8/3/2019 Meine Resume

http://slidepdf.com/reader/full/meine-resume 1/9

Teknologi DNA rekombinan

 Teknologi DNA rekombinan telah mungkinkan bagi kita untuk: mengisolasi DNA dari berbagai

organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk

DNA rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun

eukariot hingga DNA rekombinan dapat berepilkasi dan bahkan dapat diekspresikan. Jadi,

 Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk

mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-teknik tersebut meliputi:

- Teknik untuk mengisolasi DNA.

- Teknik untuk memotong DNA.

- Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.

- Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup.

perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkat-perangkat yang

ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah: enzim restriksi, enzim DNA ligase,

plasmid, transposon, pustaka genom, enzim transkripsi balik, pelacak DNA/RNA.

Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA

Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung DNA

Plasmid digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau mengklonkan fragmen DNA atau

mengubah sifat bakteri.

Transposon digunakan sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan

penanda.

Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan.

Enzim traskripsi balik digunakan untuk membuat DNA berdasarkan RNA.

8/3/2019 Meine Resume

http://slidepdf.com/reader/full/meine-resume 2/9

Pelacak DNA / RNA digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau

untuk mendeteksi klon yang benar.

Pengertian dan Macam Perpustakaan Gen

Suatu perpustakaan gen dapat diartikan sebagai sekumpulan sekuens (urutan)

DNA dari suatu organisme yang masing-masing telah diklon ke dalam vektor

tertentu untuk memudahkan pemurnian, penyimpanan, dan analisisnya. Pada

dasarnya terdapat dua macam perpustakaan gen yang dapat dikonstruksi,

bergantung kepada sumber DNA digunakan. Jika DNA yang digunakan adalah

DNA genomik/kromosom, maka perpustakaan yang dihasilkan

disebut perpustakaan genom. Sementara itu, jika DNA yang digunakan

merupakan hasil transkripsi balik suatu populasi mRNA seperti yang umum

dijumpai pada eukariot, maka perpustakaan yang diperoleh

dinamakan perpustakaan cDNA.

Hal yang perlu diperhatikan ketika kita melakukan konstruksi suatu

perpustakaan gen adalah bahwa perpustakaan tersebut harus

merepresentasikan semua gen yang ada di dalam sumber DNA asalnya. Dengan

perkataan lain, suatu perpustakaan gen dikatakan representatif apabila berisi

semua sekuens aslinya. Selain itu, jika suatu perpustakaan tidak mengandung

klon dalam jumlah yang mencukupi, maka sangat dimungkinkan hilangnya

beberapa gen tertentu.

Untuk mendapatkan perpustakaan genom yang representatif, DNA genomik

harus dimurnikan dan kemudian dipotong secara acak menjadi fragmen-fragmen

yang ukurannya sesuai dengan keperluan kloning menggunakan vektor yang

dipilih. Fraksionasi sel pada eukariot akan mengurangi kontaminasi oleh DNA

organel (mitokondria, kloroplas). Oleh karena itu, pemurnian DNA genomik

eukariot biasanya dilakukan dengan terlebih dahulu mengisolasi nukleus dan

menghilangkan protein, lemak, serta makromolekul lain yang tidak diinginkan

8/3/2019 Meine Resume

http://slidepdf.com/reader/full/meine-resume 3/9

dengan memberikan protease dan melakukan ekstraksi fenol-kloroform.

Sementara itu, DNA prokariot dapat diekstraksi langsung.

DNA genomik hasil pemurnian tersebut selanjutnya dipotong-potong secara

acak. Pada dasarnya ada dua cara pemotongan, yaitu pemotongan fisik seperti

sonikasi dan digesti menggunakan enzim restriksi. Pemotongan dengan enzim

restriksi akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung tertentu (lihat Bab

IX). Untuk mendapatkan fragmen-fragmen dengan ukuran relatif besar

dilakukan digesti parsialdengan cara mengurangi jumlah enzim restriksi atau

waktu pemotongan yang digunakan Dengan digesti parsial ini enzim restriksi

tidak akan memotong DNA genomik pada setiap tempat pengenalan yang ada

sehingga akan diperoleh fragmen-fragmen DNA genomik yang relatif panjang.

Besarnya Perpustakaan Gen

Besarnya suatu perpustakaan gen dilihat dari banyaknya rekombinan yang

terdapat di dalamnya. Untuk menghitung banyaknya rekombinan yang harus

ada di dalam suatu perpustakaan gen digunakan rumus sebagai berikut.

N = ln (1 – P) / ln (1 – f)

Pada rumus tersebut N adalah banyaknya rekombinan yang harus ada di dalam

perpustakaan gen, P peluang yang diinginkan, dan f nisbah panjang fragmen

sisipan terhadap panjang genom. Sebagai contoh, untuk mendapatkan fragmen

sisipan berukuran 20 kb (20.000 pb) dengan peluang 0,99 diperlukan

perpustakaan gen yang besarnya berbeda antara E .coli dan manusia.

N E. coli = ln (1 – 0,99) / ln (1 – 20.000 / 4,6 x 106) = 1,1 x 103

N manusia = ln (1 – 0,99) / ln (1 – 20.000 / 3 x 109) = 6,9 x 105

8/3/2019 Meine Resume

http://slidepdf.com/reader/full/meine-resume 4/9

Kita bisa melihat bahwa banyaknya rekombinan yang diperlukan untuk

mendapatkan fragmen dengan ukuran dan peluang yang sama ternyata

berbeda, bergantung kepada panjang genom organismenya. Pada E. coli dengan

panjang genom yang lebih pendek (4,6 x 106) daripada panjang genom manusia

(3 x 109) diperlukan rekombinan yang lebih sedikit (1,1 x 103) daripada

rekombinan untuk perpustakaan gen manusia (6,9 x 105).

Perhitungan seperti tersebut di atas juga dapat menjelaskan alasan bahwa

apabila genom suatu prokariot dengan fragmen sisipan sepanjang 5 hingga 10

kb diklon menggunakan plasmid akan menghasilkan perpustakaan gen yang

baik meskipun hanya membawa beberapa ribu rekombinan. Demikian pula,

untuk genom-genom yang besar cukup diperlukan sedikit rekombinan meskipun

fragmen sisipannya panjang. Penggunaan vektor yang dapat mengklon fragmen-

fragmen panjang, misalnya kosmid dan YAC, memungkinkan konstruksi

perpustakaan genom dengan jumlah rekombinan yang tidak terlalu besar.

Amplifikasi Acak Polimorfisme DNA

Dari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas

Belum Diperiksa

Hasil Elektroforesis RAPD

8/3/2019 Meine Resume

http://slidepdf.com/reader/full/meine-resume 5/9

Amplifikasi Acak Polimorfisme DNA merupakan satu jenis penanda molekular yang banyak dipakai

dalam penelitian dan diagnostik biologi molekular . Penanda ini lebih dikenal sebagai RAPD (biasa

dipanggil rapid ), singkatan dari Random Amplification of Polymorphic DNA.[1] Sebagai penandagenetik, RAPD

dikenal sebagai penanda yang relatif murah dan tidak memerlukan keterampilan teknis yang tinggi.[1] Penanda ini

bersifat dominan, dalam arti, ia dapat membedakan kelas genotipe resesif dari kelas-kelas genotipe yang lain.

[1] RAPD memerlukan teknik PCR dan elektroforesis geldalam penerapannya.[2] Kelemahan RAPD yang sangat

dikenal adalah dapat memberikan hasil yang berbeda-beda apabila diulang, sehingga dianggap kurang handal

(reliable), khususnya bagi keperluan diagnostik, seperti sidik jari DNA.[2]

•

[sunting]Prinsip

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) merupakan metode perbanyakan genom yang paling sering

digunakan karena sangat mudah dan membutuhkan jumlah DNA genom yang tidak terlalu banyak.[3] Metode

dasarnya hampir sama seperti PCR, tetapi fragmen genom yang diperbanyak bersifat acak dengan satu atau

banyak primer pada arbitrary sequence (sekuens tidak tentu).[4]Polimorfisme yang terjadi antara individual atau

strain dikenali melalui perbedaan pada fragmen DNA yang diperbanyak oleh primer yang tersedia.[4]

Dalam bekerja, RAPD memerlukan pasangan primer , biasanya berukuran antara 8-mer hingga 12-mer 

(lihat oligo), karena menggunakan teknik PCR. Setiap pasangan primer akan menghasilkan sejumlah pita (band )

yang akan tampak pada hasil elektroforesis gel.[5] Pasangan primer yang dipilih (bisa sudah diketahui atau dipilih

beberapa secara acak) diberikan pada sampel-sampel DNA(disebut DNA templat ) yang sudah dipersiapkan,

selanjutnya PCR dijalankan.[3] Sewaktu proses PCR, primer akan menempel pada urutan-urutan basa yang

komplemen pada DNA templat.[3] Di akhir PCR akan terdapat sejumlah besar fragmen-fragmen pendek DNA

hasil amplifikasi.[3] Apabila terdapat delesi untuk suatu lokasi templat, akan terjadi polimorfisme.[3] Dengan

elektroforesis gel, akan terlihat pita yang terputus-putus apabila terdapat polimorfisme (oleh karena itu bersifat

dominan).[3]

[sunting]Metode

Metode RAPD memberikan kemudahan mereplikasi DNA yang tidak diketahui sekuensnya dan

dalam konsentrasi yang kecil (nanogram) dengan primer-primer yang bersifat tidak tentu (arbitrary primers).

[6] Teknik RAPD yang umum dipakai memerlukan oligonukleotida sintesis pendek, berukuran sekitar 10 basa dari

sekuens acak.[6] Primer ini biasanya telah disiapkan dalam bentuk kit untuk analisis RAPD.[6] Jika primer yang

dipakai berukuran kurang dari 10 basa maka lebih cocok digunakan untuk menampilkan riwayat sidik

 jari DNA yang lebih kompleks (bidang forensik) dengan situs penempelan primer pada sekuens DNA yang lebih

banyak.[6] Perlu diperhatikan bahwa panjang primer menjadi faktor penentu berhasil tidaknya replikasi. Primer 

spesifik yang ideal berukuran tidak lebih panjang dari 15 bp.[6] Primer yang panjang akan menyebabkan

peluang komplemen dengan utas DNA semakin kecil, bahkan nihil.[7]

8/3/2019 Meine Resume

http://slidepdf.com/reader/full/meine-resume 6/9

Setelah dilakukan sintesis primer, tahapan selanjutnya adalah mereaksikan RAPD dalam DNA thermal cycler,

yaitu suatu perangkat PCR untuk menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat.[8]Reaksi ini bertujuan untuk

mengamplifikasi (mereplikasi) fragmen-fragmen DNA (amplikon) dengan riwayat khusus. Amplifikasi ini meliputi

3 tahapan besar, yakni tahap denaturasi DNA 96oC selama 1 menit, tahap penempelan (annealing) 40oC selama

1 menit, dan tahap pemanjangan (ekstensi) 72oC selama 2 menit.[8] Saat annealing, homologi sekuens antara

primer dan utas DNA turut berperan menentukan keberhasilan reaksi.[8] Tahapan-tahapan yang ada akan

berulang sebanyak 40 siklus hingga diperoleh sejumlah produk amplikon yang memiliki sekuens acak.

[8] Adanya variasi urutan nukleotida yang diakibatkan insersi atau delesi pada beberapa lokus gen nantinya akan

dianggap sebagai polimorfisme yang menjadi penanda diversitas genetik suatu galur (breed).[7] Hal ini dapat

dilihat setelah divisualisasikan dengan elektroforesis gel agarosa.[7] Keberadaan profil DNA unik antar lokus gen

akan terlihat berupa pita terang setelah pewarnaan gel dengan EtBr yang dilihat di bawah pendaran sinar UV.[6]

Peredaman gen

Dari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas

Belum Diperiksa

'Gene silencing', 'pembungkaman gen', dan 'pemadaman gen' beralih ke sini.

Peredaman gen[1], sebagai padanan gene silencing , mengacu pada sejumlah proses regulasi gen yang

mencegah ekspresi gen. Dalam proses ini, gen dihalangi oleh mekanisme tertentu sehingga tidak dapat

ditranskripsi, atau dapat ditranskripsi tetapi kemudian tidak dapat diproses menuju tahap ekspresi berikutnya

(translasi). Mekanisme cara pertama dikenal sebagai peredaman gen transkripsional sedangkan cara kedua

dikenal sebagai peredaman gen pascatranskripsional (PTGS, yang sering kali disamakan dengan interferensi

RNA). Karena mekanisme peredaman gen diwariskan dari satu generasi ke generasi berikut tetapi bukan melalui

variasi DNA, kajiannya merupakan bagian dari epigenetika.

Daftar isi

  [sembunyikan]

• 1 Jenis-jenisnya

○ 1.1 Peredaman gen

transkripsional

○ 1.2 Peredaman gen

8/3/2019 Meine Resume

http://slidepdf.com/reader/full/meine-resume 7/9

pascatranskripsional

• 2 Pemanfaatan

• 3 Catatan

• 4 Lihat pula

[sunting]Jenis-jenisnya

Peredaman ekspresi gen dapat melalui pemblokiran transkripsi atau perombakan produk transkripsi (mRNA)

yang belum sempat ditranslasi.

[sunting]Peredaman gen transkripsional

Dalam keadaan normal suatu gen akan diekspresikan melalui suatu mekanisme regulasi tertentu. Dalam

mekanisme ini, enzim RNA polimerase akan menempel pada suatu urutan basa tertentu di dekat bagian hulu

(upstream) suatu gen, setelah sejumlah faktor transkripsi melekat di dekat wilayah penempelan (binding site) itu.

Apabila wilayah penempelan itu tertutupi oleh suatu objek atau dimodifikasi, maka proses transkripsi tidak

mungkin terjadi. Penutupan/pemblokiran dapat terjadi karena menempelnya suatu protein tertentu yang

dihasilkan oleh suatu gen regulator. Modifikasi wilayah penempelan ini dapat terjadi akibat

modifikasi histon (protein yang membungkus DNA) atau metilasi DNA.

Para ahli biologi molekuler dapat mengintroduksi suatu sekuens yang akan menghasilkan protein yang menutup

wilayah penempelan. Teknik manipulasi ini dikenal sebagai "peng-KO-an gen" (gene knockout ).

[sunting]Peredaman gen pascatranskripsional

Peredaman gen pascatranskripsional ( post-transcriptional gene silencing , PTGS ), dikenal pula

sebagai peredaman RNA, adalah mekanisme lain pada peredaman gen. Ia pertama kali diketahui dari sel

tumbuhan pada tahun 1990 dan dianggap sebagai bagian dari sistem pertahanan individu terhadap masuknya

faktor asing (virus) ke dalam sel. Pada perkembangan selanjutnya, mekanisme ini ditemukan pula

pada hewan dan fungi (jamur). Istilah PTGS menjadi sering disamakan dengan interferensi RNA setelah pada

tahun 1998 Craig Mello dan Andrew Fire berhasil menjelaskan mekanismenya secara keseluruhan dan

menunjukkan bagaimana memanipulasinya[2]. Meskipun demikian, interferensi RNA merupakan salah satu

mekanisme peredaman. Mekanisme lainnya yang kemudian diketahui adalah non-stop decay (2004)

[3] dan nonsense-mediated decay  (2001)[4].

Dalam interferensi RNA, proses transkripsi terjadi dan mRNA dapat mengalami penyuntingan dan dibawa keluar 

dari inti sel memasuki sitoplasma. Namun demikian, karena kekhasan bentuk molekulnya, suatu mRNA akan

mengalami proses degradasi sebelum sempat dibaca oleh ribosoma untuk di translasi. Degradasi terjadi karena

mRNA yang teredam tidak berupa pilin tunggal tetapi berupa pilin ganda (double-stranded , dsRNA). RNA pilin

ganda dapat berasal dari virus atau individu eukariotik itu sendiri. Individu eukariotik dapat menghasilkan RNA

berpilin ganda apabila dua sekuens yang saling komplementer, baik berupa berkas sense dan antisense yang

8/3/2019 Meine Resume

http://slidepdf.com/reader/full/meine-resume 8/9

berekspresi bersama-sama maupun sekuens gen yang mengakibatkan terbentuknya struktur "tusuk konde"

(hairpin) dari RNA produk.

Mekanisme normal pada sitoplasma adalah mencegah RNA berpilin ganda berlama-lama di dalam sel sebagai

bagian dari strategi pertahanan terhadap unsur bahan genetik asing (virus). Enzim RNAse III (Dicer ) akan

"menyerang" dsRNA dan memotongnya dalam bentuk ujung runcing (sharp end ) sebanyak dua basa. Produk ini

dikenal sebagai siRNA (small-interfering RNA). Protein lain akan mengikat potongan ini membentuk RISC (RNA-

induced silencing complex ) dan mencerna (mendigesti) berkas RNA yang tidak dipegangnya. RISC dengan

berkas RNA yang dipegangnya dapat mencari mRNA berkas tunggal yang komplementer dan memutuskannya,

sehingga terjadi reaksi berantai peredaman suatu produk transkripsi. Perilaku inilah yang kemudian

dimanfaatkan oleh para ahli biologi molekuler pada teknik peredaman dengan antisense dan interferensi RNA.

[sunting]Pemanfaatan

Manipulasi terhadap mekanisme peredaman gen pada tingkat tertentu telah dikembangkan untuk pemanfaatan

dalam berbagai bidang biologi terapan. Penghilangan ciri-ciri yang tidak dikehendaki,pemuliaan

ternak dan tanaman, pengembangan galur  mikroorganisme, dan berbagai pemanfaatan dalam kedokteran dan

pengobatan (misalnya terapi gen untuk pengobatan penyakit akibat gangguan genetik atau kanker ) telah

menggunakan berbagai teknik peredaman gen. Metode ini menarik karena relatif lebih aman bagi lingkungan;

misalnya ia tidak melibatkan bahan radioaktif  atau tidak menggunakan antibiotika selektif (sehingga tidak perlu

ada kekhawatiran ekspresi pada mutannya).

Gene silencing

From Wikipedia, the free encyclopedia

Gene silencing is a general term describing epigenetic processes of gene regulation. The term gene silencing is

generally used to describe the "switching off" of a gene by a mechanism other thangenetic modification. That is,

a gene which would be expressed (turned on) under normal circumstances is switched off by machinery in the

cell.

Genes are regulated at either the transcriptional or post-transcriptional level.

Transcriptional gene silencing is the result of  histone modifications, creating an environment

of heterochromatin around a gene that makes it inaccessible to transcriptional machinery (RNA

polymerase,transcription factors, etc.).

Post-transcriptional gene silencing is the result of  mRNA of a particular gene being destroyed or blocked. The

destruction of the mRNA prevents translation to form an active gene product (in most cases, a protein). A

common mechanism of post-transcriptional gene silencing is RNAi.

Both transcriptional and post-transcriptional gene silencing are used to regulate endogenous genes. Mechanisms

of gene silencing also protect the organism's genome from transposons and viruses. Gene silencing thus may be

part of an ancient immune system protecting from such infectious DNA elements.

8/3/2019 Meine Resume

http://slidepdf.com/reader/full/meine-resume 9/9

Genes may be silenced by DNA methylation during meiosis, as in the filamentous fungus Neurospora crassa.

Polimorfisme Panjang Berkas RestriksiDari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas

Belum Diperiksa

Polimorfisme Panjang Berkas Restriksi (bahasa Inggris: Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP)

merupakan penanda molekul yang pertama kali ditemukan dan digunakan. Penggunaannya dimungkinkan

semenjak orang menemukan enzim endonuklease restriksi (RE), suatu kelas enzim yang mampu mengenal dan

memotong seurutan pendek basa DNA (biasanya 4-6 urutan basa). Enzim ini dihasilkan oleh bakteri dan

dinamakan menurut spesies bakteri yang menghasilkannya. Contoh:

EcoRI adalah enzim RE yang dihasilkan dari bakteri Escherichia coli strain RI (baca: R satu)

BamHIII diperoleh dari bakteri Bacillus americanus strain HIII (H tiga).

RFLP bersifat kodominan, cukup berlimpah, serta frekuensi polimorfismenya tinggi. Penanda ini mudah

dipetakan dalam peta genetik dan bersifat stabil (tidak mudah berubah hasilnya bila diulang). Penanda ini juga

tidak spesifik spesies, karena bukan berbasis PCR, sehingga hasilnya bisa digunakan untuk perbandingan peta

genetik spesies-spesies yang berbeda-beda. Kelemahannya, penanda ini memerlukan DNA dalam jumlah besar,

memakan waktu lama (memerlukan waktu tiga hari), serta melibatkan penggunaanpelabelan isotop radioaktif pada teknik yang pertama kali digunakan. Kelemahan yang terakhir ini dapat diatasi

setelah ditemukan teknik tanpa radioaktif.