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Die stereoselektive Aldolreaktion in

Biotransformationen und chemoenzymatischen

Eintopfsynthesen

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt von

Dipl.-Chem. Katrin Baer

aus Nürnberg

Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-

Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.

Tag der mündlichen Prüfung: 27.09.2011

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Harald Gröger

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Jürgen Schatz

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Organische Chemie des Departments Chemie

und Pharmazie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg unter Leitung von

Prof. Dr. Harald Gröger in der Zeit von Mai 2008 bis Juni 2011 erstellt.

Teile der Arbeit sind bereits veröffentlicht oder zur Veröffentlichung eingereicht:

K. Baer, M. Kraußer, E. Burda, W. Hummel, A. Berkessel, H. Gröger, „Sequentielle und

modulare Synthese von chiralen 1,3-Diolen mit zwei Stereozentren: Zugang zu allen vier

Stereoisomeren durch Kombination von Organo- und Biokatalyse“ Angew. Chem. 2009, 121,

9519-9522; Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 9355-9358.

K. Baer, N. Dückers, W. Hummel, H. Gröger, „Expanding the Application Range of Aldolases:

Novel Asymmetric Syntheses of α-Methylated β-Hydroxy α-Amino Acids and β-Amino

Alcohols” ChemCatChem 2010, 2, 939-942.

N. Dückers, K. Baer, S. Simon, H. Gröger, W. Hummel, „Threonine aldolases - screening,

properties and applications in the synthesis of non-proteinogenic β-hydroxy-α-amino acids”

Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 88, 409-424.

G. Rulli, N. Duangdee, K. Baer, W. Hummel, A. Berkessel, H. Gröger, „Steuerung von kinetisch

versus thermodynamisch kontrollierter Organokatalyse und Anwendung in der

chemoenzymatischen Synthese“ Angew. Chem. 2011, 123, 8092-8095; Angew. Chem. Int. Ed.

2011, 50, 7944-7947.

K. Baer, N. Dückers, T. Rosenbaum, C. Leggewie, S. Simon, M. Kraußer, S. Oßwald, W.

Hummel, H. Gröger, „Towards Efficient L-Threonine Aldolase-Catalyzed Enantio- and

Diastereoselective Aldol Reactions of Glycine with Substituted Benzaldehydes: Biocatalyst

Production and Process Development” Tetrahedron: Asymmetry 2011, 22, 925-928.

Vortrag:

K. Baer, M. Kraußer, E. Burda, W. Hummel, H. Gröger, „Synthesis of chiral 1,3-diols with two

stereogenic centres by using organo- and biocatalysis” International Symposium on Relations

between Homogeneous and Heterogeneous Catalysis (ISHHC XIV), 13.-18. September 2009,

Stockholm, Schweden.

Poster:

K. Baer, S. Simon N. Dückers, C. Leggewie, T. Rosenbaum, W. Hummel, S. Oßwald, H. Gröger,

„Efficient L-Threonine Aldolase-Catalyzed Enantio- and Diastereoselective Aldol Reactions

with Benzaldehyde Derivatives” 3rd EuCheMS Chemistry Congress, 29. August-02. September

2010, Nürnberg, Deutschland.

Danksagung:

Mein ganz besonderer Dank gilt zuerst Herrn Prof. Dr. Harald Gröger für die intensive und

kompetente Betreuung während meiner Promotion. Seine große fachliche Unterstützung

war für die Entstehung dieser Arbeit und meine Entwicklung in dieser Zeit besonders wichtig.

Außerdem möchte ich unseren Kooperationspartnern im Rahmen des DBU-Projekts danken.

Vor allem danke ich Herrn Prof. Dr. Werner Hummel vom Institut für Molekulare

Enzymtechnologie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf und evocatal für die

Bereitstellung der Enzyme. Mein besonderer Dank gilt hier vor allem Nina Dückers die zur

gleichen Zeit ihre Promotion bei evocatal anfertigte und für die Herstellung der Rohextrakte

zur Verfügung stand und mich unterstützte.

Mein Dank gilt allen derzeitigen und ehemaligen Labor- und Arbeitskollegen, Sabine Simon,

Dr. Marina Krausser, Dr. Maria Alfaro Blasco, Jürgen Wittmann, Philipp Böhm, Giuseppe

Rulli, Sonja Borchert, Katharina Tenbrink, Svenja Staudt, Tina Ress, Carolin Giese, Richard

Metzner, Oliver Pham, Xenia Kostrov, Dr. Markus Weiß, Dr. Friedrich Dietz, Dr. Edyta Burda,

Tobias Huber, Alexander Latza, Irene Keller, Dr. Harald Maid, Dr. Stefan Huber und Ingo

Schnapperelle für die große Hilfsbereitschaft und Unterstützung.

Besonders möchte ich mich bei Dr. Marina Kraußer, Sabine Simon und Giuseppe Rulli

bedanken, mit denen ich gemeinsame Projekte bearbeitet habe.

Außerdem möchte ich mich ganz herzlich bei den Angestellten des Instituts der Organischen

Chemie für die Unterstützung im Laboralltag und im Verwaltungsbereich bedanken. Ohne

diesen Beitrag wäre meine Dissertation nur schwer zu realisieren gewesen. Auch meinen

ehemaligen Praktikanten sei an dieser Stelle für die Durchführung einiger Synthesen

gedankt.

Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie und meinen Freuden. Ich danke speziell

meinen Eltern für ihre immerwährende Unterstützung. Außerdem danke ich Christina für die

sehr gute Freundschaft, die uns seit unserer Studienzeit verbindet. Zum Abschluss möchte

ich noch meinem Freund Philipp von ganzem Herzen für den Beistand und für ein offenes

Ohr während meiner Promotionszeit danken.

INHALTSVERZEICHNIS

I

I. Inhaltsverzeichnis

I. Inhaltsverzeichnis ............................................................................................... I

II. Abbildungsverzeichnis ...................................................................................... IX

III. Tabellenverzeichnis ........................................................................................ XIV

IV. Abkürzungsverzeichnis ................................................................................... XVI

1. Einleitung .......................................................................................................... 1

2. Motivation und Zielsetzung ............................................................................... 5

2.1 Synthese von 1,3-Diolen ........................................................................................... 6

2.2 Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren ................................................................. 7

2.3 Synthese von Epoxiden aus β-Hydroxy-α-aminosäuren ........................................... 8

3. Kombination einer organokatalytischen Aldolreaktion und einer enzymatischen

Reduktion ......................................................................................................... 9

3.1 Einleitung .................................................................................................................. 9

3.2 Stand der Wissenschaft .......................................................................................... 10

3.2.1 Synthesestrategien zur Herstellung von 1,3-Diolen ............................................... 10

3.2.2 Organokatalytische Aldolreaktion .......................................................................... 12

3.2.3 Enzymatische Reduktion ......................................................................................... 15

3.2.4 Eintopfreaktionen ................................................................................................... 18

3.3 Ziel der Arbeit .......................................................................................................... 20

3.4 Eigene Ergebnisse und Diskussion .......................................................................... 22

3.4.1 Organokatalyse unter lösungsmittelfreien Bedingungen ....................................... 22

3.4.2 Isolierung der 1,3-Diole ........................................................................................... 22

3.4.2.1 Optimierung der (R)-selektiven enzymatischen Synthese .................................. 23

3.4.2.2 (S)-Selektive enzymatische Umsetzung .............................................................. 24

3.4.3 Kombination der beiden Reaktionen in wässrigem Medium ................................. 25

3.4.3.1 Optimierung der Organokatalyse in wässrigem Medium ................................... 25

INHALTSVERZEICHNIS

II

3.4.3.2 Eintopfverfahren in wässrigem Medium ............................................................ 26

3.5 Zusammenfassung .................................................................................................. 28

4. Enzymatische Aldolreaktion............................................................................. 31

4.1 Einleitung ................................................................................................................ 31


4.2.1 Synthesestrategien für β-Hydroxy-α-aminosäuren ................................................ 33

4.2.2 Threoninaldolasen .................................................................................................. 37

4.3 Ziel der Arbeit.......................................................................................................... 43


4.4.1 Vorversuche ............................................................................................................ 44

4.4.1.1 Racematsynthese ................................................................................................ 44

4.4.1.2 Hintergrundreaktion ........................................................................................... 47

4.4.1.3 Epimerisierung .................................................................................................... 48

4.4.2 Photometertest zur Bestimmung der Aktivität der L-Threoninaldolase ................ 48

4.4.2.1 Direkter Photometertest..................................................................................... 49

4.4.2.2 Inhibierungsversuche .......................................................................................... 51

4.4.3 Methoden zur Umsatzbestimmung ........................................................................ 53

4.4.3.1 Umsatzbestimmung mittels NMR-Standard ....................................................... 54

4.4.3.2 Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung ...................................................... 55

4.4.4 Etablierung der Standardreaktion .......................................................................... 57

4.4.5 Bestimmung der Enantioselektivität....................................................................... 57

4.4.6 Untersuchung der enzymatischen Synthese .......................................................... 59

4.4.6.1 Einfluss der Reaktionszeit auf die enzymatische Aldolreaktion ......................... 59

4.4.6.2 Einfluss der Temperatur auf die enzymatische Aldolreaktion ............................ 60

4.4.6.3 Einfluss der Enzymmenge auf die enzymatische Aldolreaktion ......................... 61

4.4.6.4 Einfluss des Glycinüberschusses auf die enzymatische Aldolreaktion ............... 62

INHALTSVERZEICHNIS

III

4.4.6.5 Einfluss der Substratkonzentration auf die enzymatische Aldolreaktion ........... 63

4.4.6.6 Einfluss von Additiven auf die enzymatische Aldolreaktion ............................... 64

4.4.7 Erweiterung des Substratspektrums ....................................................................... 65

4.4.7.1 Thiamphenicolrelevante substituierte Benzaldehyde ........................................ 65

4.4.7.2 m-Substituierte Benzaldehyde ............................................................................ 66

4.4.7.3 p-Substituierte Benzaldehyde ............................................................................. 68

4.4.7.4 o-Substituierte Benzaldehyde ............................................................................. 68

4.4.8 Optimierung der enzymatischen Synthese von (2S)-12i ........................................ 70

4.4.8.1 Untersuchung des Reaktionsverlaufs ................................................................. 71

4.4.8.2 Vergleichsversuch mit Benzaldehyd als Substrat ............................................... 72

4.4.8.3 Cofaktor-Abhängigkeit ........................................................................................ 73

4.4.8.4 Scale-up und Isolierung des Produkts (2S)-12i ................................................... 74

4.4.8.4.1 Trennung der racemischen Diastereomere von rac-12i ................................... 75

4.4.8.4.2 Trennung der enantiomerenreinen Diastereomere von (2S)-12i .................... 76

4.4.9 Racematspaltung .................................................................................................... 77

4.4.9.1 Spaltung von rac-syn-12e .................................................................................... 78

4.4.9.2 Spaltung von rac-syn-12i ..................................................................................... 79

4.5 Zusammenfassung .................................................................................................. 80

5. Epoxidsynthese ausgehend von β-Hydroxy-α-aminosäuren .............................. 83

5.1 Einleitung ................................................................................................................ 83


5.2.1 Katalytische asymmetrische Epoxidierung ............................................................. 84

5.2.2 Synthese und Anwendung von Glycidestern .......................................................... 85

5.3 Ziel der Arbeit .......................................................................................................... 87


5.4.1 Halohydrinsynthese ................................................................................................ 87

INHALTSVERZEICHNIS

IV

5.4.1.1 Synthese von rac-syn-3-Hydroxy-3-phenylpropansäure rac-syn-20e ................ 87

5.4.1.2 Synthese der chlorsubstituierten Halohydrinverbindungen (2S)-20i ................. 88

5.4.2 Synthese des Epoxids 21i durch Ringschluss .......................................................... 88

5.4.2.1 Synthese des racemischen Epoxids rac-syn-21i .................................................. 89

5.4.2.2 Reaktion des enantiomerenreinen Halohydrins (2S)-20i zum Epoxid 21i .......... 91

5.4.3 Zusammenfassung .................................................................................................. 92

6. Zusammenfassung ........................................................................................... 94

7. Summary ......................................................................................................... 99

8. Experimenteller Teil ....................................................................................... 104

8.1 Verwendete Chemikalien und Geräte .................................................................. 104

8.2 Synthesen und spektroskopische Daten ............................................................... 107

8.2.1 Kombination von organokatalytischer Aldolreaktion und enzymatischer Reduktion

............................................................................................................................... 107

8.2.1.1 Synthese von (S)-1-(4-Chlorphenyl)-1-hydroxybutan-3-on (S)-5f mittels

organokatalytischer Aldolreaktion ................................................................... 107

8.2.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 (AAV 1): Isolierung der vier Isomere aus der

enzymatischen Reduktion ................................................................................. 107

8.2.1.2.1 Synthese von (1S,3R)-1-(4-Chlorphenyl)-1,3-butandiol (1S,3R)-17f .............. 108

8.2.1.2.2 Synthese von (1R,3R)-1-(4-Chlorphenyl)-1,3-butandiol (1R,3R)-17f .............. 108

8.2.1.2.3 Synthese von (1S,3S)-1-(4-Chlorphenyl)-1,3-butandiol (1S,3S)-17f ............... 109

8.2.1.2.4 Synthese von (1R,3S)-1-(4-Chlorphenyl)-1,3-butandiol (1R,3S)-17f .............. 110

8.2.1.3 Organokatalytische Aldolreaktion in wässrigem Medium ................................ 110

8.2.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 (AAV 2): Eintopfreaktion ................................. 111

8.2.1.4.1 Synthese von (1R,3R)-1-(4-Chlorphenyl)-1,3-butandiol (1R,3R)-17f .............. 112

8.2.1.4.2 Synthese von (1R,3S)-1-(4-Chlorphenyl)-1,3-butandiol (1R,3S)-17f .............. 112

8.2.2 Enzymatische Aldolreaktion .................................................................................. 113

INHALTSVERZEICHNIS

V

8.2.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 (AAV 3): Synthese der racemischen β-Hydroxy-α-

aminosäuren116 ................................................................................................. 113

8.2.2.1.1 Synthese von rac-p-Methylthiophenylserin rac-12d ...................................... 113

8.2.2.1.2 Synthese von rac-Phenylserin rac-12e ........................................................... 114

8.2.2.1.3 Synthese von rac-p-Chlorphenylserin rac-12f ................................................ 114

8.2.2.1.4 Synthese von rac-o-Chlorphenylserin rac-12i ................................................ 115

8.2.2.1.5 Synthese von rac-m-Bromphenylserin rac-12j ............................................... 115

8.2.2.1.6 Synthese von rac-m-Chlorphenylserin rac-12l ............................................... 116

8.2.2.1.7 Synthese von rac-m-Hydroxyphenylserin rac-12m ........................................ 116

8.2.2.1.8 Synthese von rac-o-Methoxyphenylserin rac-12n ......................................... 117

8.2.2.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 4 (AAV 4): Derivatisierung der racemischen β-

Hydroxy-α-aminosäuren mit Benzoylchlorid116 ................................................ 117

8.2.2.2.1 Synthese von rac-N-Benzoylamino-3-(4-methylthiophenyl)-3-hydroxy-

propionsäure rac-80d ..................................................................................... 118

8.2.2.2.2 Synthese von rac-N-Benzoylamino-3-hydroxy-3-phenylpropionsäure rac-80e ...

.......... ............................................................................................................. 118

8.2.2.2.3 Synthese von rac-N-Benzoylamino-3-(4-chlorphenyl)-3-hydroxy-propionsäure

rac-80f ............................................................................................................. 119

8.2.2.2.4 Synthese von rac-syn-N-Benzoylamino-3-(2-chlorphenyl)-3-hydroxy-

propionsäure rac-syn-80i ................................................................................ 119

8.2.2.2.5 Synthese von rac-anti-N-Benzoylamino-3-(2-chlorphenyl)-3-hydroxy-

propionsäure rac-anti-80i ............................................................................... 120

8.2.2.2.6 Synthese von rac-N-Benzoylamino-3-(3-bromphenyl)-3-hydroxy-propionsäure

rac-80j ............................................................................................................. 120

8.2.2.2.7 Synthese von rac-N-Benzoylamino-3-(3-chlorphenyl)-3-hydroxy-propionsäure

rac-80l ............................................................................................................. 121

8.2.2.2.8 Synthese von rac-N-Benzoylamino-3-(2-methoxyphenyl)-3-hydroxy-

propionsäure rac-80n ..................................................................................... 122

INHALTSVERZEICHNIS

VI

8.2.2.3 Untersuchung der Hintergrundreaktion ........................................................... 122

8.2.2.4 Untersuchung auf Epimerisierung .................................................................... 123

8.2.2.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 5 (AAV 5) Photometertest zur Untersuchung der

Enzymaktivität117,118 .......................................................................................... 124

8.2.2.5.1 Bestimmung des Extinktionskoeffizienten ..................................................... 125

8.2.2.5.2 Aktivitätsbestimmung für L-TA aus E. coli ...................................................... 129

8.2.2.5.3 Inhibierungsversuche ..................................................................................... 130

8.2.2.6 Umsatzbestimmung der L-TA-katalysierten Aldolreaktion ............................... 131

8.2.2.6.1 Überprüfung der Umsatzbestimmung mittels NMR-Standard ...................... 131

8.2.2.6.2 Überprüfung der Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung ...................... 132

8.2.2.6.3 Umsatzbestimmung der L-TA-katalysierten Aldolreaktion ............................ 133

8.2.2.6.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 6.1 (AAV 6.1) Umsatzbestimmung der L-TA-

katalysierten Aldolreaktion mittels NMR-Standard ..................................... 134

8.2.2.6.3.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 6.2 (AAV 6.2): Umsatzbestimmung der L-TA-

katalysierten Aldolreaktion mittels Derivatisierung .................................... 134

8.2.2.6.3.3 Ergebnisse der Umsatzbestimmung ............................................................. 134

8.2.2.7 Untersuchung der L-TA-katalysierten Aldolreaktion ........................................ 135

8.2.2.7.1 Zeitabhängigkeit ............................................................................................. 135

8.2.2.7.2 Temperaturabhängigkeit ................................................................................ 136

8.2.2.7.3 Einfluss der Enzymmenge ............................................................................... 137

8.2.2.7.4 Einfluss des Verhältnisses von Benzaldehyd zu Glycin ................................... 138

8.2.2.7.4.1 Einfluss der Glycinkonzentration ................................................................. 139

8.2.2.7.4.2 Einfluss der Benzaldehydkonzentration ....................................................... 139

8.2.2.7.5 Erhöhung der Substratkonzentration ............................................................. 140

8.2.2.7.5.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 7.1 (AAV 7.1): Umsatzbestimmung durch NMR-

Standard bei einer Substratkonzentration von 0.25 M ............................... 140

INHALTSVERZEICHNIS

VII

8.2.2.7.5.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 7.2 (AAV 7.2): Umsatzbestimmung durch

Derivatisierung bei einer Substratkonzentration von 0.25 M ..................... 141

8.2.2.7.5.3 Ergebnisse der Umsatzbestimmung (0.25 M) .............................................. 141

8.2.2.7.6 Einfluss verschiedener Additive ...................................................................... 142

8.2.2.7.7 Substratspektrum ........................................................................................... 143

8.2.2.7.7.1 Enzymatische Synthese von p-Nitrophenylserin (2S)-12b ........................... 143

8.2.2.7.7.2 Enzymatische Synthese von p-Methylthiophenylserin (2S)-12d ................. 144

8.2.2.7.7.3 Enzymatische Synthese von p-Chlorphenylserin (2S)-12f ............................ 144

8.2.2.7.7.4 Enzymatische Synthese von o-Chlorphenylserin (2S)-12i ............................ 145

8.2.2.7.7.5 Enzymatische Synthese von m-Bromphenylserin (2S)-12j ........................... 145

8.2.2.7.7.6 Enzymatische Synthese von p-Methylsulphonylphenylserin (2S)-12k ........ 146

8.2.2.7.7.7 Enzymatische Synthese von m-Chlorphenylserin (2S)-12l ........................... 146

8.2.2.7.7.8 Enzymatische Synthese von m-Hydroxyphenylserin (2S)-12m .................... 147

8.2.2.7.7.9 Enzymatische Synthese von o-Methoxyphenylserin (2S)-12n ..................... 148

8.2.2.7.7.10 Enzymatische Synthese von o-Bromphenylserin (2S)-12o ........................... 148

8.2.2.7.7.11 Enzymatische Synthese von o-Fluorphenylserin (2S)-12p ........................... 149

8.2.2.7.7.12 Enzymatische Synthese von o-Nitrophenylserin (2S)-12q ........................... 149

8.2.2.7.7.13 Enzymatische Synthese von o-Methylphenylserin (2S)-12r ......................... 150

8.2.2.7.7.14 Enzymatische Synthese von o-Hydroxyphenylserin (2S)-12s....................... 151

8.2.2.7.7.15 Enzymatische Synthese von 3,4-Dihydroxyphenylserin (2S)-12t ................. 151

8.2.2.8 Allgemeine Arbeitsvorschrift 8 (AAV 8): Optimierte Reaktion mit

o-Chlorbenzaldehyd (1i) als Substrat ................................................................ 152

8.2.2.8.1 Reaktionsverfolgung ....................................................................................... 152

8.2.2.8.2 Vergleich mit Reaktion im kleineren Maßstab ............................................... 153

8.2.2.8.3 Synthese von (2S)-12i ohne Zugabe von Cofaktor ......................................... 154

8.2.2.8.4 Vergleich mit Benzaldehyd als Substrat ......................................................... 154

INHALTSVERZEICHNIS

VIII

8.2.2.8.5 Isolierung von (2S)-12i aus Enzymumsetzung ................................................ 155

8.2.2.8.6 Abtrennung von Glycerin mittels Ionenaustauscher ...................................... 156

8.2.2.8.7 Trennung der Diastereomere ......................................................................... 156

8.2.2.8.7.1 Trennung von rac-12i mittels Ionenaustauscher ......................................... 157

8.2.2.8.7.2 Trennung von rac-12i mittels Umkristallisation ........................................... 157

8.2.2.8.7.3 Trennung von (2S)-12i mittels Fällung aus Wasser mit Aceton ................... 158

8.2.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 9 (AAV 9): Racematspaltung .............................. 158

8.2.2.1.1 Spaltung von rac-syn-Phenylserin (rac-syn-12e) ............................................ 159

8.2.2.1.2 Spaltung von rac-syn-o-Chlorphenylserin (rac-syn-12i) ................................. 159

8.2.2.1.3 Spaltung von rac-syn-Phenylserin (rac-syn-12e) im 25 mL-Maßstab ............. 160

8.2.2.1.4 Spaltung von rac-syn-o-Chlorphenylserin (rac-syn-12i) im 50 mL-Maßstab .. 161

8.2.3 Epoxidsynthese ausgehend von β-Hydroxy-α-aminosäuren 12 ........................... 161

8.2.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 11 (AAV 11): Halohydrinsynthese125 .................. 161

8.2.3.1.1 Synthese von rac-syn-3-Hydroxy-3-phenylpropansäure (rac-syn-20e) ......... 162

8.2.3.1.2 Synthese von (2S)-2-Chlor-3-(2-chlorphenyl)-3-hydroxypropansäure ((2S)-20i) .

.......... ............................................................................................................. 162

8.2.3.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 12 (AAV 12): Epoxidsynthese ............................. 163

8.2.3.2.1 Synthese von rac-syn-3-(2-Chlorphenyl)oxiran-2-carbonsäure (rac-syn-21i) 164

8.2.3.2.2 Synthese von (2R)-3-(2-Chlorphenyl)oxiran-2-carbonsäure ((2R)-21i) .......... 164

9. Literaturverzeichnis ........................................................................................ 166

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

IX

II. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1. Allgemeines Reaktionsschema der Aldolreaktion ............................................. 1

Abbildung 1.2. Beispiel für eine selektive Mukaiyama-Aldoladdition6 ...................................... 2

Abbildung 1.3. Prolinkatalysierte Aldolreaktion11...................................................................... 2

Abbildung 1.4. Enamin-Intermediate der bio- und organokatalytischen Aldolreaktion13......... 3

Abbildung 1.5. Einteilung der Aldolasen nach Donorspezifität17 ............................................... 3

Abbildung 1.6. Industrielle Anwendung der Pyruvat-abhängigen Aldolase22 ........................... 4

Abbildung 2.1. Aldolreaktion und Biokatalysatoren zur Synthese von Pharmabausteinen ...... 5

Abbildung 2.2. Konzept der Synthese von 1,3-Diolen 17 ........................................................... 6

Abbildung 2.3. Synthese von 1,3-Diolen 17 als Eintopfreaktion ................................................ 6

Abbildung 2.4. Zambon-Prozess ................................................................................................. 7

Abbildung 2.5. Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren 12 mit Threoninaldolasen ................ 7

Abbildung 2.6. Ziel der Prozessoptimierung der enzymatischen Aldolreaktion ........................ 8

Abbildung 2.7. Synthese von Epoxiden 21 ausgehend von β-Hydroxy-α-aminosäuren (2S)-12 8

Abbildung 3.1. Amphotericin B-Derivat mit verbesserter Wirksamkeit35 ................................. 9

Abbildung 3.2. Reduktion mit Borhydrid37 ............................................................................... 10

Abbildung 3.3. Metallkatalysierte Reduktion von Diketonen38 ............................................... 11

Abbildung 3.4. Chemoenzymatische Reduktion von Diketon 2440 .......................................... 11

Abbildung 3.5. Sequentieller Aufbau der beiden Stereozentren von 17f................................ 12

Abbildung 3.6. Einfluss von Wasser bei der organokatalytischen Aldolreaktion44 .................. 13

Abbildung 3.7. Organokatalysatoren für die Aldolreaktion in wässrigem Medium45,46,47,48 ... 14

Abbildung 3.8. Organkotalytische Aldolreaktion nach Singh51 ................................................ 14

Abbildung 3.9. Enzymatische Reduktion bei der Synthese von Statinen60 .............................. 15

Abbildung 3.10. Beispielsysteme zur Cofaktorregenerierung61 ............................................... 16

Abbildung 3.11. Sterisch anspruchsvolle Substrate für die enzymatische Reduktion64,65,66 ... 17

Abbildung 3.12. Vergleich Mehrstufensynthese und Eintopfverfahren .................................. 18

Abbildung 3.13. Synthese von 1,3-Diolen mittels DKR ............................................................ 19

Abbildung 3.14. Eintopfsynthese von Biphenylalkoholen77 ..................................................... 19

Abbildung 3.15. Kombination einer enzymatische Aldolreaktion und einer Metallkatalyse in

einem Eintopfverfahren78 ........................................................................................................ 20

Abbildung 3.16. Synthese der 1,3-Diole 17f............................................................................. 21


X

Abbildung 3.17. Eintopfsynthese in wässrigem Medium ........................................................ 21

Abbildung 3.18. Organokatalytische Aldolreaktion zur Synthese von (S)-5f ........................... 22

Abbildung 3.19. Reduktion von (R)-5f mit LK-ADH .................................................................. 23

Abbildung 3.20. Reduktion von (S)-5f mit LK-ADH ................................................................... 24

Abbildung 3.21. Reduktion von (R)-5f mit Rsp-ADH ................................................................ 24

Abbildung 3.22. Reduktion von (S)-5f mit Rsp-ADH ................................................................. 25

Abbildung 3.23. Eintopfverfahren in wässrigem Medium ....................................................... 27

Abbildung 3.24. Vergleich der verschiedenen Synthesemethoden ......................................... 28

Abbildung 3.25. Synthese aller vier Stereoisomere von 17f .................................................... 29

Abbildung 3.26. Eintopfsynthese von (1R,3S)-17f ................................................................... 30

Abbildung 4.1. Enzymatische Spaltung von Threonin (12c) im Körper .................................... 31

Abbildung 4.2. Vancomycin ...................................................................................................... 32

Abbildung 4.3. Synthese von Digitoxin (49)87 .......................................................................... 32

Abbildung 4.4. Synthese eines Fucosyltransferase-Inhibitors 5188 ......................................... 33

Abbildung 4.5. Aldolreaktion von Glycin (11) und Aldehyden 1 .............................................. 33

Abbildung 4.6. DKR zur Synthese von anti-β-Hydroxy-α-aminosäureestern 5390d ................. 34

Abbildung 4.7. β-Hydroxy-α-aminosäuresynthese nach Crich93 .............................................. 34

Abbildung 4.8. Synthese über Oxazolidone als Glycinsynthone94b .......................................... 35

Abbildung 4.9. Metallkatalysierte Aldolreaktion zur Synthese von β-Hydroxy-α-amino-

säuren95 .................................................................................................................................... 36

Abbildung 4.10. Organokatalytische Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäurederivaten ........ 36

Abbildung 4.11. Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren 72 mittels Phasentransfer-

katalyse102b ............................................................................................................................... 37

Abbildung 4.12. Aktivierung von Glycin (11) durch PLP ........................................................... 38

Abbildung 4.13. Einteilung der L-TA katalysierten Reaktion103 ................................................ 38

Abbildung 4.14. Enzymatische Racematspaltung103 ................................................................ 39

Abbildung 4.15. Produktspektrum der L-TA aus E. coli und der D-TA aus X. oryzae105 ............ 40

Abbildung 4.16. Ergebnisse der Synthese verschieden substituierter aromatischer β-Hydroxy-

α-aminosäuren 12109 ................................................................................................................ 41

Abbildung 4.17. Synthese von β-Hydroxy-α,ω-diaminosäuren 74113 ...................................... 42

Abbildung 4.18. Synthese von α-alkylierten β-Hydroxy-α-aminosäuren 76, 77, 7819 ............. 42

Abbildung 4.19. Literaturbekannte Ergebnisse der TA-katalysierten Aldolreaktion106 ........... 43


XI

Abbildung 4.20. Prozessoptimierung der enzymatischen Aldolreaktion ................................. 44

Abbildung 4.21. Synthese von racemischem Phenylserin ....................................................... 45

Abbildung 4.22. Racemische Phenylserinderivate ................................................................... 45

Abbildung 4.23. Derivatisierung mit Benzoylchlorid (79) ........................................................ 46

Abbildung 4.24. Racemische Produkte aus Derivatisierung mit Benzoylchlorid (79) .............. 47

Abbildung 4.25. Untersuchung einer möglichen Hintergrundreaktion ................................... 47

Abbildung 4.26. Untersuchung einer möglichen Epimerisierung ............................................ 48

Abbildung 4.27. Indirekter Photometertest zur Bestimmung der Aldolaseaktivität105 ........... 48

Abbildung 4.28. Direkte Aktivitätsbestimmung durch Verfolgung der Benzaldehyd-

konzentration ........................................................................................................................... 49

Abbildung 4.29. Bestimmung des Extiktionskoeffizienten ...................................................... 50

Abbildung 4.30. Inhibierung durch Glycin (11) ........................................................................ 52

Abbildung 4.31. Inhibierung durch rac-syn-Phenylserin (rac-syn-12e) ................................... 52

Abbildung 4.32. Rohproduktspektrum der enzymatischen Umsetzung .................................. 53

Abbildung 4.33. 1H-NMR-Spektrum zur Umsatzbestimmung mittels NMR-Standard 83 ........ 54

Abbildung 4.34. Derivatisierung mittels Benzoylchlorid (79) .................................................. 56

Abbildung 4.35. Standardreaktion und Umsatzbestimmung .................................................. 57

Abbildung 4.36. Bestimmung der Enantioselektivität der enzymatischen Umsetzung ........... 58

Abbildung 4.37. HPLC-Analytik für 80e .................................................................................... 58

Abbildung 4.38. Abhängigkeit der Biotransformation von der Temperatur ........................... 60

Abbildung 4.39. Abhängigkeit der Biotransformation von der Enzymmenge ......................... 61

Abbildung 4.40. Abhängigkeit der Biotransformation vom Glycinüberschuss ........................ 62

Abbildung 4.41. Abhängigkeit des Umsatzes von der Substratkonzentration ........................ 63

Abbildung 4.42. Umsatz bei Anwesenheit verschiedener Additive ......................................... 64

Abbildung 4.43. Thiamphenicol (19) ........................................................................................ 65

Abbildung 4.44. Enzymatische Synthese von (2S)-12d ............................................................ 66

Abbildung 4.45. Enzymatische Synthese von (2S)-12k ............................................................ 66

Abbildung 4.46. Enzymatische Synthese m-substituierter β-Hydroxy-α-aminosäuren (2S)-12

.................................................................................................................................................. 67

Abbildung 4.47. Enzymatische Synthese p-substituierter β-Hydroxy-α-aminosäuren (2S)-12 68

Abbildung 4.48. Enzymatische Synthese von (2S)-12i ............................................................. 69

Abbildung 4.49. Enzymatische Synthese o-substituierter β-Hydroxy-α-aminosäuren (2S)-12 70


XII

Abbildung 4.50. Optimierte enzymatische Synthese von (2S)-12i .......................................... 71

Abbildung 4.51. Reaktionsverfolgung der enzymatischen Synthese von (2S)-12i................... 71

Abbildung 4.52. Synthese von (2S)-12e unter optimierten Bedingungen ............................... 72

Abbildung 4.53. Vergleichsversuch unter optimierten Bedingungen mit 1e als Substrat....... 73

Abbildung 4.54. Vergleich der enzymatischen Reaktion mit und ohne Cofaktor PLP ............. 73

Abbildung 4.55. Scale-up der enzymatischen Reaktion und Isolierung von (2S)-12i .............. 75

Abbildung 4.56. Trennung der Diastereomere von rac-12i ..................................................... 76

Abbildung 4.57. Trennung der Diastereomere durch Ausfällen aus Wasser mit Aceton ........ 77

Abbildung 4.58. Racematspaltung von rac-syn-12i in 50 mL-Maßstab ................................... 80

Abbildung 4.59. Optimierte Standardreaktion ........................................................................ 81

Abbildung 4.60. Optimierte enzymatische Reaktion mit 1j als Substrat ................................. 81

Abbildung 4.61. Optimierte Reaktion in 100 mL-Maßstab ...................................................... 81

Abbildung 5.1. Synthese eines Leukotrien-Antagonisten 87124 ............................................... 83

Abbildung 5.2. Synthese von Epoxiden 21 ausgehend von Halohydrinen 20.......................... 83

Abbildung 5.3. Jacobsen-Katsuki-Epoxidierung128 ................................................................... 84

Abbildung 5.4. Glycidester 91 als Synthesebaustein für Diltiazem (92)132 .............................. 85

Abbildung 5.5. Synthese des Glycidester 91132 ........................................................................ 86

Abbildung 5.6. Synthese des Zwischenprodukts 96 über Mukaiyama-Aldolreaktion130 ......... 86

Abbildung 5.7. Synthese von Epoxiden 21i ausgehend von β-Hydroxy-α-aminosäuren (2S)-12i

.................................................................................................................................................. 87

Abbildung 5.8. Synthese von rac-syn-20h ................................................................................ 88

Abbildung 5.9. Synthese von (2S)-20j ...................................................................................... 88

Abbildung 5.10. Synthese des racemischen Epoxids 21i ......................................................... 89

Abbildung 5.11. NOESY-Spektren von rac-syn-21i ................................................................... 90

Abbildung 5.12. Synthese von (2R)-21i .................................................................................... 91

Abbildung 5.13. HPLC-Analytik zur ee-Wertbestimmung von 21i ........................................... 92

Abbildung 5.14. Synthese von (2R)-21i .................................................................................... 93

Abbildung 6.1. Synthese aller vier Stereoisomere von 17f ...................................................... 94

Abbildung 6.2. Eintopfsynthese von (1R,3S)-17f ..................................................................... 95

Abbildung 6.3. Optimierte Standardreaktion .......................................................................... 96

Abbildung 6.4. Optimierte enzymatische Reaktion mit 1i als Substrat ................................... 96

Abbildung 6.5. Optimierte Reaktion in 100 mL-Maßstab ........................................................ 97


XIII

Abbildung 6.6. Synthese von (2R)-21i ...................................................................................... 98

Abbildung 8.1. Enzymatische Reduktion der β-Hydroxyketone 5f ........................................ 107

Abbildung 8.2. Eintopfreaktion .............................................................................................. 111

Abbildung 8.3. Racematsynthese der β-Hydroxy-α-aminosäuren 12 .................................... 113

Abbildung 8.4. Derivatisierung von rac-12 ............................................................................. 117

Abbildung 8.5. Aktivierung von Glycin ................................................................................... 122

Abbildung 8.6. Untersuchung auf Epimerisierung ................................................................. 123

Abbildung 8.7. Direkte Aktivitätsbestimmung durch Verfolgung der Benzaldehyd-

konzentration ......................................................................................................................... 124

Abbildung 8.8. Extinktion bei pH 7, ohne PLP ........................................................................ 126

Abbildung 8.9. Extinktion bei pH 7, mit PLP ........................................................................... 127

Abbildung 8.10. Extinktion bei pH 8, ohne PLP ...................................................................... 128

Abbildung 8.11. Extinktion bei pH 8, mit PLP ......................................................................... 129

Abbildung 8.12. Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung ............................................... 132

Abbildung 8.13. Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung oder Zugabe eines

NMR-Standards ...................................................................................................................... 133

Abbildung 8.14. L-TA-katalysierten Aldolreaktion .................................................................. 135

Abbildung 8.15. Untersuchung der Zeitabhängigkeit ............................................................ 135

Abbildung 8.16. Untersuchung der Temperaturabhängigkeit ............................................... 136

Abbildung 8.17. Einfluss der Enzymmenge ............................................................................ 137

Abbildung 8.18. Einfluss des Verhältnisses von Glycin (11) zu Benzaldehyd (1e) ................. 138

Abbildung 8.19. Erhöhung der Substratkonzentration auf 0.25 M........................................ 140

Abbildung 8.20. Einfluss verschiedener Additive ................................................................... 142

Abbildung 8.21. Erweiterung des Substratspektrums ........................................................... 143

Abbildung 8.22. Optimierte Reaktion mit o-Chlorbenzaldehyd (1i) als Substrat .................. 152

Abbildung 8.23. Racematspaltung ......................................................................................... 158

Abbildung 8.24. Halohydrinsynthese ..................................................................................... 161

Abbildung 8.25. Epoxidsynthese über zwei Stufen ................................................................ 163

TABELLENVERZEICHNIS

XIV

III. Tabellenverzeichnis

Tabelle 3.1. Optimierung der Synthese von (R)-5f in wässrigem Medium .............................. 26

Tabelle 4.1. Ergebnisse des Photometertests .......................................................................... 51

Tabelle 4.2. Überprüfung der Umsatzbestimmung mittels NMR-Standard ............................ 55

Tabelle 4.3. Überprüfung der Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung ............................ 56

Tabelle 4.4. Abhängigkeit der Biotransformation von der Reaktionszeit ................................ 59

Tabelle 4.5. Racematspaltung von rac-syn-12e ....................................................................... 78

Tabelle 4.6. Racematspaltung von rac-syn-12i ........................................................................ 79

Tabelle 8.1. Optimierung der organokatalytischen Aldolreaktion......................................... 111

Tabelle 8.2. Untersuchung der Hintergrundreaktion ............................................................. 123

Tabelle 8.3. Untersuchung auf Epimerisierung ...................................................................... 124

Tabelle 8.4. Extinktion bei pH 7 und ohne Zugabe von PLP ................................................... 125

Tabelle 8.5. Extinktion bei pH 7 und Zugabe von PLP ............................................................ 126

Tabelle 8.6. Extinktion bei pH 8 und ohne Zugabe von PLP ................................................... 127

Tabelle 8.7. Extinktion bei pH 8 und Zugabe von PLP ............................................................ 128

Tabelle 8.8. Durchführung des Photometertests ohne Zugabe von PLP ............................... 129

Tabelle 8.9. Durchführung des Photometertest mit Zugabe von PLP ................................... 130

Tabelle 8.10. Ergebnisse des Photometertests ...................................................................... 130

Tabelle 8.11. Einfluss von 11 auf die Enzymaktivität ............................................................. 131

Tabelle 8.12. Einfluss von 12e auf die Enzymaktivität ........................................................... 131

Tabelle 8.13. Überprüfung der Umsatzbestimmung mittels NMR-Standard ........................ 132

Tabelle 8.14. Überprüfung der Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung ........................ 133

Tabelle 8.15. Umsatzbestimmung L-TA-katalysierten Aldolreaktion ..................................... 135

Tabelle 8.16. Zeitabhängigkeit der Enzymreaktion ................................................................ 136

Tabelle 8.17. Enzymreaktion bei 40°C .................................................................................... 137

Tabelle 8.18. Einfluss der Enzymmenge ................................................................................. 138

Tabelle 8.19. Einfluss des Glycinüberschusses ....................................................................... 139

Tabelle 8.20. Einfluss der Benzaldehydkonzentration ........................................................... 140

Tabelle 8.21. Umsatz bei Substratkonzentration von 0.25 M ................................................ 141

Tabelle 8.22. Einfluss verschiedener Additive........................................................................ 142

Tabelle 8.23. Enzymatische Synthese von (2S)-12b ............................................................... 143

TABELLENVERZEICHNIS

XV

Tabelle 8.24. Enzymatische Synthese von (2S)-12f ................................................................ 144

Tabelle 8.25. Enzymatische Synthese von (2S)-12i ................................................................ 145

Tabelle 8.26. Enzymatische Synthese von (2S)-12j ................................................................ 146

Tabelle 8.27. Enzymatische Synthese von (2S)-12k ............................................................... 146

Tabelle 8.28. Enzymatische Synthese von (2S)-12l ................................................................ 147

Tabelle 8.29. Enzymatische Synthese von (2S)-12m .............................................................. 147

Tabelle 8.30. Enzymatische Synthese von (2S)-12n ............................................................... 148

Tabelle 8.31. Enzymatische Synthese von (2S)-12o ............................................................... 149

Tabelle 8.32. Enzymatische Synthese von (2S)-12p ............................................................... 149

Tabelle 8.33. Enzymatische Synthese von (2S)-12q ............................................................... 150

Tabelle 8.34. Enzymatische Synthese von (2S)-12r ................................................................ 151

Tabelle 8.35. Enzymatische Synthese von (2S)-12s ............................................................... 151

Tabelle 8.36. Reaktionsverfolgung ......................................................................................... 153

Tabelle 8.37. Enzymatische Umsetzung mit und ohne Zugabe von PLP ................................ 154

Tabelle 8.38. Vergleichsversuchsreihe mit Benzaldehyd (1e) als Substrat ............................ 155

Tabelle 8.39. Racematspaltung von rac-syn-12e ................................................................... 159

Tabelle 8.40. Racematspaltung von rac-syn-12i .................................................................... 160

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

XVI

IV. Abkürzungsverzeichnis

ADH Alkoholdehydrogenase

AD-H-Säule CHIRALPAK® Amolyse tris-(3,5-dimethylphenylcarbamat)

aq. wässrig

Äq. Äquivalent(e)

atm Atmosphären

BINOL Binaphthol

BINAP 2,2'-Bis-(diphenylphosphino)-1,1'-binaphtyl

BzCl Benzoylchlorid

CDCl3 deuteriertes Chloroform

cm Zentimeter

d [cm] Küvettendicke

d Dublett

δ [ppm] chemische Verschiebung

DBU 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en

DC Dünnschichtchromatographie

dd Dublett vom Dublett

DET Diethyltartrat

DHAP Dihydroxyacetonphosphat

dhb 2,5-Dihydroxybenzoesäure

DIPT Diisopropyltartrat

DKR dynamisch kinetische Racematspaltung

d.r. Diastereomerenverhältnis (diastereomeric ratio)

EA Elementaranalyse

ee Enantiomerenüberschuss (enantiomeric excess)

EI Elektronenstoßionisation

EtOAc Ethylacetat

f Probenverdünnungsfaktor

FA Ameisensäure (formic acid)

FAB fast atom bombardement

h Stunde


XVII

HPLC High Performance Liquid Chromatography

Hz Hertz

i-PrOH iso-Propanol

IR Infrarot

J skalare Kopplungskonstante

L Liter

LB-ADH Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis

LK-ADH Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir

Kat. Katalysator

Konz. Konzentration

m Multiplett

MeOH Methanol

mg Milligramm

m/z Verhältnis Masse zu Ladung

MHz Megahertz

min Minute(n)

mL Milliliter

mmol Millimol

mol Mol

MS Massenspektrometrie

MTBE Methyl-tert-butylether

NADH, NAD+ Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid

NADPH, NADP+ Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat

NBA m-Nitrobenzylalkohol

NBS N-Bromsuccinimid

n.b. nicht bestimmt

n.d. nicht detektierbar

nm Nanometer

NMR Kernmagnetische Resonanz

Ø Durchmesser

OD-Säule CHIRALCEL®-Säule OD, Cellulose tris-(3,5-dimethylphenyl-carbamat)

OJ-H-Säule CHIRALCEL®-Säule OJ-H, Cellulose tris-(4-methylbenzoat)


XVIII

PLP Pyridoxal-5-phosphat

ppm parts per million

q Quartett

R Substituent

RF Retentionsfaktor

rac racemisch

rpm Umdrehung pro Minute (rounds per minute)

Rsp-ADH Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus sp.

RT Raumtemperatur

s Singulett

sin Sinapinsäure

SiO2 Kieselgel

t Triplett

t Zeit

tr Retentionszeit

t-BuOH tert-Butanol

t-BuOK Kalium-tert-butanolat

t-BuOOH tert-Butylhydroperoxid

TA Threoninaldolase

TEA Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofuran

Ti(O-iPr) Titan(IV)isopropylat

TMS Tetramethylsilyl-

U Units

U/mL volumetrische Enzymaktivität

U/mmol Units/Stoffmenge n(Substrat)

UV/Vis Ultraviolett/Visible

V Volumen

μl Mikroliter

ṽ [cm-1] Wellenzahl

Vg [ml] Gesamtprobenvolumen

Vp [ml] Probenvolumen

EINLEITUNG

1

1. Einleitung

Die organische Chemie basiert auf der Untersuchung und Herstellung von Kohlenstoff-

verbindungen, wie zum Beispiel Aminosäuren und Proteine. Zu den Herausforderungen

eines organischen Chemikers zählen die Herstellung von komplexen Kohlenstoff-

verbindungen sowie die Entwicklung möglichst effizienter Syntheserouten. Eine der

wichtigsten Reaktionsklassen ist hierbei die C-C-Bindungsknüpfung, die den Aufbau langer

und komplexer Kohlenstoffketten ermöglicht. Ein mit am häufigsten angewendeter Vertreter

dieser Klasse ist die Aldolreaktion, bei der zwei Aldehyde oder Ketone miteinander zu einer

β-Hydroxycarbonylverbindung reagieren (Abbildung 1.1).1 Eine Weiterreaktion zum Alken

unter Abspaltung von Wasser ist als Aldolkondensation bekannt.

R3 R4

O

R2

R1

O+ R1

O

R3

OH

R4R2

Katalysator -H2OR1

O

R3

R4

R2

Abbildung 1.1. Allgemeines Reaktionsschema der Aldolreaktion

Durch geeignete Wahl der Ausgangsverbindungen, beispielsweise die Verwendung von

lediglich einer Verbindung mit einem α-ständigen Proton, kann die Bildung unerwünschter

Kreuzprodukte vermieden werden. Auch durch den Einsatz von Enoläquivalenten, wie etwa

Silylenolether oder Lithiumenolate kann die Synthese des gewünschten Produkts beeinflusst

werden. Hierbei wird der Donor zuerst in ein Enolat überführt und anschließend der

Akzeptor zugegeben.1,2 Ein weiterer interessanter Aspekt der Aldolreaktion ist, dass hier je

nach Wahl der Ausgangsverbindungen chirale Produkte entstehen können. Bei der

klassischen achiralen säure- bzw. basenkatalysierten Reaktion entstehen Racemate,

allerdings haben sich im Laufe der Zeit auch eine Vielzahl enantioselektiver Methoden zur

Synthese von β-Hydroxycarbonylverbindungen etabliert.3,4 Ein Beispiel ist die Mukaiyama-

Aldoladdition.5 Der Donor wird zuerst in einen Silylenolether überführt und anschließend

wird die Reaktion mit dem Akzeptor durch eine chirale Lewis-Säure katalysiert. Die

asymmetrische Induktion erfolgt hier über den chiralen Liganden der Säure.1 Dabei handelt

es sich meist um Chelatliganden, wie beispielsweise BINOL-Derivate. Es können dabei

verschiedenste Lewis-Säuren verwendet werden, wie Titan-, Kupfer- oder

EINLEITUNG

2

Siliciumverbindungen.3 Ein Beispiel mit Siliciumchlorid als Lewis-Säure und einem BINOL-

Derivat 4 als chiralen Ligand ist in Abbildung 1.2 dargestellt.6

Abbildung 1.2. Beispiel für eine selektive Mukaiyama-Aldoladdition6

Alternative metallkatalysierte Routen lieferten Shibasaki7 und Trost.8 Des Weiteren steht

eine Vielzahl von Organokatalysatoren für die enantioselektive Aldolreaktion zur Verfügung.9

Erstmals wurde die enantioselektive katalytische Wirkung von chiralen Aminosäuren, wie

etwa Prolin, in den frühen siebziger Jahren am Beispiel einer intramolekularen Aldolreaktion

gezeigt.10 Nachdem die katalytische Wirkung von Prolin 2000 von List et al. auch auf

intermolekulare Bindungsknüpfungen ausgeweitet worden war (Abbildung 1.3),11 folgte die

Entwicklung weitere Katalysatoren, deren Strukturen vor allem auf Prolin basierten.12

Abbildung 1.3. Prolinkatalysierte Aldolreaktion11

Prolin reagiert mechanistisch gesehen als Enzymmimetikum.13 Im Katalysezyklus der nicht

metallhaltigen Aldolasen erfolgt die Aktivierung über ein Enamin-Intermediat, wie auch beim

Einsatz von Prolin (Abbildung 1.4).14,15

EINLEITUNG

3

HN

(Aldolase) Lys

OHR

N CO2H

Enamin-IntermediatAldolase

Enamin-IntermediatOrganokatalysator

Abbildung 1.4. Enamin-Intermediate der bio- und organokatalytischen Aldolreaktion13

Aldolasen katalysieren ebenfalls selektiv die Aldoladdition, allerdings sind diese

Biokatalysatoren stark donorspezifisch.16 Sie können in vier verschiedene Klassen eingeteilt

werden, die jeweils einen speziellen Donor akzeptieren und somit auch nur zur Synthese

bestimmter Produktklassen verwendet werden können (Abbildung 1.5)17,18 Bis jetzt sind nur

wenige Ausnahmen von dieser Donorspezifität bekannt.16,19,20,21

Abbildung 1.5. Einteilung der Aldolasen nach Donorspezifität17

Bei der Pyruvat- und der Acetaldehyd-abhängigen Aldolase entsteht eine Ketosäure 9 bzw.

die Aldolstruktur 10 mit jeweils einem Stereozentrum, wohingegen bei der

Dihydroxyacetonphosphat- (6, DHAP) und Glycin-abhängigen Aldolase unter Verwendung

prochiraler Aldehyde ein Ketose-1-phosphat 7 bzw. eine β-Hydroxy-α-aminosäure 12 mit

jeweils zwei Stereozentren entsteht. Die Gruppe der DHAP-abhängigen Enzyme wurde am

EINLEITUNG

4

intensivsten untersucht.17 Hier gibt es verschiedene Biokatalysatoren, die zur Bildung aller

vier möglichen Stereoisomere fähig sind. Bei der Wahl des Akzeptors ist das Enzym deutlich

flexibler und es werden verschiedene Carbonylverbindungen umgesetzt.16,17

Die Pyruvat-abhängige Aldolase wird industriell im großen Maßstab zur Synthese von

Neuraminsäure 15, die eine wichtige Vorstufe für das Grippemittel Zanamivir 16 darstellt,

genutzt (Abbildung 1.6).22

Abbildung 1.6. Industrielle Anwendung der Pyruvat-abhängigen Aldolase22

Die Verwendung von Enzymen in der chemischen Industrie hat in den letzten Jahren stark an

Bedeutung gewonnen.23 So bietet die Biotechnologie die Möglichkeit Prozesse nachhaltiger

und „grüner“ zu gestalten und beispielsweise den CO2-Ausstoß zu senken.24,25 Im Bereich der

Arzneimittelproduktion werden immer noch typischerweise 25 bis 100 Kilogramm Abfall pro

Kilogramm erhaltener Zielverbindung bei den klassischen Syntheserouten produziert.26 Das

Ziel der grünen Chemie ist es chemische Prozesse sicherer, umweltverträglicher und

energieeffizienter zu gestalten.27 Hier bietet sich der Einsatz von Enzymen an, da diese meist

in wässrigem Medium und bei milden Temperaturen sehr effizient und selektiv Reaktionen

katalysieren.23,24

MOTIVATION UND ZIELSETZUNG

5

2. Motivation und Zielsetzung

Zur Verbesserung von Syntheserouten für die Gewinnung pharmazeutisch relevanter

Bausteine, im Hinblick auf einen nachhaltigen Prozess, waren die Nutzung der Aldolreaktion,

sowie der Einsatz verschiedener Biokatalysatoren geplant. Die Synthese von 1,3-Diolen sollte

durch die Kombination von organokatalytischer Aldolreaktion und anschließender

enzymatischer Reduktion erzielt werden. Außerdem sollte unter Einsatz von Glycin-

abhängigen Aldolasen, den sogenannten Threoninaldolasen (TA), eine verbesserte

Syntheseroute für β-Hydroxy-α-aminosäuren etabliert werden (Abbildung 2.1). Das Motiv

der 1,3-Diole kommt in verschiedenen Naturstoffen, wie etwa makroliden Antibiotika, zu

denen auch Amphotericin B zählt, vor.28 Einige β-Hydroxy-α-aminosäuren können als

Vorstufe für die Synthese von Antibiotika, wie beispielsweise Thiamphenicol oder

Chloramphenicol genutzt werden.29

Abbildung 2.1. Aldolreaktion und Biokatalysatoren zur Synthese von Pharmabausteinen


6

2.1 Synthese von 1,3-Diolen

Von einer Vielzahl von Verfahren zur Herstellung von 1,3-Diolen wurde bereits berichtet,

allerdings gibt es hier keinen generellen Zugang zu dieser Produktklasse.30 Ein bestehendes,

vielversprechendes Konzept zur Synthese von 1,3-Diolen,31 bei dem die beiden

Stereozentren sequenziell aufgebaut werden, sollte weiterentwickelt werden. Ziel war es mit

Hilfe der organokatalytischen Aldolreaktion und Wahl eines biomimetischen Katalysators

β-Hydroxyketone 5 mit möglichst hoher Enantioselektivität und hohem Umsatz herzustellen

und anschließend das zweite Stereozentrum durch enzymatische Reduktion hoch

enantioselektiv aufzubauen (Abbildung 2.2). Durch geeignete Wahl des Organo- bzw.

Biokatalysators ist es möglich, die einzelnen Stereozentren in der gewünschten

Konfiguration zu erhalten und jedes der vier möglichen Stereoisomere zu bilden.

Abbildung 2.2. Konzept der Synthese von 1,3-Diolen 17

Durch die Weiterentwicklung der Syntheseroute zu einer Eintopfreaktion wird der Prozess

im Hinblick auf seine Nachhaltigkeit verbessert, da ein Isolierungsschritt eingespart und

somit der Verbrauch an Chemikalien reduziert wird. Die Machbarkeit eines solchen

Verfahrens unter den eben dargestellten Bedingungen konnte bereits gezeigt werden.31

Allerdings ist eine weitere Optimierung der Ausbeute und Diastereoselektivität nötig. Die

Kompatibilität der beiden Reaktionen sollte durch eine Durchführung des

organokatalytischen Schrittes in wässrigem Medium verbessert werden (Abbildung 2.3).

Abbildung 2.3. Synthese von 1,3-Diolen 17 als Eintopfreaktion


7

2.2 Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren

Rein chemische Syntheserouten zur Herstellung von β-Hydroxy-α-aminosäuren ausgehend

von Glycin sind bereits bekannt.32 Allerdings sind diese Methoden meist dadurch limitiert,

dass geschützte Ausgangsverbindungen eingesetzt werden müssen und die Synthese über

mehrere Stufen verläuft. Bei der industriellen Produktion von Thiamphenicol 19 (Zambon-

Prozess) wird beispielsweise zuerst die racemische β-Hydroxy-α-aminosäure 12d hergestellt,

die dann über eine Racematspaltung getrennt werden muss, bevor eine Weiterreaktion zum

gewünschten Produkt 19 möglich ist (Abbildung 2.4).33

Abbildung 2.4. Zambon-Prozess33

Im Vergleich zu diesen Syntheserouten ermöglicht der Einsatz von Threoninaldolasen die

Synthese der gewünschten Verbindung 12 ausgehend von Glycin (11) und einem Aldehyd 1

in nur einem enantioselektiven Schritt unter milden Bedingungen. Auch muss beispielsweise

Glycin (11) nicht entsprechend geschützt bzw. aktiviert werden (Abbildung 2.5).

Abbildung 2.5. Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren 12 mit Threoninaldolasen


8

Der bei dieser Reaktion verwendete Biokatalysator steht in zwei Varianten zur Verfügung,

der L-selektiven und der D-selektiven Threoninaldolase (L-TA, D-TA). Diese Enzyme

katalysieren die Bildung des Stereozentrums in α-Position hochselektiv, wohingegen die

Enantioselektivität für das Stereozentrum in β-Position meist geringer ist. Beide

Aldolasetypen wurden bereits bei der Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren eingesetzt,

allerdings mit zum Teil mäßigen Diastereoselektivitäten und nur in kleinem Maßstab.29

Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun mit der L-Threoninaldolase aus E. coli eine

Prozessoptimierung durchgeführt werden. Ziel war es β-Hydroxy-α-aminosäuren 12 in

möglichst großem Maßstab, bei hoher Substratkonzentration, mit gutem Umsatz und

möglichst hoher Enantio- und Diastereoselektivität herzustellen (Abbildung 2.6).

Abbildung 2.6. Ziel der Prozessoptimierung der enzymatischen Aldolreaktion

2.3 Synthese von Epoxiden aus β-Hydroxy-α-aminosäuren

Nach Etablierung einer enzymatischen Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren (2S)-12 im

50-100 mL-Maßstab sollte, ausgehend von dieser Verbindung, die Umsetzung zu

enantiomerenreinen Epoxiden 21 über zwei Stufen untersucht werden (Abbildung 5.7).

Abbildung 2.7. Synthese von Epoxiden 21 ausgehend von β-Hydroxy-α-aminosäuren (2S)-12

In Anlehnung an den Schritt des Ringschlusses ausgehend von Halohydrinen bei der Darzens-

Glycidester-Synthese1 sollte zuerst die Aminogruppe durch ein Chloridion substituiert

werden und anschließend das erhaltene Halohydrin 20 zum Epoxid 21 umgesetzt werden.

Auf diesem Weg sollte ein einfacher Zugang zu enantio- und diastereomerenreinen Epoxiden

etabliert werden.

KOMBINATION EINER ORGANOKATALYTISCHEN ALDOLREAKTION UND EINER

ENZYMATISCHEN REDUKTION

9

3. Kombination einer organokatalytischen Aldolreaktion und

einer enzymatischen Reduktion

3.1 Einleitung

Die Untersuchung und Verbesserung von Medikamenten ist ein wichtiger Bestandteil der

Forschung. So wurde auch das bereits erwähnte Amphotericin B (Abschnitt 2) in einer

aktuellen Veröffentlichung genauer untersucht.34 Die Wirksamkeit gegen chronische und

systemische Pilzinfektionen, von denen vor allem Patienten mit schwachem Immunsystem

betroffen sind, wie beispielsweise nach einer Chemotherapie oder bei einer Aids-

Erkrankung, ist unbestritten. Allerdings treten auch unerwünschte Nebenwirkungen wie

Leber- oder Nierenschäden auf. Aus diesem Grund wurden neue Derivate entwickelt, die

eine verbesserte Wirkung bei geringerer Toxizität aufweisen sollten. Die in Abbildung 3.1

dargestellte Verbindung zeigte bei den durchgeführten Testreihen die höchste

Wirksamkeit.35

Abbildung 3.1. Amphotericin B-Derivat mit verbesserter Wirksamkeit35

Zur Verbesserung verschiedenster Arzneistoffe ist die Erforschung und Weiterentwicklung

von Syntheserouten der Grundbausteine dieser Verbindungen ebenfalls unerlässlich.

1,3-Diole 17 gehören zu solch wichtigen Teilstrukturen pharmazeutisch relevanter

Verbindungen.36 Dies belegt auch die Vielzahl an Veröffentlichungen auf diesem Gebiet.28,30

Die Methoden zur Herstellung dieser Stoffe verlaufen meist über die Synthese von

β-Hydroxyketonen oder 1,3-Diketonen mit anschließender selektiver metallkatalysierter

oder biokatalytischer Reduktion. Die bekannten Methoden sind allerdings noch



10

optimierungsbedürftig im Hinblick auf Substratbreite und Enantio- bzw. Diastereo-

selektivität.30 Deshalb ist eine Weiterentwicklung der 1,3-Diolsynthese von besonderer

Bedeutung.

3.2 Stand der Wissenschaft

3.2.1 Synthesestrategien zur Herstellung von 1,3-Diolen

Eine Übersicht über die vielen verschiedenen Synthesemethoden von 1,3-Diolen 17 wurde

von Bode et al. erstellt.30 Im Folgenden sollen ausgewählte Beispiele diskutiert werden.

Meist werden die Reduktionen von 1,3-Diketonen oder β-Hydroxyketonen mit Borhydriden,

Metall- oder Biokatalysatoren zur Herstellung von 1,3-Diolen 17 verwendet.30 Mit Hilfe von

Borhydriden können beispielsweise selektiv anti-Diole 23 hergestellt werden (Abbildung

3.2).37

Abbildung 3.2. Reduktion mit Borhydrid37

Um enantiomerenreine Verbindungen zu erhalten, müssen oftmals enantiomerenreine

β-Hydroxyketone eingesetzt werden und je nach Hydrierungsreagenz werden syn- oder anti-

Produkte erhalten. Ein Nachteil bei der Verwendung von Borhydriden ist vor allem, dass

diese Verbindungen meist stöchiometrisch zugegeben werden müssen, teilweise sogar im

Überschuss.30 Eine Alternative dazu bietet die enantioselektive metallkatalysierte Reduktion,

die von Noyori et al. bereits 1988 vorgestellt wurde38 und sich im Laufe der Zeit zu einer

allgemeinen Methode zur Reduktion von Ketonen entwickelt hat.39 Die enantioselektive

katalytische Wirkung wird hier durch den Einsatz eines chiralen Liganden, wie beispielsweise

BINAP oder entsprechenden Derivaten erzielt. In Abbildung 3.3 ist die Reduktion von

Diketon 22 mit einem Ruthenium-BINAP-Katalysator gezeigt. Die Enantioselektivitäten sind

teilweise nur mäßig und stark von Substrat und Katalysator abhängig.



11

Abbildung 3.3. Metallkatalysierte Reduktion von Diketonen38

Ein Beispiel für die biokatalytische Reduktion von 1,3-Diketonen 24 zeigten Quazi et al.40 Mit

Hilfe von zwei unterschiedlich selektiven Oxidoreduktasen konnte die Ketofunktion an

Position 3 mit einer Enantioselektivität von >99% ee zum Alkohol reduziert werden.

(Abbildung 3.4). Eine enzymatische Reduktion der zweiten Ketofunktion gelang allerdings

nur in mäßigen Ausbeuten. Es wurde dann auf eine klassisch chemische

Natriumborhydridreduktion zurückgegriffen und das erhaltene Diastereomerengemisch

säulenchromatographisch getrennt.

Abbildung 3.4. Chemoenzymatische Reduktion von Diketon 2440

Eine deutliche Verbesserung der Enantio- und Diastereoselektivität bei der Synthese von

1,3-Diolen 17 durch den sequentiellen, selektiven Aufbau der beiden Stereozentren konnte

bereits während meiner Diplomarbeit gezeigt werden.31 Im ersten Schritt wurde das

Stereozentrum des β-Hydroxyketons 5f mit Hilfe einer organokatalytischen Aldolreaktion

selektiv aufgebaut. Durch anschließende enzymatische Reduktion konnten alle vier



12

möglichen Isomere hergestellt werden (Abbildung 3.5). Eine weitere Optimierung dieses

Systems, bezüglich der Enantioselektivität des ersten Schrittes sowie die Isolierung der

verschiedenen Stereoisomere 17f, ist allerdings weiter erforderlich.

Abbildung 3.5. Sequentieller Aufbau der beiden Stereozentren von 17f

3.2.2 Organokatalytische Aldolreaktion

Seit der Etablierung der intermolekularen organokatalytischen Aldolreaktion mit Prolin im

Jahr 2000 von List et al.,11 fand eine rasante Entwicklung auf diesem Gebiet statt und viele

neue Katalysatoren wurden synthetisiert und getestet.12,41,42 Ein wichtiger Fortschritt war die

Nutzung von Wasser als Lösungsmittel. Zum einen ist Wasser ein umweltverträgliches

Lösungsmittel und zum anderen besitzt es auch besondere physikalischen Eigenschaften, die

einen speziellen Einfluss auf organische Reaktionen besitzen, wie beispielsweise

Oberflächenspannung, Polarität und die Fähigkeit Wasserstoffbrückenbindungen zu bilden.43

Die Nutzung von Aminosäurederivaten als Katalysatoren stellt in wässrigem Medium kein

Problem dar, da die Verbindungen unter diesen Bedingungen stabil sind.

Als erstes konnte die Gruppe um Janda eine organokatalytische Aldolreaktion in Wasser

durchführen und lieferte zugleich auch eine Erklärung zur Rolle des Lösungsmittels während

der Reaktion (Abbildung 3.6).44 Der postulierte Mechanismus beinhaltet eine duale Rolle des

Lösungsmittels. Zum einen aktiviert es den Aldehyd für den nukleophilen Angriff durch

Übertragen eines Protons und zum anderen beschleunigt es die Hydrolyse des Imins im

letzten Schritt der Reaktion. Diese beiden Faktoren erhöhen die Geschwindigkeit der

Reaktion, was auch durch quantenchemische Berechnungen unterstützt wurde.44c Das



13

Produkt konnte zwar nur mit einer Enantioselektivität von 20% erhalten werden, aber dies

war der erste Schritt zur Etablierung der organokatalytischen Aldolreaktion in Wasser.

Abbildung 3.6. Einfluss von Wasser bei der organokatalytischen Aldolreaktion44

Mittlerweile wurde eine ganze Bandbreite an Katalysatoren entwickelt, die in solch einem

2-Phasen-System gute Ergebnisse erzielen.43 Es kommt zur Mehrphasenbildung, da die

meisten Aldehyde und Ketone nicht oder nur sehr schlecht wasserlöslich sind. Eine Vielzahl

der Katalysatoren basieren auf Aminosäurestrukturen, vor allem auf Prolin.43 Einige Beispiele

für Katalysatoren, die nicht auf Prolin basieren sind in Abbildung 3.7 gezeigt. Unter

Verwendung des Threoninderivats 28 konnten bei der Reaktion von m-Chlorbenzaldehyd

und Aceton bei Raumtemperatur gute Ausbeuten und Enantioselektivitäten von 97% ee

erzielt werden.45 Mit Hilfe des Binaphthyl-Katalysators 29 wurden mit Cyclohexanon als

Donor sehr gute Enantioselektivitäten von bis zu 98% ee gefunden, wohingegen Aceton nur

mäßige Ergebnisse (bis zu 87% ee) lieferte.46 Der Katalysator 30 konnte zum ersten Mal auch

nicht-aromatische Aldehyde als Akzeptoren mit guten Ausbeuten (70%) und exzellenten

Enantioselektivitäten (>99% ee) umsetzen.47 Sogar die ungünstige Reaktion zweier Ketone

(Cyclohexanon und Phenylglyoxylat) konnte mittels Katalysator 31 mit sehr guten

Enantioselektivitäten (>99% ee) durchgeführt werden.48



14

Abbildung 3.7. Organokatalysatoren für die Aldolreaktion in wässrigem Medium45,46,47,48

Als erstes entwickelte die Gruppe um Singh einen Katalysator 32 mit mehreren aktiven

Substituenten (OH, NH) und sterisch anspruchsvollen geminalen Phenylgruppen.49 Diese

Struktur wurde später wiederholt aufgegriffen (vgl. Katalysator 30).47,50 Mit dieser

Verbindung konnten verschiedene aromatische Aldehyde mit Aceton bei -5°C in gesättigter

Natriumchloridlösung umgesetzt und sehr gute Enantioselektivitäten von >99% ee und

Ausbeuten von bis zu 80% erzielt werden (Abbildung 3.8).51

Abbildung 3.8. Organkotalytische Aldolreaktion nach Singh51

Die hohe Enantioselektivität wurde durch Aktivierung des Aldehyds mittels

Wasserstoffbrückenbindung mit der Hydroxy- und der Amidgruppe erklärt. Die sterisch

anspruchsvollen geminalen Phenylgruppen beeinflussen die Enantioselektivität ebenfalls

positiv.51



15

3.2.3 Enzymatische Reduktion

Die Biotechnologie hält immer weiter Einzug in die industrielle Synthese. Die Gründe dafür

liegen dabei nicht nur in der hohen Stereoselektivität der Enzyme, sondern auch im

verfahrenstechnischen Bereich. So kann ein Prozess durch Einsatz von Biokatalysatoren

vereinfacht und somit Rohstoff-, Energieverbrauch und Abfallmenge verringert

werden.24,52,53 Viele Aminosäuren werden bereits durch biotechnologische Prozesse

hergestellt.23 Hierbei werden allerdings hauptsächlich fermentative Verfahren genutzt. Auch

zur Synthese chiraler Pharmaintermediate eignen sich Enzyme.54 Hier ist speziell die

Reduktion prochiraler Ketone mittels Alkoholdehydrogenasen (ADHs) zu nennen, da chirale

Alkohole oftmals in Arzneistoffen enthalten sind.55 Es wurden bereits einige Anwendungen

im Industriemaßstab entwickelt.56 Dazu zählt beispielsweise die Synthese von

Cholesterinsenkern. Shimizu et al. optimierten in Zusammenarbeit mit Kaneka die

enzymatische Reduktion von 4-Chloracetessigestern als Bausteine für Statin-

Seitenketten.57,58 In Abbildung 3.9 ist die biokatalytische Reduktion des Diketoesters 33 mit

einer Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis (LB-ADH) als Baustein zur Herstellung

von Rosuvastatin 35 gezeigt.59,60

Abbildung 3.9. Enzymatische Reduktion bei der Synthese von Statinen60

Die hier gezeigte Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis gehört zu den (R)-selektiven

ADHs, wie auch die aus Lactobacillus kefir. Dagegen sind die ADHs aus Rhodococcus species,

Pferdeleber und Hefen meist (S)-selektive Enzyme.17,61



16

Alkoholdehydrogenasen sind cofaktorabhängig, d.h. zur Reaktion muss NADH oder NADPH

stöchiometrisch zugegeben werden, damit die Reaktion abläuft. Da diese Cofaktoren sehr

teuer sind, wurden unterschiedliche Systeme entwickelt, um den Cofaktor in situ zu

regenerieren, wodurch dieser nur noch in katalytischen Mengen zugegeben werden

muss.17,56,61,62 Die zwei gängigsten Konzepte sind in Abbildung 3.10 dargestellt. Die

substratgekoppelte Cofaktorregenerierung basiert auf der Zugabe eines Alkohols, meist

iso-Propanol, der in der Rückreaktion von der gleichen Alkoholdehydrogenase zum Keton

oxidiert wird und somit den Cofaktor regeneriert. Der Alkohol muss in diesem Fall im

Überschuss zugegeben werden, um das Gleichgewicht der Reaktion auf die Produktseite zu

verschieben. Es besteht auch die Möglichkeit das bei der Cofaktorregenerierung

entstehende Keton (Aceton) destillativ aus dem Gleichgewicht zu entfernen. In beiden Fällen

muss die ADH mit dem Cosubstrat kompatibel sein.

Abbildung 3.10. Beispielsysteme zur Cofaktorregenerierung61

Das enzymgekoppelte System erfordert die Zugabe eines zweiten Enzyms, welches ein

Cosubstrat unter Rückbildung des Cofaktors umsetzt. Diese Reaktion ist irreversible,

wodurch das Gleichgewicht ebenfalls auf die Produktseite geschoben wird. Beispiele für

solche Enzyme sind die Formiatdehydrogenase (FDH), die Formiat zu CO2 umsetzt, das dem

System entweicht und die Glucosedehydrogenase (GDH), die D-Glucose zum Gluconolacton

umsetzt, das anschließend irreversibel zum Salz der Gluconsäure reagiert. Wichtig ist hierbei

die Kompatibilität der beiden Enzymreaktionen, da Inhibierungseffekte durch die

verschiedenen Reaktanden auftreten können.17,61,63



17

Eine Limitierung der Alkoholdehydrogenasen stellt oftmals das Substratspektrum dar. Die

Ketofunktion darf meist nur einen sterisch anspruchsvollen Substituenten besitzen, wie

beispielsweise bei Acetophenon.64 Zahlreiche Forschungsarbeiten beschäftigten sich in

jüngster Zeit mit der Erweiterung des Substratspektrums. In Abbildung 3.11 sind drei

Beispiele für solch sterisch anspruchsvolle Ketone gezeigt, die mit bestimmten

Alkoholdehydrogenasen umgesetzt werden können.64,65,66 Die ADHs aus Nocardia

globerula64 und Ralstonia species65 sind in der Lage das Keton 36 mit sehr guten (>96% ee

(S))64 bis moderaten Enantioselektivitäten (64% ee (S))65 umzusetzen. Dagegen konnte

ausgehend von 37 aus der Reaktion mit der ADH aus Ralstonia sp. der entsprechende

Alkohol mit einem sehr guten ee-Wert von >99% (S) erhalten werden.65 Das

Benzophenonderivat 38 wird von einer ADH aus Sporobolomyces salmonicolor akzeptiert

und mit guten Enantioselektivitäten von 88% ee (R) zum entsprechenden Alkohol reduziert.66

Abbildung 3.11. Sterisch anspruchsvolle Substrate für die enzymatische Reduktion64,65,66

Durch Mutation des bekannten Wildtyp-Enzyms aus Sporobolomyces salmonicolor konnte

ein Biokatalysator entwickelt werden, der in der Lage ist, das Produkt mit entgegengesetzter

Konfiguration zu bilden. Mit Hilfe einer Röntgenstruktur wurden spezielle Aminosäuren im

aktiven Zentrum des Proteins ausgewählt, die Einfluss auf die Enantioselektivität haben

könnten. Diese wurden dann durch Mutationen durch andere Aminosäuren ausgetauscht.

Die erhaltenen Mutanten zeigten anschließend eine (S)-Enantioselektivität von 76% ee bei

der Reduktion von 38.66

Ein wichtiger Teil bei der weiteren Entwicklung der Biotechnologie stellt die Optimierung von

bereits bekannten Biokatalysatoren dar. Die Limitierung durch begrenzte Substratakzeptanz,

geringe Stereoselektivität, unzureichende Stabilität oder auch Produktinhibierung können in

der Regel überwunden werden.67 Dadurch werden Enzyme attraktiver für eine industrielle

Anwendung.



18

3.2.4 Eintopfreaktionen

Durch Prozessoptimierung können chemische Synthesen im Sinne der grünen Chemie27

verbessert werden. Eine Möglichkeit ist hierbei das Konzept der Eintopfreaktionen oder

Kaskadenreaktionen. Dieses beruht auf der Kombination mehrerer Reaktionen ohne

Isolierung der einzelnen Zwischenstufen (Abbildung 3.12). Während bei der klassischen

Mehrstufensynthese jede Zwischenstufe (B, C) isoliert werden muss, wird bei dem

entsprechenden Eintopfverfahren lediglich das am Ende gewünschte Produkt nach

Aufarbeitung erhalten. Dadurch kann idealerweise die Reaktionszeit und die

Abfallproduktion drastisch gesenkt werden.68 Dies geschieht bereits durch den Wegfall der

aufwändigen Isolierungsschritte, wie beispielsweise der Säulenchromatographie, bei der

meist große Mengen an Lösungsmitteln benötigt werden.

Abbildung 3.12. Vergleich Mehrstufensynthese und Eintopfverfahren

Eine besondere Herausforderung besteht darin, die Vorteile der Biotechnologie zu nutzen

und diese mit etablierten chemischen Reaktionen in solchen Eintopfsystemen zu

kombinieren, da diese meist in unterschiedlichen Reaktionsmedien ablaufen. Eine Ausnahme

sind hierbei Lipasen, die in der Lage sind, in organischem Medium zu arbeiten. Deshalb hat

sich vor allem die Kombination solcher Enzyme mit Metallkatalysatoren in dynamisch

kinetischen Racematspaltungen (DKR) etabliert.69,70 Ein Beispiel für die Synthese

enantiomerenreiner 1,3-Diole mittels chemoenzymatischer DKR lieferten Bäckvall et al. Ein

racemisches Diol 17 wird mit Hilfe einer Lipase zweimal selektiv verestert und die einfach

veresterte Verbindung 39 mit Hilfe eines Rutheniumkatalysators in situ racemisiert



19

(Abbildung 3.13).71 Die Reaktion findet in Toluol statt und das syn-Produkt wird

enantiomerenrein erhalten, da die Wanderung der Acetylgruppe bei syn-Stellung bevorzugt

abläuft und die Lipase selektiv den (R)-Alkohol umsetzt. Durch diese Methode ist es

allerdings nicht möglich, alle vier Stereoisomere zu synthetisieren.

OH OH

SL

OH OAc

SL

OH OAc

SL

EnzymROAcRu-Kat. Ru-cat.

Epimerisierung

syn Acyl-migration

OAc OH

SLschnell

EnzymROAc

schnell

OAc OAc

SL

anti Acyl-migrationlangsam

17

39

40 41

L: largeS: small

Abbildung 3.13. Synthese von 1,3-Diolen mittels DKR

Schwieriger ist die Kombination von enzymatischen Reaktionen, die in wässrigem Medium

ablaufen, mit klassisch chemischen Reaktionen, da die Prozessparameter so optimiert

werden müssen, dass eine möglichst gute Kompatibilität erzielt wird. Dies gelang bereits in

verschiedenen Arbeitsgruppen.72,73,74,75 Beispielsweise konnten Kraußer et al. allylische

Alkohole durch Kombination einer Wittigreaktion und einer enzymatischen Reduktion in

einem Eintopfverfahren mit sehr guten Umsätzen (bis zu 90%) und exzellenten

Enantioselektivitäten (>99% ee) erhalten.76 Ebenfalls gelang die Kombination einer

metallkatalysierten Reaktion (Suzuki-Kupplung) mit einer enzymatischen Reduktion

(Abbildung 3.14).77

Abbildung 3.14. Eintopfsynthese von Biphenylalkoholen77

Nicht nur Alkoholdehydrogenasen wurden in Eintopfreaktionen genutzt. Auch eine

biokatalytische Aldolreaktion wurde mit einer metallkatalytischen Reaktion zur Synthese von



20

Iminocyclitolverbindungen 46 von Wong et al. eingesetzt (Abbildung 3.15).78 Auch hier

konnte die Zweistufensynthese ohne Isolierung des Zwischenprodukts durchgeführt werden.

Abbildung 3.15. Kombination einer enzymatische Aldolreaktion und einer Metallkatalyse in

einem Eintopfverfahren78

3.3 Ziel der Arbeit

In diesem Teil der Arbeit sollte durch sequenzielle Kombination von organokatalytischer

Aldolreaktion und enzymatischer Reduktion die Synthese aller möglichen Stereoisomere von

1,3-Diolen 17 durchgeführt werden. Darauf aufbauend sollte anschließend ein

Eintopfverfahren in wässrigem Medium entwickelt werden.

Basierend auf bereits veröffentlichten Vorarbeiten31 sollten die verschiedenen Isomere von

1-(4-Chlorphenyl)-1-butandiol (17f) aus der sequenziellen Synthese mit möglichst hohen

Ausbeuten isoliert werden (Abbildung 3.16). Das β-Hydroxyketon (R)-5f wurde bereits über

eine lösungsmittelfreie organokatalytische Route mit einem ee-Wert von 82% synthetisiert31

und sollte mit den ADHs aus Lactobacillus kefir (LK-ADH) und Rhodococcus species (Rsp-ADH)

diastereoselektiv mit hohem Umsatz reduziert werden.79 Das (S)-Enantiomer wurde bisher

lediglich mit einem ee-Wert von 71% eingesetzt.31 Deshalb sollte (S)-5f mit höherem

Enantiomerenüberschuss synthetisiert und das erhaltene Produkt mit den beiden ADHs

reduziert werden. Die einzelnen Diastereomere des Diols 17f sollten dann

säulenchromatographisch getrennt werden.



21

Abbildung 3.16. Synthese der 1,3-Diole 17f

Anschließend sollte die organokatalytische Aldolreaktion in wässrigem Medium mit

p-Chlorbenzaldehyd (1f) als Substrat durchgeführt und in einem Eintopfverfahren mit einer

enzymatischen Reduktion kombiniert werden (Abbildung 3.17). Um die Syntheseeffizienz zu

bewerten sollten auch hier die Produkte 17f isoliert und die Ausbeuten, sowie

Enantioselektivitäten mit denen aus der sequentiellen Route unter Isolierung der

Zwischenstufe 5f verglichen werden.

Abbildung 3.17. Eintopfsynthese in wässrigem Medium



22

3.4 Eigene Ergebnisse und Diskussion80

3.4.1 Organokatalyse unter lösungsmittelfreien Bedingungen

Das (S)-Enantiomer (S)-5f wurde mittels organokatalytischer Aldolreaktion hergestellt.

Hierzu wurde ein Organokatalysator 32 verwendet, der auf den Aminosäuren Prolin und

Leucin basiert und von Singh et al. publiziert wurde.49,51 Die Synthese von 5f erfolgte ohne

Zugabe eines organischen Lösungsmittels. Es wurde lediglich Aceton im Überschuss

eingesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur und mit einer Katalysatorkonzentration

von 5 mol% durchgeführt.31

Aufgrund der früheren Verwendung eines nicht diastereomerenreinen Katalysators wurde

lediglich ein Enantioselektivität von 71% ee bei der Synthese von (S)-5f erzielt. Der Einsatz

eines diastereomerenreinen Katalysators führte zu einer Steigerung des ee-Werts auf 83%

(Abbildung 3.18).

Abbildung 3.18. Organokatalytische Aldolreaktion zur Synthese von (S)-5f

3.4.2 Isolierung der 1,3-Diole

In einer früheren Arbeit konnte die sequentielle Synthese von 1,3-Diolen durch

organokatalytische Aldolreaktion und enzymatischer Reduktion gezeigt werden.31 Allerdings

wurden die Produkte 17f nicht isoliert. Bei der enzymatischen Umsetzung mit der

Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir wurde lediglich ein Umsatz von 33% erzielt.

Außerdem wurde bei der enzymatischen Reduktion (S)-5f lediglich mit einem ee-Wert von

71% eingesetzt.31 Im Folgenden wurde die Umsetzung mit LK-ADH optimiert, (S)-5f mit

einem Enantiomerenüberschuss von 83% eingesetzt und alle Stereoisomere von 17f isoliert.



23

3.4.2.1 Optimierung der (R)-selektiven enzymatischen Synthese

Zur Verbesserung des Umsatzes einer enzymatischen Reaktion besteht unter anderem die

Möglichkeit die Reaktionszeit zu verlängern und die Enzymmenge zu erhöhen. Bei der

Umsetzung mittels LK-ADH konnte ein vollständiger Umsatz durch Verlängerung der

Reaktionszeit von 18 h auf 36 h und Erhöhung der Enzymaktivität von 10 U/mmol auf

100 U/mmol erzielt werden.

Bei der Reduktion des (R)-Enantiomers von 5f wurde das entsprechende Diol mit einer

Enantioselektivität von >99% ee und einem Diastereomerenverhältnis von d.r. 11:1

(syn/anti) erhalten. Die hervorragende Diastereoselektivität bei der enzymatischen

Reduktion ist auf die externe asymmetrische Induktion durch den Biokatalysator

zurückzuführen. Das Verhältnis der erhaltenen Diastereomere entspricht exakt dem

Verhältnis der beiden Enantiomere des β-Hydroxyketons (R)-5f. Durch

säulenchromatographische Aufarbeitung konnte das gewünschte Diastereomer (1R,3R)-1-

(4-Chlorphenyl)-1-butandiol ((1R,3R)-17f) mit einer Ausbeute von 59% isoliert werden

(Abbildung 3.19). Die im Vergleich zum Umsatz relativ niedrige Ausbeute ist zum einen damit

zu erklären, dass bei der Reaktion lediglich 82% des gewünschten Diastereomers entstehen

und zum anderen auf Verluste bei der säulenchromatographischen Trennung

zurückzuführen.

Abbildung 3.19. Reduktion von (R)-5f mit LK-ADH

Analoge Ergebnisse wurden bei der Umsetzung des (S)-Enantiomers von 5f (83% ee)

erhalten. Das (1S,3R)-1-(4-Chlorphenyl)-1-butandiol konnte durch säulenchromato-

graphische Aufarbeitung mit einer Ausbeute von 55% und mit einem ee-Wert von >99%

isoliert werden (Abbildung 3.20).



24

Abbildung 3.20. Reduktion von (S)-5f mit LK-ADH

3.4.2.2 (S)-Selektive enzymatische Umsetzung

Bei der enzymatischen Reduktion mittels Rsp-ADH war keine weitere Optimierung nötig. Bei

Einsatz von 40 U/mmol Enzym und einer Reaktionszeit von 18 h wurde bereits ein

vollständiger Umsatz erzielt. Die Umsetzung von (R)-5f lieferte das gewünschte Produkt mit

einem Diastereomerenverhältnis von d.r. 10:1 (anti/syn) und ebenfalls mit einer

hervorragenden Enantioselektivität von >99%. Nach erfolgreicher Isolierung konnte

(1R,3S)-17f mit einer Ausbeute von 66% erhalten werden (Abbildung 3.21).

Abbildung 3.21. Reduktion von (R)-5f mit Rsp-ADH

Das vierte Isomer (1S,3S)-17f konnte mit einer Ausbeute von 71% und ebenfalls mit einem

ee-Wert von >99% isoliert werden (Abbildung 3.22).



25

Abbildung 3.22. Reduktion von (S)-5f mit Rsp-ADH

3.4.3 Kombination der beiden Reaktionen in wässrigem Medium

Die Optimierung der organokatalytischen Aldolreaktion in wässriger Natriumchloridlösung,

ausgehend von Singh et al.,51 und anschließender Kombination mit der Biokatalyse in einem

Eintopfverfahren gelang Rulli mit m-Chlorbenzaldehyd als Substrat.81,82 Diese Methode sollte

auf die Synthese von 5f ausgehend von p-Chlorbenzaldehyd (1f) angewendet werden.

3.4.3.1 Optimierung der Organokatalyse in wässrigem Medium

Bei den bekannten Bedingungen handelt es sich um einen neunfachen Überschuss an Aceton

und 0.5 mol% Katalysatorbeladung. Das Volumen an Natriumchloridlösung entspricht dem

von 4. Mit m-Chlorbenzaldehyd als Substrat wurde nach 24 h von Rulli ein produktbezogener

Umsatz von 90% erhalten. Der ee-Wert lag mit über 90% etwas höher als bei der

lösungsmittelfreien Variante.81,82

Unter diesen Bedingungen konnte mit Substrat 1f allerdings nur ein produktbezogener

Umsatz von 58% bei einem Gesamtumsatz von 61% erzielt werden (Tabelle 3.1, Eintrag 1).

Bei allen Versuchen wurde nur eine geringe Menge an Nebenprodukten wie beispielsweise

das Aldolkondensationsprodukt oder ein Aldolprodukt aus zwei Molekülen 17f

nachgewiesen. Die erhaltene Menge an 5f ist zu niedrig für eine Kombination mit der

enzymatischen Reduktion in einer Eintopfreaktion. Um den Umsatz zu steigern wurden die

Reaktionszeit und die Katalysatormenge variiert.



26

Tabelle 3.1. Optimierung der Synthese von (R)-5f in wässrigem Medium

Eintrag1) c((S,S)-32)

[mol%]

t

[h]

Produktbezogener

Umsatz (R)-5f [%]

Gesamtumsatz

[%]

ee

[%]

1 0.5 24 58 61 n.b.2)

2 0.5 32 61 64 95

3 0.5 48 70 74 95

4 1 24 82 86 92

5 1 48 90 94 92

1) Durchführung: Siehe Abschnitt 8.2.1.3

2) n.b. nicht bestimmt

Das beste Ergebnis wurde bei einer Katalysatorkonzentration von 1 mol% und einer

Reaktionszeit von 48 h erzielt (Tabelle 3.1, Eintrag 5). Der ee-Wert lag bei der höheren

Katalysatorkonzentration etwas niedriger (92% ee), aber trotzdem in einem besseren

Bereich als bei der lösungsmittelfreien Variante (82% ee). Die Abnahme des ee-Wertes bei

höherer Katalysatorkonzentration wurde bereits von Rulli beobachtet.82 Ein hoher

Enantiomerenüberschuss bei 5f ist für die anschließende enzymatische Reduktion von

besonderem Interesse, da somit ein höherer Diastereomernüberschuss bei 17f erzielt

werden kann, dies führt zu einer höheren Ausbeute und zu einer einfacheren

Diastereomerentrennung. Die organokatalytische Reaktion mit einer Produktbildung von

90% (Tabelle 3.1, Eintrag 5) wurde nun mit der enzymatischen Reduktion in einem

Eintopfverfahren kombiniert.

3.4.3.2 Eintopfverfahren in wässrigem Medium

In dem entwickelten Eintopfverfahren im wässrigen Reaktionsmedium wurde zunächst die

organokatalytische Aldolreaktion durchgeführt und erst nach Ablauf der Reaktionszeit die



27

für die Enzymreaktion benötigten Reagenzien zugegeben.81,82 Bei Verwendung von LK-ADH

musste, wie bei der Einzelreaktion, Reaktionszeit und Enzymmenge erhöht werden, um

bessere Umsätze zu erzielen. Es konnte bei keiner der beiden Eintopfreaktionen eine

vollständige Umsetzung von 5f zum gewünschten Produkt 17f festgestellt werden

(Abbildung 3.23).

Abbildung 3.23. Eintopfverfahren in wässrigem Medium

Bei der Reaktion mit Rsp-ADH wurde als Nebenprodukt hauptsächlich das ungesättigte

Aldolkondensationsprodukt, das unter Abstraktion von Wasser entsteht, mit 11% und

lediglich 3% (R)-5f nachgewiesen. Bei der Eintopfsynthese mit LK-ADH wurden 17% (R)-5f

und 12% der ungesättigten Verbindung gebildet. Offenbar wird die enzymatische Reduktion

durch die Reagenzien aus dem ersten Schritt beeinträchtigt. Dies kann zum einen durch das

im Überschuss zugegebenen Aceton (4), das die substratgekoppelte Cofaktorregenerierung

stören kann, versursacht werden oder zum anderen durch die Anwesenheit des Katalysators.

Der produktbezogene Umsatz lag in einem Bereich von bis zu 79%. Durch den verbesserten

ee-Wert bei der organokatalytischen Reaktion wurden sehr gute Diastereomernverhältnisse

von d.r. >25:1 (syn/anti bzw. anti/syn) erhalten und die Ausbeuten lagen bei bis zu 73%. Die

enzymatische Reduktion führte zu den gewünschten Diastereomeren (1R,3R)- und (1R,3S)-

17f in einem exzellenten Enantiomerenüberschuss von >99% ee.

KOMBINATION EINER ORGANOKATALYTISCHEN


28

Um die Effizienz der entwickelten

wurden die unterschiedlichen

ist die Ausbeute an (1R,3S)-17f

Isolierung von 5f (50% Gesamta

lösungsmittelfreier Organokatalyse (54%

wässrigem Medium (73% Ausbeute

Abbildung 3.24.

Der Vergleich zeigt, dass die Ausbeute des gewünschten Produkts bei der Eintopfre

wässrigem Medium am höchsten ist. Zudem

des Zwischenprodukts verzichtet werden.

Syntheseroute im Hinblick auf Nachhaltigkeit zu entwickeln.

3.5 Zusammenfassung

Es konnte gezeigt werden, dass durch den sequentiellen

die einzelnen Diastereomere von

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Au

sbe

ute

[%

]

Einzelreaktionen

ANOKATALYTISCHEN ALDOLREAKTION UND EIN

EDUKTION

entwickelten Eintopfreaktion in wässrigem Medium

n Synthesemethoden miteinander verglichen. In

17f aus der sequentiellen Durchführung der Einzelreaktionen

Gesamtausbeute über zwei Schritte), einem Eintopfverfahren mit

freier Organokatalyse (54% Ausbeute)31,83 und dem Eintopfverfahren in

Ausbeute) graphisch dargestellt.

. Vergleich der verschiedenen Synthesemethoden

Der Vergleich zeigt, dass die Ausbeute des gewünschten Produkts bei der Eintopfre

wässrigem Medium am höchsten ist. Zudem konnte bei diesem System auf eine Isolierung

des Zwischenprodukts verzichtet werden. Es ist gelungen eine vielversprechende

Syntheseroute im Hinblick auf Nachhaltigkeit zu entwickeln.

Zusammenfassung

dass durch den sequentiellen Aufbau der beiden Stereozentren

die einzelnen Diastereomere von 17f mit hohen Umsätzen und zugleich hohen

5054

73

Einzelreaktionen Eintopf (lösungsmittelfrei) Eintopf (wässrig)

LDOLREAKTION UND EINER

in wässrigem Medium darzustellen,

verglichen. In Abbildung 3.24

aus der sequentiellen Durchführung der Einzelreaktionen mit

), einem Eintopfverfahren mit

und dem Eintopfverfahren in

Vergleich der verschiedenen Synthesemethoden

Der Vergleich zeigt, dass die Ausbeute des gewünschten Produkts bei der Eintopfreaktion in

konnte bei diesem System auf eine Isolierung

Es ist gelungen eine vielversprechende

der beiden Stereozentren

msätzen und zugleich hohen

Eintopf (wässrig)



29

Diastereomerenverhältnissen hergestellt werden können. Des Weiteren gelang die

säulenchromatographische Isolierung der vier einzelnen enantiomerenreinen Diastereomere

17f (Abbildung 3.25).

Cl

O

H

O

Cl

OH O

Cl

OH O

(R)-5f95% Umsatz58% Ausbeute

82% ee

(S)-5f90% Umsatz71% Ausbeute

83% ee

Cl

OH OH

Cl

OH OH

Cl

OH OH

Cl

OH OH

NAD+,

i-PrOH

(1R,3S)-17f>95% Umsatz

d.r. 10:1 (anti/syn)>99% ee;

66% Ausbeuted.r. >25:1 (anti/syn)

(1R,3R)-17f>95% Umsatz

d.r. 11:1 (syn/anti)>99% ee;

59% Ausbeuted.r. >25:1 (syn/anti)

(1S,3S)-17f>95% Umsatz

d.r. 11:1 (syn/anti)>99% ee;

71% Ausbeute>25:1 (syn/anti)

(1S,3R)-17f>95% Umsatz

d.r. 10:1 (anti/syn)>99% ee;


NHNH

OOH

Ph Ph

NHNH

OOH

Ph Ph

RT

RT

+

(S,S)-32

(R,R)-32

NADP+,

i-PrOH1f

4

(S)-ADH,

(R)-ADH,

NAD+,

i-PrOH

(S)-ADH,

NADP+,

i-PrOH

(R)-ADH,

Abbildung 3.25. Synthese aller vier Stereoisomere von 17f

Die Organokatalyse wurde zudem in wässrigem Medium für die Umsetzung des Substrats 1f

im Hinblick auf den produktbezogenen Umsatz und Enantioselektivität verbessert. Die

optimierte Reaktion konnte in einer Eintopfreaktion mit der enzymatischen Reduktion

kombiniert werden. Auf diesem Weg wurde unter anderem (1R,3S)-17f mit einem sehr

guten Diastereomerenverhältnis (d.r. >25:2 anti/syn) erhalten und mit einer Ausbeute von

73% isoliert (Abbildung 3.26).



30

Abbildung 3.26. Eintopfsynthese von (1R,3S)-17f

Der Vergleich mit der sequentiellen Methode und der lösungsmittelfreien Eintopfsynthese

zeigte, dass hier ein vielversprechender Prozess im Hinblick auf die Nachhaltigkeit etabliert

werden konnte.

ENZYMATISCHE ALDOLREAKTION

31

4. Enzymatische Aldolreaktion

4.1 Einleitung

Aldolasen katalysieren die nichthydrolytische Spaltung von C-C-Bindungen und gehören zur

Klasse der Lyasen.17 Die Einteilung der Aldolasen nach ihrer Donorspezifität wurde bereits in

Kapitel 1 (Abbildung 1.5) beschrieben. Die DHAP-abhängige Fructose-1,6-biphosphataldolase

ist Teil des Glycolysestoffwechsels, bei dem Glucose zu Pyruvat abgebaut wird. Diese

Aldolase spaltet im ersten Teil des Abbauweges Fructose-1,6-biphosphat in DHAP und

Glycerinaldehyd-3-phosphat.84 Die Threoninaldolasen, die in vielen Pflanzen, Wirbeltieren,

Bakterien, Hefen und Pilzen vorkommen, sind für die Spaltung von Threonin (12c) in Glycin

(11) und Acetaldehyd (1c) verantwortlich (Abbildung 4.1). Im Stoffwechsel erfolgt dann der

weitere Abbau zu Acetyl-CoA und Pyruvat.29

OH

O

NH2

OH

ThreoninaldolaseH

O+ OH

O

NH2

Acetyl-CoA Pyruvat

12c 1c 11

Abbildung 4.1. Enzymatische Spaltung von Threonin (12c) im Körper

Die vier verschiedenen Aldolasetypen katalysieren ebenfalls die Rückreaktion bzw. die

C-C-Bindungsknüpfung, die aus synthetischer Sicht attraktiv ist. Die Herstellung von optisch

aktiven β-Hydroxy-α-aminosäuren ist hierbei von besonderer Bedeutung, vor allem im

Hinblick auf pharmazeutische Anwendungen. Dieser Aminosäurebaustein findet sich in

Antibiotika wie Thiamphenicol und Vancomycin (Abbildung 4.2) oder in

Entzündungshemmern, wie Cylcomarinen, wieder.85


32

Abbildung 4.2. Vancomycin

Es gibt einige Beispiele für den Einsatz von Threoninaldolasen bei der Synthese komplexer

Moleküle.86,87,88 Digitoxin (49) ist ein Na+/K+-ATPase-Inhibitor, der bei kongestiver

Herzinsuffizienz oder bei Herzrhythmusstörungen eingesetzt wird. Bei der Synthese über

mehrere Stufen wird die β-Hydroxy-α-aminosäure 47 durch enzymatische Aldolreaktion

hergestellt und kann dann zum gewünschten Produkt weiter umgesetzt werden (Abbildung

4.3).87

Abbildung 4.3. Synthese von Digitoxin (49)87

Auch die Herstellung eines Fucosyltransferase-Inhibitors 51 verläuft über eine

Threoninaldolase-katalysierte Reaktion.88 Die dabei erhaltene β-Hydroxy-α-aminosäure 50

wird über mehrere Stufen zu 51 umgesetzt. (Abbildung 4.4).


33

Abbildung 4.4. Synthese eines Fucosyltransferase-Inhibitors 5188

Diese beiden Beispiele zeigen, dass die TA-katalysierte Aldolreaktion als attraktive und

selektive C-C-Bindungsknüpfung bereits in der Synthese pharmazeutisch relevanter

Verbindungen genutzt werden kann.


4.2.1 Synthesestrategien für β-Hydroxy-α-aminosäuren

Die chemischen Methoden zur Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren sind vielfältig und

basieren auf verschiedenen Konzepten. Dabei ist vor allem die Aldolreaktion von Glycin (11),

bzw. dessen Derivaten mit Aldehyden 1, die durch unterschiedliche Verbindungen katalysiert

werden kann, zu nennen (Abbildung 4.5).89

Abbildung 4.5. Aldolreaktion von Glycin (11) und Aldehyden 1

Zudem gibt es Methoden für chemokatalytische, dynamisch kinetische Racemat-

spaltungen.90 Allerdings muss bei diesen meist auf Schutzgruppen zurückgegriffen werden.

Im Folgenden sollen nun einige dieser Konzepte vorgestellt werden.

Die Gruppe um Hamada veröffentlichte bereits mehrere Katalysatorsysteme, die in der Lage

sind selektiv β-Keto-α-aminosäureester zu den entsprechenden anti-β-Hydroxy-

α-aminosäureestern zu reduzieren.90 In Abbildung 4.6 ist die Spaltung des Ketoesters 52 mit

Hilfe eines Iridiumkomplexes 54 gezeigt.90d Es handelt sich hierbei um eine dynamisch


34

kinetische Racematspaltung, bei der sehr gute Ausbeuten und Enantioselektivitäten erzielt

werden konnten.

Abbildung 4.6. DKR zur Synthese von anti-β-Hydroxy-α-aminosäureestern 5390d

Weitere Methoden verlaufen über 1,3-Cycloadditionen91 oder auch nukleophile92 sowie

radikalische93 Substitutionen. In Abbildung 4.7 wird die Zielverbindung 58, ausgehend von

einer α-Aminosäure 55 nach radikalischer Bromierung und Umwandlung zum Oxazolidon 57

in einer Ausbeute von 77% erhalten.93

Abbildung 4.7. β-Hydroxy-α-aminosäuresynthese nach Crich93


35

Evans et al. berichteten schon 1986 über die Synthese von syn- und anti-β-Hydroxy-

α-aminosäuren über Oxazolidonderivate,94 wobei diese die Ausgangsverbindung 59

darstellten und als chirale Glycinsynthone bezeichnet wurden (Abbildung 4.8). Problematisch

ist bei dieser Syntheseroute die Verwendung von Natriumazid aufgrund der toxischen

Eigenschaften.

Abbildung 4.8. Synthese über Oxazolidone als Glycinsynthone94b

Das Glycinsynthon 59 reagiert als Enoläquivalent mit einem Aldehyd. Auf diesem Konzept

basieren eine Reihe weiterer Synthesebeispiele. So können β-Hydroxy-α-aminosäuren auch

nach bekannten Methoden der asymmetrischen Aldolreaktion hergestellt werden.

Aktiviertes Glycin, beispielsweise vom Typ 63, und ein Aldehyd 1 können mit Hilfe von

chiralen Metallkatalysatoren zu den entsprechenden Produkten umgesetzt werden.95,96,97

Das Beispiel von Shibasaki95 zeigt die Reaktion der Schiff'schen Base 63 mit einem

aliphatischen Aldehyden 64, katalysiert durch Li3[La(BINOL)3] (67) (Abbildung 4.9). Bei dieser

metallkatalysierten Reaktion entsteht ein Diastereomerengemisch von d.r. 59:41 (anti/syn)

mit guten bis mäßigen ee-Werten und sehr hohen Ausbeuten von 93%.


36

Abbildung 4.9. Metallkatalysierte Aldolreaktion zur Synthese von β-Hydroxy-

α-aminosäuren95

Diese Reaktion kann ebenfalls organokatalytisch durchgeführt werden. Als Katalysatoren

stehen hier quartäre Ammoniumsalze,98,99 sogenannte Phasentransferkatalysatoren zur

Verfügung, aber auch von einer Variante mit Prolin100 wurde berichtet. Bei der Verwendung

von Prolin als Katalysator wurde ein Phthalimid 68 mit einem Aldehyden 64 umgesetzt und

die entsprechenden β-Hydroxy-α-aminosäurederivate 70 nach Oxidation in sehr guten

Diastereo- (d.r. >100:1 (anti/syn)) und Enantioselektivitäten (>99% ee) erhalten (Abbildung

4.10).100

Abbildung 4.10. Organokatalytische Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäurederivaten100


37

Die Nutzung quartärer Ammoniumsalze wurde schon längere Zeit verfolgt. Es gibt zwei

Katalysatorgruppen, die zum einen auf einer Alkaloidstruktur98,99,101 basieren und zum

anderen auf Binatphthalineinheiten.102 Bei allen gezeigten Anwendungen muss Glycin in

aktivierter Form als Schiff'sche Base, wie beispielsweise als Silylenolether 71, eingesetzt

werden. Ein von Maruoka et al. entwickeltes Beispiel ist in Abbildung 4.11 dargestellt.102b

Das gewünschte Produkt 72 wird mit sehr hohen Enantioselektivitäten (97% ee) erhalten,

auch das Diastereomerenverhältnis ist im Vergleich zu anderen Beispielen sehr gut.

Abbildung 4.11. Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren 72 mittels

Phasentransferkatalyse102b

Es gibt viele Möglichkeiten zur Herstellung von β-Hydroxy-α-aminosäuren, allerdings ist bei

allen gezeigten Methoden das Schützen bzw. die Aktivierung der Ausgangsverbindungen

nötig. Zudem sind meist aufwändige chirale Katalysatorsysteme erforderlich und bis zum

Erhalt des gewünschten Produkts sind mehrere Reaktionsschritte notwendig. Ein Nachteil

sind auch die meist relativ niedrigen Gesamtausbeuten und Enantio-, sowie

Diastereoselektivitäten.

4.2.2 Threoninaldolasen

Eine Alternative zur Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren bietet der Einsatz von

Threoninaldolasen, die in der Lage sind, Glycin (11) und einen Aldehyden 1 direkt in das

gewünschte Produkt 12 umzusetzen. Eine Aktivierung oder das Schützen der

Ausgangsverbindungen ist hier nicht notwendig. Zudem kann die Reaktion in wässrigem


38

Medium bei milden Temperaturen durchgeführt werden. Diese Enzyme benötigen den

Cofaktor Pyridoxal-5-phosphat (PLP) in katalytischen Mengen, der durch Bildung einer

Schiff'schen Base Glycin (11) aktiviert (Abbildung 4.12).

Abbildung 4.12. Aktivierung von Glycin (11) durch PLP

Im Gegensatz zu den bereits beschriebenen Alkoholdehydrogenasen muss hier kein

Cofaktorregenerierungssystem verwendet werden. Die Enantioselektivität bei der Bildung

des Stereozentrums in α-Position ist sehr hoch (>99% ee), dagegen wird das Stereozentrum

in β-Position nicht sehr selektiv aufgebaut und es entstehen Diastereomeren-

gemische.29,103,104

Wie bereits in Kapitel 1 erwähnt, gibt es D- und L-selektive Aldolasen (D-TA, L-TA). Diese

können wiederum nach ihrer Spezifität bei der Spaltung von Threonin (12c) unterteilt

werden (Abbildung 4.13). L-Threoninaldolasen setzen selektiv L-syn-Threonin um,

wohingegen L-allo-TAs nur L-anti-Threonin spalten. Eine weniger spezifische Variante ist

ebenfalls als L-low specificity-Aldolase bekannt und akzeptiert beide Verbindungen. Bei der

D-spezifischen Variante ist nur eine low specificity-Variante bekannt.103

Abbildung 4.13. Einteilung der L-TA katalysierten Reaktion103


39

Die C-C-Bindungsknüpfung ist weniger spezifisch als die Bindungsspaltung. Die

Diastereoselektivität bei der Synthese der gewünschten Produkte hängt stark davon ab, ob

die Reaktion unter thermodynamischer oder kinetischer Kontrolle durchgeführt werden

kann. Unter kinetischer Kontrolle werden meist hohe Diastereomerenüberschüsse erzielt,

allerdings ist der Umsatz dabei oftmals niedrig.105

Die Gruppe um Griengl untersuchte, warum die D-TA eine hohe Stereospezifität bei hohen

Umsätzen aufwies, wohingegen sich beim L-spezifischen Biokatalysator schon nach kurzer

Zeit das thermodynamische Gleichgewicht einstellte und somit bei hohen Umsätzen nur

geringe Diastereomerenüberschüsse gefunden wurden. Die langsame Einstellung des

thermodynamischen Gleichgewichts konnte mit der Katalysatoreigenschaft einer höheren

Energiebarriere für die syn/anti-Epimerisierung bei der D-Threoninaldolase begründet

werden.106

Bis jetzt wurde eine Vielzahl von Threoninaldolasen isoliert und charakterisiert, sowie zur

Synthese verschiedener β-Hydroxy-α-aminosäuren eingesetzt.29 Ein Beispiel für eine

enzymatische Racematspaltung lieferte Yamada.103,107 Unter Einsatz einer D-TA aus

Anthrobacter sp. konnte (2S,3R)-12d in einer Ausbeute von 48% und einem

Enantiomerenüberschuss von >99% ee, bei einer Substratkonzentration von 200 mM erzielt

werden (Abbildung 4.14). Der Vorteil bei dieser Methode besteht darin, dass

diastereomerenreines Racemat eingesetzt wird durch dessen Spaltung dann diastereo- und

enantiomerenreines Produkt (2S,3R)-12d ensteht.

Abbildung 4.14. Enzymatische Racematspaltung103

Häufiger wurden Threoninaldolasen allerdings in der direkten asymmetrischen Synthese von

β-Hydroxy-α-aminosäuren eingesetzt, da hier prinzipiell ein vollständiger Umsatz erzielt

werden kann, wohingegen bei der Racematspaltung lediglich ein theoretischer Umsatz von

50% möglich ist. Um bei der direkten Synthese das Gleichgewicht der Reaktion auf die Seite


40

der gewünschten Produkte zu verschieben, muss Glycin im Überschuss eingesetzt

werden.108,109

Pionierarbeiten auf dem Gebiet der asymmetrischen Synthese wurden von Wong et al.

durchgeführt. Dabei wurde die TA-katalysierte enzymatische Aldolreaktion mit drei

unterschiedlichen Enzymen auf ihre Substratbreite untersucht.105,110 Es wurden zwei

L-spezifische Aldolasen aus E. coli105 und Candida humicola110, sowie eine D-TA aus

Xanthomonus oryzae105 eingesetzt. Letztere zeigte eine ausgeprägte syn-Spezifität bei den

verwendeten Substraten, wohingegen die L-TA aus E. coli bei aliphatischen Aldehyden anti-

Produkte (12c, 12g) und bei aromatischen Aldehyden syn-Produkte (12e) bildete.

Heteroatome in β-Position führten ebenfalls bei den L-TAs zu einer anti-Selektivität.

Allerdings wurden meist nur geringe Ausbeuten erzielt. Eine Übersicht der Ergebnisse ist in

Abbildung 4.15 dargestellt.

Abbildung 4.15. Produktspektrum der L-TA aus E. coli und der D-TA aus X. oryzae105

Für die beiden Aldolasen aus E. coli und X. oryzae wurde zudem eine genaue Betrachtung

der Reaktionsbedingungen durchgeführt.105 Hierbei wurde die Spaltung von Threonin (12c)

untersucht und nicht die C-C-Bindungsknüpfung. Beide Enzyme wiesen bei einem pH-Wert


41

von 7.5 die höchste Aktivität auf und tolerierten organische Additive, wie DMSO oder DMF in

einer Konzentration bis zu 30%. Vor allem die L-TA aus E. coli wies eine starke

Temperaturabhängigkeit auf: Während bei 25°C keine Bindungsknüpfung als Rückreaktion

auftrat, wurde bei 50°C die höchste Aktivität ermittelt.105

Eine ähnliche Untersuchung für zwei unterschiedlich selektive Threoninaldolasen, L-TA aus

Pseudomonas putida und D-TA aus Alcaligenes xylosoxidans, wurde von Griengl et al.

durchgeführt.109,111 Hier wurde allerdings die Synthese von Phenylserin (12e) untersucht und

nicht die Spaltung von Threonin (12c). Die D-selektive Aldolase wies eine sehr hohe

Diastereoselektivität (d.r. 99:1 syn/anti) und einen hohen Umsatz von 79% bei einer

Reaktionstemperatur von 5°C auf. Bei der L-TA wurde keine analoge

Temperaturabhängigkeit beobachtet. Mit beiden Biokatalysatoren wurden verschiedenste

aliphatische111 und aromatische109 Aldehyde zu den entsprechenden β-Hydroxy-

α-aminosäuren mit teils sehr guten Ausbeuten von bis zu 90% und exzellenten ee-Werten

von >99% umgesetzt. Die Diastereoselektivität war bei Verwendung der D-TA aufgrund des

sich langsam einstellenden thermodynamischen Gleichgewichts deutlich höher.106 In

Abbildung 4.16 sind die besten Ergebnisse aus der Umsetzung mit verschiedenen

substituierten Benzaldehyden bei Einsatz einer L-TA gezeigt.109 Je nach Substituent und

dessen Position konnten Diastereomerenverhältnisse von bis zu d.r. 78:22 (syn/anti) bei

Ausbeuten von bis zu 90% erzielt werden.

Abbildung 4.16. Ergebnisse der Synthese verschieden substituierter aromatischer

β-Hydroxy-α-aminosäuren 12109

Die Synthese anderer Produktklassen, wie ω-Carboxy-β-hydroxy-α-aminosäuren112 und

β-Hydroxy-α,ω-diaminosäuren113 75 wurden ebenfalls unter Verwendung der L-TA aus E. coli

durchgeführt. Während erstere als epimerische Mischung in einer Ausbeute von bis zu 67%

erhalten wurden, konnten die syn-Diaminosäuren 75 in einem Überschuss von bis zu

d.r. 82:18 (syn/anti) und einer Ausbeute von 27% isoliert werden (Abbildung 4.17).113


42

Abbildung 4.17. Synthese von β-Hydroxy-α,ω-diaminosäuren 74113

Trotz der vielen Vorteile der enzymatischen Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren, wie die

milden, wässrigen Bedingungen oder der Einsatz ungeschützter Substrate, gibt es auch

einige Nachteile. Lange Zeit war die Umsetzung auf Glycin (11) als Donor beschränkt und es

waren somit keine α-alkylierten Verbindungen zugänglich. Mittlerweile gibt es einige

Beispiele, bei denen Alanin, Serin oder Cystein als Donor akzeptiert werden.19,20,21 Es

konnten eine L-TA aus A. jandaei und eine D-TA aus Pseudomonas sp. erfolgreich bei der

Reaktion von entsprechenden D-Aminosäuren mit verschiedenen Aldehyden eingesetzt

werden.19 In Abbildung 4.18 sind einige dieser interessanten Produkte gezeigt. Die Umsätze

liegen in einem moderaten Bereich von bis zu 60% und die Enantioselektivität beträgt auch

hier >99% ee. Das Diastereomerenverhältnis ist wiederum stark vom Biokatalysator und dem

jeweiligen Substrat abhängig.

Abbildung 4.18. Synthese von α-alkylierten β-Hydroxy-α-aminosäuren 76, 77, 7819

Ein weiterer Nachteil bei der enzymatischen Umsetzung von Glycin (11) mit Aldehyden 1 ist

die teils geringe Diastereoselektivität. Um hohe Produktausbeuten zu erzielen, sollte diese


43

möglichst hoch sein. Die Trennung der Diastereomere erfolgt meist säulenchromato-

graphisch und unter vorheriger Einführung von Schutzgruppen.112 Die Diastereoselektivität

der Biokatalysatoren kann beispielsweise durch Protein-Engineering erhöht werden.67 Des

Weiteren wurden die Versuche lediglich in kleinem Maßstab (<1 g) durchgeführt. Um das

Konzept der Threoninaldolase-katalysierten Aldolreaktion für eine industrielle Anwendung

attraktiver zu machen, sollten die Reaktionen in größerem Maßstab durchgeführt werden

und die Isolierung der gewünschten Produkte verbessert werden. Ebenso ist die Erhöhung

der Substratkonzentration, die bisher lediglich bei maximal 100 mM lag, in dieser Hinsicht

ein wichtiger Faktor, da so eine möglichst hohe volumetrische Produktivität erreicht werden

könnte.

4.3 Ziel der Arbeit

Unter Einsatz der L-selektiven Threoninaldolase aus E. coli105,114 sollte eine genaue

Untersuchung und Optimierung der enzymatischen Aldolreaktion durchgeführt werden.

Außerdem sollten verschiedene aromatische Substrate umgesetzt werden.

Als Ausgangspunkt wurden die Arbeiten von Griengl et al.106 herangezogen (Abbildung 4.19).

Die enzymatische Umsetzung sollte mit Benzaldehyd (1e) als Standardsubstrat und der zur

Verfügung stehenden L-TA aus E. coli durchgeführt werden.

Abbildung 4.19. Literaturbekannte Ergebnisse der TA-katalysierten Aldolreaktion106

Anschließend bestand die Aufgabe darin die Reaktionsbedingungen im Hinblick auf

Enzymmenge, Glycinüberschuss, Temperaturabhängigkeit und Substratmenge, sowie den

Einfluss von Additiven zu untersuchen und zu optimieren. Des Weiteren sollte die

Diastereoselektivität des Enzyms bei verschieden substituierten Benzaldehyden evaluiert

und die Akzeptanz der Aldolase aus E. coli für thiamphenicolrelevante Aldehyde getestet


44

werden. Bis jetzt wurde mit diesem Biokatalysator lediglich die Bindungsspaltung von

Threonin (12c) untersucht und vor allem aliphatische Aldehyde bei der Synthese von β-

Hydroxy-α-aminosäuren eingesetzt.105

Ziel war es mit dem besten Substrat (höchster Umsatz und Diastereoselektivität) eine

Prozessoptimierung durchzuführen (Abbildung 4.20). Diese beinhaltete die Erhöhung der

Substratkonzentration und die Verringerung des Glycinüberschusses bei vollständigem

Umsatz und guten Diastereomerenüberschüssen, sowie exzellenten ee-Werten von >99%.

Um die enzymatische Reaktion industriell attraktiver zu machen, sollte das Konzept in

größerem Maßstab angewendet und das Produkt im Grammmaßstab isoliert werden.

Abbildung 4.20. Prozessoptimierung der enzymatischen Aldolreaktion

4.4 Eigene Ergebnisse und Diskussion115

4.4.1 Vorversuche

Vor Beginn der Untersuchung der enzymatischen Umsetzung von Glycin (11) und

Benzaldehyd (1h) wurden Versuche zur Stabilität des Produkts 12e, sowie die Analyse einer

möglichen Hintergrundreaktion durchgeführt. Des Weiteren wurden die entsprechenden

racemischen Verbindungen als Referenzsubstanzen synthetisiert.

4.4.1.1 Racematsynthese

Die Racematsynthese gelang über eine basenkatalysierte Aldolreaktion von Glycin (11) und

den entsprechenden Aldehyden 1.116 Am Beispiel der Synthese von Phenylserin 12e

(Abbildung 4.21, vgl. auch 8.2.2.1) wird die Abhängigkeit des Diastereomerenverhältnisses

von den Reaktionsbedingungen deutlich. Bei höherer Temperatur und langer Reaktionszeit


45

wurde ausschließlich das thermodynamisch günstigere syn-Produkt 12e bei einer Ausbeute

von 72% erhalten, während die Reaktion bei 0°C und 4 h Reaktionszeit ein

Diastereomerengemisch von d.r. 56:44 (syn/anti) bei einer Ausbeute von 62% lieferte. Durch

die Gleichgewichtslage war es nicht möglich reines anti-Produkt 12e herzustellen. Die

Isolierung erfolgte über mehrmalige Umkristallisation in Wasser.

Abbildung 4.21. Synthese von racemischem Phenylserin

Auf diesem Weg wurden noch weitere substituierte Phenylserinderivate 12 hergestellt, die

als Referenzverbindungen für die Analytik benötigt wurden (Abbildung 4.22).

OH

OOH

NH2Cl

rac-12f0°C, 24 h: 36% Ausbeute,

d.r. 79:21(syn/anti)

OH

OOH

NH2MeS

rac-12d0°C, 26 h: 26% Ausbeute,

d.r. >25:1(syn/anti)

OH

OOH

NH2

rac-12lRT, 2 h: 52% Ausbeute,d.r. 74:26 (syn/anti)

ClOOH

NH2

rac-12j0°C, 48 h: 11% Ausbeute,

d.r. 87:13 (syn/anti)

BrOH

OOH

NH2

rac-12m0°C, 48 h: 7% Ausbeute,

d.r. >25:1 (syn/anti)

HO

OH

OOH

NH2

rac-12iRT, 1 h: 38% Ausbeute,d.r. 82:18 (syn/anti)

Cl

OH

OOH

NH2

rac-12nRT, 3 h: 23% Ausbeute,d.r. 69:31 (syn/anti)

OMe

+NH2

O

OH

OH

OH

O

NH2

H

O

1

(1-2 Äq.)11

(0.7-2.7 M)12

5 M NaOH

R R

Abbildung 4.22. Racemische Phenylserinderivate


46

Je nach Substituent wurden unterschiedliche Diastereomerenverhältnisse erzielt. Dies ist auf

die Lage des thermodynamischen Gleichgewichts zurückzuführen. Beispielsweise konnten

bei 12i, 12l und 12n die gewünschten Diastereomerengemische bereits nach kurzer

Reaktionszeit und Raumtemperatur erhalten werden, wohingegen bei 12d bzw. 12m selbst

bei 0°C nur das syn-Isomer nachgewiesen werden konnte. 12i konnte mit einem

Diastereomerenverhältnis von d.r. 82:18 (syn/anti) und mit einer Ausbeute von 38% erhalten

werden. Durch Umkristallisation in Wasser konnte eine geringe Menge an

diastereomerenreinem anti-12i (Ausbeute 1%) isoliert werden.

Im Zuge der Herstellung der racemischen Verbindungen wurden die Phenylserinderivate mit

Benzoylchlorid (79) umgesetzt, zum einen zur vollständigen Charakterisierung und zum

anderen als Referenzverbindungen für die Umsatz- bzw. ee-Wertbestimmung der Produkte

aus der Enzymumsetzung mittels 1H-NMR-Spektroskopie bzw. chiraler HPLC. Die Reaktion

von 12 mit Benzoylchlorid (79) erfolgte im Basischen unter Zugabe von 1.2 Äquivalenten 79

(Abbildung 4.23, vgl. auch 8.2.2.2).

Abbildung 4.23. Derivatisierung mit Benzoylchlorid (79)

Bis auf rac-12m konnten alle in Abbildung 4.22 gezeigten Produkte umgesetzt werden

(Abbildung 4.24). Die Derivatisierungsprodukte 80 wurden mit Ausbeuten bis zu 55%

erhalten und vollständig charakterisiert. Bei der ortho-chlorsubstituierten Verbindung rac-

80i wurde jeweils das isolierte syn-80 bzw. anti-80 umgesetzt. Durch Umkristallisation

konnten die Diastereomere der ortho-methoxysubstituierten Verbindung rac-80n

angereichert werden (d.r. >25:1 syn/anti; d.r. 90:10 anti/syn).


47

Abbildung 4.24. Racemische Produkte aus Derivatisierung mit Benzoylchlorid (79)

4.4.1.2 Hintergrundreaktion

Vor Durchführung der enzymatischen Umsetzung wurde getestet, ob es zu einer Reaktion

zwischen Glycin (11) und Benzaldehyd (1e) ohne Anwesenheit des Biokatalysators kommt.

Möglich wäre die Aktivierung von Glycin durch Bildung einer Schiff'schen Base 81 mit dem

Aldehyd, wodurch racemisches Produkt entstehen könnte. Dies würde dann die

Enantioselektivität der enzymatischen Reaktion beeinträchtigen. Es wurden mehrere

Versuche durchgeführt, bei denen verschiedene Mengen an Glycin (11) und Benzaldehyd

(1e) in Puffer (pH 7 bzw. pH 8) mit und ohne Anwesenheit des Cofaktors PLP 27 h gerührt

wurden (Abbildung 4.25, vgl. auch 8.2.2.3).

Abbildung 4.25. Untersuchung einer möglichen Hintergrundreaktion

Es wurde keine Hintergrundreaktion nachgewiesen. Nach Entfernen des Lösungsmittels im

Vakuum konnte lediglich das Edukt 11 im 1H-NMR-Spektrum nachgewiesen werden.


48

4.4.1.3 Epimerisierung

Als nächstes wurde überprüft, ob Phenylserin (12e) unter den Bedingungen der

enzymatischen Reaktion stabil ist oder ob eine Epimerisierung auftritt, die wiederum die

Enantioselektivität der Biotransformation beeinträchtigen könnte. Dazu wurde sowohl

reines rac-syn-Phenylserin (rac-syn-12e), als auch eine racemische syn/anti-Mischung (d.r.

56:44) in Puffer (pH 7 bzw. pH 8) gelöst und 27 h gerührt (Abbildung 4.26, vgl. auch 8.2.2.4).

Abbildung 4.26. Untersuchung einer möglichen Epimerisierung

Auch hier wurde keinerlei Veränderung der eingesetzten Verbindungen gefunden. Im

1H-NMR-Spektrum wurde das entsprechende Diastereomerenverhältnis nach der Reaktion

wieder erhalten und es konnte auch kein Glycin (11), das bei einer Zersetzung entstehen

würde, nachgewiesen werden. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde nun mit der

Durchführung der enzymatischen Reaktion begonnen.

4.4.2 Photometertest zur Bestimmung der Aktivität der L-Threoninaldolase

Zur Bestimmung der Aktivität von Threoninaldolasen (TA) wird in der Literatur auf eine

photometrische Bestimmung mit Hilfe einer indirekten Methode zurückgegriffen, bei der die

Reduktion von Acetaldehyd (1c) verfolgt wird, der bei der enzymatischen Spaltung von

Threonin (12c) entsteht.105 Es wird der Cofaktorverbrauch (NADH) bei der Reduktion des

Aldehyds durch eine Alkoholdehydrogenase aus Bäckerhefe photometrisch beobachtet

(Abbildung 4.27).

Abbildung 4.27. Indirekter Photometertest zur Bestimmung der Aldolaseaktivität105


49

Aus der Extinktionsabnahme bei 340 nm (Absorptionsmaximum von NADH) kann die

Enzymaktivität in U/mL berechnet werden. Wichtig ist hierbei, dass die zweite Reaktion sehr

schnell abläuft und somit die Spaltung von Threonin (12c) der geschwindigkeitsbestimmende

Schritt ist, da ansonsten die Aktivität der Alkoholdehydrogenase bestimmt wird. Ein weiterer

Nachteil ist, dass die Untersuchung der Inhibierung des Biokatalysators durch verschiedene

Substanzen (Substrate bzw. Produkte) oder Additive (organische, wasserlösliche Solventien)

auf diesem Weg schwierig durchzuführen ist. Es kann bei solch einem indirekten

Photometertest keine genaue Aussage getroffen werden, welches der beiden Enzyme

beeinflusst wird. Zur Bestimmung der Aldolaseaktivität gibt es auch eine direkte

Variante,117,118 die im Folgenden vorgestellt wird und zur Vorbereitung der präparativen

Synthesen ausschließlich verwendet wurde.

4.4.2.1 Direkter Photometertest

Bei einem direkten Photometertest muss ein Parameter verfolgt werden, der direkt an der

Reaktion beteilig ist und in einem detektierbaren Bereich Licht absorbiert, wie beispielsweise

der Cofaktor NADH bei der Reduktion einer Ketofunktion mit Hilfe von

Alkoholdehydrogenasen. Da die Threoninaldolase einen Cofaktor benötigt, der aber nicht

verbraucht wird, muss ein anderer Reaktionsteilnehmer herangezogen werden. Die

photometrische Verfolgung der Konzentrationsänderung von Benzaldehyd (1e) bei der

Spaltung von Phenylserin (syn-rac-12e) kann dafür genutzt werden (Abbildung 4.28).117,118

Abbildung 4.28. Direkte Aktivitätsbestimmung durch Verfolgung der

Benzaldehydkonzentration

Der Photometertest wurde bei 278 nm durchgeführt und der pH-Wert sowie der Einfluss des

Cofaktors PLP untersucht (vgl. Abschnitt 8.2.2.5). Zur Berechnung der Aktivität sind

verschiedene versuchsspezifische Parameter nötig, wie beispielsweise der

Extinktionskoeffizient ε (Gleichung (1)). ΔE278nm/t ist dabei die Anfangssteigung der


50

Absorptionskurve, Vg das Gesamtvolumen der Probe, f der Verdünnungsfaktor des

Rohextraktes, Vp das Enzymvolumen und d die Küvettendicke.

Der Faktor ε kann mit Hilfe des Lambert Beer'schen Gesetztes bestimmt werden (Gleichung

(2)).119 Dieses besagt, dass sich die Extinktion E aus dem Extinktionskoeffizienten ε, der

Konzentration c des Substrates, sowie der Schichtdicke d der Küvette zusammensetzt.

Durch Auftragung der Extinktion gegen die Substratkonzentration kann ε aus der

Geradengleichung bestimmt werden. Dies wurde für verschiedene Benzaldehyd-

konzentrationen bei pH 7 bzw. 8, mit und ohne PLP durchgeführt (Abbildung 4.29).

Abbildung 4.29. Bestimmung des Extiktionskoeffizienten

Für die verschiedenen Bedingungen wurden ähnliche Extinktionskoeffizienten im Bereich

von 1.19-1.25 M-1cm-1 erhalten. Die Abweichung ist trotz der Zugabe des farbigen Cofaktors

PLP sehr gering.

pH 7: y = 1.213x + 0.073

pH 7, PLP: y = 1.190x + 0.134

pH 8: y = 1.254x + 0.128

pH 8, PLP: y = 1.224x + 0.2330,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Ext

inkt

ion

[m

in-1

]

c(Benzaldehyd) [mM]

pH 7

pH 7, PLP

pH 8

pH 8, PLP

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5


51

Im Anschluss konnte die Aktivitätsbestimmung durchgeführt werden und die

Geschwindigkeit des Anstiegs der Benzaldehydkonzentration bei der Spaltung von

Phenylserin (12e) detektiert werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.1 gezeigt. Es ist

deutlich erkennbar, dass die höchste Aktivität von 10.9 U/mL (Tabelle 4.1, Eintrag 4) bei pH 8

und in Anwesenheit des Cofaktors PLP gefunden wurden. Die folgenden Versuche wurden

deshalb unter diesen Bedingungen durchgeführt.

Tabelle 4.1. Ergebnisse des Photometertests

Eintrag1) pH Cofaktor ΔE340nm/t

[1/min]

Aktivität

[U/mL]

Relative Aktivität

[%]

1 7 ohne PLP 0.0077 1.2 11

2 7 mit PLP 0.0272 4.3 39

3 8 ohne PLP 0.0155 2.4 22

4 8 mit PLP 0.0691 10.9 100

1) vgl. Abschnitt 8.2.2.5.2

4.4.2.2 Inhibierungsversuche

Nach Bestimmung der Aktivität der TA wurde nun der Einfluss einer bestimmten Substrat-

bzw. Produktkonzentration auf die enzymatische Spaltung untersucht. Dafür wurden

verschiedene Konzentrationen an Glycin (11) bzw. rac-syn-Phenylserin (rac-syn-12e) zur

vermessenden Mischung gegeben.

Glycin (11) wurde bis zu einer maximalen Konzentration von 2.1 M zugefügt. Der

Aktivitätsverlauf ist in Abbildung 4.30 gezeigt. Die Enzymaktivität nimmt um ca. 40% ab

(Abbildung 4.30, vgl. Abschnitt 8.2.2.5.3). Eine Glycinkonzentration von über 1 M hat eine

Beeinträchtigung der Aktivität der Threoninaldolase aus E. coli zur Folge, eine vollständige

Deaktivierung tritt allerdings nicht auf.


52

Abbildung 4.30. Inhibierung durch Glycin (11)

Ein analoger Versuch wurde auch mit Zugabe von rac-syn-Phenylserin (rac-syn-12e)

durchgeführt. Hier wurde aufgrund der mangelnden Löslichkeit nur eine maximale

Konzentration von 150 mM erzielt. Die Auftragung der Enzymaktivität gegen die

Phenylserinkonzentration zeigt einen starken Abfall der Aktivität von über 60% im Vergleich

zur Aktivität ohne Zugabe von 12e (Abbildung 4.31, vgl. Abschnitt 8.2.2.5.3). Hier wurde

aufgrund höherer Temperaturen (30°C) eine stärkere Anfangsaktivität gefunden. Dies

konnte aber aufgrund eines nicht thermostatisierbaren Photometers nicht verifiziert

werden. Bereits bei einer Phenylserinkonzentration von 20 mM ist mit einer

Beeinträchtigung der Aldolaseaktivität zu rechnen.

Abbildung 4.31. Inhibierung durch rac-syn-Phenylserin (rac-syn-12e)

0

20

40

60

80

100

0 0,5 1 1,5 2 2,5

rela

tive

Akt

ivit

ät [

%]

c(Glycin) [M]

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120 140 160

rela

tive

Akt

ivit

ät [

%]

c(Phenylerin) [mM]

0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

4.4.3 Methoden zur

Zur besseren Haltbarkeit werden Enzymrohextrakte bei

Einfrieren zu verhindern und eine leichtere Handhabung zu gewährleisten

Rohextrakt mit Glycerin 1:1 (v/v) verdünnt

pipettiert werden. Bei den einleitenden Versuchen Glycin

L-Threoninaldolase aus E. coli

Umsatzbestimmung mittels 1

nicht möglich ist. Der Umsatz kann

entsprechenden Eduktpeaks verglichen werden. Benzaldehyd

werden, da das wässrige Lösungsmittel im Vakuum entfernt werden muss und somit auch

die Benzaldehydmenge verringert

entsprechenden Vergleich der

werden. Das Signal der Protonen von

den Signalen des Glycerins zwischen 3.51 und 3.80

Abbildung 4.32. Rohproduktspektrum der enzymatischen Umsetzung

ENZYMATISCHE

Methoden zur Umsatzbestimmung

Zur besseren Haltbarkeit werden Enzymrohextrakte bei -20°C aufbewahrt.

infrieren zu verhindern und eine leichtere Handhabung zu gewährleisten

1:1 (v/v) verdünnt, so bleibt die Mischung flüssig und kann leicht

tiert werden. Bei den einleitenden Versuchen Glycin (11) und Benzaldehyd

E. coli umzusetzen, wurde allerdings festgestellt, dass eine

1H-NMR aufgrund des in der Mischung enthaltenen

nicht möglich ist. Der Umsatz kann prinzipiell bestimmt werden, indem Produktpeaks

entsprechenden Eduktpeaks verglichen werden. Benzaldehyd (1e) kann nicht herangezogen


verringert wird. Folglich kann eine Umsatzbestimmung nur durc

n Vergleich der Produktsignale mit denen von Glycin (

der Protonen von 11 (3.79 ppm für das Hydrochlorid)

zwischen 3.51 und 3.80 ppm überdeckt (Abbildung

Rohproduktspektrum der enzymatischen Umsetzung

NZYMATISCHE ALDOLREAKTION

53

20°C aufbewahrt.120 Um das

infrieren zu verhindern und eine leichtere Handhabung zu gewährleisten wird der

, so bleibt die Mischung flüssig und kann leicht

und Benzaldehyd (1e) mit der

umzusetzen, wurde allerdings festgestellt, dass eine

enthaltenen Glycerins

bestimmt werden, indem Produktpeaks mit

kann nicht herangezogen


Folglich kann eine Umsatzbestimmung nur durch

(11) vorgenommen

(3.79 ppm für das Hydrochlorid) wird allerdings von

Abbildung 4.32).

Rohproduktspektrum der enzymatischen Umsetzung


54

Aus diesem Grund musste ein Verfahren zur

wurden zwei Methoden getestet. Zum einen der Einsatz eines internen NMR

zum anderen eine Derivatisierungsmethode, bei der das Produkt durch Extraktion von

Glycerin getrennt und somit der Umsatz bestim

4.4.3.1 Umsatzbestimmung mittels

Eine Möglichkeit der Umsatzbestimmung besteht in der Zugabe eines internen Standards.

Dabei wird eine Substanz mit ähnlich

Menge der zur vermessenden

Integrale der Produktsignale mit de

Menge an Produkt berechnet werden

isoliert voneinander auftreten

tert-Leucin (83) als Standard gewählt, da diese Aminosäure ähnliche Löslichkeits

eigenschaften wie das Produkt aufweist und ein isoliertes Singulett bei 1.08 ppm zeigt. In

Abbildung 4.33 ist exemplarisch

Phenylserin (rac-syn-12e) und

abgebildet.

Abbildung 4.33. 1H-NMR-Spektrum zur Umsatzbestimmung mittels NMR

LDOLREAKTION

Aus diesem Grund musste ein Verfahren zur Umsatzbestimmung entwickelt werden

wurden zwei Methoden getestet. Zum einen der Einsatz eines internen NMR


Glycerin getrennt und somit der Umsatz bestimmt werden kann.

Umsatzbestimmung mittels NMR-Standard


Dabei wird eine Substanz mit ähnlichen Eigenschaften ausgewählt, die in einer bestimmten

r zur vermessenden NMR-Probe zugefügt wird. Entsprechend können dann die

Integrale der Produktsignale mit denen des Standards verglichen und die entstandene

ukt berechnet werden. Wichtig ist dabei, dass die Signale im NMR

isoliert voneinander auftreten, damit eine gute Auswertung möglich ist. In diesem Fall wurde

Standard gewählt, da diese Aminosäure ähnliche Löslichkeits


exemplarisch das Spektrum einer hergestellten Mischung aus

und deaktiviertem Enzym mit Glycerin sowie dem Standard

Spektrum zur Umsatzbestimmung mittels NMR

Umsatzbestimmung entwickelt werden. Dabei

wurden zwei Methoden getestet. Zum einen der Einsatz eines internen NMR-Standards und



Eigenschaften ausgewählt, die in einer bestimmten

Entsprechend können dann die

und die entstandene

Wichtig ist dabei, dass die Signale im NMR-Spektrum

gute Auswertung möglich ist. In diesem Fall wurde

Standard gewählt, da diese Aminosäure ähnliche Löslichkeits-


ischung aus rac-syn-

sowie dem Standard 83

Spektrum zur Umsatzbestimmung mittels NMR-Standard 83


55

Die entsprechenden Peaks des Produkts können sehr gut mit dem isolierten Peak des

Standards verglichen werden.

Zur Kontrolle der Methode wurden verschiedene Mengen an racemischen syn-Phenylserin

(rac-syn-12e) und tert-Leucin (83) unter „simulierten“ Reaktionsbedingungen entsprechend

aufgearbeitet und anschließend mittels 1H-NMR-Spektroskopie analysiert. Es wurden

Mischungen eingesetzt, die Umsätzen zwischen 25% und 100% entsprechen sollten. In

Tabelle 4.2 sind die Ergebnisse dieser Versuche dargestellt. Es tritt lediglich eine Abweichung

zu den theoretisch erwarteten Werten von maximal 3% auf.

Tabelle 4.2. Überprüfung der Umsatzbestimmung mittels NMR-Standard

Eintrag1) 12e

[mmol]

83

[mmol]

theoretisches

Verhältnis

12e:83

Verhältnis

12e:83

aus NMR

Abweichung

[%]

1 0.025 0.025 1:1 1:1.02 2

2 0.02 0.025 1:1.25 1:1.29 3

3 0.0175 0.025 1:1.4 1:1.37 2

4 0.015 0.025 1:1.67 1:1.61 2

5 0.0125 0.025 1:2 1:2.06 1

6 0.00625 0.025 1:4 1:3.72 2

7 0.0135 0.025 1:1.85 1:1.82 1


Der Fehler liegt in einem akzeptablen Bereich, da aufgrund von Einwaage- und

Pipettierungenauigkeiten kleine Abweichungen unvermeidbar sind. Somit erschien diese

Methode der Umsatzbestimmung für die enzymatische Reaktion als geeignet.

4.4.3.2 Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung

Das zweite Konzept zur Umsatzbestimmung beruht auf der Derivatisierung der β-Hydroxy-

α-aminosäure 12e und des überschüssigen Glycins (11) mit Benzoylchlorid (79) (Abbildung

4.34). Dadurch kann das Rohprodukt im Sauren mittels Extraktion mit Ethylacetat in die

organische Phase überführt und somit vom Glycerin abgetrennt werden. Aus dem Verhältnis


56

von derivatisiertem Produkt 80e zu derivatisiertem Glycin 84 kann dann der Umsatz

bestimmt werden.

Abbildung 4.34. Derivatisierung mittels Benzoylchlorid (79)

Wichtig ist auch hier wieder die Überprüfung der Methode, da vor allem durch die

unterschiedlichen Eigenschaften der derivatisierten Verbindungen 80e und 84 beim

Extrahieren Fehler auftreten können. Mit Dichlormethan als Extraktionsmittel konnten keine

konstanten Ergebnisse erzielt werden. Daraufhin wurde das polarere Ethylacetat eingesetzt.

Verschiedene Mischungen an 11 und rac-syn-12e wurden mit Hilfe von 79 derivatisiert und

nach Aufarbeitung das Verhältnis der beiden Verbindungen zueinander mittels 1H-NMR-

Spektroskopie untersucht. Es wurden verschiedene Gemische aus Glycin (11) und

Phenylserin (12e) hergestellt, die einen theoretischen Umsatz von 50% bzw. 100%

darstellten. Dies entspricht einem Verhältnis von 1:9 bzw. 1:19 (11:12e), da Glycin in der

Reaktion in zehnfachem Überschuss zugegeben wird. Die Ergebnisse in Tabelle 4.3 wiesen

eine maximale Abweichung zu den theoretisch erwarteten Werten von 5% auf.

Tabelle 4.3. Überprüfung der Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung

Eintrag1) 80e

[mmol]

84

[mmol]

theoretisches

Verhältnis

80e:84

Verhältnis

80e:84 aus

NMR

Abweichung

[%]

1 0.5 0.5 1:1 1:1.01 1

2 0.1 0.9 1:9 1:9.5 5

3 0.1 1.9 1:19 1:19.5 3



57

Es konnte gezeigt werden, dass auch diese Methode zur Umsatzbestimmung verwendet

werden kann. Ein Vorteil dieser Variante ist, dass die derivatisierten Produkte 80 aufgrund

ihrer Löslichkeitseigenschaften zur Bestimmung des Enantiomerenüberschusses mittels

chiraler HPLC herangezogen werden können, da die meisten zur Verfügung stehenden

Säulen ausschließlich mit organischen Lösungsmitteln verwendet werden können.

4.4.4 Etablierung der Standardreaktion

Die Umsatzbestimmung erfolgte bei der Durchführung der Standardreaktion mit

Benzaldehyd (1e) als Substrat. Die Bedingungen wurden in Anlehnung an die Arbeiten von

Griengl109 gewählt, d.h. es wurden eine Substratkonzentration von 0.1 M, sowie ein

zehnfacher Überschuss an Glycin (11) eingesetzt. Beide Methoden zur Umsatzbestimmung

lieferten vergleichbare Ergebnisse (Abbildung 4.35). So konnte ein fast vollständiger Umsatz

von 91% erzielt werden und das Diastereomerenverhältnis lag etwa bei d.r. 62:38 (syn/anti).

Abbildung 4.35. Standardreaktion und Umsatzbestimmung

4.4.5 Bestimmung der Enantioselektivität

Mit Hilfe der derivatisierten Reaktionsprodukte konnte eine HPLC-Analytik zur

ee-Wertbestimmung bei der enzymatischen Umsetzung mit Benzaldehyd (1e) etabliert

werden (Abbildung 4.36, vgl. 8.2.2.7.5.2).


58

Abbildung 4.36. Bestimmung der Enantioselektivität der enzymatischen Umsetzung

In Abbildung 4.37 A ist das Spektrum von rac-80e gezeigt, in dem auch noch derivatisiertes

Glycin 84 enthalten ist. Zur Zuordnung der Peaks wurde ebenfalls nur racemisches syn-80e

vermessen (Abbildung 4.37 B).

Abbildung 4.37. HPLC-Analytik für 80e

Die Peaks für (2R,3R)-80e und (2R,3S)-80e überlagern und sind somit nur als ein Signal zu

erkennen. Das Spektrum der Enzymumsetzung (Abbildung 4.37 C) zeigt deutlich, dass kein

(2R)-Isomer enthalten ist, sondern lediglich das entsprechende (2S,3R)- und (2S,3S)-12e

gebildet wurde. Somit konnte gezeigt werden, dass die L-Threoninaldolase aus E. coli das

Stereozentrum an α-Position mit einer Enantioselektivität von >99% ee bildet.


59

Solch eine HPLC-Analytik konnte auch für die o-Cl- bzw. o-Br-substituierten Verbindungen

80i bzw. 80o etabliert werden. Auch hier wurde jeweils ein ee-Wert von >99% nachgewiesen

(vgl. Abschnitt 8.2.2.7.7.4 bzw. 8.2.2.7.7.10).

4.4.6 Untersuchung der enzymatischen Synthese

Ausgehend von der Standardreaktion (Abbildung 4.35) wurde nun eine Analyse der

Reaktionsbedingungen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden die verschiedenen

Parameter, wie beispielsweise Reaktionszeit, Temperatur, Enzymmenge und Substrat-

konzentration variiert und der Einfluss auf den Umsatz und das Diastereomerenverhältnis

der enzymatischen Reaktion untersucht.

4.4.6.1 Einfluss der Reaktionszeit auf die enzymatische Aldolreaktion

Zuerst wurde der Einfluss der Reaktionszeit auf den Umsatz und das

Diastereomerenverhältnis der biokatalysierten Aldolreaktion betrachtet. Es war bereits

bekannt, dass sich bei der Reaktion mit L-selektiven Threoninaldolasen das

thermodynamische Gleichgewicht relativ schnell einstellt und so meist nur geringe

Diastereomerenüberschüsse erzielt werden können.106 Die Ergebnisse in Tabelle 4.4

bestätigen dies. Nach einer Reaktionszeit von 1 h wurde ein Diastereomerenverhältnis von

d.r. 44:56 (syn/anti) bei einem Umsatz von 20% erhalten (Tabelle 4.4, Eintrag 1). Dies deutet

darauf hin, dass der Biokatalysator bevorzugt das anti-Isomer bildet. Im Laufe der Zeit stellte

sich dann ein thermodynamisches Gleichgewicht ein und das Diastereomerenverhältnis lag

bei d.r. 65:35 (syn/anti) (Tabelle 4.4, Eintrag 3). Es wurde bereits vermutet, dass die L-TA aus

E.coli zu den L-allo-Threoninaldolasen gezählt werden muss.106

Tabelle 4.4. Abhängigkeit der Biotransformation von der Reaktionszeit


60

Eintrag1) t [h]

1 1

2 8

3 20


2)

(2S)-80e und 84 im 1H-NMR

4.4.6.2 Einfluss der Temperatur auf die enzymatische Aldolreaktion

Die Erhöhung der Reaktionstemperatur

(Abbildung 4.38, vgl. Abschnitt

niedrigerer Umsatz von 21% im Vergleich zu dem Versuch bei Raumtemperatur

Während die Produktbildung bei Raumtemperatur im Laufe der Zeit weiter anst

bei 40°C nicht der Fall. Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der

Temperatur stark abnimmt.

O

H +

NH2

O

OH

L-TA88 U

11(10 Äq.)

1e(0.1 M)

PuffPLP

Abbildung 4.38. Abhängigkeit der Biotransformation von der Temperatur

0

20

40

60

80

100

Um

satz

[%

]

LDOLREAKTION

Umsatz (2S)-12e2) [%] d.r. (syn/anti

20 44:56

41 68:32

91 65:3

Umsatz- und d.r.-Wertbestimmung erfolgte über Verhältnis von

NMR Spektrum

Einfluss der Temperatur auf die enzymatische Aldolreaktion

Die Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 40°C brachte keine Verbesserung des Umsatzes

, vgl. Abschnitt 8.2.2.7.2). Nach 8 h Reaktionszeit wurde ein um die Hälfte

im Vergleich zu dem Versuch bei Raumtemperatur

Während die Produktbildung bei Raumtemperatur im Laufe der Zeit weiter anst

Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der

A (E. col i)U/mmol,

OH

O

NH2

OHCl

O

pH 12

79, 1.2 Äqv.

(2S)-12e

fer pH 8,(50 µM)

Abhängigkeit der Biotransformation von der Temperatur

8 h 20 h

41

91

2113

RT

40

anti) (2S)-12e2)

44:56

68:32

35

bestimmung erfolgte über Verhältnis von

Einfluss der Temperatur auf die enzymatische Aldolreaktion

brachte keine Verbesserung des Umsatzes

). Nach 8 h Reaktionszeit wurde ein um die Hälfte

im Vergleich zu dem Versuch bei Raumtemperatur (41%) erzielt.

Während die Produktbildung bei Raumtemperatur im Laufe der Zeit weiter anstieg, war dies

Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der L-TA bei erhöhter

OH

O

HN

OH

O

Ph

(2S)-80e

Abhängigkeit der Biotransformation von der Temperatur

RT

40°C


61

Um die enzymkatalysierte Rückreaktion, d.h. die Spaltung des Produkts, zu verhindern

wurden auch Versuche bei 4°C durchgeführt. Hier wurde nach 7 h ein Umsatz von 20%

erzielt und ein Diastereomerenverhältnis von d.r. 46:54 (syn/anti) gefunden (vgl. Abschnitt

8.2.2.7.2). Ein analoges Ergebnis wurde bereits bei einem Versuch bei Raumtemperatur nach

1 h gefunden. Das thermodynamische Gleichgewicht stellt sich bei niedrigeren

Temperaturen langsamer ein, allerdings ist auch der Umsatz dementsprechend niedrig. Das

Ziel einer bevorzugten Bildung des syn-Isomers kann mit dieser L-Threoninaldolase nicht

erzielt werden.

4.4.6.3 Einfluss der Enzymmenge auf die enzymatische Aldolreaktion

Zur Untersuchung des Einflusses der Enzymmenge wurde diese von 88 U/mmol auf

176 U/mmol verdoppelt, was eine Beschleunigung der Reaktion zur Folge hatte. Nach 1 h

wurde bereits ein Umsatz von 63% erzielt, dieser lag bei Verwendung der geringeren Menge

an Aldolase nur bei 20% (Abbildung 4.39, vgl. Abschnitt 8.2.2.7.3).

Abbildung 4.39. Abhängigkeit der Biotransformation von der Enzymmenge

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25

Um

satz

[%

]

Reaktionszeit [t]

88 U/mmol

176 U/mmol


62

Das thermodynamische Gleichgewicht stellte sich ebenfalls schneller ein und nach 1 h wurde

bereits ein Diastereomerenverhältnis von d.r. 67:33 (syn/anti) erhalten.

4.4.6.4 Einfluss des Glycinüberschusses auf die enzymatische Aldolreaktion

Als nächstes wurde untersucht, ob der in der Literatur beschriebene Überschuss an Glycin

(11) von 10 Äquivalenten109 erforderlich ist, um einen vollständigen Umsatz zu erzielen. Dazu

wurde die Benzaldehydkonzentration schrittweise von 0.1 M bis 1 M erhöht, während die

Glycinkonzentration (1 M) konstant gehalten wurde. Desweiteren wurde die Glycin-

konzentration von 1 M bis 0.1 M gesenkt, während die Konzentration des Aldehyden (0.1 M)

konstant gehalten wurde. In Abbildung 4.40 sind die Ergebnisse der beiden Versuchsreihen

dargestellt (vgl. Abschnitt 8.2.2.7.4.1 und 8.2.2.7.4.2). Es ist deutlich erkennbar, dass ein

hoher Überschuss an Glycin notwendig ist, um eine vollständige Produktbildung zu erzielen.

Bei einem Verhältnis Glycin (11) zu Benzaldehyd (1e) von 1:1 wurde bei einer

Benzaldehydkonzentration von 0.1 M ein Umsatz von 13% und bei einer Konzentration von

1 M lediglich ein Umsatz von 4% erhalten.

Abbildung 4.40. Abhängigkeit der Biotransformation vom Glycinüberschuss

0

20

40

60

80

100

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Um

satz

[%

]

c(Substrat) [M]

Benzaldehyd

Glycin

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

Benzaldehyd; c(Glycin)= 1 M

Glycin; c(Benzaldehyd)= 0.1 M

Es zeigte sich ebenfalls, dass eine sehr hohe

Einfluss auf die Produktbildung hat. Bei einem Verhältnis von 2:1 (Glycin/Benzaldehyd)

wurde bei einer Benzaldehydkonzentration von 0.1

wohingegen bei einer Konzentration von 0.5

konnte. Die relative Menge an erhaltenem Produkt ist zwar bei einer Konzentration von

0.5 M höher, allerdings erscheint der Prozess wenig effizient, wenn 86% des eingesetzten

Substrats nicht umgesetzt werden.

4.4.6.5 Einfluss der Substratkonzentration auf die enzymatische Aldolreaktion

Bei der Entwicklung eines effizienten und industriere

Substratkonzentration eine sehr

volumetrische Produktivität.

0.1 M (1e) bzw. 1 M (11) um den Fakto

musste auch die Enzymmenge von 88 U/mmol auf 50 U/mmol verringert werden

Umsatz der Reaktion blieb trotzdem n

8.2.2.7.5).

O

H

1e(0.25 M)

Abbildung 4.41. Abhängigkeit des Umsatzes von der Substratkonzentration

0

20

40

60

80

100

Um

satz

[%

]

ENZYMATISCHE

Es zeigte sich ebenfalls, dass eine sehr hohe Benzaldehydkonzentration einen negativen


wurde bei einer Benzaldehydkonzentration von 0.1 M ein Umsatz von 44% erhalten,

wohingegen bei einer Konzentration von 0.5 M nur ein Umsatz von 14% erzielt werden


M höher, allerdings erscheint der Prozess wenig effizient, wenn 86% des eingesetzten

Substrats nicht umgesetzt werden.

r Substratkonzentration auf die enzymatische Aldolreaktion

Bei der Entwicklung eines effizienten und industrierelevanten Prozesses spielt die

Substratkonzentration eine sehr große Rolle. Wichtig ist hierbei eine möglichst hohe

Um dies zu erreichen wurde die Substratkonzentration von

um den Faktor 2.5 erhöht. Aufgrund des geringeren Volumens

musste auch die Enzymmenge von 88 U/mmol auf 50 U/mmol verringert werden

Umsatz der Reaktion blieb trotzdem nahezu unverändert (Abbildung 4

+

NH2

O

OH

L-TA (E. coli)50 U/mmol,

O

O

NH2

OH

11(10 Äq.)

(2S)-12e

Puffer pH 8,PLP (50 µM),

17 h, RT

Abhängigkeit des Umsatzes von der Substratkonzentration

0.1 0.25

>95 91

Substratkonzentration (1e) [M]


63

Benzaldehydkonzentration einen negativen


M ein Umsatz von 44% erhalten,

ein Umsatz von 14% erzielt werden


M höher, allerdings erscheint der Prozess wenig effizient, wenn 86% des eingesetzten

r Substratkonzentration auf die enzymatische Aldolreaktion

anten Prozesses spielt die

Wichtig ist hierbei eine möglichst hohe

Um dies zu erreichen wurde die Substratkonzentration von

2.5 erhöht. Aufgrund des geringeren Volumens

musste auch die Enzymmenge von 88 U/mmol auf 50 U/mmol verringert werden. Der

4.41, vgl. Abschnitt

OH

Abhängigkeit des Umsatzes von der Substratkonzentration


64

Es wurde eine Produktbildung von >90% bei einer Substratkonzentration von 0.25

17 h Reaktionszeit erhalten. Das Diastereomerenverhältnis betrug in beiden Fällen d.r. 65:35

(syn/anti) und auch die Enantioselektivität lag unverändert bei >99%

erstmals gezeigt werden, dass die

einer Aldehydkonzentration von 0.25

Diastereoselektivitäten durchgeführt werden kann.

4.4.6.6 Einfluss von Additiven auf die enzymatische Aldolreaktion

Des Weiteren wurde der Einfluss verschiedener Additive auf die

untersucht. Mit 50 Vol% Glycerin wurden bereits sehr gute Ergebnisse von über 90% Um

bei einer Substratkonzentration von 0.25

Vergleichsversuchen mit den verschiedenen Additi

geringerer Aktivität verwendet.

Reaktionsvolumens entsprach, konnte nur ein

eingesetzt werden. Aus diesem Grund lagen die Umsätze etwas niedriger.

O

H +

1e(0.25 M)

Abbildung 4.42.

0

20

40

60

80

100

Puffer

68

Um

satz

[%

]

LDOLREAKTION

Es wurde eine Produktbildung von >90% bei einer Substratkonzentration von 0.25

nszeit erhalten. Das Diastereomerenverhältnis betrug in beiden Fällen d.r. 65:35

) und auch die Enantioselektivität lag unverändert bei >99% ee

erstmals gezeigt werden, dass die L-Threoninaldolase-katalysierte Aldolreaktion auch b

einer Aldehydkonzentration von 0.25 M mit sehr guten Umsätzen und vergleichbaren

Diastereoselektivitäten durchgeführt werden kann.

Einfluss von Additiven auf die enzymatische Aldolreaktion

Des Weiteren wurde der Einfluss verschiedener Additive auf die enzymatische Reaktion

untersucht. Mit 50 Vol% Glycerin wurden bereits sehr gute Ergebnisse von über 90% Um

tratkonzentration von 0.25 M erzielt. Bei den durchgeführten

Vergleichsversuchen mit den verschiedenen Additiven wurde eine Charge

verwendet. Da das Volumen des zugegebenen Rohextrakts dem

entsprach, konnte nur eine geringere Enzymmenge von 35 U/mmol

Aus diesem Grund lagen die Umsätze etwas niedriger.

+

NH2

O

OH


O

O

NH2

OH

PLP (50 µM),17 h, RT,Additiv11

(10 Äq.)(2S)-12e

. Umsatz bei Anwesenheit verschiedener Additive

Puffer Glycerin Aceton i-PrOH DMSO

68 71

19 1611

Additiv (50 Vol%)

i-PrOH

Es wurde eine Produktbildung von >90% bei einer Substratkonzentration von 0.25 M nach

nszeit erhalten. Das Diastereomerenverhältnis betrug in beiden Fällen d.r. 65:35

ee. Es konnte somit

katalysierte Aldolreaktion auch bei

M mit sehr guten Umsätzen und vergleichbaren

Einfluss von Additiven auf die enzymatische Aldolreaktion

enzymatische Reaktion

untersucht. Mit 50 Vol% Glycerin wurden bereits sehr gute Ergebnisse von über 90% Umsatz

M erzielt. Bei den durchgeführten

Charge L-TA aus E. coli mit

Rohextrakts dem des

geringere Enzymmenge von 35 U/mmol

Aus diesem Grund lagen die Umsätze etwas niedriger.

OH

Umsatz bei Anwesenheit verschiedener Additive

DMSO

11


65

Abbildung 4.42 zeigt, dass bei Verwendung von Puffer und Glycerin als Zusatz vergleichbare

Umsätze erzielt werden konnten. Bei der Zugabe von Aceton, iso-Propanol oder DMSO

wurden deutlich schlechtere Umsätze von <20% erzielt. Die Diastereomerenverhältnisse

lagen in einem erwarteten Bereich von d.r. 65:35 (syn/anti). Je geringer der Umsatz, desto

höher war auch der Anteil des anti-Isomer (vgl. 8.2.2.7.6). Es konnte gezeigt werden, dass

Glycerin keinen negativen Einfluss auf die enzymatische Reaktion hat. Allerdings können

keine anderen Additive als Alternative eingesetzt werden, da sie die Enzymaktivität stark

beeinträchtigen.

4.4.7 Erweiterung des Substratspektrums

Um das Substratspektrum auf andere aromatische Benzaldehyde auszuweiten, wurden

thiosubstituierte Benzaldehyde eingesetzt, die als Vorstufe für die Thiamphenicolsynthese

geeignet waren, wie beispielsweise Methylthiobenzaldehyd (1d) und Methylsulphonyl-

benzaldehyd (1k). Außerdem wurde der Einfluss des Substitutionsmusters am Aromaten auf

Umsatz und Diastereoselektivität untersucht (vgl. Abschnitt 8.2.2.7.7).

OH

NHH3CO2S

OH

O

ClCl19

Abbildung 4.43. Thiamphenicol (19)

4.4.7.1 Thiamphenicolrelevante substituierte Benzaldehyde

Im Hinblick auf ein anwendbares Zielprodukt wurden zuerst Benzaldehyde eingesetzt, die zu

einem thiamphenicolrelevanten Intermediat führen. Dazu gehört zum einen

Methylthiobenzaldehyd (1d) und zum anderen Methylsulphonylbenzaldehyd (1k). Bei der

Reaktion von 1d wurde bei einer Substratkonzentration von 0.1 M ein Umsatz von lediglich

10% und ein Diastereomerenverhältnis von d.r. 57:43 (syn/anti) erzielt (Abbildung 4.44).

Aufgrund des niedrigen Umsatzes wurde dieses Substrat nicht weiter untersucht.


66

Abbildung 4.44. Enzymatische Synthese von (2S)-12d

Bessere Ergebnisse wurden beim Einsatz von 1k ermittelt (Abbildung 4.45). Bei einer

Substratkonzentration von 0.1 M wurden ein Umsatz von 42% und ein

Diastereomerenverhältnis von d.r. 61:39 (syn/anti) erhalten. Die Reaktion bei einer

Aldehydkonzentration von 0.25 M lieferte allerdings einen deutlich niedrigeren Umsatz von

nur noch 24%.

Abbildung 4.45. Enzymatische Synthese von (2S)-12k

Die in der Literatur beschriebene L-TA aus Pseudomonas putida zeigte im Vergleich dazu

deutlich bessere Ergebnisse.109 Bei der Synthese von (2S)-12k wurde ein Umsatz von 68% bei

einem Diastereomerenverhältnis von d.r. 78:22 (syn/anti) erzielt. Der Biokatalysator aus

E. coli ist vor allem hinsichtlich des Diastereomerenverhältnisses weniger selektiv und für die

Synthese von (2S,3R)-12k wenig geeignet.

4.4.7.2 m-Substituierte Benzaldehyde

Da in der Literatur mit meta-substituierten Benzaldehyden wie beispielsweise 1j und der

L-TA aus P. putida sehr gute Diastereoelektivitäten (d.r. 78:22 syn/anti) erzielt werden


67

konnten,109 wurden verschiedene in meta-Position substituierte Benzaldehyde mit dem

Biokatalysator aus E. coli umgesetzt. Allerdings zeigte die verwendete Aldolase aus E. coli

eine geringere Diastereoselektivität bei der Bildung von 12j und 12m (Abbildung 4.46). Bei

der Reaktion des chlorsubstituierten Benzaldehyden 1l wurden dagegen ähnliche

Diastereomerenverhältnisse erhalten.109 Allgemein lässt sich sagen, dass die L-TA aus E. coli

keine erhöhte Diastereoselektivität bei der Bildung von m-substituierten β-Hydroxy-α-

aminosäuren 12 zeigt.

Abbildung 4.46. Enzymatische Synthese m-substituierter β-Hydroxy-α-aminosäuren (2S)-12

Die drei Synthesen wurden auch bei einer Substratkonzentration von 0.25 M durchgeführt

und es wurden kaum veränderte Umsätze erzielt. Lediglich bei Aldehyd 1m wurde eine

starke Verringerung der Produktbildung von 83% auf 28% Umsatz erhalten. Dies ist wohl auf

eine Beeinträchtigung des Enzyms durch Wasserstoffbrückenbindung mit der

Hydroxygruppe des Aldehyds 1m zurückzuführen, die bei einer höheren

Substratkonzentration verstärkt auftritt.


68

4.4.7.3 p-Substituierte Benzaldehyde

Zum Vergleich wurden auch zwei para-substituierte Benzaldehyde 1b und 1f umgesetzt. Es

wurden mäßige Umsätze von 55% und 32% erhalten und die Diastereomerenverhältnisse

lagen bei beiden Produkten 12b und 12f bei d.r. 62:38 (syn/anti) (Abbildung 4.47). Bei der

erhöhten Substratkonzentration von 0.25 M wurde eine etwas niedrigere Produktbildung

(35% bzw. 20%) beobachtet. Auch bei diesem Substratmuster konnte keine Verbesserung

der Diastereoselektivität erhalten werden.

Abbildung 4.47. Enzymatische Synthese p-substituierter β-Hydroxy-α-aminosäuren (2S)-12

4.4.7.4 o-Substituierte Benzaldehyde

Bei der Reaktion des ortho-substituierten Benzaldehyds 1i wurden dagegen sehr gute

Diastereoselektivitäten von d.r. 81:19 (syn/anti) bei einer hohen Produktbildung von 91%

unter Verwendung der L-TA aus E. coli erhalten (Abbildung 4.48).


69

Abbildung 4.48. Enzymatische Synthese von (2S)-12i

Mit der Aldolase aus P. putida wurde eine etwas geringere Diastereoselektivität von

d.r. 76:24 (syn/anti) in der Literatur beschrieben.109 Auch bei der erhöhten

Substratkonzentration konnte ein ähnlich guter Umsatz und ein Diastereomerenverhältnis

von d.r. 80:20 (syn/anti) erhalten werden. Die Enantioselektivität von (2S)-12i lag

unabhängig von der Substratkonzentration bei >99% ee.

Darauf aufbauend und um zu überprüfen, ob hier allgemein eine höhere

Diastereoselektivität vorliegt, wurden noch weitere o-substituierte Benzaldehyde umgesetzt

(Abbildung 4.49). Tendenziell wurde bei der Reaktion von o-substituierten Aldehyden mit

Glycin (11) eine bessere Diastereoselektivität (d.r. >70:30 syn/anti) erhalten als bei der

Bildung der p- oder m-substituierten β-Hydroxy-α-aminosäuren. Die Umsätze lagen für (2S)-

12n, (2S)-12o und (2S)-12q bei deutlich über 50%. Auch bei erhöhter Aldehydkonzentration

wurden ähnliche Umsätze und Diastereoselektivitäten erzielt. Die geringere Produktbildung

bei (2S)-12r (25%) deutet darauf hin, dass Benzaldehydderivate mit elektronenziehenden

Substituenten besser umgesetzt werden, als solche mit elektronenschiebenden. Bei der

Synthese von (2S)-12s kommt es wieder zu Wechselwirkungen zwischen der Hydroxygruppe

und dem Enzym, wodurch die Produktbildung beeinträchtigt wird.

Die L-Threoninaldolase aus E. coli weist bei der Umsetzung von o-substituierten

Benzaldehyden die höchste Diastereoselektivität auf. Das beste Ergebnis wurde mit

o-Chlorbenzaldehyd (1i) erzielt. Das Produkt (2S)-12i wurde bei einer Substratkonzentration

von 0.25 M mit einem Umsatz von 85% und einem sehr guten Diastereomerenverhältnis von

d.r. 80:20 (syn/anti) erhalten. Außerdem wurde eine Enantioselektivität von >99% ee

gefunden. Diese Reaktion wurde im Folgenden weiter optimiert und im größeren Maßstab

durchgeführt.


70

Abbildung 4.49. Enzymatische Synthese o-substituierter β-Hydroxy-α-aminosäuren (2S)-12

4.4.8 Optimierung der enzymatischen Synthese von (2S)-12i

Zur Optimierung der enzymatischen Umsetzung von 1i mit einer Substratkonzentration von

0.25 M wurde die Reaktion bei einer konstanten Temperatur von 25°C durchgeführt. Des

Weiteren wurde die Glycinmenge von einem zehnfachen auf einen achtfachen Überschuss

reduziert. Außerdem musste die Reaktion mit einer geringeren Enzymmenge von 44 U/mmol

durchgeführt werden, da das Volumen des eingesetzten Rohextraktes genau dem des

Reaktionsvolumens entsprach und die Enzymaktivität geringer war (Abbildung 4.50). Nach

einer Reaktionszeit von 20 h konnte ein vollständiger Umsatz und ein

Diastereomerenverhältnis von d.r. 79:21 (syn/anti) erzielt werden.

O

H +

1i(0.25 M)

Cl

Abbildung 4.50

4.4.8.1 Untersuchung des Reaktionsverlaufs

Um den genauen Reaktionsverlauf zu untersuchen wurde die

10 mL-Maßstab durchgeführt und nach verschiedenen Reaktionszeiten

Umsatzbestimmung entnommen.

beobachtet, die danach nur noch geringfügig anstieg

8.2.2.8.1).

O

H +

1i(0.25 M)

Cl

Abbildung 4.51. Reaktionsverfolgung der enzymatischen Synthese von

0

20

40

60

80

100

1/4 1/2 1

[%]

ENZYMATISCHE

NH2

O

OHPuffer pH 8,

PLP (50 µM),20 h, 25°C

O

NH2

OH

11(8 Äq.)

Cl

(2S)-12i>95% Umsat

d.r. 79:21 (syn/a

L-TA (E. col i)44 U/mmol,

50. Optimierte enzymatische Synthese von (2S

Untersuchung des Reaktionsverlaufs

Um den genauen Reaktionsverlauf zu untersuchen wurde die Synthese

Maßstab durchgeführt und nach verschiedenen Reaktionszeiten

Umsatzbestimmung entnommen. Nach 3 h wurde bereits eine Produktbildung von über 90%

ch nur noch geringfügig anstieg (Abbildung 4.

NH2

O

OHPuffer pH 8,PLP (50 µM),

25°C

O

NH2

OH

11(8 Äq.)

Cl

(2S)-12i


Reaktionsverfolgung der enzymatischen Synthese von

1 2 3 5 7 22 144

Zeit [h]


71

OH

tzanti)

S)-12i

Synthese in einem

Maßstab durchgeführt und nach verschiedenen Reaktionszeiten Proben zur

wurde bereits eine Produktbildung von über 90%

.51, vgl. Abschnitt

OH

Reaktionsverfolgung der enzymatischen Synthese von (2S)-12i

Umsatz

syn-Isomer syn-Isomer

Umsatz


72

Das Diastereomerenverhältnis lag nach einer halben Stunde konstant zwischen d.r. 78:22

und d.r. 80:20 (syn/anti). Die unterschiedlichen Werte sind auf Schwankungen

zurückzuführen, die bei der Auswertung durch Hintergrundrauschen der Baseline ausgelöst

werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde ein analoger Versuch in 0.5 mL-Maßstab

durchgeführt und nach 6 Stunden abgebrochen. Bei einem Umsatz von >95% wurde ein

Diastereomerenverhältnis von d.r. 80:20 (syn/anti) erhalten und ein Enantiomeren-

überschuss von >99% ee mittels chiraler HPLC nachgewiesen (vgl. Abschnitt 8.2.2.8.2).

Als nächstes sollte das Reaktionsvolumen auf 100 mL erhöht und (2S)-12i möglichst

diastereomerenrein isoliert werden. Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse wurde die Reaktion

nach den optimierten Bedingungen durchgeführt und nach 7 h beendet.

4.4.8.2 Vergleichsversuch mit Benzaldehyd als Substrat

Um die optimierte Reaktion mit 1i als Substrat mit dem Standardsubstrat 1e vergleichen zu

können, wurde Benzaldehyd unter den optimierten Bedingungen mit Glycin (11)

enzymatisch umgesetzt (Abbildung 4.52).

Abbildung 4.52. Synthese von (2S)-12e unter optimierten Bedingungen

Die Reaktionsverfolgung ist in Abbildung 4.53 dargestellt und es ist deutlich zu erkennen,

dass unter diesen Bedingungen mit 1e als Substrat lediglich ein maximaler Umsatz von 72%

erzielt werden konnte (vgl. Abschnitt 8.2.2.8.4). Das Diastereomerenverhältnis lag wie

erwartet in einem Bereich von d.r. 65:35 (syn/anti). Die optimierte Synthese kann also nicht

ohne Weiteres auf andere Substrate angewendet werden. Mit o-Chlorbenzaldehyd (1i) als

Ausgangsverbindung konnte der höchste Umsatz (>95%) und das beste

Diastereomerenverhältnis (d.r. 80:20 syn/anti) bei der Umsetzung mit der L-TA aus E. coli

erzielt werden.


73

Abbildung 4.53. Vergleichsversuch unter optimierten Bedingungen mit 1e als Substrat

4.4.8.3 Cofaktor-Abhängigkeit

Es sollte weiterhin untersucht werden, ob bei der enzymatischen Reaktion die Zugabe von

Cofaktor PLP (50 µM) notwendig ist. Deshalb wurde die Reaktionsverfolgung nochmals ohne

Cofaktor durchgeführt (Abbildung 4.54, vgl. Abschnitt 8.2.2.8.4).

Abbildung 4.54. Vergleich der enzymatischen Reaktion mit und ohne Cofaktor PLP

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25 30

Um

satz

[%

]

Zeit [h]

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25 30

Um

satz

[%

]

Zeit [h]

mit PLP

ohne PLP

(50 µM)


74

Bei der graphischen Auftragung der Ergebnisse der beiden Versuchsreihen wird deutlich,

dass eine Zugabe von PLP nicht notwendig ist. Offensichtlich ist im Rohextrakt genügend

Cofaktor enthalten um die Reaktion zu katalysieren.

Analog wurde auch die Synthese von (2S)-12i ohne Cofaktor durchgeführt. Unter den

optimierten Bedingungen wurden nach 7 h ein Umsatz von 91% und ein Diastereomeren-

verhältnis von d.r. 78:22 (syn/anti) erhalten. Dies entspricht ebenfalls den Ergebnissen der

Versuche mit Zugabe von PLP.

4.4.8.4 Scale-up und Isolierung des Produkts (2S)-12i

Das Reaktionsvolumen wurde zuerst auf 12.5 mL erhöht und verschiedene

Aufarbeitungsabläufe unter Verwendung eines Ionenaustauschers und Kristallisation

getestet. Die enzymatische Reaktion wurde nach 7 h durch Erniedrigung des pH-Werts auf 1

gestoppt und anschließend wieder neutralisiert. Durch Zugabe von Ethanol (ca. 90 Vol%)

wurde der Großteil des überschüssigen Glycins ausgefällt. Mittels Filtration konnte 11 und

ausgefälltes Protein vom Rohprodukt getrennt werden.

Durch Einengen des Filtrats auf etwa ein Zehntel des Volumens wurde (2S)-12i ausgefällt und

abfiltriert. Anfangs stand für die Synthese nur Enzymrohextrakt zur Verfügung, der mit

Glycerin verdünnt war, welches im erhaltenen Produkt noch mit etwa 10% enthalten war.

Durch mehrmaliges Umkristallisieren in Wasser konnte schließlich vollständig reines Produkt

(2S)-12i isoliert werden, allerdings nur in einer Ausbeute von 38%. Auch der Versuch das

Glycerin unter Verwendung des Kationenaustauscher Dowex 50W X8 abzutrennen, brachte

keine wesentliche Verbesserung der Ausbeute. Zwar konnte das Glycerin vollständig

abgetrennt werden, aufgrund noch enthaltener Glycinreste und Verunreinigungen aus dem

Enzymrohextrakt musste allerdings weiter umkristallisiert werden. Um die Zahl der

Aufreinigungsschritte zu verringern und den Verlust an Produkt zu minimieren wurde auf

einen unverdünnten Rohextrakt zurückgegriffen. (2S)-12i wurde wieder nach Abfiltrieren des

Glycins beim Einengen des Filtrats ausgefällt. Der Niederschlag wurde abgetrennt und mit

Wasser/Ethanol (1:4) gewaschen.


75

Abbildung 4.55. Scale-up der enzymatischen Reaktion und Isolierung von (2S)-12i

Auf diesem Weg konnte reines Produkt in einer Ausbeute von 50% und einem

Diastereomerenverhältnis von d.r. 78:22 (syn/anti) erhalten werden. Wegen der geringeren

Zahl an Aufreinigungsschritten konnte die Ausbeute stark verbessert werden. Durch die

Erhöhung des Reaktionsvolumens auf 100 mL konnte zudem eine höhere Ausbeute von 62%

bei einem Diastereomerenverhältnis von d.r. 78:22 (syn/anti) erzielt werden (Abbildung

4.55, vgl. Abschnitt 8.2.2.8.5).

4.4.8.4.1 Trennung der racemischen Diastereomere von rac-12i

Ein weiteres Ziel war die Isolierung des diastereomerenreinen Produkts (2S,3R)-12i aus der

enzymatischen Umsetzung unter Verwendung industriell anwendbarer Methoden. Die

literaturbekannten Verfahren beruhen meist auf aufwendigen und kostenintensiven

säulenchromatographischen Wegen.105,109 Beispielsweise ist eine Trennung über Silicagel mit

einem Lösungsmittelgemisch aus CH2Cl2, Methanol und Ammoniak möglich.109 Dieses

Verfahren ist allerdings nicht im Grammmaßstab anwendbar.

Zuerst wurde die Trennung mittels Ionenaustauscher (Dowex 50W X8) untersucht. Dazu

wurde das Hydrochlorid von rac-12i (d.r. 82:18 syn/anti) auf eine mit Ionenaustauscher

gefüllte Säule aufgetragen und mit 0.1 M Ammoniaklösung eluiert. Mit Hilfe von

Dünnschichtchromatographie sollte die Trennung verfolgt werden. Es konnte lediglich eine

minimale Anreicherung der Isomere auf d.r. 86:14 (syn/anti) bei geringer Ausbeute (16%)


76

erzielt werden. Aufgrund dessen wurde diese Methode zur Diastereomerentrennung

verworfen.

Abbildung 4.56. Trennung der Diastereomere von rac-12i

Als nächstes wurde versucht, das gewünschte syn-12i durch Umkristallisation in Wasser zu

erhalten. Dazu wurde rac-12i (d.r. 82:18 syn/anti) unter Sieden in Wasser gelöst. Der beim

Abkühlen entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und es konnte reines syn-12i in einer

Ausbeute von 43% isoliert werden (Abbildung 4.56). Diese Methode sollte nun auf das

enantiomerenreine Produktgemisch aus der enzymatischen Umsetzung angewendet

werden.

4.4.8.4.2 Trennung der enantiomerenreinen Diastereomere von (2S)-12i

Nach Isolierung des reinen Produkts (2S)-12i als Diastereomerengemisch aus der

enzymatischen Aldolreaktion wurde dieses in Wasser umkristallisiert, um das gewünschte

syn-Isomer zu erhalten. Leider konnte hierbei keine Verbesserung des Diastereomeren-

verhältnisses festgestellt werden. Die enantiomerenreine Verbindung weist hier andere

Fällungseigenschaften als das Racemat auf.

Anschließend wurde untersucht, ob das gewünschte Isomer unter Verwendung anderer

Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische abgetrennt werden kann. Es wurde beobachtet,

dass bevorzugt das anti-Isomer ausgefällt wird und es somit nur zu einer Anreicherung des


77

gewünschten (2S,3R)-12i im Filtrat kommt. So wurde zu einer wässrigen Lösung von (2S)-12i

(d.r. 78:22 syn/anti) so lange Aceton zugegeben, bis sich ein Niederschlag bildete. Der

Niederschlag wies ein Diastereomerenverhältnis von d.r. 68:32 (syn/anti) auf, während das

des Filtrats bei d.r. 87:13 (syn/anti) lag. In Bezug auf das eingesetzte (2S)-12i wurde 41%

Produkt beim Filtrieren wiedergewonnen und beim Abziehen des Lösungsmittel aus dem

Filtrat 44% (2S)-12i. Der Verlust lag bei etwa 15% (Abbildung 4.57).

Abbildung 4.57. Trennung der Diastereomere durch Ausfällen aus Wasser mit Aceton

Durch wiederholte Ausfällung konnte keine weitere Verbesserung des

Diastereomerenverhältnisses erreicht werden. Die Ausbeute des Diastereomerengemisches

nach der enzymatischen Reaktion lag bei 62%. Durch Trennung der Diastereomere auf eben

beschriebene Weise ist lediglich eine Anreicherung des syn-Isomers bei einer Ausbeute von

44% möglich. Somit wurde die Gesamtausbeute halbiert und trotzdem nur ein

Diastereomerenverhältnis von d.r. 87:13 (syn/anti) erhalten.

4.4.9 Racematspaltung

Darüber hinaus wurde als Alternative zur Synthese enantiomerenreiner β-Hydroxy-

α-aminosäuren die Racematspaltung untersucht. Bei der Spaltung von rac-syn-12, welches

leicht hergestellt werden kann (vgl. Abschnitt 4.4.1.1), ist eine Trennung der Diastereomere

nicht notwendig, da nur das syn-Isomer eingesetzt wird. Allerdings kann nur eine maximale

Ausbeute von 50% erzielt werden.


78

4.4.9.1 Spaltung von rac-syn-12e

Zuerst wurde die Spaltung des Standardsubstrats Phenylserin (rac-syn-12e), welches käuflich

erwerbbar ist, untersucht. Dazu wurden verschiedene Konzentrationen an 12e und

verschiedene Enzymaktivitäten eingesetzt (Tabelle 4.5).

Tabelle 4.5. Racematspaltung von rac-syn-12e

Eintrag1) rac-syn-

12e [M]

Enzymaktivität

[U/mmol]

Enzym

[mL]

Puffer pH 8

[mL]

Umsatz

11 [%]

Umsatz

anti-12e [%]

1 0.2 68 0.125 0.125 47 4

2 0.1 135 0.25 0.25 51 3

3 0.2 27 0.05 0.2 46 5

4 0.1 54 0.1 0.4 50 5


Ein vollständiger Umsatz wurde bei einer Substratkonzentration von 0.1 M erzielt. Dabei war

eine Enzymaktivität von 54 U/mmol ausreichend (Tabelle 4.5, Eintrag 4). Es wurden bei allen

Versuchen kleine Mengen von anti-12e nachgewiesen, was darauf zurückzuführen ist, dass

auch die Bindungsknüpfung stattfindet.

Um die Anwendbarkeit der Methode zu untersuchen wurde die Reaktion in größerem

Maßstab (25 mL, analog Tabelle 4.5, Eintrag 4) durchgeführt. Bei vergleichbaren Ergebnissen

von Umsatz und Diastereomerenverhältnis konnte kein Produkt isoliert werden.


79

4.4.9.2 Spaltung von rac-syn-12i

Die Racematspaltung der chlorsubstituierten Verbindung 12i wurde ebenfalls durchgeführt.

Auch hier wurde die Substratkonzentration und die Enzymaktivität variiert (Tabelle 4.6).

Tabelle 4.6. Racematspaltung von rac-syn-12i

Eintrag1) rac-syn-

12i [M]

Enzymaktivität

[U/mmol]

Enzym

[mL]

Puffer pH 8

[mL]

Umsatz

11 [%]

Umsatz

anti-12i2)[%]

1 0.5 54 0.1 0 9 n.d.

2 0.2 135 0.25 0 20 n.d

3 0.1 270 0.5 0 36 n.d

4 0.067 270 0.5 0.25 44 5

5 0.05 270 0.5 0.5 48 5

6 0.05 540 1 0 50 5

7 0.05 54 0.1 0.9 46 5

1) vgl. Abschnitt 8.2.2.1.2; 2)

n.d.: nicht detektierbar

Lediglich bei einer Substratkonzentration von 0.05 M wurden gute Umsätze erzielt (Tabelle

4.6, Eintrag 5-7). Die Enzymmenge konnte ebenfalls auf 54 U/mmol gesenkt werden (Tabelle

4.6, Eintrag 7). Der Anteil an gebildetem Glycin (11) lag bei 46%, wobei 5% des anti-Isomers

nachgewiesen werden konnten.

Unter diesen Bedingungen wurde der Ansatz in einem 50 mL-Maßstab durchgeführt. Durch

die Vergrößerung des Reaktionsvolumens wurde keine Beeinträchtigung des Umsatzes


80

beobachtet (Abbildung 4.58, vgl. Abschnitt 8.2.2.1.4). Allerdings konnte nur etwa 10%

Produkt isoliert werden, welches noch Verunreinigungen (30%) enthielt.

Abbildung 4.58. Racematspaltung von rac-syn-12i in 50 mL-Maßstab

Aufgrund der schlechten Ergebnisse bei der Racematspaltung, bezogen auf Substrat-

konzentration und Ausbeute, stellt dies kein geeignetes Verfahren zur diastereomerenreinen

Herstellung von 12i dar.

4.5 Zusammenfassung

Im Vordergrund dieses Abschnitts stand die Optimierung der enzymkatalysierten

Aldolreaktion mit der zur Verfügung stehenden L-selektiven Threoninaldolase aus E. coli. Es

wurden zwei Methoden zur Umsatzbestimmung entwickelt, einmal mittels NMR-Standard

und einmal mittels Derivatisierung. Nach Etablierung der Standardreaktion mit Benzaldehyd

(1e) wurde der Einfluss der verschiedenen Reaktionsparameter genau untersucht. So wurde

die Abhängigkeit von der Reaktionszeit und der Enzymmenge analysiert. Auch das

Konzentrationsverhältnis der Edukte 1e und 11 zueinander wurde variiert. Die

Substratkonzentration des Aldehyden 1e konnte ohne größere Umsatzeinbußen von 0.1 M

auf 0.25 M erhöht werden, wohingegen ein hoher Überschuss an Glycin (11) für eine gute

Produktbildung notwendig war. Die optimierte Standardreaktion ist in Abbildung 4.59

dargestellt.


81

Abbildung 4.59. Optimierte Standardreaktion

Des Weiteren wurden verschieden substituierte Benzaldehyde eingesetzt und der Einfluss

des Substitutionsmusters auf Umsatz und Diastereomerenverhältnis untersucht. Dabei

wurde festgestellt, dass o-substituierte Benzaldehyde die besten Ergebnisse vor allem in

Hinblick auf die Diastereoselektivität lieferten. Als bestes Substrat erwies sich o-

Chlorbenzaldehyd (1i). Die entsprechende β-Hydroxy-α-aminosäure (2S)-12i wurde mit

einem Diastereomerenverhältnis von d.r. 80:20 (syn/anti) bei einem Umsatz von 90%

erhalten. Mit diesem Substrat wurde nochmals eine Optimierung der Reaktion durchgeführt,

wodurch ein vollständiger Umsatz, bei geringerer Enzymmenge und lediglich 8 Äquivalenten

Glycin erzielt werden konnte (Abbildung 4.60).

Abbildung 4.60. Optimierte enzymatische Reaktion mit 1j als Substrat

Unter diesen Bedingungen wurde die Reaktion in größerem Maßstab (bis zu 100 mL)

durchgeführt und (2S)-12i isoliert. Durch Fällung konnte das gewünschte Produkt als

Diastereomerengemisch in einer Ausbeute von 62% erhalten werden (Abbildung 4.61).

Abbildung 4.61. Optimierte Reaktion in 100 mL-Maßstab


82

Verschiedene Versuche zur Trennung der Diastereomere schlugen leider fehl. Auch die

alternative Route der Racematspaltung brachte keine nutzbaren Ergebnisse, da bei sehr

geringer Substratkonzentration nur schlechte Ausbeuten erzielt werden konnten.

Dennoch konnte ein guter Synthese-Prozess mit hoher volumetrischer Produktivität etabliert

werden. Die Durchführung der Reaktion bei der hohen Substratkonzentration von 0.25 M

stellt eine Verbesserung der Syntheseroute dar und auch die Anwendung in großem

Maßstab wurde bisher noch nicht gezeigt.

EPOXIDSYNTHESE AUSGEHEND VON β-HYDROXY-α-AMINOSÄUREN

83

5. Epoxidsynthese ausgehend von β-Hydroxy-α-amino-

säuren

5.1 Einleitung

Chirale Epoxide sind sehr wichtige Bausteine zur Herstellung pharmazeutisch relevanter

Verbindungen. Vor allem die katalytische asymmetrische Synthese wird sowohl in der

Akademia, als auch in der Industrie für diese Zwecke verwendet.121 2001 wurde der

Nobelpreis an Sharpless für seine herausragenden Ergebnisse auf dem Gebiet der

asymmetrischen Epoxidierung verliehen.122

Die von Sharpless entwickelte katalytische asymmetrische Synthese von Epoxiden123 findet

beispielsweise in der Herstellung des Leukotrien-Antagonisten 87 Verwendung (Abbildung

5.1). Diese Verbindung hemmt die Wirkung von Leukotrienen, die Entzündungen und

allergische Reaktionen, einschließlich Asthma, hervorrufen.124

Abbildung 5.1. Synthese eines Leukotrien-Antagonisten 87124

Bei leicht zugänglichen chiralen Ausgangsverbindungen bietet sich auch eine einfache

Substitutionsreaktion zum Erhalt enantiomerenreiner Epoxide an. Analog zu dem

entsprechenden Zwischenschritt der Darzens-Glycidester-Kondensation1, können aus

enantiomerenreinen Halohydrinen 20 unter basischen Bedingungen Epoxide 21 erhalten

werden (Abbildung 5.2).125

Abbildung 5.2. Synthese von Epoxiden 21 ausgehend von Halohydrinen 20


84


5.2.1 Katalytische asymmetrische Epoxidierung

Es gibt viele verschiedene Methoden zur asymmetrischen Synthese von Epoxiden. Von

besonderer Bedeutung ist hierbei sicherlich die Entwicklung chiraler Katalysatoren zur

selektiven Oxidation von Alkenen. Im Laufe der Zeit haben sich mehrere Systeme etabliert,

die dann entsprechend weiterentwickelt wurden.121

Ein Beispiel ist die bereits erwähnte Sharpless-Epoxidierung,123 bei der Allylakohole mit

hoher Enantioselektivität epoxidiert werden können. Als Katalysator dient Titan(IV)-

isopropylat und als Epoxidierungsreagenz tert-Butylhydroperoxid. Die Selektivität wird durch

Zugabe von Weinsäureethylester (DET) erreicht. Während der Reaktion sind alle Reagenzien

über ihre Sauerstoffatome an das Metall komplexiert und daher können lediglich

Allylalkohole mit dieser Methode epoxidiert werden. Wichtig ist es zudem unter

Feuchtigkeitsausschluss zu arbeiten, da dies ansonsten zu einer Verschlechterung der

ee-Werte von 99% auf 48% führt.126

Die Jacobsen-Katsuki-Epoxidierung bietet eine Erweiterung auf nicht funktionalisierte

Olefine.1,127 Mit den höchsten Enantiomerenüberschüssen werden cis-Alkene wie 88 von

Mangan-Salen-Komplexen 90 als Katalysator umgesetzt. Beispielsweise kann mit Hilfe dieser

Methode 88 mit sehr guten Enantioselektivitäten von 92% ee zum Epoxid 89 umgesetzt

werden (Abbildung 5.3).128

Abbildung 5.3. Jacobsen-Katsuki-Epoxidierung128


85

Zur katalytischen asymmetrischen Epoxidierung stehen noch weitere Katalysatorsysteme zur

Verfügung, wie beispielsweise La(BINOL)-Komplexe, die von Shibasaki zur Epoxidierung von

Enonen eingesetzt wurden.121 Dioxirane, die aus chiralen Ketonen und Oxon in situ

hergestellt werden, werden bei der Shi-Epoxidierung eingesetzt.129

Ein Nachteil dieser homogenen Systeme ist die aufwändige Aufarbeitung und

Rückgewinnung der Katalysatoren. Aus diesem Grund wurden bereits viele verschiedene

heterogene Katalysatoren entwickelt, die jedoch eine geringere Aktivität aufweisen und

schwieriger in der Herstellung sind.121 Die bekannten Katalysatoren müssen im Hinblick auf

Syntheseaufwand und damit verbundenen Kosten optimiert werden. Außerdem ist bei allen

Methoden die Enantio- und Chemoselektivität noch ausbaufähig.

5.2.2 Synthese und Anwendung von Glycidestern

In der Totalsynthese verschiedener pharmazeutisch relevanter Verbindungen kommen

enantiomerenreine Glycidester zum Einsatz.130,131 Beispielsweise können asymmetrische

Syntheseverfahren,130 aber auch Racematspaltungen131,132 angewendet werden.

Diltiazem (92) ist ein typischer Calciumkanalblocker, der zur Behandlung koronarer

Herzkrankheiten, Herzrhythmusstörungen und Bluthochdruck eingesetzt wird. Ein Baustein

zur Herstellung dieses Arzneimittels ist ein trans-Methylgylcidester 91 (Abbildung 5.4), der

schon auf verschiedene Weisen hergestellt wurde. Jedoch sind diese Prozesse in Bezug auf

Ausbeute, Enantioselektivität und Katalysatormenge noch optimierbar.132 Beispielsweise

konnte 91 auch mittels Jacobsen-Epoxidierung hergestellt werden, allerdings mit einem

Enantiomerenüberschuss von lediglich 86%.133

Abbildung 5.4. Glycidester 91 als Synthesebaustein für Diltiazem (92)132


86

Eine Methode zur Synthese des gewünschten Glycidesters verläuft über eine

metallkatalysierte dynamisch kinetische Racematspaltung (Abbildung 5.5).132 Unter

Verwendung eines chiralen Rutheniumkatalysators wird die Ketogruppe von 93 selektiv zum

Alkohol 94 reduziert. Der anschließende Ringschluss erfolgt im Basischen unter Inversion der

Konfiguration aber unter Erhalt des Enantiomerenüberschusses. Auf diese Weise konnte das

Epoxid 91 mit einer Enantioselektivität von 95% ee isoliert werden.

Abbildung 5.5. Synthese des Glycidester 91132

Kuroda et al. entwickelten eine Route zu 94 via einer Mukaiyama-Aldolreaktion (Abbildung

5.6).130 Das Zwischenprodukt 97 kann mit einer Ausbeute von 83% und einem

Enantiomerenüberschuss von 96% erhalten werden. Der ee-Wert konnte durch

anschließende Umkristallisation auf >99% gesteigert werden. Nach Reduktion zu

Monochlorhydrin und Cyclisierung unter basischen Bedingungen wird das gewünschte

Produkt 91 ebenfalls mit >99% ee erhalten.

MeO

+OMe

OTMSCl

Cl

S

O

O

NBH

O

O

CH2Cl2, -78°C, 7 h

(96, 100 mol%)

MeO

OH

CO2Me

ClCl

9783% Ausbeute

96% ee

1a 95

H

O

Abbildung 5.6. Synthese des Zwischenprodukts 96 über Mukaiyama-Aldolreaktion130

Eine Verbesserung der Herstellung von Glycidestern ist weiter erforderlich. Die beiden

vorgestellten Methoden verlaufen über mehrere aufwändige Stufen, bei denen entweder


87

die Enantioselektivität verbesserungswürdig ist oder der Katalysator in stöchiometrischen

Mengen eingesetzt werden muss.

5.3 Ziel der Arbeit

In diesem Teil sollte ausgehend von enantiomerenreinem o-Chlorphenylserin (2S)-12i aus

der optimierten enzymatischen Umsetzung (Abschnitt 4.4.8.4) das entsprechende Epoxid 21i

hergestellt werden. Im ersten Schritt sollte die Aminogruppe durch Chlor substituiert

werden und anschließend das so erhaltene Halohydrin 20i mittels Ringschluss zum Epoxid

21i umgesetzt werden (Abbildung 5.7).

Abbildung 5.7. Synthese von Epoxiden 21i ausgehend von β-Hydroxy-α-aminosäuren (2S)-12i

Da die entsprechenden Reaktionen unter Erhalt bzw. Inversion der Konfiguration

ablaufen,125,134,135 sollte auf diesem Weg das gewünschte Epoxid enantiomerenrein erhalten

werden.

5.4 Eigene Ergebnisse und Diskussion

5.4.1 Halohydrinsynthese

Die Halohydrinsynthese wurde zuerst anhand der racemischen syn-Verbindung 12e

untersucht. Anschließend wurden die chlorsubstituierten Verbindungen rac-syn-12i und

(2S)-12i eingesetzt (vgl. Abschnitt 8.2.3.1).

5.4.1.1 Synthese von rac-syn-3-Hydroxy-3-phenylpropansäure rac-syn-20e

Die Synthese des Halohydrins rac-syn-20e erfolgte analog der von Whitesides et al.

beschriebenen Methode.125 Die β-Hydroxy-α-aminosäure rac-syn-12e wurde mit NaNO2 in


88

HCl zu rac-syn-20e umgesetzt. Das gewünschte Produkt konnte nach Umkristallisation in

CH2Cl2/Hexan mit einer Ausbeute von 29% isoliert werden (Abbildung 5.8).

Abbildung 5.8. Synthese von rac-syn-20h

5.4.1.2 Synthese der chlorsubstituierten Halohydrinverbindungen (2S)-20i

Analog wurden anschließend auch die chlorsubstituierte β-Hydroxy-α-aminosäure (2S)-12i

(d.r. 76:24 syn/anti) mit NaNO2 umgesetzt. Es konnte das gewünschte Halohydrin (2S)-20i

mit einer Ausbeute von 20% isoliert und charakterisiert werden (Abbildung 5.9). Bei der

Isolierung wurde eine Anreicherung des Überschussisomers beobachtet.

Abbildung 5.9. Synthese von (2S)-20j

5.4.2 Synthese des Epoxids 21i durch Ringschluss

Die Synthese des Epoxids 21i erfolgte direkt aus den chlorsubstituierten β-Hydroxy-

α-aminosäuren rac-syn-12i und (2S)-12i über zwei Stufen ohne Isolierung der Zwischenstufe

20i. Aufgrund der geringen Ausbeuten bei der Isolierung von rac-syn-20e und (2S)-20i wurde

das Rohprodukt direkt umgesetzt. Da eine Analyse der Konfiguration bei der offenkettigen

Verbindung 20 nicht möglich war, wurde diese anhand des Epoxids rac-syn-21i durchgeführt

(vgl. Abschnitt 8.2.3.2).


89

5.4.2.1 Synthese des racemischen Epoxids rac-syn-21i

Die Synthese des Halohydrins rac-syn-20i wurde analog Abschnitt 5.4.1 durchgeführt. Der

Umsatz (74%) wurde mittels 1H-NMR-Spektroskopie aus dem Rohprodukt bestimmt.

Anschließend erfolgte der Ringschluss mit Hilfe von tert-Butanolat als Base und das

gewünschte Epoxid rac-syn-21i konnte mit einer Ausbeute von 34% isoliert werden

(Abbildung 5.10). Dazu wurde die Säure rac-syn-21i in MTBE gelöst und durch Zugabe von

ethanolischer NaOH ausgefällt. Nach anschließender Neutralisation und Extraktion konnte

(2R,3R)-21i bzw. (2S,3S)-21i erhalten und vollständig charakterisiert werden.

Abbildung 5.10. Synthese des racemischen Epoxids 21i

In der Literatur wurde bereits beschrieben, dass bei der Substitution einer Aminogruppe

durch ein Chloridion die bestehende Konfiguration erhalten bleibt.125 Beim Ringschluss

dieser Halohydrinverbindungen 20 kommt es durch eine intramolekulare SN2 Reaktion zur

Inversion des Stereozentrums in α-Position.134,135 Die Überprüfung dieser Daten erfolgte

mittels Kernresonanzspektroskopie. Durch sogenannte 1H-NOESY-Aufnahmen kann durch

Nutzung des Kern-Overhauser-Effekts eine Aussage über die räumliche Nähe von Kernen

getroffen werden.136 Eine solche Bestimmung kann allerdings nur bei den starren

Ringsystemen 21 sinnvoll durchgeführt werden. Bei den offenkettigen Verbindungen ist die

Rotation um die Einfachbindungen zu schnell.

In Abbildung 5.11 A ist das 1H-NMR-Spektrum des Epoxids mit Zuordnung der einzelnen

Signale gezeigt. Abbildung 5.11 B und C zeigen die entsprechenden NOESY-Aufnahmen.

Hierbei wird ein Proton in seiner Frequenz angestrahlt und erscheint im Spektrum als

negatives Signal. Die Intensität der Signale der restlichen Protonen zeigt im Vergleich zum

EPOXIDSYNTHESE AUSGEHEND VON

90

Spektrum A die räumliche Nähe der Kerne an. Je weiter die Kerne voneinander entfernt sind,

desto schwächer wird die Intensität der Signale. Die Schwächung der Peakintensi

deutlich im aromatischen Bereich sichtbar. Es kann hier auch die Aussage getroffen werden,

welches der beiden H-Atome sich an C2

Abbildung

Da die Signale des en

Intensitätsverringerung aufweisen, müssen

befinden, da bei einer anti

Konfiguration stimmt auch mit der in der Literatur beschri

der Konfiguration währen der beiden Reaktionsschritte überein.

1H-NOESY-Spektroskopie konnte bewiesen werden, dass das erhaltenen Epoxid

Konfiguration (2R,3R) bzw. (2S

END VON β-HYDROXY-α-AMINOSÄUREN

die räumliche Nähe der Kerne an. Je weiter die Kerne voneinander entfernt sind,

desto schwächer wird die Intensität der Signale. Die Schwächung der Peakintensi


Atome sich an C2- bzw. C3-Position befindet.

Abbildung 5.11. NOESY-Spektren von rac-syn-21i

Signale des entsprechenden anderen Protons am Oxiran keine

weisen, müssen sich die beiden Protonen in

anti-Stellung die Peakhöhen deutlich niedriger

t auch mit der in der Literatur beschriebenen Retention bzw. Inversion

währen der beiden Reaktionsschritte überein.125,134

konnte bewiesen werden, dass das erhaltenen Epoxid

S,3S) aufweist.

AMINOSÄUREN

die räumliche Nähe der Kerne an. Je weiter die Kerne voneinander entfernt sind,

desto schwächer wird die Intensität der Signale. Die Schwächung der Peakintensität ist


Protons am Oxiran keine

sich die beiden Protonen in syn-Position

Stellung die Peakhöhen deutlich niedriger wären. Diese

benen Retention bzw. Inversion

134,135 Mit Hilfe der

konnte bewiesen werden, dass das erhaltenen Epoxid 21i die


91

5.4.2.2 Reaktion des enantiomerenreinen Halohydrins (2S)-20i zum Epoxid 21i

Als nächstes wurde das Epoxid ausgehend von der enantiomerenreinen β-Hydroxy-

α-aminosäure (2S)-12i aus der enzymatischen Synthese hergestellt. Dabei wurde (2S)-12i mit

einem Diastereomerenverhältnis von d.r. 78:22 (syn/anti) eingesetzt. Das Halohydrin

(2S)-20i wurde mit einem Umsatz von über 70% und einem Diastereomerenverhältnis von

d.r. 80:20 (syn/anti) erhalten. Bei der anschließenden Umsetzung mit tert-Butanolat wurde

ein vollständiger Umsatz erzielt. Zur Aufreinigung wurde das Rohprodukt in MTBE gelöst und

durch Zugabe von ethanolischer NaOH ausgefällt. Nach anschließender Neutralisation

konnten 30% Produkt mit einem Diastereomerenverhältnis von d.r. 82:18 (syn/anti) erhalten

werden. Durch weitere Zugabe von ethanolischer NaOH und MTBE zum Filtrat kam es zu

einer zweiten Fällung, hier Betrug die Ausbeute 22% (2R)-21i und das

Diastereomerenverhältnis d.r. 95:5 (syn/anti) (Abbildung 5.12). Beim Ringschluss wurde

keine bevorzugte Bildung des syn- oder anti-Isomers aus sterischen Gründen beobachtet.

Abbildung 5.12. Synthese von (2R)-21i

Anschließend wurde der Enantiomerenüberschuss des Epoxids (2R)-21i mittels chiraler HPLC

bestimmt, um eine Racemisierung während der Reaktion auszuschließen. In Abbildung 5.13

A ist das Chromatogramm der racemischen Verbindung (2R,3R)-21i bzw. (2S,3S)-21i gezeigt.

Die Peaks der beiden Enantiomere konnten deutlich getrennt werden. Das Spektrum der

enantiomerenreinen Verbindung (Abbildung 5.13 B) zeigt ebenfalls zwei Signale, wobei ein

Peak eine deutlich abweichende Retentionszeit aufweist. Daraus lies sich schließen, dass es

sich um die enantiomerenreinen Verbindungen (2R,3R)-21i bzw. (2R,3S)-21i handelt. Um das

Ergebnis zu verifizieren, wurde eine Mischung aus der racemischen syn-Verbindung


92

(2R,3R)-21i, (2S,3S)-21i und der enantiomerenreinen Verbindung (2R)-21i vermessen. In

Abbildung 5.13 C sind deutlich drei Signale zu sehen. Somit kann für (2R,3R)-21i ein ee-Wert

von >99% angegeben werden.

Abbildung 5.13. HPLC-Analytik zur ee-Wertbestimmung von 21i

5.4.3 Zusammenfassung

In diesem Anschnitt wurde die Synthese von Epoxiden 21 ausgehend von

enantiomerenreinen β-Hydroxy-α-aminosäuren 12 untersucht. Dabei wurde auf eine Route

in Anlehnung an die Darzens-Reaktion1 zurückgegriffen. Rac-syn-12e, rac-syn-12i und

(2S)-12i wurden dabei zum entsprechenden Halohydrin 20 umgesetzt und teilweise isoliert.

Die Halohydrine 20i wurden anschließend direkt im Basischen zum Epoxid 21i umgesetzt. Zur

Untersuchung der Stereoselektivität der Reaktionen wurde das Produkt (2R,3R)-21i bzw.

(2S,3S)-21i mittels 1H-NOESY-Spektroskopie analysiert und es konnte eine syn-Konfiguration

der beiden Protonen am Oxiran festgestellt werden. Mittels chiraler HPLC wurde außerdem

eine Racemisierung während der beiden Reaktionsschritte ausgeschlossen.

In Abbildung 5.14 ist exemplarisch die Synthese von (2R)-21i aus der enantiomerenreinen

β-Hydroxy-α-aminosäure (2S)-12i gezeigt. Über zwei Stufen konnte das gewünschte Epoxid

in einer Ausbeute von 52% isoliert werden. Es konnte sogar eine Anreicherung des

Überschussisomers (2R,3R)-21i auf d.r. 95:5 (syn/anti) beobachtet werden.


93


Die gezeigte Syntheseroute bietet einen einfachen Zugang zu enantiomerenreinen Epoxiden

(2R)-21i. Ausgehend von der im 100 mL-Maßstab enzymatisch leicht herzustellenden

β-Hydroxy-α-aminosäure (2S)-12i (Abschnitt 4.4.8.4) konnte das Epoxid (2R)-21i über zwei

Stufen in einer Gesamtausbeute von 52% isoliert werden. Außerdem wurde eine

Anreicherung des Überschussisomers (2R,3R)-21i erzielt.

ZUSAMMENFASSUNG

94

6. Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Verbesserung von Syntheserouten zur Herstellung

pharmazeutisch relevanter Bausteine im Hinblick auf einen umweltfreundlichen, effizienten

und industriell anwendbaren Prozess. Die Konzepte sollten jeweils C-C-Bindungsknüpfungen

mittels Aldolreaktionen beinhalten und unter Verwendung verschiedener Biokatalysatoren

durchgeführt werden, wie beispielsweise Aldolasen und Alkoholdehydrogenasen.

Synthese von 1,3-Diolen 1780

Zur Synthese von 1,3-Diolen 17 wurden zuerst β-Hydroxyketone 5 mittels organo-

katalytischer Aldolreaktion enantioselektiv hergestellt und anschließend mit Hilfe von zwei

unterschiedlich selektiven Alkoholdehydrogenasen (ADHs) reduziert.

Cl

O

H

O

Cl

OH O

Cl

OH O

(R)-5f95% Umsatz58% Ausbeute

82% ee

(S)-5f90% Umsatz71% Ausbeute

83% ee

Cl

OH OH

Cl

OH OH

Cl

OH OH

Cl

OH OH

NAD+,

i-PrOH

(1R,3S)-17f>95% Umsatz

d.r. 10:1 (anti/syn)>99% ee;


(1R,3R)-17f>95% Umsatz

d.r. 11:1 (syn/anti)>99% ee;

59% Ausbeuted.r. >25:1 (syn/anti)

(1S,3S)-17f>95% Umsatz

d.r. 11:1 (syn/anti)>99% ee;

71% Ausbeute>25:1 (syn/anti)

(1S,3R)-17f>95% Umsatz

d.r. 10:1 (anti/syn)>99% ee;


NHNH

OOH

Ph Ph

NHNH

OOH

Ph Ph

RT

RT

+

(S,S)-32

(R,R)-32

NADP+,

i-PrOH1f

4

(S)-ADH,

(R)-ADH,

NAD+,

i-PrOH

(S)-ADH,

NADP+,

i-PrOH

(R)-ADH,

Abbildung 6.1. Synthese aller vier Stereoisomere von 17f

ZUSAMMENFASSUNG

95

Durch dieses Konzept können die entsprechenden Stereozentren selektiv aufgebaut werden

und alle vier möglichen Stereoisomere mit der gleichen Methode synthetisiert werden. Die

Ergebnisse der sequentiellen Synthese der 1,3-Diole 17f, bei der die organokatalytische

Aldolreaktion mit einem Überschuss von Aceton (4) durchgeführt wurde, sind in Abbildung

6.1 dargestellt. Über zwei Schritte konnten die jeweiligen 1,3-Diole 17f in einer

Gesamtausbeute von 34-50% enantiomerenrein isoliert werden.

Des Weiteren wurde die Organokatalyse in wässrigem Medium mit Substrat 1f durchgeführt.

Es wurden deutlich höhere Enantiomerenüberschüsse von 92% ee (82% ee in organischem

Medium) in diesem Lösungsmittel bei einem Umsatz von 90% erhalten. Die

organokatalytische Aldolreaktion in wässrigem Medium wurde außerdem in einer

Eintopfreaktion mit der enzymatischen Reduktion kombiniert. Auf diesem Weg wurde unter

anderem (1R,3S)-17f in einem sehr guten Diastereomerenverhältnis (d.r. >25:1 anti/syn)

erhalten und konnte in einer Ausbeute von 73% isoliert werden (Abbildung 6.2).

Abbildung 6.2. Eintopfsynthese von (1R,3S)-17f

Diese Syntheseroute, bei der die beiden Stereozentren sequentiell aufgebaut werden, ist ein

effizientes Verfahren zur enantiomerenreinen Synthese von 1,3-Diolen 17. Prinzipiell können

alle vier möglichen Enantiomere über die gezeigte Eintopfreaktion hochselektiv und in hoher

Ausbeute hergestellt werden.

Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren 12115

Die enantionselektive Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren wurde mit Hilfe einer zur

Verfügung stehenden L-Threoninaldolase (L-TA) aus E. coli durchgeführt und genau

analysiert, sowie anschließend optimiert. Nach Etablierung zweier Methoden zur

Umsatzbestimmung wurde der Einfluss der verschiedenen Reaktionsparameter untersucht.

Die Abhängigkeit des Umsatzes und des Diastereomerenverhältnisses von der Reaktionszeit,

ZUSAMMENFASSUNG

96

sowie der Enzymmenge wurde ebenfalls analysiert. Durch Variation des

Konzentrationsverhältnisses der Edukte zueinander wurde die Notwendigkeit des hohen

Überschusses an Glycin (11) gezeigt. Die Substratkonzentration des Aldehyds konnte ohne

größere Umsatzeinbußen von 0.1 M auf 0.25 M erhöht werden. Die optimierte

Standardreaktion ist in Abbildung 6.3 dargestellt.

Abbildung 6.3. Optimierte Standardreaktion

Zur Erweiterung der Substratbreite wurden verschieden substituierte Benzaldehyde

eingesetzt und der Einfluss des Substitutionsmusters auf Umsatz und Diastereomeren-

verhältnis untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass o-substituierte Benzaldehyde vor allem

in Hinblick auf die Diastereoselektivität (d.r. >70:30 syn/anti) die besten Ergebnisse lieferten.

Als vielversprechendstes Substrat erwies sich o-Chlorbenzaldehyd (1i). Die entsprechende

β-Hydroxy-α-aminosäure (2S)-12i wurde mit einem Diastereomerenverhältnis von d.r. 80:20

(syn/anti) bei einem Umsatz von 90% erhalten. Mit diesem Substrat wurde eine Optimierung

der Reaktion durchgeführt, wodurch ein vollständiger Umsatz, bei geringerer Enzymmenge

erzielt werden konnte (Abbildung 6.4).

Abbildung 6.4. Optimierte enzymatische Reaktion mit 1i als Substrat

Unter diesen Bedingungen wurde anschließend die Reaktion in größerem Labormaßstab (bis

zu 100 mL) durchgeführt und (2S)-12i isoliert. Verschiedene Versuche zur Trennung der

Diastereomere schlugen fehl. Zur enantio- und diastereomerenreinen Synthese von 12i

ZUSAMMENFASSUNG

97

wurde deshalb eine Racematspaltung durchgeführt. Allerdings konnte nur eine geringe

Ausbeute (10%) bei niedriger Substratkonzentration (0.05 M) erhalten werden. Somit stellt

dieses Verfahren keine Alternative zur synthetischen Route dar. Bei dieser konnte durch

Fällung das reine Produkt als Diastereomerengemisch (d.r. 78:22 syn/anti) in einer Ausbeute

von 62% (3.3 g) erhalten werden (Abbildung 6.5). Somit konnte ein Prozess mit hoher

volumetrischer Produktivität etabliert werden.

Abbildung 6.5. Optimierte Reaktion in 100 mL-Maßstab

Synthese von Epoxiden 21

Ausgehend von der enantiomerenreinen β-Hydroxy-α-aminosäure (2S)-12i aus der

enzymatischen Synthese wurde das Epoxid (2R)-21i in nur zwei Schritten synthetisiert.

Zunächst wurde das Halohydrin 20i durch Substitution der Aminogruppe durch Chlor mit

einem Umsatz von 70% hergestellt. Der Ringschluss erfolgte ohne Isolierung von 20i mit tert-

Butanolat als Base. Bei der Synthese von (2R)-21i konnte eine Gesamtausbeute von 52%

erzielt werden. Außerdem wurde eine Anreicherung des Diastereomerenverhältnisses von

d.r. 78:22 auf d.r. 95:5 (syn/anti) beobachtet (Abbildung 6.6).

Eine Analyse der Konfiguration mittels 1H-NOESY-Spektroskopie zeigte, dass sich aus

rac-syn-12i das syn-Epoxid (2R,3R)-21i bzw. (2S,3S)-21i bildet. Eine Racemisierung der

enantiomerenreinen Ausgangsverbindung (2S)-12i während der zwei Reaktionsschritte

wurde mittels chiraler HPLC ausgeschlossen. Es konnte somit eine einfache Synthese von

enantiomerenreinen Epoxiden (2R)-21i gezeigt werden. Ausgehend von der im

100 mL-Maßstab enzymatisch einfach herzustellenden β-Hydroxy-α-aminosäure (2S)-12i

ZUSAMMENFASSUNG

98

konnte über zwei Stufen das gewünschte Epoxid (2R)-21i mit einer Gesamtausbeute von

52% erhalten werden.


Insgesamt konnten verschiedene effiziente Synthesemethoden zur Herstellung

pharmazeutisch relevanter Verbindungen 12, 17 und 21 etabliert werden. 1,3-Diole 17f

konnten in einer wässrigen Eintopfsynthese hochselektiv in sehr guter Ausbeute hergestellt

werden. Bei der Synthese von β-Hydroxy-α-aminosäuren 12 gelang die Entwicklung eines

Prozesses mit hoher volumetrischer Produktivität. Es konnte ebenfalls eine Folgechemie der

enantiomerenreinen Verbindung (2S)-12i zu Epoxiden (2R)-21i gezeigt werden.

SUMMARY

99

7. Summary

The aim of this thesis was the development and improvement of synthetic routes for the

production of pharmaceutical compounds with regard to an environmentally compatible,

efficient and industrial applicable process. The concept included C-C bond formations based

on aldol reactions and different types of biocatalysts, like aldolases and alcohol

dehydrogenases.

Synthesis of 1,3-diols 17137

For the synthesis of 1,3-diols 17 as a first step β-hydroxyketones 5 were produced

enantioselectively via an organocatalytic aldol reaction, followed by reduction of the

carbonyl group applying two different selective alcohol dehydrogenases (ADH) (Scheme 7.1).

Scheme 7.1. Synthesis of all possible stereoisomers of 17f

SUMMARY

100

By means of this concept, the stereogenic centers were formed selectively and furthermore

the synthesis of all four possible isomers was feasible using the same synthetic route.

Scheme 6.1 depicts the results of the sequential forming of 1,3-diols 17f. At this the

organocatalytic aldol reaction was carried out in an excess of acetone (4). After two reaction

steps, the 1,3-diols 17f were isolated in an enantiomerically pure form with an overall yield

of 34-50%.

Moreover, the organocatalytic aldol reaction was carried out in water instead of acetone

applying substrate 1f. Thereby, a considerable higher enantiomeric excess of 92% (82% ee in

organic solvent) in combination with a conversion of 90% was yielded. Due to these

improvements the organocatalytic aldol reaction in aqueous medium was combined with

the enzymatic reduction in an one-pot process. Thus, (1R,3S)-17f amongst others was

achieved with a very high diastereomeric ratio (d.r. >1:25 syn/anti) and a yield of 73%

(Scheme 7.2).

Scheme 7.2. One-pot synthesis of (1R,3S)-17f

This synthetic route, containing a sequential forming of the two stereogenic centers,

demonstrates an efficient process for the synthesis of enantiomerically pure 1,3-diols. It is

feasible to produce all four possible isomers with an aforementioned excellent

enantioselectivity and a high yield, using the shown one-pot process.

Synthesis of β-hydroxy-α-amino acids 12138

The enantioselective synthesis of β-hydroxy-α-amino acids was carried out by means of an

available L-threonin aldolase (L-TA) from E. coli. An explicit analysis of the process and

optimization was carried out. Afterwards the conversion and diastereomeric ratio according

to reaction time and amount of used biocatalyst were investigated. The necessity of the high

excess of glycin (11, 10 eq.) was proofed by variation of the ratio of substrate concentration

SUMMARY

101

(11:1e). The concentration of aldehyde 1 could be easily raised from 0.1 M to 0.25 M

without appreciable loss of conversion. The optimized standard reaction is depicted in

Scheme 7.3.

Scheme 7.3. Optimized standard reaction

The substrate range was expanded by using different substituted benzaldehydes 1.

Furthermore, the possible influence of the substitution pattern was analyzed. Best results

related to diastereoselectivity were found by using o-substituted benzaldehydes (d.r. >70:30

syn/anti). In particular, o-chlorobenzaldehyde (1i) revealed to be the most promising

substrate, achieving the β-hydroxy-α-amino acid (2S)-12i in a diastereomeric ratio of

d.r. 80:20 (syn/anti) and a conversion of 90%. Employing this substrate a further

optimization of the reaction process was carried out, whereby the attaching of lower

amount of biocatalyst (44 U/mmol) and a lower excess of glycine (8 eq.) was found to lead to

a complete conversion (Scheme 7.4).

Scheme 7.4. Optimized enzymatic reaction using 1i as a substrate

Increasing the scale to 100 mL by usage of the same reaction conditions product (2S)-12i

could be isolated. Different experiments were conducted for separating the diasteromers,

leading to no realization. Therefore a resolution was used to synthesize 12i diastereo- and

enantiopure. However, the desired product was isolated in a low yield of 10% applying a

meanly substrate concentration (0.05 M). Due to this fact, this procedure offers no practical

SUMMARY

102

alternative compared to the synthetic route. At this, the pure product in a diastereomeric

ratio of d.r. 78:22 (syn/anti) was achieved in an isolated yield of 62% (3.3 g) by precipitation

(Scheme 7.5). Therefore, a process including a high volumetric productivity was established.

Scheme 7.5. Optimized reaction with a reaction volume of 100 mL

Synthesis of epoxides 21

Based on the aforementioned enzymatically formed enantiomerically β-hydroxy-α-amino

acid (2S)-12i epoxides 21i were synthesized in two steps. The first step included the

formation of a halohydrin compound by substitution of the amino group, receiving 20i in a

conversion of 70%. The ring closing took place without isolation of 20i using tert-butanolate

as a base. The desired product (2R)-21i was achieved in an overall yield of 52%. In addition

an enrichment of the diastereomeric ratio from d.r. 78:22 to 95:5 (syn/anti) was found

(Scheme 7.6). Furthermore, the configuration of the epoxide 21i was analyzed by 1H-NOESY-

spectroscopy. It was established that rac-syn-12i was converted to the syn-epoxide

(2R,3R)-21i and (2S,3S)-21i, respectively. A racemisation of the starting compound (2S)-12i

during two reaction steps could be excluded by chiral HPLC. Therefore, a simple synthesis of

enantiopure epoxides 21 was shown. Based on the enzymatic production of the β-hydroxy-

α-amino acid (2S)-12i in a 100 mL-scale, the desired epoxide (2R)-21i was received in an

overall yield of 52% using two reaction steps.

SUMMARY

103

Scheme 7.6. Synthesis of (2R)-21i

Taken altogether, different efficient synthetic routes for the preparation of building blocks

for pharmaceutical compounds 17, 12 and 21 were displayed. 1,3-diols 17f were produced

high enantioselectively and in very good yields in an aqueous one-pot process. The

development of a process for the formation of β-hydroxy-α-amino acids 12i with high

volumetric productivity was realized. Furthermore, the reaction of the enantiomerically

compound 12i to epoxides (2R)-21i was demonstrated.

EXPERIMENTELLER TEIL

104

8. Experimenteller Teil

8.1 Verwendete Chemikalien und Geräte

Chemikalien:

Die für diese Doktorarbeit verwendeten käuflichen Chemikalien wurden von Acros

Organics®, Sigma-Aldrich®, ABCR®, Fisher Scientific® oder Fluka® bezogen und ohne weitere

Reinigung eingesetzt. Das Lösungsmittel MTBE wurde als Hochschulspende von der Evonik

Degussa GmbH zur Verfügung gestellt. Alle verwendeten Lösungsmittel, außer MTBE,

wurden vor Gebrauch am Rotationsverdampfer destilliert.

Enzyme:

Die verwendeten Enzyme wurden im Rahmen folgender Zusammenarbeiten erhalten:

Alkoholdehydrogenasen aus Lactobacillus kefir (LK-ADH) [W. Hummel, M.-R. Kula (FZ Jülich

GmbH), EP 456107; 1991. A. Weckbecker, W. Hummel, Biocat. Biotrans. 2006, 24, 380-389.]

und Rhodococcus sp. (Rsp-ADH) wurden im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. W. Hummel

(Universität Düsseldorf, Institut für molekulare Enzymtechnologie, Forschungszentrum

Jülich) entwickelt und für diese Arbeit zur Verfügung gestellt. Diese ADHs sind ebenfalls

käuflich erwerbbar bei evocatal GmbH.

Die Cofaktoren NAD(P)H und NAD(P)+ wurden von Oriental Yeast Co. Ltd. bezogen.

Die L-Threoninaldolase aus E. coli wurde zu Beginn der Arbeit von Prof. Dr. W. Hummel,

(Universität Düsseldorf, Institut für molekulare Enzymtechnologie, Forschungszentrum

Jülich) und später in größeren Mengen von evocatal GmbH zur Verfügung gestellt. Es wurde

die vom Hersteller angegeben Aktiviät zur Berechnung der Enzymmenge herangezogen.

Dünnschichtchromatographie (DC):

Es wurden DC-Platten mit Kieselgel 60 F254 auf Aluminiumträgerfolie von Merck® verwendet.

Zum Nachweis der Substanzzonen diente die Fluoreszenzlöschung bei 254 nm Wellenlänge.

Säulenchromatographie:

Die säulenchromatographische Reinigung wurde mit SiO2 als stationärer Phase durchgeführt,

dafür wurde Merck® Silikagel 60 (0.04-0.063 nm) der Firma ICN Biomedicals GmbH

verwendet.


105

NMR-Spektroskopie:

Die Spektren wurden auf einem JEOL JNM GX 400, JEOL JNM EX 400 oder Bruker Avance 300

oder 400 NMR-Spektrometer aufgenommen. Alle Spektren wurden bei Raumtemperatur

gemessen. Die chemischen Verschiebungen der 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren sind in ppm

angegeben. Spinmultiplizitäten werden als s (Singulett), d (Dublett), dd (dupliziertes

Dublett), t (Triplett), q (Quartett) und m (Multiplett) angegeben. Die erhaltenen Daten

wurden mit der Software Delta (4.3.6) bearbeitet.

Massenspektrometrie (FAB-MS, EI-MS, MALDI):

Die Massenspektrometrie wurde am Micromass Zabspec-Spektrometer im FAB-Modus mit

m-Nitrobenzylalkohol (NBA) als Matrix, am Finnigan MAT 95 XP-Spektrometer im EI-Modus

der Firma Thermo Electron Corporation® oder am Biotech Axima Confidence Gerät der Firma

Shimadzu im MALDI-Modus mit Sinapinsäure (sin) und 2,5-Dihydroxybenzoesäure (dhb) als

Matrix gemessen.

IR-Spektroskopie (IR):

Die Infrarotspektren wurden mit einem ASI React IR®-1000-Spektrometer bzw. mit einem

Nicolet IR 100 FT-IR Spektrometer der Firma Thermo Scientific® aufgenommen. Die

Absorption wird in Wellenzahl ṽ [cm-1] angegeben.

Elementaranalyse (EA):

Die Elementaranalyse wurde am Gerät EA 1119 CHNS, CE Instruments durchgeführt.

Schmelzpunkt:

Die Schmelzpunktbestimmung wurde an einem Schmelzpunktbestimmer Appendix B IA 9100

der Firma Electrothermal durchgeführt.

Drehwertmessung:

Die Drehwertbestimmung wurde an einem Polarimeter, Model 341 der Firma Perkin Elmer

mit einer Na-Lampe (λ = 589 nm) durchgeführt.


106

UV/Vis-Spektroskopie:

Die UV/Vis-spektroskopischen Messungen wurden an einem SPEKOL® 1300 UV/Vis-

Spektrophotometer der Firma analytikjena durchgeführt und mit dem Programm

WinASPECT 2.2.6.0 (mit Zuhilfenahme des Moduls „Kinetik Programms“) bearbeitet.

HPLC:

Die Spektren wurden mit einem LC-Net II/ADC Gerät und Pumpen (PU-1587 Intelligent Prep.

Pump und PU 987 Intelligent Prep. Pump) der Firma JASCO oder mit einem Gerät CBM-10A

und Pumpe (LC-10AT Liquid Chromatograph) der Firma Shimadzu aufgenommen. Die

Trennungen erfolgten an den Säulen Daicel Chiralpak® AD-H bzw. Daicel Chiralcel® OJ-H.


107

8.2 Synthesen und spektroskopische Daten

8.2.1 Kombination von organokatalytischer Aldolreaktion und enzymatischer

Reduktion

8.2.1.1 Synthese von (S)-1-(4-Chlorphenyl)-1-hydroxybutan-3-on (S)-5f mittels

organokatalytischer Aldolreaktion

p-Chlorbenzaldehyd (1f, 2 mmol, 282 mg) und 5 mol% Organo-

katalysator (R,R)-32 (0.1 mmol, 39 mg) wurden in Aceton (4, 8 mmol,

588 µL) gelöst und 16 h gerührt. Nach Ablauf der Reaktionszeit

wurde 1 mL NaCl-Lösung zugegeben und dreimal mit EtOAc

(3 x 5 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden

über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach

säulenchromatrographischer Aufarbeitung (Hexan/EtOAc 5:1 (v/v), RF = 0.08) wurde das

gewünschte Produkt (S)-5f als gelbliches Öl in einer Ausbeute von 71% (Auswaage 282 mg)

und einer Enantioselektivität von 83% ee erhalten (AD-H, Eluent: Hexan/i-PrOH 95:5, flow

0.8 mL/min, 220 nm; tr(R) = 16.77 min, tr(S) = 18.39 min). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm)

= 2.17 (s, 3H, CH3), 2.79 (m, 2H, CH2), 3.40 (br s, 1H, OH), 5.09 (dd, 1H, 3J = 8.3 Hz, 3.9 Hz,

CH), 7.25-7.30 (m, 4H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der

Literatur angegebenen Daten überein.139

8.2.1.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 (AAV 1): Isolierung der vier Isomere aus

der enzymatischen Reduktion

Abbildung 8.1. Enzymatische Reduktion der β-Hydroxyketone 5f

Das isolierte Aldolprodukt 5f (0.5 mmol) wurde in iso-Propanol (2.5 mL) gelöst. Anschließend

wurde Phosphatpuffer (pH 7, 50 mM, 0.1 M, 7.5 mL), MgCl2 (1 mM, nur bei Verwendung der

Cl

OHO

(S)-5fC10H11ClO2

M = 198.56 g/mol


108

(R)-ADH aus Lactobacillus kefir), NAD(P)+ (0.02 mmol) und die entsprechende

Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus sp. oder Lactobacillus kefir (40-100 U/mmol)

zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 18-67 h bei RT gerührt. Anschließend wurde mit

EtOAc extrahiert (3 x 25 mL) und die vereinigten organischen Phasen über MgSO4

getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde das Rohprodukt 17f

mittels Säulenchromatographie (Hexan/EtOAc 4:1, v/v) gereinigt und das gewünschte

Produkt erhalten.

8.2.1.2.1 Synthese von (1S,3R)-1-(4-Chlorphenyl)-1,3-butandiol (1S,3R)-17f

Die Synthese von (1S,3R)-17f wurde analog AAV 1 durchgeführt. Es

wurde (S)-5f (0.5 mmol, 99 mg) und die (R)-selektive ADH aus

Lactobacillus kefir (150 µL, 100 U/mmol), sowie der Cofaktor NADP+

(0.02 mmol, 15 mg) eingesetzt. Es wurde ein Umsatz von >95%, ein

Diastereomerenverhältnis von d.r. 10:1 (anti/syn) und eine

Enantioselektivität von >99% ee erhalten. Nach säulenchromatographischer Reinigung

(Hexan/EtOAc 4:1 (v/v), RF = 0.09) wurde das gewünschte Produkt (1S,3R)-17f als farbloses

Öl mit einer Ausbeute von 55% (Auswaage 55 mg) isoliert. AD-H-Säule, Eluent: Hexan/i-PrOH

97:3, flow 0.8 mL/min, 220 nm; tr = 46.51 min; [a]�� = -68 (c 0.5, CH2Cl2); 1H-NMR (400 MHz,

CDCl3) δ (ppm) = 1.23 (d, 3H, 3J = 6.1 Hz, CH3), 1.81-1.86 (m, 2H, CH2), 2.17 (s, 1H, OH), 3.15

(s, 1H, OH), 4.00-4.08 (m, 1H, CHCH3), 5.02 (dd, 1H, 3J = 7.3 Hz, 3.9 Hz, CHCH2), 7.26-7.31 (m,

4H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 23.63 (CH3), 46.02 (CH2), 65.49

(CHCH3), 71.17 (CHCH2), 126.97, 128.56, 132.97, 143.01 (C-aromat.); MS (FAB) m/z = 183

(M-H2O)+; IR ṽ (cm-1): 3366, 3300, 2988, 2961, 2926, 2856, 1486, 1444, 1401, 1374, 830, 807;

Elementaranalyse (C10H13ClO2): Berechnet: C: 59.86, H: 6.53; Gefunden: C: 59.03, H: 6.51.

8.2.1.2.2 Synthese von (1R,3R)-1-(4-Chlorphenyl)-1,3-butandiol (1R,3R)-17f

Die Synthese von (1R,3R)-17f wurde analog AAV 1 durchgeführt. Es

wurde (R)-5f (0.5 mmol, 99 mg) und die (R)-selektive ADH aus

Lactobacillus kefir (150 µL, 100 U/mmol), sowie der Cofaktor NADP+



109

Diastereomerenverhältnis von d.r. 11:1 (syn/anti) und eine Enantioselektivität von >99% ee

erhalten. Nach säulenchromatographischer Reinigung (Hexan/EtOAc 4:1 (v/v), RF = 0.11)

wurde das gewünschte Produkt (1R,3R)-17f als farbloses Öl mit einer Ausbeute von 59%

(Auswaage 59 mg) isoliert. AD-H-Säule, Eluent: Hexan/i-PrOH 97:3, flow 0.8 mL/min, 220 nm;

tr = 35.71 min; [a]�� = +40 (c 0.5, CH2Cl2); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1.20 (d, 3H,

3J = 6.1 Hz, CH3), 1.66-1.81 (m, 2H, CH2), 2.95 (s, 1H, OH), 3.66 (s, 1H, OH), 4.07-4.15 (m, 1H,

CHCH3), 4.88 (dd, 1H, 3J = 10.0 Hz, 3.2 Hz, CHCH2), 7.25-7.30 (m, 4H, H-aromat.); 13C-NMR

(100 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 24.17 (CH3), 47.01 (CH2), 68.82 (CHCH3), 74.47 (CHCH2), 127.03,

128.56, 133.15, 142.95 (C-aromat.); MS (FAB) m/z = 183 (M-H2O)+; IR ṽ (cm-1): 3293, 3223,

2980, 2937, 2914, 2853, 1486, 1451, 1409, 1366, 849, 826; Elementaranalyse (C10H13ClO2):

Berechnet: C: 59.86, H: 6.53; Gefunden: C: 59.25, H: 6.70.

8.2.1.2.3 Synthese von (1S,3S)-1-(4-Chlorphenyl)-1,3-butandiol (1S,3S)-17f

Die Synthese von (1S,3S)-17f wurde analog AAV 1 durchgeführt. Es

wurde (S)-5f (0.5 mmol, 99 mg) und die (S)-selektive ADH aus

Rhodococcus sp. (50 µL, 40 U/mmol), sowie der Cofaktor NAD+


Diastereomerenverhältnis von d.r. 11:1 (syn/anti) und eine


(Hexan/EtOAc 4:1 (v/v), RF = 0.11) wurde das gewünschte Produkt (1S,3S)-17f als farbloses Öl

mit einer Ausbeute von 71% (Auswaage 71 mg) isoliert. AD-H-Säule, Eluent: Hexan/i-PrOH

97:3, flow 0.8 mL/min, 220 nm; tr = 38.73 min; [a]�� = −40 (c 0.5, CH2Cl2); 1H-NMR (400 MHz,



4H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des (1R,3R)-Stereoisomers

(vgl. 8.2.1.2.2) überein.


110

8.2.1.2.4 Synthese von (1R,3S)-1-(4-Chlorphenyl)-1,3-butandiol (1R,3S)-17f

Die Synthese von (1R,3S)-17f wurde analog AAV 1 durchgeführt. Es

wurde (R)-5f (0.5 mmol, 99 mg) und die (S)-selektive ADH aus

Rhodococcus sp. (50 µL, 40 U/mmol), sowie der Cofaktor NAD+


Diastereomerenverhältnis von d.r. 10:1 (anti/syn) und eine


(Hexan/EtOAc 4:1 (v/v), RF = 0.09) wurde das gewünschte Produkt (1R,3S)-17f als farbloses

Öl mit einer Ausbeute von 66% (Auswaage 66 mg) isoliert. AD-H-Säule, Eluent: Hexan/i-PrOH

97:3, flow 0.8 mL/min, 220 nm; tr = 43.47 min; [a]�� = +68 (c 0.5, CH2Cl2); 1H-NMR (400 MHz,



4H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des (1S,3R)-Stereoisomers

(vgl. 8.2.1.2.1) überein.

8.2.1.3 Organokatalytische Aldolreaktion in wässrigem Medium

p-Chlorbenzaldehyd (1f, 0.5 mmol, 70 mg) und die entsprechende

Menge Organokatalysator (S,S)-32 (0.5-1 mol%) wurden in Aceton (4,

4.5 mmol, 330 µL) gelöst. Nach Zugabe von gesättigter NaCl-Lösung

(330 µL) wurde das Reaktionsgemisch gerührt. Nach Ablauf der

Reaktionszeit wurde mit CH2Cl2 (3 x 5 mL) extrahiert, die vereinigten

organischen Phasen über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das

Rohprodukt wurde als rötliches Öl erhalten. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 2.17 (s, 3H,

CH3), 2.79 (m, 2H, CH2), 3.40 (br s, 1H, OH), 5.09 (dd, 1H, 3J = 8.3 Hz, 3.9 Hz, CH), 7.25-7.30

(m, 4H, H-aromat.). ee-Wertbestimmung mittels HPLC: AD-H-Säule, Eluent: Hexan/i-PrOH

95:5, flow 0.8 mL/min, 220 nm; tr(R) = 16.77 min, tr(S) = 18.39 min. Die spektroskopischen

Daten stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten überein.139 Die Ergebnisse der

Reaktionsoptimierung sind in Tabelle 8.1 dargestellt.

Cl

OHOH

(1R,3S)-17fC10H13ClO2

M = 200.66 g/mol

Cl

OHO

(R)-5fC10H11ClO2

M = 198.56 g/mol


111

Tabelle 8.1. Optimierung der organokatalytischen Aldolreaktion

Eintrag c(32) [mol%] t [h] Umsatz [%]1) ee [%]2)

1 0.5 24 58 (P), 39 (A), 1 (K), 1 (D) n.b.

2 0.5 32 61 (P), 36 (A), 2 (K),1 (D) 95

3 0.5 48 70 (P), 26 (A), 2 (K), 2 (D) 95

4 1 24 82 (P), 14 (A), 2 (K), 2 (D) 92

5 1 48 90 (P), 6(A), 2 (K), 2 (D) 92

1) (P): Produkt 5f, (A): Aldehyd 1f, (K): Kondensationsprodukt, (D): Dimer;


8.2.1.4 Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 (AAV 2): Eintopfreaktion

Abbildung 8.2. Eintopfreaktion

p-Chlorbenzaldehyd (1f, 0.5 mmol) und der Organokatalysator (S,S)-32 (1 mol%) wurden in

Aceton (4, 4.5 mmol) gelöst. Nach Zugabe von gesättigter NaCl-Lösung (330 µL) wurde das

Reaktionsgemisch 48 h gerührt. Anschließend wurde Phosphatpuffer (pH 7, 50 mM, 0.1 M,

7.5 mL), iso-Propanol (2.5 mL), MgCl2 (1 mM, nur bei Verwendung der (R)-ADH aus

Lactobacillus kefir), Cofaktor NAD+ oder NADP+ (0.02 mmol) und die entsprechende

Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus sp. oder Lactobacillus kefir (10-960 U/mmol)

zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24-48 h gerührt und anschließend mit

Dichlormethan (3 x 5 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über

MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer (max. 600 mbar)

entfernt. Anschließend wurden der Umsatz und das Diastereomerenverhältnis mittels

1H-NMR-Spektroskopie und der ee-Wert mittels chiraler HPLC bestimmt. Das Rohprodukt

wurde säulenchromatographisch gereinigt (Hexan/EtOAc 4:1, v/v) und das gewünschte

Produkt erhalten.


112

8.2.1.4.1 Synthese von (1R,3R)-1-(4-Chlorphenyl)-1,3-butandiol (1R,3R)-17f

Die Synthese von (1R,3R)-17f erfolgte analog AAV 2. Es wurde 1f

(0.5 mmol, 70 mg) und (S,S)-32 (1 mol%, 5 µmol, 2 mg) in 4 gelöst

(4.5 mmol, 330 µL). Nach Zugabe von 330 µL NaCl-Lösung wurde

48 h gerührt. Für die Enzymreaktion wurde Puffer (7.5 mL), i-PrOH

(2.5 mL), die (R)-selektive ADH aus Lactobacillus kefir (600 µL,

960 U/mmol), sowie der Cofaktor NADP+ (0.02 mmol, 15 mg) zugegeben und 48 h gerührt.

Der produktbezogene Umsatz betrug 67%, das Diastereomerenverhältnis d.r. >25:1

(syn/anti). Nach säulenchromatographischer Reinigung (Hexan/EtOAc 4:1, v/v, RF = 0.11)

wurde das gewünschte Produkt (1R,3R)-17f als gelbliches Öl mit einer Ausbeute von 58%

(Auswaage 58 mg) und einer Enantioselektivität von >99% ee erhalten (AD-H, Eluent:

Hexan/i-PrOH 97:3, flow 0.8 mL/min, 220 nm; tr = 35.71 min). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ

(ppm) = 1.23 (d, 3H, 3J = 8.0 Hz, CH3), 1.71-1.77 (m, 2H, CH2), 4.08-4.16 (m, 1H, CHCH3), 4.90

(dd, 1H, 3J = 9.7 Hz, 3.4 Hz, CHCH2), 7.25-7.32 (m, 4H, H-aromat.). Die spektroskopischen

Daten stimmen mit denen aus Abschnitt 8.2.1.2.2 überein.

8.2.1.4.2 Synthese von (1R,3S)-1-(4-Chlorphenyl)-1,3-butandiol (1R,3S)-17f

Die Synthese von (1R,3S)-5f erfolgte analog AAV2. Es wurde 1f

(0.5 mmol, 70 mg) und (S,S)-32 (1 mol%, 5 µmol, 2 mg) in 4 gelöst

(4.5 mmol, 330 µL). Nach Zugabe von 330 µL NaCl-Lösung wurde

48 h gerührt. Für die Enzymreaktion wurde Puffer (7.5 mL), i-PrOH

(2.5 mL), und die (S)-selektive ADH aus Rhodococcus sp. (150 µL,

10 U/mmol), sowie der Cofaktor NAD+ (0.02 mmol, 13 mg) eingesetzt und 24 h gerührt. Der

produktbezogene Umsatz betrug 79%, das Diastereomerenverhältnis d.r. >25:1 (anti/syn).

Nach säulenchromatographischer Reinigung (Hexan/EtOAc 4:1, v/v, RF = 0.09) wurde das

gewünschte Produkt (1R,3S)-7f als gelbliches Öl mit einer Ausbeute von 73% (Auswaage

73 mg) und einer Enantioselektivität von >99% ee erhalten (AD-H-Säule, Eluent: Hexan/i-

PrOH 97:3, flow 0.8 mL/min, 220 nm; tr = 43.47 min). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm) =

1.18 (d, 3H, 3J = 6.3 Hz, CH3), 1.68-1.83 (m, 2H, CH2), 3.96-4.11 (m, 1H, CHCH3), 4.95 (dd, 1H,

3J = 6.9 Hz, 4,0 Hz, CHCH2), 7.21-7.28 (m, 4H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten

stimmen mit denen aus Abschnitt 8.2.1.2.4 überein.

Cl

OHOH

(1R,3S)-17fC10H13ClO2

M = 200.66 g/mol


113

8.2.2 Enzymatische Aldolreaktion

8.2.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 (AAV 3): Synthese der racemischen

β-Hydroxy-α-aminosäuren116

Abbildung 8.3. Racematsynthese der β-Hydroxy-α-aminosäuren 12

Glycin (11, 6.7 mol) wurde in 5 M NaOH (2.5-10 mL) gelöst, anschließend wurde der

entsprechende Aldehyd 1 (6.7-13.4 mmol) langsam zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde

so lange bei 0-35°C gerührt bis sich ein Feststoff bildete. Anschließend wurde 5 M HCl

zugegeben bis pH 1 erreicht wurde. Nachdem sich der Feststoff gelöst hatte, wurde die

wässrige Phase mit CH2Cl2 (2 x 50 mL) extrahiert, um den überschüssigen Aldehyden zu

entfernen. Die wässrige Phase wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der pH-Wert

mit 1 M NaOH so weit erhöht bis sich ein Niederschlag bildete (pH 7-8). Zur

Vervollständigung der Kristallisation wurde die Mischung über Nacht bei 4°C gelagert. Der

entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Gegebenenfalls

wurde durch erneutes einengen wiederholt ausgefällt.

8.2.2.1.1 Synthese von rac-p-Methylthiophenylserin rac-12d

Die Synthese erfolgte analog AAV 3. Es wurden 6.7 mmol Glycin (11,

0.5 g), 6.7 mmol p-Methylthiobenzaldehyd (1d, 877 µL) und 5 mL

NaOH (5 M) eingesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 0°C für

26 h gerührt. Das gewünschte Produkt wurde als gelblicher Feststoff

mit einer Ausbeute von 26% (Auswaage 396 mg) und mit einem

Diastereomerenverhältnis von d.r. >25:1 (syn/anti) erhalten. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ

(ppm) = 2.48 (s, 3H, SCH3), 3.85 (d, 1H, 3J = 4.4 Hz, syn-CHNH2), 5.22 (d, 1H, 3J = 4.6 Hz, syn-

CHOH), 7.34-7.39 (m, 4H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, D2O) δ (ppm) = 14.83 (SCH3), 61.13

(CHNH2), 71.42 (CHOH), 126.88, 126.94, 136.59, 138.25 (C-aromat.), 172.43 (COOH); MS

OH

OOH

rac-12dC10H13NO3S

M = 227.28 g/mol

NH2MeS


114

(MALDI, Matrix: dhb) m/z = 228 (M-H)+. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in

der Literatur angegeben Daten überein.140

8.2.2.1.2 Synthese von rac-Phenylserin rac-12e


0.5 g), 13.4 mmol Benzaldehyd (1e, 1.35 µL) und 2.5 mL NaOH (5 M)

eingesetzt. Die Reaktion wurde bei 35°C für 48 h und bei 0°C für 4 h

durchgeführt. Das gewünschte Produkt wurde als farbloser Feststoff

erhalten. Die Reaktion bei 35°C ergab ausschließlich syn-12e in einer

Ausbeute von 40% (Auswaage 486 mg), wohingegen die Reaktion bei 0°C eine Mischung der

beiden Diastereomere von d.r. 56:44 (syn/anti) mit einer Ausbeute von 46% (Auswaage

558 mg) ergab. 1H-NMR (400 MHz, D2O): δ (ppm) = 3.91 (d, 1H, 3J = 4.4 Hz, syn-CHNH2), 4.08

(d, 1H, 3J = 4.2 Hz, anti-CHNH2), 5.30 (d, 1H, 3J = 4.4 Hz, syn-CHOH), 5.35 (d, 1H, 3J = 4.2 Hz,

anti-CHOH), 7.28-7.46 (m, 4H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, D2O) δ (ppm) = 60.43, 60.91

(CHNH2), 72.38, 72.59 (CHOH), 125.46, 126.05, 127.75, 127.99, 128.09, 128.25, 137.50,

139.32 (C-aromat.), 172.41, 174.41 (COOH). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den

in der Literatur angegebenen Daten überein.116,141

8.2.2.1.3 Synthese von rac-p-Chlorphenylserin rac-12f


0.5 g), 13.4 mmol p-Chlorbenzaldehyd (1f, 1.88 g) und 10 mL NaOH

(5 M) eingesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 0°C für 24 h

gerührt. Das gewünschte Produkt wurde als farbloser Feststoff mit

einer Ausbeute von 36% (Auswaage 520 mg) und mit einem

Diastereomerenverhältnis von d.r. 79:21 (syn/anti) erhalten. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ

(ppm) = 4.07 (d, 1H, 3J = 4.0 Hz, syn-CHNH2), 4.21 (d, 1H, 3J = 4.3 Hz, anti-CHNH2), 5.35 (d, 1H,

3J = 4.6 Hz, syn-CHOH), 5.38 (d, 1H, 3J = 4.6 Hz, anti-CHOH), 7.38-7.50 (m, 4H, H-aromat.);

13C-NMR (100 MHz, D2O) δ (ppm) = 60.09, (anti-CHNH2), 60.45 (syn-CHNH2), 70.77

(anti-CHOH), 70.86 (syn-CHOH), 127.84, 128.11, 129.08, 129.24, 134.08, 134.28, 136.05,

137.84 (C-aromat.), 170.63 (anti-COOH) 171.49 (syn-COOH); MS (MALDI, Matrix: dhb) m/z =

OH

OOH

rac-12eC9H11NO3

M = 181.19 g/mol

NH2


115

216 (M-H)+. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegebenen

Daten überein.109

8.2.2.1.4 Synthese von rac-o-Chlorphenylserin rac-12i


0.5 g), 13.4 mmol o-Chlorbenzaldehyd (1i, 1.5 mL) und 2.5 mL NaOH

(5 M) eingesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT für 1 h gerührt.

Das gewünschte Produkt wurde als farbloser Feststoff mit einer

Ausbeute von 38% (Auswaage 549 mg) und mit einem


(ppm) = 4.08-4.09 (m, 2H, CHNH2), 5.49 (d, 1H, 3J = 3.4 Hz, anti-CHOH), 5.67 (d, 1H, 3J =

3.7 Hz, syn-CHOH), 7.35-7.64 (m, 4H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, D2O) δ (ppm) = 58.00

(anti-CHNH2), 58.46 (syn-CHNH2), 68.51 (syn-CHOH), 68.98 (anti-CHOH), 127.46, 127.74,

127.90, 128.37, 129.65, 129.99, 130.19, 130.26, 131.53, 131.86, 136.54, 136.66 (C-aromat.),

170.93 (anti-COOH), 172.19 (syn-COOH); MS (MALDI, Matrix: sin) m/z = 216 (M-H)+. Die

spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten überein.109

Durch Umkristallisation in Wasserkonnte reines syn-Isomer in einer Ausbeute von 5%

(Auswaage 72 mg) erhalten werde. Durch wiederholtes Einengen der Lösung wurde reines

anti-Isomer in einer Ausbeute von 1% (Auswaage 14 mg) erhalten. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ

(ppm) = 4.08 (d, 1H, 3J = 3.6 Hz, syn-CHNH2), 5.66 (d, 1H, 3J = 3.6 Hz, syn-CHOH), 7.35-7.64 (m,

4H, H-aromat.); 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) 4.14 (d, 1H, 3J = 3.5 Hz, anti-CHNH2), 5.54

(d, 1H, 3J = 3.5 Hz, anti-CHOH), 7.37-7.62 (m, 4H, H-aromat.).

8.2.2.1.5 Synthese von rac-m-Bromphenylserin rac-12j


6.7 mmol, 0.5 g), 6.7 mmol m-Brombenzaldehyd (1j, 785 µL) und 5 mL

NaOH (5 M) eingesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 0°C für 48 h

gerührt. Das gewünschte Produkt wurde als gelblicher Feststoff mit



OH

OOH

rac-12iC9H10ClNO3

M = 215.63 g/mol

NH2

Cl


116


3J = 4.2 Hz, syn-CHOH), 5.31 (d, 1H, 3J = 4.0 Hz, anti-CHOH) 7.31-7.65 (m, 4H, H-aromat.);

13C-NMR (100 MHz, D2O) δ (ppm) = 61.04 (CHNH2), 71.03 (CHOH), 122.65, 125.14, 129.21,

131.00, 131.82, 142.07 (C-aromat.), 172.14 (COOH); MS (MALDI, Matrix: dhb) m/z = 259

(M-H)+. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten

überein.109

8.2.2.1.6 Synthese von rac-m-Chlorphenylserin rac-12l


0.5 g), 13.4 mmol m-Chlorenzaldehyd (1l, 1.5 mL) und 5 mL NaOH

(5 M) eingesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT für 2 h gerührt.

Das gewünschte Produkt wurde als farbloser Feststoff mit einer

Ausbeute von 52% (Auswaage 751 mg) und mit einem



3J = 4.8 Hz, syn-CHOH, anti-CHOH), 7.30-7.47 (m, 4H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, D2O) δ

(ppm) = 59.09, 59.59 (CHNH2), 71.06, 71.33 (CHOH), 122.47, 123.08, 124.06, 124.56, 126.05,

126.28, 127.99, 128.16, 131.74, 131.87, 138.89, 140.57 (C-aromat.), 174.03 (COOH); MS

(MALDI, Matrix: sin) m/z = 216 (M-H)+. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der

Literatur angegebenen Daten überein.109

8.2.2.1.7 Synthese von rac-m-Hydroxyphenylserin rac-12m


0.5 g), 6.7 mmol m-Hydroxybenzaldehyd (1m, 818 mg) und 5 mL

NaOH (5 M) eingesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 0°C für

48 h gerührt. Man erhielt das gewünschte Produkt als gelblichen

Feststoff in einer Ausbeute von 7% (Auswaage 92 mg) und mit einem

Diastereomerenverhältnis von d.r. >25:1 (syn/anti). 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 3.89

(d, 1H, 3J = 3.8 Hz, syn-CHNH2), 5.26 (d, 1H, 3J = 3.8 Hz, syn-CHOH), 6.87-7.02 (m, 3H, H-

aromat.), 7.31-7.37 (m, 1H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, D2O) δ (ppm) = 61.12 (CHNH2),


117

71.35 (CHOH), 113.05, 115.71, 118.20, 130.76, 141.59, 156.21, (C-aromat.), 172.44 (COOH);

MS (MALDI, Matrix: sin) m/z = 198 (M-H)+. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in

der Literatur angegebenen Daten überein.109

8.2.2.1.8 Synthese von rac-o-Methoxyphenylserin rac-12n


0.5 g), o-Methoxybenzaldehyd (1n, 13.4 mmol, 1.62 mL) und 5 mL

NaOH (5 M) eingesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT für 3 h

gerührt. Das gewünschte Produkt wurde als farbloser Feststoff mit



(ppm) = 3.85 (s, 3H, syn-OCH3), 3.89 (s, 3H, anti-OCH3), 4.03 (d, 1H, 3J = 4.6 Hz, syn-CHNH2),

4.07 (d, 1H, 3J = 3.5 Hz, anti-CHNH2), 5.42 (d, 1H, 3J = 4.6 Hz, syn-CHOH), 5.53 (d, 1H, 3J = 3.5

Hz, anti-CHOH), 7.05-7.50 (m, 4H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, D2O) δ (ppm) = 55.60,

55.70 (OCH3) 58.82, 59.40 (CHOH), 67.59, 68.43 (CHNH2), 111.57, 121.20, 127.02, 127.20,

128.19, 130.24, 130.33, 156.38 (C-aromat.), 172.76, 172.89 (COOH); MS (MALDI, Matrix:

dhb) m/z = 212 (M-H)+. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur

angegebenen Daten überein.142

8.2.2.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 4 (AAV 4): Derivatisierung der

racemischen β-Hydroxy-α-aminosäuren mit Benzoylchlorid116

Abbildung 8.4. Derivatisierung von rac-12

Die entsprechende β-Hydroxy-α-aminosäure 12 (0.4-1 mmol) wurde in Wasser (0.2-0.5 mL)

und NaOH (0.4-1 mL) gelöst und auf 0°C gekühlt. Nach Zugabe von 1.2 Äq. Benzoylchlorid


118

(79) wurde 1 h bei 0°C und 2 h bei RT gerührt. Anschließend wurde der pH-Wert durch

Zugabe von 1 M HCl auf den Wert 1 eingestellt und die wässrige Phase mit EtOAc (3 x 5 mL)

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet. Nach

Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde der erhaltene Rückstand umkristallisiert.

8.2.2.2.1 Synthese von rac-N-Benzoylamino-3-(4-methylthiophenyl)-3-hydroxy-

propionsäure rac-80d

Die Synthese erfolgte analog AAV 4. Es wurden 0.4 mmol

p-Methylthiophenylserin (rac-12d, d.r. >25:1 syn/anti, 91 mg),

0.2 mL Wasser und 0.4 mL NaOH (5 M), sowie 0.5 mmol 79 (55 µL)

eingesetzt. Der erhaltene Rückstand wurde in Aceton aufgenommen

und mit Petrolether ausgefällt. Das gewünschte Produkt wurde als

farbloser Feststoff mit einer Ausbeute von 55% (Auswaage 73 mg)

erhalten. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 2.43 (s, 1H, SCH3), 4.13-4.14 (m, 1H, syn-

CHNH), 5.45 (d, 1H, 3J = 3.0 Hz, syn-CHOH), 7.19-7.51 (m, 9H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz,

Aceton-d6) δ (ppm) = 15.19 (CH3), 59.33 (syn-CHOH), 73.18 (syn-CHNH), 126.50, 127.40,

127.89, 129.04, 132.08, 135.10, 138.30, 139.33 (C-aromat.), 167.41 (COPh), 171.57 (COOH);

MS (MALDI, Matrix: dhb) m/z = 332 (M-H)+; IR ṽ (cm-1): 3362, 3224, 1721, 1598, 1537, 1217,

825, 691; Elementaranalyse (C17H17NO4S): Berechnet: C: 61.61, H: 5.17, N: 4.23, S: 9.68.

Gefunden: C: 61.11, H: 5.19, N: 4.20, S: 9.47; Schmelzpunkt: 173°C.

8.2.2.2.2 Synthese von rac-N-Benzoylamino-3-hydroxy-3-phenylpropionsäure

rac-80e

Die Synthese erfolgte analog AAV 4. Es wurden 0.7 mmol rac-Phenyl-

serin (rac-12e, d.r. >25:1 syn/anti, 127 mg), 0.5 mL NaOH (5 M), sowie

0.8 mmol 79 (92 µL) eingesetzt. Die Mischung wurde 2 h bei 0°C und

16 h bei RT gerührt. Die spektroskopische Analyse erfolgte aus dem

Rohprodukt. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 4.99-5.03 (m,

2H, CHNH), 5.27 (d, 1H, 3J = 6.0 Hz, anti-CHOH), 5.50 (d, 1H, 3J =

OH

OOH

rac-80dC17H17NO4S

M = 331.39 g/mol

HN OMeS

OH

OOH

rac-80eC16H15NO4

M = 285.29 g/mol

HN O


119

2.90 Hz, syn-CHOH), 7.20-8.06 (m, 10H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen

mit den Literaturdaten überein.116

8.2.2.2.3 Synthese von rac-N-Benzoylamino-3-(4-chlorphenyl)-3-hydroxy-

propionsäure rac-80f


p-Chlorphenylserin (rac-12f, d.r. 72:28 syn/anti, 194 mg), 0.5 mL

Wasser und 0.9 mL NaOH (5 M), sowie 1.1 mmol 79 (124 µL)


und mit Hexan ausgefällt. Das gewünschte Produkt wurde als

farbloser Feststoff mit einer Ausbeute von 38% (Auswaage 109 mg)

und einem Diastereomerenverhältnis von d.r. 85:15 (syn/anti) erhalten. 1H-NMR (400 MHz,

Aceton-d6) δ (ppm) = 4.97 (d, 1H, 3J = 6.0 Hz, syn-CHNH), 5.00 (d, 1H, 3J = 3.0 Hz, anti-CHNH),

5.26 (d, 1H, 3J = 5.8 Hz, syn-CHOH), 5.49 (d, 1H, 3J = 3.0 Hz, anti-CHOH), 7.31-7.56 (m, 7H,

H-aromat.), 7.79-7.83 (m, 2H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ (ppm) = 59.95

(syn-CHOH), 60.01 (anti-CHOH), 73.61 (syn-CHNH), 74.28 (anti-CHNH), 128.27, 128.31,

128.76, 129.22, 129.46, 129.56, 132.89, 134.26, 134.55, 135.10, 141.16, 141.51 (C-aromat.),

169.85, 170.17 (COPh), 173.19, 173.26 (COOH); MS (MALDI, Matrix: dhb) m/z = 320 (M-H)+;

IR ṽ (cm-1): 3238, 1725, 1599, 1540, 1071, 828, 687; Elementaranalyse (C16H14ClNO4):

Berechnet: C: 60.10, H: 4.41, N: 4.38. Gefunden: C: 59.96, H: 4.36, N: 4.42; Schmelzpunkt:

171°C.

8.2.2.2.4 Synthese von rac-syn-N-Benzoylamino-3-(2-chlorphenyl)-3-hydroxy-

propionsäure rac-syn-80i

Die Synthese erfolgt analog AAV 4. Es wurden 0.5 mmol

rac-syn-o-Chlorphenylserin (rac-syn-12i, d.r. >25:1 syn/anti, 108 mg),

0.25 mL Wasser und 0.5 mL NaOH (5 M), sowie 0.6 mmol 79 (69 µL)

eingesetzt. Der erhaltene Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst

und mit Petrolether ausgefällt. Das gewünschte Produkt wurde in

einer Ausbeute von 20% (Auswaage 32 mg) erhalten. 1H-NMR

OH

OOH

rac-80fC16H14ClNO4

M = 319.74 g/mol

HN OCl

OH

OOH

rac-80iC16H14ClNO4

M = 319.74 g/mol

HN O

Cl


120

(400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 5.22-5.24 (m, 1H, syn-CHNH), 5.86 (d, 1H, 3J = 2.1 Hz, syn-

CHOH), 7.20-7.80 (m, 9H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 56.59 (syn-

CHOH), 70.80 (syn -CHNH), 127.43, 128.00, 129.15, 129.31, 129.65, 129.84, 131.99, 132.18,

135.18, 139.95 (C-aromat.), 167.42 (COPh), 171.65 (COOH); MS (MALDI, Matrix: dhb) m/z =

320 (M-H)+; IR ṽ (cm-1): 3276, 1704, 1636, 1548, 1073, 752, 696; Elementaranalyse

(C16H14ClNO4) Berechnet: C: 60.10, H: 4.41, N: 4.38. Gefunden: C: 60.17, H: 4.41, N: 4.37;

Schmelzpunkt: 169°C.

8.2.2.2.5 Synthese von rac-anti-N-Benzoylamino-3-(2-chlorphenyl)-3-hydroxy-

propionsäure rac-anti-80i

Die Synthese erfolgt analog AAV 4. Es wurden 0.6 mmol rac-anti-

o-Chlorphenylserin (rac-anti-12i, d.r. >25:1 anti/syn, 129 mg), 0.3 mL


eingesetzt. Der erhaltene Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst

und mit Petrolether ausgefällt. Das gewünschte Produkt wurde mit

einer Ausbeute von 10% (Auswaage 19 mg) erhalten. 1H-NMR (400

MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 5.12-5.16 (m, 1H, anti-CHNH), 5.56 (d, 1H, 3J = 5.2 Hz, anti-CHOH),

7.25- 7.44 (m, 9H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 58.00 (anti-CHOH),

71.42 (anti-CHNH), 127.60, 128.11, 129.24, 129.74, 129.81, 132.35, 132.80, 135.07 135.09,

139.65 (C-aromat.), 167.19 (COPh), 171.13 (COOH).

8.2.2.2.6 Synthese von rac-N-Benzoylamino-3-(3-bromphenyl)-3-hydroxy-

propionsäure rac-80j


m-Bromphenylserin (rac-12j, d.r. 87:13 syn/anti, 104 mg ) 0.2 mL



und mit Petrolether ausgefällt. Das gewünschte Produkt wurde mit

einer Ausbeute von 37% (Auswaage 47 mg) und einem

Diastereomerenverhältnis von d.r. 87:13 (syn/anti) erhalten. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6)

OH

OOH

rac-80jC16H14BrNO4

M = 364.19 g/mol

HN O

Br

OH

OOH

rac-80iC16H14ClNO4

M = 319.74 g/mol

HN O

Cl


121

δ (ppm) = 4.96-5.03 (m, 2H, CHNH), 5.26 (d, 1H, 3J = 5.7 Hz, anti-CHOH), 5.50 (d, 1H, 3J =

2.9 Hz, syn-CHOH) 7.42-7.93 (m, 9H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz Aceton-d6) δ (ppm) =

59.18 (anti-CHOH), 59.79 (syn-CHOH), 73.00 (anti-CHNH), 73.90 (syn-CHNH), 122.47, 122.55,

125.96, 126.39 128.07, 129.17, 129.24, 130.09, 130.46, 130.74, 130.78, 131.09, 131.21.

132.24, 132.39, 134.98 (C-aromat.), 145.17, 145.50 (CBr), 167.63 (COPh), 171.37 (COOH); MS

(MALDI, Matrix: dhb) m/z = 364 (M-H)+; IR ṽ (cm-1): 3289, 1756, 1715, 1623, 1053, 763, 691;

Elementaranalyse (C16H14BrNO4): Berechnet: C: 52.77, H: 3.87, N: 3.85. Gefunden: C: 52.05,

H: 3.62, N: 3.62. Schmelzpunkt: 154°C.

8.2.2.2.7 Synthese von rac-N-Benzoylamino-3-(3-chlorphenyl)-3-hydroxy-

propionsäure rac-80l


m-Chlorphenylserin (rac-12l, d.r. 51:49 syn/anti, 108 mg), 0.25 mL


eingesetzt. Der erhaltene Rückstand wurde in Dichlormethan

aufgenommen und mit Petrolether ausgefällt. Das gewünschte

Produkt wurde als farbloser Feststoff mit einer Ausbeute von 55%

(Auswaage 88 mg) und einem Diastereomerenverhältnis von d.r. 74:26 (syn/anti) erhalten.

1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 4.99 (dd, 1H, 3J = 8.2 Hz, 2.5 Hz, syn-CHNH), 5.04

(dd, 1H, 3J = 9.1 Hz, 6.1 Hz, anti-CHNH), 5.28 (d, 1H, 3J = 5.8 Hz, syn-CHOH), 5.52 (d, 1H, 3J =

2.8 Hz, anti-CHOH), 7.22-7.83 (m, 9H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ (ppm) =

59.93 (anti-CHOH), 60.08 (syn-CHOH), 73.62 (anti-CHNH), 74.33 (syn-CHNH), 125.55, 126.19,

127.37, 128.00, 128.31, 128.34, 128.60, 128.85, 129.56, 130.67, 130.71, 132.87, 132.91,

135.09, 135.19, 144.87, 145.21 (C-aromat.), 169.90, 170.28, 173.17 (COPh, COOH); MS

(MALDI, Matrix: dhb) m/z = 320 (M-H)+; IR ṽ (cm-1): 3276, 1706, 1637, 1530, 1041, 791, 688;

Elementaranalyse (C16H14ClNO4): Berechnet: C: 60.10, H: 4.41, N: 4.38. Gefunden: C: 60.25,

H: 4.46, N: 4.08; Schmelzpunkt: 136°C.

OH

OOH

rac-80lC16H14ClNO4

M = 319.74 g/mol

HN O

Cl


122

8.2.2.2.8 Synthese von rac-N-Benzoylamino-3-(2-methoxyphenyl)-3-hydroxy-

propionsäure rac-80n

Die Synthese erfolgte analog AAV 4. Es wurden 1 mmol

o-Methoxyphenylserin (rac-1n, d.r. 69:31 syn/anti, 211 mg), 0.5 mL

Wasser und 1 mL NaOH (5 M), sowie 1.2 mmol 79 (138 µL) eingesetzt.

Der erhaltene Rückstand wurde in Aceton aufgenommen und mit

Hexan ausgefällt. Das gewünschte Produkt wurde als farbloser

Feststoff erhalten. Es konnte reines syn-Produkt in einer Ausbeute

von 24% (Auswaage 76 mg) und ein Diastereomerengemisch (d.r. 10:90 syn/anti) in einer

Ausbeute von 14% (Auswaage 44 mg) isoliert werden. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ

(ppm) = 3.85, (s, 3H, syn-OCH3) 3.90 (s, 3H, anti-OCH3), 4.99 (dd, 1H, 3J = 11.0 Hz, 5.8 Hz, syn-

CHNH), 5.18 (dd, 1H, 3J = 9.3 Hz, 2.5 Hz, anti-CHNH), 5.50 (d, 1H, 3J = 5.5 Hz, anti-CHOH), 5.79

(d, 1H, 3J = 5.8 Hz, syn-CHOH), 6.85-8.06 (m, 9H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, Aceton-d6)

δ (ppm) = 55.69 (anti-CH3), 55.82 (syn-CH3), 57.17 (syn-CHOH), 59.12 (anti-CHOH), 69.01

(syn-CHNH), 69.77 (anti -CHNH), 111.01, 111.09, 120.78, 121.18, 127.72, 127.90, 127.92,

128.26, 129.14, 129.24, 129.47, 130.10, 130.59, 132.05, 132.28, 135.12, 135.49, (C-aromat.),

156.82, 157.21 (OCH3) 167.23, 167.38 (COPh), 171.71, 172.14 (COOH); MS (MALDI, Matrix:

dhb) m/z = 316 (M+H)+; IR ṽ (cm-1): 3350, 1695, 1638, 1527, 1031, 753, 688;

Elementaranalyse (C17H17NO5) Berechnet: C: 64.75, H: 5.43, N 4.44. Gefunden: C: 64.91,

H: 5.47, N: 4.16. Schmelzpunkt: 177°C.

8.2.2.3 Untersuchung der Hintergrundreaktion

Abbildung 8.5. Aktivierung von Glycin

OH

OOH

rac-80nC17H17NO5

M = 315.32 g/mol

HN O

OMe


123

Zur Untersuchung, ob es zwischen Glycin und Benzaldehyd zur Iminbildung und somit zur

Aktivierung von Glycin kommt, wurden verschiedene Mengen Glycin (11, 0.1-1 mmol) in

Puffer (1 mL, Phosphatpuffer pH 7 oder Tris-HCl-Puffer pH 8, 0.1 M) gelöst und Benzaldehyd

(1e, 0.1-1 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde 27 h gerührt. Es wurden Versuche mit und

ohne Zugabe von Cofaktor PLP (50 µM) durchgeführt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im

Vakuum wurde der Rückstand mittels 1H-NMR-Spektroskopie untersucht. 1H-NMR (300 MHz,

D2O) δ (ppm) = 3.55 (s, 2H, CH2-11). Die Ergebnisse der verschiedenen Versuche sind in

Tabelle 8.2 gezeigt.

Tabelle 8.2. Untersuchung der Hintergrundreaktion

Eintrag 11 [mmol] 1e [mmol] pH Cofaktor Iminbildung1)

1 1.0 0.1 8 ohne PLP -

2 1.0 0.1 8 mit PLP -

3 1.0 0.1 7 mit PLP -

4 0.5 0.5 8 ohne PLP -

5 0.5 0.5 8 mit PLP -

6 0.5 0.5 7 mit PLP -

7 0.1 1.0 8 ohne PLP -

8 0.1 1.0 8 mit PLP -

9 0.1 1.0 7 mit PLP -

1) Es konnte keine Iminbildung im

1H-NMR-Spektrum beobachtet werden.

8.2.2.4 Untersuchung auf Epimerisierung

Abbildung 8.6. Untersuchung auf Epimerisierung


124

Zur Untersuchung, ob das Diastereomerenverhältnis von Phenylserin (12e) unter den

Bedingungen der enzymatischen Reaktion konstant bleibt, wurde rac-Phenylserin (rac-12e,

0.1 mmol) in Puffer (1 mL, Phosphatpuffer pH 7 oder Tris-HCl-Puffer pH 8, 0.1 M) gelöst und

27 h gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand

mittels 1H-NMR-Spektroskopie untersucht. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 3.91 (d, 1H,

3J = 4.4 Hz, syn-CHNH2), 4.08 (d, 1H, 3J = 4.2 Hz, anti-CHNH2), 5.30 (d, 1H, 3J = 4.4 Hz,

syn-CHOH), 5.35 (d, 1H, 3J = 4.2 Hz, anti-CHOH), 7.28-7.46 (m, 4H, H-aromat.). Die Ergebnisse

sind in Tabelle 8.3 gezeigt.

Tabelle 8.3. Untersuchung auf Epimerisierung

Eintrag d.r. (syn/anti) pH d.r. (syn/anti) nach 27 h

1 >95:5 7 >25:1

2 >95:5 8 >25:1

3 56:44 7 56:44

4 56:44 8 56:44

8.2.2.5 Allgemeine Arbeitsvorschrift 5 (AAV 5) Photometertest zur

Untersuchung der Enzymaktivität117,118

Abbildung 8.7. Direkte Aktivitätsbestimmung durch Verfolgung der

Benzaldehydkonzentration

Zur Bestimmung der Enzymaktivität in U/mL (µmol min-1mL-1) wurde die Spaltung von

rac-syn-12e in Benzaldehyd (1e) und Glycin (11) verfolgt. Die Änderung der

Benzaldehydkonzentration kann bei 278 nm am Photometer beobachtet werden. In eine

Küvette (d = 1 cm) wurden 730 µL Phosphatpuffer (pH 7, 50 mM), 150 µL rac-syn-12e-Lösung

(0.1 M in Phosphatpuffer pH 7, 50 mM), 50 µL Na2EDTA-Lösung (20 mM in Phosphatpuffer


125

pH 7, 50 mM), 50 µL Na2SO4 (0.5 M in Phosphatpuffer pH 7, 50 mM) gegeben und gut

durchmischt. Anschließend wurden 20 μL der entsprechend verdünnten Enzymlösung

(Rohextrakt) zugegeben, nochmals gut durchmischt und die Messung sofort gestartet. Es

wurde über 10 Minuten alle 5 Sekunden ein Messpunkt aufgenommen. Zur Berechnung der

volumetrischen Enzymaktivität wird die Anfangssteigung der Absorptionskurve in folgende

Gleichung (1) eingesetzt:

Wobei ΔE278nm/t die Anfangssteigung der Absorptionskurve in min-1, Vg das Gesamtvolumen

der Probe in mL, f der Verdünnungsfaktor des Rohextraktes, Vp das Enzymvolumen in mL, ε

der Extinktionskoeffizient in mM-1cm-1 und d die Küvettendicke in cm ist. Der

Extinktionskoeffizient wurde bei pH 7 und 8, sowie mit und ohne PLP bestimmt.

8.2.2.5.1 Bestimmung des Extinktionskoeffizienten

Zur Bestimmung des Extinktionskoeffizienten bei den verschiedenen Bedingungen wurde die

Extinktion bei 278 nm für unterschiedliche Benzaldehydkonzentrationen in Puffer (pH 7 bzw.

pH 8) und in An- bzw. Abwesenheit von PLP (Endkonzentration 50 µM) bestimmt. Es wurden

jeweils zwei Messungen durchgeführt (E(1), E(2)) und der Mittelwert (E) berechnet (Tabelle

8.4). Aus der Steigung der Geraden (x-Achse: Benzaldehydkonzentration, y-Achse:

Extinktion) wurde der Extinktionsfaktor berechnet.

Tabelle 8.4. Extinktion bei pH 7 und ohne Zugabe von PLP

c(1e) [mM] E(1) E(2) E

0.05 0.100 0.100 0.100

0.1 0.162 0.156 0.159

0.25 0.136 0.136 0.136

0.5 0.188 0.186 0.187

1.0 0.364 0.363 0.364

2.0 0.425 0.418 0.421


126

Abbildung 8.8. Extinktion bei pH 7, ohne PLP

Aus der Steigung der Geraden ergibt sich ein Durchschnittswert für den Extinktions-

koeffizienten ε von 1.213 mM-1cm-1 (Abbildung 8.8).

Tabelle 8.5. Extinktion bei pH 7 und Zugabe von PLP

c (1e) [mM] E(1) E(2) E

0.05 0.162 0.156 0.159

0.1 0.136 0.136 0.136

0.25 0.188 0.186 0.188

0.5 0.364 0.363 0.364

1.0 0.425 0.418 0.421

2.0 0.701 0.707 0.704

E: y = 1.213x + 0.073

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Ext

inkt

ion

[m

in-1

]

c(Benzaldehyd) [mM]

E(1)

E(2)

E

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0


127

Abbildung 8.9. Extinktion bei pH 7, mit PLP



Tabelle 8.6. Extinktion bei pH 8 und ohne Zugabe von PLP

c (1e) [mM] E(1) E(2) E

0.05 0.084 0.086 0.085

0.1 0.156 0.155 0.156

0.25 0.419 0.417 0.418

0.5 0.855 0.857 0.856

1.0 1.672 1.672 1.672

2.0 2.467 2.493 2.480

E: y = 1.190x + 0.134

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Ext

inkt

ion

[m

in-1

]

c(Benzaldehyd) [mM]

E(1)

E(2)

E

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5


128

Abbildung 8.10. Extinktion bei pH 8, ohne PLP



Tabelle 8.7. Extinktion bei pH 8 und Zugabe von PLP

c (1e) [mM] E(1) E(2) E

0.05 0.188 0.184 0.186

0.1 0.261 0.251 0.256

0.25 0.522 0.506 0.514

0.5 0.955 0.942 0.949

1.0 1.758 1.743 1.750

2.0 2.521 2.521 2.521

E: y = 1.254x + 0.128

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Ext

inkt

ion

[m

in-1

]

c(Benzaldehyd) [mM]

E(1)

E(2)

E

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5


129

Abbildung 8.11. Extinktion bei pH 8, mit PLP



8.2.2.5.2 Aktivitätsbestimmung für L-TA aus E. coli

Die Aktivitätsbestimmung erfolgte analog AAV 5. Es wurde die Aktivität bei

unterschiedlichen pH-Werten getestet (pH 7, Phosphatpuffer, 50 mM; pH 8, Tris-HCl-Puffer,

50 mM). Die Durchführung ist in Tabelle 8.8 gezeigt.

Tabelle 8.8. Durchführung des Photometertests ohne Zugabe von PLP

Komponente c (Stammlösung)

[M]

Volumen

[µL]

Endkonzentration

[mM]

Puffer pH 7/8 0.05 730 -

rac-syn-12e 0.1 150 15

Na2EDTA 0.02 50 1.0

Na2SO4 0.5 50 25

L-TA (E. coli) - 20 -

E: y = 1.224x + 0.233

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Ext

inkt

ion

[m

in-1

]

c(Benzaldehyd) [mM]

E(1)

E(2)

E

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0


130

Des Weiteren wurde die Aktivitätsänderung durch Zugabe von PLP (2.5 mM, gelöst in

entsprechendem Puffer) untersucht. Bei Zugabe von 20 µL PLP-Lösung wurden 710 µL

Pufferlösung zupipettiert, um das Gesamtvolumen von 1 mL beizubehalten (Tabelle 8.9).

Tabelle 8.9. Durchführung des Photometertest mit Zugabe von PLP

Komponente c (Stammlösung)

[mM]

Volumen

[µL]

Endkonzentration

[mM]

Puffer pH 7/8 50 710 -

rac-syn-12e 100 150 15

Na2EDTA 20 50 1.0

Na2SO4 500 50 25

PLP 2.5 20 50

LTA (E. coli) - 20 -

Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 8.10 dargestellt. Die Enzymlösung wurde

1:4 (v/v) verdünnt (entspricht f = 4, Gleichung (1)).

Tabelle 8.10. Ergebnisse des Photometertests

Eintrag pH Cofaktor ΔE340nm/t

[1/min]

Aktivität

[U/mL]

Relative Aktivität

[%]

1 7 ohne PLP 0.0077 1.2 11

2 7 mit PLP 0.0272 4.3 39

3 8 ohne PLP 0.0155 2.4 22

4 8 mit PLP 0.0691 10.9 100

8.2.2.5.3 Inhibierungsversuche

Die Aktivitätsbestimmung erfolgte analog AAV 5. Es wurde Puffer pH 8 (Tris-HCl-Puffer,

50 mM) verwendet, sowie Cofaktor PLP (50 µM) zugegeben (vgl. Tabelle 8.9). Um die

Substrat- und Produktinhibierung zu untersuchen wurde die Enzymaktivität bei

verschiedenen Konzentrationen von Glycin (11) und Phenylserin (12e) bestimmt. Es wurde

eine gesättigte Lösungen von Glycin (11, 2.1 M) und rac-syn-Phenylserin (rac-syn-12e,


131

0.19 M) in Puffer pH 8 (Tris-HCl-Puffer, 50 mM) verwendet und entsprechend verdünnt. Die

Substratlösung wurde anstelle der Pufferkomponente zugegeben (vgl. Tabelle 8.9). Die

Ergebnisse zur Substratinhibierung sind in Tabelle 8.11 gezeigt, die zur Produktinhibierung in

Tabelle 8.12.

Tabelle 8.11. Einfluss von 11 auf die Enzymaktivität

Eintrag 11 [M] ΔE340nm/t [1/min] Aktivität [U/mL] Relative Aktivität [%}

1 0 0.0691 10.9 100

2 0.5 0.0060 9.8 90

3 1.0 0.0064 10.5 96

4 1.5 0.0041 6.7 61

5 2.1 0.0037 6.0 55

Tabelle 8.12. Einfluss von 12e auf die Enzymaktivität

Eintrag 12e [mM] ΔE340nm/t [1/min] Aktivität [U/mL] Relative Aktivität [%}

1 0 0.0264 43.1 100

2 15 0.0180 29.4 67

3 50 0.0119 19.4 45

4 100 0.0092 15.1 35

5 150 0.0083 13.6 32

8.2.2.6 Umsatzbestimmung der L-TA-katalysierten Aldolreaktion

Da der Umsatz aufgrund von im Enzymrohextrakt enthaltenem Glycerin nicht direkt

bestimmt werden konnte, wurden zwei Methoden zur Umsatzbestimmung entwickelt und

auf ihre Genauigkeit überprüft. Anschließend wurden die beiden Methoden angewendet.

8.2.2.6.1 Überprüfung der Umsatzbestimmung mittels NMR-Standard

Es wurden verschiedene Mengen rac-syn-12e (0.006-0.025 mmol) in 111 µL Puffer (pH 8,

Tris-HCl-Puffer, 0.1 M) gelöst und 139 µL inaktive L-TA zugegen. Anschließend wurden 25 µL

einer 1 M tert-Leucin-Lösung zupipettiert und das Gemisch abzentrifugiert. Der Überstand


132

wurde in einen Kolben überführt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Danach wurde

der erhaltene Rückstand in D2O aufgenommen und das Verhältnis zwischen 12e und

tert-Leucin 83 mittels 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. 1H-NMR (400 MHz, D2O): δ (ppm) =

1.08 (s, 9H, CH3-83), 3.91 (d, 1H, 3J = 4.4 Hz, syn-CHNH2), 4.08 (d, 1H, 3J = 4.2 Hz, anti-CHNH2),

5.30 (d, 1H, 3J = 4.4 Hz, syn-CHOH), 5.35 (d, 1H, 3J = 4.2 Hz, anti-CHOH), 7.28-7.46 (m, 4H,

H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegeben Daten

überein.116,141,143 Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.13 dargestellt.

Tabelle 8.13. Überprüfung der Umsatzbestimmung mittels NMR-Standard

Eintrag 12e

[mmol]

83

[mmol]

theoretisches

Verhältnis

12e:83

Verhältnis

12e:83

aus NMR

Abweichung

[%]

1 0.025 0.025 1:1 1:1.02 2

2 0.02 0.025 1:1.25 1:1.29 3

3 0.0175 0.025 1:1.4 1:1.37 2

4 0.015 0.025 1:1.67 1:1.61 2

5 0.0125 0.025 1:2 1:2.06 1

6 0.00625 0.025 1:4 1:3.72 2

7 0.0135 0.025 1:1.85 1:1.82 1

8.2.2.6.2 Überprüfung der Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung

Abbildung 8.12. Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung

rac-syn-12e (0.1-0.5 mmol) und 11 (0.5-1.9 mmol) wurden in 19 mL H2O gelöst. Es wurde

eine 2 mL-Probe entnommen und durch Zugabe von 1 M NaOH der pH-Wert auf pH 12

gebracht. Nach Zugabe von 1.2 Äq. Benzoylchlorid 79 wurde 2 h bei RT gerührt.


133

Anschließend wurde durch Zugabe von HCl der pH-Wert auf 1 eingestellt und mit EtOAc

(3 x 5 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet

und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Verhältnis von 80e zu 84 wurde mittels

1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 4.15 (d, 2H, 3J =

5.8 Hz, CH2-84) 4.99-5.03 (m, 2H, CHNH), 5.50 (d, 1H, 3J = 2.90 Hz, CHOH), 7.20-8.06 (m, 10H,

H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegeben Daten


Tabelle 8.14. Überprüfung der Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung

Eintrag 80e

[mmol]

74

[mmol]

theoretisches

Verhältnis

80e:84

Verhältnis

80e:84 aus

NMR

Abweichung

[%]

1 0.5 0.5 1:1 1:1.01 1

2 0.1 0.9 1:9 1:9.5 5

3 0.1 1.9 1:19 1:19.5 3

8.2.2.6.3 Umsatzbestimmung der L-TA-katalysierten Aldolreaktion

O

H +

NH2

O

OH

L-TA (E.coli),Puffer pH 8,

PLP (50 M), RTOH

O

NH2

OH

11

10 Äq1e

0.1 M

pH 12

OH

O

HN

OH

O

Ph

(2S)-12etert-Leucin

8379

L-80e

Cl

O

L-12e + 83

Abbildung 8.13. Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung oder Zugabe eines

NMR-Standards


134

8.2.2.6.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 6.1 (AAV 6.1) Umsatzbestimmung der

L-TA-katalysierten Aldolreaktion mittels NMR-Standard

Glycin (11, 0.25 mmol, 19 mg) wurde in 139 µL Puffer (pH 8, Tris-HCl-Puffer, 0.1 M) gelöst.

Nach Zugabe von PLP (50 µM), Benzaldehyd (1e, 0.025 mmol, 2.5 µL) und L-TA (139 µL,

70 U/mmol) wurde 17 h gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde nach Ablauf

der Reaktionszeit zur Umsatzbestimmung durch Zugabe von HCl auf pH 1 gebracht. Nach

Zugabe von 25 µL tert-Leucin (83) wurde das durch Ansäuern ausgefallene Protein

abzentrifugiert, der Überstand abpipettiert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der

Rückstand wurde in D2O aufgenommen und der Umsatz, sowie das Diastereomeren-

verhältnis mittels 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.

8.2.2.6.3.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 6.2 (AAV 6.2): Umsatzbestimmung der

L-TA-katalysierten Aldolreaktion mittels Derivatisierung

Glycin (11, 0.25 mmol, 19 mg) wurde in 139 µL Puffer (pH 8, Tris-HCl-Puffer, 0.1 M) gelöst.

Nach Zugabe von PLP (50 µM), Benzaldehyd (1e, 0.025 mmol, 2.5 µL) und L-TA (139 µL,

70 U/mmol) wurde 17 h gerührt. Nach Ablauf der Reaktionszeit wurden zur

Umsatzbestimmung 200 µL NaOH (5 M) und Benzoylchlorid (79, 1.2 Äq.) zugegeben. Das

Reaktionsgemisch wurde 2 h bei RT gerührt. Anschließend wurde durch Zugabe von HCl der

pH-Wert auf 1 gebracht und mit EtOAc (3 x 5 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der

Umsatz, sowie das Diastereomerenverhältnis wurden mittels 1H-NMR-Spektroskopie

bestimmt.

8.2.2.6.3.3 Ergebnisse der Umsatzbestimmung

Die Reaktion wurde analog AAV 6.1 bzw. AAV 6.2 durchgeführt. Umsatzbestimmung mittels

NMR-Standard: 1H-NMR (400 MHz, D2O): δ (ppm) = 1.08 (s, 9 H, CH3-83), 3.91 (d, 1H, 3J =

4.4 Hz, syn-CHNH3+), 4.08 (d, 1H, 3J = 4.2 Hz, anti-CHNH3

+), 5.30 (d, 1H, 3J = 4.4 Hz,

syn-CHOH), 5.35 (d, 1H, 3J = 4.2 Hz, anti-CHOH), 7.28-7.46 (m, 4H, H-aromat.).

Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung: 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 4.15

(d, 2H, 3J = 5.8 Hz, CH2-84), 4.99-5.03 (m, 2H, CHNH), 5.27 (d, 1H, 3J = 6.0 Hz, anti-CHOH),


135

5.50 (d, 1H, 3J = 2.9 Hz, syn-CHOH), 7.20-8.06 (m, 10H, H-aromat.). Der ee-Wert des

derivatisierten Produkts betrug >99% (OJ-H-Säule, Hexan/i-PrOH/FA 95:5:0.1, v/v, flow 0.8

ml/min, 230 nm, tr ((2S,3R)-12e) = 43.94 min, tr ((2S,3S)-12e) = 49.78 min). Die

spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegeben Daten

überein.116,141,143,144 Die Ergebnisse der Umsatzbestimmung sind in Tabelle 8.15 gezeigt.

Tabelle 8.15. Umsatzbestimmung L-TA-katalysierten Aldolreaktion

Eintrag Methode Umsatz [%] d.r. (syn/anti)

1 AAV 6.1 >95 62:38

2 AAV 6.2 91 65:35

8.2.2.7 Untersuchung der L-TA-katalysierten Aldolreaktion

Abbildung 8.14. L-TA-katalysierten Aldolreaktion

Die enzymatische Reaktion wurde analog AAV 6.1 bzw. AAV 6.2 durchgeführt und

verschiedene Parameter variiert.

8.2.2.7.1 Zeitabhängigkeit

Abbildung 8.15. Untersuchung der Zeitabhängigkeit


136

Zur Untersuchung der Zeitabhängigkeit wurde die Reaktion analog AAV 6.2 durchgeführt. Es

wurden 0.5 mmol Glycin (11, 38 mg), 0.05 mmol Benzaldehyd (1e, 5.1 µL) und PLP (50 µM) in

250 µL Puffer (pH 8, Tris-HCl-Puffer, 0.1 M) gelöst und 250 µL L-TA aus E. coli (88 U/mmol)

zugegeben. Der Umsatz und das Diastereomerenverhältnis wurden zu verschiedenen

Zeitpunkten (1 h, 8 h, 20 h) mittels Derivatisierung bestimmt. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6)

δ (ppm) = 4.15 (d, 2H, 3J = 5.8 Hz, CH2-84), 4.99-5.03 (m, 2H, CHNH), 5.27 (d, 1H, 3J = 6.0 Hz,

anti-CHOH), 5.50 (d, 1H, 3J = 2.9 Hz, syn-CHOH), 7.20-8.06 (m, 10H, H-aromat.). Die

spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegeben Daten überein.116,144

Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.16 dargestellt.

Tabelle 8.16. Zeitabhängigkeit der Enzymreaktion

Eintrag t [h] Umsatz [%] d.r. (syn/anti)

1 1 20 44:56

2 8 41 68:32

3 20 91 65:35

8.2.2.7.2 Temperaturabhängigkeit

Abbildung 8.16. Untersuchung der Temperaturabhängigkeit

Zur Untersuchung der Temperaturabhängigkeit wurde die Reaktion analog AAV 6.2 bei 40°C

durchgeführt. Es wurden 0.5 mmol Glycin (11, 38 mg), 0.05 mmol Benzaldehyd (1e, 5.1 µL)

und PLP (50 µM) in 250 µL Puffer (pH 8, Tris-HCl-Puffer, 0.1 M) gelöst und 250 µL L-TA aus

E. coli (88 U/mmol) zugegeben. Die Reaktionszeit betrug 8 h bzw. 20 h. 1H-NMR (400 MHz,

Aceton-d6) δ (ppm) = 4.15 (d, 2H, 3J = 5.8 Hz, CH2-84), 4.99-5.03 (m, 2H, CHNH), 5.27 (d, 1H, 3J

= 6.0 Hz, anti-CHOH), 5.50 (d, 1H, 3J = 2.9 Hz, syn-CHOH), 7.20-8.06 (m, 10H, H-aromat.). Die


137



Tabelle 8.17. Enzymreaktion bei 40°C

Eintrag t [h] Umsatz [%] d.r. (syn/anti)

1 8 21 60:40

2 20 13 77:23

Ein weiterer Versuch wurde unter folgenden Bedingungen bei 4°C durchgeführt:

Zu Glycin (11, 0.313 mmol) und PLP (50 µM) wurde Benzaldehyd (1e, 0.0313 mmol) und L-TA

(125 µL, 50 U/mmol) gegeben und 7 h bei ca. 4°C gerührt. Nach Ablauf der Reaktionszeit

wurden zur Umsatzbestimmung 200 µL NaOH (5 M) und Benzoylchlorid (79, 1.2 Äq.)

zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei RT gerührt. Anschließend wurde durch

Zugabe von HCl auf pH 1 angesäuert und mit EtOAc (3 x 5 mL) extrahiert. Die vereinigten

organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum

entfernt. Es wurden ein Umsatz von 20% und ein Diastereomerenverhältnis von d.r. 46:54

(syn/anti) erhalten. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 4.15 (d, 2H, 3J = 5.8 Hz, CH2-84),

4.99-5.03 (m, 2H, CHNH), 5.27 (d, 1H, 3J = 6.0 Hz, anti-CHOH), 5.50 (d, 1H, 3J = 2.9 Hz,

syn-CHOH), 7.20-8.06 (m, 10H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in

der Literatur angegeben Daten überein.116,144

8.2.2.7.3 Einfluss der Enzymmenge

Abbildung 8.17. Einfluss der Enzymmenge


138

Zur Untersuchung des Einflusses der Enzymmenge wurde die Reaktion analog AAV 6.2

durchgeführt. Es wurden 0.5 mmol Glycin (11, 38 mg), 0.05 mmol Benzaldehyd (1e, 5.1 µL)

und PLP (50 µM) eingesetzt. Desweiteren wurden entweder 250 µL Puffer (pH 8, Tris-HCl-

Puffer, 0.1 M) und 250 µL L-TA aus E. coli (88 U/mmol) oder 500 µL L-TA aus E. coli

(176 U/mmol) zugegeben. Der Umsatz und das Diastereomerenverhältnis wurde wieder zu

verschiedenen Reaktionszeiten 1-20 h bestimmt. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) =

4.15 (d, 2H, 3J = 5.8 Hz, CH2-84), 4.99-5.03 (m, 2H, CHNH), 5.27 (d, 1H, 3J = 6.0 Hz,




Tabelle 8.18. Einfluss der Enzymmenge

Eintrag Enzymmenge [U/mmol] t [h] Umsatz [%] d.r. (syn/anti)

1 88 1 20 44:56

2 88 8 41 68:32

3 88 20 91 65:35

4 176 1 63 67:33

5 176 3 79 67:33

6 176 20 91 68:32

8.2.2.7.4 Einfluss des Verhältnisses von Benzaldehyd zu Glycin

Abbildung 8.18. Einfluss des Verhältnisses von Benzaldehyd (1e) zu Glycin (11)


139

8.2.2.7.4.1 Einfluss der Glycinkonzentration

Zur Untersuchung des Einflusses der Glycinkonzentration auf den Umsatz wurde die

Reaktion analog AAV 6.2 durchgeführt. Die Glycinkonzentration wurde von 1 M auf 0.1 M

gesenkt während die Benzaldehydkonzentration konstant bei 0.1 M gehalten wurde. Die

Enzymmenge betrug 176 U/mmol. Der Umsatz wurde jeweils nach 20 h bestimmt. 1H-NMR

(400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 4.15 (d, 2H, 3J = 5.8 Hz, CH2-84), 4.99-5.03 (m, 2H, CHNH),

5.27 (d, 1H, 3J = 6.0 Hz, anti-CHOH), 5.50 (d, 1H, 3J = 2.9 Hz, syn-CHOH), 7.20-8.06 (m, 10H,

H-aromat). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegeben Daten

überein.116,144 Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.19 dargestellt.

Tabelle 8.19. Einfluss des Glycinüberschusses

Eintrag 11 [M] 1e [M] Umsatz [%] d.r. (syn/anti)

1 1.0 0.1 91 68:32

2 0.5 0.1 44 70:30

3 0.2 0.1 28 65:35

4 0.1 0.1 8 73:27

8.2.2.7.4.2 Einfluss der Benzaldehydkonzentration

Zur Untersuchung des Einflusses der Benzaldehydkonzentration auf den Umsatz wurde die

Reaktion analog AAV 6.2 durchgeführt. Die Benzaldehydkonzentration wurde von 0.1 M auf

1 M erhöht während die Glycinkonzentration konstant bei 1 M gehalten wurde. Da die

Enzymaktivität in Abhängigkeit der Aldehydkonzentration eingesetzt wurde, musste bei

Einhaltung der Substratkonzentration die Enzymmenge reduziert werden. Der Umsatz wurde

jeweils nach 20 h bestimmt. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 4.15 (d, 2H, 3J = 5.8 Hz,

CH2-84), 4.99-5.03 (m, 2H, CHNH), 5.27 (d, 1H, 3J = 6.0 Hz, anti-CHOH), 5.50 (d, 1H, 3J =

2.9 Hz, syn-CHOH), 7.20-8.06 (m, 10H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit

den in der Literatur angegeben Daten überein.116,144 Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.20

dargestellt.


140

Tabelle 8.20. Einfluss der Benzaldehydkonzentration

Eintrag 11 [M] 1e [M] Enzymmenge

[U/mmol] Umsatz [%] d.r. (syn/anti)

1 1.0 0.1 88 91 68:32

2 1.0 0.5 17 14 71:29

3 1.0 1.0 9 4 67:33

8.2.2.7.5 Erhöhung der Substratkonzentration

Abbildung 8.19. Erhöhung der Substratkonzentration auf 0.25 M

Um einen effizienteren Prozess zu entwickeln, wurde eine Erhöhung der Substrat-

konzentration von 0.1 M auf 0.25 M untersucht. Der Umsatz wurde mit Hilfe der beiden

entwickelten Methoden bestimmt.


NMR-Standard bei einer Substratkonzentration von 0.25 M

Zu Glycin (11, 0.313 mmol, 23 mg) und PLP (50 µM) wurde Benzaldehyd (1e, 0.0313 mmol,

3.2 µL) und L-TA (125 µL, 50 U/mmol) gegeben und 17 h gerührt. Der pH-Wert des

Reaktionsgemisches wurde nach Ablauf der Reaktionszeit zur Umsatzbestimmung durch

Zugabe von HCl auf pH 1 gebracht. Nach Zugabe von 31.3 µL tert-Leucin 83 wurde das durch

Ansäuern ausgefallene Protein abzentrifugiert, der Überstand in einen Kolben pipettiert und

das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in D2O aufgenommen und der

Umsatz, sowie das Diastereomerenverhältnis mittels 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.


141


Derivatisierung bei einer Substratkonzentration von 0.25 M

Zu Glycin (11, 0.313 mmol) und PLP (50 µM) wurde Benzaldehyd (1e, 0.0313 mmol, 3.2 µL)

und L-TA (125 µL, 50 U/mmol) gegeben und 17 h gerührt. Nach Ablauf der Reaktionszeit

wurden zur Umsatzbestimmung 200 µL 5 M NaOH und Benzoylchlorid (79, 1.2 Äq.)

zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei RT gerührt. Anschließend wurde durch

Zugabe von HCl auf pH 1 angesäuert und mit EtOAc (3 x 5 mL) extrahiert. Die vereinigten

organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum

entfernt. Der Umsatz, sowie das Diastereomerenverhältnis wurden mittels 1H-NMR-

Spektroskopie bestimmt.

8.2.2.7.5.3 Ergebnisse der Umsatzbestimmung (0.25 M)

Die Reaktion wurde analog AAV 7.1 bzw. AAV 7.2 durchgeführt. Umsatzbestimmung mittels

NMR-Standard: 1H-NMR (400 MHz, D2O): δ (ppm) = 1.08 (s, 9 H, CH3-83) 3.91 (d, 1H, 3J =


+), 5.30 (d, 1H, 3J = 4.4 Hz,

syn-CHOH), 5.35 (d, 1H, 3J = 4.2 Hz, anti-CHOH), 7.28-7.46 (m, 4H, H-aromat.).


(d, 2H, 3J = 5.8 Hz, CH2-84), 4.99-5.03 (m, 2H, CHNH), 5.27 (d, 1H, 3J = 6.0 Hz, anti-CHOH),

5.50 (d, 1H, 3J = 2.9 Hz, syn-CHOH), 7.20-8.06 (m, 10H, H-aromat.). Der ee-Wert des

derivatisierten Produkts betrug >99% (OJ-H-Säule, Hexan/i-PrOH/FA 95:5:0.1, v/v, flow 0.8

ml/min, 230 nm, tr ((2S,3R)-12e) = 43.94 min, tr ((2S,3S)-12e) = 49.78 min). Die

spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten

überein.116,141,143,144 Die Ergebnisse der unterschiedlichen Umsatzbestimmung sind in Tabelle

8.21 gezeigt.

Tabelle 8.21. Umsatz bei Substratkonzentration von 0.25 M

Eintrag Methode Umsatz [%] d.r. (syn/anti)

1 AAV 7.1 91 61:39

2 AAV 7.2 84 65:35


142

8.2.2.7.6 Einfluss verschiedener Additive

Abbildung 8.20. Einfluss verschiedener Additive

Zur Untersuchung des Einflusses verschiedener Additive auf den Umsatz wurde die Reaktion

analog AAV 7.1 mit einer Substratkonzentration von 0.25 M durchgeführt. Es wurde zum

Rohextrakt 50 Vol% der entsprechenden Substanz zugefügt. Die Zugabe von tert-Leucin zur

Umsatzbestimmung war nur bei Verwendung von Glycerin als Additiv notwendig. 1H-NMR

(400 MHz, D2O): δ (ppm) = 1.08 (s, 9 H, CH3-83), 3.80 (s, 2H, CH2NH3+-11) 3.91 (d, 1H, 3J =


+), 5.30 (d, 1H, 3J = 4.4 Hz,

syn-CHOH), 5.35 (d, 1H, 3J = 4.2 Hz, anti-CHOH), 7.28-7.46 (m, 4H, H-aromat.). Die

spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegeben Daten


Tabelle 8.22. Einfluss verschiedener Additive

Eintrag Additiv (50 Vol%) Umsatz [%] d.r. (syn/anti)

1 Puffer 68 65:35

2 Glycerin 71 65:35

3 DMSO 11 58:42

4 i-PrOH 19 60:40

5 Aceton 16 60:40


143

8.2.2.7.7 Substratspektrum

Abbildung 8.21. Erweiterung des Substratspektrums

Zur Erweiterung des Substratspektrums wurden verschieden substituierte Benzaldehyde als

Akzeptor eingesetzt. Die enzymatische Reaktion wurde bei einer Substratkonzentration von

0.1 M und 0.25 M durchgeführt und der Umsatz mit Hilfe der beiden möglichen Methoden

bestimmt (vgl. AAV 6.1, 6.2, 7.1 und 7.2).

8.2.2.7.7.1 Enzymatische Synthese von p-Nitrophenylserin (2S)-12b

Die Synthese erfolgte analog AAV 6.2 und 7.1. Es wurde die

entsprechende Menge p-Nitrobenzaldehyd (1b, 0.1 M: 0.025 mmol,

0.25 M: 0.0313 mmol) eingesetzt. Umsatzbestimmung mittels NMR-

Standard: 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 4.36 (d, 1H, 3J = 3.2 Hz,

syn-CHNH3+), 4.45 (d, 1H, 3J = 3.0 Hz, anti-CHNH3

+), 5.44 (d, 1H, 3J =

2.6 Hz, anti-CHOH), 5.51 (d, 1H, 3J = 3.1 Hz, syn-CHOH), 7.57-7.67 (m, 2H, H-aromat.), 8.19-

8.25 (m, 2H, H-aromat.). Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung: 1H-NMR (400 MHz,

Aceton-d6) δ (ppm) = 5.04-5.06 (m, 1H, anti-CHNH), 5.11-5.14 (m, 1H, syn-CHNH), 5.43 (d,

1H, 3J = 5,6 Hz, anti-CHOH), 5.67 (d, 1H, 3J = 2,3 Hz, syn-CHOH), 7.44-8.27 (m, 9H, H-aromat.).

Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten

überein.109 Die Ergebnisse der enzymatischen Umsetzungen sind in Tabelle 8.23 angegeben.

Tabelle 8.23. Enzymatische Synthese von (2S)-12b

Eintrag AAV Aldehydkonzentration [M] Umsatz [%] d.r. (syn/anti)

1 6.2 0.1 55 62:38

2 7.1 0.25 35 68:32


144

8.2.2.7.7.2 Enzymatische Synthese von p-Methylthiophenylserin (2S)-12d

Die Synthese erfolgte analog AAV 6.1. Es wurde die entsprechende

Menge p-Methylthiobenzaldehyd (1d, 0.025 mmol) eingesetzt. Es

wurden ein Umsatz von 10% und ein Diastereomerenverhältnis von

d.r. 57:43 (syn/anti) erzielt. Umsatzbestimmung mittels NMR-

Standard: 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 2.41 (s, 3H, anti-SCH3),

2.42 (s, 3H, syn-SCH3), 3.85-3.88 (m, 2H, CHNH3+), 5.25 (d, 1H, 3J = 4.3 Hz, anti-CHOH), 5.29

(d, 1H, 3J = 4.0 Hz, syn-CHOH), 7.34-7.39 (m, 4H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten

stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten überein.140

8.2.2.7.7.3 Enzymatische Synthese von p-Chlorphenylserin (2S)-12f

Die Synthese erfolgte analog AAV 6.1, 6.2 und 7.2. Es wurde die

entsprechende Menge p-Chlorbenzaldehyd (1f, 0.1 M: 0.025 mmol,




+), 5.35 (d, 1H, 3J =

4.6 Hz, syn-CHOH), 5.38 (d, 1H, 3J = 4.6 Hz anti-CHOH), 7.38-7.50 (m, 4H, H-aromat.).


(dd, 1H, 3J = 8.2 Hz, 2.5 Hz, syn-CHNH), 5.04 (dd, 1H, 3J = 9.1 Hz, 6.1 Hz, anti-CHNH), 5.28 (d,

1H, 3J = 5.8 Hz, syn-CHOH), 5.52 (d, 1H, 3J = 2.8 Hz, anti-CHOH), 7.22-7.83 (m, 9H, H-aromat.).

Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten109 bzw.

mit den Daten des vollständig charakterisierten Racemats überein (Abschnitt 8.2.2.2.3). Die

Ergebnisse der enzymatischen Umsetzungen sind in Tabelle 8.24 angegeben.

Tabelle 8.24. Enzymatische Synthese von (2S)-12f


1 6.1 0.1 32 62:38

2 6.2 0.1 26 66:34

3 7.2 0.25 20 66:34

OH

OOH

(2S)-12dC10H13NO3S

M = 227.28 g/mol

NH2MeS


145

8.2.2.7.7.4 Enzymatische Synthese von o-Chlorphenylserin (2S)-12i


entsprechende Menge o-Cl-Benzaldehyd (1i, 0.1 M: 0.025 mmol, 0.25 M:

0.0313 mmol) eingesetzt. Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung:

1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 5.12-5.24 (m, 2H, CHNH), 5,56

(d, 1H, 3J = 5.2 Hz, anti-CHOH), 5.86 (d, 1H, 3J = 2.1 Hz, syn-CHOH),

7.25-7.80 (m, 9H, H-aromat.). Der ee-Wert des Produkts beträgt für beide Umsetzungen

>99% (OJ-H-Säule, Hexan/i-PrOH/FA 95:5:0.1, v/v, flow 0,8 ml/min, 230nm, tr ((2S,3R)-12i) =

63.05 min, tr ((2S,3S)-12i) = 68.07 min). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten

des vollständig charakterisierten Racemats überein (vgl. Abschnitt 8.2.2.2.4 und 8.2.2.2.5).

Die Ergebnisse der enzymatischen Umsetzungen sind in Tabelle 8.25 angegeben.

Tabelle 8.25. Enzymatische Synthese von (2S)-12i


1 6.2 0.1 91 81:19

2 7.2 0.25 85 80:20

8.2.2.7.7.5 Enzymatische Synthese von m-Bromphenylserin (2S)-12j


entsprechende Menge m-Brombenzaldehyd (1j, 0.1 M: 0.025 mmol,




+), 5.25 (d, 2H, 3J =

4.2 Hz, syn-CHOH), 5.31 (d, 1H, 3J = 4.0 Hz, anti-CHOH) 7.31-7.65 (m, 4H, H-aromat.).

Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung: 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) =

4.96-5.03 (m, 2H, CHNH), 5.26 (d, 1H, 3J = 5.7 Hz, anti-CHOH), 5.50 (d, 1H, 3J = 2.9 Hz,

syn-CHOH) 7.4-7.93 (m, 9H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in

der Literatur angegebenen Daten109 bzw. mit den Daten des vollständig charakterisierten

Racemats überein (Abschnitt 8.2.2.2.6). Die Ergebnisse der enzymatischen Umsetzungen

sind in Tabelle 8.26 angegeben.

OH

OOH

(2S)-12iC9H10ClNO3

M = 215.63 g/mol

NH2

Cl


146

Tabelle 8.26. Enzymatische Synthese von (2S)-12j


1 6.1 0.1 56 62:38

2 7.2 0.25 47 63:37

8.2.2.7.7.6 Enzymatische Synthese von p-Methylsulphonylphenylserin (2S)-12k


entsprechende Menge p-Methylsulphonylbenzaldehyd (1k,

0.1 M: 0.025 mmol, 0.25 M: 0.0313 mmol) eingesetzt. Umsatz-

bestimmung mittels NMR-Standard: 1H-NMR (400 MHz, D2O)

δ (ppm) = 4.26 (m, 1H, syn-CHNH3+), 4.30 (m, 1H, anti-CHNH3

+),

5.45 (d, 1H, 3J = 3.1 Hz, anti-CHOH), 5.52 (d, 1H, 3J = 3.4 Hz, syn-CHOH), 7.63-7.97 (m, 4H,

H-aromat.). Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung: 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6)

δ (ppm) = 5.07-5.12 (m, 2H, CHNH), 5.41 (d, 1H, 3J = 6.5 Hz, anti-CHOH), 5.63 (d, 1H, 3J =

3.3 Hz, syn-CHOH), 7.44-8.05 (m, 9H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit

den in der Literatur angegebenen Daten überein.109,145 Die Ergebnisse der enzymatischen

Umsetzungen sind in Tabelle 8.27 angegeben.

Tabelle 8.27. Enzymatische Synthese von (2S)-12k


1 6.2 0.1 42 61:39

3 7.1 0.25 24 65:35

8.2.2.7.7.7 Enzymatische Synthese von m-Chlorphenylserin (2S)-12l

Die Synthese erfolgte analog AAV 6.1, 6.2, und 7.2. Es wurde die

entsprechende Menge m-Chlorbenzaldehyd (1l, 0.1 M: 0.025 mmol,




+), 5.10 (d, 2H, 3J =

4.8 Hz, CHOH), 7.30-7.47 (m, 4H, H-aromat.). Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung:

OH

OOH

(2S)-12lC9H10ClNO3

M = 215.63 g/mol

NH2

Cl

OH

OOH

(2S)-12kC10H13NO5S

M = 259.28 g/mol

NH2MeO2S


147

1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 4.99 (dd, 1H, 3J = 8.2 Hz, 2.5 Hz, syn-CHNH), 5.04

(dd, 1H, 3J = 9.1 Hz, 6.1 Hz, anti-CHNH), 5.28 (d, 1H, 3J = 5.8 Hz, syn-CHOH), 5.52 (d, 1H, 3J =

2.8 Hz, anti-CHOH), 7.22-7.83 (m, 9H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit

den in der Literatur angegebenen Daten109 bzw. mit den Daten des vollständig

charakterisierten Racemats überein (Abschnitt 8.2.2.2.7). Die Ergebnisse der enzymatischen


Tabelle 8.28. Enzymatische Synthese von (2S)-12l


1 6.1 0.1 69 64:36

2 6.2 0.1 64 67:33

3 7.2 0.25 67 68:32

8.2.2.7.7.8 Enzymatische Synthese von m-Hydroxyphenylserin (2S)-12m


entsprechende Menge m-Hydroxybenzaldehyd (1m, 0.1 M:

0.025 mmol, 0.25 M: 0.0313 mmol) eingesetzt. Umsatzbestimmung

mittels NMR-Standard: 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 4.13-4.19

(m, 2H, CHNH3+), 5.26 (d, 2H, 3J = 4.1 Hz, syn-CHOH), 5.32 (d, 1H, 3J =

3.8 Hz, anti-CHOH) 6.78-7.41 (m, 4H, H-aromat.). Umsatzbestimmung mittels

Derivatisierung: 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 4.94 (d, 1H, 3J = 2.8 Hz, CHNH),

4.97 (d, 1H, 3J = 3.0 Hz, CHNH), 5.41 (d, 1H, 3J = 2.8 Hz, CHOH), 5.20 (d, 1H, 3J = 5.5 Hz,

CHOH), 7.40-8.08 (m, 9H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der

Literatur angegebenen Daten überein.109 Die Ergebnisse der enzymatischen Umsetzungen


Tabelle 8.29. Enzymatische Synthese von (2S)-12m


1 6.1 0.1 83 59:41

2 7.2 0.25 28 63:37


148

8.2.2.7.7.9 Enzymatische Synthese von o-Methoxyphenylserin (2S)-12n


entsprechende Menge o-Methoxybenzaldehyd (1n, 0.1 M: 0.025 mmol,


Standard: 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 3.85 (s, 3H, syn-OCH3), 3.89

(s, 3H, anti-OCH3), 4.03 (d, 1H, 3J = 4.6 Hz, syn-CHNH3+), 4.07 (d, 1H, 3J =

3.5 Hz, anti-CHNH3+), 5.42 (d, 1H, 3J = 4.6 Hz, syn-CHOH), 5.53 (d, 1H, 3J = 3.5 Hz, anti-CHOH),

7.05-7.50 (m, 4H, H-aromat.). Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung: 1H-NMR

(400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 3.85, (s, 3H, syn-OCH3) 3.90 (s, 3H, anti-OCH3), 4.99 (dd, 1H,

3J = 11.0 Hz, 5.8 Hz, syn-CHNH), 5.18 (dd, 1H, 3J = 9.3 Hz, 2.5 Hz, anti-CHNH), 5.50 (d, 1H, 3J =

5.5 Hz, anti-CHOH), 5.79 (d, 1H, 3J = 5.8 Hz, syn-CHOH), 6.85-8.06 (m, 9H, H-aromat.). Die

spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten142,109 bzw.

mit den Daten des vollständig charakterisierten Racemats überein (Abschnitt 8.2.2.2.8). Die

Ergebnisse der enzymatischen Umsetzungen sind in Tabelle 8.30 angegeben.

Tabelle 8.30. Enzymatische Synthese von (2S)-12n


1 6.1 0.1 80 79:21

2 6.2 0.25 59 78:22

32 7.2 0.25 69 75:25

8.2.2.7.7.10 Enzymatische Synthese von o-Bromphenylserin (2S)-12o


entsprechende Menge o-Brombenzaldehyd (1o, 0.1 M: 0.025 mmol,

0.25 M: 0.0313 mmol) eingesetzt. Umsatzbestimmung mittels

Derivatisierung: 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 5.12-5.15 (m,

1H, anti-CHNH), 5.25-5.29 (m, 1H, syn-CHNH), 5.50 (d, 1H, 3J = 5.1 Hz,

anti-CHOH), 5.82 (d, 1H, 3J = 2.1 Hz, syn-CHOH), 7.13-8.08 (m, 9H, H-aromat.). Der ee-Wert

wurde für die Umsetzung mit einer Substratkonzentration von 0.25 M bestimmt und betrug

>99% (OJ-H-Säule, Hexan/i-PrOH/FA 95:5:0.1, v/v, flow 0.8 ml/min, 230 nm, tr ((2R,3S)-12o)

OH

OOH

(2S)-12nC10H13NO4

M = 211.21 g/mol

NH2

OMe

OH

OOH

(2S)-12oC9H10BrNO3

M = 260.08 g/mol

NH2

Br


149

= 67.13 min, tr ((2R,3R)-12o)= 73.72 min). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in

der Literatur angegebenen Daten überein.109,145 Die Ergebnisse der enzymatischen


Tabelle 8.31. Enzymatische Synthese von (2S)-12o


1 6.2 0.1 70 72:28

2 7.2 0.25 51 73:27

8.2.2.7.7.11 Enzymatische Synthese von o-Fluorphenylserin (2S)-12p


entsprechende Menge o-Fluorbenzaldehyd (1p, 0.1 M: 0.025 mmol,


Derivatisierung: 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 5.09-5.13 (m,

2H, CHNH), 5.53 (d, 1H, 3J = 5.8 Hz, anti-CHOH), 5.80 (d, 1H, 3J = 2.5 Hz,

syn-CHOH, 7.04-8.04 (m, 9H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in

der Literatur angegebenen Daten überein.109,145 Die Ergebnisse der enzymatischen


Tabelle 8.32. Enzymatische Synthese von (2S)-12p


1 6.2 0.1 42 72:28

2 7.2 0.25 47 71:29

8.2.2.7.7.12 Enzymatische Synthese von o-Nitrophenylserin (2S)-12q


entsprechende Menge o-Nitrobenzaldehyd (1q, 0.1 M: 0.025 mmol,


Standard: 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 4.49-4.51 (m, 2H, CHNH3+),

OH

OOH

(2S)-12pC9H10FNO3

M = 199.18 g/mol

NH2

F

OH

OOH

(2S)-12qC9H10N2O5

M = 226.19 g/mol

NH2

NO2


150

5.77 (d, 1H, 3J = 3.8 Hz, anti-CHOH), 5.92 (d, 1H, 3J = 3.3 Hz, syn-CHOH), 7.48-8.11 (m, 4H, H-

aromat.). 1H-NMR-Daten für die Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung 1H-NMR (400

MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 5.41-5.45 (m, 1H, syn-CHNH), 5.48-5.53 (m, 1H, anti-CHNH), 5.78

(d, 1H, 3J = 6.4 Hz, anti-CHOH), 6.16 (d, 1H, 3J = 2.1 Hz, syn-CHOH), 7.38-8.10 (m, 9H, H-

aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten

überein.109,145 Die Ergebnisse der enzymatischen Umsetzungen sind in Tabelle 8.33

angegeben.

Tabelle 8.33. Enzymatische Synthese von (2S)-12q


1 6.1 0.1 90 68:32

2 6.2 0.25 60 71:29

32 7.2 0.25 58 70:30

8.2.2.7.7.13 Enzymatische Synthese von o-Methylphenylserin (2S)-12r


entsprechende Menge o-Methylbenzaldehyd (1r, 0.1 M: 0.025 mmol,


Standard: 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 2.24 (s, 3H, CH3), 4.13-4.16

(m, 2H, CHNH3+), 5.39 (d, 1H, 3J = 4.0 Hz, anti-CHOH), 5.53 (d, 1H, 3J =

3.6 Hz, syn-CHOH), 7.17-7.46 (m, 2H, H-aromat.), 7.71-7.42 (m, 2H, H-aromat.).

Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung: 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 2.45 (s,

6H, CH3), 4.97 (d, 1H, 3J = 2.5 Hz, syn-CHNH), 5.05 (d, 1H, 3J = 5.3 Hz, anti-CHNH), 5.43 (d, 1H,

3J = 6.1 Hz, anti-CHOH), 5.69 (d, 1H, 3J = 2.5 Hz, syn-CHOH), 7.09-8.07 (m, 9H, H-aromat.). Die


überein.109,145 Die Ergebnisse der enzymatischen Umsetzungen sind in Tabelle 8.34

angegeben.

OH

OOH

(2S)-12rC10H13NO3

M = 195.22 g/mol

NH2

Me


151

Tabelle 8.34. Enzymatische Synthese von (2S)-12r


1 6.1 0.1 27 78:22

2 6.2 0.25 25 76:24

3 7.2 0.25 24 79:21

8.2.2.7.7.14 Enzymatische Synthese von o-Hydroxyphenylserin (2S)-12s


entsprechende Menge o-Hydroxybenzaldehyd (1s, 0.1 M: 0.025 mmol,


Derivatisierung: 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 5.22-4.26 (m, 2H,

CHNH), 5.81 (d, 1H, 3J = 4.0 Hz, syn-CHOH), 7.43-8.07 (m, 4H, H-aromat.).

Das Signal des Protons von anti-CHOH wurde im Spektrum durch Verunreinigungen

überdeckt. Das Diastereomerenverhältnis wurde aus dem Verhältnis des Peaks syn/anti-

CHNH und syn-CHOH berechnet. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der

Literatur angegebenen Daten überein.145 Die Ergebnisse der enzymatischen Umsetzungen


Tabelle 8.35. Enzymatische Synthese von (2S)-12s


1 6.2 0.1 7 74:26

2 7.2 0.25 10 78:22

8.2.2.7.7.15 Enzymatische Synthese von 3,4-Dihydroxyphenylserin (2S)-12t

Die Synthese erfolgte analog AAV 6.1. Es wurde 0.025 mmol

3,4-Dihydroxybenzaldehyd eingesetzt. Umsatzbestimmung mittels

NMR-Standard: 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 5.15 (d, 1H, 3J =

4.0 Hz, anti-CHOH), 5.22 (d, 1H, 3J = 3.6 Hz, syn-CHOH), 6.72-6.82 (m,

3H, H-aromat.). Das Signal der Protonen von syn/anti-CHNH2 wurde

OH

OOH

(2S)-12sC9H11NO4

M = 197.19 g/mol

NH2

OH


152

im Spektrum durch Verunreinigungen überdeckt. Der Umsatz betrug 16% und das

Diastereomerenverhältnis d.r. 53:47.146

8.2.2.8 Allgemeine Arbeitsvorschrift 8 (AAV 8): Optimierte Reaktion mit

o-Chlorbenzaldehyd (1i) als Substrat

Abbildung 8.22. Optimierte Reaktion mit o-Chlorbenzaldehyd (1i) als Substrat

Glycin (11, 2 M) und PLP (50 µM) wurden in Puffer (pH 8, Tris-HCl-Puffer, 0.1 M) gelöst. Nach

Zugabe von o-Chlorbenzaldehyd (1i, 0.25 M) und L-TA aus E. coli (44 U/mmol) wurde das

Reaktionsgemisch 7 h bei 25°C gerührt. Anschließend wurde der Umsatz mittels NMR-

Standard oder Derivatisierung bestimmt (vgl. AAV 7.1 und 7.2).

8.2.2.8.1 Reaktionsverfolgung

Die Durchführung der Reaktion erfolgte analog AAV 8. Es wurden

2.5 mmol o-Chlorbenzaldehyd (1i, 281 µL) und 10 mL L-TA aus E. coli

(11 U/mL, 44 U/mmol) eingesetzt. Es wurden nach verschiedenen

Reaktionszeiten 250 µL-Proben entnommen und der Umsatz analog AAV

7.1 und 7.2 bestimmt. Umsatzbestimmung mittels NMR-Standard:

1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 4.36-4.40 (m, 2H, CHNH3+), 5.56 (d, 1H, 3J = 3.0 Hz,

anti-CHOH), 5.75 (d, 1H, 3J = 4.2 Hz, syn-CHOH), 7.41-7.68 (m, 4H, H-aromat.).

Umsatzbestimmung mittels Derivatisierung: 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) =

5.12-5.16 (m, 1H, anti-CHNH), 5.22-5.24 (m, 1H, syn-CHNH), 5.56 (d, 1H, 3J = 5.2 Hz,


spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten109 bzw. mit

OH

OOH

(2S)-12iC9H10ClNO3

M = 215.63 g/mol

NH2

Cl


153

den Daten des vollständig charakterisierten Racemats überein (Abschnitt 8.2.2.2.4 und

8.2.2.2.5) Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.36 dargestellt.

Tabelle 8.36. Reaktionsverfolgung

Eintrag t [h] Umsatz1) [%] d.r. (syn/anti) 1) Umsatz2) [%] d.r. (syn/anti) 2)

1 0.25 11 74:26 n.b. n.b.

2 0.5 30 80:20 n.b. n.b.

3 1 51 79:21 n.b. n.b.

4 2 76 81:19 n.b. n.b.

5 3 97 80:20 86 78:22

6 5 96 80:20 92 77:23

7 7 98 78:22 91 78:22

8 22 92 80:20 92 78:22

9 144 99 79:21 95 75:25

1)analog AAV 7.2

2)analog AAV 7.1; n.b. nicht bestimmt

8.2.2.8.2 Vergleich mit Reaktion im kleineren Maßstab


0.1 mmol o-Chlorbenzaldehyd (1i, 125 µL) und 500 µL L-TA aus E. coli

(11 U/mL, 44 U/mmol) eingesetzt. Nach 6 h Reaktionszeit wurde die

Reaktion abgebrochen und der Umsatz mittels Derivatisierung analog

AAV 7.2 bestimmt. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 5.12-5.24 (m, 2H, CHNH), 5,56

(d, 1H, 3J = 5.2 Hz, anti-CHOH), 5.86 (d, 1H, 3J = 2.1 Hz, syn-CHOH), 7.25-7.80 (m, 9H, H-

aromat.). Der ee-Wert betrug >99% (OJ-H-Säule, Hexan/i-PrOH/FA 95:5:0.1, v/v, flow 0,8

ml/min, 230nm, tr ((2S,3R)-12i) = 63.05 min, tr ((2S,3S)-12i) = 68.07 min). Die

spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten des vollständig charakterisierten Racemats

überein (vgl. Abschnitt 8.2.2.2.4 und 8.2.2.2.5).

OH

OOH

(2S)-12iC9H10ClNO3

M = 215.63 g/mol

NH2

Cl


154

8.2.2.8.3 Synthese von (2S)-12i ohne Zugabe von Cofaktor

Die enzymatische Reaktion wurde analog AAV 8 einmal mit Zugabe von

PLP (50 µM) und einmal ohne Zugabe von PLP (50 µM) durchgeführt. Es

wurden 3.125 mmol Aldehyd (1i, 351 µL), 5 mL L-TA aus E. coli (27 U/mL,

44 U/mmol) und 7.5 mL Puffer (pH 8, Tris-HCl-Puffer, 0.1 M) eingesetzt.

Die Reaktion wurde nach 7 h durch Ansäuern auf pH 1 durch Zugabe von

HCl gestoppt. Da im Rohextrakt kein Glycerol enthalten war konnte der Umsatz direkt aus

dem Verhältnis von Glycin zu entstandenem Produkt aus dem 1H-NMR-Spektrum bestimmt

werden. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 4.36-4.40 (m, 2H, CHNH3+), 5.56 (d, 1H, 3J =

3.0 Hz, anti-CHOH), 5.75 (d, 1H, 3J = 4.2 Hz, syn-CHOH), 7.41-7.68 (m, 4H, H-aromat.). Die


überein.109,147 Die Ergebnisse der beiden Versuche sind in Tabelle 8.37 dargestellt.

Tabelle 8.37. Enzymatische Umsetzung mit und ohne Zugabe von PLP

Eintrag Cofaktor Umsatz [%] d.r. (syn/anti)

1 mit PLP 96 80:20

2 ohne PLP 91 78:22

8.2.2.8.4 Vergleich mit Benzaldehyd als Substrat


3.125 mmol Benzaldehyd (1e, 316 µL), 5 mL L-TA aus E. coli (27 U/mL,

44 U/mmol) und 7.5 mL Puffer (pH 8, Tris-HCl-Puffer, 0.1 M) eingesetzt.

Es wurde ein Versuch mit und ein Versuch ohne Zugabe von PLP (50 µM)

durchgeführt. Der Umsatz der Reaktion wurde nach verschiedenen Reaktionszeiten durch

Entnahme einer 200 µL-Probe bestimmt. Der pH-Wert der Probe wurde auf 1 eingestellt und

der Umsatz direkt aus dem Verhältnis von Glycin (11) zu entstandenem Produkt 12e

bestimmt. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 4.30 (d, 1H, 3J = 3.8 Hz, syn-CHNH3+), 4.39 (d,

1H, 3J = 4.3 Hz, anti-CHNH3+), 5.38 (d, 1H, 3J = 4.0 Hz, anti-CHOH), 5.43 (d, 1H, 3J = 3.8 Hz, syn-

CHOH), 7.39-7.47 (m, 5H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der

OH

OOH

(2S)-12iC9H10ClNO3

M = 215.63 g/mol

NH2

Cl

OH

OOH

(2S)-12eC9H11NO3

M = 181.19 g/mol

NH2


155

Literatur angegebenen Daten überein.116,141,147 Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.38

dargestellt.

Tabelle 8.38. Vergleichsversuchsreihe mit Benzaldehyd (1e) als Substrat

Eintrag t [h] Umsatz1) [%] d.r. (syn/anti) 1) Umsatz2) [%] d.r. (syn/anti) 2)

1 1 62 64:36 57 63:37

2 5 68 69:31 69 64:36

3 9 71 63:37 73 63:37

4 24 72 64:36 72 61:39

1)mit Zugabe von PLP

2)ohne Zugabe von PLP; n.d. nicht detektierbar.

8.2.2.8.5 Isolierung von (2S)-12i aus Enzymumsetzung

Die Durchführung der Reaktion erfolgte analog AAV 8. Es wurde Aldehyd

1i (25 mmol, 2.8 mL), 40 mL L-TA aus E. coli (27 U/mL, 44 U/mmol) und

60 mL Puffer (pH 8, Tris-HCl-Puffer, 0.1 M) eingesetzt. Nach 7 h

Reaktionszeit wurde durch Entnahme einer 200 µL-Probe (pH-Wert der

Probe mit HCl auf 1 eingestellt) der Umsatz direkt aus dem Verhältnis

von Glycin zu entstandenem Produkt im 1H-NMR bestimmt. Zur restlichen

Reaktionsmischung wurde so lange HCl (5 M) zugegeben bis pH 1 erreicht war und 5 min

gerührt, um die Enzymreaktion zu stoppen. Anschließend wurde wieder neutralisiert und

Ethanol zugegeben (ca. das neunfache Volumen), um überschüssiges Glycin auszufällen. Das

Gemisch wurde über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt, um die Kristallisation zu

vervollständigen. Der Niederschlag, bestehend aus Glycin und ausgefälltem Protein, wurde

abfiltriert und die Lösung am Rotationsverdampfer so lange eingeengt, bis das Produkt

ausfiel. Die Mischung wurde wieder über Nacht kaltgestellt, anschließend filtriert und der

Niederschlag mit EtOH/H2O 80:20 (v/v) gewaschen. Für weitere Fällungen wurde das Filtrat

eingeengt. Bei Fällungen mit geringer Reinheit wurde der Rückstand in EtOH/H2O 1:1 (v/v)

umkristallisiert. Es wurde ein Umsatz von 90% bei einem Diastereomerenverhältnis von d.r.

79:21 (syn/anti) erhalten. Insgesamt wurde eine Ausbeute von 62% (Auswaage 3.3 g) bei

einem Diastereomerenverhältnis von d.r. 78:22 (syn/anti) erzielt. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ

(ppm) = 4.10-4.12 (m, 2H, syn-CHNH2, anti-CHNH2), 5.52 (d, 1H, 3J = 3.5 Hz, anti-CHOH), 5.69

OH

OOH

(2S)-12iC9H10ClNO3

M = 215.63 g/mol

NH2

Cl


156


stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten überein.109,147

8.2.2.8.6 Abtrennung von Glycerin mittels Ionenaustauscher

Die Durchführung der Reaktion erfolgte analog AAV 8. Es wurde Aldehyd

1i (2.5 mmol, 2.8 mL) und 10 mL L-TA aus E. coli (11 U/mL, 44 U/mmol)

eingesetzt. Nach 7 h wurde das Reaktionsgemisch für 10 min auf 100°C

erhitzt, um die Enzymreaktion zu stoppen. Nach Abkühlen auf RT wurde

Ethanol zugegeben (ca. das neunfache Volumen), um überschüssiges

Glycin auszufällen. Das Gemisch wurde über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt, um die

Kristallisation zu vervollständigen. Der Niederschlag wurde abfiltriert, die Lösung mit HCl

angesäuert (pH 1) und das Lösungsmittel und überschüssige HCl am Rotationsverdampfer

entfernt. Der Feststoff wurde in wenig Wasser aufgenommen und auf 3 g des

Ionenaustauschers Dowex 50W X8 aufgebracht. Durch Eluierung mit 1 M NH3-Lösung wurde

das Produkt nach Entfernen des Lösungsmittels erhalten. Das Diastereomerenverhältnis

betrug d.r. 79:21 (syn/anti) und es war noch 41% Glycin (11) enthalten, sowie Protein.

1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 3.56 (s, 2H, CH2-11), 3.66 (s, Verunreinigung durch

Protein), 4.10-4.12 (m, 2H, syn-CHNH2, anti-CHNH2), 5.52 (d, 1H, 3J = 3.5 Hz, anti-CHOH), 5.69


stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten überein.109

8.2.2.8.7 Trennung der Diastereomere

Die Trennung der racemischen Diastereomere wurde mittels Ionenaustauscher und

Kristallisation untersucht.

OH

OOH

(2S)-12iC9H10ClNO3

M = 215.63 g/mol

NH2

Cl


157

8.2.2.8.7.1 Trennung von rac-12i mittels Ionenaustauscher

Auf eine Ionenaustauschersäule (Ø = 4 cm, Dowex 50W X8 15 g) wurde

12i (0.48 mmol, 103 mg, d.r. 82:18 syn/anti) als Hydrochlorid aufgebracht

und mit 0.1 M NH3-Lösung eluiert. Die aufgefangen Fraktionen

(Fraktionsvolumen ca. 10 mL) wurden mittels Dünnschicht-

chromatographie auf Produkt untersucht. Dazu wurden SiO2-Platten mit

Fluoreszenzindikator verwendet und das Laufmittel CH2Cl2/MeOH/NH3 75:20:5 benutzt.

Allerdings konnte nur bei 8 Fraktionen schwache Spots (RF = 0.27) erhalten werden, die nicht

unterschieden werden konnten. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde 87 mg 12i mit

einem schlechteren Diastereomerenverhältnis von d.r. 74:26 (syn/anti) erhalten. Frühere

Fraktionen enthielten 6 mg 12i mit einem Diastereomerenverhältins von d.r. 71:29

(syn/anti). Spätere Fraktionen enthielten 16 mg Produkt mit einem

Diastereomerenverhältnis von d.r. 86:14 (syn/anti). 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 4.10-

4.12 (m, 2H, syn-CHNH2, anti-CHNH2), 5.52 (d, 1H, 3J = 3.5 Hz, anti-CHOH), 5.69 (d, 1H, 3J = 3.5

Hz, syn-CHOH), 7.35-7.67 (m, 4H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den

in der Literatur angegebenen Daten überein.109

8.2.2.8.7.2 Trennung von rac-12i mittels Umkristallisation

12i (0.7 mmol, 150 mg, d.r. 82:18 syn/anti) wurde unter Sieden in

Wasser (6.5 mL) fast vollständig gelöst. Nach Abkühlen auf RT wurde die

Mischung über Nacht in den Kühlschrank gestellt und anschließend

filtriert. Das gewünschte Produkt rac-syn-12i wurde nach Trocknen mit

einer Ausbeute von 43% (Auswaage 65 mg) und einem

Diastereomerenverhältnis von d.r. >25:1 (syn/anti) erhalten. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ

(ppm) = 4.09 (d, 1H, 3J = 3.6 Hz, syn-CHNH2), 5.67 (d, 1H, 3J = 5.6 Hz, syn-CHOH), 7.35-7.65 (m,

4H, H-aromat.). 13C-NMR (100 MHz, D2O) δ (ppm) = 58.46 (syn-CHNH2), 68.51 (syn-CHOH),

127.73, 127.88, 130.17, 130.23, 131.85, 136.66, (C-aromat.), 172.21 (syn-COOH). MS (MALDI,

Matrix: sin) m/z = 216 (M-H)+. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur


OH

OOH

rac-syn-12iC9H10ClNO3

M = 215.63 g/mol

NH2

Cl

OH

OOH

rac-syn-12iC9H10ClNO3

M = 215.63 g/mol

NH2

Cl


158

8.2.2.8.7.3 Trennung von (2S)-12i mittels Fällung aus Wasser mit Aceton

(2S)-12i (1.5 mmol, 325 mg, d.r. 78:22 syn/anti) wurde in Wasser (20 mL)

gelöst und anschließend so lange Aceton (25 mL) zugegeben bis sich ein

Niederschlag bildete. Die Mischung wurde über Nacht in den

Kühlschrank gestellt und anschließend abfiltriert. Es wurden 134 mg

(41%, d.r. 68:32 syn/anti) Feststoff erhalten. Das Filtrat enthielt 144 mg

L-12i (44%, d.r. 87:13 syn/anti). 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 4.10-4.12 (m, 2H,

syn-CHNH2, anti-CHNH2), 5.52 (d, 1H, 3J = 3.5 Hz, anti-CHOH), 5.69 (d, 1H, 3J = 3.5 Hz,

syn-CHOH), 7.35-7.67 (m, 4H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in

der Literatur angegebenen Daten überein.109

8.2.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 9 (AAV 9): Racematspaltung

Abbildung 8.23. Racematspaltung

Zu rac-syn-Phenylserin rac-syn-12e oder rac-syn-o-Chlorphenylserin rac-syn-12i (0.05-0.5 M)

wurde Puffer (pH 8, Tris-HCl-Puffer, 0.1 M), L-TA aus E.coli (27 U/mL, 27-540 U/mmol) und

PLP (50 µM) gegeben und 24 h geschüttelt. Nach Zugabe von HCl wurde das Lösungsmittel

abgezogen und der Umsatz mittels 1H-NMR aus dem Verhältnis von Glycin und Phenylserin

bestimmt.

OH

OOH

(2S,3R)-12iC9H10ClNO3

M = 215.63 g/mol

NH2

Cl


159

8.2.2.1.1 Spaltung von rac-syn-Phenylserin (rac-syn-12e)

Die Reaktion erfolgte analog AAV 9. Es wurden verschiedene

Konzentrationen an rac-syn-12e (0.1 M-0.2 M) eingesetzt und die

Enzymmenge variiert. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 3.85 (s, 2H,

CH2-11), 4.28 (d, 1H, 3J = 4.0 Hz, syn-CHNH3+), 5.44 (d, 1H, 3J = 4.0 Hz,

syn-CHOH), 7.43-7.50 (m, 5H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten

stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten überein.116,147 Die Bedingungen und

Ergebnisse der einzelnen Versuche sind in Tabelle 8.39 dargestellt.

Tabelle 8.39. Racematspaltung von rac-syn-12e

Eintrag Edukt

[M] Enzym

[U/mmol] Enzym

[mL] Puffer

[mL] Glycin

[%] anti-Isomer

[%]

1 0.2 68 0.125 0.125 47 4

2 0.1 135 0.25 0.25 51 3

3 0.2 27 0.05 0.2 46 5

4 0.1 54 0.1 0.4 50 5

8.2.2.1.2 Spaltung von rac-syn-o-Chlorphenylserin (rac-syn-12i)

Die Reaktion erfolgte analog AAV 9. Es wurden verschiedene

Konzentrationen von rac-syn-12i (0.05-0.5 M) eingesetzt und die

Enzymmenge variiert. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 3.85 (s, 2H,

CH2-11), 4.47 (m, 1H, 3J = 3.2 Hz, syn-CHNH3+), 5.75 (d, 1H, 3J = 3.2 Hz,

syn-CHOH), 7.37-7.66 (m, 4H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten

stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten überein.109,147 Die Bedingungen und

Ergebnisse der einzelnen Versuche sind in Tabelle 8.40 dargestellt.

OH

OOH

(2R,3S)-12eC9H11NO3

M = 181.19 g/mol

NH2

OH

OOH

(2R,3S)-12iC9H10ClNO3

M = 215.63 g/mol

NH2

Cl


160

Tabelle 8.40. Racematspaltung von rac-syn-12i

Eintrag Edukt

[M]

Enzym

[U/mmol]

Enzym

[mL]

Puffer

[mL]

Glycin

[%]

anti-Isomer1)

[%]

1 0.5 54 0.1 0 9 n.b.

2 0.2 135 0.25 0 20 n.b

3 0.1 270 0.5 0 36 n.b

4 0.067 270 0.5 0.25 44 5

5 0.05 270 0.5 0.5 48 5

6 0.05 540 1.0 0 50 5

7 0.05 54 0.1 0.9 46 5


8.2.2.1.3 Spaltung von rac-syn-Phenylserin (rac-syn-12e) im 25 mL-Maßstab

Die Reaktion erfolgte analog AAV 9. Zu rac-syn-Phenylserin (rac-syn-12e,

2.5 mmol, 0.1 M) wurde 20 mL Puffer (pH 8, Tris-HCl-Puffer, 0.1 M), L-TA

aus E.coli (5 mL, 27 U/mL, 54 U/mmol) und PLP (50 µM) gegeben und

20 h gerührt. Nach Zugabe von HCl, um den pH-Wert auf 1 zu bringen,

wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Umsatz mittels

1H-NMR-Spektroskopie aus dem Verhältnis von Glycin (11) zu Phenylserin (12e) bestimmt.

1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 3.85 (s, 2H, CH2-11), 4.28 (d, 1H, 3J = 4.0 Hz, syn-CHNH3+),

5.44 (d, 1H, 3J = 4.0 Hz, syn-CHOH), 7.43-7.50 (m, 5H, H-aromat.). Die spektroskopischen

Daten stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten überein.116,147 Es wurde ein

Umsatz von 50% erhalten und 4% anti-Isomer nachgewiesen. Zur Isolierung des Produkts

wurde der Rückstand in Wasser aufgenommen und neutralisiert. Das ausgefallen Protein

wurde abfiltriert und die Mutterlauge eingeengt. Es entstand kein Niederschlag und somit

konnte das gewünschte Produkt nicht isoliert werden.

OH

OOH

(2R,3S)-12eC9H11NO3

M = 181.19 g/mol

NH2


161

8.2.2.1.4 Spaltung von rac-syn-o-Chlorphenylserin (rac-syn-12i) im

50 mL-Maßstab

Die Reaktion erfolgte analog AAV 9. Zu rac-syn-o-Chlorphenylserin

(rac-syn-12i, 2.5 mmol, 0.05 M) wurde 45 mL Puffer (pH 8, Tris-HCl-

Puffer, 0.1 M), L-TA aus E.coli (5 mL, 27 U/mL, 54 U/mmol) und PLP

(50 µM) gegeben und 20 h gerührt. Nach Zugabe von HCl wurde das

Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Umsatz mittels 1H-NMR-

Spektroskopie aus dem Verhältnis von Glycin (11) und o-Chlorphenylserin (12i) bestimmt.

1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 3.85 (s, 2H, CH2-11), 4.47 (m, 1H, 3J = 3.2 Hz, syn-CHNH3+),

5.75 (d, 1H, 3J = 3.2 Hz, syn-CHOH), 7.37-7.66 (m, 4H, H-aromat.). Die spektroskopischen

Daten stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten überein. 109,147 Es wurde ein

Umsatz von 50% erhalten und 4% anti-Isomer nachgewiesen. Zur Isolierung des Produkts

wurde der Rückstand in Wasser aufgenommen und neutralisiert. Das ausgefallene Protein

wurde durch Filtration entfernt und die Mutterlauge eingeengt. Der gebildete Niederschlag

wurde abfiltriert und das gewünschte Produkt in einer Ausbeute von 15% und einer Reinheit

von 70% erhalten. 1H-NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm) = 4.10-4.12 (m, 2H, syn-CHNH2,

anti-CHNH2), 5.52 (d, 1H, 3J = 3.5 Hz, anti-CHOH), 5.69 (d, 1H, 3J = 3.5 Hz, syn-CHOH),

7.35-7.67 (m, 4H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur


8.2.3 Epoxidsynthese ausgehend von β-Hydroxy-α-aminosäuren 12

8.2.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift 11 (AAV 11): Halohydrinsynthese125

Abbildung 8.24. Halohydrinsynthese

Das entsprechende Phenylserinderivat 12 (1.0-5.6 mmol) wurde in 6 M HCl (3.2-12 mL)

gelöst. Die Mischung wurde auf ca. -10°C gekühlt und es wurde langsam NaNO2 (2.5 Äq.)

OH

OOH

(2R,3S)-12iC9H10ClNO3

M = 215.63.19 g/mol

NH2

Cl


162

zugegeben. Anschließend wurde 16 h bei -10°C gerührt und mit MTBE extrahiert (4 x 10 mL).

Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel

im Vakuum entfernt. Das erhaltene Rohprodukt wurde umkristallisiert.

8.2.3.1.1 Synthese von rac-syn-3-Hydroxy-3-phenylpropansäure (rac-syn-20e)

Die Synthese erfolgte analog AAV 11. Es wurde 5.6 mmol rac-syn-

Phenylserin (rac-syn-12e, 1.0 g) eingesetzt. Das Rohprodukt wurde als

gelbes Öl erhalten und in CH2Cl2/Hexan umkristallisiert. Das gewünschte

Produkt rac-syn-20e wurde mit einer Ausbeute von 29% (Auswaage

326 mg) isoliert. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 4.53 (1H, d, 3J =

5.5 Hz, syn-CHCl), 5.23 (1H, d, 3J = 5.5 Hz, syn-CHOH) 7.33-7.40 (m, 5H, H-aromat.). 13C-NMR

(100 MHz, CDCN3) δ (ppm) = 64.36 (CHCl), 74.52 (CHOH), 127.64, 129.10, 129.20, 140.99

(C-aromat.), 169.21 (COOH). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur


8.2.3.1.2 Synthese von (2S)-2-Chlor-3-(2-chlorphenyl)-3-hydroxypropansäure

((2S)-20i)

Die Synthese erfolgte analog AAV 11. Es wurde 1.5 mmol

o-Chlorphenylserin ((2S)-12i, d.r. 76:24 syn/anti, 323 mg) aus der

enzymatischen Umsetzung in 5 mL HCl (5 M) gelöst und 2.5 Äq. NaNO2

zugegeben. Das Rohprodukt wurde als gelbes Öl erhalten. Der Rückstand

wurde in MTBE aufgenommen und durch Zugabe von 1 M ethanolischer

NaOH-Lösung ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag wurde in Wasser aufgenommen und

mit HCl auf pH 1 angesäuert. Die wässrige Phase wurde dreimal mit CH2Cl2 (4 x 10 mL)

extrahiert und über MgSO4 getrocknet. Der nach Entfernen des Lösungsmittels erhaltene

Rückstand wurde nochmals in Aceton/Petrolether umkristallisiert. Das gewünschte Produkt

(2S)-20i wurde als gelblicher Feststoff mit einer Ausbeute von 23% (Auswaage 81 mg) und

mit einem Diastereomerenverhältnis d.r. >90:10 (syn/anti) erhalten. 1H-NMR (400 MHz,

Aceton-d6) δ (ppm) = 4.90 (d, 1H, 3J = 3.4 Hz, syn-CHCl), 5.81 (d, 1H, 3J = 3.4 Hz, syn-CHOH)

7.26-7.41 (m, 3H, H-aromat.), 7.73-7.76 (m, 1H, H-aromat.); 13C-NMR (100 MHz, Aceton-d6) δ

OH

OOH

rac-syn-20eC9H9ClO3

M = 200.62 g/mol

Cl


163

(ppm) = 62.80 (CHCl), 70.95 (CHOH), 127.64, 129.89, 130.14, 131.98, 139.10 (C-aromat.),

168.75 (COOH); Elementaranalyse (C9H8Cl2O3): Berechnet: C: 45.99, H: 3.43. Gefunden:

C: 46.16, H: 3.86. Die vollständige Charakterisierung erfolgte über das Epoxid.

8.2.3.2 Allgemeine Arbeitsvorschrift 12 (AAV 12): Epoxidsynthese149

Abbildung 8.25. Epoxidsynthese über zwei Stufen

Chlorphenylserin 12i (1.0-1.4 mmol) wurde in 6 M HCl (3.2-4.5 mL) gelöst. Die Mischung

wurde auf ca. -10°C gekühlt und es wurde langsam NaNO2 (2.5 Äq.) zugegeben.

Anschließend wurde 16 h bei -10°C gerührt und mit MTBE extrahiert (4 x 10 mL). Die

vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel im

Vakuum entfernt. Der Umsatz und das Diastereomerenverhältnis wurden mittels 1H-NMR-

Spektroskopie bestimmt. Anschließend wurde das Halohydrin 20i als Rohprodukt eingesetzt.

20i (0.7-1.0 mmol) wurde in 12 mL THF (abs.) gelöst und langsam t-BuOK (2 Äq.) in t-BuOH

(7 mL) zugegeben. Nach 16 h rühren wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.

Anschließend wurde Wasser zugegeben, auf pH 3 angesäuert (1 M HCl) und mit CH2Cl2

(4 x 10 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet

und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Anschließend wurde der Umsatz und das

Diastereomerenverhältnis mittels 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Zur Aufarbeitung wurde

das Rohprodukt in MTBE aufgenommen und durch Zugabe von ethanolischer NaOH-Lösung

(1 M) ausgefällt. Der Niederschlag wurde abfiltiriert und mit MTBE gewaschen. Nach

Neutralisation wurde das gewünschte Produkt erhalten.


164

8.2.3.2.1 Synthese von rac-syn-3-(2-Chlorphenyl)oxiran-2-carbonsäure

(rac-syn-21i)

Die Synthese erfolgte analog AAV 12. Es wurde rac-syn-

o-Chlorphenylserin (rac-syn-12i, 1 mmol, 214 mg) in 3.2 mL HCl (5 M)

gelöst und 2.5 Äq. NaNO2 zugegeben. Aus dem Rohprodukt wurde

mittels 1H-NMR-Spektroskopie und der Auswaage ein Umsatz von 74%

bestimmt. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 4.90 (d, 1H, 3J =

3.4 Hz, syn-CHCl), 5.81 (d, 1H, 3J = 3.4 Hz, syn-CHOH), 7.26-7.41 (m, 3H, H-aromat.), 7.73-7.76

(m, 1H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten aus Abschnitt

8.2.3.1.2 überein. Das Rohprodukt wurde direkt zum Ringschluss umgesetzt. Das Halohydrin

rac-syn-21i (0.7 mmol) wurde in THF (12 mL) gelöst und t-BuOK (2 Äq.) in t-BuOH (7 mL)

zugegeben. Es wurde ein vollständiger Umsatz erhalten. Das saubere Produkt konnte ohne

weitere Umkristallisation nach ethanolischer Fällung als gelblicher Festoff in einer Ausbeute

von 34% (Auswaage 68 mg) isoliert werden. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 4.02 (d,

1H, 3J = 4.6 Hz, CHCOOH), 4.45 (d, 1H, 3J = 4.6 Hz, CHAr), 7.29-7.50 (m, 4H, H-aromat.); 13C-

NMR (100 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 55.5, 56.03 (CH), 127.25, 129.52, 129.63, 130.42,

132.60, 133.52 (C-aromat.), 167.53 (COOH); MS (EI) m/z = 198 (M)+; IR ṽ (cm-1): 2979, 1711,

1480, 1249, 1061, 935, 757; Elementaranalyse (C9H7ClO3) Berechnet: C: 54.43, H: 3.55.

Gefunden: C: 53.76, H: 3.48; Schmelzpunkt: 112°C.

8.2.3.2.2 Synthese von (2R)-3-(2-Chlorphenyl)oxiran-2-carbonsäure ((2R)-21i)

Die Synthese erfolgte analog AAV 12. Es wurde 1.4 mmol

(2S)-o-Chlorphenylserin ((2S)-12i, d.r. 78:22 syn/anti, 285 mg) aus der

enzymatischen Umsetzung in 4.5 mL HCl (5 M) gelöst und 2.5 Äq.

NaNO2 zugegeben. Aus dem Rohprodukt wurden mittels 1H-NMR-

Spektroskopie und der Auswaage ein Umsatz von 70% und ein

Diastereomerenverhältnis von d.r. 80:20 (syn/anti) bestimmt. 1H-NMR (400 MHz, Aceton-d6)

δ (ppm) = 4.53 (d, 1H, 3J = 8.5 Hz, anti-CHCl), 4.90 (d, 1H, 3J = 3.4 Hz, syn-CHCl), 5.58 (d, 1H,

3J = 8.7 Hz, anti-CHOH), 5.81 (d, 1H, 3J = 3.4 Hz, syn-CHOH), 7.27-7.76 (m, 4H, H-aromat.). Die

spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten aus Abschnitt 8.2.3.1.2 überein. Das

Rohprodukt wurde direkt zum Ringschluss umgesetzt. Das Halohydrin (2S)-21i (1 mmol)


165

wurde in THF (12 mL) gelöst und t-BuOK (2 Äq.) in t-BuOH (7 mL) zugegeben. Es wurde ein

vollständiger Umsatz erzielt. Bei der Fällung aus MTBE mit NaOH wurde in einer 1. Fällung

sauberes Produkt in einer Ausbeute von 30% (Auswaage 83 mg) und einem

Diastereomerenverhältnis von d.r. 82:18 (syn/anti) erhalten. Zum Filtrat wurde anschließend

nochmal ethanolische NaOH (1 M, 0.5 mL) und MTBE (5 mL) gegeben. Die erhaltene

2. Fällung enthielt das gewünschte Produkt (2R)-21i in einer Ausbeute von 22% (Auswaage

61 mg) und einem Diastereomerenverhältnis von d.r. 95:5 (syn/anti). Es wurde eine

Gesamtausbeute von 52% erzielt. Der ee-Wert des syn-Isomers betrug >99% (OJ-H-Säule,

Hexan/i-PrOH/FA 98:2:0.1, v/v, flow 0.5 mL/min, 230 nm, tr (2R,3R) = 53.18 min). 1H-NMR

(400 MHz, Aceton-d6) δ (ppm) = 3.50 (d, 1H, 3J = 1.8 Hz, anti-CHCOOH), 4.02 (d, 1H, 3J = 4.8

Hz, syn-CHCOOH), 4.37 (d, 1H, 3J = 1.8 Hz, anti-CHAr), 4.46 (d, 1H, 3J = 4.6 Hz, CHAr), 7.29-

7.50 (m, 4H, H-aromat.). Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des Racemats

überein (vgl. Abschnitt 8.2.3.2.1).

LITERATURVERZEICHNIS

166

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(Produktnummer 1.1.030) der evocatal GmbH, Merowinger Platz 1a, 40225 Düsseldorf

(Internet: http://www.evocatal.com); b) (R)-Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus

kefir: A. Weckbecker, W. Hummel, Biocatal. Biotransform. 2006, 24, 380-389.

80 Die in diesem Abschnitt beschriebenen und von mir erstellten Arbeiten entstanden im

Rahmen einer arbeitskreisinternen Zusammenarbeit mit Marina Kraußer und Giuseppe

Rulli.

81 G. Rulli, Diplomarbeit, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, 2009; b) G.

Rulli, geplante Dissertation, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.

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Synlett 2002, 9, 1487-1490; d) T. Nishiyama, S. S. Mohile, T. Kajimoto, M. Node,

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87 T. Nishiyama, T. Kajimoto, S. S. Mohile, N. Hayama, T. Otsuda, M. Ozeki, M. Node,

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88 T. Tanaka, C. Tsuda, T. Miura, T. Inazu, S. Tsuji, S. Nishihara, M. Hisamatsu, T. Kajimoto,

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115 Die in diesem Abschnitt beschriebenen und von mir angefertigten Arbeiten wurden im

Rahmen eines von der DBU geförderten Kooperationsprojekts (AZ 13217) angefertigt,

an dem verschiedene Partner aus Industrie und Universität beteiligt waren und im


173

Rahmen einer arbeitskreisinternen Zusammenarbeit mit Sabine Simon, Giuseppe Rulli,

und Marina Kraußer.

116 T. Shiraiwa, R. Saijoh, M. Suzuki, K. Yoshida, S. Nishimura, H. Nagasawa, Chem. Pharm.

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137 The results, which I obtained and are described in this chapter, were achieved within a

cooperation with Marina Kraußer and Giuseppe Rulli.

138 The results, which I obtained and are described in this chapter, were achieved within a

project cooperation, which was supported by the DBU (AZ 13217). The participants

were different partners from industry and university, in particular Sabine Simon,

Giuseppe Rulli, Marina Kraußer and Nina Dückers.

139 Y. Zhou, Z. Shan, Tetrahedron: Asymmetry 2006, 17, 1671-1677.

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