Mikrobielle Ökologie der Phyllosphäre

Dr. Norman MauderLehrstuhl für Botanik IIUniversität Würzburg

Gliederung

• Einleitung – Definitionen• Wie kommen Bakterien in die Phyllosphäre?• Was tun epiphytische Bakterien?• Welche Untersuchungsmethoden wendet man

an?

Einleitung – Definitionen

Phyllosphäre [griechisch], die von Mikroorganismen (Bakterien, Pilzen) besiedelte Oberfläche der Blätter und Blattscheiden. (Brockhaus, Meyers Lexikon)

“The term phyllosphere was coined by Last (1955) and Ruinen (1956) to describe the plant leaf surface as an environment that is physically, chemically and biologically distinct from the plant leaf itself or the air surrounding it. The term phylloplane has been used also, either instead of or in addition to the term phyllosphere.” (Johan H.J. Leveau, 2006, in Biology of the Plant Cuticle)

Einleitung – Definitionen

Epiphyten [grch. epi = auf, über; phyton = Pflanze], Organismen (Bakterien, einzellige und filamentöse Pilze, Pflanzen), die auf Pflanzenoberflächen überleben und wachsen können(, ohne der Pflanze damit zwangsläufig zu schaden).

“microbial epiphytes or epiphytic microorganisms, which include bacteria, fungi and yeasts, are defined as being capable of surviving and thriving on plant leaf and fruit surfaces.” (Johan H.J. Leveau, 2006, in Biology of the Plant Cuticle)

Gliederung

• Einleitung – Definitionen• Wie kommen Bakterien in die Phyllosphäre?• Was tun epiphytische Bakterien?• Welche Untersuchungsmethoden wendet man

an?

Populationsdynamik – Immigration

Wie kommen Bakterien auf die Blattoberfläche?• Während des Pflanzenwachstums, von Samenoberfläche

und aus dem Boden• Aus der Luft

– Wind– Staubpartikel– Regen– Aerosole– Insekten

10 m Luft über einer Grasfläche enthält durchschnittlich 121 CFU/m3 bis 1,4×103 CFU/m3

jahreszeitliche, tageszeitliche und kurzzeitige (2 min) Fluktuationen (Lighthart & Shaffer, 1995)

Immigration von durchschnittlich 11 Pseudomonas syringae pro Tag und Bohnenblatt an einem regenfreien Tag, Insekten übertragen von ~0 bis 104 Bakterien pro Kontakt (Upper & Hirano, 2002)

Populationsdynamik – Emigration

Wie verschwinden Bakterien von der Blattoberfläche?

• Wichtigster Faktor: Regen– Hydrophobizität der Oberfläche– Oberflächenbeschaffenheit ('Lotuseffekt'!)Bei Regen werden in 15 min im Schnitt 105 Bakterien von einem Bohnenblatt gespült (Lindemann & Upper, 1985)

Wie verändern sich epiphytische Bakterienpopulationen?

• Dynamik ist Summe von Immigration, Wachstum, Absterben und Emigration

• Faktoren:– Regen– Luftfeuchtigkeit– UV Strahlung– Blattalter– Pflanzenart (Heuer & Smalla, 1997) – Insekten (Stadler & Müller, 2000)

– CO2 Konzentration (Magan & Baxter, 1996)

– Luftverschmutzung (Brighigna et al., 2000) – saurer Regen (Helander et al., 1993) – Position des Blattes (Andrews et al., 1980; de Jager et al., 2001)

Populationsdynamik

Regen führt zu starker Vermehrung von epiphytischen Bakterien, evtl. wegen erhöhter Nahrungsverfügbarkeit aufgrund von 'Leaching' (Hirano & Upper, 2000)

Niedrige relative Luftfeuchte führt zu abnehmenden Populationsdichten und Veränderungen in der Artenvielfalt (O’Brien & Lindow, 1989; Hirano & Upper, 2000).Bohnenblätter haben bei Hitze und Trockenheit hauptsächlich PPFMs (pink pigmentierte fakultativ methylotrophe Bakterien), während bei feuchtem, warmen Wetter Pseudomonas syringae dominiert (Hirano & Upper, 2000).

UV Exposition kann die bakterielle Diversität der Phyllosphäre erhöhen (Kadivar & Stapleton, 2003).Bakterien sind im Allgemeinen die Erstbesiedler eines jungen Blattes, später dominieren Hefen, und schließlich übernehmen filamentöse Pilze das alternden Blatt (Blakeman, 1985).

Gliederung

• Einleitung – Definitionen• Wie kommen Bakterien in die Phyllosphäre?

– Populationsdynamik (Immigration, Wachstum, Sterben, Emigration)

• Was tun epiphytische Bakterien?• Welche Untersuchungsmethoden wendet man

an?

Was Epiphyten tun, hängt davon ab, was sie können müssen, um zu überleben.

Fitness: 'to fit' = 'passen', aber wohinein oder wozu?

Umwelt ist die Blattoberfläche

epiphytische Fitness – 'Epiphitness'

• Die Oberfläche der Kutikula ist eine unwirtliche Umgebung:– Wasserstress– geringe Nahrungsverfügbarkeit– UV-Strahlung (95% UV-A (320–400 nm), 5% UV-B (290–320 nm))– schneller Wechsel dieser Bedingungen, sogar innerhalb der

Verdopplungszeit

Umwelt - Blattoberfläche

• Bakterien sind 106-mal kleiner als Menschen, ein Blatt ist für sie eine äußerst heterogene Landschaft:– Grüne Bohne: adaxiale Seite besteht zu 74% aus undifferenzierten

Epidermiszellen, 17 % Stomata, 7 % Adern und 1 % Trichome; Unterschiede in Durchlässigkeit für Wasser und andere Pflanzenstoffe (Monier & Lindow, 2004)

– Trichome können eine Reihen von Pflanzenstoffen sekretieren: Zucker, Proteine, Öle, Sekundärmetabolite, Schleim

– Wasserverfügbarkeit: Regen, Nebel, Tau, Wasseransammlungen an hygroskopischen Salzkristallen oder an den Stomata (Burkhardt et al., 1999)

– Temperatur ändert sich im Tagesverlauf, kann aber auch auf einem Blatt vom Zentrum zum Rand variieren (Verdunstungskälte, Wasserverfügbarkeit)

– Nähe zu anderen Epiphyten:• Konkurrenz um Nahrung und Platz• Möglichkeit zur Kooperation und zum horizontalen Gentransfer

(Austausch von Plasmiden)• Interaktion zwischen Bakterien, Hefen und Pilzen weitestgehend

unbekannt

Umwelt - Blattoberfläche

Was muss ein mikrobieller Epiphyt können, um zu überleben und zu wachsen?

• Adhäsion an Oberfläche– Fimbrien/Pili (bei Gram-negativen Bakterien)– Produktion einer (klebrigen) Matrix (Exopolysaccharide: z.B.:

Alginat, Succinoglycan, Xanthan, Zellulose)

'Epiphitness'

Was muss ein mikrobieller Epiphyt können, um zu überleben und zu wachsen?

• Adhäsion an Oberfläche• Schutz vor Austrocknung

– Exopolysaccharide zur Ausbildung eines feuchten Mikroklimas– Leben in der Nähe von Trichomen mit Wasserreservoirs

• Schutz vor UV-Licht– schützende Pigmentierung gegen UV-Strahlung (Goodfellow et al.,

1976; Dickinson, 1986; Lindow & Brandl, 2003; Jacobs et al., 2005)

– Reparaturmechanismen bei DNA Schäden (Kim & Sundin, 2000; Sundin et al., 2000; Zhang & Sundin, 2004)

– Leben in der Nähe von schattenspendenden Strukturen (z.B. Trichome)

– Ausweichen ins Innere der Pflanze (Pathogene)

'Epiphitness'

Was muss ein mikrobieller Epiphyt können, um zu überleben und zu wachsen?

• Adhäsion an Oberfläche• Schutz vor Austrocknung• Schutz vor UV-Licht• Verwertung von Nahrung

'Epiphitness'

• Kutikula: Kutin Polymer, Wachse mit hoher Kohlenstoff- und Energiedichte• ... bisher kein Beweis dafür, dass Komponenten der Kutikula von

Mikroorganismen zum Wachstum verwendet werden (Beattie, 2002)

• Pollen, Honigtau, Staub, Luftverschmutzung, Bruchstücke von Mikroben (Stadler & Müller, 2000; Leveau, 2004)

• 'Leaching' von Pflanzenmetaboliten aus dem Inneren an die Oberfläche– passiver Vorgang– stimuliert durch Wasser auf dem Blatt (Regen, Nebel)– häufigste Substanzen: Glucose, Fructose, Sucrose

• Limitierende Größe für die Population der Mikroorganismen ist die C-Quelle (Zucker), nicht die P- oder N-Quelle (Wilson & Lindow, 1994a; Wilson et al., 1995; Mercier & Lindow, 2000)

• Andere C-Quellen: Methanol und Methylamine (PPFMs!) (Holland & Polacco,

1994), sowie Indol-3-Essigsäure (Leveau & Lindow, 2005)

• Spurenelemente: Bakterien benötigen z.B. Siderophore zur Eisenbeschaffung (Loper & Buyer, 1991)

'Epiphitness' – Ernährung, Nahrungsquellen

eine Zelle Erwinia herbicola benötigt 0,3 pg Zucker für eine Verdopplung (Leveau & Lindow, 2001)

Epiphyten-freie Bohnen im Gewächshaus haben 0,2–10 µg Zucker/Blatt (durchschnittlich 2,5 µg), genug für 107 Bakterien pro Blatt (Mercier & Lindow, 2000)

• Ernährungsweisen der verschiedenen epiphytischen Mikroorganismen sind sehr unterschiedlich ...

• einerseits im Spektrum der möglichen Nahrungsquellen:– 'nutritional niche overlap index' zum Vergleich zweier Epiphyten (Wilson

& Lindow, 1994a; Ji &Wilson, 2002)

– niedriger Index: Spezies verwenden unterschiedliche Quellen, Koexistenz möglich

• andererseits in ihrer Affinität:– hohe Affinität: Organismen können Nährstoffe auch bei sehr niedrigen

Konzentrationen verwerten• auch Aufteilung in K- und r-Strategen (Andrews, 1984):

– K-Strategen reproduzieren langsamer und sind erfolgreich unter Bedingungen mit limitierten Ressourcen

– r-Strategen wachsen sehr schnell und dominieren bei abundanten Ressourcen

'Epiphitness' – Ernährung, Konkurrenz

Was muss ein mikrobieller Epiphyt können, um zu überleben und zu wachsen?

• Adhäsion an Oberfläche• Schutz vor Austrocknung• Schutz vor UV-Licht• Verwertung von Nahrung• Modifikation ihrer Umwelt

'Epiphitness'

Modifikation der biologischen Nische:• Produktion von IAA (Indol-3-Essigsäure) (Brandl et al., 2001) oder des

Phytotoxins Syringomycin (Lindow & Brandl, 2003) durch epiphytische Mikroorganismen stimuliert u.U. die Freisetzung von Nährstoffen durch die Pflanze

• Verringerung der Hydrophobizität der kutikulären Oberfläche, z.B. durch die Bildung von Surfactants (surface active agents) (Bunster et

al., 1989), kann Blattfeuchtigkeit erhöhen, was zu 'Leaching' von Nährstoffen führt (Knoll & Schreiber, 2000)

• Bildung extrazellulärer Polysaccharide zur besseren Adhäsion, Schutz vor Austrocknung, Einfangen von Nährstoffen, Barriere gegen chemische, biologische oder anderen Umweltstressfaktoren, oder als Matrix für Kommunikation über kleine diffusible Moleküle wie z.B. AHLs (N-Acyl-Homoserinlactone, bei Proteobakterien)

• Antibiose:– einige epiphytische Hefen produzieren antibakterielle Substanzen

(McCormack et al., 1994)

– antimykotischen Aktivitäten bei epiphytische Bakterien (Giesler & Yuen, 1998; Nair et al., 2002; Collins et al., 2003; Daayf et al., 2003)

'Epiphitness' – Modifikationen

• Epiphitnessgene > Pathogenitätsgene• Pathogene:

– Pseudomonas und Erwinia Arten verursachen Frostschäden durch Bildung biologischer Eiskeime (Lindow, 1983)

– ina Gene kodieren für Proteine die als Eiskeime fungieren können, und sind bei P. syringae, P. fluorescens, E. herbicola, E. ananas, Xanthomonas campestris und anderen zu finden

– Erwinia: einige Arten verursachen nekrotische oder Welke-Krankheiten, andere verursachen Weichfäulen; bewegliche Stäbchen

• Feuerbrand (fire blight), Erwinia amylovora, Nord-Amerika, Europa• Bakterien-Naßfäule (soft rot), Erwinia carotovora, Weltweit

– Pseudomonas: abgegrenzte Fäulen, z.B. Blattflecken und Brände; viele produzieren in Kulturen ein grünliches, wasserlösliches Pigment; bewegliche Stäbchen

'Epiphitness' – Pathogenität

• Pathogene:– Xanthomonas: Blattflecken und Brände; kleine, bewegliche Stäbchen– Clavibacter (Corynebacterium): einziges Gram-positives

Pflanzenpathogen, verursacht systemische Infektionen mit Gallenbildung, Ringfäulen und Welken; dünne, lange Stäbchen, unbeweglich

'Epiphitness' – Pathogenität

Erkrankungen ausgelöst durch Xanthomonas campestris auf Broccoli (oben) und Pfeffer (rechts)

Was muss ein mikrobieller Epiphyt können, um zu überleben und zu wachsen?

• Adhäsion an Oberfläche• Schutz vor Austrocknung• Schutz vor UV-Licht• Verwertung von Nahrung• Modifikation ihrer Umwelt

– Pathogenität

• Interaktion mit anderen Epiphyten

'Epiphitness'

Interaktion zwischen Epiphyten:• Kommunikation:

– viele pflanzenassoziierte Bakterien produzieren Quorum Sensing Signale (AHLs) (Cha et al., 1998) zur indirekten Bestimmung der Populationsdichte und dichteabhängigen Kontrolle der Genexpression (Juhas et al., 2005)

• Genaustausch:– Viele bakterielle Epiphyten tragen Plasmide (Kobayashi & Bailey, 1994; Sundin

et al., 2004)

– zusammen mit Transposons bilden diese den 'horizontalen Genpool' (Bailey et al., 2002)

– dieser Genpool enthält Gene für Epiphitness, Virulenzfaktoren (Sundin et

al., 2004), sowie Antibiotikaresistenz (z.B. gegen Tetracyclin, das in Apfelgärten gesprüht wird (Schnabel & Jones, 1999))

– Kutikuläre Oberflächen sind Hotspots für Genaustausch und gelten als ‘breeding grounds for microbial diversity’ (Lindow & Leveau, 2002)

– Plasmidtransferraten auf Bohnenblattoberflächen sind 30-fach höher als auf Polycarbonatfiltern (Normander et al., 1998)

'Epiphitness' – Interaktionen

Gliederung

• Einleitung – Definitionen• Wie kommen Bakterien in die Phyllosphäre?

– Populationsdynamik (Immigration, Wachstum, Sterben, Emigration)

• Was tun epiphytische Bakterien?– Epiphitness

• Umwelt (Blattoberfläche)• Anpassung

• Welche Untersuchungsmethoden wendet man an?

Methoden – Probennahme von Bakterien• Blattabdrücke

– stark vom verwendeten Medium abhängig– Selektion durch Antibiotika (Cycloheximid, Penicillin) oder

bestimmte Nahrungsquellen– Vorteile: einfach– Nachteile: geringe Auflösung, keine echte Quantifizierung möglich,

keine quantitative Entfernung der Bakterien

• Blattwaschung (Vortexen, Ultraschall) ... und Ausplattieren– stark vom Medium abhängig– Selektion durch Antibiotika (Cycloheximid, Penicillin) oder bestimmte

Nahrungsquellen– Vorteile: Quantifizierung möglich, Einzelkolonien– Nachteile: Quantifizierung ist Fehler-behaftet durch untersch.

Wachstumsgeschwindigkeit, Aggregatbildung, unterschiedliche Resistenz gegen Abwaschung

Methoden – Probennahme von Bakterien

• Mazeration (mechanisch: Mörser, Kugelmühle, etc.)– Vorteil: quantitative Entfernung der Organismen– Nachteil: Endophyten werden mitgezählt

• Gefriertechnik (eigentlich entwickelt für Wachsanalyse)– Vorteil: quantitative Entfernung der Organismen– Nachteil: tödlich für viele Organismen, deshalb ...– Quantifizierung über die gewonnene DNA-Menge (qRT-PCR)! (Heuser &

Zimmer, 2002)

• Quantifizierung erfolgt pro Blatt, pro Blattgewicht oder pro Blattoberfläche– logarithmierte Zahlen, weil keine Normalverteilung, sondern log-

normale

• Allgemeine Probleme:– nicht alle Bakterien sind kultivierbar, Unterschied VPNC (viable but not

culturable) und CFU (colony forming unit); auf Blättern 75% VPNC (Wilson & Lindow, 1992), andere Habitate nur ~1 Promille CFUs!

– untersuchtes Blatt ist zerstört oder zumindest Bakterienpopulation ist zerstört

Methoden – Probennahme von Bakterien

• Elektronenmikroskopie– höchste Auflösung, aber

Gefahr der Artefaktbildung

Methoden – Mikroskopie

Krimm, 2005

• DNA Färbung (berichtet von Kepner & Pratt, 1994)

– Acridinorange (bindet an DNA und RNA, Anregungsmaximum ~470 nm, gefärbte einzelsträngige Nukleinsäuren emittieren orange-rote Fluoreszenz, doppelsträngige eher grün

– DAPI ((Anregung mit 365 nm) interkaliert nicht, DNA-spezifisch, an DNA gebunden fluoresziert es blau oder blau-weiß (~390 nm), ungebunden gelblich)

Methoden – Mikroskopie

Methoden – DAPI-Färbung

Krimm, 2005

• DNA Färbung (berichtet von Kepner & Pratt, 1994)

– Acridinorange (bindet an DNA und RNA, Anregungsmaximum ~470 nm, gefärbte einzelsträngige Nukleinsäuren emittieren orange-rote Fluoreszenz, doppelsträngige eher grün

– DAPI ((Anregung mit 365 nm) interkaliert nicht, DNA-spezifisch, an DNA gebunden fluoresziert es blau oder blau-weiß (~390 nm), ungebunden gelblich)

– Propidiumiodit (färbt tote Zellen, leuchtet rot)

• GFP (grün fluoreszierendes Protein) exprimierende Bakterien– Reportergene, Beispiel: Fruktose-sensitiver Promotor

Methoden – Mikroskopie

Methoden – GFP als Reportergen

Krimm, 2005

• DNA Färbung (berichtet von Kepner & Pratt, 1994)

– Acridinorange (bindet an DNA und RNA, Anregungsmaximum ~470 nm, gefärbte einzelsträngige Nukleinsäuren emittieren orange-rote Fluoreszenz, doppelsträngige eher grün

– DAPI ((Anregung mit 365 nm) interkaliert nicht, DNA-spezifisch, an DNA gebunden fluoresziert es blau oder blau-weiß (~390 nm), ungebunden gelblich)

– Propidiumiodit (färbt tote Zellen, leuchtet rot)

• GFP (grün fluoreszierendes Protein) exprimierende Bakterien– Reportergene, Beispiel: Fruktose-sensitiver Promotor

• Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)– Vorteil: hohe Spezifität, Identifizierung der Organismengruppe je nach

Wahl der Sonde

Methoden – Mikroskopie

Yersinia ruckeriYersinia pestisYersinia enterocoliticaunterschieden mittels FISH

Methoden – ribosomale DNA und RNA• rDNA ist in allen Lebewesen vorhanden• rRNA liegt in hoher Kopienzahl vor (bei Stoffwechsel-aktiven

Zellen, ca. 104 Ribosomen)• es gibt konservierte und variable Bereiche• sehr große Datenbank verfügbar (>70,000 Sequenzen in

Genbank)

Ribosom von Haloarcula marismortui mit der kleinen 30 S Untereinheit (links, 16 S rRNA (orange) und Proteine (blau)) und der großen 50 S Untereinheit (rechts, 23 S rRNA (orange), 15 S rRNA (gelb) und Proteine (blau))

D/TGGE

Denaturierende/Temperatur-Gradienten Gelelektrophorese

• erlaubt kulturunabhängige Analyse der Abundanz und Diversität einer mikrobiellen Gemeinschaft

• Sequenz-Unterschiede bis zu einer einzelnen Base

DNA-Gemisch

GC-reicher Überhang

Primer für kons. rDNA Region

Amplifikat-Gemisch

je ~500 bp

PCR

D/TGGE

Amplifikat-Gemisch

Tem

pera

tur / D

enat. A

gens K

onz.

(Form

am

id)

D/TGGE

(Yang et al., 2001)

D/TGGE

Ergebnisse:• bei den leicht kultivierbaren Bakterien dominieren die Gattungen

Pseudomonas, Erwinia und Xanthomonas, noch häufiger ist jedoch oft Methylobacterium, wenn man Methanolplatten verwendet

• Analyse der 16S RNA aus Blattwaschungen:– 5 der 17 rRNA Sequenzen zeigten weniger als 90% Ähnlichkeit zu den

nächst verwandten Spezies in den Datenbanken, was darauf hindeutet das es sich um noch unbeschriebene taxonomische Gruppen handelt (Yang et al., 2001)

– auf Grüner Bohne (Phaseolus vulgaris), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Zuckerrübe (Beta vulgaris) und Orangen (Citrus spp.) ähneln sich die bakteriellen Populationen auf verschiedenen Individuen der gleichen Pflanzenart, sind aber untereinander verschieden (Yang et al., 2001)