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Nachweis der Surfactant Proteine A, B, C und D im

Epithel der humanen Gingiva sowie deren

Quantifizierung in gesundem und pathologisch

verändertem Speichel

Der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des

Doktorgrades Dr. med. dent.

vorgelegt von

Christina Stengl aus Roth

Als Dissertation genehmigt von der

medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler

Gutachter: Prof. Dr. Lars Bräuer

Gutachter: Prof. Dr. Friedrich Paulsen

Tag der mündlichen Prüfung: 06. Oktober 2014

Für meine Familie

Im Besonderen meinem Opa Franz Stengl

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung / Abstract .................................................................. 1

1.1 Hintergrund und Ziele................................................................................. 1

1.2 Methoden ..……………………………………………………………............ 1

1.3 Ergebnisse und Beobachtungen ...………………………………............... 1

1.4 Praktische Schlussfolgerungen ..……………………………………....…... 2

1 Summary ...………………………………………………………….............. 3

1.1 Objective ..………………………………………………............................... 3

1.2 Methods……………………….................................................................... 3

1.3 Results ...……………………...................................................................... 3

1.4 Conclusion ...………………………............................................................ 4

2 Einleitung ..……………………................................................................. 5

2.1 Überblick .................................................................................................... 5

2.2 Das Parodont ..…………............................................................................ 6

2.3 Pathologische Veränderungen der Gingiva und des Parodonts .............. 8

2.4 Speichel ..…………………………………………………………....……...... 10

2.5 Surfactant Proteine ..…………………….................................................... 11

3 Material und Methodik ..…………............................................................ 16

3.1 Eingesetzte Materialien und Chemikalien ..………...............................…. 16

3.1.1 Chemikalien, Kits und Enzyme ..……........................................................ 16

3.1.2 Gebrauchslösungen ...………………......................................................... 18

3.1.3 Gebrauchswaren und Geräte ..…………………….................................... 19

3.1.4 Molekulargewichtsstandards ..……………………………........................... 20

3.2 Art und Herkunft der verwendeten Gewebe- und Speichelproben ........... 21

3.3 RNA-Isolierung aus Gewebe ...………………………........................…… 21

3.4 Photometrische Konzentrationsbestimmung ..…....................................... 22

3.5 Reverse Transkription ...……..................................................................... 23

3.6 Polymerase-Kettenreaktion ...…................................................................ 24

3.7 Agarosegel-Elektrophorese ....................................................................... 26

3.8 Proteinisolierung aus Gewebe .................................................................. 27

3.9 Proteinkonzentration .................................................................................. 27

3.10 SDS-Gelelektrophorese und Western Blot Analyse ................................. 27

3.11 Western Blot .............................................................................................. 28

3.12 Immunhistochemie .................................................................................... 30

3.13 Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) …................................... 31

3.14 Statistik ...................................................................................................... 32

4 Ergebnisse ............................................................................................... 33

4.1 Nachweis der Surfactant Proteine in humanem gingivalen Epithel auf mRNA Ebene ............................................................................................

33

4.2 Nachweis der Surfactant Proteine in humanem gingivalen Epithel auf Proteinebene .............................................................................................

34

4.2.1 Western Blot des gingivalen Epithels ........................................................ 34

4.2.2 Western Blot des Speichels gesunder und erkrankter Patienten ............... 35

4.2.3 Immunhistochemische Analyse ................................................................ 35

4.2.3.1 Gesundes gingivales Gewebe ................................................................... 37

4.2.3.2 Pathologisch verändertes gingivales Gewebe .......................................... 38

4.2.3.3 Negativkontrolle gingivales Epithel ........................................................... 39

4.3 Ergebnisse des Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) ............. 40

4.3.1 Rohdaten der ELISA-Auswertung ............................................................. 40

4.3.2 Quantitative Konzentrationsbestimmung der Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D im Speichel gesunder und an Zahnfleischentzün- dungen erkrankter Patienten ......................................................................

41

5 Diskussion ............................................................................................... 44

5.1 Beurteilung der Ergebnisse der Immunhistochemie ................................. 44

5.2 Betrachtung der Ergebnisse der ELISA-Auswertung ............................... 48

5.3 Erkrankungen der Mundhöhle und deren Auswirkungen auf die Protein- zusammensetzung des Speichels ............................................................

50

5.4 Veränderung des Expressionsverhaltens der Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D bei entzündlichen Erkrankungen des Menschen ....

52

6 Thesen ...................................................................................................... 55

7 Schlussfolgerungen ................................................................................ 56

8 Abkürzungsverzeichnis .......................................................................... 57

9 Literaturverzeichnis ................................................................................ 59

10 Abbildungsverzeichnis ........................................................................... 76

11 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen ................................................ 77

11.1 Detection of Surfactant Proteins A, B, C and D in human gingiva and saliva ..........................................................................................................

77

11.2 Detection of SP-G and SP-H in human saliva as well as regulation of Surfactant-Protein-Expression in healthy and periodontal human saliva .....

77

12 Anhang ..................................................................................................... 78

12.1 Zahnfleischerkrankungen Untersuchungs- und Fragebogen .................... 78

12.2 Rohdaten .................................................................................................... 80

12.3 Statistische Auswertung ............................................................................ 83

13 Danksagung ............................................................................................. 93

14 Lebenslauf ............................................................................................... 94

1

1 Zusammenfassung / Abstract

1.1 Hintergrund und Ziele

Im Rahmen der vorliegenden Studie sollte die Existenz der Surfactant Proteine SP-

A, SP-B, SP-C und SP-D in der menschlichen Gingiva nachgewiesen und im

Speichel bestätigt werden. Des Weiteren sollte überprüft werden, ob ein

signifikanter Unterschied an der Menge der Surfactant Proteine im Speichel

gesunder und an Zahnfleischentzündungen erkrankter Patienten besteht, da

Surfactant Proteine, wie bereits in zahlreichen Studien bewiesen, modulierend in

Entzündungsprozesse eingreifen.

1.2 Methoden

In den Untersuchungen wurden Gewebeproben verwendet, die den Biopsien 19

gesunder und an Parodontalerkrankungen leidender Patienten im Alter von 21 bis

69 Jahren entstammten. Es wurden zusätzlich 80 Speichelproben entnommen, 40

davon von gesunden Probanden, 40 davon von Patienten, die an einer

Zahnfleischentzündung erkrankt waren. Der Nachweis der Proteine SP-A, SP-B,

SP-C und SP-D auf mRNA Ebene wurde mit Hilfe der RT-PCR in gesunder Gingiva

von jeweils drei unterschiedlichen Patienten erbracht. Mittels Western Blot konnten

die Surfactant Proteine in drei Gewebeproben gesunder Patienten für jedes

Surfactant Protein mit Hilfe monoklonaler Antikörper detektiert werden. Es wurden

auch Western Blot Analysen am Speichel gesunder und an einer parodontalen

Erkrankung leidenden Patienten durchgeführt. Für die immunhistochemischen

Untersuchungen wurden Gewebedünnschnitte (6 µm) von gesunden und

pathologischen Gewebeproben hergestellt und die Surfactant Proteine mit Hilfe von

monoklonalen Antikörpern und Gewebefärbungen visualisiert.

Um quantitative Aussagen bezüglich der Konzentration der einzelnen Surfactant

Proteine im Speichel treffen zu können, wurde eine Kohorten-Studie von jeweils 40

gesunden und 40 erkrankten Patienten durchgeführt und mittels ELISA ausgewertet.

1.3 Ergebnisse und Beobachtungen

Die Ergebnisse der durchgeführten Versuche zeigten eindeutig, dass die vier

Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D im gingivalen Epithel und dem

Speichel des Menschen vorkommen. Auf mRNA Ebene wurde der Beweis im

Vergleich zu Plasmid DNA erbracht, welche den ORF der entsprechenden

Surfactant Proteine enthält. Bei den Western Blot Analysen wurde als

Positivkontrolle das Gewebe gesunder menschlicher Lunge genutzt, in dem das

2

Vorkommen der Surfactant Proteine allgemein bekannt ist. Auch bei den

immunhistochemischen Analysen wurde das Gewebe humaner Lunge als

Positivkontrolle mitgeführt. Es wurde deutlich, dass sich das Expressionsverhalten

der Proteine in gesunden und pathologischen Gewebeschnitten unterscheidet.

Während die Antigen-Antikörperreaktion in gesunden Epithelien wie erwartet sehr

homogen ausfiel, waren in den pathologischen Proben deutlich stärkere

Antikörperreaktionen zu erkennen.

1.4 Praktische Schlussfolgerungen

Aus den ermittelten Ergebnissen geht hervor, dass die Surfactant Proteine SP-A,

SP-B, SP-C und SP-D reguläre Bestandteile der gesunden Gingiva sind, aber eine

Veränderung ihres Expressionsverhaltens zeigen, sobald pathologisch verändertes

Gewebe untersucht wird.

Wie bereits bekannt ist, besitzen die Surfactant Proteine A und D direkte und

indirekte antimikrobielle Eigenschaften. So scheinen sie einen direkten Einfluss auf

das Immunsystem der Mundhöhle zu besitzen. Gewebe, welches durch die

Anwesenheit und den Einfluss der Abbauprodukte verschiedenster Bakterien

entzündlich verändert ist, zeigt eine Überexpression an den Surfactant Proteinen

SP-A, SP-C und SP-D. SP-B hingegen wird in geringerer Menge exprimiert. Durch

die veränderte Surfactant-Konzentration des Speichels könnten die Immunantwort

und die Fließfähigkeit des Speichels gerade am Übergang zum gingivalen

Saumepithel verbessert werden und die antimikrobiellen Peptide im Speichel an

Effizienz gewinnen.

3

1 Summary

1.1 Objective

The purpose of this study is to evaluate whether the Surfactant Proteins SP-A, SP-

B, SP-C and SP-D can be detected in human gingiva and saliva. Furthermore it

should be checked if there was a significant difference in quantity of Surfactant

Proteins in saliva from healthy patients and patients with pathologically altered

gingiva.

1.2 Methods

The tissues used in the investigations were taken from 19 healthy patients and

patients who were suffering from periodontal disease. These were taken 80 saliva

samples from volunteers, half from healthy patients half from patients suffering from

periodontal disease. The expression of mRNA for SP-A, -B, -C and -D was analyzed

by RT-PCR in healthy gingiva with three samples from different patients. The

distribution of all Surfactant Proteins was determined with monoclonal antibodies in

three samples from healthy patients by means of Western Blot analysis for each

Surfactant Protein. The Western Blot analysis were also used for investigations on

saliva from healthy patients and patients suffering from periodontal disease. For

immunohistochemistry, tissue specimens from healthy and pathologic (gingivitis)

tissues were sectioned (6 µm) and the Surfactant Proteins were visualized with

monoclonal antibodies and tissue colours. To make statements to the concentration

for each Surfactant Protein in the saliva there is a cohort study from 40 healthy and

40 pathologic samples which are analyzed with the technique of ELISA.

1.3 Results

The results of our studies indicate obviously that all expected Surfactant Proteins

exist in the gingival epithelium and saliva of humans. On mRNA level the evidence

was made in comparison to ß-actin. For Western Blot analyses samples from

healthy human lung tissue were used as positive controls due to Surfactant Protein

being present. In the case of immunohistochemical analyses samples of healthy

human lung tissue was used for positive control as well. It is clearly recognizable

that the expression of the proteins in healthy and pathologic tissue is different. While

the immunoreaction is homogeny in the healthy tissue as expected the reaction of

the antibodies in pathologic tissues is much more intensive.

4

1.4 Conclusion

Our results indicate that the Surfactant Proteins SP-A, SP-B, SP-C and SP-D are

peptides of healthy gingiva and reveal alteration regarding the expression pattern

within pathological states of gingiva. Based on the known direct and indirect

antimicrobial effect, the Surfactant Proteins A and D appear to be involved in

immune defense inside the oral cavity especially in direct proximity of teeth. Tissue

affected by bacterial inflammation (gingivitis) seems to induce overexpression of the

Surfactant Proteins. This could increase the rheology of saliva especially at the crest

of the gingival epithelium to support the function of antimicrobial peptides present in

saliva.

Einleitung

5

2 Einleitung

2.1 Überblick

Die Mundhöhle bildet den ersten Abschnitt des menschlichen Verdauungssystems.

Sie ist nach vorne durch die Lippen, nach hinten durch die Schlundenge, nach oben

durch den harten und weichen Gaumen, nach unten durch den Mundboden und zu

den Seiten durch die Wangen begrenzt. Sie nimmt sowohl anatomisch als auch

funktionell eine besondere Stellung im menschlichen Organismus ein und dient der

mechanischen Zerkleinerung und der initialen biochemischen Aufbereitung der

Nahrung. Es herrscht ein warmes und feuchtes Milieu, das stetig in Wechselwirkung

mit exogenen Einflüssen steht. Eine Besonderheit der Mundhöhle besteht im Aufbau

des Zahnhalteapparats. Die hartgewebigen Zähne durchbrechen das Epithel und

ragen in die Mundhöhle. Zum Schutz der darunter liegenden Gewebe liegt das

Epithel am Zahnhals straff an und ist durch einen Faserapparat gut mit dem

umliegenden Gewebe verbunden. Durch diese anatomische Besonderheit

entstehen viele Nischen, die sehr gute Lebensbedingungen für eine Vielzahl von

Mikroorganismen darstellen. Durch die stete Verbindung zur Außenwelt, die über

die Mundspalte hergestellt wird, ist die Mundhöhle einer Vielzahl von exogenen

Faktoren mikrobiologischer, chemischer und physikalischer Art ausgesetzt und

beherbergt bis zu 200 unterschiedliche Bakterien-Spezies (Socransky and Haffajee,

1994). Somit muss die Mundschleimhaut eine Barriere gegen mögliche

krankheitserregende Mikroorganismen darstellen.

Das parodontale Gewebe und das gingivale Epithel, welches die Zähne direkt

umgibt, dient der Befestigung der Zähne im Kieferknochen und der Abdichtung der

unter dem Epithel befindlichen Strukturen gegenüber den ständig wechselnden

äußeren Einflüssen. Dieser Aufgabe kommt eine große Bedeutung zu, da die

Mundhöhle eine Region des menschlichen Körpers ist, in der aufgrund ihrer Lage

und Aufgaben ständig ein signifikant hohes Risiko für Infektionen und Entzündungen

besteht, die von Krankheitserregern ausgelöst werden. Normalerweise existiert ein

dynamisches Gleichgewicht zwischen den verschiedenen Mikroorganismen und der

Selbstreinigung und Immunregulation der Mundhöhle. Unter diesen, in der

Mundhöhle vorkommenden Mikroorganismen sind außer Bakterien auch Pilze,

Viren, Archaeen und Protozoen (Wade, 2013) zu finden.

Die Ernährungsgewohnheiten der Menschen in den Industrieländern veränderten

sich in den letzten Jahrzehnten stark. Es wird weniger kauintensive

einfachzuckerarme Nahrung konsumiert, was zu einem starken Anstieg der

Krankheiten führt, die in Zusammenhang mit Ernährung und Mundhygiene stehen.

Einleitung

6

Als Karies wird eine Erkrankung der Zahnhartsubstanz bezeichnet. Dabei wandeln

Mikroorganismen den Zucker aus Nahrungsmitteln in organische Säuren um. Diese

erweichen die mineralhaltigen Anteile des Zahnes und führen so zu einer

Zersetzung der Zahnhartsubstanz. Zunächst tritt der Verlust von Zahnhartsubstanz

ein, der im weiteren Verlauf zur Entzündung der Pulpa und damit verbundenen

schwerwiegenden Folgeerkrankungen wie Abszessen und Osteomyelitiden, in

seltenen Fällen mit Todesfolge (Green et al., 2001), führen kann. Neben der Karies,

unter der 60 % - 90 % der Schulkinder und nahezu alle Erwachsenen der

Bevölkerung in den Industrienationen leiden (Petersen and Lennon, 2004), bilden

die Parodontopathien, denen Gingivitis und Parodontitis zuzurechnen sind, die

zweite große Gruppe der Erkrankungen der Mundhöhle. Auch hier sind Bakterien

der Auslöser. Wie bei der Karies sind es vor allem die Stoffwechselprodukte der

Bakterien, die eine Entzündungsreaktion des Zahnfleisches veranlassen. Klinisch

äußert sich diese Immunreaktion durch Schwellung, Rötung und spontane Blutung

des Zahnfleisches. Im weiteren Verlauf folgt ohne zahnmedizinische Behandlung ein

Rückgang des Zahnfleisches und die Destruktion des Zahnhalteapparates, welche

die Lockerung und den Verlust der betroffenen Zähne nach sich zieht.

2.2 Das Parodont

Der Zahnhalteapparat, das Parodont, setzt sich aus vier Bestandteilen zusammen.

Dem Zahnzement, dem Desmodont, dem Alveolarknochen und der Gingiva.

Das Zahnzement, welches dem Dentin apikal der Schmelz-Zementgrenze aufliegt,

bietet den kollagenen Fasern des Desmodonts durch seine Rauigkeit

Haftungsmöglichkeiten an der Wurzeloberfläche. Die Struktur des Zahnzements ist

der des Alveolarknochens sehr ähnlich, enthält aber keine Blutgefäße oder Nerven.

An den verschiedenen Abschnitten der Zahnwurzel bilden sich entsprechend den

Anforderungen unterschiedliche Arten von Zahnzement aus. Den größten Anteil

bildet das azelluläre Fremdfaserzement, das dicke Bündel der Typ 1

Kollagenfasern, die Sharpeyschen Fasern enthält. Das zelluläre Eigenfaserzement

kommt überwiegend an der Wurzelspitze vor und beinhaltet Kollagenfasern, die von

Zementoblasten produziert werden. Das zelluläre Gemischtfaserzement beschreibt

die Mischung der beiden zuvor genannten Zementarten und kommt im apikalen

Bereich der Zahnwurzel vor.

Das Desmodont stellt ein straffes kollagenes Bindegewebe dar, das die Zahnwurzel

allseitig umgibt und sie an der Kompakta der Zahnalveole anheftet. Es füllt den

Parodontalspalt vollständig aus und erlaubt dem Zahn geringfügige Bewegungen

Einleitung

7

unter Belastung, die vor allem durch die Sharpeyschen Fasern ermöglicht werden.

So ist der Zahn fest, aber nicht starr in seiner Position im Knochen fixiert.

Die knöcherne Alveolenwand, ein weiterer Bestandteil des Zahnhalteapparates, ist

entgegen ihrer Bezeichnung als Lamina dura nicht solide, sondern eher siebartig

gestaltet. Die Löcher dienen den Nerven und Gefäßen als Durchtrittsstelle aus dem

Spongiosaanteil des Knochens in das Desmodont und umgekehrt. Der

Alveolarknochen unterliegt ständigen Umbaufunktionen. Er wird durch Belastungen,

die physiologische Zugbelastung der Sharpeyschen Fasern gestärkt, oder atrophiert

in Folge von dauerhafter Druckbelastung, Inaktivität oder andauernden und

rezidivierenden Entzündungen des Desmodonts.

Einen weiteren Bestandteil des Parodonts stellt die Gingiva dar. Sie ist an den

Zähnen angeheftet und geht Richtung Mundvorhof in einer geschwungenen Linie,

der Linea girlandiformis, in die bewegliche Mundschleimhaut, die Mucosa

vestibularis über. Im Gegensatz zur Mundschleimhaut ist die Farbe der Gingiva

blass. Sie setzt sich aus einem Epithel und einer darunter liegenden

Bindegewebsschicht, der Lamina propria, zusammen, mit der das oberflächliche

Epithel durch eine ausgiebige Papillenbildung stark verzahnt ist. Des Weiteren ist

die Lamina propria mit Kollagenfaserbündeln unverschieblich am Alveolarknochen

befestigt und weist kaum elastische Fasern auf. Das Epithel der Gingiva ist ein

mehrschichtiges Plattenepithel, das abhängig von der mechanischen Belastung eine

ortho- oder parakeratinisierte Oberfläche aufweist. Das Gingivaepithel wird durch

das Saumepithel mit dem Zahnhals verbunden. Das orthokeratinisierte

mehrschichtige Plattenepithel wird in der Mundhöhle aus vier Schichten gebildet:

dem Stratum basale, dem Stratum spinosum und Stratum granulosum aufliegen,

sowie dem Stratum corneum. Die oberste Schicht, das Stratum corneum besteht

aus Zellen, deren Inhalt sich von Zellorganellen mit Zellkern zu einer kernlosen

Füllung mit Keratin verändert. Diese Zellen besitzen eine massive Zellmembran und

sind in eine Lipidschicht eingebettet. Das macht sie für hydrophile Substanzen

weniger permeabel. Das parakeratinisierte mehrschichtig unverhornte Plattenepithel

unterscheidet sich von orthokeratinisiertem dadurch, dass kein Stratum granulosum

vorhanden ist und sich in der oberflächlichen Zellschicht zusätzlich zum Keratin

noch Zellkerne befinden. Es ist insgesamt dünner und weniger widerstandsfähig als

orthokeratinisiertes Plattenepithel. Makroskopisch wird die Gingiva in zwei

Abschnitte unterteilt, die freie (Gingiva marginalis) und die befestigte Gingiva

(Gingiva alveolaris), die durch eine Furche voneinander getrennt sind. Die koronal

liegende freie Gingiva bildet nur einen dünnen geschwungenen Streifen, der an den

Zahn angrenzt und auch die interdentalen Papillen überzieht. Sie geht in das

Einleitung

8

Sulkusepithel über, das sich als Saumepithel am Schmelz der Zahnkrone anheftet.

Dadurch entsteht eine schwer zugängliche Nische, die als Sulcus gingivalis

bezeichnet wird (Steiniger B., 2010). Einen guten Überblick über das Parodont

bieten neben dem Buch von B. Steiniger und V. Stachniss „Mikroskopische

Anatomie der Zähne und des Parodonts“ im Georg Thieme Verlag auch die Bücher

„Einführung in die Zahnerhaltung“ von E. Hellwig, J. Klimek, T. Attin im DZV und

„Konservierende Zahnheilkunde und Parodontologie“ von Peter Gängler, erschienen

im Thieme Verlag.

2.3 Pathologische Veränderungen der Gingiva und des Parodonts

Herkunft der Abbildungen: siehe Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Abbildung gesunder parodontaler Verhältnisse in situ. Die Farbe der marginalen

Gingiva ist blassrosa, die Stippelung, die durch einen gesunden Faserapparat hervorgerufen

wird, ist erkennbar.

Abb. 2: Histologischer Aufbau gesunder Gingiva. Es ist orthokeratinisiertes mehrschichtig

verhorntes Plattenepithel zu erkennen. Die oberste Schicht bildet das Stratum corneum,

darunter folgen Stratum granulosum, Stratum spinosum und Stratum basale.

Abb. 3: Schematischer Aufbau entzündeten Parodonts. Während auf der linken Seite der

Abbildung gesunde gingivale Verhältnisse erkennbar sind, wird auf der rechten Seite eine

bereits massive Zerstörung des Zahnhalteapparats deutlich.

Abb. 4: Auf dieser intraoralen Aufnahme erkennt man die Zahnfleischsituation eines an

Gingivitis erkrankten Patienten. Das Zahnfleisch ist im marginalen Bereich abnorm gerötet

und ödematös verändert.

Abb. 5: Histologische Betrachtung entzündlich veränderter Gingiva. In dieser Abbildung wird

die starke Färbung des Mesenchyms erkennbar. Die Zellen sind in Form und Größe

unregelmäßig und wirken aufgelockert.

Einleitung

9

Parodontale Erkrankungen, die initial als Gingivitis und im fortgeschrittenen Zustand

als Parodontitis bezeichnet werden, betreffen bis zu 90 % der weltweiten

Bevölkerung (Pihlstrom et al., 2005). Hinter dem Begriff Gingivitis verbirgt sich eine

entzündliche Erkrankung der marginalen Gingiva. Sie wird in erster Linie durch

Mikroorganismen verursacht, die auch unter physiologischen Bedingungen in der

Mundflora vorkommen. Wird dieses natürliche Gleichgewicht, zum Beispiel durch

mangelnde Mundhygiene, genetische Faktoren, wie z.B. den Interleukin-1

Polymorphismus (Stashenko et al., 1991; Pontes et al., 2004; Dirschnabel et al.,

2011; Trevilatto et al., 2011), Rauchen (Pihlstrom et al., 2005), systemische

Antibiotika oder hormonelle Veränderungen, wie zum Beispiel Schwangerschaft

(Giglio et al., 2009) gestört, kann es zu einem übermäßigen Wachstum der

Bakterien kommen. Diese Bakterien bilden einen Biofilm, der dem Zahn im Bereich

des Sulcus gingivalis in direktem Kontakt zur Gingiva anhaftet. Vertreter dieser

Bakterien, die physiologisch in der Mundhöhle vorkommen, aber auch eine

Zahnfleischentzündung bedingen können, sind zum Beispiel: Porphyromonas

gingivalis, Treponema denticola oder Tannerella forsythensis (Holt and Ebersole,

2005). Eine Gingivitis äußert sich durch Zahnfleischbluten unter geringen

Belastungen wie Kauen oder Zähneputzen. Dabei ist das entzündete Zahnfleisch

stets abnorm gerötet, ödematös verändert und durch einen Verlust der natürlichen

Stippelung auffällig. Wird dieser Zustand der Gingiva nicht therapiert, kann eine

Chronifizierung stattfinden. Die chronische Gingivitis verursacht zunächst keine

Schmerzen, kann aber in eine Parodontitis übergehen, die tiefer liegende Anteile

des Zahnhalteapparats betrifft und auch systemische Symptome, wie zum Beispiel

kardio-vaskuläre Erkrankungen (Desvarieux et al., 2005), rheumatoide Arthritis (de

Pablo et al., 2009), sowie Komplikationen in der Schwangerschaft (Xiong et al.,

2006) hervorrufen kann. Das Hauptunterscheidungsmerkmal der beiden

Entzündungsstadien stellt dabei der, bei der Parodontitis röntgenologisch

nachweisbare Knochenabbau dar (Di Benedetto et al., 2013). Sowohl bei der

Gingivitis, als auch bei der Parodontitis werden aus dem Biofilm bakterielle

Stoffwechsel- und Zerfallsprodukte freigesetzt, die Abwehrreaktionen des Körpers

auslösen (Johansson, 2011). In Folge dieser Immunantwort werden unter anderem

Enzyme gebildet, wie Interleukin-1 (Barksby et al., 2007), welche die Bakterien

zerstören sollen, jedoch auch die Zerstörung von Eigengewebe auslösen. Dies führt

letztendlich zum Verlust von Bindegewebe und Knochen. Es kommt klinisch

erkennbar zu Zahnfleischbluten, Zahnfleischrückgang und letztlich zur Lockerung

und dem Verlust sonst gesunder Zähne. Die Therapie von Parodontalerkrankungen

besteht hauptsächlich darin, den Entzündungszustand des Zahnfleisches und des

Einleitung

10

Zahnhalteapparats zu beseitigen und dabei Plaque und Zahnstein sowie andere

entzündungsfördernde Faktoren zu eliminieren. Auch die Therapie mit der

systemischen Gabe von Antibiotika kann indiziert sein (Arweiler et al., 2013).

2.4 Speichel

Speichel ist ein exokrines Sekret, das zu 99 % aus Wasser und einer Vielzahl von

Elektrolyten, Proteinen, Immunglobulinen, antimikrobiellen Peptiden und mucosalen

Glykoproteinen besteht (Edgar, 1992; Humphrey and Williamson, 2001; Berkovitz et

al., 2002; Ferraris MEG, 2006). Außerdem sind abgelöste Zellen des gingivalen

Epithels, frei bewegliche Bakterien und Komponenten des von Nasenhöhle und

Pharynx abgesonderten Sekrets enthalten (GN, 1978; Washington N, 2000;

Humphrey and Williamson, 2001; Edgar M, 2004). Speichel ist das Erzeugnis aller

im Mund-Rachenraum vorkommenden Speicheldrüsen, unterteilt in die großen

(Glandula parotidea, Glandula submandibularis, Glandula sublingualis) und die

kleinen (Glandulae labiales, Glandulae palatinae, Glandulae buccales und

Glandulae molares) Speicheldrüsen. Den Hauptteil der Speichelmenge bilden die

Glandulae parotideae und die Glandulae submandibulares. Durch die stetige

Speichelproduktion kann die Mundhöhle fortwährend feucht gehalten werden. Der

hohe Anteil an gelösten Mineralien ermöglicht eine Remineralisation des

Zahnschmelzes nach Mahlzeiten zum Schutz vor Karies. Des Weiteren sorgen

bereits Bestandteile des Speichels für die Einleitung der Verdauung von Nahrung in

der Mundhöhle. Eine bedeutende Rolle kommt dem Speichel bei der Bolusbildung

und dem Schluckvorgang zu. Die immunologische Funktion des Speichels nimmt

einen hohen Stellenwert in der primären Immunabwehr und der Verhütung bakteriell

oder viral ausgelöster systemischer oder lokalisierter Erkrankungen ein (Lee et al.,

2005).

In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl antimikrobieller Peptide im Speichel

entdeckt und untersucht, unter ihnen IgA, Lysozyme, Lactoferrin, Sialoperoxidase,

Proline-Rich-Proteine, Histamine und viele mehr (Dale and Fredericks, 2005; De

Almeida Pdel V, 2008). Aber nicht nur die Speicheldrüsen, wie bereits

wissenschaftlich belegt, produzieren und sezernieren diese Peptide, sondern auch

die unterschiedlichen Gewebe selbst. Das erste antimikrobielle Peptid, das in der

Mundhöhle identifiziert werden konnte, war das Lingual Antimicrobielle Peptid

(LAP). Es wurde in der Rinderzunge entdeckt (Schonwetter et al., 1995). Mittlerweile

konnten eine Vielzahl anderer Mitglieder der ß-Defensin-Familie des

Mundhöhlenepithels beschrieben werden (Bissell et al., 2004). Andere

repräsentative antimikrobielle Peptide, die vom Epithel der Mundhöhle exprimiert

Einleitung

11

werden, sind Cathelecidin LL-37, das neutrophile Alpha- Defensin HNP1-3 und

Adrenomedullin, welches anfänglich als Vasodilatator charakterisiert wurde (Frohm

Nilsson et al., 1999; Dale et al., 2001; Allaker and Kapas, 2003).

Auch Surfactant Proteine konnten im Speichel detektiert werden (Bräuer et al.,

2009), sie wurden bereits detailliert in Zusammenhang mit der Lunge beschrieben

(Crouch, 1998). Ihnen werden Funktionen, sowohl im unspezifischen, als auch im

spezifischen Immunsystem zugeordnet. SP-A und SP-D sind Vertreter des C-Typs

der Collectin-Familie, mit denen auch eine Vielzahl anderer Moleküle mit

immunologischer Funktion genannt werden müssen. Laut dem gängigen

Verständnis der Wirkungsweise der Collectine vom C-Typ binden exponierte

mikrobiologische Kohlenhydrate, die sich auf den Oberflächen diverser

Mikroorganismen befinden, an eine Kohlenhydratbindungsdomäne, welche ein

Bestandteil des Proteins ist. Auf diese Weise wird eine Verbesserung und

Beschleunigung der Abwehrreaktion gegen Mikroorganismen erreicht (van de

Wetering et al., 2004; Wright, 2005; Kishore et al., 2006).

2.5 Surfactant Proteine

Herkunft der Abbildung: siehe Abbildungsverzeichnis

Abb. 6: Schematische Darstellung der Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D.

Während die Surfactant Proteine SP-A und SP-D frei im Zytoplasma vorkommen, befinden

sich die Surfactant Proteine SP-B und SP-C im Bereich der Lipidschicht der Zellmembranen

oder Monolayer.

Einleitung

12

Surfactant (surface active agent), das erstmals in der Lunge entdeckt und

beschrieben wurde, besteht aus einem komplexen Gemisch von Lipiden (90 %),

Proteinen (8 %) und Kohlenhydraten (2 %) (Pattle, 1955). In der Lunge senkt

Surfactant die Oberflächenspannung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, wodurch

ein Kollabieren der Alveolen verhindert wird. Diese Definition hielt sich über 70

Jahre (Pattle, 1955; Clements, 1957). Durch neue Erkenntnisse konnte diese

grundlegende Definition erweitert werden. Erste weiterführende Untersuchungen

zeigten, dass das Surfactant Protein A dem Komplementfaktor C1q in seiner

Struktur ähnelt (Brodsky-Doyle et al., 1976). Diese Proteinfamilie, die heute als

Collectine bekannt ist, gewinnt als Bestandteil der unspezifischen Immunabwehr

zunehmend an Bedeutung. Zunächst wurden vier Surfactant Proteine beschrieben,

deren Nomenklatur alphabetisch von SP-A über SP-B und SP-C zu SP-D erfolgt. Im

Jahr 2012 konnten Rausch et al. ein weiteres Protein identifizieren, welches den

Surfactant Proteinen zugeschrieben werden muss. Hierbei handelt es sich um ein

aus 78 Aminosäuren zusammengesetztes Protein, welches als Surfactant Protein G

bezeichnet wird. Das amphiphile SP-G ähnelt den bereits bekannten Surfactant

Proteinen SP-B und SP-C (Rausch et al., 2012). Ein weiteres Surfactant Protein SP-

H wurde im Rahmen des Genomprojekts bereits im Jahr 2003 identifiziert, aber

nicht näher spezifiziert (Heilig et al., 2003). Aktuelle Untersuchungen von Schicht et

al. ermöglichten es, SP-H in Struktur und Funktion genauer zu charakterisieren

(Schicht et al., 2014). Einschließlich SP-G und SP-H sind nun sechs Surfactant

Proteine bekannt.

SP-B und SP-C stellen die Gruppe der hydrophoben Surfactant Proteine dar, im

Vergleich zu SP-A und SP-D besitzen sie ein geringes Molekulargewicht. Das

Molekulargewicht von SP-B konnte mittels nicht reduzierender Präparationen per

SDS-Page auf 15-18 kDa geschätzt werden. Reduzierende Bedingungen liefern ein

gut erkennbares Produkt bei etwa 7 kDa (Whitsett et al., 1986b; Yu et al., 1988).

SP-B, welches posttranslational aus einer „Pro-Form“ gebildet wird, ist außerdem in

der Lage, Oligomere unterschiedlicher Größenordnung über Disulfidbrücken zu

bilden (Whitsett et al., 1986b). SP-C mit 33-35 Aminosäuren ist eines der

hydrophobsten Proteine überhaupt, das Molekulargewicht beträgt 4-6 kDa

(Possmayer, 1988; Hawgood and Shiffer, 1991). Sein primäres Translationsprodukt

besteht hingegen aus 191 Aminosäuren. Auch SP-C unterliegt, wie auch SP-B,

einer hochgradigen posttranslationalen Modifizierung, wie beispielsweise der

Veresterung mit Fettsäuren, Glycosylierung oder Acylisierung (Jacobs et al., 1987;

Glasser et al., 1988a; Voorhout et al., 1992). SP-B und SP-C sind maßgeblich für

die Stabilität und Ausbildung oberflächenaktiver Schichten (Grenzflächen)

Einleitung

13

verantwortlich und werden bei der Adsorption von Phospholipiden an Luft-

Flüssigkeits-Grenzflächen benötigt (Yu and Possmayer, 1990). Auf Grund ihrer

hydrophoben Eigenschaften sind SP-B und SP-C beim „Akuten Respiratorischen

Distress Syndrom“ (ARDS) von großer pathologischer Relevanz, da diverse

Plasmaproteine die Formation des pulmonalen Surfactants inhibieren und dadurch

die alveoläre Oberflächenspannung erhöhen (Spragg RG, 1992). Es wird

beschrieben, dass die Deletion von SP-B in neugeborenen Kaninchen zu einer

ernsthaften Störung und Beschädigung der alveolären Oberfläche führt und somit

respiratorischen Stress bei den Kaninchen auslöst (Kobayashi et al., 1991). Auch

SP-C hat direkten Einfluss auf biologische Grenzflächen. Es verringert die

Oberflächenspannung und erhöht die Fähigkeit zur Adsorption der Surfactant

Proteine. Hierbei fungiert es wie ein Anker zwischen der Phospholipidschicht und

der wässrigen Phase an biologischen Grenzflächen. SP-B kann noch eine weitere

Eigenschaft zugeschrieben werden. Ähnlich wie die Surfactant Proteine SP-A und

SP-D spielt auch SP-B eine Rolle bei der Immunabwehr von Pathogenen. Die noch

nicht posttranslational modifizierte „Pro-Form“ von SP-B zählt zu der „Saposine-like“

Proteinfamilie (Patthy, 1991). Saposine haben bisher noch nicht vollständig

verstandene zelluläre Funktionen (Bruhn, 2005). Die N-Domäne des Surfactant

Protein B ähnelt den porenbildenden Proteinen (Amoebapores). Diese gehören zu

einer Untergruppe der Saposin-Peptide und besitzen zytologische und

antimikrobielle Eigenschaften (Leippe et al., 1991; Bruhn, 2005). Publikationen von

Yang et al. belegen die immunologische Funktion von SP-B. Es konnte

nachgewiesen werden, dass SP-B bei der Aktivierung von Alveolarmakrophagen in

der Lunge beteiligt ist (Yang et al., 2010). Neben anti-inflammatorischen

Eigenschaften (Ikegami et al., 2005) konnten auch bakterizide (Staphylococcus

aureus, Klebsiella pneumonie) und bakteriostatische (Pseudomonas aeruginosa)

Effekte beschrieben werden (Yang et al., 2010). Eine besondere Affinität von SP-B

gegen gramnegative Bakterien konnte Griese 1999 belegen (Griese, 1999).

SP-A und SP-D, die sich in Aufbau, Eigenschaften und Wirkungsweise ähneln, sind

glykolysierte, multimere, wasserlösliche Proteine. Sie gehören zu den Collectinen,

einer Untergruppe der C-Typ Lektine. Collectine sind Oligomere und setzen sich aus

verschiedenen Untereinheiten zusammen. Jede dieser als Monomer bezeichneten

Untereinheiten besteht N-terminal aus einer kurzen glycinreichen Disulfid-Domäne.

Ihr folgt eine lange kollagenähnliche Region (collagen-like domain), dann eine

spiralförmig gedrehte Hals-Region (neck region) und eine

Kohlenhydratbindungsregion (carbohydrate-recognition-domain, CRD) (Hoppe and

Reid, 1994a). Die Collectine unterscheiden sich durch den Grad ihrer

Einleitung

14

Multimerisierung. Das Octadecamer SP-A setzt sich aus sechs trimeren

Untereinheiten zusammen. Diese bestehen jeweils aus 26-35 kDa großen

Monomeren (Voss et al., 1991). SP-D, das aus zwölf Untereinheiten besteht, ist in

vier Trimere unterteilt. Jedes dieser Monomere besitzt eine Molekülmasse von je 43

kDa pro Monomer.

SP-A und SP-D werden in der Lunge hauptsächlich von Typ-2-Pneumocyten

gebildet, aber auch Clarazellen und Drüsenzellen der Trachea sind an der Bildung

von Surfactant beteiligt (Walker et al., 1986; Voorhout et al., 1991; Crouch, 1998).

Wie bereits durch zahlreiche Studien belegt wurde, spielen SP-A und SP-D eine

große Rolle im Rahmen der angeborenen direkten Immunabwehr (Hoppe and Reid,

1994b). Eine besondere Bedeutung kommt hierbei der Kohlenhydratbindungsregion

zu. Sie kann an Kohlenhydratliganden auf der Zelloberfläche von Pathogenen

binden. So werden Krankheitserreger schnell und effizient agglutiniert oder den

Immunzellen (Makrophagen, Granulozyten, dendritische Zellen) zur Phagozytose

präsentiert. Auf diese Art wird bei vielen Erregern die Phagozytoseaktivität

gesteigert. In aktuellen Studien wurde gezeigt, dass SP-A und SP-D auch einen

unmittelbaren antimikrobiellen Einfluss auf Pilze und Bakterien haben (McCormack

et al., 2003; Wu et al., 2003; Schaeffer et al., 2004). Auch die direkte Aktivierung

von Makrophagen über spezifische membranständige Rezeptoren konnte

nachgewiesen werden (Tenner et al., 1989). In-vivo-Untersuchungen, die an SP-A

und SP-D Knockout-Mäusen durchgeführt wurden, zeigten, dass SP-A Knockout-

Mäuse keine Veränderungen bezüglich Atemfunktion, Lungencompliance oder

Surfactantmetabolismus aufweisen, bis sie einem Pathogen oder Stimulus

ausgesetzt werden (Korfhagen et al., 1996). So kam es zu ausgeprägten

Lungenentzündungen der Mäuse, verbunden mit starkem Bakterienwachstum,

besonders Streptokokken der Serogruppe B. Auch eine Dissemination der Bakterien

in die Milz konnte festgestellt werden. Darüber hinaus war die Clearence von S.

aureus und P. aeruginosa stark gestört (LeVine et al., 1997; LeVine et al., 1998).

Nach der Gabe von gereinigtem SP-A normalisierte sich die Abwehrlage.

Bei SP-D-defizienten Mäusen fiel gleich nach der Geburt ein veränderter Phänotyp

auf. Es war eine progressive Lipidakkumulation, die alveoläre Lipidose, in den

Atemwegen festzustellen. Sie ging mit einer vermehrten Aktivierung von

Makrophagen und Metalloproteinasen einher (Wert et al., 2000). Im Verlauf des

Lebens entwickelten sie progressive pulmonale Emphyseme, sowie subpleurale

Fibrosen in Verbindung mit chronischen Entzündungen (Wert et al., 2000). Sie

zeigten außerdem eine erhöhte Anfälligkeit für Influenza-A-Viren (LeVine et al.,

2001). Da dieses Geschehen sehr komplex ist, ist die Funktion von SP-D schwer zu

Einleitung

15

beurteilen. Im Allgemeinen kann man sagen, dass die Knockout-Mäuse gegenüber

ihrem Wildtyp eine gesteigerte Affinität zu bakteriellen und viralen Infektionen

haben.

Eine der ersten Studien, die demonstrierte, dass Surfactant Einfluss auf die

immunologische Funktion hat, ist die, in der seine positive Wirkung auf die

Elimination von S. aureus durch Alveolarmakrophagen betrachtet wurde (LaForce et

al., 1973). Inzwischen zeigt eine Vielzahl von Publikationen, dass SP-A und SP-D

an der Abwehrfunktion und Interaktion mit Pathogenen maßgeblich beteiligt sind.

Dabei binden sie unter anderem an gramnegative Bakterien wie Escherichia coli,

Pseudomonas aeroginosa, Klebsiella pneumoniae (Ting et al., 2013), und

grampositive Bakterien wie Streptococcus pneumoniae und Staphylococcus aureus

(Rennie et al., 2012).

Die Anwesenheit von SP-A und SP-D ließ sich zum Zeitpunkt immunologischer

Funktion in verschiedensten Geweben auch außerhalb der Lunge nachweisen,

darunter Nasenschleimhaut (Kim et al., 2007), Haut (Risdale RA, 2001; Mo et al.,

2007), Plazenta (Sati et al., 2010), Tuba auditiva (Paananen et al., 2001b; Risdale

RA, 2001), und Speicheldrüsen (Bräuer et al., 2009).

Im Gegensatz zu den collectin-ähnlichen Surfactant Proteinen SP-A und SP-D,

scheinen die hydrophoben Surfactant Proteine SP-B und SP-C essentielle

Bestandteile bei der Bildung oberflächenaktiver Monolayer zu sein. Sie sind auch für

die Stabilität an Gas- Wasser- Grenzflächen verantwortlich (Curstedt et al., 1987;

Notter et al., 1987; Yu and Possmayer, 1990). Außerhalb der Lunge wurden auch

SP-B und SP-C bereits in unterschiedlichen Geweben nachgewiesen (Bekman et

al., 1986; Bräuer et al., 2007a; Bräuer et al., 2009). Die Reduzierung der

Oberflächenspannung, rheologische Funktionen und ihre Beteiligung an der

Pellicelbildung (Siqueira et al., 2012), (Bildung des tertiären Schmelzoberhäutchens

auf der in die Mundhöhle ragenden Zahnhartsubstanz), welche durch die Surfactant

Proteine erleichtert werden, haben eine große Auswirkung auf die physiologische

Funktion des Mundhöhlenepithels und die Gingiva. Bis heute gibt es keinen Beweis

dafür, dass SP-A, SP-B, SP-C, SP-D in gesunder oder pathologisch veränderter

Gingiva vorhanden sind. Anhand dieser Studie wird beabsichtigt, erstmals das

Vorkommen der vier Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D in ihrer

immunologischen Funktion und als oberflächenaktive Bestandteile der Gingiva und

des Mundhöhlenepithels zu beschreiben. Außerdem soll ein Vergleich der Menge

der exprimierten Proteine im Speichel von gesunden und im Speichel von an

Parodontitis erkrankten Personen durchgeführt werden.

Material und Methodik

16

3 Material und Methodik

3.1 Eingesetzte Materialien und Chemikalien

3.1.1 Chemikalien, Kits und Enzyme

10 mM dNTP´s Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

10x PCR Reaktionsmix (-MgCl2) Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

50 mM (MgCl2) Magnesiumchlorid Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

5x Reaktionspuffer Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

Acrylamid Solution 30 % Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz

Agarose Biozym, Oldendorf, Deutschland

APS (Ammoniumpersulfat) Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Aquatex Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Avidin/Biotin Blocking Kit DAKO Diagnostika GmbH, Hamburg,

Deutschland

Blocking Solution DAKO Diagnostika GmbH, Hamburg,

Deutschland

Bradford-Reagenz Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Bromphenol-Blau Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Butanol Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

Diethyldicarbonat (DEPC) -Wasser Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Taufkirchen, Deutschland

Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

EDTA pH 8,0 Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

ELISA- Kits:

SP-A: E90890Hu 96 Tests Uscn Life Science Inc, Wuhan, China

SP-B: E91622Hu 96 Tests Uscn Life Science Inc, Wuhan, China

SP-C: E91623Hu 96 Tests Uscn Life Science Inc, Wuhan, China

SP-D: E91039Hu 96 Tests Uscn Life Science Inc, Wuhan, China

Entwickler-6 Fixierlösung Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


Ethanol (99,8 %) Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland


17

Ethidiumbromid-Tetrahydrochlorid Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

H2O2 (Wasserstoffperoxid) Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

Hämalaun Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

Membran Whatman GmbH, Dassel, Deutschland

Milchpulver (Sucofin) TSI Trade Service Int., Zeven,

Deutschland

Oligo (dT)18 Primer Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

Paraformaldehyd Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Paraplast Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

PBS (Phosphatgepufferte Salzlösung) Biochrom, Berlin, Deutschland

Phosphataseinhibitor Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


Ponceau S Serva Feinbiochemica, Heidelberg,

Deutschland

Proteaseninhibitor Mix Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


RevertAid™ H - Reverse Transcriptase Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

Rnase-Free Water Promega, Mannheim, Deutschland

RNeasy Mini Kit QIAGEN, Hilden, Deutschland

SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

ß-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich Chemie GmbH,


Strept AB Complex/HRP DAKO Diagnostika GmbH, Hamburg,

Deutschland

Taq DNA Polymerase (5 U / µl) Kit Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

TEMED (N,N,N,N-Tetramethyethylenamin) Bio-RAD Laboratories GmbH, München,

Deutschland

Transcriptase Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

Tris Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

Tween 20 Serva Feinbiochemie, Heidelberg,

Deutschland


18

Vectastain ABC-Kit Linaris, Wertheim, Deutschland

Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg,

Deutschland

Xylol Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

3.1.2 Gebrauchslösungen

Citrat-Puffer: Stammlösung A: 0,1 M Zitronensäue

Stammlösung B: 0,1 M Natriumcitrat

Gebrauchslösung: 4,5 ml Stammlösung A

20,5 ml Stammlösung B

ad 225 ml Sera dest

Reducing Sample Buffer (RSB): 2 ml Glycin; 4 ml 10 % SDS; 2,5 ml

Solution 3; 1 ml Mercaptoethanol

Strept AB Compl. /HRP:

Reagenz A: Strepavidin aus Streptomyces in

0,01 mol / l Phosphatpuffer (pH 7,2)

Reagenz B: biotinylierte Meerrettichperoxidase in

0,01 mol / l Phosphatpuffer (pH 7,2)

TBE-Puffer: Stammlösung: Tris Base 108 g; Borsäure 55 g; 0,5 ml

EDTA pH 8,0 ad 1000 ml Aqua dest.

Gebrauchslösung: 100 ml TBE-Puffer Stammlösung

ad 900 ml Aqua dest.

TBS-Puffer: Stammlösung: 6,1 g TRIS in 50 ml Sera dest

ad 37 ml einer 1 M HCl-Lösung

Sera dest ad 1 l (pH 7,6)

Gebrauchslösung: 100 ml TBS Stammlösung

ad 900 ml 0,85 %ige NaCl-Lösung

(pH 7,3)

TBS/TBST: 8 g NaCl; 0,2 g KCl; 3 g Tris;

deionisiertes Wasser ad 1 l (pH 7,4)

für TBST ad 1 ml Tween

Transferpuffer: 0,84 g NaHCO3; 0,318 g Na2CO3

ad 800 ml deionisiertes Wasser (pH 9,6)

ad 200 ml Methanol (pH ca. 10,4)


19

3.1.3 Gebrauchswaren und Geräte

Bechergläser Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

Einweg-Pasteurpipetten Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

Elektrophorese-Apparatur Hoefer SemiPhor, Pharmacia Biotech,

San Francisco, USA

Elektrophorese-Kammer Biostep GmbH, Jahnsdorf, Deutschland

Gelkassetten Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

Gelschlitten Biostep GmbH, Jahnsdorf, Deutschland

Grundschlittenmikrotom Histoslide 2000 Leica Instruments GmbH, Nussloch,

Deutschland

Herolab E.A.S.Y. 429K Photo-Dokuanlage Herolab GmbH Laborgeräte, Wiesloch,

Deutschland

HistoBond-Adhesion-Micro-Slide Marienfeld, Lauda Königshofen,

Deutschland

Keyence BioRevo BZ9000 Mikroskop Keyence, Neu-Isenburg, Deutschland

Lichtmikroskop Axio Lab.A1 Carl Zeiss GmbH, Jena, Deutschland

Magnetrührer MLW Rührgerätewerk, Medingen,

Deutschland

Microplate Reader (V-Max Kinetik) MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland

Nitrocellulose Membran Milan, Genf, Schweiz

PCR Softlubes Biozym, Oldendorf, Deutschland

PCR Geräte PTC – 200 Peltier Thermal Cycler

pH-Meter- Digital pH-Meter pH 525 Wissenschaftlich-Technische

Werkstätten GmbH, Weilheim,

Deutschland

Pipetten: 0,5-10 µl; 50-200 µl; 200-1000 µl Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Pipettenspitzen: blau, gelb, kristall Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

Präzisionswaage Typ 870-13 G. Kern & Sohn, Albstadt, Deutschland

PTC-200 DNA Engine Cycler BIO RAD Laboratoriers GmbH,

München, Deutschland

Reaktionsgefäße Carl Roth GmbH&Co.KG, Karlsruhe,

Deutschland

Spektrometer Ultrospec 3300pro Amersham Biosciences, New York, USA

Speed Mill Plus Analytic Jena AG, Jena, Deutschland


20

Thermocycler PTC-200 BIO RAD Laboratoriers GmbH,

München, Deutschland

UV-Transilluminator Darkhood DH-50 Biostep GmbH,

Jahnsdorf, Deutschland

Vortex Genie 2 Scientific Industries, New York, USA

Wärmeschrank Typ 2735 Köttermann, Hänigsen, Deutschland

Zentrifuge, Biofuge Fresco Heraeus, Buckinghamshire, England

Zentrifugenröhrchen Greiner Bio-One, Solingen, Deutschland

3.1.4 Molekulargewichtsstandards

DNA-Längenstandards: Mass RulerTM DNA Ladder, mix ready to use (1-10 kbp)

Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Deutschland

Mass RulerTM DNA Ladder, Low Range (80-1031 bp), Fermentas GmbH, St. Leon-

Rot, Deutschland

Protein-Längenstandards: Page RulerTM Prestained Protein Ladder (11-170 kDa),

Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Deutschland


21

3.2 Art und Herkunft der verwendeten Gewebe- und Speichelproben

Für die immunhistochemischen und molekularbiologischen Untersuchungen wurden

Gewebeproben von gesunden und an Gingivitis erkrankten Patienten entnommen.

Es handelte sich um zehn weibliche und neun männliche Patienten aus der

Poliklinik für Kieferorthopädie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn

im Alter zwischen 21 und 69 Jahren. Die Proben wurden von PD. Dr. Heinemann

und Prof. Dr. Götz zur Verfügung gestellt. Die Hälfte der Proben wurde direkt nach

der Biopsie in einer 4 %igen Paraformaldehydlösung gelagert und später für die

immunhistochemischen Untersuchungen in Paraffin eingebettet. Die andere Hälfte

diente der molekularbiologischen Untersuchung und wurde unverzüglich auf -80°C

herabgekühlt und gelagert. Die Speichelproben, die für die ELISA und Western Blot

Analyse verwendet wurden, wurden 80 Patienten, 51 weiblichen und 29 männlichen

im Alter zwischen 23 und 76 Jahren in der Zahnklinik 1 der Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen- Nürnberg entnommen. Die Proben wurden in zwei Kohorten

unterteilt. Eine Kohorte, die 40 Proben beinhaltete, stammte von gesunden

Probanden, die zweite Kohorte mit ebenso 40 Proben war Patienten entnommen

worden, die unter einer Entzündung des Zahnfleisches litten. Für die

Unterscheidung zwischen gesunder oder erkrankter Kohorte wurde der PSI

(Periodontal Screening Index) herangezogen (Ziebolz et al., 2011). Dabei wurden

Patienten mit einem PSI von null der gesunden, Patienten mit einem PSI von zwei

bis vier der erkrankten Kohorte zugeordnet.

Die Entnahme des Speichels wurde mit Hilfe einer Einmalpipette durchgeführt,

durch die ca. 1 ml Speichel aus dem Sublingualbereich der Patienten aufgenommen

wurde. Die Speichelproben wurden direkt nach der Entnahme eingefroren und bis

zu ihrer Verwendung bei -80°C aufbewahrt. Zur genauen Beurteilung der jeweiligen

Mundsituation wurde von allen Patienten ein Fragebogen beantwortet und ein

vollständiger zahnärztlicher Befund aufgenommen. Der Fragebogen ist im Anhang

der Arbeit einzusehen. Ein gültiges Ethik-Votum ist vorhanden.

3.3 RNA- Isolierung aus Gewebe

Zur Isolierung der RNA wurde Gewebe verwendet, das durch Biopsien der Gingiva

von fünf unterschiedlichen Patienten gewonnen wurde. Die bei -80°C gelagerten

Gewebeproben wurden für den Gewebeaufschluss mit einem Mörser und Pistill

direkt in flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver zermahlen.

Für die Aufarbeitung wurde ein RNeasy Mini Kit der Firma QIAGEN verwendet. Die

Wirkungsweise des Kits und dessen Spezifität beruhen darauf, dass in Anwesenheit

eines chaotrophen Salzes Nukleinsäuren spezifisch an Glasfaser- oder


22

Silicaoberflächen gebunden werden. Diese Bindungsreaktion wird durch die

Zerstörung der geordneten Struktur der Wassermoleküle und ihrer Wechselwirkung

mit den gelösten Nukleinsäuren verursacht. Im Anschluss an die Isolation aus dem

Gewebe erfolgte ein DNase-Verdau, um Reste von genomischer DNA abzubauen.

Nach mehreren Waschschritten wurde die RNA in Rnase-freiem Wasser (DEPC-

Wasser) aus der Säule eluiert. Das Gewebepulver wurde in ein RNase-freies, mit

Flüssigstickstoff gekühltes 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und mit 600 µl

stark denaturierendem Guanidinum-Isothiocyanat-haltigem Lysepuffer und 6 µl

14,3 M ß-Mercaptoethanol versetzt, um RNasen zu inaktivieren. Diese kommen in

allen Geweben vor und können innerhalb weniger Minuten große Mengen RNA

degradieren (Bekman et al., 1986). Die Gewebeproben wurden mit einem Rotor-

Stator-Homogenisator weiter aufgeschlossen und dabei zugleich in Lysepuffer

homogenisiert. Das Homogenat wurde anschließend für 5 Minuten bei 1200 U / min

und 4°C zentrifugiert um unlösliche Bestandteile abzuscheiden. Der Überstand

wurde in ein 1,5 ml Tube überführt und mit 70 %igem Ethanol auf das doppelte

Volumen aufgefüllt. Das Gemisch wurde in ein Mikroreaktionsgefäß mit einer

Silikagelmembran gegeben und anschließend bei 10000 U / min für 15 Sekunden

zentrifugiert. In den folgenden Schritten wurde die RNA mit zwei verschiedenen

Puffern von Verunreinigungen freigewaschen. Hierzu wurden zunächst 350 µl RW1-

Puffer auf die Silikagelmembran gegeben und für 15 Sekunden bei 10000 U / min

zentrifugiert. Der Puffer wurde verworfen. Es folgte der DNase-Verdau, für den

jeweils 10 µl DNase 1 und 70 µl DNase-Puffer eingesetzt wurden. Der Ansatz wurde

15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und erneut mit 350 µl RW1-Puffer für 15

Sekunden bei 10000 U / min zentrifugiert. Anschließend wurden in zwei sich

wiederholenden Schritten jeweils 500 µl RPE-Puffer auf die Membran pipettiert, erst

nach 15 Sekunden, dann nach 2 Minuten bei 10000 U / min zentrifugiert.

Abschließend wurde die an die Silikagelmembran gebundene RNA mit 2x30 µl

Rnase-freiem Wasser in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß eluiert. Bei -80°C kann die RNA

für mehrere Wochen gelagert werden.

3.4 Photometrische Konzentrationsbestimmung

Die Konzentration der RNA im Eluat konnte durch Messung der optischen Dichte bei

260 nm (OD260) in einem Spektrophotometer bestimmt werden. Aufgrund der

Spektralcharakteristika ihrer Basen, die ein Absorptionsmaximum bei 260 nm

zeigen, absorbieren Nukleinsäuren Licht zwischen einer Wellenlänge von 250-

270 nm. Bei Verdünnung der RNA in Wasser entspricht eine OD260 von eins einer

Konzentration von 42,1 µg / ml Gesamt-RNA (Sambrook and Gething, 1989). Durch


23

folgende Gleichung lässt sich die RNA-Konzentration der eingesetzten Proben

errechnen:

RNA-Konzentration (µg / ml) = OD260 x 42,1 x Verdünnungsfaktor

Vor der Messung wurde das RNA-Eluat mit DEPC-Wasser 1:100 verdünnt und das

Spektrophotometer mit 100 µl DEPC-Wasser auf null geeicht. Der Quotient

OD260 / OD280 erlaubte einen Rückschluss auf die Reinheit der isolierten RNA

hinsichtlich möglicher Kontamination durch UV-absorbierende Stoffe, wie zum

Beispiel Proteine. Für sehr reine RNA gilt:

OD260 / OD280 = 1,9 – 2,1

Die Qualität der isolierten Gesamt-RNA konnte anhand einer Agarosegel-

Elektrophorese nachvollzogen werden, bei der die Banden der 28S und 18S

ribosomalen RNA (rRNA) nach erfolgter Ethidiumbromid-Inkubation bei 5,0 und 1,9

Kilobasen (kb) begutachtet werden konnten.

3.5 Reverse Transkription

Der reversen Transkription (Kogan et al., 1987) liegt eine Umschreibung von RNA in

komplementäre DNA (cDNA) mit anschließender PCR zugrunde. Die mRNA liegt in

den Zellen in nur sehr geringer Zahl vor. Eine Möglichkeit, bestimmte Sequenzen in

dem RNA-Gemisch nachzuweisen, ist die selektive Amplifikation dieser Sequenzen.

Für die Durchführung wurden 2 µg RNA aus dem DNase Verdau eingesetzt und der

RevertAid™ H Minus-Reverse-Transkriptase nach folgendem Standardprotokoll

verwendet (Tab. 1):

Tab. 1: Standardprotokoll Reverse Transkription lt. Protokoll des Instituts für Anatomie

Lehrstuhl II der FAU-Erlangen

Substanz Volumen

2 µl total RNA *1 x µl (max. 12 µl)

Oligo (dT)18 Primer (0,5 µg / 100 pmol) 2,5 µl

DEPC-Wasser auf 13 µl auffüllen

*1 Berechnung: 2 µg / RNA-Konzentration in µg / µl


24

Der Reaktionsansatz wurde 5 Minuten bei 65°C inkubiert, um die RNA zu

denaturieren. Im Anschluss daran wurden die Reaktionsgefäße für eine Minute auf

Eis abgekühlt. Danach wurde der Mastermix (Tab. 2) zu jedem Ansatz

hinzugegeben.

Tab. 2: Zusammensetzung Mastermix lt. Protokoll des Instituts für Anatomie Lehrstuhl II der

FAU-Erlangen

Substanz Volumen

5x Reaktionspuffer 4 µl

dNTP Mix (10 mM) 2 µl

RNase Inhibitor (20 U / µl)*2 0,5 µl

RevertAid H Minus reverse Transkriptase (200 U / µl) 1 µl

Der Ansatz wurde für eine Stunde bei 42°C inkubiert. Die Inaktivierung der RT durch

Hitze erfolgte für 10 Minuten bei 70°C.

3.6 Polymerase-Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction = PCR) erlaubt es, in

vitro eine Vermehrung einer spezifischen DNA-Sequenz zu produzieren (Saiki et al.,

1985). Dazu nutzt man bestimmte Eigenschaften der DNA-Replikation. Eine DNA-

Polymerase erzeugt aus dNTPs (Desoxynukleosidtriphosphate) Kopien von Teilen

der vorgelegten cDNA. Die von der Polymerase als Matrize benötigte Einzelstrang-

DNA erzeugt man durch Erhitzen doppelsträngiger DNA fast bis zum Siedepunkt.

Für den Start der DNA-Synthese braucht die Polymerase ein kurzes Stück

doppelsträngige DNA. Durch Zugabe eines Paares verschiedener

Oligonukleotidprimer, die sich komplementär an beiden Enden der gesuchten

Sequenz anlagern, können Start- und Endpunkt der DNA-Synthese festgelegt

werden. So erhält man als Produkt einen speziellen, von den Bindungsstellen der

Primer flankierten DNA-Strang. Jeder der so neusynthetisierten Stränge enthält

wiederum Primer-Bindungsstellen und kann bei einer erneuten Polymerisation, wie

der Altstrang, als Matrize dienen. Durch mehrfache Wiederholung eines

Temperaturzyklus in einem Thermocycler werden die Reaktionsschritte (1)

Trennung der Doppelstränge (Denaturierung, 96°C), (2) Anlagerung der Primer

(Annealing, 50-60°C) und (3) Elongation (72°C) so oft durchlaufen, bis das

gewünschte Fragment in ausreichender Kopienzahl vorliegt. Die Anzahl der

Reaktionszyklen wird üblicherweise zwischen 25 und 40 gewählt, je nach Menge

der Ausgangs-cDNA. Ein Erhöhen der Zykluszahl ergibt nicht notwendigerweise


25

eine größere Menge an PCR Produkt, sondern kann zur Bildung von unspezifischen

Produkten führen. In der vorliegenden Arbeit wurden je 2 µg cDNA mit folgendem

Reaktionsansatz inkubiert (Tab. 3):

Tab. 3: Reaktionsansatz PCR lt. Protokoll des Instituts für Anatomie Lehrstuhl II der FAU-

Erlangen

Substanz Volumen

10x PCR Reaktionsmix (ohne MgCl2) 2 µl

MgCl2 (50 mM) 1 µl

dNTP-Mix (10 mM) 0,5 µl

Primer-Mix (100 pmol) 0,5 µl

Taq-Polymerase (5 U / µl) 0,2 µl

Rnase-freies Wasser 13,7 µl

cDNA 2 µl

Gesamtvolumen 19,9 µl

Es wurde ein PCR-Programm mit 35 Reaktionszyklen angewendet, die einzelnen

Reaktionsschritte wurden wie folgt festgelegt (Tab. 4):

Tab. 4: Reaktionsschritte PCR lt. Protokoll des Instituts für Anatomie Lehrstuhl II der FAU-

Erlangen

Schritt Temperatur Zeit

1 Vordenaturierung 96°C 5 min

2 Denaturierung 96°C 60 sec

3 Annealing 50-60°C 60 sec

4 Elongation 72°C 60 sec

35 Zyklen Schritt 2 – 4

5 Elongation 72°C 5 min

Als Negativkontrolle wurde die cDNA im Reaktionsansatz durch Wasser ersetzt. Die

PCR-Produkte wurden durch die Agarosegel- Elektrophorese identifiziert.


26

Für die PCR wurden folgende Primer verwendet (Tab. 5):

Tab. 5: Primer PCR lt. Protokoll des Instituts für Anatomie Lehrstuhl II der FAU-Erlangen

Primer Gewicht Sequenz Temperatur

SP-A 212 bp sense 5’-GAT GGG CAG TGG AAT GAC AGG-3’ 57°C

antisense 5’-GGG AAT GAA GTG GCT AAG GGT G-3’

SP-B 275 bp sense 5’-CAA ACG GCA TCT GTA TGC AC-3’ 52°C

antisense 5’-CGG AGA GAT CCT TGT TG-3’

SP-C 110 bp sense 5’-TCA TCG TCG TGG TGA TGG TG-3’ 55,8°C

antisense 5’- ATG GAG AAG GTG GCA GTG GTA A-3’

SP-D 199 bp sense 5’-ATG TTG CCT CTC TGA GG-3’ 57°C

antisense 5’-TCA GAA CTC GCA GAC CAC AAG-3’

3.7 Agarosegel-Elektrophorese

Im Anschluss an die RT-PCR wurde die amplifizierte DNA elektrophoretisch

aufgetrennt. Nukleinsäuren haben aufgrund der negativen Nettoladung ihrer

Phosphatgruppen die Fähigkeit, in einem elektrischen Feld zur Anode zu wandern.

Die Wanderungsgeschwindigkeit durch die Maschenstruktur des Agarosegels ist

von der Größe und Form der Nukleinsäuren abhängig. Zur Durchführung wurde ein

2 %iges Agarosegel verwendet. 2 g Agarose wurden in 100 ml 1xTBE-Puffer durch

Erhitzen in der Mikrowelle vollständig gelöst und mit Ethidiumbromid versetzt. Das

Gel wurde in eine Elektrophorese-Kammer gegeben und Elektrophorese-Puffer (1x

TBE-Puffer) zugegeben, bis das Gel knapp bedeckt war. Die PCR-

Amplifikationsprodukte wurden mit einem Gemisch aus 3 µl Ladepuffer versetzt und

in die jeweiligen Geltaschen mit den Proben beladen. Für die spätere Analyse der

Banden wurde ein DNA-Marker (100 bp DNA Ladder) mitgeführt. Anschließend

wurde eine Spannung von 80 bis 120 Volt bei 180 mA angelegt. Der im Ladepuffer

enthaltene niedermolekulare Farbstoff Bromphenol-Blau diente als Farbmarker, um

den Verlauf der Elektrophorese beurteilen zu können. Die voneinander getrennten

DNA-Fragmente wurden durch Fluoreszenz bei 366 nm auf einem UV-

Transilluminator im Gel sichtbar gemacht und mit Hilfe der Herolab E.A.S.Y. 429K

Foto-Dokumentationsanlage digital abgespeichert und ausgedruckt.


27

3.8 Proteinisolierung aus Gewebe

Die Gewebeproben wurden für den Gewebeaufschluss mit einer Speedmill der

Firma Analytic Jena aufbereitet. Dazu wurden die Proben mit Tritonpuffer in PBS

(1 %), Phosphataseinhibitor und Proteaseinhibitor versetzt und dreimal für die Dauer

von einer Minute zerkleinert. Das Gewebepulver wurde bis zur 200 µl Markierung

eines 2 ml Eppendorf-Tube gefüllt, mit 300 µl Ripa-Puffer versetzt und mit einem

Rotor Stator-Homogenisator aufgeschlossen und dabei zugleich in dem Lysepuffer

homogenisiert. Anschließend wurde Phosphataseinhibitor (1 ml / 100 ml) und

Proteaseninhibitor (2 µl / 1 ml) hinzugefügt. Dieses Gemisch wurde 30 Minuten auf

Eis inkubiert und im Anschluss daran für 30 Minuten mit 13000 U / min bei 4°C

zentrifugiert. Die im Überstand gewonnenen Proteine wurden in ein 1,5 ml

Eppendorf-Tube überführt und die Proteinkonzentration mit Hilfe der Bradfort-

Methode (siehe 3.9) gemessen.

3.9 Proteinkonzentration

Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte nach Bradford (1979). Für die

Messung wurden 800 µl destilliertes Wasser und 200 µl Bradford-Reagenz sowie

1 µl der Probe herangezogen. Als Leerwert wurde ein Ansatz ohne Protein

vorbereitet. Die Messung erfolgte in einer Einmalküvette. Die isolierten und

gemessenen Proteine wurden anschließend bei –80°C gelagert.

3.10 SDS-Gelelektrophorese und Western Blot Analyse

Zur Analyse von Proteingemischen wurden die Proteine nach der Lämmli-Methode

unter denaturierenden Bedingungen in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

entsprechend ihres Molekulargewichts aufgetrennt.

Das SDS-Polyacrylamidgel setzte sich aus einem Sammel- und einem Trenngel

zusammen, deren Konzentration entsprechend der zu erwartenden Proteingröße

variiert werden kann. In den vorliegenden Versuchen wurden Gele mit einer

Acrylamid-Konzentration von 12 % für SP-A und SP-D und 15 % für SP-B und SP-C

verwendet. Die Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels der SDS-

Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigt folgende Tabelle (Tab. 6):


28

Tab. 6: Zusammensetzung Trenn- und Sammelgel lt. Protokoll des Instituts für Anatomie

Lehrstuhl II der FAU-Erlangen

Bestandteil 12 % Trenngel 15 % Trenngel 5 % Sammelgel

Destilliertes Wasser 3,3 ml 2,3 ml 3,4 ml

Acrylamid (30 %) 4 ml 5 ml 0,83 ml

Tris (1,5 M, pH 8,8) 2,5 ml 2,5 ml

Tris (1 M, pH 6,8) 0,63 ml

SDS (10 %) 100 µl 100 µl 50 µl

APS (10 %) 100 µl 100 µl 50 µl

TEMED 10 µl 10 µl 5 µl

Zu Beginn wurde das 12- bzw.15 %ige Trenngel in eine Gelkammer gegossen und

mit gesättigtem Ethanol bedeckt, um während der Herstellung des Sammelgels vor

Austrocknung geschützt zu sein. Nach vollständiger Polymerisation des Trenngels

wurde das Ethanol entfernt und das Sammelgel aufgegossen, in das zur Ausbildung

von Probentaschen ein Kamm eingesetzt wurde. Im Anschluss an die

Polymerisation des Sammelgels wurde das fertige Gel in die Elektrophorese-

Kammer gespannt, die mit Lämmlipuffer gefüllt wurde und der Kamm entfernt.

Abschließend wurde das Gel mit den Proteinproben beladen, die zuvor mit 10 µl

Probenpuffer versetzt, dann für 5 Minuten bei 100°C denaturiert und bei

9000 U / min kurz anzentrifugiert wurden. Zusätzlich wurden 5 µl des

Molekulargewichtstandards pipettiert. Die elektrophoretische Trennung erfolgte bei

125 V für 90 Minuten.

3.11 Western Blot

Tab. 7: Primärantikörper für den Western Blot

Antikörper Klonalität Code Donor Verdünnung Hersteller

SP-A polyklonal H-148 Rabbit 1:200 Santa Cruz

SP-B monoklonal MAB3276 Mouse 1:250 Millipore

SP-C polyklonal AB3786 Rabbit 1:500 Millipore

SP-D polyklonal BM4083 Rabbit 1:500 Acris

Tab. 8: Sekundärantikörper für den Western Blot

Sekundärantikörper Konzentration Firma

Goat anti Mouse HRP 1:5000 Dianova

Goat anti Rabbit HRP 1:5000 Dako


29

Bei der Western Blot Analyse werden die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine

aus dem Polyacrylamid-Trenngel zum späteren immunologischen Nachweis mittels

Sandwich-Verfahren auf eine geeignete Membran transferiert.

Dazu wurde das SDS-Gel luftblasenfrei auf eine Nitrocellulosemembran gelegt, die

zuvor 15 Minuten in Transferpuffer äquilibriert wurde. Es folgten, sowohl zur Anode

als auch zur Kathode hin, zwei Lagen mit in Transferpuffer angefeuchtetem

Filterpapier. Alle drei Sandwichkomponenten (SDS-Gel, Filterpapier,

Nitrocellulosemembran) wurden auf Gelgröße zugeschnitten und zwischen Anode

und Kathode gepresst (Abb. 7). Anschließend erfolgte der Elektrotransfer (Blot) der

Proteine für 90 Minuten bei 25 V und 125 mA.


Abb. 7: Schematische Darstellung eines Western Blots

Zu Beginn der Antikörperreaktion erfolgte für eine Stunde die Inkubation der

Membran mit TBS-T, welches mit 5 % Milchpulver versetzt wurde, um alle

unspezifischen Proteinbindungsstellen zu blockieren. Danach wurde die Membran

mit der primären Antikörperlösung, die für jedes Surfactant Protein spezifisch ist,

über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte

eine weitere Stunde Inkubation bei Raumtemperatur, bevor die Membran dreimal für

15 Minuten mit TBS-T gespült wurde, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen.

Anschließend wurde die Membran mit dem sekundären Antikörper für 2 Stunden bei

Raumtemperatur inkubiert. Um den störenden Hintergrund und nicht gebundene

Antikörper zu entfernen, wurden mehrere Waschschritte mit TBS-T angeschlossen.

Alle weiteren Schritte zur Sichtbarmachung der Proteine wurden mit Hilfe der

Enhanced Chemiluminescence (ECL) Methode durchgeführt. Dazu wurde die

Membran 5 Minuten mit jeweils 2 ml ECL-A und ECL-B Gemisch inkubiert. Die am

Sekundärantikörper haftende Meerrettich-Peroxidase oxidiert unter alkalischen

Bedingungen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid das zyklische Diacylhydrazid

Luminol. Die Chemolumineszenz auf dem Blot wurde in der Dunkelkammer durch

das Auflegen eines Röntgenfilms und die damit verbundene Schwärzung lokalisiert.


30

Die Dauer des Auflegens (Belichtungszeit) richtet sich nach der Menge des zu

detektierenden Proteins oder der Qualität der Antikörpersysteme und variiert

zwischen 5 und 60 Minuten.

3.12 Immunhistochemie

Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden die in der folgenden

Tabelle (Tab. 9) aufgeführten Primärantikörper verwendet.

Tab. 9: Primärantikörper für die Immunhistochemie

Antikörper Klonalität Code Donor Verdünnung Hersteller

SP-A monoklonal MAB3270 Mouse 1:50 Millipore

SP-B monoklonal MAB3276 Mouse 1:50 Millipore

SP-C polyklonal AB3786 Rabbit 1:50 Millipore

SP-D polyklonal BM4083 Rabbit 1:50 Acris

Tab. 10: Sekundärantikörper für die Immunhistochemie

Sekundärantikörper Konzentration Firma

Biotinylated Goat anti Mouse Ig 1:200 Dako

Biotinylated Goat anti Rabbit Ig 1:200 Dako

Die Präparate wurden wie folgt aufbereitet:

• Fixierung der Gewebeproben in 4 % Paraformaldehyd für 24 Stunden

• Auswaschen der Fixierlösung (24 Stunden fließend wässern)

• Entwässern mit Xylol in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 % - 100 %)

• Einbettung in Paraplast

Mit dem Grundschlittenmikrotom wurden Paraffinschnitte von 6 µm Schichtdicke

angefertigt und auf HistoBond-Adhesion-Micro-Slides aufgebracht. Anschließend

wurden diese in Küvetteneinsätze sortiert und über Nacht bei 60°C in den

Wärmeschrank gestellt, um das Herauslösen des Paraffins zu erleichtern. Am

nächsten Tag wurden die Paraffinschnitte in Xylol entparaffiniert. Danach in einer

absteigenden Alkoholreihe und abschließend in destilliertem Wasser rehydriert. Um

die Darstellung der Surfactant Proteine zu ermöglichen, wurden die Schnitte im

Sinne der Epitopdemaskierung vorbehandelt. Hierzu wurden sie in eine mit

Natriumcitratpuffer (pH 6,0) gefüllte Plastikküvette gestellt und bei verschlossenem

Deckel 10 Minuten lang gekocht. Danach wurden die Schnitte bei Raumtemperatur

eine Stunde abgekühlt. Im Anschluss wurden diese dreimal mit destilliertem Wasser


31

gespült. Nach dem sorgfältigen Abtrocknen der Objektträger wurden die einzelnen

Schnitte mit einer hydrophoben Flüssigkeit mittels eines Stiftes zweimal umrandet.

Im Anschluss wurden die Schnitte mit 3 %igem Wasserstoffperoxid dunkel inkubiert.

Nach 10 Minuten wurde dieses abgeschüttet und die Schnitte sofort mit destilliertem

Wasser zweimal gespült. Um eine übermäßig starke unspezifische

Hintergrundfärbung zu verhindern, wurde 20 Minuten mit Normalserum inkubiert. Im

Anschluss erfolgte die Inkubation mit dem Avidin Biotin Kit. Für jede Probe wurde

eine Negativkontrolle mitgeführt, die statt des Primärantikörpers mit TBS-Puffer

inkubiert wurde. Als Positivkontrolle diente für alle Surfactant Proteine das Gewebe

humaner Lunge. Abschließend wurde der Primärantikörper in entsprechender

Konzentration nach Herstellerangaben aufgebracht und es erfolgte die Inkubation

über Nacht bei 4°C. Am nächsten Tag folgte dreimaliges Spülen der Schnitte in

TBST-Puffer und die Inkubation der Schnitte mit Sekundärantikörper für 60 Minuten

bei Raumtemperatur. Nach abgelaufener Inkubationszeit wurden alle Schnitte

dreimal 5 Minuten in TBST-Puffer gespült. Es erfolgte eine weitere Inkubation von

30 Minuten mit dem „ABC-Kit“. Nach abschließendem dreimaligen Spülen in TBST-

Puffer wurden die Schnitte mit Diaminobenzidin entwickelt. Dieser entscheidende

Schritt dauert je nach Gewebetyp zwischen 1 und 5 Minuten. Abschließend wurden

alle Präparate für 30 Sekunden mit Hämalaun nach Meyer gegengefärbt, erneut mit

destilliertem Wasser gespült und mit Aquatex eingedeckt. Die digitale

Dokumentation erfolgte mit dem Photomikroskop Keyence BioRevo BZ9000. Die

Lagerung der Schnitte sollte dunkel, kühl und trocken erfolgen.

3.13 Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA)

Bei einem ELISA handelt es sich um eine immunologische Methode, deren Wirkung

in einem enzymatischen Farbumschlag besteht. Durch spezifische Antikörper, die

an ein Antigen (den nachzuweisenden Stoff) binden, können Hormone, Proteine

oder andere Stoffe nachgewiesen werden. Als Probe wurde Speichel von 40

gesunden Probanden und 40 Patienten verwendet, bei denen eine

Zahnfleischentzündung bzw. eine Entzündung des Zahnhalteapparates vorlag. Für

jedes Surfactant Protein wurden entsprechende Standards mitgeführt, die es

ermöglichten, die Antigenkonzentrationen in den jeweiligen Proben zu

quantifizieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die ELISA- Kits der Firma USCN

verwendet. Die Durchführung erfolgte gemäß dem mitgelieferten Protokoll der Firma

USCN. Die Extinktion wurde bei 405 nm bzw. 450 nm Wellenlänge in einem

Mikroplatten-Spektrometer bestimmt. Hierbei ist die Intensität der Färbung

proportional zur Konzentration des zu bestimmenden Antigens. Durch das ELISA-


32

Verfahren ist es möglich, Aussagen über die Quantität der Proteine in den

untersuchten Proben zu treffen. Zunächst wurde eine

Proteinkonzentrationsbestimmung der Gesamtproteine aller 80 Proben nach der

Methode nach Bradfort (siehe 3.9) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden

photoanalytisch mittels des zum ELISA- gehörigen Computerprogramms erfasst und

mit dem Statistikprogramm SPSS unter Verwendung unterschiedlicher

Testverfahren ausgewertet.


Abb. 8: Wirkungsprinzip des Sandwich-ELISA.

(1) Antikörper, der an den Boden der Mikrotiterplatte gebunden ist; (2) Bindung des

gesuchten Antigens aus der Probe an den Antikörper; (3) Bindung des Detektions-

Antikörpers an das gesuchte Antigen; (4) Zugabe des enzyme-linked Antikörper, Bildung

eines Antikörper- Antigen- Antikörper- Komplexes; (5) Zugabe eines passenden Substrats,

das durch das Enzym zu einem nachweisbaren Reaktionsprodukt umgesetzt wird.

3.14 Statistik

Zur Auswertung der Sandwich-ELISAs wurden die Zahlenwerte, die durch eine

spezielle Auswertungssoftware bestimmt worden waren, mit Hilfe des

Statistikprogramms SPSS genau analysiert. Dazu wurde der Student T-Test für die

Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D verwendet. Dabei wurde der

quantitative Unterschied der Konzentration der unterschiedlichen Surfactant

Proteine zwischen den Proben gesunder und erkrankter Patienten verglichen. Eine

Signifikanz ließ sich für p< 0,05 erkennen.

Ergebnisse

33

4 Ergebnisse

4.1 Nachweis der Surfactant Proteine in humanem gingivalen Epithel auf

mRNA-Ebene

Um die Transkription der Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D in der

Gingiva nachweisen zu können, wurde, wie unter 3.3 beschrieben, mRNA aus den

Gewebeproben isoliert, in cDNA umgeschrieben und in den unter 3.5 erläuterten

Bedingungen in einer RT-PCR amplifiziert. Für alle Gene ergaben sich dabei in allen

untersuchten Proben spezifische cDNA-Fragmente. Für SP-A betrug die Größe des

Amplifikationsproduktes 212 bp für SP-B 194 bp für SP-C 110 bp für SP-D 461 bp

und für ß-Aktin 275 bp. Damit entsprechen sie bereits sequenzierten Fragmenten,

die mit den ermittelten Größen der NCBI 100 %ig übereinstimmen

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Als Positivkontrolle wurde Plasmid DNA verwendet,

die den ORF (open reading frame), der entsprechenden Surfactant Proteine enthält.

Um den Ablauf der PCR bewerten zu können, wurde das ubiquitär enthaltende ß-

Aktin als interne Positivkontrolle bei den PCRs verwendet.

Abb. 9: Mit Ethidiumbromid angereicherte Proben in Gelen auf Agarose-Basis zur

Visualisierung der Amplifikationsprodukte der folgenden Proben:

(1-3) Gewebeproben der Gingiva unterschiedlicher gesunder Patienten, (-) Negativkontrolle

ohne „template vergleichbare“ c-DNA, (+) Positivkontrolle Plasmid DNA, die den ORF der

entsprechenden Surfactant Proteine enthält. Alle RT-PCR Ergebnisse zeigen eine cDNA

Amplifikation der betreffenden Surfactant Proteine.

≈ 212 bp

≈ 194 bp

≈ 110 bp

≈ 461 bp

≈ 275 bp

SP-A

SP-B

SP-C

SP-D

β-actin

1 2 3 - +

Ergebnisse

34

4.2 Nachweis der Surfactant Proteine in humanem gingivalen Epithel auf

Proteinebene

4.2.1 Western Blot des gingivalen Epithels

Für den Nachweis der Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D auf

Proteinebene wurden Zahnfleischproben von drei unterschiedlichen Patienten

verwendet. Die spezifischen Antikörper führten zu einer eindeutigen Reaktion. Es

sind Banden bei 60 kDa für SP-A, bei 40 kDa für SP-B, bei 16 kDa für SP-C und bei

43 kDa für SP-D sichtbar. Als Positivkontrolle wurde unter gleichen

Versuchsbedingungen gesundes Lungengewebe mitgeführt. Dafür ergaben sich

deutlich sichtbare Banden bei 60 kDa für SP-A, bei 9 kDa für SP-B, bei 6 kDa für

SP-C und bei 43 kDa für SP-D. Zusätzlich wurden Speichelproben auf die

Anwesenheit aller vier Surfactant Proteine untersucht. Bei den Spendern handelte

es sich um drei gesunde Patienten sowie drei Patienten, die an einer Entzündung

der Gingiva bzw. des Parodonts leiden. Es zeigte sich in allen Proben eine deutliche

Antikörperreaktion, welche in klaren, kräftigen Proteinbanden sichtbar wurde (bei

60 kDa für SP-A, 40 kDa für SP-B, 16 kDa für SP-C und bei 43 kDa für SP-D).

Abb. 10: Western Blot der vier Surfactant Proteine abgeleitet von folgenden Proben:

(1-3) Gewebeproben der Gingiva unterschiedlicher gesunder Patienten, (+) Lungengewebe

als Positivkontrolle. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt und zeigen eindeutige

Banden an den Positionen, an denen sie laut der für die einzelnen Surfactant Proteine

spezifischen Molekulargewichte zu erwarten sind (SP-A: 60 kDa, SP-B: 40 kDa, SP-C:

16 kDa, SP-D: 43 kDa).

Ergebnisse

35

4.2.2 Western Blot des Speichels gesunder und erkrankter Patienten

Abb. 11: Western Blot der Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D abgeleitet von

folgenden Proben:

(1) Speichelprobe eines gesunden Patienten, (2) Speichelprobe eines an Gingivitis bzw.

Parodontitis erkrankten Patienten. (3) Lungengewebe als Positivkontrolle. Die Proteine

wurden durch SDS-PAGE getrennt und zeigen eindeutige Banden, die sich an den

Positionen befinden, an welchen sie laut der für die einzelnen Surfactant Proteine

spezifischen Molekulargewichte zu erwarten sind (SP-A: 60 kDa, SP-B: 40 kDa, SP-C:

16 kDa, SP-D: 43 kDa). SP-B weist eine Frühform bei 18 kDa auf.

4.2.3 Immunhistochemische Analyse

Mittels immunhistochemischer Methoden ist es möglich, die Lokalisation der

Surfactant Proteine im gingivalen Epithel nachzuweisen. Dafür standen fünf

Gewebeproben mit gesundem gingivalen Epithel und neun Proben mit entzündlich

verändertem gingivalen Epithel zur Verfügung. Auf den Objektträgern wurden je

nach Größe der Gewebeproben zwei oder vier Gewebedünnschnitte aufgebracht,

auf denen die Immunfärbung mit den Antikörpern aller vier Surfactant Proteine

durchgeführt wurde. Zusätzlich wurden Objektträger mit je einem Präparat der

Gingiva als Negativkontrolle und einem Präparat aus Lungengewebe als

Positivkontrolle bestückt. Bei der Negativkontrolle wurde der Gewebedünnschnitt

nur mit Sekundärantikörper behandelt, um eine spezifische Antikörperreaktion zu

gewährleisten. Als Versuchsergebnis lässt sich zusammenfassen, dass in allen

gesunden Gewebeproben eine Antikörperreaktion gegen jedes Surfactant Protein

erkennbar ist. Im Hinblick auf die physikochemischen Eigenschaften der Surfactant

Proteine sind diese im Zytosol der Epithelzellen als Granula vorhanden.

Ergebnisse

36

Stromazellen und angrenzendes Gewebe zeigen im Vergleich zum oberflächlichen

Epithel keine spezifische Färbung. Auf der Oberfläche der Gewebe, die mit

Antikörpern gegen SP-A und SP-C behandelt wurden, kann man eine Ansammlung

der Antikörper auf der obersten Epithelzellschicht erkennen. Aber auch SP-B ist dort

lokalisiert (siehe Vergrößerung SP-B Abb.3a). SP-D hingegen kann in dieser

obersten Schicht nicht eindeutig identifiziert werden. SP-A ist nur in geringem Maß

in den Membranen der einzelnen Zellen zu erkennen (Inset SP-A). In den

untersuchten pathologisch veränderten Gewebeschnitten ist bereits morphologisch

ein Unterschied zu gesundem Gewebe auffällig. Die Zellen sind hyperplastisch, und

es ist eine Auflockerung des Zellverbundes zu erkennen. Auch die

immunhistochemische Reaktion weicht von der der gesunden Gingiva in ihrer

Intensität ab. So ist festzustellen, dass die Antikörperreaktion für alle vier Surfactant

Proteine in entzündeten Gewebeanteilen deutlicher ausfällt. SP-A und SP-D

befinden sich in großen Mengen im Randbereich der Zellen, was den Anschein

erweckt, dass diese in die Zellmembran eingelagert sind (Abb. 3b). Bei SP-B und

SP-C hingegen befindet sich ein deutlicher Niederschlag im basalen Bereich der

Zelle. Dies ist vor allem in den hyperplastisch veränderten Zellen sehr deutlich. Da

alle untersuchten Präparate, bei denen dieser Befund auftrat, von unterschiedlichen

Patienten stammen, kann davon ausgegangen werden, dass es sich nicht um ein

individuelles Phänomen handelt.

Ergebnisse

37

4.2.3.1 Gesundes gingivales Gewebe

Abb. 12: Immunhistochemischer Nachweis der Surfactant Proteine in gesunder Gingiva.

Das mehrschichtig unverhornte Plattenepithel der Gingiva zeigt eine positive

Antikörperreaktion, welche nahezu homogen im Epithel des Zahnfleisches verteilt ist.

Während SP-D im Zytosol lokal in gut erkennbaren Aggregaten gespeichert ist (siehe Inset

SP-D), befinden sich die anderen Proteine (SP-A, SP-B und SP-C) gleichmäßig im Zytosol

verteilt. Vor allem SP-A und SP-C bilden einen dünnen Film auf der obersten Zellschicht,

aber auch SP-B kann dort detektiert werden (siehe Inset SP-B). SP-D hingegen zeigt keine

oder nur eine sehr geringe Verteilung in der Schicht, die den oberflächlichen Zellen aufliegt.

Ferner kann man SP-A in einem schwachen Saum um die einzelnen Zellen herum erkennen

(siehe Inset SP-A). Vergleicht man die spezifische Antikörperreaktion der Antikörper im

Epithel mit der des Stromas oder des angrenzenden Gewebes, so zeigen diese eine

stärkere Antikörperreaktion im Fall von SP-D oder eine geringere Antikörperreaktion im Fall

von SP-B.

Ergebnisse

38

4.2.3.2 Pathologisch verändertes gingivales Gewebe

Abb. 13: Immunhistochemischer Nachweis der Surfactant Proteine in pathologisch

verändertem gingivalen Gewebe. Im Gegenteil zu den Biopsien von gesunden Patienten

zeigen diese Proben hyperplastische und morphologische Veränderungen. Außerdem ist im

Vergleich zu den Tests in gesundem Gewebe eine auffällig stärkere Reaktion der Antikörper

für alle Surfactant Proteine festzustellen. SP-A und SP-D zeigen eine starke Reaktion, vor

allem in den Membranbereichen der einzelnen Zellen (siehe Insert SP-A und SP-D).

Hinsichtlich der Proteine SP-B und SP-C wird ein Niederschlag in den basalen Anteilen der

Zellen auffällig (siehe SP-B und Insert in Abbildung SP-B).

Ergebnisse

39

4.2.3.3 Negativkontrolle gingivales Epithel

Abb. 14: Ergebnisse der Negativkontrolle für die Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C

und SP-D. Das Epithel der humanen Gingiva lässt keine spezifische Antikörperfärbung

erkennen.

Ergebnisse

40

4.3 Ergebnisse des Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA)

4.3.1 Rohdaten der ELISA-Auswertung

Tab. 11: Daten, die mittels des Statistikprogramms SPSS ausgewertet wurden

NR. m/w Patientencode SP-A ng/mg SP-B ng/mg SP-C ng/mg SP-D ng/mg gesund

3 1 003024GWZIAAGJRJ 0,842105263 143,8036984 1,438259109 0,030901549 1

5 2 005079GMAOHRGJRN 0,244897959 266,03861 0,159340659 0,119822332 1

7 2 007017GMRNMXGJRN 0,126984127 180,2702703 0,247863248 0,08853539 1

17 1 017112GWAGSEGJRN 0,026666667 66,71567568 0,520512821 0,230937575 1

30 1 030039GWHLMAGJRN 0,426666667 55,45009009 2,134102564 0,144825259 1

34 2 034098GMMRFZGJRN 0,046242775 104,7189502 0,067696754 0,083148387 1

36 1 036115GWDGSEGJRN 0,225806452 43,53792502 1,385235732 0,435612157 1

41 1 041023GWFRJAGJRJ 0,217391304 60,35135135 10,01421405 0,15954604 1

43 1 043087GWKKKAGJRN 1,103448276 163,8378378 0,807692308 0,222704266 1

45 1 045076GWSLHEGJRN 0,171428571 114,7459459 5,019230769 0,184526392 1

48 1 048062GWRHLAGJRN 0,091743119 9,764939251 3,366619619 0,056558339 1

55 1 055103GWVRAEGJRN 0,112676056 29,20974496 13,25108342 0,045481857 1

61 1 061115GWFGDEGJRN 0,447368421 20,64651494 0,051366397 0,046352323 1

65 2 065118GMRSJSGJRN 0,191780822 31,86671603 0,695205479 0,164878812 1

72 1 072117GWBMJNGJRN 1,0 122,9887387 0,650641026 0,15901422 1

79 1 079087GWSRSEGJRN 0,061068702 17,50649887 0,298003523 0,029132376 1

81 1 081107GWURJAGJRN 1,371428571 17,87027027 0,836538462 0,029356471 1

10 2 010031GMHNWRGNRN 0,467532468 54,29484029 3,244755245 0,144876093 2

11 1 011024GWPHFAGNRJ 0,711111111 73,396997 3,123076923 0,737173616 2

12 1 012043GWSÜHAGNRJ 0,28 49,37837838 8,666538462 0,302371656 2

13 2 013089GMMKHTGNRN 0,037735849 64,80265171 5,082365747 0,492967162 2

20 2 020052GMSNHTGNRJ 0,782608696 31,01057579 15,33249721 0,565856623 2

21 2 021064GMHNASGNRN 0,41322314 16,14205941 0,645263827 0,288712405 2

32 1 032066WGGTHEGNRN 0,330275229 23,4559881 6,76905434 0,958798517 2

35 2 035035GMNRRDGNRN 0,633027523 10,92263823 3,294989414 0,33800341 2

37 2 037030GMMGJNGNRJ 0,020618557 29,4120925 1,247620936 0,490283337 2

39 2 039029GMLMGDGNRN 0,392523364 107,5761556 12,66013659 0,189308087 2

40 1 040018GWSRAEGNRN 0,22962963 31,57777778 4,670156695 0,328357569 2

44 2 044032GMHTRDGNRN 0,340425532 112,9982749 4,734451718 1,086814049 2

49 1 049114GWWAJEGNRJ 1,218390805 27,11711712 0,673076923 0,165341046 2

50 2 050024GMBKWRGNRN 0,2 104,2432432 2,862820513 0,4109906 2

51 1 051122GWRTREGNRN 0,181818182 17,84493584 0,039432789 0,471482723 2

52 1 052014GWWRBAGNRN 0,251655629 83,85967424 2,973127866 0,769878324 2

53 2 0531030GMGZHTGNRN 1,746031746 20,03003003 7,652777778 0,631397124 2

58 2 058020GMKRETGNRN 0,306122449 144,2162162 12,07005495 0,221671315 2

60 2 060058GMDTJMGNRJ 0,383371824 16,42144685 3,389944928 0,408821069 2

66 2 066046GMELWRGNRN 1,181818182 10,64045864 2,070221445 0,249085212 2

75 1 075032GWSLEAGNRN 0,701030928 20,13597102 4,42704203 0,587129429 2

78 1 078029GWKRREGNRN 0,387096774 23,36181343 2,518610422 0,274625055 2

82 2 082128GMMEJSGNRN 0,471544715 25,51439244 0,222170106 0,164682645 2

90 1 090051GWRTEEGNRN 2,379562044 0,800946932 0,541409321 0,627842783 2

Ergebnisse

41

4.3.2 Quantitative Konzentrationsbestimmung der Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D im Speichel gesunder und an Zahnfleischentzündungen erkrankter Patienten

Zur Veranschaulichung wurden Balkendiagramme erstellt, die die Konzentration der

Surfactant Proteine gesunder und erkrankter Patienten in ng Surfactant Protein pro

mg Gesamtprotein darstellen.

Abb. 15: Übersichtsdarstellung der vier untersuchten Surfactant Proteine SP-A, B, C und D.

Anhand des Balkendiagramms ist zu erkennen, dass SP-B absolut den größten Anteil an

den Surfactant Proteinen im Speichel darstellt. Sowohl im gesunden, als auch im Speichel

erkankter Probanden ist die Menge mit bis zu 260 ng / mg im Vergleich zu den anderen drei

Surfactant Proteinen stark erhöht. In der Abbildung rechts ist die Konzentration der

Surfactant Proteine im Speichel gesunder und erkrankter Patienten ohne die Betrachtung

von Surfactant Protein B dargestellt. Bei der quantitativen Analyse der Konzentration der

Surfactant Proteine SP-A, SP-C und SP-D stellt die Konzentration von SP-C den größten

Anteil dar, wobei hier zu erkennen ist, dass die Menge im Speichel erkrankter Patienten mit

maximal ca. 15 ng / mg gegenüber den gesunden Patienten erhöht ist.

Ergebnisse

42

Abb. 16: Das Balkendiagramm stellt die Ergebnisse aus 41 Einzelmessungen mit der

dazugehörigen Standardabweichung dar. Die y-Achse gibt die Proteinkonzentration des

entsprechenden Surfactant Proteins in ng / mg Gesamtprotein an. Für Surfactant Protein A

ergibt sich ein nicht signifikanter Unterschied (p= 0,238) zwischen der Menge im Speichel

gesunder (x-Achse: gesund) und der Menge im Speichel erkrankter (x-Achse: krank)

Patienten. Für Surfactant Protein B ergibt sich ein gerade nicht mehr signifikanter

Unterschied (p= 0,051) zwischen der Menge im Speichel gesunder (x-Achse: gesund) und

der Menge im Speichel erkrankter (x-Achse: krank) Patienten. Die Menge von SP-B im

Speichel gesunder Patienten ist erhöht. Die Menge von SP-A im Speichel erkrankter

Patienten ist leicht erhöht. Für Surfactant Protein C ergibt sich ein nicht signifikanter

Unterschied (p= 0,098) zwischen der Menge im Speichel gesunder (x-Achse: gesund) und

der Menge im Speichel erkrankter (x-Achse: krank) Patienten. Die Menge von SP-C im

Speichel erkrankter Patienten ist erhöht. Für Surfactant Protein D ergibt sich ein signifikanter

Unterschied (p< 0,0001) zwischen der Menge im Speichel gesunder (x-Achse: gesund) und

der Menge im Speichel erkrankter (x-Achse: krank) Patienten. Die Menge von SP-D im

Speichel erkrankter Patienten ist stark erhöht.

Ergebnisse

43

Tab. 12: Zusammenfassung des Student T-Test

Auswertung des Student T-Test

SP-A (gesund vs. krank): p= 0,238 kein signifikanter Unterschied

SP-B (gesund vs. krank): p= 0,051 kein signifikanter Unterschied; grenzwertig

SP-C (gesund vs. krank): p= 0,098 kein signifikanter Unterschied

SP-D (gesund vs. krank): p< 0,0001 hoch signifikanter Unterschied

Die Balkendiagramme implizieren, dass sich die Konzentration der Surfactant

Proteine im Speichel gesunder und erkrankter Patienten unterscheidet. Für SP-A

wird eine nicht signifikante Steigerung (p= 0,238) der Konzentration um 48,71 %

erkennbar. Die Konzentration des Surfactant Proteins der gesunden Gruppe liegt im

Mittel bei 0,39 ng / mg, bei der erkrankten Gruppe etwa bei 0,58 ng / mg. Die

Expression des Surfactant Protein A ist bei den Proben der erkrankten Patienten

gegenüber den gesunden Probanden erhöht. Für SP-B ergibt sich ein genau

konträres Bild. Zwar besteht ein nahezu signifikanter Unterschied zwischen den

beiden Versuchsgruppen, allerdings überwiegt im Falle von SP-B die Menge der

gemessen Surfactant Proteine in den Proben der gesunden Probanden. Es wird

eine Konzentration von SP-B im Mittel von 45,79 ng / mg bei den Proben gesunder

Probanden und 85,25 ng / mg bei den Proben erkrankter Patienten erreicht. Im

Vergleich zu den Proben der erkrankten Patienten sind die Proben der gesunden

Probanden um 86,17 % erhöht. Eine weitere Auffälligkeit, die im Falle von SP-B

eintritt, ist, dass die absolute Menge an Surfactant Protein B sowohl bei den

gesunden, als auch den erkrankten Proben deutlich über der, der anderen drei

Surfactant Proteine liegt. Wird nur SP-A, SP-C und SP-D betrachtet, stellt SP-C

sowohl bei den Gesunden als auch bei den Erkrankten den nächstgrößeren Anteil

dar. Des Weiteren fällt bei der Betrachtung des Diagramms für SP-C auf, dass mehr

Surfactant Protein im Speichel der erkrankten Patienten vorliegt. Zwar ist auch

dieser Unterschied nicht signifikant, doch ergibt sich eine Differenz von 90,41 %,

berechnet aus den Mengen 2,40 ng / mg für Proben gesunder Probanden und

4,57 ng / mg für die Proben erkrankter Patienten. Betrachtet man das Diagramm für

Surfactant Protein D, fällt ein hoch signifikanter (p< 0,0001) Unterschied auf. Die

Menge an SP-D beträgt bei den Proben der gesunden Probanden 0,13 ng / mg,

während sie bei den Proben der erkrankten Patienten nur 0,45 ng / mg beträgt. Dies

entspricht einer Steigerung von 246,15 %.

Diskussion

44

5 Diskussion

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals, dass die Surfactant Proteine SP-A,

SP-B, SP-C und SP-D im Epithel der menschlichen Gingiva vorkommen. Die

Expression der Proteine wurde sowohl in gesundem, als auch in entzündlich

verändertem gingivalen Epithel nachgewiesen. Weiterführende Untersuchungen an

Speichelproben gesunder und an Zahnfleischentzündungen erkrankter Patienten

führten zu dem Ergebnis, dass die Expression von SP-A, -C und -D in den Proben

erkrankter Patienten erhöht ist, während die Analyse für das Surfactant Protein B

ein gegenteiliges Expressionsmuster aufweist. Der Nachweis der Surfactant

Proteine in humaner Gingiva wurde in der vorliegenden Arbeit mittels PCR, Western

Blot und Immunhistochemie erbracht. Der Speichel gesunder und an Parodontitis

erkrankter Patienten wurde mittels Western Blot und enzyme-linked immunosorbent

assay (ELISA) untersucht. Für SP-B und SP-C wurde bei der Western Blot Analyse

eine Frühform des Surfactant Proteins detektiert. Im Fall von SP-B liegt diese bei

der Analyse der Gewebeproben bei 40 kDa, im Speichel konnte für SP-B eine

Frühform bei 18 kDa ermittelt werden. SP-C zeigt nur bei der Analyse des Gewebes

eine Frühform bei 16 kDa, während im Speichel keine zusätzlichen Proteinbanden

detektiert werden konnten. Diese Frühformen befinden sich innerhalb des

Spezifizitätsspektrums der verwendeten Antikörper. Auch in zahlreichen anderen

Geweben, zum Beispiel in der Glandula parotis und der Glandula submandibularis

(Bräuer et al., 2009) und Sekreten wie zum Beispiel dem Liquor (Schob et al., 2013)

konnte dieses Phänomen bereits nachgewiesen werden. Es wird vermutet, dass die

ausgiebige posttranslationale Modifizierung (Whitsett et al., 1986a; Jacobs et al.,

1987; Glasser et al., 1988b; Voorhout et al., 1992) für das Vorliegen der Frühformen

verantwortlich sein könnte und die unterschiedlichen Formen, entsprechend der

ausgebildeten Domänen spezifische Aufgaben in den verschiedenen Geweben

übernehmen könnten (Bruhn, 2005). Auch das Vorliegen der Surfactant Proteine in

monomerer oder dimerer Form kann zu zusätzlichen Banden bei den Western Blots

führen (Bourbon and Chailley-Heu, 2001).

5.1 Beurteilung der Ergebnisse der Immunhistochemie

Bräuer et al. konnten im Jahr 2009 bereits belegen, dass die vier Surfactant

Proteine in den Speicheldrüsen gebildet werden und somit Bestandteile des

Speichel sind, welchem vielfältige Aufgaben in der Mundhöhle zukommen (Bräuer et

al., 2009). So stellte sich die Frage, ob die im Speichel vorhandenen Surfactant

Diskussion

45

Proteine ausschließlich in den Speicheldrüsen gebildet werden, oder ob auch

andere Gewebe an der Bildung des Surfactants beteiligt sind.

Die immunhistochemischen Untersuchungen gesunder Gingivabioptate zeigen eine

homogene zytoplasmatische Verteilung der Surfactant Proteine in den Zellen des

mehrschichtig unverhornten Plattenepithels der Gingiva. Die Zellen des Stromas

und des Bindegewebes hingegen zeigen keine, beziehungsweise eine sehr geringe

Antikörperreaktion. Diese Ergebnisse sind mit den immunhistochemischen Analysen

der Speicheldrüsen, der Nasenschleimhaut und den Tränendrüsen, welche ähnliche

Verteilungsmuster aufweisen, vergleichbar (Paulsen et al., 2004; Bräuer et al., 2009;

Schicht et al., 2013). Die Surfactant Proteine SP-A und SP-D, die im Gingivaepithel

vorkommen, könnten demnach als Bestandteile des angeborenen Immunsystems

der Mundhöhle an der Gesunderhaltung und der Modulation von Entzündungen

beteiligt sein. Dies entspricht Ergebnissen, die bereits aus Untersuchungen anderer

Gewebe bekannt sind, wie zum Beispiel humaner Cornea und Prostata (Oberley et

al., 2005; Bräuer et al., 2007b). LeVine et al. gelang es, SP-A und SP-D als aktive

Modulatoren der Zytokinproduktion bei bakteriell verursachten Lungenerkrankungen

nachzuweisen (LeVine et al., 2001). Demnach ist davon auszugehen, dass diese

Proteine auch bakteriell verursachte Entzündungsprozesse des Parodonts

modulieren könnten. Wootten et al. konnten belegen, dass die Expression von SP-A

mit der Exacerbation einer Entzündung korreliert (Wootten et al., 2006). Besonders

im Sulcus gingivalis, der eine natürliche Nische zwischen Gingiva und Zahn bildet,

ist die Zirkulation und Konzentration der Speichelflüssigkeit aufgrund der

anatomischen Gegebenheiten vermindert (Bräuer et al., 2012). Aus diesem Grund

ist eine wirkungsvolle Barriere nötig, um die Gesundheit der Mundhöhle zu erhalten.

Die Anwesenheit von SP-B und SP-C in dieser Region könnte die Fließfähigkeit des

Speichels beeinflussen und so die verminderte Zirkulation der Speichelflüssigkeit

kompensieren. Ähnliches konnte für den Sekretfluss in der Tuba auditiva festgestellt

werden (Paananen et al., 2001a). Anhand der charakteristischen Färbung der

immunhistochemischen Schnittbilder kann man erkennen, dass sich die Surfactant

Proteine hauptsächlich in den Zellen des mehrschichtig unverhornten

Plattenepithels befinden. Auch in einem dünnen Film, der dem Epithel oberflächlich

aufliegt, erkennt man eine Färbung, die auf die Anwesenheit der gesuchten

Surfactant Proteine hinweist. Auch Schob et al. konnten einen derartigen

oberflächlichen Film in unterschiedlichen immunhistochemisch analysierten

Gewebeschnitten des ZNS beschreiben (Schob et al., 2013). Außerdem lassen sich

Auffälligkeiten bei der Betrachtung der Proben erkennen, welche von Patienten

gewonnen wurden, die an einer Entzündung der Gingiva leiden. Betrachtet man das

Diskussion

46

Epithel und das darunter liegende Mesenchym der Gingiva bei an fortgeschrittener

Parodontitis erkrankten Patienten, fallen eine unregelmäßige Epitheloberfläche mit

Exsudat der Zellen, Verschmälerung der Reteleisten, Mikroulzerationen,

Mikroabszessen, lymphozellulärem Infiltrat im Mesenchym und vereinzelte

Lymphozyten im Epithel auf (Page and Schroeder, 1976). Bei den Gewebeschnitten

für SP-A befindet sich eine deutlich sichtbare, starke Färbung im Bereich der

Zellmembranen. Es ist davon auszugehen, dass die hydrophilen Surfactant Proteine

in Vesikeln in der Zellmembran gespeichert werden, bevor sie an die

Epitheloberfläche abgegeben werden (Ochs et al., 2002). Außerdem ist eine stark

angefärbte Granula sichtbar, die gleichmäßig im Zytoplasma der Epithelzelle verteilt

ist. Die Intensität der Färbung ist im Bereich des noch nicht verhornenden Stratum

spinosum am stärksten. Das weist darauf hin, dass die Produktion des Surfactant

Protein A in den jüngeren Zellgenerationen dominiert. Mit zunehmender Verhornung

und dem damit verbundenen Aufstieg der Zellen Richtung Epitheloberfläche könnte

sich die Produktion von Surfactant Protein A verringern. Der deutlich sichtbare,

dunkel gefärbte Streifen auf dem Epithel besteht aus den Surfactant Proteinen, die

sowohl aus dem Speichel stammen, als auch von den Epithelzellen selbst sezerniert

werden (Bräuer et al., 2009). In Anbetracht der entzündlichen Veränderung des

Zahnfleisches lässt die erhöhte Expression von SP-A darauf schließen, dass es eine

entscheidende Rolle in der lokalen Immunabwehr der Mundhöhle spielen könnte.

Lee et al. konnten im Jahr 2005 einen Zusammenhang der vermehrten Expression

von SP-A bei Patienten mit einer bakteriell verursachten chronischen Sialadenitis

herstellen (Lee et al., 2005). Für das Surfactant Protein D stellt sich ein ähnliches

Bild dar. Auch hier kann man eine deutliche Färbung der Schnittbilder im Bereich

der Zellmembranen der Epithelzellen erkennen. Die Granula im Zytosol der Zellen

ist ebenfalls vorhanden. Dieses Phänomen konnte auch bei den

immunhistochemischen Analysen des Gewebes des ZNS und in der

Nasenschleimhaut festgestellt werden (Schicht et al., 2013; Schob et al., 2013). Da

auch SP-D ein Protein ist, welches der Immunabwehr zuzuordnen ist, entsprechen

die Ergebnisse den Erwartungen, dass auch bei SP-D die Produktion durch die

Epithelzellen selbst bei entzündeter Gingiva verstärkt sein könnte. Eine mögliche

immunologische Funktion von SP-D im Speichel ist dessen Fähigkeit an Proteine zu

binden, die identisch mit dem Scavenger-Rezeptor-Protein gp-340 sind (Ligtenberg

et al., 2001). Auch bei der Betrachtung der hydrophoben Surfactant Proteine B und

C lassen sich bei erkrankten Patienten Besonderheiten erkennen. Obwohl diese nur

bedingt direkt an der Immunabwehr beteiligt sind, ist deren Färbung bei den

entzündeten Proben ebenso verstärkt. Es ist zwar keine Einlagerung der Surfactant

Diskussion

47

Proteine in die Zellmembranen der Epithelzellen erkennbar, aber es wird ein

deutlicher Niederschlag im Zytosol sichtbar. Dieser befindet sich vornehmlich im

basalen Bereich der Zellen und entsteht wahrscheinlich durch im hydrophilen

Zytosol nicht lösliche, ausfallende Proteine. Im Gegensatz zu SP-A und SP-D ist

das Surfactant Protein B nicht gleichmäßig verteilt sondern erweckt eher den

Eindruck, dass es in Aggregaten gebunden vorliegt (Schicht et al., 2013) und nicht

an die Epitheloberfläche abgegeben wird. Diese Annahme wird dadurch bekräftigt,

dass sich keine Färbung in den obersten Epithelschichten erkennen lässt.

Außerdem fehlt die in allen anderen Färbungen sichtbare bandförmige Ablagerung

auf der Oberfläche der Gingiva. SP-C scheint sich in den Immunhistochemischen

Färbungen ähnlich zu verhalten wie die Surfactant Proteine A und D. Zwar ist auch

hier in einigen Zellen ein Niederschlag der Proteine erkennbar, insgesamt erinnert

deren Verteilungsmuster aber eher an SP-A und SP-D. Die Färbung ist gleichmäßig

über das gesamte Epithel verteilt und auch auf der Epitheloberfläche ist eine

durchgängige oberflächliche Schicht erkennbar. SP-B und SP-C haben die

Eigenschaft, die Oberflächenspannung von Flüssigkeiten herabzusetzen und

dadurch deren Fließfähigkeit zu erhöhen (Gortner and Hilgendorff, 2004). Im Fall

einer Entzündung würde eine Zirkulation des Speichels bei verstärkter Expression

von SP-B und SP-C gefördert werden. So könnten die immunologisch wirksamen

Proteine an den Ort der Entzündung gelangen. Vor allem im Bereich des Sulcus

gingivalis, dem Entstehungsort einer Gingivitis, würde sich dies eventuell als Vorteil

erweisen. Da SP-B aber das Surfactant Protein ist, welches auch im Speichel wie im

Nasensekret (Schicht et al., 2013), Liquor (Schob et al., 2013) und Tränenflüssigkeit

(Posa, 2013) am häufigsten vorkommt und dieses bei Entzündungen des

Zahnfleisches herunterreguliert ist, wirft das die Vermutung auf, dass eine verstärkte

Fließfähigkeit vermieden werden soll. Dadurch würde die Dauer der Anwesenheit

des Speichels in den entsprechenden Bereichen erhöht werden, was eine erhöhte

Wirksamkeit der immunologischen Faktoren bedingen könnte. Ähnlich wie dem

Sekret in der Nasenhöhle könnte auch dem Speichel in der Mundhöhle die Aufgabe

zukommen, eine schützende Schicht auf entzündlich verändertem Gewebe zu

bilden (Weston, 2010). Eine weitere Aufgabe in der Mundhöhle, bei der SP-B und

SP-C aufgrund ihrer rheologischen Eigenschaften beteiligt sein könnten, ist die

Bildung und Aufrechterhaltung des tertiären Schmelzoberhäutchens, des Acquired

Enamel Pellicle (AEP). Das AEP hat großen Einfluss auf die Gesunderhaltung der

Zähne (Lendenmann et al., 2000). Es begünstigt die Remineralisation, vermeidet

Demineralisation sowie Austrocknung der Zahnhartsubstanz und beeinflusst die

Zusammensetzung der frühen bakteriellen Plaque, indem es nur ganz wenigen,

Diskussion

48

bestimmten Bakterien eine Anheftung an der Hydroxylapatitschicht der Zähne

ermöglicht (Hay, 1973). So können Erkrankungen der Zähne wie Karies, Erosion

oder parodontale Erkrankungen durch das Vorhandensein und die Beschaffenheit

des tertiären Schmelzoberhäutchens beeinflusst werden (Siqueira et al., 2012).

Abgesehen von den Surfactant Proteinen sind auch andere Proteine an

parodontalen Entzündungen beteiligt. Bereits 1964 konnte ein Zusammenhang

zwischen einer erhöhten Lysozymkonzentration und dem Vorliegen einer akuten

parodontalen Entzündung hergestellt werden (Brandtzaeg and Mann, 1964).

Lysozym ist ein Enzym, welches, wie die Surfactant Proteine, auch in

Tränenflüssigkeit, Nasensekret und dem Speichel nachgewiesen werden konnte

(Embery and Waddington, 1994). Die Aktivität von Lysozym im Sulcusfluid kann als

Indikator für die Schwere einer Parodontalerkrankung betrachtet werden. Surna et

al. konnten erhöhte Werte für Lysozym, alkalische Phosphatase und beta-

Glucuronidase im Blut von Patienten mit entzündlich verändertem parodontalen

Befund feststellen (Surna et al., 2008). Neben den direkten antimikrobiellen

Eigenschaften (Nakatsuji and Gallo, 2012) können Lysozym protektive Funktionen

zugerechnet werden (Younes et al., 2009). So konnte nachgewiesen werden, dass

Lysozym an Elastinfasern bindet um diese vor dem Abbau durch Proteasen oder die

humane Leukozyten-Elastase zu schützen (Park et al., 1996; Seite et al., 2006). Vor

allem im faserreichen Parodont muss dieser Eigenschaft eine hohe Bedeutung

beigemessen werden.

5.2 Betrachtung der Ergebnisse der ELISA-Auswertung

Speichel scheint nur vollständig ausgereifte Formen der Surfactant Proteine zu

enthalten, da in ihm keine zusätzlichen Proteinbanden abgebildet waren, die durch

noch nicht vollständig posttranslational modifizierte Proteine entstehen. Es ist

anzunehmen, dass der Ursprung des Hauptanteils der Surfactant Proteine des

Speichels im Speicheldrüsensystem liegt, wo die Proteinexpression bereits

Gegenstand früherer Untersuchungen war (Bräuer et al., 2009). Die Untersuchung

von Gingivabiopsien von Patienten, die unter einer Entzündung des oralen Epithels

leiden, lassen morphologische Veränderungen sowie eine Hyperplasie erkennen. In

allen pathologisch veränderten Proben ist eine enorm erhöhte Reaktion der

Antikörper gegen Surfactant Proteine zu erkennen. Dies hat die Forschungsgruppe

dazu veranlasst, weiterführende Untersuchungen durchzuführen.

Die Auswertungen der Sandwich ELISAs mit Speichelproben gesunder und an

Zahnfleischentzündungen erkrankter Patienten zeigen, dass die Surfactant Proteine

SP-A, SP-C und SP-D bei den erkrankten Personen in erhöhten Konzentrationen

Diskussion

49

vorliegen. Für SP-D weist das Ergebnis einen hoch signifikanten Unterschied auf.

Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass sowohl das gingivale Epithel selbst,

als auch die Speicheldrüsen im Falle einer Entzündung verstärkt die Surfactant

Proteine SP-A, SP-C und SP-D ausschütten, um so den Heilungsprozess positiv zu

beeinflussen. Für SP-A und SP-D, denen immunologische Funktionen zuzuordnen

sind, ist diese Reaktion äußerst plausibel. Im Fall von SP-C kann dahingehend

argumentiert werden, dass dessen rheologische Eigenschaften, die im Stande sind,

die Fließfähigkeit an Gas- Wasser- Grenzflächen zu beeinflussen, sich positiv auf

die Ausheilung einer Entzündung auswirken, indem sie die Verteilung von SP-A und

SP-D sowie anderer immunologisch wirksamer Faktoren fördern. So könnten schon

zu Beginn jeder Entzündung, die immer vom Sulcus gingivalis ausgeht (Oz and

Puleo, 2011), durch verstärkte Speichelzirkulation die im Speichel vorhandenen

immunologischen Faktoren an ihren Wirkungsort befördert werden. Obwohl der

Sulcus gingivalis, aufgrund seiner anatomischen Besonderheiten die

Prädilektionsstelle für jegliche Art der Parodontalerkrankung darstellt, ist generell

eine erhöhte Fließfähigkeit und Bildungsrate des Speichels in der gesamten

Mundhöhle von Vorteil, um initiale Entzündungen zu eliminieren und noch gesunde

Areale vor Infektionen zu schützen. Für SP-B stellt sich in der ELISA Analyse ein

abweichendes Bild dar. SP-B scheint im Gegensatz zu den drei anderen Surfactant

Proteinen SP-A, SP-C und SP-D bei den gesunden und nicht bei den erkrankten

Personen verstärkt exprimiert zu werden. Dies könnte darauf hinweisen, dass eine

Erhöhung der Fließfähigkeit des Speichels sensibel reguliert wird, indem die beiden

dafür verantwortlichen Faktoren unterschiedliche Verteilungsmuster aufweisen, um

eine zu starke Erhöhung der Fließfähigkeit zu vermeiden. Da SP-B das am

häufigsten vorkommende Surfactant Protein ist, hat eine verminderte Expression im

Entzündungsfall bedeutende Veränderungen zur Folge. Möglicherweise resultiert

die verminderte Expression von Surfactant Protein B auch daraus, dass die durch

die Entzündung angegriffenen Zellen nicht mehr in der Lage sind, Surfactant Protein

B in der benötigten Menge zu exprimieren, ähnliches konnte in der Nasenhöhle

beobachtet werden (Seong et al., 2002; Hsu and Peters, 2011). Dies könnte auch

ein Grund dafür sein, dass Gingival- und Parodontalerkrankungen nur sehr selten

selbstständig ausheilen. Meist ist eine Intervention durch den Zahnmediziner

erforderlich.

Vergleicht man die durch ELISA ermittelten Ergebnisse der Proteinkonzentrationen

des Speichels mit denen der Tränenflüssigkeit (Posa, 2013), des Liquors (Schob et

al., 2013) und des Nasensekrets (Schicht et al., 2013), fällt auf, dass sich die Werte

für alle Surfactant Proteine in allen Geweben unterscheiden. Während bei den

Diskussion

50

gesunden Probanden im Speichel im Mittel 0,4 ng / mg gemessen wurden, lagen die

Werte für Tränenflüssigkeit bei 3 ng / mg, für Liquor bei 27 ng / mg und für nasales

Sekret bei 3,7 ng / mg. Somit ist SP-A in Tränenflüssigkeit und nasalem Sekret in

etwa der gleichen Konzentration vorhanden, während für Liquor deutlich höhere und

für Speichel deutlich niedrigere Konzentrationen erreicht werden. Für SP-B stellt

sich das Ergebnis folgendermaßen dar. Im Speichel gesunder Probanden liegt die

Konzentration bei 45 ng / mg, in der Tränenflüssigkeit bei 170 ng / mg, im Liquor

wurden 25 ng / mg gemessen und im Nasensekret liegt SP-B mit einer

Konzentration von 4 ng / mg vor. Damit liegt SP-B in allen untersuchten Sekreten in

der höchsten Konzentration vor. Auch für SP-C lassen sich die Konzentrationen der

gesunden Probanden vergleichen. Im Speichel liegt SP-C mit 2 ng / mg, in der

Tränenflüssigkeit mit 5 ng / mg, im Liquor mit 48 ng / mg und im Nasensekret mit

1,5 ng / mg vor. Damit ist die Konzentration im Liquor gegenüber den anderen

ähnlichen Konzentrationen erhöht. Vergleicht man die Konzentrationen von SP-D

ergeben sich bei den gesunden Probanden Konzentrationen von 0,13 ng / mg

(Speichel), 14 ng / mg (Tränenflüssigkeit), 16 ng / mg (Liquor) und 3 ng / mg

(Nasensekret). Für SP-D liegen damit ähnliche Konzentrationen sowohl für Speichel

und Nasensekret als auch für Liquor und Tränenflüssigkeit vor. Eine statistische

Signifikanz der Messungen ließ sich beim Speichel nur für SP-D ermitteln, während

bei der Tränenflüssigkeit die Ergebnisse aller Surfactant Proteine außer SP-B

statistisch signifikant waren. Im Liquor waren sowohl die Messungen für SP-A als

auch für SP-D statistisch signifikant und im nasalen Sekret konnte nur im Fall von

SP-B ein statistisch signifikantes Ergebnis zwischen den Proben gesunder

Probanden und entzündlich erkrankter Patienten ermittelt werden.

Der Vergleich macht deutlich, dass keine klaren Zusammenhänge im

Expressionsverhalten der Proteine vorliegen. Jedes Surfactant Protein muss für

jedes Gewebe individuell beurteilt werden.

5.3 Erkrankungen der Mundhöhle und deren Auswirkungen auf die

Proteinzusammensetzung des Speichels

Auch bei anderen Erkrankungen, die sich in der Mundhöhle ereignen, finden sich

unterschiedliche Regulationsmuster für verschiedene Proteine. So beschrieben

Gunduz et al. 2009, dass bei der als Sjögren-Syndrom bekannten, chronischen

Erkrankung der großen Speicheldrüsen das Protein ß-Defensin-2 stärker

herabreguliert wird, als das Protein ß-Defensin-1. Weil diese verminderte

Expression der ß-Defensine so charakteristisch ist, kann sie als Biomarker für die

Diagnosestellung dieser Erkrankung herangezogen werden (Kaneda et al., 2009).

Diskussion

51

Ein weiterer pathologischer Prozess in der Mundhöhle, der eine Veränderung der

Proteinzusammensetzung des Speichels verursacht, ist die Karies. Bei dieser

Erkrankung der Zahnhartsubstanz kommt es zu einer Herabregulierung der

Ausschüttung von Staterin (Pingel et al., 2008), von HIS-1 (McDonald et al., 2011),

HIS-5 (Kurowska et al., 2011) und zu einer Heraufregulierung von PRP-1 (Huo et

al., 2011), PRP-3 (Hong et al., 2009), IL-6, Chemokinen (Chotjumlong et al., 2010)

und PGE2 (Lundy et al., 2008) gegenüber den kariesfreien Personen. Generell wird

eine höhere Menge an Proteinen im Speichel gesunder Personen nachgewiesen.

Auch bei Patienten, die an Diabetes Typ 1 erkrankt sind, findet man gegenüber der

gesunden Kontrollgruppe eine Vielzahl von Veränderungen. Diese wurden von

Baehni et al. 2011, Akamatsu et al. 2009 und Cabras et al. 2010 beschrieben.

Rauchen verändert die Zusammensetzung des Speichels dahingehend, dass es zu

einer vermehrten Ausschüttung von IL-8 (Mahanonda et al., 2009) kommt, die

Expression von ß-Defensinen (Mahanonda and Pichyangkul, 2007) wird hingegen

herabreguliert. Die vom Rauchen verursachten Veränderungen werden auf den

Einfluss mehrerer Bestandteile des Tabaks auf die Epithelzellen der Gingiva

zurückgeführt. Betrachtet man nur den Einfluss von Nikotin, fällt die Veränderung

der Speichelzusammensetzung gegenüber Nichtrauchern geringer aus (Mahanonda

et al., 2009). Neben den Surfactant Proteinen, die Gegenstand der vorliegenden

Arbeit sind, werden auch andere Proteine des Speichels durch

Zahnfleischentzündungen beeinflusst. Ackermann et al. untersuchten 2010

Erkrankungen der Gingiva, die durch das Bakterium Porphyromonas gingivalis

verursacht wurden. Dabei stellte sich heraus, dass die Anwesenheit von

Stoffwechselprodukten von Porphyromonas gingivalis die Synthese

proinflammatorischer Zytokine (IL-6) und von Chemokinen anregt. Bei der

Anwesenheit der humanen - und ß-Defensine fiel diese Immunreaktion geringer

aus (Kohlgraf et al., 2010). Dies lässt darauf schließen, dass komplexe Vorgänge an

der Synthese der einzelnen Proteine beteiligt sind und diese

Regulationsmechanismen bezüglich der Veränderung des Expressionsverhaltens

der einzelnen Surfactant Proteine weiter untersucht werden müssen, um genauere

Aussagen hinsichtlich der verminderten Expression von SP-B im Falle von

Zahnfleischentzündungen treffen zu können. Die vorangegangenen Beispiele

zeigen, dass es durchaus möglich ist, dass sich Proteine bestimmter Gruppen im

Fall von Veränderungen des sie umgebenden Milieus unterschiedlich verhalten. So

ist es nicht weiter erstaunlich, dass sich SP-B, wie durch die vorangegangenen

Untersuchungen nachgewiesen werden konnte, bei Entzündungszuständen der

Diskussion

52

Gingiva anders verhält als die drei anderen Surfactant Proteine SP-A,SP- C und SP-

D.

5.4 Veränderung des Expressionsverhaltens der Surfactant Proteine SP-A, SP-

B, SP-C und SP-D bei entzündlichen Erkrankungen des Menschen

Schob et al. konnten im Jahr 2013 mittels ELISA- Untersuchungen belegen, dass

sich die Konzentration der Surfactant Proteine SP-A, -B, -C und -D im Liquor von

gesunden und erkrankten Patienten unterscheidet. Sie untersuchten Infektionen des

ZNS (zentrales Nervensystem), Autoimmunerkrankungen sowie Gehirninfarkte und

verglichen die Konzentrationen der Surfactant Proteine mit Werten gesunder

Probanden. Auffällig wurde dabei, dass bei der Gruppe der entzündlichen

Veränderungen des ZNS für jedes Surfactant Protein spezifische

Regulationsmechanismen eingreifen. So wurden die immunologisch aktiven

Substanzen SP-A und SP-D im Fall einer Entzündung stark herunterreguliert. Auch

SP-C war im Liquor von Patienten mit einer Infektion in geringerer Konzentration

vorhanden, als bei den gesunden Probanden. SP-B wies ein genau gegenteiliges

Expressionsmuster auf. SP-B fand sich in deutlich erhöhter Konzentration im Liquor

von Patienten, die unter einer Infektion des zentralen Nervensystems litten (Schob

et al., 2013). Damit ergibt sich ein genau gegenteiliges Ergebnis von

Infektionserkrankungen des ZNS im Vergleich zu den Konzentrationen der

Surfactant Proteine bei Entzündungen, die in der Mundhöhle auftreten. Posa hat im

Jahr 2013 im Rahmen seiner Dissertation „Proteinkonzentrationen im humanen

okulären Surfactant System und deren Einfluss auf das trockene Auge“, die Menge

der Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D gesunder Probanden mit

Patienten verglichen, die unter einem chronisch trockenen Auge leiden. Die

Ergebnisse von Posa et al. unterstützen die Annahme, dass die Surfactant Proteine

unter bestimmten pathologischen Einflüssen, zum Beispiel Bakterien, oder der

Präsenz von proinflammatorischen Zytokinen an der Augenoberfläche und im

Tränenapparat, induziert und reguliert werden. Bei der ELISA- Auswertung zeigten,

ähnlich wie im Speichel, die hydrophilen immunologisch aktiven Proteine SP-A und

SP-D einen signifikanten Anstieg ihrer Konzentration im Vergleich zur gesunden

Kontrollgruppe. Auch die hydrophoben Surfactant Proteine SP-B und SP-C lagen

bei Patienten mit den Symptomen eines trockenen Auges, verglichen mit gesunden

Patienten, in erhöhter Konzentration vor. Auffällig war dabei, dass Surfactant Protein

B nur eine geringe Erhöhung der Proteinkonzentration von 11 % gegenüber der

gesunden Kontrollgruppe aufwies. SP-A, SP-C und SP-D dagegen wiesen

Erhöhungen um mindestens 43 % auf. So stellt auch bei diesen Untersuchungen

Diskussion

53

SP-B mit einer vergleichsweise geringen Veränderung des Expressionsverhaltens

gegenüber den Surfactant Proteinen SP-A, SP-C und SP-D, die eine starke

Veränderung ihres Expressionsverhaltens aufweisen, eine Ausnahme dar (Posa,

2013). Betrachtet man die Ergebnisse, die Schicht et al. 2013 veröffentlicht haben,

fällt auf, dass bei einer chronischen Entzündung der Nasennebenhöhlen nur

Surfactant Protein B gegenüber einer gesunden Kontrollgruppe stark erhöht ist. Alle

anderen Surfactant Proteine liegen bei den erkrankten Patienten in geringerer

Konzentration vor (Schicht et al., 2013). Damit weist auch dieses Verhalten der

Surfactant Proteine ein genau konträres Bild zu den in der vorliegenden Arbeit

ermittelten Ergebnissen auf. Dies könnte mit rheologischen und antibakteriellen

Eigenschaften von SP-B zusammenhängen. Der Hauptteil der Surfactant Proteine

des Speichels stammt aus dem Speicheldrüsensystem, nur ein geringer Anteil wird

vom gingivalen Epithel selbst sezerniert (Bräuer et al., 2012). Die Bakterien die für

das Auftreten einer Parodontitis verantwortlich sind, sind gramnegative anaerobe

Bakterien wie Aggregatibacter actinomycetemcommitans, Porphyromonas

gingivalis, Bakteriodes forsythus, Fusobacterium nodatum sowie zahlreiche andere

(Socransky et al., 1998). Eine chronische Rhinitis hingegen lösen hauptsächlich

grampositive Bakterien wie Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,

Propionibakterium acnes (Boase et al., 2013) oder Streptococcus pneumoniae

(Balachandran et al., 2002) aus. Da SP-B, welches nicht auf die Abwehr

grampositiver Bakterien spezialisiert ist, bei chronischen Sinusitiden stark erhöht ist,

weist das darauf hin, dass nicht die antimikrobielle, sondern die rheologische

Funktion bei entzündlichen Erkrankungen in der Nasenhöhle überwiegt. Demnach

spielen die Verbesserung der Fließfähigkeit und der Abtransport des Nasensekrets

eine übergeordnete Rolle (Glowina, 2011). Bei einer Parodontitis sind in der Regel

gramnegative Bakterien für die Ausbildung der Entzündung verantwortlich. Da SP-B

vor allem an der Abwehr gramnegativer Bakterien beteiligt ist, ist es möglich, dass

viel des im Speichel vorliegenden SP-B aufgebraucht wird, um den Bakterien im

gingivalen Epithel entgegenzuwirken, aber kein direkter Zusammenhang zwischen

der Entzündung des Parodonts und dem Expressionsverhalten der Speicheldrüsen

besteht. Dies macht die immunhistochemischen Ergebnisse für SP-B plausibel,

denn das Epithel reagiert direkt mit einer erhöhten Produktion von SP-B auf die

lokale Entzündung, bei der auch Bakterien in das Epithel eindringen. Die

verminderte Produktion von SP-B durch die Speicheldrüsen könnte auch darauf

hindeuten, dass die Fließfähigkeit im Bereich des Sulcus gingivalis verringert

werden soll, um den Proteinen des Sulcusfluids optimale Bedingungen zu bieten.

Diskussion

54

Diese Vermutung könnte mit einer Konzentrationsbestimmung der Surfactant

Proteine in entzündlich verändertem parodontalen Gewebe bestätigt werden.

Untersuchungen von Bräuer et al. und Oberley et al. in anderen Geweben ergaben,

dass es bei entzündlichen Prozessen zu einer Hochregulierung der Surfactant

Proteinexpression aller Surfactant Proteine kommt. Zum Beispiel in pathologisch

veränderter humaner Cornea (Bräuer et al., 2007a) und in der Prostata von

Nagetieren (Oberley et al., 2007).

Alle diese Erkenntnisse weisen darauf hin, dass bisher keine generelle Aussage

über das Expressionsverhalten der Surfactant Proteine SP-A, -B, -C und -D bei

Entzündungen gemacht werden kann. Das Expressionsverhalten muss für jedes

Gewebe und jedes einzelne Protein, wahrscheinlich auch für jeden Erregertyp

individuell und im Zusammenhang mit anderen Proteinen betrachtet werden

(Kohlgraf et al., 2010).

Ein wichtiger Aspekt, der bei der Betrachtung der Surfactant-Konzentration in der

Mundhöhle nicht außer Acht gelassen werden darf, ist, dass auch Bakterien in der

Lage sind, Surfactant Proteine zu produzieren. Diese können von den verwendeten

Analyseverfahren detektiert werden. So gelang es Bräuer et al. im Jahr 2013

nachzuweisen, dass Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa SP-A,

SP-B, SP-C und SP-D exprimieren (Bräuer et al., 2013). Staphylokokken und

Bakterien der Familie Pseudomonas können unter physiologischen Bedingungen in

der Mundhöhle vorkommen (Socransky and Haffajee, 2005). Da

Parodontalerkrankungen meistens durch eine Vermehrung von Bakterien ausgelöst

werden, ist es möglich, dass eine Erhöhung der Surfactant-Konzentration im

Speichel unter anderem auch durch Surfactant produzierende Bakterien

herbeigeführt wird. Weiterführend müsste untersucht werden, ob auch die für

Parodontalerkrankungen typischen Bakterien in der Lage sind, Surfactant Proteine

in messbaren Konzentrationen herzustellen.

Diese Ergebnisse erweitern den bisherigen Kenntnisstand, der aussagt, dass die

Surfactant Proteine als Bestandteil des Speichels auch in der Mundhöhle

vorkommen (Bräuer et al., 2009).

Thesen

55

6 Thesen

Die Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D sind in der Mundhöhle des

Menschen vorhanden. Dort können sie im Speichel und im gingivalen Epithel

nachgewiesen werden.

In dieser Dissertation wird gezeigt, dass die Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C

und SP-D vom gingivalen Epithel selbst produziert und sezerniert werden.

SP-A und SP-D besitzen eine immunologische Funktion, mit der sie vermutlich

einen Einfluss auf die Gesunderhaltung der Mundhöhle haben. Dies könnte eine

große Bedeutung für den Sulcus gingivalis haben, der eine natürliche Nische

zwischen Gingiva und Zahn bildet.

SP-B und SP-C erhöhen vermutlich durch ihre oberflächenaktiven Eigenschaften die

Fließfähigkeit des Speichels. So kann möglicherweise eine verminderte Zirkulation

der Speichelflüssigkeit im schwer zugänglichen Sulcus gingivalis kompensiert

werden.

Durch die Sekretion der Surfactant Proteine durch die Speicheldrüsen und das

Epithel der Mundschleimhaut wird eine gleichmäßige Verteilung der Surfactant

Proteine in der Mundhöhle gewährleistet. So wird auch eine effektive Immunreaktion

in allen Bereichen der Mundhöhle ermöglicht.

In der Mundhöhle kommt Surfactant Protein B in größerer Menge vor, als die

Surfactant Proteine SP-A, SP-C und SP-D.

Bei Zahnfleischentzündungen können die Surfactant Proteine SP-A, SP-C und SP-D

verstärkt im Speichel nachgewiesen werden.

Surfactant Protein B scheint im Falle einer Zahnfleischentzündung vermindert

exprimiert zu werden.

Schlussfolgerungen

56

7 Schlussfolgerungen

Die Surfactant Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D konnten bisher in den

Epithelien und Sekreten zahlreicher Organe nachgewiesen werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals der Beweis erbracht, dass die Surfactant

Proteine SP-A, SP-B, SP-C und SP-D auch im Epithel der menschlichen Gingiva

gebildet werden. Die immunhistochemischen Abbildungen zeigen, dass die

Expression der vier Surfactant Proteine in entzündlich verändertem Gewebe

gegenüber den Gewebeschnitten gesunder Personen erhöht ist. Darüber hinaus

konnte bestätigt werden, dass SP-A, SP-B, SP-C und SP-D physiologisch auch im

Speichel vorkommen. SP-B ist das Surfactant Protein, das in gesundem, sowie in

pathologisch verändertem Speichel in der höchsten Konzentration vorliegt. Am

zweithäufigsten kommt das ebenfalls hydrophobe Surfactant Protein SP-C vor. Die

hydrophilen Surfactant Proteine SP-A und SP-D kommen in vergleichbaren

Konzentrationen im Speichel vor. Im Vergleich zu SP-B und SP-C liegen sie in

geringer Menge vor.

Die Untersuchungen pathologisch veränderten Speichels mittels ELISA ergaben,

dass die Konzentration der Surfactant Proteine SP-A, SP-C und SP-D im Speichel

erkrankter Personen erhöht ist. SP-B hingegen wird beim Vorliegen einer

Parodontalerkrankung in geringeren Mengen exprimiert.

Wie bereits bekannt ist, besitzen die Surfactant Proteine A und D direkte und

indirekte antimikrobielle Eigenschaften. Gewebe, welches durch die Anwesenheit

und den Einfluss der Abbauprodukte verschiedenster Bakterien entzündlich

verändert ist, zeigt eine Überexpression an diesen Surfactant Proteinen. So

scheinen sie einen direkten Einfluss auf das Immunsystem der Mundhöhle zu

besitzen.

Die rheologisch wirksamen Surfactant Proteine SP-B und SP-C besitzen die

Fähigkeit, die Oberflächeneigenschaften des Speichels zu beeinflussen. Dadurch

könnte die Fließfähigkeit des Speichels bei Zahnfleischerkrankungen gerade am

Übergang zum gingivalen Saumepithel so verbessert werden, dass die

antimikrobiellen Peptide im Speichel an Effizienz gewinnen würden. Ob sich ein

klinischer Nutzen durch die Substitution von Surfactant Proteinen bei

Parodontalerkrankungen ergibt, müsste durch weiterführende Studien geklärt

werden.

Abkürzungsverzeichnis

57

8 Abkürzungsverzeichnis

ß Beta

°C Grad Celsius

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µm Mikrometer

Abb. Abbildung

APS Ammoniumpersulfat

bp Basenpaare

BSA Rinderserumalbumin

ca. circa

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

DEPC Diethylpyrocarbonat

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP´s Desoxynukleosidtriphosphate

ELISA Enzyme-linked-immuno sorbent assay

g Gramm

h Stunde

H2O2 Wasserstoffperoxid

Ig Immunglobulin

IgA Immunglobulin A

kbp Kilobasenpaare

KCl Kaliumchlorid

kDa Kilodalton

l Liter

lt. laut

M Mol

mA Milliampere

mg Milligramm

MgCl2 Magnesiumchlorid

min Minute

ml Milliliter

mM Millimol

mol / l Mol pro Liter

mRNA messenger Ribonukleinsäure

n Anzahl

Abkürzungsverzeichnis

58

NaCl Natriumchlorid

Ng Nanogramm

nm Nanometer

OD Optische Dichte

ORF Open Reading Frame

P. Pseudomonas

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung

PCR Polymerase-Kettenreaktion

pmol Pikomol

RNA Ribonukleinsäure

rRNA ribosomale Ribonukleinsäure

RSB Reducing Sample Buffer

RT-PCR Reverse Transkriptase- Polymerase-Kettenreaktion

S. Staphylokokkus

SDS Sodium Dodecyl Sulfat

sec, s Sekunde

Tab. Tabelle

TAE Trisaminomethan- Acetat- Ethylendiamintetraessigsäure

TBS Trisgepufferte Saline

TBS-T Trisgepufferte Saline plus Tween

TEMED N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin

TRIS Trishydroxymethylaminomethan

tRNA transfer Ribonukleinsäure

U / µl Units pro Mikroliter

U / min Umdrehungen pro Minute

UV Ultra Violett

V Volt

vs versus

ZNS zentrales Nervensystem

Literaturverzeichnis

59

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P, Cure S, Segurens B, Aniere F, Samain S, Crespeau H, Abbasi N, Aiach

N, Boscus D, Dickhoff R, Dors M, Dubois I, Friedman C, Gouyvenoux M,

James R, Mairey-Estrada B, Mangenot S, Martins N, Menard M, Oztas S,

Ratcliffe A, Shaffer T, Trask B, Vacherie B, Bellemere C, Belser C, Besnard-

Gonnet M, Bartol-Mavel D, Boutard M, Briez-Silla S, Combette S, Dufosse-

Laurent V, Ferron C, Lechaplais C, Louesse C, Muselet D, Magdelenat G,


64

Pateau E, Petit E, Sirvain-Trukniewicz P, Trybou A, Vega-Czarny N, Bataille

E, Bluet E, Bordelais I, Dubois M, Dumont C, Guerin T, Haffray S, Hammadi

R, Muanga J, Pellouin V, Robert D, Wunderle E, Gauguet G, Roy A, Sainte-

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Abbildungsverzeichnis

76

10 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Prof. Dr. med. dent. Matthias Pelka; Zahnklinik 1 FAU-Erlangen-Nürnberg

Abb. 2: Lichtmikroskopische Aufnahme des gesunden humanen gingivalen

Epithels aus dem Anatomischen Institut 2 der FAU-Erlangen- Nürnberg

Abb. 3: http://www.praxis-karsch.de/media/shop/layout/home/img-

parodontologie-karsch.jpg Abb. 4: Prof. Dr. med. dent. Matthias Pelka; Zahnklinik 1 FAU-Erlangen-

Nürnberg Abb. 5: Lichtmikroskopische Aufnahme des entzündeten humanen gingivalen

Epithels aus dem Anatomischen Institut 2 der FAU-Erlangen- Nürnberg

Abb. 6: Schematische Darstellung der Surfactant Proteine überlassen von Dr.

Martin Schicht; Institut für Anatomie II der FAU-Erlangen-Nürnberg Abb. 7: Schematische Abbildung des Aufbaus eines Western Blots Abb. 8: http://www.epitomics.com/images/products/sandwich.jpg Abb. 9: Abbildung der Ergebnisse der Polymerase-Kettenreaktion Abb. 10: Abbildung der Ergebnisse der Western Blot Analyse für gesundes

humanes gingivales Epithel Abb. 11: Abbildung der Ergebnisse der Western Blot Analyse für

Speichelproben gesunder und erkrankter Patienten Abb. 12: Immunhistochemischer Nachweis der vier Surfactant Proteine in

gesunder humaner Gingiva Abb. 13: Immunhistochemischer Nachweis der vier Surfactant Proteine in

entzündeter humaner Gingiva Abb. 14: Negativkontrolle des immunhistochemischen Nachweises in

gesunder humaner Gingiva Abb. 15: Übersichtsdarstellung der vier untersuchten Surfactant Proteine Abb. 16: Gegenüberstellung der Konzentration der Surfactant Proteine im

Speichel gesunder und erkrankter Patienten

http://www.praxis-karsch.de/media/shop/layout/home/img-parodontologie-

http://www.praxis-karsch.de/media/shop/layout/home/img-parodontologie-

Verzeichnis der Vorveröffentlichungen

77

11 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen

11.1 Detection of Surfactant Proteins A, B, C, and D in human gingiva and

saliva

Bräuer L, Schicht M, Stengl C, Heinemann F, Götz W, Scholz M, Paulsen F. 2012.

Detection of surfactant proteins A, B, C, and D in human gingiva and saliva.

Biomedizinische Technik Biomedical engineering 57:59-64.

11.2 Detection of SP-G and SP-H in human saliva as well as regulation of

Surfactant-Protein-Expression in healthy and periodontal human saliva

Schicht M and Stengl C, Sel S, Heinemann F, Götz W, Petschelt A, Pelka M, Scholz

M, Paulsen F, Bräuer L (Publikation voraussichtlich in einer zahnmedizinischen

Sonderausgabe der Annals of Anatomy im Jahr 2014)

Anhang

78

12 Anhang

12.1 Zahnfleischerkrankungen Untersuchungs- und Fragebogen Patientennummer: Alter: Geschlecht: Diagnose: Schweregrad (PSI): Untersuchungen: Befund: Sulcustiefen: Sulcus Blutungsindex: Bemerkungen: Subjektive Symptome (Beschwerden) Objektive Symptome

Verlust der Stippelung Zahnfleischbluten Lockerung von Zähnen Ulzerationen Mundgeschmack Mundgeruch sonstige ________

Mundhygienestatus Wie oft putzen sie täglich Ihre Zähne? mal

Hygienezustand: API? aktive Karies Zahnersatz festsitzend herausnehmbar

Mundhygiene Zahnhygiene

wie oft __________ wann __________ nach Mahlzeiten vor Mahlzeiten Zahnpasta Marke __________ Zahnseide/Interdentalbürste Wie oft __________ Mundspüllösung Marke __________ Zahnpflegekaugummi Marke __________

Gewohnheiten

Knirschen Mundatmung

Getränke

Wasser Fruchtsäfte Limonade Energydrinks Wein Kaffee Tee zuckerfrei nach dem Zähneputzen am Abend nachts

Anhang

79

Süßigkeiten Bonbons zuckerfrei täglich Gummibärchen sauer täglich Schokolade täglich Salzgebäck/ Chips täglich

Rauchen

wie viele Zigaretten täglich __________ Marke vor dem zu Bett gehen nach dem Zähneputzen

Alkohol

Bier Wein Spirituosen Wie viel Wie häufig Tageszeit __________ Zahnpflege danach

Allgemeinanamnese (Eigen- u. Familienanamnese)

mehrfache Fälle von Zahnfleischerkrankungen in der Familie Partner mit Zahnfleischerkrankungen (Frauen) verstärktes Auftreten während Schwangerschaften „stressiger Job“

Allgemeinerkrankungen seit

Allergien __________ Diabetes mellitus __________ Hypertonie __________ Herz-Kreislauf-Erkrankungen __________ Arteriosklerose __________ Autoimmunerkrankungen __________ Erkrankungen des Blutes __________ Leber- oder Nierenerkrankungen __________ Rheumatismus __________ Schilddrüsenfehlfunktion __________ Chronische Erkrankung (Epilepsie) __________ Infektionskrankheit (Hep., AIDS…) __________ Sonstige Erkrankungen __________ Operationen __________

Allgemeinmedikation

Analgetika (Schmerzmittel) __________ Antiandrogene Hormontherapie __________ Anticholinergika (gegen Magengeschwüre __________

oder -krämpfe) Antihistaminika (Allergiebehandlung) __________ Betablocker (gegen Bluthochdruck) __________ Diuretika (Wassertabletten) __________ Orale Kontrazeptiva (Pille) __________ Psychopharmaka (Schlafmittel, Antidepresiva) __________ Insulin __________ Blutgerinnungshemmer (Marcumar, Ass) __________ Schlilddrüsenmedikamente __________ Sonstige __________

Anhang

80

12.2 Rohdaten Elisa und Auswertung der Fragebögen

NR m/w Patientencode SP-A ng/mg SP-B ng/mg SP-C ng/mg SP-D ng/mg

g/k

3 1 003024GWZIAAGJRJ 0,842105263 143,8036984 1,438259109 0,03090155 1

5 2 005079GMAOHRGJRN 0,244897959 266,03861 0,159340659 0,11982233 1

7 2 007017GMRNMXGJRN 0,126984127 180,2702703 0,247863248 0,08853539 1

17 1 017112GWAGSEGJRN 0,026666667 66,71567568 0,520512821 0,23093758 1

30 1 030039GWHLMAGJRN 0,426666667 55,45009009 2,134102564 0,14482526 1

34 2 034098GMMRFZGJRN 0,046242775 104,7189502 0,067696754 0,08314839 1

36 1 036115GWDGSEGJRN 0,225806452 43,53792502 1,385235732 0,43561216 1

41 1 041023GWFRJAGJRJ 0,217391304 60,35135135 10,01421405 0,15954604 1

43 1 043087GWKKKAGJRN 1,103448276 163,8378378 0,807692308 0,22270427 1

45 1 045076GWSLHEGJRN 0,171428571 114,7459459 5,019230769 0,18452639 1

48 1 048062GWRHLAGJRN 0,091743119 9,764939251 3,366619619 0,05655834 1

55 1 055103GWVRAEGJRN 0,112676056 29,20974496 13,25108342 0,04548186 1

61 1 061115GWFGDEGJRN 0,447368421 20,64651494 0,051366397 0,04635232 1

65 2 065118GMRSJSGJRN 0,191780822 31,86671603 0,695205479 0,16487881 1

72 1 072117GWBMJNGJRN 1 122,9887387 0,650641026 0,15901422 1

79 1 079087GWSRSEGJRN 0,061068702 17,50649887 0,298003523 0,02913238 1

81 1 081107GWURJAGJRN 1,371428571 17,87027027 0,836538462 0,02935647 1

10 2 010031GMHNWRGNRN 0,467532468 54,29484029 3,244755245 0,14487609 2

11 1 011024GWPHFAGNRJ 0,711111111 73,396997 3,123076923 0,73717362 2

12 1 012043GWSÜHAGNRJ 0,28 49,37837838 8,666538462 0,30237166 2

13 2 013089GMMKHTGNRN 0,037735849 64,80265171 5,082365747 0,49296716 2

20 2 020052GMSNHTGNRJ 0,782608696 31,01057579 15,33249721 0,56585662 2

21 2 021064GMHNASGNRN 0,41322314 16,14205941 0,645263827 0,28871241 2

32 1 032066WGGTHEGNRN 0,330275229 23,4559881 6,76905434 0,95879852 2

35 2 035035GMNRRDGNRN 0,633027523 10,92263823 3,294989414 0,33800341 2

37 2 037030GMMGJNGNRJ 0,020618557 29,4120925 1,247620936 0,49028334 2

39 2 039029GMLMGDGNRN 0,392523364 107,5761556 12,66013659 0,18930809 2

40 1 040018GWSRAEGNRN 0,22962963 31,57777778 4,670156695 0,32835757 2

44 2 044032GMHTRDGNRN 0,340425532 112,9982749 4,734451718 1,08681405 2

49 1 049114GWWAJEGNRJ 1,218390805 27,11711712 0,673076923 0,16534105 2

50 2 050024GMBKWRGNRN 0,2 104,2432432 2,862820513 0,4109906 2

51 1 051122GWRTREGNRN 0,181818182 17,84493584 0,039432789 0,47148272 2

52 1 052014GWWRBAGNRN 0,251655629 83,85967424 2,973127866 0,76987832 2

53 2 0531030GMGZHTGNRN 1,746031746 20,03003003 7,652777778 0,63139712 2

58 2 058020GMKRETGNRN 0,306122449 144,2162162 12,07005495 0,22167131 2

60 2 060058GMDTJMGNRJ 0,383371824 16,42144685 3,389944928 0,40882107 2

66 2 066046GMELWRGNRN 1,181818182 10,64045864 2,070221445 0,24908521 2

75 1 075032GWSLEAGNRN 0,701030928 20,13597102 4,42704203 0,58712943 2

78 1 078029GWKRREGNRN 0,387096774 23,36181343 2,518610422 0,27462506 2

82 2 082128GMMEJSGNRN 0,471544715 25,51439244 0,222170106 0,16468264 2

90 1 090051GWRTEEGNRN 2,379562044 0,800946932 0,541409321 0,62784278 2

1= w

1= g

2= m

2= k

Anhang

81

Alter Sulcust. max. Mundhygiene Gewohnheiten Getränke Süßigkeiten Rauchen Alkohol

1984 1 3 4 4 3 3 1

1979 1 2 3 1 3 1 1

1987 1 2 3 4 1 1 1

1982 1 2 2 1 3 1 1

1989 1 2 3 1 2 1 1

1988 1 2 1 1 5 1 1

1985 1 1 2 1 5 1 1

1983 1 2 4 1 1 2 1

1987 1 2 1 2 2 1 1

1986 1 2 1 4 2 1 1

1982 1 2 4 1 2 1 1

1983 1 2 1 1 2 1 1

1985 1 2 2 2 2 1 1

1988 1 2 2 1 1 1 1

1987 1 2 2 1 3 1 1

1987 1 1 1 4 5 1 1

1987 1 1 3 3 2 1 1

1951 3 3 2 4 3 1 1

1964 3 2 1 1 1 3 1

1953 2 1 1 1 3 4 1

1949 2 1 3 4 1 1 1

1962 3 1 2 1 5 3 1

1954 3 3 2 2 1 1 4

1936 2 1 1 4 1 1 1

1955 2 1 4 1 5 1 1

1960 3 1 2 4 1 4 2

1939 2 2 1 1 1 1 1

1968 3 1 1 1 2 1 1

1952 2 1 4 1 4 1 1

1964 2 1 1 4 1 4 1

1934 2 2 4 1 3 1 1

1952 3 1 2 1 1 1 3

1954 3 1 4 1 1 1 3

1953 2 3 2 4 1 1 1

1940 2 1 1 1 2 1 2

1948 3 1 2 2 1 4 2

1936 2 1 3 1 2 1 2

1937 3 1 1 1 5 1 1

1949 3 2 2 4 1 1 1

1968 3 3 2 4 1 1 1

1961 3 1 3 4 4 1 1

Mundhygieneverhalten Gewohnheiten Getränke Süßigkeiten

1= nur Zahnpasta 1= nein 1= haupts. zuckerfrei 1= Keine Süßigkeiten

2= Zahnpasta + Zahnseide 2= Knirschen 2= haupts. zuckerhaltig 2= Schokolade

3= Zahnpasta Mundspüllösung 3= Mundatmung 3= säurehaltig 3= Bonbons zuckerfrei

4= Zahnpflegekaugummis 4= Knirschen + Mundatmung 4= Zucker + Säure 4= Knabbersachen

5= Kombinationen

Rauchen Alkohol Sulkustiefe

1= Nichtraucher 1= Kein Alkohol 1= bis 3 mm

2= bis 5 Zig. pro Tag 2= Bier 2= 3-6 mm

3= bis 10 Zig. pro Tag 3= Wein 3= ab 6 mm

4= ab 10 Zig. pro Tag 4= Bier+Wein

Anhang

82

Begleitumstände Allergie AW Allgemeinerkrankungen AW Medikamente

1 1 2 2

1 1 1 1

1 2 1 1

1 2 1 1

1 1 1 1

1 1 1 1

1 1 1 1

1 1 1 2

1 2 1 1

1 1 1 1

1 1 2 2

1 2 1 1

1 1 1 1

1 1 1 1

1 2 2 2

1 1 1 1

1 1 1

1 1 5 5

1 1 5 1

2 2 3 3

1 1 4 3

1 1 1 1

1 1 5 5

1 1 4 3

1 1 1 1

1 2 1 1

2 1 5 5

2 1 1 1

1 1 3 3

3 2 3 3

1 1 5 5

1 1 2 2

1 2 2 2

1 2 4 3

1 1 4 1

3 1 1 3

1 1 3 3

3 1 3 3

3 2 1 1

1 1 1 1

3 2 1 1

Begleitumstände Allergie AW Allgemeinerkrankungen AW Medikamente

1= nein 1= keine Allergie 1= keine Allgemeinerkrankung 1= keine Medikamente

2= Stress 2= Allergie 2= Hypothyreose 2= Schilddrüsenmedikamente

3= fam. Häufung 3= Herz-Kreislauf-Erkrankung 3= Herz-Kreislauf-Medikamente

4= Diabetes 4= Pille

5= andere 5= andere

Anhang

83

10.3 Statistische Auswertung

Gesund (n=15) Krank (n=24) P value

Geschlecht Weiblich Männlich

11 4

10 14

0.054

1

Alter mean±SD 26.5 ± 2.7 60.38 ± 10.4 <0.0012

SulkustiefeBis 3.00 mm 3.00 bis 6.00 Ab 6,00 mm

15 0 0

0 11 13

<0.001

1

SpA mean±SD 4.3±4.4 5.9±5.2 0.3492

SpB mean±SD 9.1±7.5 4.6±3.9 0.0452

SpC mean±SD 1.2±1.4 4.5±4.1 0.0012

SpD mean±SD 1.4±1.1 4.5±2.5 <0.0012

Pearson chi-square test Student´s t test GET FILE='C:\Users\sel\Desktop\20120627_Surfactant.sav'. SORT CASES BY gesund. SPLIT FILE SEPARATE BY gesund. NPAR TESTS /K-S(NORMAL)=SP_A SP_B SP_C SP_D Alter /MISSING ANALYSIS. NPar Tests

Notes

Output Created 06-Jul-2012 13:45:53

Comments

Input Data C:\Users\sel\Desktop\20120627_Surfactant.sav

Active Dataset DataSet1

Filter <none>

Weight <none>

Split File gesund

N of Rows in Working Data File 41

Missing Value Handling Definition of Missing User-defined missing values are treated as missing.

Cases Used Statistics for each test are based on all cases with valid data for the variable(s) used in that test. Syntax NPAR TESTS /K-S(NORMAL)=SP_A SP_B SP_C SP_D Alter /MISSING ANALYSIS.

Resources Processor Time 0:00:00.000

Elapsed Time 0:00:00.016

Number of Cases Alloweda 98304

a. Based on availability of workspace memory.

[DataSet1] C:\Users\sel\Desktop\20120627_Surfactant.sav gesund = ja

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Testc

SP_A SP_B SP_C

N 17 17 17

Normal Parametersa,,b

Mean ,394570808941

8,525433986829E1

2,408447408235E0

Std. Deviation ,41917189 7,18391064948 3,75038693012

Most Extreme Differences Absolute ,287 ,190 ,308

Positive ,287 ,190 ,308

Negative -,190 -,147 -,265

Kolmogorov-Smirnov Z 1,181 ,784 1,270

Anhang

84

Asymp. Sig. (2-tailed) ,123 ,571 ,080

a. Test distribution is Normal.

b. Calculated from data.

c. gesund = ja


SP_D Alter

N 17 17


Mean ,131254926176 26,76

Std. Deviation ,1036685025649 2,705

Most Extreme Differences Absolute ,162 ,214

Positive ,138 ,214

Negative -,162 -,095

Kolmogorov-Smirnov Z ,669 ,880

Asymp. Sig. (2-tailed) ,762 ,420



c. gesund = ja

gesund = nein


SP_A SP_B SP_C

N 24 24 24


Mean ,585298099042

4,579811148467E1

4,537983174083E0

Std. Deviation ,5529092995314

3,8935153777804E1

4,1126816899153E0

Most Extreme Differences Absolute ,248 ,268 ,197

Positive ,248 ,268 ,197

Negative -,154 -,142 -,137

Kolmogorov-Smirnov Z 1,216 1,311 ,967

Asymp. Sig. (2-tailed) ,104 ,064 ,307



c. gesund = nein


SP_D Alter

N 24 24


Mean ,454436243708 60,38

Std. Deviation ,2532001506651

10,362

Most Extreme Differences Absolute ,136 ,119

Positive ,136 ,113

Anhang

85

Negative -,111 -,119

Kolmogorov-Smirnov Z ,664 ,583

Asymp. Sig. (2-tailed) ,770 ,886



c. gesund = nein

Die Interpretation dieser Auswertung besagt: Studenten T-Test kann für die Analyse von SpA bis SpD eingesetzt werden. SPLIT FILE OFF. EXAMINE VARIABLES=SP_A SP_B SP_C SP_D BY gesund /COMPARE VARIABLE /PLOT=BOXPLOT /STATISTICS=NONE /NOTOTAL /MISSING=LISTWISE. Explore

Notes


Comments



Filter <none>

Weight <none>

Split File <none>


Missing Value Handling Definition of Missing User-defined missing values for dependent variables are treated as missing.

Cases Used Statistics are based on cases with no missing values for any dependent variable or factor used. Syntax EXAMINE VARIABLES=SP_A SP_B SP_C SP_D BY gesund /COMPARE VARIABLE /PLOT=BOXPLOT /STATISTICS=NONE /NOTOTAL /MISSING=LISTWISE.



[DataSet1] C:\Users\sel\Desktop\20120627_Surfactant.sav gesund

Case Processing Summary

gesund

Cases

Valid Missing Total

N Percent N Percent N Percent

SP_A ja 17 100,0% 0 ,0% 17 100,0%

nein 24 100,0% 0 ,0% 24 100,0%

SP_B ja 17 100,0% 0 ,0% 17 100,0%

nein 24 100,0% 0 ,0% 24 100,0%

SP_C ja 17 100,0% 0 ,0% 17 100,0%

nein 24 100,0% 0 ,0% 24 100,0%

SP_D ja 17 100,0% 0 ,0% 17 100,0%

nein 24 100,0% 0 ,0% 24 100,0%

Anhang

86

EXAMINE VARIABLES=SP_A SP_C SP_D BY gesund /COMPARE VARIABLE /PLOT=BOXPLOT/STATISTICS=NONE /NOTOTAL /MISSING=LISTWISE. Explore

Notes


Comments



Filter <none>

Weight <none>

Split File <none>



Cases Used Statistics are based on cases with no missing values for any dependent variable or factor used. Syntax EXAMINE VARIABLES=SP_A SP_C SP_D BY gesund /COMPARE VARIABLE /PLOT=BOXPLOT /STATISTICS=NONE /NOTOTAL /MISSING=LISTWISE.





gesund

Cases

Valid Missing Total


SP_A ja 17 100,0% 0 ,0% 17 100,0%

nein 24 100,0% 0 ,0% 24 100,0%

SP_C ja 17 100,0% 0 ,0% 17 100,0%

nein 24 100,0% 0 ,0% 24 100,0%

Anhang

87

SP_D ja 17 100,0% 0 ,0% 17 100,0%

nein 24 100,0% 0 ,0% 24 100,0%

EXAMINE VARIABLES=SP_A BY gesund /PLOT=BOXPLOT /STATISTICS=NONE /NOTOTAL. Explore

Notes


Comments



Filter <none>

Weight <none>

Split File <none>



Cases Used Statistics are based on cases with no missing values for any dependent variable or factor used. Syntax EXAMINE VARIABLES=SP_A BY gesund /PLOT=BOXPLOT /STATISTICS=NONE /NOTOTAL.





gesund

Cases

Valid Missing Total


SP_A ja 17 100,0% 0 ,0% 17 100,0%

nein 24 100,0% 0 ,0% 24 100,0%

SP_A EXAMINE VARIABLES=SP_B BY gesund /PLOT=BOXPLOT /STATISTICS=NONE /NOTOTAL. Explore

Notes


Comments



Filter <none>

Weight <none>

Anhang

88

Split File <none>



Cases Used Statistics are based on cases with no missing values for any dependent variable or factor used. Syntax EXAMINE VARIABLES=SP_B BY gesund /PLOT=BOXPLOT /STATISTICS=NONE /NOTOTAL.





gesund

Cases

Valid Missing Total


SP_B ja 17 100,0% 0 ,0% 17 100,0%

nein 24 100,0% 0 ,0% 24 100,0%

SP_B EXAMINE VARIABLES=SP_C BY gesund /PLOT=BOXPLOT /STATISTICS=NONE /NOTOTAL. Explore

Notes


Comments



Filter <none>

Weight <none>

Split File <none>



Cases Used Statistics are based on cases with no missing values for any dependent variable or factor used. Syntax EXAMINE VARIABLES=SP_C BY gesund /PLOT=BOXPLOT /STATISTICS=NONE /NOTOTAL.





gesund

Cases

Valid Missing Total

Anhang

89


SP_C ja 17 100,0% 0 ,0% 17 100,0%

nein 24 100,0% 0 ,0% 24 100,0%

SP_C EXAMINE VARIABLES=SP_D BY gesund /PLOT=BOXPLOT /STATISTICS=NONE /NOTOTAL. Explore

Notes


Comments



Filter <none>

Weight <none>

Split File <none>



Cases Used Statistics are based on cases with no missing values for any dependent variable or factor used. Syntax EXAMINE VARIABLES=SP_D BY gesund /PLOT=BOXPLOT /STATISTICS=NONE /NOTOTAL.





gesund

Cases

Valid Missing Total


SP_D ja 17 100,0% 0 ,0% 17 100,0%

nein 24 100,0% 0 ,0% 24 100,0%

SP_D T-TEST GROUPS=gesund(1 2) /MISSING=ANALYSIS /VARIABLES=SP_A SP_B SP_C SP_D /CRITERIA=CI(.95). T-Test

Notes


Comments



Filter <none>

Weight <none>

Anhang

90

Split File <none>


Missing Value Handling Definition of Missing User defined missing values are treated as missing.

Cases Used Statistics for each analysis are based on the cases with no missing or out-of-range data for any variable in the analysis. Syntax T-TEST GROUPS=gesund(1 2) /MISSING=ANALYSIS /VARIABLES=SP_A SP_B SP_C SP_D /CRITERIA=CI(.95).



[DataSet1] C:\Users\sel\Desktop\20120627_Surfactant.sav

Group Statistics

gesund N Mean Std. Deviation Std. Error Mean

SP_A ja 17 ,394570808941 ,4191718983539 ,1016641183649

nein 24 ,585298099042 ,5529092995314 ,1128621381576

SP_B ja 17 8,525433986829E1 7,1839106494863E1 1,7423542595783E1

nein 24 4,579811148467E1 3,8935153777804E1 7,9476049843681E0

SP_C ja 17 2,408447408235E0 3,7503869301271E0 9,0960243822647E-1

nein 24 4,537983174083E0 4,1126816899153E0 8,3949763456497E-1

SP_D ja 17 1,312549261765E-1 1,0366850256489E-1 2,5143305066157E-2

nein 24 4,544362437083E-1 2,5320015066508E-1 5,1684264327106E-2

Independent Samples Test

Levene's Test for Equality of Variances t-test for Equality of Means

F Sig. t df

SP_A Equal variances assumed ,292 ,592 -1,198 39

Equal variances not assumed -1,256 38,772

SP_B Equal variances assumed 8,183 ,007 2,268 39

Equal variances not assumed

2,060 22,668

SP_C Equal variances assumed ,321 ,574 -1,693 39


-1,720 36,462

SP_D Equal variances assumed 10,649 ,002 -4,962 39


-5,623 32,554


t-test for Equality of Means

Anhang

91

Sig. (2-tailed) Mean Difference Std. Error Difference

SP_A Equal variances assumed ,238 -1,9072729010049E-1

1,5925168906920E-1

Equal variances not assumed ,217 -1,9072729010049E-1

1,5189949042848E-1

SP_B Equal variances assumed ,029 3,9456228383627E1

1,7395561382232E1

Equal variances not assumed ,051 3,9456228383627E1

1,9150568178898E1

SP_C Equal variances assumed ,098 -2,1295357658480E0

1,2578798361761E0

Equal variances not assumed ,094 -2,1295357658480E0

1,2377935506649E0

SP_D Equal variances assumed ,000 -3,2318131753186E-1

6,5134237085837E-2

Equal variances not assumed ,000 -3,2318131753186E-1

5,7475638045037E-2


t-test for Equality of Means

95% Confidence Interval of the Difference

Lower Upper

SP_A Equal variances assumed -5,1284423558123E-1 1,3138965538025E-1

Equal variances not assumed -4,9803068664426E-1 1,1657610644328E-1

SP_B Equal variances assumed 4,2703843268498E0 7,4642072440405E1

Equal variances not assumed -1,9186253857986E-1 7,9104319305835E1

SP_C Equal variances assumed -4,6738378889784E0 4,1476635728236E-1

Equal variances not assumed -4,6387923012868E0 3,7972076959069E-1

SP_D Equal variances assumed -4,5492774746889E-1 -1,9143488759484E-1

Equal variances not assumed -4,4017732000031E-1 -2,0618531506341E-1

Anhang

92

93

13 Danksagung

Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Friedrich Paulsen, der mir ermöglicht hat, diese Arbeit

am Institut für Anatomie ll der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

durchzuführen.

Ganz besonders möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Dr. Lars Bräuer für die

Überlassung des Dissertationsthemas, für seine Unterstützung, fachliche Betreuung

und die Hilfestellung beim Verfassen der Publikationen und der Dissertation

bedanken.

Auch bei Herrn Prof. Dr. Anselm Petschelt und Herrn Prof Dr. Matthias Pelka der

Zahnklinik für Zahnerhaltung und Parodontologie möchte ich mich dafür bedanken,

dass sie mir ermöglichten, Speichelproben von Patienten zu entnehmen und mich

mit Bildmaterial und Informationen unterstützt haben.

Vielen Dank an PD Dr. Friedhelm Heinemann und Prof. Dr. Werner Götz für die

Bereitstellung der Gingivaproben.

Herrn Dr. Saadettin Sel möchte ich herzlich für die Unterstützung bei der

statistischen Auswertung der erhobenen Daten herzlich danken.

Mein Dank gilt Herrn Dr. Martin Schicht für die Hilfe und Unterstützung bei der

Durchführung und Auswertung der praktischen Versuche und die vielen guten

Ratschläge, die zum Gelingen der Arbeit beigetragen haben.

Herzlichen Dank auch an Anke Fischer, Hong Nguyen, Marko Gößwein und alle

Mitarbeiter der Forschungsgruppe, die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen.

Herzlichen Dank auch an alle Patienten und Kommilitonen, die sich bereit erklärt

haben, an der Studie teilzunehmen.

Letztlich gilt mein Dank meiner lieben Familie, die mich während der Erstellung

dieser Dissertation und meines gesamten Studiums bedingungslos unterstützt hat.

Auch bei meinem Freund Bernd Bräuer möchte ich mich herzlichst für die

Zuwendung, den Rückhalt, das entgegengebrachte Verständnis und die

Unterstützung während der letzten fünf Jahre bedanken.

94

14 Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name, Vorname: Stengl, Christina

Geburtsdatum: 27.03.1984

Geburtsort: Roth (Mittelfranken)

Eltern: Helga und Franz Stengl

Geschwister: Benedikt und Sebastian Stengl

Werdegang:

Schulbildung:

1990-1994: Grundschule Heideck

1994-2003: Gymnasium Hilpoltstein

2003: Abitur

Berufliche Laufbahn:

2004-2007: Ausbildung zur Zahntechnikerin, Dentallabor Amann,

Eichstätt

2007: Gesellenprüfung

2007-2008: Berufstätig als Zahntechnikerin, Dentallabor Amann,

Eichstätt

Studium:

SS 2008: Beginn des Zahnmedizinstudiums an der FAU

Erlangen-Nürnberg

WS 2008 / 09: Naturwissenschaftliche Vorprüfung

SS 2010: Zahnärztliche Vorprüfung

WS 2012 / 13: Zahnärztliche Prüfung und Approbation als Zahnärztin

SS 2010-WS 2014: Promotion am Institut für Anatomie ll der FAU

Erlangen-Nürnberg

95

Eidesstattliche Selbstständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich mich mit der vorliegenden Arbeit „Nachweis der

Surfactant Proteine A, B, C und D im Epithel der humanen Gingiva sowie deren

Quantifizierung in gesundem und pathologisch verändertem Speichel“ erstmals um

die Erlangung des Doktorgrades bewerbe.

Ich habe die Arbeit selbstständig und nur unter Verwendung der angegebenen

Quellen angefertigt und die den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich

entnommenen Stellen als solche gekennzeichnet.

Erlangen, 24.03.2014

Christina Stengl

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