Mikroelektrochemische Methoden in der Biosensorik und ... · Diese Arbeit wurde in der Zeit von...

Mikroelektrochemische Methoden

in der Biosensorik und Elektroanalytik

Dissertation

zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Chemie

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Marcus Mosbach

Bochum, Februar 2001

Diese Arbeit wurde in der Zeit von Juli 1998 bis Februar 2001 am Lehrstuhl für

Analytische Chemie, AG Elektroanalytik und Sensorik unter der Leitung von Prof. Dr.

W. Schuhmann angefertigt.

Eingereicht am: 22. Februar 2001

Tag der mündlichen Prüfung: 04. April 2001

Referent: Prof. Dr. W. Schuhmann

Koreferent: Prof. Dr. W. S. Sheldrick

Prüfer: Prof. Dr. Ch. Wöll

Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht als

M. Mosbach, T. Laurell, J. Nilsson, E. Csöregi, W. Schuhmann„Determination of Diffusion Coefficients of Electroactive Species in "Time-of-Flight-Experiments" Using a Microdispenser and Microelectrodes“Analytical Chemistry, akzeptiert

M. Mosbach, T. Laurell, J. Nilsson, E. Csöregi, W. Schuhmann„A Miniaturized Electrochemical Affinity Assay Based on a Wall-Free Sample Dropletand Micro-Dispensing of the Redox-Labelled Binding Partner“Biosensors & Bioelectronics, akzeptiert

M. Mosbach, H. Zimmermann, T. Laurell, J. Nilsson, E. Csöregi, W. Schuhmann„Picodroplet-Deposition of Enzymes on Functionalized Self-Assembled Monolayersas a Basis for Miniaturized Multi-Sensor Structures“Biosensors & Bioelectronics, akzeptiert

M. Mosbach, W. Schuhmann„Modulation of the Diffusion Coefficient of a Hapten-Modified Redox Species as aBasis for an Amplified Electrochemical Affinity Assay“Sensors & Actuators B 70 (2000) 145-152

K. Habermüller, M. Mosbach, W. Schuhmann„Electron-Transfer Mechanisms in Amperometric Biosensors“Fresenius Journal of Analytical Chemistry 366 (2000) 560-568

Patentanmeldung

P19917052.5 M. Mosbach, W. Schuhmann„Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung chemischer und biochemischer Analytemittels amplifizierter mikroelektrochemischer Detektion“

zur Veröffentlichung eingereicht

S. Gaspar, M. Mosbach, L. Wallman, T. Laurell, E. Csöregi, W. Schuhmann„Generation of Enzyme Microstructures Using a Flow-Through Microdispenser -A New Method to Design and Study Recognition Layers in Biosensors“Analytical Chemistry

in Vorbereitung

M. Mosbach, W. Schuhmann„Electrochemical Measurements in Picoliter Droplets Deposited in an Oil-Environment by Means of a Microdispenser“

M. Mosbach, A. Salmon, P. Jutzi, W. Schuhmann„Determination of Diffusion Coefficients of Redoxactive Compounds Using aMicrodispenser and Fast Scan Cyclic Voltammetry“

F.D. Munteanu, M. Mosbach, A. Schulte, W. Schuhmann, L. Gorton„Fast Scan Cyclic Voltammetry and Scanning Electrochemical Microscopy forStudies on the Acidic pH-Effect on 2-Electron Mediators Immobilized on ZirconiumPhosphate“

Vorträge

61. AGEF-Seminar, Düsseldorf, 15.11.2000M. Mosbach, S. Gaspar, T. Laurell, J. Nilsson, E. Csöregi, W. Schuhmann„Miniaturisierte Multisensor-Strukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auffunktionalisierten selbstorganisierten Monoschichten“

6th World Congress on Biosensors, San Diego (USA), 24.-26.05.2000Keynote Lecture, ausgezeichnet mit dem Biosensors & Bioelectronics Award 2000M. Mosbach,T. Laurell, J. Nilsson, E. Csöregi, W. Schuhmann:„Modulation of the Diffusion Coefficient of a Hapten-Modified Redox Species as aBasis for an Amplified Miniaturized Electrochemical Affinity Assay“

Industriepräsentation, Institut für Bioanalytik, Göttingen, 21.01.2000M. Mosbach, W. Schuhmann„Amplifizierter elektrochemischer Affinitätsassay durch Modulation vonDiffusionskoeffizienten“

5. Doktorandentreffen der Elektroanalytiker, Bochum, 09.-11.06.1999M. Mosbach, W. Schuhmann„Amplifizierter elektrochemischer Affinitätsassay durch Modulation vonDiffusionskoeffizienten“

Biosensor Symposium 1999, München, 14.-16.04.1999M. Mosbach, W. Schuhmann„Direkte Affinitätsassays durch Modulation des Diffusionskoeffizienten einerRedoxspezies“

Posterpräsentation

Electrochemical Microsystem Technologies / Interfinish 2000,Garmisch-Partenkirchen, 11.-15.09.2000 (mit Kurzvortrag)M. Mosbach, H. Zimmermann, T. Laurell, J. Nilsson, E. Csöregi, W. Schuhmann„Picodroplet-Deposition of Enzymes on Functionalized Self-Assembled Monolayersas a Basis for Miniaturized Multi-Sensor Structures“

DANKSAGUNG

Ich danke

Herrn Prof. Dr. Wolfgang Schuhmann für die hervorragende Betreuungund Unterstützung, seinen mitreißenden Optimismus, dasfreundschaftliche Verhältnis und die vielen „5 Minuten“ Zeit, die erimmer für meine Anliegen hatte

Herrn Prof. Dr. Thomas Laurell, Dr. Johan Nilsson und Herrn LarsWallman (Institut für Elektrische Messtechnik, Technische HochschuleLund, Schweden) für die freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppewährend meiner Aufenthalte in Schweden, die Ausbildung in Silizium-Mikrotechnologie und die Einweihung in die Geheimnisse derMikrodispenser

Frau Dr. Elisabeth Csöregi (Institut für Biotechnologie, Universität Lund,Schweden) für die Organisation meiner Forschungsaufenthalte inSchweden

Herrn Szilveszter Gaspar (Institut für Biotechnologie, Universität Lund,Schweden) für die gute Zusammenarbeit in Lund und Bochum und dieUntersuchungen auf dem Gebiet der Multischicht-Sensorstrukturen

Herrn Dr. Thomas Schmidt (Institut für Bioanalytik, Göttingen) für diegroßzügige Bereitstellung von Streptavidin

Herrn Prof. Dr. Jutzi (Lehrstuhl für Anorganische Chemie, UniversitätBielefeld) für das Interesse, das der dieser Arbeit entgegenbrachte unddie gute Kooperation mit seiner Arbeitsgruppe

Herrn Alexander Salmon (Lehrstuhl für Anorganische Chemie,Universität Bielefeld) für die Synthese und Bereitstellung derFerrocenderivate

Frau Florentina Munteanu (Institut für Analytische Chemie, UniversitätLund, Schweden) für die gemeinsamen Arbeiten auf dem Gebiet derCarbonpastenelektroden

Herrn Ralf Arnold (Lehrstuhl für Physikalische Chemie, Ruhr-UniversitätBochum) für die Goldbedampfung der Siliziumwafer

der Feinmechanik-Werkstatt der Fakultät für Chemie der Ruhr-Universität Bochum, besonders Herrn Lindner, für die präzise undschnelle Fertigung der benötigten Teile

den ehemaligen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Elektroanalytik undSensorik, als da wären

Frau Dr. Katja Habermüller für den Großteil der Arbeit amgemeinsamen Übersichtsartikel

Herrn Dr. Heiko Zimmermann für die gemeinsamen Forschungs-arbeiten am VW-Projekt und die gute Schreibtisch-Nachbarschaft

Herrn Dr. Andreas Hengstenberg für die Unterstützung bei derschnellen Datenaufnahme-Software

allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Elektroanalytik und Sensorik für dasfreundliche Arbeitsklima, die stete Hilfs- und Diskussionsbereitschaftund die vielen netten gemeinsamen Unternehmungen

ganz besonders meinen Eltern, deren Unterstützung ich immer hintermir wusste

und vor allem Kerstin.

MEINEN ELTERN

Inhaltsverzeichnis I

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG ........................................................................................................................................ 1

2 STAND DER FORSCHUNG................................................................................................................. 3

2.1 AUFBAU UND ANWENDUNGEN VON METABOLISCHEN BIOSENSOREN UND AFFINITÄTSSENSOREN......... 3

2.2 ELEKTROCHEMIE IN DER BIOSENSORIK............................................................................................. 62.2.1 Enzymbasierte elektrochemische Biosensoren...................................................................... 62.2.2 Redoxmediatoren als artifizielle Cosubstrate in Biosensoren ................................................ 92.2.3 Elektrochemische Affinitätsassys......................................................................................... 11

2.3 MOLEKULARE ERKENNUNG ZWISCHEN BIOTIN UND STREPTAVIDIN................................................... 15

2.4 MINIATURISIERUNG VON ELEKTROCHEMISCHEN MESSSYSTEMEN..................................................... 182.4.1 Mikroelektroden.................................................................................................................... 182.4.2 Elektrochemische Rastermikroskopie.................................................................................. 222.4.3 Funktionsprinzip des Elektrochemischen Rastermikroskops............................................... 232.4.4 Mikrobandelektroden und Interdigitalelektroden .................................................................. 33

2.5 MIKROSTRUKTURIERUNG VON OBERFLÄCHEN MIT BIOMOLEKÜLEN.................................................. 35

3 PROBLEMSTELLUNG....................................................................................................................... 39

4 EIGENE ARBEITEN ........................................................................................................................... 42

4.1 AMPLIFIZIERTER AFFINITÄTSASSAY DURCH MODULATION VON DIFFUSIONSKOEFFIZIENTEN VON

HAPTEN-MODIFIZIERTEN REDOXSPEZIES ......................................................................................... 424.1.1 Biotin-Streptavidin als Modellsystem für molekulare Erkennung ......................................... 434.1.2 Synthese eines redoxmarkierten Biotinderivats ................................................................... 454.1.3 Messprinzip des Affinitätsassays ......................................................................................... 474.1.4 Messelektroden .................................................................................................................... 484.1.5 Signalamplifizierung durch Redoxrecycling.......................................................................... 504.1.6 Messapparatur ..................................................................................................................... 524.1.7 Messvorgang mit Redoxamplifizierung ................................................................................ 554.1.8 Detektion von Biotin-Streptavidin Bindungsereignissen über die Modulation des

Diffusionskoeffizienten von Fc-Biotin ................................................................................... 574.1.9 Sandwich-Assay zur Bestimmung biotinilierter Komplexe ................................................... 624.1.10 Miniaturisierung des Affinitätsassays ................................................................................. 65

4.2 AUFBAU, FUNKTIONSWEISE UND FABRIKATION DES MIKRODISPENSERS........................................... 704.2.1 Aufbau .................................................................................................................................. 704.2.2 Funktionsweise..................................................................................................................... 724.2.3 Fabrikationsverfahren........................................................................................................... 75

4.3 ELEKTROCHEMIE IN PIKOLITERTROPFEN......................................................................................... 914.3.1 Deposition und Konservierung von Pikolitertropfen in Öl ..................................................... 914.3.2 Elektrochemie in konservierten Pikolitertropfen ................................................................... 94

4.4 BESTIMMUNG DER DIFFUSIONSKOEFFIZIENTEN VON REDOXMOLEKÜLEN IN ELEKTROCHEMISCHEN

„TIME OF FLIGHT“-EXPERIMENTEN ............................................................................................... 1024.4.1 Dispensieren von Redoxspezies in die Nähe einer Elektrodenoberfläche mit

amperometrischer Detektion.............................................................................................. 1034.4.2 Abhängigkeit des Peakstroms von der Dispenserposition ................................................. 1054.4.3 Abhängigkeit des Peakstroms von der geschossenen Tropfenzahl .................................. 1074.4.4 Abhängigkeit des zeitlichen Auftretens der Strompeaks von der Dispenserposition ......... 110

Inhaltsverzeichnis II

4.4.5 Bestimmung von absoluten Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten......... 1124.4.6 Bestimmung von relativen Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten

durch Kalibrierung mit einer zweiten Redoxspezies .......................................................... 1194.4.7 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten mit Mikroelektroden in chrono-

amperometrischen Experimenten...................................................................................... 127

4.5 SCHNELLE CYCLISCHE VOLTAMMETRIE......................................................................................... 1314.5.1 Bestimmung relativer Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten mit

schneller cyclischer Voltammetrie...................................................................................... 1364.5.2 Untersuchung des Ausblutens von Redoxmediatoren aus Carbonpastenelektroden

mit schneller cyclischer Voltammetrie................................................................................ 145

4.6 MINIATURISIERUNG VON ELEKTROCHEMISCHEN AFFINITÄTSASSAYS DURCH MIKROLITERTROPFEN

ALS ELEKTROCHEMISCHE MESSZELLEN........................................................................................ 1494.6.1 Aufbau zur Verwendung von Mikrolitertropfen als elektrochemische Messzellen ............. 1494.6.2 Dispensieren von Redoxspezies in elektrochemische Tropfenzellen ................................ 1544.6.3 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Tropfenzellen................................... 1584.6.4 Signalverstärkung durch Redoxamplifizierung................................................................... 160

4.7 DEPOSITION VON ENZYM-PIKOLITERTROPFEN AUF OBERFLÄCHEN ALS BASIS FÜR MINIATURISIERTE

MULTIANALYT-SENSORSTRUKTUREN ............................................................................................ 1644.7.1 Herstellung von Enzym-Mikrostrukturen ............................................................................ 1644.7.2 Visualisierung von immobilisierter Enzymaktivität mittels Elektrochemischer

Rastermikroskopie ............................................................................................................. 1694.7.3 Quantitative Bestimmung von Enzymsubstratkonzentrationen .......................................... 1754.7.4 Multianalyt-Sensorstrukturen.............................................................................................. 1784.7.5 Multischicht-Sensorstrukturen............................................................................................ 181

5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK ....................................................................................... 188

6 EXPERIMENTELLER TEIL .............................................................................................................. 193

6.1 METHODEN.................................................................................................................................. 1936.1.1 Elektrochemische Messungen ........................................................................................... 1936.1.2 Herstellung von Mikroelektroden........................................................................................ 1936.1.3 Reinigung der Mikroelektroden .......................................................................................... 1946.1.4 Herstellung von Pseudo-Referenzelektroden..................................................................... 1946.1.5 Goldbedampfung von Siliziumwafern................................................................................. 1946.1.6 Modifizierung von Goldoberflächen mit selbstorganisierenden Monoschichten................. 1946.1.7 Immobilisierung von Enzymen auf Oberflächen................................................................. 195

6.2 SYNTHESEN................................................................................................................................. 1966.2.1 Synthese des ferrocenmarkierten Biotinderivats (Fc-Biotin) .............................................. 1966.2.2 Synthese biotinilierter Glucoseoxidase............................................................................... 197

6.3 CHEMIKALIEN .............................................................................................................................. 1986.3.1 Chemikalien........................................................................................................................ 1986.3.2 Enzyme und Proteine ......................................................................................................... 199

6.4 MATERIALIEN UND GERÄTE .......................................................................................................... 2006.4.1 Materialien .......................................................................................................................... 2006.4.2 Geräte ................................................................................................................................ 2016.4.3 Software ............................................................................................................................. 201

7 LITERATUR...................................................................................................................................... 202

Formelzeichen und Abkürzungen III

Formelzeichen

A Fläche

c Konzentration

∅ Durchmesser

D Diffusionskoeffizient [cm2 s-1]

E Potential

E0 Standardpotential

F FARADAY-Konstante (96487 C mol-1)

i Strom

KM MICHAELIS-MENTEN-Konstante

n Zahl der in einer Reaktion übertragenen Elektronen

NA Avogadro-Zahl (6.023 1023 mol-1)

Q Ladung

r Radius

t Zeit

U Unit, 1U = 1 µmol min-1, Substratumsatz des Enzyms beiSubstratüberschuss

V Volumen

v Potentialvorschubgeschwindigkeit [V s-1]

Formelzeichen und Abkürzungen IV

Abkürzungen

AFM* Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy)

Ag/AgCl Silber/Silberchlorid-Referenzelektrode

BSA Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin)

CV Cyclische Voltammetrie / Cyclisches Voltammogramm

DMF Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonucleinsäure

FAD/FADH2 Flavin-Adenin-Dinucleotid (oxidierte/reduzierte Form)

Fc Ferrocen

GOD Glucoseoxidase

NAD+/NADH β-Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid (oxidiert/reduziert)

NHE Normalwasserstoffelektrode

PEGDGE Poly(ethylenglycol)-(400)-diglycidylether

RNA Ribonucleinsäure

SAM selbstorganisierende Monoschicht (Self-Assembled Monolayer)

SECM* Elektrochemische Rastermikroskopie (Scanning ElectrochemicalMicroscopy)

SCE gesättigte Kalomel-Referenzelektrode

SPA Streptavidin

STM* Rastertunnelmikroskopie (Scanning Tunneling Microscopy)

* Die Abkürzung wird sowohl für die Methode als auch für das entsprechende Gerät verwendet.

1 Einleitung 1

1 Einleitung

Die Biosensorik hat als eigenständiges Forschungsgebiet in den letzten Jahren stark

an Bedeutung gewonnen. Nachdem der Glucose-Biosensor die Forschungsebene

bereits vor längerer Zeit verlassen hat und sich im klinischen Bereich und im privaten

Bereich als portables Blutzucker-Messgerät für Diabetiker etabliert hat, werden nun

auch andere Biosensoren vermehrt in klinische und industrielle Anwendungen

integriert.

Durch die größer werdende industrielle Nutzung der Biosensoren gewinnt auch die

Kostenfrage stetig an Bedeutung. Aus diesem Grund werden auch im universitären

Bereich bei der Neuentwicklung von Biosensoren und Immunosensoren neben dem

Nachweis der prinzipiellen Machbarkeit immer häufiger ökonomische Faktoren, wie

Automatisierbarkeit des Messsystems oder günstige Produktions- und

Betriebskosten, berücksichtigt.

Die möglichst effektive Minimierung der letztgenannten Kostenfaktoren, z. B. durch

die Reduzierung des Verbrauchs an kostenintensiven biochemischen Komponenten,

hat eine deutliche Tendenz zur Verkleinerung der Messsysteme hervorgerufen.

Dieser Trend zur Miniaturisierung ist bereits soweit fortgeschritten, dass bei den

Strukturgrößen der makroskopische Bereich verlassen wurde und man z. B. durch

photolitographische Techniken bis in den Mikrometer- und Nanometer-Bereich

vorgedrungen ist.

Großes Forschungsinteresse wird in den analytischen Techniken momentan dem

High-Throughput-Screening (HTS) entgegengebracht, dem automatisierten Testen

von möglichst vielen Substanzen bzw. Proben in möglichst kurzer Zeit. HTS ist für

viele Bereiche, wie beispielsweise der pharmazeutischen Forschung, interessant, da

so in kürzester Zeit viele Substanzen oder Substanzgemische, die als potentielle

Medikamente oder biochemische Wirkstoffe in Frage kommen, auf ihre tatsächliche

Eignung geprüft werden können. Ein weiteres Anwendungsgebiet liegt in der DNA-

Analytik, bei der Bindungsereignisse zwischen einer großen Zahl von immobilisierten

DNA-Fragmenten oder Oligonucleotiden und DNA- oder RNA-Bestandteilen in der

Probe detektiert werden.

Als Mess- und Detektionsverfahren haben sich für Messsysteme im kommerziellen

Einsatz vor allem optische Verfahren etabliert. In neuester Zeit hat neben den

1 Einleitung 2

optischen Verfahren wie z. B. Photometrie, Fluoreszenzmessung oder Oberflächen-

plasmonenresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR), die Elektrochemie eine

immer größer werdende Bedeutung erlangt. Vor allem SPR und Fluoreszenz-

messgeräte haben einen Anschaffungswert, der um ein Vielfaches höher ist, als für

vergleichbare amperometrische Messsysteme. Die Elektrochemie zeichnet sich

gegenüber den optischen Methoden zudem durch einen vergleichsweise geringen

technischen Aufwand aus. Aufgrund der Einfachheit und Robustheit werden

elektrochemische Verfahren für viele Anwendungen wie z. B. portable

Blutzuckermessgeräte bevorzugt.

Der bereits erwähnte Trend zur Miniaturisierung von Sensorsystemen stellt jedoch

hohe Anforderungen an die elektrochemische Messtechnik. So müssen für eine

Miniaturisierung des Messsystems auch entsprechend miniaturisierte

elektrochemische Messsonden und aufgrund der verringerten Elektrodengröße auch

genügend sensitive Messverfahren zur Verfügung stehen. Die Integration von

mikroelektrochemischen Messverfahren in miniaturisierte Biosensorsysteme kann

dabei eine Schlüsseltechnologie zur Entwicklung von alternativen, kostengünstigen

Analysemethoden darstellen.

In dieser Arbeit werden neue Strategien und Verfahren zur Nutzung von

mikroelektrochemischen Messmethoden in miniaturisierten Enzym-Biosensor-

systemen, als auch zur Detektion von Bindungsereignissen zwischen

komplementären biologischen Erkennungsstrukturen in miniaturisierten Affinitäts-

assays vorgestellt.

2 Stand der Forschung 3

2 Stand der Forschung

Das Gebiet der Biosensorik lässt sich in die Bereiche metabolische Biosensoren und

Affinitätssensoren und -assays einteilen.

Metabolische Biosensoren sind dabei im weitesten Sinne alle Messsysteme, die auf

biologischen Erkennungselementen mit einem regenerierbaren Zyklus mit

Stoffumsatz basieren. Hauptsächlich werden Enzyme als biologische

Erkennungselemente verwendet und über die Bildung oder den Verbrauch einer an

der enzymatischen Reaktion beteiligten Substanz können Rückschlüsse auf die

Konzentration des Analyten gezogen werden.

Affinitätsassays und -sensoren hingegen beruhen auf der spezifischen molekularen

Erkennung und Bindung komplementärer biologischer Erkennungsstrukturen. Das

affinante Bindungsereignis wird detektiert und so das Vorhandensein des

spezifischen Erkennungselementes in der Probe nachgewiesen.

2.1 Aufbau und Anwendungen von metabolischen Biosensorenund Affinitätssensoren

Metabolische Biosensoren und Affinitätssensoren sind prinzipiell gleich aufgebaut

und bestehen aus folgenden Komponenten: Einer biologischen Erkennungsstruktur,

einem Transducer, der die biologische Information in ein messbares Signal

umwandelt, einem Detektor zur Erfassung des Messsignals und einem Schreiber

oder Computer zur Darstellung, Speicherung und Verarbeitung der Messwerte.

Die biologischen Erkennungselemente werden zur möglichst optimalen

Signalgewinnung in dichter Nähe des Transducers immobilisiert oder direkt an die

Transduceroberfläche gekoppelt.

Abbildung 2.1-1 oben zeigt die schematische Darstellung des Aufbaus eines

enzymbasierten Metabolismus-Biosensors. Der untere Teil der Abbildung zeigt eine

analoge Darstellung für einen Affinitätssensor.


(2) (4)(3)(1)

Substrat

Produkt

(2) (4)(3)(1)

Abbildung 2.1-1 schematische Darstellung eines Metabolismus-Biosensors (oben) und einesAffinitätssensors (unten)(1) immobilisierte biologische Strukturen(2) Transducer(3) Detektor(4) Schreiber oder Computer

Bei den enzymbasierten metabolischen Biosensoren liegt ein Reaktionszyklus vor, in

dem das enzymspezifische Substrat zu seinem Produkt und gegebenenfalls ein

weiteres Cosubstrat zur Regeneration des Enzyms umgesetzt werden. Somit gibt es

eine Fülle von Detektionsmöglichkeiten der enzymatischen Reaktion. Es genügt,

wenn eine der in der Reaktion ständig gebildeten bzw. verbrauchten Substanzen

quantitativ bestimmt werden kann. Unter bestimmten Voraussetzungen ist auch eine

direkte Kommunikation des Enzyms mit dem Transducer möglich, z. B. kann,

entsprechend der Marcus-Theorie [1,2] für Elektronentransferprozesse von Enzymen

[3], die Regeneration des Enzyms über eine Elektronentransferreaktion mit einer

geeigneten Elektrode erfolgen [4-8].


Die Anwendungen von metabolischen Biosensoren liegen vorwiegend in der

Bestimmung von Enzymsubstraten, wie z. B. Alkohol [9-11], Lactat [12-15], Glutamat

[16,17], Harnstoff [18,19], Cholesterin [20,21] und vielen weiteren biologisch

relevanten Substanzen. Den größten und wichtigsten Anteil der Anwendungen

stellen die Glucosesensoren [22-25] dar, die unter anderem in

Blutzuckermessgeräten für Diabetiker eingesetzt werden. Ein weiteres

Anwendungsgebiet von Biosensoren liegt in der Umweltanalytik [26] in der

Bestimmung von z. B. Phosphaten [27], Cyaniden [28] oder Pestiziden [29]. Auf die

genaue Funktionsweise mit Beispielen und Strategien zur Entwicklung von

enzymbasierten Biosensoren wird in einem späteren Kapitel eingegangen.

Bei Affinitäts- oder Immunosensoren wird die Bildung eines Komplexes zwischen

rekombinanten biologischen Erkennungsstrukturen, z. B. Antigen-Antikörper oder

Oligonucleotid-DNA, detektiert. Im Normalfall ist damit keine chemische oder

biochemische Reaktion mit Stoffumsatz verknüpft, so dass hier eine andere

Strategie verfolgt werden muss, um quantitative oder qualitative Aussagen über das

Vorhandensein eines der Bindungspartner machen zu können. Hierfür gibt es eine

Vielzahl verschiedener Ansätze, von denen einige im entsprechenden Kapitel näher

dargestellt werden. Die Hauptanwendungsbereiche von Affinitätssensoren und

Affinitätsassays liegen in der Quantifizierung von Immunreaktionen, wie dem

Nachweisen von Antigenen oder Antikörpern, als Kriterium für die Diagnose von

Krankheiten [30]. Durch den direkten Nachweis von biologischen Substanzen, auf

die Krankheiten zurückzuführen sind, können Affinitätssensoren für die Diagnose

von beispielsweise Hepatitis B [31], HIV [32], Herpes [33], oder Leukämie eingesetzt

werden. Weiterhin können physiologisch wichtige Substanzen und Rezeptoren, wie

beispielsweise Hormone [34,35], Myoglobin [36], Thyrotrophin [37], Cortison [38,39]

oder Biotin [40] bestimmt werden. Für den Nachweis von Drogenmissbrauch und für

Dopingtests sind Bestimmungsverfahren für Kokain [41,42], Amphetaminen [43] und

Morphinen [44,45] von Bedeutung.


2.2 Elektrochemie in der Biosensorik

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit mikroelektrochemischen Methoden und

Detektionsverfahren in der Biosensorik. Da die Vielzahl von unterschiedlichen

Detektionsmethoden derart hoch ist, dass eine vollständige Beschreibung und

Aufzählung den Rahmen dieser Arbeit übersteigt, sind die folgenden Abschnitte auf

Biosensoren und Affinitätsassays mit elektrochemischen Messmethoden fokussiert.

Ein guter Überblick über die in der Biosensorik zum Einsatz kommenden

Messverfahren ist beispielsweise in [46] zu finden.

Die Elektrochemie spielt in der Biosensorik eine bedeutende Rolle, was sich in der

hohen Zahl an wissenschaftlichen Neu-Veröffentlichungen und regelmäßigen

Übersichtsartikeln auf den Gebieten der elektrochemischen Biosensoren [47-56] und

Affinitätsassays und -sensoren [57-61] wiederspiegelt. Vor allem die Forschung in

Richtung miniaturisierter elektrochemischer Messsysteme ist in letzter Zeit

intensiviert worden [62,63].

2.2.1 Enzymbasierte elektrochemische Biosensoren

Den Hauptanteil der enzymbasierten elektrochemischen Biosensoren stellen die

amperometrischen und voltammetrischen Sensoren dar. Daneben gibt es einige

Beispiele mit potentiometrischen [64,65] und konduktometrischen [66-68]

Messverfahren.

Als Enzyme werden in amperometrischen Biosensoren vor allem Enzyme aus der

Gruppe der Oxidoreduktasen, die in ihren katalytischen Reaktionen Elektronen

übertragen, verwendet. Das weitverbreitetste und wichtigste Enzym dieser Gruppe ist

dabei Glucoseoxidase (GOD), welche die Oxidation von β-D-Glucose zu

D-Glucono-δ-lacton katalysiert.


Die prosthetische Gruppe der Glucoseoxidase ist Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD).

β-D-Glucose wird in einer 2-Elektronentransferreaktion zu D-Glucono-δ-lacton

oxidiert, während FAD zu FADH2 reduziert wird, wobei zwei Protonen der

β-D-Glucose aufgenommen werden. In einem zweiten Schritt wird das Enzym

regeneriert, indem das reduzierte FADH2 durch ein entsprechendes Cosubstrat

wieder zu FAD reoxidiert wird. Das natürliche Cosubstrat der Glucoseoxidase ist

dabei Sauerstoff, der zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. Die Regeneration ist

dabei nicht auf Sauerstoff als Cosubstrat beschränkt. FADH2 kann auch durch eine

Vielzahl von Redoxmediatoren, wie z. B. Hexacyanoferrat, Ferrocencarbonsäure

oder verschiedene Osmium-Komplexe als artifizielle Cosubstrate reoxidiert werden

[69-73].

Die biologische Antwort des Enzyms auf eine gegebene Substratkonzentration muss

für ein amperometrisches Messverfahren durch den Transducer in eine messbare

Stromantwort transformiert werden. Als Transducer werden in der Amperometrie

üblicherweise Elektroden aus Edelmetallen, wie Platin oder Gold, oder aus

Kohlenstoff verwendet, auf die das Enzym mit geeigneten Immobilisierungstechniken

fixiert wird. Beispiele hierfür sind die Anbindung oder der Einschluss in eine Vielzahl

unterschiedlicher Polymerfilme, z. B. durch Sol-Gel-Verfahren [74], elektrochemisch

abscheidbare leitende Polymere, wie Polypyrrol [75-78] oder Polythiophen [79],

abscheidbare nichtleitende Polymere [80] oder die Verwendung von

Quervernetzungsreagenzien wie Glutaraldehyd [81] oder Polyethylenglycol-

diglycidylether [82]. Eine weitere elegante Methode zur Immobilisierung von

Biomolekülen stellen selbstorganisierende Monoschichten (Self-Assembled

Monolayer, SAM) mit funktionellen Kopfgruppen (z. B. Säure- Amino- oder

N-hydroxysuccinimidylester-Gruppen) dar. Thiole und Disulfide lagern sich spontan

β-D-Glucose + O2 GOD(FAD)

D-Glucono-δ-lacton + H2O2

Hydrolyse

Gluconsäure

Abbildung 2.2-1 Reaktionsschema der katalytischen Reaktion von Glucoseoxidase


auf saubere Goldoberflächen an und bilden eine geordnete stabile Monoschicht aus.

An die funktionellen terminalen Gruppen der Monoschicht können Biomoleküle wie

Redoxproteine [83-85], Enzyme [85-87], DNA [88], Antigene oder Antikörper [89]

oder Biotin [90,91] gebunden werden.

Die Signaltransduktion bei amperometrischen Biosensoren erfolgt über eine

heterogene Elektronentransferreaktion zwischen der Messelektrode und einer an der

enzymatischen Reaktion beteiligten elektrochemisch aktiven Komponente. In

seltenen Einzelfällen kann die prosthetische Gruppe des Enzyms auch direkt über

eine Elektronentransferreaktion mit der Elektrodenoberfläche regeneriert werden

[5-7].

Für die amperometrische Bestimmung von Glucose mit Glucoseoxidase gibt es

folgende Möglichkeiten:

Wie im Reaktionsschema in Abbildung 2.2-1 gezeigt, wird bei der katalytischen

Umsetzung von Glucose zu Gluconolacton der im Lösungsmittel gelöste Sauerstoff

verbraucht und zu Wasserstoffperoxid umgesetzt. Beide Stoffe sind einer

elektrochemischen Messung zugänglich. Die Menge an Glucose kann somit über die

Messung der Abnahme an Sauerstoff oder die Bildung von Wasserstoffperoxid

bestimmt werden.

Die Messung der Sauerstoffabnahme in der enzymatischen Reaktion von

Glucoseoxidase war dabei eine der Pionierleistungen in der Entwicklung der

Biosensorik. Mit Hilfe der CLARK-Sauerstoffelektrode, die mit einer Membran zur

Immobilisierung von Glucoseoxidase versehen war, gelang die amperometrische

Bestimmung von Glucose über die Messung der Abnahme der Sauerstoff-

konzentration [92].

Eine weitere weniger aufwendige und häufiger genutzte Möglichkeit ist die

Bestimmung der Glucosekonzentration über die amperometrische Messung des in

der enzymatischen Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxid [78,93]. Wasserstoff-

peroxid kann beispielsweise an Platinelektroden bei einem Potential von +600 mV

vs. Ag/AgCl mit diffusionskontrollierter Rate oxidiert werden:

H2O2 → O2 + 2H+ + 2e-


Der durch die Oxidation des H2O2 an der Elektrode hervorgerufene Stromfluss ist

direkt mit der Konzentration an H2O2 und somit auch mit der Konzentration an

Glucose (vgl. Abbildung 2.2-2) korreliert.

2.2.2 Redoxmediatoren als artifizielle Cosubstrate in Biosensoren

Wie bereits erwähnt, lässt sich Sauerstoff als Cosubstrat der Glucoseoxidase durch

artifizielle Redoxmediatoren substituieren. Diese sind ebenfalls einer

amperometrischen Messung zugänglich, so dass über den Stromfluss,

hervorgerufen durch den heterogenen Elektronentransfer zwischen der

Messelektrode und dem entsprechenden Redoxmediator, Glucosekonzentrationen

bestimmt werden können. Artifizielle Redoxmediatoren bieten gegenüber Sauerstoff

als natürlichem Cosubstrat den Vorteil, dass sie z. T. bei erheblich niedrigeren

Potentialen als Wasserstoffperoxid an Elektrodenoberflächen oxidiert bzw. reduziert

werden können. Hiermit können Interferenzen durch Cooxidation von

Probebestandteilen, wie z. B. Ascorbinsäure, Harnsäure, Cystein oder Paracetamol,

die ebenfalls bei einem Elektrodenpotential von +0.6 V vs. Ag/AgCl oxidiert werden,

wirkungsvoll eliminiert werden [69]. Weiterhin kann durch eine genügend hohe

Konzentration an Redoxmediator eine eventuelle Limitierung der enzymatischen

GOD

Glucose Gluconolacton

O2 H2O2

+600 mV

FAD FADH2

Abbildung 2.2-2 Schema der Bestimmung von Glucose durch amperometrische Messung vonenzymatisch gebildetem H2O2 an einer Elektrode


Reaktion durch das Cosubstrat verhindert werden [94]. Voraussetzung dafür ist,

dass die Geschwindigkeitskonstante des Elektronentransfers zwischen Enzym und

Redoxmediator (angenommen sei eine Kinetik erster Ordnung) hoch sein muss, so

dass diese gegenüber dem natürlichem Cosubstrat bevorzugt wird. Vor allem bei

den Sensoren auf der Basis von Oxidasen kann die Konkurrenz zwischen Sauerstoff

und Redoxmediator zu einer mehr oder weniger stark ausgeprägten Abhängigkeit

von der Sauerstoffkonzentration führen.

Inkorporiert man die Redoxmediatoren mit den Enzymen in einem Film oder einer

Polymermatrix auf der Elektrodenoberfläche, so erhält man sogenannte reagenzlose

Biosensoren [78,95], die ohne den Zusatz von Redoxmediatoren oder anderen

Reagenzien direkt in einer Probelösung messen können. Dabei erfolgt der

Elektronentransfer vom Enzym über die im Film eingeschlossenen Redoxmediatoren

zur Elektrodenoberfläche [96].

Weiterhin können mit Hilfe künstlicher Redoxmediatoren auch Enzymreaktionen

amperometrisch verfolgt werden, in denen das Cosubstrat nicht direkt an der

Elektrodenoberfläche umgesetzt werden kann. Dies ist z. B. bei Enzymreaktionen

der Fall, bei denen das NAD+/NADH-System (NAD = β-Nicotinsäureamid-Adenin-

Dinucleotid) als Cosubstrat genutzt wird. Bekanntestes Beispiel hierfür ist die Gruppe

der NAD-abhängigen Dehydrogenasen. Bei der Oxidation von NADH zu NAD+ an

reinen Edelmetallelektroden ist Elektrodenfouling ein bekanntes Problem,

hervorgerufen durch die Bildung radikalischer Intermediate während der zwei

separaten Ein-Elektron-Transferprozesse [97]. Zudem findet die anodische Oxidation

von NADH zu NAD+ an reinen Metalloberflächen bei hohen Überpotentialen von

mehr als +0.6 V vs. SCE statt [98], so dass Interferenzen durch elektrochemisch co-

oxidierbare Interferenzen, die in komplexen Analyt-Matrizes vorkommen, auftreten.

Ein Ansatz zur Lösung dieser Probleme ist, das Elektrodenpotentials, das zur

Oxidation von NADH nötig ist, zu senken und gleichzeitig einen simultanen Zwei-

Elektronen-Transfer zu gewährleisten. Beide Ziele können durch die Immobilisierung

von geeigneten Redoxmediatoren auf der Elektrodenoberfläche erreicht werden. Die

Redoxmediatoren müssen dabei in der Lage sein, den Elektronentransfer von NADH

zur Elektrodenoberfläche zu modulieren und so einen simultanen Zwei-

Elektronentransfer zu ermöglichen [99].


Beispiele für geeignete Mediatoren sind Methylengrün [100], Methylenblau

(Phenothiazin) [101,102] oder Nilblau (Phenoxazin) [103-106]. Weiterhin konnte

gezeigt werden, dass Polymerfilme, die durch elektrochemische Polymerisation von

Chinon-modifiziertem Pyrrol [107] oder Osmium enthaltenden Redoxpolymeren [108]

auf Elektrodenoberflächen abgeschieden wurden, eine hohe Aktivität für die

elektrokatalytische Oxidation von NADH zeigen.

2.2.3 Elektrochemische Affinitätsassys

Elektrochemische Affinitätsassays und Affinitätsassays allgemein lassen sich

entsprechend ihrer Signaltransduktion in direkte und indirekte Formate einteilen.

In direkten Verfahren ist die Verfolgung des Bindungsprozesses kontinuierlich und in

Echtzeit möglich, wofür aber zumeist hochentwickelte und teure Systeme wie

Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) [109-111] oder piezoelektrische Techniken

[112-114] erforderlich sind. Mit SPR ist zudem ein einfache Bestimmung von

kinetischen Konstanten, wie Affinitäts- oder Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten

möglich [115]. Die piezoelektrische Techniken auf der Basis von Quarz-Mikrowaagen

weisen eine sehr hohe Sensitivität auf, haben aber häufig aufgrund ihrer hohen

Querempfindlichkeit durch unspezifische Adsorption nur eine vergleichsweise

geringe Spezifität.

In indirekten, kompetitiven Assays wird der zu bestimmende Analyt oder Antikörper

mit einer Markierung (z. B. redoxaktive Gruppen, Enzyme, Fluoreszenzmarker oder

radioaktive Markierungen) versehen, um das komplementäre Bindungsereignis zu

detektieren. Ein Vergleich der verschiedenen Markierungsmethoden ist z. B. in [116]

zu finden. Die markierten Komplexe werden der Probe zugesetzt und konkurrieren

mit dem Analyten um eine begrenzte Anzahl an Bindungsstellen. Anschließend wird

die Intensität bzw. Menge der gebundenen Markierung bestimmt, über die auf die

Konzentration des Analyten geschlossen werden kann. Bei maximaler Intensität sind

die Bindungsstellen nur mit markierten Komplexen belegt, was bedeutet, dass der

entsprechende Analyt nicht in der Probe vorhanden ist.


Das bekannteste und weitverbreitetste Verfahren für indirekte, kompetitive

Affinitätsassays sind die sogenannten ELISA-Assays (ELISA = Enzyme Linked

Immunosorbent Assay), deren Messprinzip in Abbildung 2.2-3 schematisch

dargestellt ist.

Die quantitative Bestimmung des im ELISA-Assay enzymatisch gebildeten Produktes

kann dabei über elektrochemische oder photometrische Messverfahren erfolgen.

Häufig verwendete Markerenzyme sind Alkalische Phosphatase [117-119],

Peroxidasen [120-122], oder Glucoseoxidase [120,123,124].

Ein anderes indirektes Verfahren besteht in der Verwendung markierter sekundärer

Antikörper, über die das primäre Bindungsereignis zwischen Analyt und auf einer

Matrix immobilisierten Bindungsstellen detektiert werden kann. Die sekundären

Antikörper sind dabei spezifisch für den Analyten und können nur über die

Verbrückung durch den Analyten an die limitierte Zahl von Bindungsstellen

anbinden. Je höher das Intensitätssignal der Markierung des sekundären Antikörpers

ist, desto höher ist die Analytkonzentration in Lösung.

Affinitätsassays werden weiterhin in homogene und heterogene Formate unterteilt. In

heterogenen Assayformaten müssen vor dem Messprozess die spezifisch

gebundenen Erkennungselemente von ungebundenen getrennt werden, wozu

verschiedene Wasch- und Separationsschritte nötig sind. Homogene Assayverfahren

beruhen auf der Signaländerung einer Markierung, hervorgerufen durch die Bildung

E

E

E

E E E E E E

S PS PS

P

E

Abbildung 2.2-3 schematische Darstellung des Messprinzips eines ELISA-AssaysAnalyt (schwarz) und enymmarkierter Analyt (grün), welcher der Probezugesetzt wird, konkurrieren um eine begrenzte Anzahl an Bindungsstellen(orange). Nicht gebundene Spezies werden abgewaschen. Das EnzymsubstratS wird zugesetzt. Über die Bestimmung des enzymatisch gebildeten Produkts Pkann auf die in der Probe enthaltene Menge an Analyt geschlossen werden.


eines Immunkomplexes in Lösung. Das Messsignal wird dabei direkt in der

Reaktionslösung ohne vorherige Separationsschritte detektiert. Als Abwandlung der

homogenen Formate sind die pseudohomogenen Verfahren zu betrachten, die

ebenfalls ohne Separationsschritte auskommen, bei denen die prinzipielle

Immunreaktion aber an einer Elektrodenoberfläche stattfindet [59].

Elektrochemische Techniken haben breite Anwendung gefunden, um in kompetitiven

Assays mit enzymmarkierten Erkennungselementen komplementäre Bindungs-

ereignisse zu detektieren. Beispielsweise wurden elektrochemische Affinitätsassays

entwickelt, die auf der Verwendung von Antikörper, die mit Alkalischer Phosphatase

[118,119], Meerrettich-Peroxidase [121,122] oder Glucoseoxidase [123,124] markiert

sind, und der amperometrischen Messung von elektroaktiven Spezies, die in der

enzymkatalysierten Reaktion in Gegenwart des spezifischen Enzymsubstrats

gebildet werden, basieren.

Mit elektrochemischen Methoden gelingt auch die direkte elektrochemische

Detektion von molekularen Erkennungsprozessen, wobei die meisten der

beschriebenen Systeme sehr speziell auf einen Analyten ausgelegt sind, so dass

eine Adaption an andere Analyte oder Erkennungssysteme meist nicht möglich ist.

So wurden homogene elektrochemische Affinitätsassays für das komplementäre

Biotin-Avidin-System entwickelt. Dazu wurde Biotinhydrazid [125] oder Biotinderivate

mit Daunomycin [126,127] oder Nilblau [128] als elektrochemisch aktive

Markierungen verwendet. Bei entsprechenden Elektrodenpotentialen können diese

Redoxspezies auf der Elektrodenoberfläche angereichert und in einer nachfolgenden

linearen Potentialrampe oxidiert oder reduziert werden (Stripping Voltammetrie).

Wird jedoch der Biotin-Teil der redoxaktiven Moleküle durch Avidin erkannt und

gebunden, so wird der elektrochemisch aktive Teil ebenfalls mit in die

Bindungstasche gezogen, was zu einem Verlust der elektrochemischen Aktivität

führt. Die Abnahme des Stromes im Stripping Voltammogramm kann mit der

Konzentration an Avidin korreliert werden und dient als Basis für den Affinitätsassay.

Etwas abgewandelte Versionen dieses Prinzips verwenden N-Iodoacetyl-N-biotin-

hexylendiamin [129] und mit Cystein markiertes Biotin [130]. Quecksilber(II) wurde

dabei als Marker zur Detektion des Bindungsereignisses zwischen Biotin und Avidin

genutzt. Die Oxidationswelle von Quecksilber im Stripping Voltammogramm

erniedrigt sich, wenn der Cystein-Teil des Biotinderivats Quecksilber(II) komplexiert.


Ist Avidin in der Lösung, so bindet das Cystein-Biotin an Avidin, so dass

Quecksilber(II) nicht komplexiert werden kann und keine Abnahme des Quecksilber-

Peaks zu beobachten ist. Ein analoges Messprinzip nutzt mit Dopamin markiertes

Biotin [131]. Freies dopamin-markiertes Biotin besitzt eine elektrokatalytische

Aktivität für die Oxidation von NADH. Nach Bindung an Avidin verliert der Dopamin-

Teil seine elektrokatalytische Aktivität, was zu einer Verminderung des NADH-

Oxidations-Stroms führt.

In einem anderen Ansatz zur Detektion von Biotin-Avidin-Interaktion wurden mit

Streptavidin modifizierte Goldkolloide verwendet [132]. Auf der Elektrodenoberfläche

wird biotiniliertes Rinder-Serum-Albumin (Bovine Serum Albumin, BSA) immobilisiert.

Die Elektrode wird mit Streptavidin und streptavidin-modifizierten Goldkolloiden

inkubiert. Anschließend werden in 0.1 M HCl Lösung die an der Oberfläche

gebundenen Goldkolloide elektrochemisch in Gold-Chloro-Komplexe überführt. Die

Intensität des Reduktionspeak der Gold-Chloro-Komplexe im nachfolgenden linearen

Potentialscan stellt das Signal des Assays dar und kann mit der Konzentration an

Streptavidin in der Inkubationslösung korreliert werden.

Bindungsereignisse zwischen Antigen und Antikörpern konnten direkt mit Hilfe von

Glucoseoxidase oder BSA, die mit Ferrocengruppen und Digoxin modifiziert wurden,

detektiert werden [133,134]. Nach Inkubation mit einem Anti-Digoxin Antikörper

konnte eine Stromabnahme beobachtet werden. Eine Verstärkung des Stromsignals

konnte durch Mehrfachmarkieren der Proteine mit Ferrocen und im Falle von

Glucoseoxidase zusätzlich durch enzymatische Verstärkung durch den Zusatz von

Glucose erreicht werden.

Eine andere Möglichkeit, komplementäre Bindungsereignisse mit elektrochemischen

Methoden direkt zu detektieren basiert auf der Intercalation eines redoxaktiven

Komplexes, z. B. Actinomycin, zwischen DNA-Doppelsträngen, was zu einer

Verringerung des Diffusionskoeffizienten und somit zu einem verringerten

polarographischen Stromsignal führt [135].


2.3 Molekulare Erkennung zwischen Biotin und Streptavidin

In der Affinitäts- und Immunosensorik sind Verfahren für die Quantifizierung der

verschiedensten Immun- und Erkennungsreaktionen entwickelt worden. In der

folgenden Tabelle ist ein Überblick über die verwendeten molekularen

Erkennungssysteme gegeben.

Molekulares Erkennungselement Analyt / Bindungspartner

Antikörper

polyklonal Antigen / Hapten

monoklonal Antigen / Hapten

Bindeproteine

Protein A und G Immunglobulin G (IgG)

Avidin / Streptavidin Biotin, biotinilierte Substanzen

Singlestrand-Binding Protein (SSB) einsträngige DNA (ssDNA)

Nucleinsäuren komplementäre Nucleinsäuren

Lectine Kohlenhydrate / Glycoproteine /Zelloberflächen

Lipide hydrophobe Substanzen

Rezeptoren z. B. Neurotransmitter / Inhibitoren

Enzyme Inhibitoren / Substrate / Cosubstrate

Das Hauptanwendungsgebiet liegt in der Quantifizierung der molekularen Erkennung

zwischen Antigenen und Antikörpern. Die Herstellung von Antikörpern mit

immunologischen Methoden ist jedoch ein aufwendiger Prozess, so dass Antikörper

recht hohe Produktionskosten haben. Aus diesem Grunde werden für die

Entwicklung neuer Assayverfahren häufig zunächst Modellsysteme anstelle des

Antigen-Antikörper-Systems verwendet. Erweist sich das Verfahren als erfolgreich,

so sind beim Übergang vom Modellsystem zum realen System meist nur geringe

Adaptionen nötig, wodurch Entwicklungskosten gespart werden können.


Ein Modellsystem, das häufig für die Entwicklung neuer Assaytechnologien

verwendet wird, ist das Biotin-Avidin bzw. Biotin-Streptavidin-System, das im

Folgenden kurz vorgestellt werden soll.

Avidin und Streptavidin dienen dabei nicht nur als Modellsysteme, sondern sind

wichtige nicht-immunologische molekulare Erkennungssysteme, die in einer Vielzahl

von bioanalytischen Verfahren [136-138] und der klinischen Diagnostik, z. B. in

Immunoassays, der DNA-Diagnostik und der Immunohistochemie, verwendet

werden [139].

Avidin und Streptavidin sind intensiv erforscht worden. So sind die Gensequenzen

beider Proteine bekannt, kloniert und in E. Coli exprimiert worden [140,141]. Ebenso

aufgeklärt sind die primären Aminosäuresequenzen und die dreidimensionalen

Strukturen [140,142,143]

Avidin ist ein in Eiweiß vorkommendes Glycoprotein, das aus vier identischen

Untereinheiten aus je 128 Aminosäureresten, inklusive 2 Cysteinresten, besteht

[144]. Das Molekül hat eine sehr hohe konformale Stabilität und besitzt nur eine

Disulfidbindung zwischen den Peptidketten [145]. Streptavidin, ein zu Avidin

homologes Protein aus dem Actinobakterium Streptomyces avidinii [146], hingegen

besitzt keine Kohlenhydrateigenschaften und ist frei von Aminosäureresten mit

Schwefelatomen [147,148]. Obwohl Streptavidin 30 Aminosäurereste mehr als

Avidin besitzt, weist es eine fast identische globuläre Tertiärstruktur auf [149].

Avidin stellt 0.05 % der Proteinmenge in Eiweiß dar. Bereits 1898 wurde festgestellt,

das ungekochtes Eiweiß toxisch ist [150] und in einem Vitamindefizit resultiert [151].

Später wurde entdeckt, dass Avidin Biotin (Vitamin H) bindet und somit dessen

Absorption im Darm verhindert. Im Falle von Mikroorganismen wird die Aufnahme

von Biotin aus dem Wachstumsmedium unterdrückt, was Avidin antibakterielle

Eigenschaften verleiht. Streptavidin besitzt gleiche Bindungseigenschaften für Biotin

wie Avidin.

Jedes Streptavidin- und Avidinmolekül ist in der Lage vier Moleküle D-Biotin mit einer

ungewöhnlich hohen Affinität (Dissoziationskonstante KD = 10-15 M) und Spezifität

über nichtkovalente Wechselwirkungen zu binden [146,147]. Die hohe Affinität kann

dabei auf mehrere Faktoren zurückgeführt werden, wie die Verdrängung von

gebundenem Wasser, die multiple Ausbildung von Wasserstoffbrücken, van der

Waals-Wechselwirkungen zwischen Heteroatomen des Biotins und der


Bindungstasche des Proteins (z. B. zwischen dem Schwefelatom des Biotin und

Threonin-Resten in der Bindungstasche), zusammen mit der Ausrichtung eines

Oberflächen-Polypeptidrings, der das Biotin im Inneren des Proteins einschließt. Die

genauen strukturellen Gründe und Ursachen für die hohe Bindungsaffinität zwischen

Biotin und Streptavidin sind in der Literatur intensiv erforscht und beschrieben

worden [143,152]. Die Stärke der Streptavidin-Biotin Wechselwirkung wurde z. B.

durch Kraftmessungen mit Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy, AFM)

bestimmt [153,154], während die Bindungskinetik u. a. mit Oberflächenplasmonen-

resonanz untersucht wurde [155].

Streptavidin gilt als eines der stabilsten Proteine. So behält es seine funktionellen

Eigenschaften selbst bei hohen Temperaturen, extremen pH-Werten und in der

Gegenwart von hohen Konzentrationen an denaturierenden Reagenzien oder

organischen Lösungsmitteln und besitzt eine hohe Stabilität gegenüber Proteolyse.

Diese besonderen Eigenschaften von Streptavidin in Kombination mit der

Möglichkeit Biotin in verschiedene biologische Materialien und Substanzen zu

inkorporieren, hat Streptavidin zu einem der variabelsten und meistverwendeten

Affinitäts-Tag-Systeme (Tag (engl.) = (angebrachte) Erkennungsmarkierung) in

biologischen Anwendungen gemacht.

Die Klonierung und die Fusionierung des Streptavidin-Gens mit anderen Genen

durch Sano und Cantor im Jahr 1990 öffnete den Weg zum „Genetic Engineering“

von Streptavidin [156]. Zur Erweiterung des Anwendungsgebiets wurde Streptavidin

genetisch verändert, um so eine besonders hohe Affinität zu bestimmten Protein-

Tags, z. B. StrepTag [157-159], oder eine reduzierte Affinität zu Biotin [160,161] zu

erhalten. Weiterhin gelang die Herstellung eines rekombinanten Fusionsproteins aus

Streptavidin und Protein A, das beide Funktionalitäten aufweist [160]. Protein A

bindet an die unspezifische Fc-Domäne von Immunglobulin G-Antikörpern (IgG) ohne

deren Fähigkeit Antigene zu binden einzuschränken [162] und wird deshalb häufig in

immunologischen Anwendungen für die Aufreinigung oder untergruppenspezifische

Bestimmung von Antikörpern benutzt.


2.4 Miniaturisierung von elektrochemischen Messsystemen

Wie bereits einleitend erwähnt, besteht zunehmendes Interesse an der

Miniaturisierung von Biosensoren und Affinitätsassays. Hierzu müssen miniaturisierte

Messsonden und Verfahren zur Herstellung entsprechend kleiner Sensorstrukturen

entwickelt werden. Ein wichtiger Schritt in der Miniaturisierung elektrochemischer

Messsysteme war die Entwicklung von Mikroelektroden und der Elektrochemischen

Rastermikroskopie (Scanning Electrochemical Microscopy, SECM).

2.4.1 Mikroelektroden

In der Elektrochemischen Rastermikroskopie werden Scheibenmikroelektroden, d. h.

Elektroden, deren Durchmesser der aktiven Elektrodenoberfläche kleiner als 50 µm

ist, als Messsonden verwendet. Durch das Verständnis des voltammetrischen

Verhaltens von Mikroelektroden wurde die fundamentale Grundlage für die

Entwicklung des SECM geschaffen.

Scheibenmikroelektroden mit Durchmessern von 50 µm und weniger weisen in

voltammetrischen Experimenten ein von Makroelektroden (∅ > 100 µm)

abweichendes Verhalten auf, das intensiv theoretisch behandelt worden ist, und in

der Literatur in vielen Publikationen und Übersichtsartikeln beschrieben wird

[163-169].

Im Folgenden soll eine kurze Zusammenfassung mit den wichtigsten Grundlagen

gegeben werden.

Generell spricht man von Mikroelektroden, wenn in der Zeitskala des Experimentes

die Ausdehnung der an sich schon kleinen Diffusionsschicht größer wird, als die

charakteristische Dimension der Elektrode [170]. Im Falle von Scheibenelektroden

handelt es sich hierbei um den Radius der aktiven Elektrodenoberfläche. An

stromdurchflossenen Scheibenmikroelektroden entwickeln sich innerhalb kürzester

Zeit sehr große Diffusionsschichten. Der anfängliche zeitabhängige Massentransport

zur Elektrodenoberfläche geht dabei in einen stationären Massentransport über.

Diffusionskanteneffekte an den Grenzflächen zwischen aktiver Elektrodenoberfläche

und isolierender Ummantelung kommen bei den kleinen Ausmaßen von

Mikroelektroden besonders zum Tragen, was bedeutet, dass zusätzlich zur üblichen


axialen Diffusion eine radiale Diffusionskomponente parallel zur Oberfläche wirksam

wird. Die anfangs eindimensionalen Diffusionsfelder wandeln sich in räumliche um.

Daraus ergibt sich einerseits, dass pro Zeit- und Flächeneinheit wesentlich mehr

elektroaktive Spezies die Elektrodenoberfläche erreichen als im Falle planarer

Diffusion. Andererseits bedingt das durch die Elektrodengeometrie in einem

vorgegebenen Raumwinkel anwachsende Volumen des Diffusionsfeldes, dass der

Teilchenfluss in und aus Raumvolumenelementen mit fortschreitender Zeit stationär

wird und die Diffusionsschicht nicht weiter anwächst.

Der Massentransportkoeffizient m, der ein Maß für die Transportgeschwindigkeit der

Teilchen in der stationären Diffusionsschicht darstellt, verhält sich in einem

sphärischen Diffusionsfeld umgekehrt proportional zum Elektrodenradius (m = D r-1

[cm s-1] D = Diffusionskoeffizient). Daraus resultiert, dass bei Mikroelektroden trotz

absolut abnehmender Ströme die Stromdichten gegenüber konventionellen

Makroelektroden um viele Größenordnungen ansteigen, wodurch sich das Verhältnis

vom FARADAY-Strom zu kapazitivem Strom erheblich verbessert.

Die geringen kapazitiven Stromanteile, die dementsprechend rasch abklingen,

erlauben die Verwendung von hohen Vorschubgeschwindigkeiten und ermöglichen

so Messungen in sehr kleinen Zeitdomänen, wie sie für Untersuchungen schneller

Elektronentransferreaktionen und Reaktionsmechanismen mit schneller cyclischer

Voltammetrie erforderlich sind [171].

Die speziellen Eigenschaften von Mikroelektroden werden besonders in

voltammetrischen Experimenten deutlich. Hierbei wird ausgehend von einem

Anfangswert das Potential der Arbeitselektrode zeitlich linear bis zu einem Endwert

verändert und der resultierende Stromfluss gemessen. Führt man den

Potentialvorschub nach Erreichen des Endpotentials wiederum linear bis zum

Anfangswert zurück, so spricht man von cyclischer Voltammetrie [172,173]. Die

Messzeitskala wird dabei über die Potentialvorschubgeschwindigkeit v = ∆E / ∆t

festgelegt.

In Abbildung 2.4-1 sind als Vergleich cyclische Voltammogramme einer Makro- und

einer Mikroelektrode gezeigt.


0 100 200 300 400 500

-20

-10

0

10

20

30

i [µ

A]

E vs. Ag/AgCl [mV]0 100 200 300 400 500

-5

0

5

10

15

20

i [nA

]

E vs. Ag/AgCl [mV]

Abbildung 2.4-1 Beispielhafte cyclische Voltammogramme einer Makroelektrode (∅ = 2.5 mm)(links) und einer Mikroelektrode (∅ = 10 µm) (rechts) bei gleicherVorschubgeschwindigkeit (20 mV/s) und gleicher Konzentration an K4[Fe(CN)6]

Die unterschiedlichen Diffusionsfelder von Makro- und Mikroelektroden spiegeln sich

im unterschiedlichen Verlauf ihrer Cyclovoltammogramme wieder.

Im Folgenden soll der allgemeine Fall einer heterogenen Elektronentransferreaktion

an Makroelektroden behandelt werden:

OX + e- RED

Mit zunehmenden Potential nimmt entsprechend der NERNST-Gleichung

]d[Re

]Ox[log

n

059.0EE o += (Gleichung 4.2-1)

die Oberflächenkonzentration an OX ab und von RED zu, wodurch der Gradient und

damit auch der heterogene Ladungstransfer durch die Reduktion von OX zu RED

anwächst. Nach Überschreiten des E0-Potentials wird die Oberflächenkonzentration

von OX verschwindend gering und der Strom erreicht ein Maximum, dessen Höhe

durch die RANDLES-SEVCIK-Gleichung beschrieben wird [172,174]:

ip = (2.69 105) n3/2 A D1/2 v1/2 c (Gleichung 4.2.-2)

Der Konzentrationsgradient an der Elektrodenoberfläche wird nahezu unabhängig

vom Potential. Der Stromfluss wird jetzt durch den Nachtransport von umsetzbarer

Spezies durch das planare Diffusionsfeld zur Elektrodenoberfläche bestimmt. Die

Diffusionsschicht dehnt sich dabei weiter in die Lösung aus, was zum Absinken des

Stroms führt. Der abfallende Stromverlauf bei Makroelektroden kann dabei durch die


COTTRELL-Gleichung beschrieben werden [172,174]:

π=

t

AnFcDi

2/1

t (Gleichung 4.2-3)

Im Unterschied dazu erfolgt im Falle von Mikroelektroden der Massentransport durch

ein hemisphärisches Diffusionsfeld. Die hemisphärische Diffusion führt auf die

Fläche bezogen zu einem erhöhten und sich schnell einstellenden Massentransfer

zur Elektrodenoberfläche. Der erhöhte Massentransfer durch ein stationäres

Diffusionsfeld führt dazu, dass es vor der Elektrodenoberfläche nicht zu Verarmung

an umsetzbarer Spezies kommt, so dass bei Potentialen oberhalb des

Normalpotentials keine Abnahme des Stromflusses auftritt, sondern sich ein

konstanter, potentialunabhängiger Stromfluss einstellt. Die Cyclovoltammogramme

von Mikroelektroden haben daher eine sigmoide Form, die polarographischen Stufen

ähnelt.

Die Einstellzeit bis zu einem stationären Zustand des Diffusionsfeldes vor der

Elektrodenoberfläche beträgt bei einem durchschnittlichen Diffusionskoeffizienten

von D = 10-6 cm2 s-1 und einem Elektrodendurchmesser von 1 µm ca. 0.01 s und bei

einem Durchmesser von 10 µm ca. 1.3 s [175]. Die Einstellzeit ist für die

Elektrochemische Rastermikroskopie insofern von Bedeutung, da sie festlegt, mit

welcher Geschwindigkeit die Mikroelektrode über die zu untersuchende Oberfläche

bewegt werden kann.

In umfangreichen theoretischen Studien [175-177] konnte gezeigt werden, dass die

stationären, zeitunabhängigen Grenzströme is für Kugel-, Halbkugel-, und

Scheibenmikroelektroden mit (hemi)sphärischen Diffusionsfelder mit einer

identischen Beziehung zu beschreiben sind, sofern man einen Oberflächen-

durchmesser d einführt:

is = 2nFcDd (Gleichung 2.4-4)

Für den Oberflächendurchmesser ergibt sich für die Kugel d = 2πr, für die Halbkugel

d = πr und für die Scheibenelektrode d = 2r (mit r = Radius der aktiven Elektroden-

oberfläche).

Somit ergibt sich für den stationären Grenzstrom is einer Scheibenmikroelektrode:

is = 4nFcDr (Gleichung 2.4-5)


2.4.2 Elektrochemische Rastermikroskopie

Das Prinzip der Elektrochemischen Rastermikroskopie (SECM) wurde Mitte der

achtziger Jahre von Engstrom et al. [178] erfunden und von Bard et al. [179,180]

Ende der achtziger Jahre zur Methode weiterentwickelt. Aber erst in der letzten Zeit

hat die Elektrochemische Rastermikroskopie als elektroanalytische Untersuchungs-

methode stärker an Bedeutung gewonnen, was aktuelle Übersichtsartikel

verdeutlichen [181-186].

Das SECM gehört zu der Gruppe der Rastersonden-Mikroskopien (Scanning Probe

Microscopy), welche auf dem Abrastern einer Probenoberfläche mit einer

miniaturisierten Messsonde, die in alle drei Raumrichtungen mit hochauflösenden

Positioniersystemen bewegt werden kann, beruht. Als Messdaten werden dabei der

Ort bzw. die Position der Sonde zusammen mit dem lokal aufgenommenen

Messsignal der Sonde registriert. Mittels spezieller Software können die Messdaten

in Bilder umgewandelt werden.

Der wesentlicher Unterschied zwischen der Elektrochemischen Rastermikroskopie

und ähnlichen Techniken wie Rastertunnelmikroskopie (Scanning Tunneling

Microscopy, STM) oder Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy, AFM) ist,

dass mit dem SECM zusätzlich zur Topographie der Probe auch deren chemische

Eigenschaften untersucht werden können. Allerdings ist das Auflösungsvermögen

des SECM um mehrere Größenordnungen schlechter als das des STM und AFM,

die bis in den atomaren Bereich vordringen können.

Das Auflösungsvermögen des SECM wird hauptsächlich durch die Größe des

Durchmessers der aktiven Elektrodenoberfläche der als Messsonden verwendeten

Mikroelektroden und deren Abstand zur Probenoberfläche bestimmt [187].

Momentan ist man in der Lage Ultramikroelektroden herzustellen, deren

Durchmesser sich im unteren Mikrometerbereich und Sub-Mikrometerbereich

befinden [188-194], so dass auch das Auflösungsvermögen des SECM in diesem

Bereich anzusiedeln ist.

Im einfachsten Untersuchungsmodus des SECM wird eine Mikroelektrode in einer

Elektrolytlösung, die eine reversibel oxidierbare und reduzierbare Spezies

(Redoxmediator) enthält, mit konstanter Geschwindigkeit und konstanter

Höhenposition über die zu untersuchende Probenoberfläche bewegt. Die

Mikroelektrode wird dabei mit einem Potential belegt, so dass die Redoxspezies


diffusionskontrolliert an der Elektrodenoberfläche umgesetzt wird. Der resultierende

FARADAY-Strom stellt das Messsignal im SECM-Experiment dar.

Die Größe dieses Stroms enthält Informationen über Topographie [195], lokale

Leitfähigkeit [196], Konzentrationsprofile [197] und chemisch aktive Bereiche der

Oberfläche (sogenannte hot spots) [198].

Ein weiteres Anwendungsgebiet des SECM ist die lokale Modifikation von

Oberflächen. So konnten mit dem SECM Metalle [199,200] und Halbleiter [201,202]

geätzt werden, sowie leitende [203-205] und nichtleitende Polymere [206] und

Metalle [207] abgeschieden werden. Weiterhin kann das SECM für die Bestimmung

von Diffusionskoeffizienten [208] und für kinetische Studien des Elektronentransfers

[209,210] und chemischer Reaktionen [211] ohne laterale Auflösung genutzt werden.

In neuerer Zeit ist das SECM auch vermehrt zur Charakterisierung von biologischen

komplexen Systemen wie Zellen herangezogen worden [184,212,213]. So gelang mit

dem SECM die Abbildung von Zellen und die ortsaufgelöste amperometrische

Detektion von singulären Exocytose-Ereignissen [214,215].

Weiterhin konnte das SECM zur Untersuchung von Enzymreaktionen, sowie zur

Charakterisierung und Herstellung von Enzym-Mikrostrukturen verwendet werden,

worauf später in dieser Arbeit noch eingegangen wird.

2.4.3 Funktionsprinzip des Elektrochemischen Rastermikroskops

Ein SECM besteht prinzipiell aus folgenden Komponenten:

• Eine elektrochemische Zelle, die mit Elektrolytlösung, der häufig eine redoxaktive

Spezies zugesetzt wird, befüllt ist. Am Boden der elektrochemischen Zelle

befindet sich die zu untersuchende Probe.

• Eine Mikroelektrode, die senkrecht zur Probenoberfläche orientiert von oben in die

elektrochemische Zelle abgesenkt werden kann.

• Ein Präzisionspositioniersystem für alle Raumrichtungen, mit dem die relative

Position zwischen Mikroelektrode und Probenoberfläche exakt justiert werden

kann. Dabei gibt es mehrere Möglichkeiten: So kann entweder die Position der

elektrochemischen Zelle variiert werden und die Mikroelektrode bleibt ortsfest

oder umgekehrt.


• Ein (Bi-)Potentiostat zur Polarisierung der Mikroelektrode und/oder der Probe auf

ein festes Potential oder zur Durchführung elektrochemischer Messungen.

• Ein Computer zur Steuerung der Positioniereinheiten, des Potentiostaten und zur

Aufnahme und Auswertung der Messdaten.

Detaillierte Beschreibungen des in dieser Arbeit verwendeten SECM mit allen

Komponenten und der Steuersoftware finden sich in [187,212].

Abbildung 2.4-2 schematische Darstellung des Aufbaus eines SECM (adaptiert aus [187])


Im einfachsten SECM-Experiment wird die Mikroelektrode in kurzem Abstand zur

Probe positioniert, auf ein festes Potential polarisiert und anschließend kammartig

über die Probenoberfläche gerastert. Über die sich ändernden Stromwerte der

Mikroelektrode kann auf die lokale Oberflächenbeschaffenheit geschlossen werden.

Je nach experimenteller Anordnung der Mikroelektrode und der Probenoberfläche

kann man verschiedene Betriebsmodi unterscheiden, von denen im Folgenden nur

die für die Arbeit relevanten behandelt werden.

Zu Beginn des Experiments wird die Mikroelektrode in die mit einer Elektrolytlösung

und redoxaktiven Spezies gefüllte elektrochemische Zelle eingeführt und auf ein

Potential polarisiert, so dass die in Lösung befindliche Redoxspezies unter

Diffusionskontrolle umgesetzt wird.

Nach Ausbildung eines hemisphärisches Diffusionsfeld vor der Mikroelektrode fließt

der diffusionskontrollierte Grenzstrom entsprechend folgender Gleichung:

it,∞ = 4nFcDr (Gleichung 2.4-6)

n = Zahl der ausgetauschten Elektronen

F = FARADAY-Konstante

c = Konzentration der Redoxspezies

D = Diffusionskoeffizient der Redoxspezies

r = Radius der aktiven Elektrodenoberfläche

Der Messeffekt des SECM ergibt sich nun, wenn die Mikroelektrode senkrecht an die

zu untersuchende Oberfläche, im Folgenden auch Substratoberfläche genannt,

angenähert wird. Entsprechend den Eigenschaften der Oberfläche können dabei

mehrere Fälle unterschieden werden, die im Folgenden diskutiert werden.


2.4.3.1 Annäherung an nichtleitende Oberflächen (negativer Feedback)

Je dichter sich die Mikroelektrode

senkrecht einer nichtleitenden Oberfläche

nähert, desto kleiner wird der aktuell

fließende Strom it. Durch die

Substratoberfläche wird das Diffusionsfeld

vor der Mikroelektrode partiell blockiert, so

dass der Diffusionsfluss zur Mikroelektrode

gehemmt wird und weniger umsetzbare

Spezies pro Zeiteinheit die Mikroelektrode

erreichen, was zu einem Absinken des

Stroms führt. Bei sehr dichter Annäherung

erreicht der Strom einen Grenzwert von

null. Die Mikroelektrode hat auf der

Oberfläche aufgesetzt, welche nun den

gesamten Redoxmediatorfluss zur

Mikroelektrode blockiert, so dass kein Stromfluss mehr zu verzeichnen ist. Da in der

Praxis eine perfekte Planparallelität zwischen Mikroelektrode und Substratoberfläche

nur selten gegeben ist, erfolgt keine vollständige Blockierung des Diffusionsfeldes,

so dass immer ein geringer Reststrom zu messen ist.

Da bei der Annäherung an eine nichtleitende Oberfläche der Strom it kleiner wird als

der Grenzstrom it,∞ in unendlicher Entfernung von der Oberfläche bezeichnet man

diesen Effekt als negativen Feedback.

Das Verhalten von Scheibenmikroelektroden beim Annähern an nichtleitende und

leitende Oberflächen ist von Kwack und Bard theoretisch behandelt worden [216].

Die Annäherungskurven konnten unter folgenden Annahmen numerisch berechnet

werden:

• Die Probenoberfläche ist planar, unbegrenzt ausgedehnt und planparallel zur

Mikroelektrode ausgerichtet.

• Der Radius der Isolierung der Scheibenmikroelektrode ist um ein Vielfaches

größer als der Radius der aktiven Elektrodenoberfläche.

d

r

Abbildung 2.4-3 negativer Feedback übereiner nichtleitendenOberfläche


• Die Umsetzung des Redoxmediators an der Mikroelektrode verläuft

diffusionskontrolliert. Im Falle leitender Substratoberflächen verläuft die

Umsetzung des Redoxmediators an diesen ebenfalls unter Diffusionskontrolle.

Die Berechnungen erfolgten für isolierende Ummantelungen, die 10- bzw. 100-fach

größer waren als der Elektrodenradius. Um Elektroden verschiedener Größe

vergleichen zu können, wird der Abstand d der Mikroelektrode von der

Substratoberfläche auf den aktiven Elektrodenradius r normiert.

Interpoliert man die einzelnen berechneten Werte mit verschiedenen

mathematischen Ausdrücken, so erhält man für eine Annäherung an eine

nichtleitende Substratoberfläche folgende Näherungsformel [217]:

−⋅++

=∞

)r/d(

4035.2exp6553.0

)r/d(

5151.1292.0

1

i

i

,t

t

(Gleichung 2.4-7)

Diese Näherung hat eine Abweichung von 1.2 % von den durch Simulation

berechneten Werten und besitzt ihre Gültigkeit für Werte von d/r im Bereich von 0.05

bis 20.

0 2 4 6 8 100.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

i t / i

t,∞

d / r

Abbildung 2.4-4 theoretisch berechnete Annäherungskurve einer Mikroelektrode an einenichtleitende Oberfläche


Abbildung 2.4-4 zeigt die nach Gleichung 2.4-7 berechnete Stromänderung mit der

Distanz zwischen Mikroelektrode und Substratoberfläche. Auf der Ordinate ist der

auf den Elektrodenradius normierte Abstand der Mikroelektrode von der

Substratoberfläche aufgetragen; die Abszisse stellt den auf it,∞ normierten Stromfluss

durch die Mikroelektrode dar. Die Beeinflussung des FARADAY-Stroms durch die

nichtleitende Oberfläche setzt bei Abständen an, die um das ca. 5-fache größer sind

als der Radius der aktiven Elektrodenoberfläche. Ein weiterer Parameter, der die

Annäherungskurve beeinflusst, ist das Verhältnis von isolierender Ummantelung zu

aktiver Elektrodenoberfläche, was in der Näherung nicht berücksichtigt wird.

2.4.3.2 Annäherung an leitende Oberflächen (positiver Feedback)

Nähert man die Mikroelektrode einer

leitenden Oberfläche (z. B. einer Metall-

oberfläche), an der die Umkehrreaktion der

Mikroelektrodenreaktion OX + e- → RED

stattfinden kann, so steigt mit geringer

werdender Distanz der Strom an. An der

leitenden Oberfläche bildet sich ein

Potential aus, das durch das Verhältnis

von oxidierter Spezies OX zu reduzierter

Spezies RED in der Lösung über die

NERNST-Gleichung bestimmt wird:

]d[Re

]Ox[log

n

059.0EE o +=

Im Falle einer Oxidationsreaktion an der Mikroelektrode legt man eine Lösung vor,

die nur die reduzierte Form der Redoxspezies enthält. Somit ist das Verhältnis von

[OX] zu [RED] sehr klein. Der Logarithmus in Gleichung 4.2-8 wird negativ, und das

Potential der leitenden Oberfläche wird kleiner als das Standardpotential der

Reaktion RED → OX + e-. Daraus folgt, dass die an der Mikroelektrode generierte

oxidierte Spezies OX aufgrund des niedrigen Potentials der leitenden Oberfläche an

Red Ox

d

r

Abbildung 2.4-5 positiver Feedback übereiner leitenden Oberfläche


dieser wieder zur Spezies RED reduziert wird. Das Potential der leitenden Oberfläche

wird vom Konzentrationsverhältnis von OX zu RED über der gesamten

Substratoberfläche bestimmt. Da die Substratoberfläche im Vergleich zur

Mikroelektrode sehr viel größer ist, führt die lokale Erhöhung des

Konzentrationsverhältnisses von oxidierter zu reduzierter Spezies in der Nähe der

Mikroelektrode im Vergleich zur restlichen Lösung nicht zu einer Änderung des

Potentials der leitenden Oberfläche, sondern zu der zuvor erwähnten Umsetzung.

Durch diesen Recycling-Prozess erreichen mehr umsetzbare Redoxspezies pro

Zeiteinheit die Mikroelektrode als im Falle des diffusionskontrollierten Transports aus

dem Volumen der Lösung zu einer Mikroelektrode, die sich weit entfernt von der

leitenden Oberfläche befindet. An der Mikroelektrode können somit mehr

elektroaktive Spezies pro Zeiteinheit umgesetzt werden, was eine Stromerhöhung

zur Folge hat.

Aufgrund des Stromanstiegs im Vergleich zum Grenzstrom it,∞ in unendlicher

Entfernung von der Oberfläche bezeichnet man diesen Effekt als positiven

Feedback.

Die Größe von it im Vergleich zu it,∞ ist zum einen distanzabhängig und zum anderen

anhängig von den Eigenschaften der Oberfläche. In der Praxis kann die Situation

jedoch komplizierter werden, nämlich dann, wenn nicht - wie oben angenommen -

die Diffusion von der Substratoberfläche zur Mikroelektrode der limitierende Faktor

ist, sondern die Geschwindigkeit des heterogenen Ladungstransfers zwischen dem

Mediator und der Substratoberfläche. In diesem Fall kann das SECM zur

Untersuchung der Reaktionskinetik heterogener Elektronentransferreaktionen

benutzt werden [210,218,219].

Die Annäherungskurve von Mikroelektroden an leitende Oberflächen ist ebenfalls

theoretisch behandelt worden. Im Gegensatz zu nichtleitenden Oberflächen, bei

denen die Radien von aktiver Elektrodenoberfläche und isolierender Ummantelung

Einfluss auf die Annäherungskurve haben, ist bei leitenden Oberflächen nur die

aktive Elektrodenoberfläche von Bedeutung [216].


Der Stromverlauf für die Annäherung an leitende Oberflächen kann durch folgende

Näherungsformel beschrieben werden [217]:

−⋅++=

∞ )r/d(

0672.1exp3315.0

)r/d(

78377.068.0

i

i

,t

t(Gleichung 2.4-8)

Diese Näherung hat eine Abweichung von 0.7 % zu der durch Simulation

berechneten Kurve. Die Gültigkeit liegt im Wertebereich für d/r von 0.05 bis 20.

Abbildung 2.4-6 zeigt die nach Gleichung 2.4-8 berechnete Stromänderung mit der

Distanz zwischen Mikroelektrode und Substratoberfläche. Auf der Ordinate ist

wiederum der auf den Elektrodenradius normierte Abstand aufgetragen; die

Abszisse stellt den auf it,∞ normierten Strom dar. Die Beeinflussung des Stroms der

Mikroelektrode durch die leitende Substratoberfläche setzt bei Abständen ein, die

ungefähr dem 5-fachen des aktiven Elektrodenradius entsprechen.

0 2 4 6 8 100

1

2

3

4

5

i t / i t,

∞

d / r

Abbildung 2.4-6 theoretisch berechnete Annäherungskurve einer Mikroelektrode an eine leitendeOberfläche


2.4.3.3 Enzymatischer Generator-Kollektor-Modus / Enzymatischer Feedback

Die Detektion von immobilisierter

Enzymaktivität mit dem SECM kann

prinzipiell mit zwei Methoden erfolgen, die

im Folgenden erläutert werden.

Im enzymatischen Generator-Kollektor-

Modus und im Generator-Kollektor-Modus

allgemein wird lokal generierte

elektrochemisch aktive Spezies mit der

positionierten Mikroelektrode detektiert.

Eine theoretische Behandlung ist

schwierig, da die Bewegung der

Mikroelektrode und die Umsetzung an der

Mikroelektrode das Diffusionsfeld der

Substratoberfläche stört. Bei sehr kurzen

Abständen muss zudem berücksichtigt

werden, dass durch die Mikroelektrode die

Diffusion der Reaktanden zur Substratoberfläche partiell blockiert wird. Ein Beispiel

für den enzymatischen Generator-Kollektor-Modus ist die Detektion der

Enzymaktivität von immobilisierter Glucoseoxidase. In Gegenwart von Glucose kann

das von der immobilisierten Glucoseoxidase enzymatisch gebildete H2O2 an einer

Mikroelektrode, die sich in kurzem Abstand direkt über der Glucoseoxidase befindet

und auf +600 mV vs. Ag/AgCl polarisiert ist, detektiert werden [220]. In diesem Fall

stehen die Synonyme OX und RED in Abbildung 2.4-7 für O2 und H2O2.

Ein weitere Möglichkeit für die Detektion von Enzymaktivität mit dem SECM stellt der

enzymatische Feedback-Modus dar, der eng mit dem Generator-Kollektor-Modus

verknüpft ist. In einer Lösung, die nur die reduzierte Form einer artifiziellen

Redoxspezies enthält, wird an der Mikroelektrode die oxidierte Form produziert, die

in der enzymatischen Reaktion als Cosubstrat fungieren kann. Ist das Enzymsubstrat

in der Lösung vorhanden, so wird die an der Mikroelektrode generierte oxidierte

Form des Mediators in der enzymatischen Reaktion wieder in die reduzierte Form

überführt. Durch dieses Recycling tritt, analog zum bereits diskutierten positiven

Red Ox

EnzymSubstrat Produkt

Abbildung 2.4-7 Schema der Detektion vonimmobilisierter Enzym-aktivität mit dem SECM


Feedback-Effekt, eine Zunahme des Stroms der Mikroelektrode auf. Die Synonyme

OX und RED in Abbildung 2.4-7 stellen im Falle von immobilisierter Glucoseoxidase

z. B. [FeIII(CN)6]3- und [FeII(CN)6]

4- dar.

Pierce et al. beschrieben bereits 1992 die Detektion von immobilisierter

Glucoseoxidase mit [FeII(CN)6]4-, Fc-COOH und Hydrochinon als Mediatoren, sowie

erste Ansätze für theoretische Beschreibungen des enzymatischen Feedback-

Effektes und für die kinetische Bestimmung der involvierten Reaktionsraten [221].

Um immobilisierte Enzymaktivität mit dem SECM zu detektieren, muss die

Enzymreaktion den reduzierten Mediator mit eine genügend hohen Reaktionsrate

regenerieren, um mit dem Massentransfer vom Volumen der Lösung zur Elektrode

konkurrieren zu können. Diese Voraussetzung konnte quantitativ durch die digitale

Simulation des enzymatischen Feedback-Effekt für Glucoseoxidase beschrieben

werden [221]:

kcat Γenz ≥ 10-3 DRed cRed r-1 (Gleichung 2.4-9)

Die linke Seite der Gleichung fasst die enzym-abhängigen Terme zusammen: kcat

charakterisiert die katalytische Reaktionsrate unter Substratsättigung, d. h. bei hohen

Substratkonzentrationen. Γenz ist die Oberflächenkonzentration des Enzyms, oder im

Falle von Filmen endlicher Schichtdicke das Produkt aus Enzymkonzentration im

Film und Filmdicke. Die rechte Seite fasst die experimentellen Terme zusammen:

DRed ist der Diffusionskoeffizient und cRed die Konzentration der reduzierten Spezies

im Volumen der Lösung, r steht für den Radius der Mikroelektrode.

Aus Gleichung 2.4-9 wird deutlich, dass das Kriterium zur Detektion von

immobilisierter Enzymaktivität am einfachsten durch die Verwendung von niedrigen

Mediatorkonzentrationen und Mikroelektroden mit einem großen Radius erfüllt

werden kann.


2.4.4 Mikrobandelektroden und Interdigitalelektroden

Ein weiterer wichtiger Schritt in der Miniaturisierung elektrochemischer Messsysteme

war die Entwicklung von Mikrobandelektroden- und Interdigitalelektroden-Arrays.

Mikrobandelektroden und Interdigitalelektroden besitzen ähnliche Eigenschaften und

Herstellungsprozeduren, so werden beide in Silizium-Mikrotechnologie unter

Reinraumbedingungen gefertigt. Die schematischen Darstellungen von Mikroband-

und Interdigitalelektroden sind in Abbildung 2.4-8 gezeigt.

Die Dimensionen der einzelnen Elektrodenfinger und Abstände liegen bei beiden

Strukturen im unteren Mikrometerbereich [222-224]. Typische Größenordnungen für

im Biosensorbereich verwendete Mikrobandelektroden sind 25 µm x 1000 µm mit

einem Abstand von 25 µm zwischen den einzelnen Elektroden [225].

Elektrodenfinger dieser Größenordnung besitzen noch die spezifischen

Eigenschaften von Mikroelektroden. Interdigitalelektroden-Arrays (IDA) sind in

verschiedenen Größen und Geometrien gefertigt worden. Dabei wurden neben der

Größe und der Zahl der Finger auch der Abstand zwischen den Fingern variiert. Den

Einfluss dieser Parameter auf das elektrochemische Verhalten der

Abbildung 2.4-8 schematische Darstellung von parallelen Mikrobandelektroden (links) undInterdigitalelektroden-Arrays (rechts)Die dunkelgrauen Flächen sind verkapselt, so dass die darunter liegendenMetallflächen von der Elektrolytlösung isoliert sind, die hellgrauen sind freigelegtund kommen somit mit der Elektrolytlösung in Kontakt. Die Kreise stellenKontaktstellen zum Potentiostaten dar und befinden sich außerhalb derElektrolytlösung.


Interdigitalelektroden ist intensiv in Theorie und Praxis untersucht worden [226-231].

Mit IDA ist eine Verstärkung des amperometrischen Stromsignals durch

Redoxrecycling analog zum positiven Feedback im SECM möglich. Allerdings

müssen dazu die Elektrodenkämme in bipotentiostatischer Anordnung geschaltet

werden. Dieser Effekt soll am folgenden Beispiel erläutert werden: In der

Elektrolytlösung befindet sich eine Redoxspezies, die reversibel oxidiert und

reduziert werden kann. Ein Elektrodenkamm wird auf ein Potential polarisiert, so

dass die Redoxspezies diffusionskontrolliert oxidiert werden kann; der andere auf ein

Potential, so dass die diffusionskontrollierte Reduktion der Redoxspezies an diesem

stattfinden kann. Bei sehr kleinen Abständen zwischen den Elektrodenkämmen

kommt es zu einer Überlappung der Diffusionsfelder benachbarter Elektroden. Die

an einem Kamm generierten oxidierten Redoxspezies gelangen über sehr kurze

Diffusionswege zum anderen Kamm, an dem sie wieder reduziert werden. Die

kurzen Diffusionswege der oxidierbaren Redoxspezies zum anodisch geschalteten

Elektrodenkamm und der reduzierbaren Redoxspezies zum kathodischen Kamm

führen zu einer Regeneration im Diffusionsfeld, damit zu einer erhöhten

Transportrate und folglich zu einer Verstärkung sowohl des kathodischen, als auch

des anodischen Stromsignals. Die Effizienz des Redoxrecyclings („Kollektor-

Effizienz“) ist, wie theoretische und praktische Untersuchungen zeigen [230,231],

stark abhängig vom Abstand zwischen den Elektrodenfingern. Typische

Verstärkungsfaktoren von Interdigitalelektroden-Arrays liegen zwischen 5 und 15

[228].

Interdigitalelektroden werden in der Biosensorik häufig in Fliessinjektionssystemen

eingesetzt [232,233]. Die in einem vorgeschalteten enzymatischen Reaktor

gebildeten elektrochemisch aktiven Enzymprodukte werden amperometrisch mit IDA

detektiert. Beispielsweise wurde die Konzentration von p-Aminophenol als

elektrochemisch aktives Produkt der enzymatischen Reaktion von Alkalischer

Phosphatase, die als Enzymmarkierung in einem Enzym-Immunoassay verwendet

wurde, bestimmt [234].

Eine aktuelle Übersicht über die Verwendung von in photolitographischen Verfahren

gefertigten Mikroelektroden in der Biosensorik ist in [235] zu finden.


2.5 Mikrostrukturierung von Oberflächen mit Biomolekülen

Seit der Entwicklung des ersten Biosensors wurde verschiedene chemische und

physikalische Methoden entwickelt, um Biomoleküle auf Transduceroberflächen zu

immobilisieren. Eine geeignete Immobilisierungsmethode muss dabei zum einen

gewährleisten, dass bei der Immobilisierung die Aktivität des Biomoleküls erhalten

bleibt und zum anderen eine gute Langzeitstabilität aufweisen. Seit Miniaturisierung

ein zunehmender Trend in der Biosensorforschung geworden ist, ist das Interesse

an nichtmanuellen Immobilisierungsmethoden mit hoher lokaler Auflösung

gewachsen. Die Immobilisierung von verschiedenen Enzymen an verschiedenen

exakt definierten Orten auf einem festen Substrat stellt dabei eine wichtige Basis zur

Entwicklung von homogenen Multi-Analyt-Sensorsystemen dar.

Die verschiedenen Methoden zur Strukturierung von Oberflächen mit Proteinen

können in zwei Klassen eingeteilt werden: Indirekte Methoden und aktive

Strukturierungsmethoden (Active Placement) [236].

Indirekte Methoden beruhen auf der lokalen Änderung der Reaktivität der Oberfläche

in Bezug auf Biomoleküle. Viele dieser Methoden basieren auf der Modifikation von

Oberflächen mit selbstorganisierenden Monoschichten (Self-Assembled Monolayer,

SAM), die funktionelle terminale Gruppen besitzen. Über diese funktionellen

Gruppen (z. B. Amino-, Säure- oder N-Hydroxysuccinimidyl-Gruppen) erfolgt die

Anbindung und Immobilisierung der Biomoleküle.

Die einfachste indirekte Methode besteht darin, vorstrukturierte Substrate mit

Biomolekülen zu modifizieren. Beispielsweise können die einzelnen Elektroden eines

Mikrobandelektroden-Arrays (vgl. Abbildung 2.4-8) durch elektrochemisch induzierte

Koagulation und anschließender Quervernetzung mit verschiedenen Enzymen

modifiziert werden [237]. Durch den geringen Abstand von 25 µm zwischen den

einzelnen Bandelektroden treten Interferenzen und „Cross-Talk“-Effekte zwischen

benachbarten Bandelektroden auf, die mit dem SECM charakterisiert werden

konnten [238].

Die Elektrochemische Rastermikroskopie ist eine der Schlüsseltechniken in der

Herstellung und Charakterisierung von enzymatischen Mikrostrukturen.

Zur Herstellung enzymatisch aktiver Kreisstrukturen (im Folgenden als Spots

bezeichnet) wurde eine Goldoberfläche mit einer nichtfunktionalisierten Monoschicht


modifiziert und diese lokal elektrochemisch desorbiert. Die lokal freigelegte

Goldoberfläche wurde mit funktionalisierten SAM modifiziert und an diese

Glucoseoxidase kovalent gebunden. Die Aktivität der immobilisierten

Glucoseoxidase konnte mit dem SECM über die Detektion von enzymatisch

generiertem H2O2 visualisiert werden [239,240].

In einer anderen indirekten Methode wurden mit dem SECM mit Aminogruppen

modifizierte Pyrrolderivate lokal abgeschieden, an die kovalent Glucoseoxidase

angebunden wurde. Mit Fc-COOH oder Osmium-(2,2’-bipyridyl)formylpyridinium-

chlorid als Redoxmediatoren gelang die lokale Detektion der immobilisierten

Enzymaktivität [241].

Weiterhin konnte das SECM genutzt werden, um auf eine Siliziumoberfläche lokal

Goldpartikel abzuscheiden, die nachfolgend mit funktionalisierten SAM modifiziert

wurden. Anschließend konnten an die Goldpartikel fluoreszierende Isothiocyanate

oder Glucoseoxidase angebunden werden [242].

Eine andere Methode nutzt die lokale Immobilisierung von magnetischen sehr

kleinen Kugeln (Beads), die mit primären Anti-Maus-Antikörpern modifiziert sind.

Mittels einer Mikropipette und einem Permanentmagneten konnten kreisförmige

Mikrostrukturen von Beads mit einem Durchmesser zwischen 25 µm und 150 µm

erzeugt werden. Unter Nutzung eines sekundären, mit Alkalischer Phosphatase

markierten Anti-Maus-Antikörpers konnte ein Sandwich-Assay für Maus-IgG etabliert

werden, in dem die Enzymaktivität des sekundären Antikörpers mit dem SECM

detektiert wird [243,244]. Alkalische Phosphatase katalysiert die Umsetzung von

elektrochemisch inaktivem 4-Aminophenyl-phosphat zu elektrochemisch aktivem

p-Aminophenol, welches an der Mikroelektrode oxidiert wird.

Die Enzymaktivität von biotinilierter Glucoseoxidase, die an immobilisierten

streptavidin-modifizierte Beads angebunden wurde, konnte ebenfalls mittels SECM

über in der Enzymreaktion gebildetes H2O2 detektiert werden [244].

Eine andere Methode, die seit kurzer Zeit für die Strukturierung von Oberflächen mit

Biomolekülen verwendet wird, ist Mikrokontakt-Stempeln [245,246]. Das Prinzip des

Mikrokontakt-Stempeln ist die Übertragung der dreidimensionalen Struktur des

Stempels in eine laterale Struktur auf der Substratoberfläche. Dazu werden

mikrostrukturierte elastische Stempel aus PDMS (Poly(dimethylsiloxan)) mit einer

Lösung eines Thiolderivats benetzt und auf die Substratoberfläche gedrückt,


wodurch die Oberfläche entsprechend der Stempelstruktur mit Thiolaten modifiziert

wird [247,248]. Komplexere Mikrostrukturen lassen sich durch sequentielle

Stempelschritte mit verschiedenen Thiolen oder dem Verfüllen unmodifizierter

Substratstellen erhalten. Durch Mikrokontakt-Stempeln konnten 200 µm breite

alternierende Streifen von ω-Hydroxy-Undekanthiolat und einer Mischung aus

ω-Hydroxy-Undekanthiolat und einem biotin-modifiziertem Thiolat erhalten werden.

Durch weitere Anbindung an das biotin-modifizierte Thiolat wurden Mikrostrukturen

G-Protein-gekoppelter Rezeptoren mit definierter Orientierung erhalten [249].

Neben selbstorganisierenden Monoschichten kann auch das Biotin-Avidin-System

genutzt werden, um mit indirekten Methoden Mikrostrukturen immobilisierter

Biomoleküle zu erhalten. Mittels konfokaler Lasermikroskopie wurden durch lokale

Immobilisierung eines photoaktiven Biotinderivats Biotin-Mikrostrukturen mit lateralen

Strukturen zwischen 5 µm und 20 µm auf Glaskohlenstoff- oder Siliziumoberflächen

erzeugt. Anschließend wurde an die Biotinstrukturen ein fluoreszierendes Avidin

gebunden, so dass die Mikrostrukturen mittels Fluoreszenzmikroskopie detektiert

werden konnten [250].

In aktiven Strukturierungsmethoden (Active Placement) werden die Biomoleküle an

definierten Stellen direkt auf die Oberfläche aufgebracht. Im einfachsten Ansatz

wurden als Basis für einen Immunoassay mit einer Glaskapillare unter Beobachtung

mit einem Mikroskop 20 µm große Spots von chrorionischem Anti-Human

Gonadropin und plazentalem Anti-Human Lactogen auf einem Glassubstrat

aufgebracht [251].

Ein konventioneller Tintenstrahl-Druckkopf (Ink-Jet) wurde benutzt, um kleine

Tropfen eines Gemisches aus Enzym und BSA zu schießen und so selektiv die

Gates von ionensensitiven Feldeffekt-Transistoren (ISFET) mit Glucoseoxidase oder

Urease zu modifizieren [252]. Um eine stabile quervernetzte Enzymschicht zu

erhalten, müssen die Strukturen nach jedem Schiessvorgang in einer

Gludaraldehyd-Atmosphäre inkubiert werden, wobei die schlechte

Reproduzierbarkeit des Quervernetzungsprozesses ein Problem darstellt.

Nach einem ähnlichen Prinzip konnten mit einem Ink-Jet-Verfahren

amperometrische Glucosesensoren hergestellt werden, indem Schichten von

Glucoseoxidase, BSA und Glutaraldehyd auf im Siebdruck-Verfahren hergestellte


Kohlenstoff-Makroelektroden aufgebracht wurden [253].

Ink-Jet-Verfahren konnten weiterhin genutzt werden, um DNA-Mikroarrays auf

Glasoberflächen aufzubringen [254]. Konventionelle Tintenstrahldrucker wurden

benutzt, um ein- und zweidimensionale Arrays von Meerrettich-Peroxidase Spots auf

Zellulosepapier [255] oder DNA-Strukturen auf Nylon oder Nitrozellulose [256]

herzustellen. Mit einem auf einem CD-Rotierteller montierten Tintenstrahl-Druckkopf

wurden Mikroarrays von Erkennungselementen auf eine CD aufgebracht, um

kompetitive Immunoassays für Hydroxyatrazin, Carbaryl, und Molinat zu entwickeln

[257]. Die resultierenden Mikrospots, die einen Durchmesser von 75 µm haben,

wurden nach der Inkubation mit dem Analyten und einem kompetitiven Inhibitor mit

einem fluoreszierenden sekundären Antikörper inkubiert und mit einem kommerziell

erhältlichen Fluoreszenzdetektor, der ebenfalls an dem CD-Rotierteller angebracht

ist, visualisiert.

Nachteilig bei all diesen Verfahren ist, dass aufgrund der Tintenstrahltechnik, die

bisher nur vier verschiedene Farben benutzt, auch nur Mikrospot-Arrays von

maximal vier verschiedenen Substanzen hergestellt werden können. Weiterhin muss

berücksichtigt werden, dass eine technisch bedingte wechselseitige Kontaminierung

(Cross-Kontaminierung) der Mikrospots auftreten kann.

3 Problemstellung 39

3 Problemstellung

In der Biosensorik sind elektrochemische Messmethoden den optischen Verfahren

hinsichtlich Einfachheit, Kostengünstigkeit und technischem Aufwand überlegen,

weswegen sie in neuer Zeit zunehmend auch in kommerziellen Geräten Anwendung

finden. Die Vorteile mikroelektrochemischer Verfahren sind in der Biosensorik aber

erst ansatzweise ausgenutzt worden. Gerade die besonderen Eigenschaften von

Scheibenmikroelektroden, z. B. in der Kombination mit Elektrochemischer

Rastermikroskopie, bieten eine Fülle von neuen Anwendungsmöglichkeiten.

In der Affinitätssensorik sind homogene nichtkompetitive Messverfahren vorteilhaft,

da aufwendige Wasch- und Separationsschritte entfallen und ein kostenintensives

Markieren des Analyten, der bei jeder Messung der Probenlösung zugesetzt werden

muss, nicht notwendig ist. Die bisher in der Literatur beschriebenen

elektrochemischen homogenen Affinitätsassays nutzen bisher nicht ausreichend die

besonderen Möglichkeiten der Mikroelektrochemie. Viele dieser Methoden sind

zudem auf ein spezielles Erkennungssystem beschränkt und können nicht ohne

weiteres an andere Erkennungssysteme adaptiert werden. Eine mögliche

Miniaturisierung und Automatisierbarkeit des Messverfahrens wird ebenfalls häufig

nicht berücksichtigt.

An diesem Punkt soll die vorliegende Arbeit ansetzen:

Unter Nutzung der besonderen Eigenschaften von mikroelektrochemischen

Verfahren soll eine Strategie für einen elektrochemischen Affinitätsassay mit einem

allgemeinen Detektionsprinzip, das auf beliebige molekulare Erkennungssysteme

übertragen werden kann, entwickelt werden.

Weitere Voraussetzungen, die der Affinitätsassay erfüllen soll, sind:

• homogenes, nichtkompetitives Assayformat

• Miniaturisierbarkeit

• möglichst hoher Automatisierbarkeitsgrad

• geringe Materialkosten

• Kompatibilität zum Titerplattenstandard


Bei der Entwicklung von Biosensoren haben nichtmanuelle Immobilisierungs- und

Strukturierungstechniken an Bedeutung gewonnen. Nichtmanuelle Methoden

besitzen gegenüber manuellen Methoden den Vorteil, dass die Strukturen mit einer

höheren Reproduzierbarkeit hergestellt werden können und dass die

Herstellungsprozedur weitgehend automatisiert werden kann.

Das strukturierte Anordnen von verschiedenen Biomolekülen an definierten

Positionen auf einer Oberfläche oder einem Transducer stellt eine wichtige

Grundlage für die Entwicklung von miniaturisierten Multisensor-Strukturen dar. Eine

Sensoroberfläche mit einer großen Zahl von mikroskopischen Strukturen, jede davon

sensitiv für ein anderes Substrat, kann eine effektive Möglichkeit darstellen, bei einer

Minimierung des Probevolumens einen hohen Probendurchsatz (High-Throughput)

zu gewährleisten.

Bisher wurden dafür vor allem vorstrukturierte Substrate benutzt, die dann mit

Biomolekülen modifiziert wurden, oder es waren aufwendige Vorbereitungsschritte

wie die lokale Desorption von selbstorganisierenden Monoschichten oder das lokale

Abscheiden von Metallen oder Polymeren nötig, was zum einen apparativ aufwendig

ist und zum anderen gut ausgebildetes Personal benötigt.

Viele der bisher beschriebenen Strukturierungsmethoden haben Defizite in Bezug

auf:

• mangelnde Flexibilität bezüglich der Oberflächenbeschaffenheit

• unbefriedigende Reproduzierbarkeit durch manuelle Verfahren

• hoher Verbrauch an wertvollen biochemischen Substanzen

• spezialisiert auf nur eine Immobilisierungsmethode

• geringes Automatisierungspotential

• hoher apparativer und zeitlicher Aufwand

• Herstellung von Mikrostrukturen unterschiedlicher Biomoleküle an definierten

Orten, z. B. Enzym-Arrays als Multisensor-Strukturen

• Aufbau von Multischicht-Strukturen zur Nutzung oder Untersuchung der

Interaktion verschiedener Enzyme oder Biomoleküle

Im Rahmen dieser Arbeit soll ein einfaches, universelles Verfahren zur

Mikrostrukturierung von beliebigen Oberflächen mit Biomolekülen entwickelt werden,

das nicht die genannten Limitierungen aufweist.


Weiterhin muss durch entsprechende Messverfahren nachgewiesen werden, dass

die Aktivität der immobilisierten Biomoleküle erhalten bleibt. Durch die Kombination

verschiedener Enzyme in Multischichtstrukturen und Enzym-Arrays soll die Eignung

des Verfahrens zur Herstellung von miniaturisierten Multisensor-Strukturen gezeigt

werden. Mit mikroelektrochemische Messverfahren soll demonstriert werden, dass

mit diesen Mikrostrukturen quantitative Bestimmungen von physiologisch relevanten

Substanzen möglich sind.

Das zusammenfassende Ziel dieser Arbeit ist es, neue Ansätze zur Nutzung mikro-

elektrochemischer Messverfahren in der Biosensorik und in der Elektroanalytik zu

erarbeiten.

4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation von Diffusionskoeffizienten 42

4 Eigene Arbeiten

Elektroanalytische Techniken haben in der Entwicklung von Affinitätsassays

aufgrund geringer Kostenfaktoren zunehmend an Interesse gewonnen. Für eine

breite Anwendbarkeit sind universelle Konzepte, die auf möglichst viele molekulare

Erkennungssysteme übertragen werden können, wünschenswert. Weiterhin sind

eine Miniaturisierung zur Einsparung von Chemikalien- und Entsorgungskosten und

ein hoher Automatisierbarkeitsgrad zur Reduzierung von Personalkosten von

Bedeutung.

Wie bereits im Stand der Technik erläutert, sind bei Affinitätsassays

nichtkompetitive, homogene Verfahren vorteilhaft, da bei der Durchführung keine

Separations- und Waschschritte notwendig sind und kostenintensives Markieren des

Analyten entfällt.

4.1 Amplifizierter Affinitätsassay durch Modulation vonDiffusionskoeffizienten von hapten-modifizierten Redox-spezies

Im Folgenden soll ein neuer Ansatz für einen elektrochemischen Affinitätsassay

vorgestellt werden, der alle im einleitenden Teil dieses Kapitels erwähnten

Voraussetzungen erfüllt. Dieser basiert auf der Veränderung des

Diffusionskoeffizienten von redoxaktiven Molekülen, die mit einem biologischen

niedermolekularen Erkennungselement (Hapten) markiert sind, durch die molekulare

Erkennung und Anbindung der komplementären Erkennungsstruktur.

Der Diffusionskoeffizient von redoxaktiven Molekülen kann durch eine Vielzahl

elektroanalytischer Techniken, wie z. B. cyclische Voltammetrie, Differenz-Puls-

Voltammetrie oder Chronoamperometrie, bestimmt werden. Für Makroelektroden ist

die Relation zwischen Diffusionskoeffizient und FARADAY-Strom über die COTTRELL-

Gleichung gegeben:

π=

t

AnFcDi

2/1

t (Gleichung 4.1-1)


Bei Makroelektroden ist der FARADAY-Strom proportional zur Wurzel des

Diffusionskoeffizienten. Im Gegensatz dazu ist bei Mikroelektroden der FARADAY-

Strom direkt proportional zum Diffusionskoeffizienten:

it,∞ = 4nFcDr (Gleichung 4.1-2)

Prinzipiell kann somit jede der genannten Techniken und Elektroden benutzt werden,

um Veränderungen des Diffusionskoeffizienten einer Redoxspezies zu detektieren.

4.1.1 Biotin-Streptavidin als Modellsystem für molekulare Erkennung

Als Modellsystem für molekulare Erkennung wurde auf das bekannte Biotin-

Streptavidin-System zurückgegriffen. Gründe hierfür waren die hohe Spezifität der

Bindung, die sehr niedrige Dissoziationskonstante von 10-15 M [146,147], die

Verfügbarkeit von funktionalisierten Biotinderivaten und die Bedeutung des Biotin-

Streptavidin-Systems für die Bestimmung von StrepTag-modifizierten rekombinanten

Proteinen [157-159].

Die Molekülstruktur von Biotin ist in Abbildung 4.1-1 dargestellt. Abbildung 4.1-2 zeigt

die Peptidkettenstruktur von Streptavidin mit gebundenen Biotinliganden.

NHHN

O

S

HH

O

OH

Abbildung 4.1-1 Molekülstruktur von Biotin


Streptavidin (M.W. ≈ 53.000 Da) ist symmetrisch aus vier identischen Untereinheiten

aufgebaut, von denen jede ein Biotin oder Biotinderivat binden kann. Biotin wird

dabei in der Art gebunden, dass sich der bicyclische Ring mit den Heteroatomen im

Inneren der Bindungstasche befindet und die Säuregruppe am Ende der

Kohlenstoffkette zum offenen Ende der Bindungstasche orientiert ist. Somit können

auch Biotinderivate, die an der endständigen Säuregruppe modifiziert sind, von

Streptavidin gebunden werden.

Die Bindungsaffinität jeder Bindungsstelle von Streptavidin ist identisch und

weitestgehend unabhängig von den Besetzungen der anderen Bindungsstellen

[147]. Bei einer statistischen Berechnung von Besetzungsverteilungen können somit

alle Bindungsstellen als gleichwertig behandelt werden.

Abbildung 4.1-2 Peptidkettenstruktur von Streptavidin mit gebundenen Biotinliganden.Die Biotinliganden (farbige Kugeln: gelb = Schwefel, rot = Sauerstoff,blau = Stickstoff) sind zur Verdeutlichung vergrößert dargestellt.


4.1.2 Synthese eines redoxmarkierten Biotinderivats

Um das Bindungsereignis zwischen Biotin und Streptavidin mit elektrochemischen

Methoden detektieren zu können, wurde ein wasserlösliches elektrochemisch aktives

Biotinderivat synthetisiert. Als elektrochemisch aktive Gruppe wurde aufgrund der

guten heterogenen Elektronentransfereigenschaften, der hohen Reversibilität und

des moderaten Formalpotentials die Ferrocenylgruppe gewählt. Die Struktur des

ferrocenmarkierten Biotinderivats, im Folgenden Fc-Biotin genannt, ist in Abbildung

4.1-3 dargestellt.

Um eine Bindung des Biotinteils an Streptavidin sterisch nicht zu behindern wurde

zwischen der Ferrocengruppe und der Biotingruppe ein längerer Alkylketten-Spacer

eingefügt. Die Sauerstoffatome in der Alkylkette erhöhen die Polarität des Moleküls

und verbessern so die Löslichkeit in polaren Medien.

Fc-Biotin wird in einer zweistufigen Synthese dargestellt. In einem ersten Schritt wird

der Spacer an die Ferrocenylgruppe gebunden, indem Ferrocenaldehyd mit einem

Überschuss an 2,2’-(Ethylendioxy)diethylamin umgesetzt wird. Im zweiten

Syntheseschritt wird dieses Produkt mit N-Hydroxysuccinimido-biotin (NHS-Biotin)

zur Reaktion gebracht. Dabei bindet NHS-Biotin unter Abspaltung der

Aktivestergruppe an die endständige Aminogruppe des Ferrocenderivats. Das

komplette Reaktionsschema ist in Abbildung 4.1-4 dargestellt.

NHHN

O

S

HH

O

NHO

ONH

FeO

Abbildung 4.1-3 Molekülstruktur des ferrocenmarkierten Biotinderivats (Fc-Biotin)


NHHN

O

S

HH

O

NHO

ONH

Fe

Fe

O

HO

ONH2

H2N+ DMF

100°C

Fe

OO

NH2N + H2O

FeH2N

NHO

OS

HH

O

O

NHHN

O

N

O

O

+

Phosphatpuffer

pH 7

H2NNH

OO

Fe

OO

NH2N

Fe

25°C

NaBH4

O

O

NHO+

Abbildung 4.1-4 Synthese des ferrocenmarkierten Biotinderivats


4.1.3 Messprinzip des Affinitätsassays

Das Messprinzip des Affinitätsassays ist nicht auf das Biotin-Streptavidin beschränkt,

weswegen im Folgenden eine für alle molekularen Erkennungssysteme

verallgemeinerte Beschreibung und Erläuterung des Verfahrens gegeben wird.

Die Modulation von Diffusionskoeffizienten stellt die Basis des entwickelten

Affinitätsassays dar, in dem die spezifische Erkennung und Bindung zweier

komplementärer Erkennungsstrukturen zu einer Erhöhung der molaren Masse einer

Redoxspezies, die mit einer der Erkennungsstrukturen markiert ist, führt. Die

Erhöhung der molaren Masse geht dabei einher mit einer Abnahme des

Diffusionskoeffizienten. In Abbildung 4.1-5 ist eine schematische Illustration des

Messprinzips gezeigt.

Eine Messelektrode wird auf ein Potential polarisiert, so dass das redoxmarkierte

Hapten unter Diffusionskontrolle an dieser umgesetzt wird. Somit wird der

diffusionskontrolliert fließende Grenzstrom idiff1 durch den Nachtransport der

Redoxspezies zur Elektrodenoberfläche und damit durch die Diffusionskoeffizienten

D1 und D1’ bestimmt. Die Diffusionskoeffizienten der oxidierten und reduzierten Form

D1 und D1’ können dabei als gleich angenommen werden [208]. Nach Zugabe und

D1 D1’

D2 D2’

i diff 1 i diff 2

+

Abbildung 4.1-5 schematische Darstellung der Modulation des Diffusionskoeffizienten einerRedoxspezies durch Bindung der komplementären Erkennungsstruktur


Bindung der komplementären Erkennungsstruktur erhöht sich die molare Masse des

redoxmarkierten Moleküls, was eine gleichzeitige Verringerung des

Diffusionskoeffizienten bedingt. Der Nachtransport zur Elektrodenoberfläche erfolgt

langsamer, so dass ein verringerter diffusionskontrollierter Strom idiff2 fließt. Die

Stromdifferenz zwischen idiff1 und idiff2 ist direkt auf die molekulare Erkennung

zurückzuführen und kann somit als Messsignal für einen elektrochemischen

Affinitätsassay genutzt werden.

Bei molekularen Erkennungssystemen mit mehreren Bindungsstellen, wie z. B. im

Fall von Biotin und Streptavidin, muss in Betracht gezogen werden, dass ein

Streptavidin mehr als ein redoxmarkiertes Biotin binden kann. Dadurch wird die

Konzentration an Redoxmolekülen verringert, während aber gleichzeitig die Zahl an

übertragbaren Elektronen zunimmt. Unter der Annahme, dass nach Erreichen der

Elektrolyt-Elektroden-Grenzschicht alle Redoxzentren eines Moleküls oxidiert oder

reduziert werden können, bleibt der diffusionskontrollierte Strom in Gleichung 4.1-1

und Gleichung 4.1-2 unverändert.

4.1.4 Messelektroden

Das Messsignal des Affinitätsassays ist ein FARADAY-Strom, hervorgerufen durch

einen reversiblen heterogenen Elektronentransfer zwischen Elektrodenoberfläche

und einer löslichen Redoxspezies. Dies ist die einfachste Art einer

elektrochemischen Elektrodenreaktion, so dass keine hohen Anforderungen an die

Messelektroden gestellt werden. Konventionelle Scheibenelektroden aus Platin, Gold

oder Kohlenstoff sind hierfür bestens geeignet. Aufwendige Modifikationen der

Elektrodenoberfläche mit Polymeren oder Beschichtungen, wie sie z.B. bei der

elektrochemischen Messung von NADH erforderlich sind, und zeitintensive

Elektrodenvorbereitung und Reinigungsprozeduren sind nicht notwendig.

Wie bereits einleitend erläutert, ist sowohl bei Makro- als auch bei Mikroelektroden

das Stromsignal mit dem Diffusionskoeffizienten der Redoxspezies korreliert, so

dass prinzipiell beide Elektrodentypen verwendet werden können.

Bei Mikroelektroden ist der absolute Stromwert aufgrund der geringeren

Elektrodenoberfläche viel geringer als bei Makroelektroden, was aber aufgrund des


hohen Entwicklungsstands bei der potentiostatischen Strommessung messtechnisch

kein Problem darstellt.

Mikroelektroden bieten jedoch einige interessante Vorteile gegenüber

Makroelektroden:

Bei Makroelektroden erfolgt der Transport der Redoxspezies zur

Elektrodenoberfläche über ein planares Diffusionsfeld, das mit zunehmender Zeit in

die Lösung hineinwächst. Somit kann sich kein stationäres Diffusionsfeld aufbauen

und die zunehmende Verarmung an Redoxspezies an der Elektrodenoberfläche führt

zu einem kontinuierlichem Absinken des Stromes.

Aufgrund der sehr kleinen Elektrodenoberfläche erfolgt bei Mikroelektroden der

Transport der Redoxspezies zur Elektrodenoberfläche über ein hemisphärisches

Diffusionsfeld. Aufgrund der höheren Transportrate durch hemisphärische Diffusion

kommt es zu keiner Verarmung an Redoxspezies an der Elektrodenoberfläche und

es bildet sich ein stationäres Diffusionsfeld aus. In diesem Fall ist der FARADAY-

Strom keine Funktion der Zeit.

Dieses unterschiedliche Verhalten von Makro- und Mikroelektroden spiegelt sich

auch im cyclovoltammetrischen Experiment wieder. Während man bei

Makroelektroden nach dem Anstieg des Stromes ein Absinken bei Potentialwerten

oberhalb des Normalpotentials der Redoxspezies beobachtet und somit eine

Peakform entsteht, stellt sich bei Mikroelektroden bei Potentialen oberhalb des

Normalpotentials ein stationärer Strom ein, der unabhängig vom Elektrodenpotential

ist.

Dies bedeutet, dass die Stromauswertung bei Mikroelektroden wesentlich einfacher

ist: Im chronoamperometrischen Experiment muss bei Makroelektroden die

Stromantwort zeitaufgelöst ausgewertet werden und bei cyclovoltammetrischen

Experiment muss eine recht aufwendige Peak-Auswertung durchgeführt werden. Bei

Mikroelektroden ist nach Ausbildung des hemisphärischen Diffusionsfeldes das

Stromsignal im chronoamperometrischen Experiment zeitunabhängig und im

cyclovoltammetrischen Experiment bei Potentialwerten oberhalb des

Normalpotentials potentialunabhängig, so dass bei beiden Experimenten eine

Punktauswertung ausreichend ist.


Für den beschriebenen Affinitätsassay bedeutet dies, dass die Verwendung von

Mikroelektroden eine wesentlich einfachere und schnellere Möglichkeit zur

Signalauswertung zulässt.

Ein weiterer wichtiger Punkt wurde bereits im einleitenden Teil des Kapitels erwähnt:

Während bei Makroelektroden der FARADAY-Strom von der Wurzel des

Diffusionskoeffizienten abhängt, ist bei Mikroelektroden ein linearer Zusammenhang

gegeben. Im Affinitätsassay ist bei Mikroelektroden somit eine höhere relative

Signaländerung zu erwarten, da das Messsignal eine Stromänderung, hervorgerufen

durch die Veränderung des Diffusionskoeffizienten, darstellt.

Mikroelektroden zeigen im Vergleich zu Makroelektroden noch einen weiteren

interessanten Aspekt. So kann bei Mikroelektroden eine Amplifizierung des

Stromsignals durch senkrechte Annäherung an eine leitende Oberfläche erreicht

werden. Dieser auch in der SECM-Technik genutzte Effekt ist bereits im Kapitel

„Stand der Forschung“ erläutert worden, seine Relevanz für den Affinitätsassay soll

jedoch noch einmal kurz aufgegriffen werden.

4.1.5 Signalamplifizierung durch Redoxrecycling

Polarisiert man eine Mikroelektrode auf ein Potential, so dass die in Lösung

befindliche Redoxspezies unter Diffusionskontrolle umgesetzt wird und nähert man

sie senkrecht sehr dicht an eine leitende Oberfläche an, so ist eine Erhöhung des

FARADAY-Stroms durch eine Regeneration des Redoxmediators an der leitenden

Oberfläche zu verzeichnen. Abbildung 4.1-6 zeigt eine simulierte Annäherungskurve

einer Mikroelektrode an eine leitende Oberfläche [217], bei der die Stromzunahme

gegen den Abstand zwischen Mikroelektrode und leitende Oberfläche aufgetragen

ist. Der Strom ist dabei auf den Stromwert der Elektrode in unendlicher Entfernung

von der Oberfläche normiert, und der Abstand d ist normiert auf den

Elektrodenradius r.


Aus Abbildung 4.1-6 wird deutlich, dass der Verstärkungsfaktor eine starke Funktion

des Abstandes zwischen Mikroelektrode und leitende Oberfläche ist und für kleine

Abstände sehr groß wird.

Zurückkommend auf den Affinitätsassay bedeutet dies, dass man durch Annäherung

der Mikroelektrode an eine leitende Oberfläche oder eine Makroelektrode eine

einfache Möglichkeit zur Amplifizierung des Assaysignals hat. Dabei lässt sich der

Verstärkungsfaktor über die Distanz zwischen Mikroelektrode und leitende

Oberfläche variieren und so flexibel an die jeweiligen Erfordernisse, z. B. bei

verschiedenen Analyten oder Konzentrationsbereichen anpassen.

Hierin liegt ein enormer Vorteil gegenüber Interdigitalelektroden (IDA), die ebenfalls

eine Signalverstärkung durch Redoxrecycling zeigen. Bei Interdigitalelektroden ist

der Abstand zwischen den einzelnen Elektrodenkämmen jedoch konstant, so dass

ein unveränderlicher Verstärkungsfaktor vorliegt. Will man den Verstärkungsfaktor

variieren, muss eine komplett neue Mikrostruktur mit einem anderen Abstand

zwischen den Elektrodenkämmen entworfen und gefertigt werden. Da

Interdigitalelektroden in Mikrotechnologie gefertigt werden und die Elektrodenkämme

aus mit Edelmetall bedampften Silizium bestehen, treten beim längeren Gebrauch

0.0 0.5 1.0 1.50

5

10

15

20

Vers

tärk

ung

sfakt

or

= i t /

i t, ∞

d / r

Abbildung 4.1-6 simulierte Annäherungskurve einer Mikroelektrode aneine leitende Oberfläche


Veränderungen oder Ablösungen des Elektrodenmaterials auf. Weiterhin erschwert

diese Bedampfung die Reinigung der Interdigitalelektroden, da ein Polieren der

Elektrodenoberflächen, wie im Falle glasummantelter Scheibenmikroelektroden nicht

möglich ist. Bei der elektrochemischen Reinigung der Interdigitalelektroden, z. B.

durch die elektrochemische Reduktion oder Oxidation von Wasser in Basen oder

Säuren, lösen sich durch die mechanische Belastung der Oberfläche durch die

Gasentwicklung häufig Teile des Elektrodenmaterials ab.

Aufgrund der genannten Kriterien wurden für den Affinitätsassay als

Arbeitselektroden glasummantelte Scheibenmikroelektroden mit einem Durchmesser

von 50 µm verwendet. Der für Mikroelektroden recht große Durchmesser erleichtert

durch entsprechend hohe Ströme das Messen bei kleinen Konzentrationen, zeigt

aber bei langsamen Vorschubgeschwindigkeiten dennoch die für Mikroelektroden

typischen Eigenschaften.

4.1.6 Messapparatur

Eine geeignete Messapparatur für den Affinitätsassay muss folgende

Voraussetzungen erfüllen:

• präzise Positionierbarkeit der Mikroelektrode in lateraler, insbesondere aber in

vertikaler Richtung

• Redoxamplifizierung

• elektrochemische Messzelle mit 3-Elektrodenanordnung

• Verwendung möglichst geringer Elektrolytvolumina

• potentielle Automatisierbarkeit durch Computerkontrolle aller Komponenten

Eine schematische Zeichnung der entwickelten Messapparatur, die diese

Voraussetzungen erfüllt, ist in Abbildung 4.1-7 dargestellt.


Potentiostat

Mikrometerschrauben zurlateralen Positionierung

Höhenverstellung mit Mikrometerschraube undcomputergesteuertem Piezoelement

Elektrodenhalter mitMikroelektrode

AERefGE

Personal Computer zurSteuerung und

Messwerterfassung

Messzellenhalter mitMesszelle

Abbildung 4.1-7 schematische Darstellung der Messapparatur für den Affinitätsassay


Die verwendete elektrochemische Messzelle ist aus durchsichtigem Acrylglas

gefertigt und hat zur Redoxamplifizierung einen extern kontaktierbaren planaren

Platinboden sowie eine integrierte Platin-Gegenelektrode. Vervollständigt wird die

3-Elektrodenanordnung über eine einschraubbare Ag/AgCl-Referenzelektrode. Der

Durchmesser der Messzelle beträgt ca. 0.5 cm und die Tiefe etwa 0.4 cm, wodurch

ein Arbeiten mit Elektrolytvolumina zwischen 200 und 600 µL möglich ist.

Die Mikroelektrode wird an eine Karosseriescheibe geklebt und mittels einer

Magnethalterung am Elektrodenturm befestigt.

Eine präzise Positionierung der Messzelle relativ zur Mikroelektrode kann mit Hilfe

von Verschiebetischen mit Mikrometerschrauben in alle Raumrichtungen

vorgenommen werden. Eine Feinjustierung des Abstandes zwischen Mikroelektrode

und leitendem Platinboden der Messzelle ist über ein zusätzliches im

Verschiebetisch integriertes computergesteuertes Hochspannungspiezoelement mit

einem maximalen Verstellweg von 200 µm möglich.

Der Potentiostat zur Messwertaufnahme ist ebenfalls computergesteuert. Mithilfe

eines Computerprogramms, welches analog zur Steuersoftware eines SECM

arbeitet, kann über die fortlaufende Kontrolle des FARADAY-Stroms der

Mikroelektrode die Annäherung der Messzelle an die Mikroelektrode automatisiert

erfolgen und bei einem vorher festgelegten Verstärkungsfaktor angehalten werden.

Durch Austausch der Mikrometerschrauben gegen computergesteuerte

Schrittmotoren und durch Benutzung von Schlauchpumpen zum Befüllen und

Entleeren der Messzelle ist eine vollständige Automatisierung des Messsystems

prinzipiell möglich.


4.1.7 Messvorgang mit Redoxamplifizierung

Nachdem der Messvorgang des Affinitätsassays ohne Redoxamplifizierung bereits in

Kapitel 4.1.3 bei der Erläuterung des Messprinzips prinzipiell dargestellt wurde, soll

im Folgenden kurz auf die Besonderheiten, die sich bei der Durchführung des

Affinitätsassays mit Redoxamplifizierung ergeben, eingegangen werden.

Abbildung 4.1-8 zeigt die prinzipiellen Schritte eines Messvorganges mit

Signalverstärkung durch Redoxrecycling.

(1) Im ersten Schritt wird die Mikroelektrode auf ein Potential polarisiert, so dass

die hapten-modifizierte Redoxspezies unter Diffusionskontrolle umgesetzt wird.

Bei gleichzeitiger Aufnahme des Stroms it wird die Mikroelektrode der leitenden

Oberfläche angenähert. Sobald ein bestimmter Verstärkungsfaktor erreicht ist,

wird die Annäherung abgebrochen und die Position der Mikroelektrode im

weiteren Verlauf der Messung nicht mehr verändert.

i1

Zugabe des Analyten

∆ t

+

it

i2

i2<i1

(1) (2) (3) (4)

Abbildung 4.1-8 Messvorgang des Affinitätsassays mit Redoxamplifizierung


(2) Ein elektrochemisches Messverfahren, das mit dem Diffusionskoeffizient der

Redoxspezies in Lösung korreliert ist, wird durchgeführt und der

diffusionskontrolliert fließende Strom i1 bestimmt.

(3) Der Analyt wird zugesetzt und die Inkubationszeit ∆t wird abgewartet.

(4) Das elektrochemische Messverfahren wird erneut durchgeführt und der

diffusionskontrolliert fließende Strom i2 ermittelt. Aus dem Strom i2 oder der

Stromdifferenz zwischen i1 und i2 kann durch Vergleich mit Kalibrierkurven die

Konzentration des Analyten bestimmt werden.


4.1.8 Detektion von Biotin-Streptavidin Bindungsereignissen über dieModulation des Diffusionskoeffizienten von Fc-Biotin

Als elektrochemisches Messverfahren für die Detektion von Bindungsereignissen

zwischen Fc-Biotin und Streptavidin wurde die cyclische Voltammetrie verwendet.

Das kontinuierliche Zyklisieren der Mikroelektrode reduziert Effekte wie

Elektrodenfouling oder unspezifische Adsorption auf der Elektrodenoberfläche, wie

sie in chronoamperometrischen Messungen bei konstantem Potential auftreten

können.

In Abbildung 4.1-9 sind Sequenzen von cyclischen Voltammogrammen dargestellt,

die den Effekt der Modulation des Diffusionskoeffizienten von Fc-Biotin durch

Anbindung von Streptavidin demonstrieren.

200 250 300 350 400 450 500

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

i [p

A]

E vs. Ag/AgCl [mV]

1

2

3

4

Abbildung 4.1-9 Cyclische Voltammogramme von Fc-Biotin vor und nach der Zugabe einerSättigungskonzentration an Streptavidin. Die roten Voltammogramme wurdenmit Redoxamplifizierung, die blauen ohne Redoxamplifizierung aufgenommen.(∅ Mikroelektrode = 50 µm, Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, Elektrolyt-volumen = 300 µL, c(Fc-Biotin) = 100 µM)


Die cyclischen Voltammogramme von Fc-Biotin (Voltammogramme 1 und 3) zeigen

die typischen S-förmigen Strom-Potential-Kurven, wie sie für einen quasi-reversiblen

Elektronentransfer an einer Mikroelektrode zu erwarten sind. Aufgrund der geringen

Konzentration an Fc-Biotin und eines offensichtlichen langsamen

Elektronentransfers sind nur kleine Ströme zu beobachten. Dies führt zu einer

deutlichen Hysterese in den Voltammogrammen, zusätzlich verursacht durch die für

eine Mikroelektrode relativ große Elektrodenoberfläche, die zu merklichen

kapazitiven Ladeströmen der elektrochemischen Doppelschicht führt.

Die Stromdifferenz im diffusionslimitierten Potentialbereich zwischen

Voltammogramm 1 und 3 wird durch Redoxamplifizierung nach Annähern der

Mikroelektrode an eine leitende Oberfläche hervorgerufen.

Nach Zugabe einer Sättigungskonzentration an Streptavidin, so dass jedes Fc-Biotin

an Streptavidin gebunden ist, nimmt aufgrund der bereits erläuterten Abnahme des

Diffusionskoeffizienten von Fc-Biotin in beiden Fällen der diffusionskontrollierte

Strom ab. Voltammogramm 2 zeigt dabei die Stromabnahme mit Redox-

amplifizierung und Voltammogramm 4 ohne Redoxamplifizierung.

Die durch die Zugabe einer Sättigungskonzentration an Streptavidin verursachte

Stromabnahme in der Messreihe mit Redoxamplifizierung (rote Voltammogramme 1

und 2) ist um den Faktor 2.3 höher als die entsprechende Stromabnahme in der

Messreihe ohne Redoxamplifizierung (blaue Voltammogramme 3 und 4).

Daraus wird deutlich, dass durch Redoxrecycling das absolute Messsignal erhöht

werden kann, was die Sensitivität des Assays beträchtlich steigert und zu einem

höheren Signal-Rausch-Verhältnis führt. Redoxamplifizierung hat jedoch keine

Auswirkungen auf die Größe des Messbereichs, der durch die Konzentration der

hapten-modifizierten Redoxspezies bestimmt wird.

Da die Analytkonzentration aus den Stromwerten vor und nach der Anbindung von

Streptavidin bestimmt werden kann, ist es nicht notwendig, die absoluten Werte der

Diffusionskoeffizienten der gebundenen und ungebundenen Spezies zu ermitteln.


Als Kontrollversuche wurden analoge Experimente mit Ferrocencarbonsäure

(Fc-COOH) anstelle von Fc-Biotin durchgeführt.

Anhand des in Abbildung 4.1-10 dargestellten Kontrollexperiments mit Fc-COOH

wird deutlich, dass die Zugabe von Streptavidin zu einer Redoxspezies, die keine

affinante Wechselwirkung mit Streptavidin eingeht, zu keiner signifikanten Abnahme

des FARADAY-Stroms führt. Störeffekte, wie unspezifische Adsorption und

Elektrodenfouling sind vergleichsweise klein und können vernachlässigt werden.

In den bisher vorgestellten Experimenten, die die prinzipielle Machbarkeit des

Assayverfahrens demonstrieren, wurde jeweils ein Überschuss an Streptavidin

zugesetzt. Gibt man zur Fc-Biotin-Lösung kleinere Mengen an Streptavidin, so dass

nach der ersten Zugabe noch nicht alle Fc-Biotin-Moleküle einen Bindungspartner

zur Verfügung haben, so setzt sich der Diffusionsgrenzstrom aus Stromanteile des

Fc-Biotins und des Fc-Biotin-Streptavidin-Komplexes zusammen.

200 250 300 350 400 450 500-200

0

200

400

600

800

i [pA

]

E vs. Ag/AgCl [mV]

Abbildung 4.1-10 Kontrollexperiment mit Fc-COOH anstelle von Fc-Biotin ohne Redox-amplifizierungDas schwarze Cyclovoltammogramm wurde vor, das rote nach Zugabe vonStreptavidin aufgenommen.(∅ Mikroelektrode = 50 µm, Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, Elektrolyt-volumen = 300 µL, c(Fc-COOH) = 100 µM)


In Abbildung 4.1-11 sind cyclische Voltammogramme (mit Redoxamplifizierung)

gezeigt, die nach sequentieller Erhöhung der Konzentration an Streptavidin in 5 µM

Schritten, erhalten wurden.

Der diffusionslimitierte Grenzstrom verringert sich nach jeder Zugabe an Streptavidin

und erreicht nach Zugabe von ca. 25 µM Streptavidin einen stationären Wert. Eine

weitere Erhöhung der Konzentration an Streptavidin führt zu keiner weiteren

signifikanten Verringerung des Diffusionsgrenzstroms. Sobald alle Fc-Biotin-

Moleküle an Streptavidin gebunden sind, führt eine weitere Erhöhung der

Konzentration an Streptavidin zu keiner weiteren Erniedrigung des

Diffusionskoeffizienten der redoxaktiven Spezies, so dass keine weitere

Stromabnahme erfolgt.

Trägt man die diffusionslimitierten Grenzströme gegen die Konzentration an

Streptavidin auf, so erhält man eine Kalibrierkurve für Streptavidin, die in Abbildung

4.1-12 gezeigt wird.

200 250 300 350 400 450 500

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

i [p

A]

E vs. Ag/AgCl [mV]

Abbildung 4.1-11 Sequenz von cyclischen Voltammogrammen (mit Redoxamplifizierung) von Fc-Biotin nach schrittweiser Erhöhung der Konzentration an Streptavidin um jeweils5 µM(∅ Mikroelektrode = 50 µm, Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, Elektrolyt-volumen = 300 µL, c(Fc-Biotin) 100 µM)


Ab einer Streptavidinkonzentration von 25 µM ist die Sättigung erreicht; es ist keine

weitere signifikante Stromabnahme zu verzeichnen. Berücksichtigt man, dass jedes

Streptavidin in der Lage ist, vier Fc-Biotin-Moleküle zu binden, korreliert die

Sättigungskonzentration von 25 µM Streptavidin gut mit der Konzentration an

Fc-Biotin von 100 µM.

Durch Biotin-Streptavidin als Modellsystem für molekulare Erkennung konnte gezeigt

werden, dass ein Affinitätsassay, der auf der Veränderung des

Diffusionskoeffizienten einer mit biologischen Erkennungselementen markierten

Redoxspezies basiert, ein tragfähiges Konzept darstellt. Der Messbereich des

vorgestellten Assays wird durch die Konzentration bzw. Stoffmenge der biotin-

markierten Redoxspezies bestimmt und kann somit einfach an verschiedene

spezifische analytische Fragestellungen adaptiert werden. Der stufenlos einstellbare

Verstärkungsfaktor erlaubt zudem ein einfaches Anpassen der Sensitivität an die

jeweiligen Anforderungen. Die untere Nachweisgrenze des Assays kann durch die

Verwendung von Potentiostaten mit stromsensitiven Vorverstärkern weiter gesenkt

werden. Eine zusätzlicher Schritt in diese Richtung kann durch die Erhöhung des

Verstärkungsfaktors durch dichteres Annähern der Mikroelektrode an die leitende

Oberfläche erreicht werden.

i [p

A]

0 5 10 15 20 25 30

900

1000

1100

1200

1300

1400

c (Streptavidin) [µM]

Abbildung 4.1-12 Kalibrierkurve für Streptavidin, abgeleitet aus den diffusionslimitierten Strömenbei 480 mV der cyclischen Voltammogramme in Abbildung 4.1-11


Die Universalität des Assayverfahrens wird im folgenden Kapitel unter weiterer

Nutzung des Biotin-Streptavidin-Systems durch die Erweiterung zu einem Sandwich-

Assay demonstriert. Damit wird die prinzipielle Möglichkeit geschaffen, jeden

biotinilierten Komplex zu bestimmen.

4.1.9 Sandwich-Assay zur Bestimmung biotinilierter Komplexe

Die Tatsache, dass Streptavidin vier Bindungsstellen für Biotin besitzt, ermöglicht die

Erweiterung des vorgestellten Affinitätsassays zu einem Sandwich-Assay. Dazu

muss im ersten Schritt mindestens eine der Bindungstaschen eines

Streptavidinmoleküls mit einem ferrocenmarkierten Biotin besetzt werden. In einem

zweiten Schritt kann danach die Anbindung eines beliebigen biotinilierten Komplexes

an die verbleibenden Bindungsstellen erfolgen.

Eine schematische Darstellung des Prinzips des Sandwich-Assays mit biotinilierter

Glucoseoxidase (GOD) als Beispiel für einen biotinilierten Komplex ist in Abbildung

4.1-13 dargestellt.

+

Überschuss

GODGOD +

Abbildung 4.1-13 schematische Illustration des Prinzips des Sandwich-Assays


Im ersten Schritt wird Fc-Biotin ein Überschuss an Streptavidin zugesetzt. Es können

nicht alle Bindungsstellen des Streptavidins besetzt werden. Dies hat zur Folge, dass

es eine den Mengenverhältnissen entsprechende statistische Verteilung von

Streptavidinmolekülen mit einem, zwei drei oder vier Fc-Biotin-Liganden gibt, da alle

Bindungsstellen von Streptavidin gleichwertig sind [147]. Die freien Bindungsstellen

stehen wiederum für die Anbindung eines weiteren Biotins oder Biotinderivats zur

Verfügung.

Da in beiden Schritten des Sandwich-Assays der Diffusionskoeffizient der

redoxaktiven Spezies moduliert wird, können in beiden Fällen die affinanten

Anbindungen mit elektrochemischen Messverfahren visualisiert werden. Der dem

Mittelwert der Diffusionskoeffizienten der mit unterschiedlich vielen Fc-Biotin-

Liganden modifizierten Streptavidinmoleküle entsprechende Stromwert stellt dabei

die Grundlinie für die nachfolgende Bestimmung des biotinilierten Komplexes dar.

In Abbildung 4.1-14 sind typische Cyclovoltammogramme eines Sandwich-Assays

unter Verwendung biotinilierter Glucoseoxidase gezeigt.

200 250 300 350 400 450 500

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

i [p

A]

E vs. Ag/AgCl [mV]

1

23

4

Abbildung 4.1-14 Sequenz von Cyclovoltammogrammen eines Sandwich-Assays mit biotinilierterGlucoseoxidase mit RedoxamplifizierungVoltammogramm 1 wurde vor und Voltammogramm 2 nach Zusatz einesÜberschusses an Streptavidin zu Fc-Biotin aufgenommen. Voltammogramm 3entspricht der Zugabe von 15 µL Phosphatpuffer zur Evaluierung desVerdünnungseffekts. Voltammogramm 4 wurde nach Zusatz von 15 µL einerLösung biotinilierter Glucoseoxidase erhalten.(∅ Mikroelektrode = 50 µm, Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, Elektrolyt-volumen = 300 µL, c(Fc-Biotin) = 100 µM)


Das erste Cyclovoltammogramm repräsentiert Fc-Biotin mit Redoxamplifizierung.

Nach Zusatzes eines Überschusses an festem Streptavidin tritt die bereits erläuterte

Abnahme des Diffusionsgrenzstroms auf (Voltammogramm 2). Da die biotinilierte

Glucoseoxidase in Phosphatpuffer gelöst vorliegt, wurde eine Evaluierung der durch

Volumenzunahme bedingten Stromabnahme durchgeführt. Hierzu wurden 15 µL

einer Phosphatpuffer-Lösung zugesetzt und die durch die Verdünnung (9,5 %, von

300 auf 315 µL) hervorgerufene Stromabnahme gemessen, die offensichtlich gering

ist (Voltammogramm 3). Im letzten Schritt wurden 15 µL biotinilierter Glucoseoxidase

zugesetzt (Voltammogramm 4), was zu einer sehr starken Abnahme des

Diffusionsgrenzstromes führt. Diese starke Stromabnahme, die sehr viel

ausgeprägter ist als im Fall von Streptavidin, kann zum einen auf das hohe

Molgewicht von Glucoseoxidase (M.W. ≈ 186.000 Da) und eine mögliche

Quervernetzung von redoxmarkierten Streptavidinmolekülen durch mehrfach

biotinilierte Glucoseoxidase (siehe Abbildung 4.1-13) zurückgeführt werden. Diese

Quervernetzung erhöht das Molgewicht noch weiter, was sich in den beobachteten,

veränderten Diffusionseigenschaften der redoxaktiven Ferrocenmarkierung

wiederspiegelt.

Es ist offensichtlich, dass eine Kalibrierkurve durch schrittweise Zugabe von

biotinilierter Glucoseoxidase erhalten werden kann.

Nach dem gleichen Sandwich-Prinzip wie bei biotinilierter Glucoseoxidase können

sämtliche StrepTag-modifizierte Proteine bestimmt werden.

Weiterhin kann das Konzept des vorgestellten Sandwich-Assays durch die

Einführung einer Redoxmarkierung an nahezu jedes konventionelle Sandwich-Assay

System adaptiert werden.


4.1.10 Miniaturisierung des Affinitätsassays

Obwohl mit der bisher benutzen Messzelle elektrochemische Messungen in geringen

Volumina zwischen 200 und 300 µL möglich waren, mussten doch vergleichsweise

große Mengen an kostenintensiven Substanzen wie Streptavidin, Fc-Biotin und im

Falle des Sandwich-Assays, eines biotinilierten Proteins, eingesetzt werden. Um den

Chemikalienverbrauch und damit die Analysekosten zu reduzieren und einen Schritt

in Richtung einer möglichen Automatisierung zu gehen, wurde ein Konzept zur

Miniaturisierung des Affinitätsassays erarbeitet. Dazu muss das zu einer Messung

erforderliche Volumen, unter Beibehaltung des Messprinzips und des prinzipiellen

Aufbaus, signifikant verringert werden.

Dies gelang unter Verwendung von sehr kleinen Flüssigkeitstropfen als wandfreie

elektrochemische Messzellen.

In Abbildung 4.1-15 ist eine schematische Darstellung und ein Foto des

miniaturisierten Messaufbaus gezeigt, mit dem elektrochemische Messungen in

kleinen Flüssigkeitstropfen möglich sind.

Ag/AgCl Pseudo-Referenz-elektrode

Pt-Gegen-elektrode

an Magnet befestigteKontaktklemme

Metallplatte

Mikroelektrode

Au-Makroelektrode

Abbildung 4.1-15 Schematische Darstellung und Foto der elektrochemischen Tropfenzelle mitmöglicher Redoxamplifizierung durch eine Gold-MakroelektrodeDie Platin-Gegenelektrode und die Pseudo-Referenzelektrode werden in denTropfen eingeführt, indem die auf Magneten montierten Klemmen auf derMetallplatte entsprechend ausgerichtet werden. Die Distanz zwischenMikroelektrode und Gold-Makroelektrode (∅ 2.5 mm) kann über Mikro-positioniersysteme eingestellt werden. Eine entsprechende Mikrometerschraubeist auf dem Foto vorne zu erkennen. Alle weiteren Komponenten derMessapparatur wurden bereits in Abbildung 4.1-5 gezeigt.


Die Mikroelektrode wird in kurzer Entfernung zur Gold-Makroelektrode

vorpositioniert. Mit Hilfe einer Mikroliter-Pipette wird ein Tropfen an das obere Ende

der Mikroelektrode gebracht, welcher den Schaft der Mikroelektrode heruntergleitet

und einen halbkugelförmigen Tropfen bildet, der die Spitze der Mikroelektrode

umschließt und durch die hydrophobe Tefloneinfassung der Gold-Makroelektrode

begrenzt wird. Typische verwendbare Tropfenvolumina liegen dabei im Bereich

zwischen 20 und 50 µL. Bei Tropfenvolumina kleiner als 20 µL gestaltet sich die

Zugabe von Streptavidin im Affinitätsassay als schwierig. Zudem spielen bei kleinen

Tropfen Verdampfungseffekte des Lösungsmittels eine stärkere Rolle als bei

größeren Tropfen.

Die elektrochemische 3-Elektrodenanordnung wird durch einen Platindraht als

Gegenelektrode und einen mit Silberchlorid beschichteten Silberdraht als Pseudo-

Referenzelektrode komplettiert. Die Drähte werden dabei von Kontaktklemmen

gehalten, die jeweils an einem Magneten befestigt sind. Die Klemmen können auf

einer Metallplatte so bewegt werden, dass die Enden des Platin- und Silberdrahts in

den Tropfen hineinragen.

Damit sind alle Voraussetzungen erfüllt, um elektrochemische Experimente im

Flüssigkeitstropfen mit Redoxamplifizierung durchführen zu können.

Im Folgenden soll gezeigt werden, dass es möglich ist, den beschriebenen

Affinitätsassay für Streptavidin, basierend auf der Modulation des

Diffusionskoeffizienten von Fc-Biotin, an die Tropfenzelle zu adaptieren.

Zunächst wird eine Tropfenzelle mit einem Tropfen Fc-Biotin-Lösung, wie oben

beschrieben, aufgebaut. Anschließend wird die Mikroelektrode auf +500mV

polarisiert und unter kontinuierlicher Aufnahme des Stroms an die Gold-

Makroelektrode angenähert bis der vordefinierte Amplifizierungsfaktor erreicht ist.

Das Potential der Gold-Makroelektrode wird dazu nicht potentiostatisch kontrolliert,

befindet sich also auf dem über die Nernst-Gleichung festgelegten „Open Circuit“-

Potential.

Ein elektrochemisches Experiment wird durchgeführt und der diffusionslimitierte

Strom bestimmt. Danach muss Streptavidin als komplementäre Erkennungsstruktur

zu Fc-Biotin zugesetzt werden, was sich aufgrund des kleinen Tropfenvolumens als

schwierig gestaltet, und ein erneutes elektrochemisches Experiment in der

Tropfenzelle zur Strombestimmung durchgeführt werden.


Bei der Zugabe von Streptavidin sind die folgenden prinzipielle Möglichkeiten zu

betrachten:

1) Man gibt Streptavidin in Lösung zu. Hierzu muss auch bei Zugabe kleinster

Volumina aufgrund der geringen Tropfengröße die Volumenzunahme

berücksichtigt werden, da eine signifikante Verdünnung der Konzentration der

Redoxspezies erfolgt. Die durch die Abnahme des Diffusionskoeffizienten der

Redoxspezies verursachte Stromabnahme wird überlagert von der

Stromabnahme, hervorgerufen durch die mit der Zunahme des Volumens

verbundene Konzentrationserniedrigung. Somit ist die Aufnahme einer weiteren

Kalibrierkurve, die nur die Volumenvergrößerung berücksichtigt, notwendig.

2) Die Zugabe von Streptavidin erfolgt in fester Form. Hierbei muss eine

Mindesttropfengröße vorhanden sein, so dass ein Teils des Volumens der

Tropfenzelle entnommen, Streptavidin in ihm gelöst und wieder der Tropfenzelle

hinzugefügt werden kann. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass keine

Volumenzunahme berücksichtigt werden muss, und das Messsignal somit nur

der Stromabnahme entspricht, die auf die Veränderung des

Diffusionskoeffizienten zurückzuführen ist.

In Abbildung 4.1-16 sind die Cyclovoltammogramme eines entsprechenden

Experiments in einer 50 µL Tropfenzelle dargestellt.


Wie erwartet nimmt nach der ersten Zugabe von Streptavidin in den Tropfen aus

Fc-Biotin-Lösung der FARADAY-Strom aufgrund der Verringerung des

Diffusionskoeffizienten von Fc-Biotin ab (siehe Voltammogramm 1 und 2). Eine

weitere Zugabe von Streptavidin führt zu keiner weiteren Stromänderung

(Voltammogramm 3). Dies ist darauf zurückzuführen, dass bereits nach dem ersten

Zusatz von Streptavidin alle Fc-Biotin-Moleküle im Tropfen mit Fc-Biotin abgesättigt

sind und einer weitere Zugabe von Streptavidin zu keiner weiteren Veränderung des

Diffusionskoeffizienten der redoxaktiven Spezies führt. Verdampfungseffekte des

Tropfens können aufgrund der Tropfengröße von 50 µL und einer relativ kurzen

Messdauer vernachlässigt werden.

Mit diesem Experiment konnte demonstriert werden, dass eine Miniaturisierung des

vorgestellten Affinitätsassays durch die Verwendung von kleinen Tropfen als

elektrochemische Messzellen möglich ist.

Probleme ergeben sich jedoch bei der Reagenz/Proben-Dosierung und einer

potentiellen Automatisierung. Da kleinere Mengen als 0.1 mg nicht reproduzierbar

abgewogen werden können, ist die Aufnahme einer Kalibrierkurve mit den bisherigen

200 250 300 350 400 450 500

0

500

1000

1500

i [pA

]

E vs. Ag/AgCl [mV]

1

23

Abbildung 4.1-16 Sequenz von cyclischen Voltammogrammen (mit Redoxamplifizierung) in einerTropfenzelleVoltammogramm 1 wurde vor der Zugabe von Streptavidin zu Fc-Biotinaufgenommen, Voltammogramm 2 und 3 jeweils nach einer Zugabe von 0.1 mgfestem Streptavidin.(∅ Mikroelektrode = 50 µm, Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, Elektrolyt-volumen = 50 µL, c(Fc-Biotin) = 100 µM)


Mitteln nicht möglich. Die Zugabe von Streptavidin in Lösung als alternative Methode

weist ebenfalls einige Nachteile auf, die bereits ansatzweise diskutiert wurden.

Zusätzlich bringt die Zugabe von Lösung in die Tropfenzelle technische Probleme

mit sich. So ist mit manuellen Mikropipetten das minimal reproduzierbar dosierbare

Volumen etwa 1 µL. Will man die Miniaturisierung weiter vorantreiben, z. B. auf eine

Tropfengröße von unter 10 µL, so kann die Zugabe von Probe durch eine manuelle

Mikropipette zu einem hohen prozentualen Volumenfehler führen. Weiterhin ist bei

derartig kleinen Tropfen die Gefahr groß, dass beim manuellen Zugeben eine

Berührung der Pipettenspitze mit der Mikro- oder Makroelektrode stattfindet und so

der Amplifizierungsfaktor unkontrolliert während der Messung verändert wird.

Aus diesen Gründen muss im Hinblick auf eine weitere Miniaturisierung und

Automatisierung ein präzises, nicht-manuelles Dosierungsverfahren für den Einsatz

im miniaturisierten Affinitätsassay in der Tropfenzelle gefunden werden.

4.2 Aufbau und Fabrikation des Mikrodispensers 70

Die Arbeitsgruppe von Prof. Thomas Laurell, Institut für Elektrische Messtechnik,

Technische Hochschule Lund, Schweden arbeitet seit Jahren auf dem Gebiet der

Entwicklung von Dispensern und Ink-Jet-Verfahren zur Mikrodosierung von

Flüssigkeiten. Das Institut für Elektrische Messtechnik besitzt Reinraumlaboratorien,

in denen in Mikrotechnologie gefertigte Mikrodispenser gebaut werden können.

Im Rahmen eines durch den Deutschen Akademischen Auslandsdienstes (DAAD)

geförderten Kooperationsprojekts wurden während mehrerer Forschungsaufenthalte

in Schweden alle Komponenten des Mikrodispensers mit Mikrotechnologie im

Reinraum selbst hergestellt, zum fertigen funktionsfähigen Dispenser

zusammengebaut und an elektrochemische Anwendungen adaptiert.

4.2 Aufbau, Funktionsweise und Fabrikation des Mikrodispensers

Der im Folgenden vorgestellte und bereits in [258] publizierte Mikrodispenser

gestattet die reproduzierbare Dosierung kleinster Flüssigkeitsmengen im Piko- bis

Nanoliter-Maßstab. Die Größe einer Dosiereinheit kann dabei über die Anzahl von

hintereinander ausgestoßenen kleinen Tropfen festgelegt werden. Die Tropfen

bewegen sich nach dem Ausstoßen auf einer von Luftbewegungen unabhängigen,

stabilen linearen Flugbahn von 2-3 cm. Im weiteren Verlauf ist die Flugbahn

ungeordnet und von zufälligen Luftbewegungen und -verwirbelungen bestimmt.

Der Aufbau und das Funktionsprinzip des Mikrodispensers ist dabei ähnlich dem

eines konventionellen Tintenstrahldruckers mit Piezotechnologie und wird im

folgenden Abschnitt erläutert.

4.2.1 Aufbau

Der Mikrodispenser besteht aus zwei miteinander verbundenen, in Mikrotechnologie

gefertigten Siliziumstrukturen mit einer Größe von 13 x 6 mm. Die Struktur, welche

die Rückseite darstellt, besitzt einen Ein- und Auslasskanal zum Befüllen des

Dispensers und eine Membran, die mit einem Piezoelement verbunden ist. Das

Piezoelement ist an einen Spannungspulsgenerator angeschlossen. Die zweite

Siliziumstruktur formt den Durchflusskanal und besitzt gegenüberliegend der


Membran eine nach Außen gerichtete Siliziumpyramide mit einer Auslassöffnung. Im

Gegensatz zu konventionellen Ink-Jet-Druckköpfen, die mit nur einer Lösung aus

einem Reservoir befüllt werden können und bei denen ein Lösungswechsel ein

aufwendiges Verfahren darstellt, kann der hier vorgestellte Mikrodispenser im

Durchflussmodus betrieben werden. Mittels einer Schlauchpumpe kann z. B. ein

kontinuierlicher Lösungsfluss durch den Dispenser geleitet werden und zu

bestimmten Zeiten oder in bestimmten Intervallen kann dann eine Probe dispensiert

werden. Ist der Zuleitungsschlauch mit mehreren Probensegmenten befüllt, so

können durch Vorpumpen des entsprechenden Segmentes vor die Auslassöffnung

sequentiell definierte Mengen jedes Segmentes entnommen werden.

Eine schematische Zeichnung des Aufbaus des Mikrodispensers ist in Abbildung

4.2-1 dargestellt.

Flow inlet & outlet

Crossection of the third generation dispenser

Plexiglassstands

Piezoceramicbimorph

Actuatingmembrane

Flow channelPN-etch stop

defined nozzle

Bottom die

Top die

Abbildung 4.2-1 schematische Darstellung des Aufbaus des Mikrodispensers


Abbildung 4.2-2 zeigt ein rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der

Siliziumpyramide mit der Auslassöffnung. Die Höhe der Pyramide beträgt etwa

70 µm. Die Öffnung hat eine Größe von 40 µm x 40 µm; die Pyramidenwände haben

eine Breite von ca. 8 µm.

4.2.2 Funktionsweise

Zur einwandfreien Funktion des Mikrodispensers ist es essentiell, dass der

Mikrodispenser blasenfrei mit Lösung befüllt wird, da sonst statt einer

Tropfenformation lediglich eine Oszillation der Luftblase stattfindet [259].

Mittels eines Pulsgenerators wird ein kurzer, hoher Spannungspuls an das

Piezoelement angelegt. Typische Parameter sind Amplituden zwischen 10 und 35

Volt mit Pulsdauern um 100 µs. Im Falle von bimorphen Piezoelementen führt das

Anlegen des Spannungspulses zu einer kurzzeitigen Verbiegung. Dadurch drückt die

mittlere Plastikrolle (siehe Abbildung 4.2-1, unteres Bild) auf die Membran. Die

entstehende Druckwelle im Durchflusskanal führt zum Herauspressen eines

einzelnen Tropfens aus der pyramidenförmigen Düse auf der gegenüberliegenden

Seite der Membran. Die sich nach oben verjüngenden Form der pyramidenförmigen

Abbildung 4.2-2 SEM-Bild der pyramidenförmigen Auslassdüse des Mikrodispensers


Düse erhöht die Stabilität der Tropfenformation und der Flugbahn. Durch die kleine

Oberfläche des Randes der Auslassöffnung werden Störeffekte durch Benetzung,

Partikelablagerung oder Auskristallisierung von Lösungsbestandteilen reduziert. Da

die Dimensionen der Pyramidenwände sehr viel größer sind als die des oberen

Randes, werden durch die Oberflächenspannung leckende Flüssigkeit und

Flüssigkeitsreste auf die Pyramidenwände oder auf die Bodenfläche des Dispensers

gezogen, wo sie die Tropfenformation nicht beeinträchtigen.

Abbildung 4.2-3 zeigt das Herausdrücken und die Formation eines Tropfens aus der

pyramidenförmigen Düse.

Die Tropfenformation ist sehr reproduzierbar und es können Tropfen sehr schnell

hintereinander herausgeschossen werden. Stabile Tropfenbildung kann dabei bis in

den kHz-Bereich beobachtet werden. Die Fluggeschwindigkeit der ausgestoßenen

Tropfen ist unterhalb von 600 Hz, das Tropfenvolumen unterhalb von 1 kHz

unabhängig von der Frequenz [258].

Typische Betriebsfrequenzen liegen im niedrigeren Frequenzbereich um 100 Hz.

Die Geschwindigkeit des herausgedrückten Tropfens hängt stark von der Amplitude

des Spannungspulses ab und nimmt mit steigender Pulshöhe zu. Das

Tropfenvolumen hängt nur in geringem Maße vom Spannungspuls ab, sondern wird

vornehmlich durch die Größe der Auslassöffnung bestimmt [258]. Im Falle einer

Öffnung von 40 µm x 40 µm habe die einzelnen Tropfen ein Volumen von etwa

100 pL.

Mittels einer einfachen Steuerelektronik wird der Rückpuls zeitlich verlangsamt, so

dass Resonanzen im Dispenser verringert werden und eine stabilere

Tropfenformation erreicht wird.

Abbildung 4.2-3 Tropfenformation aus der pyramidenförmigen Düse


Das Anlegen von Spannungspulsen mit zu hoher Amplitude führt zur Bildung von

ungewollten kleineren Satellitentropfen, die sich neben dem größeren Haupttropfen

bilden. Die Flugbahn der Satellitentropfen unterscheidet sich dabei meist merklich

von der des Haupttropfens, so dass kein präzises lokal aufgelöstes Dispensieren

möglich ist. Abbildung 4.2-4 zeigt die Bildung eines kleineren Satellitentropfen, der

nach dem Haupttropfen aus der pyramidenförmigen Düse gedrückt wird.

Ein weiterer zu berücksichtigender Punkt sind die physikalischen Eigenschaften der

Flüssigkeit, wie Viskosität, Oberflächenspannung und Dichte. Damit eine

Tropfenformation überhaupt stattfindet, muss die pulsartige Druckänderung die

Oberflächenspannungskräfte an der Auslassöffnung und die viskosen Druckverluste

im Inneren des Dispensers überschreiten und die Masse der ausgestoßenen

Flüssigkeit beschleunigen. In den meisten chemischen Anwendungen stellt dabei die

Oberflächenspannung den am häufigsten variierenden Parameter dar. Wässrige

Lösungen haben dabei hohe Oberflächenspannungen, während lösungsmittel-

basierte Flüssigkeiten, wie z. B. Ethanol oder Acetonitril, niedrige Oberflächen-

spannungen besitzen.

Die verschiedenen Flüssigkeitseigenschaften beeinflussen dabei Tropfengröße,

Geschwindigkeit und die Formation von Satellitentropfen, so dass die

Betriebsparameter, wie Pulshöhe und Pulslänge, entsprechend angepasst werden

müssen. Der hier vorgestellte Mikrodispenser gestattet verschiedene Flüssigkeiten

Abbildung 4.2-4 Bildung eines Satellitentropfen


mit einem weiten Bereich an Viskositäten und Oberflächenspannungen zu

dispensieren [260].

4.2.3 Fabrikationsverfahren

Das Herzstück des Mikrodispensers, die miteinander verbundenen Silizium-

strukturen, werden in Mikrotechnologie unter Reinraumbedingungen gefertigt. Das

Anbringen des Piezoelementes, der Halterung und der Schlauchverbindungen erfolgt

außerhalb des Reinraums.

Die Herstellung der beiden Siliziumstrukturen des Mikrodispensers im Reinraum

erfolgt mit photolitographischen Standardverfahren mit nachfolgenden Ätzschritten,

um die entsprechenden Mikrostrukturen zu erhalten.

Einige wichtige Grundlagen zur Mikrostrukturierung von Silizium werden im

Folgenden kurz dargestellt.

4.2.3.1 Grundlagen der Silizium-Mikrotechnologie

Silizium kristallisiert kubisch flächenzentriert im Diamanttyp mit einer Gitterkonstante

von a = 5.43 Å. Die entstehenden Netzebenen eines Kristallgitters werden durch drei

Miller-Indizes (h k l) klassifiziert.

Kommerziell erhältliche Einkristall-Siliziumwafer werden üblicherweise mit

Oberflächen (111), (100) und (110) angefertigt. In Abbildung 4.2-5 sind

entsprechende Kristallflächen gezeigt.


Es gibt zwei Dotierungsmöglichkeiten für Silizium: p-dotiert oder n-dotiert. N-dotiertes

Silizium besitzt einen Überschuss und p-dotiertes ein Defizit an Elektronen, was

bedeutet, dass beide elektrische Leiter ist. Typische Dotierungsmaterialen sind

Phosphor für n-dotiertes Silizium und Bohr für p-dotiertes Silizium. Zur Dotierung

wird Silizium in Gegenwart von Phosphin oder Diboran auf hohe Temperaturen

erhitzt. In der ersten Phase werden die Phosphor- oder Bohr-Atome an die

Siliziumoberfläche angelagert, in der zweiten Temperungsphase dringen die Atome

durch die bei hohen Temperaturen erhöhte Diffusionsrate tiefer in das Kristallgitter

ein.

Um Siliziumwafer in Ätzprozessen dreidimensional strukturieren zu können, muss

das gewünschte Strukturmuster auf das Silizium übertragen werden. Zu ätzende

Flächen müssen dabei frei bleiben, alle anderen Flächen müssen mit einer

Schutzschicht passiviert sein. Im Falle von KOH als Ätzmittel, kann Siliziumdioxid

(SiO2), das mit einer langsameren Rate geätzt wird als Silizium, zur Passivierung

verwendet werden [261]. Ein Siliziumwafer kann mit SiO2 als Passivierungsschicht

versehen werden, indem man die obersten Schichten bei hohen Temperaturen in

Wasserdampfatmosphäre oxidiert [262].

Der oxidierte Wafer wird mit einem lichtempfindlichen Polymer (positivem

Photoresist) beschichtet. Dazu wird in die Mitte des Wafers eine geringe Menge

Photoresist aufgetragen und der Wafer mit hohen Umdrehungszahlen rotiert, so

(100) (110) (111)

Abbildung 4.2-5 ausgewählte Kristallflächen der Kristallformen {100}, {110} und {111} desSiliziumkristalls


dass die gesamte Oberfläche mit Photoresist bedeckt wird (Spin Coating).

Anschließend wird eine Glasmaske, die das gewünschte Strukturmuster trägt,

ausgerichtet auf den Wafer gelegt und mit UV-Licht bestrahlt. Der mit dem

Photoresist beschichtete Wafer wird entwickelt, wobei der bestrahlte Teil des

Photoresist, dessen Polymerketten durch die UV-Bestrahlung zerstört wurden,

entfernt wird. Der verbleibende Photoresist stellt nunmehr eine Ätzmaske für das

chemische Ätzen von SiO2 mit gepufferter HF dar. Nachdem das SiO2 weggeätzt

und das darunterliegende Silizium freigelegt wurde, wird der verbleibende

Photoresist entfernt. Das Muster der Maske wurde somit in die Oxidschicht des

Wafers überführt. Das Schema dieses Prozesses ist in Abbildung 4.2-6 gezeigt.

(1)

(2)

(3)

(1) Der Wafer wird mit Photoresist beschichtetund durch eine Glasmaske, die dasStrukturmuster trägt, belichtet.

(2) Der bestrahlte Photoresist wird entfernt,dadurch wird das Strukturmuster in denPhotoresist übertragen.

(3) Das freigelegte SiO2 wird mit gepufferterHF geätzt. Das Strukturmuster wurde so indas SiO2 übertragen, das als Ätzmaske fürdas nachfolgende Siliziumätzen dient.

Abbildung 4.2-6 Schema des photolitographischen Prozessesschwarz = Si, grau = SiO2, rot = Photoresist


Silizium kann chemisch isotrop oder anisotrop geätzt werden. Beim isotropen Ätzen

ist die Ätzrate des Siliziums für alle Raumrichtungen gleich groß. Für isotropes Ätzen

benutzt man üblicherweise eine Mischung aus HNO3 und HF. Das Ätzprofil für ein

isotropes Ätzen von Silizium ist in Abbildung 4.2-7 dargestellt.

Beim anisotropen Ätzen treten unterschiedliche Ätzraten für unterschiedliche

Raumrichtungen des Kristalls auf. Übliche Ätzreagenzien hierfür sind wässrige KOH-

Lösungen oder Mischungen aus Ethylendiamin, Pyrocatechol und Wasser. Das

Ätzprofil hängt dabei von der Orientierung des Materials ab. Beim Ätzen von Silizium

mit KOH wird die (111) Kristallfläche langsamer geätzt und kann somit als

Ätzbegrenzung fungieren (Abbildung 4.2-8).

Abbildung 4.2-7 Ätzprofil für isotropes Ätzen von Siliziumschwarz = Silizium, grau = Ätzmaske

54.7°

a b

Abbildung 4.2-8 Ätzprofil von Silizium in KOHschwarz = Silizium, grau = Ätzmaskea) (100) orientierte Siliziumoberflächeb) (110) orientierte Siliziumoberfläche


Die Ätzraten für die (100) und (110) Flächen sind stark temperatur- und

konzentrationsabhängig und liegen im Bereich zwischen 0.3 und 1.5 µm/min. Bei in

der Praxis üblichen Konzentration von 44 g KOH in 100 mL H2O und einer

Temperatur von 85 °C beträgt die Ätzrate für die (110) Fläche 1.4 µm/min und ist

damit etwa 400 mal höher als die Ätzrate der (111) Fläche. SiO2 als

Maskierungsmaterial wird unter diesen Bedingungen nur mit einer Rate von 14 Å/min

geätzt.

Umfangreiche und detaillierte Informationen über Mikrostrukturierung und

anisotropes Ätzen von Silizium finden sich beispielsweise in [261-266].


4.2.3.2 Herstellungsprozedur des Mikrodispensers

Als Basis für die Fertigung der Mikrodispenser dienen zwei konven-

tionelle Siliziumwafer, ∅ 76 mm, Orientierung (100), Bohr-Dotierung (p-dotiert). Der

Wafer für die Membranseite hat eine Dicke von 250 µm. Für die Seite mit der

Auslassöffnung wird ein Wafer mit einer Dicke von 360 µm verwendet.

Die unterschiedlichen Mikrostrukturen werden in mehreren, sich wiederholenden

Schritten in die Wafer geätzt. Zunächst wird die prinzipielle Methode erläutert,

danach werden nähere Erläuterungen gegeben und Bilder der einzelnen Schritte

gezeigt.

Ein Strukturierungsschritt besteht dabei aus folgenden Prozeduren

1. Die obere Schicht des Wafers wird 4 Stunden lang bei 1100 °C in

Wasserdampfatmosphäre oxidiert.

2. Mittels Spincoating wird der Wafer mit positivem Photoresist beschichtet.

3. „Soft Baking“ des Photoresist: 20 Minuten bei 75 °C

4. Die Maske, welche die gewünschte Struktur trägt, wird auf den Wafer gelegt,

anhand von Markierungen ausgerichtet und der zu ätzende Teil mit UV-Licht

bestrahlt.

5. Der belichtete Photoresist wird in der entsprechenden Entwickler-Lösung

entfernt.

6. „Hard Baking“ des Photoresist: 20 Minuten bei 120 °C

7. Der freigelegte Teil der SiO2-Schutzschicht wird durch Ätzen in gepufferter HF

entfernt.

8. Der Photoresist wird entfernt.

9. Das freigelegte Silizium wird anisotrop in wässriger KOH (0.4 g/mL) bei 80 °C

geätzt.

10. Der Wafer wird in einer Waschprozedur („RCA-Washing“) intensiv gereinigt.


Eine schematische Darstellung des Querschnitts durch eine Dispenser-Mikrostruktur

mit allen zur Herstellung notwendigen Ätzschritte ist in Abbildung 4.2-9 gezeigt.

Alle Strukturierungsschritte erfolgen nach der beschriebenen Prozedur durch

anisotropes Ätzen in KOH. Die letzten Ätzschritte bei beiden Wafern, in denen die

dünne Membran und die pyramidenförmige Düse freigelegt werden, unterscheiden

sich von den vorherigen Ätzschritten, da hier eine Begrenzung des Ätzprozesses

über einen sogenannten „pn-Etch Stop“ erfolgt. Eine schematische Darstellung

dieses Verfahrens ist Abbildung 4.2-10 gezeigt.

a

b

Abbildung 4.2-9 schematische Darstellung der Ätzschritte zur Herstellung der Dispenser-Mikrostrukturen

a) Wafer mit der Auslassöffnung (Wafer 1)(1) Ätzen der inversen Pyramide(2) Ätzen des Durchflusskanals(3) Öffnen und Freilegen der pyramidenförmigen Düse

b) Membran-Wafer (Wafer 2)(1) Vorätzen der Ein- und Auslassöffnung(2) Durchätzen der Ein- und Auslassöffnung und Ätzen der Membran mit

„Pushbar“ zum Anbringen des Piezoelements


Zur Herstellung der dünnen Membran und der pyramidenförmigen Düse, werden die

p-dotierten Wafer auf der entsprechenden Waferseite n-dotiert. Die Tiefe des

Eindringens der Phosphoratome in das Siliziumkristallgitter bestimmt dabei die Dicke

der Membran bzw. die Breite der Pyramidenwände.

Zunächst wird die Außenseite des Wafers mit der inversen Pyramide solange in

KOH geätzt, bis die gewünschte Größe der Öffnung erreicht ist. Das Ätzen wird

dabei von Zeit zu Zeit unterbrochen und der Wafer im Mikroskop inspiziert.

Anschließend wird potentiostatisch ein Passivierungspotential von +0.7 V gegen eine

Platinelektrode als Referenz an die n-dotierte Seite des Wafers angelegt. Durch das

anodische Potential wird das n-dotierte Silizium durch fortlaufende elektrochemische

Oxidbildung passiviert [267]. Aufgrund der umgekehrten Polarität der pn-Sperrschicht

liegt das p-dotierte Silizium weiterhin auf dem „Open Circuit“-Potential und wird somit

weiterhin geätzt. Wird während des Ätzens eine n-dotierte Schicht erreicht, so wird

aufgrund der Passivierung der Ätzvorgang automatisch an der n-dotierten Schicht

gestoppt [268-270]. Beim letzten Ätzschritt des anderen Wafers mit der Membran

wird bereits zu Beginn des Ätzvorgangs im „pn-Etch Stop“-Verfahren die n-dotierte

Seite polarisiert.

a b

c d

Abbildung 4.2-10 schematische Darstellung des "pn-Etch Stop"-Prozessesa) anisotropes Ätzen der inversen Pyramide in die Mitte des Durchflusskanalsb) n-Dotieren der Waferseite mit der inversen Pyramidec) anisotropes Ätzen von der Außenseite des Wafers bis die gewünschte Größe

der Auslassöffnung erreicht istd) Freilegen der Pyramide durch weiteres Ätzen mit pn-Etch Stop, bei dem nur

p-dotiertes Silizium geätzt wird


1. Schritt: Ätzen der inversen Pyramide (Wafer 1)

Abbildung 4.2-11 vollständig geätzte inversePyramide

Abbildung 4.2-12 unvollständig geätzte inversePyramide

Im ersten Schritt wird die Innenseite der pyramidenförmigen Düse anisotrop in den

Wafer geätzt. Der Ätzschritt ist dabei, wie im Grundlagenteil erläutert,

selbstlimitierend. Die beiden Abbildungen zeigen Mikroskopaufnahmen einer bis zum

Ende geätzten inversen Pyramide (kleine Spitzenfläche, Abbildung 4.2-11) und einer

unvollständig geätzen inversen Pyramide (große Spitzenfläche, Abbildung 4.2-12).

Das Mikroskop ist jeweils auf die Pyramidenspitze bzw. auf das Plateau fokussiert.

Bei der unvollständig geätzten Pyramide wurde der Ätzvorgang vor der

Selbstlimitierung des anisotropen Ätzens abgebrochen. Man erkennt, dass die

Pyramide noch nicht bis zum Ende geätzt wurde, da an der tiefsten Ätzstelle ein

großes Plateau statt einer kleinen Spitzenfläche zu beobachten ist. Die dunklen

Quadrate zeigen die Bodenflächen der Pyramiden, die hellen Flächen entsprechen

den Flächen der Pyramidenspitzen. Die Tiefe der vollständig geätzten Pyramide

beträgt etwa 250 µm, die quadratische Grundfläche hat eine Seitenlänge von

300 µm.


2. Schritt: Ätzen des Durchflusskanals (Wafer 1)

Im zweiten Schritt wird der längliche Durchflusskanal mit einer Tiefe von 50-60 µm

anisotrop in die Waferseite mit der inversen Pyramide geätzt. Dabei befindet sich die

inverse Pyramide in der Mitte des Durchflusskanals, der eine Länge von etwa 12 mm

aufweist. Abbildung 4.2-13 zeigt einen Ausschnitt des mittleren Teils des

Durchflusskanals mit der in schwarz zu erkennenden inversen Pyramide.

3. Schritt: Phosphor-Dotierung (Wafer 1 und 2)

Beide Wafer werden bei einer Temperatur von 1000 °C in Gegenwart eines hoch mit

Phosphor dotierten Wafers n-dotiert. Dabei ist zu beachten, dass die Seite mit den

inversen Pyramiden zum phosphordotierten Wafer orientiert ist, damit nur diese

dotiert wird. Beim zweiten, neuen Wafer für die Membranseite des Dispensers spielt

dies keine Rolle: Nach dem Dotierungsprozess muss lediglich bekannt sein, welche

Seite des Wafers n-dotiert ist.

Anschließend werden die Wafer eine Stunde lang bei 1100 °C oxidiert. In diesem

Temperungsschritt diffundieren die Phosphoratome tiefer in das Kristallgitter des

Silizium, wodurch die spätere Dicke der Membran und Pyramidenwände bestimmt

wird.

Abbildung 4.2-13 eingeätzter Durchflusskanal


4. Schritt: Vorätzen der Ein- und Auslassöffnungen (Wafer 2)

In die n-dotierte Seite des Membran-Wafers werden quadratische Löcher, welche die

späteren Ein- und Auslassöffnungen an den Enden des Durchflusskanals darstellen,

geätzt. Die Tiefe muss dabei mindestens 30 µm betragen. In einem späteren Schritt

wird von der Rückseite her die Öffnung durchgeätzt.

5. Schritt: Freilegen der pyramidenförmigen Düse (Wafer 1)

Zum Freilegen der pyramidenförmigen Düse wird von der bisher unstrukturierten

Rückseite her geätzt. Mit Hilfe photolitographischer Maskierung wird nicht die

gesamte Rückseite geätzt, sondern nur der Teil der Fläche, der sich direkt um der

Pyramide befindet. Zunächst wird konventionell in KOH geätzt, bis der erste

Durchbruch durch den Wafer zu beobachten ist. Danach wird in kurzen

Zeitabständen mit häufiger Kontrolle im Mikroskop soweit geätzt bis eine Öffnung

von 40 x 40 µm entstanden ist. Anschließend wird das Ätzen in KOH mit der

beschriebenen „pn-Etch Stop“-Technik fortgesetzt, bis die Pyramide auf einer Höhe

von etwa 70 µm freigelegt ist.

Abbildung 4.2-14 freigelegte pyramidenförmige Düse


Abbildung 4.2-14 zeigt die Aufsicht auf die freigelegte pyramidenförmige Düse. Der

graue Teil in der Mitte stellt die quadratische von unten beleuchtete Öffnung dar, die

von einem scharf definierten, 7 µm dicken Rand umgeben ist. Die breite schwarze

Umrandung entspricht den zum Boden des Wafers hin breiter werdenden

Seitenwänden der Pyramide.

6. Schritt: Ätzen der Membran und der Ein- und Auslassöffnungen (Wafer 2)

Mittels Photolitographie wird die Struktur der Membran und der Ein- und

Auslasskanäle auf die bisher unbehandelte p-dotierte Seite des Membran-Wafers

übertragen. Es wird vom Beginn des Ätzvorgangs in KOH an mit „pn-etch stop“-

Technik geätzt. Da bereits von der anderen Seite her der Ein- und Auslasskanal in

einer Tiefe von mehr als 30 µm vorgeätzt wurden, wird an diesen Stellen durch den

Wafer geätzt und die Kanäle werden geöffnet. Die Membran wird bis zu ihrer durch

den n-Dotierungsprozess definierten Dicke geätzt. In der Mitte der Membran bleibt

ein durch Maskierung geschützter dünner Siliziumstreifen (Pushbar) ungeätzt, um

später das Piezoelement an diesem zu befestigen.


Nach allen Ätzprozessen sehen die Wafer wie folgt aus:

Wafer mit pyramidenförmiger Auslassdüse (Wafer1)

Außenseite mit pyramidenförmiger Düse(befindet sich jeweils an den Kreuzungen)

Innenseite mit Durchflusskanal und Innenseite derpyramidenförmigen Auslassdüse

Membran-Wafer (Wafer 2)

Außenseite des Dispensers mit Membran und Ein-und Auslasskanal

Innenseite des Dispensers mit Ein- undAuslasskanal

Abbildung 4.2-15 fertige Wafer nach Beendigung aller Ätzvorgänge


7. Schritt: Direktes Verbinden der Wafer durch „Silicon Fusion Bonding“

Wenn zwei Wafer dicht zusammengebracht werden, so findet eine spontane feste

Bindung statt.

Direktes Binden der Wafer durch „Fusion Bonding“ ist möglich zwischen:

• zwei reinen Siliziumwafern

• einem reinen Siliziumwafer und einem Siliziumwafer mit einer thermischen

Oxidschicht

• zwei Siliziumwafern mit einer thermischen Oxidschicht

Es wird vermutet, dass die Bindung im Falle von hydrophoben Waferoberflächen auf

van der Waals-Wechselwirkungen und im Falle von hydrophilen Oberflächen auf

Wasserstoffbrückenbindung zurückzuführen ist [271,272]. In einem Temperungs-

schritt bei hohen Temperaturen kann die Stärke der Bindung weiter gefestigt werden.

Das Verbinden der Wafer durch „Fusion Bonding“ ist ein kritischer Schritt. Die

Qualität und Reinheit der Oberfläche ist entscheidend für eine erfolgreiche Bindung.

Im ersten Schritt werden die sorgfältig gereinigten Wafer oxidiert. Die dünne

Oxidschicht des Membran-Wafers wird durch Ätzen in HF entfernt. Der oxidierte und

nicht-oxidierte Wafer werden mit Hilfe von Markierungen passend übereinander

gelegt und aneinander gepresst. Anschließend werden die verbundenen Wafer über

Nacht bei 800 °C getempert und so der Zusammenhalt erhöht.

8. Schritt: Schneiden der Wafer

Im nächsten Schritt, der erste außerhalb des Reinraums, werden die Wafer entlang

der Kreuzmarkierungen auf der Außenseite des Wafers mit der pyramidenförmige

Düse (siehe Abbildung 4.2-15, oben links) maschinell geschnitten.

Wenn die Wafer homogen geätzt wurden, so dass alle Strukturen gleich und intakt

sind, so erhält man 46 Dispenser-Mikrostrukturen. In der Praxis verliert man jedoch

einige Dispenser durch nicht geöffnete pyramidenförmige Düsen, schlecht definierte

nicht quadratische Auslassöffnungen oder defekte Membranen.


9. Schritt: Anbringen des Piezoelements und der Schlauchverbindungen

Der hier vorgestellte Mikrodispenser hat, abweichend von dem in Abschnitt 4.2.1

erläuterten Dispenser, ein verbessertes Verfahren zum Generieren des Druckpulses.

Das bimorphe Piezoelement wird gegen einen Piezostapel ersetzt, der direkt an den

hochstehenden Siliziumstreifen der Membran angeklebt wird. Dadurch kann auf die

Plastikrollen verzichtet werden, was die Herstellungsprozedur vereinfacht und

verkürzt. Das Funktionsprinzip bleibt trotz dieser Modifikation gleich, ist aber in

Abbildung 4.2-16 noch einmal schematisch dargestellt.

Abbildung 4.2-16 Aktuatorprinzip des Dispensers mit einem PiezostapelBeim Anlegen des Spannungspulses dehnt sich der Piezostapelkurzzeitig aus und drückt auf die Membran, so dass einFlüssigkeitstropfen aus der gegenüberliegenden Öffnungausgestoßen wird.


Der Piezostapel wird in eine U-förmige Plastikhalterung geklebt. Die Plastikhalterung

wird auf der Siliziumstruktur so ausgerichtet, dass das Piezoelement direkt auf den

Pushbar der Membran drückt. Die Membran wird mit dem Piezoelement verklebt und

die Plastikhalterung ober- und unterhalb der Membran mit der Siliziumstruktur.

An die Ein- und Auslassöffnung werden Silikonschläuche geklebt, über die Standard-

Teflonschläuche zum Befüllen des Dispensers angeschlossen werden können.

Abbildung 4.2-17 zeigt einen zusammengebauten Dispenser vor dem Anbringen der

Silikonschläuche an die Füllkanäle. Eine dieser beiden quadratischen Öffnungen ist

in der Mitte des rechten Teils der Siliziumstruktur zu erkennen. In der Mitte der

Siliziumstruktur befindet sich das mit der Membran verbundene Stapel-Piezoelement

mit angelöteten Kabeln.

Abbildung 4.2-17 fertig zusammengebauter Dispenser

4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen 91

Die Tropfengröße eines einzelnen Tropfens, der aus einem Mikrodispenser mit einer

Auslassöffnung von 40 µm x 40 µm geschossen wird, kann mit einem optischen

Aufbau, der aus einem Stroboskop und einer CCD-Kamera besteht, aus dem

Durchmesser der Tropfen abgeschätzt werden und beträgt etwa 100 pL. Im

folgenden Kapitel wird eine alternative elektrochemische Methode zur Bestimmung

der Größe eines Tropfens vorgestellt.

4.3 Elektrochemie in Pikolitertropfen

Die Verdampfungsrate von Tropfen im Piko- bis Nanoliterbereich mit einem großen

Verhältnis von Oberfläche zu Volumen ist sehr hoch, so dass unmittelbar nach dem

Auftreffen auf eine Oberfläche Verdampfungseffekte einsetzen und die Flüssigkeit

des Tropfens in wenigen Augenblicken in die Gasphase übergeht.

Um elektrochemische Messungen in einem Tropfen durchführen zu können, müssen

die ausgestoßenen Tropfen durch ein Konservierungsverfahren vor dem

Verdampfen bewahrt werden.

4.3.1 Deposition und Konservierung von Pikolitertropfen in Öl

In der Literatur wurde beschrieben, dass es möglich ist, mit Mikropipetten oder

Diffusions-Mikrobüretten abgelegte Tropfen bzw. mit einem Zerstäuber versprühte

Tropfen unter einer Ölschicht oder unter Heptan zu konservieren [273,274]. Bislang

konnte jedoch nicht gezeigt werden, dass es möglich ist, mit nicht-manuellen

Methoden kleinste Flüssigkeitsmengen mit hoher Reproduzierbarkeit und an

definierten Orten zu konservieren.

Als Konservierungsverfahren wurde die Deposition der Pikolitertropfen auf einem

Glasobjektträger unter einer Ölschicht untersucht. Als Öl wurde dabei aufgrund

seiner Viskosität und seiner optischen Eigenschaften Paraffinöl ausgewählt.

Zunächst muss untersucht werden, ob es möglich ist, mit dem Dispenser Tropfen

durch einen Ölfilm bis auf den Glasobjektträger zu schießen, wo sie anhaften und

konserviert werden.


Ein konventioneller Glasobjektträger wird mit einem Paraffinölfilm belegt. Der

Dispenser wird mit einer Lösung an „Green Fluorescent Protein“ (GFP) gefüllt.

Mittels eines Drehgelenks wird der Dispenser so orientiert, dass der Winkel zwischen

der horizontal liegenden Glasoberfläche und der Flugbahn der Tropfen größer als

45° ist. Anschließend wird der Dispenser dicht an den Ölfilm auf dem

Glasobjektträger angenähert. Durch Anlegen eines Spannungspulses an das

Piezoelement des Dispensers wird ein einzelner Tropfen aus der pyramidenförmigen

Öffnung in Richtung des Ölfilms herausgeschossen.

Es können je nach Schichtdicke des Ölfilms und Geschwindigkeit des Tropfens

folgende Fälle auftreten:

• Der Ölfilm ist zu dick. Der Tropfen trifft auf den Ölfilm, kann jedoch nicht tief genug

in das Öl eindringen und schwimmt auf dem Ölfilm. Neigt man den

Glasobjektträger, so dass der Ölfilm sich langsam bewegt, so bewegt sich auch

der Tropfen. Durch den partiellen Kontakt des Tropfens mit dem Öl wird die

Verdampfung zwar verlangsamt aber nicht unterbunden.

• Der Ölfilm ist zu dünn. Der Tropfen trifft auf den Ölfilm und dringt bis zum

Glasobjektträger vor, verdrängt aber dadurch das Öl von der Glasoberfläche. Der

Tropfen ist nicht durch einen Ölfilm geschützt und verdampft. Das viskose Öl fließt

nicht nach und im Ölfilm bleibt ein Loch von der Größe des auf die Glasoberfläche

aufgetroffenen Tropfens zurück.

• Bei einer optimalen Dicke des Ölfilms durchdringt der Tropfen den Ölfilm, dringt

bis zur Glasoberfläche vor, haftet dort an und wird vom umgebenen Öl vor dem

Verdampfen geschützt.

Als Testsubstanz wurde zunächst fluoreszierendes GFP verwendet, da mit Hilfe der

Fluoreszenzmikroskopie zwischen kristallinem GFP und GFP in Lösung

unterschieden werden kann. GFP besitzt ein Absorptionsmaximum bei einer

Wellenlänge von 397 nm und ein Emissionsmaximum bei 510 nm [275].


Abbildung 4.3-1 fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von GFP-Spots auf einer Glasoberfläche

Abbildung 4.3-2 fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von in Öl konservierten GFP-Tropfen

In Abbildung 4.3-1 ist eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme (Filter:

BP = 450-490 nm, FT = 510 nm, LP = 520 nm) eines Rasters von einzelnen GFP-

Tropfen gezeigt, die auf eine Glasoberfläche geschossen wurden. Im rechten Teil

der Abbildung ist ein Spot vergrößert dargestellt. Zwischen dem Dispensieren der

einzelnen Tropfen wurde die relative Position des Glasobjektträgers zum Dispenser

geändert. Zur exakten lateralen Positionierung kann der Glasobjektträger mit zwei

Mikrometerschrauben bewegt werden. Der Abstand zwischen zwei Spots beträgt

jeweils 300 µm. Trifft ein einzelner Tropfen auf die Glasoberfläche, so verdampft die

Flüssigkeit, und die im Tropfen enthaltene GFP-Menge kristallisiert aus und bleibt

auf der Glasoberfläche zurück, wodurch die heterogene Struktur der GFP-Spots

entsteht. Abbildung 4.3-2 zeigt ein analoges Experiment, bei dem die Tropfen in

einen Ölfilm optimaler Dicke geschossen wurden. Der GFP-Tropfen haftet an der

Glasoberfläche und wird vom umgebenen Öl vor dem Verdampfen geschützt. Die


milchige homogene Färbung mit der höchsten Intensität in der Mitte der Spots zeigt,

dass GFP in Lösung vorliegt und nicht auskristallisiert ist. Die Konservierung der

Tropfen durch das umgebende Öl ist dabei über mehrere Stunden stabil.

Bei den durchgeführten Versuchen mit Fluoreszenz ist die Art des verwendeten Öls

von großer Bedeutung, da es keinerlei Eigenfluoreszenz aufweisen darf. Mineral-

oder Pumpenöle zeigen im Fluoreszenzbereich von GFP eine derartig hohe

Fluoreszenz, so dass das im Öl konservierte GFP nicht detektiert werden kann.

Abhilfe schafft hier die Verwendung von Paraffinöl, welches aus langkettigen

gesättigten Alkanen besteht und keine fluoreszierenden Eigenschaften besitzt.

4.3.2 Elektrochemie in konservierten Pikolitertropfen

Der Mikrodispenser wird mit einer Lösung einer redoxaktiven Substanz befüllt und

Pikolitertropfen werden in einen auf einem Glasobjektträger befindlichen Ölfilm

geschossen und dort konserviert. Dies führt zur Ausbildung von elektrochemisch

aktiven „Enklaven“ im elektrochemisch inerten Öl.

Um elektrochemische Messungen in den konservierten Tropfen durchführen zu

können, muss eine entsprechende Messapparatur konzipiert werden, die folgende

Bedingungen erfüllt:

• Eine miniaturisierte Messsonde, z. B. eine Mikroelektrode, muss mit hoher

Präzision in den Tropfen eingeführt werden können.

• Eine optische Kontrolle, mit der die konservierten Tropfen visualisiert werden

können, so dass sie mit der Messsonde angefahren werden können.

• Komplettierung der 3-Elektrodenanordnung durch Referenz- und Gegenelektrode.

Ein Beispiel für einen derartigen Aufbau wurde kürzlich von Kashyap und Gratzl

beschrieben [273]. In diesem Aufbau wurden eine Mikroelektrode und eine

miniaturisierte Referenzelektrode (beide mit einem nominalen Durchmesser von

7.5 µm) in Heptan konservierte Pikolitertropfen einer Lösung von [Ru(NH3)6]3+

eingeführt und elektrochemische Messungen durchgeführt. Es wurde jedoch

festgestellt, dass bei diesem Aufbau Probleme durch die Referenzelektrode


auftraten. Das verwendete Agar-Diaphragma besaß nicht die erforderlichen

Eigenschaften in Bezug auf Dichtigkeit, so dass ein Teil des Tropfens durch das

Diaphragma in die Referenzelektrode diffundierte. Mit einem ähnlichen Aufbau unter

Verwendung einer Diffusions-Mikrobürette [274] konnten komplexometrische [276]

und Säure-Base-Titrationen [277] in Pikolitertropfen durchgeführt werden.

Weiterhin konnten mit ionensensitiven Mikrokapillarelektroden potentiometrische

Messungen in manuell abgelegten, unter Öl konservierten Tropfen durchgeführt

werden. Durch ionensensitive Mehrkanal-Elektroden gelang die simultane

Bestimmung der Mg2+-Konzentration und des pH-Wertes [278].

Im Folgenden wird ein neuer Ansatz für einen Aufbau vorgestellt, der

voltammetrische Messungen in konservierten Pikolitertropfen gestattet.

Abbildung 4.3-3 zeigt ein schematisches Bild des entsprechenden Aufbaus. Der

Glasobjektträger wird auf einer U-förmigen Halterung befestigt, so dass er mit Hilfe

des Videomikroskops von unten beobachtet werden kann. Zur Visualisierung der

konservierten Tropfen ist eine Anpassung der Lichtverhältnisse durch eine

Kaltlichtquelle unerlässlich. Der Objektträger kann über Mikrometerschrauben lateral

bewegt werden, um die konservierten Tropfen in den Blickwinkel des

Videomikroskop

x,y,z-Mikrometer-Verschiebetische

Glasobjektträger mit Ölfilm undPikolitertropfen

Klemmenhalter für Referenz-und Gegenelektrode Halter für

Mikroelektrode

Abbildung 4.3-3 schematische Darstellung des Aufbaus zur Durchführung von elektro-chemischen Messungen in konservierten Pikolitertropfen mit Mikroelektroden


Videomikroskops zu bringen. Mithilfe der Mikrometerschraube zur

Höhenpositionierung kann der Objektträgers in den Beobachtungsabstand des

Videomikroskops gebracht werden und so die Schärfe des Bildes justiert werden.

Die Mikroelektrode wird an dem Elektrodenhalter befestigt und kann über

Mikrometerschrauben bzw. Schrittmotoren ebenfalls in allen Raumrichtungen frei

positioniert werden.

Die 3-Elektrodenanordnung wird komplettiert, indem außerhalb des Ölfilms ein

Tropfen wässriger Leitsalzlösung aufgebracht wird, so dass sich eine direkte

Phasengrenzfläche zwischen der wässrigen und der Ölphase ausbildet. In die

wässrige Phase werden über verschiebbare Magnetklemmen ein Platindraht als

Gegenelektrode und ein chloridisierter Silberdraht als Pseudo-Referenzelektrode

eingetaucht (siehe auch Kapitel 4.1.10.). Zur Erhöhung der Leitfähigkeit können dem

Paraffinöl geringe Mengen an Tetrabutylammonium-hexafluorophosphat (TBAPF6)

als Leitsalz zugesetzt werden.

Nachdem der Glasobjektträgers so positioniert wurde, dass die konservierten

Tropfen mit dem Videomikroskop lokalisiert werden konnten, wird die Mikroelektrode

in eine Position gebracht, so dass sie ebenfalls von der Videokamera erfasst wird.

Dazu werden nur die Verstelleinheiten für die Positionierung der Mikroelektrode

benutzt; die Position des Glasobjektträgers und damit die Position der Tropfen auf

dem Videobild bleiben unverändert. Abbildung 4.3-4 zeigt ein typisches Bild des

Videomikroskops vor dem Positionieren und Eintauchen der Mikroelektrode in den

Tropfen.


Oben rechts in der Abbildung ist die Spitze der Mikroelektrode mit ihrer isolierenden

Glasummantelung zu erkennen. Die aktive Elektrodenoberfläche (dunkler Kreis in

der Mitte) hat einen Durchmesser von 50 µm. In der Mitte der Abbildung erkennt man

mehrere konservierte Flüssigkeitstropfen, die einen Durchmesser von je etwa

100 µm besitzen. Die Mikroelektrode wird über einen Tropfen lateral positioniert und

dann abgesenkt und unter optischer Kontrolle in den Tropfen eingeführt. Sobald die

Spitze der Mikroelektrode in den Tropfen eintaucht, findet eine Adhäsion des

Tropfens an der Mikroelektrode statt, was im Videomikroskop als eine leichte

Verformung der Tropfenbegrenzung erkennbar ist.

Als elektrochemisch aktive Substanz wurde Kaliumhexacyanoferrat(III)

(K3[FeIII(CN)6]) verwendet, welches elektrochemisch reduziert werden kann. Das

Normalpotential dieser reversiblen Redoxreaktion liegt bei 360 mV vs. NHE [279].

Der Dispenser wurde mit einer 20 mM Lösung an Kaliumhexacyanoferrat(III) in 0.1 M

KCl befüllt und einzelne Tropfen wurden entsprechend dem erläuterten Verfahren in

Paraffinöl konserviert.

Abbildung 4.3-4 videomikroskopische Aufnahme der Mikroelektrode und der konserviertenTropfen. Zur besseren Visualisierung sind die Tropfen in einer nachträglichenBildbearbeitung weiß umrandet worden.


Abbildung 4.3-5 zeigt cyclische Voltammogramme einer Mikroelektrode mit

verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten, die mit der beschriebenen

Messanordnung in einem konservierten Tropfen K3[FeIII(CN)6]-Lösung erhalten

wurden.

Die cyclischen Voltammogramme zeigen nicht das für Mikroelektroden typische

sigmoide Verhalten, sondern eine ausgeprägte Peakform mit einer sehr hohen

Peakseparation. Die Peakseparation ist dabei stark abhängig von der

Vorschubgeschwindigkeit. Das Auftreten der Peakform und die hohe Peakseparation

können durch die schlechte Leitfähigkeit des Öls und die besonderen Eigenschaften

der elektrochemischen Zelle erklärt werden. Das Öl kann formal als Widerstand

zwischen Arbeits- und Gegen- bzw. Referenzelektrode betrachtet werden. Dadurch

tritt ein Potentialabfall („iR-Drop“) auf, um den das tatsächlich an der

Arbeitselektrode anliegende Potential vermindert wird. Dies bedeutet, dass sowohl in

reduktiver Richtung als auch in oxidativer Richtung ein höheres Potential

aufgewendet werden muss, um diesen Potentialabfall zu kompensieren. Dadurch

wird die Reduktionswelle weiter in den reduktiven Potentialbereich und die

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40 4 mV/s 8 mV/s 16 mV/s 32 mV/s

i [nA

]

Potential vs. Ag/AgCl [V]

Abbildung 4.3-5 Cyclische Voltammogramme einer Mikroelektrode in einem in Öl konserviertenTropfen mit verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten(∅ Mikroelektrode = 50 µm, c(K3[Fe(CN)6]) = 20 mM)


Oxidationswelle in den oxidativen Bereich verschoben, was zu den beobachteten

hohen Peakseparationen führt.

Da das Volumen der konservierten Tropfen im Vergleich zum Durchmesser der

Elektrodenoberfläche von 50 µm relativ klein ist, tritt hier der elektrochemische

Sonderfall der Dünnschichtzelle auf. Man spricht von einer Dünnschichtzelle, wenn

das Lösungsvolumen und damit die absolute Menge an Redoxspezies so klein ist,

dass sie durch die Elektrode innerhalb kurzer Zeit vollständig umgesetzt werden

kann. Üblicherweise wird dies durch eine große Elektrodenoberfläche, die in einen

sehr dünnen Flüssigkeitsfilm der Elektrolytlösung taucht, erreicht.

Im hier beschriebenen Experiment liegt eine ähnliche Situation vor: Zu Beginn des

Potentialzyklus liegt die gesamte Menge an Kaliumhexacyanoferrat in der

Oxidationsstufe +III vor. Durch die fortlaufende Polarisierung der Mikroelektrode zu

reduktiven Potentialen wird das Hexacyanoferrat reduziert. Nach Unterschreitung

des Normalpotentials verläuft die Reduktion nicht mehr unter kinetischer Kontrolle,

beschrieben durch die Nernst-Gleichung, sondern unter Diffusionskontrolle. Ist das

Elektrolytvolumen groß genug, so stellt sich bei Mikroelektroden ein zeit- und

potentialunabhängiges Diffusionsfeld ein und der Strom mündet in einen stationären

Grenzwert. Im hier vorliegenden Fall nimmt der Strom im cyclovoltammetrischen

Experiment nach Überschreiten eines Maximums ab und kehrt zur Grundlinie zurück.

Dies lässt sich dadurch erklären, dass die Gesamtmenge der im Tropfen zur

Verfügung stehenden reduzierbaren Spezies umgesetzt wurde, so dass kein

Stromfluss mehr möglich ist.

Unter dieser Bedingung lässt sich über die in einem Halbzyklus ausgetauschte

Ladungsmenge das Volumen des konservierten Tropfens abschätzen. Der Strom

eines Halbzyklus wird über die Zeit integriert und so die Ladungsmenge bestimmt.

Unter der Annahme, dass pro Hexacyanoferrat-Molekül ein Elektron ausgetauscht

wird, kann die Anzahl der im Tropfen befindlichen Moleküle berechnet werden.

Mithilfe der bekannten Konzentration kann schließlich das Volumen des Tropfens

wie folgt berechnet werden:

== −−− L

]mol[]Lmol[]C[

]C[

Nc1062.1

QV

11A

19 (Gleichung 4.3-1)


Integriert man den Strom über die Zeit im Reduktionshalbzyklus cyclischer

Voltammogramme verschiedener Vorschubgeschwindigkeiten entlang der in

Abbildung 4.3-6 gezeigten Basislinien, so erhält man folgende Werte:

v [mV s-1] Q [*10-7 C]

4 3.38

8 3.54

16 3.91

Mit größer werdender Vorschubgeschwindigkeit steigt die ausgetauschte

Ladungsmenge an. Neben der Ladungsmenge, die durch einen heterogenen

Elektronentransfer zwischen Elektrode und Redoxmediatormolekülen ausgetauscht

wird, findet ein zusätzlicher Ladungstransfer durch das Aufladen der

elektrochemischen Doppelschicht an der Grenzfläche zwischen Elektrode und

Elektrolyt statt. Die Kapazität der elektrochemischen Doppelschicht einer Elektrode

im cyclovoltammetrischen Experiment ist eine Funktion der Vorschubgeschwindigkeit

und nimmt mit steigender Vorschubgeschwindigkeit zu. Trägt man die

0 100 200 300 400 500-30

-20

-10

0

10

20

30 4 mV/s

8 mV/s

16 mV/s

i [n

A]

t [s]

Abbildung 4.3-6 Integration des Stroms über die Zeit in cyclischen Voltammogrammenunterschiedlicher Vorschubgeschwindigkeiten in einem in Öl konserviertenTropfen

(∅ Mikroelektrode = 50 µm, c(K3[Fe(CN)6]) = 20 mM)


Ladungsmenge gegen die Vorschubgeschwindigkeit auf, so erhält man eine Gerade

(Abbildung 4.3-7).

Extrapoliert man die Gerade auf eine Vorschubgeschwindigkeit von 0 mV/s, so erhält

man einen Wert für die Ladungsmenge, bei der der kapazitive Anteil weitestgehend

eliminiert ist. Mithilfe der Regressionsgeraden wird hierfür ein Wert von 3.2 10-7 C

bestimmt. Durch Einsetzen in Gleichung 4.3-1 errechnet sich daraus ein Volumen

von 148 pL für den in Öl konservierten Tropfen.

Das mit dieser Methode bestimmte Tropfenvolumen ist somit in guter

Übereinstimmung mit den Tropfenvolumina, die mit optischen Methoden aus dem

Durchmesser des Tropfens unter Annahme einer Kugelform bestimmt wurden. Für

den hier verwendeten Mikrodispensertyp mit einer Auslassöffnung von 40 x 40 µm

wurden für Wasser Tropfenvolumina um 100 pL bestimmt. Wie bereits im vorherigen

Kapitel erläutert, ist das Tropfenvolumen ein für jeden Dispenser spezifischer

Parameter, der im wesentlichen von der Größe der Auslassöffnung, den

physikalischen Eigenschaften der Flüssigkeit und in geringem Maße auch von der

Höhe des Spannungspulses abhängig ist.

0 2 4 6 8 10 12 14 16

3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

Q [

*10

-7 C

]

v [mV/s]

Abbildung 4.3-7 Auftragung des Ladungsmenge gegen die VorschubgeschwindigkeitLineare Regression: Steigung = 0.044, Achsenabschnitt = 3.2, r = 0.9999

4.4 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten 102

4.4 Bestimmung der Diffusionskoeffizienten von Redoxmolekülenin elektrochemischen „time of flight“-Experimenten

Die Bestimmung von Diffusionskoeffizienten elektrochemisch aktiver Moleküle

erfordert die genaue Kenntnis von Systemparametern, wie Konzentration oder

Größe der elektrochemisch aktiven Oberfläche, die z. T. in langwierigen

Vorversuchen ermittelt werden muss.

Die präzisen Dosierungseigenschaften des Mikrodispensers in Kombination mit

zeitlich und lokal aufgelösten elektrochemischen Detektionsverfahren können

ausgenutzt werden, um die Diffusionskoeffizienten elektrochemisch aktiver Moleküle

ohne Kenntnis dieser Systemparameter zu bestimmen.

Hierzu wurde ein Messaufbau konzipiert, der im Folgenden schematisch und als

Fotografie dargestellt ist:

��

Gegen-elektrode

Referenz-elektrode

einschraubbareElektrode

Mikrodispenser

ausgestoßene Tropfen

0.1M KCl

X

YZ

Abbildung 4.4-1 schematische Darstellung und Fotografie des Messaufbaus zur Bestimmungvon Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten


Eine Arbeitselektrode wird von unten in die elektrochemische Messzelle

eingeschraubt und mit einer Lösung, die nur Leitelektrolyt enthält befüllt, so dass

sich die aktive Elektrodenoberfläche dicht unterhalb des Oberfläche der Flüssigkeit

befindet. Der Mikrodispenser wird mit einer Lösung, welche die zu untersuchende

Redoxspezies enthält, befüllt. Mittels eines Gelenks wird der Winkel zwischen dem

herausgeschossenen Tropfenstrahl und der Flüssigkeitsoberfläche auf ca. 90°

eingestellt. Die elektrochemische Zelle kann mit Mikrometerschrauben präzise in alle

Raumrichtungen positioniert werden. Über einen Funktionsgenerator mit „Burst“-

Option kann die Anzahl der vom Dispenser ausgestoßenen Tropfen in jedem

Experiment exakt festgelegt werden.

4.4.1 Dispensieren von Redoxspezies in die Nähe einer Elektrodenoberflächemit amperometrischer Detektion

Der Mikrodispenser wird mit Kaliumhexacyanoferrat(II) (20 mM K4[FeII(CN)6] in 0.1 M

KCl) als Redoxspezies befüllt. Als Arbeitselektrode wird in die elektrochemische

Messzelle eine Platin-Makroelektrode mit einem Durchmesser der aktiven

Elektrodenoberfläche von 0.5 mm von unten eingeschraubt. Die Messzelle wird mit

Basiselektrolyt (3 mL 0.1 M KCl) befüllt. Die Platin-Arbeitselektrode wird auf ein

Potential von +300 mV vs. Ag/AgCl gelegt, so dass Hexacyanoferrat(II) an dieser zu

Hexacyanoferrat(III) oxidiert werden kann. Der Ausgang des Potentiostaten ist mit

einem Linienschreiber (20 mm/min) verbunden.

Die elektrochemische Zelle wird mittels Mikrometerschrauben so positioniert, dass

der aus dem Dispenser ausgestoßene Tropfenstrahl in direkter Nähe der

elektroaktiven Elektrodenoberfläche auf die Flüssigkeitsoberfläche trifft.

Abbildung 4.4-2 zeigt die Stromantwort der Elektrode nach dem Dispensieren von 50

Tropfen der Hexacyanoferrat(II)-Lösung in die Nähe der Elektrodenoberfläche.


Direkt nach dem Dispensieren tritt ein scharfer Strompeak (Höhe ∼700 nA) auf, der

nach einer Abklingzeit von etwa 75 Sekunden wieder zur Grundlinie zurückkehrt.

Das Schiessen von Hexacyanoferrat(II) in die Nähe der Elektrode führt zu einem

plötzlichen Anstieg der Konzentration an umsetzbarer Redoxspezies vor der

Elektrodenoberfläche. Die Oxidation des Hexacyanoferrat(II) zu Hexacyanoferrat(III)

führt dabei zu dem starken Stromanstieg. Die nachfolgende Stromabnahme kann auf

zwei Effekten basieren:

1. Die gesamte in die Nähe der Elektrodenoberfläche geschossene Redoxspezies

wird an der Elektrodenoberfläche umgesetzt, so dass nach dem Oxidieren aller

Hexacyanoferrat(II)-Moleküle eine Rückkehr zum Grundstrom erfolgt.

2. Die Redoxspezies diffundiert in das Volumen des Elektrolyten, so dass die

Menge an oxidierbarer Spezies vor der Elektrodenoberfläche abnimmt. Direkt

nach dem Dispensieren befindet sich eine hohe Konzentration an Redoxspezies

in einem sehr kleinen Volumenteil. Das umgebende Volumen enthält keine

Redoxspezies, so dass ein hoher Konzentrationsgradient vorliegt. Da das

Lösungsvolumen der Messzelle sehr viel größer ist als das Volumen der

Abbildung 4.4-2 zeitaufgelöste Stromantwort einer Makroelektrode nach demDispensieren von 50 Tropfen 20 mM K4[Fe(CN)6]-Lösung(Schreiberauftragung: Strom gegen Zeit,∅ Elektrode = 0.5 mm, E = 350 mV vs. Ag/AgCl)


geschossenen Tropfen, ist nach vollständiger Verdünnung die Konzentration an

Redoxspezies in der Messzelle nahezu null.

Nachdem gezeigt wurde, dass es möglich ist, geringe Mengen Redoxspezies,

welche in die Nähe einer Elektrode geschossen werden, amperometrisch zu

detektieren, ist für weitere Anwendungen, wie z. B. die Bestimmung von

Diffusionskoeffizienten, eine Optimierung erforderlich. Der in Abbildung 4.4-2

gezeigte Peak resultiert aus dem Schiessen einer großen Anzahl an Tropfen mit

einer hohen Konzentration an Redoxspezies. Für potentielle Anwendungen ist es

notwendig, das Detektionslimit des Verfahrens zu bestimmen und die Abhängigkeit

des Stromsignals von der Tropfenzahl und der Position der Elektrode zu

untersuchen.

4.4.2 Abhängigkeit des Peakstroms von der Dispenserposition

Zur Untersuchung des Einflusses des Abstandes zwischen dem Punkt, an dem die

Tropfen in die Lösung treffen, und der aktiven Elektrodenoberfläche wurden analoge

Experimente an verschiedenen Dispenserpositionen durchgeführt. Zunächst wird der

Dispenser so vorpositioniert, dass nach dem Dispensieren der Redoxspezies nur ein

geringer Strompeak auftritt. Nach der Rückkehr des Stroms zur Grundlinie wird die

Position der elektrochemischen Zelle mit Hilfe der Mikrometerschrauben so

geändert, dass die Distanz zwischen dem Punkt, an dem die Tropfen in die Lösung

treffen, und der aktiven Elektrodenoberfläche kleiner wird. Das Dispensieren wird mit

der gleichen Anzahl an Tropfen wiederholt und die Höhe des Peakstroms wird

bestimmt. In nachfolgenden analogen Experimenten wird die Position der

elektrochemischen Zelle in gleichen Abständen (200 µm) weiter entlang der Geraden

geändert, die durch die ersten beiden Messpositionen festgelegt wird. Das bedeutet,

dass in nachfolgenden Experimenten zunächst eine radiale Annäherung des

Punktes, an dem die Tropfen in die Lösung treffen, an die aktive

Elektrodenoberfläche stattfindet. Nach Erreichen des kurzmöglichsten Abstandes,

erhöht sich in jedem Experiment durch die Änderung der Messpositionen der

Abstand zwischen dem Auftreffpunkt und der Elektrodenoberfläche.


In Abbildung 4.4-3 ist eine Auftragung der Höhe der Peakströme gegen die so

angefahrenen Positionen dargestellt.

Die Höhe des Peakstroms ist stark abhängig vom Abstand zwischen aktiver

Elektrodenoberfläche und dem Punkt, an dem die Tropfen in die Lösung treffen. Je

kürzer der Abstand zwischen diesen beiden Punkten ist, desto höher ist der

Peakstrom. Bei immer größer werdenden Abständen nimmt die Peakhöhe ab, bis bei

sehr großen Abständen die Verdünnung der Redoxspezies vor dem Erreichen der

aktiven Elektrodenoberfläche so hoch ist, dass kein signifikanter Stromanstieg mehr

zu verzeichnen ist.

Das Dispensieren führt zu einer hohen lokalen Konzentration an Redoxspezies an

dem Punkt, an dem die Tropfen in die Lösung treffen. Aufgrund des hohen

Konzentrationsgradienten breitet sich das Konzentrationsprofil in das

Lösungsvolumen aus. Die Durchmischung mit dem Basiselektrolyten des

Lösungsvolumens führt dabei zu einer Abnahme der Konzentration der

Redoxspezies. Somit nimmt die lokale Konzentration mit zunehmender Zeit und

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Distanz [µm]

Peakh

öhe [nA

]

Abbildung 4.4-3 Abhängigkeit des Peakstroms von der Distanz zwischen aktiver Elektroden-oberfläche und Auftreffpunkt der Tropfen in die LösungDer maximale Peakstrom wird beim kleinstmöglichsten Abstand zwischen aktiverElektrodenoberfläche und Auftreffpunkt erreicht, so dass dieser Punkt alsNullpunkt für die Abstandsskala festgelegt wurde.(300 Tropfen 0.5 mM K4[Fe(CN)6]-Lösung, ∅ Elektrode = 0.5 mm, E = 300 mVvs. Ag/AgCl)


zunehmender Distanz vom Zentrum ab. Bei vollständiger Verdünnung wird aufgrund

der Größe des Lösungsvolumens im Vergleich zum Volumen der geschossenen

Tropfen die Konzentration an Redoxspezies überall annähernd gleich null. Daraus

folgt: Je weiter die aktive Elektrodenoberfläche, an der die Redoxspezies umgesetzt

werden können, von dem Punkt entfernt ist, an dem die höchste Konzentration an

Redoxspezies herrschte, desto kleiner wird der resultierende Strompeak. Bei sehr

großen Abständen treten keine Strompeaks mehr auf, da die Verdünnung soweit

fortgeschritten ist, dass das Detektionslimit der amperometrischen Bestimmung

unterschritten wird.

Die aus den Höhen der Peakströme resultierende Kurve in Abbildung 4.4-3 kann

somit als Abbild der elektroaktiven Elektrodenoberfläche gesehen werden. Zieht man

die halbe Peakhöhe des Stromverlaufs in Abbildung 4.4-3 als Maß für die

Elektrodenoberfläche heran, so erhält man einen Wert von 0.65 mm, der gut mit

dem tatsächlichen Durchmesser der aktiven Elektrodenoberfläche von 0.5 mm

korreliert.

Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, dass der Abstand zwischen aktiver

Elektrodenoberfläche und dem Punkt, an dem die Tropfen in die Lösung treffen, und

somit die relative Position des Dispensers zur Elektrodenoberfläche ein essentieller

Parameter für die sensitive amperometrische Detektion von Redoxspezies darstellt.

4.4.3 Abhängigkeit des Peakstroms von der geschossenen Tropfenzahl

Um eine höchstmögliche Sensitivität und eine niedrige Nachweisgrenze bei der

amperometrischen Detektion der geschossenen Redoxspezies zu erreichen, ist eine

Optimierung der relativen Positionen von Elektrode und Mikrodispenser nötig. Für die

folgenden Experimente wurde daher die Dispenserposition nach dem im vorherigen

Abschnitt beschriebenen Verfahren so optimiert, dass sich der kürzestmögliche

Abstand zwischen der aktiven Elektrodenoberfläche und dem Punkt, an dem die

Tropfen in die Lösung treffen, ergibt. Unter Beibehaltung der optimierten Position

wurden Experimente zur Ermittlung des Detektionslimit und zur Untersuchung der

Abhängigkeit des Stromsignals von der geschossenen Tropfenzahl durchgeführt.

Abbildung 4.4-4 zeigt eine Strom-Zeit-Kurve der Elektrode nach dem Dispensieren

von unterschiedlichen Tropfenzahlen.


Wie erwartet nimmt mit steigender Zahl an Tropfen in jedem Experiment auch die

Peakhöhe der Stromantwort zu, wobei Wiederholungsexperimente eine gute

Reproduzierbarkeit zeigen. Selbst ein einzelner geschossener Tropfen kann

detektiert werden. Mit steigender Tropfenzahl nähert sich der Strompeak einem

Grenzwert an; die Peakspitze verbreitert sich zu einem Plateau, so dass der

gesamte Peak an Breite gewinnt.

Tropfenzahl Peakhöhe #1[nA]

Peakhöhe #2[nA]

Peakhöhe #3[nA]

gemitteltePeakhöhe [nA]

1 14 14 14 142 22 24 24 234 43 41 46 448 70 77 77 7516 140 140 133 13832 216 205 207 20964 280 270 255 270128 294 274 270 279256 294 270 270 278

Abbildung 4.4-4 amperometrisches Signal nach dem Schiessen von unterschiedlichenTropfenzahlen einer 0.5 mM K4[Fe(CN)6]-Lösung(Schreiberauftragung: Strom gegen Zeit, ∅ Elektrode = 0.5 mm, E = 300 mVvs. Ag/AgCl)


Trägt man die Höhe der Strompeaks gegen die Anzahl an geschossenen Tropfen

auf, so erhält man die in Abbildung 4.4-5 dargestellte Kurve.

Bei kleinen Tropfenzahlen steigen die Stromhöhen linear mit der Tropfenzahl an, bei

hohen Tropfenzahlen strebt der Peakstrom jedoch einem Grenzwert entgegen. Dies

ist dadurch zu erklären, dass bei hohen Tropfenzahlen eine derart große Menge an

Redoxspezies in die Nähe der Elektrode geschossen wird, dass kurzzeitig lokal die

gleiche Konzentration an Redoxspezies herrscht, wie im Dispenser. Liegt nach dem

Dispensieren einer bestimmten Tropfenzahl vor der Elektrodenoberfläche diese

Konzentration vor, so führt eine Erhöhung der Tropfenzahl nicht zu einer Erhöhung

des Peakstroms. Die zusätzliche zugefügte Menge an Redoxspezies erhöht nicht die

lokale Konzentration, sondern führt lediglich dazu, dass sich das Gebiet mit der

maximal möglichen Konzentration ausweitet. Dadurch benötigt die Verdünnung

durch Diffusion mehr Zeit, so dass die hohe lokale Konzentration länger erhalten

bleibt, was zu einer Verbreiterung des Strompeaks führt.

Die Peakhöhe nach dem Schiessen eines Tropfens beträgt 14 nA. Setzt man für das

Volumen eines Tropfens einen Wert von 100 pL voraus, so wurden hier absolute

Mengen von weniger als 50 fmol detektiert. Mit aktueller Potentiostat-Technik lassen

sich leicht Ströme bis in den pA-Bereich messen, so dass das Detektionslimit in

0 25 50 75 100 1250

50

100

150

200

250

300P

eakh

öhe

[nA

]

Tropfenzahl

Abbildung 4.4-5 Abhängigkeit des Peakstroms von der Anzahl der geschossenen Tropfen(Messwerte aus Abbildung 4.4-4)


diesem Experiment bei weitem noch nicht erreicht wurde. Da die Tropfenzahl nicht

kleiner als eins werden kann, kann als weiterer Parameter die Konzentration der

Redoxspezies, mit der der Dispenser befüllt wird, gesenkt werden. Setzt man einer

Verbesserung um einen Faktor von mindestens 100 voraus, lassen sich absolute

Stoffmengen im unteren femtomolaren Bereich detektieren.

4.4.4 Abhängigkeit des zeitlichen Auftretens der Strompeaks von derDispenserposition

Im vorherigen Kapitel wurde bereits die Abhängigkeit der Höhe des Strompeaks vom

Abstand zwischen dem Punkt, an dem die Tropfen in die Lösung treffen, und der

aktiven Elektrodenoberfläche untersucht. Im Folgenden soll nun auf die Abhängigkeit

des zeitlichen Auftretens des Strompeaks von der Dispenserposition eingegangen

werden. Wiederholt man das Schiessen von gleichen Mengen an Redoxspezies an

verschiedenen relativen Positionen von Elektrode und Dispenser, so lässt sich nicht

nur die bereits erläuterte Abhängigkeit des Peakstroms von der Dispenserposition

feststellen, sondern auch das zeitliche Auftreten des Peaks ist mit der

Dispenserposition korreliert. Abbildung 4.4-6 zeigt zwei Strompeaks, die nach dem

Dispensieren von gleichen Mengen an Redoxspezies an verschiedenen

Dispenserpositionen erhalten wurden. Das erste Experiment entspricht einem

geringen Abstand zwischen Auftreffpunkt und aktiver Elektrodenoberfläche; das

zweite wurde nach einer Vergrößerung des Abstandes um 100 µm durchgeführt. Die

beiden rechteckigen Stromanstiege vor jedem Peak wurden beim Starten des

Dispensieren manuell verursacht und legen auf der Zeitskala den Nullpunkt für jedes

Experiment fest.


Durch das Experiment wird zum einen noch einmal die bereits erläuterte

Abhängigkeit der Höhe des Peakstroms vom Abstand deutlich, zum anderen ist zu

erkennen, dass im zweiten Experiment, in dem der Abstand zwischen

Elektrodenoberfläche und Auftreffpunkt der Tropfen in die Lösung vergrößert wurde,

der Strompeak viel breiter ist und das Maximum im zeitlichen Vergleich bezogen auf

den jeweiligen Zeitpunkt des Schiessens viel später auftritt. Im ersten Experiment

vergehen 0.9 s vom Zeitpunkt des Dispensierens bis zum Erreichen des

Strommaximums, nach Vergrößerung des Abstandes im zweiten Experiment

vergrößert sich diese Zeitspanne auf 2.3 s.

Zur vereinfachten sprachlichen Darstellung werden folgende Begriffe definiert:

• Die Zeitspanne, die zwischen dem Dispensieren der Redoxspezies und dem

Erreichen des Strommaximums verstreicht, wird im Folgenden als „Peakzeit“

bezeichnet.

• Der Punkt, an dem die vom Dispenser geschossenen Tropfen in die Lösung

treffen, wird im Folgenden als „Auftreffpunkt“ bezeichnet.

Abbildung 4.4-6 verdeutlicht die starke Abhängigkeit der Peakzeit vom Abstand

zwischen Auftreffpunkt und aktiver Elektrodenoberfläche. In beiden Experimenten ist

Abbildung 4.4-6 zeitaufgelöstes amperometrisches Signal bei verschiedenen Abständenzwischen Elektrodenoberfläche und Auftreffpunkt der Tropfen in die Lösung.Die rechteckigen Stromanstiege entsprechen dem Zeitpunkt des Schiessens.t max1 = 0.9 s , t max2 = 2.3 s(Schreiberauftragung: Strom gegen Zeit, lateraler Verfahrweg zwischen Peak 1und 2 = 100 µm, 10 Tropfen 0.5 mM K4[Fe(CN)6], ∅ Elektrode = 0.5 mm,E = 300 mV vs. Ag/AgCl)


die gleiche, sehr geringe Menge an Redoxspezies geschossen worden. Es wurden

jeweils 10 Tropfen mit einer Frequenz von 50 Hz geschossen, das Dispensieren

dauert somit lediglich 0.2 s. Somit wird in kurzer Zeit eine sehr hohe lokale

Konzentration an Redoxspezies erzeugt. Aufgrund des Konzentrationsgradienten

findet eine diffusionskontrollierte Verdünnung der Redoxspezies in das Volumen der

Lösung statt. Ist die aktive Elektrodenoberfläche weiter von dem Ort der hohen

lokalen Konzentration an Redoxspezies entfernt, so wird mehr Zeit benötigt um die

Strecke durch Diffusion zurückzulegen, so dass das Strommaximum später auftritt.

Durch die größere Distanz wird auch die Verdünnung größer, so dass ein breiterer

Strompeak mit einem niedrigeren Maximum auftritt (siehe Kapitel 4.4.2).

Die Verdünnung der Redoxspezies verläuft unter Diffusionskontrolle und ist somit

direkt mit dem Diffusionskoeffizienten korreliert.

Im Folgenden soll ein Verfahren vorgestellt werden, das es ermöglicht, nur aus den

Peakzeiten und den Abständen zwischen verschiedenen Dispenserpositionen den

Diffusionskoeffizient einer Redoxspezies zu bestimmen. Ähnliche Verfahren wurden

bereits mit Mikrobandelektroden-Arrays durchgeführt, bei denen an einem

Elektrodenfinger eine Spezies generiert wurde und die anderen Elektrodenfinger zur

Detektion dieser Spezies benutzt wurden [280,281]. Diese Verfahren setzen jedoch

eine hohe Reversibilität des heterogenen Elektronentransfers voraus, was bei dem

hier beschriebenen Verfahren nicht zwingend notwendig ist.

4.4.5 Bestimmung von absoluten Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten

Im vorherigen Kapitel wurde zur Auswertung des Strom-Zeit-Signals der Elektrode

ein Schreiber benutzt. Die Peakhöhen und die Peakzeiten wurden mit einem Lineal

ausgemessen. Über die Vorschubgeschwindigkeit des Schreibers und die

Messbereiche des Potentiostaten und des Schreibers konnte auf die tatsächlichen

Peakzeiten und Höhe der Strompeaks zurückgerechnet werden. Weiterhin wurde der

Zeitpunkt des Dispensierens, der den Bezugspunkt für die Bestimmung der Peakzeit

darstellt, durch ein manuell gegebenes Signal in die Messkurve eingefügt, wodurch

ein großes Maß an Ungenauigkeit bei der Bestimmung der Peakzeiten resultiert.


Für eine mathematische Betrachtung des Sachverhaltes müssen sowohl der

Auftreffpunkt als auch die Elektrodenoberfläche als Punktquellen betrachtet werden,

was für die zur Strommessung verwendete große Makroelektrode nicht zulässig ist.

Die entsprechenden Modifikationen des Messaufbaus für eine möglichst exakte

Messung von Strom, Peakzeit und Abstand zwischen Elektrodenoberfläche und

Auftreffpunkt werden im Folgenden erläutert:

• Die Makroelektrode wird durch eine Mikroelektrode mit einem Durchmesser von

25 µm oder 50 µm ersetzt.

• Zur Messung der Stromwerte wird der Schreiber gegen einen Computer mit AD-

Karte ersetzt. Die verwendete Software zur Datenaufnahme gestattet dabei die

Aufnahme von bis zu 1000 Datenpunkten pro Sekunde. Die Messwerte für jedes

Experiment können gespeichert und später mit entsprechenden Programmen

ausgewertet werden.

• Die Datenaufnahmesoftware wird über ein Trigger-Signal mit dem

Funktionsgenerator gekoppelt. Beim Starten des Dispensierens wird ein Trigger-

Signal an den Computer übergeben, welches die Datenaufnahme startet. Das

Dispensieren und die Aufnahme der Stromwerte erfolgen somit zeitgleich, so dass

eine exakte Festlegung des Nullpunktes der Zeitmessung gegeben ist. Zur

Verdeutlichung zeigt Abbildung 4.4-7 ein entsprechendes Flussdiagramm.

Funktionsgenerator

Computer zurDatenaufnahme

Mikrodispenser

startet

Stromsignal

zeitaufgelöstesStromsignal

Dispensieren vonRedoxspezies

Potentiostat(legt kontinuierlich

Potential an Elektrode an)

Abbildung 4.4-7 Flussdiagramm der zeitaufgelösten Stromwertaufnahme


Positioniert man den Dispenser so, dass die Tropfen sehr dicht in der Nähe der

Mikroelektrode in die Lösung treffen, so erhält man wiederum peakförmige Strom-

Zeit-Kurven. Abbildung 4.4-8 zeigt zwei typische Strom-Zeit-Kurven bei

verschiedenen Abständen zwischen aktiver Elektrodenoberfläche und dem

Auftreffpunkt der Tropfen in die Lösung.

Zu Beginn des Experiments, direkt nach dem Dispensieren, ist der Stromwert gleich

null, da sich keine umsetzbare Redoxspezies vor der aktiven Elektrodenoberfläche

befindet. Nach einer kurzen Zeitverzögerung tritt ein starker Stromanstieg auf,

hervorgerufen durch die Oxidation der Redoxspezies an der Elektrode. Diese

Zeitverzögerung entspricht der Zeit, die die Redoxspezies benötigt, um die Distanz

vom Auftreffpunkt bis zur aktiven Elektrodenoberfläche zurückzulegen. Nach

Erreichen des Maximums verringert sich der Strom durch die Verdünnung der

Redoxspezies im Volumen der Lösung. Die unterschiedlichen Kurvenverläufe bei

verschiedenen Abständen wurden bereits im vorherigen Kapitel ausführlich

diskutiert, weswegen hier nicht weiter darauf eingegangen wird. Im Unterschied zu

den bisherigen Experimenten mit einem kontinuierlich aufzeichnenden Schreiber ist

die Zeitachse genau definiert, da über das Trigger-Signal die Datenaufnahme

0 2 4 6 8 10 12 140

2

4

6

8

10

i [n

A]

t [s]

Abbildung 4.4-8 Strom-Zeit Kurven einer Mikroelektrode nach dem Dispensieren von 10 Tropfeneiner 20 mM K4[Fe(CN)6]-LösungDie rote Kurve entspricht einem kurzen Abstand zwischen Elektrode, bei derblauen Kurve wurde die Distanz um 100 µm erhöht.(∅ Elektrode = 50 µm, E = 500 mV vs. Ag/AgCl)


gestartet wird, und so der Zeitnullpunkt durch den Zeitpunkt des Schiessens

festgelegt wird.

Zur Bestimmung des Diffusionskoeffizienten aus experimentellen Daten ist es

notwendig, die Zeitspanne zu kennen, die die Redoxspezies benötigt, um eine genau

bekannte Distanz zurückzulegen. Die Zeit, die in dem obigen Experiment gemessen

wird, entspricht der Zeit, die die Redoxspezies benötigt, um vom Auftreffpunkt bis zur

Elektrodenoberfläche vorzudringen. Um aus einem dieser Experimente den

Diffusionskoeffizient bestimmen zu können, muss man die zurückgelegte Distanz der

Redoxspezies, also den tatsächlichen Abstand zwischen Auftreffpunkt und aktiver

Elektrodenoberfläche kennen. Die Ermittlung dieser Distanz ist aber ohne weiteres

nicht möglich. Zur Umgehung dieses Problems schießt man gleiche Mengen an

Redoxspezies an definierten Positionen. Aus den resultierenden Peakzeiten und

dem bekannten Abstand zwischen den Positionen kann der Diffusionskoeffizient

bestimmt werden.

Trägt man in einem Diagramm die Peakzeiten nach dem Dispensieren immer

gleicher Mengen an Redoxspezies gegen die jeweilige Distanz zwischen

nachfolgenden Dispenserpositionen auf, so lässt sich die aktive

Elektrodenoberfläche der Mikroelektrode visualisieren. Zunächst wird eine grobe

Vorpositionierung vorgenommen, so dass sich der Auftreffpunkt bereits in der Nähe

der aktiven Elektrodenoberfläche befindet. Anschließend wird die Position der

Dispensers in 100 µm Schritten so verändert, dass sich ein rechtwinkliges Gitter von

400 µm x 500 µm ergibt, in dem sich die aktive Elektrodenoberfläche befindet. An

jeder Gitterposition werden 10 Tropfen Redoxspezies geschossen und die Peakzeit,

die bis zum Erreichen des Strompeaks benötigt wird, ermittelt. In Abbildung 4.4-9

sind die Peakzeiten gegen die Gitterposition aufgetragen.


Dunkle Bereiche entsprechen kurzen Peakzeiten und hellere Bereich entsprechen

längeren Peakzeiten. Der schwarze Bereich, mit einem Durchmesser von etwa

100 µm, stellt den kurzmöglichsten Abstand zwischen Auftreffpunkt und

elektroaktiver Oberfläche dar. Berücksichtigt man den Einfluss der

Flüssigkeitsschicht über der Mikroelektrode, die relative groben Gitterabstände von

100 µm und die Tatsache, dass der Auftreffpunkt keine perfekte Punktquelle

darstellt, so ist die so bestimmte Größe der aktiven Oberfläche der Mikroelektrode

von 100 µm in guter Übereinstimmung mit dem tatsächlichen Durchmesser von

50 µm.

Mit Hilfe dieser Messdaten ist es möglich, ohne Kenntnis der Größe der aktiven

Elektrodenoberfläche und der Konzentration der Redoxspezies, den

Diffusionskoeffizienten der Redoxspezies, hier [FeII(CN)6]4-, zu bestimmen. Dazu

müssen folgende Annahmen gemacht werden:

1. Das Quadrat im Gitter zwischen 100 µm < x < 200 µm und 200 µm < y < 300 µm,

das der Fläche der aktiven Elektrodenoberfläche entspricht (siehe Abbildung 4.4-

9) wird als Nullpunkt für die Bestimmung von Abständen festgelegt.

Abbildung 4.4-9 Auftragung der Peakzeiten gegen die DispenserpositionDie Distanz zwischen zwei Gitterpunkten beträgt 100 µm. Dunkle Bereicheentsprechen kurzen Peakzeiten und helle Bereiche langen Peakzeiten.(10 Tropfen 20 mM K4[Fe(CN)6]-Lösung, ∅ Elektrode = 50 µm, E = 500 mV vs.Ag/AgCl)


2. Die radial vom Null-Quadranten gemessene Distanz zwischen zwei

Auftreffpunkten ist gleich dem Diffusionsweg, den die Redoxspezies zwischen

beiden Auftreffpunkten zurücklegt. Diese Näherung ist essentiell, da die Dicke

der Flüssigkeitsschicht über der Mikroelektrode nicht bekannt ist, und so eine

exakte Bestimmung des Diffusionsweges unmöglich ist.

3. Der Auftreffpunkt und die aktive Elektrodenoberfläche können als Punktquelle

bzw. Punktkollektor betrachtet werden.

4. Konvektive Effekte können vernachlässigt werden.

5. Die Einstein-Smoluchowsky Gleichung [282],

Dt2d = (Gleichung 4.4.-1)

die den Zusammenhang zwischen Diffusionsweg d und Diffusionszeit t für eine

Dimension beschreibt, ist gültig.

Die Distanz zwischen einem ersten Auftreffpunkt und der aktiven

Elektrodenoberfläche ist x. Die Redoxspezies benötigt die dem Strommaximum

entsprechende Zeit t1, um die aktive Elektrodenoberfläche zu erreichen. Die Distanz

zwischen einem zweiten Auftreffpunkt, der auf der radialen Geraden liegt, die durch

den Nullpunkt und dem ersten Auftreffpunkt festgelegt ist, und der aktiven

Elektrodenoberfläche ist d+x. Nach dem Dispensieren der Redoxspezies erhält man

einen zweiten Strompeak bei einer Zeit t2, welche aufgrund der größeren Distanz

größer ist als die Zeit t1. Die Distanz x ist nicht bekannt, jedoch kann die Distanz d

zwischen dem ersten und dem zweiten Auftreffpunkt exakt aus dem Gitter bestimmt

werden. Unter Berücksichtigung der oben gemachten Annahmen können folgende

Terme aus der Einstein-Smoluchowsky-Gleichung abgeleitet werden:

1

2

2t

xD = (Gleichung 4.4-2)

und

2

2

2t

d)(xD

+= (Gleichung 4.4-3).

Gleichung 4.4-2 und 4.4-3 können kombiniert und das entstehende

Gleichungssystem gelöst werden, so dass man eine Gleichung für den

Diffusionskoeffizienten erhält.


2

−−

−−

−−=

)t2(t

d

)t2(t

2td

)t2(t

2tdD

21

22

21

1

21

1 (Gleichung 4.4.-4)

Tabelle 4.4-1 zeigt die aus verschiedenen Gitterpunkten berechneten Werte für den

Diffusionskoeffizient für Hexacyanoferrat(II)

Der Mittelwert von 5.38 ± 0.58 10-6 cm2 s-1 stimmt gut mit den in der Literatur

beschriebenen Werten überein. Stackelberg et al. [283] bestimmten für

Hexacyanoferrat(II) in 0.1 M KCl einen Wert von 6.50 10-6 cm2 s-1.

Ein genauerer Blick in die Literatur zeigt, dass die veröffentlichten Werte für den

Diffusionskoeffizienten für die gleiche Redoxspezies zum Teil weit voneinander

abweichen. Je nach Bestimmungsmethode und Auswertealgorithmus findet man

Werte für den Diffusionskoeffizienten von Hexacyanoferrat(II) in 1 M KCl von

5.19 10-6 cm2 s-1 [284] bis 7.98 10-6 cm2 s-1 [285].

Die Abweichung des ermittelten Wertes des Diffusionskoeffizienten von

Hexacyanoferrat(II) von den Literaturwerten lässt sich durch die oben genannten

Annahmen erklären. Es wird angenommen, dass der Diffusionsweg der

Redoxspezies gleich dem Verfahrweg der elektrochemischen Zelle ist. Der

tatsächliche Diffusionsweg wird jedoch durch das rechtwinklige Dreieck aus

Auftreffpunkt, aktiver Elektrodenoberfläche und Dicke der Flüssigkeitsschicht über

Auftreffpunkt 1 Auftreffpunkt 2 d [µm] D [10-6 cm2 s-1]Gitter-

koordinatet1 [s] Gitter-

koordinatet2 [s]

100,100 1.33 100,0 4.40 100 4.73

200,100 1.05 200,0 4.08 100 5.39300,100 1.90 400,0 8.64 141 5.33300,200 1.38 400,100 4.13 100 4.87300,300 1.13 400,300 2.95 100 6.47300,400 1.85 400,500 7.5 141 5.92200,400 1.09 200,500 4.54 100 4.96

Tabelle 4.4-1 berechnete Diffusionskoeffizienten von Kaliumhexacyanoferrat(II) in 0.1 MKCl aus den Peakzeiten und Abständen verschiedener Gitterpunkte(vgl. Abbildung 4.4-9)


der Mikroelektrode bestimmt. Somit wird die Distanz d, die für die Berechnung des

Diffusionskoeffizienten benutzt wird, zu klein abgeschätzt. Da in Gleichung 4.4-4,

über die der Diffusionskoeffizient berechnet wird, die Distanz d nur im Nenner

vorkommt, tritt bei der Bestimmung des Diffusionskoeffizienten eine systematische

Abweichung in Richtung zu niedrigerer Werte auf.

Konvektive Effekte hingegen, die in diesem Ansatz nicht berücksichtigt werden,

resultieren in einer positiven Abweichung. Konvektion wird hauptsächlich durch das

Auftreffen der Tropfen in die Lösung verursacht. Da die Zeitspanne zwischen dem

Dispensieren der Tropfen und der Detektion an der Mikroelektrode aber relativ lang

ist, spielt die durch das Auftreffen der Tropfen in die Lösung verursachten

konvektiven Effekte eine vernachlässigbare Rolle.

4.4.6 Bestimmung von relativen Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten durch Kalibrierung mit einer zweiten Redoxspezies

Um diese Limitierungen zu überwinden wurde eine zweite Redoxspezies zur

Kalibrierung benutzt. Der Mikrodispenser wird dazu mit einer Lösung, die beide

Redoxspezies enthält, befüllt. Als erstes wurde eine Mischung aus

Hexacyanoferrat(II) und Ferrocencarbonsäure (Fc-COOH) verwendet. Legt man an

die Mikroelektrode ein Potential von 500 mV an, so werden beide Redoxspezies

unter Diffusionskontrolle oxidiert. Falls die Differenz zwischen den

Diffusionskoeffizienten beider Redoxspezies groß genug ist, sollten durch die

unterschiedlichen Diffusionszeiten zwei Peaks in der Strom-gegen-Zeit-Kurve

auftreten. In der Strom-Zeit-Kurve konnte jedoch nur eine Peakverbreiterung

beobachtet werden, aus der die Peaks nicht separiert werden können, so dass eine

Diffusionskoeffizientenbestimmung nicht möglich war.

Um dieses Problem zu umgehen, wurde eine zweite Redoxspezies benutzt, welche

im Potentialbereich, in dem die erste Redoxspezies oxidiert wird, keine

elektrochemische Umsetzung zeigt. Weiterhin müssen beide Redoxspezies im

gleichen Leitsalzelektrolyten stabil vorliegen, ohne sich gegeneinander zu

beeinflussen. Eine Mischung aus Ferrocencarbonsäure (FC-COOH) und Ruthenium-

hexamin ([Ru(NH3)6]Cl3) in 0.1 M KCl erfüllt diese Bedingungen.


Der Dispenser wird mit einer Lösung, die 10 mM [Ru(NH3)6]3+ und 10 mM Fc-COOH

enthält befüllt und der Aufbau wird wie bereits beschrieben vervollständigt. Im

Gegensatz zu den Experimenten, bei denen nur eine Redoxspezies geschossen

wurde, sind für jeden Punkt des Gitters zwei Messungen bei verschiedenen

Potentialen notwendig. Im ersten Experiment wird die Mikroelektrode auf 500 mV

polarisiert, so dass Fc-COOH diffusionskontrolliert an dieser oxidiert wird. Eine

genau bekannte Zahl an Tropfen wird geschossen und die resultierende Strom-Zeit-

Kurve aufgenommen. Anschließend wird zur diffusionskontrollierten Reduktion von

[Ru(NH3)6]3+ zu [Ru(NH3)6]

2+ die Mikroelektrode auf -300 mV polarisiert, die gleiche

Anzahl an Tropfen nochmals geschossen und die Strom-Zeit-Kurve aufgenommen.

Die Position des Mikrodispensers wird verändert und analoge Experimente werden

an den anderen Gitterpunkten durchgeführt.

In Abbildung 4.4-10 ist ein Beispiel für eine Strom-Zeit-Kurve von Fc-COOH und

[Ru(NH3)6]3+ gezeigt. In beide Experimenten wurden 5 Tropfen Fc-COOH/

[Ru(NH3)6]3+-Lösung an derselben Position geschossen. Die Stromwerte sind auf

den jeweiligen Peakstrom normiert.

0 1 2 3 4 5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

i (n

orm

iert

)

t [s]

Abbildung 4.4-10 normierte Strom-Zeit-Kurven nach dem Dispensieren von jeweils 5 Tropfeneiner Fc-COOH / [Ru(NH3)6]

3+-Lösung. Die obere Kurve wurde bei 500 mVerhalten; bei der unteren Kurve wurde das Potential auf -300 mV justiert. Dieobere Kurve zeigt somit die Oxidation von Fc-COOH, während die untere derReduktion von [Ru(NH3)6]

3+ entspricht.(∅ Elektrode = 25 µm, c( Fc-COOH) = 10 mM, c([Ru(NH3)6]

3+) = 10 mM)


Die Strom-Zeit-Kurve von Fc-COOH hat ein Peakmaximum bei t = 1.33 s, während

das Peakmaximum bei [Ru(NH3)6]3+ bei t = 1.15 s auftritt. Da in beiden Experimenten

alle Systemparameter gleich sind, sind die unterschiedlichen Peakzeiten auf die

unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten von Fc-COOH und [Ru(NH3)6]3+

zurückzuführen. Wiederholt man derartige Experimente in verschiedenen Abständen

zur aktiven Elektrodenoberfläche und trägt die Peakzeiten von [Ru(NH3)6]3+ gegen

die Peakzeiten von Fc-COOH auf, so erhält man die in Abbildung 4.4-11 gezeigte

schwarze Gerade. Die Steigung von 0.90 entspricht dabei dem Verhältnis der

Diffusionskoeffizienten von Fc-COOH und [Ru(NH3)6]3+, so dass bei Bekanntsein des

Diffusionskoeffizienten einer der Redoxspezies der Diffusionskoeffizient der anderen

Redoxspezies durch Multiplizieren bzw. Dividieren berechnet werden kann.

0 1 2 3 4 5 6 70

1

2

3

4

5

6

t P

eak

(Ru

-hexa

min

) [s

]

t Peak (Fc-COOH) [s]

Abbildung 4.4-11 Auftragung der Peakzeiten von [Ru(NH3)6]3+ gegen die Peakzeiten von

Fc-COOH an verschiedenen Dispenserpositionenschwarze Quadrate: c([Ru(NH3)6]

3+) = 10 mM , c(Fc-COOH) = 10 mMlineare Regression: Steigung = 0.90, Achsenabschnitt = 0.03, r = 0.995roten Kreise: c([Ru(NH3)6]

3+) = 5 mM , c(Fc-COOH) = 10 mMlineare Regression: Steigung = 0.88, Achsenabschnitt = 0.04, r = 0.986(∅ Elektrode = 25 µm, Tropfenzahl = 5, Messpotentiale: [Ru(NH3)6]

3+ = -300 mV,Fc-COOH = 500 mV vs. Ag/AgCl)


Die rote Gerade in Abbildung 4.4-11 entstammt einer Messreihe, bei der die

Konzentration der Lösung an [Ru(NH3)6]3+ im Dispenser um die Hälfte reduziert

wurde, während die Konzentration von Fc-COOH nicht verändert wurde. Trotz der

Verminderung der Konzentration an [Ru(NH3)6]3+ ergibt sich annähernd die gleiche

Regressionsgerade. Somit konnte gezeigt werden, dass die Peakzeiten, wie

erwartet, von der Konzentration der Redoxspezies im Dispenser unabhängig sind.

Die Substitution von Fc-COOH gegen ein Ferrocenderivat mit einer höheren molaren

Masse und einem entsprechend niedrigerem Diffusionskoeffizienten sollte in einer

verminderten Steigung in der Korrelationskurve gegen [Ru(NH3)6]3+ resultieren.

Im Rahmen einer Kooperation wurden vom Lehrstuhl für Anorganische Chemie der

Universität Bielefeld (AG Prof. Jutzi) zwei wasserlösliche Ferrocenderivate zur

Verfügung gestellt [286]. In Abbildung 4.4-12 sind die Strukturen der

Ferrocenderivate gezeigt.

Ferrocenderivat 1

N+

N+

N+

OH

FeFe

OHN

+

N+

Fe

Ferrocenderivat 2

Abbildung 4.4-12 Strukturen der Ferrocenderivate 1 und 2Die Gegenionen Br- sind nicht dargestelltFerrocenderivat 1: [1,3-Bis(N,N-dimethyl-N-(2-ferrocenylethyl)ammonium-methyl)-5-(N,N-dimethyl-N-(2-hydroxyethyl)ammoniummethyl]benzoltribromidFerrocenderivat 2: [1-(N,N-dimethyl-N-(2-ferrocenylethyl)ammoniummethyl)-4-(N,N-dimethyl-N-(2-hydroxyethyl) ammoniummethyl)]benzoldibromid


Sowohl Ferrocenderivat 1 als auch Ferrocenderivat 2 liegen in Gegenwart

[Ru(NH3)6]3+ in 0.1 M KCl stabil in der reduzierten Form vor. Beide Ferrocenderivate

müssen mit Dimethylsulfoxid (DMSO) angelöst werden, können aber anschließend

mit der wässrigen KCl-Lösung verdünnt werden.

Ferrocenderivat 1 besitzt zwei Ferrocengruppen und ist vergleichsweise größer als

Fc-COOH, während Ferrocenderivat 2 und Fc-COOH von vergleichbarer Größe sind.

Führt man analoge Experiment mit [Ru(NH3)6]3+ und Ferrocenderivat 2 bzw.

[Ru(NH3)6]3+ und Ferrocenderivat 1 durch, so sollte man für Ferrocenderivat 2 eine

ähnliche Peakzeit wie für Fc-COOH erwarten, während man aufgrund der

komplexeren Molekülstruktur im Falle von Ferrocenderivat 1 eine längere Peakzeit

erwarten kann.

Führt man Messreihen an verschiedenen Dispenserpositionen mit Lösungen von

Ferrocenderivat 1 und [Ru(NH3)6]3+ bzw. Ferrocenderivat 2 und [Ru(NH3)6]

3+ durch

und trägt die Peakzeiten von [Ru(NH3)6]3+ gegen die Peakzeiten des jeweiligen

Ferrocenderivats auf, so erhält man die in Abbildung 4.4-13 gezeigten Geraden.

0 1 2 3 4 50

1

2

3

4

5

Fc-Derivat 1 Fc-Derivat 2

t P

eak

(R

u-h

exa

min

) [s

]

t Peak

(Fc-Derivat 1 bzw. 2) [s]

Abbildung 4.4-13 Auftragung der Peakzeiten von [Ru(NH3)6]3+ gegen die Peakzeiten von

Fc-Derivat 1 und von [Ru(NH3)6]3+ gegen Fc-Derivat 2

blaue Diamanten: c([Ru(NH3)6]3+) = 5.3 mM , c(Fc-Derivat 1) = 5.8 mM

lineare Regression: Steigung = 0.63, Achsenabschnitt = 0.13, r = 0.990grüne Dreiecke: c([Ru(NH3)6]

3+) = 6.1 mM , c(Fc-Derivat 2) = 6.2 mMlineare Regression: Steigung = 0.87, Achsenabschnitt = -0.05, r = 0.980(∅ Elektrode = 25 µm, Tropfenzahl = 5, Messpotentiale: [Ru(NH3)6]

3+ = -300 mV,Fc-Derivate = 500 mV)


Wie erwartet ist für Ferrocenderivat 2, das eine geringfügig komplexere

Molekülstruktur wie Fc-COOH besitzt, mit 0.87 eine ähnliche Geradensteigung wie

für Fc-COOH (Steigung = 0.90) zu beobachten. Ferrocenderivat 1, das eine

wesentlich komplexere Molekülstruktur als Fc-COOH hat, zeigt mit 0.63 eine

wesentlich geringere Geradensteigung. Die ermittelten Diffusionskoeffizienten der

beiden Ferrocenderivate und Fc-COOH relativ zu [Ru(NH3)6]3+ stehen somit in

Einklang mit der Komplexität ihrer Molekülstrukturen. Ferrocenderivat 1 mit der

komplexesten Molekülstruktur hat den niedrigsten relativen Diffusionskoeffizienten,

während Fc-COOH mit der einfachsten Molekülstruktur den höchsten relativen

Diffusionskoeffizient besitzt.

Somit konnte demonstriert werden, dass es möglich ist, ohne Kenntnis von

Parametern, wie Größe der aktiven Elektrodenoberfläche, Konzentration der

Redoxspezies oder Zahl der ausgetauschten Elektronen, die relativen

Diffusionskoeffizienten verschiedener Ferrocenderivate relativ zu [Ru(NH3)6]3+ zu

bestimmen; allerdings unter der Voraussetzung, dass sich unabhängig voneinander

die Diffusionszeiten der beiden Redoxspezies, die verschiedene Oxidationszustände

und Formalpotentiale haben, bestimmen lassen.

Es sollte weiterhin möglich sein, die relativen Diffusionskoeffizienten zweier

Redoxspezies zu bestimmen, die ähnliche Formalpotentiale besitzen, sich aber

signifikant in ihrem Diffusionskoeffizient unterscheiden. Hierzu muss die

Mikroelektrode auf ein Potential polarisiert werden, das hoch genug ist, um beide

Redoxspezies unter Diffusionskontrolle umzusetzen. Falls die Differenz der

Diffusionskoeffizienten beider Redoxspezies groß genug ist, sollte die

entsprechende Strom-Zeit-Kurve zwei einzelne Peaks oder eine Peakaufspaltung mit

zwei detektierbaren Maxima zeigen.

Da sich die relativen Diffusionskoeffizienten von Ferrocenderivat 1 und Fc-COOH

hinreichend unterscheiden, kann man beim Dispensieren einer Lösung, die eine

Mischung dieser beiden Substanzen enthält, zumindest eine Aufspaltung des

resultierenden Strompeaks erwarten.

Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden Dispensier-Experimente mit einer

Mischung aus Fc-COOH und Ferrocenderivat 1 bei einem Mikroelektroden-Potential

von 500 mV durchgeführt. Bei den meisten der untersuchten Kombinationen der

Systemparameter, wie Abstand zwischen Auftreffpunkt und aktiver


Elektrodenoberfläche, Zahl der geschossenen Tropfen und Dicke der

Elektrolytschicht über der Mikroelektrode konnte keine Peakseparation beobachtet

werden. Bei kleinen Distanzen zwischen Auftreffpunkt und Elektrodenoberfläche sind

die Transitzeiten für beide Redoxspezies kurz. Dementsprechend sind die

Unterschiede zwischen den jeweiligen Transitzeiten so klein, dass sie nicht aufgelöst

werden können und eine Peakverbreiterung zu beobachten ist. Wenn die Abstände

zwischen Auftreffpunkt und Elektrodenoberfläche groß sind, ist durch die

Verbreiterung der Strompeaks eine klare Peakidentifizierung nur sehr schwer

möglich.

Trotzdem kann mit einem optimierten Satz an Parametern eine Peakseparation

beobachtet werden. Ein entsprechende Strom-Zeit-Kurve ist in Abbildung 4.4-14

gezeigt.

Es ist eine Aufspaltung des Strompeaks mit zwei Maxima bei t = 0.92 s und

t = 1.40 s ist zu beobachten. Aufgrund der kleineren Molekülstruktur stellt Fc-COOH

den ersten Peak dar und Ferrocenderivat 1 den zweiten Peak dar. Die Höhe des

ersten Strommaximum beträgt 16.1 nA, der zweite Peak hat einen Maximalstrom von

17.1 nA. Obwohl die Konzentration von Ferrocenderivat 1 nur etwa halb so groß wie

0 1 2 3 4 50.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

i [n

A]

t [s]

Abbildung 4.4-14 Strom-Zeit Kurve einer 25 µm Mikroelektrode (E = 500 mV) nach demDispensieren von 90 Tropfen einer Lösung aus Fc-COOH (c = 10 mM) undFerrocenderivat 1 (c = 5.2 mM)


die Konzentration von Fc-COOH ist, ist der Strompeak dennoch von vergleichbarer

Höhe, da Ferrocenderivat 1 zwei oxidierbare Ferrocengruppen pro Molekül besitzt.

Wiederholt man analoge Dispensier-Experimente, so dass Doppelpeaks erhalten

werden, und trägt die Zeiten des ersten Peaks gegen die des zweiten Peaks auf, so

erhält man wiederum eine Gerade mit einer Steigung von 1.37 und einem

Achsenabschnitt von 0.04 (r = 0.998).

Um die Selbstkonsistenz des vorgestellten Verfahrens zur Bestimmung von

Diffusionskoeffizienten zu zeigen, können die relativen Werte der

Diffusionskoeffizienten von Fc-COOH gegen [Ru(NH3)6]3+ und von Ferrocenderivat 1

gegen [Ru(NH3)6]3+ mit den relativen Werten von Fc-COOH gegen Ferrocenderivat 1

verglichen werden.

89.0))D(Ru(NH

COOH)D(Fc363

=−+

63.0))D(Ru(NH

)1 Derivat-D(Fc363

=+ 41.163.0

89.0

)1 Derivat-D(Fc

COOH)-D(Fc ==⇒

Der so berechnete Wert des Quotienten der Diffusionskoeffizienten von Fc-COOH

und Ferrocenderivat 1 von 1.41 ist sehr dicht am experimentell bestimmten Wert von

1.37. Diese gute Übereinstimmung demonstriert die Selbstkonsistenz und

Universalität der vorgestellten Methode zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten.

Da die Ferrocenderivate 1 und 2 neu synthetisiert wurden und bisher nicht in der

Literatur bekannt sind, wurden die Diffusionskoeffizienten mit einer alternativen, in

der Literatur beschriebenen Methode bestimmt. Hierfür wurde eine Methode gewählt,

die unabhängig von der Konzentration der Redoxspezies ist, um eventuelle

Konzentrationsfehler durch nicht vollständige Aufreinigung auszuschließen.

Weiterhin können zur Evaluierung des hier beschriebenen Verfahrens die ermittelten

Diffusionskoeffizienten mit einer etablierten Methode verglichen werden.


4.4.7 Bestimmung von Diffusionskoeffizienten mit Mikroelektroden inchronoamperometrischen Experimenten

Mikroelektroden haben sich für die Bestimmung von Diffusionskoeffizienten

elektroaktiver Spezies etabliert. In der Literatur sind eine Vielzahl von Publikationen

zu diesem Thema zu finden [285,287-290]. Bei den meisten Verfahren muss jedoch

die Konzentration der Redoxspezies genau bekannt sein. Da die hier verwendeten

Substanzen neu synthetisiert wurden und hygroskopisch sind, ist eine genaue

Konzentrationsangabe oder Bestimmung schwierig. Aus diesem Grund wurde ein

von Bard et. al. [284] beschriebenes Verfahren zur Bestimmung von

Diffusionskoeffizienten benutzt, das unabhängig von der Konzentration der

Redoxspezies ist. Dazu wird ein chronoamperometrisches Experiment mit

Mikroelektroden mit einem Potentialsprung von einem Potential, bei dem keine

Umsetzung der Redoxspezies stattfindet, auf ein Potential, bei dem ein

diffusionskontrollierter Umsatz stattfindet, durchgeführt. In einem zweiten Experiment

wird der zeitunabhängige diffusionskontrolliert fließende Grenzstrom bestimmt, der

sich nach dem Potentialpuls einstellt.

Zur Ermittlung des Diffusionskoeffizienten trägt man in einem Diagramm den auf den

zeitunabhängigen Grenzstrom normierten Strom der Mikroelektrode gegen die

inverse Quadratwurzel der Zeit auf. Man erhält eine Gerade, über deren Steigung b

und dem Radius der aktiven Elektrodenoberfläche r sich der Diffusionskoeffizient der

Redoxspezies nach der folgenden Formel berechnen lässt:

2

2

b16

rD

π= (Gleichung 4.4.-5)

Zur Evaluierung dieses Verfahrens wurden zunächst Experimente mit einer

Redoxspezies mit bekanntem Diffusionskoeffizient durchgeführt. Aufgrund seiner

guten Bekanntheit in der Literatur und seiner guten reversiblen heterogenen

Elektronentransfereigenschaften wurde Kaliumhexacyanoferrat(II) benutzt.


Abbildung 4.4-15 zeigt die Auftragung des normierten Stroms gegen die inverse

Quadratwurzel der Zeit einer Mikroelektrode nach einem Potentialsprung von 0 auf

500 mV vs. Ag/AgCl in einer Lösung von Hexacyanoferrat(II).

Berechnet man aus der Steigung der Geraden anhand von Gleichung 4.4-5 den

Diffusionskoeffizient von Hexacyanoferrat(II) in 0.1 M KCl, so erhält man einen Wert

von 6.49 10-6 cm2 s-1, welcher sehr dicht am oft zitierten Literaturwert von 6.50 10-6

cm2 s-1 von Stackelberg et al. liegt [283].

Nachdem sich dieses Verfahren als geeignet für die exakte Bestimmung von

Diffusionskoeffizienten erwiesen hat, wurden analoge chronoamperometrische

Experimente mit den Ferrocenderivaten 1 und 2 durchgeführt. Die entsprechenden

Auftragungen der normierten Stromwerte gegen die inverse Quadratwurzel der Zeit

sind in Abbildung 4.4-16 dargestellt.

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

1.00

1.02

1.04

1.06

1.08

1.10

1.12

i (n

orm

iert

)

1 / √t

Abbildung 4.4-15 Auftragung der normierten Stromwerte gegen die inverse Quadratwurzel der Zeitim chronoamperometrischen Experiment mit [Fe(CN)6]

4-

lineare Regression: Steigung = 0.087, Achsenabschnitt = 0.980, r = 0.998(∅ Elektrode = 10 µm, Potentialsprung von 0 mV nach 500 mV vs. Ag/AgCl,c(K4[Fe(CN)6]) = 10 mM in 0.1 M KCl)


Die inversen Quadrate der Steigungen der Geraden in Abbildung 4.4-16 sind

proportional zum Diffusionskoeffizienten (vgl. Gleichung 4.4-5). Bildet man den

Quotienten der inversen Quadrate der Steigungen von Ferrocenderivat 1 und 2, so

erhält man einen Wert von 0.733, der dem Verhältnis ihrer Diffusionskoeffizienten

entspricht.

Aus den im vorherigen Abschnitt beschriebenen „time of flight“-Experimenten unter

Nutzung des Mikrodispensers wurden folgende relative Diffusionskoeffizienten

bestimmt:

63.0))D(Ru(NH

)1 Derivat-D(Fc363

=+

87.0))D(Ru(NH

)2 Derivat-D(Fc363

=+ 72.063.0

87.0

)2 Derivat-D(Fc

)1 Derivat-D(Fc ==⇒

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

1.00

1.05

1.10

1.15

Ferrocenderivat 1 Ferrocenderivat 2

i (n

orm

iert

)

1 / √t

Abbildung 4.4-16 Auftragung der normierten Stromwerte gegen die inverse Quadratwurzel der Zeitin chronoamperometrischen Experimentenschwarze Quadrate: Ferrocenderivat 1,lineare Regression: Steigung = 0.132, Achsenabschnitt = 0.967, r = 0.995rote Kreise: Ferrocenderivat 2,lineare Regression: Steigung = 0.113, Achsenabschnitt = 0.973, r = 0.993(∅ Elektrode = 10 µm, Potentialsprung von 0 mV nach 500 mV vs. Ag/AgCl,gleiche Lösungen wie in den Experimenten in Abbildung 4.4-13: c(Fc-Derivat 1)= 5.8 mM, c(Fc-Derivat 2) = 6.2 mM)


Vergleicht man das in den „time of flight“-Experimenten bestimmte Verhältnis der

Diffusionskoeffizienten von 0.72 mit dem in chronoamperometrischen Experimenten

bestimmten Verhältnis von 0.73, so lässt sich eine sehr gute Übereinstimmung

feststellen. Somit konnten die in den time of flight“-Experimenten bestimmten Werte

für die Diffusionskoeffizienten der Ferrocenderivate 1 und 2 durch ein unabhängiges

Verfahren bestätigt werden.

Berechnet man die absoluten Werte der Diffusionskoeffizienten so erhält man für

Ferrocenderivat 1 einen Wert von 2.81 10-6 cm2 s-1 und für Ferrocenderivat 2 einen

Wert von 3.84 10-6 cm2 s-1 in 0.1 M KCl (mit 15 % DMSO-Anteil).

4.5 Schnelle Cyclische Voltammetrie 131

4.5 Schnelle cyclische Voltammetrie

In den bisherigen „time of flight“-Experimenten mit zwei Redoxspezies mussten an

jedem Messpunkt zwei amperometrische Messungen bei unterschiedlichen

Potentialen durchgeführt werden, um unabhängig voneinander die Transitzeit jeder

Redoxspezies zu bestimmen. Trotz einer hohen Reproduzierbarkeit stellen zwei

separate Experimente immer eine recht hohes Fehlerpotential dar. Aus diesem

Grund ist es wünschenswert, beide Transitzeiten in einem Experiment zu ermitteln.

Eine geeignete Möglichkeit hierzu stellt die schnelle cyclische Voltammetrie (Fast

Scan Cyclic Voltammetry) dar. Schnelle cyclische Voltammetrie verfolgt dasselbe

Prinzip wie die konventionelle cyclische Voltammetrie, jedoch mit wesentlich höheren

Vorschubgeschwindigkeiten von mehreren hundert bis mehreren tausend Volt pro

Sekunde. Hierbei treten sehr hohe kapazitive Ströme auf, so dass schnelle cyclische

Voltammetrie nur mit Mikroelektroden sinnvoll durchführbar ist. Im Gegensatz zur

konventionellen cyclischen Voltammetrie werden bei der schnellen cyclischen

Voltammetrie die kapazitiven Stromanteile, d. h. ein schnelles cyclisches

Voltammogramm, das in reiner Leitsalzlösung aufgenommen wird, von der

eigentlichen Messung abgezogen. Aufgrund der hohen Vorschubgeschwindigkeit bei

schneller cyclischer Voltammetrie verändert sich die Form des Voltammogramms der

Mikroelektroden. Die übliche sigmoide Form bei langsamen Vorschub-

geschwindigkeiten geht bei hohen Vorschubgeschwindigkeit in eine Peakform mit

hohen Peakseparationen zwischen Oxidations- und Reduktionswelle über. Bei

langsamen Vorschubgeschwindigkeiten kann die Nachdiffusion schnell genug

erfolgen, so dass sich das typische stationäre hemisphärische Diffusionsfeld

ausbildet. Bei hohen Vorschubgeschwindigkeiten kann sich das hemisphärische

Diffusionsfeld nicht vollständig ausbilden, so dass es wie bei Makroelektroden zu

einer Stromabnahme durch die Limitierung des Massentransfers kommt.

Detaillierte Informationen über schnelle cyclische Voltammetrie finden sich

beispielsweise in [171,291-294].

Prinzipiell kann schnelle cyclische Voltammetrie in den bisher beschriebenen

Messaufbau zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-

Experimenten integriert werden. Das Trigger-Signal, das beim Starten des

Dispensieren der Tropfen durch den Funktionsgenerator gegeben wird, muss an


eine entsprechende Software zum Starten der kontinuierlichen Aufnahme von

schnellen cyclischen Voltammogrammen gegeben werden. Problematisch ist

allerdings die große Menge an Daten, die während einer Messung entsteht und die

verarbeitet, gespeichert, ausgewertet und dargestellt werden muss. Weiterhin

müssen aus der Datenmenge die relevanten Potential-, Strom- und

Zeitinformationen gefiltert werden.

Diese Anforderungen erfüllt bisher keine kommerziell erhältliche Potentiostat-

Software, so dass eine eigene Software zur Datenaufnahme und Auswertung, sowie

zur Ansteuerung des Potentiostaten entwickelt worden ist.

Die zu entwickelnde Software sollte dabei folgende Anforderungen erfüllen:

• Ansteuern des Potentiostaten und Generieren der Potentialrampe

• Möglichkeit zur Aufnahme eines Leer-Voltammogramms in reinem Leitsalz, das

von allen späteren Voltammogrammen subtrahiert wird. (Hintergrund-Korrektur)

• kontinuierliches Aufnehmen schneller cyclischer Voltammogramme nach Start

durch das Trigger-Signal des Dispensers

• simultane Darstellungsmöglichkeit aller relevanten Parameter wie Zeit, Potential

und Strom

• Auswertemöglichkeit des Strom-Zeit-Verlaufs bei einzelnen Potentialwerten

nachfolgender Cyclovoltammogramme

Als Programmiersprache wurde die graphische Programmiersprache „HP VEE 5.0“

unter WINDOWS 98 in Kombination mit der Schnittstellen-Software „Universal Library“

zum Ansteuern der AD/DA-Karte (Computer Boards, PCI-DAS 1602) im Computer

(Intel Pentium III, 600 MHz) benutzt.

Die Software kann in zwei verschiedenen Modi betrieben werden. Zum einen

ermöglicht die Software in Kombination mit einem Funktionsgenerator die komplette

Steuerung eines Potentiostaten und die Aufnahme der entsprechenden Messwerte,

zum anderen kann die Software auch dazu dienen, in Echtzeit die Potential- und

Stromwerte aus fast jedem kommerziell erhältlichen Potentiostat bzw. dessen

Software einzulesen.

Zum Ansteuern von Potentiostaten wird zusätzlich ein programmierbarer

Funktionsgenerator (Hewlett-Packard 33120 A) benutzt, der die Potentialrampe

generiert, die an den Potentiostaten übergeben wird. Da nur Daten in den Computer


eingelesen werden, erhöht sich die Verarbeitungsgeschwindigkeit und ermöglicht

somit hohe Vorschubgeschwindigkeiten. Über die serielle Schnittstelle wird der

Funktionsgenerator so programmiert, dass er die durch den Benutzer im Programm

vorgegebene Rampe an den Potentiostaten ausgibt. Das Starten der

Datenaufnahme des Programms und das Ausgeben der Potentialrampe durch den

Funktionsgenerators erfolgt zeitgleich über ein Trigger-Signal, das die Software an

den Funktionsgenerator gibt; die resultierenden Potential- und Stromwerte des

Potentiostaten werden über die 16-Bit-AD-Karte in den Computer eingelesen.

Alternativ dazu können Potential- und Stromwerte aus kommerziellen Potentiostaten

bzw. deren Software eingelesen werden. Das HP VEE Programm liest dabei nur die

vom Potentiostaten ausgegebenen Potential- und Stromwerte ein. Das Generieren

der Rampe und Einstellen der Parameter wird über den Potentiostaten bzw. dessen

Software vorgenommen. Zeitlich korreliert wird die Datenaufnahme durch ein

Trigger-Signal, das durch den Potentiostaten vor jedem Cyclovoltammogramm

gegeben wird und die Datenaufnahme startet. In der Datenaufnahme-Software

müssen nur die entsprechenden Rampenparameter des Potentiostaten durch den

Benutzer eingegeben werden und der externe Trigger-Eingang aktiviert werden.

In Abbildung 4.5-1 ist das Bedienfeld der entwickelten Software gezeigt.


Im Folgenden werden kurz tabellarisch die wesentlichen Merkmale und

Einstellmöglichkeiten des Programms dargestellt.

Bedien- / Anzeige-Element

Funktion

Rate [Points/s](Datenaufnahmefrequenzder AD-Karte)

legt die Zahl der Punkte pro CV fest(siehe Feld Points / Cycle)

No. of Scans Anzahl der aufzunehmenden VoltammogrammeTime per Scan [s]Overall Time [s]

theoretisch berechnete Zeitdauer für ein CV bzw. für alleCVs

Reader #1 [V]Reader #2 [V]

Verfolgung des zeitlichen Stromverlaufs beiausgewählten Potentialen:Zwei frei wählbare Potentialwerte, bei denen derentsprechende Stromwert in jedem CV ausgelesen,dargestellt und separat gespeichert wird.

Time Factor [s] Zeitfaktor, der die Verzögerung vom Ausgeben des

Abbildung 4.5-1 Bedienoberfläche der Fast Scan CV Software


(nur bei Verwendung desFunktionsgenerators zumGenerieren der Rampevon Bedeutung)

Trigger-Signals an den Funktionsgenerator bis zumendgültigen Start der Datenaufnahme berücksichtigt.

Startpotential [V]Switchpotential [V]Scanrate [V/s]

Start- und Unkehrpunkt der Potentialrampe undVorschubgeschwindigkeitDiese Werte werden bei Benutzung desFunktionsgenerators zum Programmieren der Rampeherangezogen und an den Funktionsgenerator nachdem Aktivieren des „Transmit“-Buttons übertragen. ImFalle der Benutzung als reine Datenaufnahme-Softwaremüssen diese Parameter mit den Parametern desPotentiostaten bzw. dessen Software übereinstimmen.

Time / Cycle [s] Aus den Potentiostat-Einstellungen berechneteZeitdauer für ein CV

Current Range [µA/V] Messbereichseinstellung des PotentiostatenPre Scan TriggerData Acquisition Trigger

Aktivieren bzw. Deaktivieren der externen Trigger-FunktionWenn die Trigger-Funktion aktiviert ist, startet dasProgramm die Datenaufnahme erst, wenn es dasexterne Trigger-Signal erhalten hat.

„Accept“-Button Übernahme aller eingegebenen Werte und Berechnungder entsprechenden Parameter

„Transmit“-Button Übertragung der Rampe an den Funktionsgeneratorüber die serielle Schnittstelle

„Start“-Button Start des Pre Scans bzw. der Messwertaufnahme„Pre Scan“-Button Legt fest, ob ein Pre Scan oder eine Messreihe

durchgeführt wird.Der Pre Scan wird von allen CVs der Messreihesubtrahiert (Hintergrund-Korrektur).

„Pre Scan“-Fenster Das Leer-CV wird zusammen mit der Potentialrampedargestellt. Ist ein stabiles CV erreicht, kann dasHäkchen bei „Pre Scan“ entfernt werden und dieMessreihe gestartet werden.

Subtracted CV Hier wird während der Messung das aktuellehintergrund-korrigierte CV dargestellt.

Single Data Point Reader Die Stromwerte der beiden ausgewählten Potentiale#1 (rot) und #2 (weiß) werden hier während derMessung gegen die entsprechende Nummer desVoltammogramms dargestellt.

Gespeichert werden nach Beendigung der Messung alle Voltammogramme, alle

hintergrund-korrigierten Voltammogramme, sowie die Stromwerte der beiden

ausgewählten Potentiale zusammen mit der entsprechenden Nummer des

Voltammogramms. Die gewünschten Dateinamen können vor Beginn der Messreihe

in die entsprechenden schwarz hinterlegten Felder eingetragen werden.


Zur Weiterverarbeitung und Darstellung der Messdaten wurden zwei weitere

Programme entwickelt:

Da die Dateien, die die vollständigen CVs enthalten, mehrere Megabyte groß sein

können, ist eine Verarbeitung und Darstellung mit üblichen Auswertungsprogrammen

wie ORIGIN oder EXCEL nicht möglich. Aus diesem Grunde wurde ein weiteres

Programm geschrieben, das diese Dateien wieder einliest und jedes gewünschte CV

einzeln darstellen kann. Jedes CV, das von Interesse ist, kann anschließend in eine

separate Datei gespeichert werden.

Mithilfe eines Filter-Programms, das eine Datenreduktion vornimmt, können die

Dateien, die die Messdaten aller CVs enthalten, in ein Standard-Datenformat

konvertiert werden, so dass die graphische Darstellung von Potential, Strom und Zeit

mit einer bereits vorhandenen in der Programmiersprache IDL entwickelten

Software, die für die Darstellung von SECM-Messdaten entwickelt wurde, erfolgen

kann.

4.5.1 Bestimmung relativer Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten mit schneller cyclischer Voltammetrie

Zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten in „time of flight“-Experimenten mit

schneller cyclischer Voltammetrie wurde der gleiche Aufbau, der in Abbildung 4.4-1

gezeigt ist, verwendet, mit dem Unterschied, dass die einschraubbare

Referenzelektrode durch einen chloridisierten Silberdraht als Pseudo-

Referenzelektrode ersetzt wurde. Als Modellsubstanzen wurden [Ru(NH3)6]3+ und ein

mit Ferrocengruppen modifiziertes hochmolekulares Dendrimer, das ebenfalls am

Lehrstuhl für Anorganische Chemie der Universität Bielefeld in der Arbeitsgruppe

von Prof. Jutzi synthetisiert wurde, verwendet. Dargestellt wurde diese Verbindung

aus dem käuflichen erwerbbaren Polypropylenimin-octaamin-Dendrimer (DAB-Am 8,

Generation 2.0) durch reduktive Aminierung mit Ferrocenaldedyd und

anschließender Fällung als Multihydrochlorid [286]. Da diese Substanz sehr

hygroskopisch ist, ist eine Konzentrationsangabe sehr schwierig. [Ru(NH3)6]3+ und

das Ferrocen-Dendrimer wurden sukzessiv in 0.1 M KCl gelöst, so dass im

cyclovoltammetrischen Experiment beide Redoxwellen eine ähnliche Intensität


zeigen. In diesen Experimenten zeigte sich zudem, dass das Ferrocen-Dendrimer

zur Adsorption an der Elektrodenoberfläche neigt.

Trotzdem wurde das hochmolekulare Ferrocen-Dendrimer als zweite Redoxspezies

benutzt, da durch die großen Unterschiede in der Komplexität der Molekülstruktur

von [Ru(NH3)6]3+ und dem Ferrocen-Denrimer in „time of flight“-Experimenten eine

deutliche zeitliche Verschiebung zwischen dem Auftreten der beiden

amperometrischen Signalen zu erwarten ist.

Für die Bestimmung von Diffusionskoeffizienten wurde die Fast Scan-Software im

Datenaufnahme-Modus betrieben. Als Potentiostat wird ein HEKA PG 310 mit der

entsprechenden Software benutzt. Zu Beginn jedes Voltammogramms gibt die

Software des HEKA-Potentiostaten ein Trigger-Signal an die HP VEE Software und

startet so die Datenaufnahme.

Im Standardbetrieb schreibt die Software des HEKA-Potentiostaten nach jedem

Voltammogramm die Messdaten auf die Festplatte, was viel Zeit in Anspruch nimmt

und zu einer ungewollten Zeitverzögerung zwischen den einzelnen

Voltammogrammen führt. Diese Option kann ausgeschaltet werden, da die HP VEE

Software die Daten ebenfalls aufnimmt, diese aber im Hauptspeicher ablegt und erst

nach Beendigung aller Voltammogramme auf Festplatte schreibt, was zu einer

merklichen Geschwindigkeitssteigerung der intermediären Datenverarbeitung führt.

Direkt nach dem Starten einer Serie von 200 Cyclovoltammogrammen im

Potentialbereich zwischen -0.6 V und 0.7 V vs. Ag/AgCl (Pseudo-Referenz) mit einer

Vorschubgeschwindigkeit von 100 V/s wurde mit einer Mikropipette ein 1 µL großer

Tropfen in die Nähe der Mikroelektrode pipettiert.

Als Potentiale, bei denen die Stromwerte in jedem CV ausgelesen werden und

gespeichert werden sollen, wurden -0.2 V und 0.4 V ausgewählt, da diese den

Maxima der Redoxwellen von [Ru(NH3)6]3+ und dem Ferrocen-Dendrimer

entsprechen.

Abbildung 4.5-2 zeigt den resultierenden Stromverlauf bei -0.2 V und 0.4 V

aufgetragen gegen die Nummer des Cyclovoltammogramms.


Wie erwartet tritt die Redoxwelle von [Ru(NH3)6]3+ früher auf als die Redoxwelle des

Ferrocen-Dendrimers. Das zeitlich versetzte Auftreten der Strompeaks ist auf die

unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten von [Ru(NH3)6]3+ und dem Ferrocen-

Dendrimer zurückzuführen und wurde bereits in früheren Abschnitten ausführlich

diskutiert. Nach Erreichen des Peakmaximums sinkt der Stromverlauf bei

[Ru(NH3)6]3+ wieder auf den Grundstrom ab. Zwar fällt der Stromverlauf beim

Ferrocen-Dendrimer nach Erreichen eines Maximums ebenfalls wieder ab, erreicht

jedoch nicht die Grundlinie, sondern bleibt auf einem hohen Stromniveau konstant.

Die hier gezeigten Stromverläufe spiegeln nur den zeitlichen Verlauf der jeweiligen

Oxidationswelle wieder. Aufschlussreicher ist eine Auftragung des gesamten Strom-

gegen Potentialverlaufs über die Zeit, also die Darstellung aller

Cyclovoltammogramme in einem Diagramm. Hierfür ist die gleichzeitige Darstellung

der 3 Koordinaten Potential, Strom und Nummer des CVs notwendig. Dieses

Problem wurde bereits für SECM-Messdaten, die ebenfalls 3 Koordinaten enthalten,

gelöst, so dass nur ein entsprechendes Filterprogramm entwickelt werden musste,

welches das Datenformat des Fast Scan CV-Programms in das SECM-Datenformat

konvertiert. Da durch Hin- und Rückscan bedingt, für jeden Potentialwert zwei

50 100 150 2000.0

0.2

0.4

0.6 -0.2 V 0.4 V

i [µ

A]

Nr. CV

Abbildung 4.5-2 Auftragung des Stromverlaufs bei -0.2 V und 0.4 V gegen die Nummer desVoltammogrammsDie schwarze Kurve bei -0.2 V entspricht der Umsetzung von [Ru(NH3)6]

3+ unddie rote Kurve bei 0.4 V entspricht der Umsetzung des Ferrocen-Dendrimers ander Elektrodenoberfläche(∅ Elektrode = 25 µm, 200 Cyclen, E = -0.6 V - 0.7 V vs. Ag/AgCl,Scangeschwindigkeit = 100 V/s, 1 µL Lösungsgemisch aus [Ru(NH3)6]

3+ undFerrocen-Dendrimer pipettiert)


Stromwerte existieren, werden Hin- und Rückscan voneinander getrennt in zwei

verschiedenen Diagrammen dargestellt.

In Abbildung 4.5-3 ist die zeitliche Entwicklung des Vorwärtsscans in einer

dreidimensionalen Darstellung gezeigt.

Der erste Peak bei -0.2 V entspricht der Redoxwelle von [Ru(NH3)6]3+, die zweite

Redoxwelle bei 0.4 V dem Ferrocen-Dendrimer. Durch diese Abbildung wird deutlich,

dass eine gegenseitige Beeinflussung der Strompeaks stattfindet. [Ru(NH3)6]3+

erreicht zuerst die Elektrodenoberfläche und wird dort umgesetzt. Man erkennt, dass

im Potentialbereich oberhalb des Formalpotentials der Strom nicht auf den

Grundstrom zurückkehrt, sondern sich der Grenzstrom einstellt, der durch das im

Rückscan generierte [Ru(NH3)6]2+ bestimmt wird. Daraus folgt, dass der erste

Stromanstieg in Abbildung 4.5-2 bei 0.4 V nicht auf die Oxidation des Ferrocen-

Dendrimers zurückzuführen ist, sondern lediglich einer Erhöhung des

Hintergrundsignals entspricht. Wenn [Ru(NH3)6]3+ sich vollständig mit dem

Lösungsvolumen verdünnt hat und dadurch keine detektierbare Umsetzung von

[Ru(NH3)6]3+ mehr an der Elektrodenoberfläche stattfindet, so klingt der

Abbildung 4.5-3 Dreidimensionale Darstellung des Vorwärtsscans einer Serie von schnellencyclischen VoltammogrammenAuf der x-Achse sind die Potentialwerte des Halbzyklus aufgetragen, in y-Richtung sind nachfolgende Voltammogramme aufgetragen. Die Stromwertesind in z-Richtung aufgetragen.Experimentelle Parameter: siehe Abbildung 4.5-2


entsprechende Strompeak vollständig ab und das Stromhintergrundsignal im

Potentialbereich zwischen den beiden Redoxwellen kehrt wieder auf seinen

Anfangswert zurück.

Abbildung 4.5-4 zeigt Farb-Darstellungen des Vorwärts- und Rückscans des in

Abbildung 4.5-2 vorgestellten Experiments.

Abbildung 4.5-4 Farb-Darstellung von schnellen cyclischen VoltammogrammenAuf der x-Achse von links nach rechts ist der Potentialbereich eines Halbzyklusaufgetragen. Die linke Abbildung zeigt den Vorwärtsscan, in x-Richtung sindsomit Potentialwerte von -0.6 V bis 0.7 V aufgetragen. Die rechte Abbildungzeigt den Rückscan mit Potentialwerten in x-Richtung von 0.7 V bis -0.6 V. In y-Richtung von unten nach oben sind die nachfolgenden Voltammogrammeaufgetragen; die y-Achse entspricht somit einer Zeitachse. Die Stromhöhe isteiner Farbskala zugeordnet.Experimentelle Parameter: siehe Abbildung 4.5-2

Auch hier wird wiederum deutlich, dass [Ru(NH3)6]3+ vor dem höhermolekularen

Ferrocen-Dendrimer die Elektrodenoberfläche erreicht. Sowohl beim Hin- als auch

beim Rückscan ist die Redoxwelle von [Ru(NH3)6]3+ bereits vollständig abgeklungen,

bevor die Redoxwelle des Ferrocen-Dendrimers ihren Maximalstrom erreicht.

Die Abbildungen verdeutlichen, dass schnelle cyclischer Voltammetrie die

Möglichkeit bietet, Zeit-, Strom- und Potentialinformation simultan in einem

Experiment zu erhalten und so die Basis für die Bestimmung von relativen

Diffusionskoeffizienten in einem „time of flight“-Experiment darstellt.


Zur Bestimmung von relativen Diffusionskoeffizienten müssen, wie bereits erläutert,

die Transitzeiten, d. h. die Zeitspanne, die die Redoxspezies benötigen, um vom

Auftreffpunkt bis zur Elektrodenoberfläche zu gelangen, bekannt sein. In dem bisher

vorgestellten Experiment wurde manuell ein Tropfen Redoxspezies in die Nähe der

Elektrodenoberfläche gebracht, was ausreicht, um qualitative Unterschiede in den

Transitzeiten festzustellen. Mit dieser Methode können jedoch keine absoluten

Transitzeiten ermittelt werden.

Aus diesem Grunde wurde wiederum auf einen Aufbau mit einem integrierten

Mikrodispenser zurückgegriffen. Der Aufbau entspricht dabei dem in Abbildung 4.4-1

erläutertem Prinzip. Der Mikrodispenser wird mit einer Lösung, die ein Gemisch aus

[Ru(NH3)6]3+ und dem Ferrocen-Dendrimer erhält, befüllt. Beim Starten des

Dispensiervorgangs wird ein Trigger-Signal vom Funktionsgenerator des Dispensers

gegeben.

Die Software des HEKA-Potentiostat wird so eingestellt, dass sie erst startet, wenn

sie das Trigger-Signal vom Funktionsgenerator erhält. Anschließend werden

kontinuierlich schnelle cyclische Voltammogramme aufgenommen. Die HP VEE

Software wird, wie bereits beschrieben, über ein Trigger-Signal, das die Software

des HEKA-Potentiostaten vor jedem Voltammogramm gibt, in die Datenaufnahme

eingebunden. Über diese Verknüpfung mit Trigger-Signalen ist der Beginn der

Aufnahme der schnellen cyclischen Voltammogramme zeitlich direkt mit dem

Einbringen der Redoxspezies in die Nähe der Elektrodenoberfläche korreliert.

In Abbildung 4.5-5 sind die mit Hilfe der HP VEE Software aufgenommenen

zeitlichen Verläufe der Stromwerte bei -0.2 V und 0.4 V nach dem Schiessen von

500 Tropfen dargestellt.


Die Peakform des [Ru(NH3)6]3+-Peaks kann trotz einer leichten Aufspaltung, die

durch eventuelle Satellitentropfen zurückzuführen ist, gut ausgewertet werden. Der

Verlauf der Stromkurve des Ferrocen-Dendrimers bereitet jedoch Schwierigkeiten.

Zum einen ist die Kurve sehr breit gezogen und zeigt keinen richtigen Abfall, zum

anderen scheint auch hier eine Aufspaltung vorzuliegen. Aus diesem Grunde

erschien es sinnvoll, einige interessante Voltammogramme aus der Gesamtzahl der

kontinuierlich aufgenommenen Voltammogramme einzeln anzuschauen.

In Abbildung 4.5-6 sind vier ausgewählte Voltammogramme gezeigt.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 40 80 120 160 200 240

Nr. CV

i (b

ei 0

.4 V

) [µ

A]

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

i (b

ei -

0.2

V)

[µA

]

0.4 V

-0.2V

Abbildung 4.5-5 Auftragung des Stromverlaufs bei -0.2 V und 0.4 V gegen die Nummer desVoltammogrammsDie schwarze Kurve bei -0.2 V entspricht der Umsetzung von [Ru(NH3)6]

3+ unddie rote Kurve bei 0.4 V entspricht der Umsetzung des Ferrocen-Dendrimers ander Elektrodenoberfläche(∅ Elektrode = 25 µm, 240 Cyclen, E = -0.6 V - 0.7 V vs. Ag/AgCl,Scangeschwindigkeit = 100 V/s, 500 Tropfen Lösungsgemisch aus [Ru(NH3)6]

3+

und Ferrocen-Dendrimer geschossen)


Das erste Voltammogramm, direkt nach dem Dispensieren aufgenommen, zeigt nur

die Basislinie, d. h. es ist noch keine der beiden Redoxspezies vor der aktiven

Elektrodenoberfläche vorhanden. Voltammogramm #48 zeigt das Maximum der

reversiblen Redoxwelle von [Ru(NH3)6]3+, das aufgrund des höheren

Diffusionskoeffizienten zuerst die Elektrodenoberfläche erreicht hat. Im

Potentialbereich des Ferrocenderivats bei 0.4 V ist keine signifikante Redoxwelle zu

erkennen. In Voltammogramm #65 hat die Höhe der Redoxwelle von [Ru(NH3)6]3+

aufgrund der fortschreitenden Verdünnung abgenommen. Das Ferrocen-Dendrimer

erreicht die Elektrodenoberfläche, so dass eine schwache Redoxwelle im Bereich

um 0.4 V entsteht. In Voltammogramm #200 ist [Ru(NH3)6]3+ vollständig im Volumen

der Lösung verdünnt, so dass die entsprechende Redoxwelle bei -0.2 V nicht mehr

vorhanden ist. Im Potentialbereich des Ferrocen-Dendrimers ist ein starker

Oxidationspeak zu erkennen In nachfolgenden Voltammogramme bleibt dieser

relativ konstant und verliert nur langsam an Intensität. Im Gegensatz zum hohen

Oxidationspeak ist der Reduktionspeak des Ferrocen-Dendrimers nur schwach

ausgeprägt. Die starke Diskrepanz zwischen Oxidations- und Reduktionspeak und

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8 CV #1 CV #48 CV #65 CV #200

i [µ

A]

E vs. Ag/AgCl [V]

Abbildung 4.5-6 ausgewählte Voltammogramme einer Serie von kontinuierlich aufgenommenschnellen Cyclovoltammogrammen nach dem Schiessen einesLösungsgemisches aus [Ru(NH3)6]

3+ und Ferrocen-DendrimerAlle Voltammogramme sind hintergrundkorrigiert.(∅ Elektrode = 25 µm, 240 Cyclen, E = -0.6 V - 0.7 V vs. Ag/AgCl, Scan-geschwindigkeit = 100 V/s, 500 Tropfen Lösungsgemisch aus [Ru(NH3)6]

3+ undFerrocen-Dendrimer geschossen)


das zeitlich konstante Auftreten des Oxidationspeaks deuten stark darauf hin, dass

das Ferrocen-Dendrimer auf der Elektrodenoberfläche adsorbiert.

Aus diesem Grunde ist eine Bestimmung der genauen Transitzeit des Ferrocen-

Dendrimers schwierig. Zieht man als grober Abschätzung die Mitte des ersten Peaks

als Transitzeit heran und bezieht diese auf die Mitte des ersten Peaks des

[Ru(NH3)6]3+, so lässt sich das Verhältnis der Diffusionskoeffizienten aus dem

Quotienten der Nummer des entsprechenden Voltammogramms abschätzen. Dabei

bleibt die Zeitspanne, die während eines Voltammogramms vergeht,

unberücksichtigt. Ein Voltammogramm wird einem Zeitpunkt, und zwar dem

Anfangszeitpunkt zu Beginn des Voltammogramms zugeordnet. Zur Vereinfachung

werden die entsprechenden Stromwerte der beiden Redoxspezies diesem Zeitpunkt

zugeordnet. Da ein Voltammogramm aber nur etwa 30 Millisekunden dauert, ist

diese Zeitauflösung für die Abschätzung der relativen Diffusionskoeffizienten zweier

Redoxspezies, die sich hinreichend in ihren Diffusionskoeffizienten unterscheiden,

ausreichend.

Schätzt man die Transitzeiten für [Ru(NH3)6]3+ und das Ferrocen-Dendrimer wie

oben beschrieben aus Abbildung 4.5-5 ab, so erhält man für den Quotienten aus

D([Ru(NH3)6]3+) und D(Ferrocen-Dendrimer) einen Wert von etwa 0.4. Dieser Wert ist

aus den erläuterten Gründen sehr stark fehlerbehaftet, liegt jedoch im erwarteten

Bereich, wenn man die Molekülstrukturen des Ferrocen-Dendrimers mit

Ferrocenderivat 1 vergleicht, für das im Vergleich zu [Ru(NH3)6]3+ ein relativer

Diffusionskoeffizienten von 0.63 ermittelt wurde.


4.5.2 Untersuchung des Ausblutens von Redoxmediatoren aus Carbonpasten-elektroden mit schneller cyclischer Voltammetrie

Carbonpastenelektroden, in denen neben einem Redoxmediator auch

Zirkoniumphosphat immobilisiert ist, zeigen eine gute Aktivität für die

elektrokatalytische Oxidation von NADH [295]. Geeignete Redoxmediatoren hierfür

sind z. B. Methylenblau, Nilblau, Methylengrün oder Riboflavin [295,296]. Derartige

Elektroden zeigen eine hohe Stabilität bezüglich des Ausblutens des Mediators

(Med), da dieser über einen Ionenaustausch an Zirkoniumphosphat (ZP) gebunden

wird:

ZPH + MedCl ZPMed + HCl

Im neutralen und basischen Bereich liegt das Gleichgewicht auf der Seite des

Zirkoniumphosphat-Mediator-Komplexes, so dass eine hohe Stabilität der Elektroden

in Bezug auf das Ausbluten des Mediators resultiert. Bei niedrigen pH-Werten jedoch

wird das Gleichgewicht nach links in Richtung des „freien“ Mediators verschoben,

welcher aus der Carbonpastenelektrode herausdiffundieren kann.

Bei einer pH-Wert-Änderung in der Lösung findet nur an der äußeren Schicht der

Carbonpastenelektrode ein Ausbluten des Mediators statt, so dass eine

Untersuchung mit integralen elektrochemischen Methoden schwierig ist. Der Strom,

der in voltammetrischen Experimenten durch den Elektronentransfer zwischen

Carbonpaste und Mediator hervorgerufen wird, wird über den Gesamtgehalt an

Redoxmediator in der Carbonpastenelektrode bestimmt. Da eine Änderung der

Mediatorkonzentration an der Elektroden-Lösungsmittel-Grenzfläche nur geringen

Einfluss auf die Gesamtkonzentration an Redoxmediator in der Carbonpaste hat, ist

eine Detektion des Ausblutens über eine Stromabnahme nur schwer möglich.

Eine geeignete alternative Untersuchungsmethode hierfür stellt schnelle cyclische

Voltammetrie mit einer positionierten Mikroelektrode dar. Hierfür wird die

Carbonpastenelektrode von unten in eine elektrochemische Messzelle eingeschraubt

(vgl. Abbildung 4.4-1). Die elektrochemische Zelle wird mit tris-Pufferlösung (0.1 M,

pH 7.5) befüllt. Von oben wird eine Mikroelektrode mittels Mikrometerschrauben

senkrecht sehr nahe an die elektroaktive Oberfläche der Carbonpastenelektrode

angenähert. Die Mikroelektrode wird dazu auf ein Potential von -350 mV vs. Ag/AgCl

gelegt, so dass der im Lösungsmittel gelöste Sauerstoff an der Mikroelektrode

elektrochemisch reduziert wird. Die Annäherung wird gestoppt, wenn eine definierte


Abnahme des Stroms der Mikroelektrode durch die Blockierung ihres

Diffusionsfeldes durch die Carbonpastenelektrode erreicht ist (negativer Feedback).

Anschließend kann der aus der Carbonpastenelektrode ausblutende Mediator mittels

schneller cyclische Voltammetrie detektiert werden.

Nach Einstellung eines stabilen „Leer“-Voltammogramms wird eine Messreihe mit

600 aufeinanderfolgenden schnellen cyclischen Voltammogrammen gestartet.

Während der Messung wird der pH-Wert der Lösung lokal an der

Carbonpastenelektrode verändert, indem mit einer Mikropipette an den Schaft der

Mikroelektrode ein 4 µL Tropfen 1 M Salzsäure platziert wird, der an der

Mikroelektrode herunter in die Lösung gleitet.

Mit diesem Verfahren wurde die pH-Wert-Abhängigkeit des Meditor-Ausblutens von

Carbonpastenelektroden untersucht, die Riboflavin oder Methylengrün als

Redoxmediator enthielten.

In Abbildung 4.5-7 und Abbildung 4.5-8 sind die resultierenden schnellen cyclischen

Voltammogramme einer Carbonpastenelektrode mit Zirkoniumphosphat und

Riboflavin gezeigt.

Abbildung 4.5-7 Farb-Darstellung von schnellen cyclischen VoltammogrammenAuf der x-Achse von links nach rechts ist der Potentialbereich eines Halbzyklusaufgetragen. Die linke Abbildung zeigt den Vorwärtsscan, in x-Richtung sindsomit Potentialwerte von -0.7 V bis 0.7 V aufgetragen. Die rechte Abbildungzeigt den Rückscan mit Potentialwerten in x-Richtung von 0.7 V bis -0.7 V. In y-Richtung von unten nach oben sind die nachfolgenden Voltammogrammeaufgetragen; die y-Achse entspricht somit einer Zeitachse. Die Stromhöhe isteiner Farbskala zugeordnet.(∅ Mikroelektrode = 25 µm, v = 100 V/s, 600 Cyclen, CPE: 35% Carbonpaste,65% ZP+Riboflavin)


Im neutralen pH-Bereich zu Beginn des Experiments tritt sowohl im Vor- als auch im

Rückscan eine homogene Farbverteilung über den gesamten Potentialbereich auf.

Es treten keine Redoxwellen auf, was bedeutet, dass mit der positionierten

Mikroelektrode und schneller cyclischer Voltammetrie keine Ausbluten des Mediators

zu detektieren ist. Unmittelbar nach Zusatz von 4 µL HCl tritt eine starke Oxidations-

und Reduktionswelle auf, die im Laufe des Experiments wieder abfällt. Anhand der

Potentialwerte, bei denen die Redoxwelle auftritt, kann die Substanz eindeutig als

Riboflavin identifiziert werden (Abbildung 4.5-8).

Nach Zusatz von HCl findet an der Carbonpastenelektrode eine lokal begrenzte pH-

Wert-Erniedrigung statt, die zu einer Verdrängung der an Zirkoniumphosphat

gebundenen Redoxmediatormoleküle durch Protonen führt. Die freiwerdenden

Redoxmediatormoleküle diffundieren aus der Carbonpastenelektrode in die Lösung,

wo sie von der positionierten Mikroelektrode als reversible Redoxwelle detektiert

werden. Die lokale pH-Wert-Erniedrigung wird jedoch von der Pufferlösung sehr

schnell abgefangen, so dass sich an der Carbonpaste nach kurzer Zeit wieder der

pH-Wert der Lösung von 7.5 einstellt. Bei diesem pH-Wert wird der Mediator wieder

an Zirkoniumphosphat gebunden, so dass das Ausbluten des Mediators

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 CV #7

CV #159

i [µ

A]

E vs. Ag/AgCl [V]

Abbildung 4.5-8 ausgewählte Voltammogramme aus der in Abbildung 4.5-7 gezeigten Serie vonkontinuierlich aufgenommenen schnellen Cyclovoltammogrammen. BeideVoltammogramme sind hintergrundkorrigiert. Voltammogramm #7 vor derZugabe von HCl zeigt die keine Redoxwelle. Voltammogramm #159 nach derZugabe von HCl zeigt die Redoxwelle von Riboflavin.


unterbunden wird. Dies führt dazu, dass die Intensität der Redoxwelle mit

zunehmender Zeit nach der Injektion von HCl abnimmt und nahezu völlig

verschwindet. Die verbleibende geringe Redoxwelle ist auf eine Adsorption von

Riboflavin auf der Oberfläche der Mikroelektrode zurückzuführen.

Diese Resultate zeigen, dass das durch pH-Wert-Änderungen ausgelöste Ausbluten

des Redoxmediators aus den Carbonpastenelektroden ein reversibler Prozess ist.

Wiederholungsexperimente mit mehren sequentiellen pH-Wert-Änderungen zeigen,

dass der Ausblutungs-Effekt mehrfach hintereinander beobachtet werden kann, was

bedeutet, dass bei der ersten pH-Wert-Änderung nicht die gesamtmögliche Menge

an Mediator aus der Carbonpastenelektrode herausdiffundiert ist.

Führt man gleiche Experimente mit der Zugabe von 1 M NaOH durch, so ist kein

signifikantes Ausbluten des Redoxmediators zu beobachten.

Es wurden analoge Experimente mit Methylengrün, das ebenfalls als Redoxmediator

in einer Zirkoniumphosphat enthaltenden Carbonpastenelektrode verwendet wird,

durchgeführt. Dabei konnte ein analoges Ausblutungsverhalten beobachtet werden.

Aus den Ergebnisse wird deutlich, dass Carbonpastenelektroden auf der Basis von

Redoxmediatoren, die an Zirkoniumphosphat gebunden sind, eine starke

Abhängigkeit des Ausblutungsverhalten vom pH-Wert zeigen und dass das

Ausbluten einen reversiblen Prozess darstellt.

Daraus folgt, dass bei NADH-Messungen mit diesen Elektroden im saurem Milieu

berücksichtigt werden muss, dass eine Kontaminierung der Probelösung mit dem in

der Carbonpaste inkorporiertem Redoxmediator erfolgt.

4.6 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Mikrolitertropfen 149

4.6 Miniaturisierung von elektrochemischen Affinitätsassaysdurch Mikrolitertropfen als elektrochemische Messzellen

Die Kosten einer Analyse mit einem Affinitätsassay werden zum größten Teil durch

die verwendete Menge des biologischen Erkennungselementes bestimmt. Weiterhin

zu berücksichtigen sind Kosten zur Anschaffung von Chemikalien und

Lösungsmitteln, sowie zu deren Entsorgung. Zur Minimierung dieser Kosten wird

zunehmend in Richtung miniaturisierter Affinitätsassays und Biosensorsysteme

geforscht.

Der in dieser Arbeit in Kapitel 4.1 vorgestellte Affinitätsassays, der auf der

Modulation des Diffusionskoeffizienten einer hapten-modifizierten Redoxspezies

nach dem Erkennen der komplementären Bindungsstruktur beruht, konnte bereits

ansatzweise miniaturisiert werden. In Kapitel 4.1.10 wurden kleine, nur wenige

Mikroliter große Tropfen als elektrochemische Messzellen für den Affinitätsassay

vorgestellt. Ein bisher nicht gelöstes Problem war dabei, eine geeignete

Dosiereinheit zu finden, die in der Lage ist, reproduzierbar und möglichst

automatisiert Probe oder Reagenz in diese Tropfenzellen zu dosieren. Bei der

Verwendung derartig kleiner Volumina und Stoffmengen muss besonderes

Augenmerk auf eine potentielle Cross-Kontaminierung beim Dosieren von Probe

oder Reagenz gelegt werden.

4.6.1 Aufbau zur Verwendung von Mikrolitertropfen als elektrochemischeMesszellen

Der in Kapitel 4.2 vorgestellte Mikrodispenser besitzt die Eigenschaft, reproduzierbar

kleinste Flüssigkeitsmengen zu dosieren. Über die Anzahl der Tropfen kann die

Größe des zu dosierenden Volumens exakt festgelegt werden. Die Flugbahn der aus

dem Mikrodispenser ausgestoßenen Tropfen ist über eine Distanz von 2-3 cm stabil.

Damit ist zur Dosierung kein physikalischer Kontakt zwischen dem Mikrodispenser

und der Tropfenzelle nötig, so dass eine mögliche Cross-Kontaminierung

ausgeschlossen wird.

Um eine möglichst reproduzierbare Bildung der Tropfenzelle und einen hohen

Automatisierungsgrad zu erreichen, wurde der in Kapitel 4.1.10 vorgestellte


Messaufbau modifiziert und mit einem neu konzipierten Elektrodenhalter und einer

computergesteuerten motorgetriebenen Präzisions-Spritzenpumpe zur Dosierung

der Tropfenzelle versehen. In Abbildung 4.6-1 ist eine schematische Darstellung des

Aufbaus mit integriertem Mikrodispenser zur Dosierung in die Tropfenzellen gezeigt.

Die Mikroelektrode wird in den aus transparentem Polyacrylat gefertigten

Elektrodenhalter von oben eingeführt und in ihrer vertikale Position mittels einer

Schraube und einer Silikondichtung fixiert, so dass nur die Spitze der Mikroelektrode

aus der Öffnung am unteren Teil des Elektrodenhalters herausragt. Um eine

vertikale Ausrichtung der Mikroelektrode zu erhalten, ist der Durchmesser des

oberen Teil des Kanals im Inneren des Halters nur minimal größer als der

Durchmesser der Mikroelektrode. Auf beiden Seiten des unteren, breiteren Teils des

vertikalen Kanals zweigen zwei weitere Kanäle ab, von denen der untere einen

chloridisierten Silberdraht trägt, der mit einem Fitting und einer Dichtung fixiert ist.

Der obere Kanal ist über ein Fitting und einen Schlauch mit einer Präzisions-

Spritzenpumpe verbunden, mit der eine Tropfenzelle um die Spitze der

Mikroelektrode erzeugt werden kann. Aus diesem Grund besitzt der untere Teil des

chloridisierter Silberdraht

Mikroelektrode

Mikro-dispenser

Lösung

��

Spritzen-pumpe

Spannungspulse

Fitting

Gegen-elektrode

Elektrodenhalter mit Durchflusskanal

Abbildung 4.6-1 schematische Darstellung des Messaufbaus zum Dispensieren kleiner Tropfenals elektrochemische Messzellen mit einer Spritzenpumpe und einemMikrodispenser zum Dosieren in die Tropfenzelle


vertikalen Kanals einen größeren Durchmesser, damit Flüssigkeit um den Schaft der

Mikroelektrode herum bis zur unteren Öffnung des Elektrodenhalters fließen kann.

Mithilfe von Mikrometerschrauben wird die Gold-Makroelektrode in kurzer Entfernung

zur Mikroelektrode vorpositioniert. In einem späteren Schritt kann durch eine weitere

Verringerung der Distanz zwischen Mikroelektrode und Goldelektrode

Redoxamplifizierung erreicht werden.

Mit Hilfe der Spritzenpumpe wird eine exakte Menge an Flüssigkeit aus der Öffnung

am unteren Ende des Elektrodenhalters herausgedrückt, so dass ein Tropfen um die

Spitze der Mikroelektrode gebildet wird, der von der Goldelektrode und der

Auslassöffnung des Elektrodenhalters begrenzt wird. Aufgrund der geringen Distanz

zwischen Mikroelektrode und Goldelektrode benetzt die aus der Öffnung

heraustretende Flüssigkeit die Goldoberfläche. Da die Goldoberfläche von einer

hydrophoben Teflonummantelung umgeben ist, wird nur der Goldteil der Elektrode

benetzt, so dass die Form des Tropfens durch den Durchmesser der Goldoberfläche

und der Öffnung des Elektrodenhalters bestimmt wird. Somit führt das Dispensieren

eines genau definierten Volumens mit der Spritzenpumpe zur Ausbildung eines

definierten Tropfens zwischen Elektrodenhalter und Goldelektrode. Abhängig vom

Volumen der Spritzenpumpe und der Distanz zwischen Mikroelektrode und

Elektrodenhalter können so reproduzierbar Tropfen mit Volumina zwischen 5 und

50 µL erzeugt werden.

Der Mikrodispenser wird so positioniert, dass der ausgestoßene Tropfenstrahl nahe

der aktiven Elektrodenoberfläche der Mikroelektrode in die Tropfenzelle trifft. Um die

Störung durch Luftbewegung möglichst gering zu halten, wird der Mikrodispenser

dabei so positioniert, dass die zurückgelegte Distanz des Tropfenstrahls vor dem

Auftreffen auf die Tropfenzelle geringer als 1 cm ist.

Zur Minimierung der Verdampfung der Tropfenzelle befindet sich der gesamte

Aufbau in einem FARADAY-Käfig mit einer möglichst wassergesättigten Atmosphäre.

Weiterhin ist die Gold-Makroelektrode von einem Wasserreservoir mit

wassergetränkten Filterpapieren umgeben, um lokal eine mit Wasser maximal

gesättigte Atmosphäre zu erhalten. In Abbildung 4.6-2 ist eine Fotografie des

Elektrodenhalters mit dem Wasserreservoir gezeigt.


Es existieren prinzipiell zwei Möglichkeiten, den Affinitätsassay auf Basis der

Modulation des Diffusionskoeffizienten einer hapten-modifizierten Redoxspezies (vgl.

Kapitel 4.1) mit dem beschriebenen Aufbau durchzuführen. Entweder wird die Probe

mit dem Mikrodispenser in eine Tropfenzelle, die hapten-modifizierte Redoxspezies

enthält, geschossen (Abbildung 4.6-3 a) oder der Mikrodispenser wird mit der

hapten-modifizierten Redoxspezies befüllt, die dann in den Probetropfen geschossen

wird (Abbildung 4.6-3 b).

Abbildung 4.6-2 Fotografie des Elektrodenhalters mit positioniertem MikrodispenserZur besseren Übersicht wurde das Filterpapier aus dem Wasserreservoir, dasdie Goldelektrode und die Tropfenzelle umgibt, entfernt.


Das Messsignal des Affinitätsassays ist die Abnahme des diffusionskontrolliert

fließenden Stromes, hervorgerufen durch die Änderung des Diffusionskoeffizienten

der hapten-modifizierten Redoxspezies nach Anbindung des komplementären

Bindungspartners. Das maximale Messsignal wird erreicht, wenn die Gesamtmenge

an Redoxspezies an den komplementären Bindungspartner in der Probe gebunden

ist. Aufgrund der großen Differenz zwischen dem Volumen der Tropfenzelle (~10 µL)

und dem Volumen der mit dem Mikrodispenser geschossenen Tropfen (~100 pL)

erscheint es nicht sinnvoll, die Probe in eine Tropfenzelle, die hapten-modifizierte

Redoxspezies enthält, zu schießen, was im Folgenden näher erläutert wird. Obwohl

diese Methode ein Minimum an Probelösung benötigt, können beim Betreiben des

Mikrodispensers im Durchflussmodus Probleme durch Viskositätsunterschiede und

unterschiedliche Beschaffenheiten der Proben auftreten. Um ein reibungsloses

Funktionieren des Dispensers zu gewährleisten, müssten alle Proben sorgfältig

filtriert und vorbereitet werden, so dass diese möglichst gleiche physikalische

Eigenschaften aufweisen. Um Störeffekte, die durch die Volumenzunahme in der

Tropfenzelle nach dem Schiessen der Probe entstehen und ebenfalls zu einer

Stromabnahme führen, zu minimieren, ist es vorteilhaft, so wenige Pikolitertropfen

wie möglich in die Tropfenzelle zu schießen. Dies impliziert die Verwendung

hochkonzentrierter Probelösungen bei niedrigen Konzentrationen der hapten-

modifizierten Redoxspezies in der Tropfenzelle. Hierbei ist zu bemerken, dass in

a) b)

Abbildung 4.6-3 schematische Darstellung der beiden prinzipiellen Möglichkeiten zurDurchführung des Affinitätsassays


realen Proben hohe Konzentrationen an biologischen Erkennungselementen eher

unwahrscheinlich sind.

Aus diesen Gründen wurde sich für das folgende Verfahren entschieden: Mit Hilfe

der Spritzenpumpe wird einen definierter Probetropfen erzeugt, in den dann mit dem

Mikrodispenser die hapten-modifizierte Redoxspezies als Reagenz

hineingeschossen wird. Hierbei wird der Mikrodispenser, als wertvollstes Teil der

Apparatur, nicht mit Probe kontaminiert. Diese Variante gestattet zudem die

Verwendung von geringen Probekonzentrationen, da hier keine Überlagerung des

Messsignals des Assays durch die Volumenzunahme der Tropfenzelle auftritt,

welche durch Kalibrierkurven ausgeglichen werden muss.

Eine typische Messprozedur des miniaturisierten Affinitätsassays mit diesem

Verfahren setzt sich aus folgenden Schritten zusammen:

1. Die Probe (z. B. Streptavidin) wird in die Spritzenpumpe eingesaugt und der

Mikrodispenser wird mit der hapten-modifizierten Redoxspezies (z. B. Fc-Biotin)

befüllt.

2. Mithilfe der Spritzenpumpe wird ein festgelegtes Volumen dosiert, so dass sich

eine definierte Tropfenzelle um die Mikroelektrode formt.

3. Eine definierte Tropfenzahl hapten-modifizierter Redoxspezies wird mit dem

Mikrodispenser in den Probetropfen geschossen und das komplementäre

Bindungsereignis zwischen Probe und hapten-modifizierter Redoxspezies wird

mit elektrochemischen Messverfahren (z. B. cyclische Voltammetrie oder

Chronoamperometrie) detektiert.

4. Aus dem diffusionskontrolliert fließenden Strom wird durch Vergleich mit

Kalibrierkurven die Konzentration der Probe ermittelt.

4.6.2 Dispensieren von Redoxspezies in elektrochemische Tropfenzellen

Um die Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes, die intrinsischen Fehler durch

Verdampfung des Tropfens und unvollständiges Mischen innerhalb des Tropfens zu

evaluieren, wurden Experimente durchgeführt, in denen Redoxspezies in eine nur

aus Basiselektrolyt bestehende Tropfenzelle geschossen wurde und die

resultierende Stromantwort der Mikroelektrode aufgezeichnet wurde. Als


elektrochemische Methode wurde die kontinuierliche cyclische Voltammetrie

gewählt, um Störeffekte wie Elektrodenfouling und unspezifische Adsorption zu

verringern.

Als Redoxspezies wird das auch im Affinitätsassay zur Anwendung kommende

Fc-Biotin (siehe Abbildung 4.1-3, Struktur von Fc-Biotin) verwendet.

Wenn eine definierte Anzahl an Tropfen Fc-Biotin-Lösung in die Tropfenzelle

geschossen wird, so tritt direkt nach dem Dispensieren eine hohe lokale

Konzentration an Fc-Biotin im Auftreffpunkt auf. Der hohe Konzentrationsgradient

bewirkt eine Diffusion des Fc-Biotin vom Auftreffpunkt in das Volumen des Tropfens

bis eine homogene Verteilung erreicht ist. Die Konzentration von Fc-Biotin an der

Elektrodenoberfläche der Mikroelektrode hängt somit vom Abstand zwischen

Auftreffpunkt und Elektrodenoberfläche und von der Zeitspanne zwischen dem

Dispensieren der Redoxspezies und dem Erreichen der Elektrodenoberfläche ab.

Man erhält eine peakförmiges Stromsignal der Mikroelektrode, analog zu der in

Kapitel 4.4.1 (Dispensieren von Redoxspezies in die Nähe einer

Elektrodenoberfläche mit amperometrischer Detektion) beschriebenen Situation. Ist

vollständige Verdünnung erreicht, so wird die Konzentration von Fc-Biotin an der

Elektrodenoberfläche zeitunabhängig. Der resultierende FARADAY-Strom spiegelt die

mittlere Konzentration an Fc-Biotin im Tropfen wieder.

Abbildung 4.6-4 zeigt eine Serie von kontinuierlich aufgenommenen

Cyclovoltammogrammen nach dem Schiessen von 10000 Tropfen Fc-Biotin in eine

Tropfenzelle aus 10 µL Phosphatpuffer.


Das erste Voltammogramm zeigt nur die Ladeströme der elektrochemischen

Doppelschicht in der Basiselektrolytlösung. Nach dem Schiessen der Redoxspezies

bildet sich eine durch die Oxidation und Reduktion von Fc-Biotin an der

Elektrodenoberfläche verursachte reversible Redoxwelle aus. Die Ströme im

diffusionslimitierten Potentialbereich steigen in jedem Voltammogramm an, bis sie

schließlich ein Maximum erreichen. In weiteren Cyclovoltammogrammen sinkt der

Strom wieder ab, bis bei vollständiger Verdünnung des Fc-Biotins in der Tropfenzelle

ein stationärer Strom erreicht wird.

In Abbildung 4.6-5 ist der diffusionskontrolliert fließende Strom bei 0.3 V, der sich in

analogen Experimenten mit unterschiedlicher Anzahl an geschossenen Fc-Biotin

Tropfen ergibt, gegen die Nummer des entsprechenden Voltammogramms

aufgetragen.

0.0 0.1 0.2 0.3

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

7-10

6

5

4

3

2

1

i [n

A]

E vs. Ag/AgCl [V]

Abbildung 4.6-4 Serie von kontinuierlich aufgenommenen Cyclovoltammogrammen nach demSchiessen von 10000 Tropfen Fc-Biotin in eine 10 µL Tropfenzelle aus 0.1 MPhosphatpuffer(∅ Elektrode = 50 µm, 10 Cyclen, Scangeschwindigkeit = 15 mV/s, c(Fc-Biotin)= 1.15 mM)


Nach dem Schiessen von 10000 Tropfen Fc-Biotin stellt sich ein stationärer

Stromwert bei vollständiger Verdünnung von 0.789 nA ein. In einem analogen

Experiment mit 15000 Tropfen Fc-Biotin ergibt sich ein Stromwert von 1.186 nA.

Diese Stromwerte sind direkt mit der Konzentration an Fc-Biotin im Tropfen

korreliert. Bildet man den Quotienten aus den beiden Stromwerten, so erhält man

einen Wert von 1.503, welcher sehr gut mit dem theoretisch berechneten Wert von

1.5 aus dem Quotienten der Zahl der geschossenen Tropfen Fc-Biotin

übereinstimmt.

Dieses verdeutlicht die Möglichkeit, die Konzentration an Fc-Biotin in der

Tropfenzelle über die Anzahl an geschossenen Fc-Biotin Tropfen festzulegen. Durch

das Schiessen der entsprechenden Anzahl an Tropfen kann jede beliebige

Konzentration im Tropfen etabliert werden.

Zur Evaluierung der Verdampfung des Lösungsmittels im Tropfen wurde die

Spritzenpumpe mit 0.13 mM Fc-COOH in 0.1 M Phosphatpuffer befüllt und eine

10 µL große Tropfenzelle erzeugt. Anschließend wurde kontinuierlich cyclische

0 5 10 15 20 25 30 351.10

1.15

1.20

1.25

1.30

1.35

1.40

1.45

i [n

A]

Nr. CV

2 4 6 8 10 12 140.5

1.0

1.5

2.0

2.5

(a) 10000 Tropfen Fc-Biotin (b) 15000 Tropfen Fc-Biotin (c) Verdampfungseffekt

i [nA

]

Nr. CV

Abbildung 4.6-5 Stromwerte bei 0.3 V in nachfolgenden Voltammogrammen in 10 µLTropfenzellen aus 0.1 M Phosphatpuffer nach dem Schiessen von 10000Tropfen Fc-Biotin (Kurve a) und 15000 Tropfen Fc-Biotin (Kurve b).(∅ Elektrode = 50 µm, Scangeschwindigkeit = 15 mV/s, c(Fc-Biotin)= 1.15 mM)Kurve c (oben rechts mit vergrößerter Skala) zeigt als VergleichsmessungStromwerte gemessen in einer 10 µL Tropfenzelle aus 0.13 mM Fc-COOH. DerStromanstieg ist auf die Verdampfung des Lösungsmittels aus der Tropfenzellezurückzuführen.


Voltammogramme mit der Mikroelektrode aufgenommen. Setzt man eine hohe

Reversibilität der heterogenen Elektronentransferreaktion voraus, so sind die

Stromzunahmen in nachfolgenden cyclischen Voltammogrammen im

diffusionskontrollierten Potentialbereich auf eine Erhöhung der Konzentration an

Fc-COOH im Tropfen durch eine Verdampfung des Lösungsmittels zurückzuführen.

Trägt man den Strom im diffusionslimitierten Potentialbereich bei 0.3 V gegen die

Nummer des Voltammogramms auf (Abbildung 4.6-5, Kurve c), so ergibt sich nur ein

leichter Stromanstieg, was verdeutlicht, dass Verdampfungseffekte vernachlässigt

werden können.

4.6.3 Miniaturisierter elektrochemischer Affinitätsassay in Tropfenzellen

Nachdem demonstriert wurde, dass der beschriebene Aufbau in der Lage ist,

Pikolitertropfen mit hoher Präzision in eine Tropfenzelle zu schießen und man durch

die Zahl der geschossenen Tropfen die Konzentration an Redoxspezies in der

Tropfenzelle definieren kann, muss eine Prozedur zur Durchführung des

elektrochemischen Affinitätsassay basierend auf der Modulation des

Diffusionskoeffizienten der hapten-modifizierten Redoxspezies entwickelt werden.

In den Teflonschlauch, der die Spritzenpumpe mit dem Elektrodenhalter verbindet,

werden Probensegmente (jedes mit einem Volumen von 50 µL) mit

unterschiedlichen Konzentrationen an Streptavidin eingesogen. Für eine Messung

wird eine 10 µL Tropfenzelle aus der Mitte jedes Probensegmentes um die

Mikroelektrode erzeugt. Der Mikrodispenser wird Fc-Biotin Lösung gefüllt und eine

festgelegte Anzahl an Pikolitertropfen wird in die Tropfenzelle geschossen. Die

resultierende Stromantwort der Mikroelektrode wird mittels kontinuierlicher cyclischer

Voltammetrie detektiert. Die diffusionslimitierten Stromwerte bei einem Potential von

0.3 V werden gegen die Nummer des entsprechenden Voltammogramms

aufgetragen bis ein stationärer Stromwert erreicht wird. Nachdem die Messung

beendet ist, wird die Tropfenzelle entfernt und nach Waschschritten mit den

folgenden Segmenten wird aus der Mitte des nächsten Probensegmentes eine neue

10 µL Tropfenzelle erzeugt.


In Abbildung 4.6-6 ist eine entsprechende Kalibrierkurve gezeigt, bei der die

stationären Ströme bei 0.3 V gegen die Konzentration an Streptavidin des jeweiligen

Probensegmentes aufgetragen sind.

Die Anbindung von Streptavidin an den Biotinteil des biotin-markierten Ferrocens

resultiert in einer Erniedrigung des Diffusionskoeffizienten und führt somit zu einer

Verringerung des diffusionslimitierten Stroms. In Probensegmenten, die nur geringe

Konzentrationen an Streptavidin enthalten, können nicht alle Fc-Biotin Moleküle

einen Bindungspartner finden. Somit setzt der diffusionslimitierte Strom der

Mikroelektrode aus Anteilen an freiem Fc-Biotin und an Streptavidin gebundenem

Fc-Biotin zusammen. Wenn allerdings die Streptavidinkonzentration den

Sättigungswert erreicht hat, so dass alle Fc-Biotin Moleküle einen Bindungspartner

finden, so wird der Strom unabhängig von der Streptavidinkonzentration. Dies führt

dazu, dass die Kalibrierkurve bei hohen Konzentrationen an Streptavidin einem

Grenzwert zustrebt.

Die absolute Menge an Streptavidin in einem 10 µL Tropfen mit einer Konzentration

von 1 mg/mL beträgt 180 pmol. Durch das Schiessen von 10000 Tropfen einer 1 mM

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

0.64

0.66

0.68

0.70

0.72

0.74

0.76

0.78

i [nA

]

c (Streptavidin) [mg/ml]

Abbildung 4.6-6 Kalibrierkurve für Streptavidin abgeleitet aus den diffusionslimitiertenStromwerten bei 0.3 V von stationären cyclischen Voltammogrammen beivollständiger Verdünnung von Fc-BiotinIn 10 µL Tropfenzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Streptavidinwurden jeweils 10000 Tropfen Fc-Biotin geschossen.(∅ Elektrode = 50 µm , Scangeschwindigkeit = 15 mV/s, c(Fc-Biotin) = 1 mM)


Fc-Biotin Lösung mit dem Mikrodispenser wird eine absolute Stoffmenge von 1 nmol

Fc-Biotin in die Tropfenzelle gebracht. Berücksichtigt man die Tatsache, dass jedes

Streptavidinmolekül vier Bindungsstellen für Biotin hat, so wird eine Sättigung bei

einer Streptavidinkonzentration von 1.4 mg/mL erreicht. Diese Abschätzung ist in

guter Übereinstimmung mit der Kalibrierkurve, die bei Streptavidinkonzentrationen

zwischen 1 mg/mL und 2 mg/mL in ihren Grenzwert erreicht. Extrapoliert man

zwischen diesen beiden Punkten so ergibt sich eine Sättigungskonzentration für

Streptavidin von 1.5 mg/mL.

4.6.4 Signalverstärkung durch Redoxamplifizierung

Um mit dem hier beschriebenen Aufbau eine Signalverstärkung durch

Redoxamplifizierung zu erreichen, muss die Mikroelektrode sehr dicht an die Gold-

Makroelektrode angenähert werden. Der Effekt der Redoxamplifizierung ist bereits in

vorherigen Kapiteln ausführlich diskutiert worden, weswegen hier nicht noch einmal

darauf eingegangen wird.

Die Gold-Makroelektrode kann mittels einer Mikrometerschraube und einem

Piezoelement in vertikaler Richtung positioniert werden. Eine 10 µL Tropfenzelle, die

neben Basiselektrolyt auch Fc-Biotin enthält, wird erzeugt. Die Mikroelektrode wird

auf 0.5 V polarisiert, so dass Fc-Biotin unter Diffusionskontrolle an dieser umgesetzt

wird. Während kontinuierlich der Strom der Mikroelektrode aufgenommen wird,

nähert man die Goldelektrode mittels der Mikrometerschraube an die Mikroelektrode

an. Sobald eine Stromzunahme durch Redoxrecycling des Fc-Biotins an der

Goldelektrode zu verzeichnen ist, wird eine Feineinstellung der vertikalen Position

der Goldelektrode mit dem Piezoelement vorgenommen. Ist der gewünschte

Verstärkungsfaktor erreicht, wird die Annäherung gestoppt und die Position der

Goldelektrode für alle folgenden Experimente konstant gehalten. Die Tropfenzelle

wird entfernt und nach einigen Waschschritten werden mit der Spritzenpumpe

Tropfenzellen mit verschiedenen Konzentrationen an Streptavidin erzeugt. Analog zu

den im vorherigen Abschnitt beschriebenen Verfahren wird mittels cyclischer

Voltammetrie der diffusionslimitierte Strom bestimmt, der sich nach dem

Dispensieren von Fc-Biotin in die Tropfenzelle ergibt.


In Abbildung 4.6-7 sind entsprechende cyclische Voltammogramme bei vollständiger

Verdünnung nach dem Schiessen von jeweils 10000 Tropfen Fc-Biotin in

Tropfenzellen unterschiedlicher Streptavidinkonzentration gezeigt. Nach dem letzten

Experiment mit der höchsten Streptavidinkonzentration wurde die Goldelektrode

mittels des Piezoelementes um 100 µm abgesenkt, um den Bereich der

Redoxamplifizierung zu verlassen. Ein weiteres cyclisches Voltammogramm wurde

aufgenommen, aus welchem man den Verstärkungsfaktor bestimmen kann. In

diesem Experiment wurde ein Verstärkungsfaktor von 2.9 benutzt, welcher sich aus

den Verhältnis der Stromwerte bei einem Potential von 0.3 V des Voltammogramms

mit und ohne Redoxamplifizierung ergibt.

Trägt man die Stromwerte bei 0.3 V jedes stationären Cyclovoltammogramms gegen

die entsprechende Konzentration an Streptavidin auf, so erhält man eine

Kalibrierkurve, die in Abbildung 4.6-8 gezeigt ist.

0.1 0.2 0.3

0

1

2

3

6

4,532

1(1) Phosphatpuffer

(2) 0.25 mg/ml SPA

(3) 0.50 mg/ml SPA

(4) 1.00 mg/ml SPA

(5) 2.00 mg/ml SPA

(6) ohne Redoxamplifizierung

i [nA

]

E vs. Ag/AgCl [V]

Abbildung 4.6-7 Stationäre cyclische Voltammogramme mit Redoxamplifizierung beivollständiger Verdünnung von Fc-Biotin in 10 µL Tropfenzellen unterschiedlicherStreptavidinkonzentration nach dem Dispensieren von 10000 Tropfen Fc-Biotin. Nach der letzten Messung wurde die Elektrode aus dem Feedbackbereichbewegt und Voltammogramm 6 wurde ohne Redoxamplifizierungaufgenommen.(∅ Elektrode = 50 µm , Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, c(Fc-Biotin) = 1 mM)


Die Kalibrierkurve zeigt die bereits diskutierte Form, wobei durch das Redoxrecycling

zwischen Mikroelektrode und Gegenelektrode eine Erhöhung der Stromdifferenzen

und damit des Messsignals zu verzeichnen ist, was zu einer verbesserten Sensitivität

des Assays führt. Redoxamplifizierung hat keinen Einfluss auf den Messbereich des

Assays, der durch die Konzentration an Fc-Biotin, der Anzahl an geschossenen

Pikolitertropfen und der Größe der Tropfenzelle festgelegt wird. Da diese Parameter

unverändert sind, erhält man eine Kalibrierkurve mit der gleichen Sättigungs-

charakteristik wie ohne Redoxamplifizierung.

Ein direkter Vergleich der Kalibrierkurven des Fc-Biotin/Streptavidin Affinitätsassays

mit und ohne Redoxamplifizierung verdeutlicht die Erhöhung der Sensitivität des

Verfahrens durch Redoxamplifizierung (Abbildung 4.6-9).

0.0 0.5 1.0 1.5 2.02.6

2.7

2.8

2.9

3.0

3.1

3.2

i [n

A]

c(Streptavidin) [mg/ml]

Abbildung 4.6-8 Kalibrierkurve für Streptavidin, abgeleitet aus den diffusionskontrolliertenStrömen bei 0.3 V der Cyclovoltammogramme in Abbildung 4.6-7


Neben dem Amplifizierungsfaktor können in dem entwickelten Affinitätsassays eine

Reihe von Parametern, wie Volumen der Tropfenzelle, Zahl der geschossenen

Pikolitertropfen und Konzentration der hapten-modifizierten Redoxspezies an die

spezifischen Bedürfnisse einer analytischen Fragestellung angepasst werden.

Eine weitere Reduzierung der Größe der Tropfenzelle, eine Erhöhung der

Konzentration der hapten-modifizierten Redoxspezies und eine Optimierung der

geschossenen Tropfenzahl in Kombination mit einem höheren Amplifizierungsfaktor

erlaubt eine Verbesserung des Detektionslimits. Gleichzeitig kann der Verbrauch an

Probe und hapten-modifizierter Redoxspezies weiter gesenkt werden.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0 (a) ohne Redoxamplifizierung (b) mit Redoxamplifizierung

∆ i [n

A]

c(Streptavidin) [mg/ml]

Abbildung 4.6-9 Erhöhung der Sensitivität des Affinitätsassays durch RedoxamplifizierungKalibrierkurve (a) wurde ohne und Kalibrierkurve (b) mit Redoxamplifizierungerhalten.(∅ Elektrode = 50 µm , Scangeschwindigkeit = 10 mV/s, Stromwerte inVoltammogrammen bei 0.3 V bestimmt, V(Tropfenzelle) = 10 µL, 10000Pikolitertropfen Fc-Biotin geschossen, c(Fc-Biotin) = 1 mM)

4.7 Enzym-Mikrostrukturen durch Deposition von Pikolitertropfen auf Oberflächen 164

4.7 Deposition von Enzym-Pikolitertropfen auf Oberflächen alsBasis für miniaturisierte Multianalyt-Sensorstrukturen

Die laterale Strukturierung von Oberflächen mit Enzymen und biologischen

Erkennungselementen auf Transduceroberflächen findet zunehmendes Interesse

seit die Miniaturisierung ein starker Trend in der Forschung und Entwicklung von

neuen Sensorsystemen geworden ist.

Im Folgenden soll ein neues Verfahren vorgestellt werden, dass es sowohl

ermöglicht, mit hohe lokaler Auflösung und Präzision biologisch aktive Strukturen auf

beliebigen Oberflächen herzustellen, als auch die biologische Information mit lokaler

Auflösung quantitativ auszulesen.

Zur Mikrostrukturierung wird der in Kapitel 4.2 vorgestellte Mikrodispenser benutzt

und zum Auslesen der biologischen Information wird Elektrochemische

Rastermikroskopie (SECM) eingesetzt.

4.7.1 Herstellung von Enzym-Mikrostrukturen

Zur Mikrostrukturierung von Enzymen auf Oberflächen ist ein Aufbau entwickelt

worden, der aus einem x,y,z-Mikromanipulator zur Positionierung der

Substratoberfläche und einem Mikrodispenser, dessen x,y,z-Position ebenfalls mit

Mikrometerschrauben festgelegt werden kann, besteht. Das Substrat, in diesem Fall

ein goldbeschichtetes Siliziumplättchen, wird mit doppelseitigem Klebeband an den

Halter des Mikromanipulators befestigt, so dass eine Feinpositionierung der

Oberfläche in allen Raumrichtungen möglich ist. Der Mikrodispenser wird mit der

entsprechenden Enzymlösung befüllt und so positioniert, dass die vom Dispenser

ausgestoßenen Tropfen auf die gewünschte Stelle der Oberfläche treffen. Eine

schematische Abbildung des Aufbaus ist in Abbildung 4.7-1 gezeigt.


Zur Herstellung von Enzym-Mikrostrukturen wird ein einzelner Tropfen mit einem

Volumen von 100 pL aus der Öffnung des Dispensers herausgestoßen. Dieser trifft

auf die Oberfläche und bildet dort einen kreisförmigen Spot mit einem Durchmesser

von ca. 100 µm. Anschließend wird das Substrat mit den Mikromanipulatoren in

lateraler Richtung bewegt und ein weiterer Tropfen wird auf die Oberfläche

geschossen. Ist die Distanz groß genug, so erhält man einzelne Enzymspots mit

einem Durchmesser von 100 µm. Wenn die Distanz zwischen zwei

Tropfenausstößen kleiner als 100 µm ist, so führt dies zu einer Überlappung

benachbarter Spots. Mit Hilfe dieser Methode lassen sich beliebige enzymatische

Strukturen auf die Oberfläche schreiben. Eine Automatisierung des Verfahrens

(Dispensieren, Bewegen der Oberfläche, Dispensieren) ist durch den Austausch der

Mikrometerschrauben durch computergesteuerte Schrittmotoren und einer

entsprechenden Software möglich.

Damit die Enzymstrukturen sich bei späteren Untersuchungen in wässrigen

Lösungen nicht ablösen, müssen geeignete Immobilisierungstechniken zur Fixierung

der Enzyme auf der Oberfläche verwendet werden.

�� +

-

Düse

Piezoaktor

Enzym- lösung

Goldplättchen

Mikrostrukturen

X

Y

Z

Mikropositionier-system

Abbildung 4.7-1 schematische Darstellung des Aufbaus zur Herstellung von Enzym-Mikrostrukturen bestehend aus Mikrodispenser mit Enzymlösung,Positioniersystem und Substratoberfläche


Dabei stehen prinzipiell zwei Methoden zur Auswahl:

1. Kovalente Anbindung an die mit funktionellen Gruppen modifizierte

Substratoberfläche

2. Quervernetzung der Enzyme mit Kopplungsreagenzien oder physikalischer

Einschluss in einer geeigneten Polymermatrix

Für beide Methoden wurden mehrere Beispiele untersucht, die im Folgenden

erläutert werden.

Zur kovalenten Anbindung an die Oberfläche muss diese mit funktionellen Gruppen

versehen werden. Geeignet hierfür sind beispielsweise Goldoberflächen, die sich mit

selbstorganisierenden Monoschichten (Self Assembled Monolayer, SAM)

modifizieren lassen. Thiole und Disulfide lagern sich spontan an eine saubere

Goldoberfläche an und bilden dort geordnete Monoschichten. Verwendet man Thiole

und Disulfide mit terminalen funktionellen Gruppen, so erhält man nach Ausbildung

einer Monoschicht eine funktionalisierte Goldoberfläche, an die eine weitere

kovalente Anbindung stattfinden kann. Besonders geeignet hierfür sind

Funktionalitäten wie Aminogruppen, Säuregruppen oder N-Hydroxysuccinimidylester-

Gruppen.

Als Substratoberflächen wurden goldbedampfte Siliziumwafer benutzt, die in 0.5 cm

x 0.5 cm große Stücke geschnitten wurden. Zur Funktionalisierung werden die

Goldoberflächen für 2 Stunden in eine Lösung des entsprechenden Disulfids

getaucht. Durch die Verwendung eines amino-terminierten Disulfids (Cystamin)

können mit Aminogruppen funktionalisierte Goldoberfläche erhalten werden und

durch die Verwendung von 3-3’-Dithiodipropionsäure-di(N-succinimidylester) kann

die Goldoberfläche mit N-hydroxysuccinimidylester-Gruppen (im Folgenden

Aktivester-Gruppen genannt) modifiziert werden.

Im Falle der mit Aminogruppen modifizierten Oberfläche wird der Dispenser mit einer

Lösung befüllt, die neben dem Enzym ein Carbodiimid (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-

propyl)carbodiimid, EDAC) enthält, welches die Säuregruppen des Enzyms aktiviert

und so die kovalente Anbindung an die Aminogruppen der modifizierten

Goldoberfläche ermöglicht. Gleichzeitig kann ein Quervernetzen der Enzyme über

die aktivierten Säuregruppen und die Lysinreste eines zweiten Enzymmoleküls

stattfinden.


Bei der mit Aktivester-Gruppen modifizierten Goldoberfläche ist kein zusätzliches

Reagenz notwendig. Der Dispenser wird nur mit einer wässrigen Lösung des

Enzyms befüllt. Es findet eine kovalente Kopplung der Enzyme über Lysinreste an

die aktivierten Säuregruppen der Goldoberfläche unter Ausbildung einer

Amidbindung statt. Da hierbei keine Quervernetzung auftritt, führt diese Methode zur

Ausbildung einer definierten Enzym-Monoschicht auf der Goldoberfläche.

In beiden Fällen wird nach einer Inkubationszeit von mindestens 2 Stunden die nicht

gebundene Menge an Enzym mit Pufferlösung hoher Ionenstärke intensiv

abgewaschen.

Beide Reaktionssequenzen zur Enzymimmobilisierung sind in Abbildung 4.7-2

dargestellt.

O

O

OON

S

O

O

OON

S

O

O

OON

S

O

O

OON

S

NH2

O-

O

S

O-

O

S

O

S

NH

O

S

NH

NH2

S

NH2

S

NH2

S

NH2

S

NH2

S

NH2

S

NH2

SCOOH

+ EDAC

NH2

S

NH2

S

NH2

S

NH2

S

NH

S

O

NH

O

NH2

S

NH

S

O

Abbildung 4.7-2 Reaktionssequenzen zur kovalenten Kopplung von Enzymen an funktionalisierteMonoschichtenoberes Schema: Ausbildung von Amidbindungen zwischen carbodiimid-aktivierten Säuregruppen des Enzyms und terminalen Aminogruppen derCystamin-Monoschichtunteres Schema: Ausbildung von Amidbindungen zwischen Lysinresten desEnzyms und terminalen Aktivester-Gruppen einer 3-Thiopropionsäure(N-succinimidylester)-Monoschicht


Die bisher beschriebenen Methoden setzen eine Oberfläche mit funktionellen

Gruppen voraus, so dass nur eine begrenzte Zahl von Materialien in Frage kommt.

Setzt man der Enzymlösung im Dispenser Quervernetzungsreagenzien oder eine

Polymermatrix, in das Enzym eingeschlossen werden kann, zu, so lassen sich

praktisch auf jede Oberfläche enzymatische Mikrostrukturen aufbringen.

Als Beispiel für eine Quervernetzung der Enzyme wurde der Enzymlösung als

Kopplungsreagenz Poly(ethylenglycol)-(400)-diglycidylether (PEGDGE) zugesetzt.

Die beiden terminalen Epoxidringe des PEGDGE binden unter Ringöffnung an die

Lysinreste der Enzyme, so dass eine Quervernetzung der Enzyme über ihre

Aminogruppen mit PEGDGE als Brückenmolekül stattfindet [297].

Nach einer Reaktionszeit von 2 Stunden wird nicht quervernetztes Enzym mit

Pufferlösung hoher Ionenstärke von der Oberfläche abgespült.

Für eine Immobilisierung der Enzyme durch physikalischen Einschluss in einer

Polymermatrix wurde Vinnapas EP 16, eine wässrige Polyvinylacetat-Polyethylen-

Copolymer-Dispersion, verwendet [298,299]. Die Enzymlösung wird dazu mit einer

wässrigen Dispersion des Vinnapas EP 16 Polymers vermischt. Nach dem

Dispensieren der Mikrostrukturen werden die Substratoberflächen zum Trocknen der

Polymermatrix für 12 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt und anschließend

intensiv mit Pufferlösung gespült.

O

CH2 O (CH2 CH2 O)n CH2

O+ NH22 R

CH2 O (CH2 CH2 O)nCHCH2NHR

OH

CH2 CH CH2 NH R

OH

Abbildung 4.7-3 Reaktionsschema der Quervernetzung von Enzymen mit PEGDGE


In Abbildung 4.7-4 sind zwei Beispiele für unterschiedliche Strukturen gezeigt, die mit

diesen Immobilisierungstechniken auf Oberflächen aufgebracht wurden. Die

Fotografien wurden jeweils vor dem Spülen der Substratoberflächen mit Pufferlösung

aufgenommen.

Abbildung 4.7-4 Fotografien von immobilisierten Enzym-MikrostrukturenDie Abbildung links zeigt zwei Linien immobilisierter Glucoseoxidase, die durchSchiessen von EDAC-aktivierter Glucoseoxidase auf eine cystamin-modifizierteGoldoberfläche erhalten wurden. Die Linien haben einen Durchmesser von etwa100 µm und einen Abstand von 500 µmDas Foto rechts zeigt eine Meanderstruktur aus Glucoseoxidase, die mittelsSchiessen von Glucoseoxidase-Lösung auf eine aktivester-modifizierteGoldoberfläche hergestellt wurde.

4.7.2 Visualisierung von immobilisierter Enzymaktivität mittels Elektro-chemischer Rastermikroskopie

Aufgrund der Tatsache, dass die Fläche mit immobilisierten Enzymen im Vergleich

zur gesamten Oberfläche sehr klein ist, können integrale Methoden, wie z. B.

Amperometrie, nicht zur Bestimmung der Aktivität der immobilisierten Enzyme

verwendet werden, da die bei dieser Technik auftretenden Hintergrundströme und

Kapazitäten sehr viel größer wären als das vergleichsweise geringe

amperometrische Messsignal. Photometrische Methoden besitzen zwar eine

ausreichend hohe Sensitivität zur Erfassung der immobilisierten Enzymaktivität,

jedoch können mit dieser Technik keine Aussagen über die lokale Variation der

Enzymaktivität gemacht werden.


Aus diesem Grund wurde zur Erfassung der lokal immobilisierten Enzymaktivität die

Elektrochemische Rastermikroskopie (SECM) verwendet. Im Kapitel „Stand der

Forschung“ sind bereits mehrere Anwendungsfälle beschrieben worden, in denen

SECM erfolgreich zur Untersuchung von immobilisierter Enzymaktivität eingesetzt

worden ist.

Im Falle von immobilisierten Oxidasen ist die einfachste Methode, das enzymatisch

generierte H2O2 im Generator-Kollektor-Modus an einer positionierten

Mikroelektrode, welche auf ein Potential von 600 mV vs. Ag/AgCl polarisiert ist, zu

oxidieren. Der resultierende Stromfluss durch die Mikroelektrode ist direkt korreliert

mit der H2O2-Konzentration und somit auch mit der lokalen Enzymaktivität. Bewegt

man die Mikroelektrode lateral über die Probenoberfläche, so kann zwischen Orten

hoher Enzymaktivität (hoher Strom) und Orten, an denen keine Enzymaktivität

vorhanden ist (niedriger Hintergrundstrom), unterschieden werden. Trägt man den

Strom gegen die x,y-Position der Mikroelektrode auf, so lässt sich ein

Enzymaktivitätsprofil der Probe erhalten. Eine schematische Darstellung dieses

Verfahrens zur Visualisierung immobilisierter Enzymaktivität ist in Abbildung 4.7-5

gezeigt.

X

YZ

Probenoberfläche

Enzym-substrat

ProduktO2 H2O2

immobilisierteEnzyme

Strom

Abbildung 4.7-5 Schematische Darstellung der Detektion von immobilisierter Enzymaktivität mitdem SECMDie Oxidation des enzymatisch lokal generierten H2O2 an der Mikroelektrodeführt zu einem Stromfluss. Beim lateralen Bewegen der Mikroelektrode über dieProbenoberfläche sind über immobilisierten Enzymen hohe Ströme und überunmodifizierten Flächen niedrige Ströme zu verzeichnen (vgl. blaue Linie).


Der Aufbau und die Funktionsweise eines SECM ist detailliert im Kapitel „Stand der

Forschung“ erläutert worden, weswegen hier nicht noch einmal darauf eingegangen

wird.

Die zu untersuchende Probe wird in eine für das SECM geeignete Messzelle

montiert und diese mit Basiselektrolyt-Lösung befüllt. Die Mikroelektrode wird von

oben in die Messzelle abgesenkt. Eine Ag/AgCl-Referenz- und Platin-

Gegenelektrode komplettieren die 3-Elektrodenanordnung. Zur Visualisierung des

enzymatisch generierten H2O2 muss die Mikroelektrode der Probeoberfläche bis auf

eine Distanz, die in der Größenordnung des Durchmessers der aktiven

Elektrodenoberfläche der Mikroelektrode liegt, angenähert werden. Um eine

Annäherung unabhängig von der enzymatischen Reaktion an der Probenoberfläche

machen zu können, wurde die Reduktion von molekularem Sauerstoff an der

Mikroelektrode genutzt. Die Mikroelektrode wird dazu auf -350 mV vs. Ag/AgCl

polarisiert und langsam der Probenoberfläche angenähert. Sobald die

Mikroelektrode so dicht an die Probeoberfläche angenähert ist, dass die

Nachdiffusion des O2 partiell durch diese blockiert wird, ist eine Abnahme des

Reduktionsstroms der Mikroelektrode zu verzeichnen (negativer Feedback). Die

Annäherung wird fortgesetzt und gestoppt, sobald eine vordefinierte Stromabnahme

(typischerweise 75 %) erreicht ist.

Das entsprechende Substrat des immobilisierten Enzyms wird der Lösung in der

Messzelle zugesetzt. Anschließend wird die Mikroelektrode auf 600 mV vs. Ag/AgCl

polarisiert und zur Detektion der immobilisierten Enzymaktivität lateral über die

Probenoberfläche bewegt.

Abbildung 4.7-6 zeigt das resultierende SECM-Bild für die in Abbildung 4.7-4

gezeigten immobilisierten zwei Glucoseoxidaselinien.


Die Stromzunahmen über den beiden immobilisierten Glucoseoxidaselinien zeigen

die typische durch das Diffusionsprofil des H2O2 verursachte verbreiterte Peakform.

Wie erwartet, beträgt der Abstand zwischen den beiden Maxima 500 µm. In

y-Richtung ist ein starker linearer Stromanstieg zu beobachten, welcher entweder auf

eine Verkippung zwischen Mikroelektrode und Probenoberfläche oder einer

Akkumulation des enzymatisch gebildeten H2O2 zurückzuführen ist.

Zur Klärung dieses Sachverhaltes wurde ein Topographiebild der Probenoberfläche

aufgenommen. Dazu wurde die Glucoselösung aus der Messzelle entfernt und nach

gründlichem Spülen gegen eine Lösung mit Hexacyanoferrat(II) als lösliche

Redoxspezies ausgetauscht. Die Mikroelektrode wird auf 500 mV vs. Ag/AgCl

polarisiert, so dass Hexacyanoferrat(II) unter Diffusionskontrolle oxidiert wird.

Anschließend wird der gleiche Bereich wird noch einmal abgerastert. Das

resultierende SECM-Bild ist in Abbildung 4.7-7 dargestellt.

Abbildung 4.7-6 SECM-Bild der Enzymaktivität von zwei immobilisierten Glucoseoxidaselinien,aufgenommen in 0.1 M Glucoselösung(∅ Elektrode = 25 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)


Da Glucose als Enzymsubstrat der Glucoseoxidase nicht mehr in der Lösung

vorhanden ist, ist die immobilisierte Glucose inaktiv und es sind keine Stromanstiege

über den Glucoseoxidaselinien zu verzeichnen. Lediglich sehr kleine

Stromschwankungen, die Oberflächenrauhigkeiten zuzuordnen sind, sind über den

Glucoseoxidaselinien zu erkennen. In y-Richtung ist eine starke Stromzunahme zu

verzeichnen. Das an der Mikroelektrode generierte Hexacyanoferrat(III) wird an der

leitenden Goldoberfläche wieder zu Hexacyanoferrat(II) reduziert (positiver

Feedback-Effekt). Dieses Redoxrecycling zwischen Mikroelektrode und

Goldoberfläche führt zu einer Zunahme des Stroms der Mikroelektrode und ist stark

abstandsabhängig. Ändert sich durch eine nicht planparallele Ausrichtung der

Abstand zwischen Mikroelektrode und Goldoberfläche beim Rastern der

Mikroelektrode, so wird bei einer Vergrößerung des Abstandes eine Stromabnahme

und bei einer Verkleinerung des Abstands eine Stromzunahme beobachtet.

Die Stromzunahme in y-Richtung kann somit auf eine Verringerung der Distanz

zwischen Mikroelektrode und Goldoberfläche in y-Richtung zurückgeführt werden.

Damit erklärt sich auch der Stromanstieg in y-Richtung in Abbildung 4.7-6, welche

die Enzymaktivitäten der Glucoseoxidaselinien zeigt. Der Stromanstieg wird also

Abbildung 4.7-7 SECM-Bild der Topographie der Goldoberfläche mit zwei immobilisiertenGlucoseoxidaselinien, aufgenommen in 1 mM K4[Fe(CN)6]Der untersuchte Bereich ist identisch zu dem in Abbildung 4.7-6.

(∅ Elektrode = 25 µm , E = 0.5 V vs. Ag/AgCl)


offensichtlich nicht durch eine Akkumulation des enzymatisch generierten H2O2

verursacht, sondern kann auf die Verringerung der Distanz zwischen Mikroelektrode

und Goldoberfläche während des Abrasterns zurückgeführt werden.

Im Folgenden soll gezeigt werden, dass die Detektion von Enzymaktivität mit dem

SECM sensitiv genug ist, um auch Monoschichten immobilisierter Glucoseoxidase zu

detektieren. Die Linienstruktur, die in den vorherigen Experimenten untersucht

wurde, basierte auf der Immobilisierung von mit EDAC aktivierten Enzymen auf einer

Cystamin-Monoschicht, wobei es durch Kopplung der Enzyme untereinander zur

Ausbildung einer Enzymmultischicht kommen kann. Benutzt man die

Immobilisierungsmethode, bei der die Goldoberfläche mit Aktivester-Gruppen

modifiziert wird, und auf die nur reine Enzymlösung geschossen wird, so kann keine

Quervernetzung der Enzyme stattfinden und man erhält eine Monoschicht

immobilisierter Enzyme auf der Oberfläche. Eine mit dieser Methode hergestellte

Meanderstruktur (vgl. Abbildung 4.7-4) wurde mit dem SECM untersucht. Das

resultierende SECM-Bild ist in Abbildung 4.7-8 gezeigt.

Abbildung 4.7-8 SECM-Bild der Enzymaktivität einer Meanderstruktur aus immobilisierterGlucoseoxidase, aufgenommen in 0.1 M Glucose(∅ Elektrode = 25 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)


Die Abbildung verdeutlicht, dass auch eine Monoschicht immobilisierter

Glucoseoxidase über die Detektion des enzymatisch produzierten H2O2 mit der

Mikroelektrode visualisiert werden kann. Die Meanderstruktur ist dabei klar als

Anstieg des Oxidationsstroms im SECM-Bild wiederzuerkennen.

4.7.3 Quantitative Bestimmung von Enzymsubstratkonzentrationen

Die bisherigen Messungen demonstrieren die Möglichkeit, mit Hilfe des SECM die

Aktivität der immobilisierten Enzym-Mikrostrukturen zu detektieren. Jedoch wurde

bislang nicht gezeigt, dass es möglich ist, mit dieser Methode quantitative

Messungen mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen durchzuführen. Das

Quantifizieren von Substratkonzentrationen ist aber eine unabdingbare

Voraussetzungen für eine eventuelle Nutzung dieser Strukturen als Biosensoren

oder Multianalyt-Sensorsysteme.

Um ein hohes Messsignal durch eine möglichst große Menge an immobilisierter

Enzymaktivität zu erhalten, wurde eine Linien-Mikrostruktur aus Glucoseoxidase

unter Nutzung von PEGDGE als Quervernetzungsreagenz auf einer Goldoberfläche

hergestellt.

Bewegt man die positionierte Mikroelektrode in Gegenwart unterschiedlicher

Konzentrationen an Glucose über die Linie immobilisierter Glucoseoxidase und

zeichnet den jeweils resultierenden Strom der Mikroelektrode auf, so erhält man die

in Abbildung 4.7-9 gezeigten Kurven.


Trägt man die Höhe der Peakströme von der jeweiligen Grundlinie der Kurven in

Abbildung 4.7-9 gegen die entsprechende Glucosekonzentration auf, so erhält man

eine Kalibrierkurve für Glucose, die in Abbildung 4.7-10 gezeigt ist.

0 500 1000 1500 20000.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8 1 mM 2 mM 3 mM 4 mM 5 mM 8 mM 13 mM 23 mM

i [n

A]

Distanz [µm]

Abbildung 4.7-9 H2O2-Oxidationsströme einer Mikroelektrode beim Rastern über einerimmobilisierten Glucoseoxidaselinie in Gegenwart unterschiedlicher Glucose-konzentrationen(∅ Elektrode = 50 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)

0 5 10 15 20 250.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

i [nA

]

c (Glucose) [mM]

Abbildung 4.7-10 Kalibrierkurve für Glucose erhalten aus den Peakströmen der Linienscans inAbbildung 4.7-9


Die Kalibrierkurve zeigt die für eine MICHAELIS-MENTEN-Kinetik typische

Sättigungscharakteristik bei hohen Glucosekonzentrationen. Ermittelt man die

kinetischen Daten des Sensors mittels nicht-linearerer Regression nach der

Modellgleichung

cK

cii

M

max

+= (Gleichung 4.7-1)

unter Variation der Parameter imax und KM nach dem LEVENBERG-MARQUARDT-

Algorithmus, so erhält man für die MICHAELIS-MENTEN-Konstante KM einen Wert von

2.81 ± 0.26 mM und für den Maximalstrom imax einen Wert von 0.55 ± 0.01 nA.

Diese Ergebnisse verdeutlichen die Möglichkeit, mit Enzym-Mikrostrukturen unter

Nutzung des SECM quantitativ Substratkonzentrationen zu bestimmen.

Mit Hilfe dieser Messmethode können zudem Interferenzen durch in der Probelösung

vorhandene co-oxidierbare Substanzen eliminiert werden, die bei dem angelegten

Potential von 0.6 V vs. Ag/AgCl ebenfalls an der Elektrode umgesetzt werden

können. Die Cooxidation von Interferenzien, wie z. B. Ascorbinsäure oder

Paracetamol, führt bei vielen amperometrischen Sensoren, die auf der Detektion von

H2O2 basieren, zu einem höheren Stromfluss, so dass der daraus ermittelte Wert für

die Glucosekonzentration höher ist als der tatsächliche.

Abbildung 4.7-11 zeigt den Einfluss von Ascorbinsäure auf das Messsignal beim

Rastern der Mikroelektrode über eine Glucoseoxidaselinie. Zunächst wurde das

Stromsignal der Mikroelektrode in einem Linienscan über der Glucoseoxidaselinie in

Gegenwart von Glucose aufgezeichnet. Anschließend wurde der Lösung

Ascorbinsäure zugesetzt und der gleiche Linienscan noch einmal durchgeführt.


Der Zusatz von Ascorbinsäure bewirkt eine Erhöhung der Basislinie. Der

Stromhintergrund steigt durch die Oxidation von Ascorbinsäure an der

Mikroelektrode von 0.2 nA auf etwa 0.9 nA an. Die Höhe des Stromanstiegs von der

jeweiligen Basislinie bis zum Strommaximum, hervorgerufen durch das von der

immobilisierten Glucoseoxidase produzierte H2O2, bleibt jedoch konstant. Das

Messsignal zur Bestimmung der Glucosekonzentration ist somit unabhängig von der

Gegenwart von Ascorbinsäure.

Hierdurch wird deutlich, dass Interferenzen durch co-oxidierbare Probenbestandteile

durch die Subtraktion des Stromhintergrunds wirkungsvoll eliminiert werden können.

Zu bemerken ist, dass hierfür im Gegensatz zu vielen anderen Sensorsystemen

keine zusätzliche Messung mit einer Vergleichselektrode, die nur das durch co-

oxidierbare Substanzen verursachte Stromsignal erfasst, notwendig ist.

Das Potential der Kombination von SECM und Enzym-Mikrostrukturen wird in den

folgenden Abschnitten anhand von Multianalyt- und Multischicht-Sensorstrukturen

verdeutlicht.

0 500 1000 1500 2000

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4 mM Glucose

4 mM Glucose + 0.1 M Ascorbinsäure

i [nA

]

Distanz [µm]

Abbildung 4.7-11 Oxidationsströme einer Mikroelektrode beim Rastern über einer immobilisiertenGlucoseoxidaselinie in Gegenwart von Glucose (untere Linie) und in Gegenwartvon Glucose und Ascorbinsäure (obere Linie)(∅ Elektrode = 50 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)


4.7.4 Multianalyt-Sensorstrukturen

Für die Herstellung von Multisensor-Strukturen mit dem Mikrodispenser müssen zwei

oder mehrere Enzymstrukturen sequentiell in sehr kurzem Abstand voneinander auf

das Substrat aufgebracht werden. Als Immobilisierungsmethode wurde auf eine mit

Aktivester-Gruppen modifizierte Goldoberfläche zurückgegriffen, auf die eine

wässrige Lösung des zu immobilisierenden Enzyms geschossen wird. Durch den

Verzicht auf den Zusatz von Quervernetzungsreagenzien kann zum einen die

Enzymlösung für mehrere Versuche benutzt werden, zum anderen können durch die

milden Reaktionsbedingungen auch labile Enzyme verwendet werden. Es ist

beispielsweise nicht möglich, Lactatoxidase mit EDAC unter Beibehaltung der

enzymatischen Aktivität zu aktivieren.

Um das Detektionsprinzip (Oxidation von H2O2 an einer lateral bewegten

Mikroelektrode) beizubehalten, wurden verschiedene Oxidasen als Basis für eine

Multisensor-Struktur ausgewählt.

Neben Glucoseoxidase wurde Lactatoxidase als zweite Oxidase ausgewählt, da der

simultanen Bestimmung von Lactat und Glucose hohe Bedeutung zukommt, z. B. bei

der Überwachung von Molkereiprodukten oder in der klinischen Analytik [300].

Bewegt man die positionierte Mikroelektrode über lokal separierte Strukturen von

verschiedenen immobilisierten Oxidasen, so kann jede von ihnen nur dann über eine

Stromzunahme visualisiert werden, wenn sich das entsprechende Enzymsubstrat in

der Lösung befindet. Ein Strompeak über einer immobilisierten Oxidasestruktur zeigt

somit die Gegenwart des entsprechenden Enzymsubstrats in der Probenlösung an.

Aus der Höhe des Strompeaks kann, wie im vorherigen Abschnitt erläutert, die

Konzentration des Substrats bestimmt werden.

Zur Herstellung derartiger Multisensor-Strukturen wurde der Dispenser mit einer

wässrigen Lösung von Lactatoxidase befüllt und eine Linie auf eine mit Aktivester-

Gruppen modifizierte Goldoberfläche geschossen. Der Mikrodispenser wird intensiv

mit Wasser gespült und mit einer wässrigen Lösung von Glucoseoxidase befüllt. Das

Goldsubstrat wird mit den Mikrometerschrauben lateral bewegt und eine

Glucoseoxidaselinie wird parallel zur Lactatoxidaselinie geschossen.


Damit ergeben sich folgende Reaktionssequenzen:

- an der Glucoseoxidaselinie: ββββ-D-Glucose + O2 → D-Glucono-δ-lacton + H2O2

- an der Lactatoxidaselinie: L-Lactat + O2 → Pyruvat + H2O2

Durch die lokale Detektion von enzymatisch generiertem H2O2 mit dem SECM

können somit beide Enzymlinien visualisiert werden.

Abbildung 4.7-12 SECM-Bilder einer Linie immobilisierter Glucoseoxidase und einer Linieimmobilisierter LactatoxidaseDie linke Abbildung wurde in der Gegenwart von 0.1 M Lactat aufgenommen, sodass nur die Lactatoxidaselinie visualisiert wird. Die rechte Abbildung wurdenach dem Zusatz von Glucose erhalten und zeigt somit die Aktivität derimmobilisierten Glucoseoxidase und Lactatoxidase.(∅ Elektrode = 25 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)

Abbildung 4.7-12 links zeigt ein SECM-Bild der Region beider immobilisierter

Enzymlinien in der Gegenwart von Lactat. Wie erwartet, ist eine einzelne Linie hoher

Stromwerte bei einer x-Position von 1600 µm zu erkennen, was in guter

Übereinstimmung mit der Lage der immobilisierten Lactatoxidase ist. Anschließend

wurde der Lösung Glucose zugesetzt und der gleiche Bereich noch einmal

abgerastert. Das resultierende SECM-Bild ist in Abbildung 4.7-12 rechts gezeigt. Die

Lactatoxidaselinie ist weiterhin zu erkennen; zusätzlich tritt eine weitere Linie hoher

Stromwerte bei einer x-Position von 600 µm auf, die durch die Oxidation des von der

jetzt aktiven Glucoseoxidase erzeugten H2O2 an der Mikroelektrode hervorgerufen

wird.


Diese Resultate zeigen, dass lokales Strukturieren von Oberflächen mit

verschiedenen Enzymen mit dem Mikrodispenser möglich ist.

Die Detektion des Diffusionsprofils von lokal enzymatisch generiertem H2O2

ermöglicht die simultane quantitative Bestimmung verschiedener Enzymsubstrate

während eines einzigen Linienscans ohne Interferenzprobleme und Hintergrund-

korrekturen.

4.7.5 Multischicht-Sensorstrukturen

Die bisher generierten Enzymstrukturen bestanden aus nur einer

Immobilisierungsschicht, die jeweils nur ein Enzym enthielt. Die

Immobilisierungsmethoden unter Nutzung von PEGDGE als Quervernetzungs-

reagenz oder Vinnapas EP 16 als Polymermatrix zum Einschließen von Enzymen

gestatten jedoch auch das Aufbauen von Enzymmultischichten ohne signifikante

Vergrößerung der lateralen Dimensionen.

Diese Möglichkeit eröffnet den Weg zu Sensorstrukturen, mit denen durch

Interaktion verschiedener Enzyme in Multischichtstrukturen fast jedes biologische

Substrat bestimmt werden kann.

Im Folgenden wird die Interaktion verschiedener Enzyme in derartigen

Multischichtstrukturen an mehren Beispielen demonstriert.

Zur Untersuchung der Interaktion verschiedener Enzyme wurden unterschiedliche

Mikrostrukturen nach folgendem Schema hergestellt. Es werden mehrere parallele

Linien eines ersten Enzyms A auf die Oberfläche aufgebracht, anschließend wird die

Lösung im Dispenser gegen Enzymlösung B ausgetauscht und es werden um 90°

verdrehte parallele Linien geschossen. An den Kreuzungspunkten der beiden

Enzymlinien liegen immobilisierte Multienzymschichten vor.

Ein Beispiel für eine derartige Gitterstruktur ist in Abbildung 4.7-13 gezeigt.


Zur Evaluierung wurde zunächst eine Monoenzymstruktur aus Glucoseoxidase

hergestellt. Im SECM-Experiment ist zu erwarten, dass bei dieser Struktur die

Gitterkreuzungen aufgrund der größeren Menge an immobilisiertem Enzym einen

höheren Strom zeigen, als die Gitterlinien. In Abbildung 4.7-14 ist das SECM-Bild

einer Gitterstruktur von immobilisierter Glucoseoxidase gezeigt, das über die

Detektion von H2O2 in Gegenwart von Glucose erhalten wurde.

Abbildung 4.7-13 Fotografie einer Gitterstruktur verschiedener Enzyme (Einschluss in VinnapasEP16 auf einer Goldoberfläche)In den Quer- und Längslinien sind die Enzyme A bzw. B immobilisiert, so dassan den Kreuzungspunkten Multienzymschichten vorliegen. Die Breite der Linienbeträgt 100 µm.

Abbildung 4.7-14 SECM-Bild der Aktivität einer Gitterstruktur von immobilisierter Glucoseoxidasein Gegenwart von 1 M Glucose(∅ Elektrode = 50 µm, E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)


Die Gitterstruktur der immobilisierten Glucoseoxidase kann gut im SECM-Bild

wiedererkannt werden. Weiterhin zeigt sich, dass, wie erwartet, an den Kreuzungen

der Gitterlinien aufgrund der höheren immobilisierten Enzymaktivität ein höherer

Strom als über den Enzymlinien zu verzeichnen ist.

Dieses Experiment demonstriert die Möglichkeit, durch Gitterstrukturen

Enzymschichten übereinander zu immobilisieren und die Gitterkreuzungspunkte

mittels SECM eindeutig zu erfassen.

Aufbauend auf diesen Grundlagen wurde zu Multienzymschicht-Strukturen

übergegangen.

Ein System von zwei interagierenden Enzymen stellen Glucoseoxidase und Catalase

dar. Catalase wird in Kombination mit Oxidasen benutzt, um Interferenzen in

amperometrischen Biosensoren durch endogenes H2O2 zu eliminieren. Catalase

katalysiert die Disproportionierungsreaktion von H2O2, wobei das H2O2 sowohl als

Substrat als auch als Cosubstrat dient [301].

Wird Catalase mit Glucoseoxidase gekoppelt, so findet die folgende

Reaktionssequenz statt:

- an der Glucoseoxidase-Struktur: ββββ-D-Glucose + O2 → D-Glucono-δ-lacton + H2O2

- an der Catalase-Struktur: 2 H2O2 → 2 H2O + O2

Um die Kopplung und Interaktion zweier Enzyme in Enzym-Mikrostrukturen zu

zeigen und um das bekannte Detektionsprinzip beizubehalten, wurde eine zu

Abbildung 4.7-13 analoge Gitterstruktur aus Glucoseoxidase und Catalase

hergestellt. Dementsprechend bestehen die Linien A aus immobilisierter

Glucoseoxidase und die Linien B aus immobilisierter Catalase.

In Abbildung 4.7-15 ist in einer schematischen Zeichnung das im SECM-Experiment

erwartete Stromprofil erläutert.


In Abbildung 4.7-16 ist das SECM-Bild einer Gittermikrostruktur aus Glucoseoxidase

und Catalase gezeigt, das durch die Detektion des von der Glucoseoxidase in

Gegenwart von Glucose produziertem H2O2 an der Mikroelektrode erhalten wurde.

Abbildung 4.7-15 erwartetes Stromprofil im SECM-Experiment über einer Glucoseoxidase-Catalase-Gitterstruktur in Gegenwart von GlucoseDas von der Glucoseoxidase (Enzym 1) produzierte von der Mikroelektrodedetektierbare H2O2 wird von der Catalase (Enzym 2) umgesetzt, so dass anden Kreuzungspunkten eine lokal verringerte H2O2 Konzentration herrscht.

Abbildung 4.7-16 SECM-Bild einer Glucoseoxidase-Catalase Gitterstruktur aufgenommen in 1 MGlucoseDie drei Glucoseoxidaselinien sind parallel zur y-Achse und die drei Catalase-linien parallel zur x-Achse orientiert.(∅ Elektrode = 50 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)


Die Linien immobilisierter Glucoseoxidase parallel zur y-Achse sind klar als

Stromanstiege zu erkennen. An den Kreuzungspunkten mit den parallel zur x-Achse

verlaufenden Catalaselinien ist jedoch eine starke Stromabnahme zu beobachten,

was darauf zurückzuführen ist, dass das in der unteren Glucoseoxidaseschicht

produzierte H2O2 in der darüber liegenden Catalaseschicht enzymatisch gespalten

wird. Somit bildet sich an diesen Punkten kein H2O2 Diffusionsprofil aus, so dass mit

der Mikroelektrode an diesen Stellen ein verringerter Stromfluss zu messen ist.

Weiterhin zu bemerken ist, dass aufgrund der enzymatischen Zersetzung von H2O2

entlang der Catalaselinien durchgehend eine Verringerung des Hintergrundstroms

zu verzeichnen ist.

Eine der Hauptanwendungen interagierender Enzyme in amperometrischen

Biosensoren ist die Bestimmung von Substraten, welche in der enzymatischen

Reaktion zu einem elektrochemisch inaktiven Produkt umgesetzt werden. Das

elektrochemisch inaktive Produkt, das in der primären enzymatischen Reaktion

gebildet wird, dient dabei als Substrat eines zweiten Enzyms, aus dessen

Katalysereaktion ein elektrochemisch aktives Produkt hervorgeht. Eine derartige

Kopplung von Enzymen ist dabei nicht auf zwei Enzyme beschränkt, sondern kann

entsprechend der interagierenden Eigenschaften der Enzyme zu beliebigen

Enzymkaskaden ausgedehnt werden.

Im Folgenden wird ein Beispiel für drei interagierende Enzyme vorgestellt, welche die

Bestimmung des Disaccharids Maltose gestatten. Dabei wird die Interaktion

zwischen den Enzymen α-Glucosidase, Mutarotase und Glucoseoxidase in folgender

Reaktionssequenz ausgenutzt:

- in der α-Glucosidase-Struktur: Maltose + H2O → 2 α-D-Glucose

- in der Mutarotase-Struktur: α-D-Glucose → β-D-Glucose

- in der Glucoseoxidase-Struktur: β-D-Glucose + O2 → D-Glucono-δ-lacton + H2O2

Somit kann erwartet werden, dass sich Maltose durch die Detektion des in der

Glucoseoxidase-Strukur gebildeten H2O2 bestimmen lässt.


Abbildung 4.7-17 zeigt eine schematische Zeichnung, in der das zu erwartende

Stromprofil im SECM-Experiment in Gegenwart von Maltose erläutert wird.

Es wurde eine Gittermikrostruktur hergestellt, in der sich drei Linien immobilisierter

Glucoseoxidase mit drei Linien, die sowohl immobilisierte α-Glucosidase als auch

immobilisierte Mutarotase enthalten, schneiden. In Gegenwart von Maltose wurde

ein entsprechendes SECM-Experiment an dieser Struktur durchgeführt, in dem

enzymatisch gebildetes H2O2 mit der Mikroelektrode detektiert wird.

Das so erhaltene SECM-Bild ist in Abbildung 4.7-18 gezeigt.

Abbildung 4.7-17 erwartetes Stromprofil im SECM-Experiment über einer Glucoseoxidase/Glucosidase/Mutarotase-Gitterstruktur in Gegenwart von MaltoseDie von der Glucosidase/Mutarotase-Struktur (Enzym 2) aus Maltose(Substrat 2) generierte Glucose (Substrat 1) wird von der Glucoseoxidase(Enzym 1) umgesetzt, wobei H2O2 als detektierbares Produkt gebildet wird.Diese Enzymkopplung findet nur an den Kreuzungspunkten statt, so dass dorteine hohe lokale H2O2 Konzentration zu erwarten ist.


An den neun Kreuzungspunkten zwischen den Enzymlinien sind klare

Stromerhöhungen zu erkennen. Dies bedeutet, dass an diesen Punkten die oben

aufgeführten enzymatischen Reaktionen ablaufen und das dabei generierte H2O2 mit

der Mikroelektrode detektiert werden kann. Da Maltose als einziges Enzymsubstrat

zur Lösung zugegeben wurde, ist es offensichtlich, dass der gemessene

Oxidationsstrom proportional zur Maltosekonzentration in Lösung ist. Die

Quantifizierung der Substratkonzentration über das Stromsignal der Mikroelektrode

wurde bereits in Kapitel 4.7.3 demonstriert.

Die kommerzielle Erhältlichkeit von Enzymen wie z. B. Galactoseoxidase in

Kombination mit der hier vorgestellten Strukturierungsmethode und dem SECM zur

lokalen Detektion biochemischer Reaktionen öffnet einen neuen Weg zur

Bestimmung von Mono- und Oligosacchariden. Die Bestimmung von Sacchariden

hat große Bedeutung für die Überwachung und Qualitätskontrolle von

Milchprodukten und erfordert kostenintensive bisher chromatographische

Trennmethoden [302-304].

Abbildung 4.7-18 SECM-Bild einer Gitterstruktur aus α-Glucosidase, Mutarotase undGlucoseoxidase in Gegenwart von 0.083 M MaltoseDie drei Glucoseoxidaselinien sind parallel zur y-Achse und die dreiα-Glucosidase/Mutarotase-Linien parallel zur x-Achse orientiert.(∅ Elektrode = 50 µm , E = 0.6 V vs. Ag/AgCl)

5 Zusammenfassung und Ausblick 188

5 Zusammenfassung und Ausblick

Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Methoden und Strategien für die Entwicklung

von miniaturisierten Biosensor- und Affinitätssensor-Systemen unter Nutzung von

mikroelektrochemischen Detektionsmethoden erarbeitet. Dies gelang unter anderem

durch die Etablierung eines in Mikrotechnologie gefertigten Mikrodispensers zur

Herstellung von Biosensor-Mikrostrukturen und zur Proben- bzw.

Reagenziendosierung in Affinitätsassays.

Ein elektrochemischer Affinitätsassay mit einem neuen Detektionsverfahren, das auf

der Modulation des Diffusionskoeffizienten einer hapten-modifizierten Redoxspezies

beruht, ist entwickelt worden. Die Erniedrigung des Diffusionskoeffizienten einer

hapten-modifizierten Redoxspezies führt nach Anbindung der komplementären

Erkennungsstruktur zu einem verringerten diffusionskontrollierten Strom. Als

Modellsystem für molekulare Erkennung wurde auf das bekannte Biotin-Streptavidin-

System zurückgegriffen. Als geeignete Messelektroden für den Affinitätsassays

haben sich Mikroelektroden erwiesen, mit dem Vorteil, dass durch Redoxrecycling an

einer leitenden Oberfläche eine Verstärkung des Messsignals erzielt werden konnte

(Kapitel 4.1).

Durch die Verwendung von Erkennungselementen mit mehreren Bindungsstellen

gelang die Erweiterung des Verfahrens auf einen Sandwich-Assay, indem freie

Bindungsstellen zur Anbindung eines weiteren affinanten Bindungspartners genutzt

werden konnten (Kapitel 4.1.9). Der vorgestellte Sandwich-Assay zur Bestimmung

biotinilierter Komponenten besitzt potentielle Anwendung für die Bestimmung

Strep-Tag modifizierter Proteine in der Bioanalytik.

Die Miniaturisierung des amplifizierten Affinitätsassays gelang über die Verwendung

von sehr kleinen Tropfen im Mikrolitermaßstab als wandfreie elektrochemische

Messzellen. Für eine potentielle Automatisierung wurde ein neuartiger Aufbau

konzipiert, mit einer motorgetriebenen Spritzenpumpe zur Bildung der Tropfenzelle

und einem Mikrodispenser zum Dosieren von sehr kleinen Mengen an Reagenz oder

Probe in die Tropfenzelle (Kapitel 4.6).

Ein Vorteil des entwickelten Assayverfahrens ist, dass das Format zum einen

homogen ist, was bedeutet, dass während der Messprozedur keine Wasch- und

Separationsschritte nötig sind, und zum anderen nichtkompetitiv ist, so dass der


Analyt nicht in markierter Form zugegeben werden muss. Das zugrundeliegende

Messprinzip ist allgemein gültig und kann auf nahezu jedes biologische

Erkennungssystem übertragen werden, in dem Erkennungselemente möglichst

unterschiedlicher Strukturgröße, von denen das niedermolekulare mit einer

Redoxmarkierung versehen werden kann, einen Affinitätskomplex eingehen.

Beispiele für derartige molekulare Erkennungssysteme sind z. B. Antigen-Antikörper

oder Oligonucleotid-DNA.

Im Gegensatz zu Interdigitalelektroden, bei denen der Amplifizierungsfaktor fest über

die Elektrodengeometrie vorgegeben ist, kann bei dem hier vorgestellten Verfahren

der Verstärkungsfaktor stufenlos gewählt werden, so dass eine einfache Anpassung

an die individuellen Bedürfnisse jedes analytischen Problems möglich ist. Weiterhin

besitzen in Glas eingeschmolzene Mikroelektroden eine wesentlich höhere

mechanische Stabilität und Lebensdauer als auf Silizium aufgedampfte Metallfilme,

die bei Interdigitalelektroden als Elektrodenmaterial verwendet werden.

Das Assayverfahren konnte zudem miniaturisiert werden, so dass nur geringe

Mengen an Probe und Reagenzien nötig sind. Der dazu vorgestellte miniaturisierte

Aufbau besitzt ein hohes Automatisierungspotential und kann ohne größere

Modifikationen an Standard-Mikrotiterplatten angepasst werden. Das Assayverfahren

kann durch eine Optimierung von Parametern, wie Sensitivität des Potentiostaten,

Amplifizierungsfaktor und Elektronentransfereigenschaften des redoxmarkierten

Haptens, weiter verbessert werden.

Der im miniaturisierten Assay zur Dosierung verwendete in Silizium-Mikrotechnologie

gefertigte Mikrodispenser wurde im Rahmen eines Kooperationsprojektes während

eines Forschungsaufenthaltes am Institut für Elektrische Messtechnik der Universität

Lund (Schweden) selbst hergestellt (Kapitel 4.2) und in weitere

mikroelektrochemische Anwendungen integriert.

Mittels der Deposition der aus dem Mikrodispenser ausgestoßenen Pikolitertropfen

in einer Ölatmosphäre, um eine Verdampfung der Tropfen zu verhindern, und

elektrochemischen Messverfahren mit positionierten, in den Tropfen eintauchenden

Mikroelektroden, gelang es, ein neues Verfahren zur Bestimmung des Volumens der

aus dem Dispenser ausgestoßenen Tropfen zu entwickeln (Kapitel 4.3).

Weiterhin konnte der Mikrodispenser genutzt werden, um die Diffusionskoeffizienten

elektrochemisch aktiver Spezies in „time of flight“-Experimenten zu bestimmen.


Hierfür konnten zwei neue Verfahren etabliert werden.

Mit dem ersten Verfahren gelang die Abschätzung von Diffusionskoeffizienten in

zeitaufgelösten amperometrischen Experimenten aus der Zeitspanne, die die

Redoxspezies benötigt, um von dem Punkt, an dem sie in die Lösung gebracht

werden, bis zur elektroaktiven Oberfläche der Mikroelektrode zu gelangen, und der

dabei zurückgelegten Strecke (Kapitel 4.4.5).

Durch den Zusatz einer zweiten Redoxspezies (mit bekanntem

Diffusionskoeffizienten) konnte das Verfahren vereinfacht werden und die Zahl der

nötigen Experimente reduziert werden. Die Transitzeiten der beiden Redoxspezies,

die sich in ihrem Formalpotential unterscheiden müssen, werden sequentiell in zwei

analogen amperometrischen Experimenten mit identischen Parametern, aber bei

verschiedenen Potentialen erfasst. Über den Quotienten der Transitzeiten kann der

unbekannte Diffusionskoeffizient bestimmt werden (Kapitel 4.4.6). Die so ermittelten

Diffusionskoeffizienten konnten mit einer in der Literatur beschriebenen

Standardmethode verifiziert werden (Kapitel 4.4.7).

Eine weitere Vereinfachung des Verfahrens konnte durch die Verwendung schneller

cyclischer Voltammetrie in Kombination mit einer neu entwickelten Datenaufnahme-

und Auswertungs-Software erreicht werden, die es ermöglicht, die Transitzeiten

beider Redoxspezies in nur einem Experiment zu ermitteln (Kapitel 4.5.1).

Das vorgestellte Verfahren zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten ist

unabhängig von experimentellen Parametern wie Konzentration der Redoxspezies,

Größe der aktiven Elektrodenoberfläche und Zahl der ausgetauschten Elektronen, so

dass aufwendige Vorversuche zur Bestimmung dieser Parameter entfallen. Dadurch

ist das Verfahren auch für die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten von

Substanzen geeignet, die hygroskopisch sind und deren genaue Konzentrations-

bestimmung nur schwer möglich ist, oder die zu Adsorption auf der

Elektrodenoberfläche neigen. Im Gegensatz zu vielen anderen elektrochemischen

Verfahren, die zur Bestimmung des Diffusionskoeffizienten eine hohe Reversibilität

des heterogenen Elektronentransfers voraussetzen, ist dies bei der hier

beschriebenen Methode nicht zwingend notwendig, so dass auch

Diffusionskoeffizienten von redoxaktiven Molekülen, die einen quasireversiblen oder

irreversiblen heterogenen Elektronentransfer zeigen, bestimmt werden können.


Mit Hilfe der neu entwickelten Software für schnelle cyclische Voltammetrie und

positionierten Mikroelektroden wurde ein neues Verfahren zur Untersuchung des

Ausblutungsverhaltens von Carbonpastenelektroden entwickelt (Kapitel 4.5.2). Durch

die Zeit-, Strom- und Potentialauflösung des Verfahrens konnte gezeigt werden,

dass das Ausbluten des Redoxmediators aus Carbonpastenelektroden auf der Basis

von Zirkoniumphosphat einen bei niedrigen pH-Wert stattfindenden reversiblen

Prozess darstellt. Die Ergebnisse machen deutlich, dass bei NADH-Messungen mit

diesen Elektroden im saurem Milieu ein Kontaminierung der Probe mit dem in der

Carbonpaste inkorporierten Redoxmediator stattfindet. Das vorgestellte Verfahren

ermöglicht das Kontaminierungsverhalten von Biosensoren mit inkorporierten

Redoxmediatoren bei unterschiedlichen physiologischen Bedingungen zu

untersuchen, was vor allem bei potentiellen in-vivo-Sensoren von Bedeutung ist.

Mittels des Mikrodispensers wurde ein einfache Methode zur Mikrostrukturierung von

beliebigen Oberflächen mit biologischen Erkennungselementen entwickelt (Kapitel

4.7). Die Universalität des Verfahrens konnte durch die erfolgreiche Verwendung von

vier verschiedenen Immobilisierungstechniken gezeigt werden. Die Aktivität

immobilisierter Enzyme konnte mit hoher lokale Auflösung mittels Elektrochemischer

Rastermikroskopie detektiert werden. Weiterhin gelingt die quantitative Bestimmung

von biologischen Substraten mit Enzym-Mikrostrukturen und positionierten

Mikroelektroden (Kapitel 4.7.3), was beispielhaft für immobilisierte Glucoseoxidase

gezeigt wurde. Durch die Immobilisierung verschiedener Enzyme in dicht

nebeneinander angeordneten Strukturen gelangt man zu Multisensor-Strukturen, die

mit dem SECM in nur einem Linienscan ausgelesen werden können und so

interferenzfrei die simultane Bestimmung mehrerer Enzymsubstrate ermöglichen

(Kapitel 4.7.4). Zwei der verwendeten Immobilisierungstechniken gestatten den

Aufbau von Multischicht-Sensorstrukturen. Diese können genutzt werden, um sowohl

die Interaktion verschiedener in mehreren Schichten übereinander immobilisierter

Enzyme zu untersuchen, als auch durch gekoppelte Reaktionen interagierender

Enzyme biologische Substrate zu bestimmen, in deren enzymatischer Reaktion kein

elektrochemisch aktives Produkt gebildet wird (Kapitel 4.7.5). Die Interaktion zweier

Enzyme wurde dabei am Beispiel von Glucoseoxidase und Catalase aufgezeigt,

während die Bestimmung von biologischen Substraten mit Multienzym-

Schichtstrukturen für Maltose über die enzymatische Kopplung von α-Glucosidase,


Mutarotase und Glucoseoxidase demonstriert wurde.

Durch eine Modifizierung der Platinmikroelektrode mit Redoxmediatoren wie z. B.

Phenothiazin oder Phenoxazin sollte eine Adaption dieses Verfahrens an

NAD+/NADH-abhängige Enzyme möglich sein, wodurch die Zahl der bestimmbaren

Enzymsubstrate beträchtlich erhöht werden kann (vgl. Kapitel 2.2.2).

Durch die neu entwickelte Mikrostrukturierungsmethode wurde die Grundlage für

eine Fülle von weiteren Anwendungsmöglichkeiten gelegt. So ist es denkbar, mit

dem Mikrodispenser, der im Durchflussmodus betrieben wird, einzelne Spots von

biologischen affinanten Erkennungselementen aufzubringen. Durch das geringe

Volumen des Mikrodispensers ist dazu nur eine sehr geringe Menge an Substanz

nötig, so dass sich z. B. die Herstellung von DNA-Strukturen im finanziell

vertretbaren Rahmen bewegt. Limitierungen und Probleme, wie sie sich durch

modifizierte Tintenstrahl-Druckköpfe, die nur eine eng begrenzte Zahl an Reservoirs

besitzen, so dass nur eine limitierte Zahl an verschiedenen Erkennungselementen

auf eine Oberfläche aufgebracht werden können, entfallen.

Durch das definierte Aufbringen von vielen Spots unterschiedlicher

Erkennungselemente auf einem Substrat erhält man einen Multianalyt-Chip, der in

der Lage sein sollte, mehrere Analyte simultan zu bestimmen. Hierbei ist eine

Detektion eines erfolgten Bindungsereignisses z. B. über die Detektion einer

Redoxmarkierung mit mikroelektrochemischen Methoden denkbar.

6 Experimenteller Teil 193

6 Experimenteller Teil

6.1 Methoden

6.1.1 Elektrochemische Messungen

Elektrochemische Messungen werden, soweit nicht anders angegeben, in einer

3-Elektrodenanordnung durchgeführt. Bei der Durchführung des elektrochemischen

Affinitätsassays und der SECM-Messungen an Enzym-Mikrostrukturen diente 0.1 M

Phosphatpuffer (pH 7) als Leitelektrolyt; bei den Experimenten zur Bestimmung von

Diffusionskoeffizienten und des Volumens der vom Mikrodispenser geschossenen

Tropfen wurde 0.1 M KCl als Leitsalz verwendet.

6.1.2 Herstellung von Mikroelektroden

Die im SECM und im Affinitätsassay zur Anwendung kommenden Mikroelektroden

bestehen aus einer Kapillare aus Borosilikatglas (Durchmesser 1.5 mm), in deren

unterem Ende ein Platindraht (Durchmesser 50 µm, 25 µm oder 10 µm

eingeschmolzen ist. Nach dem Einschmelzen des Platindrahtes wird das untere

Ende der Kapillare solange abgeschliffen bis der Platindraht freigelegt ist.

Anschließend wird das untere Ende konisch zugeschliffen, so dass das

Radienverhältnis von Platin zu Glas der entstehenden Kreisfläche bei etwa 1 : 10

liegt. Der Platindraht wird im Inneren der Glaskapillare über einen leitenden Epoxy-

Kleber mit einem Kupferdraht kontaktiert, über den der Anschluss an den

Potentiostaten erfolgt. Detaillierte Angaben zur Herstellung der Mikroelektroden

finden sich in [187,203].


6.1.3 Reinigung der Mikroelektroden

Vor Gebrauch werden die Mikroelektroden mit Polierpasten abnehmender

Partikelgröße (3 µm, 1 µm und 0.3 µm) poliert und anschließend mit Wasser intensiv

abgespült. Nachfolgend werden die Mikroelektroden 10 Minuten im Ultraschallbad

gereinigt.

6.1.4 Herstellung von Pseudo-Referenzelektroden

Die Herstellung bzw. Regeneration von Pseudo-Referenzelektroden erfolgt nach

einem Standardverfahren. Der Silberdraht wird in einer 3-Elektrodenanordnung als

Arbeitselektrode geschaltet. In 1 M HCl durchläuft man 3 Potentialzyklen von -0.2 V

bis 1.2 V vs. Ag/AgCl. Auf dem Silberdraht bildet sich dabei eine braun-graue AgCl-

Schicht. Anschließend wird 300 s bei 0.3 V vs. Ag/AgCl elektrolysiert.

6.1.5 Goldbedampfung von Siliziumwafern

Die Bedampfung der Siliziumwafer mit Gold erfolgte am Lehrstuhl für Physikalische

Chemie der Ruhr-Universität Bochum. Eine Hochvakuum-Bedampfungsanlage

wurde benutzt, um die Wafer mit einer Titanschicht (50 Å) als Haftvermittler und

nachfolgend mit einer Goldschicht (1000 Å) zu bedampfen. Mit einem Skalpell

werden die Wafer in Stücke von 0.5 cm x 0.5 cm geschnitten und unter Inertgas-

atmosphäre aufbewahrt.

6.1.6 Modifizierung von Goldoberflächen mit selbstorganisierenden Mono-schichten

Cystamin-modifizierte Goldoberflächen werden durch zweistündiges Eintauchen der

Goldsubstrate bei Raumtemperatur in eine 10 mM wässrige Lösung von Cystamin

erhalten. Anschließend werden die Goldsubstrate intensiv mit Wasser gespült und im

Argonstrom getrocknet.

Zur Modifizierung von Goldoberflächen mit Aktivester-Gruppen werden diese für 1.5


Stunden bei Raumtemperatur in eine 10 mM Lösung von 3-3’-Dithiodipropionsäure-

di(N-succinimidylester) in getrocknetem DMSO getaucht. Nach Spülen mit DMSO

und wenig Wasser, um Hydrolyse der Aktivester-Gruppen zu vermeiden, werden die

Goldsubstrate im Argonstrom getrocknet.

6.1.7 Immobilisierung von Enzymen auf Oberflächen

Die Konzentration der wässrigen Enzymlösungen, mit denen der Dispenser befüllt

wird, beträgt im Allgemeinen 1 mg/mL.

Bei mit Aktivester-Gruppen modifizierte Goldoberflächen wird nur die reine

Enzymlösung geschossen.

Für die Aktivierung der Säuregruppen des Enzyms im Falle cystamin-modifizierter

Goldoberflächen wird der Enzymlösung 2 mg/mL EDAC zur Aktivierung der

Säuregruppen des Enzyms zugesetzt.

Für die Herstellung von quervernetzten Enzymstrukturen wird die Enzymlösung mit

2.5 mg/mL PEGDGE versetzt.

Für den Einschluss der Enzyme in eine Polymermatrix wird der Enzymlösung

5 mg/mL Vinnapas EP 16 zugesetzt.

Die Reaktionszeit beträgt bei allen Immobilisierungsmethoden mindestens 2

Stunden, lediglich beim Einschluss der Enzyme in Vinnapas EP 16 sollte die

Trocknungszeit mindestens 12 Stunden lang sein.

Anschließend werden die Oberflächen intensiv mit Pufferlösung hoher Ionenstärke

gespült, um nicht gebundene und adsorbierte Enzyme abzuwaschen.


6.2 Synthesen

6.2.1 Synthese des ferrocenmarkierten Biotinderivats (Fc-Biotin)

Ein wasserlösliches ferrocenmarkiertes Biotinderivat (Fc-Biotin, zur Struktur siehe

Abbildung 4.1-1) wurde in einer 2-Schritt-Synthese dargestellt.

Im ersten Schritt wird ein Alkylamin-Ferrocenderivat (Fc-CH2-NH-C2H4-O-C2H4-O-

C2H4-NH2) synthetisiert [305], welches im zweiten Schritt mit N-hydroxysuccinimido-

Biotin (NHS-Biotin) umgesetzt wird (vgl. Reaktionsschema in Abbildung 4.1-4).

Das Alkylamin-Ferrocenderivat wird durch die Umsetzung von 2,2’(-Ethylen-

dioxy)diethlyamin mit Ferrocencarbaldehyd (Fc-CHO) erhalten.

500 mg (2.34 mmol) Fc-CHO werden in 25 mL DMF und 1.36 mL (9.35 mmol)

2,2’(-Ethylendioxy)diethlyamin werden in 50 mL DMF gelöst.

In einer Dreihalskolben-Rührapparatur wird das (Ethylendioxy)diethlyamin vorgelegt

und auf 100 °C erhitzt. Über einen Zeitraum von einer Stunde wird das Fc-CHO

langsam zugetropft, um die Bildung von verbrückten Di-Ferrocenderivaten zu

vermeiden. Die Reaktionslösung wird für weitere 4 Stunden bei 100 °C gehalten und

dann auf Raumtemperatur abgekühlt. 0.2 g NaBH4 werden in 20 mL Wasser

aufgelöst und langsam zur Reaktionslösung zugegeben. Die Lösung wird über Nacht

bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird bis zur Trockene abrotiert und der

Rückstand in CHCl3 aufgenommen und über einen Faltenfilter abfiltriert. Es werden

Dünnschichtchromatogramme in CHCl3 und CHCl3/CH3OH (1:10) gemacht. Das

Filtrat wird am Rotationsverdampfer eingeengt und anschließend über eine

Kieselgelsäule mit CHCl3 als Laufmittel getrennt. Es werden verschiedene

Fraktionen gesammelt, von denen Dünnschichtchromatogramme in CHCl3 und

CHCl3/CH3OH (1:10) gemacht werden. Die zweite orangefarbige Fraktion stellt das

Produkt dar. Die Produktfraktionen werden vereinigt und bis zur Trockene abrotiert.

Der Rückstand wird in Diethylether aufgenommen, zum vollständigen Lösen wird

unter kräftigem Rühren tropfenweise CHCl3 zugegeben. Diese Lösung wird in einem

Rundkolben mit Gaseinleitungsrohr und Magnetrührer vorgelegt. Durch langsames

Zutropfen konzentrierter Schwefelsäure auf festes Natriumchlorid erzeugter

Chlorwasserstoff wird etwa 30 Minuten lang unter langsamen Rühren in die Vorlage

eingeleitet. Es fällt ein gelb-oranger Niederschlag aus. Die Reaktionslösung wird

noch eine Stunde gerührt. Der Diethylether wird abrotiert, der Niederschlag wird in


Wasser aufgenommen und abfiltriert. Das Wasser wird ebenfalls abrotiert und die

Substanz wird in einer Vakuumapparatur getrocknet.

Im zweiten Reaktionsschritt werden 0.5 mg (1.5 µmol) NHS-Biotin mit einem

zweifachen Überschuss des Alkylamin-Ferrocen in 0.1 M Phosphatpuffer (pH 7) für 2

Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Das Endprodukt Fc-Biotin wird

durch eine kommerziell erhältliche monomere Avidin-Säule von nicht-biotiniliertem

Alkylamin-Ferrocen getrennt. Diese Affinitätstrennung erlaubt die Verwendung von

nicht intensiv aufgereinigten intermediären Reagenzien, da nur Fc-Biotin und

eventuell nicht umgesetztes NHS-Biotin an das monomere Avidin der Affinitätssäule

gebunden werden. Das Endprodukt wird mittels cyclischer Voltammetrie

charakterisiert.

6.2.2 Synthese biotinilierter Glucoseoxidase

0.3 mg (0.9 µmol) NHS-Biotin werden mit einem fünffachen Überschuss (berechnet

auf der Basis von 42 Lysinresten pro Enzymmolekül) an Glucoseoxidase (20 mg) in

0.1 M Phosphatpuffer für 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Durch eine

monomere Avidinsäule wird die biotinilierte Glucoseoxidase von nicht-biotinilierterter

Glucoseoxidase getrennt.


6.3 Chemikalien

Die Reinheit aller verwendeten Substanzen war p.a. oder von höchstem erhältlichem

Standard. Verwendetes Wasser wurde dreifach destilliert.

Alle gängigen Laborchemikalien und Lösungsmittel, wie Chloroform, Methanol,

Diethylether, DMF oder DMSO, sowie Säuren und Basen wurden wahlweise von den

Firmen Merck, Fluka, oder Riedel de Haen bezogen.

6.3.1 Chemikalien

1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid Sigma, Taufkirchen, D

2,2’(-Ethylendioxy)diethylamin Fluka, Neu-Ulm, D

3-3’-Dithiodipropionsäure-di(N-succinimidylester) Fluka, Buchs, CH

Cystamindihydrochlorid Acros, Geel, B

D-Glucose Merck, Darmstadt, D

D-Maltose Biomol, Hamburg, D

Ferrocencarbaldehyd Sigma, Taufkirchen, D

Ferrocencarbonsäure Strem, Newburyport, USA

Kaliumdihydrogenphosphat Riedel de Haen, Seelze, D

Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat Merck, Darmstadt, D

Kaliumhexacyanoferrat(III) Merck, Darmstadt, D

Methylengrün Fluka, Neu-Ulm, D

Natriumborhydrid Mallinckrodt Baker, Deventer, NL

Natrium-L-Lactat Fluka, Neu-Ulm, D

N-hydroxysuccinimido-Biotin Pierce, St. Augustin, D

Paraffinöl Fluka, Neu-Ulm, D

Poly(ethylenglycol)-(400)-diglycidylether Polysciences, Warrington, USA

Polypropylenimin-octaamin-Dendrimer Aldrich, Taufkirchen, D

Riboflavin Sigma, Taufkirchen, D

Ruthenium(III)hexamintrichlorid Strem, Newburyport, USA

Tetrabutylammonium-hexafluorophosphat Fluka, Neu-Ulm, D

Tris-(hydroxymethyl)aminomethan Biomol, Hamburg, D

Vinnapas EP 16 Wacker, Burghausen, D

Zirkonium(IV)hydrogenphosphat Aldrich, Taufkirchen, D


6.3.2 Enzyme und Proteine

α-Glucosidase(EC 3.2.1.20 aus Hefen, 67 U mg-1)

Serva, Heidelberg, D

Catalase(EC 1.11.1.6. aus Rinderleber, 2100 U mg-1

fest)

Sigma, Taufkirchen, D

Glucoseoxidase(EC 1.1.3.4. von Aspergillus Niger, Typ X-S,100000-250000 U mg-1)


Lactatoxidase(aus Pediococcus Spezies, 36 U mg-1)


Mutarotase(EC 5.1.3.3. aus Schweineniere, 4400 U mg-1

Protein)


Streptavidin Institut für Bioanalytik, Göttingen, D


6.4 Materialien und Geräte

6.4.1 Materialien

Aluminiumoxid-Polierpasten Leco GmbH, Kirchheim, D(Partikeldurchmesser 1 µm und 0.3 µm)

Diamantsuspension-Polierpaste Leco GmbH, Kirchheim, D(Partikeldurchmesser 3 µm)

Polierfilz Leco GmbH, Kirchheim, D

Platindraht Goodfellow, Cambridge, UK(∅ 1 mm, 10 µm, 25 µm, 50 µm)

Silberdraht Goodfellow, Cambridge, UK(∅ 1 mm)

Glasobjektträger (76 x 26 mm) Menzel, Braunschweig, D

Goldelektroden CH-Instruments, Austin, USA(∅ 3 mm)

Borosilikatglaskapillaren Hilgenberg GmbH, Malsfeld, D

Teflonschläuche Kronlab, Mannheim, D(innerer Durchmesser 0.75 mm)

Softlink Avidin Resin (monomere Avidin-Säule) Promega, Mannheim, D

Zweikomponenten-Silberepoxykleber Polytek, Waldbronn, Depo-tek H-20E

einschraubbare Ag/AgCl-Referenzelektrode, Biometra GmbH, Göttingen, Dgefüllt mit 3 M KCl


6.4.2 Geräte

Funktionsgenerator Hewlett-Packard 33120 A Agilent, Böblingen, D

Hochvakuum-Bedampfungsanlage Univex 300 Leybold, Köln, D

Spritzenpumpe Microlab OEM 3 Hamilton, Bonaduz, CH

Netzgerät PS2403D Conrad Hirschau, D

Verschiebetische MT 75 25 mm Owis, Staufen, D(für z-Richtung mit 200 µm Piezoverstellung)

Spannungsverstärker PS 500 Owis, Staufen, D

AD/DA-Karte PCI-DAS 1602 Plug-In, Eichenau, D

Videomikroskop SPI GmbH, Oppenheim, D

Potentiostat HEKA PG 310 HEKA GmbH, Lambrecht, D

Potentiostat EG&G PAR 263A EG&G, Bad Wildbad, D

Potentiostat Petit Ampere LC-3C Bioanalytical Systems, WestLafayette, USA

6.4.3 Software

WINDOWS 98 Microsoft, Unterschleißheim, D

Hewlett-Packard HP VEE 5.0 Plug-In, Eichenau, D

Universal Library Plug-In, Eichenau, D

IDL 4.0 Research Systems Inc., Boulder, USA

Die Auswertung und Darstellung der Messdaten erfolgte mit Hilfe von EXCEL

(Microsoft, Unterschleißheim, D) und ORIGIN 4.1 (Microcal Software, Northampton,

USA). Die IDL-Unterprogramme für die dreidimensionale Darstellung der Messdaten

wurden freundlicherweise von Dr. Gunther Wittstock zur Verfügung gestellt.

7 Literatur 202

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Lebenslauf

Name Marcus MosbachGeburtsdatum 20. Februar 1973Geburtsort HerneFamilienstand ledig

Schule1979 - 1983 Grundschule Pantrings Hof in Herne1983 - 1992 Pestalozzi-Gymnasium in HerneMai 1992 Abitur

ZivildienstJuni 1992 - August 1993 Zivildienst bei der Arbeiterwohlfahrt in Herne

UniversitätOktober 1993 - Mai 1998 Studium der Chemie an der Ruhr-Universität BochumDezember 1997 - Mai 1998 Diplomarbeit am Lehrstuhl für Analytische Chemie in

der Arbeitsgruppe Elektroanalytik und Sensorik(Prof. Dr. W. Schuhmann) mit dem Titel„Untersuchung der Permeabilität von biologischenStrukturen mittels Elektrochemischer Rastersonden-mikroskopie (SECM)“

Juli 1998 - Februar 2001 Promotion am Lehrstuhl für Analytische Chemie in derArbeitsgruppe Elektroanalytik und Sensorik(Prof. Dr. W. Schuhmann) über „Mikro-elektrochemische Methoden in der Biosensorik undElektroanalytik“ gefördert durch ein Stipendium derGraduiertenförderung des Landes Nordrhein-Westfalen

ForschungsaufenthalteSeptember 2000 Forschungsaufenthalt am Institut für Elektrische

Messtechnik, Universität Lund, Schweden (Prof. Dr. T.Laurell): Herstellung von Mikrodispensern inMikrotechnologie

Oktober 1999 Forschungsaufenthalt am Institut für ElektrischeMesstechnik (Prof. Dr. T. Laurell) und Institut fürBiotechnologie (Dr. Elisabeth Csöregi), UniversitätLund, Schweden): Bestimmung der Diffusions-koeffizienten von Redoxmolekülen in „time of flight“-Experimenten

April 1999 Forschungsaufenthalt am Institut für ElektrischeMesstechnik (Prof. Dr. T. Laurell) und Institut fürBiotechnologie (Dr. Elisabeth Csöregi), UniversitätLund, Schweden): Adaption von Mikrodispenser anelektrochemische Anwendungen

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