Z. Lebensm. Unters.-Forseh. 157, 23--27 (1975) © by J. F. Bergmann, Mfinchen 1975

PH-statische Pektinesterase.Bestimmung in SiiBkirschen Paul Sehmid*

Institut ffir Obstbau der Techn. Universit~t in Mfmchen Weihenstephan (BRD)

Eingegangen am 10. Juni 1974

P H - S t a t i e Pec t in Es te rase Analys i s in Sweet Cherries

Su~nrnary. For the analysis of pectin esterase (PE) activities in sweet cherries some methods, as described in literature, were tested as to their usefulness in this specific range of application. The PE activities in dependence of the methods of extraction, the pH-value and the temperature were examined and a suitable procedure was achieved. With this method the PE activities in depo- sited sweet cherries were analyzed.

Zusammen/assung. Ffir die Bestimmung der Pektinesterase (PE)-Aktivit~iten in SfiBkirsehen ~ l rden einige in der Literatur beschriebene Methoden auf ihre Brauehbarkeit in diesem speziellen Anwendungsbereich geprfift. Die PE-Aktivit~ten in Abh~ngigkeit vom Extraktionsveffahren, yore pH-Wert und yon der Temperatur wurden untersucht mad ein geeignetes Veffahren erarbei- tet. Mit dieser Methode wurden die PE-Aktivit~ten in gelagerten SfiBkirschen bestimmt.

E|nle|tung Die qualitative und quantitative Zusammensetzung der Pektine in den Frfichten und ihre

~nderung w~hrend des Reifens und Lagerns und bei der Konservierung sind mit ein MaB ffir ihre :Fruehtfleischfestigkeit. Die Bestimmung der einzelnen Pektinfraktionen und der pektinabbauen- den Enzyme kann hierfiber wichtige Aufsehlfisse geben. Die Pektinesterase (PE) ist neben der Pek- tinase (Polygalakturonase) ffir den Abbau der Pektine verantwortlieh. Im Rahmen unserer Arbei- ten fiber Kurzzeitlagerung yon SfiBkirschen erschien uns neben der quantitativen Effassung der Pektine besonders die Bestimmung der Pektinesterase-Aktivit~t wfinsehenswert. In einigen l~rfichten wurde sic bereits w~hrend des Reifens und Lagerns untersucht [1--4]. Die Brauehbar- keit der hierffir in der Literatur besehriebenen Methoden muBte ffir unseren Anwendungsbereich geprfift und das Verfahren entsprechend modifiziert werden. Wir haben daher verschiedene Iso- lierungsverfahren der Pektinesterase yon Sfiflkirschen und die Abh~ngigkeit der PE-Aktivit~t yon verschiedenen Faktoren untersucht.

Ergebnisse Als Marl ]~tr die Pektinesterase-Aktivlt(tt diente die pro Zeiteinheit aus einer PektinlSsung frei-

gesetzte Polygalakturons~ure. Sie wurde ausgedrfiekt in ~Val Polygalakturons~ure/min (=Ein- heiten oder U), gewShnlich bezogen auf 100 g Fruchttroekensubstanz. Die freiwerdende S~ure wnrde pH-statisch mit einer 0,1 n-NaOtt ans einer an das PH-Meter angeschlossenen mad fiber einen Titrator gesteuerten Autobfirette laufend neutralisiert. Der NaOH-Verbrauch wurde in Ab- h~ngigkeit yon der Zeit durch einen gekoppelten Sehreiber registriert.

Die Extraktion der Pektinestera~e aus den Frf ieh ten und die Besei t igung yon ak t iv i - t / ~ shemmenden Subs tanzen bere i te ten anfangs einige Sehwier igkei ten. Ein d i rek tes LSsen der E n z y m e aus den Fr f ich ten mi t einer KoehsalzlSsung, wie es verschiedene A u t o r e n empfehlen [1, 3, 4 - - 6 ] , war n icht mSglich. Wahrsehein l ich werden die En- zyme durch den hohen Gehal t der Ki r sehen an Po lypheno loxydase und Po lypheno len bere i t s bei de r Zerkle inerung der Ki r sehen dureh die hieraus en t s tehenden Oxyda- t ions- und Po lymer i s a t i onsp roduk te als EiweiB-Gerbs tof f -Komplex inak t iv ie r t .

:Beim Homogenisieren der Friichte mi t ka l t em Aee ton und ansehlieBender ersehSp- fender E x t r a k t i o n m i t dem gleichen LSsungsmi t te l [2, 7] wurden die Po lyphenole nebs t e inigen anderen Stoffen ent fernt , w~hrend die Pek t ines te rase im Rf ieks tand (Aeetonpulver) verbl ieb. Das Ende der erschSpfenden E x t r a k t i o n war erreicht , wenn das le tz te Ace ton f i l t r a t bei 280 nm im Spek t r a l pho tome te r p rak t i seh keine Absorp- t ion mehr zeigte. I m t rockenen Ace tonpu lve r s ind die E n z y m e bei ca. 4 ° C l/~ngere Zei t lagerf/ihig.

* Frl. R. Dill und Frl. H. Ullmann danke ieh ffir ihre ~iitarbelt bei diesen Untersuchungen.

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Etwas schwieriger gestaReSe sieh die Ex$raktion der gefriergetroekneten Kirsehen mit Aeeton. Der hohe Zuekergehalt (80% der Tr) verhinderte weitgehend die Ex- traktion der aeetonlSsliehen Substanzen. Vielleieht ist aueh die yon Lee u. Wiley [2] gefundene Hemmung der PE-Aktivit/it bei £pfeln dureh zunehmende Zuekermengen auf/~hnliehe Effekte zurfiekzuffihren. Ffir die erste Extraktion warden daher bei ge- friergetroekneten Kirsehen versehiedene Aeeton-Wasser-Gemische erprobt. Die naeh- folgenden Extraktionen erfolgten mit reinem Aeeton.

Tabelle 1. Abh~ngigkeit der ~enge des Aeetonpulvers und der PE-Aktivi~t yon der Zusammen- setzung des 1. Extraktionsmittels

1. Extraktions- Wasserzusatz Acetonpulver PE-Aktivit~t mittel (10 ml, (in mg pro g (in °/o der Tr) in U pro 100 g 0,75 g Tr) Kirsch-Tr) Tr. Aceton/Wasser

14-0 0 87 ,8 - - 4 + 1 2,7 40,5 - - 4+5 7,4 6,1 1670 3-{-1 3,3 10,2 1130

Tabelle 1 gibt die Mengen des Aetonpulvers naeh den versehiedenen ersehSpfenden Extraktionen wieder. Als geeignetes LSsungsmittel fiir die 1. Extraktion erwies sieh bei gefriergetrockneten Kirschen ein Wasser-Aeeton-Gemiseh (4+5) mit ungef£hr 7,4 ml Wasser pro g Troekensubstanz. Diese Wasserkonzentration ~ r d aueh bei der 1. Extraktion der Frisehkirsehen mit reinem Aeeton dureh den Wassergehalt der Friiehte erreieht. Untersuehungen in Abhi~ngigkeit yon der Substratmenge zeigten, dab eine Endkonzentration yon 0,5% Pektin ausreieht, um bei den in Frage kommen- den Enzymkonzentrationen eine lineare Abhi~ngigkeit der freiwerdenden S~ure von der Zeit zu erreiehen, d. h. die Substratkonzentration von 0,5% ist gro$ genug, um aUe aktiven Zentren des Enzyms st~ndig besetzt zu halten.

Weitere Untersuchungen dienten der quantitativen Br]assung der Pektinesteraze im Aeetonpulver.DurehAufsehlemmung des Aeetonpulvers in Natriumehlorid-LSsung konnten nur in niedrigen Konzentrationsbereichen reproduzierbare Aktivit~ten er- halten werden. Wie Abb. 1 (gestriehelte Kurve) zeigt, ist die Aktivit£t im unteren

0,061 mVal i rain 0.05

0,04

023

0.02

0,01

0

x

" / ' S ~ t ~ ' I , I I r , l 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 m[ 15,0

100 200 300 400 m q Acetonputver StammLSsung

Abb. 1. A_ktivit~t in Abh~ngigkeit yon der PektinesSerase-Menge. Abh~,ngigkeit yon der NIenge des Acetonpulvers . . . . . bzw. der StammlSsung (60 mg Acetonpulver]ml)x ×

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Bereieh fast linear proport ional dem eingesetzten Acetonpulver. Bei Suspension yon gr56eren Mengen Acetonpulver n immt die PE-Aktivit/~t jedoch nu t noeh unregel- m/~Big und geringfiigig zu. Ffir vergleiehende quant i ta t ive Untersuchungen k/ime also nur der untere Bereich in Frage. Weitere Versuche, die Pektinesterase quant i ta t iv aus dem Acetonpulver zu extrahieren und yon der Festsubstanz abzutrennen, erga- ben, dab sich eine 5%ige NatriumchloridlSsung hierzu am besten eignet (Tab. 2).

Tabelle 2. PE-Aktivit~t in den atffeinanderfolgenden Ex~rakten des Acetonpulvers

PE-Aktivit~t (in U pro 0.75 mg Tr)

Versuch t Versuch 2

Aufschlemmung 11,2 - - 1. Extrakt 11,6 12,5 2. Extrakt 4,3 5,0 3. Extrakt 0,8 0,1

Zweimal je 5 ml 5°/oige Na~riumchlorid-LSsung geniigen, um die PE quantitativ aus 150 mg Joeton-Pulver zu isolieren. Bei den folgenden Bestimmungen wurde mit dreimal je 5 ml NaC1- LSsung extrahiert. Weiter konnten wit feststellen, da[~ die Aktivit~it der Aeetonpulver-Suspen- sion ungef~hr der Aktiviti~t des 1. Extraktes entspricht.

Die Abh~ngigkeit der Aktivit~t yon der PE-Konzentration wurde nochmals mit gel6ster PE wiederholt. Hiefffir wurden 3 g Acetonpulver einma| mit insgesamt 50 ml 5°/oiger NaCl-LSsung extrahiert. Von dieser Stamm-LSsung wurden verschiedene Mangen zur Pektinl6sung gegeben. Das Endvolumen und die Substratkonzentration (0,5%) wurden durch Zusatz yon entsprechenden ~engen NaCI-LSsung konstant gehalten. Wie man aus Abb. 1 sieht, ist die Aktivit&t in unserem ~Ie6bereieh linear proportional der PE-Konzentration. W&hrend die PE im Acetonpulver l~ngere Zeit unbeschadet haltbar ist, nimmt die Aktivi~t in LSsung bereits nach einem Tag, selbst bei Kfihhmg, stark ab (Abb. 4).

Die Abh~ngigkeit der PE-Akt iv i t~ t yon der Tempera tur im Bereieh yon 15--40 ° C ist in Abb. 2 wiedergegeben. Man sieht, dal~ die Zunahme der Akt ivi t£ t bis 35 ° C linear proport ional dem Temperaturanst ieg ist. I n Abb. 3 ist die Abh&ngigkeit der Aktivi t~t yore p H der LSsung aufgefiihrt. Ein relativ breiter Maximumbereieh er- s t reckt sieh yon ca. pI-I 5,5--9,5.

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T~ ::&

2O

10 20 30 o C 40

Abb. 2. PE-Aktivi~t in Abhangigkeit yon der Temperatur

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Naeh Angaben yon Collins [2] ist die Pektinesterase in Erbsen ziemlieh resistent gegen Hitze. Die Konsistenz hitzekonservierter Kirschen kfnnte mit yon der Resistenz ihrer PE und dem ange- wandten Konservierungsverfahren beeinfluBt werden.

Wir haben daher jeweils gleiehe Mengen einer Enzymextrakt-Stamml6sung 15 rain im Ther- mostat auf versehiedene Temperaturen erhitzt und naeh dem Wiederabkfthlen auf 23 ° C die Akti- vitiit gemessen. Die Erhitzungsversuche wurden einmal mit friseh extrahierter Enzyml6sung und einmal mit der gleiehen, abet einen Tag bei ca. 4 ° C aufbewahrten LSsung durehgeffikrt. (Abb. 4)

8O

60

20

0 3,0

x

! I I l T I I I T ! 1 ! I

Z,,0 5.0 6.0 7.0 8,0 9.0 pH -Wert

Abb. 3. Abh~ingigkeit der PE-Aktivit~t yore pH-Wert

,=,

10

i i ~ ~ i i i

10 30 50 70 °C -qo Erhitzungstemperatur

Abb. 4. PE-Aktivit~t nach 15 rain Erhitzen auf versehiedene Temperaturen und Abkfxhlen au{ 23 ° C. × × = frische PE-L6sung, • . . . . einen Tag a r e PE-L6sung

~ b e r r a s c h e n d ist , dab du tch die zwischenzeitHche Erw/~rmung bis zu 60 ° C die A k t i v i t ~ t insbesondere bei der frisehen Pekt ines te rase-LSsung erhSht wurde. Es w/~re denkbar , dal~ eventuel l vorhandene Hemmstof fe schneller koagul ieren und h ie rdurch die Akt iv i t /~ tszunahme zu erkl/~ren ist .

I n Tab. 3 s ind die in gelager ten Ki rschen gefundenen Pek t ines t e ra se -Ak t iv i t~ t en und die en t sprechenden Pek t ingeha l t e wiedergegeben. Man sieht, dal3 w/~hrend der Lagerung m i t der A b n a h m e der Aktivit /~t eine Zunahme vor al lem der hSherpolyme- ren Pek t ine s t a t t f i n d e t und umgekehr t . Die fas t periodisch erscheinende Ab- und Zu- n a h m e der A k t i v i t ~ t bzw. Zu- und A b n a h m e der Pek t ine im Ver lauf der Lagerung wurde auch bei anderen Inha l t s s to f fen festgestel l t und soll an anderer Stelle einge- bender d i sku t i e r t werden.

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Arbeitsweise 1. Herstellung des Acetonpulvers

a) Aus frischen Friichten. 50 g Frisclffrueht mit 50 ml kaltem (--15 bis --20 ° C) Aceton im Homogenisator mahlen. Das Gemiseh einige Std. stehen lassen und dann filtrieren. Den Riiek- stsnd noch 2--3mal auf die gleiche Weiss mit Aeeton behandeln bis das letzte Filtrat bei 280 ml hn Spektralphotometer keine Absorption mehr zeigt. Knapp 200 ml Aceton insgesamt verbrau- chen. Die Substanz zuerst im Vakuum und dann im Exsiceator trocknen bis kein Acetongeruch mehr feststellbar ist. Das gewogene Aceton-Pulver bis zum Gebrauch verschlossen bei ca. 4 ° C auf- bewahren.

Tabelle 3. Pektinesterase-Aktivit~it und Pektine in gelagerten SfiBkirschen (HL = Hauptlagerung bei -~1 ° C, NL = Naehlagerung bei Zimmertemperatur)

Lagerzeit PE-Aktivit~t Pektine in Tagen H~O-15sl . oxalat-15sl. NaOH-16sl. Gesamt

(in U/100 g Tr) (in mg/10O g Tr) (in mg/100 g Tr) (in rag/100 g Tr) (in mg/100 g Tr)

Ernte 2450 192,1 552,4 880,7 1625,2 7 HL* + 1 NL* 2300 112,9 563,4 714,8 1391,2 7 HL -~ 3 NL 1800 14 HL -~ 1 NL 2090 132,3 585,8 860,9 1579,0 14 HL -{- 3 1NL 2090 21 HL -~ 1 1NL 2660 151,0 437,7 655,3 1244,0 2 1 H L + 3 N L 2020

b) AusgefrlergetrocknetenKirschen. 750rag des ge~riergetroeknetenKirsehpulversmit 10mlAce- ton]Wasser-Gemisch (445) extrahieren. Naehfolgenden Behandlungen wie bei a). Verwendung kleinerer Probenmengen m6glich, da das gefriergetrocknete Pulver schon weitgehend homogen ist.

2. Bestimmung der Pektinesterase.Aktivitdt 150 mg des Aeetonpulvers mit 5 ml einer 5%igen NaC1-L5sung versetzen, das Gemiseh mit

Natronlauge genau auf pH 9,0 einstellen und dann 20 min sehfitteln. Danach fiber Watts filtrieren und den Riiekstand noeh 2 real mit der gleichen L6sungsmittelmenge behandeln. Die restliehe Festsubstanz verweffen. Die vereinigten Filtrate auf pH 7,5 bringen. 15 ml einer jeden Tag frisch hergestellten 1% igen Pektinl6sung (Apfelpektin B der Fa. Roth) ebenfalls auf pH 7,5 einstellen trod nach dem Temperieren auf 23 ° C zu der PE-L6sung geben.

Zur pH-statischen Titration: Ger~t der Firma Radiometer mit pH-Meter, automatischer Biirette, automatisehem Titrator und gekoppeltem Sehreiber; pH 7,5 als Neutralisationspunkt.

Unter Berfieksiehtigung des pro 100 g Tr erhaltenen Aeetonpulvers kann man die PE-Akti- vit~t in 131100 g Tr. angeben.

Literatur 1. Hultin, H.O., Levine, A.S. : J. Food Sei. 39, 917--921 (1965) 2. Koch ,J , Hess, D.: Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 126, 25--38 (19691 3. Lee, Y.S., Wiley, R.C.: J. Am. Soe. Hort. Sci. 95, 465--468 (1970) 4. Ratner, A., Goren, R., Monselise, S.P.: Plant. Physiol. 44, 1717--1729 (1969) 5. Collins, J .L. : J. Food Sci. 35, 1--4 (1970) 6. l~agel,C.W., Patterson,]~I.E. : J. Food Sci. 32, 294---297 (1967) 7. Ara]~ji, O.A., Yang, H.Y.- J. Food Sci. 34, 340--342 (1969) 8. Rouse, A.H., Knorr, L.C.: Food Technol. 23, 121--123 (1969)

Dr. P. Schmid Institut ffir Obstbau der Techn. Universit~t Mfinchen D-8050 Freising-Weihenstephan Bundesrepublik Deutschland