Molekularer Nachweis von Vascular Endothelial Growth ......wird und eine entscheidende Rolle bei der...

Aus der Station für Künstliche Besamung und Embryotransfer

Department für Kleintiere und Pferde

Veterinärmedizinische Universität Wien

(Vorstand: AO. Univ. Prof. Dr. Christine Aurich)

Fach: Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie

Molekularer Nachweis von Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Epidermal Growth Factor (EGF) und

Platelet Activating Factor (PAF) sowie deren Rezeptoren VEGF-R1, -R2, EGF-R und PAF-R im Uterus der

graviden Hündin

Diplomarbeit

zur Erlangung der Würde einer

Magistra Medicinae Veterinariae

Der Veterinärmedizinischen Universität Wien

vorgelegt von

Elisabeth Reinbacher

Wien, im November 2011

BETREUERIN: Ao.Univ-Prof. Dr. med.vet. Sabine Schäfer-Somi Besamungs- und Embryotransferstation

Department für Kleintiere und Pferde


BEGUTACHTER:

Ao.Univ-Prof. Dr. Dieter Klein

VetCore Technologiezentrum


Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung und Fragestellung ............................................................................ 1 2. Literaturübersicht .............................................................................................. 3 2.1. Die frühe Gravidität der Hündin ......................................................... 3

2.1.1. Befruchtung ........................................................................................ 3

2.1.2. Implantation ........................................................................................ 5

2.1.3. Plazentation ......................................................................................... 8

2.2. Wachstum und Angiogenese im caninen Uterus ................................. 8

2.2.1. VEGF und Rezeptoren ...................................................................... 11

2.2.2. EGF und Rezeptor ............................................................................ 17

2.2.3. PAF und Rezeptor ............................................................................. 21

2.2.4. Expression von Wachstumsfaktoren in caninen Embryonen ............ 23

2.2.4.1. VEGF und Rezeptoren ...................................................................... 24

2.2.4.2. EGF und Rezeptor ............................................................................ 25

2.2.4.3. PAF und Rezeptor ............................................................................. 26

3. Materialien und Methodik .............................................................................. 28 3.1. Tiere .................................................................................................. 28

3.2. Materialien und Methodik ................................................................ 28

3.2.1. Embryonengewinnung und Gruppierung der Tiere .......................... 28

3.2.2. Probenentnahme, –vorbereitung und –lagerung ............................... 30

3.2.3. Bestimmung des RIN Wertes (RNA Qualitätskontrolle) .................. 31

3.2.4. Qualitative RT-PCR .......................................................................... 31

3.2.5. Quantitative RT-PCR (RT qPCR) ..................................................... 33

3.2.6. Statistik ............................................................................................. 35

4. Ergebnisse ......................................................................................................... 36 4.1. Ergebnisse der qualitativen PCR ...................................................... 36

4.1.1. Uterusproben ..................................................................................... 36

4.1.2. Embryonen ........................................................................................ 38

4.2. Ergebnisse der quantitativen PCR (RT qPCR) ................................. 40

4.2.1. VEGF ................................................................................................ 40

4.2.2. VEGF-R1 und VEGF-R2 .................................................................. 40

4.2.3. EGF ................................................................................................... 42

4.2.4. EGF-R ............................................................................................... 42

4.2.5. PAF ................................................................................................... 43

4.2.6. PAF-R ............................................................................................... 44

4.2.7. Vergleich der Gruppen untereinander ............................................... 44

5. Diskussion ......................................................................................................... 45 5.1. VEGF und Rezeptoren ...................................................................... 45

5.2. EGF und Rezeptor ........................................................................... 51

5.3. PAF und Rezeptor ............................................................................. 55

6. Zusammenfassung ............................................................................................ 60 6.1. Ziele der Arbeit ................................................................................. 60

6.2. Materialien und Methodik ................................................................ 60

6.3. Ergebnisse ......................................................................................... 60

7. Extended Summary .......................................................................................... 62 7.1. Objective of the present study .......................................................... 62

7.2. Materials and methods ...................................................................... 62

7.3. Results ............................................................................................... 62

8. Literaturverzeichnis ......................................................................................... 63

9. Danksagung .................................................................................................... 100

10. Anhang .......................................................................................................... 101 10.1. Tabelle der verwendeten Proben ..................................................... 101

Verwendete Abkürzungen

Folgende Abkürzungen wurden im weiteren Text verwendet:

Abb. ......................................................................................................... Abbildung

EGF ................................................................................... Epidermal growth factor

EGF-R ................................................................ Epidermal growth factor-receptor

PAF .................................................................................... Platelet activating factor

PAF-R ................................................................. Platelet activating factor-receptor

RT-PCR .......................................................... Real time-polymerase chain reaction

Tab................................................................................................................. Tabelle

VEGF ................................................................. Vascular endothelial growth factor

VEGF-R1 ..........................................Vascular endothelial growth factor-receptor 1

VEGF-R2 ..........................................Vascular endothelial growth factor-receptor 2

1

1. Einleitung und Fragestellung

Die Entstehung und Erhaltung der Gravidität erfordert die Kommunikation

zwischen maternalem Gewebe und dem Embryo. Diese Kommunikation wird

durch Zytokine, Wachstumsfaktoren und Hormone ermöglicht, welche sowohl

maternalen, als auch embryonalen Ursprungs sind und autokrin, parakrin oder

endokrin wirksam werden (KAYE u. HARVEY, 1995; DUC-GOIRAN et al.,

1999). Bei vielen Tierarten sind Faktoren für die maternale Erkennung und

Erhaltung der Gravidität bekannt. Beim Hund aber ist nur sehr wenig Wissen über

feto-maternale Interaktionen vorhanden und es wurde kein Faktor gefunden, der

für die maternale Erkennung der Gravidität verantwortlich ist (SCHÄFER-SOMI

et al., 2008; BECERIKLISOY et al., 2009). In mehreren Studien wurden bereits

Faktoren und Rezeptoren, die für das immunologische Milieu im Uterus und die

embryonal-maternale Kommunikation während der frühen caninen Gravidität von

Bedeutung sind, untersucht (SCHÄFER-SOMI et al., 2008, 2009;

BECERIKLISOY et al., 2009), allerdings gibt es über Faktoren, die für

Wachstum und Angiogenese im Uterus der graviden Hündin verantwortlich sind,

keine Studien. Da diese Prozesse notwendig sind, damit die Gravidität erhalten

bleibt, ist es wichtig zu verstehen, welche Faktoren dafür verantwortlich sind.

Sowohl der Embryo, als auch das Endometrium müssen sich auf die Implantation

vorbereiten, was auf beiden Seiten mit Wachstum und Differenzierung einhergeht

(CARSON et al., 2000). Fehlerhafte Implantation führt zu embryonalem Tod

(STEWART u. CULLINAN, 1997), weswegen es von Bedeutung ist zu

untersuchen, welche Faktoren die Entwicklung von Endometrium und Embryo

regulieren und synchronisieren. Die Implantation des Embryos, seine weitere

Entwicklung, das Wachstum der Plazenta und die Aufrechterhaltung der

Gravidität sind von der Entstehung eines lokalen Gefäßnetzes abhängig

(REYNOLDS et al., 2010). Die Kontrolle der Angiogenese in der Plazenta spielt

also eine Schlüsselrolle für die Erhaltung der Gravidität (CHUNG et al., 2000).

Obwohl bei vielen Tierarten bereits intensiv Forschung über Faktoren, die wichtig

für Wachstum und Angiogenese im graviden Endometrium sind, betrieben wurde,

ist bei der Hündin nur sehr wenig Wissen vorhanden.

2

Es hat sich herausgestellt, dass VEGF ein essentieller Faktor für die Angiogenese

in der Plazenta und die Implantation des Embryos ist (CHAKRABORTY et al.,

1995); Insuffizienz von VEGF oder seiner Rezeptoren kann die Implantation

verhindern oder zu unzureichender Entwicklung der Plazenta führen (RABBANI

u. ROGERS, 2001; ROCKWELL et al., 2002; DOUGLAS et al., 2009).

EGF wird sowohl vom Endometrium, als auch vom Embryo selbst während der

prä- und implantatorischen Phase gebildet und ist am Wachstum und der

Differenzierung von maternalem und embryonalem Gewebe beteiligt

(TWARDZIK, 1985; WOOD u. KAYE, 1989; HUET-HUDSON et al., 1990;

PARIA u. DEY, 1990; NELSON et al., 1991; PARIA et al., 1993a; KENNEDY et

al., 1994; WATSON et al., 1996; LIM et al., 1997; FLORES et al., 1998;

LENNARD et al., 1998; AFLALO et al., 2007).

PAF ist ein Faktor, der sowohl vom Endometrium, als auch vom Embryo gebildet

wird und eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und dem Überleben des

präimplantatorischen Embryos spielt, sowie bei der Implantation von großer

Bedeutung ist (ACKER et al., 1988; SPINKS u. O’NEILL, 1988; RYAN et al.,

1990a, b; SPINKS et al., 1990; ROBERTS et al., 1993; O’NEILL, 1995b;

O’NEILL, 1997; JIN u. O’NEILL, 2011).

Das Ziel dieser Studie war es, die Expression der Faktoren VEGF, EGF, PAF,

sowie derer Rezeptoren, welche essentiell für Wachstum und Angiogenese des

Embryos und der Plazenta während der frühen Gravidität anderer Tierarten sind,

im caninen graviden Uterus und caninen Embryonen zu erforschen. Aufgrund

ihrer großen Bedeutung für Implantation, Wachstum und Angiogenese, könnte die

Manipulation dieser Faktoren auch zur Entwicklung neuer, nicht-chirurgischer

kontrazeptiver, aber auch trächtigkeitserhaltender Maßnahmen führen.

3

2. Literaturübersicht

2.1. Die frühe Gravidität der Hündin

Die scheinbare Länge der Gestation, das Intervall zwischen der fertilen Paarung

und der Geburt, beträgt bei der Hündin 57 bis 72 Tage (CONCANNON et al.,

1983). Diese große Variation ergibt sich daraus, dass es bei der Hündin große

Unterschiede bezüglich des Intervalls zwischen Deckung, LH-Peak und Ovulation

gibt (CONCANNON, 1986). TSUTSUI u. SHIMIZU (1975) beobachteten

Deckungen, die zu einer Gravidität führten, zwischen 54 Stunden vor und 120

Stunden nach der Ovulation. Die Länge der Gestation im Bezug auf den

präovulatorischen LH-Peak zeigt allerdings nur eine geringe Variation, nämlich

64 - 66 Tage zwischen LH-Peak und Geburt (CONCANNON et al., 1983). Es

gibt zahlreiche Studien, die sich mit der zeitlichen Bestimmung der wichtigsten

Ereignisse in der Gravidität der Hündin beschäftigen, leider aber oft nur in

Relation zur Deckung oder zum Einsetzen des Östrus (CONCANNON, 1986).

Die frühe embryonale Entwicklung korreliert jedoch signifikant mit dem

Zeitpunkt des präovulatorischen LH-Peaks bzw. der Ovulation, weswegen das

Alter der Embryonen in Bezug auf diese sehr genau bestimmt werden kann

(CONCANNON, 1986; BYSTED et al., 2001; REYNAUD et al., 2005), siehe

Tabelle 1 nach CONCANNON (1986).

2.1.1. Befruchtung

Die Eizellen ovulieren etwa 2 Tage (PHEMISTER et al., 1973), genauer 38 - 50

Stunden nach dem LH-Peak (CONCANNON et al., 1977). Eine Besonderheit der

Hündin ist, dass die Eizelle bei der Ovulation als immature primäre Oozyte

freigesetzt wird, die Meiose 48 - 72 Stunden nach der Ovulation im Oviduct

fortsetzt und so zur befruchtungsfähigen sekundären Eizelle reift (HOLST u.

PHEMISTER, 1971; TSUTSUI, 1975a; REYNAUD et al., 2005). Das

Zeitintervall zwischen der Ovulation und dem Erreichen des fertilisierbaren Status

4

der Eizellen beträgt 2 - 5 Tage (PHEMISTER et al., 1973; RENTON et al., 1991)

und die Oozyten bleiben bis 5 Tage nach der Ovulation fertilisierbar (TSUTSUI u.

SHIMIZU, 1975), nach einer Studie von TSUTSUI et al. (2009) sogar bis zu 7

Tage nach der Ovulation. Es ist sehr schwierig, genaue Zeitangaben zu machen,

denn in Bezug auf die Dauer der Meiose unterscheiden sich die Oozyten stark;

unterschiedliche Entwicklungsstadien der Eizellen können in ein und derselben

Hündin gleichzeitig gefunden werden (REYNAUD et al., 2005). Letztere fanden

unterschiedliche Reifungsstadien der Oozyten zwischen 17 und 127 Stunden nach

der Ovulation. Ähnlich heterogen verhalten sich auch der Zeitpunkt der

Befruchtung und die Entwicklung der frühen Embryonen: REYNAUD et al.

(2005) fanden 2-, 3-, 4- und 8-Zell Embryonen zum gleichen Zeitpunkt in einer

Hündin. Die Spermatozoen überleben bis 6 Tage nach der Paarung im weiblichen

Genitaltrakt, einige wurden auch noch 11 Tage danach gefunden (DOAK et al.,

1967; CONCANNON et al., 1983).

Die Spermien befruchten die maturen Eizellen im MII-Stadium, der Zeitpunkt

variiert hier zwischen den verschiedenen Autoren; TSUTSUI (1975a) beobachtete

fertilisierte Oozyten bereits 48 Stunden post ovulationem, REYNAUD et al.

(2005) erst frühestens 83 Stunden nach der Ovulation, CONCANNON (1986) gab

ein Intervall von 2 - 5 Tagen nach der Ovulation an. Die Penetration von unreifen

Oozyten wurde nur in Ausnahmefällen beobachtet (REYNAUD et al., 2005).

Embryonen im Pronucleus-Stadium wurden zwischen 72 und 124 Stunden nach

der Ovulation beobachtet, zu diesem Zeitpunkt befanden sie sich bereits im

distalen Anteil des Ovidukts (TSUTSUI, 1975a; RENTON et al., 1991; BYSTED

et al., 2001; REYNAUD et al., 2005). Die Embryonen befinden sich 96 Stunden

(4 Tage) nach der Ovulation im Zwei-Zell Stadium, nach 5 - 8 Tagen im 8-Zell

Stadium und nach 8 Tagen im 16-Zell Stadium (TSUTSUI, 1975a; RENTON et

al., 1991). Sie erreichen 8.5 - 12 Tage nach der Ovulation den Uterus im Morula-

oder Blastozysten- Stadium (TSUTSUI, 1975a; RENTON et al., 1991), wo die

Blastozysten etwa 1 Woche intrauterin frei umherwandern und sich am Ende der

Migration in annähernd gleicher Anzahl in jedem Uterushorn positionieren

(HOLST u. PHEMISTER, 1971). Auch TSUTSUI (1975b) und SHIMIZU et al.

5

(1990) beobachteten eine transuterine Migration der Embryonen vor der

Implantation und folgerten, dass die Konsequenz der Migration die gleichmäßige

Verteilung der Feten in und zwischen den Uterushörnern ist.

Tab. 1: Ereignisse in der frühen embryonalen Entwicklung, nach CONCANNON (1986)

Ereignisse in der frühen embryonalen

Entwicklung

Tage in Relation zum LH-Peak

LH-Peak 0

Erste von mehreren Paarungen -5 bis +10

Erste fertile Paarung -3 bis +9

Ovulation der primären Oozyten 2

Oozyten im Oviduct

Fortsetzung der Meiose

Penetration der Spermien

Zwei-Zell Embryonen

Morulae (8-16 Zellen)

3 bis 4

3 bis 9

6 bis 10

8 bis 10

Eintritt der Morulae/Blastozysten in den

Uterus

9 bis 11

Intrauterine Migration der Embryonen 10 bis 15

Verlust der Zona pellucida, Entstehung

der Anhaftungsstellen

16 bis 18

Schwellung der Implantationsstellen,

Entstehung des Primitivstreifens

18 bis 20

2.1.2. Implantation

Die Implantation wird dadurch gekennzeichnet, dass sich der Trophoblast an das

uterine Epithel haftet und eine Bindung mit dem Endometrium eingeht. Die

Implantation bei Carnivoren kann in die Phasen der Apposition, Adhäsion und

Invasion unterteilt werden (SCHLAFKE u. ENDERS, 1975; DANTZER, 1999).

6

Die Implantation, welche durch ein endometriales Ödem an der endgültigen

Lokalisation jedes Embryos erkennbar ist, findet bei der Hündin zwischen Tag 16

und 20 nach dem Decken statt (HOLST u. PHEMISTER, 1971). In der Studie

von THATCHER et al. (1994) fand die Implantation zwischen Tag 20 und 22

nach dem LH-Peak statt, CONCANNON (1986) gab als zeitliches Intervall der

Implantation Tag 18 bis 20 nach dem LH-Peak an. Die Blastozysten sind nicht

mehr frei beweglich, die Zona pellucida, welche die Blastozyste umgibt, löst sich

auf und die Keimscheibe beginnt sich zu differenzieren (HOLST u. PHEMISTER,

1971; RENTON et al., 1991). Am Tag 20 nach dem LH-Peak wurde histologisch

die frühe, nicht-invasive Anhaftung des Trophoblasten an das Endometrium, die

Invasion des Trophektoderms in das Endometrium ab Tag 22 nach dem LH-Peak

beobachtet (THATCHER et al., 1994). Bei der Implantation nehmen das

Trophektoderm und der Trophoblast des Embryos Kontakt mit dem Uterus auf.

Die Blastozyste nimmt eine feste Position im Uterus ein und bindet an das

Endometrium. Dafür muss es zur Interaktion zwischen dem Trophektoderm mit

der apikalen Oberfläche des luminalen Epithels kommen (CARSON et al., 2000).

In der Phase der Apposition baut der Trophoblast die ersten Kontakte zum

uterinen Epithel auf (DANTZER, 1999). Während der Adhäsionsphase entwickelt

das Chorion Fortsätze in das Lumen der Uterindrüsen (DANTZER, 1999), es

kommt zu Verzahnungen zwischen den Mikrovilli des Trophoblasten sowie des

uterinen Epithels und Desmosom-ähnliche Verbindungen werden gebildet

(TACHI et al., 1970; MORRIS et al., 1982). Dieser Prozess verlangt eine genaue

Koordination der Produktion von Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Hormonen

und deren Rezeptoren sowohl embryonalen als auch maternalen Ursprungs.

Außerdem müssen auch Oberflächenkomponenten aktiviert werden, welche die

Anhaftung des Embryos an die Uteruszellen ermöglichen. Hierfür müssen

Prozesse sowohl im Embryo als auch im Uterus stattfinden (CARSON et al.,

2000). Damit sich die Blastozyste anheften und das Epithel durchdringen kann,

unterliegt die Oberfläche des uterinen Epithels morphologischen Veränderungen:

die normalerweise dicke Glycocalyx an der uterinen Oberfläche ist zur Zeit der

Implantation verschwunden (SCHLAFKE u. ENDERS, 1975), das Aktin-

Zytoskelett verändert sich und an der luminalen Plasmamembran entstehen

7

Adhäsionsmoleküle und Pinopodien (LUXFORD u. MURPHY, 1992; THIE et

al., 1997, 1998; LOPATA et al., 2002), außerdem ziehen sich die Mikrovilli des

uterinen Epithels nach der Adhäsion zurück (TACHI et al., 1970). Auch der

Zytotrophoblast weist Veränderungen der Adhäsionsmoleküle auf und exprimiert

vermehrt Matrix-Metalloproteinasen, welche zur Lyse der extrazellulären Matrix

führen und somit für die Invasion von Bedeutung sind (DAMSKY et al., 1994;

ALEXANDER et al., 1996). Zusätzlich werden auch Integrine und Liganden für

die extrazelluläre Matrix exprimiert. Die Anheftung der Blastozyste an das

uterine Epithel benötigt ein exaktes Gleichgewicht zwischen Mechanismen, die

die Adhäsion begünstigen und jenen, welche die Adhäsion hemmen (DAMSKY et

al., 1994). Es folgt die Invasion, in der das uterine Epithel aufgelöst, dessen

Basalmembran penetriert wird und der Trophoblast progressiv in das uterine

Stroma vordringt (SCHLAFKE u. ENDERS, 1975; DANTZER, 1999). Die Zellen

im Stroma beginnen zu proliferieren und vergrößern sich, was man

„Dezidualisierung“ nennt, außerdem kommt es zur Dilatation der maternalen

Blutgefäße (AMOROSO, 1952). Die maternalen Kapillaren werden fast

vollständig vom Trophoblast umschlossen, bleiben aber intakt und zwischen den

maternalen Endothelzellen und dem Syncytiotrophoblast bleibt extrazelluläre

Matrix bestehen. Während der Vaskularisation der Chorioallantois entstehen

netzförmig subtrophoblastische fetale Kapillaren. Diese wandern entlang des

Trophoblasten und umhüllen die viel größeren maternalen Kapillaren, was wie ein

Labyrinth aussieht. Dieser Prozess endet in der Bildung des plazentären Gürtels

im Bereich des Äquators des Chorions. Der Prozess der Implantation und später

Plazentation wird von einer großen Zahl von Signaltransmittern wie Hormonen,

Wachstumsfaktoren und Zytokinen maternalen und embryonalen Ursprungs

koordiniert, deren Zusammenspiel zur Entstehung eines Austauschsystems, zum

Wachstum der fetalen und maternalen Gefäße und zu Zelldifferenzierung von

uterinem und embryonalem Gewebe führt (DANTZER, 1999; SCHÄFER-SOMI

et al., 2008).

Für die erfolgreiche Implantation und Aufrechterhaltung der Gravidität müssen

sowohl maternale als auch embryonale Faktoren zusammenarbeiten. Bei vielen

Spezies sind die Faktoren, welche für die maternale Erkennung der Gravidität

8

verantwortlich sind, bekannt. Beim Hund ist allerdings nur wenig Wissen über das

maternale immunologische Milieu während der frühen Gravidität und über feto-

maternale Interaktionen vorhanden, es wurde auch bisher kein Faktor gefunden,

der für die maternale Erkennung der Gravidität verantwortlich ist. Es gibt

allerdings neue Studien über lokale Faktoren wie Zytokine und

Wachstumsfaktoren, die mit der caninen Implantation in Zusammenhang stehen

(SCHÄFER-SOMI et al., 2008, 2009; BECERIKLISOY et al., 2009).

2.1.3. Plazentation

Bei den Carnivoren handelt es sich um eine endotheliochoriale Plazentation,

welche durch die Entwicklung einer Plazenta, in der das Chorion die maternale

uterine Schleimhaut erodiert und dem Endothel der maternalen Kapillaren anliegt,

charakterisiert wird. Das Kontakt-Areal wird durch die Bildung von Falten oder

Lamellen vergrößert, damit die Fläche für den Austausch von Sauerstoff,

Kohlendioxid, Nährstoffen und Metaboliten maximiert werden kann. Diese

faltenreichen Abschnitte des Chorions bilden ein gürtelförmiges Band, weswegen

man beim Hund von einer Gürtelplazenta oder Placenta zonaria spricht. Aufgrund

der Invasivität dieser Plazentationsform wird das maternale Gewebe, welches sehr

eng mit den fetalen Häuten verbunden ist, mit der Nachgeburt abgestoßen; diese

Form wird Placenta deciduata genannt (AMOROSO, 1952; DANTZER, 1999).

2.2. Wachstum und Angiogenese im caninen Uterus

Wachstum und Differenzierung der Zellen des Endometriums und Embryos in der

frühen Gravidität sind notwendig, um die Implantation, Plazentation und

Erhaltung der Gravidität gewährleisten zu können (CARSON et al., 2000). Die

präimplantatorische Phase erfordert feto-maternale Interaktionen, die zur

maternalen Erkennung und Erhaltung der Gravidität führen, welche spezies-

spezifisch reguliert werden; der Embryo selbst produziert in dieser Phase eine

große Menge an Zytokinen, Hormonen und Enzymen, nimmt also aktiv an der

9

Regulation der periimplantatorischen Periode teil (SCHÄFER-SOMI, 2003).

Wachstumsfaktoren haben im feto-maternalen Dialog einen bedeutenden

Stellenwert, wobei diese vom weiblichen Reproduktionstrakt und Embryo selbst

produziert werden und autokrin sowie parakrin auf die Rezeptoren an den

Zielzellen wirken (KAYE u. HARVEY, 1995; PARIA et al., 2000; CASTRO-

RENDON et al., 2006). Die Implantation des Embryos erfordert die

Synchronisation und Koordination der Entwicklung des Embryos und des

Endometriums, welches für die Blastozyste empfänglich sein muss (PARIA et al.,

1993b), denn Probleme während der Implantation resultieren in inadäquatem

Wachstum des Embryos oder auch embryonalem Tod (STEWART u.

CULLINAN, 1997).

Kontrollierte, nicht pathologische Angiogenese kommt im Gewebe von adulten

Organismen selten vor. Eine Ausnahme bildet der weibliche Reproduktionstrakt,

wo Angiogenese im Endometrium sowohl während des Zyklus als auch während

der Gravidität eine essentielle Stellung einnimmt (KLAGSBRUN u. D’AMORE,

1991). Das Wachstum der Plazenta, die Implantation des Embryos und seine

weitere Entwicklung sind von der Entstehung eines lokalen Gefäßnetzes abhängig

(REYNOLDS et al., 2010). Die Kontrolle der Angiogenese in der Plazenta spielt

also eine Schlüsselrolle für die Erhaltung der Gravidität (CHUNG et al., 2000).

Die frühe Gravidität ist eine sehr kritische Phase, weil zu diesem Zeitpunkt

wichtige Ereignisse wie die Entwicklung der Plazenta und der embryonalen

Organe stattfinden. Über die Plazenta werden Gase, Nährstoffe und Metaboliten

zwischen dem maternalen und fetalen System transportiert. Bei der Entwicklung

der Plazenta ist Angiogenese sowohl auf maternaler als auch fetaler Seite von

größter Bedeutung, um eine optimale Umgebung für den Embryo und den

Austausch zwischen Mutter und Fetus im Uterus gewährleisten zu können. Es ist

daher sehr wichtig, die komplexen Regulationsmechanismen, die für Angiogenese

verantwortlich sind, zu verstehen. Es hat sich herausgestellt, dass die plazentäre

Angiogenese in gefährdeten Schwangerschaften, in welchen das fetale Wachstum

beeinträchtigt ist, nicht adäquat stattfindet. Studien haben gezeigt, dass die

Defekte in der vaskulären Entwicklung bereits in der frühen Gravidität entstehen

(REYNOLDS u. REDMER, 2001; BURTON et al., 2009). Bereits MEEGDES et

10

al. (1988) entdeckten, dass unzureichende Entwicklung der plazentären

Blutversorgung beim Menschen zu embryonalem Tod während der frühen

Schwangerschaft führen kann. Die Identifikation der Faktoren, welche

Entwicklung, Wachstum und Erhaltung der plazentären Gefäßversorgung

kontrollieren, kann dabei helfen, die Pathogenese von fehlerhafter Plazentation zu

verstehen und die Diagnose und Behandlung von gefährdeten Graviditäten zu

ermöglichen (VUORELA et al., 1997).

Die Bildung von Blutgefäßen kann durch 2 Prozesse geschehen: Vaskulogenese

und Angiogenese. Unter Vaskulogenese versteht man die Bildung von

Blutgefäßen durch die Differenzierung von Mesenchymzellen zu

Hämangioblasten und weiter zu Angioblasten während der embryonalen

Entwicklung. Bei der Angiogenese hingegen entstehen die neuen Gefäße aus

einem bereits bestehenden Gefäßnetz; es kommt zur proteolytischen Spaltung der

extrazellulären Matrix, Migration und Proliferation der Endothelzellen, Bildung

eines Gefäßlumens und funktionellen Reifung des Endothels (FOLKMAN u.

KLAGSBRUN, 1987; RISAU, 1995, 1997). Sowohl Vaskulo- als auch

Angiogenese sind essentiell beim Wachstum und der Differenzierung der Plazenta

und des Embryos. Beim Menschen resultiert die plazentare Vaskularisation aus

der de-novo Formation von Kapillaren in den plazentaren Villi von fetalen

pluripotenten mesenchymalen Vorläuferzellen ausgehend, welche sich zu

Hämangioblasten differenzieren, welche wiederum die Vorläufer für Endothel-

und hämatopoietische Zellen sind (DEMIR et al., 1989). Leider ist bisher zu

wenig über die Faktoren, welche die Gefäßentwicklung in der Plazenta steuern,

bekannt. VEGF, exprimiert sowohl von maternaler, als auch fetaler Seite, scheint

definitiv eine Rolle zu spielen (RABBANI u. ROGERS, 2001; HERYANTO et

al., 2003).

Bei der Hündin existieren, im Gegensatz zu anderen Tierarten, nur wenige

Studien über Wachstum und Angiogenese im graviden Uterus und Faktoren,

welche diese beeinflussen: in der Studie von BECERIKLISOY et al. (2009)

wurde die Expression von den Wachstumsfaktoren, welche möglicherweise bei

der Implantation der Embryonen bei der Hündin wichtig sind, untersucht, wobei

11

vor allem Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor (GM-CSF ) und

Insulin-like Growth Factor-2 (IGF-2) während der Implantation aufreguliert

wurden und wahrscheinlich fetales Wachstum und Modulation des maternalen

Immunsystems unterstützen. SCHÄFER-SOMI et al. (2008) untersuchten

verschiedene Zytokine, Wachstumsfaktoren sowie Immunzellrezeptoren im

präimplantatorischen caninen Uterus und kamen zu dem Ergebnis, dass der

Embryo selbst direkt oder indirekt die Expression der untersuchten Faktoren

beeinflussen muss. SCHÄFER-SOMI et al. (2009) untersuchten die Expression

von Leukemia Inhibitory Factor (LIF) im Uterus von graviden und nicht graviden

Hündinnen, da LIF embryonales Wachstum stimuliert und eine wichtige Rolle

während der Implantation spielt. Die Expression von LIF-Genen stieg im Verlauf

der Gravidität im Uterusgewebe an, was ein Hinweis auf die Bedeutung dieses

Faktors für die Entstehung der caninen Gravidität ist. Zusätzlich gibt es noch

weitere Studien bezüglich Proteinen, welche vom Endometrium frühgravider

Hündinnen sezerniert werden, wobei jedoch keine signifikanten Unterschiede

zwischen zyklischen und graviden Hündinnen entdeckt werden konnten (BUHI et

al., 1992, 1993, 1995).

2.2.1. VEGF und Rezeptoren

Vaskulogenese und Angiogenese entstehen durch das Zusammenwirken der

lokalen Sauerstoff-Konzentration und anti-angiogenetischen sowie pro-

angiogenetischen Faktoren und deren Rezeptoren, welche auch an der

Entwicklung von Gefäßen im Embryo und in der Plazenta beteiligt sind und von

Zellen und Bestandteilen maternaler und fetaler Gewebe produziert werden

(CHARNOCK-JONES et al., 2004; KAUFMANN et al., 2004; MAYHEW et al.,

2004; BURTON et al., 2009). Es sind zahlreiche Faktoren bekannt, die wichtig für

die Angiogenese im Endometrium sind, da sie in ihrem komplexen

Zusammenwirken die Proliferation, Migration und Formation von Kanälen der

Endothelzellen bewirken (HANAHAN, 1997; SMITH, 1998). Darunter befinden

sich auch die Wachstumsfaktoren aus der Familie von Vascular Endothelial

Growth Factor (VEGF), Fibroblast Growth Factor (FGF), Epidermal Growth

12

Factor (EGF), Placental Growth Factor (PlGF), Transforming Growth Factor-α

und -β (TGF-α und -β), Tumour necrosis facor-α (TNFα), Angiogenin,

Prostaglandin E2 (PGE2), Platelet-Derived Endothelial Cell Growth

Factor/Thymidine Phosphorylase (PD-ECGF/TP) und die Angiopoietine

(KLAGSBRUN u. D’AMORE, 1991; REYNOLDS u. REDMER, 1995;

FERRARA u. DAVIS-SMYTH, 1997; HANAHAN 1997; RISAU, 1997; SMITH,

1998; CHARNOCK-JONES et al., 2004; REYNOLDS et al., 2005; BURTON et

al., 2009). Die wichtigsten Faktoren der plazentären Angiogenese scheinen

VEGF, FGF und die Angiopoietine sowie deren Rezeptoren zu sein (REYNOLDS

et al., 2005). Doch auch Progesteron (WALTER et al., 2005) und die Implantation

des Embryos stimulieren die Angiogenese, es ist aber unwahrscheinlich, dass

dieser Stimulus vom Embryo produziert wird (DOUGLAS et al., 2009), denn

auch mechanische Stimulation (z.B. intraluminale Injektion von Sesamöl) führt

zur Dezidualisierung und Blutgefäßentwicklung ohne die Anwesenheit eines

Embryos (KASHIWAGI et al., 2007).

Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), auch Vascular Permeability Factor

genannt, ein Polypeptid-Faktor, ist ein potentes Mitogen für Endothelzellen, ein

wichtiger Faktor für die Angiogenese (FERRARA u. HENZEL, 1989): er

stimuliert Wachstum und Proliferation von Endothelzellen, erhöht die vaskuläre

Permeabilität (SENGER et al., 1986; CONNOLLY et al., 1989;

GOSPODAROWICZ et al., 1989; BROWN et al., 1992), bewirkt Vasodilatation

(KU et al., 1993) und ist außerdem an der Protektion der Blutgefäßwand beteiligt

(WHEELER-JONES et al., 1997). Da Angiogenese sowohl Proliferation als auch

Migration der Endothelzellen beinhaltet, ist VEGF auch an beiden Prozessen

beteiligt (SENGER et al., 1996). Die Reifung der Gefäße zu komplexeren

Strukturen erfordert jedoch weitere Proteine: angiopoietin-1, angiopoietin-2 und

deren Rezeptor tie-2 (MAISONPIERRE et al., 1997). Da VEGF aber nicht nur an

proliferierende, sondern auch an Gefäße im Ruhezustand bindet, wird vermutet,

dass der Faktor auch für die Erhaltung der Endothelzellen von Bedeutung ist

(JAKEMAN et al., 1992; SHWEIKI et al., 1993).

13

VEGF ist für zahlreiche physiologische und pathologische Prozesse, bei welchen

Angiogenese essentiell ist, wie bei der Wundheilung (BROWN et al., 1992;

PETERS et al., 1993) und bei Veränderungen im weiblichen Reproduktionstrakt

während des Zyklus und der Gravidität im Endometrium (CHARNOCK-JONES

et al., 1993, SHWEIKI et al., 1993) bedeutend; ist aber auch an der Angiogenese

von Tumoren beteiligt und wird von Tumorzellen vieler humaner Neoplasien

hochgradig exprimiert (SENGER et al., 1986; BROWN et al., 1993a, b).

VEGF bindet an mindestens 2 Rezeptoren der Familie Tyrosin-Kinase

Rezeptoren: VEGF-R1 (c-fms-like tyrosine kinase, flt-1) (SHIBUYA et al., 1990;

DE VRIES et al., 1992) und VEGF-R2 (fetal liver kinase 1, Flk-1 oder kinase

insert domain-containing receptor, KDR) (MATTHEWS et al., 1991; TERMAN

et al., 1992; QUINN et al., 1993). Die Expression der Rezeptoren von VEGF ist

hauptsächlich auf Endothelzellen von Geweben und Organen adulten und

embryonalen Ursprungs beschränkt (CONNOLLY et al., 1989;

GOSPODAROWICZ et al., 1989; JAKEMAN et al., 1992; PETERS et al., 1993;

QUINN et al., 1993), aber auch humane Makrophagen der Peritonealflüssigkeit

exprimieren neben VEGF auch beide VEGF-Rezeptoren, wobei VEGF einen

chemotaktischen Effekt auf diese hat (McLAREN et al., 1996).

Im Uterus spielen räumlich-zeitliche Synthese und Sekretion von mehreren

Steroidhormon-gesteuerten Wachstumsfaktoren, Zytokinen, Lipid-Mediatoren

und Transkriptions-Faktoren eine wichtige Rolle bei der Vorbereitung des Uterus

auf die Implantation (CARSON et al., 2000). Das Endometrium, speziell seine

Gefäße, unterliegt zyklischen Veränderungen und muss auf die Implantation

vorbereitet werden, weswegen Angiogenese eine bedeutende Rolle spielt. VEGF

wird im Endometrium sowohl während des Zyklus als auch der Gravidität

exprimiert. Der Faktor wird im zyklischen Endometrium von Ratten (SHWEIKI

et al., 1993), Kaninchen (DAS et al., 1997), Schafen (REYNOLDS et al., 1998),

Pferden (SILVA et al., 2011), Schweinen (WINTHER et al., 1999), Menschen

(CHARNOCK-JONES et al., 1993; LI et al., 1994; SHIFREN et al., 1996;

MÖLLER et al., 2001; SUGINO et al., 2002) exprimiert und wurde auch schon

im Endometrium der Hündin im Metöstrus entdeckt (BUKOWSKA et al., 2011a).

14

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass VEGF eine bedeutende Rolle bei der

Angiogenese und Funktion der Blutgefäße im zyklischen Endometrium spielt.

Die Expression von VEGF wird von hormonellen und nicht-hormonellen

Mechanismen reguliert: da das Endometrium sich während jedes Zyklus unter

dem Einfluss von Sexualsteroiden, welche Wachstum, Differenzierung und

Funktion des Endometriums über lokale Wachstumsfaktoren regulieren,

verändert, wird auch VEGF von diesen Hormonen beeinflusst: beim Menschen,

Schaf und bei der Ratte haben die Sexualsteroide, vor allem Östrogen, aber auch

Progesteron einen stimulierenden Einfluss auf die Expression von VEGF im

Endometrium (CHARNOCK-JONES et al., 1993; CULLINAN-BOVE u. KOOS,

1993; McLAREN et al., 1996; SHIFREN et al., 1996; REYNOLDS et al., 1998;

SUGINO et al., 2002). Aber auch die Expression von VEGF-R2 im humanen

Endometrium wird unter dem Einfluss der beiden Steroidhormone aufreguliert

(SUGINO et al., 2002; WELTER et al., 2003). Die Folgerung daraus ist, dass das

von Zellen im Endometrium produzierte VEGF für die von endo- und exogenen

Östrogenen hervorgerufene erhöhte vaskuläre Permeabilität und Proliferation der

uterinen Blutgefäße essentiell und möglicherweise auch an der Herstellung von

Bedingungen, unter denen weitere Wachstumsfaktoren wirken können, beteiligt

ist (CULLINAN-BOVE u. KOOS, 1993; REYNOLDS et al., 1998). Neben den

ovariellen Steroidhormonen beeinflusst Hypoxie VEGF: niedrige lokale

Sauerstoff-Konzentration stimuliert die Expression von VEGF im zyklischen

humanen Endometrium (SHARKEY et al., 2000), was eine bedeutende Rolle für

die Angiogenese und den endometrialen Wiederaufbau nach der Menstruation

spielen könnte. Lokale Hypoxie nimmt außerdem auch eine Schlüsselrolle bei der

Angiogenese während der plazentären Entwicklung ein: in humanen plazentären

Fibroblasten steigt die Konzentration von VEGF unter hypoxischen Bedingungen

signifikant an (WHEELER et al., 1995). Dies stimmt auch mit den

Beobachtungen von SHARKEY et al. (1993) überein, denn diese Autoren fanden

besonders starke VEGF-Expression von Makrophagen, welche nekrotische

Bereiche im Bereich der Implantationsstelle der Plazenta umgeben. Somit scheint

VEGF einer der Mechanismen zu sein, über die Hypoxie die Entwicklung der

Plazenta stimuliert. Zusätzlich sind noch verschiedene Zytokine und

15

Wachstumsfaktoren an der Regulation der VEGF-Expression beteiligt (SMITH,

1998), dazu gehören Fibroblast Growth Factor (FGF), selbst ein potentes

Mitogen, welches die angiogenetische Wirkung von VEGF potenziert (PEPPER et

al., 1992) und Epidermal Growth Factor (EGF), welcher die Produktion von

VEGF in Stromazellen des Endometriums stimuliert (KAWANO et al., 2002).

Auch TNF-α und TGF-β1, pro-angiogenetische Zytokine, stimulieren die VEGF-

Expression von humanen Trophoblastenzellen (CHUNG et al., 2000).

Während der Gravidität spielt VEGF bei der Implantation und der Entwicklung

des plazentären Gefäßnetzes eine Rolle, er stimuliert Endothelzell-Proliferation

und vaskuläre Permeabilität (RABBANI u. ROGERS, 2001; HERYANTO et al.,

2003). Seine Expression korreliert mit der gesteigerten Entwicklung der

plazentaren Gefäßdichte bei fortschreitender Gestation von Schweinen

(VONNAHME et al., 2001) und Schafen (BOROWICZ et al., 2007). Zahlreiche

Studien bestätigten die Expression von VEGF in der Plazenta vieler Tierarten und

dass VEGF, welches lokal vom Trophoblast und Deziduazellen gebildet wird,

eine bedeutende Rolle bei der Angiogenese, Regulation der synzytio-vaskulären

Permeabilität, Entwicklung der Plazenta und Differenzierung des

Zytotrophoblasten spielt: VEGF wird in der Plazenta von Mäusen (SHWEIKI et

al., 1993; CHAKRABORTY et al., 1995; DUMONT et al., 1995), Ratten

(JAKEMAN et al., 1993), Kaninchen (DAS et al., 1997), Schafen (CHEUNG et

al., 1995; BOGIC et al., 2000), Pferden (SILVA et al., 2011), Schweinen

(WINTHER et al., 1999; VONNAHME et al., 2001; KACZMAREK et al., 2008)

und Menschen (SHARKEY et al., 1993; AHMED et al., 1995; COOPER et al.,

1995; WHEELER et al., 1995; SHIRAISHI et al., 1996; SUGINO et al., 2002;

DEMIR et al., 2004) während der Gravidität hochgradig exprimiert. In der Studie

von BUKOWSKA et al. (2011a) wurde VEGF-mRNA zum ersten Mal im

graviden Endometrium der Hündin nachgewiesen.

VEGF wird aber auch im Trophoblasten von Ratten (JAKEMAN et al., 1993),

Mäusen (SHWEIKI et al., 1993; CHAKRABORTY et al., 1995; DUMONT et al.,

1995), Kaninchen (DAS et al., 1997), Schafen (CHEUNG et al., 1995;

REYNOLDS et al., 1998; BOGIC et al., 2000), Schweinen (WINTHER et al.,

16

1999; CHARNOCK-JONES, et al., 2001; VONNAHME et al., 2001), Rhesus-

Affen (WANG et al., 2003) und Menschen (SHARKEY et al., 1993; JACKSON

et al., 1994; AHMED et al., 1995; COOPER et al., 1995; CLARK et al., 1996;

SHIRAISHI et al., 1996; VUCKOVIC et al., 1996; DEMIR et al., 2004)

detektiert. Die Expression von VEGF im Trophoblast deutet darauf hin, dass

dieser aktiv an der Entwicklung des plazentären Gefäßsystems teilnimmt

(JACKSON et al., 1994). SHWEIKI et al. (1993) folgerten, dass VEGF, welches

im Trophoblast exprimiert wird, möglicherweise das Wachstum und die

Migration von Endothelzellen in Richtung des Embryos stimulieren könnte.

Außerdem könnte VEGF auch stimulierend auf die Proliferation und Invasion des

Trophoblasten wirken (SHIRAISHI et al., 1996).

Beide VEGF-Rezeptoren konnten in den Endothelzellen der Gefäße der Plazenta

von Ratten (JAKEMAN et al., 1993), Mäusen (CHAKRABORTY et al., 1995;

DUMONT et al., 1995), Kaninchen (DAS et al., 1997), Schafen (CHEUNG und

BRACE, 1999), Pferden (SILVA et al., 2011), Schweinen (WINTHER et al.,

1999; CHARNOCK-JONES et al., 2001), Rhesus-Affen (WANG et al., 2003),

Endothelzellen und Hämangioblasten als auch hämatopoietischen Zellen in der

Plazenta des Menschen (SUGINO et al., 2002; DEMIR et al., 2004) gefunden

werden. Zusätzlich werden die Rezeptoren auch in den Epithelzellen des

Endometriums während der Gravidität exprimiert (CLARK et al., 1996; SUGINO

et al., 2002; SILVA et al., 2011).

Da es für die Entwicklung des Fetus essentiell ist, dass eine ausreichende

Blutversorgung der Plazenta besteht, haben Faktoren, welche für die Angiogenese

wichtig sind, einen bedeutenden Einfluss auf das Wachstum und die Entwicklung

des Fetus. Unzureichende Gefäßentwicklung und Expression von

angiogenetischen Faktoren in der Plazenta sind mit zahlreichen Komplikationen

in der Gravidität, welche mit abnormem fetalen Wachstum und Tod einhergehen,

assoziiert und entstehen meist schon in der frühen Gravidität (REYNOLDS et al.,

2005). Veränderungen der VEGF-Expression spielen eine Rolle bei Pathologien

während der Gravidität, welche durch unzureichendes Wachstum und

unzureichende Vaskularisation der Plazenta verursacht werden (MAYHEW et al.,

17

2004). Dazu zählen die Präeklampsie (COOPER et al., 1996), Fehlgeburten

(VUORELA et al., 2000), sowie hypoxisch-ischämische Veränderungen der

Plazenta und Chorioamnionitis des Menschen (KUMAZAKI et al., 2002) und

restriktives fetales Wachstum aufgrund insuffizienter Entwicklung der Plazenta

beim Schaf (REGNAULT et al., 2002; REYNOLDS et al., 2005). Da

Angiogenese im Endometrium essentiell ist, um die Implantation und

Entwicklung des Embryos gewährleisten zu können, ist es wahrscheinlich auch

möglich durch die Inhibition von Faktoren wie VEGF, welche wichtig für die

Angiogenese und Implantation sind, postkoitale kontrazeptive Maßnahmen zu

ergreifen. Es gelang durch die Verabreichung von VEGF und VEGF-R2

Antikörpern die Implantation von Embryonen zu verhindern (ROCKWELL et al.,

2002; SHARKEY et al., 2005; SENGUPTA et al., 2007; DOUGLAS et al., 2009).

Aufgrund der bedeutenden Rolle von VEGF bei der Entwicklung der Plazenta bei

vielen anderen Tierarten, wollten wir in dieser Studie die Expression von VEGF

und seinen Rezeptoren bei der Hündin in der frühen Gravidität untersuchen.

2.2.2. EGF und Rezeptor

Die Implantation des Embryos erfordert die Synchronisation und Koordination

der Entwicklung des Embryos und des Endometriums, welches für die Blastozyste

empfänglich sein muss (PARIA et al., 1993b), denn Probleme während der

Implantation resultieren in inadäquatem Wachstum des Embryos oder auch

embryonalem Tod (STEWART u. CULLINAN, 1997). Die Steroidhormone

Östrogen und Progesteron spielen während der Vorbereitung des Uterus auf die

Implantation eine bedeutende Rolle, denn sie führen zur Proliferation und

Dezidualisierung des Endometriums (IRWIN et al., 1989); die Wirkung dieser

Hormone auf das Endometrium wird über die Koordination und Interaktion von

verschieden lokalen Wachstumsfaktoren, welche auto- oder parakrin wirken,

vermittelt (STEWART u. CULLINAN, 1997; CASTRO-RENDON et al., 2006).

In dieser Phase müssen Mutter und Embryo miteinander kommunizieren,

Wachstumsfaktoren nehmen bei dieser Kommunikation einen großen Stellenwert

18

ein (FISCHER et al., 1994). Mitglieder der Familie von Epidermal Growth Factor

(EGF) gehören zu den wichtigsten Wachstumsfaktoren während der Implantation,

werden vom Uterus und Embryo während der Implantation exprimiert und wirken

als lokale Mediatoren der steroidalen Effekte auf Wachstum und Differenzierung

des Endometriums zur Vorbereitung auf die Implantation (TWARDZIK, 1985;

HUET-HUDSON et al., 1990; NELSON et al., 1991; PARIA et al., 1993a;

KENNEDY et al., 1994; WATSON et al., 1996; LIM et al., 1997; FLORES et al.,

1998; LENNARD et al., 1998), beeinflussen aber auch die Entwicklung des

präimplantatorischen Embryos selbst (WOOD u. KAYE, 1989; PARIA u. DEY,

1990; AFLALO et al., 2007).

Zur Familie von EGF gehören EGF, Transforming Growth Factor-α (TGF-α),

Heparin-binding EGF (Hb-EGF), Betacellulin, Epiregulin, Amphiregulin (AR)

und Neureguline 1-3 (NRGs) (TOYODA et al., 1995; LIM et al., 1998); alle

haben einen mitogenen Effekt auf zahlreiche Zielzellen (SCHREIBER et al.,

1986). EGF wirkt mitogen auf die fetalen und maternalen Zellen der Plazenta: er

stimuliert die Proliferation von Epithel- und Stromazellen des Endometriums

(NELSON et al., 1991; HAMMOND et al., 1993) und stimuliert auch das

Wachstum und Differenzierung von Mäuse-Trophoblasten und humanen

Trophoblasten in vitro (MACHIDA et al., 1995; MARUO et al., 1995). TGF- α ist

zusätzlich, wie auch EGF, ein angiogenetischer Faktor (SCHREIBER et al.,

1986); EGF stimuliert außerdem die VEGF-Produktion in endometrialen

Stromazellen (KAWANO et al., 2002), diese Wachstumsfaktoren könnten also

auch an der Vaskularisation der Plazenta beteiligt sein.

Die Mitglieder der EGF-Familie binden an Rezeptoren der erbB Gen Familie,

welche aus 4 Rezeptor Tyrosin Kinasen besteht: ErbB1 (EGF-R), ErbB2, ErbB3

und ErbB4, welche zwar strukturell sehr ähnlich sind, sich aber in der Spezifität

ihrer Liganden unterscheiden (LIM et al., 1998). Alle 4 Rezeptoren werden

sowohl im Uterus und Embryonen von Mäusen (LIM et al., 1997, 1998), als auch

im Trophoblast von Kaninchen (KLONISCH et al., 2001) in der

periimplantatorischen Phase exprimiert und sind aufgrund ihrer unterschiedlichen

Lokalisation in unterschiedlichen Zellen des Endometriums und der Fähigkeit,

19

unterschiedliche Liganden zu binden, wahrscheinlich für verschiedene Ereignisse

während der Implantation wie Adhäsion, Apposition, Penetration, Invasion und

Dezidualisierung verantwortlich (LIM et al., 1997, 1998).

Die Expression von EGF und EGF-R im Endometrium wird sowohl von

Östrogen, als auch von Progesteron stimuliert. Da EGF und andere

Wachstumsfaktoren wie TGF-α und TGF-β sowie FGF die Proliferation von

Stromazellen des Endometriums stimulieren, scheint EGF einer der Mechanismen

zu sein, über die Östrogen das Wachstum und Progesteron die Differenzierung

und Dezidualisierung des Endometriums beeinflussen und zur Vorbereitung des

Endometriums auf die Implantation führen (MUKKU u. STANCEL, 1985;

HUET-HUDSON et al., 1990; IRWIN et al., 1991; HAMMOND et al., 1993;

DAS et al., 1994; WATSON et al., 1996; BYUN et al., 2008).

In der prä- und implantatorischen Phase kommt es zur Proliferation und

Differenzierung der uterinen Zellen und EGF und sein Rezeptor sind an der

Regulierung dieser Prozesse beteiligt (NELSON et al., 1991; HAMMOND et al.,

1993; MACHIDA et al., 1995; MARUO et al., 1995). EGF und sein Rezeptor

werden während der periimplantatorischen Periode im Uterus zahlreicher

Tierarten exprimiert: EGF wurde im Endometrium von Mäusen (CAI et al., 2003)

und Ratten (BYUN et al., 2008), im Trophoblast und der Dezidua von Kaninchen

(HOFMANN u. ANDERSON, 1990; KLONISCH et al., 2001), im Endometrium

von Ziegen (FLORES et al., 1998) und Kühen (KLIEM et al., 1998b), im

Endometrium und den fetalen Membranen bei Stuten (STEWART et al., 1994;

LENNARD et al., 1998), im Endometrium von Schweinen ((KENNEDY et al.

1994; WOLLENHAUPT et al., 1999; KIM et al., 2001, 2009) und Rhesus-Affen

(YUE et al., 2000) und im Trophoblast und Deziduazellen von Menschen

(SAKAKIBARA et al., 1994; MARUO et al., 1995) nachgewiesen.

Auch der EGF-Rezeptor, EGF-R, wird im Endometrium von Mäusen (BROWN et

al., 1989; DAS et al., 1994; LIM et al., 1998; CAI et al., 2003), Ratten (BYUN et

al., 2008), in der Dezidua und dem Trophoblast von Kaninchen (HOFMANN u.

ANDERSON, 1990; KLONISCH et al., 2001), im Endometrium von Schafen

(TAMADA et al., 2002) und Kühen (KLIEM et al., 1998b), Endometrium und

20

fetalen Membranen von Pferden (LENNARD et al., 1998), Uterus von graviden

Schweinen (KENNEDY et al., 1994; WOLLENHAUPT et al., 1999; KIM et al.,

2001, 2009) sowie Affen (YUE et al., 2000) und im Endometrium und

Trophoblast des Menschen (MÜHLHAUSER et al., 1993; BASS et al., 1994;

MARUO et al., 1995) in der periimplantatorischen Phase exprimiert.

EGF wurde bereits im zyklischen Endometrium von Hunden nachgewiesen

(TAMADA et al., 2005; OZYURTLU et al., 2010; BUKOWSKA et al., 2011b)

und gefolgert, dass EGF auch bei der Hündin eine wichtige Rolle bei Wachstum

und Differenzierung sowie der Vorbereitung des Uterus auf die Implantation

spielt. KIDA et al. (2010) berichteten von einer geringeren Expression und

veränderten Lokalisation von EGF im Zusammenhang mit der Entwicklung der

zystischen glandulären Hyperplasie und Pyometra bei der Hündin. Es gibt aber im

Gegensatz zu anderen Säugetierarten keine Studien über die EGF-Expression im

Uterus von graviden Hündinnen.

EGF scheint speziell während der Implantation eine Rolle zu spielen, denn die

Supplementierung von EGF konnte die Implantationsrate von Ratten und Mäusen

steigern (KIM et al., 1999; AFLALO et al., 2007), andererseits kann die

Implantation durch EGF-Antikörper gehemmt werden (CAI et al., 2003).

Die Expression von EGF und seiner verwandten Wachstumsfaktoren und seinem

Rezeptor im Uterus und Embryo während der Implantation beweist, wie

bedeutend dieser Wachstumsfaktor bei der Interaktion zwischen Endometrium

und Embryo während der Implantation ist. EGF und Wachstumsfaktoren aus

dieser Familie, welche vom Endometrium und auch Embryo produziert werden,

wirken wahrscheinlich sowohl autokrin, als auch parakrin und sind für die

Proliferation und Differenzierung der Zellen im Endometrium sowie für die

Entwicklung des Embryos, aber auch am Prozess der Implantation selbst beteiligt

(PARIA et al., 2000). Obwohl sich die Säugetierarten stark in der

präimplantatorischen Entwicklung und Form der Plazentation unterscheiden,

scheint EGF und sein Rezeptor im Allgemeinen eine große Rolle während der

Implantation von Säugetieren zu spielen.

21

2.2.3. PAF und Rezeptor

Platelet activating factor (PAF) ist aufgrund seiner angiogenetischen und

mitogenen Eigenschaften in viele Ereignisse im Reproduktionstrakt involviert,

darunter die Ovulation (ESPEY et al., 1989), die Fertilisation (PIKE et al., 1992),

der Transport der Blastozyste im Ovidukt (TIEMANN et al., 2001a;

VELASQUEZ et al., 2001), die Implantation (ACKER et al., 1988; SPINKS u.

O’NEILL, 1988; RYAN et al., 1990b; SPINKS et al., 1990; O’NEILL, 1995b),

die Herstellung des rezeptiven Status des Endometriums (SMITH u. KELLY,

1988; ACKER et al., 1989; ALECOZAY et al., 1991; AHMED et al., 1998) sowie

die Geburt (LI et al., 1999) und die Entwicklung der präimplantatorischen

Embryonen (RYAN et al., 1990a; SPINKS et al., 1990; ROBERTS et al., 1993;

O’NEILL, 1997; JIN u. O’NEILL, 2011).

Platelet activating factor (PAF) ist ein Lipidmediator, der als 1-0-alkyl-2-acetyl-

sn-glyceryl-3-phosphocholine charakterisiert wurde (O’NEILL, 1985), ein

potenter proinflammatorischer Mediator, wird von einer Vielzahl von Zellen

exprimiert und ist an vielen biologischen Prozessen beteiligt (VARGAFTIG et al.,

1981; ALECOZAY et al., 1991; IZUMI et al., 1995; ISHII et al., 1998; ISHII u.

SHIMIZU, 2000; MONTRUCCHIO et al., 2000b). Durch seine mitogenen und

angiogenetischen Eigenschaften spielt der Faktor auch eine Rolle bei der

Entwicklung von Tumoren (BUSSOLINO et al., 1995; BUSSOLATI et al., 2000).

Die Bildung von PAF scheint von mehreren angiogenetischen Faktoren stimuliert

zu werden, darunter VEGF, wobei durch VEGF stimulierte PAF-Bildung der

Endothelzellen vor allem die Motilität der Endothelzellen, welche wichtig für die

Formation von neuen Gefäßen ist, autokrin steigert und PAF somit ein

sekundärer Mediator der angiogenetischen Effekte von VEGF ist

(MONTRUCCHIO et al., 2000a). RUSSO et al. (2003) berichteten, dass PAF

wichtig für die Migration und Formation der Endothelzellen zu Gefäßen ist und

die Interaktion zwischen Endothelzellen und glatten Muskelzellen der Gefäße

reguliert. Zusätzlich erhöht der Faktor die vaskuläre Permeabilität (RUBIN et al.,

1988).

22

PAF bindet an seinen Rezeptor PAF-R, welcher in zahlreichen Zellen und

Geweben exprimiert wird (KUDOLO u. HARPER, 1989; CHAO u. OLSON,

1993; IZUMI et al., 1995; ISHII u. SHIMIZU, 2000).

PAF ist an vielen Ereignissen im Reproduktionstrakt beteiligt und wurde im

Endometrium der Ratte (LI et al., 1999), des Kaninchens (ANGLE et al., 1988),

des Schafes (BATTYE et al., 1996), des Rindes (TIEMANN et al., 2001b) und

Menschen (ALECOZAY et al., 1991) gefunden. Auch sein Rezeptor, PAF-R,

wurde im Endometrium gravider Kaninchen (KUDOLO u. HARPER, 1989), im

fetalen und maternalen Teil der Plazenta von Rindern (TIEMANN et al., 2001a, b;

BÜCHER et al., 2006), im Endometrium von graviden Schweinen (YANG et al.,

2003) und im zyklischen Endometrium des Menschen (AHMED et al., 1998)

detektiert.

Der Faktor hat Einfluss auf die Herstellung des rezeptiven Status des

Endometriums: die intrauterine Injektion von PAF verursacht eine

Entzündungsreaktion und die Dezidualisierung der endometrialen Stromazellen

von Ratten (ACKER et al., 1989). Auch die Stimulierung der vaskulären

Permeabilität durch PAF (RUBIN et al., 1988) spielt im Endometrium

dahingehend eine große Rolle, dass die erhöhte vaskuläre Permeabilität der

uterinen Gefäße charakteristisch für die Implantation ist (McRAE u. HEAP, 1988)

und wird wahrscheinlich durch die von PAF stimulierte Freisetzung von PGE im

Endometrium hervorgerufen (SMITH u. KELLY, 1988; ALECOZAY et al.,

1991). Ein weiteres Prostaglandin, welches von PAF beeinflusst wird, ist PGF2α ;

durch dessen Unterdrückung und die daraus resultierende Hemmung der

Luteolyse könnte PAF eine Rolle bei der maternalen Erkennung der Gravidität

spielen (ALECOZAY et al., 1991; BATTYE et al., 1992). Zusätzlich ist PAF an

der Angiogenese (AHMED et al., 1998), am Wachstum der Zellen (BALDI et al.,

1994; TIEMANN et al., 1995) und an der Modulation des Immunsystems im

Endometrium (NASU et al., 1999) beteiligt; alle oben genannten Ereignisse sind

die Voraussetzung für eine erfolgreiche Implantation. Kurz vor der Geburt wird

der Faktor hochgradig im Uterus exprimiert und erhöht die uterine Kontraktilität

(LI et al., 1999).

23

Die Expression von PAF im Endometrium wird unter anderem hormonell

reguliert: Progesteron und eine Kombination mit Östrogen, nicht aber Östrogen

alleine stimulieren die Expression des Faktors (ALECOZAY et al., 1991; CHAMI

et al., 2004). Auch die Expression von PAF-R wird von Progesteron, aber nicht

von Östrogen stimuliert (TIEMANN et al., 2005). Andere Ergebnisse brachten

jedoch die Studien von NAKAYAMA et al. (1991), SATO et al. (1997) und LI et

al. (1999), wo Östrogen die PAF-Expression im Endometrium stimulierte. Die

Konzentration von PAF im Uterus hängt von seiner Synthese und seinem Abbau

ab; der Abbau wird vor allem durch ein Enzym bestimmt: PAF-Acetylhydrolase

(PAF-AH) (ARAI, 2002) inaktiviert den Faktor und steht unter steroidaler

Kontrolle; somit könnte dieses Enzym ein weiterer Mechanismus sein mit dessen

Hilfe die Sexualsteroide die uterine Funktion regulieren, wobei Progesteron die

Aktivität des Enzyms supprimiert und Östrogen die Aktivität stimuliert

(O’NEILL, 1995a; CHAMI u. O’NEILL, 2001; BÜCHER et al., 2006); allerdings

kam die Studie von LI et al. (1999) zu dem Ergebnis, dass Östrogen die Aktivität

von PAF-AH im Uterus von Ratten während der späten Gravidität herabsetzt und

so die PAF Konzentration steigert, was mit den Ergebnissen von YASUDA u.

JOHNSTON (1992) übereinstimmt: Östrogen inhibiert und Progesteron stimuliert

die Plasmakonzentration von PAF-AH, was die gesteigerte PAF-Expression kurz

vor der Geburt erklären kann, da Progesteron kurz vor der Geburt absinkt und

Östrogen stärker exprimiert wird. Die unterschiedlichen Ergebnisse bezüglich der

steroidalen Regulierung von PAF könnten auf spezies-spezifische Kontrolle

hinweisen, vielleicht ist sie aber auch vom Zyklusstadium oder dem Stadium der

Gravidität abhängig (TIEMANN et al., 2005).

2.2.4. Expression von Wachstumsfaktoren in caninen Embryonen

Das Wachstum von präimplantatorischen Embryonen wird von der Interaktion

einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren reguliert und zumindest teilweise von

autokrinen Wachstumsfaktoren, welche in einer sehr komplexen Art und Weise

zusammenwirken, gesteuert (O’NEILL, 2008), da Embryonen sich unabhängig

von maternalen Wachstumsfaktoren und Hormonen in vitro entwickeln können

24

und ihre Entwicklung von der Dichte in der Kultur abhängig ist: Embryonen in

höheren Konzentrationen entwickeln sich schneller als Embryonen in niedrigeren

Konzentrationen (PARIA u. DEY, 1990; O’NEILL, 1997, 1998). Die befruchtete

Eizelle muss beginnen sich zu teilen und muss sich zur Blastozyste mit Embryo-

und Trophoblast differenzieren und diese Entwicklung wird teilweise autokrin

gesteuert; präimplantatorische Embryonen produzieren selbst Wachstumsfaktoren,

exprimieren aber auch Rezeptoren, um auf maternale und embryonale Signale

reagieren zu können, wobei hier vor allem Faktoren der EGF- , FGF und IGF-

Familie, LIF, Colony-Stimulating Factor (CSF), GM-CSF, TNF-α, Interleukin-1

(IL-1), Platelet-Derived-Growth Factor (PDGF) und PAF eine Rolle spielen

(KAYE u. HARVEY, 1995; STEWART u. CULLINAN, 1997; DUC-GOIRAN et

al., 1999; PARIA et al., 2000; CASTRO-RENDON et al., 2006). Doch auch der

Embryo selbst, wie das Endometrium, ist vom Einfluss der Steroidhormone und

von durch diese regulierten Wachstumsfaktoren, welche vom Endometrium

produziert werden, abhängig (PARIA u. DEY, 1990).

2.2.4.1. VEGF und Rezeptoren

VEGF scheint nicht nur an der Angiogenese im Uterus beteiligt zu sein, er

mediiert auch die Vaskulogenese im Embryo (FONG et al., 1995; CARMELIET

et al., 1996; FERRARA et al., 1996) und ist ein bedeutender Faktor für die

Implantation (DUBINSKY et al., 2010).

VEGF-Rezeptoren konnten in präimplantatorischen Embryonen von Mäusen

(JAKEMAN et al., 1993) und Schweinen (KACZMAREK et al., 2009) entdeckt

werden. Bei der Expression von VEGF gibt es laut den vorhandenen Studien

tierartliche Unterschiede: beim Schwein (KACZMAREK et al., 2009) und

Menschen (KRÜSSEL et al., 2000) wurde VEGF bereits in den

präimplantatorischen Embryonen entdeckt, wobei die Embryonen von Mäusen

(JAKEMAN et al., 1993) und Ratten (DUMONT et al., 1995) den Faktor erst ab

dem Zeitpunkt der Implantation exprimierten. Embryonal produzierter VEGF

könnte über die Bindung an endometriale VEGF-Rezeptoren Angiogenese an der

Implantationsstelle induzieren (KRÜSSEL et al., 2000; KACZMAREK et al.,

2009). Nach der Implantation ist VEGF einer wichtiger Faktor für die

25

Vaskulogenese des Embryos (FONG et al., 1995; CARMELIET et al., 1996;

FERRARA et al., 1996) und auch für die Implantation selbst ist VEGF essentiell

(DUBINSKY et al., 2010), indem er die Migration der Trophoblastenzellen

stimuliert.

2.2.4.2. EGF und Rezeptor

Mitglieder der Familie von Epidermal Growth Factor (EGF) gehören zu den

wichtigsten Wachstumsfaktoren während der Implantation und beeinflussen die

Entwicklung des präimplantatorischen Embryos (WOOD u. KAYE, 1989; PARIA

u. DEY, 1990; AFLALO et al., 2007). EGF stimuliert Proliferation und

Differenzierung der Embryonen (PARIA u. DEY, 1990; GLABOWSKI et al.,

2005) und stimuliert die Invasivität des Trophoblasten während der Implantation

(BASS et al., 1994; CAI et al., 2003; AFLALO et al., 2007).

Präimplantatorische Embryonen von Mäusen (PARIA et al., 1991, 1993a; WILEY

et al., 1992; CAI et al., 2003), Kaninchen (KLONISCH et al., 2001), Schafen

(FISCHER et al., 1994), Rindern (KLIEM et al., 1998b), Pferden (FISCHER et

al., 1994), Schweinen (VAUGHAN et al., 1992; FISCHER et al., 1994; KLIEM et

al., 1998a; WOLLENHAUPT et al., 1999; WEI et al., 2001) und Menschen

(CHIA et al., 1995) exprimieren EGF-R und können auf exogenes, maternales

sowie embryonales EGF reagieren. EGF scheint also sowohl auto-, als auch

parakrin auf die EGF-Rezeptoren des Embryos zu wirken. Bei der Expression von

EGF mRNA von präimplantatorischen Embryonen unterscheiden sich die Studien

stark: EGF konnte in Embryonen von Mäusen (CAI et al., 2003), Kaninchen

(KLONISCH et al., 2001), Schweinen (VAUGHAN et al., 1992;

WOLLENHAUPT et al., 1999) und Menschen (CHIA et al., 1995) gefunden

werden. Allerdings konnte in Embryonen von Rindern und Schafen bislang noch

keine EGF-mRNA Expression nachgewiesen werden (WATSON et al., 1992,

1994; GHARIB-HAMROUCHE et al., 1995; KLIEM et al., 1998b).

Wie wichtig EGF für die Entwicklung der Embryonen ist, zeigte die Studie von

THREADGILL et al. (1995): Mäuse mit Mutationen am Lokus für EGF-R starben

je nach genetischem Hintergrund bereits periimplantatorisch aufgrund der

26

Degeneration der inneren Zellmasse, in der Mitte der Gravidität aufgrund

unzureichender Entwicklung der fetalen Plazenta oder es kam zum neonatalen

Tod der Mäuse, welche Anomalien in Wachstum, Haut, Leber, Nieren,

Gastrointestinaltrakt und Gehirn aufwiesen. EGF-R scheint also an einer großen

Anzahl von Zellaktivitäten beteiligt zu sein.

2.2.4.3. PAF und Rezeptor

PAF gehört zu den embryonalen autokrinen Embryotropinen, welche vom

Embryo produziert werden und eine Rolle beim Überleben des

präimplantatorischen Embryos und der Bildung der Blastozyste spielen; er

stimuliert die Entwicklung (O’NEILL, 1997, 1998), das Wachstum (ROBERTS et

al., 1993) und den Metabolismus (RYAN et al., 1990a) und ist ein Indikator für

die Lebensfähigkeit der Embryonen (ROUDEBUSH et al., 2002b).

Der Faktor wurde in präimplantatorische Embryonen vom Zweizell- bis zum

Blastozystenstadium von Mäusen (O’NEILL, 1985; O’NEILL, 1997;

ROUDEBUSH et al., 2002a), Kaninchen (MINHAS et al., 1993), Schafen

(BATTYE et al., 1991), Rindern (STOCK u. HANSEL, 1992), Schweinen

(YANG et al., 2003) und Menschen (COLLIER et al., 1988; ROUDEBUSH et al.,

2002b), nachgewiesen. Ebenso konnte der PAF-Rezeptor in Embryonen vom

Zweizellstadium bis hin zur Blastozyste von Mäusen (STOJANOV u. O’NEILL,

1999; ROUDEBUSH et al., 2002a), Kaninchen (KUDOLO et al., 1991),

Schweinen (YANG et al., 2003) und Menschen (ROUDEBUSH et al., 2003)

detektiert werden.

PAF scheint auch an der Regulierung der Funktion des Ovidukts während des

Transportes des Embryos zum Uterus eine Rolle zu spielen, denn PAF-R wird im

Zeitraum dieses Ereignisses stark im Eileiter exprimiert. Da PAF von

präimplantatorischen Embryonen exprimiert wird, könnte embryonale

produzierter PAF parakrin den Transport in den Uterus regulieren (TIEMANN et

al., 2001a; VELASQUEZ et al., 2001).

Neben seinem positiven Einfluss auf den Transport und die Entwicklung des

Embryos, ist PAF ein essentieller Faktor während der Implantation, denn diese

27

kann durch die Behandlung mit PAF-Antagonisten gehemmt werden (ACKER et

al., 1988; SPINKS u. O’NEILL, 1988; RYAN et al., 1990b; O’NEILL, 1995b).

Da PAF bei vielen Tierarten sowohl maternales, als auch embryonales Gewebe in

der periimplantatorischen Phase beeinflusst und von beiden produziert wird, war

das Ziel dieser Studie, herauszufinden, ob der Faktor und sein Rezeptor auch bei

der Hündin im Uterus und den Embryonen in diesem Zeitraum exprimiert werden.

28

3. Materialien und Methodik

3.1. Tiere

Zur Verfügung standen insgesamt 19 Hündinnen verschiedener Rassen im Alter

von 3.6 ± 2.6 Jahren. Alle Hündinnen wurden nach einer allgemein klinischen

Untersuchung als klinisch gesund befunden und weiters gynäkologisch und

sonographisch (Pie Medical®, 6 und 8 MHz Schallköpfe, Maastricht,

Niederlande) untersucht und je nach Vorbericht und Untersuchungsbefund

verschiedenen Gruppen zugeordnet. Neun Hündinnen waren ungewollt gedeckt

worden und sollten aus diesem Grund möglichst bald kastriert werden. Weitere 10

Hündinnen waren bereits gravid, als sie vorstellig wurden; 5 davon befanden sich

im Implantationsstadium (n=5, Tag 18 - 25 nach der Deckung), weitere 5 im

Plazentationsstadium (n=5, Tag 28 - 45 nach der Deckung). Die Tabelle der

verwendeten Proben befindet sich im Anhang (Tab. 6 - 9).

3.2. Materialien und Methodik

3.2.1. Embryonengewinnung und Gruppierung der Tiere

Die vor kurzem gedeckten Hündinnen wurden am Tag 10-12 nach der letzten

Deckung unter Allgemeinanästhesie ovariohysterektomiert. Die Uteri wurden

gleich anschließend mit steriler PBS Lösung gespült, die Spüllösung in sterilen

Embryonenfiltern aufgefangen und im Binokularmikroskop nach Embryonen

durchsucht (Abb. 1 - 4). Wurden Embryonen gefunden, so wurde die Hündin der

Gruppe im Präimplantationsstadium (n=5, Tag 10 - 12) zugeordnet; falls nicht, so

galten sie als Embryo negativ oder metöstrisch (n=4, Tag 10 - 12). Die übrigen 10

Hündinnen wurden mittels Ultraschall untersucht und je nach

Trächtigkeitsstadium den zwei Gruppen Implantationsstadium oder

Plazentationsstadium zugeordnet. Auch diese Hunde wurden unter

29

Allgemeinanästhesie ovariohysterektomiert und die Uteri dann unmittelbar post

operationem überprüft um die Ultraschallbefunde zu verifizieren.

Abb. 4: Das Filtrat wird unter dem Mikroskop auf Embryonen überprüft

Abb. 3: Mit PBS-Spüllösung wird der Uterus von den Hörnern Richtung Corpus gespült, dann die Klemme gelöst um die Flüssigkeit zu verringern und wieder geschlossen, um eventuell vorhandene Embryonen im Filter zurückzuhalten

Abb. 1: Material für die Embryonenspülung (Filter zum Auffangen der Embryonen, PBS-Spüllösung)

Abb. 2: Abklemmen des Corpus uteri vor der Spülung

30

3.2.2. Probenentnahme, –vorbereitung und –lagerung

Sowohl bei den frühgraviden als auch den nichtgraviden Hündinnen wurden

Gewebeproben von ca. 2x2 cm Größe von der Mitte des linken Uterushornes

entnommen, bei später graviden Hündinnen wurden Proben von den

Plazentationsstellen und den Interplazentationsstellen genommen. Diese wurden

in flüssigem Stickstoff schockgefroren, nachdem sie in Tissue Tec® (Sanova

Pharma GmbH, Wien, Österreich) eingebettet worden waren. Die Embryonen

wurden in PBS gewaschen und tiefgefroren (-80° C) gelagert, Embryonen einer

Hündin wurden gemeinsam in einem Röhrchen gelagert.

Für die qualitative RT-PCR wurden ein bis drei Schnitte mit einer sterilen

Skalpellklinge auf einem Eisblock durch jede Gewebeprobe gemacht, während

diese noch gefroren waren. Stücke der Uterusproben (30 mg) bestanden aus

Endometrium, Myometrium und Serosa, die Plazentationsstellen enthielten

zusätzlich noch Plazentationsgewebe. Die gefrorenen Proben wurden in einem

sterilen Glashomogenisierer mithilfe von 1 ml TRI Reagenz (# T 9424; Sigma-

Aldrich, Wien, Österreich) homogenisiert. Mit TRI Reagenz ist es möglich

gleichzeitig tRNA, Protein und DNA von derselben Probe zu isolieren; die RNA

Isolierung und der anschließende DNA Verdau erfolgten gemäß der Anleitung des

Herstellers.

Nachdem alle Embryonen einer Hündin gemeinsam aufgetaut worden waren,

wurden sofort deren Morphologie und Entwicklungsstadium evaluiert. Nach der

Zugabe von 0,5 ml TRI Reagenz wurden sie in einem sterilen Glashomogenisierer

homogenisiert. Anschließend an die RNA Extraktion wurde keine DNA

Verdauung mit diesen Proben durchgeführt. Die Embryonen eines Wurfes wurden

gemeinsam analysiert um ausreichend Material zur Verfügung zu stellen und um

die erhaltenen Daten mit jenen, die man vom Uterusgewebe der Mutter erhalten

hat, vergleichen zu können. Alle so gewonnenen RNA Proben wurden bis zur

weiteren Analyse bei -80°C aufbewahrt.

31

3.2.3. Bestimmung des RIN Wertes (RNA Qualitätskontrolle)

Bevor die RNA Proben für die RT-PCR verwendet wurden, wurde eine

Bestimmung der RNA Integrity Number (RIN) gemacht, um sicherzustellen, dass

es sich um intakte RNA handelte. Dieses System erlaubt eine standardisierte

Interpretation der RNA-Integrität und basiert auf einem Nummerierungssystem

von 1 bis 10, wobei 1 für das degradierteste Profil und 10 für das intakteste steht.

Die Gewebeproben wurden mit sterilen Keramikstäben (Peqlab Biotechnology

GmBH, Erlangen, Deutschland) mithilfe des MagNalyser Instruments (Roche,

Rotkreuz, Schweiz) homogenisiert. Danach wurde die RNA mit dem Qiacube

Robot-System (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach dem Protokoll des RNeasy

Mini Kit extrahiert. Nach dem Turbo DNase I Verdau (Ambion, Austin, Texas)

wurde die RNA Qualität überprüft. Dafür wurden der Agilent 2100 Bioanalyzer

und RNA LabChip Kits verwendet (Agilent Technologies GmbH, Wien,

Österreich): die RNA wird mittels Elektrophorese auf Mikrochips separiert, die

einzelnen RNA-Stücke mittels Fluoreszenz detektiert; die dazugehörige Software

erstellt ein Elektropherogram und zeigt die Konzentrationen an. Die

entsprechenden Werte für die zur Verfügung gestandenen Proben befinden sich

im Anhang (Tab. 6 - 9); die Berechnung des RIN-Wertes für jede Gruppe ergab

folgende Ergebnisse: alle Proben hatten einen RIN Wert >5 (präimplantatorische

Gruppe: 8.48 ± 0.32, Embryo-negative Gruppe: 8.34 ± 0.83, implantatorische

Gruppe: 6.97 ± 0.46, plazentatorische Gruppe: 8.84 ± 0.16).

3.2.4. Qualitative RT-PCR

Für alle Gene, die untersucht wurden, wurden Primer für die qualitative RT-PCR

mittels des GCG Wisconsin Pakets entworfen, wofür man die verfügbaren

caninen Sequenzen der Datenbank benutzte. Als Negativkontrolle wurde anstatt

der Vorlage in der RT-PCR Reaktion (verwendete Geräte Abb. 5) für jedes

untersuchte Gen RNAse freies Wasser verwendet.

Die Ergebnisse wurden mittels Elektrophorese (Abb. 6) in Ethidiumbromid

enthaltendem Agarosegel (1,5%) sichtbar gemacht.

32

Die Banden der passenden Größe wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und

zur Sequenzierung an einen Sequenzierungsdienst gesandt (IBL, Wien,

Österreich), wobei die Amplifizierungsprimer benutzt wurden. Die erhaltene

Sequenz wurde mit der Datenbank, welche BLAST Analysen benutzt, verglichen

(SCHÄFER-SOMI et al., 2008).

Die Expression folgender Gene wurde überprüft: vascular endothelial growth

factor (VEGF) und VEGF-Rezeptoren (VEGF-R1, VEGF-R2), epidermal growth

factor (EGF) und EGF-Rezeptor (EGF-R), platelet activating factor (PAF) und

PAF-Rezeptor (PAF-R).

Die Primer, welche in dieser Studie benützt wurden sind in der Tabelle 2

aufgelistet.

Abb. 5: Zentrifuge, Thermomixer, Vortexer und Mastercycler

Abb. 6: Elektrophorese

33

Tab. 2: Für die qualitative PCR verwendete Primer

Primer Sequence Length of amplicon

Reference Accession No. (Gen bank)

VEGF all

Isoforms S

TTCTGTATCAGTCTTTCCTGGTGAG 405,534, 606 Uchida et al. (2008)

VEGF all

Isoforms AS

CGAAGTGGTGAAGTTCATGGATG

VEGF-R1 S GTTCAAGGAACCTCGGACAA 452 XM_534520

VEGF-R1 AS CAGGCTCCTAGCAGGTTGAC

VEGF-R2 S CCAATCAGAGACCCACGTTT 357 DQ269018

VEGF-R2 AS AGGCAAGGACCATACCACTG

EGF S GCACATGCCCTGTAGGATTT 297 NM_001003094

EGF AS ATGCTGCACAGCTTTGTTTG

EGF-R S TACAGCTTTGGTGCCACCTG 380 Hatoya et al. (2009)

EGF-R AS GGCCAAGCCTGAATCAGCAA

PAF S AGGAGGACGAGGAAGAGGAG 500 XM_544475

PAF AS GTTGAATTTGGCCTTGGAAA

PAF-R S CTACCACAACCAGGGCAACT 398 AF 186831

PAF-R AS TGACCACGTTGCAGAAGAAG

S = sense primer ; AS = anti-sense primer; bp = base pairs; VEGF = Vascular endothelial growth factor; EGF = Epidermal growth factor; PAF = Platelet activating factor

34

3.2.5. Quantitative RT-PCR (RT qPCR)

Die quantitative RT-PCR Methodik (KLEIN, 2002) wurde angewandt, um die

relativen Genexpressionsstufen von VEGF, VEGF-R1, VEGF-R2, EGF, EGF-R,

PAF und PAF-R bewerten zu können, indem man die Expression dieser Gene mit

der von zwei Housekeeping-Genen miteinander verglich. Es wurden zwei Sonden

für zwei Housekeeping-Gene entworfen und in dieser Studie benutzt: ß-Aktin und

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Auch hierfür wurde

dieselbe extrahierte RNA wie für die qualitative RT-PCR benutzt. Für das Design

der Primer (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) wurden die Primer Express Software

2.0 und 3.0 (Applied Biosystems, Foster City, USA) und Nucleotid Blast (NCBI;

canis familiaris) benutzt. Die Reaktionseffizienz für die quantitative RT-PCR der

Gene, welche in Tabelle 3 aufgelistet sind, wurde in der Studie von KLEIN et al.

(1999) beschrieben. Für die Vorbereitung der cDNA wurden High Capacity

Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) und ein Step One Plus Cycler

(Applied Biosystems) verwendet. Um die relative Genexpression zu brechnen

wurden das 7900HT Detection System (Applied Biosystems) und Power SYBR

Green PCR Master Mix (Applied Bioystems) benützt. Die Daten wurden mit Hilfe

der ddCT-Methode (JAIS et al., 2011) analysiert um die relative Genexpression in

Bezug auf ein Housekeeping- Gen zu bewerten. Die Ergebnisse sind als

durchschnittliche Prozentzahlen für mRNA/mRNA des housekeeping Gens

angegeben. Um quantitative intrauterine Veränderungen während der Gravidität

zu untersuchen wurden die Ergebnisse des gesamten Uterusgewebe (Serosa,

Myometrium und Endometrium inklusive Plazentargewebe von graviden

Hündinnen) der periimplantatorischen und plazentatorischen Gruppe mit den

Proben der nichttragenden und präimplantatorischen Gruppe miteinander

verglichen (SCHÄFER-SOMI et al., 2009).

35

Tab. 3: Für die RT qPCR verwendete Primer

Primer Sequence qPCR Length of amplicon

Reference Accession No. (Gen bank)

VEGF S TTG CTG CTC TAC CTC CAC CAT 64 Jais et al. (2011)

AF133249

VEGF AS TGT GCT CTC CTC CTG CCA TAG

VEGF-R1 S TGA AGG AAG GCA GAT CGT CAT 111 Jais et al. (2011)

AF262963

VEGF-R1 AS CAG GTT ATT CGC TTC CCA TCA

VEGF-R2 S TGT CAT CCT TAC CAA CCC CAT T 103 Jais et al. (2011)

NM_001048024

VEGF-R2 AS CGG AGA GAT CAG GGA TTT CTC A

EGF S AGA ACT GGA ACT GTC CTG AAG TCT 127 NM_001003094

EGF AS TGA TTA GTG CCT TCC AGG TCA A

EGF-R S CTA CAA GGC GCT GTG CGC 157 XM_533073

EGF-R AS TGG GAC AGC TTG GAT CAC AC

PAF S AAT CGA GGC CAT CGT ACA ACT T 84 XM_536562

PAF AS CAC CTC GAG GTA ACA AAC CC

PAF-R S TGT GGC TGC TGC ATC CTA TTT 90 AF186831

PAF-R AS TCA AAG CAG CGT GTG ATG TTG

S = sense primer ; AS = anti-sense primer; bp = base pairs; VEGF = Vascular endothelial growth factor; EGF = Epidermal growth factor; PAF = Platelet activating factor

3.2.6. Statistik

Die Gruppen wurden untereinander mithilfe des Mann-Whitney-U-Tests

verglichen. Ergebnisse werden als Mittelwerte ± Standartabweichung vom

Mittelwert angegeben. Signifikante Unterschiede bedeuten, dass die

Irrtumswahrscheinlichkeit <5% (p<0.05) bis <1% (p<0.01) betrug.

36

4. Ergebnisse

4.1. Ergebnisse der RT PCR

4.1.1. Uterusproben

Für die Durchführung der RT PCR wurde aufgrund der hohen Anforderungen an

den RIN Wert für die RT qPCR eine andere Probenauswahl (n=16) getroffen,

jeweils 4 Proben aus der präimplantatorischen, Embryo-negativen,

implantatorischen und plazentatorischen Gruppe wurden verwendet. In allen

Gruppen konnten mRNA der untersuchten Faktoren und Rezeptoren

nachgewiesen werden. Eine Übersicht befindet sich in Tabelle 4; die Ergebnisse

sind grafisch auf den Abbildungen 7-10 dargestellt.

Tab. 4: Anzahl der für den jeweiligen Faktor/Rezeptor positiven Proben

Gruppe PAF PAF-R EGF EGF-R VEGF VEGF-R1 VEGF-R2

Präimplantation 4 3 4 4 4 4 4

Embryo-negativ 2 3 4 4 3 3 4

Implantation 4 3 4 4 3 4 4

Plazentation 4 4 4 4 4 4 4

Probenanzahl je Gruppe n=4; PAF, platelet activating factor; PAF-R, PAF-

Rezeptor; EGF, epidermal growth factor; EGF-R; VEGF, vascular endothelial

growth factor; VEGF-R1, VEGF-R2

37

100%

75% 75%

100% 100%

75%

100% 100% 100% 100% 100% 100%

VEGF VEGF-R1 VEGF-R2

100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

EGF EGF-R

100%

50%

100% 100%

75% 75% 75%

100%

PAF PAF-R

Abb. 9: Prozentueller Anteil der positiven Proben für den Nachweis von VEGF, VEGF-R1 und VEGF-R2 in den Uterusproben (n=4/Gruppe)

Abb. 7: Prozentueller Anteil positiver Proben für den Nachweis von PAF und PAF-R in den Uterusproben (n=4/Gruppe)

Abb. 8: Prozentueller Anteil positiver Proben für den Nachweis von EGF und EGF-R in den Uterusproben (n=4/Gruppe)

38

PAF PAF-R EGF EGF-R

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2

EGF-R VEGF VEGF-R1 VEGF-R2

3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

4.1.2. Embryonen

Es wurden präimplantatorische Embryonen von 8 Würfen (insgesamt 27

Embryonen), welche mittels Embryonenspülung gewonnen worden waren, auf das

Vorhandensein der oben genannten Faktoren und Rezeptoren mittels RT PCR

untersucht. Mit Ausnahme von VEGF konnten alle in den Embryonen

nachgewiesen werden. Eine Übersicht gibt Tabelle 5, die Ergebnisse sind auf

Abbildung 11 und 12 dargestellt.

Tab. 5: Anzahl der für den jeweiligen Faktor/Rezeptor positiven Proben der präimplantatorischen Embryonen (Probenanzahl n=8)

PAF PAF-R EGF EGF-R VEGF VEGF-R1 VEGF-R2

Anzahl der positiven Proben 6 2 4 4 0 2 4

Abb. 10: Gelelektrophorese mit mRNA von jeweils einer präimplantatorischen (1), embryo-negativen (2), implantatorischen (3) und plazentatorischen (4) Uterusprobe.

39

PAF PAF-R EGF EGF-R

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2

EGF-R VEGF VEGF-R1 VEGF-R2

3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

75%

25%

50% 50%

0%

25%

50%

Abb. 11: Prozentueller Anteil der positven Proben für den Nachweis von PAF, PAF-R, EGF, EGF-R, VEGF-R1 und VEGF-R2 in den Embryonen (n=8)

Abb.12: Gelelektrophorese mit mRNA von präimplantatorischen Embryonen von 4 Hündinnen; 1 = Embryo 1, 2 = Embryo 2, 3 = Embryo 3, 4 = Embryo 4

40

4.2. Ergebnisse der RT qPCR

4.2.1. VEGF

Die relative Genexpression von VEGF in den Proben von graviden Tieren war

vergleichbar mit jener der Proben der embryo-negativen Gruppe. Im Laufe der

Gravidität war ein signifikanter Abfall der mRNA von der präimplantatorischen

zur plazentatorischen Gruppe erkennbar. Der Verlauf von VEGF während der

Gravidität ist auf Abbildung 13 grafisch dargestellt.

4.2.2. VEGF-R1 und VEGF-R2 Die Expression von VEGF-R1 veränderte sich während der Gravidität nicht signifikant,

wohingegen der Verlauf von VEGF-R2 dem von VEGF ähnelte, nämlich während der

Präimplantation seinen Höhepunkt erreichte und sich signifikant zu den Werten der

Embryo-negativen Proben unterschied (Abb. 14 und 15).

0

5

10

15

20

25

30

Embryo - Preimpl. Impl. Placent.

rela

tive

Gen

expr

essi

on

VEGF

GAPDH ßActin

*

*

Abb. 13: Genexpression von VEGF im Verlauf der Gravidität; Embryo - = metöstrisch, Preimpl = präimplantatorisch, Impl = implantatorisch, Placent = plazentatorisch

* Balken mit gleichen Indices unterscheiden sich signifikant (p<0.05)

41

0

2

4

6

8

10

12

14


rela

tive

Gen

expr

essi

on

VEGFR1

GAPDH ßActin

0

2

4

6

8

10

12

14

16


rela

tive

Gen

expr

essi

on

VEGFR2

GAPDH ßActin

*

*

Abb. 14: Genexpression von VEGF-R1 im Verlauf der Gravidität; Embryo - = metöstrisch, Preimpl = präimplantatorisch, Impl = implantatorisch, Placent = plazentatorisch

Abb. 15: Genexpression von VEGF-R2 im Verlauf der Gravidität; Embryo - = metöstrisch, Preimpl = präimplantatorisch, Impl = implantatorisch, Placent = plazentatorisch

* Balken mit gleichen Indices unterscheiden sich signifikant (p<0.05)

42

4.2.3. EGF

Die Genexpression von EGF stieg tendenziell zwischen der präimplantatorischen

und implantatorischen Gruppe an, zwischen implantatorischer und

plazentatorischer sank sie wieder ab, allerdings unterschieden sich die Werte nicht

signifikant (Abb. 16).

4.2.4. EGF-R

Die Expression von EGF-Rezeptor war derjenigen von EGF entgegengesetzt:

EGF-R fiel zwischen präimplantatorischer und implantatorischer Gruppe ab, um

während der Plazentation wieder anzusteigen (Abb. 17).

0

50

100

150

200

250

300


rela

tive

Gen

expr

essi

on

EGF

GAPDH ßActin

Abb. 16: Genexpression von EGF im Verlauf der Gravidität; Embryo - = metöstrisch, Preimpl = präimplantatorisch, Impl = implantatorisch, Placent = plazentatorisch

43

4.2.5. PAF

Die Expression der mRNA von PAF zeigte einen signifikanten Abfall im Verlauf der

Gravidität; außerdem waren die Resultate der metöstrischen Proben gleich wie jene der

präimplantatorischen Gruppe (Abb. 18).

0

5

10

15

20

25

30

35


rela

tive

Gen

expr

essi

on

EGFR

GAPDH ßActin

0

2

4

6

8

10

12


rela

tive

Gen

expr

essi

on

PAF

GAPDH ßActin

*

*

Abb. 17: Genexpression von EGF-R im Verlauf der Gravidität; Embryo - = metöstrisch, Preimpl = präimplantatorisch, Impl = implantatorisch, Placent = plazentatorisch

Abb. 18: Genexpression von PAF im Verlauf der Gravidität; Embryo - = metöstrisch, Preimpl = präimplantatorisch, Impl = implantatorisch, Placent = plazentatorisch * Balken mit gleichen Indices unterscheiden sich signifikant (p<0.05)

44

4.2.6. PAF-R

Gleich wie PAF war auch der Verlauf seines Rezeptors, PAF-R, welcher seinen

Höhepunkt während der präimplantatorischen Phase erreicht und signifikant

während Implantation und Plazentation abfiel (Abb. 19).

4.2.7. Vergleich der Gruppen untereinander

Die Expression von VEGF, VEGF-R2, PAF und PAF-R erreichte während der

präimplantatorischen Phase an ihrem Höhepunkt und fiel danach ab, wobei

zwischen präimplantatorischer und plazentatorischer Gruppe bei VEGF, PAF und

PAF-R ein signifikanter Unterschied erkennbar war. EGF hingegen wurde

während der Implantation maximal exprimiert, EGF-R erreichte im Gegensatz zur

Expression des Faktors während der Implantation seinen Tiefpunkt.

Die Ergebnisse der präimplantatorischen und embryo-negativen Gruppe waren

ähnlich, mit Ausnahme von VEGF-R2, denn der Rezeptor wurde in der

präimplantatorischen Gruppe signifikant stärker exprimiert.

0

5

10

15

20

25

30

35

40


rela

tive

Gen

expr

esso

in

PAFR

GAPDH ßActin

*

*

*

Abb. 19: Genexpression von PAF im Verlauf der Gravidität; Embryo - = metöstrisch, Preimpl = präimplantatorisch, Impl = implantatorisch, Placent = plazentatorisch * Balken mit gleichen Indices unterscheiden sich signifikant (p<0.05)

45

5. Diskussion

Die Gene von VEGF, EGF, PAF und ihrer Rezeptoren VEGF-R1, VEGF-R2,

EGF-R und PAF-R konnten in den Gewebeproben von allen untersuchten

Gestations-Gruppen gefunden werden. Auch in den präimplantatorischen

Embryonen wurden alle Gene, bis auf VEGF exprimiert.

5.1. VEGF und Rezeptoren

Während der Gravidität spielt VEGF bei der Implantation und Entstehung der

Plazenta eine essentielle Rolle, der Faktor stimuliert die Angiogenese über die

Stimulation von Endothelzell-Proliferation und vaskulärer Permeabilität

(RABBANI u. ROGERS, 2001; HERYANTO et al., 2003). Uterine

Dezidualisierung wird von schneller Proliferation und Differenzierung von

ansässigen Stroma-Fibroblasten zu großen epitheloid-ähnlichen Deziduazellen

charakterisiert (CHENG et al., 2001; LEE et al., 2007). Endothelzellen in

unmittelbarer Nähe zu Deziduazellen proliferieren um ein neues Gefäßsystem im

graviden Uterus zu bilden und VEGF ist ein wichtiger Regulator dieses Prozesses

(GOODGER u. ROGERS, 1993; CHAKRABORTY et al., 1995). Seine

Expression korreliert mit der gesteigerten Entwicklung der plazentaren

Gefäßdichte bei fortschreitender Gestation von Schweinen (VONNAHME et al.,

2001) und Schafen (BOROWICZ et al., 2007) und es scheint, dass die Expression

von VEGF und seinen Rezeptoren mit der Entwicklung der Blutgefäße in der

Plazenta im Laufe der Gravidität gesteigert wird. VEGF stimuliert nicht nur die

Angiogenese und vaskuläre Permeabilität, er ist wahrscheinlich auch an der

Proliferation und Transformation von stromalen Zellen zu Deziduazellen und an

der Invasion und Entwicklung des Embryos beteiligt (CHARNOCK-JONES et al.,

1994; AHMED et al., 1995; COOPER et al., 1995; DUBINSKY et al., 2010).

Außerdem könnte VEGF auch ein lokaler Signalfaktor zwischen dem sich

implantierenden Embryo und den vaskulären Strukturen des Endometriums sein

(KRÜSSEL et al., 2000; KACZMAREK et al., 2009). Zusammen mit anderen

Wachstumsfaktoren, Steroiden und Enzymen scheint VEGF ein wichtiger Faktor

46

bei der komplexen Regulation der plazentaren Angiogenese und Invasion des

Trophoblasten zu sein.

Bei der Hündin wurde in unserer Studie in allen 4 Gruppen (präimplantatorisch,

implantatorisch, plazentatorisch, metöstrisch) VEGF, VEGF-R1 und VEGF-R2-

mRNA exprimiert. Die Expression von VEGF erreichte ihren Höhepunkt während

der präimplantatorischen Phase und fiel danach signifikant ab. Die erste und

bisher einzige Publikation über VEGF im Endometrium der graviden Hündin

(BUKOWSKA et al., 2011a) ergab, dass VEGF-mRNA in präimplantatorischen

Proben (Tag 10 - 12 nach dem Decken) stärker exprimiert wurde als in

metöstrischen Kontrollen, was auf eine Rolle von VEGF in der frühen Gravidität

der Hündin hindeutete. Auch in unserer Studie wurde VEGF in der

präimplantatorischen Gruppe stärker exprimiert als in der metöstrischen Gruppe,

wobei aber kein signifikanter Unterschied erkennbar war. Der präimplantatorische

Höhepunkt der Expression von VEGF-mRNA stimmt nicht mit vergleichbaren

Studien beim Schwein überein, denn bei dieser Tierart wurde ein Anstieg im

Zeitraum der Implantation beobachtet und die Expression von VEGF-mRNA stieg

auch postimplantatorisch weiter an (WELTER et al., 2003; KACZMAREK et al.,

2008); beim Schwein könnte das von den Embryonen produzierte Östrogen eine

Rolle bei der Regulation von VEGF spielen. Auch WINTHER et al. (1999)

folgerten, dass die starke Expression von VEGF und seinen Rezeptoren während

und nach der Plazentation im Uterus des Schweines darauf hindeutet, dass VEGF

nicht nur während der Implantation und frühen Plazentation an der

Neovaskularisation beteiligt ist, sondern auch in späteren Phasen der Gravidität

für die Erhaltung der Gefäße bedeutend ist. VONNAHME et al. (2001)

berichteten von einem stetigen Anstieg der VEGF-mRNA Expression in der

porcinen Plazenta in der zweiten Hälfte der Gravidität, was mit der Zunahme der

Anzahl der plazentaren Gefäße korrelierte, um eine größere Oberfläche für den

Austausch von Nährstoffen und Metaboliten zwischen Mutter und den schnell

wachsenden Feten zu schaffen. Wahrscheinlich stimuliert die in Relation zum

schnellen Wachstum des Fetus herrschende plazentäre Hypoxie die Sekretion von

VEGF. Der Anstieg der intrauterinen VEGF - Expression im Laufe der Gravidität

wurde auch beim Schaf (CHEUNG et al., 1995; BOGIC et al., 2000;

47

REGNAULT et al., 2002; BOROWICZ et al., 2007) und beim Menschen

(DEMIR et al., 2004) beobachtet.

Während der frühen Phasen der Implantation sind 2 bedeutende Ereignisse

charakteristisch für die endometrialen Gefäße: gesteigerte Gefäßpermeabilität und

vermehrte Proliferation der Endothelzellen (RABBANI u. ROGERS, 2001).

VEGF stimuliert während der Implantation die Gefäßpermeabilität (RABBANI u.

ROGERS, 2001) und die Entstehung des endometrialen Ödems (ROCKWELL et

al., 2002), zwei für die Implantation essentielle Ereignisse. Die Transformation

der endometrialen Zellen in Dezidua-Zellen geht mit exzessiver

Neovaskularisation des Endometriums einher, dieses Gefäßnetz muss später den

maternalen Anteil der Plazenta versorgen (SHWEIKI et al., 1993). VEGF ist auch

an der Angiogenese im Endometrium während der frühen Gravidität beteiligt,

denn der Faktor stimuliert die Proliferation der Endothelzellen im Endometrium

(GOODGER u. ROGERS, 1993; GRIMWOOD et al., 1995; HERYANTO et al.,

2003; WALTER et al., 2005) und ist an der Expansion der dezidualen Gefäße

beteiligt (SHWEIKI et al., 1993).

Wie bedeutend VEGF während der Periimplantation ist, zeigte sich in folgenden

Studien: SHARKEY et al. (2005) und SENGUPTA et al. (2007) gelang es mittels

systemisch verabreichten VEGF-Antikörpern die Implantationsrate von Rhesus-

Affen signifikant zu senken und lieferten den Beweis, dass VEGF während der

Implantation beim Rhesus-Affen sowohl für die Angiogenese im Endometrium,

als auch die Invasion der Blastozyste selbst von Bedeutung ist und dass die

Hemmung des Faktors als kontrazeptive Maßnahme eingesetzt werden könnte.

Auch ROCKWELL et al. (2002) verabreichten Ratten in der präimplantatorischen

Phase VEGF-Antikörper, woraufhin die Implantation vollständig blockiert wurde.

Auch bei der Hündin könnte der Faktor aufgrund oben genannter Effekte bei der

Vorbereitung des Endometriums auf die Implantation eine Rolle spielen,

allerdings unterscheidet sich der Verlauf bei der Hündin bedeutend von dem

anderer Tierarten, denn im Gegensatz zu den oben genannten Studien, in denen

die VEGF- Expression im Laufe der Gravidität zunahm, fiel sie bei der Hündin

signifikant ab.

48

Die Expression der beiden Rezeptoren verhielt sich bei der Hündin in dieser

Studie unterschiedlich: während sich VEGF-R1 nicht signifikant veränderte,

wurde VEGF-R2 gleich wie VEGF in der präimplantatorischen Phase maximal

exprimiert und unterschied sich signifikant von der metöstrischen Kontrollgruppe.

Die Expression von VEGF-R2 scheint eine Schlüsselposition in der

präimplantatorischen Phase einzunehmen, denn die Neutralisierung von VEGF-

R2 mittels systemisch zugeführten spezifischen Antikörpern gegen VEGF-R2 am

Tag 3.75 der Gestation von Mäusen in der Studie von DOUGLAS et al. (2009)

führte zu einer signifikanten Reduzierung der dezidualen Angiogenese und

Zellproliferation der Dezidua und in weiterer Folge zum Graviditätsabbruch. Die

spätere Applikation von VEGF-R2 Antikörpern (Tag 6.5 der Gestation) hatte

keine Auswirkungen auf die Entwicklung der Embryonen. Antikörper gegen

VEGF-R1 hatten keinen Effekt und die Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren

banden nicht an die Embryonen. Demzufolge wird die Bildung von neuen

Gefäßen während der Periimplantationsperiode, welche essentiell für die

Anbildung einer funktionellen Dezidua ist, hauptsächlich über den VEGF/VEGF-

R2 Weg reguliert. Die Resultate der Studie von DOUGLAS et al. (2009) lassen

vermuten, dass Probleme bei der Angiogenese während der Periimplantation im

Zusammenhang mit Dysfunktionen des VEGF/VEGF-R2 Signalweges stehen und

Grund für Fehlgeburten sein könnten. Andererseits stellt diese Studie auch einen

Zugang zur Möglichkeit der immunologischen Kontrazeption dar.

Doch der Verlauf der VEGF-Rezeptoren bei der Hündin unterscheidet sich von

den Ergebnissen anderer Studien: beim Schwein begannen die Rezeptoren in der

periimplantatorischen Periode bis nach der Implantation (Tag 13 - 25) anzusteigen

(WELTER et al., 2003; KACZMAREK et al., 2008). Beim Pferd wurde ein

Anstieg der VEGF-R2 mRNA Expression während der Implantation beobachtet

(SILVA et al., 2011), was darauf hinweist, dass bei dieser Tierart vor allem die

Bindung von VEGF an VEGF-R2 für die vaskulären Veränderungen während der

Implantation verantwortlich ist. REGNAULT et al. (2002) wiederum fanden,

dass beide Rezeptoren im Laufe der Gravidität von Schafen (Tag 50 - 90)

anstiegen und wahrscheinlich eine ebenbürtige Rolle bei der Angiogenese in der

Plazenta des Schafes spielen.

49

Zusammenfassend kann man sagen, dass in den meisten Studien, im Gegensatz zu

unseren Ergebnissen, VEGF während der Implantation anstieg und im Laufe der

Gravidität immer stärker exprimiert wurde; außerdem verhielt sich die Expression

von VEGF und seinen Rezeptoren meist gleich, stieg also während der Gravidität

an. Insgesamt war es schwierig, adäquate Vergleichsstudien zu finden, da die

Quantifizierung der Expression von VEGF und seiner Rezeptoren in den meisten

Studien auf die späte Gravidität bezogen sind, es meist keine Verlaufsstudien,

sondern nur Ergebnisse von einzelnen Stadien der frühen Gravidität anderer

Tierarten gibt und die einzelnen Studien zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen

kamen. Dies ist entweder auf die unterschiedlichen Messmethoden (manche

Autoren bestimmten VEGF und seine Rezeptoren über die Verwendung von

Immunohistochemie, andere über die Messung von mRNA, wieder andere über

die Messung von Protein) oder eine spezies-spezifische Expression des Faktors

und seiner Rezeptoren zurückzuführen. Trotzdem gibt es keinen Zweifel, dass

VEGF und speziell auch VEGF-R2 eine Schlüsselrolle während der frühen

Gravidität spielen, diese Studie beweist, dass das auch bei der Hündin zutrifft.

Ein interessantes Ergebnis dieser Studie ist, dass VEGF nicht in den

präimplantatorischen Embryonen nachgewiesen werden konnte; es wurde aber

mRNA beider Rezeptoren exprimiert. Auch JAKEMAN et al. (1993) konnten

VEGF-mRNA Expression in Mäuseembryonen erst postimplantatorisch

entdecken, wohingegen die VEGF-Rezeptoren bereits früher detektierbar waren.

Im Gegensatz dazu wird VEGF von humanen Embryonen bereits

präimplantatorisch im 8-Zell Stadium exprimiert, VEGF scheint also unter den

ersten transkribierten Genen zu sein; der Embryo könnte somit über die Bindung

von embryonal synthetisiertem VEGF an die endometrialen VEGF-Rezeptoren

Angiogenese an der Implantationsstelle induzieren (KRÜSSEL et al., 2000). Auch

in Schweineembryonen wurden VEGF sowie beide Rezeptoren vor der

Implantation entdeckt (KACZMAREK et al., 2009). In der Studie von

KACZMAREK et al. (2009) wurde deutlich, dass VEGF im periimplantatorischen

porcinen Conceptus verglichen mit der präimplantatorischen Periode anstieg, was

auf eine aktive Rolle des Embryos bei der Angiogenese während der Implantation

hinweist. In Rattenembryonen wurden VEGF und VEGF-R2 erst zum Zeitpunkt

50

der Implantation detektiert (DUMONT et al., 1995), die Autoren folgerten daraus,

dass VEGF wichtig für die Vaskulogenese im Embryo ist. Nach der Implantation

ist VEGF ein wichtiger Faktor für die Vaskulogenese des Embryos (FONG et al.,

1995; CARMELIET et al., 1996; FERRARA et al., 1996). Da beide Rezeptoren

auch auf fetalen hämangiogenetischen Zellen exprimiert werden, ist VEGF fetalen

Ursprungs ein wichtiger Faktor bei der Differenzierung von Endothelzellen aus

pluripotenten Vorläuferzellen, indem es parakrin bzw. autokrin wirkt (PETERS et

al., 1993; QUINN et al., 1993), auch BURTON et al. (2009) beschrieben, dass

VEGF wahrscheinlich der wichtigste Faktor ist, der die Differenzierung von

Mesenchymzellen zu Angioblasten promotet. Da fetale Makrophagen aber auch

am Ende der Gravidität VEGF exprimieren, scheint es in dieser Phase für die

Erhaltung des Endothels und Regulation der vaskulären Permeabilität bedeutend

zu sein (SHARKEY et al., 1993).

Wie bedeutend VEGF und seine Rezeptoren für die Vaskulo- und Angiogenese

von Plazenta und Fetus sind, zeigen Studien mit Knock-out Mäusen: VEGF-

defiziente Mäuseembryonen starben im Alter von 11 bis 12 Tagen aufgrund von

Anomalien der Gefäße verschiedener Organe, indem sowohl Vaskulo- also auch

Angiogenese in den Embryonen gestört waren (CARMELIET et al., 1996;

FERRARA et al., 1996). FONG et al. (1995) untersuchten VEGF-R1 Knock-out-

Mäuseembryonen und fanden heraus, dass VEGF-R1 wichtig für die Organisation

der Endothelzellen zu Gefäßen, aber nicht essentiell für die Differenzierung der

Endothelzellen ist. Die Embryonen bildeten zwar Endothelzellen, welche sich

aber nicht zu normalen Gefäßkanälen zusammenschlossen, was den Tod der

Embryonen verursachte. Die Folgerung war, dass VEGF-R1 an der Regulierung

der Interaktionen zwischen Endothelzellen untereinander und der Matrix während

der Gefäßentwicklung beteiligt ist. Mutationen am VEGF-R2 Genlokus führen

zum intrauterinen Tod von Mäuseembryonen aufgrund fehlerhafter Entwicklung

von Endothel- und hämatopoietischen Zellen, was darauf zurückzuführen ist, dass

Hämangioblasten, embryonale Vorläuferzellen für Endothel- und

hämatopoietische Zellen, VEGF-R2 Rezeptoren exprimieren (SHALABY et al.,

1995). Diese Studien mit Knock-out-Mäuseembryonen deuten darauf hin, dass die

zwei Rezeptoren unterschiedliche Rollen beim Prozess der Angiogenese spielen.

51

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Angiogenese in der Plazenta und im

Embryo sowohl maternal, als auch embryonal gesteuert wird. VEGF scheint

aufgrund seiner sowohl zeitlich als auch lokal regulierten Expression in der

Plazenta und im Embryo und der Bindung an Endothelzellen und deren Vorläufer

eine Rolle bei der komplexen Regulation der Vaskulo- und Angiogenese in der

Plazenta und der embryonalen Entwicklung zu spielen.

5.2. EGF und Rezeptor

EGF wird während der Implantation im Uterus vieler Tierarten exprimiert und ist

an vielen Prozessen im Endometrium und Embryo, welche mit Wachstum und

Differenzierung einhergehen, beteiligt und somit ein essentieller Faktor zur

Erhaltung der frühen Gravidität. EGF scheint einer der Mechanismen zu sein,

über die Östrogen das Wachstum und Progesteron die Differenzierung und

Dezidualisierung des Endometriums beeinflussen und zur Vorbereitung des

Endometriums auf die Implantation führen (MUKKU u. STANCEL, 1985;

HUET-HUDSON et al., 1990; IRWIN et al., 1991; HAMMOND et al., 1993;

DAS et al., 1994; WATSON et al., 1996; BYUN et al., 2008). In der prä- und

implantatorischen Phase kommt es zur Proliferation und Differenzierung der

uterinen Zellen und EGF und sein Rezeptor sind an der Regulierung dieser

Prozesse beteiligt (NELSON et al., 1991; HAMMOND et al., 1993; MACHIDA

et al., 1995; MARUO et al., 1995).

Bei der Hündin stieg die intrauterine EGF-Expression in der Implantationsphase

auf ihren Höhepunkt - und fiel in der Plazentationsphase wieder ab. Auch im

Uterus von graviden Ratten (BYUN et al., 2008) und Schweinen (KIM et al.,

2009) ist die Expression von EGF während der Implantation am höchsten, fällt

danach ab und bleibt während der restlichen Gravidität sehr niedrig. Bei der Stute

hingegen erfolgte der Anstieg der EGF-Expression auch während der

Implantation, blieb aber auch später während der Plazentation bis Tag 250 der

Gravidität sehr hoch (STEWART et al., 1994; LENNARD et al., 1998). Auch

beim Rhesus-Affen begann EGF während der Präimplantation anzusteigen und

52

erreichte ihren Höhepunkt während der Implantation, - leider existieren keine

Studien über den weiteren Verlauf bei dieser Tierart (YUE et al., 2000).

Die EGF-R Expression fiel bei der Hündin während der Implantation ab und stieg

während der Plazentation wieder an, verhielt sich also gegenläufig zu EGF. Bei

der Stute begann EGF-R während der Implantation anzusteigen und erreichte

ihren Höhepunkt während der Plazentation (LENNARD et al., 1998). Bei der Sau

hingegen erreicht sie präimplantatorisch (Tag 12) ihren Höhepunkt, fällt dann ab

und bleibt sehr niedrig im weiteren Verlauf der Gravidität, verhält sich also gleich

wie EGF bei dieser Tierart (KIM et al., 2009). Dies dürfte beim Schwein auf den

parakrinen Einfluss der Östrogene, welche von den Embryonen sezerniert werden,

zurückzuführen sein (WOLLENHAUPT et al., 1999, 2004). Auch bei der Ratte

verhält sich EGF-R gleich wie EGF, ist also während der Implantation am

höchsten und fällt danach ab (BYUN et al., 2008). Im Endometrium des Rhesus-

Affen erreicht EGF-R während der Implantation ihren Höhepunkt, leider gibt es

keine Studie über den Verlauf nach der Implantation (YUE et al., 2000).

Dass EGF ein notwendiger Faktor für die Implantation ist, wurde in folgenden

Studien bewiesen: die Supplementierung von EGF verdoppelt die

Implantationsrate bei graviden Ratten (AFLALO et al., 2007) und die intrauterine

Injektion von EGF-Antikörpern reduziert die Implantationsrate von Mäusen

signifikant (CAI et al., 2003). Auch die Inkubation von Mäuse-Blastozysten in

EGF-hältigem Medium steigert die Implantationsrate signifikant (KIM et al.,

1999). Niedrige Plasmakonzentration von EGF führt bei Mäusen zum Abort

(TSUTSUMI u. OKA, 1987) und verminderten Wachstum der Feten (KAMEI et

al., 1993), wobei die Applikation von EGF diese Effekte verhindern konnte. EGF

und EGF-R werden vor allem von Zellen des Endometriums und Trophoblasten,

welche eine hohe Proliferationsrate aufweisen, stark exprimiert (MÜHLHAUSER

et al., 1993; CAI et al., 2003). Diese Studien unterstützen den mitogenen Effekt

von EGF auf Zellen des Endometriums und Trophoblasten während der

Implantation. Außerdem scheint EGF auch die Dezidualisierung der Stromazellen

des Endometriums zu stimulieren (SAKAKIBARA et al., 1994; TAMADA et al.,

1994).

53

Zusammengefasst kann gesagt werden, dass EGF und Mitglieder dieser Familie

wie TGF-β (BECERIKLISOY et al., 2009) auch im Uterus der Hündin essentielle

Wachstumsfaktoren während der Implantation und frühen Plazentation sind; über

welche Mechanismen EGF die Implantation im Uterus der Hündin reguliert, muss

durch weitere Studien untersucht werden.

In dieser Studie konnten sowohl EGF als auch EGF-R mittels qualitativer RT-

PCR in präimplantatorischen caninen Embryonen nachgewiesen werden.

SCHÄFER-SOMI et al. (2008) stellten fest, dass der canine präimplantatorische

Embryo verschiedene Faktoren, darunter auch ein Mitglied der EGF-Familie,

nämlich TGF-β, exprimiert und vermutlich so lokal das maternale Immunsystem

moduliert. EGF-R wird auch von Mäuse- (PARIA et al., 1991, 1993a; WILEY et

al., 1992; CAI et al., 2003), Kaninchen- (KLONISCH et al., 2001), Schaf-

(FISCHER et al., 1994), Rinder- (KLIEM et al., 1998b), Pferde- (FISCHER et al.,

1994), Schweine- (VAUGHAN et al., 1992; FISCHER et al., 1994; KLIEM et al.,

1998a; WOLLENHAUPT et al., 1999; WEI et al., 2001) und humanen (CHIA et

al., 1995) Blastozysten exprimiert, welche somit auf exogenes, maternales sowie

embryonales EGF reagieren können. Bei der Expression von EGF mRNA von

präimplantatorischen Embryonen unterscheiden sich die Studien stark:

WOLLENHAUPT et al. (1999) konnten auch schwache Expression von EGF in

Blastozysten von Schweinen detektieren, was darauf hindeutet, dass sowohl

embryonales EGF als auch embryonale Steroide die EGF-Rezeptorendichte im

Endometrium der Sau beeinflussen könnten (WOLLENHAUPT et al., 1999,

2004). Auch humane präimplantatorische Embryonen exprimieren EGF und

EGF-R, wobei die gleichzeitige Expression von Faktor und Rezeptor auf die

autokrine Stimulation der frühen embryonalen Entwicklung hinweisen könnte.

Zusätzlich wurde EGF auch in Blastozysten von Mäusen (CAI et al., 2003) und

Kaninchen (KLONISCH et al., 2001) gefunden. Allerdings exprimieren

Embryonen von Schafen und Rindern kein EGF (WATSON et al., 1992;

GHARIB-HAMROUCHE et al., 1995).

EGF hat auf Embryonen einen mitogenen Effekt und regt die Differenzierung der

Zellen an: der Zusatz von EGF und auch TGF-α und –β zu präimplantatorischen

54

Embryonen von Mäusen führte zu erhöhter Proliferation und Differenzierung der

embryonalen Zellen und dadurch zur Entwicklung vom 2-Zell Stadium zur

Blastozyste (PARIA und DEY, 1990; GLABOWSKI et al., 2005). EGF wirkt

außerdem protektiv auf Mäuseembryonen gegen negative Stimuli wie Tumor

Necrosis Factor-α (TNF-α) (GLABOWSKI et al., 2005). LONERGAN et al.

(1996) wiesen nach, dass EGF den Metabolismus von präimplantatorischen

bovinen Embryonen stimuliert, konnten aber keinen mitogenen Effekt von EGF

auf die Embryonen nachweisen. Zum gleichen Ergebnis kamen WOOD u. KAYE

(1989): die Zugabe von EGF zu Mäuseembryonen bewirkte zwar eine erhöhte

Proteinproduktion und die Differenzierung der Blastozysten in Tropho- und

Embryoblast, mitogenen Effekte wurden jedoch nicht beobachtet. Ähnlich die

Ergebnisse von WEI et al. (2001): EGF unterstützte die Entwicklung von porcinen

Embryonen zu Blastozysten in vitro, bewirkte aber keine erhöhte Proliferation der

embryonalen Zellen. Außerdem spielt EGF eine Rolle beim Auflösen der Zona

pellucida (PARIA et al., 1991; KIM et al., 1999). Während der Implantation

scheint EGF die Invasivität des Trophoblasten zu stimulieren: CAI et al. (2003)

deuteten die gleichzeitige Expression von EGF und EGF-R in Mäuse-

Blastozysten als autokrine Regulation der Invasivität des Trophoblast während der

Implantation. Durch die Verabreichung von EGF konnte auch bei humanen

Zytotrophoblastenzellen die invasive Kapazität in vitro deutlich erhöht werden

(BASS et al., 1994) und die Supplementierung von EGF führte zur erhöhten

Produktion von Plasminogen activators, welche wichtig für die Implantation sind,

in präimplantatorischen Rattenembryonen (AFLALO et al., 2007).

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sowohl EGF, als auch EGF-R von

Embryonen der meisten untersuchten Tierarten gebildet werden und EGF sowohl

autokrin, als auch parakrin einen starken Einfluss auf die präimplantatorische

Entwicklung hat. Die unterschiedlichen Ergebnisse bezüglich der EGF-Expression

während der frühen Gravidität könnten ihre Ursache in der spezies-spezifischen

Regulation der Implantation und Entwicklung der verschiedenen Plazenta-Typen

haben oder auch einfach Artefakte aufgrund unterschiedlicher Messmethoden

sein.

55

In dieser Studie haben wir die Expression von EGF und EGF-R und deren Verlauf

während der frühen Gravidität der Hündin untersucht. Wie bei anderen Tierarten

erreicht der Faktor während der Implantation seinen Höhepunkt und scheint

besonders für dieses Ereignis von Bedeutung zu sein. Die Ergebnisse lassen

vermuten, dass EGF und sein Rezeptor gegenläufig reguliert werden und

zusammen mit einer Vielzahl anderer Wachstumsfaktoren (SCHÄFER-SOMI et

al., 2008) essentiell für die Implantation und Plazentation in der caninen

Gravidität sind.

5.3. PAF und Rezeptor

PAF ist an vielen Ereignissen im Reproduktionstrakt beteiligt und wurde im

Endometrium der Ratte (LI et al., 1999), des Kaninchens (ANGLE et al., 1988),

des Schafes (BATTYE et al., 1996), des Rindes (TIEMANN et al., 2001b) und

Menschen (ALECOZAY et al., 1991) gefunden. Auch sein Rezeptor, PAF-R,

wurde im Endometrium gravider Kaninchen (KUDOLO u. HARPER, 1989), im

fetalen und maternalen Teil der Plazenta von Rindern (TIEMANN et al., 2001a, b;

BÜCHER et al., 2006), im Endometrium von graviden Schweinen (YANG et al.,

2003) und im zyklischen Endometrium des Menschen (AHMED et al., 1998)

detektiert.

Die Ergebnisse dieser Studie ergaben, dass die Expression von PAF im Uterus der

graviden Hündin präimplantatorisch maximal war und danach signifikant abfiel.

Auch die PAF-Expression im Uterus des graviden Kaninchens steigt während der

präimplantatorischen Phase an, erreicht ihren Höhepunkt während der

Implantation und fällt danach wieder ab, was zur Folgerung führt, dass PAF vor

allem an den ersten Schritten der Implantation, wie erhöhte vaskuläre

Permeabilität, beteiligt ist (ANGLE et al., 1988). Ähnlich wie die Ergebnisse

beim Kaninchen sind jene bei der Kuh: der kontinuierliche Anstieg der

Expression im Uterus erreichte seinen Höhepunkt kurz vor der Implantation und

wird stärker exprimiert als im zyklischen Endometrium zum vergleichbaren

Zeitpunkt, was auf die höhere Progesteronkonzentration während der Gravidität

56

zurückgeführt werden könnte (TIEMANN et al., 2001b). Der stimulierende

Einfluss von Progesteron auf die PAF Expression im humanen Endometrium

wurde bereits in der Studie von ALECOZAY et al. (1991) bewiesen.

Es wurde in zahlreichen Studien bewiesen, dass PAF ein essentieller Faktor für

die Implantation, sowie für die Herstellung des rezeptiven Status des

Endometriums ist, was die ansteigende Expression während der

präimplantatorischen Periode, die in dieser Studie beobachtet wurde, erklärt. Die

intrauterine Injektion von PAF verursacht eine Entzündungsreaktion und die

Dezidualisierung der endometrialen Stromazellen von Ratten, welche durch die

Entstehung eines Ödems, sowie Hypertrophie und –plasie der Zellen

charakterisiert ist. Diese Effekte von PAF werden wiederum durch die Bildung

von Prostaglandinen gesteuert (ACKER et al., 1989). Bereits RUBIN et al. (1988)

beschrieben, dass PAF-Antagonisten die vaskuläre Permeabilität herabsetzen.

Auch für die Implantation ist die erhöhte vaskuläre Permeabilität der uterinen

Gefäße charakteristisch (McRAE u. HEAP, 1988). PAF stimuliert die Freisetzung

von PGE im Endometrium (SMITH u. KELLY, 1988; ALECOZAY et al., 1991),

was den permeabilitätsfördernden Effekt des Faktors erklären könnte. Doch auch

PGF2α wird von PAF beeinflusst: ALECOZAY et al. (1991) und BATTYE et al.

(1992) zeigten, dass die Behandlung mit PAF die PGF2α –Produktion im

Endometrium von Menschen sowie Schafen herabsetzt und so maternal bzw.

embryonal synthetisierter PAF die Luteolyse hemmen und an der maternalen

Erkennung der Gravidität beteiligt sein könnte. Außerdem ist PAF auch ein

angiogenetischer Faktor im Endometrium, er stimuliert VEGF und die Freisetzung

von Stickstoffoxid (NO) und verursacht so Vasodilatation, ein Ereignis, welches

für die Implantation charakteristisch ist (AHMED et al., 1998). PAF hat zusätzlich

auch einen mitogenen Effekt auf die Zellen des Endometriums (BALDI et al.,

1994; TIEMANN et al., 1995) und regt die Zytokin-Produktion im Endometrium

an (NASU et al., 1999).

PAF ist ein Faktor, der durch seinen Einfluss auf die Dezidualisierung und das

Wachstum der Zellen, erhöhte vaskuläre Permeabilität, Angiogenese und

Vasodilatation im Endometrium bei der Erkennung der Gravidität und

57

Vorbereitung des Endometriums auf die Implantation bedeutend ist. Seine

angiogenetischen Eigenschaften könnten auch sehr wichtig für die Entstehung der

Blutversorgung der Plazenta sein. Jedoch ist nicht geklärt, ob maternal und/oder

embryonal produzierter PAF das Endometrium beeinflussen, denn PAF wird

sowohl vom graviden, als auch zyklischen Endometrium in sehr niedrigen

Konzentrationen gebildet (ANGLE et al., 1988; CHAMI u. O’NEILL, 2001). Es

ist auch nicht geklärt, ob PAF endometrialen Ursprungs auf den Embryo wirkt

(O’NEILL, 2005).

Gleich wie die Expression von PAF verlief die des PAF-R bei der graviden

Hündin; PAF-R fiel zwischen Präimplantation und Plazentation signifikant ab.

Beim Kaninchen erreichte PAF-R während der Implantation seinen Höhepunkt

(KUDOLO et al., 1991). Bei Kalbinnen wurde ein signifikanter Anstieg von

PAF-R im Uterus von graviden Kalbinnen am Tag 20 (präimplantatorische

Periode) im Vergleich zu nicht tragenden Kalbinnen nachgewiesen, was darauf

schließen ließ, dass PAF im Zusammenhang mit der Kontrolle des uterinen

Gefäßbettes sowie der Modulation des endometrialen Zellwachstums bei der

Vorbereitung für die Implantation stehen könnte (TIEMANN et al., 2001a, b)

Außerdem wurde PAF-R beim Rind in unreifen, nicht aber in reifen

Trophoblastenzellen gefunden, PAF könnte somit eine Rolle bei der

Differenzierung und Migration dieser Zellen in das Endometrium spielen

(BÜCHER et al., 2006), denn auch in Brustkrebszellen bewirkt PAF Migration

und Proliferation (BUSSOLATI et al., 2000).

Die Bedeutung von PAF für die Vorbereitung des Endometriums auf die

Implantation wird auch in den Ergebnissen dieser Studie bei der Hündin

widergespiegelt und PAF scheint ein essentieller Faktor während der frühen

Gravidität der Hündin zu sein.

PAF und PAF-R wurden in unserer Studie auch in den caninen

präimplantatorischen Embryonen nachgewiesen. Auch bei anderen Tierarten

wurde der Faktor nicht nur im weiblichen Reproduktionstrakt, sondern auch in

den präimplantatorischen Embryonen detektiert: der Faktor wurde in

präimplantatorischen Embryonen vom Zweizell- bis zum Blastozystenstadium

58

von Mäusen (O’NEILL, 1985; O’NEILL, 1997; ROUDEBUSH et al., 2002a),

Kaninchen (MINHAS et al., 1993), Schafen (BATTYE et al., 1991), Rindern

(STOCK u. HANSEL, 1992), Schweinen (YANG et al., 2003) und Menschen

(COLLIER et al., 1988; ROUDEBUSH et al., 2002b), nachgewiesen. Ebenso

konnte der PAF-Rezeptor in Embryonen vom Zweizellstadium bis hin zur

Blastozyste von Mäusen (STOJANOV u. O’NEILL, 1999; ROUDEBUSH et al.,

2002a), Kaninchen (KUDOLO et al., 1991), Schweinen (YANG et al., 2003) und

Menschen (ROUDEBUSH et al., 2003) nachgewiesen werden.

Das Wachstum von präimplantatorischen Embryonen wird von einer komplexen

Interaktion verschiedener Wachstumsfaktoren reguliert und zumindest teilweise

von autokrinen Wachstumsfaktoren, welche in einer sehr komplexen Art und

Weise zusammenwirken, gesteuert (O’NEILL, 2008). PAF gehört zu den

embryonalen autokrinen Embryotropinen, welche vom Embryo produziert werden

und eine Rolle beim Überleben des präimplantatorischen Embryos und der

Bildung der Blastozyste spielen; O’NEILL (1997, 1998) berichteten, dass die

Supplementierung von PAF die Entwicklung von Embryonen zur Blastozyste in

vitro steigert und einen „Survival-Faktor“ für die Embryonen darstellt, da er die

Apoptose embryonaler Zellen reduziert. PAF stimuliert in vitro den Metabolismus

(RYAN et al., 1990a) und das Wachstum (ROBERTS et al., 1993) der

präimplantatorischen Embryonen; die mit PAF behandelten Embryonen zeigen

einen höheren Mitoseindex (ROBERTS et al., 1993) und der Faktor stimuliert die

Produktion von embryonalen Proto-Onkogenen, welche essentiell für die

Entwicklung, das Wachstum und Überleben der Embryonen sind (JIN u.

O’NEILL, 2011). Je höher die PAF-Produktion von humanen Embryonen ist,

desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass es auch zu einer erfolgreichen

Schwangerschaft kommt; PAF ist somit ein Indikator für die Lebensfähigkeit der

Embryonen (ROUDEBUSH et al., 2002b). In der Studie von O’NEILL et al.

(1989) steigerte die Behandlung von präimplantatorischen Embryonen mit PAF

die Schwangerschaftsrate beim Menschen signifikant und bei Mäuseembryonen,

welche mit PAF behandelt wurden, stiegen die Geburtenrate und das Gewicht der

Neonaten signifikant an (ROUDEBUSH et al., 2004). Allerdings entwickelten

sich Mäuse, welchen das PAF-R Gen fehlte, normal und waren sogar fruchtbar

59

(ISHII et al., 1998), was vermuten lässt, dass PAF auch an andere Rezeptoren

binden bzw. unabhängig vom Rezeptor wirken kann. Auch LU et al. (2004)

führten eine Studie mit PAF-R Knock-out-Mäusen durch, in der sich im Vergleich

zu normalen Mäusen weniger Embryonen zur Blastozyste entwickelten.

Neben seinem positiven Einfluss auf die Entwicklung des Embryos, ist PAF ein

essentieller Faktor während der Implantation, denn diese kann durch die

Behandlung mit PAF-Antagonisten gehemmt werden (ACKER et al., 1988;

SPINKS u. O’NEILL, 1988; RYAN et al., 1990b; SPINKS et al., 1990;

O’NEILL, 1995b). Zusätzlich wurde in der Studie von RYAN et al. (1990b)

gezeigt, dass die Behandlung von Embryonen mit PAF das Implantationspotential

signifikant steigern kann.

Embryonaler PAF scheint als einer der wichtigsten autokrinen Faktoren die

Entwicklung der caninen präimplantatorischen Embryonen zu beeinflussen, sowie

parakrin auch an präimplantatorischen Veränderungen des Endometriums sowie

maternaler Erkennung der Gravidität beteiligt zu sein. Als essentieller Faktor für

die erfolgreiche Implantation könnten PAF-Antagonisten vielleicht auch als

kontrazeptive Maßnahmen eingesetzt werden.

60

6. Zusammenfassung

6.1. Ziele der Arbeit

Die Untersuchung von Wachstum und Angiogenese, sowie lokaler Immunität im

graviden caninen Uterus könnte hilfreich bei der Entwicklung neuer, nicht-

chirurgischer kontrazeptiver Maßnahmen sein. Das Ziel dieser Studie war es, das

Vorhandensein und den Verlauf der Expression von Vascular Endothelial Growth

Factor (VEGF), VEGF-Rezeptoren (VEGF-R1, VEGF-R2), Epidermal Growth

Factor (EGF), EGF-Rezeptor (EGF-R), Platelet Activating Factor (PAF) und

PAF-Rezeptor (PAF-R), Faktoren und deren Rezeptoren, welche wichtig für

Wachstum und Angiogenese im Uterus anderer Säugetiere sind, während der

Gravidität der Hündin zu untersuchen.

6.2. Materialien und Methodik

15 Hündinnen wurden 10 - 12 (n=5), 18 - 25 (n=5) und 28 - 45 (n=5) Tage nach

der Deckung ovariohysterektomiert. Die präimplantatorische Gruppe wurde durch

die Spülung der Embryonen aus dem Uterus nach der Ovariohysterektomie als

gravide bestätigt. Als Kontrolle dienten 4 nicht-gravide Hündinnen im Metöstrus

(Tag 10 -12, Embryo-negativ). Es wurden Gewebeproben von den Uterushörnern

und Plazentationsstellen genommen, in Tissue Tec® eingebettet und in flüssigem

Stickstoff schockgefroren. Die Embryonen wurden in PBS gewaschen und

tiefgefroren gelagert. Die Extraktion der mRNA aus den Uterusproben und

Embryonen erfolgte mittels TRI-Reagenz. Anschließend wurden qualitative und

quantitative RT-PCR durchgeführt.

6.3. Ergebnisse

In den Uterusproben aller Gruppen wurden alle 3 Faktoren sowie deren

Rezeptoren exprimiert. VEGF, VEGF-R2, PAF und PAF-R erreichten ihren

Höhepunkt während des präimplantatorischen Stadiums und fielen danach ab,

während sich VEGF-R1 im Verlauf der Gravidität nicht signifikant veränderte.

61

EGF wurde während der Implantation am stärksten exprimiert, EGF-R verhielt

sich gegenläufig zu EGF. Die Embryonen exprimierten alle untersuchten Faktoren

und Rezeptoren mit Ausnahme von VEGF. Diese Ergebnisse deuten darauf hin,

dass die untersuchten Faktoren bedeutend für die frühe Gravidität, speziell für die

präimplantatorische und implantatorische Phase der Hündin sind und die

Manipulation dieser Faktoren interessant für die Entwicklung nicht-chirurgischer

kontrazeptiver Maßnahmen sein könnte.

62

7. Extended Summary

7.1. Objective of the present study

Investigation of growth, angiogenesis and local immunology of the pregnant

canine uterus could be helpful to develop non-surgical contraceptive measures.

The aim of the present study was to investigate the course of expression of

vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF-receptors (VEGF-R1, VEGF-

R2), epidermal growth factor (EGF), EGF-receptor (EGF-R), platelet activating

factor (PAF) and PAF-receptor (PAF-R) during canine pregnancy. These factors

and receptors were shown to be important for uterine growth and angiogenesis in

other mammals.

7.2. Materials and methods

15 pregnant bitches were ovariohysterectomized at days 10 - 12 (n=5), 18 - 25

(n=5) and 28 - 45 (n=5) days after mating, respectively. The preimplantation

group was proven pregnant by embryo flushing of the uterus after the operation.

Four non-pregnant bitches in diestrus (day 10 - 12, embryo negative) served as

controls. Tissue samples from the uterus (placentation sites and horn width) were

excised and snap frozen in liquid nitrogen after embedding in Tissue Tek®.

Extraction of mRNA for RT-PCR was performed with Tri-Reagent.

7.3. Results

In the course of pregnancy, significantly higher expression of PAF and PAFR as

well as VEGF and VEGFR2 during the preimplantation stage than in all other

stages, and a strong upregulation of EGF during implantation was characteristic.

This points towards an increased need during the earliest pregnancy stages. The

course of EGF-R was in diametrical opposition to the course of the factor. In the

embryos, mRNA from all factors except VEGF was detected. This may be

explained by an increased need of the investigated factors during preimplantation

and implantation. As to non-surgical sterilization, manipulation of factors most

important during early pregnancy stages might be interesting.

63

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100

9. Danksagung

Danken möchte ich an dieser Stelle Frau Ao.Univ-Prof. Dr.med.vet. Sabine

Schäfer-Somi für die Bereitstellung des Themas und der Infrastruktur zur

Abarbeitung desselben, die Hilfe bei der Durchführung der qualitativen PCR und

Statistik sowie für die gute Betreuung und den jederzeit verfügbaren Ratschlag.

Herzlichen Dank auch an Frau Mag.rer.nat. Sonja Sabitzer für die Bestimmung

der RIN-Werte, die Durchführung der quantitativen PCR und Bereitstellung der

Ergebnisse.

101

10. Anhang

10.1. Tabelle der verwendeten Proben

Tab. 6: Verwendete Proben der präimplantatorische Gruppe, n=5

Name der Hündin Tag der Gravidität RIN-Wert

1 Asli 12 9

2 Hophop 10 8.8

3 Obez 12 7.8

4 Davul 10 9.2

5 Esdar 8 7.6

Tab. 7: Verwendete Proben der embryo-negativen Gruppe, n=5


21 Alas 10 10

22 Adsiz 12 9.4

23 Zurna 10 8.9

24 Kiz 10 8.2

26 Safinaz 14-15 5.2

Tab. 8: Verwendete Proben der implantatorischen Gruppe, n=5


11 Delta 22 8.2

10 Sele 20 7.8

9 Hortum 23 6.4

20 Gidon 18 5.7

17 Plazd20 20 6.5

Rot markierte Werte wurden nicht in die Analyse miteinbezogen

102

Tab. 9: Verwendete Proben der plazentatorischen Gruppe, n=5


18 Pudra 35 8.3

12 Beybi 35 9.2

14 Naclican 28 8.8

16 Bilal 26-28 9.2

19 Kartopu 27 8.7

Molekularer Nachweis von Vascular Endothelial Growth ......wird und eine entscheidende Rolle bei der...

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