Untersuchung zur Veränderung der Aktionspotentialmuster

während der Reifung von Forellen Retina Ganglienzellen

(Oncorhynchus mykiss) unter besonderer Berücksichtigung

Kv 3.1 und BK verwandter Kaliumkanäle

Dissertation

zur Erlangung des

naturwissenschaftlichen Doktorgrades

des Fachbereichs Biologie/Chemie

der Universität Osnabrück

vorgelegt von

Jutta Henne

aus Osnabrück.

Osnabrück 2004

1

I Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 4

2 Material und Methoden 7

2.1.1 Versuchstiere 7

2.1.2 Eukaryontische Zellkulturlinie 7

2.2 Medien 7

2.2.1 Lösungsansätze für die Zellisolierung und Zellkultur 8

2.2.2 Lösungsansätze für die Elektrophysiologie 8

2.2.3 Puffer und Systeme 10

2.2.4 Primer 10

2.3 Immunologische Methoden 11

2.4 Molekularbiologische Methoden 11

2.4.1 mRNA Isolierung aus einzelnen RGZ 11

2.4.2 Reverse Transkription 12

2.4.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 12

2.4.4 Agarosegelelektrophorese 13

2.5 Baculovirus-Technik 13

2.6 Isolierung der Retinaganglienzellen (RGZ) 14

2.7 Zellkultur von Retinaganglienzellen (RGZ) 15

2.8 Materialnachweis 15

2.9 Versuchsaufbau des Patch-Clamp Messtandes 16

2.9.1 Mechanisch optischer Aufbau 16

2.9.2 Verstärker 17

2.9.3 Spannungsklemmen Modus (Voltage-Clamp, VC) 18

2.9.4 Search-Modus 19

2.9.5 Stromklemmen (Current Clamp; CC) und CC + COMM Mode 19

2.9.6 Pipetten und Elektroden 20

2.9.7 Versuchssteuerung und Erfassung der Messdaten 20

2.9.8 Kapazitäts - und Serienwiderstandskompensation 21

2.10 Versuchsdurchführung 22

2

3 Ergebnisse 24

3.1 Entwicklung von RGZ 24

3.2 Entwicklung der Aktionspotentiale 24

3.3 Charakterisierung spannungsabhängiger Summeneinströme 29

3.4 Charakterisierung von passiven Membraneigenschaften und 31

Kaliumkanalmustern

3.4.1 Hauptklassen von Kaliumkanälen 36

3.4.2 Spannungsabhängige Kaliumkanäle 38

3.4.2.1 Charakterisierung des IA Stroms in adulten RGZ 38

3.4.2.2 Charakterisierung des Summenausstromes in RGZ 39

3.4.2.3 Heterologe Expression von Kv3.1 in SF21 Zellen 45

3.5 Einsatz von Antikörpern in der Elektrophysiologie 46

3.5.1 Wirkung von Antikörpern auf den Summenausstrom

von Kv3.1 und RGZ 46

3.5.2 Wirkung von Antikörpern auf Aktionspotentialmuster 46

3.6 Ergebnisse der PCR Studien 52

3.7 Ergebnisse der Zellkulturversuche 54

4 Zusammenfassung 56

5 Diskussion 57

6 Literaturverzeichnis 63

7 Anhang 69

7.1 Abkürzungen 69

7.2 Publikationen 71

3

1 Einleitung

Im zentralen Nervensystem ist die koordinierte Expression von spannungsaktivierten

Kaliumkanälen von zentraler Bedeutung für die korrekte Ausbildung des

Signalverhaltens der Nervenzellen. Durch die vorhandenen Kanäle werden neben

dem Membranpotential die intrinsischen Feuereigenschaften und damit das

elektrische Signalverhalten festgelegt (Hille 2001). Da die korrekte neuronale

Vernetzung und das Überleben der Neurone während der Gehirnentwicklung von

einer adäquaten elektrischer Aktivität abhängt (Catalano 1998; Dantzker 1998),

dürften Kaliumkanäle auch an der Steuerung neuronaler Differenzierungsprozesse

beteiligt sein (Ribera und Spitzter 1992; Hendriks et al. 1999b; McFarlane und

Pollock 2000). Kaliumkanäle lassen sich anhand der Anzahl ihrer

Transmembrandomänen (TM) in drei Hauptklassen einteilen. Die mit zwei

hydrophoben TM und einer Porendomäne ausgestatteten Kanäle werden als

Einwärtsgleichrichter bezeichnet. Die 4 TM Familie entsteht während der Evolution

durch eine Verdopplung dieses Motivs. Die größte Anzahl der bekannten

Kaliumkanäle gehört der 6 TM Klasse an (Vanderberg 2000). Sie besitzt 6

transmembrane Helices (S1 bis S6). Die Porendomäne H5 ist zwischen S5 und S6

lokalisiert. Der Kanal wird durch Assemblierung aus 4 α-Untereinheiten zu einem

Oligomer gebildet, mit dem akzessorische β-Untereinheiten assoziiert sein können.

Sämtliche spannungsabhängigen Kaliumkanäle (Kv) gehören der 6 TM Klasse an.

Sie sind in 4 Hauptfamilien ( Kv 1 bis Kv4) und deren Subklassen unterteilt ( Pongs

1992, Chandy and Guttman 1994). In der ursprünglichen Drosophila Nomenklatur

werden diese Kanäle mit Shaker, Shab , Shaw und Shal bezeichnet. Zusätzlich zu

spannungsabhängigen Kaliumkanälen spielen auch kalziumaktivierte Kaliumkanäle

eine wichtige Rolle im Nervensystem. Sie werden in drei Klassen unterteilt: Die big-

conductance (BK), intermediate conductance (IK) und small conductance (SK)

Kaliumkanäle (Sah 1996). Aufgrund ihrer Ähnlichkeiten in der Genstruktur und des

Leitwertes werden die IK und SK Kanäle einer gemeinsamen Familie zugeordnet

(Wallner 1999). BK Kanäle sind sowohl kalziumsensitiv als auch spannungsabhängig

und gehören folglich der 6 TM Klasse an. Am N-Terminus ist eine zusätzliche S0

Domäne lokalisiert. Am C-Terminus befinden sich 4 weitere Domänen S7-S10. Die

Kalziumsensitivität wird über ein Kalziumbindemotiv, der sogenannten Calcium Bowl,

am C-Terminus erreicht (Wallner 1999). SK Kanäle sind spannungsunabhängig und

4

durch geringe Leitwerte von unter 10 pS gekennzeichnet (Sah 1996). Aufgrund

dieser geringen Leitfähigkeit stellen sie keinen großen Anteil am Summenausstrom.

Sie spielen jedoch eine Rolle bei der langsamen Nachhyperpolarisation eines

Aktionspotentiales (Sah 1991). Die elektrophysiologischen Eigenschaften von

Kaliumkanälen wurden in der Vergangenheit anhand verschiedener heterologer

Expressionssysteme untersucht. Dabei wurden neben eukaryontischen Zelllinien wie

z.B. HEK-Zellen, CHO-Zellen am häufigsten Frosch-Oocyten genutzt. Insgesamt

wurde eine hohe Diversität der Stromeigenschaften unterschiedlicher

Kaliumkanalsubtypen festgestellt. Es zeigten sich charakteristische Unterschiede in

der Aktivierungsschwelle, im pharmakologischen Profil und den Kanalkinetiken der

einzelnen Subfamilien (Covarrubias 1991). Dabei erzeugt jeder Kanal ein für sich

typisches Strombild, das in zwei Hauptklassen zu unterteilen ist. Bei dem

sogenannten IA Typ zeigt sich ein schnell inaktivierendes Strommuster. Dem

entgegen steht ein nicht inaktivierender KD Stromtyp. Die hohe physiologische

Diversität der Kaliumkanäle steht in gutem Einklang mit einer extrem hohen Diversität

von elektrischen Membraneigenschaften neuronalen Zellen. In einigen Fällen konnte

das individuelle Feuermuster von Neuronen und dessen Änderung während der

Entwicklung mit dem Auftreten eines bestimmten Kaliumkanalsubtypes korreliert

werden.

Native Neurone exprimieren in der Regel eine Vielzahl unterschiedlicher

Kaliumkanalsubtypen. Dies führt zu einer Vermischung und Überlagerung der

Strombilder, so dass die einzelnen Komponenten nicht mehr zu erkennen sind. Sie

können jedoch mit Hilfe von Toxinen bzw. pharmakologischen Substanzen, wie TEA,

teilweise voneinander getrennt und identifiziert werden. Dabei ist nicht für jeden

Kaliumkanal ein spezifischer Blocker bekannt, und häufig werden durch eine

Substanz mehrere Mitglieder einer ganzen Kanalfamilie gehemmt. Für die

zweifelsfreie Zuordnung eines Stroms zu einem bestimmten Kanal werden deshalb

mehrere Blocker eingesetzt und andere Kanaleigenschaften, wie z.B. die

Aktivierungsschwelle, betrachtet. Eine Grundlage für diese Arbeitsmethode bilden die

Ergebnisse, die durch heterologe Expression von Kaliumkanälen ermittelt wurden.

Neben Ergebnissen der elektrophysiologischen Charakterisierung rekombinanter

Säugerkanäle wurden die Stromeigenschaften der Forellen Shaker Kanäle Tsha1

und Tsha2 (Ngyuen 2000) zugrunde gelegt. Ergänzend zu den

elektrophysiologischen Methoden sollten molekularbiologische eingesetzt werden.

5

Dabei sollte die Expression von verschiedenen Kaliumkanalsubtypen auf RNA Ebene

mit Hilfe der RT-PCR Technik untersucht werden. Dafür konnten vorliegende

Sequenzdaten über 4 Shaker und 2 Shaw Kanäle der Forelle genutzt werden

(Panofen 2001; 2002; Ngyuen 2000).

Die Retina stellt ein hervorragendes System zur Beobachtung von Wachstums- und

Differenzierungsvorgängen im ZNS dar. Aufgrund ihrer exponierten Lage ist sie

experimentell gut zugänglich und sie besteht aus mehreren einfach zu

identifizierenden Zellschichten. In der Photorezeptorschicht werden Lichtimpulse

aufgefangen und in elektrische Signale umgewandelt. Die Reizweiterleitung führt

über die Horizontal-, Bipolar- und Amakrinzellen. Diese Interneurone bilden ein

komplexes Netzwerk, das die Informationen der Photorezeptoren bündelte und an

die Neurone der Retina, die Retinaganglienzellen (RGZ), weiterleitet. Diese Zellen

generieren Aktionspotentiale und leiten sie über ihre Axone, die den Sehnerv bilden,

ins visuelle Zentrum des Gehirns weiter (Dudel 1996). Untersuchungen über die

elektrophysiologischen Eigenschaften von Nervenzellen der Retina wurden fast

sämtlich an Säugern durchgeführt (Günther 1999). Über die ursprünglicheren

Vertebraten, wie z.B. Knochenfische, liegen nur wenige Untersuchungen vor (Yazulla

1998).

Am Beginn dieser Arbeit stand eine Methode zur Isolierung und

elektrophysiologischen Analyse von adulten Forellen RGZ (Stegmann 1998). In

vorangegangenen Untersuchungen wurde gezeigt, dass die Ausströme durch

spannungsabhängige Kaliumkanäle getragen werden. Im Rahmen der hier

durchgeführten Untersuchungen sollten die dem Kaliumstrom zugrunde liegenden

Kanäle mit Hilfe pharmakologischer und elektrophysiologischer Methoden ermittelt

werden. Als weiterer Teilaspekt dieser Arbeit sollte ein System zur Kultivierung von

RGZ etabliert werden, um weiterführende Entwicklungsstudien zu ermöglichen.

Als Hauptaspekt dieser Arbeit sollte ein Model für die Entwicklung von elektrischen

Eigenschaften einer Nervenzelle im ZNS geschaffen werden. Dabei boten sich

Forellen RGZ aufgrund ihrer guten experimentellen Zugänglichkeit an. Des weiteren

handelt es sich bei diesen Neuronen um einen elektrischen genau definierten Zelltyp

an dem die Entwicklung von elektrischen Eigenschaften gut verfolgt werden kann.

Dabei sollte die Rolle von bestimmten Kaliumkanälen bei der Veränderung des

Aktionspotentialmusters im Rahmen der Reifung der Zelle untersucht werden.

6

2 Material und Methoden

2.1.1 Versuchstiere

Als Versuchstiere dienten Regenbogenforellen ( Oncorhynchus mykiss ). Es wurden

sowohl junge adulte Tiere mit einer Körperlänge von 2 bis 4 cm, als auch

verschiedene larvale Stadien verwendet, deren Alter nach Vernier (1969) bestimmt

wurde. Die Fischeier wurden vom Forellenzuchtbetrieb Linndthorst-Emme aus

Schloß-Holte Stuckenbrock, sowie vom Fischzuchtbetrieb Freya Forellen aus

Dänemark bezogen. Die Tiere wurden in gut belüfteten Aquarien bei einer

Temperatur zwischen 4°C und 15°C gehalten und täglich mit handelsüblichem

Fischtrockenfutter gefüttert. Eine Beckentemperatur von 15° C über mindestens 2

Wochen verbesserte die Messbarkeit der RGZ, insbesondere von jungen

Entwicklungsstadien.

2.1.2 Eukaryotische Zellkulturlinie Für die Messung von heterolog expremierten Kaliumkanälen wurden Sf21 Zellen

(Spondoptera frugiperda, Ovarienzellen) verwandt. Die Zellen wurden in Insect-

Xpress - Medium mit 2 % fötalem Kälberserum ( FCS) und 100 µg/ml Gentamycin in

Zellkulturflaschen bei 27° C gehalten. Alle 3 bis 4 Tage wurden die Zellen im Stadium

der Konfluenz passagiert. Dazu wurden sie vom Flaschengrund abgeschlagen und in

einer Verdünnung von 1:5 bzw. 1:10 in frisches Kulturmedium umgesetzt.

2.2 Medien 2.2.1 Lösungsansätze für die Zellisolierung und Zellkultur

Substanz Ansatz Lagerung

Concanavalin A 5 mg Ausgangsstoff in 5 ml Aqua dest. lösen;

zu 500 µl alliquotieren

-20° C

Cystein 100 mg kristallines Cystein in 2 ml DMEM lösen,

zu 100 µl alliquotieren

-20° C

DMEM gebrauchsfertig + 4° C

7

Substanz Ansatz Lagerung

DNAS´se 1,6 mg in 40 ml DMEM lösen;

zu 1 ml alliquotieren

-20° C

FCS

(fötales

Kälberserum)

gebrauchsfertig; größere Mengen müssen

portioniert werden; bei 37° C auftauen, 1 mal

aufschütteln und zu 1 ml alliquotieren

-20° C

Glutamin gebrauchsfertig; zu 400 µl alliquotieren -20° C

Gentamycin gebrauchsfertig 18° C

Hyaluronidase 50 mg Ausgangsstoff in 50 ml PBS lösen;

zu 1 ml alliquotieren

-20° C

Insect –Xpress –

Medium

2 % FCS und 100 µg/ml Gentamycin 4° C

Kulturmedium ( KM) Waschmedium mit 10 % FCS; am

Präparationsstag frisch herstellen

Kulturmedium 2 39,2 ml V-Start Medium, 400 µl Gentamycin,

400 µl Glutamin,

Papain 1ml Ausgangsstoff mit 9 ml DMEM und 100 µl

Glutamin mischen; zu 1 ml alliquotieren

-20° C

Papain ( aktiviert ) 100 µl Cysteinlösung mit 500 µl WM mischen; den

pH-Wert mit 1 M NaOH einstellen; 200 µl dieser

Lösung zum Papain geben; schütteln

Start V Medium Gebrauchsfertig 4° C

Waschmedium (WM) 400 µl Glutamin, 400 µl Gentamycin und 39,2 ml

DMEM; am Tag der Präparation frisch herstellen

2.2.2 Lösungsansätze für die Elektrophysiologie

Die Pipettenlösung setzt sich wie folgt zusammen:

Substanz Konzentration [mmol/l]

KCl 50

KFl 30

CaCl2 2

8

Substanz Konzentration [mmol/l]

MgSO4 2

Hepes 10

EGTA 11

ATP 3,1

GTP 0,4

Phosphocreatin 4,0

Leupeptin 0,1

Das EGTA wird als erstes in 10 ml 500 mmol/l KOH gelöst, deshalb muss bei der

Bestimmung der Gesamtkonzentration von K+ in der Pipettenlösung 50 mmol/l K+

addiert werden. Der ph-Wert der Pipettenlösung wird mit HCl auf 7,25 bei RT

eingestellt.

Die Standardbadlösung TaCSF (Teleost artificial Cerebral Spinal Fluid) setzte sich

wie folgt zusammen:

Substanz Konzentration [mmol/l]

NaCl 118

KCl 3,5

MgSO4- 2

CaCl2 2

Hepes 10

Glucose 10

Der pH Wert von 7,2 bei 16° C wurde mit HCl eingestellt. Bei Versuchen mit Sf21

Zellen muss der Wert auf 6,25 eingestellt werden.

9

Bei Experimenten mit Kanalblockern wurde eine TaCSF Lösung mit folgenden

Agenzien verwandt:

Substanz Konzentration

Alpha-Dendrotoxin 1 µM

Apamin 100 nM

BDS 1 2 µM ; 100 nM

Chinin 100 µM

CoCl2 0,2 mM

H7 10 µM

r-Iberiotoxin 1 µM

Tetraethylammoniumacetat (TEA) 0,1 und 2 mmol/l

Tetrodotoxin 1 µM

TPA 50 nM TPA; in DMSO lösen

2.2.3 Puffer und Systeme

Puffer / Kit Zusammensetzung / Hersteller

Superskript Preamplification System Fa. Gibco BRL 50 Reaktionen

TAE Puffer 40 mM Tris, 10 mM Na-Acetat,

1 mM EDTA, pH 8,0 mit Essigsäure

Taq DNAse, recombinant Fa. Gibco BRL

2.2.4 Primer

Alle für die PCR verwendeten Primer wurden im Kundenauftrag der Firma MWG

Biotech synthetisiert. Alle Primer wurden in einer Konzentration von 50 pmol/µl in

den PCR Reaktionen verwandt.

Name Sequenz 5´ → 3´

RCKC CAA YGA RTA YTT YTT AGA

Chan CAC IAC ICG CCA CCA RAA

Raw CCC ITG YTG YTG GAT GAC

10

Name Sequenz 5´ → 3´

Tsha1 v GAG GAC GAA CCA CAC ATG GTC TT

Tsha1 r TGC TCG CTT CCC GCT CCC TGT

Tsha2 v GGT TCA GGG AAG ATC ACA GCA

Tsha2 r TGC TCA CTT CCC GCT CCC TGT

Tsha3 v CTT TAT CAC CAC CTT TTC C

Tsha3 r CTG GAG TTG ATG TCT GTA TC

Tsha4 v AGG AGA AAC ATT GGG ACA CTG AG

Tsha4 r TGT CCG TTT CCT TGG TGA CCC

Kv3r v GAG AAT TCA GAG GAG GAT

Kv3r r TGC TGT TGT CCA GCG GGT

Kv3c v ACG TTG ACA ATG GAG ACG AC

Kv3c r CAC ACT TGT TGA TGA TGG T

2.3 Immunologische Methoden

Für einige elektrophysiologische Versuche wurden polyklonale Antikörper gegen

spannungsabhängige Kaliumkanäle eingesetzt. Diese Antikörper wurden von der

Firma Bioscience in Kaninchen oder Meerschweinchen produziert. Die dafür nötigen

Polypeptide wurden von Dr. Frank Panofen im Rahmen seiner Dissertation

synthetisiert (vergl. Panofen 2001). Die Antikörper wurden in Konzentrationen von

1:100 bis 1:000 in die Pipettenlösung gegeben. Der Antikörper gegen die Kv1.4

Untereinheit der Säuger wurde über die Firma Sigma bezogen.

2.4 Molekularbiologische Methoden 2.4.1 mRNA Isolierung aus einzelnen RGZ

Für den Nachweis der Transkription von spannungsabhängigen Kaliumkanälen

wurde das Zellplasma und die darin enthaltenen mRNA´s einer einzelnen RGZ nach

erreichen des Whole Cell Modus durch sanftes Saugen in die Spitze der

Messelektrode gesogen. Dabei musste darauf geachtet werden, den Zellkern intakt

zu lassen, um eine Kontamination mit gDNA zu verhindern. Der Kern und der Rest

der Zelle, der häufig an der Elektrodenspitze hing, wurde beim Herausfahren der

Elektrode aus dem Medium aufgrund starker Scherrkräfte abgerissen. Dies konnte im

11

Mikroskop optisch kontrolliert werden. Vorher wurde das Aktionspotentialmuster der

Zelle bestimmt. Dies war deswegen nötig, um RGZ, von in der selben Schicht

vorkommenden, ähnlich aussehenden Amakrinen Zellen, zu unterscheiden. Diese

generieren kein komplexes Aktionspotentialmuster wie RGZ. Für die Reverse

Transkription, der im Zellplasma enthaltenen m-RNA, wurde der Inhalt der

Messelekrodenspitze in ein Eppendorf PCR-Cup geblasen.

2.4.2 Reverse Transkription

Die reverse Transkription dient der cDNA- Erststrangsynthese. Vor dem Aussaugen

der RGZ wurde in ein 0,2 ml Eppendorf PCR-Cup 1 µl RNA´se ( 40 U), 1 µl 100 nM

DTT, 1 µl 50 µM Random Hexanukleotide, 1 µl 10 mM dNTP Mix und 1,5 µl 5 fach

Erststrang Puffer auf Eis pipetiert. In dieses Cup wurde das Zellplasma einer

einzigen RGZ mit einem abgeschätzten Volumen von 1 µl geblasen. Dieses Cup

wurde 1 min bei 72° C erhitzt, um Sekundärstrukturen der mRNA aufzulösen.

Anschließend wurde das Gemisch bei 0° C abgekühlt. Danach wurden 0,5 µl (100

U) Superskript Reverse Transkriptase II zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde

zunächst 10 min bei Raumtemperatur und anschließend 60 min bei 42° C inkubiert.

Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 90° C für 5 min beendet und bei –20° C

gelagert oder sofort als PCR-Templat eingesetzt.

2.4.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Um die gering expremierten Kaliumkanaltranskripte zu amplifizieren, wurde eine

multiplex PCR Technik angewandt. Es wurden 2 aufeinanderfolgende PCR

Reaktionen durchgeführt. Im ersten Durchgang wurden allgemeine Primerpaare für

spannungsabhängige Kaliumkanäle (RCKC und Chan für Shaker; RCKC und RAW

für Shawkanäle) benutzt. Im zweiten Durchgang wurden spezifische Primer für je

einen spannungsabhängigen Kaliumkanal benutzt. Die erste PCR wurde in dem

Reaktionsgefäß der reversen Transkription in einem Volumen von 50 µl durchgeführt.

In diese Reaktion wurden je 1 µl 50 pmol/l der Primer RCKC, Chan und Raw , 2 µl 10

mM dNTP Mix, 2 µl DMSO, 5 µl 10fach PCR Puffer, 2 µl 10 mM MgCl2, 28,5 µl H2O

und 0,5 µl Taq-Polymerase (Firma Gibco) pipettiert. Der Reaktionsansatz wurde mit

Mineralöl überschichtet. Das Temperaturprofil der PCR begann mit einem initialen

Denaturierungsschritt von 2 min bei 94° C. Anschließend wurde die Polymerase bei

einer Temperatur von 72° C (Hot-Start) hinzugefügt. Innerhalb der 35 Zyklen wurden

12

die DNA - Doppelstränge für 30 s bei 94° C denaturiert, während das Anlagern der

Primer (Annealing) bei einer Temperatur von 53° C über 45 s stattfand. Die

Extension der angelagerten Primer wurde bei 72° C über 1,5 min erreicht. Alle PCR

Reaktionen wurden in einem programmierbaren Thermocycler ( Fa. MWG Biotech)

durchgeführt. Für den zweiten PCR Ansatz wurde jeweils 1 µl aus der ersten

Reaktion als Template verwandt. In der zweiten PCR Runde wurden 6 verschiedene

Primerkombinationen für die Amplifikation von 4 Shakerkanälen (Tsha1-4) und 2

Shawkanälen (Kv3.1 R und C) verwandt. Der PCR Ansatz wurde in einem Volumen

von 25 µl durchgeführt. Zu dem Template aus Reaktion 1 wurden je 2 µl des

Primerpaares , 2,5 µl des 10 fach Puffers, 1 µl MgCl2 , 1 µl dNTP´s, 17,2 µl H2O und

0,3 µl Taq Polymerase pipetiert. Es wurde wieder eine Hot-Start PCR Reaktion

durchgeführt. Das Protokoll änderte sich zu PCR Nummer 1 nur in folgenden

Punkten. Die Annealingtemperatur wurde auf 56° C erhöht und die Extension der

Primer wurde auf 1 min verkürzt.

2.4.4 Agarosegelelektrophorese

Mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese wurden DNA-Fragmente im elektrischen Feld

aufgetrennt und hinsichtlich ihres relativen Molekulargewichts analysiert. Zur

Herstellung des Agarosegels wurden 1 – 2 % Agarose in TAE-Puffer durch

Aufkochen gelöst und auf einen Gelträger gegossen. Ca 6 µl der DNA Proben

wurden in die Taschen des Gels pipettiert. Als Größenstandard diente Smart Ladder

(Fa. Eurogentec). Die Elektrophorese wurde bei 5 V/cm Elektrodenabstand in einer

Horizontalkammer durchgeführt und beendet, sobald die zwei Blaufronten das Gel in

Drittel unterteilt hatten. Nach 10 minütiger Färbung in einem Ethidiumbromid-Bad

(2 µg/ml) und anschließender Entfärbung in dH20 für 10 min wurden die Banden bei

302-360 nm in einem UV-Transilluminator angeregt und mit einer

Geldokumentationsanlage analysiert.

2.5 Baculovirus-Technik Bei der heterologen Expression des Kv3.1 Kanals Traw 1 in Sf21 Zellen wurde der

von Frank Panofen (2001) hergestellte Virus Kv 3.1; 17-20 verwendet. Für die

Infektion wurden 3 Tropfen frisch passagierter Sf21 Zellen mit 1 ml Medium in ein

Nunc Dish gegeben. Nach 2 Stunden hatten sich die Zellen an den Boden angeheftet

und wurden mit 1 bis 5 µl der Virussuspension infiziert. Nach ca. 20 Stunden war ein

13

deutliches grünes Leuchten der Zellen erkennbar. Eine Messung der Zellen war ca. 6

Stunden lang möglich, bevor die Zellyse eintrat.

2.6 Isolierung der Retinaganglienzellen ( RGZ) Die Isolierung der Retinaganglienzellen erfolgte mit einem modifiziertem

Gewebeabdruckverfahren, wie bei Barres et all (1988) beschrieben. Da Forellen sehr

temperaturempfindlich sind und ab Temperaturen von 19° C sterben, musste die

gesamte Präparation in einem auf 16° C gekühlten Raum durchgeführt werden. Der

spätere Transport und die anschließenden Experimente mit den RGZ erfolgten

immer unter Kühlung auf 16° C. Während der Präparation mussten die Augen, bzw.

die Retina vor Austrocknung geschützt werden. Deshalb wurde zu Beginn die

Präparationskammer mit mindestens 1ml WM gefüllt. Anschließend wurde in die

Mitte eines Nunc Dishes 125 µl ConA gegeben. Dieses Lectin sollte die spätere

Anheftung der Zellen an den Untergrund unterstützen. Danach wurde der Fisch

dekapiert und zur Oberflächensterilisation 10 s in 70 % Ethanol gehalten. Bei

jüngeren Entwicklungsstadien war es notwendig, die Tiere zuerst aus dem Ei

herauszuschneiden, und mit Hilfe der Entwicklungstabelle von Vernier, das

Entwicklungsstadium festzustellen. Danach wurden die Augen herausgeschnitten

und der Augenbecher im Bereich der ora serata geöffnet. Die Linse und der

Glaskörper konnten entfernt werden. Danach wurde die Retina mit einem Schnitt

durch den Sehnerv vom Augenbecher abgetrennt. Anschließend erfolgte eine

Inkubation von 10 min mit Hyaluronidase, um Reste des Glaskörpers zu verdauen.

Die folgende Behandlung mit der cysteinaktivierten Protease Papain lockerte den

Gewebeverband und erleichterte ein späteres herauslösen der Retinaganglienzellen

aus dem Gewebeverband. Die Inkubationszeit dieses Enzyms ist stark abhängig von

der Größe des Fisches. Je kleiner und damit jünger die Fische sind, desto kürzer

sollte die Inkubationszeit sein. Bei nicht geschlüpften Fischen sollten 20 min nicht

überschritten werden. Danach sollte die Verdauzeit um 5 min pro späteres Stadium

verlängert werden. Bei jungen, adulten Fischen sollte die Zeit 60 bis 90 min

betragen. Anschließend erfolgt eine 15 - minütige DNA´se Behandlung. Vor dem

Gewebeabdruck der Retina in das Con A beschichtete Dish, muss das überflüssige

ConA durch 2-3 - faches Waschen mit Waschmedium entfernt werden. Für den

Gewebeabdruck wird ein Stück Cellulosenitrat unter die Retina geschoben, hierbei

14

muss die Rezeptorschicht unten liegen. Das Papierstückchen wird aus dem Medium

gezogen, wobei sich die Retina ausbreitet, und auf den Boden des beschichteten

Dishes gelegt. Durch leichten Druck mit einem kleinen Stempel wird die Anheftung

der RGZ an das Dish unterstützt. Danach werden 500 µl WM in das Dish gegeben

und das Papierstückchen vorsichtig entfernt. Die Anheftung der Zellen kann jetzt

erfolgen. Nach ca. 30 min werden 500µl des Kulturmediums auf das Präparat

gegeben, da das darin enthaltene FCS die Anheftung der Zellen erschwert. Bis zur

Durchführung der Experimente verbleiben die Zellen in diesem Medium.

2.7 Zellkultur von Retinaganglienzellen (RGZ) Für die Zellkultur von RGZ wurde 2 Stunden nach der Präparation der Zellen das

Kulturmedium 1 durch das Kulturmedium 2 in mehreren Schritten ausgetauscht.

Danach wurden die Präparate in eine gasdichte Zellkulturkammer (Fa. Jürgens)

überführt. Die Kammer wurde mit Carbogen (Firma Westfalen; 95 % O2 und

5 % CO2 ) gefüllt. Alle 2 bis 3 Tage wurde die Hälfte des Kulturmediums 2 durch

frisches Medium ersetzt. Sollten die Zellen elektrophysiologisch gemessen werden,

wurden 1 bis 2 Stunden vor der Messung die Präparate aus der Kulturkammer

genommen und Kulturmedium 2 durch TaCSF in mehreren Schritten ersetzt.

2.8 Materialnachweis Reagenzien /Materialien/ Enzyme Bezugsquelle

Apamin Alomone Labs LTD

ATP Sigma

BDS 1 Alomone Labs LTD

Cellulosenitrat Schleich Schuell

Chinin Merck

Concanvalin A Sigma

Cystein ( L-Cystein) Sigma

DMEM ICN Eschwege

Dishes mit Nunclon Surface Nalge Nunc International

Dnase Boehringer Mannheim

DTX ( alpha-Dendrotoxin) Alomone Labs Ltd.

Ethidiumbromid Fa. Serva Heidelberg

15

Reagenzien /Materialien/ Enzym Bezugsquelle

FCS ( fötales Kälberserum) Biochrom Berlin

Gentamycin Gibco

Glutamin ( L-Glutamin) Gibco

GTP ( Kalium GTP) Sigma

H 7 Sigma

Hepes ( Natriumsalz) Sigma

Hyaluronidase Boehringer Mannheim

r-Iberiotoxin Alomone Labs LTD

Insect-Xpress Medium Fa. Bio Whittaker ( Belgien)

Kaliumfluorid Sigma

Leupeptin Sigma

Papain Boehringer Mannheim

Phosphocreatin Sigma

PBS-Puffer Boehringer Mannheim

Start V- Medium Fa. Biochrom

Superskript 2 Gibco

Taq- Polymerase Fa. Gibco Brl Eggenheim

TPA Sigma

TEA (Tetraethylammoniumacetat) Sigma

TTX (Tetrodotoxin; citrat free) Alomone Labs LTD.

2.9 Versuchsaufbau des Patch-Clamp Messstandes 2.9.1 Mechanisch optischer Aufbau

Der gesamte Messstand ist, zur Abschirmung gegen äußere elektrische Störungen,

von einem Faradaykäfig (Breite 105 cm; Höhe 90 cm; Tiefe 85 cm) umgeben.

Innerhalb des Käfigs dient eine massive Kunststeinplatte als Arbeitsplattform. Sie

wird durch vier luftgefüllte Balgzylinder (Fa. Phönix) stossgedämpft. Die optische

Einheit besteht aus einem Invertmikroskop (Olympus ITM-2; max 600-fache

Vergrößerung) mit einer Hoffmann Modultaion Contrast Optik (Fa. Hoffmann; New

York). Der motorgetriebene Mikromanipulator (Fa. Eppendorf) ermöglicht eine

Bewegung in 3 Ebenen und trägt den Messkopf des Verstärkers. Der Pipettenhalter

16

ist über einen BNC-Stecker direkt mit dem Messkopf verbunden. Auf dem Objekttisch

ist eine Platte aus Aluminium befestigt, in welche die Messkammer (ein Nunc Dish)

eingesetzt werden kann. Zusätzlich sind eine Halterung für die Badelektrode und 2

für die Zu- und Ablaufkanülen angebracht. Die Temperatur in der Messkammer kann

mit Hilfe einer Wasserumlaufkühlung konstant bei 16° C gehalten werden. Ein

oberhalb des Mikroskops angebrachter Aluminiumblock wird auf die selbe Weise

gekühlt. In ihm befinden sich 10 Bohrungen, in die je 5 10 ml und 5 50 ml

Einwegspritzen eingebracht werden können. Aus diesen Spritzen können über ein

8-Port-Drehventil (Fa. Hamilton) Lösungen in die Versuchskammer eingespült

werden. Die Messkammer besitzt ein Volumen von ca. 2,5 ml. Die Flüssigkeit kann

mit einer Flussrate von 4 ml pro Minute ausgetauscht werden. Die Höhe der

Flüssigkeit in der Messkammer kann über die Abflusskanüle festgelegt werden. Das

Absaugen der Lösungen aus der Messkammer geschieht mittels Unterdrucks, der

von einer Vakuumpumpe (Medcalf Bros. LTD, England) erzeugt wird. Die anfallenden

Flüssigkeiten werden in einer Unterdrucksaugflasche aufgefangen.

2.9.2 Verstärker

Für die Messungen wurde ein Patch-Clamp-Verstärker (Modell LV/M EPC-7, List

Elektronik, Darmstadt) verwendet. Die wichtigsten Elemente sind der

Operationsverstärker (OPA; operational amplifier) mit einem Widerstand von 50 GΩ

und der Rückkopplungswiderstand (Messwiderstand, oder Rf; R = 500 MΩ), die als

Strom Spannungswandler arbeiten. An den Eingängen des OPA liegt die Spannung

der Pipette (Membranspannung) und die vorgegebene Sollspannung

(Kommandospannung) an. Gibt es eine Abweichung zwischen Pipettenpotential und

Sollspannung, entsteht am Ausgang des OPA eine Spannung. Diese Spannung ist

proportional zu der Potentialdifferenz, aber um ein vielfaches verstärkt. Zum

Ausgleich des Spannungsunterschiedes muss ein Strom (Klemmstrom) über den

Messwiderstand fließen. Dieser Strom fließt so lange, bis die Potentialdifferenz

ausgeglichen ist. Diese Schaltung gleicht somit Abweichungen zwischen Pipetten -

und Kommandopotential aus und erzeugt am Rückkopplungswiderstand eine

Spannung, die proportional zu dem in die Pipette injizierten Strom ist. Daher stammt

die Bezeichnung Strom-Spannungs-Wandler. Die Ausgangsspannung wird an die

Steuereinheit weitergeleitet und mit Hilfe eines Kalibrierungsfaktors (Größe von Rf

spielt eine Rolle) in Strom umgerechnet. Die Sollspannung wird hierzu addiert,

17

allerdings später von einem Differenzverstärker wieder subtrahiert. Am Ausgang des

Differenzverstärkers liegt dann eine Spannung an, die dem Stromfluss in der Pipette

proportional ist.

2.9.3 Spannungsklemmen Modus ( Voltage-Clamp; VC)

In diesem Modus wird die Spannung konstant gehalten und der dazu nötige

Kompensationsstrom gemessen. Im Experiment werden die Zellen auf ein

Haltepotential, z.B. -80 mV geklemmt, das durch stufen - oder rampenförmige

Testpulse verändert werden kann. Diese direkt gemessenen Membranströme

ermöglichen Aussagen über das Verhalten von Ionenkanälen. In der Schaltung

arbeitet der OPA als I/U Wandler. Die gemessene Spannung und die Sollspannung

werden verglichen. Abweichungen werden durch eine Kompensation über den Rf

ausgeglichen. Der Kompensationsstrom hat den gleichen Wert und das gleiche

Vorzeichen wie der Ionenstrom,

der während der Veränderung des

Membranpotentials über die

Membran fließt. Der Ausgang des

I/U Wandlers ist an den

nachgeschalteten Differenz-

Verstärker angeschlossen, der den

Sollwert subtrahiert, so dass eine

Spannung analog zum Strom

verfügbar ist. Das

Pipettenpotential setzt sich aus

dem Kommandosignal der

Steuereinheit, das am Verstärkereingang (Stim Input) anliegt, und einer variablen

Haltespannung, die durch das VHold-Potentiomerter (+/-200 mV) eingestellt werden

kann, zusammen. Die Haltespannung, also das Pipettenpotential, wird am

Digitalvoltmeter Vcomm angezeigt. Bei Experimenten mit RGZ wurde ein Haltepotential

von –80 mV gewählt. Die SF21 Zellen hingegen wurden auf –60 mV Haltepotential

geklemmt. Bei der Ermittlung des spannungsabhängigen Summenausstroms wurden

in beiden Zelltypen Pulse über 500 ms eingesetzt. Ausgehend vom Haltepotential

stiegen die Pulse stufenförmig um 10 mV bis auf +100 mV an. Bei der Ermittlung des

Summeneinstroms in RGZ wurde das gleiche Protokoll über 30 ms eingesetzt. Für

Abbildung 1: Schaltplan des VC Modus

18

die Ermittlung der spannungsabhängigen Gleichgewichtsinaktivierung bei RGZ

wurden die Zellen auf ein Haltepotential von –60 mV geklemmt. Ein 500 ms

dauernder Vorpuls wurde stufenförmig um je 10 mV steigend ausgehend von –120

mV auf + 60 mV gegeben. Der nachfolgende 500 ms andauernde Testpuls wurde

nicht variiert und betrug konstant + 60 mV.

2.9.4 Search-Modus

Der Search Modus ähnelt dem Spannungsklemmen Modus. Zusätzlich ist ein

Integrator zugeschaltet, der eine negative Rückkopplung zwischen dem Current

Monitor Signal und dem

Pipettenpotential bewirkt. Die

Rückkopplung regelt das

Pipettenpotential VP so, dass ohne ein

Stim In Signal kein Strom durch die

Pipette fließt. Die Regelung der

Rückkopplung geschieht sehr langsam,

so dass kurze Impulse zur Bestimmung

des Pipetten- und des

Sealwiderstandes nicht kompensiert werden. Dieses verhindert beim Sealen ein

herausdriften des Monitorsignals aus dem Messbereich. Die Geschwindigkeit der

Rückkopplung ist zum Widerstand zwischen Pipetten- und Badelektrode proportional

und zwar mit einer Zeitkonstante von 1 s/10 MΩ.

Abb2: Schaltplan des Search-Modus

2.9.5 Stromklemmen (Current Clamp; CC ) und CC + COMM Mode

Wie auch im Search Mode ist im CC und CC+ COMM Mode zwischen dem Current

Monitor Signal und dem Pipettensignal eine Rückkopplung geschaltet. Hierfür wird

ein als Spannungsfolger geschalteter OPA

eingesetzt, der mit einer Zeitkonstante von

30 µs wesentlich schneller rückkoppelt und

das Pipettenpotential entsprechend

variiert, so dass das freilaufende

Membranpotential konstant 0 mV beträgt.

Am Digitalvoltmeter Vcomm wird das

Abb3: Schaltplan des Stromklemmen Modus 19

Membranpotential angezeigt. Stimm IN und VHold haben im Gegensatz zum Search

Mode keinen direkten Einfluss auf das Membranpotential. Im CC+COMM Modus

werden die Änderungen des Membranpotentials nach Injektion eines

Kommandostroms erfasst. Der injizierte Strom beträgt 1 pA/mV. Er wird durch die

Summe der Spannungen des Haltepotentials VHold und des Stim IN Signals bestimmt.

Bei Experimenten im CC-Modus wurde in die Zelle stufenförmig Strom injiziert. Der

erste Puls betrug 0 pA mit einer Steigerung um 10 pA bei jedem weiteren Puls. Es

wurden Versuche mit 2 verschiedenen Aufnahmezeiten verwandt. Bei Versuchen

über 500 ms wurde das Aktionspotentialmuster bestimmt. Für eine bessere

Auflösung einzelner Aktionspotentiale und deren Ausmessung wurden Experimente

über 30 ms durchgeführt.

2.9.6 Pipetten und Elektroden

Die Pipetten wurden in 2 Schritten aus 7 cm langen Borosilikatkapillaren mit Filament

(Fa. Hilgenberg; Außen 1,5 mm; Innen 0,85 mm; Filament 0,1 mm) hergestellt. Dies

geschah mit einem temperaturkontrollierten, vertikal ziehenden Puller (Heka; Pip 5).

Die Pipetten hatten in TaCSF einen Widerstand von 6-8 MΩ. Die Badelektroden

wurden mit einer Lösung vom 500 mM KCl und 2 % Agar-Agar gefüllt. Dafür wurden

Borosilikatkapilaren (Fa Hilgenberg) mit einem Außendurchmesser von 1mm und

einem Innendurchmesser von 0,8 mm verwendet.

2.9.7 Versuchssteuerung und Erfassung der Messdaten

Die Aufzeichnung der Messdaten und die Steuerung des Digital-Analog-Wandlers

erfolgte über einen IBM kompatiblen PC (486 DX-20; 8 MB RAM). Dabei wurde das

Programmpaket „pclamp 6.0.3“ verwendet. Das Unterprogramm „calmpex“ steuert,

nach vorher festgelegten Parameterdateien, den Digital-Analog-Wandler (Fa. Axon

Instruments; TL-1) an. Dieser erzeugt analoge Ströme aus digitalen Steuersignalen

und leitet sie an den Verstärker weiter. Um ein rauschfreies Signal zu erhalten,

wurden die Verstärkerausgänge (Current Monitor Signal) über einen internen 3-Pol

Besselfilter (10kH) gefiltert. An diesem Ausgang waren parallel 2 Geräte

angeschlossen, so dass das Signal gleichzeitig an den D-A-Wandler und an das

Oszilloskop geleitet werden konnte. Über jede Messung wurde ein Protokollbogen

geführt. Darauf wurden die Daten festgehalten, die der Computer nicht speicherte.

Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Unterprogramm „Clampfit“.

20

2.9.8 Kapazitäts - und Serienwiderstandkompensation

Bei Ganzzellableitungen (Whole Cell recording) im VC-Modus mussten der

Serienwiderstand (RS) und die Membrankapazität (CM) kompensiert werden. Der RS

setzt sich aus dem

Pipettenwiderstand und Resten

der durchbrochenen Zellmembran

zusammen. Während der

Messung in der

Spannungsklemme wird das

Membranpotential (VM) durch das

Pipettenpotential (VP) kontrolliert.

Ein Teil der Kommandospannung

fällt ohne Kompensation am RS

ab, wodurch das

Membranpotential nicht um die

Sollspannung verändert wird und die Messungen verfälscht würden. Der Messfehler

im Membranpotential beträgt bei einem Strom von 1 nA und einem Serienwiderstand

von 10 MΩ 10 mV. Die durch RS verursachten Fehler werden elektronisch korrigiert.

Daneben verlangsamt die RS die Aufladung der Membrankapazität. Die

Gesamtkapazität wird durch die Größe der Zelle und die Eintauchtiefe der Pipette in

die Lösung bestimmt. Die Gesamtkapazität verursacht bei Spannungsstufen

Umladeströme mit langen Zeitkonstanten, welche die Messungen beeinträchtigen.

Deswegen muss die Aufladung der Zellmembrankapazität (CM) beschleunigt werden.

Abb. 4: Ersatzschaltbild einer Ganzzellableitung. Nach durchbrechen der Membran erhält man die Whole-Cell Konfiguration.

Die unkompensierte Zeitkonstante τU der Aufladung beträgt:

τU = unkompensierte Zeitkonstante

τU = RS * CM RS = Serienwiderstand

CM = Zellmembrankapazität

Bei typischen Werten von RS = 10 MΩ und CM = 10 pF beträgt τ = 100 µs. Dieser

Wert ist zu groß, um schnelle spannungsabhängige Ionenströme zu untersuchen.

Um dennoch verwertbare Daten zu erhalten, wird die Aufladung der

Zellmembrankapazität mit Hilfe eines Kompensationsschaltkreises beschleunigt.

21

2.10 Versuchsdurchführung

Bei der Ableitung von RGZ musste eine halbe Stunde vor Versuchsbeginn die

Umlaufkühlung in Betrieb genommen werden, um alle Lösungen und die

Aluminiumkammer 16° C zu temperieren, bei der Messung von Sf21 Zellen war

dieses nicht notwendig. Anschließend wurden das Zellkulturschälchen mit dem RGZ

Abdruck bzw. den Sf21 Zellen in die Versuchskammerhalterung eingesetzt. Der

Lösungsaustausch von Kulturmedium zu TaCSF erfolgte in 2 bis 3 Schritten. Am

Rand des Nunc Dishes wurden die Ab - und Zulaufkanülen montiert und die

Badelektrode eingesetzt. Für jede Messung wurde eine neue Pipette benutzt. Nur in

die Spitze der Glaselektrode wurde Pipettenlösung eingefüllt, so dass der Silberdraht

der Elektrode gerade in die Pipettenlösung tauchte. Dies war notwendig, um

Umladeartefakte zu minimieren. Beim Eintauchen der Pipette in das Messmedium

musste ein leichter Überdruck an die Pipette angelegt werden, um eine

Verunreinigung der Pipettenspitze zu verhindern. Der zwischen Badelektrode und

Pipette bestehende kleine Potentialunterschied wurde mit dem VP-ZERO

Potentiometer kompensiert. Um den Widerstand der Pipette zu bestimmen, wurde im

Search Mode eine Spannung von 1 mV an die Pipette angelegt. Ein Puls von 1 mV

lässt durch eine 1 MΩ Pipette einen Strom von 1 nA fließen, durch eine Pipette mit

einem Widerstand von 10 MΩ fließt ein Strom von 0,1 nA. Nur Pipetten mit einem

Widerstand von 6-8 MΩ wurden für die Versuche verwendet. Mit Hilfe des

Mikromanipulators, unter Anlegen eines Überdrucks, wurde die Pipette an die zu

messende Zelle herangefahren. Zeigte sich in der Zellmembran eine leichte Wölbung

durch den Überdruck, wurde dieser abgelassen und unter leichtem Saugen die

Zellmembran an die Pipettenspitze gesaugt, so dass die Spitze der Pipette auf der

Membran aufsaß. In diesem sogenannten „Cell attached Mode“ der „Patch Clamp“

Technik stieg der Widerstand der Pipette an. Die Umladeartefakte der

Membrankapazität wurden mit C-Fast und τ-Fast kompensiert. Um den „Whole Cell“

Modus der Patch Clamp“ Technik zu erreichen, musste das Stückchen (patch)

Membran zwischen Pipettenspitze und Zellinnerem entfernt werden, um einen

Zugang zum Zellinneren über die Pipette zu schaffen. Dies geschah durch

intervallartiges Saugen. Das Ereichen der „Whole Cell“ Konfiguration konnte über ein

Ansteigen der Membrankapazität nachvollzogen werden. Der Widerstand stieg

gleichzeitig in den GΩ Bereich an. Der sogenannte „Gigaseal“ war erreicht. Der

22

Unterdruck wurde vorsichtig abgelassen. Die Membrankapazität und der

Serienwiderstand wurden durch C-Slow und G-Series minimiert. Nach diesen

Kompensationsschritten waren Spannungs- und Stromklemmenexperimente möglich.

23

3 Ergebnisse

3.1 Entwicklung von RGZ

Die Entwicklung von Forellen ist in verschiedene Stadien gegliedert. Diese sind bei

Vernier (1969) beschrieben. Das Schlüpfen der Tiere erfolgt bei Stadium 30. Von

jungen adulten Forellen wird ab Stadium 37 gesprochen. Mit der morphologischen

Entwicklung geht die Reifung der Retina einher. Die RGZ müssen wachsen und

Verbindungen mit den Interneuronen ausbilden. Die Axone aller RGZ bilden den

Sehnerv. Dieser wächst während Stadium 28 in das optische Zentrum (Tectun

opticum = TO) des Forellengehirns ein. Mit dem Gewebeabdruckverfahren ist es

möglich RGZ ab Stadium 26 zu isolieren. In früheren Stadien ist die Retina zu klein.

3.2 Entwicklung der Aktionspotentiale Neuron zeichnet die Fähigkeit zur Generation von Aktionspotentialen, sowohl

spontan als auch nach Reizung aus. Bei RGZ kann beides beobachtet werden. Die

Generation von Aktionspotentialen ohne vorhergehende Reizung wurde für

verschiedene RGZ Stadien in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst.

Entwicklungsstadium

der Zellen

26-30

31 33 35 Adult

Anteil der Zellen,

die Spontanaktivität

zeigen [%].

4

12,1 28,6 57,7 65,7

Tab.1: Anteil der RGZ, die Aktionspotentiale ohne induzierte Reizung generieren.

Die ersten spontan generierten Aktionspotentiale wurden im Stadium 29 gemessen.

Vor dem Schlupf der Fische kann insgesamt kaum Spontanaktivität nachgewiesen

werden. Danach steigt sie deutlich von Stadium zu Stadium. Die Steigerung der

Spontanaktivität geht mit der morphologischen Reifung der Tiere einher. Ein weiterer

wichtiger Punkt besteht in der Fähigkeit der RGZ Aktionspotentiale nach induzierter

Stromgebung zu generieren, um auf einen Reiz von Außen zu reagieren und damit

Informationen weiterzuleiten. Um diese Fähigkeit zu testen, wurden RGZ mit

24

verschiedenstarken Strompulsen gereizt und die Antwort der Zelle, die

Aktionspotentiale, aufgezeichnet. Im ersten Schritt der Auswertung wurde die

Erregbarkeit der Zellen festgestellt. Eine Zelle wurde als erregbar eingestuft, wenn

sie mindestens 1 Aktionspotential im Rahmen der Messungen generierte.

Entwicklungsstadium 27 30 32 35 Adult

Prozentsatz der

erregbaren Zellen.

66,7 69 92 96 94

Tab.2: Anzahl der RGZ, die auf Strompulse von 10 bis 100 pA in 10 pA Schritten in 500 ms

mindestens ein Aktionspotential generierten.

Schon vor dem Schlupf gelten 2 von 3 Zellen als erregbar. Danach steigt der Wert

sprunghaft bei Stadium 32 auf das Niveau der adulten Zellen an. In weiterführenden

Untersuchungen wird die Anzahl der Aktionspotentiale, der verschiedenen

Entwicklungsstufen betrachtet.

0

2

4

6

8

20 30 40 50 60 70

Reizstrom [pA]

Anz

ahl d

er A

ktio

nspo

tent

iale

Abb. 5: Die Anzahl der Aktionspotentiale bei einem Strom von 10 bis 80 pA über 100 ms in

verschiedenen Entwicklungsstadien. Schwarz = adult; Gelb = Stadium 35; Rot = Stadium 34;

Blau = Stadium 31-33; Grün Stadium 26-30.

25

Hier zeigt sich ein deutlicher Unterschied zwischen den Entwicklungsstadien. Je

reifer die Zellen sind, desto stärker antworten sie auf eine Erhöhung des Reizes mit

einer Steigerung der Aktionspotentialfrequenz. Die Stadien 26-30 generieren nur 1

bis 2 Ap´s unabhängig von der Reizintensität. Die Fähigkeit zur Signalcodierung

steigt signifikant im Rahmen der Reifung an. Dies spiegelt sich auch in einer

genaueren Betrachtung der Ap Anzahl wieder. RGZ wurden nach der maximalen

Anzahl der generierten Aktionspotentiale in drei Gruppen unterteilt.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

26-29 30-31 32-33 34 35 adult

Entwicklungsstadium

Anz

ahl d

er A

ktio

nspo

tent

iale

[%]

Abb. 6: Anzahl der Aktionspotentiale, die in verschiedenen RGZ Entwicklungsstadien bei einer

Stromgebung von 50 pA über 100 ms generiert werden (schwarz = 1 Ap; blau 2-5 Ap´s; rot 6 bis 8

Ap´s).

Die Anzahl der generierten Aktionspotentiale ist in den verschiedenen Stadien

unterschiedlich. Vor und kurz nach dem Schlupf wird hauptsächlich ein einzelnes

Aktionspotential generiert (Stadium 26-31). Ab Stadium 32 zeigt ein Grossteil der

Zellen ein Erregungsmuster mit 2-5 Ap. Späte Stadien und reife Zellen zeigen 6-8

Aktionspotentiale als Antwort auf die Reizung.

26

A B C

Abb.:7: Originalregistrierungen von Ap´s bei einem Reizstrom von 50 pA über 500 ms. A: Stadium 29;

B: Stadium 32; C: adulte RGZ.

Bei der Betrachtung der Aktionspotentialmuster in den unterschiedlichen

Entwicklungsstufen zeigen sich erhebliche Unterschiede. Für eine detaillierte

Auswertung einzelner Aktionspotentiale mussten Messungen mit einer höheren

Auflösung der Signale durchgeführt werden. Als ersten Punkt betrachtete ich die

maximale Depolarisation, die Höhe der Aktionspotentiale, in den verschiedenen

Stadien.

Stadium 26-29 31 35 Adult Maximale Depolarisation [mV]

0,4 ±1,56

5,6 ± 2,25

15,1 ±2,02

20,6 ± 2,23

Tab.3: Die maximale Depolarisation des 1. Ap´s bei einer Stromapplikation von 50 pA über 30 ms in verschiedenen RGZ Stadien. Die maximale Depolarisation steigt kontinuierlich von 0 mV bei Stadium 26-29 auf

+20 mV in den adulten Zellen. Die Höhe der Aktionspotentiale steigt parallel mit dem

Entwicklungsstand der Zellen. Als zweiter Parameter bei der Auswertung wurde die

Dauer bzw. die Breite der einzelnen Aktionspotentiale ermittelt, indem die Zeit

zwischen dem Startpunkt und dem Repolarisationsmaximum ausgemessen wurde.

27

0

1

2

3

4

5

6

26-28 29 30-31 32 33 34 35 36 adult

Stadium

Dau

er d

er A

p´s

[ms]

Abb. 8: Die Dauer

des 1. Aktionspotentiales

gemessen vom

Startpunkt zum

Repolarisationsmaximum

bei einer Stromgebung von

100 pA über 30 ms.

Von Stadium 26 bis 32 zeigt sich keine signifikante Veränderung in der Breite der

Aktionspotentiale. Zwischen Stadium 32 und 33 verkürzt sie sich sprunghaft von 4,6

auf 2,9 ms. Danach sinkt der Wert kontinuierlich bis auf 2,2 ms bei den adulten RGZ.

Die Aktionspotentiale werden schmaler und es können folglich mehr

Aktionspotentiale in reifen RGZ pro Zeiteinheit generiert werden als in unreifen. Die

starke Verkürzung der Aktionspotentiale zwischen Stadium 32 und 33 deutet auf eine

drastische Veränderung der zugrundeliegenden Ströme in dieser Phase der

Entwicklung hin. Da die Aktionspotentiale im Zuge der Reifung schmaler und höher

werden, muss die aufsteigende (Slope up) oder die absteigende (Slope down)

Flanke des Aktionspotentiales steiler werden.

Stadium 26 –30 Adult

Slope up [mV/ms] 74,6 ±9,3 124 ±13

Slope down [mV/ms] 73 ± 7,5 86 ±11

Tab. 4: Slope up und Slope down Werte von RGZ bei einer Stromgebung von 50 pA über 30 ms.

Im Vergleich von RGZ, vor dem Schlupf (26-30), und adulten Zellen steigt der Slope

up um 66 %, wobei der Slope down um 18 % zunimmt. Die zeitliche Verkürzung und

stärkere Depolarisation der Aktionspotentiale während der Reifung wird

hauptsächlich durch den steileren Anstieg bedingt. Dadurch können in adulten RGZ

mehr Aktionspotentiale innerhalb eines bestimmten Zeitraums im Vergleich zu

28

frühen Stadien generiert werden. Diese Unterschiede müssen durch die den Ap´s

zugrunde liegenden Ströme erklärt werden.

3.3 Charakterisierung spannungsabhängiger Summeneinströme Als erster Schritt bei der Generation eines Aktionspotentiales fließt ein

spannungsabhängiger Natriumstrom in die Zelle und erzeugt eine Depolarisation.

Zeitverzögert werden Kaliumkanäle geöffnet und wirken dem Natriumstrom

entgegen. Aus dem Zusammenspiel von spannungsabhängigen Natrium - und

Kaliumkanälen entsteht ein Aktionspotential. Neben den Natriumionen wird der Strom

in die Zelle noch von weiteren Ionen, vornehmlich von Kalzium, getragen.

Vorhergehende Experimente mit dem Natriumkanalblocker TTX und der Substitution

von Natrium durch Tris zeigten, dass der Hauptanteil des Einstromes in adulten RGZ

durch Natrium getragen wird (Vent , Diplomarbeit). Diese Untersuchungen wurden

durch den Einsatz des Kalziumkanalblockers CoCl2 bestätigt. Die Höhe des

Summeneinstromes wurde für verschiedene RGZ Stadien bestimmt.

Stadium 26-28 31 33 adult

Summeneinstrom [mV] -1029 ±93 -963 ±120 -1017 ±100 -1021 ±81

Tab. 5: Höhe des maximalen Summeneinstromes in RGZ bei einen Haltepotential von –80 mV und

einem Spannungspuls von –20 mV.

Bei der Höhe des maximalen Summeneinstromes ist keine deutliche Veränderung für

die verschiedenen Entwicklungsstadien festzustellen. In den Stadien vor dem

Schlupf werden schon die adulten Werte erreicht. In allen Stadien beträgt der

Einstrom ca. 1 nA. Für einen genaueren Vergleich wurden die I/U (Strom /

Spannung) Kennlinien des Summeneinstroms verschiedener Entwicklungsstadien

zusammengefasst.

29

-1300

-1100

-900

-700

-500

-300

-100

100

-80 -60 -40 -20 0 20 40

Spannung [mV]S

trom

[pA

]

Abb.9: I/U Diagramm des Summeneinstroms von RGZ verschiedener Stadien (Blau 26-28; Rot 32;

Schwarz adult). Die Zellen wurden von einem Haltepotential von –80 mV aus in 10 mV Schritten über

30 ms bis auf +50 mV gereizt.

Stadium 28 Stadium 32 Adult

Abb. 10 Originalregistrierung der Summeneinströme von RGZ der Stadien 28, 32 und Adult. Die

Zellen wurden von einem Haltepotential von –80 mV aus in 10 mV Schritten über 30 ms bis auf + 50

mV gereizt.

Bei der Betrachtung dieser I/U Kennlinien und Originalregistrierungen sind keine

signifikanten Unterschiede zwischen den RGZ Stadien erkennbar. Die Höhe und der

Verlauf des Summeneinstromes ist folglich nicht für die unterschiedlichen

Aktionspotentiale während der Reifung der RGZ verantwortlich. Deshalb betrachtete

ich ausführlich die Summenausströme.

30

3.4 Charakterisierung von passiven Membraneigenschaften und

Kaliumkanalmustern

Für die Charakterisierung von Neuronen sind die passiven Membraneigenschaften

der Zelle, wie Größe und Membranpotential, von Bedeutung. Die Größe einer Zelle

kann auf verschiedenen Wegen festgestellt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde

sie indirekt über die Höhe der Zellkapazität bestimmt.

Stadium 26 30 32 33 35 Adult

Zellkapazität

[pF]

4,7

±0,6

5,2

±0,48

5,7

±0,46

4,96

±0,36

5,79

±0,27

5,62

±0,45

Tab. 6 Zellkapazität von RGZ in verschiedenen Entwicklungsstadium

Die Kapazität der Zellen beträgt in allen Stadien zwischen 4,7 und 5,7 pF. Es ist

keine signifikante Veränderung im Rahmen der Reifung der RGZ festzustellen. Das

Größenwachstum ist bei dem jüngsten für die Messungen zugänglichen Stadium

schon abgeschlossen. Neben der Größe ist das Membranpotential (VM) ein wichtiges

Kriterium bei der Beschreibung von Neuronen.

Stadium 26 28 30 32 34 Adult

VM [mV] -41,3

±1,6

-39,8

±2,4

-41,8

±1,1

-45,1

±2,2

-46,6

±2,1

-51,1

±1,1

Tab. 7 Membranpotential von RGZ in verschiedenen Entwicklungsstadien

In den Stadien 26 –30 beträgt das Membranpotential konstant ca. -41 mV. Es erhöht

sich signifikant bei Stadium 32 auf –45 mV und zwischen Stadium 34 und 37 von –46

auf –51 mV. Diese Untersuchungen zeigen die Altersabhängigkeit des

Membranpotentials. Je jünger die Zellen sind, desto positiver ist ihr Potential. Neben

der Ermittlung der passiven Eigenschaften sind die aktiven Membraneigenschaften

von Bedeutung. Zu diesen zählen die bereits dargestellten spannungsabhängigen

Summeneinströme. Diesen wirken die spannungsabhängigen Summenausströme

31

entgegen. Die Maxima der Ausströme von RGZ in verschiedenen

mm zusammengefasst.

Entwicklungsstadien sind im nachfolgenden I/U Diagra

bb. 11: Maximum des

ummenausstroms von RGZ

Zuge der Reifung der Zellen ist ein Anstieg des maximalen Summenausstroms

on 1734 pA ±165 bei Stadium 26 auf 2320 pA ±138 bei adulten Zellen zu

29 31 33 35 Adult

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

26-28 29-30 31 32 33 35 adult

Entwicklungsstadium

Stro

m [p

A]

A

S

verschiedener Entwicklungsstadien

bei einem Haltepotential von –80 mV

und einer gegebenen Spannung von

+100 mV über 500 ms.

Im

v

beobachten. Die signifikanteste Stromzunahme ist kurz nach dem Schlupf zwischen

den Stadien 30 und 31 zu beobachten. Danach steigt der Strom nicht mehr deutlich

an. Eine genauere Methode für den Vergleich der Strommaxima von Zellen stellt die

Ermittlung der Stromdichte der Zellen dar. Dabei wird der Strom im Verhältnis zur

Zellgröße betrachtet.

Stadium 27

Stromdichte 329

364

413

470

447

464

[pA/pF] ±65 ±59 ±34 ±46 ±58 ±44

Tab.8: Stromdich Spa und Ha ential von –80 mV in

denen Entwicklungsstadien.

t nach dem Schlupf der Fische an. Bei Stadium 33 ist

er Wert der adulten Zellen erreicht. Im Summenausstrom zeigt sich im Gegensatz

te der RGZ ermittelt bei +100 mV nnung einem ltepot

verschie

Die Stromdichte der RGZ steig

d

zum Summeneinstrom eine drastische Veränderung im Rahmen der Entwicklung der

RGZ. Somit sind die Summenausströme für die Veränderung der Aktionspotentiale

während der Entwicklung verantwortlich. In der nachfolgenden Betrachtung wurde

32

die Frage untersucht, ob die Stromerhöhung durch vermehrten Einbau der

vorhandenen Ionenkanäle oder durch den zusätzlichen Einsatz von neuen Kanälen

erreicht wird. Da jeder Kanal ein für ihn typisches Strommuster aufweist, kann bei der

Betrachtung der Summenausströme ein erster Hinweis auf unterschiedliche, dem

Strom zugrunde liegenden Kanäle gezeigt werden. Bei der Betrachtung der

Originalregistrierungen von Summenausströmen verschiedener RGZ Stadien zeigen

erste Anzeichen dafür.

Abb.12: Originalregistrierung der Summenausströme von RGZ Stadium 30 (A), 35 (B) und eine

dulten (C) Zelle. Die RGZ wurden auf ein Haltpotential von –80 mV geklemmt. Die Spannungspulse

s sind erhebliche Unterschiede zwischen den Summenströmen zu erkennen. Das

dulte Strombild zeigt einen typischen, nicht inaktivierenden KD Strom, wohingegen

r

a

wurden davon ausgehend in 10 mV Schritten stufenförmig über 500 ms bis auf +100 mV gegeben.

E

a

das juvenile Strombild einen großen Anteil inaktivierenden IA Strom aufweist. Dies

deutet auf unterschiedliche Kaliumkanäle, die den Strömen zu Grunde liegen hin.

Der Anteil des nicht inaktivierenden KD-Stroms wurde im Rahmen der Reifung der

RGZ ermittelt. Beträgt der Wert 100 %, so handelt es sich um einen nicht

inaktivierenden Strom. Beträgt er 50 %, so inaktiviert der Strom um die Hälfte.

33

bb.13: Anteil des nicht

aktivierenden Stromes in

In den Stadien vor dem Schlupf ist keine signifikante Veränderung festzustellen. Ab

tadium 31 steigt der Anteil des nicht inaktivierenden Stromes kontinuierlich an.

A

40

50

60

70

80

90

100

26 27 29 30 31 32 33 34 35 36 adult

Stadium

Nic

ht in

aktiv

iere

nder

Stro

m [%

in

verschiedenen RGZ

Entwicklungsstadien. Der

Strom wurde bei einem

Haltepotential von –80 mV

und einer 500 ms

dauernden Messspannung

von 100 mV gemessen.

Der Stromwert von 200 ms

wurde durch den Wert bei

15 ms geteilt.

S

Wobei ein sprunghafter Anstieg zwischen Stadium 33 und 34 zu beobachten ist. Dies

deutet auf unterschiedliche Kaliumkanäle in den verschiedenen RGZ

Entwicklungsstadien hin. Neben der Morphologie des Stromes ist die Kinetik ein

weiteres, wichtiges Charakteristikum für die Zuordnung von Strömen zu den

zugrunde liegenden Kaliumkanälen. In den nachfolgenden Versuchen wurde das

Öffnungs- und Schließungsverhalten der Kanäle, nach unterschiedlicher

Spannungsgebung untersucht. Die Strommaxima wurden beim Testpuls ermittelt und

in einem I/U Diagram dargestellt.

34

Abb.14: Originalregistrierungen der Kinetik. Links Stadium 29, rechts Stadium 34. Ein Vorpuls wurde

über 500 ms von –120 auf + 40 mV in 10 mV Schritten appliziert. Der Testpuls betrug +60 mV über

500 ms.

Zeigen sich Unterschiede im Verlauf der Kurven, so liegen den Summenströmen

unterschiedliche Kanäle zugrunde. Neben dem Kurvenverlauf ist die halbmaximale

Inaktivierung des Summenstromes zu betrachten. Dieser IC 50 Wert gibt die

Spannung an, bei der die Hälfte der Kanäle geschlossen ist.

-120 -80 -40 0 400,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Stro

m [I

/Imax

]

Vorpuls [mV] Abb.15: Ergebnisse der Kaliumkanalkinetik. (Schwarz Stad. 29/30; Rot = 31; Grün 34/35; Blau = adult) Die Zellen

wurden auf ein Haltepotential von – 60 mV geklemmt. Ein Vorpuls über 500 ms von –120 auf + 40 mV wurde in

10 mV Schritten stufenförmig appliziert. Der Testpuls betrug +60 mV über 500 ms. Das Strommaximum wurde

nach den verschiedenen Vorpulsen ermittelt und der Strom normiert dargestellt. Die IC 50 Werte sind mit den

gestrichelten Linien gezeigt. Die Kurven wurden durch eine modifizierte Boltzmann Gleichung angenähert.

35

Der Kurvenverlauf verschiebt sich signifikant mit jedem weiteren

Entwicklungsstadium in den positiveren Bereich. Dabei berühren sich die Kurven

nicht. Die Auswertung der IC 50 Werte verdeutlicht dieses.

Stadium 29 31 33/34 36

IC 50 [mV] -45 -31,7 -13,3 -1,6

Tab.9: Errechnete IC 50 Werte der Kaliumkanalkinetik.

Die IC 50 Werte verschieben sich deutlich von –45 mV bei Stadium 29 auf –1,6 mV

bei Stadium 36. Dabei ist eine kontinuierliche Verlagerung der Werte in positiver

Richtung zu beobachten. Zusammen mit der I/U Auswertung der Kinetik kann

angenommen werden, dass in jüngeren Stadien Kanäle expremiert werden, die bei

negativeren Spannungen schließen als die der weiter entwickelten RGZ. Die

vorhergehenden Auswertungen zeigten deutlich, dass in der Entwicklung der RGZ

der Summenausstrom steigt und die Zusammensetzung der zugrunde liegenden

Kanäle sich verändert. Welche Ionenkanäle hierbei eine Rolle spielen soll in einer

weiterführenden pharmakologischen Untersuchung geklärt werden.

3.4.1 Hauptklassen von Kaliumkanälen

Die Summenausströme der adulten RGZ wurden in vorhergehenden Arbeiten

untersucht (Pöttering, Vent, Stegmann). Sie werden hauptsächlich von zwei

verschiedenen Kaliumkanalpopulationen getragen. Den spannungsabhängigen

Kaliumkanälen wie den Shaker und Shaw und den kalziumabhängigen

Kaliumkanälen. Diese sind in adulten RGZ durch Iberiotoxin blockierbar und gehören

folglich der Gruppe der BK Kaliumkanäle an. Durch den Austausch von CoCl2 für

CaCl2 in der Badlösung kann der Kalziumeinstrom in die Zelle unterbunden und die

kalziumabhängigen Kaliumkanäle indirekt blockiert werden. Um den Anteil von

kalziumabhängigen Kaliumkanälen am Summenausstrom der RGZ während der

Reifung zu bestimmen, wurde der Summenausstrom in TaCSF bestimmt und

anschließend 0,2 mM CoCl2 oder 100 µM Iberiotoxin eingespült.

36

0

5

10

15

20

25

30

35

Stad 29-31 Stad 32-33 adult

Entwicklungsstadium

Red

uktio

n de

s S

umm

enau

sstro

mes

[%]

Abb.16: Die Reduktion des maximalen Summenausstromes durch 0,2 mM CoCl2 (Blau) und 100 µM

Iberiotoxin (Rot) bei einer Spannung von 100 mV über 500 ms und einem Haltepotential von –80 mV.

Die Reduktion des Summenausstromes durch CoCl2 und Iberiotoxin erreicht in allen

drei untersuchten Stadien die gleichen Werte. Die kalziumabhängigen

Summenströme werden durch Kaliumkanäle der BK Familie getragen. Dabei erreicht

die Hemmung in den verschiedenen Stadien ein verschiedenes Niveau. In juvenilen

RGZ vor dem Schlupf erfolgt keine signifikante Hemmung durch Iberiotoxin oder

CoCl2. Erst nach dem Schlupf steigt bei Stadium 32/33 der Anteil des

kalziumabhängigen Stromes am Gesamtstrom an und erreicht in adulten RGZ einen

Wert von ca. 30 %. Um festzustellen, ob die BK Kanäle eher den IA oder den KD

Stromanteil des Summenausstromes beeinflussen, wurde die Hemmung durch CoCl2

für unterschiedliche Zeitpunkte bestimmt.

37

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

27-30 33 adult

Stadium

Stro

mre

dukt

iom

[%]

Abb.17: Die Reduktion des maximalen Summenausstromes durch 0,2 mM CoCl2 bei einer Spannung

von 100 mV über 500 ms und einem Haltepotential von –80 mV. Der Peakstrom (schwarz) wurde bei

15 ms der KD-Strom (rot) bei 200 ms ermittelt.

Der Peak und KD Strom werden im gleichen Maße durch CoCl2 gehemmt. Der Anteil

von kalziumabhängigen Kaliumkanälen ist somit beim inaktivierenden und nicht

inaktivierendem Strom gleich.

3.4.2 Spannungsabhängige Kaliumkanäle

3.4.2.1 Charakterisierung des IA Stroms in adulten RGZ

Der Summenausstrom der adulten RGZ besteht aus 2 unterschiedlichen

Komponenten. Der langsam aktivierende und nicht inaktivierende Stromanteil wird

als KD Strom bezeichnet. In Gegensatz dazu steht der IA Strom, welcher schnell

aktiviert und schnell inaktiviert. Aus der Addition dieser Ströme ergibt sich das

Summenausstrommuster. Durch den Einsatz der Kaliumkanalblocker Chinin und

Iberiotoxin wurde der Hauptanteil des KD Strom blockiert. Bei diesen Experimenten

wurde ein IA Strom sichtbar. Aufgrund vorhergehender Arbeiten (Pöttering 2000)

könnte es sich um einen Kv. 3.4 Kaliumkanal handeln. Dessen Strom wird durch das

Seeanemonengift BDS-l blockiert (Diochot et al1998)

38

Abb.18: Der Summenausstrom einer adulten RGZ wurde in

100 µM Chinn und 0,2 mM CoCl2 bei einem Haltepotential

von –80 mV gemessen (A). Die Spannung wurde vom

Haltepotential ausgehend in 10 mV Schritten stufenförmig

bis auf +100 mV appliziert. Der Summenausstrom der

selben Zellen (B) mit 100 µM Chinin, 0,2 mM CoCl2 und

100 nM BDS. Bei C ist der Subtraktionsstrom der

Stromspuren von A-B dargestellt. 150 pA40 ms

A

B

C

Deutlich wird die IA Komponente des

Summenausstromes in Anwesenheit von Chinn

und CoCl2 hervorgehoben. Durch den Einsatz

des Blocker BDS l wurde keine signifikante

Reduktion des IA Stromes erreicht. Dieser Anteil

des Stromes kann folglich nicht durch Kv 3.4

Kanäle getragen werden.

3.4.2.2 Charakterisierung des Summenausstromes in RGZ

In RGZ vor dem Schlupf kann ein Summenausstrom um 1,7 nA gemessen werden.

Dieser Strom wird nicht durch kalziumabhängige Kaliumkanäle verursacht. Er kann

jedoch, wie in den adulten Zellen gezeigt (Vent 1999; Pötteing 2000; Stegmann

1998) durch spannungsabhängige Kaliumkanäle getragen werden. Durch den

Einsatz des Kaliumkanalblockers TEA (Grissmer et al 1994) in einer hohen

Konzentration können viele spannungsabhängige Kaliumkanäle, z.B. einige des

Shaker Typs gehemmt werden.

Peakstrom KD-Strom

Reduktion durch 2 mM

TEA [%]

78,4 ± 5 73 ± 3,6

Tab. 10: Reduktion des maximalen Summenausstroms von RGZ Stadium 29 und 30 durch 2 mM TEA.

Die Zellen wurden auf ein Haltepotential von –80 mV geklemmt und über 500 ms die Reizspannung

von 100 mV appliziert. Der Peakstrom wurde bei 15 ms, der KD bei 200 ms ermittelt.

39

Über 70 % des Summenausstromes von RGZ der Stadien 29 und 30 wird durch den

Einsatz von 2 mM TEA blockiert. Dabei werden IA und KD Strom gleichstark

gehemmt. Der Anteil des durch spannungsabhängige Kaliumkanäle getragen

Stromes kann noch weit höher liegen, da einige dieser Kanäle TEA insensitiv sind.

Für die genaue Zuordnung der Ströme zu einem bestimmten Kaliumkanal müssen

spezifische Blocker eingesetzt werden. In vorhergehenden Untersuchungen wurden

Kaliumkanäle aus dem ZNS der Forelle heterolog expremiert (Ngyuen et al 2000)

und elektrophysiologisch gemessen. Die dabei durchgeführte pharmakologische

Charakterisierung zeigte für den Shaker Kaliumkanal Tsha 2 die vollständige

Blockierung durch 100 µM TEA. Kann in Vorschlupf RGZ ein auf 100 µM TEA

reagierender Strom nachgewiesen werden, so kann dieser durch Tsha 2

Kaliumkanäle getragen werden.

Stadium 29

Stadium 34

Abb. 19: Originalregistrierungen des Summenausstromes von 2 RGZ Stadium 29 (oben) und 34

(unten). Die Zellen wurden auf ein Haltepotential von –80 mV geklemmt. Davon ausgehend wurden

die Spannungspulse in 10 mV Schritten stufenförmig über 500 ms bis auf + 100 mV gegeben. Die

Messungen wurden in TaCSF (links) durchgeführt und anschließend in 100 µM TEA (Mitte)

wiederholt. Der Subtraktionsstrom (TaCSF - 100 µM TEA) ist Rechts dargestellt.

40

0

10

20

30

40

50

60

70

26-28 29-30 31-32 33-34 35 adult

Stadium

Red

uktio

n de

s Su

mm

enau

sstro

ms

[%]

Abb. 20: Reduktion des maximalen Summenausstromes durch 100 µM TEA gemessen bei einem

Haltpotential von –80 mV und einer Spannung von 100 mV über 500 ms. Blau = Peakstrom bei 15 ms;

Rot = KD Strom bei 200 ms

Durch die geringe Dosierung von TEA wird im Gegensatz zum Einsatz von 2 mM

TEA ein höherer Anteil an KD Strom gehemmt. Eine deutliche Reduktion des

Summenausstromes durch 100 µM TEA erfolgt erst nach dem Schlupf bei Stadium

32. In RGZ vor dem Schlupf wird folglich kein signifikanter Anteil des Stromes durch

Tsha 2 Kaliumkanäle getragen. Neben Tsha 2 wurde ein weiterer Shakerkanal aus

dem ZNS der Forelle (Tsha 1) in vorhergehenden Untersuchungen heterolog

expremiert sowie elektrophysiologisch und pharmakologisch charakterisiert (Nguyen 2000). Seine Expression in adulten RGZ wurde mit dem Einsatz des für Tsha 1

spezifischen Blockers DTX nachgewiesen. Die Reduktion des Summenausstromes in

verschiedenen RGZ Stadien durch den Einsatz von 1 µM DTX wurde untersucht.

41

Stadium 30 / 31

Stadium 34 / 35

TaCSF DTX Subtraktionsstrom

Abb. 21: Originalregistrierungen des Summenausstromes von RGZ Stadium 30 / 31 (oben) und 34 /

35 (unten). Die Zellen wurden auf ein Haltepotential von –80 mV geklemmt. Davon ausgehend wurden

die Spannungspulse in 10 mV Schritten stufenförmig über 500 ms bis auf + 100 mV gegeben. Die

Messungen wurden in TaCSF (links) durchgeführt und anschließend in 1 µM DTX (Mitte) wiederholt.

Der Subtraktionsstrom (TaCSF - 1 µM DTX) ist Rechts dargestellt.

0

10

20

30

40

26/27 30/31 32 34/35

Stro

mre

dukt

ion

[%]

Abb.22: Reduktion des Summenausstromes von RGZ durch 1 µM DTX. Der maximale

Summenausstrom wurde bei einem Haltepotential von –80 mV und einer Spannungsgebung von 100

mV über 500 ms in TaCSF und in Anwesenheit von 1 µM DTX ermittelt.

42

In den Stadien vor dem Schlupf ist durch den Einsatz von 1 µM DTX nur eine geringe

Reduktion des Summenausstromes um 6 % feststellbar. Nach dem Schlupf steigt der

Anteil auf 15 % bei Stadium 32 und weiter auf 26 % bei Stadium 34/35 an. Der

Summenausstrom in RGZ vor dem Schlupf wird nicht hauptsächlich durch Tsha 1

und Tsha 2 Kaliumkanäle getragen, da sonst eine höhere Stromreduktion mit DTX

und 100 mM TEA erreicht werden müsste. Bei adulten RGZ wird 80 % des

spannungsabhängigen Summenausstromes durch 100 µM Chinin gehemmt (Henne

et al 2000). Sollte dieser Blocker eine Reduktion des Stromes bei Vorschlupf RGZ

verursachen, so könnte dem Ausstrom ein spezifischer Kaliumkanal zugeordnet

werden.

TaCSF Chinin Subtraktionsstrom

Stadium 28

Stadium 34 / 35

Abb. 23 Originalregistrierungen des Summenausstromes von RGZ Stadium 28 (oben) und 34 / 35

(unten). Die Zellen wurden auf ein Haltepotential von –80 mV geklemmt. Davon ausgehend wurden

die Spannungspulse in 10 mV Schritten stufenförmig über 500 ms bis auf + 100 mV gegeben. Die

Messungen wurden in TaCSF (links) durchgeführt und anschließend in 100 µM Chinin (Mitte)

wiederholt. Der Subtraktionsstrom (TaCSF - 100 µM Chinin) ist Rechts dargestellt.

43

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

27/28 31/30 32/33 34/35 adult

Stadium

Red

uktio

n de

s S

umm

enau

sstro

mes

[%]

Abb.24: Reduktion des Summenausstroms von RGZ durch 100 µM Chinin. Die Zellen wurden auf ein Haltepotential von –80 mV geklemmt und der maximale Ausstrom in TaCSF und 100 µM Chinin bei einem Spannungspuls von 100 mV über 500 ms gemessen. Der Peakstrom (blau) wurde bei 15 ms, der KD Strom (rot) bei 200 ms ermittelt.

In keiner RGZ konnte vor dem Zeitpunkt des Schlüpfens eine Reduktion des Stromes

durch Chinin festgestellt werden. Nach dem Schlupf steigt der Anteil des chinin-

sensitiven Stromes bei Stadium 30 / 31 sprunghaft auf 49 % Peak und 73 % KD an.

Diese Werte verändern sich im Rahmen der Reifung nicht signifikant. Die Reduktion

bei adulten RGZ beträgt am Peak gemessen 50 % und die des KD Stroms 73 %. In

allen Stadien blockiert Chinin den KD Strom deutlich stärker als den Peakstrom.

Durch die Experimente mit den spezifischen Kaliumkanalblockern, TEA, Chinin und

DTX wurde gezeigt, dass die Zusammensetzung der Kaliumkanäle in RGZ vor und

nach dem Schlupf bzw. in adulten Zellen völlig verschieden ist. Um den Zeitpunkt des

Schlüpfens findet ein völlige Neuzusammensatzung der Kaliumkanäle und deren

daraus resultierenden Ströme statt.

44

3.4.2.3 Heterologe Expression von Kv3.1 in Sf21 Zellen

Ein wesentlicher Teil des spannungsabhängigen Summenausstromes wird in adulten

RGZ von einem chininsensitiven Kaliumkanal getragen. Kaliumkanäle der Shaw

Familie zeigen dieses pharmakologische Profil. In früheren Studien wurde ein Shaw

Kaliumkanal (Trout Shaw = Traw1) aus dem ZNS der Forelle isoliert (Panofen et al

2000). Dieser Traw1 wurde in das Baculovirus-Expressionssystem kloniert und Viren

mit einem C-terminalen GFP-Fusionsprotein generiert. Die damit infizierten Sf21

Zellen konnten leicht über ihre grüne Fluoreszenz identifiziert werden. Die

Verwendung von Sf21 Zellen für die heterologe Expression von

spannungsabhängigen Kaliumkanälen bietet viele Vorteile. Die Zellen sind in der

Zellkultur sehr anspruchslos und einfach zu vermehren. Sie sind relativ groß, rund

und bilden keine Zellausläufer wie z.B. CHO Zellen. Dies erleichtert die Messungen

erheblich. Sf21 Zellen zeigen zusätzlich nur einen geringen Eigenstrom von ca. 200-

300 pA. Bei der Expression von Traw1 wurden Ströme von 10 bis 20 nA gemessen.

Der Eigenstrom der Zelle konnte vernachlässigt werden.

Chinin [mM]

Nor

mie

rter S

trom

[I/I

]m

ax

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0110-1

10-210-3

Abb. 25: Dosis Wirkungskurve von

Chinin auf den in Sf21 Zellen

heterolog expremierten Kaliumkanal

Traw1. Die Zellen wurden auf ein

Haltepotential von –60 mV geklemmt

und der Maximalausstrom bei einer

Spannungsgebung von 100 mV vor

und nach der Zugabe von Chinin

gemessen.

Diese Dosis - Wirkungskurve zeigt die hohe Sensitivität des Traw 1 Kaliumkanals

gegenüber Chinin. Der Strom wird durch den Einsatz von 0,1 mM Chinin vollständig

blockiert. Da der Kanal in seiner Primässequenz am C-Terminus 5

Konsensussequenzen zur Phosphoryliering durch Proteinkinase C (PKC

Phosphorylierung) enthält, lag es nahe, den Einfluss des Phorbolesters TPA auf den

Strom zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden 50 nM TPA in die Badlösung

45

gespült. Dies führte zu einer zeitabhängigen Reduktion des Kaliumstromes. Nach 10

min wurde die Stromamplitude um 50 % reduziert. Bei einer vorherigen Inkubation

der Zellen mit dem Proteinkinaseinhibitor H7 wurde keine Reduktion des Stroms

gemessen.

Abb. 26: Effekt von 50 nM TPA auf die

Stromamplitude von Traw 1 expremiert in Sf21

Zellen. Der maximale Ausstrom wurde bei einem

Haltepotential von –60 mV und einer Stromgebung

von 100 mV in 50 nM TPA (Quadrat) und nach

vorheriger Inkubation mit 100 µM H7 (Kreise)

gemessen. 0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

1 3 5 7 9Zeit [min]

Rel

ativ

er S

trom

[I/I

max

]

Der chininsensitive Summenausstrom in RGZ wird durch den Shaw Kaliumkanal

Traw 1 getragen. Die Beeinflussung des Kanals durch Phosphorilierung kann in der

Zelle erfolgen und damit eine weitere Möglichkeit der Regulation von Kaliumkanälen

darstellen.

3.5. Einsatz von Antikörpern in der Elektrophysiologie

3.5.1 Wirkung von Antikörpern auf den Summenausstrom von Kv3.1 und RGZ

Die den Summenausströmen von adulten RGZ zugrunde liegenden Kanäle sind

zu einem großen Teil zugeordnet. Diese Arbeiten wurden größtenteils mit

spezifischen Kanalblockern durchgeführt. Das Einbringen dieser Blocker in die

Badlösung geht jedoch mit einer starken mechanischen Belastung der Zellen einher

und ist mit einer möglichen Schädigung verbunden, daraus kann eine verfälschte

Messung resultieren. Ein weiteres Problem besteht darin, dass nicht für alle Kanäle

spezifische Blocker vorhanden sind. Um die mechanische Belastung der Zellen zu

minimieren, besteht die Möglichkeit, Kanäle über Giftgabe in der Pipettenlösung vom

Zellinneren her zu blockieren. Eine Kontrollmessung ohne Blocker kann dabei nicht

an der selben Zelle durchgeführt werden, da ein Austausch der Pipettenlösung

46

während der Messung nicht möglich ist. In den folgenden Untersuchungen sollte die

Frage geklärt werden, ob ein spezifischer Antikörper in der Pipettenlösung den

zugehörigen Kanal blockieren kann. Der Antikörper Traw 03, der gegen einen Teil

des N-Terminus von Traw 1 gerichtet ist, wurde dazu getestet. Der Kaliumkanal

wurde in Sf21 Zellen expremiert. In die Pipettenlösung wurden Antikörper gegen

Traw 1 oder Tsha 1 gegeben.

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 2 4 6 8 10 12Zeit [min]

I/Im

ax

Abb. 27: Die Wirkung von 2 Antikörpern Tsha1 (schwarze Quadrate) und Traw 03 (rote Quadrate) auf

den Kv3.1 Strom in Sf21 Zellen. Sie wurden in einer Konzentration von 1:100 in der Pipettenlösung

eingesetzt. Die Zellen wurden auf ein Haltepotential von –60 mV geklemmt. Der Maximalstrom wurde

alle 60 Sekunden bei einer Spannungsgabe von +100 mV ermittelt. Der Strom wurde normiert

dargestellt.

Der Traw 03 Antikörper in der Pipettenlösung bewirkt eine kontinuierliche,

zeitabhängige Reduktion des Kv3.1 Stroms. Die maximale Hemmung von 64% wird

nach 10 Minuten erreicht. Der Einsatz des Tsha 1 Antikörpers zeigt keine signifikante

Wirkung auf die Höhe des Ausstroms. Nach 10 Minuten beträgt dieser 87% des

Maximalwertes. In den nachfolgenden Originalregistrierungen wird die Wirkung der

beiden Antikörper exemplarisch aufgezeigt.

47

0 Minuten 6 Minuten

Tsha 1

Traw 03

Abb.28: Originalregistrierungen von Kv3.1 expremiert in Sf21 Zellen. Die Zellen wurden von dem

Haltepotential von –60 mV aus in 10 mV Schritten auf bis 100 mV über 500 ms gereizt. Bei den

oberen Stromspuren wurde eine Pipettenlösung mit 1:100 Tsha1 Antikörper in den unteren Spuren

eine Pipettenlösung mit Traw 03 Antikörper 1:100 verwendet. Die Messungen wurden nach 0 Minuten

(links) und nach 6 Minuten (rechts) durchgeführt.

Der Einsatz von Traw 03 in der Pipettenlösung bewirkt eine Reduktion des Traw 1

Stroms bei der heterologen Expression des Kanals. Diesem Kanal liegt in adulten

RGZ ein großer Teil des spannungsabhängigen Summenausstromes zu Grunde. In

diesem System kann geklärt werden, ob der Kanal in seinem physiologischen

Kontext durch den Einsatz eines spezifischen Antikörpers blockiert wird. Dabei wird,

wegen der geringern Größe der RGZ gegenüber dem Sf21 Zellen, eine geringere

Konzentration des Antikörpers in der Pipettenlösung verwendet.

48

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1 3 5 7 9 11

Zeit [min]

I / I

max

Abb.29: Wirkung von Tsha1 (Schwarz) und Traw 03 (Rot) Antikörpern 1:350 in der Pipettenlösung auf

den spannungsabhängigen Summenausstrom von adulten RGZ.. Alle Messungen wurden in einer

Badlösung mit 0,2 mM CoCl2 durchgeführt. Die RGZ wurden von einem Haltepotential von –80 mV

aus über 500 ms mit 100 mV gereizt. Alle 60 Sekunden wurde der Maximalstrom bestimmt. Der Strom

wurde normiert dargestellt.

Traw 03 reduziert deutlich den spannungsabhängigen Summenausstrom der RGZ.

Innerhalb der ersten 3 Minuten sinkt die Amplitude um 50 %. Das Maximum der

Hemmung wird nach 4 Minuten mit ca. 60 % erreicht. Danach sinkt der Strom nicht

weiter ab. Beim Einsatz des Tsha 1 Antikörpers in der Pipettenlösung erfolgt

ebenfalls eine Reduktion des Stromes. Sie ist mit ca. 20 % deutlich geringer als mit

Traw 03. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der

spannungsabhängige Kaliumkanal Traw 1 in RGZ durch den Einsatz eines

spezifischen Antikörpers gehemmt werden kann. Dabei entspricht die Reduktion des

Stromes in etwa dem Werten, die mit dem Blocker Chinin erzielt wurden.

3.5.2 Wirkung von Antikörpern auf Aktionspotentialmuster

Die Reduktion des Traw 1 Stromes durch einen spezifischen Antikörper ist in der

vorhergehenden Untersuchung beschrieben. Mit Hilfe einer geringen Konzentration

des Antikörpers in der Pipettenlösung soll der Einfluss des Traw 1 Stromes auf die

Aktionspotentiale untersucht werden.

49

Abb.30: Originalregistrierungen einer adulten RGZ bei Reizung mit 60 pA. In der Pipettenlösung wurde

der Antikörper Traw 03 1:1000 eingesetzt. Die Messungen wurden nach 0 (links) einer (Mitte) und

zwei (rechts) Minuten durchgeführt.

0

20

40

60

80

100

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5

Messzeit [min]

Anz

ahl d

er A

ktio

nspo

tent

iale

[%]

Abb.31: Die Wirkung von Traw 03 Antikörpern bei einer Verdünnung von 1:1000 in der

Pipettenlösung. Die Zellen wurden bei einem Strom von 60 pA über 500 ms all 30 Sekunden

gemessen.

Der Traw 03 Antikörper wurde in einer geringeren Konzentration als in den

Experimenten zum spannungsabhängigen Summenausstrom eingesetzt. Eine

Wirkung ist jedoch ähnlich schnell zu beobachten. Die Anzahl der Aktionspotentiale

reduziert sich innerhalb der ersten 2 Minuten um 68 %. Anschließend ist keine

signifikante Reduktion der Peaks zu beobachten. Dies deutet auf die Rolle des Traw

1 Stromes bei der Generation eines regelmäßigen Feuermusters hin. Die Reduktion

50

der Anzahl der Aktionspotentiale kann nicht über die Dauer der Messung uns eine

damit verbundene Schädigung der Zelle erklärt werden. Wie aus den folgenden

Originalregistrierungen zu ersehen, tritt keine Reduktion der Ap Anzahl nach

5 Minuten Messzeit ein.

15 mV20 ms

Abb.32: Ausschnitt aus einer Originalregistrierung einer RGZ Stadium 35 bei einer Stromgebung von

40 pA über 500 ms. Die Messung erfolgte nach 0 (links) und 5 (rechts) Minuten.

In den nachfolgenden Untersuchungen wurde die Wirkung des Antikörpers auf ein

einzelnes Aktionspotential bestimmt. Die maximale Depolarisation der

Aktionspotentiale wurde bei induzierter und bei Spontanaktivität gemessen.

Minuten 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

Höhe des

1.Ap´s [mV]

9

±4,4

7,3

±4

5,7

±3,4

4

±2,7

2,8

±2,8

1,5

±3

0

±2,8

-0,5

±2

-1

±3,2

Höhe Ap [mV]

Spontanaktivität

6 -4 2 -1 -6

Tab. 11: Wirkung des Traw 03 Antikörpers in einer Verdünnung von 1:1000 auf die

Aktionspotentialhöhe von adulten RGZ bei einem Strom von 60 pA über 30 ms (oben) oder in einer

Verdünnung von 1:350 bei 500 ms Messung ohne Stromgebung (unten). Die Höhe der

Aktionspotentiale wurde alle 30 bzw. 60 sec bestimmt.

Trotz der unterschiedlich hohen Antikörperkonzentration in der Pipettenlösung zeigt

sich bei beiden Messreihen ein ähnliches Bild. Die Höhe der Aktionspotentiale sinkt

kontinuierlich mit zunehmender Messzeit. Dabei zeigt sich kein signifikanter

Unterschied zwischen spontanen und induzierten Aktionspotentialen. Die Reduktion

51

beträgt 10 bzw. 12 mV in 4 Minuten. Neben der maximalen Depolarisation ist die

Breite bzw. Dauer eines Aktionspotentiales von großer Bedeutung.

Minuten 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

Breite des Ap´s

[ms] induziert

0,69

±0,07

0,69

±0,09

0,76

±0,16

0,71

±0,09

0,71

±0,06

0,71

±0,04

0,73

±0,06

0,72

±0,08

0,73

±0,07

Breite des Ap´s

[ms] spontan

0,8

1,4

1,2

1,4

2,4

Tab. 12: Wirkung des Traw 03 Antikörpers in einer Verdünnung von 1:1000 auf die

Aktionspotentialbreite von adulten RGZ bei einem Strom von 60 pA über 30 ms (oben) oder in einer

Verdünnung von 1:350 bei 500 ms Messung ohne Stromgebung (unten). Die Dauer der

Aktionspotentiale wurde alle 30 bzw. 60 sec bestimmt. Die Messpunkte wurden auf halber Höhe

zwischen Aktionspotentialmaximum und Repolarisationsmaximum gesetzt.

Die Wirkung des Traw 03 Antikörpers auf die Breite des Aktionspotentiales ist bei

spontaner und induzierter Aktivität verschieden. Im Fall der Spontanaktivität zeigt

sich eine Verlängerung der Ap Dauer innerhalb von 4 Minuten um den Faktor 3,

während bei der induzierten Aktivität keine signifikante Verlängerung festzustellen ist.

Dieses deutet auf eine mögliche unterschiedliche Rolle des Traw Stroms bei der

Generation von Aktionspotentialen nach Strominduzierung oder bei Spontanaktivität

hin.

3.6 Ergebnisse der PCR Studien

Der Einsatz von spezifischen Blockern und die Verwendung von Antikörpern in der

Pipettenlösung ermöglicht die Blockierung eines bestimmten Kanals oder einer

Kanalpopulation. Damit ist eine Untersuchung des zugrunde liegenden Stromes und

seiner Wirkung auf die Aktionspotentiale möglich. Die Expression verschiedener

Kanäle ist jedoch nicht nachvollziehbar. Bei der Verwendung der Einzel Zell RT PCR

Methode kann die Transkription mehrerer Kaliumkanäle in einer Zelle nachgewiesen

werden. In Fall der RGZ wurden diese Untersuchungen zum Nachweis der

Transkription von 4 Shaker (Tsha1-4) und 2 Shaw Kanälen (Traw1/2= Kv3.1 R/C) in

verschiedenen Entwicklungsstufen durchgeführt.

52

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Stad 27-30 n= 9 Stad 33-35n= 12 Stad 36-adult n= 24

Anz

ahl d

er Z

elle

n [%

]

Abb.33: Auswertung der RT PCR Untersuchungen. Nachweis der Transkription von 6 Kaliumkanälen

in verschiedenen RGZ Entwicklungsstadien (Gelb=Tsha1; Rot = Tsha2; Schwarz = Tsha3; Blau =

Tsha4; Grün gesteift = Kv3.1R; Blau gestreift = Kv3.1C).

In den untersuchten RGZ Stadien konnte die Transkription aller Shakerkanäle Tsha1-

4 nachgewiesen werden. Im Durchschnitt konnten Tsha1 –3 in 75 – 80 % aller Zellen

und damit häufiger amplifiziert werden als Tsha 4 mit 54 %. Die Transkription der

Shaw Kanäle wurde zuerst im ersten nach dem Schlupf untersuchten Stadium 33

nachgewiesen. Dieses Ergebnis geht mit den Untersuchungen zur Chininsensitivität

des Summenausstroms einher. Eine Reduktion des Stroms durch Chinin konnte

ebenfalls erst nach dem Schlupf festgestellt werden. Im adulten Stadium konnte der

Kv3.1 R Kanal in 70 % aller untersuchten Zellen, Kv3.1 C jedoch nur in 25 %

nachgewiesen werden. Die häufigste Kombination in adulten Zellen zeigte die

Transkription von Tsha 1-3 und den Shaw Kanal Kv3.1 R. In 16 % der Zellen konnten

alle 6 Kanäle nachgewiesen werden. Vor dem Schlupf (Stad 27-30) konnte am

häufigsten die Kombination Tsha 1, 2 ,3 und 4 in 44 % der Zellen amplifiziert werden.

53

Tsha

2

Tsha

3

Kv3.

1r

Kv3.

1c

STs

ha1

Tsha

4

Tsha

2

Tsha

3

Kv3.

1rKv

3.1c

S

Tsha

1

Tsha

4

200 bp

Abb.34: Nachweis der Transkripte von Tsha1/2/3/4 und Kv3.1 R und C aus RGZ der Stadien 29 (links)

und 35 (rechts) mit PCR. S: Smart Ladder-Standard.

3.7 Ergebnisse der Zellkulturversuche Die im Rahmen der Entwicklung von RGZ auftretenden Ströme und

Aktionspotentialmuster sind in den vorhergehenden Punkten eingehend beschrieben.

In weiterführenden Untersuchungen soll ein In vitro Modell erstellt werden, um später

die Rolle von exogenen Faktoren, wie z.B. Wachstumsfaktoren, bei der Reifung der

Zellen untersuchen zu können. Als geeignetes Medium für die Kultur von RGZ

Gewebeabdrücken über einen längeren Zeitraum erwies sich das V-Start Medium

der Firma Biochrom mit einem Zusatz von 35 mM KCl. RGZ von adulten Fischen

wurden wie beschrieben isoliert, kultiviert und nach 3 Tagen elektrophysiologisch

gemessen. Dabei wurden Zellkapazität, Membranpotential sowie die Summenaus-

und Einströme bestimmt.

54

Zellkapazität

[pF]

Membran-

potential [mV]

Max. Summen-

einstrom [pA]

Max. Summen-

ausstrom [pA]

Nach 3 Tagen

in Zellkultur

5,3 ± 1,5 -50,5 ± 1,4 -1718 ± 189 2948 ± 564

Frisch isoliert 5,62 ±0,45 -51,1 ±1,1 - 1021 ±81 2320 ±138

Tab.13: Elektrophysiologische Charakterisierung von frisch isolierten adulten RGZ (unten) und nach

3 Tagen (oben) Inkubation in V-Start Medium mit 35 mM KCl. Die Zellen wurden auf ein Haltepotential

von –80 mV geklemmt und der maximale Summenausstrom bei +100 mV gemessen. Der maximale

Summeneinstrom wurde bei –30 mV Spannungsgebung ermittelt.

Nach 3 Tagen in Zellkultur zeigen die RGZ bezüglich der Zellkapazität und des

Membranpotentiales keine signifikanten Unterschiede zu frisch isolierten Zellen. Der

Summenausstrom steigt leicht an. Eine große Veränderung zeigt sich beim

Summeneinstrom. Dieser erhöht sich um 68 %. Diese Steigerung könnte auf den

Einfluss der erhöhten Kaliumkonzentration im Medium zurückzuführen sein. In keiner

der durchgeführten Messungen konnte eine Degeneration der Zellen festgestellt

werden. Damit eignet sich diese Zellkulturmethode, um Untersuchungen zur Reifung

von RGZ über einen längeren Zeitraum hinweg durchzuführen.

55

4 Zusammenfassung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Entwicklung von Forellen Retina

Ganglienzellen untersucht. Dabei wurde die Fähigkeit der Zellen Aktionspotentiale zu

generieren betrachtet. Es konnte festgestellt werden, dass die Anzahl der

Aktionspotentiale im Rahmen der Reifung stieg und gleichzeitig ihre Dauer sank. Bei

der Ermittlung der passiven elektrischen Membraneigenschaften wurde keine

signifikante Erhöhung der Zellgröße mit steigendem Entwicklungsstadium

festgestellt. Jedoch zeigte sich eine altersabhängige Steigerung des

Membranpotentials.

Im nächsten Schritt wurden die zugrunde liegenden Summenein- und

Summenausströme der RGZ charakterisiert. Dabei konnte keine Veränderung des

spannungsabhängigen Natriumeinstroms in den untersuchten Entwicklungsstadien

festgestellt werden. Beim spannungsabhängigen Summenausstrom wurde eine

signifikante Veränderung des Strommusters ab dem Zeitpunkt des Schlüpfens

festgestellt. Durch den Einsatz von spezifischen Blockern konnten Kaliumkanäle aus

der BK und Shaw Familie erstmals zum Zeitpunkt des Schlüpfens nachgewiesen

werden, die in adulten RGZ den größten Anteil des Summenausstromes tragen. Die

Zuordnung der spannungsabhängigen Summenausströme der frühen

Entwicklungsstadien zu einem bestimmten Kanal oder einer Kanalfamilie konnte bis

zum Ende dieser Arbeit nicht erreicht werden.

Im Rahmen der heterologen Expression eines Forellen Kv3.1 Kanals in Sf21 Zellen

konnte eine hohe Sensitivität gegenüber dem Blocker Chinin festgestellt werden.

Neben der üblichen Methode zur Blockierung von Kaliumkanälen durch den Einsatz

von Blockern wie z.B. TEA, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine weitere Methode

untersucht. Dabei zeigte sich, das spezifische Antikörper eine vergleichbare

Hemmung des Stromes erreichen wie klassische Blocker.

Neben den elektrophysiologischen Methoden zum Nachweis von spezifischen

Kaliumkanälen wurde in einem weiterführenden Schritt die Expression von 4 Shaker

und 2 Shaw Kanälen mit Hilfe der Einzelzell RT-PCR Technik nachgewiesen. Dabei

stimmten die Ergebnisse mit denen der elektrophysiologischen Experimente überein.

Für weiterführende Untersuchungen wurde schließlich eine Methode zur

Zellkultivierung von Forellen RGZ entwickelt.

56

5 Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurden die entwicklungsbedingten Veränderungen der

elektrischen Membraneigenschaften von frisch isolierten Forellen-

Retinaganglienzellen untersucht. Die elektrophysiologischen Untersuchungen

wurden mit Hilfe der Patch-Clamp Technik durchgeführt. Molekulare Aspekte wurden

durch Expressionstudien von Kaliumkanal Transkripten mit der Einzel Zell RT-PCR

bearbeitet.

Während der Embryonalentwicklung der Forellenlarve im Ei antwortet der Grossteil

der RGZ auf andauernde über der Feuerschwelle liegende Reizungen mit nur einem

einzelnen Aktionspotential. Nach dem Schlupf steigt der Anteil der repetitiv

feuernden Zellen mit der Entwicklungsstufe stetig an. Am Ende der Larvalentwicklung

sind fast alle Neurone in der Lage wiederholt Aktionspotentiale zu feuern. Dies

entspricht den von Wang et al. (1997) erhobenen Daten über die Retina der Ratten.

Die allmähliche Reifung der Aktionspotentialmuster geht mit der Fähigkeit der

Neurone einher, die Intensität des Reizstromes über die Anzahl der generierten

Aktionspotentiale zu beantworten. Das heißt, die Zellen sind ab diesem

Entwicklungsstadium zur Signalkodierung fähig. In vorangegangenen Studien wurde

gezeigt, dass diese Periode in der Entwicklung der Forellen durch die Ausbildung der

Sehbahn gekennzeichnet ist. Das Auswachsen des optischen Nervs, der aus den

Axonen der RGZ besteht, beginnt ab Stadium 28 (Jeserich 1982), während die

Synapsenbildung im Tectum opticum in der Larvalphase kurz nach dem Schlupf

einsetzt. Wie durch Verhaltensstudien belegt wurde, ist dies durch eine

kontinuierliche Zunahme der Sehschärfe gekennzeichnet (Rahmann und Jeserich

1978). Bei Experimenten im Spannungsklemmen-Modus (VC) konnten in den

frühesten Entwicklungsstadien der Forellen-RGZ hohe Natriumströme gemessen

werden. Dabei wurden im Zuge der fortschreitenden Reifung keine signifikanten

Änderungen der Stromdichte, Stromhöhe, Kinetik oder Schwelle des Natriumstromes

festgestellt. Dies ist ein deutlicher Unterschied zu RGZ von Ratten und Mäusen. Hier

wurde ein Anstieg des Natriumstroms sowie eine Veränderung der Aktivierungs und

Inaktivierungskinetiken zwischen dem Embryonalstadium E15 und dem

Postnatalstadium P5 beobachtet (Günther et al.1999). Daraus kann geschlossen

werden, das die Reifung und Expression der Natriumkanäle in Forellen RGZ früher

erfolgt, als in den entsprechenden Säugerzellen. Diese Ergebnisse stimmen mit

57

Untersuchungen an adulten Goldfischen überein. An einem Gewebeschnitt der

Retina konnte gezeigt werden, das die Expression spannungsaktivierter

Natriumkanäle beginnt, noch bevor Progenitor-Zellen zu ihrer festgelegten Position in

der adulten Retina wandern (Tamalu et al. 2000). In der Wachstumsschicht der

Retina von adulten Forellen konnten ebenfalls spannungsabhängige Kalzium- und

Natriumkanäle nachgewiesen werden (Olson 2000). Die Höhe des

spannungsabhängigen Kaliumauswärtsstroms von Forellen RGZ steigt im Rahmen

der hier untersuchten Entwicklungsstufen geringfügig an. Da sich die Zellgröße,

gemessen über die Zellkapazität, nicht signifikant erhöht, ist davon auszugehen,

dass dem größeren Kaliumstrom eine Erhöhung der Stromdichte zugrunde liegt. Das

bedeutet, es wird entweder eine höhere Anzahl von Kaliumkanälen in die Membran

eingebaut, oder noch nicht vollständig funktionelle Kanäle werden aktiviert. In den

jüngsten Entwicklungsstadien besteht der spannungsabhängige Auswärtsstrom

überwiegend aus einem schnell inaktivierenden IA Strom. Während der

fortschreitenden Reifung wird dieser Strom immer mehr von einem nicht

inaktivierenden verzögerten Gleichrichter, einem sogenannten KD Strom, überdeckt.

Der Kaliumsummenausstrom durchläuft im Rahmen der Entwicklung von Forellen

RGZ also eine qualitative und quantitative Veränderung. Dies wird auch bei der

Betrachtung der Kaliumkanalkinetiken deutlich. Bei diesen Experimenten wurde das

Öffnungs- und Schließverhalten der Kaliumkanäle nach unterschiedlicher

Spannungsgebung in verschiedenen Entwicklungsstadien untersucht. Die daraus

resultierenden Kurven verlagern sich mit fortschreitender Reifung in den positiveren

Bereich. Ebenso verschiebt sich der IC 50 Wert, bei dem die Hälfte der Kanäle

inaktiv ist. Vergleichbare Beobachtungen zeigten sich bei Untersuchungen der RGZ

von Katzen (Skaliora et al. 1995) und Ratten (Günter et al. 1999), während sich bei

Ganglienzellen aus der Mäuseretina ein gegensätzliches Bild zeigte. Bei den

Entwicklungsstadien vor (E15) und nach der Geburt (P5) konnte keine signifikante

Erhöhung des Kaliumstroms oder eine unterschiedliche Zusammensetzung der

Kaliumkanäle festgestellt werden (Rothe et al. 1999). Eine Zuordnung von

bestimmten Kaliumströmen aus Forellen RGZ zu den zugrunde liegenden

Kaliumkanalsubtypen konnte in einigen Fällen durch pharmakologische

Untersuchungen erreicht werden. Dabei wurden Daten von vorhergehenden

Experimenten an klonierten und heterolog exprimierten Kaliumkanälen von Säugern

(Vega-Saenz de Mira et al. 1994) bzw. der Forelle (Nguyen et al. 2000; Panofen et

58

al. 2000) zugrunde gelegt. Um diese Untersuchungen zu vervollständigen, wurde für

den in Sf21 Zellen, heterolog exprimierten Forellen Kv3 Kaliumkanal Traw1 eine

Dosis Wirkungskurve für den Blocker Chinin erstellt. Der Kanal reagiert hochsensitiv

gegenüber Chinin. Aufgrund der in der Primärsequenz des Traw1 Kanals

vorkommenden Konsensussequenzen zur Phosphorylierung durch Proteinkinase C

lag es nahe, die Wirkung des Phorbolesters TPA auf dessen Ströme zu untersuchen.

Eine vorherige Inkubation mit dem Proteinkinaseinhibitor H7 verhinderte die TPA

abhängige Stromreduktion. Daraus kann geschlossen werden, dass die

Stromreduktion durch PKC-Phosphorilierung hervorgerufen wird. Neben den voran

erwähnten Methoden zur selektiven Reduktion eines Ionenstroms wurde im Rahmen

dieser Arbeit eine weitere angewandt. Dabei wurden Antikörper gegen Traw1

spezifische Sequenzen benutzt, die über die Pipettenlösung ins Zellinnere gebracht

wurden. Der Strom des in Sf21 Zellen heterolog exprimierten Kanals wurde durch

den zugehörigen Antikörper deutlich reduziert. Dabei spielten die eingesetzten

Antikörperkonzentrationen keine wesentliche Rolle für die Höhe der Reduktion,

jedoch war die Geschwindigkeit der Stromabnahme dadurch beeinflussbar. Je höher

die Antikörperkonzentration war, desto schneller verlief die Blockierung des Kanals.

Ein auf dieselbe Weise hergestellter Antikörper gegen den Tsha 1 Kanal zeigte keine

Wirkung auf den Traw 1 Strom. Somit konnte mit Hilfe von Antikörpern ein

Kaliumkanalsubtyp selektiv gehemmt werden. Spezifische Antikörper gegen Tsha 1

und Traw 1 blockierten auch in adulten RGZ Teile des spannungsabhängigen

Summenausstroms. Dabei entsprach die Reduktion des Stroms dem Anteil der durch

Chinin oder DTX reduziert wird. Damit erreichten sowohl die konventionellen Blocker

sowie die Antikörper vergleichbare Ergebnisse. In adulten Forellen RGZ ist die KD

Stromkomponente vorherrschendend. Sie zeigt, eine hohe Sensitivität für niedrige

Dosen von TEA und Chinin. Dieses pharmakologische Profil entspricht einem Kv3.1

verwandten Traw 1 Kanal der Forelle (Panofen et al. 2000; Henne et al. 2000). Durch

Multiplex Einzelzell RT-PCR konnte gezeigt werden das in RGZ früher Stadien, die

Transkripte für eine Vielzahl von Shakerkanälen (Tsha 1, 2, 3 und 4) schon bei

Stadium 27, also vor dem Schlupf, jedoch noch kein Transkript der Kv3 ähnlichen

Kanälen (Traw 1 / Traw2), vorhanden sind. Dies steht im guten Einklang zu der

Tatsache, dass der Kaliumstrom von nicht reifen RGZ sensitiv gegenüber hohen

Dosen von TEA ist, und partiell von DTX geblockt wird. Eine eindeutige

Identifizierung des dem IA Strom zugrunde liegenden Kaliumkanals konnte nicht

59

erreicht werden. Die in vorhergehenden Arbeiten umfangreich untersuchten und in

CHO-Zellen heterolog expremierten Kaliumkanäle Tsha 1 und Tsha 2 (Panofen

2001) konnten ausgeschlossen werden, da ihr Strombild dem eines verzögerten

Gleichrichters entsprach. Alternativ könnte der IA Strom durch Kv3.4, einem weiteren

Shaw verwandten Kanal getragen werden, der durch das Seeanemonengift BDS I

gehemmt wird (Diochot et al 1998). Da dieser Blocker in RGZ jedoch zu keiner

Reduktion des IA Stroms führte, kann auch Kv 3.4 als Ursache für den IA Strom der

RGZ ausgeschlossen werden. Insbesondere Mitglieder der Kv4 (Shal) Familie zeigen

ein stark inaktivierendes Strombild, sind allerdings resistent gegenüber TEA. Diese

Resistenz wurde bei der Sequenzierung eines Shalkanals aus dem der Forelle nah

verwandten Zebrafisch bestätigt. Folglich liegt dem IA Strom kein Shalkanal

zugrunde. Die Sensitivität des IA Stroms gegenüber TEA und DTX deutet eher auf

einen Shakerkanal hin. Beide Substanzen wurden in vorhergehenden

Untersuchungen als Blocker auch für Forellenshakerkanäle identifiziert (Nguyen et al

2000). Neben den Shakerkanälen Tsha 1 und 2 wurde ein dritter Forellenkanal Tsha

3 in CHO Zellen heterolog exprimiert und elektrophysiologisch abgeleitet (Panofen

2000). Die Messungen zeigten eindeutig, dass es sich nicht um einen

funktionsfähigen Kanal handelt. Jedoch wurden bei Untersuchungen mit der Einzel

Zell RT-PCR die Transkripte dieses Kanals in allen untersuchten RGZ Stadien

nachgewiesen. Somit besteht die Möglichkeit dass Tsha 3 eine Untereinheit eines

heteromultimeren Shakerkanals bildet. Inwieweit Tsha 3 mit den bereits untersuchten

Kanälen Tsha 1 und Tsha 2 interagiert muss in weiterführenden Untersuchungen

geklärt werden.

Das zunehmende Auftreten von hoch sensitiven TEA und Chinin Strömen vom Typ

des verzögerten Gleichrichters nach dem Schlupf der Fische steht in guten Einklang

mit dem Nachweis von Traw 1 und Traw 2 Transkripten durch Einzel Zell RT-PCR.

Das Auftreten von Kv3.1 zugehörigen Strömen im Rahmen der Reifung und die

zugehörigen Kanaltranskripte gehen mit der Fähigkeit der Neurone einher, ein

regelmäßiges Feuermuster zu generieren. Zusätzlich wird die Breite der

Aktionspotentiale verringert. Diese Daten stimmen mit dem Konzept überein, dass

Kv3 Kanäle schnelles sich wiederholendes Feuern von Neuronen durch eine

Verkürzung der Aktionspotentialdauer bedingen (Wang et al. 1998). Das späte

Auftreten von Kv3 ähnlichen Strömen im Rahmen der Entwicklung von Forellen RGZ

steht im Gegensatz zu Studien an Rhombencephalon Neuronen von Hühnchen,

60

welche Kv3 ähnliche Ströme in der frühen Embryonalphase ausbilden (Hendriks et

al. 1999a). Die Aktivität dieser Kanäle wird mit dem Wanderungsverhalten dieser

Neurone in Verbindung gebracht (Hendriks et al. 1999b). Im Gegensatz dazu geht

bei Forellen-RGZ die Expression von Kv3 ähnlichen Transkripten und das Auftreten

des zugehörigen verzögerten Gleichrichters mit der postnatalen Reifung dieser

Zellen einher. Die Neurone zeigen einen schnell feuernden elektrischen Phänotyp

mit einem repetetiven Feuermuster.

Die Amplitude von kalziumaktivierten Kaliumströmen ist in Forellen RGZ vor dem

Schlupf noch sehr gering. Ein deutlicher Anstieg dieses Stromes ist erst ab Stadium

32 zu beobachten. Da in allen Entwicklungsstadien der Ausstrom im selben Ausmaß

von CoCl2 und Iberiotoxin blockiert wird, dürfte der Kalzium aktivierte Kaliumstrom

hauptsächlich durch Kanäle der BK Klasse getragen werden. In vorausgegangenen

Untersuchungen wurde der SK Kanal Tsk2 in Forellen RGZ mittels Antikörpern

nachgewiesen. Es ist anzunehmen, dass ein geringer Anteil dieses Ausstroms durch

SK Kanäle getragen wird. Die zu erwartende sehr geringe Reduktion dieses Stroms

durch den SK Kanal Blocker Apamin (Sah 1996) ist mit dem hier verwandten

Messaufbau nicht nachweisbar. Diese Ergebnisse stimmen mit Untersuchungen an

Maus RGZ überein, bei denen die Applikation von Charybdotoxin das wiederholende

Feuern dieser Neurone verhinderte (Rothe et al. 1999). Allerdings blockiert

Charybdotoxin BK Kanäle weniger selektiv als Iberiotoxin, da es zusätzlich Mitglieder

der Skaker Unterfamilie hemmt (Garcia et al. 1991). BK Kaliumkanäle spielen eine

wichtige Rolle bei der Kontrolle der Nachhyperpolarisation eines Aktionspotentials, so

dass die Dauer des Interspike Intervalls beeinflusst werden kann (Sah 1996).

Die hier beschriebenen auffallenden Veränderungen im Kaliumkanalprofil der RGZ

finden zu einem Zeitpunkt statt, in dem sich ein markanter Entwicklungsschritt des

Forellengehirns vollzieht. Um den Zeitpunkt des Schlüpfens der Fische wächst der

optische Nerv, der aus den RGZ Axonen besteht, in das optische Zentrum des

Gehirns, dem Tectum opticum (Jeserich 1980), ein. Gleichzeitig setzt die

Synaptogenese (Jeserich 1980) in diesem Bereich des Gehirns ein. Damit scheint

eine Rolle, insbesondere der früh exprimierten Shakerkanäle, bei der Kontrolle des

Axonwachstums und dessen Wegfindung eventuell denkbar. Untersuchungen haben

gezeigt, dass die elektrische Aktivität von Neuronen in vivo eine wesentliche Rolle

bei der korrekten Verknüpfung im sich entwickelnden optischen System spielt (Olson

und Meyer 1994; Shatz 1990). Es konnte gezeigt werden, dass die Blockade von

61

Kaliumkanälen durch hohe TEA Dosen zu unkontrolliertem Wachstum von Frosch

Retina Axonen in vivo führte (Mc Farlane und Pollock 2000). Die Expression von

Kaliumkanälen in Forellen RGZ kann in 2 Phasen der Entwicklung eingeteilt werden.

In der frühen Phase vor dem Schlupf werden in RGZ keine repetetiven

Aktionspotentiale generiert. Zu diesem Zeitpunkt sind noch kaum Synapsen im

Tectum opticum vorhanden. Die Aufgabe der Kaliumkanäle in dieser frühen

Entwicklungsstufe kann folglich nicht die Informationsübertragung von optischen

Reizen sein. Kaliumkanäle spielen grundsätzlich eine wesentliche Rolle für die

Kontrolle des Membranpotentials von Zellen, das möglicherweise an der Steuerung

axonaler Wachstumsprozesse beteiligt ist. Dies wurde an den Spitzen der

Wachstumskegel von Xenopus Nervenzellen in vitro untersucht (Gu und Spitzer

1995; Gomez und Spitzer 2000). Dabei spielt insbesondere der Einstrom von

Kalziumionen eine wichtige Rolle für das zielgerichtete Axonwachstum. Die

kalziumabhängige Phosphatase Calciuneurin und deren Substrat GAP 43 steuern

die Polymerisation von Aktin und folglich das Axonwachstum. Das Membranpotential

beeinflusst die „driving force“ für Kalzium und damit die Aktivität von Calcineurin.

In der späten Phase der Kaliumkanalexpression werden Kv 3.1 verwandte Traw

Kanäle expremiert und die Synaptogenese in Tectum opticum abgeschlossen. Dies

führt zu einer Veränderung der Feuereigenschaften der RGZ. Sie zeigen nun einen

schnell feuernden elektrischen Phänotyp, der repetetive Aktionspotentiale generiert.

Dadurch können optische Reize frequenzcodiert und über die Sehbahn ins Gehirn

geleitet werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Veränderung des

Kaliumkanalprofils während der Reifung von Forellen RGZ gezeigt werden. Daraus

ergibt sich ein Umschalten in der Nervenzellentwicklung von einer Periode in der die

Zellen wachsen und Synapsen bilden zu einem Punkt, an dem RGZ optische

Informationen verarbeiten und weiterleiten.

Für zukünftige Arbeiten wird die Frage, welche epigenetischen Faktoren und zelluläre

Abläufe bei der Kontrolle dieses Prozesses eingebunden sind, von großer Bedeutung

sein. Dabei ist unter anderen Dingen der Einfluss von Gliazellen zu berücksichtigen.

Die hier dargestellten Ergebnisse können als Grundlage für weitere Experimente in

dieser Richtung genutzt werden.

62

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68

7 Anhang

7.1 Abkürzungen

A Analog

A Ampere

Abb. Abbildung

α Kompensationsfaktor

Ap Aktionspotential

ATP Adenosyltriphosphat

BDS blood depressing substance, Toxin aus Anemonia sulcata

BK Big conductance Ca2+ aktivated potassium channel

bp Basenpaare

C Kapazität

CC Stromklemmenmodus

c-DNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

CM Membrankapazität

Con A Concanavalin A

Cys Cystein

dH2O entionisiertes Wasser

D Digital

DMEM Dubecco´s Modification of Eagles Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleosintriphospat

DTX Dendrotoxin

F Farad

FCS Fötales Kälberserum

G Giga

Glu Glutamin

GTP Guanosyltriphosphat

HVAslow high voltage activated and slowly inactivating calcium current

HVAfast high voltage activated and fast inactivating calcium current

H7 1-[ 5-Isochinolinsulfonyl ] –2-methylpiperazin

69

Hp Haltepotential

Hz Herz

I Strom

IA inaktivierender Strom

IC50 Halbmaximale Inaktivierung

IPL Inner Plexiform Layer

KD nicht inaktivierender Strom

KM Kulturmedium

Kv spannungsabhängiger Kaliumkanal

Lsg Lösung

LVA low voltage activated calcium current

m-RNA messanger Ribonukleinsäure

Ω Ohm

OPA Operationsverstärker

OPL Outer Plexiform Layer

PBS Phosphatpuffer

PCR Polymerase Kettenreaktion

PKC Proteinkinase C

RGZ Retina Ganglienzelle

RS Serienwiderstand

RF Rückkopplungswiderstand

RT-PCR Reverse Transkription-PCR

S Siemens

Sf21 Ovarienzellen von Spondoptera frugiperda

SK Smal conductance Ca2+ activated potasium channel

Tab. Tabelle

TaCSF Teleost artificial Cerebral Spinal Fluid

TEA Tetraethylammonium

TM Transmembrandomäne

TTX Tetradotoxin

TO Tectum opticum (Sehzentrum der Fische im Gehirn)

TPA 12-0-Tetradecanoylphorbol- 13- Acetat

U Spannung

V Volt

70

VC Spannungsklemmenmodus

VM Membranpotential

VP Pipettenpotential

WM Waschmedium

ZNS Zentrales Nervensystem

7.2 Publikationen

Henne, J.; Pöttering, S.; Jeserich, G. (2000): Voltage-Gated Potassium Channels in

Retinal Ganglion Cells of Trout: A Combined Biophysical, Pharmacological,

and Single-Cell RT-PCR Approach. J. of Neuroscience Research: 62:629-637

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Ganglion Cells Coincides With Upregulation of Kv3.1- and BK-Related

Potassium Channels. J. of Neuroscience Research.

Panofen, F., Rabe, H., Henne, J., Jeserich, G., (2000): Molecular cloning and

funktional characterization of Shaw-related potassium channels of trout CNS.

Brain Res.Mol. Brain Res.; 83 (1-2): 9-19

Poster

J.Stegmann; G.Jeserich: Development of intrinsic electrical membrane

properties of retinal ganglion cells from the trout: An electrophysiological and

molecular study. Göttingen Conference of the German Neuroscience Society

May 27-30, 1999

J. Henne; S.Pöttering; G. Jeserich: Shaw and shaker related potassium channels

contribute to potassium currents in trout retinal ganglion celll´s. 28th Göttingen

Neurobiology Conference June 7-10 2001;

J. Henne; S .Pöttering; G. Jeserich: Voltage-Gated Potassium Channels in Retinal

Ganglion Cells of Trout: A Combined Biophysical, Pharmalogical, and Single

Cell RT-PCR Approach. 94th Annual Meeting of the Deutsche Zoologische

Gesellschaft in Osnabrück, June 4-8, 2001

71