Aus der Medizinischen Klinik 1 mit Poliklinik

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Markus F. Neurath

Der Tyrosinkinaseinhibitor AEE788 im Morrishepatom der Ratte

- Eine tierexperimentelle Arbeit -

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Susanne Söthje aus

Marktredwitz

2

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Univ ersität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Referent: Prof Dr. med. Matthias Ocker Korreferent: Prof. Dr. med. Eckhart G. Hahn Tag der mündlichen Prüfung: 21.März 2012

3

Meinem Vater

4

Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung .......................................................................................................................... 1

2. Einleitung ........................................................................................................................................ 3

2.1 Grundlagen ............................................................................................................................... 4 2.1.1 HCC - Wachstumsfaktoren und Signaltransduktion .......................................................... 4

2.1.2 Angiogenese und VEGF ..................................................................................................... 5

2.1.3 EGF – epidermal growth factor ......................................................................................... 8

2.1.4 AEE 788 .............................................................................................................................. 8

2.2 Das Hepatozelluläre Karzinom ................................................................................................. 9

2.2.1 Definition ........................................................................................................................... 9

2.2.2 Epidemiologie .................................................................................................................... 9

2.2.3 Ätiologie .......................................................................................................................... 11

2.2.4 Prävention und Screening ............................................................................................... 13

2.2.5 Diagnostik ........................................................................................................................ 14 2.2.6 Therapie .......................................................................................................................... 16

2.2.6.1 Invasive Methoden ................................................................................................... 18

2.2.6.2 Medikamentöse Therapieoptionen......................................................................... 20

2.3 Fragestellung .......................................................................................................................... 23

3. Material und Methoden ............................................................................................................... 24

3.1 Material .................................................................................................................................. 24

3.2 Zellkultur ................................................................................................................................ 29

3.2.1 Verwendete Zellen .......................................................................................................... 29

3.2.2 Kulturbedingungen und Passage ..................................................................................... 29

3.2.3 Vorbereitung der Zellen zur Inokulation ......................................................................... 30 3.3 Tierexperimentelle Arbeiten .................................................................................................. 30

3.3.1 Tumorinokulation ............................................................................................................ 30

3.3.2 Medikamentengabe ........................................................................................................ 31

3.3.3 Verlaufskontrollen ........................................................................................................... 31

3.3.4 Tötung der Tiere ............................................................................................................. 31

3.4 Western Blot .......................................................................................................................... 31

3.4.1 Proteinextraktion ............................................................................................................ 32

3.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration .......................................................................... 32

3.4.3 Gelelektrophorese ........................................................................................................... 33

3.4.4 Transfer auf Nitrocellulosemembran .............................................................................. 33 3.4.5 Antikörperinkubation und Röntgenfilmentwicklung ..................................................... 34

3.4.6 Antikörperentfernung ..................................................................................................... 34

3.4.7 Auswertung ..................................................................................................................... 35

3.5 PCR ......................................................................................................................................... 35

3.5.1 RNA-Isolation aus Tumorgewebe .................................................................................... 35

3.5.2 RNA-Konzentrationsbestimmung .................................................................................... 35

3.5.3 RNA-Transkripition in cDNA ............................................................................................ 36

3.5.4 Light-Cycler PCR .............................................................................................................. 36

3.5.5 Auswertung ..................................................................................................................... 36

3.6 Histologische Verfahren ......................................................................................................... 36 3.6.1 Anfertigung der Präparate .............................................................................................. 36

3.6.2 HE – Färbung ................................................................................................................... 37

3.6.3 TUNEL – Färbung ............................................................................................................. 37

3.6.4 KI-67-Färbung .................................................................................................................. 38

3.6.5 VEGF- und VEGFR-Färbung .............................................................................................. 38

3.6.6 EGF- und EGFR-Färbung .................................................................................................. 38

3.6.7 Auswertung ..................................................................................................................... 38

5

4. Ergebnisse .................................................................................................................................... 40

4.1 Sonographischer Wachstumsverlauf ..................................................................................... 40

4.2 Western Blot .......................................................................................................................... 41

4.3 Immunhistochemie ................................................................................................................ 43 4.3.1 KI-67 Färbung .................................................................................................................. 43

4.3.2 TUNEL-Färbung................................................................................................................ 44

4.3.3 Färbung des EGF- und des VEGF-Rezeptors .................................................................... 45

4.3.4 Färbung der phosphorylierten EGF- und VEGF-Rezeptoren ........................................... 47

4.4 Light-Cycler® PCR ................................................................................................................... 49

5. Diskussion ..................................................................................................................................... 51

6. Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................................. 56

7. Tabellenverzeichnis ...................................................................................................................... 57

8. Abbildungsverzeichnis .................................................................................................................. 57

9. Literaturverzeichnis ...................................................................................................................... 58 10. Danksagung ................................................................................................................................ 66

11. Lebenslauf .................................................................................................................................. 67

1

1. Zusammenfassung

Als fünfthäufigste Todesursache weltweit steht das hepatozelluläre Karzinom

unverändert im Interesse der medizinischen Forschung.

Ansatz einer medikamentösen systemischen Therapie des HCC stellt die Inhibition

des Gefäßwachstums im Karzinom dar. Bestimmte modulierende Botenstoffe und

Rezeptoren, die dabei eine Rolle spielen, bieten hierfür Angriffsmöglichkeit.

In der vorliegenden tierexperimentellen Arbeit wurde die Wirkung des dualen

Tyrosinkinaseinhibitors AEE788 im Morrishepatom der Ratte untersucht.

Das Potenzial von AEE788 in der HCC-Therapie liegt in der Hemmung der

Phosphorylierung, also Aktivierung der Wachstumsfaktoren epidermal-growth-factor

(EGF) und vascular-epidermal-growth-factor (VEGF) und ihrer Rezeptoren und

anschließende Signalwege, dem mitogen-activated-protein-kinase-Weg (MAPK) und

dem Proteinkinase-B-Weg (AKT).

Jeweils fünf Versuchstiere wurden nach Implantation von Morris-Hepatom-Zellen mit

AEE788 behandelt, weitere fünf Tiere dienten als unbehandelte Kontrollen. Im

Verlauf wurde das Wachstum durch Gewichtskontrollen und sonographische

Ausmessung der Tumorgröße verfolgt. Anschließend wurden die Tumoren für

laborchemische Untersuchungen entnommen: mittels Immunhistochemie, Western-

Blot-Analyse und Polymerasekettenreaktion wurde die Expression von EGF, VEGF

und ihrer Rezeptoren, sowie die MAPK und AKT ausgewertet.

Die Ergebnisse untermauern die Rolle der beiden Wachstumsfaktoren als

Ansatzpunkt in der Therapie des hepatozellulären Karzinoms.

Sowohl auf biochemischer als auch auf makroskopischer Ebene konnte ein positiver

Effekt im Sinne der Arbeitshypothese nachgewiesen werden.

Die immunhistologische Auswertung zeigte eine Proliferationsinhibition bei mit

AEE788 behandelten Tieren, sowie eine verminderte Expression der

Wachstumsfaktoren EGF, VEGF und deren Rezeptoren.

Es konnte gezeigt werden, dass die orale Verabreichung des

Tyrosinkinaseinhibitors AEE788 eine Reduktion des Wachstums des HCC in der

Ratte erzeugt, die Vermittlung dieses Effekts scheint in einer Herabregulierung der

weiterführenden Signaltransduktion von EGF zu beruhen.

Neben anderen Arbeiten zu AEE788 legt die hier Vorliegende den Grundstein für

die Erforschung einer neuen Therapieoption des HCC, verlangt aber nach weiterer

Abklärung in größeren tierexperimentellen Studien, auch um eine eventuelle

alternative Applikationsart in ihrer Wirksamkeit prüfen zu können.

2

Conclusion

Being the fifth most common cause of death worldwide, hepatocellular carcinoma

still remains in the focus of medical research.

Inhibition of angiogenesis in this highly vascularized tumor is a promising approach

to systemic medicamentous treatment, as messengers and receptors with the

potential of medical intervention have been identified.

The present dissertation investigates the effect of the dual tyrosinkinase inhibitor

AEE788 in the morris hepatoma model of the rat.

The potential of AEE788 in the therapy of the hepatocellular carcinoma is assumed

in the regulation of the epidermal-growth-factor (EGF) and vascular-epidermal-

growth-factor (VEGF) as well as their receptors and following signaling pathways,

the mitogen-activated-protein-pathway (MAPK) and proteinkinase-b-way (AKT).

After implanting the tumor cells into the rats` livers, five animals have been treated

orally with AEE788, and five remained untreated as control group, respectively. The

follow-up was done by sonographic assessment of tumor size as well as weight

controls. Subsequently, the tumors were extracted for further investigation: via

immunohistochemistry, western-blotting and quantitative real-time PCR the

expression of EGF, VEGF and their receptors as well as of downstream signaling

molecules MAPK and AKT were analyzed.

The results of this study confirm the importance of these two growth factors as

targets in HCC-therapy.

Biochemical and macroscopic findings support the thesis; AEE788 may have the

potential to inhibit tumor growth. Immunohistochemistry showed an inhibition of

proliferation, as well as a decreased expression of EGF, VEGF and their receptors.

It was possible to show the reduction of tumor growth, which seems to be based on

an inhibition of the down streaming signaling pathways of EGF.

Among other studies concerning AEE788 this dissertation reveals a new therapy

option in HCC, but further research in larger studies is recommended to prove the

present findings and evaluate possible alternative ways of administration.

3

2. Einleitung

Das hepatozelluläre Karzinom bzw. HCC ist die fünfthäufigste Krebserkrankung und

die dritthäufigste tumorassoziierte Todesursache weltweit, europaweit steht es auf

Platz 7 der Krebstodesursachen.

90% aller Lebermalignome sind primäre Leberzellkarzinome, die Inzidenz steigt

weltweit stetig an. Bisher imponiert das HCC mit seiner schlechten Prognose.

Nur in sehr frühen Phasen kann das HCC durch Resektion oder

Lebertransplantation geheilt werden. Mangelnde Früherkennungsmöglichkeiten

gestalten ebenso wie fehlende Therapieoptionen in späteren Stadien die

Behandlung als schwierig. Weltweit fordert es mindestens 500 000 Todesopfer

jährlich. [64]

Das Managment des HCC beansprucht die multidisziplinäre und stadienorientierte

Zusammenarbeit und ist Gegenstand der medizinischen und pharmakologischen

Forschung. Mit der Feststellung, welch wichtige Rolle die Angiogenese in

Entstehung und Wachstum von Tumoren spielt, wurden die Weichen in der

Erforschung medikamentöser systemischer und lokaler Verfahren neu gestellt.

Bereits 1971 wurde von J. Folkman die Hypothese vertreten, dass Tumorwachstum

und –ausbreitung von der Angiogenese abhängig sind. [20]

Da das hepatozelluläre Karzinom als hochvaskularisierter Tumor gilt, ist auch bei

dieser Krebsentität das Gefäßwachstum und dessen Stopp als Therapieziel

interessant.

Einem Mediator kommt hierbei eine Schlüsselfunktion zu: Dem vascular endothelial

growth factor, kurz VEGF. Unreguliert, wie im HCC, führt seine Aktivierung zur

Gefäßneubildung und unterhält so die Ausbreitung des Karzinoms. VEGF, genau

wie andere Wachstumsfaktoren und deren Beeinflussung, stellen eine große

Hoffnung in der Bekämpfung dieses Krebsleidens dar.

4

2.1 Grundlagen

2.1.1 HCC - Wachstumsfaktoren und Signaltransduktion

In der Kanzerogenese unterscheidet man verschiedene Stadien, die Initial-, die

Latenz- und schließlich die Proliferationsphase. Verschiedene Voraussetzungen

sind notwendig, um die Neuentstehung eines Tumors überhaupt möglich zu

machen. Veränderungen im Genom einer Tumorzelle führen zu vermehrter oder

verminderter Expression des Genprodukts oder aber sie führen zu einem

verändertem Genprodukt. Dies kann z. B. zu Mutationen von Protoonkogenen zu

Onkogenen und zum Ausfall von Tumorsuppressorgenen führen und ermöglicht so

eine expansive Größenzunahme. Für das Wachstum benötigt auch ein Tumor

Wege, das Signal zur Proliferation an die Zellen weiterzugeben. Dies geschieht mit

Hilfe sogenannter Wachstumsfaktoren und ihrer Rezeptoren. Wachstumsfaktoren

sind Proteine, welche durch Bindung an ihre Rezeptoren bestimmte Signalwege in

der Zelle aktivieren, die wiederum z.B. zur Proliferation anregen oder die Apoptose

inhibieren. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Inhibition der Aktivierung

eben zweier solcher proliferationsstimulierender Rezeptoren im Wachstum des

HCC, weswegen auf diese besonders eingegangen werden soll: Der epidermal-

growth-factor (EGF) und der vascular-endothelial-growth-factor (VEGF). Beide

führen nach Bindung an ihre Rezeptoren zur Aktivierung einer Tyrosinkinase und

anschließend durch Phosphorylierungen anderer intrazellulärer Botenstoffe zur

Aktivierung des Phosphatidylinsotiol-3-AKT-Kinase-Weges und des Ras-MAP-

Kinase-Weges. Schlussendlich münden diese beiden Wege in eine Stimulation der

Proliferation, also in Förderung des Tumorwachstums. [21]

Abb.1 Signaltransduktion nach EGFR- und VEGFR-Aktivierung in der Zelle [21]

5

2.1.2 Angiogenese und VEGF

Unter Angiogenese versteht man die Neubildung von Blutgefäßen aus bereits

Bestehenden, welche vor allem während der Embryonalentwicklung im Zuge der

Vaskulogenese entstanden sind. Verschiedene Reize, welche zu einem

Ungleichgewicht zwischen pro- und antiangiogenetischen Faktoren führen, können

zu einer solchen Blutgefäßneubildung bedingen. So etwa die chronische Hypoxie,

Gewebsazidose, Genmutationen, Immun – oder Entzündungsreaktionen.

Etliche molekulare Einflussgrößen konnten bis jetzt identifiziert werden, die folgende

Tabelle gibt einen Überblick. [39]

Tabelle 1 Pro- und antiangiogentische Faktoren

Proangiogenetische Faktoren Inhibitoren der Angiogen ese

Angiogenin

Angiopoietin-1

Adrenomedullin

Del-1-Fibroblast-growth-factor-1 (acidic FGF, FGF1)

Fibroblast-growth-factor-2 (basic FGF, FGF2)

Follistatin

Granulocyte-colony-stimulating-factor (G-CSF)

Hepatocyte-growth-factor/scatter-factor (HGF/SF)

Interleukin-3 (IL-3)

Interleukin-8 (IL-8)

Intermedin-Keratinocyte-growth-factor (FGF-7)

Leptin

Midkine

Neuregulin

Osteogenic-protein-1

Placental-growth-factor (PlGF)

Platelet-derived-endothelial-cell-growth-factor (PD-ECGF)

Platelet-derived-growth-factor (PDGF)

Pleiotrophin

Progranulin

Proliferin

Transforming-growth-factor-α (TGFα)

Transforming-growth-factor-β (TGFβ)

Tumor-necrosis-factor-α (TNFα)

Vascular-endothelial-growth-factor/vascular-permeabilityfactor (VEGF/VPF)

Angiopoietin-2 (in the absence of VEGF)

Angiostatin

Antithrombin III fragment

Arresten

Canstatin

Chondromodulin I

Connective-tissue-growth-factor (CTGF)

Decorin

Endorepellin

Endostatin

Fibronectin 20-kDa fragment

Interferons-α, β, and γ

Interleukin-4 (IL-4)

Interleukin-10 (IL-10)

Interleukin-12 (IL-12)

Interferon-inducible-protein-10 (IP-10)

Kringle 5

Metastatin

METH-1

METH-2

2-Methoxyestradiol

Osteopontin cleavage product

PEX

Pigment-epithelium-derived-factor (PEDF)

Plasminogen-activator-inhibitor (PAI)

Platelet factor-4

Prolactin 16-KDa fragment

Proliferin-related-protein

Prothrombin kringle 2

Maspin

Restin

Soluble-fms-like-tyrosinekinase-1 (S-Flt-1)

6

SPARC cleavage product

Tetrahydrocortisol-S

Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMPs)

Thrombospondin-1 and -2

Transforming-growth-factor-β (TGF-β) (activated form)

Troponin-1

Tumstatin

Vascular-endothelial –growth-inhibitor (VEGI)

Vasostatin

Die genetischen Regulatoren der Angiogenese stehen in engem Zusammenhang

mit Tumorwachstumsförderung und –inhibition. So sind beispielweise die aktivierten

Formen der Onkogene HER-2/neu, c-myc oder p73 assoziiert mit der Produktion

von VEGF in den Zellen und der Tumorgenese. Andere Tumorsupressorgene wie

p53, Rb und vHL kontrollieren die Expression des Angiogeneseinhibitors

Thrombospondin und vermindern die Tumorneuvaskularisierung. Eine Mutation im

Retinoblastomgen (Rb) oder von-Hippel-Lindau-Gen (vHL) führen zur VEGF-

Produktion und damit zu Angiogenese und Tumorwachstum. [39]

Im Wachstum von Tumoren gilt es zu unterscheiden zwischen einer avaskulären

Phase, in der man Tumoren bis zu einer Zellzahl von 10.000.000 findet. Solche

Tumoren finden sich autoptisch z.B. bei 40% aller Frauen im Alter zwischen 40 – 50

Jahren und bei 50% aller Männer im Alter zwischen 50 und 60 Jahren, nahezu jeder

im Alter über 70 besitzt solche sporadischen Tumoren z.B. in der Schilddrüse.

Ernährt werden diese Neubildungen über Diffusion, sie bleiben meist klinisch

stumm. [32, 39] Um ihr Wachstum voranzutreiben, benötigen Tumoren schließlich

eine eigene Blutgefäßversorgung, welche über mehrere Stufen im sogenannten

„angiogentic switch“ gebildet wird.

Durch Genmutation in oben aufgeführten Regulatoren kommt es zur Einsprossung

eigener Tumorgefäße, wie die Abbildung 2 zeigt: Nach Erreichen eines „steady-

state“ von Proliferation und Apoptose im Tumor kommt es zur Gefäßdilatation der

umliegenden Gefäße, Neueinsprossung kleiner Abzweigungen und schließlich zur

Ausbildung einer eigenen vaskulären Versorgung. [40]

Abb.2 Angiogenese im Tumor [40]

7

Die lokale Kapillarisierung schreitet mit einer Geschwindigkeit von bis zu 0,8

mm/Tag fort und ermöglicht so das exponentielle Wachstum der Tumormasse und

die überregionale Ausbreitung in Form von Metastasen durch Streuung der

Tumorzellen in die Blutbahn.

Solche Tumorgefäße unterscheiden sich von normalen Blutgefäßen durch eine

geringere Widerstandsfähigkeit, erhöhte Permeabilität und Kurzschlüssen zwischen

verschiedenen Abschnitten. Zum einen führt dies zu vermehrter Nekrose durch

Hypoxie und Azidose, zum anderen werden widerstandsfähige Tumorzellen

selektiert, die frei im Gewebe liegenden Endothelzellen sind leichter erreichbar für

Angiogenesefaktoren wie z.B. VEGF. [10]

Dieses, an dem komplexen Mechanismus der Gefäßneubildung beteiligte Protein,

ist der vascular endothelial growth factor, welcher in mehreren Tumoren gefunden

werden konnte. Derzeit sind verschiedene Subtypen bekannt, darunter VEGF-A, B,

C, D, E sowie der Plazenta Wachstumsfaktor PIGF, wobei vor allem VEGF-A eine

ausschlaggebende Rolle zugesprochen wird. VEGF ist ein großes Protein mit 45

kDa und bindet an Rezeptoren mit Tyrosinkinaseaktivität, hauptsächlich an VEGFR1

oder Flt-1 und VEGFR2 oder KDR/Flk-1. Mehrere Studien unterstützen die

Hypothese, dass vor allem VEGFR2 bzw. KDR/flk-1 für die physiologische als auch

pathologische Angiogenese im Menschen verantwortlich sind. [73]

Da das HCC sich üblicherweise als ein hochvaskularisierter Tumor zeigt, konnten

die Überexpression des vascular endothelial growth factor, kurz VEGF, und seiner

Rezeptoren flt-1 (VEGFR 1) und flk-1 (KDR, VEGFR 2), nachgewiesen werden.

Diese Überexpression konnte mit dem Tumorstadium korreliert werden. [3, 86]

Das fortschreitende Verständnis physiologischer Vorgänge während der

Angiogenese in Tumoren eröffnet den Weg zu kurativer, ursächlicher Therapie. Das

Konzept der antiangiogenetischen Therapie wurde erstmals 1971 von Judah

Folkman postuliert. Heutzutage findet man bereits über 300 Angiogenese-

Inhibitoren als potenzielle Chemotherapeutika sowohl in Studien als auch in

klinischem Gebrauch. Untenstehende Liste gibt einen Überblick über derzeit

verwendete antiangiogenetische Medikamente und ihr Zieltumoren. [40]

Tabelle 2 Antiangiogeneteische Medikamente in der Krebstherapie Medikament Hersteller Zieltumor

Bevacizumab Gentech/Roche Darm, Lunge, Brust, Gehirn,

Niere

Cetuximab Bristol-Myers

Squibb/Imclone

Kolon, Gehirn

Endostatin Simcere Lunge

Erlotinib Genentech/Roche/OSI Lunge, Pankreas

8

Everolimus Novartis Niere, Pankreas/NET,

Gehirn

Imiquimod Graceway/3M Aktinische Keratose,

Basalzellkarzinom

Interferon alfa Roche/Schering Melanom, Kaposi-Sarkom

Lenalidomide Celgene Myelodysplastisches

Syndrom, Multiples Myelom

Pazopanib GlaxoSmithKline Niere

Sorafenib Bayer/Onyx Niere, Leber

Sunitinib Pfizer Niere, GIST, Pankreas/NET

Temsilorimus Wyeth Niere, Lymphom

Thalidomide Celgene Multiples Myelom

Vandetanib AstraZeneca Schilddrüse

2.1.3 EGF – epidermal growth factor

Der epidermale Wachstumsfaktor (epidermalgrowth factor – EGF) gehört wie c-

erbB-2, C-erbB-3 und c-ErbB-4 in die Familie erbB-Proteine. Es tritt im Zuge der

Mitose als Signalmolekül auf und bindet an den epidermal growth factor receptor,

EGFR-R (auch bezeichnet als ErbB1 oder HER-1) welcher zu den Rezeptor-

Tyrosinkinasen zählt.

Nach Bindung des Liganden und Dimerisierung des Transmembranrezeptors

EGF-R kommt es zur Autophosphorylierung und Signaltransduktion über den MAP-

Kinase-Signalweg, AKT-Signalweg oder das STAT-Protein.

Verschiedene Studien [29, 22] konnten den Zusammenhang zwischen EGF-

Expression und Wachstum der malignen Zellen im HCC zeigen. Die Arbeitsgruppe

Ito et al konnte eine Überexpression des EGF-R im HCC und eine positive

Korrelation zu Krankheitsstadium, Progression und Metastasierung herstellen. [35]

Interessanterweise vermitteln sowohl EGFR als auch VEGFR ihre

Wachstumsregulation über den MAP-Kinase-Weg. [79]

Vorausgehende Studien, die alleinige EGFR bzw. VEGFR-Antagonisten

verwendeten (z.B. Cetuximab [34], Geftinib [33], Bevacizumab [91]) konnten einen

vielversprechenden anti-tumoralen Effekt zeigen.

2.1.4 AEE 788

AEE788 ist ein neuartiger Tyrosinkinaseinhibitor, der sowohl am EGF- als auch am

VEGF –Rezeptor angreift und somit das Tumorwachstum stoppen soll. Des

weiteren inhibiert es den human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), welcher

im HCC jedoch eine untergeordnete Rolle spielt. In vorangehenden Studien konnte

9

der antitumorale Effekt bei oraler Verabreichung im Mausmodell bei anderen

Tumorarten nachgewiesen werden [78], 2008 schließlich auch im HCC humaner

Zelllinien im Nackt-Maus-Modell [56].

2.2 Das Hepatozelluläre Karzinom

2.2.1 Definition

Das hepatozelluläre Karzinom, kurz HCC, ist weltweit die fünfthäufigste

Krebserkrankung mit jährlich steigender Inzidenz. [44]

Es handelt sich hierbei um eine maligne epitheliale Neoplasie der

Leberparenchymzellen.

2.2.2 Epidemiologie

Annähernd 500.000 – 1.000.000 neue Fälle pro Jahr weltweit werden angenommen,

wobei starke regionale Unterschiede in den Inzidenzraten des HCC zu sehen sind.

[5 asmaa] So findet man in den sogenannten Hochinzidenzzonen wie etwa China,

Südostasien oder Afrika 30-120/100.000 Einwohner/Jahr, in Mittelinzidenzzonen wie

etwa Südeuropa 8-25/100.000 und Niedriginzidenzzonen wie den USA und Nord-

sowie Mitteleuropa etwa 1-4 Fälle pro 100.000 Einwohner/Jahr. [67]

Abb.3 Klassifikation in geographische Zonen unterschiedlich hoher Inzidenzraten [61]

Das HCC stellt 65% aller Fälle von Leberkrebs in den USA dar, wobei farbige

Einwohner doppelt so häufig betroffen sind wie Weiße. Asiaten sind doppelt so

häufig betroffen wie afrikanisch stämmige Amerikaner, lateinamerikanische Bürger

wiederum doppelt so häufig wie Kaukasier. [16]

Insgesamt lässt sich in den Industrieländern eine Zunahme der

Leberkrebserkrankungen feststellen, so hat sich die Inzidenzrate zwischen den

Jahren 1976 und 2000 in den Vereinigten Staaten von Amerika verdoppelt. [51]

10

1976 – 1980 lag die Rate der Neuerkrankungen noch bei 1,4 Fällen pro 100.000

Einwohner, 1991 bereits bei 2,4/100.000 Einwohner pro Jahr, zumindest die Hälfte

des Anstiegs wurde durch eine Zunahme der HCV-Infektionen einige Jahrzehnte

zuvor erklärt. [61, 16]

Es bleibt festzuhalten, dass trotz gegenwärtig niedriger Inzidenzraten in der

westlichen Welt die Erkrankungen an primären Leberkrebs steigen und dieser

Anstieg nicht gänzlich erklärt werden kann. Dabei ist das HCC insbesondere in den

westlichen Ländern die Tumorentität mit der größten Steigerung der Inzidenz.

Männer sind ungefähr dreimal so häufig betroffen wie Frauen [16]: Weltweite Registrierung neuer HCC-Fälle pro Jahr [61] Jahr Gesamtzahl Männer Frauen 1990 437408 316300 121100 2000 564300 398364 165972 World health report 2003 714600 504600 210000

Die folgende Abbildung zeigt die altersstandardisierten Inzidenzraten des HCC bei

Männern pro 100000 Einwohner. [5]

Abb.4 Graphische Veranschaulichung der Verteilung der unterschiedlichen Inzidenzzonen

Hinter Lungen-, Magen- und Darmkrebs rangiert der primäre Leberkrebs an Stelle

vier der häufigsten Krebstodesursachen weltweit, auf Platz drei bei Männern und

Platz fünf bei Frauen. [52] Dabei liegt die durchschnittliche Lebenserwartung nach

Diagnosestellung bei ca. acht Monaten. [16]

Die Inzidenz steigt mit zunehmendem Lebensalter und erreicht seinen Höhepunkt

über 65. Allerdings wurde innerhalb der letzten beiden Jahrzehnte ein Trend hin zu

Erkrankung in jüngerem Lebensalter festgestellt. [16]

11

2.2.3 Ätiologie

In etwa 80% der Fälle gründet sich das Leberzellkarzinom auf eine Zirrhose. [25]

Darunter versteht man den Verlust funktionstüchtigen Leberparenchyms, der

histologisch sichtbar wird als Nekrosen, entzündliche Infiltrate, Fibrosierung durch

vermehrte Bildung von Kollagen und extrazellulärer Matrix sowie der Entstehung

sogenannter Regeneratknoten, ein Versuch des bedeutenden Stoffwechselorgans,

seine Funktion wiederherzustellen. Jedoch ist das Stadium der Leberzirrhose im

Gegensatz zur Verfettung oder reinen Fibrose der Leber, irreversibel. [75]

Als Ursache der Leberzirrhose findet man in gängigen Lehrbüchern und Statistiken

den Alkoholabusus mit ca. 50% in den Industrienationen an erster Stelle, gefolgt von

den Virushepatitiden B, C und D mit ca. 45%. Doch wahrscheinlich aufgrund der

besseren Therapiemöglichkeiten der chronischen Hepatitiden und der damit

verbunden längeren Überlebenszeit, in der allerdings auch das

Krebsentstehungsrisiko steigt, findet man vermehrt HBV und HCV Infektionen als

Ursache des HCC in Patienten aus entwickelten Ländern. So zeigt z.B. auch eine

deutsche Studie anhand ihres Patientengutes eine Assoziation mit einer

Virusinfektion in 51,9% der Fälle. [38] Weltweit ist die Hepatitis B Infektion mit 50-

80% aller HCC-Fälle der primäre und wichtigste Risikofaktor. Die Hepatitis C liegt in

10 – 25% einem primären Lebertumor zugrunde, wobei die chronische HCV-

Infektion vor allem in den Industrienationen von Bedeutung ist. [5, 7]

Beide Virushepatitiden können auch ohne Leberzirrhose zu einem HCC führen,

HBV häufiger als HCV. So konnten bestimmte Virusproteine identifiziert werden, wie

z.B. das HBx-Gen, welche ursächlich an der Pathogenese des HCC beteiligt sein

sollen. [41]

Andere wichtige Risikofaktoren für die Entstehung einer Leberzirrhose sind die

Autoimmunhepatitis, die primär biliäre Zirrhose und die primär sklerosierende

Cholangitis, Stoffwechselerkrankungen wie die Hämochromatose, bei der die HCC-

Entwicklung bei ca. 4%/Jahr liegt, der Morbus Wilson, der α1 – Antitrypsinmangel,

die Tyrosinämie Typ 1, die Mukoviszidose, chronische Exposition gegenüber Arsen

oder Nitrosaminen, die kardiale Zirrhose durch chronische Stauung, das Budd-

Chiari-Syndrom und seltener Tropenerkrankungen wie die Bilharziose. Zu erwähnen

ist außerdem der Langzeitmissbrauch androgener Steroide und die Einnahme

östrogenhaltiger Kontrazeptiva. Das größte Risiko der Entwicklung eines HCC aus

einer Zirrhose haben Patienten mit einer Hepatitis B – Infektion, gefolgt von der

Hepatitis C. [18, 26]

12

Das Insulin-Resistenz-Syndrom, welches sich in Fettleibigkeit und Diabetes mellitus

Typ 2 manifestiert, kann über eine Nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) in 5%

der Fälle/Jahr in eine Leberzirrhose münden. [27]

Diabetes Mellitus [13] und Fettleibigkeit [70] konnten in mehreren Studien als

eigenständige Risikofaktoren für die Entwicklung eines primären Leberzellkarzinoms

herausgearbeitet werden. Zu beachten sind hierbei die ständig zunehmenden

Fallzahlen des sogenannten metabolischen Syndroms in der westlichen Welt, auch

bereits bei jungen Patienten, so dass in den kommenden Jahrzehnten eine

zunehmende Anzahl an HCC-Erkrankungen zu erwarten ist.

Die ungleiche geographische Verteilung der internationalen Inzidenzraten des HCC

sind zurückzuführen auf die ungleiche Verteilung der wichtigsten Risikofaktoren, der

Hepatitis B und C Infektion:

Die Seroprävalenz des Hepatitis B – Virus, festgestellt durch Messung des HBsAg

(Hepatitis B – surface- Antigen) liegt in Nordamerika, Nord- und Westeuropa bei

unter 2%, in Asien und unterhalb der Sahara liegendem Afrika bei über 8%.[80]

Bestimmte der bis jetzt bekannten Subtypen des HB-Virus können mit einer

erhöhten Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung eines HCC zugeordnet werden, so

etwa dem Genotyp C. Auch eine simultane HIV-Infektion erhöht das Risiko der

HCC-Entstehung bei HBV positiven Individuen. [5]

Die folgende Grafik veranschaulicht die Unterschiede im Auftreten einer

chronischen HBV- oder HCV-Infektion bei diagnostiziertem HCC: in als entwickelt

geltenden Ländern, hier Japan und die USA, spielt vor allem das HCV neben dem

HCC auf dem Boden einer alkoholischen Leberzirrhose eine Rolle (Daten

entstammen dem Zeitraum von ca. 1970 – 2001): [80]

Abb.5 Simultane HBV bzw. HCV Infektion bei Patienten mit HCC, länderspezifisches Vorkommen [80]

13

In Asien und Afrika kommt ein weiterer, jedoch untergeordneter Risikofaktor hinzu,

das Gift des Pilzes Aspergillus flavus, Aflatoxin B1. [52] Der Schimmelpilz wächst

bevorzugt auf Getreiden und Nüssen im feuchten Klima und sondert sein Mykotoxin

ab, welches so in die Nahrungskette gerät und als stark karzinogen gilt. [30] Das

Toxin soll zu einer spezifischen Mutation im p53-Tumorsupressorgen führen und so

zur Entstehung des HCC beitragen. [5]

Die funktionellen Folgen der Zirrhose sind zunächst die Cholestase, die Entstehung

der portalen Hypertension und derer Konsequenzen, und eine metabolische

Insuffizienz der Leber, welche sich nicht nur in mangelnder „Entgiftungsfunktion“

sondern auch an mangelnder Syntheseleistung des Organs zeigt. Die schwerste

Spätfolge der Leberzirrhose, die Entwicklung eines HCC, trifft etwa 4% der

Patienten pro Jahr.

2.2.4 Prävention und Screening

Zur Prävention der Entstehung des hepatozellulären Karzinoms sollte natürlich die

Vermeidung der bereits aufgeführten Risikofaktoren zählen.

So ließe sich die Infektion mit Hepatitis B vermeiden durch konsequent

durchgeführte Impfung, wie ein Impfprogramm, 1984 in Taiwan eingeführt,

vorbildlich unter Beweis stellt: die Rate HBV-infizierter Kinder sank von 8% auf

0,8%. Auch in Deutschland ist die Impfung aller Kinder sowie als Indikationsimpfung

im Erwachsenenalter, z.B. für medizinisches Personal, durch die STIKO (ständige

Impfkommission des Robert-Koch-Instituts) empfohlen. [68]

Schutz vor dem häufigsten Übertragungsmodus der Hepatitis B kann durch

Verwendung von Kondomen gewährleistet werden, das Bereitstellen von „sauberen“

Injektionsinstrumenten an i.v.-Drogenabhängige und das Screening von

Blutprodukten das Risiko der Hepatitis C-Infektion minimieren. Eine streng

durchgeführte Therapie der Infektionskrankheiten mit Interferon alpha in

Kombination mit anderen antiviralen Mitteln kann das Fortschreiten einer Zirrhose

verhindern.

Alkoholabstinenz bzw. gemäßigter Alkoholgenuss verhinderte eine C2-bedingte

Zirrhose und ihre Folgen, genau wie die Überprüfung von Lebensmittel auf den

Schimmelpilz Aspergillus die Verbreitung seines Toxins verhindert kann.

Verschiedene Studien arbeiten darauf hin, einen Zusammenhang zwischen

diätischen Maßnahmen und der Entstehung des HCC herstellen zu können.

Bezüglich des Konsums von Eiern, Fleisch und anderen tierischen Produkten

konnte allerdings kein Konsens und keine allgemeine Empfehlung gefunden

werden. Dahingegen scheinen Soja-Produkte protektiv zu wirken, sowohl durch die

darin enthaltenen Isoflavone als auch durch einen antagonistischen humoralen

14

Effekt. Der Genuss von Kaffee zeigte in Untersuchungen eine Risikoreduktion von

41% im Gegensatz zu Nicht-Kaffee-Trinkern. [5]

Derzeit wird für Patienten mit Leberzirrhose und erhöhtem Risiko für die Entwicklung

eines HCC die Aufnahme in ein Surveillance-Programm empfohlen. Zu diesem

Kollektiv gehören Patienten mit chronischer Hepatitis B oder C, chronischem

Alkoholabusus, vererbter Hämochromatose und primär biliärer Zirrhose.

Im Rahmen dieser Überwachung sollen sich die Betroffenen alle sechs Monate

einer Lebersonographie, welche mit einer Sensitivität von 65 – 80% und einer

Spezifität von über 90% eine gute Option als Screeningtest darstellt, unterziehen.

Alpha-Fetoprotein (AFP) als alleiniger Test zeigt zu viele falsche Ergebnisse und

wird daher nicht empfohlen. [9]

2.2.5 Diagnostik

Für die Beurteilung des Gesamtbildes ist die anamnestische Abklärung zum Beispiel

der familiären Prädisposition, diätischen, reise- oder suchtbedingten Risikofaktoren

unerlässlich.

Klinische Symptome zeigen sich leider oft erst im Spätstadium, dazu zählen alle

bekannten Zeichen einer Leberinsuffizienz bzw. Zirrhose, wie etwa

Oberbauchdruckschmerz durch Spannung der Leberkapsel, Aszites bei portaler

Hypertension, hepatische Enzephalopathie, Ösophagusvarizenblutungen,

sogenannte Leberhautzeichen wie Spider nävi, Caput medusae, Weißnägel oder

Palmar-/Plantarerythem. [25]

Die Diagnostik des Leberzellkarzinoms schließt sowohl bildgebende Verfahren wie

Ultraschall, Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) und

Angiografie als auch laborchemische Untersuchungen ein.

In der CT nutzt man vor allem kontrastmittelverstärkte Verfahren, wobei das HCC im

Gegensatz zu normalem Leberparenchym bevorzugt in der arteriellen und nicht in

der portalvenösen Phase Kontrastmittel anreichert. Grund hierfür ist die stark

ausgeprägte Vaskularisierung des Tumors.

Die MRT gilt der CT in der Bildgebung des HCC als überlegen. In der T1-

gewichteten Aufnahme stellt sich das Leberzellkarzinom hypointens, in der T2-

Wichtung hyperintens im Vergleich zu normal Leberparenchym dar. Allerdings

zeigen mehrere Arbeiten, dass sich das HCC äußerst variabel darstellt. Eine

diffusions-gewichtete Aufnahme kann eventuell helfen, eine Entscheidung über die

Art der Raumforderung zu urteilen.

Denn besonders die Abgrenzung eines HCC-Knotens in einer zirrhotischen Leber

kann sich schwierig darstellen. [8]

15

Mit dem Alpha-Feto-Protein (AFP), einem embryonalen Tumorantigen, welches

normalerweise von der fetalen Leber gebildet wird, gibt es einen laborchemischen

Parameter zur Erfassung eines HCC, da auch dieses zur Bildung dieses Proteins

fähig ist. AFP werden je nach Bindungskapazität an „ lectin lensculinaris agglutin“

drei Unterformen unterschieden AFP-L1, -L2 und –L3. Dabei gilt die dominierende

Glykoform AFP-L3 als assoziiert mit einer schlechteren Prognose. Allerdings wird

seine Wertigkeit kontrovers diskutiert und nur noch in Zusammenhang mit der

Bildgebung als aussagekräftig betrachtet. Normale Werte liegen bei ca. 15 µg/l.

Physiologisch erhöhte Werte finden sich bei Schwangeren, auch bei viralen

Hepatitiden kann AFP im Serum erhöht sein. Ansteigende Werte über 20 µg/l gelten

als auf ein HCC verdächtig.

Die internationalen Grenzwerte für eine AFP – Erhöhung sind nicht einheitlich und

mehrere Studien in denen die AFP-Bestimmung als Screeningmethode für das HCC

verwendet wurde, zeigten eine Sensitivität zwischen 39 und 64%, eine Spezifität

zwischen 76 und 91% und einen positiv prädiktiven Wert von 9 bis 32%. Manche

Autoren fordern sogar eine Abschaffung der AFP-Bestimmung in der Diagnostik des

HCC. [28, 71, 72]

Aus diesen Gründen versuchen derzeit verschiedene Arbeitsgruppen, einen neuen

Tumormarker zu finden, welcher eine größere Sensitivität zur Früherkennung des

HCC besitzt. [89]

In Deutschland steht derzeit noch keine Leitlinie zum Management des HCC zur

Verfügung. Seit 2009 ist bei der AWMF (Arbeitsgemeinschaft der wissenschaftlichen

Fachgesellschaften e.V.) ein Leitlinienvorhaben zur Erstellung einer S3-Leitlinie

angemeldet.

Die Feinnadelbiopsie gilt als Methode der Wahl zur histologischen Sicherung der

Diagnose. Es gibt zwei Möglichkeiten der Biospie, einmal perkutan, blind oder CT-

bzw. Ultraschall-gesteuert, zum anderen die endoskopisch durchgeführte Biopsie.

Dabei ist die Güte des bioptisch gesicherten Materials immer von vielen Faktoren

abhängig, wie etwa der Größe und Lage der Läsion, der Erfahrung des Operateurs

und natürlich der histopathologischen Auswertung. Die Sensitivität bei gesteuerter

perkutaner Biospie liegt bei ungefähr 90%, die Spezifität bei ca. 100%. Die

endoskopische Biopsie zeigt ähnliche Werte. [82]

Die Amercian Association for the Study of Liver Disease empfiehlt in ihren Leitlinien

die Vergabe der Diagnose „hepatozelluläres Karzinom“ bei Knoten mit einer Größe

über 2 cm, falls diese in der Bildgebung die typische arterielle

Kontrastmittelaufnahme zeigen, bei Knoten zwischen 1 und 2 cm wird die Biopsie

empfohlen, falls nicht zwei verschieden bildgebende Verfahren typische HCC

16

Merkmale aufweisen können. Bei Knoten kleiner einen Zentimeter empfiehlt die

European Association for the Study of Liver eine abwartende Haltung mit 3-

monatigen Kontrollen. Das Risiko einer Stichkanalmetastase ist vor allem bei

Knoten über 2cm erhöht und beträgt nach verschiedenen Studien zwischen 0,0003

– 5%.

Alpha-Feto-Protein muss wegen seiner geringen Sensitivität einen Wert von

400 µg/l überschreiten, um die Diagnose des HCC stützen zu können. [82]

2.2.6 Therapie

Um eine Entscheidung bezüglich der für den Patienten bestmöglichen Therapie

treffen zu können, wurden verschieden Klassifikationssysteme entwickelt.

Die TNM-Klassifikation der Union for International Cancer Control (UICC) bezieht

sich auf das Wachstum des HCC und dessen Ausbreitung und lautet wie folgt: [28]

Tabelle 3 TNM-Klassifikation des HCC

T1 Solitär, ohne Gefäßinvasion

T2 Solitär, mit Gefäßinvasion

T3a Multipel >5cm

T3b Invasion größerer Äste der V.portae oder Vv. hepaticae

T4 Invasion von Nachbarorganen, ausgenommen Gallenblase, Perforation des

viszeralen Peritoneums

N N0=ohne regionäre Lymphknoten-, N1=mit regionären Lymphknotenmetastasen

M M0=keine Fernmetastasen, M1=mit Fernmetastasen

Generell unterscheidet man drei Wachstumsmuster des HCC, solitär, multizentrisch

und diffus inflitrierendes Wachstum. [28]

Ein weiteres, 1985 von Okuda et al eingeführtes System, berücksichtigt außer der

Ausbreitung des Tumors in der Leber auch Serumwerte von Albumin, Bilirubin sowie

das Vorhandensein von Aszites. [57]

Die aktuellste und derzeit weltweit gebräuchliche Klassifikation ist die Barcelona

Clinic Liver Cancer (BCLC) Klassifikation, 1999 entwickelt von Llovet, Brù und Briux.

[45]

Diese Klassifikation berücksichtigt neben der Tumorgröße und – ausbreitung auch

den „performance status“ also den allgemeinen Zustand des Patienten, die

Leberfunktion und dazugehörige Serumparameter und gibt neben der

Phaseneinteilung auch die dazugehörige beste Therapieoption wider.

Insgesamt existieren vier Stadien, durchgängig bezeichnet von A bis D.

17

Tabelle 4 Barcelona Clinic Liver Cancer Klassifikation[45]

Stadium PST

(performance status)

Tumoreigenschaft Okuda-Stadium

Leberfunktionsstaus

A= frühes HCC

A1

0

Einzeln

I

Keine portale Hypertension, normales Bilirubin

A2 0 Einzeln I Portale Hypertension, normales Bilirubin

A3 0 Einzeln I Portale Hypertension, anormales Bilirubin

A4 0 3 Tumoren < 3cm I - II Child-Pugh A - B

B = intermediate HCC

0 Groß, multinodular I - II Child – Pugh A - B

C = advanced HCC

0 1 – 2 Gefäßinvasion oder extrahepatische Ausbreitung

I - II Child – Pugh A - B

D = end-stage HCC

3 - 4 mehrere III Child – Pugh C

Stadium A und B: alle Kriterien sollen erfüllt sein Stadium C: zumindest 1 Kriterium: PST 1-2 oder vaskuläre Infiltration/extrahepatische

Ausbreitung Stadium D: zumindest 1 Kriterium: PST 3-4 oder Okuda III/Child-Pugh C

Der hier erwähnt Child-Pugh-Score bezieht sich auf das Stadium der Leberzirrhose,

auf deren Boden das HCC meist entsteht. Zum allgemeinen Verständnis soll er hier

kurz erwähnt werden: [26]

Tabelle 5 Child-Pugh-Score

1 Punkt 2 Punkte 3 Punkte

Albumin i.S. (g/dl) > 3,5 2,8 – 3,5 < 2,8

Bilirubin i.S. (mg/dl) < 2,0 2,0 – 3,0 > 3,0

Quick (%) > 70 40 - 70 < 40

Aszites (Sono) 0 leicht mittelgradig

Grad der

Enzephalopathie*

0 I - II IIi - IV

* Nach der Einteilung von Trey, Burns und Saunders (1966)

Die Addition der Punkte ergibt das jeweilige Stadium, Child A entspricht 5 – 6, Child

B 7 – 9, Child C 10 – 15 Punkten. Die Stadien korrelieren mit der Prognose, die 5-

Jahres-Überlebens-Rate von Patienten im Stadium A beträgt 44%, während diese

bei Patienten im Stadium C bei 21% liegt.

Grundsätzlich gilt es, zwischen konservativen und invasiven sowie kurativen und

palliativen Therapieansätzen zu unterscheiden.

Im Falle des HCC gilt als bisher einziger kurativer Ansatz die Leberteilresektion bzw.

Transplantation. Geeignet für diese Art der Therapie sind allerdings nur Patienten im

18

BCLC-Stadium 0 und A. Patienten in Stadium B sollten einer transarteriellen

Chemoembolisation zugeführt werden, Patienten in Stadium C profitieren von einer

Therapie mit dem Multikinaseinhibitor Sorafenib. [66]

In der Praxis gebräuchliche Therapiealternativen sind derzeit die perkutane

Ethanolinjektion (PEI) und die Radiofrequenzablation (RF), alle Möglichkeiten

werden später näher erläutert.

Folgender Algorithmus wurde zur Orientierung bei Therapiefindung entwickelt:

Abb.6 Therapiealgorithmus nach der BCLC-Klassifikation [14]

2.2.6.1 Invasive Methoden

Die operative Teilresektion ist Therapie der Wahl bei Leberzellkarzinomen ohne

Leberzirrhose und ausreichender Leberfunktion, wonach etwa 20 – 30% der

Patienten auf diese Weise zu behandeln sind. Bestes Ergebnis zeigen nach

operativer Entfernung Patienten mit monodulärem Tumorknoten kleiner als 5cm mit

einer 5-Jahresüberlebensrate von 57% und einer Rezidivrate von 26%. [16]

Thomas E. Starzl vollzog 1963 die erste Lebertransplantation. Seither gilt die

orthotope Lebertransplantation als theoretisch optimale kurative Methode für

Patienten mit resektablen HCC. 1996 etablierte die Arbeitsgruppe um Vicenzo

Mazzaferro die sogenannten Milan-Kriterien, nach welchen Patienten mit HCC ohne

Leberzirrhose für die orthotope Lebertransplantation (OLT) eingeteilt werden. Nach

4 Jahren Beobachtungszeit ihrer transplantierten Patienten gelangte die Gruppe zu

einer Überlebensrate von 75% und einem rezidivfreiem Überleben von 83% sowie

zu folgender Empfehlung: Transplantation in Patienten mit singulärem Herd ≤ 5 cm

oder maximal drei Herden ≤ 3 cm. [50] Die 5 Jahres-Überlebensrate nach erfolgter

19

Transplantation bei Patienten mit zirrhotischer Leber liegt bei ca. 69%. Viele Zentren

konnten in ihren Studien eine Wiederholbarkeit dieser hervorragenden Ergebnisse

in Patienten mit solitären Knoten von einem Durchmesser von maximal 6,5 cm und

mehreren Knoten von max. 4,5 cm Größe beweisen. Einer Ausdehnung der

Selektionskriterien für eine Transplantation liegt derzeit vor allem der Mangel an

geeigneten Spenderorganen zugrunde. Mazzaferro et al schlagen z.B. eine

Modifikation der Milan-Kriterien im Sinne der „up-to-seven“-Regel vor: Der

Durchmesser des größten Tumors in Zentimetern plus die verbleibende Anzahl an

Tumoren darf dabei maximal sieben ergeben, um noch als Indikation zur

Transplantation gewertet zu werden. [66]

Bewährte lokal interventionelle Verfahren sind die perkutane Ethanolinjektion (PEI)

sowie die Radiofrequenzablation (RFA). So erzielt die PEI in solitären Tumoren

≤ 3cm eine Nekrose von 70-80%, in Tumoren ≤ 2cm sogar eine Nekrose von 100%.

[16] Schlussfolgernd wurde festlegt dass die PEI am besten geeignet ist für Herde <

3cm und einer Anzahl < 3, entsprechend BCLC-Stadium A. [50]

Bei der RFA wird die Ablationselektrode ultraschallgesteuert in den Tumor

eingebracht und durch hochfrequenten Wechselstrom und die dadurch entstehende

Hitze eine Verkochung des Gewebes hervorgerufen. Die RFA ist der PEI in

größeren Herden überlegen, außerdem sind weniger Sitzungen zur Zerstörung des

Herdes notwendig. [16]

Weiterhin zählt zu den Möglichkeiten in der Therapie des HCC die Transarterielle

Chemoembolisation (TACE). Da die Lebertumoren hauptsächlich aus der Arteria

hepatica gespeist werden, während normales Leberparenchym eine duale

Blutversorgung, zu 85% über die Portalvene besitzt, führt ein Verschluss

derselbigen, also auch eine transarterielle pharmakologisch unterstützte

Embolisation, zur Nekrose des Tumors.

Sie kann neoadjuvant, also vor geplanter operativer Resektion, zur Verkleinerung

des Tumors, zur Überbrückung der Wartezeit auf eine Transplantation oder in

palliativer Absicht durchgeführt werden.

Yamada et al. konnten durch dieses Verfahren 1990 in Patienten mit nicht

operablem HCC eine 5-Jahres-Überlebens-Rate von 6% herbeiführen. [85]

Neuere Arbeiten von Arbeitsgruppen wie zum Beispiel Llovet et al, Poon et al oder

Ferrari et al zeigten einen Rückgang der Tumorgröße um 16 bis 61%, sowie eine

Vergrößerung der 1 – Jahres – Überlebensrate um 82%. [66]

Derzeit wird aus der Verwendung der Zytostatika Doxorubicin, Mitomycin oder

Cisplatin (TACE) ein Nutzen für die Versorgung palliativer Fälle gezogen. In einer

20

großangelegten Studie mit 8510 Patienten konnte eine signifikante Verlängerung

der Überlebenszeit nach dieser Behandlung gezeigt werden. [46]

2.2.6.2 Medikamentöse Therapieoptionen

Galt das HCC im fortgeschrittenen Stadium, d.h. Leberzellkarzinom mit Metastasen

oder extrahepatischen Begleiterkrankungen, lange Zeit als nicht effektiv

behandelbar, entstand aufgrund des Erfolgs zielorientierter medikamentöser

Therapie in anderen soliden Tumoren, wie etwa der Behandlung HER2/Neu-

positiven Mamma-Karzinomen mit dem Antikörper Trastuzumab [6] erneut Interesse

an der Erforschung einer medikamentösen Behandlung des HCC.

Derzeit untersuchte Medikamente sind vor allem Inhibitoren der Angiogenese, denn

die Blutversorgung und damit die Neubildung von Gefäßen stellen in dem stark

vaskularisierten Tumor den größten Faktor für sein Wachstum dar und ist somit

geeignetes Ziel der medikamentösen systemischen Therapie. Mehrere Studien

konnten zeigen, dass eine hohe Dichte an Gefäßneubildungen in resezierten

Tumoren mit einer verkürzten Rezidiv-freien-Überlebenszeit einhergeht und ein

hoher Serum-Spiegel an zirkulierendem VEGF für eine schlechtere Prognose

spricht. [81, 65]

Zu den derzeit untersuchten Medikamenten gehören unter anderem Sorafenib,

Sunitinib und Bevacizumab. [64]

Bevacizumab (Avastin®) ist ein monoklonaler humaner Antikörper gegen VEGF,

welcher dessen Bindung an seine Rezeptoren verhindert. Zunächst wurde

Bevacizumab in der Therapie des metastasierten kolorektalen Karzinoms

eingesetzt, in der Behandlung des fortgeschrittenem HCC zeigen Phase II Studien

der Monotherapie mit dem Antikörper ein Ansprechen in 16% der Patienten, das

mediane progressionsfreie Überleben lag bei 6,9 Monaten, die 1-Jahres-

Überlebensquote bei 53%. [74]

So zeigten Zhu et al. in einer Phase II Studie an 33 Patienten im fortgeschrittenem

Stadium, dass die kombinierte zyklische Gabe von Bevacizumab, Gemcitabin sowie

Oxaliplatin, beides Zytostatika, zu einem medianem 6-monatigem

progressionsfreiem Überleben in 48% der Patienten führt. [91]

Das Medikament Nexavar (Sorafenib) inhibiert die Tyrosinkinasen von VEGFR1,

VEGFR2, VEGFR3, FLT3, PDGFRβ, RET und c-KIT. Positive Effekte dieses oralen

Multikinase-Inhibitors wurden in verschieden klinischen Studien gezeigt.

Llovet et al [48] erzielten im „Sorafenib HCC assessment randomized protocol“

(SHARP) in Patienten mit HCC und Child-Pugh-Score A, PST ≤ 2 mit einer zweimal

täglichen Gabe von 400 mg Sorafenib eine signifikante Verlängerung des

21

progressionsfreien Überlebens (5,5 versus 2,8 Monate) und der Überlebenszeit

(10,7 versus 7,9 Monate).

Cheng et al [12]. zeigten ähnliche Ergebnisse (progressionsfreies Überleben 2,8

versus 1,4 Monate sowie Verlängerung der Überlebenszeit 6,5 versus 4,2 Monate).

Allerdings brachen 50% der Patienten aufgrund der toxischen Nebenwirkungen die

Behandlung ab. Dazu zählen dermatologische Effekte wie das Hand-Fuß-Syndrom

und gastrointestinale Beschwerden wie Durchfall und Übelkeit. Durch den Nachweis

der Wirksamkeit von Sorafenib in diesen und weiteren Studien konnte eine neue

Therapieoption des fortgeschrittenen HCC etabliert werden. Allerdings fehlen bisher

Daten zu einer Kombinationstherapie, die einzige Phase II Studie kombiniert

Sorafenib mit Doxorubicin [21].

Sutinib ist ein weiterer Tyrosinkinaseinhibitor, er greift an VEGFR 1-3, PDGFR-α

und PDGFR-β, FLT3, der RET-Kinase und dem „stem cell factor receptor“ (KIT) an.

Präklinische Studien zeigten eine Inhibition der Tyrosinkinasen des VEGF-

Rezeptors und des PDGF-Rezeptors. Zwei Phase-II Studien, in denen die Patienten

jeweils mit 37,5 mg bzw. 50 mg täglich behandelt wurden, zeigten ein medianes

Überleben von 11,2 bzw. 11,6 Monaten, ein progressionsfreies Überleben von 5,2

bzw. 4,1 Monaten. [19, 92]

Cediranib und Vatalanib sind unter anderem ebenfalls gegen die VEGF-Rezeptoren

gerichtet und erzielten in bisherigen Phase I und II Studien wachstumsinhibierende

Effekte. [64]

Gefitinib und Erlotinib sind beide orale EGF-Tyrosinkinaseinhibitoren. Autoren einer

Studie zur Wirkung von Geftinib konnten keinen Vorteil aus der Behandlung mit dem

Tyrosinkinaseinhibitor folgern. [55] Für Erlotinib konnte in Phase II Studien Erfolg in

der Therapie des fortgeschrittenen HCC gezeigt werden. So wurde nach täglicher

Gabe von 150 mg Erlotinib zwar nur geringe Ansprechraten von 6% beobachtet,

allerdings konnten in 50% bzw. 43% der Fälle stabile Verläufe gefunden werden, in

32% bzw. 28% ein progressionsfreies Überleben nach 26 bzw. 24 Wochen. [63, 76]

Eine Studie welche die Kombination von Erlotinib und Bevacizumab beinhaltet, und

somit eine duale Inhibition der VEGF- und EGF-Rezeptoren versucht, erzielte ein

Ansprechen von 25%, das mediane progressionsfreie Überleben lag bei 39

Wochen, die mediane Überlebenszeit bei 68 Wochen. So konnte ein signifikanter

antitumoraler Effekt der Kombination nachgewiesen werden. [76]

Mehrere neue Medikamente, welche ebenfalls Tyrosinkinaseinhibitoren sind,

wurden in den letzten Jahren in der Therapie des HCC getestet.

AZD2171, ein VEGFR, PDGFR und c-kit Inhibitor hat sich in der Behandlung des

Glioblastoms verdient gemacht, allerdings erlitten 84% der Patienten mit

22

fortgeschrittenem HCC, welche in einer Phase II Studie mit AZD2171 behandelt

wurden, Grad 3 Nebenwirkungen [2] Nachdem PTK787, ein weiterer

Multikinaseinhibitor (VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, PDGFR-β, Flt-3 und kit) zu

Tumorapoptoseinduktion und einer verminderten Gefäßausbildung im Mausmodell

führte [42], welche durch die Applikation via TACE noch erhöht werden konnte [87],

wurde 2005 eine Phase I Studie an 18 Patienten mit einer oralen Gabe von täglich

750 mg durchgeführt, bei der bei 9 Patienten eine Stabilisation erreicht werden

konnte [37]

Phase I und Phase II Studien des Multikinaseinhibitors TSU-68, welcher die

Aktivierung von VEGFR-2, PDGFR und FGFR hemmt, wurden an Patienten mit

fortgeschrittenem HCC durchgeführt. In Phase II nahmen 35 Patienten täglich 200

mg TSU-68 ein, ein Patient zeigte ein komplettes, zwei ein teilweises Ansprechen

und 15 Patienten ein stabiles Krankheitsbild, die mediane progressionsfreie Zeit lag

bei 2,1 Monaten, die mediane Überlebenszeit bei 13,1 Monaten. Nebenwirkungen

waren Hypalbuminämie, Diarrhö, Anorexie, abdominaler Schmerz, Übelkeit, Ödeme

und eine Transaminasenerhöhung [36].

In einer Phase II Studie wurden 800 mg Brivanib, ein weiterer VEGF und FGR-

Inhibitor, täglich gegeben. Von den 55 Patienten erreichte ein Patient unter Therapie

eine Vollremission, ein sechs-monatiges progressionsfreies Intervall konnte bei

18,2% der Patienten erreicht werden, die mediane Überlebenszeit lag bei 10

Monaten [60].

Weiterer Angriffspunkt zur systemischen Therapie des HCC ist die extracellular

signal-regulated/mitogen-activated protein kinase kinase (MEK). Selumetinib, ein

Inhibitor der MEK-Tyrosinkinase, wurde in einer Phase II Studie an 19 Patienten mit

fortgeschrittenem HCC zweimal täglich in einer Dosierung von 100 mg ausgegeben.

Die Arbeit zeigt jedoch weder ein Ansprechen auf die Therapie in der Bildgebung,

noch wurde eine verlängerte progressionsfreie Überlebenszeit erreicht. Allerdings

konnte im Western-Blot ein Ansprechen nachgewiesen werden. [59]

Ein weiterer MEK-Inhibitor, PD0325901, konnte bis jetzt positive Ergebnisse in vitro

und im Mausmodell zeigen. [24]

Der PI3K-AKT-Signalweg enthält ein Substrat, welches als mammalian target of

rapamycin bezeichnet wird (mTOR), und das wiederum über andere Proteine an der

Zellzykluskontrolle teilhat. Auch das Antibiotikum Rapamycin und das

Immunsuppressivum Sirolimus führen über eine Inhibition der mTOR-Aktivität zu

einem Wachstumsstopp von Tumoren. Diese und andere mTOR-Inhibitoren finden

sich derzeit in präklinischen Studien zur HCC-Therapie wieder. Eine Phase I/II zu

Everolimus (RAD001), ebenfalls ein mTOR-Inhibitor wurde kürzlich veröffentlicht. In

23

Phase II erhielten 25 Patienten täglich 10 mg, partielle Remission wurde in einem

Patienten erreicht, die mediane progressionsfreie Überlebenszeit lag bei 3,8

Monaten die mittlere Überlebenszeit bei 8,4 Monaten. Nebenwirkungen waren unter

anderem Lymphopenie, Hyponatriämie und Anämie. [90]

Weiterer Angriffspunkt ist der Wnt-Signalweg, der in 40% der hepatozellulären

Karzinome eine Aktivierung zeigt. Präklinische Studien zu Medikamenten, die an

verschieden Proteinen, die Teil des genannten Signalwegs sind, angreifen, zeigen

vielversprechende Erfolge. [83]

Auch die epigenetische Modifikation des Genoms, vor allem Histon-Deacetylase-

Inhibitoren gehören zum Forschungsspektrum in der HCC-Therapie. Ein solcher

Inhibitor, PXD-101, auch als Belinostat bezeichnet, wurde bereits präklinisch

studiert, zeigte dabei eine Apoptoseinduktion und wird derzeit in Phase II Studien

erprobt. [49]

Weiterer Angriffspunkt ist die Inhibition der Telomerase, welche der Verkürzung von

Chromosomen bei Replikation entgegenwirkt und so Tumorzellen hilft, sich quasi

endlos oft teilen zu können. Tierexperimentell konnte in Nacktmäusen dadurch ein

Wachstumsstopp des menschlichen Hepatoms der Zellinien Hep3B und Huh7

gezeigt werden. [15]

2.3 Fragestellung

Kann der duale Tyrosinkinaseinhibitor AEE788 das Wachstum des hepatozellulären

Karzinoms beeinflussen?

Mit zunehmendem Erfolg und Ausweitung der Angiogenesforschung zeigt sich

VEGF (vascular endothelial growth factor) als einer der maßgeblich beteiligten

Einflussgrößen der Entstehung und des Wachstums des hepatozellulären

Karzinoms. Mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ist ein weiterer

wachstumsfördernder Faktor im HCC bekannt. Beide Wachstumsfaktoren binden an

Rezeptoren mit Tyrosinkinaseaktivität und fördern so die Zunahme der

Tumormasse.

Bisher konnten vor allem mit den Multikinaseinhibitoren Sorafenib und Bevacizumab

erfolgversprechende systemische Therapieansätze des HCC gefunden werden [64].

Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirkung des dualen Tyrosinkinaseinhibitors

AEE788 auf die Wachstumsfaktoren EGF und VEGF und deren Rezeptoren. Dafür

wurde im Rattenmodell die Auswirkung nach oraler Gabe von AEE788 auf

Wachstum, Proliferation und Apoptose im Morrishepatom überprüft.

24

3. Material und Methoden

3.1 Material

Chemikalien und Verbrauchsmittel

Tabelle 6 Chemikalien und Verbrauchsmittel

3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) Merck, Darmstadt Chloroform Roth, Karlsruhe Citronensäure-Monohydrat Merck, Darmstadt Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Complete Prot-I)

Roche, Mannheim

DAB Substrate Roche, Mannheim Dexamethason Merck, Darmstadt Desoxyadenosintriphosphat (dATP) Peqlab, Erlangen Desoxycytidintriphosphat (dCTP) Peqlab, Erlangen Desoxyguanosintriphosphat (dGTP) Peqlab, Erlangen Desoxythimidintriphosphat (dTTP) Peqlab, Erlangen Developer G153B AGFA, Mortsel, Belgien Diethyldicarbonat (DEPC) Sigma, Steinheim Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma, Steinheim Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck, Darmstadt DTT 0,1M (Dithiothretiol) Invitrogen, Karlsruhe Dulbecco´s modified eagle medium (DMEM) Biochrom, Berlin Ethanol Merck, Darmstadt Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA) Merck, Darmstadt First Strand Buffer 5x Invitrogen, Karlsruhe Fötales Kälberserum (FCS) Biochrom, Berlin Glycin Serva, Heidelberg Hämalaunlösung Roth, Karlsruhe Insulin Isopropanol Merck, Darmstadt Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck, Darmstadt Kaliumchlorid (KCl) Merck, Darmstadt Luminol AppliChem, Darmstadt Magermilchpulver Heirler Cenovis GmbH, Radolfzell Magnesiumchlorid – Hexahydrat (MgCl2) Merck, Darmstadt Mark12 Unstained Standard (1x) Invitrogen, USA Methanol Roth, Karlsruhe Methyl Green, zinc chloride salt 83% Sigma-Aldrich, USA Natriumchlorid (NaCl) Marck, Darmstadt Natrium-Citrat Calbiochem, USA NONIDET NP-40 Amresco, Ohio, USA NuPAge Antioxidant Invitrogen, USA NuPage LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen, USA NuPage Reducing Agent (10x) Invitrogen, USA NuPage Transfer Buffer (20x) Invitrogen, USA Oligo (dT)-15-Primer Promega, USA Para-Hydroxycoumarinsäure Sigma, Steinheim Penicillin Biochrom, Berlin Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) Sigma, Steinheim

25

Phosphat Buffet Saline (PBS) Biochrom, Berlin Random Primers Invitrogen, USA Rapid Fixer G354 AGFA, Mortsel, Belgien RNase OUT™ Invitrogen, Karlsruhe RNA-Pure Peqlab, Erlangen StreptABComplex/HRP (Streptavidin, Biotinylated Peroxidase)

Dako Cytomation, Dänemark

Streptomycin Biochrom, Berlin Sodium Dodecyl Phosphate (SDS) Sigma, Steinheim SuperScript® II Reverse Transcriptase Invitrogen, USA Tissue Clear Sakura, Niederlande Tris Base Calbiochem, USA Trishydroxymethylaminomethanhydrochlorid (Tris-HCl)

Merck, Darmstadt

Trypsin Biochrom, Berlin Tween 20 Sigma, Steinheim Wasserstoffperoxid (H2O2) Sigma, Steinheim Xylol Roth, Karlsruhe

Antikörper

Tabelle 7 Antikörper

anti-AKT Cell Signaling, Frankfurt a.M. Anti-Beta-Aktin, mouse IgG Sigma, Steinheim Anti-Epidermal-Growth-Factor-Receptor (EGFR) Upstate, New York Anti-MAPK1 (mitogen activated proteine kinase) p44/42

Cell Signaling, Frankfurt a.M.

Anti-mouse Sigma, Steinheim Anti-P-AKT Cell Signaling, Frankfurt a.M. Anti-P-EGFR (Tyr 1068) Cell Signaling, Frankfurt a.M. Anti-P-EGFR (Phosphor S1070) Abcam, Cambridge, U.K. Anti-P-MAPK p42/44 Cell Signaling, Frankfurt a.M. Anti-P-VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor-2) (Tyr 1223)

Millipore, New York

Anti-P-VEGFR2 (phospho Y1054) Abcam, Cambridge, U.K. Anti-rabbit Sigma, Steinheim Anti-Rat-KI-67 Clone MIB-5 Dako Cytomation, Dänemark Anti-VEGFR2 Abcam, Cambridge Anti VEGFR-2 (Flk-1) (C-1158) :sc-504 Santa Cruz, USA

Light-Cycler PCR-Primer

Tabelle 8 Light-Cycler-PCR-Primer

Rn_bax_1SG QuantiTect Primer Assay Qiagen, Hilden Rn _bcl2_1_SG QuantiTect PrimerAssay Qiagen, Hilden Rn_GAPD_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen, Hilden Rn_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen, Hilden Rn_RGD :2543_1_SG QuantiTect Primer Assay

Qiagen, Hilden

Rn_RGD :619991_1_SG QuantiTect Primer Qiagen, Hilden

26

Assay

Verbrauchsmittel

Tabelle 9 Verbrauchsmittel

4-12% Bis-Tris Gel Invitrogen, USA Amersham™Hyperfilm™ECL GE Healthcare, Buckinghamshire, U.K. BD Falcon (15ml, 50ml) BD Biosciences, Erembodegem, Belgien Cryoröhrchen Nalge Nunc International, Dänemark Einbettkassetten Langenbrinck, Emmendingen Einmal-Skapelle, steril Feather, Japan Eppendorf Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg Filterpapier Whatman, England Kunststoffpipettenspitzen Biozym, Hannover Kunststoffpipettenspitzen Eppendorf, Hamburg LightCycler® Capillaries 20µl Roche, Mannheim Menzel-Gläser Superfrost Plus Menzel GmbH, Braunschweig Microtom-Einmalklingen Leica, Wetzlar Nahtmaterial Johnson&Johnson, Neuss Nitrocellulose Transfer Membran Schleicher und Schüll, Dassel Novex Sharp Standard Invitrogen, USA Objektträger Langenbrinck, Emmendingen PP-Test Tubes (15ml und 50 ml) Greiner, Nürtingen Western Blot Papier Schleicher und Schüll, Dassel Zellkulturflaschen (25,75 und 175cm²) Nalge Nunc International, Dänemark FALCON® Pipetten (2ml, 5ml, 10ml, 25ml, 50ml)

Becton Dickison Labware, Franklin Lakes, USA

Fertigkits

Tabelle 10 Fertigkits

Amersham™ECL™ Western Blotting Detection Reagent

GE Healthcare, Buckinghamshire, U.K.

BCA™ Protein Assay Kit Pierce, USA In situ cell death detection POD Roche, Mannheim Light Cycler® FastStart DNA Master SYBR Green 1

Roche, Mannheim

Geräte

Tabelle 11 Geräte

Analysewaage Sartorius, Göttingen Autoklav Systec, Wettenberg Biofuge Heraeus Christ, Osterode Bio-Photometer Eppendorf, Hamburg Blot-Kammer Biometra, Göttingen Clean Bench DLF/BSS 6 Kl IIa Clean Air, USA CO2-Schrank mit Heizluftsterilisation CB210 Binder, Tuttingen Electrophoresis Power Supply EPS 3500 Pharmacia, Freiburg Flowmeter Typ SF2 UNO Roestvaststaal BV, Didam,

Niederlande

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Gefrierschrank -80° Thermoscientific, USA Heizblockthermomixer HLC Haep Labor Consult, Bovenden

Kühlschrank -20° Liebherr, Germany Kühlschrank +4° Liebherr, Germany Magnetrührer Heidolph, Schwabach Megafuge 1.0 R Heraeus Christ, Osterode Microtom Leica, Wetzlar Neubauer Zählkammer Hecht-Assistent, Sondheim PCR-Light Cycler Roche, Mannheim pH-Meter Hanna Instruments, Kehl a. Rhein Picofuge Stratagene, U.K. Pipettierhilfen Eppendorf, Hamburg Präzisionswaage Sartorius, Göttingen PTC-200 Peltier Thermal Cycler BioRad, München Rollmischer Hecht-Assistent, Sondheim Schüttler Janke und Kunkel, Freiburg Shandon Cover-Plates Thermo-Shandon, Frankfurt Sigma Delta Vaporizer Penlon Limited, Abingdon, U.K. Vortexter VF 2 Janke&Kunkel, Freiburg Wasserbad Memmert, Schwabach Xcell SureLock® Mini Cell invitrogen

Substanzen und Medikamente

Tabelle 12 Substanzen und Medikamente

AEE 788 Novartis, Basel, Schweiz Forane, Isoflurane Abbott, Indien Ketanest, Ketamin Pfizer, Berlin Novaminsulfon Ratiopharm, Ulm

Lösungen und Puffer Zellkulturmedium Dulbecco´s MEM 84,5g/l Glucose) 10% Fötales Kälberserum (FCS). 20min bei 56°C inaktiviert 105 U/l Penicillin 100 mg/l Streptomycin 1 mg/l Humaninsulin 0,4 mg/l Dexamethason (Aufbewahrung bei 4°C) 10x Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) pH 7,4 80 g NaCl 2 g KCl 11,5 g Na2HPO4

2,0 g KH2PO4

Ad 1 l Aqua dest. Tris Puffer (TBS) pH 7,4 30,25 g Tris 45 g NaCl Ad 5 l Aqua dest.

28

Citrat-Puffer pH 6,0 2,94 g Natrium-Citrat Ad 1 l Aqua dest. MOPS-Buffer pH 7,7 50 mM MOPS 50 mM Tris Base 0,1% SDS 1 mM EDTA Glycin-Puffer pH=2 3,76 g Glycin Ad 500 ml Aqua dest. ECL (Enhanced Chemiluminescence) Solution A (store at 4° C) 200 ml 0,1M Tris-HCl (pH 8,6) 50 mg Luminol Solution B 11 mg para-Hydroxycoumarinsäure 10 ml DMSO 4 ml Solution A + 1,2 µl H2O2(30%) – 400µl Solution B DEPC-H2O 0,1 % DEPC H2O Jie´s Puffer 10 MM NaCl 0,5% Nonidet NP-40 20 mM Tris-HCl 5 mM MgCl2

10 µg/ml Complete, Prot-I 1 mM PMSF Auffüllen mit Aqua dest. RT-Mix (Reserve Transkriptase Mix) Desoxyribonukleosidtriphosphate-Mix 20 µl 100 mM dATP 20 µl 100 mM dTTP 20 µl 100 mM dGTP 20 µl 100 mM dCTP = 80 µl of 25 mM dNTPs mix 400 µl DTT 800 µl 5x First Strand Buffer Blockierlösung 1x PBS/TBS 4% Magermilch 0,1% Tween Glycin 0,1M 3,75 g Glycin 500 ml H2O

29

Zelllinie MH – 7777A : murine Hepatomzellen (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen

und Zellkulturen, DSMZ, Braunschweis, Deutschland) Tiere Buffalo-Ratten BUF/SimRijHsd Firma Harlan, Niederlande

3.2 Zellkultur

3.2.1 Verwendete Zellen

Bei den für die Tumorinokulation verwendeten Zellen handelt es sich um

Rattenhepatomzellen der Zelllinie mit der Bezeichnung MH – 7777A, welche

ursprünglich aus Lebertumoren der Buffalo-Ratte gewonnen worden waren.

Morris et al induzierten in den 50er und 60er Jahren in weiblichen Buffalo-Ratten

durch Gabe des langwirksamen Karzinogens N-2-Fluoranylphthalamsäure die

Entstehung eines Hepatoms mit möglichst geringer biologischer und biochemischer

Abweichung vom humanen HCC. [53,54]

Die Zellen können nur auf Buffalo-Ratten transplantiert werden und haben eine

Anwachsrate von ca. 90 – 100%.

Bezogen wurden die Zellen über die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig.

Die runden und polymorphen Zellen zeichnen sich durch ein Wachstum in

Monolayern aus und sind laut Herstellerangaben frei von Mycoplasmen und

Reverse Transkriptase negativ.

3.2.2 Kulturbedingungen und Passage

Die MH – 7777A – Zellen wurden im Zellkulturschrank bei 37°C und einem CO2-

Partialdruck von 5% im oben genannten Medium kultiviert. Aufbewahrung im

Kühlschrank bei 4°C.

Nach dem Auftauen der Zellen wurde diese zunächst in Zellkulturflaschen von

25 cm² mit 10 ml Kulturmedium gegeben und bei nahezu 70% Konfluenz, welche

unter dem Lichtmikroskop beurteilt wurde, in größere Kulturflaschen umgesetzt.

Konfluenz war nach ca. 1-3 Tagen erreicht.

Die Passage wurde folgendermaßen durchgeführt:

Nach Absaugen des Kulturmediums wurde die Zellkultur mit 5 ml PBS gespült und

anschließend mit 5 ml Trypsin befeuchtet. Während der nun folgenden Ablösung der

Zellen vom Flaschenboden im Brutschrank erfolgten regelmäßig optische

Verlaufskontrollen. Nach ca. 10 min wurde die Trypsinaktivität durch Zugabe von

Nährmedium gestoppt und die Zellen abzentrifugiert (1200 min-1, 5 min, 4°C).

30

Nachdem der Überstand abpipettiert worden war, konnten die Zellen erneut

ausgesät werden, dies erfolgte zumeist in einem Verhältnis von 1:2 bis 1:5.

3.2.3 Vorbereitung der Zellen zur Inokulation

Um eine konstant große Anzahl an zu inokulierenden Tumorzellen zu erhalten,

mussten die Zellen jeweils ausgezählt und der erwünschten Konzentration

angeglichen werden.

1. Das alte Medium der Zellkultur wurde abgesaugt, die Zellen wie bei der

Passage üblich mit PBS gespült, dann mit 5 ml Trypsin abgelöst.

2. Anschließend wurde dieser Prozess mit 20 ml Medium gestoppt, und der

Zellrasen unter mehrmaligem Wiederaufnehmen der Flüssigkeit abgespült,

sodass man ein Volumen von 25 ml erhielt.

3. Aus der gut durchmischten Lösung entnahm man 10 µl und trug diese in

eine Neubauer-Zählkammer auf.

4. Nach auszählen der Felder ergab sich die Zellanzahl pro 25 ml Lösung

eines Falcons.

5. Die Zellen wurden anschließend abzentrifugiert (1000 U, 10 min) und das

Pellet in 400 µl PBS gelöst

Auf diese Weise wurden jeder Ratte 10 Millionen Zellen in einem Volumen von

200 µl PBS injiziert.

3.3 Tierexperimentelle Arbeiten

Bei den Tieren handelte es sich um den Inzuchtstamm BUF/SimRijHsd bezogen

über die niederländische Zweigstelle von Harlan Laboratories Inc., Indianapolis.

Die männlichen Buffalo-Ratten hatten bei Lieferung ein Gewicht von ca. 200-250 g.

Das Tierversuchsvorhaben Nr. 54-2531.31-23/07 wurde von der zuständigen

Regierungsbehörde im Vorfeld genehmigt.

3.3.1 Tumorinokulation

Die Operation zur Implantation der Tumorzellen verlief wie folgend beschrieben:

1) Die Tiere wurden jeweils einzeln in einen speziellen Käfig gesetzt, an

welchen man die Leitung zur Begasung mit Isofluran anschließen kann.

2) Nachdem die Tiere narkotisiert waren, wurden sie auf den Operationstisch

gelegt und per Saugglocke, welche man über der Schnauze des Tiers

anbrachte, weiterhin mittels Inhalationsanästhetikum in Narkose gehalten.

3) Anschließend erfolgte die Fellrasur am Abdomen.

4) Ein 1-2 cm großer Schnitt links unterhalb des Sternums erlaubte den Zugang

zum linken Leberlappen.

31

5) Nach Sondierung des selbigen wurden den Tieren langsam die Tumorzellen

in einem Volumen von 200 µl injiziert.

6) Anschließend wurde die Wunde per Subkutan- und Kutannaht wieder

verschlossen. (Nahtmaterial: Vicryl Polyglactin 910, Ethicon, Inc., Johnson &

Johnson)

7) Zur Schmerzlinderung wurde dem Trinkwasser der Tiere Novaminsulfon®

zugegeben.

3.3.2 Medikamentengabe

Drei Wochen nach Tumorinokulation wurde den Tieren zwei Mal pro Woche der

Tyrosinkinaseinhibitor AEE788 oral mit Hilfe einer Knopfkanüle verabreicht. Zur

Applikation wurde eine Insulinspritze verwendet, so dass auch kleine Mengen genau

verabreicht werden konnten.

Den Buffalo-Ratten wurden jeweils 50 mg pro kg Körpergewicht appliziert. Im

Beispiel einer 300 g schweren Ratte wären dies somit 15 mg, gelöst in 200 µl einer

Lösung von 10% N-Methyl-pyrrolidone (NMP) und 90% PEG300.

Dies geschah jeweils unmittelbar vor Verwendung des Medikaments.

3.3.3 Verlaufskontrollen

Um das Wachstum des Karzinoms zu überprüfen, sowie vor Medikamentengabe die

Menge des zu applizierenden AEE788 berechnen zu können, wurden die Ratten

zweimal wöchentlich gewogen.

Außerdem wurden sonographische Kontrollen der Tumoren mit Hilfe von Herrn Dr.

Till Wissniowski, Medizinische Klinik I, Universität Erlangen-Nürnberg, durchgeführt.

Auch für die Ultraschalluntersuchungen wurden die Tiere mittels Inhalationsnarkose

(Isofluran) ruhiggestellt. Zur Feststellung der Tumorgröße wurde der Tumor mit Hilfe

der Ultraschalluntersuchung vermessen, jeweils in ihrem größten vertikalen und

horizontalen Durchmesser.

3.3.4 Tötung der Tiere

Hauptkriterium zur Tötung der Tiere war der vor Beginn der Experimente festgelegte

Beobachtungszeitraum von 3 Wochen nach der Tumorinokulation bzw. das

Erreichen von Abbruchkriterium gem. dem Tierschutzgesetz (z.B.

Gewichtsabnahme > 20%). Die Tiere wurden durch CO2-Inhalation getötet und das

Tumorgewebe für weitere Analysen (s.u.) asserviert.

3.4 Western Blot

Der Western Blot, auch als Immunoblot bezeichnet, dient dem Nachweis

verschiedener Proteinfraktionen zu untersuchender Proben.

32

Dabei werden die Proteine zunächst mithilfe der Elektrophorese getrennt um

anschließend auf Nitrocellulose übertragen – geblottet – zu werden.

Mit Hilfe von Antikörpern kann das entsprechende Protein sichtbar gemacht werden.

Zunächst bindet der 1. Antikörper an das nachzuweisende Protein, anschließend

bindet an diesen ein 2. Immunglobulin, welches mit einem Enzym gekoppelt ist, das

sein Substrat in einer chemilumineszenten Reaktion umsetzt und zu einer

Schwärzung des Röntgenfilms führt.

Im Folgenden werden die einzelnen Schritte zur Erstellung eines Westernblots kurz

erläutert.

3.4.1 Proteinextraktion

Die Gewebeproben wurden mit jeweils 500 µl des Extraktionspuffers (Jie´s Puffer)

versetzt. Anschließend wurden die Proben 30 min lang auf Eis gestellt,

zwischenzeitlich 2 – 3-mal gevortext. Weitere 30 min wurde das Material bei

13.000 rpm und bei 4°C im Kühlraum zentrifugiert, danach der Überstand mit den

benötigten Proteinen in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt, das Pellet verworfen.

Bis zur weiteren Verwendung wurden die Proben bei -20°C gelagert.

3.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde der BCA Protein Assay Kit der

Firma PIERCE, Thermo Scientific, USA verwendet. Je 25 µl pro Probe wurden in

eine Mikroplatte pipettiert. Anschließend wurden die zu bestimmenden

Proteinproben aus dem Tumorgewebe 1:25 verdünnt pipettiert, je 1 µl aus der

Proteinisolation und 24 µl Aqua dest. Als nächster Schritt folgte die Zugabe des

BCA Working Reagent, welches zwei Reaktionen zur Quantifizierung benutzt.

Lösung A enthält Kupferionen und führt so zur Biuret-Reaktion, bei der

Peptidbindungen eine Bindung mit zweiwertigen Kupferionen eingehen, so dass ein

Farbumschlag nach blau entsteht. Lösung B enthält Bicinchoninsäure welche mit

einwertigen Kupferionen, die nach Reaktion mit Peptidbindungen aus zweiwertigen

Cu-Ionen hervorgehen, einen violetten Komplex eingeht.

200 µl dieses Working Reagent, in einem Verhältnis von 50 Teilen A und 1 Teil B

wurden nun sowohl zur Standardreihe als auch den zu bestimmenden

Proteinproben zugegeben. Der violette Farbstoff konnte nach einer Inkubationszeit

von 30 min bei 37°C und erneuter Abkühlung auf Raumtemperatur photometrisch

bei einer Wellenlänge von 562 nm quantitativ bestimmt werden.

Anhand der Standardkurve konnte anschließend der Proteingehalt der Proben

berechnet werden.

33

3.4.3 Gelelektrophorese

Für die Gelelektrophorese wurden NuPAGE Novex 4 – 12% Bis-Tris Mini Gele

sowie Puffersysteme der Firma invitrogen: NuPAge Antioxidant, NuPage LDS

Sample Buffer (4x), NuPage Reducing Agent (10x), NuPage Transfer Buffer (20x)

verwendet.

Bei der SDS-Gelelektrophorese wird durch das verwendete Sodiumdodecylsulfat die

Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur der Proteine zerstört, die

Ladungsunterschiede werden weitgehend aufgehoben. In der Gelelektrophorese

folgt schließlich die Auftrennung der Proteine nach ihrer Molekülmasse.

Die Proteinproben wurden vor der Elektrophorese folgendermaßen vorbereitet:

- 13 µl Probe (enthielt je 15 µg Protein, verdünnt mit H2O)

- 2 µl Reducing Agent

- 5 µl LDS Sample Buffer

Dann wurden die Proben für 10 min auf 70°C erhitzt, die Proteine so denaturiert.

Das Gel wurde in die Kammer Xcell SureLock® Mini Cell eingebracht und folgende

Puffer gemischt:

1. 25 ml 20fach MOPS-Puffer und 475 ml Aqua dest.

2. 200 ml aus dieser Lösung mit 500 µl NuPage Antioxidant mischen

Die Lösung aus 2. wurde in die entstandene innere Kammer gefüllt, nach

Überprüfung der Dichtigkeit wurde die verbleibende Lösung aus 1. in die äußere

Kammer gefüllt.

Anschließend wurden die Taschen des Gels mit den Proben befüllt.

In die erste Tasche wurde der Marker MagicMark gegeben, in die folgenden die

jeweiligen Proben. Dann wurde die Kammer mit dem Transformator verbunden und

die Elektrophorese wurde gestartet. (50 min, 200 V, 125 mA)

3.4.4 Transfer auf Nitrocellulosemembran

Für das Blotten, also den Übertrag auf die Nitrocellulosemembran wurde stets ein

neuer Transferbuffer zubereitet:

10 ml enthalten

- 5 ml Transferbuffer 20x

- 100 µl Antioxidant

- 10 ml Methanol

- 84,9 ml Aqua dest.

Die Filterpapiere und die Nitrocellulosemembran wurden darin getränkt und die

Blotkammer anschließend in folgender Reihenfolge bestückt:

- 2 Lagen Filterpapier

34

- Gel

- Nitrocellulosemembran

- 2 Lagen Filterpapier

Geblottet wurde jeweils 30 min mit 200 V und 125 mA.

Schlussendlich wurde die entstandene Membran dreimal für jeweils 10 min in PBS

oder TBS + 0,1% Tween20 gewaschen und über Nacht in 4% Magermilch/PBS oder

TBS/0,1%Tween20 blockiert.

3.4.5 Antikörperinkubation und Röntgenfilmentwicklung

Vor Inkubation mit dem 1. Antikörper wurde die Membran zunächst wie oben

beschrieben blockiert und anschließend dreimal für 10 min mit PBS oder, bei

phosphorylierten Proteinen, mit TBS, gewaschen. Der 1. Antikörper wurde je

nachdem entweder 1:200, 1:500 oder 1:1000 in 5ml PBS oder TBS verdünnt, die

Membran damit auf dem Schüttler eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend wurde die Membran wiederum dreimal 10 min lang mit PBS oder

TBS-Puffer gewaschen.

Der 2.Antikörper wurde 1:1000 verdünnt und anschließend auf die Membran

gegeben und bei Raumtemperatur für eine Stunde belassen. Nachdem die

Membran nochmals dreimalig für 10 Minuten mit entsprechendem Puffer

gewaschen worden war, wurde das Ergebnis mittels Röntgenfilmentwicklung

sichtbar gemacht.

Hierzu wurde die Membran für 2 Minuten mit ECL inkubiert (Amersham™ECL™

Western Blotting Detection Reagent) und anschließend von einer Folie bedeckt in

die Entwicklungskassette gegeben. In der Dunkelkammer wurde anschließend das

Röntgenpapier (Amersham™ Hyperfilm™ECL) auf die Membran gelegt und die

Kassette verschlossen. Je nach Antikörper wurde der Film zwischen 30 Sekunden

und 10 Minuten exponiert und anschließend in einer Filmentwicklungsmaschine

entwickelt.

3.4.6 Antikörperentfernung

Zur Entfernung der Antikörper, dem sogenannten „Stripping“, wurde die Membran

für eine Stunde mit Glycin-Puffer inkubiert, welches anschließend wieder entfernt

wurde (Waschung mit PBS/TBS 3 mal, 10 min).

Bis zur nächsten Verwendung des Blots wurde die Membran über Nacht in 4%

Magermilch/PBS oder TBS/0,1% Tween20 blockiert.

35

3.4.7 Auswertung

Die Auswertung der Western Blots erfolgte mittels Densitometrie, d.h. durch

quantitative Messung der Farbdichte. Normalisiert wurden die Werte anschließend

zu ß-Aktin, welches auf der gleichen Membran ausgewertet wurde. Nach der

Berechnung der Mittelwerte der Expressionsniveaus sowie der dazugehörigen

Standardabweichungen, wurde durch den t-Test, Signifikanz gleich p<0.05,

versucht, signifikante Unterschiede herauszustellen.

3.5 PCR

3.5.1 RNA-Isolation aus Tumorgewebe

Zum Tumorgewebe wurden jeweils 500 µl RNA-Pure zugegeben und mittels des

Tissue-Lysers gemischt und so gelöst. Nach Zugabe von weiteren 200 µl RNA-Pure

wurde gemischt bis eine vollständige Homogenisierung erreicht war, 140 µl

Chloroform zugesetzt und so die RNA-Isolierung begonnen.

Nach Vermengung des Gemischs, bis zur Trübung der Lösung, wurde dieses 5 min

bei Raumtemperatur stehen gelassen, um danach für 20 min zentrifugiert zu werden

(4°C, 13.000 rpm). Anschließend wurde die wässrige Phase in 100 µl Schritten

abpipettiert und 1:1 mit Chloroform vermischt, anschließend erneute Mischung bis

zur Trübung.

Im nächsten Schritt wurde nochmals für 10 min mit 13.000 rpm bei 4°C zentrifugiert,

die so entstandene wässrige Phase abgenommen und in ein neues Eppendorf-

Gefäß überführt, welches bereits 700 µl Isopropanol enthielt. Nach vortexen und

Zentrifugation (20 min, 4°C, 13.000 rpm) wurde die RNA gewaschen, das

überstehende Isopropanol abpipettiert und das verbleibende RNA-Pellet mit 70%

Ethanol (gelöst in DEPCH2O) vermischt, anschließend zentrifugiert (7 min, 4°C,

13.000 rpm).

Der Waschvorgang wurde zwei Mal wiederholt und die RNA anschließend

getrocknet, die dabei durchsichtig wird. Zum Schluss wurde die RNA in 50 µl

DEPCH2O gelöst.

3.5.2 RNA-Konzentrationsbestimmung

Zur Konzentrationsbestimmung per Photometrie wurden jeweils 1 µl Probe mit 99 µl

DEPCH2O verdünnt und bei einer Längenwelle von 230 nm vermessen.

Das erhaltene Ergebnis wurde wegen des Verdünnungsfaktors mit 100 multipliziert

und anschließend berechnet, in wieviel µl Probe sich ein µg RNA befindet.

Der Wert in µl wurde mit DEPCH2O auf 10 µl verdünnt.

36

3.5.3 RNA-Transkripition in cDNA

Es wurden jeweils 1 µg RNA gelöst in 10 µl DEPCH2O transkribiert. Den auf Eis

gestellten Proben wurden jeweils 1µl Oligo-dT-Primer sowie 1 µl Random Primer

zugesetzt. Dieser Ansatz wurde für 10 min auf 70°C erhitzt.

Nach Zugabe von 7 µl RT-Mix und 1 µl RNAse-out wurde für 2 min auf 42°C erhitzt.

Im letzten Lauf wurde 1 µl SuperScriptII zupipettiert und für 1 Stunde auf 42°C

erhitzt.

3.5.4 Light-Cycler PCR

Die PCR wurde mit Hilfe des LightCycler Faststart DNA Master SYBR Green 1 Kits

der Firma Roche durchgeführt. Die Probe, welche als Standard verwendet wurde,

wurde mit H2O zu folgender Konzentrationsreihe verdünnt: unverdünnt, 1:4, 1:8,

1:16, 1:32.

Für den Master-Mix wurden immer 10µl aus dem Gefäß 1a (FastStart Taq-

Polymerase) des Kits in das Gefäß 1b(Ready-to-use Hot Start PCr Reaction Mix)

gegeben.

Je Ansatz wurde folgender Mix benötigt:

- 2µl Master-Mix

- 3,2 µl MgCl2

- 1,83 µl Primer

- 11 µl H2O

Nach dem Pipettieren in spezielle Kapillaren wurde kurz abzentrifugiert und die

Ansätze anschließend in das LightCycler® Carousel-Based System eingegeben und

die Real-Time-PCR gestartet.

3.5.5 Auswertung

Die Analyse der Rohdaten erfolgte mit der GenEx Software. Durch Berechnung der

Mittelwerte der Expressionsniveaus sowie der dazugehörigen

Standardabweichungen. Durch den t-test, Signifikanz gleich p<0.05, wurden

signifikante Ergebnisse von irrelevanten separiert.

3.6 Histologische Verfahren

3.6.1 Anfertigung der Präparate

Die in Paraffin gebetteten Blöcke (Pathologisches Institut, Universität Erlangen-

Nürnberg) wurden mithilfe eines halbautomatischen Mikrotoms in 2 – 3 µm dünne

Schnitte aufgeteilt. Nach überbringen der Schnitte in ein Warmwasserbad wurden

sie manuell auf die Objektträger aufgebracht und zum Trocknen aufgestellt.

37

3.6.2 HE – Färbung

Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurde vom pathologischen Institut der Universität

Erlangen-Nürnberg nach dort üblichem Protokoll durchgeführt.

3.6.3 TUNEL – Färbung

Für die TUNEL – Färbung (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling), welche

zum Nachweis der Apoptose in Zellkernen dient, wurde der In Situ Cell Death

Detection POD Kit von Roche verwendet.

Dabei ermöglicht eine terminale Desoxynukleotidyltransferase die Markierung freier

DNA-Strangbrüche mittels Fluoreszein-markierter dUTP-Moleküle, die sichtbar

gemacht werden können. Obwohl eine unspezifische Mitfärbung von vereinzelten

Nekrosen bei massivem DNA-Abbau nicht ausgeschlossen werden kann, stellt die

TUNEL-Färbung ein hochspezifisches und –sensitives Verfahren zum

Apoptosenachweis dar.

Zunächst wurden die Schnitte wie folgend beschrieben entparaffiniert:

- 30 min Inkubation mit Tissue Clear

- 2 x 5 min Waschung mit Isopropanol

- 10 min waschen mit 96% Ethanol

- 10 min waschen mit 70% Ethanol

- 2 x 5 min Waschung mit Aqua dest.

Danach wurde nach entsprechendem Protokoll gefärbt:

- Inkubation mit Proteinkinase K 30 min bei 37°C

- 2x waschen mit 1xPBS

- Inkubation in Blocking Solution für 10 min bei RT

- 2x waschen mit 1xPBS

- Pro Schnitt auftragen von 50 µl Reaktionslösung, Inkubation unter

Parafilm 60 min bei 37°C

- 3x waschen mit 1xPBS

- Pro Schnitt auftragen von 50 µl POD Konverter, Inkubation 30 min

bei 37°C

- 3x waschen mit 1x PBS

- 50-100 µl DAB Substrat-Lösung für 10 min bei RT

- 3x waschen mit 1xPBS

- Gegenfärbung mit Methylengrün 2,5% für 7 min

- Kurz mit Aqua dest. waschen

- Aufbringen der Deckgläser

38

3.6.4 KI-67-Färbung

Das Antigen KI-67 ist ein Proliferationsmarker. In der histologischen Färbung

werden sich gerade in der Wachstumsphase befindliche Zellen angefärbt.

Die Färbung wurde nach folgendem Protokoll angefertigt:

Entparaffiniert wurde wie unter Punkt 2.6.3 bereits beschrieben.

Anschließend folgte das Kochen der Schnitte in Citratpuffer:

- 1 x 8 min bei 600 Watt

- 1 x 8 min bei 800 Watt

- 20 min abkühlen lassen, danach 3x2 min mit Aqua dest. waschen

Der Peroxidaseblock wurde mit 3% H2O2 durchgeführt. Danach zweimalige Spülung

mit Tris-Puffer.

Die Primärantikörperinkubation verlief folgendermaßen:

- Über 16 h bei 4°C oder 1h bei RT

- Verdünnung 1:200 mit Tris-Puffer

- Für Rattengewebe: ki-67 Klon MIB-5 (Dako)

- Spülen 1x mit Tris-Puffer Brij und 1x mit Tris-Puffer

Die Zweitantikörperinkubation:

- Mit biotinyliertem Brücken-AK Kaninchen anti-Maus für 60 min bei RT

Verdünnung 1:50 mit Tris-Puffer

- Spülen mit Tris-Puffer

Der Streptavidin-Biotin-Komplex (Dako) muss eine halbe Stunde vor Verwendung

nach Protokoll des Kits angefertigt werden und wird 30 min bei RT auf den Schnitten

belassen. Nach Gegenfärbung mit Hämalaunlösung wurden die Schnitte gespült

und die Deckgläser aufgebracht.

3.6.5 VEGF- und VEGFR-Färbung

Die Färbungen mit den Antikörpern gegen den vascular endothelial growth factor

und dessen Rezeptor wurden vom Pathologischen Institut der Universität Erlangen-

Nürnberg durchgeführt.

3.6.6 EGF- und EGFR-Färbung

Die Färbungen mit den Antikörpern gegen den endothelial growth factor und dessen

Rezeptor wurden vom Pathologischen Institut der Universität Erlangen-Nürnberg

durchgeführt.

3.6.7 Auswertung

Die Schnitte wurden analysiert mithilfe eines kombinierten Licht- und

Fluoreszenzmikroskops (Nikon ECLIPSE 80i, Nikon Deutschland). Fotografien

39

wurden mit einer Digitalkamera (DS5-Mc) unter Gebrauch einer Analysesoftware

(NIS software Version 2.2, Nikon Japan) aufgenommen. Mit der

Bearbeitungssoftware Adobe Photoshop 5.5 wurden anschließend Helligkeit und

Kontrast der Aufnahmen angepasst.

Die Quantifizierung der immunhistochemischen Färbungen für KI-67 und TUNEL

erfolgten durch Auszählung der positiv reagierenden Hepatozyten. Daraus wurde

der Anteil im Schnittpräparat in Prozent ermittelt. Als positiv wurden Zellen mit

einem eindeutig stärkeren Signal als das umliegende Gewebe gewertet.

Die Färbungen für die EGFR, VEGFR bzw. P-EGFR und P-VEGFR-Antikörper

wurden semiquantitativ bestimmt, indem der prozentuale Anteil positiven Gewebes

im Schnittpräparat geschätzt wurde. Außerdem wurde die Intensität mit einem Wert

zwischen 1 und 3 bestimmt. Die Multiplikation der beiden Werte stellt dann den

Ausprägungsgrad der Färbung am jeweiligen Schnitt dar.

Durch die statistische Auswertung mittels des zweiseitigen t-test auf Mittelwert für

normalverteilte Werte, Signifikanz gleich p < 0.05, wurden signifikante Ergebnisse

von irrelevanten separiert. Die signifikanten Ergebnisse sind in den graphischen

Darstellungen mit * markiert.

40

4. Ergebnisse

Die vorliegende Arbeit untersucht die Wirkung des dualen Tyrosinkinaseinhibitors

AEE788 im Rattenmodell. Hierzu wurden wie oben ausführlich beschrieben,

zunächst Tumoren der Morris-Hepatom Zelllinie in Buffaloratten transplantiert und

nach erfolgter oraler Verabreichung des Medikaments das Tumorgewebe zu

Untersuchungen entnommen. Zur Auswertung des Materials wurden verschiedene

Methoden angewandt, darunter sonographische Überprüfung des

Tumorwachstums, laborchemische Verfahren wie der Western Blot, die PCR und

histologische Färbungen. Alle Analysetechniken wurden mit dem Ziel eingesetzt, die

Arbeitshypothese zu überprüfen, welche besagt, dass die Behandlung mit AEE788

zu einem signifikanten Unterschied im Tumorwachstum im Vergleich zu

unbehandelten Stichproben führt.

Im Folgenden soll dargelegt werden, inwiefern dieses Vorhaben umgesetzt werden

konnte.

4.1 Sonographischer Wachstumsverlauf

Nach einer Behandlungsdauer von drei Wochen wurde die Tumorgröße der

behandelten und unbehandelten Tiere sonografisch transversal in Millimetern

vermessen. Dabei ergab sich ein signifikanter Unterschied (p < 0,05) zwischen den

beiden Gruppen, bei einem Mittelwert von 25,44 mm (SEM 5,01) in der

unbehandelten und 11,21 mm (SEM 0,95) in der Gruppe mit durch AEE788

behandelten Hepatomen.

Abb.7 Beispiel einer repräsentativen unbehandelten Kontrolle

Links ist eine Ultraschallaufnahme mit Vermessung des Tumors zu sehen, rechts der makroskopische

Befund nach Tumorentnahme

41

Abb.8 Beispiel eines repräsentativen mit AEE788 behandelten Tieres

Links ist eine Ultraschallaufnahme mit Vermessung des Tumors zu sehen, rechts der makroskopische

Befund nach Tumorentnahme

4.2 Western Blot

Im Western Blot wurde die Expression der Mitogen-aktivierten-Proteinkinase, kurz

MAPK, und ihrer phosphorylierten, aktivierten Form, sowie der Proteinkinase B, kurz

als AKT bezeichnet, ausgewertet. Standardisiert wurden die Ergebnisse zu ß-Aktin.

Beide Kinasen finden sich im Signalweg sowohl des VEGF- als auch des EGF-

Rezeptors. Die jeweils phosphorylierte Form der Kinasen ist dabei die aktivierte,

signalübertragende.

In der Darstellung der Blots finden sich mit 7 – 11 die Kontrollen, mit den Ziffern

12 – 16 die behandelten Tiere bezeichnet. Unter der jeweiligen Spur ist das

Ergebnis der densitometrischen Auswertung aufgeführt, normalisiert zum jeweils

darunter stehenden ß-Aktin-Blot.

Während das Signalmolekül MAPK (1:1000) konstant gleich in der Kontrollgruppe

und der Gruppe behandelter Tiere zu detektieren war, fand sich ein Unterschied in

der Expression der phosphorylierten Isoformen (1:1000). So kann man die im

Western Blot gezeigte Expression der p-MAPK in den Kontrolltieren 7, 10 und 11 als

stärker interpretieren, im Vergleich zu der Gruppe behandelter Tiere.

Auch die P-AKT war in den behandelten Tumoren im Vergleich zu den

Unbehandelten vermindert detektierbar.

42

Diese auf den ersten Blick sichtbaren Unterschiede werden unterstützt durch die

densitometrische Auswertung. Demnach kann ein Trend hin zu verringerter

Expression der P-MAPK und auch der P-AKT festgestellt werden, wie nachfolgende

Abbildung zeigt:

Abb.10 Densitometrische Auswertung des Western Blot

Die Abbildung zeigt die unterschiedlich starke Expression der untersuchten Signalmoleküle MAPK, P-

MAPK, AKT und P-AKT, jeweils in unbehandelten und behandelten Tumoren.

Signifikante Werte erbrachte das Western-Blotting nicht, doch auch der statistische

Vergleich des Verhältnisses der jeweils inaktiven und aktivierten Form der

Signalmoleküle (Abb.10) zeigt einen Trend hin zur verminderter Aktivität der

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

MAPK P-MAPK AKT P-AKT

no

rma

lisi

ert

e E

xp

ress

ion

Kontrolltiere

AEE788

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

MAPK

1,20 1,47 2,23 0,98 0,65 0,72 0,54 2,12 1,39 1,28

P-MAPK

0,93 0,19 0,28 0,69 0,26 0,81 0,13 0,15 0,09 0,16

ß-Aktin

AKT

1,33 0,75 1,24 0 0 0 0,19 0,88 0,96 0,16

P-AKT

0,98 0,56 2,38 1,85 0,88 2,44 0,37 0,27 0,29 0,07

ß-Aktin

Abb.9 Darstellung der Western Blots

43

Signalwege in mit AEE788 behandelten Tumoren, und somit eine Bestätigung der

Arbeitshypothese.

Abb.11 Vergleichende Darstellung des Verhältnisses P-MAPK/MAPK und P-AKT/AKT

Die statistische Auswertung bestätigt einen Trend zu verminderter Aktivität der Signalwege in den

behandelten Tumoren im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen.

4.3 Immunhistochemie

4.3.1 KI-67 Färbung

Die Auszählung der positiven Zellkerne der Schnittpräparate der 5 Kontrollen ergab

einen Mittelwert an positivem Signal von 52,99% mit einer SEM von 6,7%.

Bei den mit AEE788 behandelten Tumoren ergab sich für die 5 Präparate ein

Mittelwert von positiven Zellkernen von 25,47% mit einer SEM von 8,4%.

Das KI67-Antigen ist ein Proliferationsmarker, d.h. es färbt sich die

Wachstumsfraktion im Gewebe an, und gibt so Aufschluss über die

Wachstumsgeschwindigkeit eines Tumors. Dies bedeutet, dass eine verringerte

Anzahl positiver Zellkerne eine verminderte Proliferation des untersuchten Materials

angibt. Im vorliegenden Fall ist also eine geringer ausgeprägte Anfärbung in mit

AEE788 behandeltem Tumorgewebe wünschenswert, deutet es doch auf ein

vermindertes Tumorwachstum hin.

Und tatsächlich konnten signifikant weniger positive Zellkerne in mit AEE788

behandelten Tumorzellen als in unbehandelten (p < 0,01) nachgewiesen werden.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

P-MAPK/MAPK P-AKT/AKT

Kontrolltiere

AEE78

44

Abb.12 Graphische Auswertung KI67-Färbung

*p<0,01 vs. Kontrolle

Abb.13 KI67-Färbung, 20x Vergrößerung

Die linke Abbildung zeigt einen repräsentativen Ausschnitt eines mit AEE788 behandelten Tumors, die

rechte einer unbehandelten Kontrolle

4.3.2 TUNEL-Färbung

Die Bestimmung der positiven Zellen in der TUNEL-Färbung der Schnittpräparate

der unbehandelten 5 Kontrollen ergab einen prozentualen Anteil von 7,3% mit einer

SEM von 1,8%. Die Auszählung der signalstarken Zellkerne in den Präparaten der

mit AEE788 behandelten Tumoren ergab einen Anteil von 10,3% mit einer SEM von

3%.

Die TUNEL-Färbung dient der Apoptosedetektion. D.h. im vorliegenden Falle wäre

in dieser Färbung eine signifikant stärkere Anfärbung in mit AEE788

vorbehandeltem Material wünschenswert, jedoch konnte kein signifikanter

Unterschied gezeigt werden.

0

10

20

30

40

50

60

70

% K

i67

po

siti

ve Z

ellk

ern

e

Kontrolle

AEE788*

45

Abb.14 Graphische Auswertung TUNEL-Färbung

Abb.15 TUNEL-Färbung, 20x Vergrößerung

Die linke Abbildung zeigt einen repräsentativen Ausschnitt eines mit AEE788 behandelten Tumors, die

rechte einer unbehandelten Kontrolle

4.3.3 Färbung des EGF- und des VEGF-Rezeptors

Wie bereits erwähnt, wurden die Präparate mit den Färbungen für die EGFR,

VEGFR bzw. P-EGFR und P-VEGFR-Antikörper semiquantitativ bestimmt. Der

prozentuale Anteil positiven Gewebes im Schnittpräparat wurde geschätzt,

anschließend die Intensität mit einem Wert zwischen 1 und 3 bestimmt. Die

Multiplikation der beiden Werte stellt dann den Ausprägungsgrad der Färbung am

jeweiligen Schnitt dar.

Die semiquantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbungen des EGF-

und des VEGF-Rezeptors ergaben folgende Ergebnisse:

Mit 93 wurde die positive Anfärbung des Gewebes der unbehandelten Kontrollen in

der EGFR-Färbung (SEM 8,86) bewertet, die der mit AEE 788 Behandelten mit 63

(SEM 8,34). Die VEGFR-Färbung resultierte mit 53 Punkten des unbehandelten

0

2

4

6

8

10

12

14

16

%TU

NE

L-p

osi

tive

r Ze

llke

rne

Kontrolle

AEE788

46

Gewebes positiv (SEM 8,57), die des unbehandelten Gewebes reagierten ebenfalls

positiv und wurde mit 37 bewertet (SEM 6,55).

Wünschenswerter und hier hinterfragter Effekt des Tyrosinkinaseinhibitor AEE 788

ist die Inhibition sowohl des VEGF als auch des EGF Rezeptors. Eine signifikant

geringere Anfärbung der Rezeptoren in der Immunhistochemie gäbe einen positiven

Nachweis dieser Wirkung.

Die vorliegende Arbeit konnte signifikante Unterschiede im Sinne der

Arbeitshypothese erbringen (p < 0,1 für EGFR-Färbung, p < 0,2 für VEGFR-

Färbung).

Abb.16 Graphische Auswertung EGFR-Färbung

*p<0,1 vs. Kontrolle

Abb.17 Graphische Auswertung VEGFR-Färbung

*p<0,2 vs Kontrolle

0

20

40

60

80

100

120

Pu

nkt

we

rt E

GFR

-p

osi

tive

r Ze

llen

Kontrolle

AEE788

*

0

10

20

30

40

50

60

70

Pu

nkt

we

rt V

EG

FR-p

osi

tive

r Ze

llen

Kontrolle

AEE 788

*

47

4.3.4 Färbung der phosphorylierten EGF- und VEGF-Rezeptoren

Die Bestimmung der positiv gefärbten Flächenanteile und ihrer Intensität für den

phosphorylierten, somit aktiven EGF-Rezeptor ergab folgende Werte:

Im Mittel ergab die semiquantitative Bestimmung einen Wert von 63 positiv gefärbter

Fläche (SEM 7,04) sowie 32,5 bei der Bestimmung der mit AEE788 behandelten

Schnitte (SEM 3).

Der Vergleich dieser Werte zeigt einen hochsignifikanten Unterschied (p < 0,01) und

bedeuten wohl eine Herabregulierung der aktiven Form des epidermal growth factor

receptors in denen mit dem Tyrosinkinaseinhibitor behandelten Tumoren.

Für den phosphorylierten VEGF-Rezeptor wurden folgende Werte ermittelt:

Mittelwert in der Kontrollgruppe war 118,5 (SEM 9,37), in der behandelten Gruppe

72 (SEM 9,37). Da auch dieser Unterschied als hochsignifikant (p < 0,01) ermittelt

wurde, zeigt sich, dass auch der P-VEGFR in mit AEE788 behandelten Tumor

deutlich weniger exprimiert wird als in der unbehandelten Kontrollgruppe.

Beide Werte sprechen für eine Bestätigung der Hypothese, dass AEE788 Angriff an

den Rezeptoren von EGF und VEGF im Morrishepatom nimmt. Sowohl die

unphosphorylierte als auch die aktivierten Formen der Rezeptoren der

Wachstumsfaktoren zeigten eine geringergradige Ausprägung in behandeltem

Tumorgewebe.

Abb.18 Graphische Auswertung P-EGFR-Färbung

*p<0,01 vs Kontrolle

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Pu

nkt

we

rt P

-EG

FR-p

osi

tive

r Ze

llen

Kontrolle

AEE788*

48

Abb.19 Graphische Auswertung P-VEGFR-Färbung

*p<0,01 vs Kontrolle

Abb.20 VEGFR-Färbung, 20x Vergrößerung

Die linke Abbildung zeigt einen repräsentativen Ausschnitt eines mit AEE788 behandelten Tumors, die

rechte einer unbehandelten Kontrolle

Abb.21 EGFR-Färbung, 20x Vergrößerung

Die linke Abbildung zeigt einen repräsentativen Ausschnitt eines mit AEE788 behandelten Tumors, die

rechte einer unbehandelten Kontrolle

0

20

40

60

80

100

120

140

Pu

nkt

we

rt P

-VE

GFR

-po

siti

ver

Zelle

n

Kontrolle

AEE 788

*

49

Abb.22 P-VEGFR-Färbung, 20x Vergrößerung

Die linke Abbildung zeigt einen repräsentativen Ausschnitt eines mit AEE788 behandelten Tumors, die

rechte einer unbehandelten Kontrolle

Abb.23 P-EGFR-Färbung, 20x Vergrößerung

Die linke Abbildung zeigt einen repräsentativen Ausschnitt eines mit AEE788 behandelten Tumors, die

rechte einer unbehandelten Kontrolle

4.4 Light-Cycler® PCR

In der PCR im Light Cycler® Verfahren wurden folgende Proteine untersucht: Das

humane vascular endothelial growth factor – A – Protein (VEGF-A), das endothelial

growth factor-receptor-Protein (EGFR), das kinase insert domain receptor – Protein

(KDR), welches einen der beiden Rezeptoren für VEGF darstellt, die

Glyceraldehyddehydrogenase (GAPDH), das BCL2-assoziierte-X-Protein (bax),

sowie Bcl-2.

Bcl-2 sowie das bax-Protein spielen eine Rolle beim programmierten Zelltod, der

Apoptose. Bekanntermaßen gibt es zwei Wege, den extrinsischen und den

intrinsischen, mitochondrialen, Weg der Apoptose.

Bax und Bcl-2, beide Mitglieder der Bcl-2-Familie, finden sich beim intrinsischen

Weg wieder. Hierbei wird das Mitochondrium durch verschiedene Proteine, sog.

Pro-apoptotische, wie z.B. bax, zur Ausschüttung von Cytochrom c angeregt. Auf

dem weiteren Weg findet man die Aktivierung der Zelle zum programmierten Tod.

Bcl-2 hingegen gehört zu den anti-apoptotischen Proteinen. [14 Debra]

50

Eine Unterstützung der Arbeitshypothese würde nach folgenden Ergebnissen

verlangen: Verminderte Expression von VEGF-A, EGFR und KDR würden die

Vermutung, dass AEE788 zu einer Beeinflussung dieser Wachstumsfaktoren und

ihrer Signalweitergabe führt, unterstützen. Inwieweit die Abläufe der Apoptose

involviert sind, sollte Expression von bax und Bcl-2 zeigen. Erhöhte bax und

verringerte Bcl-2 Werte im Tumorgewebe würden für eine Apoptoseinduktion

sprechen.

Die Auswertung der Daten der behandelten und unbehandelten Tiere führten zu

folgendem Ergebnis.

Abb.24 Graphische Auswertung der PCR

*p<0,05 vs Kontrolle

Ein signifikanter Unterschied ergibt sich hierbei nur bei der Expression des BCL2-

Proteins (p<0,05), mit deutlich geringerem Wert in der behandelten Gruppe, was für

einen Anstoß Richtung Apoptoseinduktion durch AEE788 gedeutet werden kann.

Zwar zeigt sich eine wünschenswert geringer ausgeprägte Expression von VEGF

und EGF-Rezeptor in den behandelten Tieren, allerdings nicht signifikant. Auch die

Apoptose scheint nach Ergebnissen der PCR nicht positiv durch die Behandlung

beeinflusst zu werden.

-2

0

2

4

6

8

10

BAX BCL2 VEGF VEGFR EGFR

Kontrolle

AEE788

*

51

5. Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des dualen Tyrosinkinaseinhibitors

AEE788 bei oraler Applikation auf das Morrishepatom der Zelllinie MH-7777 bei

männlichen Buffalo-Ratten untersucht.

Das hepatozelluläre Karzinom gilt weltweit als fünfthäufigste Todesursache und

erweckt somit großes Interesse in der medizinischen und pharmakologischen

Forschung. Es ist bereits bekannt, dass das HCC zu den hochvaskularisierten

Tumoren des Menschen zählt und die Beeinflussung der

Wachstumsfaktorrezeptoren, welche am Gefässwachstum beteiligt sind, einen

Ansatzpunkt zur Therapie darstellen [9, 12, 47, 55, 89, 90]

Dieser Arbeit lag die Hypothese zugrunde, dass bei oraler Applikation des

Tyrosinkinaseinhibitors AEE788 sowohl die Aktivierung des EGF- als auch des

VEGF-Rezeptors vermindert und somit auch deren schlussendlicher Effekt, das

Tumorwachstum selbst, negativ beeinflusst werden können.

Die Arbeitsgruppe Ocker et al konnte im Maus-Modell einen solchen Effekt bereits

nachweisen. [56] Dabei untersuchte man sowohl die in vitro Wirkung von AEE788 in

der menschlichen Zelllinie HepG2 und der Zelllinie Heb3B, als auch den in vivo

Einfluss im Nacktmaus-Modell. Die Studie konnte eine Reduktion der

Proliferationsrate der Zellen und die Apoptoseinduktion nach Applikation des

Tyrosinkinaseinhibitors nachweisen.

In den Zellkulturen konnte nach einer Applikation von 10 µM AEE788 oder mehr

eine Apoptoseinduktion in den Zellen beobachtet werden. Die Auswertung des

Western-Blottings zeigte eine Reduktion der Expression der phosphorylierten, also

aktivierten, Form des EGF-Rezeptors und von EGF selbst, während VEGF und sein

Rezeptor unverändert im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen nachweisbar

waren. Die weiterführenden Signalwege der MAPK und der AKT wurden ebenfalls

untersucht, hierbei zeigte sich eine Suppression der P-MAPK und der p-AKT, die

Expression der inaktivierten Formen der Kinasen wurden durch die Behandlung

nicht verändert.

Im in vivo Versuch wurde männlichen Nacktmäusen ein HepG2-Heterotransplantat

subkutan beigebracht, anschließend wurden sie mit 50 mg/kg AEE788 dreimal

wöchentlich peroral behandelt, nachdem der Tumor eine Größe von 7mm im

Durchmesser erreicht hatte. Es zeigte sich ein signifikanter Unterschied im

Tumorwachstum zwischen behandelten und unbehandelten Tieren: die mittlere

Fläche betrug im Durchschnitt 59,6mm² bei den Kontrolltieren im Vergleich zu

13,2mm² bei behandelten Mäusen. Die immunhistologische Färbung mit dem Meca-

32-Antikörper, welcher gegen Endothelzellen in der Maus gerichtet ist, zeigte eine

52

signifikant verringerte Vaskularisierung in mit AEE788 behandelten Tieren. Auch

konnte eine verringerte Proliferationsrate, eine verminderte Expression von EGFR

und eine erhöhte Apoptoserate in der Immunhistochemie nachgewiesen werden.

Eine Down-Regulation des MAPK-Signalweges konnte auch im Mausmodell

nachgewiesen werden.

Die soeben kurz beschriebene Studie liegt dieser Arbeit und ihrer Arbeitshypothese

zugrunde. Um die Ergebnisse zu reproduzieren und anschließend eventuell andere

Applikationswege für AEE788 finden zu können, wurde AEE788 oral im

Homotransplantat der Zelllinie MH-7777 im Ratten-Modell verabreicht.

Den Buffalo-Ratten wurden Zellen der Linie MH-7777A orthotop in die Leber injiziert

und nach drei Wochen mit 50 mg/kg Körpergewicht zweimal wöchentlich für 21

Tage peroral behandelt. Makroskopisch zeigte sich ein signifikanter Unterschied im

mittleren Tumordurchmesser, 11,21 mm im Gegensatz zu 25,44 mm in der

Kontrollgruppe. Im Western-Blot konnte eine verminderte Expression der aktivierten

MAPK (P-MAPK) nachgewiesen werden, wohingegen alle anderen untersuchten

Proteine unverändert im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle nachzuweisen

waren. Die immunhistologische Färbung mit dem Proliferationsmarker KI-67 zeigte

eine signifikante Abnahme der Proliferationsrate in behandelten Tieren, jedoch

konnte mittels TUNEL-Färbung kein signifikanter Unterschied in der Apoptosrate

nachgewiesen werden. Sowohl EGFR, P-EGFR, VEGF und P-VEGF zeigten eine

signifikant geringere Expression in der immunhistochemischen Färbung. Die PCR

zeigte eine signifikant verminderte Expression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2

in der behandelten Gruppe.

So kann die vorliegende Arbeit also einen Teil der bereits gewonnen Erkenntnisse

aus der Studie von Ocker et al [56] bestätigen bzw. wiederholen: beide Arbeiten

zeigen ein vermindertes Tumorwachstum nach Behandlung mit AEE788 und in

beiden Experimenten konnte eine verringerte Proliferationsrate, eine verminderte

aktivierte MAPK und eine verringerte Expression des EGF-Rezeptors gezeigt

werden.

Llovet et al [43] verwendeten AEE788 ebenfalls tierexperimentell im Nacktmaus-

Modell. Sie implantierten je Maus 5x106 Zellen der menschlichen Linie Huh7.

Anschließend wurden Gruppen von je 9 bzw. 7 Tieren ein Placebo, AEE788,

RAD001(Everolimus) oder eine Kombination aus beiden Medikamenten oral

verabreicht. Die mit AEE788 behandelten Tumoren zeigten sowohl eine signifikante

Wachstumshemmung, als auch eine Verlängerung der Überlebenszeit, verglichen

mit der Placebo-Gruppe. Die immunhistochemische Auswertung zeigte außerdem

einen signifikanten Anstieg der Apoptoserate in der mit dem Tyrosinkinaseinhibitor

53

behandelten Gruppe. Auch eine Abnahme der immunhistochemischen Reaktivität

von p-EGFR in behandelten Tumoren konnte nachgewiesen werden.

Beide Arbeiten, sowohl die vorliegende als auch die Studie von Llovet et al,

kommen zu dem Ergebnis, dass die Gabe von AEE788 das Tumorwachstum hemmt

und weisen eine signifikante Abnahme der Expression des aktivierten EGF-

Rezeptors nach.

Auch in anderen Tumoren kommen Forschungsarbeiten zu AEE788 zu einem

ähnlichen Ergebnis. So konnte zum Beispiel in Schilddrüsenkarzinomzellen eine

Apoptoseinduktion und Proliferationshemmung gezeigt werden. Auch hier wurde

eine verminderte Expression von P-EGFR, P-VEGFR, P-AKT und P-MAPK als

Grund für das verminderte Wachstum gefunden. [31]

Die vorliegende tierexperimentelle Arbeit belegt also eine Wachstumshemmung

durch AEE788 in der Ratten-Hepatomzellinie MH-7777 nach oraler Applikation..

Die Wachstumsverzögerung scheint durch eine Aktivitätsminderung im MAPK-

Signalweg vermittelt zu werden, worauf man aus der vermindert P-MAPK-

Expression schließen kann, wie z.B. auch in der Arbeit von Ocker et al [56] gezeigt

wurde. Dass sich eine Abnahme der Expression der p-AKT und p-MAPK nicht

eindeutig feststellen lässt, kann durch mehrere Umstände begründet sein:

Mögliche technische Fehler wurden bereits während der Analysearbeit vermutet.

Aus diesem Grund wurden das Blotting und die PCR nach Überprüfung und

Kontrolle der einzelnen Arbeitsschritte erneut durchgeführt. Da sich jedoch auch

durch mehrmalige Wiederholungen der Westernblots inklusive vorausgehender

Proteinextraktion und Konzentrationsbestimmung, sowie der PCR inklusive RNA-

Gewinnung, keine eindeutigen Ergebnisse zeigen ließen, konnte die fehlerhafte

Durchführung der Analyse als Fehlerquelle ausgeschlossen werden.

Die vorliegende Arbeit berücksichtigt in ihrer Auswertung alle wichtigen Schaltstellen

der durch die Wachstumsfaktoren EGF und VEGF verwendeten

Signaltransduktionsmechanismen, d.h. die MAPK und die AKT. Darüber hinaus

wurde in der PCR versucht, eine mögliche Apoptoseinduktion nachzuweisen.

Eventuell hätten andere Schlüsselstellen, wie etwa die mTOR berücksichtigt werden

müssen, um ein noch klareres Ergebnis herauszustellen.

Beim Vergleich mit den Arbeiten der oben genannten Arbeitsgruppen muss

außerdem bedacht werden, dass zwischen den Studien bedeutende Unterschiede

in der Durchführung bestehen. Zwar wurde das gleiche Medikament verabreicht,

jedoch unter unterschiedlichen Bedingungen: Sowohl Ocker et al [56], als auch

Llovet et al [43], verwendeten männliche Nacktmäuse. Bei diesen Tieren handelt es

sich um immundefiziente Lebewesen, wohingegen die in dieser Arbeit verwendeten

54

Buffalo-Ratten immunkompetente Tiere sind. Den Ratten wurde das

Tumortransplantat orthotop in die Leber gesetzt, den Mäusen wurden die

Tumorzellen subkutan in die Flanken injiziert. Diese beiden Tatsachen sprechen für

ein wesentlich komplexeres System in den hier verwendeten Ratten, sodass ein

Vergleich zwischen den Arbeiten erschwert ist.

Zu berücksichtigen bleibt auch die Anzahl der Versuchstiere. Durch die kleine

Gruppengröße von jeweils fünf Tieren wird das Erbringen signifikanter Werte

erschwert, denn „Ausreißer“ verzerren sofort das Bild.

Festzuhalten bleibt also der Nachweis einer eindeutigen Proliferationshemmung

durch AEE788, welche möglicherweise durch eine Inhibition der Aktivierung des

EGF-Rezeptors und des anschließenden MAPK-Signalweges erreicht wird. Dass

der VEGF-Rezeptor im Gegensatz zum EGF-Rezeptor ein geringeres Ansprechen

auf den Tyrosinkinaseinhibitor zeigte, könnte durch die geringere Affinität von

AEE788 zum VEGFR erklärt werden. [78] Doch wie zum Beispiel die vergleichende

Analyse verschiedener molekularer Therapien von Greten et al [21] zeigt, außerdem

erscheint zumindest der alleinige Ansatz am VEGFR in der HCC-Therapie als wenig

erfolgversprechend. Dies würde die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stützen, da

wir den Grund für die Proliferationshemmung im Hepatom vor allem in der Inhibition

des EGF-Rezeptors gefunden haben.

Ebenso wie eine Sensibilisierung der Zellen in Richtung Apoptose: die Expression

von bcl-2 war in behandelten Tumoren signifikant erniedrigt. Allerdings finden sich in

der Literatur Angaben über eine vergleichsweise geringe Expression von bcl-2 in

Zellen des hepatozellulärem Karzinoms, sodass dies die Erklärung für einen nicht

genügenden Anstoß Richtung Apoptose sein könnte. [11]

Was bedeutet diese Ergebnisse nun für die Verwendung von AEE788 in der

Therapie des HCC?

Mit der Suche nach einer geeigneten systemischen Therapie will man vor allem

einen Ansatz für die fortgeschrittenen Tumorstadien finden. Bislang konnte keine

Substanz identifiziert werden, die zu einer Heilung führen konnte, jedoch ist dies

auch nicht das erklärte Ziel einer solchen Therapie, sondern vielmehr die

Verlängerung der progressionsfreien Überlebenszeit und der

Gesamtüberlebenszeit.

In bisherigen Phase II Studien zu Tyrosinkinaseinhibitoren wurde in den seltensten

Fällen eine Vollremission erreicht. Eine Verlängerung des progressionsfreien-

Überlebens stellt jedoch für jeden Tumorpatienten, sofern die dafür notwendige

Therapie nicht zu viele Nebenwirkungen verursacht, einen Zugewinn an qualitativ

55

hochwertiger Lebenszeit dar. Und zumindest eine Verlängerung der mittleren

Überlebenszeit konnte für AEE788 im Tiermodell bereits gezeigt werden. [43]

Vermutlich kann einer Therapie, welche einen Wachstumsstopp im HCC

hervorrufen kann, nicht nur ein Ziel, wie etwa alleinig der EGF- oder VEGF-Rezeptor

zugrunde liegen. Die vorliegende Arbeit lässt den richtigen Weg, mehrere

Zielmoleküle anzugehen, bereits erkennen. Interessant wäre eventuell eine

Kombination von AEE788 mit bereits erprobten systemischen Therapien, wie etwa

Sorafenib. Möglicherweise könnte eine solche Kombination sich gegenseitig in ihrer

Wirkung potenzieren.

Zu erproben bleibt auch eine andere Art der Medikamentenapplikation. Die

transarterielle Chemoembolisation, welche derzeit in palliativen Fällen unter

Verwendung herkömmlicher Zytostatika wie etwa Cisplatin oder Doxorubicin

durchgeführt wird, könnte ebenfalls durch den Effekt von AEE788 potenziert

werden, indem verbleibende Zellen nach herkömmlicher Chemotherapie erneut

durch AEE788 angegegangen, und in ihrem Wachstum gehemmt werden. Man

würde eine höhere Konzentration am Tumor erreichen, ohne eine erhöhte

systemische Belastung einzugehen.

Für Studien zur Verabreichung via TACE ist das Rattenmodell besser geeignet als

die bisher verwendeten Nacktmaus-Modelle. Zum einen erleichtert die Größe der

Ratten das Handling mit zur Verabreichung notwendigen Instrumenten, zum

anderen gibt es mit den Morrishepatom-Zellen ein gut erprobtes orthotopes HCC-

Modell. Empfehlenswert wäre eine eventuelle Wiederholung der Studie mit

vergleichender kombinierter Medikamentengabe oder Gabe von AEE788 via TACE.

Zusammenfassend konnten mit der vorliegenden Arbeit einige der bereits

bekannten Ergebnisse in der Behandlung hepatozellulärer Karzinome im Tiermodell

mit AEE788 bestätigt werden. Sie zeigt, dass das Verständnis der molekularen

Vorgänge auf Ebene der Signaltransduktion in der Hepatokarzinogenese weiterhin

wichtigster Bestandteil für die Erforschung einer systemisch medikamentösen

Therapie des HCC bleibt. Eine gleichzeitig auf mehrere Ziele ausgerichtete Therapie

scheint der richtige Ansatz zu sein, eine verlängerte Überlebenszeit bei Patienten

mit fortgeschrittenem HCC zu erreichen. Der Anfang der Suche nach einer solchen

Therapie ist gemacht und AEE788 könnte eine Rolle dabei spielen.

56

6. Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung AFP Alpha-Feto-Protein AKT Proteinkinase B BCLC Barcelona Clinic Liver Cancer CT Computertomographie cDNA complementary deoxyribonucleic acid EGF endothelial growth factor EGFR endothelial growth factor receptor GIST Gastrointestinale Stromatumoren HBsAg Hepatits B surface Antigen HBV Hepatitis B Virus HCC hepatozelluläres Karzinom HCV Hepatitis C Virus HE Hämatoxylin-Eosin ICH Immunhistochemie KIT stemm cell factor receptor MAPK Mitogen-aktivierte-Proteinkinase MRT Magnetresonanztomographie NASH nicht-alkoholische Steatohepatitis NET neuroendokrine Tumoren OLT orthotope Lebertransplantation P- phosphoryliert PCR polymerase chain reaction PEI perkutane Ethanolinjektion PIGF Plazentawachstumsfaktor Rb Retinoblastomgen RFA Radiofrequenzablation RNA ribonucleic acid SEM standard error of the mean TACE transarterielle Chemoembolisation TUNEL TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling VEGF vascular endothelial growth factor VEGFR vascular endothelial growth factor receptor vHL von-Hippel-Lindau-Gen

57

7. Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Pro- und antiangiogentische Faktoren ..................................................................... 5

Tabelle 2 Antiangiogeneteische Medikamente in der Krebstherapie ..................................... 7

Tabelle 3 TNM-Klassifikation des HCC ................................................................................... 16

Tabelle 4 Barcelona Clinic Liver Cancer Klassifikation[45] ..................................................... 17

Tabelle 5 Child-Pugh-Score .................................................................................................... 17

Tabelle 6 Chemikalien und Verbrauchsmittel ........................................................................ 24

Tabelle 7 Antikörper .............................................................................................................. 25

Tabelle 8 Light-Cycler-PCR-Primer ......................................................................................... 25

Tabelle 9 Verbrauchsmittel .................................................................................................... 26

Tabelle 10 Fertigkits ............................................................................................................... 26

Tabelle 11 Geräte ................................................................................................................... 26

Tabelle 12 Substanzen und Medikamente............................................................................. 27

8. Abbildungsverzeichnis

Abb.1 Signaltransduktion nach EGFR- und VEGFR-Aktivierung in der Zelle [21] ............... 4

Abb.2 Angiogenese im Tumor [40] ..................................................................................... 6

Abb.3 Klassifikation in geographische Zonen unterschiedlich hoher Inzidenzraten [61] .. 9

Abb.4 Graphische Veranschaulichung der Verteilung der unterschiedlichen

Inzidenzzonen ........................................................................................................................ 10

Abb.5 Simultane HBV bzw. HCV Infektion bei Patienten mit HCC, länderspezifisches

Vorkommen [80] .................................................................................................................... 12

Abb.6 Therapiealgorithmus nach der BCLC-Klassifikation [14] ........................................ 18

Abb.7 Beispiel einer repräsentativen unbehandelten Kontrolle...................................... 40

Abb.8 Beispiel eines repräsentativen mit AEE788 behandelten Tieres ........................... 41

Abb.9 Darstellung der Western Blots ............................................................................... 42

Abb.10 Densitometrische Auswertung des Western Blot .................................................. 42

Abb.11 Vergleichende Darstellung des Verhältnisses P-MAPK/MAPK und P-AKT/AKT ..... 43

Abb.12 Graphische Auswertung KI67-Färbung .................................................................. 44

Abb.13 KI67-Färbung, 20x Vergrößerung ........................................................................... 44

Abb.14 Graphische Auswertung TUNEL-Färbung ............................................................... 45

Abb.15 TUNEL-Färbung, 20x Vergrößerung ....................................................................... 45

Abb.16 Graphische Auswertung EGFR-Färbung ................................................................. 46

Abb.17 Graphische Auswertung VEGFR-Färbung ............................................................... 46

Abb.18 Graphische Auswertung P-EGFR-Färbung ............................................................. 47

Abb.19 Graphische Auswertung P-VEGFR-Färbung ........................................................... 48

Abb.20 VEGFR-Färbung, 20x Vergrößerung ....................................................................... 48

Abb.21 EGFR-Färbung, 20x Vergrößerung ......................................................................... 48

Abb.22 P-VEGFR-Färbung, 20x Vergrößerung .................................................................... 49

Abb.23 P-EGFR-Färbung, 20x Vergrößerung ...................................................................... 49

Abb.24 Graphische Auswertung der PCR ........................................................................... 50

58

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10. Danksagung

Herrn Prof. Dr. med. Matthias Ocker möchte ich für die freundliche Aufnahme in seine Arbeitsgruppe danken. Über seine Zeit an der Medizinischen Klinik 1 der Friedrich-Alexander-Universität hinaus stand er mir jederzeit mit Rat und Tat zur Verfügung und hat so maßgeblich zum Erfolg dieser Dissertation beigetragen.

Weiterhin möchte ich mich bei den Mitgliedern der ehemaligen Arbeitsgruppe bedanken. Allen voran bei den Technischen Assistentinnen Astrid Taut und Isabel Zeitträger, die immer ein offenes Ohr für alle Fragen hatten. Außerdem bei Dr. med. Till Wissniowski und Dr. med. Susanne Gahr für ihre Hilfe bei der Durchführung der tierexperimentellen Arbeiten. Ebenfalls bedanken möchte ich mich für die hervorragende Unterstützung bei der Auswertung der Ergebnisse bei Dr. med. Karl Quint. Nicht unerwähnt möchte ich Herrn Dr. Thomas Appl für seine Hilfestellung am Mikroskop lassen.

Zu guter Letzt möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die sich meine Arbeit zu Gemüte geführt und Korrektur gelesen haben: meinem Bruder Dominik, Herrn Dr. Christian Dreyer und meinem Freund Lukas Koch-Weser, der mir zudem während der ganzen Zeit eine große Hilfe und moralische Stütze war.

67

11. Lebenslauf

Nicht in Veröffentlichung enthalten.