Molekulare Diagnostik

Ralf Lichtinghagen, Klinische Chemie

Gliederung

•Methodische Grundlagen der DNA-Analytik

•Anwendungen der molekularen Diagnostik:

Assoziation von DNA-Polymorphismen mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken

Pharmakogenetik

Tumordiagnostik auf Grundlage von molekularbiologischen Methoden

Untersuchung von DNA

•Southern-Blot (Gensondentechik)•Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-PCR Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung

•DNA-Sequenzierung

Southern Blot

Southern Blot: AnwendungenBsp: Sichelzellanämie

RestriktionsenzymMst II..CCTNAGG..

β-Globingen..CCTGAGG..

Mutation..CCTGTGG..

PolymerasePolymerase Chain Chain ReactionReaction (PCR)(PCR)

1111

cyclecycle 11 cyclecycle 22

94°C∼1min 72°C

∼1min

55°C∼1min

94°C∼1min 72°C

∼1min

55°C∼1min

denaturationdenaturation annealingannealing elongationelongation

11

22

11

22

11

22

11

2211

2222

11

22

22

DNA-Template, Primer (sense, antisense)Nukleotide, Puffer, Mg2+, thermostabile DNA-Polymerase

Temperaturen und Zeiten beispielhaft

Bedeutung der PCR-Effizienz

E [%]

Aus-beute[%] *)

100 100

95 21

90 4

85 0,8

80 0,1

75 0,02

70 0,002N = N0 x En, (E von 0-2)

*)nach 30 ZyklenEffizienz (E) der Reaktion wichtig (oft 70-80%):

Protein-Polymorphismus in einer Population

Ursache: Akkumulation verschiedener Mutationen (Genpolymorphismen) im Genpool einer Population

Die Phänotyp-Verteilung in einer Population hängt von der Art der zugrunde liegenden Mutation ab

SNP: „single nucleotide polymorphisms“

Mutationstypen

Ermittlung eines Genotypsdurch die Analyse einer

bekannten Mutation

•RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)-PCR(Häufigkeit des Einsatzes etwa 25%)

•Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung(Häufigkeit des Einsatzes etwa 50%)

Genchip-Analyse zur gleichzeitigen Erfassungvieler unterschiedlicher Mutationenkommerziell bedingt erhältlich (z.B. CYP450-Array

mit 33 versch. Mutationen)

Ausstattung für RFLP-PCR

RFLP-PCRErmittlung der Punktmutation (C/T) bei Nukleotid 677 im MTHFR-Gen

(Methylentetrahydrofolsäure-Reduktase)Bedeutung für den VitB12/Folsäure-Stoffwechsel

(Artheroskleroserisiko über Einfluss auf Homocystein-Konzentration im Serum)

100200300

MN N N N N HO HE NHE

bp

•Amplifikation des DNA Bereiches•DNA-Fragment von 198 bp•Verdauung der DNA mit Hinf I

•Wildtyp: 198 bp•Homozyg. Mutation: 175 bp•Heterozyg. Mutation: 175+198 bp

Real-Time-PCRBsp.: Glaskapillar-Thermocycler

Real-Time-PCRFluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)

zwischen Hybridisierungssonden

•Methode geeignet zur Quantifizierung von PCR-ProduktenMessung eines zunehmenden Fluoreszenzsignals während der laufenden PCR. Beginn des Signalanstiegs ist das Maß für die Ausgangskonzentration des betreffenden DNA-Bereiches.

•Methode geeignet zur MutationsanalyseNach der abgeschlossenen PCR wird das Schmelzverhalten der FRET-Sonden geprüft. Mutation und Wildtyp haben aufgrund von Basen-Fehlpaarungen verschiedene Schmelzpunkte.

Genotypisierung mittels Schmelzkurvenanalyse

Schmelzkurve45 –75 °C

Ableitung-d[Fluoreszenz]/dT

WTHE

HO

WT

HE

HO

Im Beispiel:FRET-Sonden haben eine 100%ige Übereinstimmung mit der Wildtyp-Sequenz

Genotypisierung mittels Sequenzierung der betroffenen Genregion

Nukleotid 677 imMTHFR-Gen

Einbau von Didesoxynukleotiden (ddNTP) in 4 getrennten Reaktionen,Statistisch verteilte Strangabbrüche, Fragmente elektroph. getrennt,Einbau markierter dNTP (dATP) Autoradiographie (32P), Fluoreszenzlabel

Enzymatische Reaktion (DNA-Polymerase):

Erforderlich bei:•Aufspüren unbekannter Mutationen•zahlreiche Polymorphismen/Gen

klassische Autoradiographie

Increasing role of genotype at other loci

Incr

easi

ngro

leof

env

ironm

ent

and

stoc

hast

icfa

ctor

s

•Tay Sachs•Duchenne dystrophy

•Huntington disease•Cystic fibrosis

•Sickle-cell anemia

•G6PD deficiency•Hemochromatosis

•Acute intermittent porphyria

• α1-Antitrypsin ZZ

•Phenylketonuria

•Apo E-2/E-2 hyperlipoproteinämie

•Type I diabetes mellitus

Assoziation von DNA-Polymorphismen mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken

• Alpha-1-Antitrypsin

• Angiotensin converting enzyme (ACE)

• Apolipoprotein B100

• Apolipoprotein E

• Faktor II-Leiden (Prothrombin)

• Faktor V-Leiden

• HFE (HLA-H)

• HLA (Klasse I und Klasse II, zur Typisierung)

• Laktase (Laktosetoleranzstörung)

• MTHFR

• Mukoviszidose

• UDP-Glucuronosyltransferase (Gilbert-Meulengracht)

Häufig untersuchte Gene (Beispiele)

Angiotensin-converting enzyme (ACE)

Insertions (I) / Deletions (D) –Polymorphismus im ACE-Gen

0 20 40 60 80 100 U/l

Häu

figke

it

0

2

4

6

8

10

12

DD

ID

II

Klinische Bedeutung:Labordiagnostik der Sarkoidose:S-ACE als Surrogatmarker erhöht(Polymorphismus beeinflusst Serumkonz.)

Gendefekt: Risikofaktor kardiovaskulärer Erkrankungen??

Referenzintervalle (Genotyp-abhängig)

ACE Genotyp DD (ca. 25%) 24-89 U/lACE Genotyp DI (ca. 50%) 13-66 U/lACE Genotyp II (ca. 25%) 7-33 U/l

α1-Antitrypsinmangelα1-Antitrypsin: Akute-Phase-Protein aus Hepatozyten,

Aktivitätshemmung von Serinproteasen(PMN-Elastase)>40 AlleleWildtyp (PiM), Mangelallele: 7% PrävalenzWichtige klinisch relevante Mangelallele:PiZ, PiS, PiNullRisiko korreliert mit vermind. Antitryp.-Konz.high risk: PiZZ, PiZNull, PiNullNullincreased risk : PiSZ

Erkrankungen der Leber (Kindesalter): Sekretionsstörung in Hepatozyten bei PiZZ

Lungenemphysem (Erwachsenenalter):Folge einer nicht inhibierten PMN-Elastase-Aktivität

Hereditäre Hämochromatose (HH)Prävalenz in Mitteleuropa: 1:400, häufigste autos. rez. Erbkrankheit

Manifestationsalter: 40-60 Jahre, Hepatomegalie, Leberzirrhose, D. mellitus, dunkle Hautpigmentierung

Mutationen im HFE-Gen (Typ 1-Hämochromatose)Cys 282Tyr (C282Y) homozygot bei ca. 85-95% der HH-Patienten, Compound-Heterozygotie mit His63Asp (H63D) bei 3-8% der HH-Patienten (Prävalenz dieses H63D-Polymorphismus: 13%)

Typ 2-Hämochromatose (Hepcidin, Hämojuvelin): seltene juvenile Form, vor 30. Lebensjahr manifest, geht mitschwerer Kardiomyopathie und Hypogonadismus einher.

Typ 3: (Transferrinrezeptor 2)Typ 4: (basolateraler Eisencarrier Ferroportin 1)

Diagnoseweg bei V.a. hereditäre Hämochromatose

Klinische Hinweise und Transferrinsättigung >60% und S-Ferritin >250-300 ng/l

Gen-Test: Cys282Tyr-Mutation, gegebenenfalls His63Glu_ +

Gentest negativ, aber klin. Verdacht,bzw. zur Bestimmung des Ausmaßes

des Leberschadens

Hämochromatose gesichert

Leberbiopsie mit quantitativer Messungdes Lebereisengehaltes

Aderlasstherapie+

FettstoffwechselLipoproteinstoffwechsel maßgeblich durch Zelloberflächenrezeptoren mitbestimmt

LDL-Rezeptor bindet neben ApoB100 auch Apo E Funktion: Regulation der Cholesterinkonzentration

Cholesterinlieferung für zell. Bedarf, Hormonsynthese

Familiäre Hypercholesterinämie:LDL-Rez.defekte: >100 bislang bekannte Mutationen

(DNA-Sequenzierung)

ApoB100: häufigste Mutation: G10699A (Arg3500Gln)Frequenz: 1 auf 700 Kaukasierbei Heterozygotie erhöhtes S-LDL-Cholesterin,gestörte Bindung an LDL-Rezeptor,Risiko kardiovaskulärer Erkrankungen

FettstoffwechselHyperlipoproteinämie Typ III:

ApoE: ApoE2-Homozygotie ist Voraussetzung zur Ausprägung dieser Fettstoffwechselstörung

Aber: Nur ein kleiner Teil der Homozygoten erkrankt!!!Ansonsten korreliert das Allel E2 mit niedrigeren Cholesterinspiegeln.

ApoE-Allele: E2, E3 und E4 durch Mutat. C112R und R158CIsoformen: E2/2 (1%), E3/3(55%), E4/4, E2/3, E2/4, E3/4 (26%)

Rezeptorbindung E2 bindet nicht , Aktivierung des hepat. LDL-RezeptorsE4-Partikel bewirken das Gegenteil, E4 ist somit potentiell artherogen, E2 protektiv

Assoziation mit M. Alzheimer für E4

ThrombophiliediagnostikStudien gerade bei jungen Thrombophilie-patienten ergaben eine Korrelation von verschiedenen genetischen Polymorphismen vor allem in zwei Genen von Faktoren des Gerinnungssystems : Faktor V (G1691A) Prothrombin (Faktor II, G20210A)

Außerdem konnte eine Korrelation mit einem Polymorphismus (thermolabiles Enzym) der Methylentetrahydrofolsäurereduktase(MTHFR; C611T) gezeigt werden.

ThrombophiliediagnostikFaktor V: G1691A (Arg506Gln), autosom. dominant

(nach Entdeckungsort Faktor V/Leiden genannt)Effekt : verlangsamte Spaltung durch aktiviertes Protein C (APC-Resistenz)Prävalenz: 1:20 für heterozygoten Defekt

Weitverbreitester Risikofaktor für venöse ThrombosenHeterozygotie: ca. fünf- bis zehnfache Erhöhung des Thromboserisikos gegenüber der Normalbevölkerung

Homozygotie: Risiko ca. 100fach erhöht

Weitere Risikofaktoren (z.B. Kombinationsdefekte, Nikotinkonsum, Einnahme oraler Kontrazeptiva) können das Thromboserisiko zusätzlich erheblich erhöhen.

(zusätzlich Ausschluss von Prothrombin-Genmutation, Antithrombin III-, Protein C-, Protein S-Mangel).

PharmakogenetikBeschäftigt sich mit den hereditären Grundlagen der Unterschiede in einer Population bezüglich dem Response auf ein Arzneimittel.

DNA-Sequenzen variieren leicht von Individuum zu Individuum

zahlreiche Polymorphismen

Genetische und damit häufig auch Unterschiede in Proteinzusammen-setzungen verursachen daher bei gleicher Medikation verschiedene systemische Konzentrationsniveaus.

Insgesamt abhängig vonAufnahme, Absorption, Metabolismus (Phase I und Phase II Biotransformations-reaktionen), Clearance und Exkretion

PharmakogenetikEnzym Häufigkeit Medikamente ProblemeCytochrom P450CYP2D6 3-10% viele (Antidepressiva Meist verstärkte CYP2C19 2-5% Neuroleptika, Beta-Blocker.....) WirkungCYP1A2 12%

N-ActeyltransferaseNAT2 50% Isoniazid, Sulfapyridin Überempfindlich-

Dapson, Koffein, Hydralazin keitsreaktionenThiopurinmethyltransf.TPMT 0,3% Azathioprin, Mercaptopurin Leukopenie

Dihydropyrimidin-Dehydr. 5% (Het.) 5-Fluoruracil verstärkte Wirkung(DPD, DPYD)

Glukose-6-Phos.-Dehydr. 1% Sulfonamide, Primaquin Hämolyse

Serum-Cholinesterase 0,04% Succinylcholin Apnoe

Ca-Transport im ER 0,005% Inhalationsanästhetika Maligne Hyperthermie

Siehe MHH-Homepage/MHH-Internes/ CYP P450 Tabelle sowie Einrichtungen/Klinische Chemie/ Analysenspektrum/Pharmakogenetik/

Sinn dieser Analysen abh. von klin. Bedeutung + Durchführbarkeit.

Bsp: Die Cytochrom P450-Genfamilie (CYP) umfasst eine Vielzahl von Isoenzymen, die für die Verstoffwechslung diverser Substanzen verantwortlich sind.CYP 2D6: Von diesem Isoenzym (Debrisoquin-Hydroxylase) sind eine Reihe von Allelen bekannt, die zu einem Verlust der Enzymaktivität führen [CYP2D6*1 (Wildtyp)] („extensive (rapid) Metabolizer“).

CYP2D6*3, *4, *5, *6 („poor (slow) Metabolizer (PM)“) sind in 98% aller Fälle an einem Verlust der CYP2D6-Aktivität beteiligt. Zwei Mangelallelemüssen allerdings nachgewiesen werden.

CYP2D6*2 („intermediate Metabolizer“) in Verbindung mit einem Poor-Metabolizer-Allel. Genduplikationen führen zu „Ultrafast Metabolizer“.

Betroffene Pharmaka: Antidepressiva (z.B. Amitriptylin), Neuroleptika (z.B. Haloperidol), Antiarrhythmika (z.B. Propafenon)

Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6

Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6

UM: ultrafast metabolizerEM: extensive metabolizerIM: intermediate metabolizerPM: poor metabolizer

Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6

3025N =polymorphismnon-polymorphism

inpa

tient

trea

tmen

t day

s

200

150

100

50

0

45

40

5

CYP-abhängige Schwierigkeiten bei der medikamentösen Therapie psychiatrischer Patienten spiegeln sich sogar in der stationären Behandlungsdauer wider.

Höhere BehandlungskostenEM PM/IM

Mutationsnachweise in der molekulargenetischen Tumordiagnostik

•Keimbahnmutationen

•somatische Mutationen

TumordiagnostikNachweis von Keimbahn-Mutationen

Familiäre Disposition bei Krebserkrankungen:Hereditäre Tumoren: ca. 2% aller Krebserkrankungen

Hinweise auf erbliche Disposition für Tumoren:

FamilieZwei oder mehr Verwandte ersten Grades mit demselben TumorZwei oder mehr Verwandte mit seltenen TumorenEvtl. drei oder mehr Tumoren in typischer Assoziation (z.B. Mamma und Ovar)

PatientMultiple Tumoren in einem Organ oder in typischer AssoziationAssoziation von Tumoren mit anderen genetischen Auffälligkeiten oder kongenitalen DefektenTumoren an ungewöhnlichem Ort oder in frühen Lebensjahren

TumordiagnostikNachweis von Keimbahn-Mutationen

Erkrankung GenFam. Retinoblastom rbFam adenomatöse Polyposis (FAP) apcHeredit. kolorektale Karzinome o. Polyposis mlh 1Fam. Brust-/Ovarialkrebs brca 1Fam. Brustkrebs brca 2Li Fraumeni Syndrom p53Multiple endokrine Neoplasie (MEN) Typ1 men 1 (menin)Fam. Medulläres SchilddrüsenkarzinomMEN Typ 2A und 2B retFam. Melanom p16Neurofibromatose Typ 1 nfl 1Neurofibromatose Typ 2 nfl 2Gorlin Sydrom, Basalzellkarzinom ptchVon Hippel-Lindau Syndrom vhlFam. Wilms-Tumor wt 1

TumordiagnostikNachweis von Keimbahn-Mutationen

Diagnostische und präventive Maßnahmen, die den Nachweis einer genetischen Tumordisposition rechtfertigen:

Maßnahme Beispiele

Präventive Diagnostik Koloskopie bei HNPCC und FAP

Vermeidung invasiver diagnost. Ausschluss eines Risikos bei Maßnahmen bei Ausschluss einer Mitgliedern von HNPCC- und FAP-disponierenden Mutation Familien

Präventive therapeutische Maßnahmen Thyreodetektomie bei Patienten aus MEN Typ II-Familien

HNPCC: Hereditäres nicht-polypöses kolorektales KarzinomFAP: Familiäre adenomatöse Polyposis ColiMEN: Multiple endokrine Neoplasie

Tumordiagnostik IINachweis von somatischen Mutationen

Genetische Instabilität in malignen Tumoren:

Entweder kausal für Tumorgenese verantwortlich,und/oder für Tumorprogression verantwortlich!

Wichtige Gene: p53, k-ras

Mutationsanalyse zur Früherkennung von Tumoren.Tumorzellnachweise in Körperflüssigkeiten und Stuhl.

Problem: Vielzahl möglicher Mutationen, Nachweis eines mutierten Allels unter einem Überschuss von Wildtyp-Allelen.

Tumoren: z.B. Kolon-Karzinom, Pankreas-Karzinom

Tumordiagnostik IINachweis von somatischen Mutationen

p53Am häufigsten mutiertes Tumorgen (Tumorsuppressorgenkodiert für Transkriptionsfaktor). Mutationen (meist Punkt-mutationen/missense) fast ausschließlich im Bereich der DNA-bindenden Domäne (Exone 4-8).

Mutiertes P53-Protein häufig mit verlängerter Halbwertszeit,immunhistochemisch im Tumorgewebe nachweisbar.

Mutationen bzw. zelluläre Akkumulationen korrelieren mit geringerer Überlebenszeit des Patienten. (z.B. Mamma-Ca: unabhängiger prognostischer Parameter)

Tumordiagnostik IIINachweis von somatischen Translokationen

(Tumorgene an Bruchstellen von Chromosomen)

Aus technischen Gründen Nachweis von Chromosomenanomalien in Tumoren hämatopoetischer Zellen leichter. Große Mehrzahl bisher gesicherter Chromosomenanomalien bei Leukämien und Lymphomen.

Gen Rearrangement ErkrankungRearrangements, kodierende Sequenz exprimiert und nicht verändertBCL2 t(14;18)(q32;q21) follikuläres Lymphom

Rearrangements, HybridgeneBCR-ABL t(9;22) (q34;q11) CML, B-ALLPhiladelphia-Chromosom zytogenetisch bei bis zu 90% der CML nachweisbar!!!

Nachweis mittels PCR /RT-PCR mit Primern von beiden Seiten der chromosomalen Bruchstelle.

Tumordiagnostik IVNachweis/Quantifizierung zirkulierender Tumorzellen

Nachweis residualer Tumorzellen im peripheren Blut, Knochenmark oder Blutprodukten über Marker (Transkripte, Methylierungsgrad der DNA), welche nicht in hämatopoetischenZellen vorhanden sind.Target: meist Gene klassischer Tumormarker: z.B.

AFP alpha-FetoproteinPSA Prostataspezifisches AntigenCK19 Zytokeratin 19Nachweis mittels RT-PCR o. quantitativer RT-PCRNachweisgrenzen: ca. 1 Tumorzelle unter 106 Zellen

Methylierungsgrad der DNA: (neuerer Trend). DNA von Tumoren ist häufig (spez. in Promorbereichen) hypermethyliert (C 5mC).Nachweis des Methylierungsgrades von ausgewählten Indikatorgenenzum sensitiven Nachweis einer Metastasenbildung.

Experimentelle Doktorarbeit Gemeinschaftsprojekt der Abt. Gastroenterologie und der Klinischen Chemie

Matrixdegradation bei chronischen Lebererkrankungen

Funktionelle Rolle des MMP/TIMP-Systems für die hepatische Regeneration und die Entwicklung chronischer Organschäden an der Leber. Adenovirale hepatischeÜberexpression von MMPs im Mausmodel.Techniken:Immunoassays, Western-Blot in situ-Techniken, (quantitative) RT-PCR, PCR, Genexpression, Genotypanalyse, rekombinante Proteinherstellung in prokaryonten und viralen Expressions-systemen, molecular cloning

Kontakt: Prof. Dr. Ralf Lichtinghagen Tel: 3940; Pieper: 74-2272

Voraussetzungen: Molekularbiologische Vorkenntnisse nicht hinderlich,Teamfähigkeit, Interesse am wissenschaftl. ArbeitenDauer der Labortätigkeit: ca. 1 JahrFebruar 2006