Ruth Prassl 10. Thüringer Biomaterial – Kolloquium

17. September 2015

LiposomaleLiposomale WirkstoffträgersystemeWirkstoffträgersysteme Vom Konzept bis zur klinischen AnwendungVom Konzept bis zur klinischen Anwendung

1

Drug Drug DeliveryDelivery Systeme Systeme -- WirkstoffträgerWirkstoffträger

Schutz des Wirkstoffes vor enzymatischen Abbau Erhöhung der Löslichkeit des Wirkstoffes

Geschützter Transport an den Wirkort und gezielte Freisetzung des Wirkstoffes vor Ort (targeted drug delivery)

Wozu überhaupt Wirkstoffträger ?

Reduktion der verabreichten Wirkstoffmenge Reduktion der Toxizität von Wirkstoffen Reduktion unerwünschter Nebenwirkungen Langzeitwirkung durch verlangsamte Freisetzung (Retardeffekt)

Erwartete Vorteile:

2

Herausforderungen:

Biologische Verträglichkeit

Beladbarkeit des Wirkstoffträgers

Lagerungsstabilität

Stabilität im Körper, Aufnahme von den Zellen

Freisetzung des Wirkstoffes

Reproduzierbarkeit im Herstellungsverfahren

Up-scaling (Herstellung großer Mengen)

Regulatorische Hürden

Kosten ………

Drug Drug DeliveryDelivery Systeme Systeme -- WirkstoffträgerWirkstoffträger

Oral

Alternative Darreichungsformen zu Injektionen

Inhalativ

3

Flüssigkristalle

..... und viele mehr

Nano-Kapsel

Nano-Kugeln

Protikel - Peptide

Mizellen

S

S

S

S

SH

HS

S

S

S

S

SH

HS

Thiomere

NanotechnologieNanotechnologie Platform für Platform für WirkstoffträgerWirkstoffträger

Liposomen Albumin

4

Alec Bangham (1921-2010)

Geschichte Geschichte –– LiposomenLiposomen als Wirkstoffträger als Wirkstoffträger

1990

Danilo Lasic

Demetrios Papahadjopoulos

1965

Gregory Gregoriadis

1970

5 Yechezkel „Chezy“ Barenholz

Liposomal Doxorubicin FDA approved 1995

Phospholipid Moleküle

amphiphil Hydrophile Kopfgruppe Hydrophobe Ketten

Liposomen sind modulare selbstassemblierende

Systeme

Warum Liposomen ?

MLV Multi Lamellar Vesicles

H2O

LiposomenLiposomen als Wirkstoffträgersysteme als Wirkstoffträgersysteme

“plain“ Liposomen

Wirkstoffe Kontrastmittel

Zielfindungsmoleküle Signalgebende Moleküle

Polymer Oberflächen Polymer Oberflächen Polymer Oberflächen

LUV Large Unilamellar Vesicles

6

DSPE-PEG 2000

„Stealth Liposome“

SterischSterisch stabilisierte stabilisierte LiposomenLiposomen

Wirkstoffbeladung &

„targeting“

Phospholipide: Phosphatidylcholine – Lecithin (EggPC, SoyPC, POPC, DPPC…) Phosphatidylethanolamin - (DPPE, DOPE…..) Kationische oder anionische Phospholipide (DOTMA/DOTAP/DC-Chol oder PS/PA/PG…) Cholesterin PEGyliertes Phosphatidylethanolamin (3-5 mol % DSPE – PEG2000)

7

Polymer Ummantelung

Funktionalisierte Funktionalisierte sterischsterisch--stabilisierte stabilisierte LiposomenLiposomen

Wirkstoffe Signalgebende Gruppen

Radionuklide : 111In, 68Ga MRI : Gd3+, Ironoxid- NPs Fluoreszenz Marker : e.g. Atto655

Erkranktes Gewebe: Tumor, atherosklerotischer Plaque….

Marker Moleküle

Aktives Targeting

8

Zielmoleküle

Regulatorische Peptide, Proteine oder Antikörper

Passives Targeting EPR Effekt

„enhanced permeation and retention“

Gesundes Gewebe

Endothel

Basalmembran

Blutgefäß

Tumor Gewebe

Lysosom

Spezifische oder unspezifische Absorption

Fusion

Zytoplasma

Pinozytose

Lipidaustausch

Endozytose

Endosom

ZellulärereZellulärere Aufnahme von Aufnahme von LiposomenLiposomen

Caveolin Clathrin

9

Polymer Coating: Thiomer gecoatete Liposomen

Kopplung von thiolierten Polymeren an funktionalisierte Liposomen

Orale Applikation: - verbesserte mucoadhäsive Eigenschaften erhöhen die orale Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen

thioliertes Chitosan maleimide-funktionalisiertes Phospholipid

H

SH

H

CH 2 OH

NH

O

OH

H

O

H O O H

SH

H

CH 2 OH

NH

O

OH

H

O

H O O O

O

O

O H

O P

O

O O H

N

N

O

O

Na + Na +

O R 1

R 2

Gradauer et al, J. Control.Release (2014) 10

Lipidmischungen in

organischen

Lösungsmittel

Chloroform/Methanol

Lipide, funktionalisierte Lipide

Markermoleküle

Hydratation

& Vortex

Abdampfen

N2-Strom

Trockener Lipidfilm

Vakuumtrocknung

Liposomen

unterschiedlicher

Größe in Puffer

Dispersion

Beladung / Labelling

Freeze/thaw Suspension

Herstellungsmethoden von Liposomen

Homogenisieren - Beschallen

Membranfilter mit definierter Porengröße z.B. sequentiell 400 nm, 200 nm, 100 nm Filter

Größenextrusion

11

Reversed phase separation, Ethanolinjektion ....

NanoAssemblr

Scale-up

Herstellungsmethoden von Liposomen

Mikrofluidics - schnelles Mischen

Einschrittsynthese

12

Flussraten 2-12 ml/min

Reinigung : Dialyse Zentrifugation Chromatographische Methoden

Liposome Suspension

Charakterisierung : Chemische Charakterisierung Lipid Zusammensetzung / Lipid Integrität Dünnschichtchromatographie Lipidquantifizierung Enzymatische Assays, Anorganischer Phosphor Wirkstoff / Markerkonzentation HPLC/MS, Fluoreszenz Elektrophoresen ….

Reinigung und Charakterisierung von Liposomen

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Biophysikalische Charakterisierung Größenmessung – Photonenkorrelationsspektroskopie Dynamische Lichtstreuung (Malvern Instruments)

Oberflächenladung – Zetapotential Morphologie – Elektronenmikroskopische Methoden Morphologie / Form – Röntgenkleinwinkelstreuung (Small Angle X-ray Scattering, SAXS) Thermisches Verhalten – Differentielle Mikrokalorimetie (Differential Scanning Calorimetry, DSC)

DSC

q (Å-1

)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

I (a

rb. units)

0

2000

4000

6000

8000

10000

z (Å)

-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40

(a

rb.

un

its)

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

SAXS

TEM

14

Mikroskop

Metalloberfläche Glas

Nanopartikel in Lösung

Nanopartikel streuen das Laserlicht

Laserstrahl (ca. 50 µm Durchmesser)

Nanopartikel Tracking Analyse - NTA

Malvern Instruments

Brown´sche Bewegung + Lichtstreuung

15

Gezielte Freisetzung des Wirkstoffes

pH sensitive Lipide

Temperaturerhöhung

Photoaktivierung

Ultraschall

Stabilität, Beladungseffizienz, Freisetzungsverhalten, Wirkung …….

Zellkultur, Biologische Barrieren, Proteincorona, zelluläre Aufnahme …..

Pharmazeutische Entwicklung

16

Präklinische Validierung – geeignetes Tiermodell

Alzheimer

virale Infektionen

Stoffwechsel krankheiten

kardiovaskuläre Krankheiten

bakterielle Infektionen

Krebs

Autoimmun- erkrankungen

Potential

mit

tel

mittel hoch

ho

ch

Wah

rsch

ein

lich

keit

fü

r R

eal

isie

run

g

Anwendungbereiche & Umsetzung

Therapiepotential und Realisierungswahrscheinlichkeiten bis 2020

Baumgartner und Jäckli, 2007

Teilweise in klinischer Phase und erste Produkte schon am Markt

17

18

Liposomale Produkte am Markt

AmBisome ® (Gilead Sciences), Albelcet®(ELAN) : Pilzinfektion Membran interkaliertes Amphotericin B SUV, lyophilisiert Lipide : H-SPC (hydrogenated Soy PC), Cholesterin, DSPG

O

OH O

H

CO2H

OH

OH

O OHOH

OH

OHOH

O

O

OH

NH2

OH

DaunoXome® (Gilead Sciences) : Krebstherapie enkapsuliertes Daunorubicin SUV, wässrige Suspension Lipide : DSPC, cholesterol

Doxil® (ALZA), Caelix® (Janssen-Cilag), Myocet® (Enzon) : Krebstherapie enkapsuliertes Doxorubicin LUV, wässrige Suspension – Blutstabilität 4 Tage Lipide : MPEG-DSPE, H-SPC, Cholesterin Ammonium-gradient Wirkstoffeinbau

http://www.nanopharmaceuticals.org/Liposomes.html

19 Bozzuto G., Molinari, A., (2015), Int.J.Nanomedicine

20 Bozzuto G., Molinari, A., (2015), Int.J.Nanomedicine

21

2015

22 22 22

Nanomedizin von „Nanomedizin von „benchbench toto bedsidebedside“ “

Vom Labor zur Klinik bis zum Market rechnet man mit 10-16 Jahren

Preclinical Phase

Clinical Phase I

Clinical Phase II

Clinical Phase III

Marketing Production

Search /Optimization

of a drug

Search /Optimization

of a drug

Search /Optimization

of a drug

Nanomedicine Start-ups Pharmaceutical Industry

Basic Research Drug screening, galenics

Clinical Phase IV Observation after approval

PreclinicaL Studies in vitro

in vivo animal

Approval market

Clinical Phase I Tolerance, healthy

individuals

Clinical Phase III Tolerance, large group

of patients

Clinical Phase II Tolerance, small group

of patients

Acknowledgements

23