind Halbleiterlaserdioden mit einem, oben beschriebenen, pn-Übergang, aber ohne einen optischen Resonator. Somit werden sie unterhalb der Laserschwel-le betrieben werden, so dass keine Laseraktion auftreten kann. Da die Resonatorfunktion bei Halbleiterlaserdioden an den glatten Oberflächen aufgrund des großen Brechungsindexdiffe-renz HL - Luft von alleine auftritt, muss dieser Übergang verändert werden. Dazu werden auf die HL-Oberfläche sog. Anti-Reflektions-Schichten aufgebracht. Sie bestehen in der Regel aus mehreren λ/4-Plätchen, die eine destruktive Interferenz in Reflektionsrichtung bewirken. Auflösung Die axiale Auflösung lässt sich nun mit der folgenden Formel (hergeleitet aus dem Fourier-verhältnis zwischen Korrelationsbreite und spektraler Breite, gemessen bei voller Breite auf halber Höhe) berechnen:

( )λπλ

∆⋅⋅⋅

=∆202ln2

z

Hier bei ist ∆z die axiale Auflösung, λ0 die zentrale Wellenlänge und ∆λ die volle spektrale Bandbreite bei halber Höhe des Spektrums. Superlumineszenzdioden mit einer Zentralwellenlänge zwischen 815 und 835nm sowie 1300nm und einer spektralen Breite von ∆λ = 20, 22 bzw. 40-45nm haben somit eine Kohä-renzlänge von etwa 15µm.

Abb.: Axiale Auflösung in der OCT bei variierender Bandbreite und zentraler Wellenlänge für unterschiedliche Lichtquellen [19]



5.2 Methode Die optische Kohärenztomographie ist ein interferometrisches, Bildgebendes Messverfahren, welches das Innere des Gewebes bis zu einigen mm tomographisch darstellen kann. Da Photonen, die in biologisches Gewebe eindringen, vielfach gestreut werden, sind Men-schen undurchsichtig. Licht, das von Gewebe zurückgestreut wird, enthält so gut wie keine Informationen über innere Gewebestrukturen mehr. Mit der OCT gelingt es jedoch, genau diejenigen Lichtteilchen herauszufiltern, die ins Gewebe eingedrungen sind, dort genau ein-mal gestreut wurden und anschließend das Gewebe wieder verlassen haben. Diese Lichtteil-chen transportieren Informationen über die Position der Gewebestrukturen, an denen sie ge-streut wurden. Da das Menschliche Gewebe sehr viel Wasser enthält, werden die meisten Photonen stark gestreut und für die Messung unbrauchbar. Die kurze Kohärenzlänge der Photonen gewähr-leistet nun, dass wirklich nur die Photonen, die direkt zurückgestreut wurden gemessen wer-den. Zudem werden bei der OCT Superluminiszenzdioden mit Zentralwellenlängen im nahen Infraroten verwendet, da Wasser dort sehr wenig absorbiert. Bei der OCT werden die genau einmal im Gewebe gestreuten Lichtteilchen anhand ihrer In-terferenzfähigkeit herausgefiltert. Dazu wird ein Lichtstrahl mit einer Kohärenzlänge von nur ca. 10µm senkrecht zur Gewebeoberfläche eingestrahlt und das zurückgestreute Licht mit Hilfe einer interferometrischen Anordnung nach Art eines Michelson-Interferometers analy-siert. Nur einfach gestreutes Licht, dessen Wegstrecke sich vor der des Referenzarms des In-terferometers um weniger als die Kohärenzlänge unterscheidet, trägt zum Interferenzsignal bei.

Sind die optischen Wege der beiden Photonen (Proben- und Referenzphoton) gleichlange, so wird am Detektor ein Interfe-renzbild gemessen. Bei konstruktiver Interferenz ist die Inten-sität sehr groß (IDetektor=Imax). Bei destruktiver Interferenz wird keine Intensität gemessen (IDetektor=0). Ist der optische Wegun-terschied größer als die Kohärenzlänge der Lichtquelle, wird am Detektor kein Interferenzbild, sondern lediglich die dort ankommende Gesamtintensität des reflektierten Lichts (IDetek-

tor=Imax/2). Wenn der Referenzspiegel in eine Richtung (mit einem Pie-zotranslator) bewegt wird, wird das Interferenzbild innerhalb der Kohärenzlänge moduliert. Die Detektion dieser Modulati-on IM wird elektronisch demoduliert, so dass die Einhüllende der Modulation aufgenommen wird. Diese gibt dann Auskunft darüber, aus welcher Tiefe das Photon reflektiert wurde. Abb.: OCT Messung an einem Objekt aus Glas und einem Streuer [13]

a) Aufbauskizze des Objektes b) Modulationsamplitude eines einzelnen OCT A-Scanns c) Gesamtes OCT-Bild aus vielen A-Scanns

Das gemessene OCT-Signal ist die Intensität I in Abhängigkeit von der Zeit t und wird als Zeitdomänen-Signal (Time-Domain TD) bezeichnet. Diese Intensität I(t) ist über die Fourier-Transformation mit der Intensität abhängig von der Frequenz I(ν) verknüpft. Dieses Signal wird als Frequenzdomänen-Signal (Frequency Domain FD) bezeichnet.



Abb.: TD Signal und die Fouriertransformierte da-von, das FD-Signal [19]

Einfach ausgedrückt, bedeutet dies, dass man entweder den Referenzarm in der Länge verän-dert und kontinuierlich die Intensität der Interferenz messen ohne auf das Spektrum Rücksicht zu nehmen (Time Domain) oder die Interferenz der einzelnen spektralen Komponenten erfas-sen (Frequency Domain). Dieses Verfahren wurde erst durch die Verfügbarkeit von schnellen, empfindlichen Kameras und schnellen Rechnern ermöglicht. Hierzu wird noch ein dispersives Element (Gitter oder Prisma) benötigt, welches die unterschiedlichen spektralen Komponen-ten (Licht unterschiedlicher Frequenzen) räumlich separiert. Für das Licht jeder einzelnen Frequenz wird ein eigener Detektor benötigt, weshalb hier line-arrays oder CCD-Chips zum Einsatz kommen.

Abb.: Frequenzdomänen OCT – Prinzip mit [19] Im Gegensatz zum Zeitdomänen OCT befindet sich der Spiegel des Referenzarms in Ruhe und das Interferenzsignal wird nach Wellenlängen räumlich separiert und von einer Serie von Detektoren ausge-lesen.

Der Vorteil der FD-Verfahren liegt in der einfachen und schnellen simultanen Messung. Die vollständige Information über die Tiefe wird hier simultan ermittelt, ohne ein bewegliches Teil zu benötigen. Dadurch lässt sich sowohl die Geschwindigkeit erhöhen, als auch ein me-chanisch weniger anfälliges Gerät bauen. Grundsätzlich sind auch simultane Messungen in der Zeitdomäne möglich, diese erfordern aber nichtlineare Prozesse, die nur bei relativ hohen Lichtintensitäten funktionieren. Dies widerspricht aber der hochsensitiven Messung bei Mess-signalleistungen unterhalb des Nanowattbereichs. Tiefeninformation: In der Frequenzdomäne ist die Messtiefe über die Fouriertransformation mit der Abtastrate verküpft. Hohe Abtastraten bzw. hohe Anzahl von Pixels eines Detektors innerhalb des glei-chen Spektralbereiches erhöhen den Bereich in dem mehrere Objekte eindeutig voneinander unterschieden werden können. Die räumliche Auflösung in Strahlrichtung entspricht daher der Kohärenzlänge des verwende-ten Lichtes. Die kontinuierliche Variation der Referenzarmlänge in Kombination mit latera-lem Vorschub der Optik erlaubt schließlich die Darstellung von 2-dimensionalen Schnittbil-dern senkrecht zur Gewebeoberfläche.



Dargestellt wird die räumliche Verteilung des Streukoeffizienten. Ab einer Tiefe von ca. 2mm lassen sich die Interferenzoszillationen, die durch die kontinuierliche Veränderung der Refe-renzarmlänge provoziert werden, nicht mehr aus dem Untergrund der mehrfach gestreuten Lichtteilchen herausfiltern, da die Zahl der bis in diese Tiefe vorgedrungenen genau einmal gestreuten Teilchen nur noch sehr gering ist. Die Schnittbilder werden analog zur Sonographie im A-Modus aufgenommen und zu zweidi-mensionalen Tiefenschnitten (B-Modus) zusammengesetzt (siehe oben).

In der Praxis wird die starre Apparatur des Michelson-Interferometers z. T. durch Lichtwellenleiter ersetzt. Dieses macht zum Einen das mühsame Arre-tieren der Strahlengänge überflüssig und beseitigt deren Empfindlichkeit gegenüber Erschütterungen und erlaubt zum Andern die OCT auch an nicht direkt zugängigen Körperstellen anzu-wenden. Hierbei ersetzt ein optischer Koppler (50:50) den Strahlteiler. Abb.: Herstellung eines optischen Kopplers aus mehreren Lichtwellenleitern [42] Messtiefen und benutzte Wellenlängen bei unterschiedlichen Materialien:

Material Zentralwellenlänge des verwendeten Lichts

Durchschnittliche Messtiefe

biologische Proben (hoher Wasseran-teil)

NIR* < mehrere cm

Dermatologie (Haut) 830nm < 1,5mm 1300nm < 2,0mm

*Im nahen Infrarot-Bereich (NIR) ist der Absorptionskoeffizient von Wasser relativ gering. Tabelle: Messtiefe und Zentralwellenlänge [13]



5.3 Anwendungsbereiche 5.3.1 Ophthalmologie5

Im Bereich des vorderen Augenabschnittes werden mit der OCT die Hornhaut-dicke, -krümmung und De-fekte der Hornhaut darge-stellt. Im Bereich des hinte-ren Augenabschnittes sind Untersuchungen der Aus-dehnung von Netzhautablö-sungen, Makulalöchern6, Netzhautödeme7, Dicke der Nervenfaserschicht und Ne-ovaskularisationen8 klinisch Routine.

Abb.: Patientin (rechts) an einem OCT der Firma Zeiss mit der Ärztin vor dem Monitor (links). Auf dem Moni-tor ist der Befund eines Makulaloches zu erkennen. [38] Zur Untersuchung der Netzhaut ist die OCT das am Besten geeignete Verfahren. Als nicht-invasives Verfahren ist sie auch bei der lichtempfindlichen Netzhaut unbedenklich, da sie mit breitbandigem Licht mit deutlich geringeren Energiedichten als beispielsweise ein Laser ar-beitet. Einen weiteren Vorteil bietet das kontaktfreie Messen, da die Netzhaut hinter dem Glaskörper des Auges liegt, welcher das optisch kohärente Licht kaum stört, während die Hochfrequenz-Ultraschallwellen bei der Sonographie viel zu stark durch ihn gebeugt werden. Mit der OCT lässt sich also die beste Auflösung der Netzhaut erzielen, ohne sie dabei zu ver-letzen. Die Netzhaut ist mit dem Film eines Photoapparates vergleichbar, es ist die lichtempfindliche Schicht. Die Aderhaut ist die Unterlage, welche die Netzhaut teilweise ernährt. Die stärkste Reflektion zeigt das Pigmentepithel.

5 Ophthalmologie: Augenheilkunde 6 Makulalöcher: Löcher in der Netzhaut 7 Netzhautödeme: Wassereinlagerungen in der Netzhaut 8 Neovaskularisationen: Gefäßneubildung, Gefäßwucherung

Abb.: Aufbau des Auges (oben) In einem OCT-Bild wird die Retina (Netzhaut) um die Fovea herum in einem Schnittbild dargestellt [14]

Foto der Netzhaut mit Fovea (dunkel) in der Mitte und dem gelben Fleck (Sehnerv) rechts (links) Das OCT-Bild wird von links nach rechts durchgescannt [5]



Bei einem kranken Patienten sieht das Bild etwas anders aus. Rechts sind drei Beispiele unterschiedlicher Krankheits-befunde gezeigt [5]: A: Bestandteile des Blutes treten inner-halb der Netzhaut aus, was anhand der schwarzen Kreise und der starken Re-flektion (rot) darüber. B: In der Netzhaut befindet sich eine Bluteinlagerung, die auch im direkten Bild (oben links in der Ecke) zu sehen ist, dort kann man allerdings nicht die Schwellung und den Grund der Schwel-lung erkennen. Blut reflektiert stark, daher erlaubt die OCT solche Diagno-sen. C: Man erkennt deutlich die Einlage-rung einer Flüssigkeit (oft Wasser) hier ist es eine „Enzündungsfüssigkeit“. 5.3.2 Dermatologie9 Neben der Auflichtmikroskopie und der hochauflösenden Sonographie kommt die OCT zur nicht-invasiven morphologischen Untersuchung der Haut zum Einsatz. Hierbei lassen sich mit der Auflichtmikroskopie mit einer ca. sechzigfachen Vergrößerung oberflächliche Pigment-ver-änderungen und Gefäßmuster näher begutachten. Mit der hochauflösenden Sonographie gelingt bei Frequenzen von 20 bis 50MHZ eine Differenzierung von Strukturen innerhalb des

9 Dermatologie: Lehre von der Haut und ihren Erkrankungen (Hautheilkunde)

Das OCT-Bild eines gesunden Patien-ten sieht wie folgt aus: Abb.: OCT-Bild eines gesunden Patienten mit histologischem Schnitt der Netzhaut [4]



Koriums10, wobei die Epidermis aufgrund einer zu geringen Auflösung von 40 bis 100µm nicht ausreichend dargestellt wird. Da jedoch viele Hauterkrankungen wie entzündliche Dermatosen und Tumore im Wesentli-chen epidermale Veränderungen zeigen, kommt hier die OCT zum Einsatz. Sie kann ohne Nebenwirkungen die obersten Hautschichten (das Stratum corneum11, die lebende Epider-mis12 und obere Dermis13) mit einer Messauflösung von etwa 15µm bei einer Messtiefe bis 2mm morphologisch darstellen. Eine solche Untersuchung ist sonst lediglich mit der Histolo-gie möglich, welche jedoch einen invasiven Eingriff mit entsprechenden Nebenwirkungen und Risiken wie Entzündung, Blutung und Narbenbildung erfordert.

Abb.: OCT-Schnittbild der Haut an einer Fingerkuppe. Man erkennt deutlich die schraubenförmigen Schweißdrüsen (links) [19]

Abb.: Unterschiedliche Hautschichten mit bis zur Basalmembran14 eingedrungenen Tumoren (rechts) [16] 5.3.3 Urologie und HNO-Heilkunde Durch den endoskopischen OCT-Einsatz können körperinnere Oberflächen untersucht wer-den. Dabei lässt sich in der Urologie beispielsweise die Infiltrationstiefe und Lage von Bla-sentumoren mittels OCT feststellen, was insofern von Interesse ist, als dass oberflächliche Tumore vom Arzt leicht abgeschabt werden können und tief gewachsene nicht. 5.3.4 Zahnheilkunde In der Zahnheilkunde kann Karies oder eine Zahnschmelzverletzung mit der OCT frühzeitig detektiert werden. Zudem lassen sich Heilungsprozesse am Übergang vom Zahnfleisch zum Zahn bei Parodontosepatienten begutachten. Im Jahre 2002 wurde dieses Verfahren allerdings noch nicht praktiziert.

10 Korium: Lederhaut 11 Stratum corneum: Hornhautschicht 12 lebende Epidermis: Oberste Schicht der Oberhaut (Epidermis) 13 Obere Dermis: Oberste Schicht der Unterhaut (Dermis) 14 Basalmembran: Schicht zwischen Oberhaut und Unterhaut



5.4 Vor- und Nachteile der OCT Anforderungen an OCT-Geräte für die Diagnostik:

- hohe axiale Auflösung - hohe Messtiefe - kontaktfreies Messen - hohe Empfindlichkeit

Zusätzliche Anforderungen für die Anwendung der OCT in der Praxis:

- einfache Bedienbarkeit (möglichst seltenes Nachjustieren) - flexible Erreichbarkeit des Probenortes (Patient) - kurze Messdauer (so klein, dass Bewegungen (Atmung, Herzschlag, etc.) nicht rele-

vant sind) Vergleich mit anderen nicht-invasiven, Bildgebenden, diagnostischen Verfahren:

Verfahren

Auflösung Messtiefe Darstellung von

konfokale Mikroskopie

ca. 1µm ca. 100µm einzelnen Zellen

Sonographie bis zu 16µm 1mm große Strukturen im Gewebe

OCT ca. 15µm 1,5mm kleine Blutgefäße, Zellverbände, Gewebe-

schichten Tabelle: Erreichbare Messtiefe und Auflösung unterschiedlicher Verfahren im Vergleich [13] Vor- und Nachteile der Verfahren im direkten Vergleich:

Verfahren Vorteile Nachteile von OCT gegenüber: konfokale Mikroskopie

- höhere Messtiefe - keine direkten Informatio-nen über Art des Gewebes

Sonographie

- OCT misst berührungslos (z.B. offene Wunden messen)

-



6. Resume - Perspektive Der Vortrag hat gezeigt, wie nützlich Laser in der medizinischen Diagnostik sind, und wie vielfältig sie eingesetzt werden. Und die Möglichkeiten sind noch lange nicht ausgeschöpft. Vieler Orts wird stets weiter nach neuen Möglichkeiten gesucht, Krankheiten frühzeitig und unproblematisch zu diagnostizieren, um sie anschließend therapieren zu können. So erhoffen sich einige Mediziner und Wissenschaftler in baldiger Zukunft mit kleinen, hand-lichen Durchflusscytometern Krankheiten durch einfaches Beleuchten eines Blutgefäßes in der Nase oder dem Ohr zu diagnostizieren. Bei Astronauten wäre so eine völlig unkomplizier-te Ferndiagnose möglich.

Abb.: Zukunftsvisionen: Handliche Durchflusscytometer zur schnellen, unkomplizierten Diagnose direkt am Menschen, ohne Blutproben zu entnehmen [28] Ein Laser ist aber nicht nur zur Diagnose geeignet. Viele Krankheiten lassen sich durch ge-zieltes Bestrahlen mit einem Laser behandeln. So lässt sich beispielsweise bei der OCT nach einer erfolgreichen Diagnose eines Netzhaut-problems das Problem häufig durch Therapie ebenfalls mit einem LASER beheben. Laser können bei einer Vielzahl verschiedener Erkrankungen der Netzhaut und Aderhaut ein-gesetzt werden. Netzhautlöcher können z.B. durch „Punktschweißen“ versiegelt und so die gefährliche Netzhautablösung verhindert werden. Bei der Zuckerkrankheit kommt es durch undichte bzw. krankhaft wuchernde Blutgefäße ebenfalls zu gefährlichen Veränderungen, die mit dem Laser angegangen werden können.



7. Quellen- und Literaturverzeichnis Literatur:

[1] Lasers and Electro-Optics (Fundamentals and Engineering) – Christopher C. Davis, Cambridge Uni-versity Press 1996, New York (USA)

[2] Optische Spektroskopie (Eine Einführung) – Werner Schmidt, Wiley-VCH, 2000, Weinheim (Ger-many)

[3] Laserspektroskopie (Grundlagen und Techniken) – Wolfgang Demtröder, Springer, 2000, Berlin (Germany)

[4] Optical Coherence Tomography of Macular Diseases – Vishali Gupta, Amod Gupta, Mangat R. Do-gra, Taylor & Franci, 2004, New Delhi (India)

[5] Optical Coherence Tomography of Ocular Diseases – Joel S Schuman, Carmen A. Puliafito, James G. Fujimoto, Slack incorporated, 2004, Thorofare (USA)

[6] Laser – Fritz Kurt Kneubühl, Markus Werner Sigrist, Teubner, 1988, Stuttgart (Germany)

[7] Skript Experimentalphysik IV, Prof. Dr. R. Courths, SS2005 (Universität Duisburg-Essen)

[8] Skript Physikalisches Praktikum für Anfänger, Dr. J. Kästner, SS 2005 (Universität Duisburg-Essen)

[9] Skript Laserphysik, Prof. Dr. W. Kleemann, SS 2006 (Universität Duisburg-Essen)

[10] Fluoreszenzdiagnostik und Photodynamische Therapie - B.M. Lippert, S. Schmidt, J.A. Werner, Mar-burger Laser-Zentrum, 2000, Aachen (Germany)

[11] Progress in Biomedical Optics and Imaging Vol. 1, No. 31: Photon Migration, Diffuse Spectroscopy, and Optical Coherence Tomography: Imaging and Functional Assessment – Stefan Andersson-Engels, James G. Fujimoto, Juli 2000, Amsterdam (Nederlands)

[12] Progress in Biomedical Optics and Imaging Vol. 5, No. 5: Coherence Domain Optical Methods and Optical Coherence Tomography in Biomedicine VIII – Valery V. Tuchin, Joseph A. Izatt, James G. Fujimoto, Januar 2004, San Jose (California, USA)

[13] Optische Kohärenztomographie: Dispersive Einflüsse und Anwendungen in der medizinischen Dia-gnostik – Eva Maria Lankenau (Inauguraldissertation zur Erlangung der Dokrorwürde der Medizini-schen Universität zu Lübeck) Lübeck 2002

[14] Untersuchungen von Hornhaut, Kammerwinkelregion, Iris und Linse mit dem Laser Tomographic Scanner (LTS) – Peter Marahrens (Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität Tübingen) Tübingen 1990

[15] Hochauflösendes Laser Scan Ophthalmoskop: Aufbau und Analyse eines digitalen Bildgebenden Systems zur Darstellung der menschlichen Netzhaut – Andreas Plesch (Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaftlich – Mathematischen Fakultät der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg) Heidelberg 1986

[16] Eignung der flächenhaften Detektion zur Erweiterung der optischen Kohärenztomographie an stark streuenden dermalen Strukturen – Aristotel Razvan Lavar (Dissertation zur Erlangung des Doktorgra-des der Humanbiologie der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm) Ulm 1999



Internet:

[17]

http://www.aulag.de/laser-technik-netzhaut.html (AULAG: Augen Laser Gesellschaft mbH Ruhr)

[18]

http://www.meditec.zeiss.com/ (Meditec Zeiss)

[19] http://www.wikipedia.org (Oline-Enzyklopädie Wikipedia)

[20] http://9monate.qualimedic.de/Junge_oder_maedchen (Qualimedic Online Medizin Wissen)

[21] http://www.lmtb.de/bdf/bdf_lena_de.html (Laser- und Medizin-Technologie GmbH, Berlin)

[22] http://www.physik.fu-berlin.de/~brewer/Molek-Spekt-SW.pdf (Universität Berlin)

[23] http://www.med4you.at (Östereichisches Online Medizin Wissen)

[24] http://www.ueb.cas.cz/Olomouc1/LabDol/Research/Flow_cytometry/labdol_flowcytometry.htm (Tschechisches Forschungszentrum)

[25] http://meds.queensu.ca/qcri/flow/index.html (Queens University Kingston, Ontario, Canada)

[26] http://personalpages.manchester.ac.uk/staff/j.gough/default.htm (Universität von Manchester)

[27] http://cyto.mednet.ucla.edu/instrume.htm (UCLA The Janis V. Giorgi Flow Cytometry Laboratory)

[28] nano.med.umich.edu/projects/flow-cytometry.htm (MNiMBS Nanotechnologie-Institut für Biologie und Medizin, Michigan)

[29] http://www.nikon-instruments.com (Firma Nikon)

[30] http://www.ipf.uni-stuttgart.de/lehre/online-skript/index.html (Universität Stuttgart und Universität Kiel)

[31] http://www.fe-lexikon.info/pages/lexikon-e.htm (Lexikon der Fernerkundung)

[32] http://studweb.studserv.uni-stuttgart.de/ (Universität Stuttgart)

[33] http://www.panske.de (Showlaser Unternehmen)

[34] http://www.colostate.edu/Depts/CMB/facilities.htm (Colorado State Universität)

[35] http://www.human-solutions.com (Bodyscanner Unternehmen)

[36] http://www.muellerr.ch (Private engeniering home-page)

[37] http://www.vitus.de/ (Bodyscanner von Vitronic)

[38] http://www.uni-augenklinik.uni-bonn.de (Universitäts- Augenklink Bonn)

[39] http://www.rp-photonics.com (Enzyklopädie der Laser-Physik und Technologie)

[40] http://131.246.237.56/startseite.html (Remote Controlled Laboratory (Verfasser: Universität Keiserslautern))

[41] http://www.fitzpatrick.duke.edu/biophotonics/research/OCT (Duke Universität USA)

[42] www.tpub.com/neets/tm/108-11.htm (Integrated publishing)

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