Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung...
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Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple kartilaginäre Exostosen)
DNA-Sequenzanalyse (direkte Diagnostik) (Tricho-Rhino-Phalangeales Syndrom)
MLPA (direkte Diagnostik, Retinoblastom)
(D. Lohmann) H.-J. Lüdecke
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Retinoblastom
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Familienanamnese bei Retinoblastom
Familie L.S.
I
II
1 2
1 2 3
I
II
1 2
1 2 3
Familie J.W.
Familie L.B.
I
II
1 2
1 2
III 1 2 3
3 4
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Erbliches Retinoblastom
rbrb rbrbRBRB rbrbrbrb X RBRB
TumorkonstitutionellKeimbahn
rbrb RBRB
Gameten
ersteMutation
zweiteMutation
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Retinoblastomgen
1 2 3 6 7 17 18 275´ 3´
Genomische DNA
ExonIntron Intron
Beispiele für Mutationen in kodierenden Bereichen
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Segregation
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Indirekte Diagnostik: Segregation gekoppelter Marker
locus A
locus B
A1 A2B1 B2
A1B1
A1B1
A2B2
A2B2
A1B1
A2B2
A1B1
A2B2
crossingover
DNA-replication
or
A1B1
A1B1
A1B1
A1B2
A2B1
A2B2
A2B2
A2B2
gametes
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VNTR-Polymorphismus
14801 ggtgtacgtc tatacagggc tatgtataac cgactcctgt ttctcctccc 14851 tgcaaccaca gaaccatcac acacacacac acacacacac acacacacac
14901 acacacacac acacggatac acgcacagat acgctccttt ccacaaatgc
14951 acgcaaaccg ggacgcaaac ccacaactcg agggcttaga ccttcactgc
5´ 3´
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... CTTT ...
... GAAA ...
Intragene VNTR-Loci
5´ 3´
D13S153(RBi2) RB1.20
... CA ...
... GT ...n n
VNTR-Loci
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Genotypisierung
RB1, väterliches Allel RB1, mütterliches Allel
CAGT
20
CTTTGAAA
14
CAGT
18
CTTTGAAA
19
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Kopplungsphase
RB1, mutiert
CTTTGAAA
14
CTTTGAAA
19
4bpDeletionExon 4
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Kopplungsphase
I
II
1 2
1 2
III 1 2 3
3 4
14-2014-20
14-1814-18
15-1815-18
18-2018-20
14-1614-16
Rb1.20-Rb1.20-GenotypGenotyp
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Kopplungsphase
I
II
1 2
1 2
III 1 2 3
3 4
1414-20-20
1414-18-18
15-1815-18
18-2018-20
1414-16-16
Rb1.20-Rb1.20-GenotypGenotyp
CTTTGAAA
1414
4bpDeletionExon 4
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Analyse von VNTR-Loci
5´ 3´
PCR
Fragmentlängenanalysedurch elektrophoretischeAuftrennung
oder
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Gelektrophorese
›
+
– 1 2 3Ladepositionen
elek
tris
ches
Fel
d
Längen-standard
Polyacrylamidgel
St.
90 bp
180 bp190 bp
300 bp
400 bp500 bp
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Agarosegel in Elektrophresekammer
Kathode (+)
Anode (–)
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Auftragen der Proben
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Elektrophoretische Auftrennung
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Dokumentation per Videobild
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Dokumentation
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Genotypisierung
I
II
1 2
1 2
III 1 2 3
3 4
11-5-5
11-4-4
2-42-4
4-54-5
11-3-3
Rb1.20-Rb1.20-GenotypGenotyp
I-1 I-2 II-2 II-3 III-1
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Familie I
I
II
III
1 2
1 2 3 4
1 2
I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1 III-2 RB-Probenvon III-2
Familie 1
11 11
1
1
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Familie I
I
II
III
1 2
1 2 3 4
1 2
I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1 III-2 RB-Probenvon III-2
Familie 1
2222 22 22 22 22
1-2
12 2
2
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Familie I
I
II
III
1 2
1 2 3 4
1 2
I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1 III-2 RB-Probenvon III-2
Familie 1
33
1-2
12-3 2-3
2-3
33
33 33 33 33
3
3
3
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Familie I
I
II
III
1 2
1 2 3 4
1 2
I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1 III-2 RB-Probenvon III-2
Familie 1
44
1-2
1-42-3 2-3
2-3
3-4
3
3
44
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Familie I
I
II
III
1 2
1 2 3 4
1 2
I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1 III-2 RB-Probenvon III-2
Familie 1
1-2
1-42-3 2-3
2-3
3-4
3-5
3-5
55 55
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Familie I
I
II
III
1 2
1 2 3 4
1 2
I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1 III-2 RB-Probenvon III-2
Familie 1
11-22
11-422-3 22-33
22-3
3-4
33-5
3-5
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Familie 2
II-1 II-3II-2 III-1
Familie 2 I
II 1
1 2
2 3
1III22-331-31-3 11-33
22-3
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Familie 3Familie 4
II
III
IV
1 2
1 2
1
I 1 2
3 4 5
II-1 II-3II-2 II-4III-1 III-2 IV-1 II-5
44-5 2-4
2-44
1-5 3-44 1-5
44-4
1-4
3
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Familie 4
I
II
1 2 3
III
1 2 3 4
1
Familie 6
I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1
2-4
2-4
2-33
22-33
22-4 33-4 1-33
4
![Page 31: Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple.](https://reader038.fdokument.com/reader038/viewer/2022102915/570491ca1a28ab14218dd475/html5/thumbnails/31.jpg)
Prädiktive Diagnostik bei Prädiktive Diagnostik bei LocusheterogenitätLocusheterogenität
SegregationsanalyseSegregationsanalyse bei bei hereditären multiplen cartilaginären hereditären multiplen cartilaginären
Exostosen (HME)Exostosen (HME)
Hermann-Josef LüdeckeHermann-Josef Lüdecke
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![Page 33: Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple.](https://reader038.fdokument.com/reader038/viewer/2022102915/570491ca1a28ab14218dd475/html5/thumbnails/33.jpg)
![Page 34: Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple.](https://reader038.fdokument.com/reader038/viewer/2022102915/570491ca1a28ab14218dd475/html5/thumbnails/34.jpg)
Lokalisierung der ExostosenLokalisierung der Exostosen
![Page 35: Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple.](https://reader038.fdokument.com/reader038/viewer/2022102915/570491ca1a28ab14218dd475/html5/thumbnails/35.jpg)
Multiple cartilaginäre ExostosenMultiple cartilaginäre Exostosen
Häufigkeit 1 : 50.000
Penetranz 100 %
autosomal dominant
genetisch heterogen• 8q24.1 EXT1• 11p11-12 EXT2 (19p EXT3)
![Page 36: Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple.](https://reader038.fdokument.com/reader038/viewer/2022102915/570491ca1a28ab14218dd475/html5/thumbnails/36.jpg)
Spektrum der Mutationen in Spektrum der Mutationen in EXT1EXT1 und und EXT2EXT2
Wuyts & van Hul, 2000
![Page 37: Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple.](https://reader038.fdokument.com/reader038/viewer/2022102915/570491ca1a28ab14218dd475/html5/thumbnails/37.jpg)
KopplungsanalyseKopplungsanalyse
und Segregationsanalyseund Segregationsanalyse
mitmit
EXT1EXT1- bzw. - bzw. EXT2EXT2- intragenen- intragenen
Mikrosatelliten-MarkernMikrosatelliten-Markern
![Page 38: Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple.](https://reader038.fdokument.com/reader038/viewer/2022102915/570491ca1a28ab14218dd475/html5/thumbnails/38.jpg)
genomische Organisation des genomische Organisation des EXT1EXT1-Gens-Gens
(A)nUGAAUG
6.5
5.09.0 1.0 4.0
4.0 2.2
6.02.2
6.0
65G5 46F10
25B8
90D8
250 kb
6.0
21 3 4 5 6 7 8 9 10 11
“EXT1“
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Kopplungsphase:Risiko:
12345
1234
P
P
PGP
P P
EXT2, Allel 2
MP
kein Risiko
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ÜbungsaufgabenÜbungsaufgaben
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1234
123P
P
EXT1, Allel 2
P
kein Risiko für III2
![Page 42: Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple.](https://reader038.fdokument.com/reader038/viewer/2022102915/570491ca1a28ab14218dd475/html5/thumbnails/42.jpg)
123
123
P P
P P
keine Aussage möglich
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12345
1234
P
P
EXT2, Allel 2
P
Individuum III2 wird erkranken
![Page 44: Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple.](https://reader038.fdokument.com/reader038/viewer/2022102915/570491ca1a28ab14218dd475/html5/thumbnails/44.jpg)
I
II
EXT1
EXT2
Familie D
P PPM M
M
M
MP
? P ?
Fehlen paternaler EXT1-Allele
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y935A12
y960B10
y960B10
![Page 46: Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple.](https://reader038.fdokument.com/reader038/viewer/2022102915/570491ca1a28ab14218dd475/html5/thumbnails/46.jpg)
der(8)
der(5)
8
der(5)
5
5
Sonde: "paint 5" Sonde: y960B10
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Molekulargenetische Molekulargenetische Diagnostik durch DNA-Diagnostik durch DNA-
SequenzanalyseSequenzanalyse
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PunktmutationenPunktmutationen
THE CAT DID EAT THE RED HATTHE CAT DID EAT THE RED HAT
THE RAT DID EAT THE RED HATTHE RAT DID EAT THE RED HAT
THE ATD IDE ATT HER EDH ATTHE ATD IDE ATT HER EDH AT
THE CHA TDI DEA TTH ERE DHA TTHE CHA TDI DEA TTH ERE DHA T
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1. Enzymatische Vermehrung des zu untersuchenden Genabschnittes mittels PCR
Cave: Es werden immer das maternale und paternale gemeinsam amplifiziert!
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2. Enzymatische Sequenzierung nach Sanger
Template (Matrize)
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'
Primer (Startmolekül)5'-AAGTCATTGC-3'
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGC-3'
Primer-Annealing (Anlagerung)
DNA-PolymerasedNTPsddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
Primer-Verlängerung und Kettenabbruch
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Enzymatische Sequenzierung nach Sanger
Template (Matrize, einzelsträngig)
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'
Primer (Startmolekül)5'-AAGTCATTGC-3'
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGC-3'
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGC
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGC
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGC
Primer-Annealing (Anlagerung)
DNA-PolymerasedNTPsddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
Primer-Verlängerung und Kettenabbruch
TACGTAACT
TACGTAACTG
TACGTAACTGA
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGCTACGTAACTGAC
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Enzymatische Sequenzierung nach Sanger
3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGC-3'
5'-AAGTCATTGCTACGT
DNA-PolymerasedNTPsddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
Primer-Verlängerung und Kettenabbruch
5'-AAGTCATTGCTACGTAA5'-AAGTCATTGCTACGTAAC
hier sind einmal alle Produkte der Primer-Verlängerung gezeigt:
5'-AAGTCATTGCT5'-AAGTCATTGCTA5'-AAGTCATTGCTAC5'-AAGTCATTGCTACG
5'-AAGTCATTGCTACGTA
5'-AAGTCATTGCTACGTAACT5'-AAGTCATTGCTACGTAACTG5'-AAGTCATTGCTACGTAACTGAusw.
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Gelelektrophorese Kapillarelektrophorese
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manuelle Beladung der Gele automatische Beladung der Kapillaren
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laser
detectorcomputer
Automateddetection
–
+
T ACT GAGCT ACAGAAAAACAT AGAA
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AGCTATAATTGTCAGTTCTGTGACTTCNGATATTCCAAAAGC
AGCTATAATTGTCAGTTCTGTGACTTCCGATATTCCAAAAGC
PatientPatient
NormalpersonNormalperson
CGATGA
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Klinische Zeichen:Klinische Zeichen:
• dünnes, spärliches Kopfhaar dünnes, spärliches Kopfhaar • große, "birnenförmige" Nase große, "birnenförmige" Nase • langes, flaches Philtrumlanges, flaches Philtrum• schmales Oberlippenrotschmales Oberlippenrot• ZapfenepiphysenZapfenepiphysen• BrachydaktylieBrachydaktylie• HüftveränderungenHüftveränderungen• KleinwuchsKleinwuchs• multiple cartilaginäre Exostosen multiple cartilaginäre Exostosen (nur TRPS II) (nur TRPS II)
Tricho-Rhino-Phalangeale SyndromeTricho-Rhino-Phalangeale Syndrome8
TRPS1TRPS1EXT1EXT1
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Tricho-Rhino-Phalangeales SyndromTricho-Rhino-Phalangeales Syndrom
An dieser Stelle wurde im Praktikum das Foto einer
Patientin gezeigt. Dieses darf jedoch nicht im Internet
veröffentlicht werden. Ich hoffe, Sie haben sich die
Charakteristika des TRPS einprägen können.
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![Page 64: Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple.](https://reader038.fdokument.com/reader038/viewer/2022102915/570491ca1a28ab14218dd475/html5/thumbnails/64.jpg)
33 44 55 6 77N C
Struktur des TRPS1 TranskriptionsfaktorsStruktur des TRPS1 Transkriptionsfaktors
Exon 6Exon 6
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Sequenzierung von Exon 6 des Sequenzierung von Exon 6 des TRPS1TRPS1-Gens-Gens
CGA CGA CAA; Arg CAA; Arg Gln; R Gln; R Q Q
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ÜbungsaufgabenÜbungsaufgaben
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Patient 1Patient 1
NormalpersonNormalperson
CCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTGNCCACAAAGACCTCTC
CCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTGACCACAAAGACCTCTC
ACCCCC
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Patient 1Patient 1
NormalpersonNormalperson
CCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTGNCCACAAAGACCTCTC
CCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTGACCACAAAGACCTCTC
ACCCCC
= Thr= Pro
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R R R G S G V F C
ANCLTTKTSLW
RKNANGGYVC
NA
CG L Y Q K L H S
Zn
PP
NH2 COOH
Struktur des Zinkfingers vom "GATA"-TypStruktur des Zinkfingers vom "GATA"-Typ
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aus: Vilain et al. (1999) Am J Med Genet 85:495-497
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Patient 2Patient 2
NormalpersonNormalperson
CAGAGGCGTAGAGGCTCCGGTGTTTTTTNGGNCCATTGNCNN
CAGAGGCGTAGAGGCTCCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTG
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Patient 2Patient 2
NormalpersonNormalperson
CAGAGGCGTAGAGGCTCCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTG
TGTGCCAATTGCCTGTGCCAATTGCCTG
CAGAGGCGTAGAGGCTCCGGTGTTTTTTNGGNCCATTGNCNNWildtyp:mutant:
T-Insertion
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Patient 3Patient 3
NormalpersonNormalperson
CTCTGGCGAAAGAATGCAAATGGCGGATANGTATGCAACGCGT
CTCTGGCGAAAGAATGCAAATGGCGGATATGTATGCAACGCGT
TATTAA = Stop
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Patient 4Patient 4
NormalpersonNormalperson
AAGCTTCACTCGNTAAGAACTTGTTCCACTCTTTCAGGAAAA
AAGCTTCACTCGGTAAGAACTTGTTCCACTCTTTCAGGAAAA
gtaagattaaga
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RNA - Spleissen
WildtypWildtyp
Mutation eines Spleiss-SignalsMutation eines Spleiss-Signals
![Page 77: Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple.](https://reader038.fdokument.com/reader038/viewer/2022102915/570491ca1a28ab14218dd475/html5/thumbnails/77.jpg)
33 44 55 6 77N C
IVS6+1G>T exon6-TRPS1
33 44 55 77N C
1281 aa1281 aa
1240 aa1240 aa
Wildtyp-TRPS1
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MMultiplex ultiplex LLigation-dependent igation-dependent PProbe robe AAmplication mplication (MLPA)(MLPA)
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SALSA MLPA probes
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Hybridisierung1. Der MLPA Sondenmix wird zu denaturierter
genomischer DNA gegeben2. Die zwei Teile jeder Sonde hybridisieren mit
benachbarten Zielsequenzen
Beachte den Unterschied
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Ligation3. Die Sonden werden mit Hilfe einer thermostabilen
Ligase verbunden (ligiert)
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Amplification4. Mit einem universellen Primerpaar kann man alle
ligierten Sonden amplifizierenDas Amplifikationsprodukt jeder einzelnen Sonde hat eine genau definierte Länge (92 - 481 bp).
Fluoreszenzfarbstoff
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bp
NP1
NP2
Patient 1
Patient 2
Patient 3
1 10 20 30 40