Photosynthetischer Elektronenfluss: Regulationsmechanismen ...nbn:de:gbv:700... · Ingenhousz, dass...

Photosynthetischer Elektronenfluss: Regulationsmechanismen und die zentrale Rolle

der Ferredoxine

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Doktorgrades der Naturwissenschaften

des Fachbereichs Biologie/Chemie an der Universität Osnabrück

vorgelegt von

Ingo Voß

Osnabrück, November 2009

Diese Arbeit ist meinen Eltern gewidmet.

Vielen Dank für alles.

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG ............................................................................................... 4

1.1 Die Primärreaktion der Photosynthese ...................................................................... 4 1.2 Ferredoxine ............................................................................................................... 8

1.2.1 Ferredoxine als zentrale Elektronenüberträger ................................................................. 9 1.2.2 Fd‐Isoformen in A. thaliana .............................................................................................. 10

1.3 Posttranslationale Regulation des Chloroplasten‐Metabolismus ............................. 11 1.3.1 Das Fd‐Trx‐System ............................................................................................................ 11 1.3.2 Fine‐tuning und feedback‐Regulation .............................................................................. 13 1.3.3 Regulation des Kohlenstoff‐Metabolismus im Chloroplasten .......................................... 13

1.4 Lichtstress und Lichtakklimation ............................................................................. 16 1.4.1 Poising‐Mechanismen ...................................................................................................... 16 1.4.2 Langzeitakklimation und Signalling .................................................................................. 20 1.4.3 Photoinhibition, ROS und antioxidative Systeme ............................................................. 22

1.5 Ziele der Arbeit ....................................................................................................... 25

2 MATERIAL UND METHODEN ..................................................................... 28

2.1 Chemikalien ............................................................................................................ 28 2.2 Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen ............................................................ 28 2.3 Oligonukleotide ...................................................................................................... 29 2.4 Pigmentbestimmung ............................................................................................... 30 2.5 Bestimmung von Frisch‐ und Trockengewicht .......................................................... 31 2.6 Proteinbestimmung nach Bradford ......................................................................... 31 2.7 Stärkenachweis in Blattscheiben ............................................................................. 31 2.8 Reverse Transkriptase PCR (RT‐PCR) ........................................................................ 32

2.8.1 Isolierung von Gesamt‐RNA ............................................................................................. 32 2.8.2 RNA‐Quantifizierung mittels Absorptionsmessungen ...................................................... 33 2.8.3 DNAse‐Verdau .................................................................................................................. 33 2.8.4 Einzelstrang‐cDNA‐Synthese mittels Reverser Transkriptase (RT) ................................... 33 2.8.5 Amplifikation von cDNA mittels Polymerase‐Kettenreaktion (PCR) ................................ 33 2.8.6 Auftrennung der Fragmente im Agarosegel ..................................................................... 34 2.8.7 Densiometrische Auswertung .......................................................................................... 35

2.9 Immundetektion ..................................................................................................... 35 2.9.1 SDS‐PAGE .......................................................................................................................... 36 2.9.2 Western‐Blot und Immundetektion ................................................................................. 36

2.10 Auftrennung von Pigment‐Protein‐Komplexen der Thylakoidmembran im Saccharosegradienten ............................................................................................. 38

2.10.1 Isolierung von Thylakoiden aus A. thaliana ...................................................................... 38 2.10.2 Herstellung des Saccharosegradienten ............................................................................ 39 2.10.3 Probenvorbereitung und Auftrennung ............................................................................ 40

2.11 P700‐Absorptionsmessungen .................................................................................. 41 2.11.1 Experimentelles Setup ...................................................................................................... 41 2.11.2 Bestimmung der maximalen P700‐Absorptionsänderung im NIR .................................... 42 2.11.3 Bestimmung von ΔAP700 im NIR an mit Methylviologen behandelten Blattscheiben ...... 42

II Inhaltsverzeichnis

2.12 Chlorophyllfluoreszenz‐Messungen ........................................................................ 42 2.12.1 Experimentelles Setup ...................................................................................................... 42 2.12.2 Bestimmung der Parameter zur photosynthetischen Lichtnutzung ................................. 43 2.12.3 Bestimmung des Parameters FC ........................................................................................ 44

2.13 CO2‐Gaswechselmessungen .................................................................................... 45 2.13.1 Experimentelles Setup ...................................................................................................... 45 2.13.2 Bestimmung des CO2‐Gaswechsels im steady‐state ......................................................... 47 2.13.3 Lichtsättigungskurven und Chlorophyllfluoreszenz‐Messungen ...................................... 47 2.13.4 A/Ci‐Kurven ....................................................................................................................... 48 2.13.5 Berechnung des Parameters APR ....................................................................................... 49

2.14 ROS‐Bestimmung .................................................................................................... 50 2.14.1 Isolierung von Protoplasten aus Blatt‐Gewebe ................................................................ 50 2.14.2 ROS‐Visualisierung ............................................................................................................ 51

2.15 Lokalisationsstudien ............................................................................................... 51 2.15.1 Klonierung des FdC1‐GFP‐Fusionsproteins ....................................................................... 51 2.15.1.1 Transformation von Plasmid‐DNA in kompetente E. Coli Zellen ...................................... 52 2.15.1.2 Minipräparation von Plasmid‐DNA ................................................................................... 53 2.15.1.3 Maxipräparation von Plasmid‐DNA .................................................................................. 53 2.15.2 Transformation isolierter Protoplasten ............................................................................ 54 2.15.3 Fluoreszenzmikroskopie transformierter Protoplasten .................................................... 55

2.16 Bestimmung der Enzymaktivitäten ......................................................................... 55 2.16.1 NADP‐MDH ....................................................................................................................... 56 2.16.2 G6PDH ............................................................................................................................... 56

2.17 Glutathion‐Bestimmung mittels HPLC ..................................................................... 56

3 ERGEBNISSE ............................................................................................. 58

3.1 Fd2‐KO‐Pflanzen als Modellorganismus zur Untersuchung von Regulations‐ und Akklimationsvorgängen .......................................................................................... 58

3.1.1 Phänotyp ........................................................................................................................... 59 3.1.2 Photosynthetischer Elektronentransport und CO2‐Assimilation ...................................... 60 3.1.2.1 Photosystem I ................................................................................................................... 61 3.1.2.2 Photosystem II .................................................................................................................. 68 3.1.2.3 CO2‐Assimilation ............................................................................................................... 74 3.1.2.4 Licht‐ und CO2‐Abhängigkeit der Photosynthese ............................................................. 75 3.1.3 Reduktionsgrad und Redoxregulation im Stroma............................................................. 80 3.1.3.1 Redoxregulierte Stroma‐Enzyme in Fd2‐KO‐Pflanzen ...................................................... 80 3.1.3.2 Akkumulation von ROS ..................................................................................................... 83 3.1.4 NTRC als Fd‐unabhängiges antioxidatives System ............................................................ 87

3.2 Fd2‐KO‐Pflanzen im Hochlicht ................................................................................. 89 3.2.1 Kurzzeitakklimation im Hochlicht ..................................................................................... 90 3.2.1.1 Anpassungen im photosynthetischen Elektronentransport ............................................. 90 3.2.1.2 CO2‐Assimilation und Photorespiration ............................................................................ 95 3.2.2 Langzeitakklimation im Hochlicht ..................................................................................... 97 3.2.2.1 Phänotyp ........................................................................................................................... 98 3.2.2.2 Anpassungen im photosynthetischen Elektronentransport ............................................. 99 3.2.2.3 CO2‐Assimilation ............................................................................................................. 102

3.3 Charakterisierung der alternativen Fd‐Isoform FdC1 ..............................................104 3.3.1 Bioinformatische Einordnung von FdC1 ......................................................................... 105 3.3.2 Lokalisationsstudien ....................................................................................................... 108 3.3.3 Die Funktion von FdC1 im photosynthetischen Elektronentransport ............................ 109

Inhaltsverzeichnis III

3.4 Fd1‐KO‐Pflanzen als Modell zur Aufklärung unterschiedlicher Funktionen photosynthetischer Fd‐Isoformen ......................................................................... 112

3.4.1 Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Anzuchtbedingungen ............................................. 113 3.4.1.1 Phänotyp ........................................................................................................................ 114 3.4.1.2 Photosynthetischer Elektronenfluss und CO2‐Assimilation ............................................ 116 3.4.2 Induktion des ZET in den Fd1‐KO‐Pflanzen .................................................................... 119 3.4.2.1 Der photosynthetische Elektronenfluss ......................................................................... 120 3.4.2.2 CO2‐Assimilation ............................................................................................................. 123

4 DISKUSSION ............................................................................................ 125

4.1 Fd2‐KO‐Pflanzen – Gleichzeitige Simulation von Hoch‐ und Schwachlicht‐ bedingungen im Chloroplasten .............................................................................. 125

4.1.1 Langzeitakklimation und poising .................................................................................... 125 4.1.2 Signalling ........................................................................................................................ 128 4.1.3 Posttranslationale Regulation ........................................................................................ 132

4.2 Die klassischen Blatt‐Fds Fd1 und Fd2 in A. thaliana – redundant, funktionell differenziert oder beides? ..................................................................................... 134

4.3 Neue FdC1‐Isoform als alternativer Elektronenakzeptor am PSI ............................ 140

5 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................. 144

6 ABSTRACT ............................................................................................... 147

7 LITERATURVERZEICHNIS ......................................................................... 148

8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..................................................................... 162

9 DANKSAGUNG ........................................................................................ 166

10 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG ................................................................ 168

4 Einleitung

1 Einleitung Die Fähigkeit höherer Pflanzen und anderer photoautotropher Organismen, mittels

Photosynthese über Lichtenergie organische Verbindungen zu synthetisieren, ist von

zentraler Bedeutung im Kreislauf des Lebens. Im Rahmen der Photosynthese wird

Kohlenstoffdioxid (CO2) gebunden und Sauerstoff (O2) freigesetzt. Heterotrophe

Organismen wiederum nutzen O2 zur Energiegewinnung mittels Atmung, CO2 wird dabei

frei. Seit mehr als 200 Jahren wird versucht, mit wissenschaftlichen Methoden die

Prozesse der Photosynthese zu analysieren. Bereits Ende des 18. Jahrhunderts erkannte

Ingenhousz, dass Pflanzen im Licht CO2 aufnehmen und O2 freisetzen (vgl. Ingenhousz,

1779). Wissenschaftler befassen sich seitdem bis zum heutigen Tage mit der

Aufschlüsselung der Mechanismen der Photosynthese.

In den folgenden Kapiteln werden die grundsätzlichen molekularen Abläufe der

Photosynthese aufgezeigt. Hierbei wird der Fokus vor allem auf die Primärreaktion bzw.

Lichtreaktion gelegt. Licht ist hierbei nicht nur die universelle Antriebskraft der

Photosynthesereaktion, sondern kann auch bei hoher Strahlungsbelastung zu

Schädigungen am Photosyntheseapparat führen.

Die Primärreaktion der Photosynthese 1.1

In der Primärreaktion der Photosynthese (häufig auch als Lichtreaktion bezeichnet) wird

in Folge der Anregung von zwei Photosystemen über Elektronentransfer und

Protonenverschiebung aus Lichtenergie ATP als Energieträger und, im Zuge des linearen

Elektronentransportes (LET), NADPH als Reduktionsmittel synthetisiert. Durch

Lichtenergie ausgelöste Ladungstrennung in den Photosystemen und der folgenden

Spaltung von Wasser (H2O) werden Elektronen im photosynthetischen

Elektronentransport (PET) auf Ferredoxin (Fd), die erste lösliche Redoxkomponete

übertragen (siehe Abb. 1.1). Der PET ist in der Thylakoidmembran und den darin

assoziierten Proteinkomplexen Photosystem I (PSI), Photosystem II (PSII), Cytochrom‐

b6f‐Komplex (Cyt‐b6f), F‐ATP Synthase (F‐ATPase) und den Lichtsammelkomplexen (light

harvesting complexes – LHCs) lokalisiert (vgl. Marder und Barber, 1989).

Die Photosynthese beginnt mit der Absorption von Lichtenergie über die LHCs, welche

in Form von Excitonen in die aktiven Zentren von PSI und PSII weitergeleitet wird.

Dieses System ermöglicht eine effiziente und spektral breite Lichtnutzung. Die

Lokalisation verschiedener Pigmente, Carotinoide und Chlorophylle vergrößert das

Absorptionsspektrum der LHCs. Mit LHCI und LHCII sind bislang zwei unterschiedliche

Einleitung 5

LHCs bekannt (vgl. Vassiliev und Bruce, 2008). Am PSI sind vier LHCI‐Monomere

assoziiert, die zusammen mit den am PSI‐Proteinkomplex lokalisierten Pigmenten 167

Chlorophylle aufweisen, wobei das Verhältnis von Chlorophyll a (Chla) zu Chlorophyll b

(Chlb) bei ca. 9 liegt (vgl. Ben‐Shem et al., 2003; Jolley et al., 2005). In diesem

Zusammenhang muss erwähnt werden, dass an den Proteinkomplexen der

Photosysteme neben Chla nur geringe Mengen an Carotinoiden und kein Chlb zu finden

sind. An PSII liegen zwei LHCII‐Trimere und drei LHCII‐Monomere (CP24, CP26 und CP29)

assoziiert vor, die zusammen mit den an PSII‐Proteinkomplex gebundenen Pigmenten

auf 150 Chlorophylle bei einem Chla/Chlb Verhältnis von 2,5 kommen (vgl. Nield et al.,

2000; Barber, 2002). Neben diesen an den Photosystemen fest lokalisierten LHCs

können höhere Pflanzen einen variablen Anteil an LHCII‐Komplexen aufweisen. Diese

zusätzlichen Komplexe sind dynamisch und können sowohl am PSI als auch am PSII

lokalisiert sein, um eine Optimierung der Lichtnutzung über state transitions (vgl. Kruse,

2001; Dekker und Boekama, 2005) zu erreichen.

Abb. 1.1: Schematische Darstellung der Primärreaktion der Photosynthese. Dargestellt sind die Komponenten des PET sowie der Protonen‐ und Elektronentransfer (gestrichelte rote Linie) der Primärreaktion mit den Endprodukten des LET NADPH und ATP.

Über die am PSII lokalisierten LHCs wird Lichtenergie auf das reaktive Zentrum des PSII

(P680) weitergeleitet. Das PSII‐Reaktionszentrum wird im Wesentlichen aus den zwei

Membranproteinen D1 und D2 gebildet (vgl. Zouni et al., 2001; Ferreira et al., 2004), an

welche insgesamt 96 Chla‐Moleküle gebunden sind (vgl. Schubert et. al. 1997; Jordan et

al., 2001). Neben den Chla‐Molekülen sind zusätzlich Carotinoide, Phäophytin und

Plastochinon (PQ) assoziiert. Das P680 ist wahrscheinlich ein Chla‐Dimer, dessen

6 Einleitung

spektrale Eigenschaften mit einem Absorptionsmaximum bei 680 nm die Nomenklatur

begründen. Ist die von den LHCs absorbierte Lichtenergie ausreichend, wird das P680 in

den angeregten Zustand (P680*) überführt. Das hierbei angeregte Elektron wird über

Phaeophytin auf den primären Elektronenakzeptor QA, ein fest am PSII‐Proteinkomplex

gebundenes Plastochinon, übertragen. Die Elektronenlücke am oxidierten P680 (P680+)

wird über die Oxidation von H2O zu O2 unter Abspaltung von Protonen (H+) im

Thylakoidlumen aufgefüllt (vgl. Yachandra et al., 1996). Die Freisetzung von O2 ist

messbar und ein Maß für linear transportierte Elektronen (vgl. Walker, 1988). Das QA

bildet in Folge der Reduktion ein Semichinonradikal, von welchem das Elektron auf ein

weiteres, locker am PSII‐Proteinkomplex assoziiertes PQ, dem QB, übertragen wird. Im

Gegensatz zu QA kann QB zweifach reduziert werden und nimmt nacheinander zwei

Elektronen vom PSII auf. Im Zuge dieser Reduzierung ist QB nicht mehr am PSII‐

Proteinkomplex assoziiert, es bindet zwei Protonen aus dem Stroma, wodurch

Plastohydrochinon (PQH2) entsteht und diffundiert über die Lipidphase der

Thylakoidmembran zum Cyt‐b6f Komplex. Reduziertes QB in Form von PQH2 sowie

oxidiertes QB bilden in ihrer Gesamtheit den Plastochinon‐Pool (PQ‐Pool) in der

Thylakoidmembran.

Am Cyt‐b6f Komplex wird PQH2 oxidiert, wobei die Elektronen auf den Cyt‐b6f Komplex

und die Protonen ins Thylakoidlumen abgegeben werden, so dass ein Protonengradient

über die Thylakoidmembran generiert wird. Über die Bestimmung der

Chlorophyllfluoreszenz‐Emission ist der Protonengradient als qE‐Anteil der nicht‐

photochemischen Fluoreszenzlöschung (NPQ) messbar (vgl. Schreiber et al., 1986, Baker

et al., 2007 und Kapitel 2.12.2 bzw. Kapitel 3.1.2.2). Durch den integralen

transmembranen Proteinkomplex der F‐ATPase (vgl. Cox et al., 1992) wird der

Protonengradient für die ATP‐Synthese genutzt (vgl. Junge, 1989). An der Lumenseite

des Cyt‐b6f Komplexes werden die vom PQH2 kommenden Elektronen auf Plastocyanin

(PC), ein kuperfhaltiges, im Lumen lokalisiertes Protein, übertragen. Reduziertes PC

wandert an der Lumenseite der Thylakoidmembran zum PSI.

Pflanzliches PSI liegt als Superkomplex aus LHCI‐Proteinen und dem PSI‐

Core Proteinkomplex (PSI‐Core) vor und ist nahezu ausschließlich in den Stromalamellen

sowie in den Rändern der Grana‐Stapel der Thylakoidmembran lokalisiert (vgl.

Albertsson, 2001; Anderson, 2002; Kim et al., 2005; Nelson und Yocum, 2006). Der

gesamte PSI‐Superkomplex besteht aus 18 Protein‐Untereinheiten, wobei 14 den PSI‐

Core bilden (vgl. Scheller et al., 2001, Chitnis et al., 2001). Die Nomenklatur der

Untereinheiten von PsaA bis zu PsaO erfolgt nach Goldbeck (1992), angelehnt an die

Bezeichnung der entsprechenden codierenden Gene psaA bis psaO. Hierbei ist zu

Einleitung 7

beachten, dass PsaM nur in Cyanobakterien und PsaG, PsaH, PsaN und PsaO

ausschließlich in Pflanzen und eukaryotischen Algen vorkommen (vgl. Knoetzel et al.,

2002). Insgesamt sind am PSI‐Core 128 Kofaktoren assoziiert (vgl. Krauss, 2003). Die

beiden transmembranen Peptide PsaA und PsaB sind in A. thaliana mit 83,1 kDa bzw.

82,5 kDa die größten Untereinheiten des PSI‐Core. Daran sind 79 Chla‐Moleküle, ein ß‐

Carotinoid, das aktive Zentrum, bestehend aus zwei Chla‐Molekülen (P700), die

Elektronenakzeptoren A0 bzw. A0’ (je ein Chla‐Molekül) und A1 bzw. A1’ (in A. thaliana je

ein Phyllochinon) sowie das 4‐Eisen‐4‐Schwefel‐Zentrum ([4Fe‐4S]‐Zentrum) Fe‐SX (vgl.

Goldbeck, 1992; Krauss et al., 1993; Chitnis, 1996; Jordan et al., 2001; Scheller et al.,

2001; Jensen et al., 2003; Nelson et al., 2006) assoziiert. PsaA und PsaB sind als

Heterodimer in einer zweifach gewundenen virtuellen Achse um P700 und das [4Fe‐4S]‐

Zentrum Fe‐SX angeordnet. Die übrigen Untereinheiten des PSI‐Core sind mit 4 – 18 kDa

deutlich kleiner und zum Teil mit Chla‐Molekülen und ß‐Carotinoiden assoziiert (vgl.

Jensen et al., 2003). PsaC, PsaD und PsaE sind auf der Stromaseite lokalisiert, wobei

PsaD und PsaE für die Bindung von Fd verantwortlich sind (vgl. Merati und Zanetti,

1987; Zilber und Malkin, 1988; Andersen et al., 1992; Pandini et al., 1999; Jordan et al.,

2001), während am PsaC zwei weitere [4Fe‐4S]‐Zentren, Fe‐SA und Fe‐SB, assoziiert

vorliegen. Zusätzlich scheint PsaD für die Orientierung von PsaC und die Stabilisierung

der Interaktionen zwischen Fe‐SA, Fe‐SB und den Fds verantwortlich zu sein. PsaE

hingegen wird eine entscheidende Rolle bei der Interaktion zwischen Fds und der

Ferredoxin‐NADP+‐Reduktase (FNR) (vgl. Shin und Arnon, 1965) sowie im zyklischen

Elektronentransport (ZET) zugeschrieben. An der Lumenseite sind PsaF und PsaN bei der

Bindung von PC an PsaA und PsaB beteiligt (vgl. Farah et al., 1995; Haldrup et al., 1999;

Haldrup et al., 2000). Den übrigen Untereinheiten werden hauptsächlich stabilisierende

Funktionen sowie die Interaktion mit den LHCs zugeschrieben (vgl. Chitnis und Chitnis,

1993; Xu et al., 1994; Xu et al., 1995; Jansson et al., 1996; Fischer et al., 1999; Lunde et

al., 2000; Knoetzel et al., 2002; Jensen et al., 2003; Lunde et al., 2003; Jensen et al.,

2004).

Im PSI verläuft der Elektronentransport über die am PSI‐Core assoziierten Kofaktoren

P700, A0, A1, Fe‐SX, Fe‐SA und Fe‐SB (siehe Abb. 1.2). Über die am PSI lokalisierten LHCs

wird Lichtenergie auf das P700 weitergeleitet. Es kommt zur Ladungstrennung, wobei

P700 oxidiert und der primäre Elektronenakzeptor A0 reduziert wird. Das Elektron wird

von A0 auf das Phyllochinon A1 und darauf folgend auf Fe‐SX übertragen. Vom

reduzierten Fe‐SX geht das Elektron letztendlich auf die am PsaC assoziierten [4Fe‐4S]‐

Zentren Fe‐SA und Fe‐SB über. Oxidiertes P700 (P700+) wird über PC an der Lumenseite

des PSI wiederum reduziert.

8 Einleitung

Die Struktur und Anordnung der am Elektronentransport im PSI beteiligten Moleküle

belegt den oben beschriebenen Weg der Elektronen durch PSI, wirft allerdings auch

Fragen auf, inwieweit abweichende Transportwege über weitere Kofaktoren möglich

sind (vgl. Jordan et al., 2001; Zeng et al., 2002; Gong et al., 2003; Nelson und Yocum,

2006). So ist zu beachten, dass die Elektronentransportkette im PSI aus zwei nahezu

symmetrischen Zweigen an PsaA und PsaB aufgebaut ist, wobei die bereits

beschriebenen Kofaktoren des PSI als „Paare“ am Heterodimer, je ein Molekül an PsaA

bzw. PsaB, assoziiert vorliegen (siehe Abb. 1.2). In Algen und Pflanzen wurden Hinweise

gefunden, die beiden Zweigen eine essentielle Rolle im Elektronentransport in PSI

zuschreiben (vgl. Joliot und Joliot, 1999; Bordreaux et al., 2001; Guergova‐Kuras et al.,

2001; Jordan et al., 2001; Muhiuddin et al., 2001; Purton et al., 2001; Fairclough et al.,

2003; Pushkar et al., 2005), so dass von einer aktiven Funktion sowohl der am PsaA als

auch der am PsaB assoziierten Kofaktoren im Elektronentransport ausgegangen werden

kann (vgl. Ramesh et al., 2004). Trotz dieser Hinweise konnte der genaue Ablauf des

Elektronentransportes in PSI bislang nicht abschließend aufgeklärt werden.

Von den [4Fe‐4S]‐Zentren am PsaC werden Elektronen auf freie stromale Akzeptoren

übertragen. Hierbei nimmt Fd im photosynthetischen Elektronentransport als

Elektronenakzeptor am PSI eine zentrale Rolle ein.

Abb. 1.2: Schematische Darstellung des PSI‐Proteinkomplexes. Dargestellt ist der PSI‐Core mit den assoziierten LHCI‐Komplexen und den am Elektronentransport durch PSI beteiligten Kofaktoren. Der hypothetische Elektronenfluss über PsaA ist durch Pfeile markiert.

Ferredoxine 1.2

Fds sind ubiquitär verbreitete, lösliche Eisen‐Schwefel‐Proteine, die im Metabolismus

von Organismen an zentralen Stellen als Elektronenüberträger lokalisiert sind (vgl.

Einleitung 9

Arnon, 1988). Erstmals wurden Fds in Bakterien als Proteine beschrieben, welche an der

Stickstoff‐Fixierung beteiligt sind (vgl. Mortenson et al., 1962). In Pflanzen sind Fds

kerncodiert, werden als Präproteine im Zytoplasma synthetisiert und über Signalpeptide

in die Plastiden transportiert. Die meisten Pflanzen‐Fds bestehen aus

95 ‐ 98 Aminosäuren (AS) für das native Protein und einer 46 – 54 AS langen

Transitpeptid‐Sequenz am N‐Terminus. Insgesamt weist das native Protein einen hohen

Anteil an sauren AS auf. Vier hoch konservierte Cystein‐Reste sind an der Ausbildung

des charakteristischen 2‐Eisen‐2‐Schwefel‐Zentrums ([2Fe‐2S]‐Zentrums) beteiligt. Fd

nehmen sowohl in photosynthetisch aktiven als auch in heterotrophen Geweben eine

zentrale Rolle als Reduktionsmittel für Fd‐abhängige Enzyme ein. In den Chloroplasten

werden Fds im Licht direkt am PSI über den PET reduziert, während in heterotrophen

Geweben und Zellkompartimenten, z. B. Leukoplasten‐, Amyloplasten‐ und

Chromoplasten‐haltigen Geweben, die Reduzierung von Fd mittels NADPH erfolgt.

1.2.1 Ferredoxine als zentrale Elektronenüberträger

In den Chloroplasten sind Fds elementare Bestandteile der Photosynthesereaktion und

dienen am PSI als zentrale „Verteilerstelle“ für Elektronen (siehe Abb. 1.3). Die

bekannteste Funktion von Fds in Chloroplasten ist die als Elektronendonator zur

Reduktion von NADP+, katalysiert durch FNR. Mit der Reduktion von NADP+ zu NADPH

endet der LET der Photosynthese, der mit der Oxidation von Wasser beginnt (vgl.

Karplus et al., 1991). NADPH wird während der CO2‐Assimilation im reduktiven

Pentosephosphatweg (RPP) bzw. Calvin Zyklus als Reduktionsmittel benötigt. Außer der

Funktion als Elektronendonator im LET besitzt Fd im ZET eine Vermittlerrolle, wenn

Elektronen wieder in den PET der Thylakoidmembran eingeschleust werden

(siehe Kapitel 1.4.1). Weitere plastidäre Enzyme akzeptieren Elektronen direkt von Fd

für anabolische Prozesse. Hier sind u.a. Sulfit‐ und Nitrit‐Reduktase, Fd‐GOGAT und die

Fettsäure‐Desaturase von Bedeutung (vgl. Knaff, 1996). Weiter überträgt Fd Elektronen

auf oxidiertes Thioredoxin (Trx), katalysiert durch die Ferredoxin‐Thioredoxin‐Reduktase

(FTR), wobei der Reduktionszustand der Thylakoidmembran in ein regulatorisches Signal

zur Kontrolle der Aktivität vieler Enzyme, u.a. im Calvin‐Zyklus und oxidativen

Pentosphosphatweg (OPP, siehe Kapitel 1.3.3), umgesetzt wird (vgl. Montrichard et al.,

2009). Die flexible Verteilung der Elektronen über Fd ist von entscheidender Bedeutung

für die Regulation der Photosynthese sowie der assimilatorischen Prozesse im Licht und

unterliegt hierbei einer hierarchischen Ordnung (vgl. Backhausen et al., 2000). Der LET

zur Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten in Form von NADPH sowie die S‐ bzw. N‐

Assimilation besitzen eine hohe Priorität in der Fd‐abhängigen Elektronenverteilung.

10 Einleitung

Abb. 1.3: Fd‐abhängige Elektronenverteilung im Stroma. Schematisch dargestellt ist der photosynthetische Elektronentransfer auf diverse Akzeptoren im Stroma mit Fd als zentraler „Verteilerstelle“ und erstem Elektronenakzeptor am PSI.

1.2.2 Fd‐Isoformen in A. thaliana

In höheren Pflanzen sind verschiedene Fd‐Isoformen im Genom codiert (vgl. Hase et al.,

1991; Hanke et al., 2004; Hanke und Hase, 2008). Alle Pflanzen, für die signifikante EST‐

(expressed sequence tag) bzw. cDNA‐Datenbanken vorliegen, besitzen eine Fd‐Isoform

mit einer hohen Affinität zur FNR in nicht photosynthetisch aktiven Geweben, weshalb

diese Isoform auch als „Wurzel‐Fd“ bezeichnet wird (vgl. Onda et al., 2000; Hanke et al.,

2004) und mindestens zwei photosynthetische Fd‐Isoformen (vgl. Hase et al., 1991;

Hanke und Hase, 2008), welche aus diesem Grund häufig als Blatt‐Fds geführt werden.

In der C4‐Pflanze Mais werden den Blatt‐Fd‐Isoformen unterschiedliche Funktionen im

LET bzw. ZET zugeschrieben (vgl. Kimata und Hase, 1989; Matsumura et al., 1999;

Kimata‐Ariga et al., 2000). In C3‐Pflanzen konnten funktionelle Unterschiede der Blatt‐

Fds bislang nicht eindeutig nachgewiesen werden.

Vier verschiedene Fd‐Isoformen sind für A. thaliana bislang beschrieben. Neben den

Blatt‐Fds, Fd1 (AGI‐Code: At1g10960) und Fd2 (AGI‐Code: At1g60950), kommt das

klassische Wurzel‐Fd (Fd3 – AGI‐Code: At1g27510) und eine Fd3‐ähnliche Fd‐Isoform

(Fd4 – AGI‐Code: At5g10000) vor (Hanke et al., 2004). Zusätzlich sind zwei weitere,

bislang unbekannte Fd‐ähnliche Peptide (AGI‐Code: At4g14890 bzw. At1g32550) codiert

(Hanke et al., 2004). Diese Fd‐ähnlichen Peptide (At1g32550, At4g14890) enthalten die

konservierten Cystein‐Reste für die Bildung des [2Fe‐2S]‐Zentrums, weisen am C‐

Terminus allerdings deutliche Unterschiede zu den übrigen Fd‐Isoformen auf (siehe

Einleitung 11

Kapitel 3.3). Mit 90 % Anteil an den Blatt‐Fds (Fd1 und Fd2) bildet Fd2 in A. thaliana die

vorherrschende photosynthetische Isoform, während Fd1 nur in vergleichweise

geringen Mengen translatiert wird (vgl. Hanke et al., 2004; Voss et al., 2008). Obwohl

Fd1 und Fd2 eine ähnliche Affinität zur FNR besitzen, gibt es erste Hinweise, die auf eine

spezifische Funktion von Fd1 bei A. thaliana im ZET hindeuten (vgl. Hanke und Hase,

2008).

1.3 Posttranslationale Regulation des Chloroplasten‐Metabolismus

Organismen sind in der Lage, die Geschwindigkeit ihrer metabolischen Prozesse zu

regulieren und somit auf veränderte endogene sowie exogene Faktoren zu reagieren.

Dies ist notwendig, um die intrazelluläre Homöostase aufrecht zu erhalten. Dieses

Prinzip ist in besonderer Weise im chloroplastidären Metabolismus von Pflanzen

verwirklicht, wobei eine Anpassung an das wechselnde Angebot von Licht, Wasser und

Substraten erfolgt. Die häufigste Änderung, an welche der chloroplastidäre

Metabolismus angepasst werden muss, ist der natürliche Tag/Nacht‐Wechsel. Der

Metabolismus am Tag mit der Synthese von Kohlenhydraten ist hierbei vom

Metabolismus in der Nacht mit dem Abbau von Kohlenhydraten vollkommen

unterschiedlich. Um das Auftreten nutzloser Verluste (futile cycles) zu vermeiden, ist die

Aktivität von Enzymen beider Stoffwechselwege streng reguliert. Viele Prozesse im

Stroma unterliegen somit einem fine‐tuning, wobei die beteiligten Enzyme u.a. über den

Intermediatspiegel der entsprechenden Stoffwechselwege einer indirekten

lichtabhängigen Kontrolle unterliegen. Zusätzlich ist die Aktivität einiger

Schlüsselenzyme direkt über Licht mittels des Ferredoxin‐Thioredoxin‐System (Fd‐Trx‐

System, siehe Kapitel 1.3.1) reguliert.

1.3.1 Das Fd‐Trx‐System

Das Fd‐Trx‐System ist ein Oxidations‐Reduktions‐Mechanismus, der die

Stoffwechselaktivität im Stroma an den PET koppelt (vgl. Buchanan, 1980; Wolosuik et

al., 1993; Buchanan und Balmer, 2005, Mora‐Gracia et al., 2006; Schürmann und

Buchanan, 2008) und eine direkt posttranslationale Lichtregulation darstellt. Ein Teil der

Elektronen des PET wird von reduzierten Fd, katalysiert durch die FTR, direkt auf die Trx

übertragen. Reduzierte Trx fungieren als Elektronenüberträger und verändern die

katalytische Aktivität diverser Zielenzyme, was zu einer Aktivierung bzw. Deaktivierung

führt (siehe Abb. 1.4). So wird z. B. die RubisCO‐Aktivase über das Fd‐Trx‐System

posttranslational aktiviert (vgl. Zhang und Portis, 1999). Hingegen ist das

12 Einleitung

Schlüsselenzym des OPP, die Glukose‐6‐Phosphat‐Dehydrogenase (G6PDH), im Licht

über das Fd‐Trx‐System inaktiviert (vgl. Buchanan, 1980; Scheibe, 1990; Wenderoth et

al., 1997). Die hierbei vorliegende kovalente Redox‐Modulation wird durch einen Thiol‐

Disulfid‐Austausch regulatorischer Cystein‐Reste in den Proteinen verursacht (vgl.

Buchanan 1980; Droux et al., 1987). In A. thaliana, wie auch in anderen höheren

Pflanzen, kommen die unterschiedlichsten Trx‐Gruppen vor, welche insgesamt von

einer großen Genfamilie codiert werden (vgl. Meyer et al., 2005) und in vielen

verschiedenen Geweben und Zellkompartimenten lokalisiert sind. Das aktive Zentrum

besteht für alle bekannten Trx aus zwei Cystein‐Resten, getrennt durch zwei weitere AS‐

Reste (CxxC). Eine detaillierte Beschreibung der diversen Trx‐Gruppen und ihrer

Eigenschaften bzw. Funktionen ist in Meyer et al. (2005) gegeben. In den Chloroplasten

werden Trx im Licht über die FTR reduziert, während im Cytosol entsprechend eine

NADPH‐Thioredoxin‐Reduktase (NTR) diese Funktion ausfüllt und NADPH als

Elektronendonator fungiert. Zusätzlich ist in A. thaliana ein Gen für eine

chloroplastidäre NTR codiert (NTRC; AGI‐Code: At2g41680), welche zusätzlich außer

einer NTR‐ eine Trx‐Domäne besitzt und NADPH als Elektronendonator nutzt. An den

homologen Proteinen in Reis konnte gezeigt werden, dass NTRC eine Schlüsselfunktion

im Abbau reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) einnimmt und u.a. als Elektronendonator

für darin beteiligte Peroxiredoxine fungiert (vgl. Serrato et al., 2004; Pérez‐Ruíz et al.,

2006 und Kapitel 1.4.3).

Abb. 1.4: Das Fd‐Trx‐System im Stroma. Schematisch dargestellt ist die Aktivierung bzw. Deaktivierung von Zielenzymen über das Fd‐Trx‐System und die Kopplung an die PET.

Es wird angenommen, dass das Spektrum der über das Fd‐Trx‐System kontrollierten

Stoffwechselwege äußerst vielfältig ist (vgl. Buchanan und Balmer, 2005; Mora‐Gracia,

2006). Im Chloroplasten ist es vor allem eine Regulationsschnittstelle, welche die

metabolische Aktivität im Stroma direkt an die Intensität des photosynthetischen

Elektronenflusses im Zuge der Primärreaktion koppelt und somit ein Regulationssystem

Einleitung 13

zur effektiven und schnellen Anpassung auf wechselnde endogene und exogene

Faktoren (z. B. den Tag/Nacht‐Wechsel) darstellt.

1.3.2 Fine‐tuning und feedback‐Regulation

Neben der posttranslationalen Regulation über das Fd‐Trx‐System (siehe Kapitel 1.3.1)

unterliegen viele Enzyme im Chloroplasten einer postranslationalen Feinregulation oder

einem fine‐tuning über die Intermediate des Metabolismus. Das fine‐tuning ist an den

Elektronenfluss in der Primärreaktion gekoppelt und stellt somit eine indirekte

Lichtregulation dar. So ist für die NADP‐abhängige Malatdehydrogenase (NADP‐MDH)

und die Fructose‐1,6‐Bisphosphat‐Phosphatase (FBPase) eine Aktivierung bzw.

Inaktivierung über den Reduktions‐ bzw. Oxidationsgrad stromaler Intermediate

bekannt. Am Beispiel der NADP‐MDH erfolgt eine Deaktivierung über ein geringes

NADPH/(NADPH+NADP+)‐Verhältnis im Stroma (vgl. Scheibe und Jacquot, 1983),

welches sich in Folge eines eingeschränkten oder nicht ablaufenden LET in der

Primärreaktion einstellt. Hingegen unterliegt die G6PDH einer Deaktivierung über ein

erhöhtes NADPH/(NADPH+NADP+)‐Verhältnis (vgl. Scheibe, 1986; Scheibe et al., 1989;

Dennis und Blakeley, 2000). Die RubisCO unterliegt ebenfalls einer solchen

Feinregulation. Dabei fördern z. B. hohe Mg2+‐ und verringerte H+‐Konzentrationen im

Stroma, die in Folge der Protonenverschiebung innerhalb der Primärreaktion auftreten,

die Aktivierung (vgl. Held, 1979; Portis et al., 1992; Salvucci und Ogren, 1996).

Zusätzlich ist die Aktivität vieler Enzyme des Chloroplasten‐Metabolismus über eine

feedback‐Regulation der spezifischen Metabolite kontrolliert und somit auf den

tatsächlichen metabolischen Bedarf angepasst. Die NADP‐MDH ist z. B. über hohe

Konzentrationen an NADP+ inaktiviert (vgl. Scheibe et al., 1991; Faske et al., 1994;

Scheibe et al., 2004). RubisCO ist u.a. über die Konzentration seiner Substrate, Ribulose‐

1,5‐Bisphosphat (RuBP) und CO2, reguliert und die G6PDH unterliegt einer Inaktivierung

über hohe Konzentrationen an NADPH (vgl. Scheibe et al., 1989).

Das fine‐tuning, sowie die feedback‐Regulation vieler Chloroplasten‐Enzyme

ermöglichen somit zusätzlich zur direkten Lichtregulation über das Fd‐Trx‐System eine

effiziente Anpassung der Enzymaktivität an den metabolischen Bedarf.

1.3.3 Regulation des Kohlenstoff‐Metabolismus im Chloroplasten

In der Sekundärreaktion der Photosynthese, dem Calvin‐Zyklus, wird der größte Anteil

der durch die Primärreaktion bereitgestellten Energie (ATP) und Reduktionsäquivalente

(NADPH) zur CO2‐Assimilation benötigt. Im Zuge der reduktiven CO2‐Assimilation

14 Einleitung

werden Triosephosphate synthetisiert, die außer für die Regeneration von RuBP, für die

Synthese von Hexosen zur Verfügung stehen. Hierbei sind Stärke und Saccharose die

Endprodukte der Kohlenhydratsynthese, wobei Stärke im Chloroplasten und Saccharose

im Cytosol synthetisiert werden. Über die Leitbündel wird Saccharose (in vielen Pflanzen

sind neben Saccharose auch Raffinose, Stachyose und Verbascose als Transportformen

vorhanden) in die heterotrophen Gewebe transportiert. Hier werden die aus der

Photosynthese stammenden Kohlenhydrate zur Gewinnung von Energie und

Reduktionsäquivalenten als Kohlenstoffquelle zum Aufbau von Biomasse sowie als

Speicher benötigt.

Die in den Chloroplasten in Folge der Primär‐ und Sekundärreaktion als transitorische

Stärke assimilierten und gespeicherten Kohlenhydrate werden unter nicht‐

photosynthetischen Bedingungen (z. B. bei Dunkelheit) mobilisiert und in Form von

Maltose und Glukose in Cytosol transportiert. Im Licht werden entsprechend direkt

Triosephosphate aus dem Calvin‐Zyklus ins Cytosol gebracht, z. B. für die

Saccharosesynthese. Die Einstellung eines partitioning zwischen Stärkesynthese und der

Mobilisierung transitorischer Stärke im Chloroplasten sowie der Saccharosesynthese im

Cytosol erfolgt über eine komplexe Regulation der Enzymaktivitäten angepasst an die

jeweilige metabolische Situation und beugt somit einem Anstau von Intermediaten

sowie der Verarmung der Intermediatspiegel vor.

Für die metabolischen Prozesse in den Chloroplasten wird ATP und NADPH im Licht

photoautotroph über die Primärreaktion der Photosynthese erzeugt. Unter nicht‐

photosynthetischen Bedingungen hingegen (idR bei Dunkelheit, allerdings auch unter

Stressbedingungen wie Trockenheit oder Lichtstress) werden notwendige

Stoffwechselwege über die Mobilisierung der transitorischen Stärke mit

Reduktionsäquivalenten versorgt. Die Abspaltung von löslichen Glukanen zur

letztendlichen Synthese von Glukose‐1‐Phosphat (G1P) aus den Stärkegranula der

Chloroplasten erfordert die Phosphorylierung der Glycosyl‐Reste des Amylopektins.

Hierbei ist die Glukan‐Wasser‐Dikinase (GWD) das diese Reaktion katalysierende Enzym

und für die Mobilisierung der Stärke im Chloroplasten essentiell (vgl. Yu et al., 2001).

Die GWD unterliegt einer direkten Lichtregulation über das Fd‐Trx‐System (vgl.

Mikkelsen et al., 2005), so dass nur unter nicht‐photosynthetischen Bedingungen ein

Abbau der Stärkegranula im Chloroplasten erfolgen kann. G1P wird in der Nacht über

den OPP abgebaut.

Im OPP werden Reduktionsmittel und metabolische Intermediate für biosynthetische

Prozesse gewonnen. Das Schlüsselenzym dieses Stoffwechselwegs, die G6PDH, ist bei

A. thaliana in sechs verschiedenen Isoformen im Genom codiert, wobei zwei

Einleitung 15

cytosolische (G6PD5‐G6PD6; AGI‐Code: At3g27300 und At5g40760) und vier plastidäre

(G6PD1‐G6PD4; AGI‐Code: At1g09420, At1g24280, At5g13110 und At5g35790)

Isoformen vorliegen (vgl. Kruger und van Schaewen, 2003). Die plastidären Isoformen

werden hierbei in zwei Gruppen unterteilt, wobei die Isoformen im photosynthetisch

aktiven Plastiden als P1‐Formen und die Isoformen in den nicht‐photosynthetisch

aktiven Plastiden als P2‐Formen zusammengefasst werden (vgl. Wendt et al., 1999;

Kruger und van Schaewen, 2003). In A. thaliana werden G6PD1 der P1‐Klasse, G6PD2

und G6PD3 der P2‐Klasse sowie G6PD5 und G6PD6 den cytosolischen Isoformen

zugeordnet (vgl. Wendt et al., 1999; Kruger und van Schaewen, 2003; Wakao und

Benning, 2005). Alle G6PDH‐Isoformen unterliegen einer feedback‐Regulation und

werden über hohe Konzentrationen an NADPH inaktiviert. Zudem ist die in‐vivo‐

Aktivität mittels fine‐tuning über das NADPH/(NADPH+NADP+)‐Verhältnis kontrolliert

(siehe Kapitel 1.3.2). In den nicht‐photosynthetisch aktiven Plastiden ist der OPP ein

essentieller Mechanismus, um Fd‐abhängige Reaktionen mit NADPH zu versorgen. In

den Chlorplasten hingegen geschieht dies im Licht über die Primärreaktion der

Photosynthese, nur unter nicht‐photosynthetischen Bedingungen wird NADPH über den

OPP generiert. Insgesamt ist der OPP in den Chloroplasten gegenläufig zum Calvin‐

Zyklus. Ein zeitgleicher Ablauf dieser beiden Stoffwechselwege würde zu einem

futile cycle führen. Aus diesem Grund unterliegen OPP und Calvin‐Zyklus u.a. einer

Licht/Dunkel‐Regulation, wobei die Aktivität einiger Schlüsselenzyme dieser

Stoffwechselwege an den PET gekoppelt ist. Im Calvin‐Zyklus ist hier zunächst die

RubisCO zu erwähnen, welche auf verschiedenen Ebenen einer komplexen

Lichtregulation unterliegt und somit ausschließlich im Licht aktiv ist. Außerdem sind die

Aktivitäten von vier weiteren Enzymen (FBPase, Sedoheptulose‐1,7‐Bisphosphat‐

Phosphatase (SBPase), Phosphoribulokinase (PRK) und NAD(P)‐Glycerinaldehyd‐3‐

Phosphat‐Dehydrogenase (NAD(P)‐GAPDH)) des Calvin‐Zyklus u.a. über das Fd‐Trx‐

System direkt reguliert. Das Schlüsselenzym des OPP, die G6PDH, ist hingegen zusätzlich

zu den oben beschriebenen Regulationsmechanismen der G6PDH‐Isoformen über das

Fd‐Trx‐System im Licht inaktiviert und somit nur unter nicht‐photosynthetischen

Bedingungen aktiv (vgl. Buchanan, 1980; Scheibe, 1990; Wenderoth et al., 1997). Diese

gegenläufige Regulation des Calvin‐Zyklus und des OPP über das Fd‐Trx‐System

verhindert das Auftreten eines futile cycle bei gleichzeitigem Ablauf beider

Stoffwechselwege.

16 Einleitung

Lichtstress und Lichtakklimation 1.4

Licht ist nicht nur die elementare Energiequelle der Photosynthesereaktion, sondern

kann auch bei erhöhten Strahlungsintensitäten die Kapazität des

Photosyntheseapparates überschreiten und somit zu oxidativem Stress und

irreversiblen Schäden führen. Um dies möglichst zu verhindern, besitzen Pflanzen

diverse Schutzmechanismen. Einige Pflanzen verfügen über Mechanismen, die eine

erhöhte Absorption an Lichtenergie vermeiden, z. B. über die Stellung der Blätter bei

einigen Leguminosen (vgl. Koller, 1990) oder die Veränderung der

Chloroplastenlokalisation, wodurch die Absorptionsrate um bis zu 20 % herabgesetzt

wird (vgl. Kagawa und Wada, 2002). Zusätzlich besitzen Pflanzen diverse

Akklimationsmechanismen, die Schädigungen in Folge erhöhter Strahlungsenergien

verhindern. Hierbei ist zwischen Kurzzeitakklimation (poising), welche über bereits in

der Zelle vorhandene Komponenten erfolgen, und Langzeitakklimation, welche eine

Veränderung der Genexpression nach sich zieht, zu unterscheiden. Das poising ist ein

schneller reversibler Prozess, während Langzeitakklimation häufig irreversible

metabolische und morphologische Veränderungen des Phänotyps nach sich zieht.

1.4.1 Poising‐Mechanismen

Da der photosynthetische Elektronentransport immer mehr Elektronen liefert als für die

biosynthetischen Stoffwechselwege benötigt werden (vgl. Stitt, 1986), fallen

„Überschusselektronen“ an. Hierbei ist zu beachten, dass im Rahmen der Fixierung

eines Moleküls CO2 im Calvin‐Zyklus drei Moleküle ATP und zwei Moleküle NADPH

benötigt werden, woraus sich ein Verhältnis von 1,5 berechnet. Dieser Wert liegt höher

als der Wert, der für die Bereitstellung von ATP/NADPH über die Lichtreaktion in‐vivo

mit 1,1 bis 1,3 bestimmt wurde (vgl. Heber und Kirk, 1975; Ort und Melandri, 1982;

Badger, 1985), wobei sich der Bedarf an ATP über die Stärkesynthese sowie die

Photorespiration nochmals erhöht. Hieraus ergibt sich eine Überkapazität von

mindestens 0,25 µmol NADPH pro freigesetztem Molekül O2. Erhöhte

Strahlungsenergien sowie CO2‐Limitierung erzeugen zusätzlich einen

Elektronenüberschuss und es entsteht ein Mangel an Elektronenakzeptoren, idR in

Form von NADP+, im Stroma. Einem Elektronenüberschuss und der damit

einhergehenden Akzeptorlimitierung kann über poising‐Mechanismen schnell und

effektiv entgegengewirkt werden, um die Akkumulation toxischer Intermediate (z. B.

ROS) und Schädigungen am Photosyntheseapparat (siehe Kapitel 1.4.3) zu vermeiden

und um das Verhältnis von ATP zu NADPH für die biosynthetischen Prozesse im

Chloroplasten zu optimieren. Zu den poising‐Mechanismen zählen u.a. alternative

Einleitung 17

Elektronenakzeptoren im Stroma, wobei bereits absorbierte Lichtenergie in Form von

Elektronen auf diverse Akzeptoren abgeleitet wird. Dabei spielen die nicht‐

photochemische Löschung überschüssiger Lichtenergie (vgl. Horton et al., 1996), state‐

transitions (vgl. Kruse 2001, Dekker und Boekama, 2005), die Verringerung der

Elektronentransportrate über die Inaktivierung von PSII (vgl. Foyer et al., 1990, Krieger

und Weis, 1993) sowie bedingt auch Photoinhibition am PSII bzw. PSI (vgl. Terashima et

al., 1994; Ivanov et al., 1998) wichtige Rollen.

Das Malat‐Ventil gehört zu den alternativen Elektronenakzeptoren im Stroma. Hierbei

wird Oxalacetat (OAA) im Stroma unter Verbrauch von NADPH zu Malat reduziert, das

über einen hochaffinen Malat‐OAA‐Translokator ins Cytosol gebracht wird. Durch den

Verbrauch von NADPH werden überschüssige Elektronen aus dem Stroma entfernt und

oxidiertes NADP+ steht als Elektronenakzeptor im Stroma erneut zur Verfügung. Das

katalysierende Enzym dieser Reaktion, die NADP‐MDH, unterliegt u.a. einer Regulation

über das Fd‐Trx‐System und ist im Licht aktiv (vgl. Scheibe und Jacquot, 1983; Ferté et

al., 1984; Scheibe, 1991). Eine Feinregulation der Enzymaktivität erfolgt über das

NADPH/(NADPH+NADP+)‐Verhältnis im Stroma, wobei hohe Konzentrationen an NADPH

die reduktive Enzymaktivierung erleichtern. Hingegen erfolgt eine Hemmung der

Aktivierung durch NADP+, wobei hier nicht das Verhältnis, sondern die absolute

Konzentration entscheidend ist (siehe Kapitel 1.3.2). Dieser komplexe Mechanismus der

posttranslationalen Regulation führt schon bei geringen Verschiebungen des

Reduktionszustandes im Stroma zu einer veränderten Aktivität der NADP‐MDH, so dass

die in‐vivo‐Aktivität dieses Enzyms als Marker für den Reduktionsgrad des Stromas

herangezogen werden kann (vgl. Scheibe und Jacquot, 1983; Scheibe und Stitt, 1988;

Foyer et al., 1992; Backhausen et al., 1994). Somit kommt der NADP‐MDH auch eine

wichtige Funktion in der Balancierung des ATP/NADPH Verhältnisses zu (vgl. Scheibe,

1987; Backhausen et al., 1994; Backhausen et al., 2000).

Auch die Photorespiration wird als möglicher Mechanismus zur Entfernung von

überschüssigen Reduktionsäquivalenten und ATP aus der Primärreaktion diskutiert (vgl.

Niyogi, 2000; Foyer et al., 2009), um überschüssige Strahlungsenergien abzubauen.

Dadurch werden ebenfalls Akzeptoren in Form von NADP+ und ADP regeneriert. Auch

für das Enzym Fd‐GOGAT, das bei der Reassimilation des photorespiratorisch

freigesetzten Ammoniums eine Rolle spielt, könnte Fd direkt als Elektronenüberträger

fungieren, um einen verstärkten Elektronendruck in der Primärreaktion zu verringern

(siehe Kapitel 4.1.1). Studien an transgenen Pflanzen belegen, dass eine verminderte

Photorespiration einen Anstieg der in‐vivo‐Aktivität der NADP‐MDH zur Folge hat (vgl.

18 Einleitung

Igamberdiev et al., 2001) und auch umgekehrt ein knock‐out im Gen für die NADP‐MDH

eine erhöhte photorespiratorische Aktivität verursacht (Strodtkötter, unpubl.)

Über die Reaktionen des ZET werden ebenfalls überschüssige Elektronen am PSI

abgenommen und zurück in die Thylakoidmembran transportiert. Im Gegensatz zum

LET, wobei NADPH und ATP gebildet werden, wird im Rahmen des ZET ausschließlich

ATP synthetisiert. Dies ermöglicht den Ausgleich der im Rahmen des LET entstehenden

Überkapazitäten an NADPH (s. o.), welche im Calvin‐Zyklus zusammen mit ATP

verbraucht werden und somit wiederum in Form von NADP+ als Elektronenakzeptor am

PSI zur Verfügung stehen (vgl. Allen, 2003). Vor allem in Cyanobakterien und in C4‐

Pflanzen nimmt der ZET eine essentielle metabolische Funktion ein, um das

ATP/NADPH‐Verhältnis im Stroma zu regulieren und die Chloroplasten der

Bündelscheidenzellen mit ausreichend ATP zu versorgen (vgl. Herbert et al., 1990;

Asada et al., 1993; Ravenel et al., 1994; Mi et al., 1995; Finazzi et al., 1999). In C3‐

Pflanzen hingegen wurde lange Zeit eine signifikante Rolle des ZET ausgeschlossen (vgl.

Herbert et al., 1990; Harbinson und Foyer, 1991; Havaux et al., 1991; Bendall und

Manasse, 1995; Joët et al., 2002). Neuere Studien deuten allerdings auf eine wichtige

Funktion unter verschiedenen Stressbedingungen, vor allem bei erhöhten

Lichtintensitäten, hin (vgl. Clarke und Johnson, 2001; Joliot und Joliot, 2002; 2006;

Golding und Johnson; 2003; Golding et al., 2004; Munekage et al., 2004).

Beim ZET um PSI werden Elektronen im Zuge der Ladungstrennung am P700 über die

Kofaktoren im PSI auf Fd im Stroma übertragen (siehe Kapitel 1.1). Die Elektronenlücke

am P700 wird durch Elektronen aus dem PQ‐Pool über den klassischen

photosynthetischen Elektronentransport aufgefüllt. Zur Vervollständigung dieses Zyklus

werden die Elektronen von Fd zurück in den PQ‐Pool transferiert. Dies kann prinzipiell

über zwei bislang bekannte Wege erfolgen, den Fd‐abhängigen und den NAD(P)H‐

Dehydrogenase‐abhängigen (NDH‐abhängigen) ZET (siehe Abb. 1.5). Es wird

angenommen, dass beide möglichen Wege essentiell, aber auch zum Teil redundant

sind (vgl. Munekage et al., 2004). Der NDH‐abhängige ZET transferiert Elektronen über

NADPH mittels einer membranständigen NAD(P)H‐Dehydrogenase (NDH) in den PQ‐

Pool. Dieser Weg des ZET nimmt vor allem in Cyanobakterien und C4‐Pflanzen eine

essentielle Rolle im photosynthetischen Elektronentransport ein (vgl. Mi et al., 1994;

Takabayashi et al., 2005), wohingegen in C3‐Pflanzen die Funktion bislang noch unklar

ist (vgl. Burrows et al., 1998; Havaux et al., 2005; Rumeau et al., 2005; Nandha et al.,

2007).

Der Fd‐abhängige ZET transferiert Elektronen vom PSI über Fd direkt in den PQ‐Pool.

Hierbei ist noch nicht abschließend geklärt, ob Fd den PQ‐Pool über den Cyt‐b6f

Einleitung 19

Komplex (vgl. Zhang et al., 2001; Kurisu et al., 2003; Stroebel et al., 2003; Joliot et al.,

2004; Joliot und Joliot, 2006; Kramer et al., 2004) oder direkt über eine Ferredoxin‐

Plastochinon‐Reduktase (FQR) (vgl. Moss und Bendall, 1984; Cleland und Bendall, 1992;

Okegawa et al., 2005) reduziert. Es wird allgemein angenommen, dass mehrere

Proteine unter Bildung eines Komplexes am Transport beteiligt sind, wobei Fd, FNR, PSI

(PsaD) und Cyt‐b6f in diesem Zusammenhang diskutiert werden (vgl. Dalcorso et al.,

2008). Munekage et al. (2004) konnten eine essentielle Rolle für das Protein PGR5 im

Fd‐abhängigen ZET bei der Übertragung von Elektronen von Fd in den PQ‐Pool

nachweisen, wobei Nandha et al. (2007) diese Rolle als regulatorisch und nicht direkt

beschrieben haben. Das in der Thylakoidmembran lokalisierte Protein PGRL1 interagiert

mit PGR5 und FNR und ist somit auch Bestandteil des Fd‐abhängigen ZET (vgl. Dalcorso

et al., 2008). Die Tatsache, dass bislang kein FQR‐Protein in Pflanzen nachgewiesen

werden konnte, veranlasste Dalcorso et al. (2008) zu der Annahme, dass ein Komplex

aus PGR5, PGRL1 und FNR diese Funktion einnimmt. Insgesamt erlauben die bis dato

erhobenen Daten keine definitive Klärung der molekularen Abläufe des Fd‐abhängigen

ZET.

Abb. 1.5: Schematische Darstellung des ZET. Abgebildet sind die zwei bekannten Wege des ZET, die Elektronen vom PSI zum einen über NADPH und die membranständige NDH (rote durchgezogene Linie) und zum anderen direkt über Fd (rote gestrichelte Linie) in den PQ‐Pool transferieren. Die Abbildung ist stark vereinfacht, da die genauen Mechanismen des ZET noch nicht abschließend geklärt sind (siehe Text).

O2 ist letztendlich ebenfalls ein alternativer Elektronenakzeptor am PSI. Im Zuge dieser

Reaktion, die auch als Mehler‐Reaktion bezeichnet wird, entstehen ROS (vgl. Mehler,

1951), welche über antioxidative Systeme abgebaut werden, um eine übermäßige

20 Einleitung

Akkumulation und daraus resultierende Schädigungen in der Zelle zu vermeiden

(siehe Kapitel 1.4.3).

Die alternativen Elektronenakzeptoren unterliegen ebenso einer Hierarchie der

Elektronenverteilung am PSI wie es auch für die übrigen Elektronenakzeptoren der Fall

ist (vgl. Backhausen et al., 2000). Hierbei haben antioxidative Reaktionen sowie die

Reduktion von Nitrit Vorrang vor der CO2‐Assimilation, während die Abführung von

Elektronen über das Malat‐Ventil oder die Übertragung auf molekularen O2 erst dann

erfolgt, wenn keine freien Akzeptoren vorhanden sind.

Der ZET ist nicht nur ein alternativer Elektronenakzeptor und u.a. ein Mechanismus, um

das Verhältnis von ATP und NADPH im Stroma anzupassen, sondern auch ein

entscheidender Faktor zur Abführung überschüssiger Lichtenergie. Dabei wird diese im

als NPQ in Form von Wärmestrahlung emittiert wird (vgl. Niyogi, 1999; Shikanai, 2007).

Dieser Mechanismus stellt ebenfalls eine schnelle und effiziente Form des poising in

Pflanzen dar. Im Verlauf eines vermehrt ablaufenden ZET kommt es zur Ansäuerung des

Lumens und es stellt sich ein erhöhter Protonengradient über die Thylakoidmembran

ein. Diese Ansäuerung des Lumens wird in C3‐Pflanzen hauptsächlich dem Fd‐

abhängigen ZET zugeschrieben (vgl. Munekage et al., 2002; Munekage et al., 2004). Im

Zuge des erhöhten Protonengradienten über die Thylakoidmembran erfolgt ein

vermehrter Umbau von Violaxanthin zu Zeaxanthin innerhalb des Xanthophyll‐Zyklus,

wobei die Aktivität der katalysierenden Enzyme dieser Reaktion direkt an den pH‐Wert

im Lumen gekoppelt ist (vgl. Hieber et al., 2000). Lichtenergie wird von Zeaxanthin als

Wärme emittiert und nicht auf das PSII‐Reaktionszentrum übertragen, so dass

überschüssige Lichtenergie keine weitere Erhöhung des photosynthetischen

Elektronenflusses nach sich ziehen kann. Letztendlich hat eine signifikante Erhöhung

von NPQ auch eine Verringerung in der Elektronentransportrate am PSII zur Folge, was

ebenfalls ein effizienter Schutz vor zu hoher Strahlungsenergie ist (vgl. Foyer et al.,

1990; Krieger und Weis, 1993) Dieser Effekt wird durch dynamische Photoinhibition am

PSII nochmals verstärkt. Dynamische Photoinhibition am PSII tritt im Zuge erhöhter

Strahlungsenergien dann auf, wenn die übrigen poising‐Mechanismen gesättigt sind

und wird als Mechanismus zur Vermeidung von Photoinhibition am PSI diskutiert


1.4.2 Langzeitakklimation und Signalling

Neben den schnellen poising‐Mechanismen ist auch eine Langzeitakklimation von

entscheidender Bedeutung, um das Auftreten von Schäden vor allem in Folge

Einleitung 21

andauernder erhöhter Strahlungsenergien zu vermeiden. Dies ist mit einer Änderung

der Genexpression verbunden. Typische Formen der Langzeitakklimation bezogen auf

erhöhte Strahlungsenergien sind z. B. die Verschiebung der Sättigungsphase der

Photosynthese in Richtung höherer Lichtintensitäten, die Verringerung des Chla/Chlb‐

Verhältnisses durch einen verringerten Anteil an LHCII (vgl. Bailey et al., 2001) sowie ein

verminderter Anteil an Grana‐Thylakoiden (vgl. Anderson und Osmond, 1987).

Eine Änderung der Genexpression im Zuge einer Langzeitakklimation ist auf Redox‐

Signale aus den Chloroplasten zurückzuführen, welche über eine

Signaltransduktionskette bis zum Nukleus weitergeleitet werden (vgl. Scheibe et al.,

2005). Bislang sind allerdings weder der Ursprung dieses Signals noch die Mechanismen

einer Signaltransduktionskette bekannt. Sowohl Komponenten des PET, z. B. der

Cyt‐b6f Komplex oder der PQ‐Pool als auch lösliche Komponenten im Stroma, z. B. ROS

(siehe Kapitel 1.4.3), Trx oder Glutaredoxine, werden u.a. als mögliche Redox‐Sensoren

und Ursprung des Redox‐Signals angenommen.

Die Aufklärung möglicher initialer Redox‐Signale im Chloroplasten gestaltet sich als

äußerst schwierig, da zum einen nicht von einem einzigen Ursprung ausgegangen

werden kann und zum anderen durch poising‐Mechanismen der Redox‐Zustand des

Chloroplasten so effektiv wie möglich in Balance gehalten wird. Selbst eine

Unterscheidung inwieweit Redox‐Signale entweder vom Reduktionsgrad des PET oder

des Stromas abhängig sind, ist auf Grund der in‐vivo gekoppelten Redoxzustände bislang

nicht möglich gewesen.

Nach einer erfolgten initialen Induktion werden unterschiedlichste Moleküle

angenommen, die in der Weiterleitung eines Redox‐Signals eine entscheidende

Funktion einnehmen und letztlich zu einer Änderung der Genexpression im Kern führen.

So ist bekannt, dass z. B. ROS, Stickstoffmonoxid (NO), Ascorbat (Asc) und einige andere

Moleküle als Redox‐Signale an der Regulation der Genexpression diverser Proteine

beteiligt sind (vgl. Wingate et al., 1988; Arrigoni und De Tullio, 2002; Neill et al., 2002;

Mittler, 2002; Wendehenne et al., 2004). Bei der Weiterleitung eines Redox‐Signals in

den Nukleus und der folgenden Induktion bzw. Repression der Genexpression könnten

Trx und Glutaredoxine eine Rolle spielen (vgl. Meyer et al., 1999; Marchand et al.,

2004). Ebenso wird ein direkter Zusammenhang zwischen Kofaktoren und Enzymen des

Metabolismus und der Transkription diskutiert (vgl. Shi und Shi, 2004). Insgesamt gibt es

einige Hinweise, die auf ein hoch komplexes Netzwerk einer Signaltransduktion in Folge

einer Reaktion auf endogene und exogene Faktoren hinweisen (vgl. Takahashi et al.,

2004; Chen und Zhu, 2004; Hameister et al., 2007; Holtgrefe et al., 2008; Hanke et al.,

2009).

22 Einleitung

1.4.3 Photoinhibition, ROS und antioxidative Systeme

Mechanismen der Kurzzeit‐ und Langzeitakklimation treten auf, um Photoinhibition an

den Photosystemen und die Akkumulation von ROS im Zuge überschüssiger

Strahlungsenergien zu vermeiden. Trotz diverser Akklimationsmechanismen kann

Lichtstress letztendlich Photoinhibition am PSII auslösen, wobei die Bildung von

Chlorophyll‐Triplett‐Zuständen sowie die Akkumulation von Singulett‐Sauerstoff

vorausgehen. Oxidative Schäden am PSII sind die Folge. Sie führen zur Degradation der

D1‐Untereinheit. Photoinhibition tritt dann auf, wenn die Rate des Abbaus der D1‐

Untereinheit die der Neusynthese übersteigt. Die Neusynthese des D1‐Proteins

unterliegt hierbei einem sehr hohen turnover, der unter extremen Lichtintensitäten

maximal ist und von diversen endogenen und exogenen Faktoren bestimmt ist (vgl.

Nishiyama et al., 2001; Adir et al., 2003; Nishiyama et al., 2004; Allakhverdiev und

Murata, 2004; Nishiyama et al., 2005; Nishiyama et al., 2006). Die Degradation hingegen

erfolgt linear zur Lichtintensität (vgl. Allakhverdiev und Murata 2004; Nishiyama et al.

2004). Das Ausmaß an Photoinhibition wird durch die Balance des Abbaus der D1‐

Untereinheit zur Neusynthese bestimmt (vgl. Aro et al., 1993; Adir et al., 2003;

Nishiyama et al., 2005; Nishiyama et al., 2006), wobei prinzipiell dynamische

Photoinhibition und chronische Photoinhibition unterschieden werden können. Die

dynamische Photoinhibition stellt einen Schutzmechanismus bei kurzzeitig erhöhten

Lichtintensitäten dar (siehe Kapitel 1.4.1) und ist in Folge der hohen turnover‐Rate des

D1‐Proteins reversibel. Chronische Photoinhibition hingegen ist bei anhaltend hohen

Lichtintensitäten zu beobachten, wobei wahrscheinlich in Folge einer vermehrten ROS‐

Akkumulation die Neusynthese der D1‐Untereinheit inhibiert ist (vgl. Nishiyama et al.,

2001; Nishiyama et al., 2004). Die Schädigungen am PSII mit dem Abbau des D1‐Proteins

sind in diesem Falle nahezu irreversibel, so dass chronische Photoinhibition am PSII

mehrere Wochen und Monate andauern kann.

Im Gegensatz zur Photoinhibition am PSII ist Photoinhibition am PSI für Pflanzen idR mit

schwerwiegenderen Folgen verbunden. Durch akkumulierende ROS am PSI im Zuge

mangelnder Akzeptoren an der PSI‐Akzeptorseite (z. B. in Folge überschüssig

absorbierter Lichtenergie) treten zunächst oxidative Schäden an den [4Fe‐4S]‐Zentren

Fe‐SA und Fe‐SB der PsaC‐Untereinheit und in späteren Stadien an weiteren Akzeptoren

im PSI‐Komplex auf (vgl. Scheller und Haldrup, 2005). Dies führt letztlich zur

Degradation des Proteinkomplexes (vgl. Sonoike, 1996; Jakob und Heber, 1996; Aroca et

al., 2001; Tjus et al., 2001). Studien an A. thaliana und Gurke zeigen, dass der komplette

Proteinkomlex dem Abbau unterliegt und nicht wie bei der Photoinhibition am PSII

lediglich die D1‐Untereinheit (vgl. Kudoh und Sonoike, 2002; Zhang und Scheller, 2004).

Einleitung 23

Die Degradation von PSI ist ein langwieriger Prozess und kann mehrere Stunden dauern.

Dies ist unter anderem Anlass für die Vermutung, dass es sich um einen induzierten und

gesteuerten Prozess handeln könnte und nicht ausschließlich abhängig von der

Akkumulation von ROS ist (vgl. Scheller und Haldrup, 2005). Die Neusynthese des PSI‐

Komplexes in A. thaliana dauert mehrere Tage, da die turnover‐Raten der PSI‐

Untereinheiten signifikant geringer sind als die der D1‐Untereinheit in PSII (vgl. Sonoike

et al., 1996; Zhang und Scheller, 2004). Zusätzlich konnte an A. thaliana gezeigt werden,

dass die Menge an neu synthetisierten PSI‐Komplexen wahrscheinlich geringer ist, als

vor der Degradation (vgl. Zhang und Scheller, 2004). Fortschreitende Photoinhibition am

PSI stellt demnach einen zum Teil irreversiblen Prozess dar und verursacht nachhaltige

Schäden in der Pflanze. Dynamische Photoinhibition am PSII ist unter anderem ein

Mechanismus, der Photoinhibition am PSI vorbeugt, so dass in A. thaliana

Photoinhibition am PSI immer mit Photoinhibition am PSII einhergeht (vgl. Sonoike et

al., 1996; Tjus et al., 1998; Zhang und Scheller, 2004). Die Aufklärung der molekularen

Mechanismen der Photoinhibition am PSI und ihrer mögliche Regulation sowie die

funktionale Einordnung stehen allerdings noch aus.

Letztlich verursachen exogene Stressfaktoren, z. B. erhöhte Strahlungsenergien, die

Akkumulation von ROS, z. B. Superoxid (O2‐) oder Wasserstoffperoxid (H2O2) (vgl.

Mittler, 2002). ROS sind äußerst reaktive Moleküle, welche irreversible Schäden in der

Zelle verursachen können. Neuere Studien belegen allerdings auch, dass ROS nicht nur

als toxischer Faktor in Folge von Stressfaktoren akkumulieren, sondern auch als

Signalling‐ und Regulatormoleküle fungieren (vgl. Mittler et al., 2004; Foyer und Noctor,

2005; Fujita et al., 2006; Bailey‐Sorres und Mittler, 2006). Diese regulatorische Funktion

ist nur im Zusammenhang mit effektiven antioxidativen Systemen möglich, die einer

unkontrollierten Akkumulation entgegenwirken und die ROS‐Homöostase in der Zelle

stabilisieren (vgl. Mittler, 2004; Bailey‐Sorres und Mittler, 2006; Mittler et al., 2008).

In den Chloroplasten entstehen ROS hauptsächlich in Folge der Mehler‐Reaktion (vgl.

Mehler, 1951) am PSI und an den Antennenpigmenten (vgl. Mittler, 2004), wobei in

Folge mangelnder Akzeptoren Elektronen auf O2 übertragen werden und O2‐ entsteht.

Mittels der Superoxiddismutase (SOD) kann O2‐ zu H2O2 detoxifiziert werden. Der Abbau

von H2O2 erfolgt u.a. über den Beck‐Halliwell‐Asada‐Weg (water‐water cycle) (vgl. Foyer

und Halliwell, 1976; Groden und Beck, 1979; Asada, 1999). Hierbei wird H2O2 mittels

Askorbat (Asc) als Elektronendonator zu H2O reduziert, was über eine Askorbat‐

Peroxidase (APX) katalysiert wird (siehe Abb. 1.6). APX stellt das Schlüsselenzym in

diesem Stoffwechselweg dar und ist entweder an der Thylakoidmembran gebunden

oder liegt frei im Stroma vor (vgl. Asada, 2000). Die Regeneration von Asc aus

24 Einleitung

Monodehydroaskorbat (MDA) kann entweder über die Monodehydroaskorbat‐

Reduktase (MDHR), wobei NADPH aus der Primärreaktion als Elektronendonator dient,

oder mittels reduziertem Glutathion (GSH), katalysiert über die Dehydroaskorbat‐

Peroxydase (DHAR), erfolgen. GSH wird durch die Reduktion von oxidiertem Glutathion

(GSSG) mittels NADPH als Elektronendonator wiederum über die Glutathion‐Reduktase

(GR) reduziert. Alternativ wird MDA auch über Fd aus der Primärreaktion direkt

reduziert.

Abb. 1.6: Antioxidative Systeme im Stroma. Dargestellt ist eine vereinfachte Reaktionsabfolge zum Abbau von ROS (O2

‐ und H2O2) im Stroma. Hierbei ist neben dem Beck‐Halliwell‐Asada‐Weg die Reduktion von H2O2 über Prx dargestellt (dunkelgrau unterlegt) und die alternative Möglichkeit, über den OPP Reduktionsäquivalente unter nicht photosynthetischen Bedingungen zu generieren (gestrichelter Rahmen). Neben der Mehler‐Reaktion, bei welcher Elektronen über Fd auf O2 fließen, ist eine alternative Möglichkeit angegeben, wobei Elektronen über einen stromalen Faktor (SF) direkt vom PSI auf O2 übertragen werden (vgl. Asada et al., 1999).

Neben dem Beck‐Halliwell‐Asada‐Weg kann H2O2 über Peroxiredoxine (Prx) reduziert

und detoxifiziert werden (vgl. Dietz et al., 2002). Prx sind übiquitär verbreitete

antioxidative Proteine, welche in die Gruppe der Thiol‐spezifischen Reduktasen bzw.

Einleitung 25

Peroxidasen eingeordnet werden (vgl. Kobayashi et al., 2004), kommen in diversen

Isoformen vor (vgl. Dietz. et al., 2002; Rouhier und Jacquot 2002) und katalysieren die

Reduktion von Peroxiden, z. B. H2O2. Im Chloroplasten von A. thaliana sind drei Prx‐

Klassen lokalisiert (2‐Cys‐Prx; Prx Q und Prx II mit der Unterklasse Prx II E)

(vgl. Dietz et al., 2006). 2‐Cys‐Prx katalysieren einen alternativen Weg zum Beck‐

Halliwell‐Asada‐Weg zur Detoxifizierung von H2O2 (vgl. Baier et al., 2000). Hierbei dient

2‐Cys‐Prx als Elektronendonator und Peroxidase zur Reduktion von H2O2. Die Re‐

Reduzierung von 2‐Cys‐Prx kann über Trx‐x (vgl. Collin et al., 2003), das plastidäre Trx

CDSP32 (vgl. Broin et al., 2002; Rey et al., 2005) oder auch Cyclophiline (vgl. Laxa et al.,

2007) erfolgen. Trx‐x bzw. CDSP32 werden im Licht über das Fd‐Trx‐System reduziert, so

dass reduziertes Fd aus dem PET als Elektronendonator für die Regeneration von Prx

erforderlich ist. Zusätzlich kann die Reduktion von Prx über die NTRC katalysiert werden,

welche eine Doppelfunktion als Trx‐Reduktase sowie als Trx‐x aufweist (vgl. Serrato et

al., 2004; Pérez‐Ruíz et al., 2006) und NADPH als Elektronendonator nutzt. Die

Reduktion von Prx über NTRC ist hierbei deutlich effektiver als über Trx bzw. CDSP32

(vgl. Pérez‐Ruíz et al., 2006). Ebenso konnte in diesem Zusammenhang gezeigt werden,

dass NTRC vor allem im Dunkeln eine entscheidende Funktion einnimmt und NADPH

aus den OPP als Elektronendonator nutzt. Neben ihrer antioxidativen Funktion sind Prx

auch an der Regulation des zellulären Signalling und der Zelldifferenzierung

entscheidend beteiligt (vgl. Hoffmann et al., 2002).

1.5 Ziele der Arbeit

Pflanzen sind sessile Organismen und haben daher im Laufe der Evolution vielfältige

Mechanismen entwickelt, um sich wechselnden externen Bedingungen mit hoher

Effektivität anzupassen. Hierzu zählt auch das Licht, welches nicht nur die Energie für

die Photosynthese liefert, sondern auch bei hohen Strahlungsintensitäten zu einem

schädigenden Faktor werden kann. Um dies zu vermeiden und ein vitales,

photoautotrophes Wachstum zu gewährleisten, besitzen Pflanzen diverse Anpassungs‐

und Schutzmechanismen, welche allerdings nur zum Teil vollständig aufgeklärt sind.

Fd2‐KO‐Pflanzen dienen im Rahmen dieser Arbeit als Modell, um eine extreme

Hochlichtsituation zu simulieren und die Anpassungsmechanismen dieser Pflanzen zu

analysieren. Hier wird der Fokus vor allem auf die molekularen Abläufe des

photosynthetischen Elektronentransportes und der daran geknüpften metabolischen

Reaktionen im Stroma gelegt. Die Bedeutung und das Zusammenspiel von poising‐

Mechanismen zur schnellen Anpassung der Redox‐Homöostase und der

Langzeitakklimation an extreme Lichtintensitäten soll verdeutlicht werden.

26 Einleitung

Eine Langzeitakklimation geht mit einer veränderten Genexpression einher. Der Großteil

der in den Chloroplasten lokalisierten Proteine ist kerncodiert, so dass sich in diesem

Fall die Frage nach einem Signal aus den Chloroplasten zur Änderung der Genexpression

im Kern in Folge erhöhter Strahlungsenergien stellt. Der Ursprung bzw. die Art eines

solchen Signals ist Gegenstand von kontroversen Diskussionen. Im Rahmen dieser

Arbeit soll anhand der Fd2‐KO‐Pflanzen der Ursprung eines solchen Signals zur

Änderung der Genexpression in Folge erhöhter Strahlungsintensitäten genauer

lokalisiert werden.

In diesem Zusammenhang werden die Fd2‐KO‐Pflanzen für eine differenzierte

Betrachtung der Regulation des Chloroplasten‐Metabolismus herangezogen. Die

Aktivität vieler Enzyme im Stroma ist an die Photosynthesereaktion gekoppelt, um

bezogen auf das Angebot der Intermediate und den Bedarf der Pflanze effizient

operieren zu können. Das Zusammenspiel zwischen einer veränderten Genexpression

sowie der posttranslationalen Regulation der Enzymaktivitäten im Zuge extremer

Lichtbedingungen soll anhand von beispielhaften Schlüsselenzymen des Metabolismus

im Mittelpunkt stehen. Fd2‐KO‐Pflanzen sollen daher im Rahmen dieser Arbeit als

Modell herangezogen werden, um folgende Fragestellungen zu untersuchen:

1. Welche Mechanismen sind unter extremen Lichtbedingungen

entscheidend, um die Vitalität einer Pflanze zu gewährleisten?

2. Wo liegt der Ursprung eines chloroplastidären Signals, das die

Änderung der Genexpression im Kern induziert?

3. Wie wird der stromale Metabolismus in den Chloroplasten der Fd2‐

KO‐Pflanzen an diese extreme Situation angepasst?

Ferredoxine dienen in der Photosynthese als zentraler Elektronenverteiler am PSI. In

den Blättern höherer Pflanzen sind verschiedene Isoformen nachgewiesen worden.

Bislang konnte allerdings nicht eindeutig geklärt werden, inwieweit unterschiedliche

Isoformen spezifische Funktionen im photosynthetischen Elektronentransport

einnehmen. In A. thaliana sollen im Rahmen dieser Arbeit anhand von Fd2‐KO‐, Fd1‐KO‐

und Fd1‐RNAi‐Mutanten die spezifischen Funktionen der photosynthetischen Fd‐

Isoformen in C3‐Pflanzen genauer analysiert werden. Hierbei wird der Fokus vor allem

auf die von Hanke und Hase (2008) postulierten Funktionsunterschiede der

photosynthetischen Fd‐Isoformen (Fd1 und Fd2) im linearen und zyklischen

Elektronentransport gelegt. Zusätzlich soll anhand der Fd1‐KO‐Pflanzen auf die

Bedeutung des zyklischen Elektronentransportes in C3‐Pflanzen eingegangen werden.

Folgende Fragestellungen werden demnach im Rahmen dieser Arbeit bearbeitet:

Einleitung 27

1. Sind die Fd‐Isoformen Fd1 und Fd2 im photosynthetischen Gewebe redundant

oder funktionell differenziert?

2. Ist der zyklische Elektronentransport in C3‐Pflanzen nur bei Bedarf von

Bedeutung oder ein obligater Mechanismus im Rahmen der

Photosynthesereaktion?

Neben den bekannten Fd‐Isoformen zeigten Hanke et al. (2004) zwei zusätzliche Fd‐

ähnliche Peptide (FdC1 und FdC2) in A. thaliana auf, für welche bis heute allerdings

keine weitere Charakterisierung vorgenommen wurde. Versuche an den Fd2‐KO‐

Pflanzen deuten auf eine Funktion von FdC1 und FdC2 im photosynthetischen

Elektronentransport hin. Im Rahmen dieser Arbeit wird eine erste Charakterisierung von

FdC1 gegeben. Anhand dieser Charakterisierung soll die Möglichkeit geklärt werden, ob

FdC1 als neue Fd‐Isoform im photosynthetischen Elektronentransport fungieren kann.

In diesem Zusammenhang werden folgende Fragestellungen betrachtet:

1. Ist FdC1 eine neue, in den Chloroplasten lokalisierte und am photosynthetischen

Elektronentransport beteiligte Fd‐Isoform?

2. Welche physiologische Funktion besitzt FdC1 in A. thaliana?

28 Material und Methoden


Chemikalien 2.1

2.2

Alle verwendeten Chemikalien wurden, soweit nicht anders vermerkt, in pro analysi‐

Qualität von den Firmen AppliChem (Darmstadt), Biomol (Hamburg), Biozym

(Oldendorf), Boehringer (Ingelheim), Duchefa (Haarlem, Niederlande),

Invitrogen (Karlsruhe), Roche (Mannheim), Fermentas (St. Leon‐Rot), Merck

(Darmstadt), New England Biolabs (Frankfurt), Riedel de Haen (Seelze), Roth (Karlsruhe),

Serva (Heidelberg), Sigma‐Aldrich (München), Stratagene (Heidelberg) bezogen.

Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene transgene und entsprechende WT‐

Pflanzen der Art Arabidopsis thaliana L. (Heynh.) verwendet (siehe Tab. 2.1). Hierbei

musste auf Grund der Verfügbarkeit der transgenen Pflanzen mit unterschiedlichen

Ökotypen gearbeitet werden.

Fd2 knock‐out (Fd2‐KO) Pflanzen des Ökotyps Noessen tragen eine homozygote Ds‐

Transposon‐Insertion (Ds‐T‐DNA) im Gen At1g60950, transformiert über das Ac/Ds‐

tagging‐System (vgl. Federoff und Smith, 1993). Saatgut für Pflanzen mit einer

heterozygoten Ds‐T‐DNA‐Insertion und entsprechende Wildtypen(Noe‐WT) wurden

vom RIKEN Institute (RIKEN Genomics Science Center, Yokohama, Japan) bezogen.

Mittels RT‐PCR‐Analysen wurden für das Ds‐T‐DNA‐Insert homozygote Pflanzen

identifiziert. Die hierbei verwendeten Oligonukleotide sind in Tab. 2.2 einzusehen.

Fd1 knock‐out (Fd1‐KO) Pflanzen des Ökotyps Landsberg erecta tragen eine homozygote

Ds‐Transposon‐Insertion im Gen At1g10960, transformiert über das

gene‐trap Transposon tagging‐System (vgl. Sundaresan et al., 1995). Saatgut für

Pflanzen mit einer heterozygoten Ds‐T‐DNA‐Insertion im Gen At1g10960 und

entsprechende Wildtypen (Lae‐WT) wurden vom Cold Spring Harbor Laboratory (Cold

Spring Harbor Laboratory, Long Island, USA) bezogen. Mittels RT‐PCR‐Analysen wurden

für die Ds‐T‐DNA‐Insertion homozygote Pflanzen identifiziert (siehe Abb. 3.41). Die

hierbei verwendeten Oligonukleotide sind in Tab. 2.2 einzusehen.

Die Fd1 RNA‐interference (Fd1‐RNAi) und die FdC1 RNA‐interference (FdC1‐RNAi)

Pflanzen des Ökotyps Columbia tragen eine modifizierte Version des Vektors pB1101

(vgl. Jefferson et al., 1987) im Genom, wobei ca. 200 bp lange Fragmente von Fd1 bzw.

FdC1 in sense und antisense Richtung in diesen Vektor eingebracht wurden (vgl. Hanke

Material und Methoden 29

und Hase, 2008). Die Fd1‐RNAi‐, FdC1‐RNAi‐ und die entsprechenden Wildtypen (Col‐

WT) wurden vom Laboratory of Regulation of Biological Reactions (Laboratory of

Regulation of Biological Reactions, Institute for Protein Research, Universität Osaka,

Japan) entwickelt und für die Versuche im Rahmen dieser Arbeit zur Verfügung gestellt.

Mittels der RNA‐interference‐Methode (vgl. Fire et al., 1998) ist neben der

Transkriptmenge auch der Proteingehalt in den Fd1‐RNAi‐Pflanzen verringert (vgl.

Hanke und Hase, 2008). In den FdC1‐RNAi‐Pflanzen wurde ein deutlich verminderter

FdC1‐mRNA‐Gehalt und verringerte Mengen an FdC1‐Protein nachgewiesen (Hanke,

unpubl.).

Alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Pflanzen wurden im Kurztag (vgl. Becker et

al., 2006) auf Erde (36,4 % Bims, 36,4 % Kompost, 18,2 % Torf, 9,1 % Sand, 1,5 g/l PolyCrescal) in Klimakammern angezogen. Hierbei wurden Töpfe mit einem

Durchmesser von 5 cm verwendet. Die Pflanzen wurden zwei Wochen nach der Aussaat

vereinzelt und entweder unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1, 20 °C; 55 %

Luftfeuchtigkeit; 21 % O2; 0,04 % CO2) oder im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1; 20 °C; 55 %

Luftfeuchtigkeit; 21 % O2; 0,04 % CO2) bis zu zehn Wochen weiter kultiviert. Die

Belichtung in den Klimakammern erfolgte über Hochdruck‐Metallhalogendampfllampen

des Typs SON‐T Agro, 400 W (Philips, Hamburg).

Tab. 2.1: Transgene Linien der Art A. thaliana. Aufgelistet sind die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten transgenen Pflanzen‐Linien mit Hintergrundinformationen zum Ökotyp, AGI‐Code des mutierten Gens sowie Bezugsquellen und Referenzen.

Oligonukleotide 2.3

Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide (siehe Tab. 2.2) wurden von

der MWG‐Biotech AG (Ebersberg) bezogen.


Tab. 2.2: Liste der verwendeten Oligonukleotide. Aufgelistet sind die verwendeten Oligonukleotide mit der Angabe der spezifischen Annealing‐Temperatur (Annealing‐Temp.) sowie die optimierte Zyklenzahl für das zu amplifizierende Fragment im Rahmen der RT‐PCR‐Analysen.

Pigmentbestimmung 2.4

Die quantitative Bestimmung der Blatt‐Pigmente wurde modifiziert nach Sims und

Gamon (2002) durchgeführt. Zwei Blattscheiben (1,33 cm2) wurden in flüssigem


Stickstoff pulverisiert, mit Aceton‐Tris‐Puffer homogenisiert und zentrifugiert (1300 x g,

10 min, Raumtemperatur (RT)). Der Pigmentgehalt im Überstand wurde photometrisch

im Cary UV Visible Spectrophotometer (Varian GmbH, Darmstadt) bestimmt und

anschließend bezogen auf die Blattfläche berechnet (vgl. Sims und Gamon, 2002).

Aceton‐Tris‐Puffer: 80 % (v/v) 100 % Aceton 20 % (v/v) 200 mM Tris mit HCl auf pH 7,6 einstellen

2.5

2.6

Bestimmung von Frisch‐ und Trockengewicht

Das Blattfrischgewicht wurde mit einer AB135‐S Analysewaage (Mettler Toledo,

Giessen) an Blattscheiben (1,33 cm2) bestimmt. Die gleichen Blattscheiben wurden zur

Bestimmung des Trockengewichts herangezogen. Hierfür wurden die Blattscheiben

zuvor zwei Tage bei 50 °C getrocknet.

Proteinbestimmung nach Bradford

Die Proteinbestimmungen im Rahmen dieser Arbeit wurden im Blatt‐Rohextrakt nach

Bradford (1976) mit BSA als Referenzprotein durchgeführt.

Für die Gewinnung des Rohextraktes aus A. thaliana wurden fünf in flüssigem Stickstoff

pulverisierte Blattscheiben (1,33 cm2) mit einem Gewicht von ca. 100 mg mit 100 µl

Extraktionspuffer homogenisiert. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert (8000 x g,

5 min, 4 °C) und für die Proteinbestimmung nach Bradford (1976) verwendet.

Extraktionspuffer: 50 mM Tris 100 mM Kaliumacetat 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) 1 mM DTTRED (Dithiothreitol) 20% (v/v) Glycerin mit KOH auf pH 7 einstellen

auf 1 ml frisch dazu: 1:2000 (v/v) Plant‐Protease‐Inhibitor‐Cocktail (Sigma‐Aldrich,

München) 1 µl 1 M DTTRED in 1 M Tris‐HCl (pH 7,8)

2.7 Stärkenachweis in Blattscheiben

Die für die Stärkebestimmung verwendeten Blattscheiben (1,33 cm2) wurden direkt

nach der Ernte in 100 % Methanol bei 70 °C inkubiert, bis alle Pigmente ausgewaschen

waren (ca. 20 min). Danach wurden die Blattscheiben für 1 min bei RT in Iod‐

Kaliumiodid‐Lösung angefärbt, mit H2Obidest gewaschen und ca. 5 min auf Whatman‐

Papier (3 mm, Schleicher und Schuell, Dassel) getrocknet und fotografiert.


Iod‐Kaliumiodid‐Lösung: 6,7 % (w/v) Kaliumiodid 3,3 % (w/v) Iod

Reverse Transkriptase PCR (RT‐PCR) 2.8

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Expressionsanalysen an A. thaliana

wurden mittels RT‐PCR angelehnt an Ahn (2002) durchgeführt. Hierfür wurde aus

Blattmaterial die Gesamt‐RNA isoliert und mittels Reverse Transkriptase in cDNA

umgeschrieben. Mittels spezifischer Oligonukleotide (siehe Tab. 2.2) wurden die zu

untersuchenden Gene amplifiziert und im Agarosegel zur weiteren Auswertung

aufgetrennt.

2.8.1 Isolierung von Gesamt‐RNA

Zur Isolierung der Gesamt‐RNA wurde TRI‐Reagenz (Sigma‐Aldrich, München,

Deutschland) verwendet. Die RNA‐Isolierung mit TRI‐Reagenz ist eine

Weiterentwicklung der Phenol‐Chloroform Extraktion nach Chomczynski und Sacchi

(1987). Alle für die Isolierung verwendeten Materialien wurden zuvor bei trockener

Hitze (100 – 200°C) oder durch Autoklavieren entkeimt. Verwendete Lösungen und

H2Obidest wurden mit 0,1% (v/v) DEPC, einem starken RNAse‐Inhibitor (vgl. Ehrenberg et

al., 1966), versetzt.

Pulverisiertes Blattmaterial (ca. 100 mg) wurde mit 1 ml TRI‐Reagenz homogenisiert und

für 5 min bei RT inkubiert. Nach einer Zentrifugation (12000 x g, 10 min, 4 °C) wurde der

Überstand mit 200 µl Chloroform versetzt, gemischt und 3 min bei RT inkubiert. Nach

einer weiteren Zentrifugation (12000 x g, 10 min, 4 °C) wurde die obere, wässrige Phase

mit 500 µl Isopropanol versetzt und für 10 min bei RT inkubiert. Die Lösung wurde

zentrifugiert (12000 x g, 8 min, 4 °C) und das Pellet mit 1 ml 75 % Ethanol gewaschen

(7500 x g, 10 min, 4 °C). Das Pellet wurde vollständig von Ethanol gesäubert und bei

60 °C sowie 300 upm im Thermomixer comfort 5436 (Eppendorf, Hamburg) resuspendiert. Das in DEPC‐H2O gelöste Pellet wurde mit 0,2 Volumeneinheiten 3 M

Natrium‐Acetat (pH 5) und 2,5 Volumeneinheiten 100 % Ethanol über Nacht bei ‐80 °C

gefällt. Nach einer Zentrifugation (20817 x g, 15 min, RT) wurde das Pellet mit 80 %

Ethanol gewaschen (20817 x g, 10 min, RT). Der Überstand wurde verworfen, das Pellet

wurde sorgfältig von Ethanol‐Resten gereinigt und in 20 µl DEPC‐H2O für 10 min bei

60 °C und 300 upm im Thermomixer comfort 5436 (Eppendorf, Hamburg) resuspendiert.

Nach einer weiteren Zentrifugation (20817 x g, 5 min, RT) wurde der Überstand

bei ‐20 °C gelagert.


2.8.2 RNA‐Quantifizierung mittels Absorptionsmessungen

Die RNA‐Konzentrationen wurden mittels Absorptionsmessungen im Bio‐Photometer

(Eppendorf, Hamburg) bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Eine Extinktion von

1 entspricht hierbei 33 µg/ml RNA (vgl. Lottspeich und Zobras, 1998). Die Messungen

erfolgten bei einer Verdünnung von 1:50 in DEPC‐H2O (0,1 % (v/v) DEPC) in einer

Plastibrand® UV‐Kunststoffküvette (Brand, Wertheim). Um Verunreinigungen der RNA

auszuschließen, wurde zusätzlich die Extinktion bei 230 nm (Absorption von Phenolen

und Kohlenhydraten) und 280 nm (Absorption aromatischer AS) bestimmt. Nach

Lottspeich und Zobras (1998) liegt das Verhältnis 260 nm zu 280 nm für reine RNA bei

2,0.

2.8.3 DNAse‐Verdau

Um die RNA‐Lösungen von möglichen DNA‐Resten zu befreien, wurde ein DNAse‐

Verdau mit DNAse I (1 u / µl, Fermentas, St. Leon‐Rot) durchgeführt. Es wurden 5 µg

Gesamt‐RNA für den Verdau eingesetzt. Zur RNA wurden 5 µl 10 x DNAseI‐Puffer mit

MgCl2 (Fermentas, St. Leon‐Rot) gegeben und die Lösung mit DEPC‐H2O auf ein

Gesamtvolumen von 45 µl aufgefüllt und vorsichtig gemischt. Der Reaktionsansatz

wurde 30 min bei 37 °C inkubiert. Nach der Zugabe von 5 µl 25 mM EDTA wurde der

Reaktionsansatz bei 60 °C für 10 min weiter inkubiert. Durch Einfrieren in flüssigem

Stickstoff bei ‐196 °C wurde die Reaktion gestoppt und die reine RNA‐Lösung bei ‐80 °C

gelagert.

2.8.4 Einzelstrang‐cDNA‐Synthese mittels Reverser Transkriptase (RT)

Zur Synthese von cDNA aus Gesamt‐RNA wurde das RevertAidTM H Minus First strand

cDNA Synthesis Kit (Fermentas, St. Leon‐Rot) mit der RevertAid H Minus M‐Mul V RT

(200 U/ml) verwendet. Es wurde ausschließlich mit Oligo(dT)18‐Primer (0,5 µg/ml) zur

cDNA‐Erststrang‐Synthese gearbeitet. Dieser hybridisiert spezifisch im Bereich des

poly(A)‐Überhangs am 3´‐Ende eukaryotischer mRNA. Die Synthese der cDNA erfolgte

nach Herstellerangaben, wobei 11 µl der Gesamt‐RNA aus dem DNAse‐Verdau

eingesetzt wurde. Die cDNA wurde bei ‐20 °C gelagert.

2.8.5 Amplifikation von cDNA mittels Polymerase‐Kettenreaktion (PCR)

Um bestimmte cDNA‐Fragmente zur Bestimmung des Expressionsniveau ausgewählter

Gene zu bestimmen, wurden für diese Sequenzen spezifische Oligonukleotide in der

PCR‐Reaktion (vgl. Mullis und Faloona, 1987) eingesetzt (siehe Tab. 2.2). Um


Pipettierfehler zu minimieren, wurde die cDNA für den PCR‐Reaktionsansatz zuvor 1:10

in Merck‐H2O verdünnt. Der PCR‐Reaktionsansatz wurde in zuvor autoklavierten

0,2 ml Eppendorf‐Reaktionsgefäßen (Eppendorf, Hamburg) in einem Gesamtvolumen

von 20 μl angesetzt. Taq‐Polymerase (nativ, ohne BSA), aus dem Bakterium

Thermus aquaticus, MgCl2, Desoxyribonukleotide (dNTP´s) sowie Taq‐Puffer ohne MgCl2

wurden von der Fermentas (St. Leon Rot) bezogen. Der PCR‐Reaktionsansatz setzte sich

wie folgt zusammen:

1,5 mM MgCl2 1 µM forward‐Primer 1 µM reverse‐Primer 0,1 mM dNTPs 1 x Reaktionspuffer 1,25 U Taq‐Polymerase 10 µl 1:10 verdünnte cDNA Auf 20 µl mit Merck‐H2O auffüllen

Für die PCR‐Ampflifikation der cDNA wurde entweder ein Mastercycler® Personal oder

ein Mastercycler® Gradient (beide Eppendorf, Hamburg) verwendet. Um Rückschlüsse

auf das Expressionsniveau verschiedener Gene anhand der cDNA nach der Amplifikation

ziehen zu können, wurde für jedes in dieser Arbeit untersuchte Fragment eine

Optimierung der Zyklenzahl durchgeführt, um zu gewährleisten, dass die Amplifikation

im linearen Bereich abläuft. Hierfür wurde WT‐cDNA als Substrat für die PCR‐Reaktion

eingesetzt. Die Auswertung und die Bestimmung der optimalen Zyklenzahl wurde

anhand einer densiometrischen Auswertung (siehe Kapitel 2.8.7) bestimmt. Die jeweils

optimierte Zyklenzahl sowie die spezifische Annealing‐Temperatur für die eingesetzten

Oligonukleotide sind in Tab. 2.2 zusammengefasst. Folgendes PCR‐Programm wurde für

die Amplifizierung der cDNA verwendet.

5 min 95°C Prä‐Denaturierung 1 min 95°C Denaturierung Optimierte Zyklenzahl 1 min XX°C Annealing 1 min 72°C Extension 5 min 72°C Abschluss‐Extension ∞ 10°C Kühlung

2.8.6 Auftrennung der Fragmente im Agarosegel

Die analytische Auftrennung der zuvor amplifizierten cDNA erfolgte in horizontalen TAE‐

Gelen. Für ein Gel wurden 100 ml 1x TAE‐Puffer mit 1,5 % (w/v) Agarose versetzt und

aufgekocht. Nach dem Abkühlen der Agarose‐TAE‐Lösung auf ca. 50°C wurden 30 µl

0,1 % Ethidiumbromid zugegeben und die Lösung in Gelkammern (10 x 10 x 1 cm) mit


Taschenformer gegossen. Nach dem Aushärten des Gels wurde der Taschenformer

entfernt und das Gel in einer Laufkammer mit 0,5x TAE‐Puffer überschichtet. Die cDNA‐

Amplifikate aus der PCR‐Reaktion (siehe Kapitel 2.8.5) wurden mit

0,2 Volumeneinheiten 5x TBE‐Ladepuffer versetzt. Die Auftrennung erfolgte bei einer

Spannung von 100 V. Die Agarosegele wurden mit dem

Molecular Imager Gel Doc XR System (BioRad, München) ausgewertet.

TAE‐Puffer: 2 M Tris 100 mM EDTA mit Essigsäure auf pH 8 einstellen

TBE‐Ladepuffer: 90 mM Tris 90 mM Borsäure 2,5 mM EDTA 6 % (v/v) Glycerin 0,04 % (w/v) Bromphenolblau mit NaOH auf pH 7,6 einstellen

2.8.7 Densiometrische Auswertung

Die im Agarosegel aufgetrennten Amplifikate der RT‐PCR‐Analysen wurden einer

densiometrischen Auswertung über das Programm Quantity One (Version 4.6.1, BioRad,

München) nach Herstellerangaben durchgeführt. Hierbei wurde die Dichte der Banden

densiometrisch analysiert. Als Bezugswert diente der GeneRulerTM 100 bp Plus DNA

Ladder, von welchem in jedem Agarosegel als Standardbande 0,33 µg DNA aufgetragen

wurden. Für jedes amplifizierte Fragment wurde auf die gleiche cDNA eine RT‐PCR‐

Analyse für Ubiquitin 10 (UBQ10 – At4g05320) als housekeeping gene durchgeführt, um

die Qualität der isolierten cDNA zu prüfen und um die densiometrisch berechneten

cDNA‐Konzentrationen der einzelnen Fragmente auf den UBQ10‐Gehalt abzugleichen.

Für die Zyklusoptimierungen wurde eine einfache densiometrische Bestimmung der

Dichte der im Agarosegel aufgetrennten Banden durchgeführt. Zur Überprüfung der

Qualität der hierfür eingesetzten cDNA wurde ebenfalls eine RT‐PCR‐Analyse für UBQ10

durchgeführt.

2.9 Immundetektion

Der immunologische Nachweis von Proteinen in A. thaliana wurde in Rohextrakten aus

Blattmaterial durchgeführt Die Proteine im Rohextrakt wurden elektrophoretisch

aufgetrennt, auf eine Membran geblottet und mit spezifischen Antikörpern

(siehe Tab. 2.3) detektiert. Die Isolierung des Rohextraktes und die Bestimmung der


Gesamt‐Proteinmenge im Rohextrakt wurde wie in Kapitel 2.6 beschrieben durch‐

geführt.

2.9.1 SDS‐PAGE

Die Auftrennung isolierter Proteine aus dem Rohextrakt erfolgte im vertikalen 15 %igen

Natrium‐Dodecylsulfat‐Polyacrylamid‐Gel (SDS‐Gel) nach Laemmli (1970).

Hierfür wurde ein 3 %iges Sammelgel über ein 15 %iges Trenngel gegossen. 25 µg

Protein aus dem Rohextrakt wurden zusammen mit 1/3 Probenvolumen 4 x SDS‐

Gelladepuffer für 10 min im kochenden Wasserbad erhitzt. Durch Zugabe von

0,1 Volumeneinheiten DTTRED wurden Disulfidbrücken zwischen Cystein‐Resten

reduziert und somit aufgebrochen. Nach dem Abkühlen wurde die Proben nochmals mit

0,1 Volumeneinheiten 1 M DTTRED für 10 min reduziert. Die so aufbereiteten Proben

wurden mit einer Hamilton‐Spritze (Techlab, Erkerode) auf das Sammelgel aufgetragen.

15 %iges Trenngel: 2,3 ml 40 % Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1) 1,6 ml 1,5 M Tris‐HCl (pH 8,8), 0,4% SDS 40 µl 10 % (w/v) Ammoniumpersulfat (APS) 60 µl 5 % (v/v) TEMED 2 ml H2Obidest

3 %iges Sammelgel: 230 µl 40% Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1)

1,5 ml 0,5 M Tris‐HCl (pH 6,8), 0,4% SDS, 20 µl 10 % (w/v) APS 80 µl 5% (v/v) TEMED 1,2 ml H2Obidest

4 x Gelladepuffer: 3 ml 4 M Tris‐HCl (pH 6,8) 2 g SDS 20 ml Glycerin

50 mg Bromphenolblau auf 50 ml mit H2Obidest auffüllen SDS – Laufpuffer : 12 mM Tris 192 mM Glycerin 1 % (w/v) SDS

2.9.2 Western‐Blot und Immundetektion

Nach der Methode von Burnette (1981) wurden die mittels SDS‐PAGE aufgetrennten

Proteine auf eine ImmunblotTM PVDF‐Membran (Porengröße 0,2 µm, BioRad, München)

transferiert. Die PVDF‐Membran wurde 10 s in 100% Methanol, danach 10 s in H2Obidest

gewaschen und 15 min in Transferpuffer inkubiert. Das SDS‐Gel wurde ebenfalls für

15 ‐ 30 min in Transferpuffer vorinkubiert. Der Transfer der Proteine auf die Membran

erfolgte nach Herstellerangaben nass in Transferpuffer in der Mini Trans‐

Blot Electrophoretic Transfer Cell (Biorad, München) bei 90 mA für 12 h. Zur Fixierung


der Proteine wurde die Membran nach dem Blot kurz in 100 % Methanol geschwenkt

und anschließend getrocknet. Um unspezifische Antikörperbindung an die proteinfreien

Bereiche der Membran zu vermeiden, wurde diese für 1 h in Blocking‐Puffer inkubiert.

Nach dem Blockieren wurde die Membran mit 10 ml des ersten spezifischen

Antikörpers (Verdünnung: siehe Tab. 2.3) für 1 h bei RT bei leichtem Schütteln inkubiert.

Die Antikörper‐Lösung wurde abgegossen und die Membran dreimal für 10 min in

Blocking‐Puffer und einmal für 10 min in TBS‐Puffer gewaschen, um nicht gebundene

Antikörperreste zu entfernen. Als zweiter Antikörper wurde 50 ml (1:25000 verdünnt)

der anti‐Kaninchen‐IgG‐Antikörper (BioRad, München) mit daran gekoppelter

Peroxidase verwendet, wobei die Membran für 1 h bei RT bei leichtem Schütteln

inkubiert wurde. Die Membran wurde dreimal für 10 min in Blocking‐Puffer und einmal

für 10 min in TBS‐Puffer gewaschen. Anschließend folgte die Färbung mit dem

ELC Western blotting detection reagents and analysis system (Amersham Bioscience,

Freiburg), welche nach Herstellerangaben durchgeführt wurde. Der für 10 min

aufgelegte Film (Kodak, Stuttgart) wurde für 3 min im Entwickler (Kodak, Stuttgart)

entwickelt und im Fixierer (Kodak, Stuttgart) 5 min fixiert.

Transferpuffer: 39 mM Glycin 48 mM Tris TBS‐Puffer: 20 mM Tris 0,5 M NaCl

mit HCl auf pH 7,4 einstellen Blocking‐Puffer: 50 mM Tris 150 mM NaCl 0,2 % (v/v) Tween 20 Mit HCl auf pH 7,6 einstellen 0,25 g/l fettfreies BSA frisch zugeben

Tab. 2.3: Liste der verwendeten Antikörper. Aufgelistet sind die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Antikörper, wobei die angegebene Verdünnung für die in Kapitel 2.9.2 beschriebene Immundetektion verwendet wurde. Der Antiköper gegen Fd aus Mais wurde von T. Hase (Universität Osaka), der Antikörper gegen NTRC aus Reis von F.J. Cejudo (Instituto de Bioquimica Vegetal y Fotosintesis, Sevillia, Spanien) und der Antikörper gegen BAS1 von K.J. Dietz (Universität Bielefeld) zur Verfügung gestellt.


Auftrennung von Pigment‐Protein‐Komplexen der Thylakoidmembran im Saccharosegradienten

2.10

Um die qualitative Zusammensetzung der Thylakoidmembran zu analysieren wurden

isolierte Thylakoide im Saccharosegradienten modifiziert nach der Methode von Ruban

et al. (1999) aufgetrennt.

2.10.1 Isolierung von Thylakoiden aus A. thaliana

Alle im Rahmen der Isolierung verwendeten Geräte und Materialien wurden auf 4 °C

vorgekühlt und die Zentrifugationsschritte wurden, soweit nicht anders vermerkt, in

einer Sorvall‐RC5 ‐Zentrifuge (Kendro, Hanau) mit den SS 34‐Rotor (Kendro, Hanau)

durchgeführt.

Es wurde ca. 10 g Blattmaterial geerntet und direkt in flüssigem Stickstoff gefroren. In

60 ml Homogenisierungspuffer wurde das eingefrorene Blattmaterial viermal 5 s mit

dem Ultra‐Turrax T25 (Janke und Kunkel IKA Labortechnik, Staufen) aufgeschlossen. Die

Suspension wurde durch vier Lagen Verbandsmull (Lohmann, Neuwied) und einer Lage

Miracloth (Calbiochem, Darmstadt) gefiltert, dann gleichmäßig auf

80 ml Zentrifugenröhrchen verteilt und anschließend zentrifugiert (2420 x g, 2 min,

4 °C). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 10 ml Sorbitmedium vorsichtig

resuspendiert. Die resuspendierte Lösung wurde in neue 80 ml Zentrifugenröhren

überführt und zunächst mit 3 ml 0,4 x Percoll‐Sorbitmedium sowie darauf mit

3 ml 1 x Percoll‐Sorbitmedium vorsichtig unterschichtet. Es folgte eine Zentrifugation im

HB 4‐Rotor (Kendro, Hanau) (2420 x g, 30 min, 4 °C, ohne Bremse), wobei sich die

Chloroplasten an der Grenzschicht zwischen dem 0,4 x Percoll‐Sorbitmedium und dem

1 x Percoll‐Sorbitmedium absetzten. Die Chloroplasten wurden vorsichtig mit einer

Pasteurpipette abgenommen, mit 10 ml Sorbitmedium in einem

80 ml Zentrifugenröhrchen verdünnt und zentrifugiert (2420 x g, 2 min, 4 °C). Der

Überstand wurde verworfen und das Pellet in 1 ml Sorbitmedium aufgenommen, mit

4 ml 5 mM KH2PO4 (pH 7,6) verdünnt und für 10 min bei RT inkubiert, wobei die

Chloroplasten durch den osmotischen Schock aufbrechen. Es folgte eine Zentrifugation

der aufgeschlossenen Chloroplasten (23426 x g, 30 min, 4 °C) um die Thylakoide zu

sedimentieren. Das Thylakoid‐Pellet wurde in 10 ml 5 mM KH2PO4 (pH 7,6)

resuspendiert und erneut zentrifugiert (20199 x g, 100 min, 4 °C). Das Pellet mit den

Thylakoiden wurde in 500 µl 5 mM KH2PO4 (pH 7,6) aufgenommen und der

Chlorophyllgehalt nach Porra et al. (1989) bestimmt.


Homogenisierungspuffer: 0,3 mM Sorbit (Lagerung bei ‐20 °C) 20 mM Tricin 5 mM EGTA 5 mM EDTA 10 mM NaHCO3 0,1 % (w/v) BSA auf pH 8,4 einstellen 2 mM Asc frisch hinzugegeben Sorbitmedium: 0,3 mM Sorbit (Lagerung bei ‐20 °C) 20 mM HEPES 5 mM MgCl2 2,5 mM EDTA 10 mM NaHCO3

0,1 % (w/v) BSA auf pH 7,9 einstellen 2 mM Asc frisch hinzugegeben Percoll‐Sorbitmedium: Sorbitmedium angesetzt in 100 % Percoll

2.10.2 Herstellung des Saccharosegradienten

Für die Auftrennung der Pigment‐Protein‐Komplexe wurde ein 8‐Stufen‐

Saccharosegradient direkt in einem Ultrazentrifugenröhrchen erstellt (siehe Abb. 2.1).

Hierbei wurde zunächst über eine fest installierte Glas‐Pasteurpipette 1,5 ml einer

0,16 M Saccharose‐Lösung in ein Ultrazentrifugenröhrchen überführt. Mit 1,5 ml einer

0,26 M Saccharose‐Lösung wurde die 1,6 M Saccharose‐Lösung vorsichtig

unterschichtet. Nach diesem Prinzip wurde der Gradient weiter mit höher

konzentrierten Saccharose‐Lösungen unterschichtet, bis ein 8‐stufiger Gradient nach

dem in Abb. 2.1 dargestellten Schema erstellt war. Die unterschiedlich konzentrierten

Saccharose‐Lösungen wurden hierbei aus einer 0,16 M und einer 1,87 M Saccharose‐

Lösung erstellt, wobei die Lösung mit der geringeren Saccharosekonzentration jeweils

mit der 1,87 M Stammlösung hochkonzentriert wurde.

0,16 M Saccharose‐Lösung: 3,3 g Saccharose 20 mM NaF mit HEPES‐Puffer‐A auf 60 ml auffüllen 600 µl HEPES‐Puffer‐B zugeben 1,87 M Saccharose‐Lösung: 38,4 g Saccharose 20 mM NaF mit HEPES‐Puffer‐A auf 60 ml auffüllen 600 µl HEPES‐Puffer‐B zugeben HEPES‐Puffer‐A: 5 mM HEPES mit KOH auf pH 7,6 einstellen HEPES‐Puffer‐B: 5 mM HEPES 1 % (w/v) n‐Dodecyl‐Maltosid

mit KOH auf pH 7,6 einstellen


Abb. 2.1: Schematische Aufbau des Saccharosegradienten. Links: Aufbau und Herstellung. Rechts: Fertiger 8‐Stufen‐Saccharosegradient.

2.10.3 Probenvorbereitung und Auftrennung

Für die isolierten Thylakoide wurde der Chlorophyllgehalt nach Porra et al. (1989)

bestimmt. Es wurden 250 µg Thylakoide (bezogen auf den Chlorophyllgehalt) mit

HEPES‐Puffer‐A (siehe Kapitel 2.10.2) auf 500 µl aufgefüllt. Weiter wurden 500 µl

HEPES‐Puffer‐C zugegeben, so dass alle verwendeten Proben ein Gesamtvolumen von

1000 µl bei einem Chlorophyllgehalt von 250 µg/ml aufwiesen. Das Probengemisch

wurde 30 min auf Eis inkubiert, wobei alle 5 min die Proben durch kurzes Schütteln

homogenisiert wurden. Von dem Probenansatz wurden 500 µl auf den

Saccharosegradienten aufgetragen.

Die Saccharosegradienten mit den aufgetragenen Proben wurden in der Optima XL‐80K

Ultrazentrifuge mit dem SW 41 – Rotor (Beckman Instruments Inc., Fullerton ‐ CA, USA)

zentrifugiert (19700 x g, 4 °C, 20 h, Beschleunigung 5, Bremse 5). Nach der

Zentrifugation wurden die Saccharosegradienten gegen einen weißen Hintergrund

fotografiert.

HEPES‐Puffer‐C: 5 mM HEPES 1,4 % (w/v) n‐Dodecyl‐Maltosid mit KOH auf pH 7,6 einstellen


2.11 P700‐Absorptionsmessungen

Die P700‐Absorptionsmessungen und der experimentelle Aufbau wurden in Anlehnung

an das von Schreiber et al. (1988) entwickelten Puls‐Amplituden‐Modulationsprinzip

durchgeführt. Soweit nicht anders vermerkt wurden die Messungen jeweils nach drei

Stunden in der Lichtphase vorgenommen, um diurnale Verschiebungen auszuschließen.

2.11.1 Experimentelles Setup

Zur Bestimmung der Absorptionsänderungen von P700 (ΔAP700) im Nahen‐Infrarot‐

Bereich (NIR) wurde das Fluorometer PAM‐101 (Heinz Walz GmbH, Effeltrich)

verwendet Dabei wurden kurze Messlichtimpulse (1 µs, λ = 830 nm) über eine

lichtemittierende Diode (LED) in der Emittor‐Detektor‐Einheit ED‐P700‐DW‐E (Heinz

Walz GmbH, Effeltrich) bei einer Modulation von 100 kHz angelegt. Der Messlichtimpuls

wurde am PAM‐101 auf eine Intensität von zwölf festgelegt (0,07 µE m‐2 s‐1). Über den

2‐Wellenlängen‐Detektor ED P700 DW‐E (Heinz Walz GmbH, Effeltrich) wurden

Emissions‐Messungen bei einer Wellenlänge von 830 nm durchgeführt. Als Referenz

dienten Messungen bei einer Wellenlänge von 860 nm (siehe Kapitel 3.1.2.1). Die

Glasfiberoptik EK‐1 (Euromex, Arnheim) wurde als NIR‐Quelle verwendet, wobei die

Einstellung der Wellenlänge von λ > 700 nm mit dem Filter RG‐716 (Schott, Hochheim)

vorgenommen wurde. Die Datenaufzeichnung für ΔAP700 über WinControl‐

Software (Heinz Walz GmbH, Effeltrich) erfolgte mit dem PAM‐Data‐Acquisition‐System

(PDA‐100, Heinz Walz GmbH, Effeltrich), wobei die Verstärkung (Gain) des Signals nach

voheriger Optimierung auf neun und die Dämpfung (Damping) auf elf festgelegt wurde.

Die Bestimmung von ΔAP700 im NIR wurde direkt an Blattscheiben (1,33 cm2)

durchgeführt. Die Pflanzen wurden zuvor für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten

(siehe Kapitel 3.1.2.1). Die Messungen von ΔAP700 erfolgten zunächst für ca. 3 min im

Dunkeln. Anschliessend erfolgte eine Bestrahlung der Blattscheiben für bis zu 7 min im

NIR. Hierbei wurde alle 0,06 s ein Messpunkt aufgezeichnet, wobei ΔAP700 im Dunkeln

vor der Messung manuell auf 300 – 400 mV am PAM‐101 gesetzt wurde, um ein

Abdriften in negative Werte zu vermeiden, da diese von der WinControl‐Software nicht

aufgezeichnet werden. Die Daten sind als ΔAP700‐Kinetik im Ergebnisteil dargestellt,

wobei die Aufbereitung der Rohdaten mit dem Programm Graphpad Prism (Software

Mackiev, Graphpad Software, Version 4.02) erfolgte.


2.11.2 Bestimmung der maximalen P700‐Absorptionsänderung im NIR

Aus den ΔAP700‐Kinetiken konnte die maximale Änderung von ΔAP700 im NIR (ΔAP700‐MAX)

bestimmt werden, wobei die arithmetischen Mittelwerte von ΔAP700 im Dunkeln

(ΔAP700‐D) und ΔAP700 im NIR (ΔAP700‐N) mit n > 1000 für die Berechnung herangezogen

wurden (ΔAP700‐MAX = ΔAP700‐N ‐ ΔAP700‐D).

2.12

2.11.3 Bestimmung von ΔAP700 im NIR an mit Methylviologen behandelten Blattscheiben

Die Messungen und Auswertung von ΔAP700 an mit Methylviologen (MV) behandelten

Blattscheiben (1,33 cm2) erfolgte nach dem in Kapitel 2.11.1 und Kapitel 2.11.2

beschriebenen Prinzip. Hierfür wurden die Blattscheiben vor der Messung mit der

Blattoberseite in 10 ml H2O (Referenzwert) bzw. in 10 ml 100 µM Methylviologen für 5 h

im Dunkeln inkubiert. MV wird hierbei über die Epidermiszellen der Blattscheiben

aufgenommen.

Chlorophyllfluoreszenz‐Messungen

Die Messungen der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission wurden zur Einordnung der

photosynthetischen Lichtnutzung von Pflanzen durchgeführt und erfolgten nach dem

Puls‐Amplituden‐Modulationsprinzip in Anlehnung an Schreiber (1986). Soweit nicht

anders vermerkt fanden die Messungen nach drei Stunden in der Lichtphase statt, um

diurnale Schwankungen auszuschließen.

2.12.1 Experimentelles Setup

Die Bestimmung der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission am PSII erfolgte mit dem

Fluorometer PAM‐101 mit integriertem PAM‐103 (flash trigger control) (Heinz Walz

GmbH, Effeltrich). Durch eine LED in der Emitter‐Detektor‐Einheit 101 ED(Heinz Walz

GmbH, Effeltrich) wurden kurze Messlichtimpulse (ML ‐ λ = 650 nm) von 1 μs bei einer

Modulation von 1,6 kHz bzw. 100 kHz (siehe Abb. 2.2) abgestrahlt. Der Messlichtimpuls

wurde am PAM‐101 auf eine Intensität von zwölf (0,1 µE m‐2 s‐1) festgelegt. Zwischen

den Lichtpulsen wurde im Detektor‐Teil der Emittor‐Detektor‐Einheit 101 ED (Heinz

Walz GmbH, Effeltrich) die jeweilige Fluoreszenzemission bei λ > 700 nm gemessen. Die

Trennung des Messlichts vom aktinischen Licht (AL ‐ photosynthetisch nutzbares Licht)

macht es möglich, die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission unter verschiedenen

Lichtintensitäten zu messen. Emittiert wurde das aktinische Licht von der Halogenlampe


KL 1500 (Schott, Hochheim). Die Lichtpulse mit einer Intensität bis zu 5000 μE m‐2 s‐1

wurden durch eine Lichtquelle FL‐103 (Heinz Walz GmbH, Effeltrich) abgegeben. Die

Datenaufzeichnung der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission über WinControl‐

Software (Heinz Walz GmbH, Effeltrich) erfolgte mit dem PAM‐Data‐Acquisition‐System

(PDA‐100, Heinz Walz GmbH, Effeltrich), wobei die Verstärkung (Gain) des

aufgenommenen Signals am PAM‐101, nach voheriger Optimierung, auf zwölf und die

Dämpfung (Damping) auf elf festgelegt wurde.

2.12.2 Bestimmung der Parameter zur photosynthetischen Lichtnutzung

Die Pflanzen wurden vor jeder Messung 15 – 30 min im Dunkeln gehalten, bevor an

Blattscheiben (1,33 cm2) die Messung der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission erfolgte,

wobei alle 0,02 s ein Datenpunkt aufgezeichnet wurde. Innerhalb der Messung wurde

zunächst an der Dunkel‐adaptierten Blattscheibe die Grundfluoreszenz (F0) im Messlicht

und die maximale Fluoreszenz (FM) durch einen Sättigungspuls (1 s bei ca. 5000 μE)

bestimmt. Anschließend folgte eine kurze Dunkelphase (ca. 10 s), um die Re‐Oxidation

von P680 zu ermöglichen. Weiter wurde die Blattscheibe 15 min mit aktinischem Licht

(150 bzw. 800 μE m‐2 s‐1) und zusätzlich in 30 s‐Intervallen mit SPs bestrahlt

(siehe Abb. 2.2).

Anhand der aufgezeichneten Chlorophyllfluoreszenz‐Emission wurden in Anlehnung an

Schreiber et al. (1986), Walker (1988) und Genty et al. (1989) Parameter zur Einordnung

der photosynthetischen Lichtnutzung bestimmt bzw. berechnet, wobei die Nomenklatur

nach van Knooten und Snel (1990) erfolgte. Hierbei wurden zunächst die Parameter F0,

FM, F (steady‐state Fluoreszenz im aktinischem Licht), F0’ (Grundfluoreszenz im Licht‐

adaptierten Zustand) und FM’ (maximale Fluoreszenz im Licht‐adaptierten Zustand)

abgeleitet (siehe Abb. 2.2). Aus diesen Parametern wurde anhand der unten

angegebenen Formeln ФII (Quantenausbeute am PSII), qP (photochemische

Fluoreszenzlöschung – photochemical quenching), NPQ (nicht‐photochemische

Fluoreszenzlöschung – non‐photochemical quenching), ETR (Elektronentransportrate)

sowie FV/FM, und qL berechnet.

ФII = 'FF'F

M

M −

'F'FF

NPQM

MM −=

M

0M

M

V FFFF

F −=

'F'FF'F

qP0M

M

−−

= /FFqP

q0

L =

0,5*LI*'FF'F

ETRM

M −= LI = Betrag der anliegenden Lichtintensität in µE m‐2 s‐1


Abb. 2.2: Schematische Darstellung einer typischen Chlorophyllfluoreszenz‐Messung. Neben der Messkurve sind an der x‐Achse die variierenden Einstellungen während der Messung und an der y‐Achsedie zu bestimmenden Parameter für die Auswertung (siehe Kapitel 2.12.2) angegeben.

2.12.3 Bestimmung des Parameters FC

Zur Bestimmung des Parameters FC, dem Anteil der chlororespiratorischen

Chlorophyllfloureszenz‐Emission eines Licht‐adaptierten Blattes im Dunkeln, bezogen

auf die Chlorophyllfloureszenz‐Emission im Licht (siehe Kapitel 2.12.2), wurde das in

Kapitel 2.12.1 beschriebene experimentelle Setup verwendet. Für die Messung der

Chlorophyllfluoreszenz‐Emission wurden Blattscheiben herangezogen (1,33 cm2),

welche für 15 min mit aktinischem Licht (150 bzw. 800 μE m‐2 s‐1) bestrahlt und danach

für bis zu 10 min im Dunkeln weiter bemessen wurden (siehe Abb. 2.3). Hierbei wurde

alle 0,02 s ein Datenpunkt aufgezeichnet. Die Berechnung von FC erfolgte anhand der

aufgezeichneten Chlorophyllfluoreszenz‐Emission nach folgender Formel:

'FF'FF

F0

00C

C

−=

−

Die Bestimmung von F und F0’ erfolgte hierbei wie in Kapitel 2.12.2 beschrieben. Für F0C

wurde die maximale Chlororespiration (Chlorophyllfluoreszenz‐Emission im Dunkeln im

Licht‐adaptierten Blatt) bestimmt (siehe Abb. 2.3).


Abb. 2.3: Schematische Darstellung einer typischen Chlorophyllfluoreszenz‐Messung mit Chlororespiration im Dunkeln. Neben der Messkurve sind an der x‐Achse die variierenden Einstellungen während der Messung und an der y‐Achse die zu bestimmenden Parameter für die Auswertung von FC angegeben. Die Messung muss mindestens 15 min im aktinischen Licht (AL) erfolgen, um den Parameter FC

M im Dunkeln bestimmen zu können.

CO2‐Gaswechselmessungen 2.13 Die in den folgenden Kapiteln beschriebene Methodik befasst sich mit dem Prinzip der

CO2‐Gaswechselmessungen und beschreibt die variablen Parameter für die in dieser

Arbeit durchgeführten Versuche. Die Bedienung des hierbei verwendeten Systems

sowie allgemeine Parameter und Anwendungen sind hierbei, soweit im Rahmen dieses

Kapitels nicht aufgeführt, der Bedienungsanleitung des Herstellers (LI‐6400 Instruction

Manual, Version 6; ftp://ftp.licor.com/perm/env/LI‐6400/Manual/Using_the_LI‐

6400XT‐v6.1.pdf) zu entnehmen.

sich mit dem Prinzip der

CO2‐Gaswechselmessungen und beschreibt die variablen Parameter für die in dieser

Arbeit durchgeführten Versuche. Die Bedienung des hierbei verwendeten Systems

sowie allgemeine Parameter und Anwendungen sind hierbei, soweit im Rahmen dieses

Kapitels nicht aufgeführt, der Bedienungsanleitung des Herstellers (LI‐6400 Instruction

Manual, Version 6; ftp://ftp.licor.com/perm/env/LI‐6400/Manual/Using_the_LI‐

6400XT‐v6.1.pdf) zu entnehmen.

2.13.1 Experimentelles Setup 2.13.1 Experimentelles Setup

Für die Messungen an A. thaliana wurde das LI‐6400XT Portable Photosynthesis System

(LI‐COR Biosciences, Lincoln, USA) verwendet. Zusätzliche für das LI‐6400XT Portable

Photosynthesis System spezifische Geräte und Applikationen wurden ebenfalls von der

Firma LI‐COR Biosciences bezogen und nach Herstellerangaben verwendet.

Für die Messungen an A. thaliana wurde das LI‐6400XT Portable Photosynthesis System

(LI‐COR Biosciences, Lincoln, USA) verwendet. Zusätzliche für das LI‐6400XT Portable

Photosynthesis System spezifische Geräte und Applikationen wurden ebenfalls von der

Firma LI‐COR Biosciences bezogen und nach Herstellerangaben verwendet.

Bei dem LI‐6400XT Portable Photosynthesis System handelt es sich um ein offenes

Gaswechselsystem. Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen wurde

dem aufgenommenen Gasgemisch zunächst CO2 mittels Natronkalk (LI‐COR Biosciences,

Lincoln, USA) entzogen und über getrocknetes CaSO4 (Drierite, LI‐COR Biosciences,

Bei dem LI‐6400XT Portable Photosynthesis System handelt es sich um ein offenes

Gaswechselsystem. Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen wurde

dem aufgenommenen Gasgemisch zunächst CO2 mittels Natronkalk (LI‐COR Biosciences,

Lincoln, USA) entzogen und über getrocknetes CaSO4 (Drierite, LI‐COR Biosciences,

Lincoln, USA) die relative Luftfeuchtigkeit reguliert. Mittels dem 6400‐01 CO2‐Mixer Lincoln, USA) die relative Luftfeuchtigkeit reguliert. Mittels dem 6400‐01 CO2‐Mixer


wurden über einen 12 g CO2‐Zylinder (LI‐COR Biosciences, Lincoln, USA) dem nun CO2‐

freien Gasgemisch kontrolliert CO2 zugeführt, um es danach in die Messküvette mit der

Blattprobe zu pumpen. Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche an

A. thaliana wurde die Gaswechsel‐Küvette 6400‐40 Leaf Chamber Fluorometer

verwendet. iese Gaswechsel‐Küvette dient hierbei zusätzlich als Lichtquelle und als

Fluorometer. Die Messungen der CO2‐ sowie der H2O‐Konzentration im Gasgemisch

erfolgte über Infrarot‐Gasanalysatoren (IRGA). Hierbei wurde ein Teil des anliegenden

Gasgemisches über die Messküvette mit dem eingespannten Blatt geleitet und die CO2‐

sowie H2O‐Konzentrationen als Sample‐Werte ([CO2S] bzw. [H2OS]) von einem IRGA

direkt hinter der Messküvette aufgezeichnet. Ein Teil des Gasgemisches wurde an der

Messküvette vorbei geleitet und von einem zweiten IRGA analysiert, um die Referenz‐

Werte der CO2‐ sowie H2O‐Konzentrationen ([CO2R] bzw. [H2OR]) zu bestimmen.

Während der Messungen erfolgte vor jeder Aufnahme eines Datenpunktes ein Abgleich

der IRGAs über den Match‐Mode. Die CO2‐Assimilationsrate bzw. Photosyntheserate (A)

wurde nach folgender Beziehung berechnet:

D

S][CO*ES

S])[COR]([CO*u 2A 2T

2−

−=

Hierbei wurde die Flussrate (u) direkt über ein flow‐meter aufgezeichnet. Die Blattfläche

E

(S) wurde über die Fläche der Messküvette (1,8 cm2) abgeleitet und die

Transpirationsrate ( T) über folgende Beziehung bestimmt:

OS])[H(1*SOR])[HOS]([H*u 22

E2

T −−

=

Für alle im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen der Photosyntheseraten

(

ch lie

Beziehungen sind, soweit nicht aufgeführt, den Herstellerangaben zu entnehmen.

wurden zuvor Stabilitätskriterien festgelegt. Die Stabilitätskriterien beschreiben einen

Bereich, in welchem die aufgenommenen Parameter stabil sind und somit die

Aufnahme eines Datenpunktes erlauben. Hierfür wurde ein Bemessenszeitraum von

15 s gesetzt, in welchem [CO2S] und [H2OS] keiner höheren Schwankung als 1 µmol mol ‐

1 unterliegen und Abweichungen in der Flussrate nicht mehr als 1 mol s‐1 betragen

durften. Das LI‐6400XT Portable Photosynthesis System wurde über die für das System

spezifische Software OPEN (Version 5, LI‐COR Biosciences, Lincoln, USA) gesteuert. Die

Datenaufzeichnung wurde automatisiert über die OPEN‐Software durchgeführt, wobei

neben den über die System‐Sensoren direkt gemessenen Parametern (z. B. CO2‐

Konzentrationen, Temperatur oder Lichtintensität) auch die Kalkulation der zu

berechnenden Parameter z. B. Photosyntheserate, Blattleitfähigkeit oder

Transpirationsrate) automatis erfolgte. Die hier zu Grunde genden mathematischen


2.13.2 Bestimmung des CO2‐Gaswechsels im steady‐state

Die Bestimmung des CO2‐Gaswechsels im steady‐state wurde nach dem in

nisteil nicht anders

d i e

ngen

ie Lichtsättigungskurven mit der simultanen Bestimmung der Chlorophyllfluoreszenz‐

ungen

e

g h 2

g l

kl

Kapitel 2.13.1 beschriebenen Prinzip durchgeführt. Soweit im Ergeb

vermerkt, wurden ie Pflanzen jeweils nach dre Stunden in der Lichtphase bemess n.

Für die Messungen wurden zur Anzucht identische Bedingungen etabliert (150 bzw.

800 µE m‐2 s‐1, 20 °C, 55 % Luftfeuchtigkeit; 21 % O2; 0,04 % CO2). Für jede Pflanze

wurden fünf Messpunkte innerhalb einer fünfminütigen Messung gesetzt.

2.13.3 Lichtsättigungskurven und Chlorophyllfluoreszenz‐Messu

D

Emission wurden unter den in Kapitel 2.13.1 beschriebenen Voraussetz

durchgeführt. Hierbei wurde die jeweilige Photosyntheserate in Abhängigkeit zur

anliegend n Lichtintensität bestimmt. Mittels der Gaswechsel‐Küvette 6400‐

40 Leaf Chamber Fluorometer wurde zusätzlich die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission

nach dem Puls‐Amplituden‐Modulationsprinzip auf ezeic net (siehe Kapitel 2.1 ) und

nach dem in Kapitel 2.12.2 dargestellten System direkt über die OPEN‐Software

ausgewertet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden „schnelle“ Lichtsättigungskurven erstellt,

um die minimale sowie maximale Photosyntheserate in Abhängigkeit von der

Lichtintensität bestimmen zu können. Hierbei wurde in kurzen Abständen von hohen zu

niedrigen Lichtintensitäten emessen, womit das das natür iche Schließen der Stomata

unter niedrigen Lichtintensitäten vermieden wurde. Jede Lichtintensität wurde

höchstens für 2 min angelegt. Die Photosyntheserate bei der jeweilig anliegenden

Lichtintensität wurde frühestens nach 1 min und spätestens nach 2 min, abhängig von

der Erfüllung der Stabilitätskriterien, aufgezeichnet. Innerhalb der Messung über ein

zuvor erstelltes Autoprogramm wurde die Pflanze zunächst für 10 min im Dunkeln

gehalten, um F0 und FM im Dunkel‐adaptierten Blatt zu bestimmen. Nach der

Dunkelinkubation wurden in großen Schritten die Lichtintensität bis auf 2000 µE m‐2 s‐1

erhöht und folgend in einen Schritten verringert (siehe Lichtsättigungskurven‐

Autoprogramm). Für die Auswertung wurden die Daten herangezogen, die zwischen

2000 und 0 µE m‐2 s‐1 aufgenommen wurden. Während der Messung wurden die zur

Anzucht identische Bedingungen (20 °C, 55 % Luftfeuchtigkeit; 21 % O2; 0,04 % CO2)

konstant gehalten.

Lichtsättigungskurve‐Autoprogramm: 0 min – 15 min 0 µE m‐2 s‐1 ‐2 ‐1

15 min – 20 min 150 bzw. 800 µE m s 20 min – 22 min 400 µE m‐2 s‐1

‐1 22 min – 24 min 2000 µE m‐2 s 24 min – 26 min 1500 µE m‐2 s‐1


26 min – 28 min 1000 µE m‐2 s‐1

28 min – 30 min 500 µE m‐2 s‐1

ie Erstellung von A/Ci‐Kurven wurde unter den in Kapitel 2.13.1 beschriebenen

Voraussetzungen durchgeführt. Hierbei wurde die Photosyntheserate in Abhängigkeit

substomatären Raum (C ) bestimmt. C ist eine berechnete

30 min – 32 min 250 µE m‐2 s‐1

32 min – 34 min 150 µE m‐2 s‐1

34 min – 36 min 120 µE m‐2 s‐1

36 min – 38 min 50 µE m‐2 s‐1 38 min – 40 min 20 µE m‐2 s‐1

40 min – 42 min 10 µE m‐2 s‐1

42 min – 44 min 0 µE m‐2 s‐1

2.13.4 A/Ci‐Kurven

D

zur CO2 i i

Größe und wurde über folgende Beziehung bestimmt:

‐Konzentration im

2E

AS][CO*)2E

(gC

2tw

i

−−=

gtw +

Hierbei ist Ci u.a. vom Öffnungszustand der Stomata abhängig, welcher über die H2O‐

Blattleitfähigkeit (gtw) angezeigt und über folgende Formel berechnet wurde:

OS][H]O[HE

g2ST2

tw−

=

Es wurde davon ausgegangen, dass die H2O‐Konzentration im substomatären Raum

[H2OST] gesättigt und somit ausschließlich von der Temperatur und dem Druck abhängig

ist. Aus dieser Annahme erfolgte die Berechnung von [H O ] über folgende Beziehung: 2 ST

P(T)e

OHsat

ST2 =

Hierbei ist esat(T) die Konstante für den Dampfdruck in Abhängigkeit zur anliegenden

Temperatur und P der anliegende Druck.

i

ng der RubisCO bei geringen Ci zu vermeiden.

Um unterschiedliche C ‐Konzentrationen zu erreichen, wurde innerhalb eines

en wurde

zur

Im Rahmen d eser Arbeit wurden „schnelle“ A/CI‐Kurven erstellt, um ein Schließen der

Stomata bei hohen Ci oder eine Inaktivieru

i

Autoprogramms [CO2R] alle 3 min verändert, wobei zunächst geringe und zum Ende der

Messung ansteigende Konzentrationen angelegt wurden (siehe A/Ci‐Kurve

Autoprogramm). Die Photosyntheserate bei der jeweilig anliegend [CO2R]

frühestens nach 2 min und spätestens nach 3 min, abhängig von der Erfüllung der

Stabilitätskriterien, aufgezeichnet. Während der Messung wurden die Anzucht


identische Bedingungen konstant gehalten (150 bzw. 800 µE m‐2 s‐1; 20 °C,

55 % Luftfeuchtigkeit; 21 % O2).

A/Ci‐Kurve Autoprogramm: 0 min 3 min [CO2R] = 400 µmol mol‐1

–3 min – 6 min [CO2R] = 300 µmol mol‐1

6 min – 9 min [CO2R] = 200 µmol mol‐1

rve unter iebenen

edingungen wurde am gleichen Blatt eine zweite A/Ci‐Kurve nach dem gleichen Prinzip

2.13.5 Berechnung des Parameters APR

er Parameter APR wurde im Rahmen dieser Arbeit eingeführt, um den apparenten

maximalen RubisCO‐Verbrauchsrate zu

9 min – 12 min [CO2R] = 100 µmol mol‐1 12 min – 15 min [CO2R] = 50 µmol mol‐1 15 min – 18 min [CO2R] = 200 µmol mol‐1 18 min – 21 min [CO2R] = 400 µmol mol‐1 21 min – 24 min [CO2R] = 500 µmol mol‐1

24 min – 27 min [CO2R] = 600 µmol mol‐1 27 min – 30 min [CO2R] = 700 µmol mol‐1 30 min – 33 min [CO2R] = 800 µmol mol‐1 36 min – 39 min [CO2R] = 1000 µmol mol‐1

39 min – 42 min [CO2R] = 1200 µmol mol‐1

Direkt im Anschluss an die Erstellung einer A/Ci‐Ku den oben beschr

B

gemessen. Hierbei wurde unter Verwendung von N2 als Gasgemisch eine O2‐freie

Atmosphäre in der Messküvette etabliert. Lichtintensität, Temperatur und

Luftfeuchtigkeit entsprachen den Anzuchtbedingungen und wurden während der

Messung konstant gehalten (150 bzw. 800 µE m‐2 s‐1; 20 °C, 55 % Luftfeuchtigkeit;

0 % O2). Die Messungen unter O2‐freier Atmosphäre wurden durchgeführt, um die

maximale RubisCO‐Verbrauchsrate zu bestimmen und den Parameter APR zu berechnen


D

prozentualen Anteil der Photorespiration an der

bestimmen (siehe Kapitel 3.1.2.4). Hierfür wurden A/Ci‐Kurven bei 21 % O2 im

Referenzgas und in O2‐freier Atmosphäre erstellt (siehe Kapitel 2.13.4). Die Berechnung

von APR erfolgte für die jeweiligen Ci‐Werte nach folgender Beziehung:

100*AAA

)(CA0

0Ni PR

−=

Hierbei steht AN für die Photosyntheserate in O2 Atmosphäre und AO für die

Photosyntheserate bei 21 % O2 im Referenzgas.

‐freier


ROS‐Bestimmung 2.14

Die ROS‐Akkumulation im photosynthetisch aktiven Gewebe der im Rahmen dieser

Arbeit verwendeten Pflanzen wurde an isolierten Blatt‐Protoplasten mittels

Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt.

2.14.1 Isolierung von Protoplasten aus Blatt‐Gewebe

Für die Isolierung von Protoplasten wurden mit einer scharfen Rasierklinge abgetrennte

Blätter zunächst mit der Blattoberseite nach unten, in eine mit H2Obidest gefüllte Glas‐

Petrischale gelegt. Unter Wasser wurde die Epidermis der Blattunterseite mit einer

feinen flachen Pinzette entfernt. Die epidermislosen Bereiche der Blätter wurden mit

einer Rasierklinge abgetrennt und in eine weitere Glas‐Petrischale (Ø 94 mm) mit der

Blattunterseite nach unten in Lösung A überführt, bis die Fläche der Petrischale

vollständig mit Blattmaterial ausgefüllt war. Lösung A wurde vorsichtig entfernt und

durch Lösung B ersetzt. In Lösung B wurden die Blattstücke für 40 min bei 24 °C und

30 upm inkubiert. Um die Protoplasten weiter aus den Blättern zu lösen wurde die

Petrischale vorsichtig einige Male geschwenkt. Der Puffer mit den darin enthaltenen

Protoplasten wurde anschließend durch ein Nylonnetz mit einer Maschenweite von

100 µm filtriert. Mit Lösung A wurden die Blattstücke so mehrmals vorsichtig

gewaschen bis sich der Großteil der Protoplasten gelöst hatte. Das gesamte Filtrat

wurde in 50 ml‐Greinerröhrchen (Greiner, Essen) überführt und zentrifugiert (100 x g,

3 min, RT). Das Pellet wurde vorsichtig, ohne es aufzuwirbeln, mit 10 ml W5‐Lösung

gewaschen und wiederum zentrifugiert (100 x g, 3 min, RT). Anschließend wurde das

Pellet in 6 ml W5‐Lösung resuspendiert und in 10 ml‐Greinerröhrchen (Greiner, Essen)

zur weiteren Behandlung in 1 ml Anteile aliquotiert.

Lösung A: 0,4 M Mannitol 20 mM KCl 20 mM MES (pH 5,7) 10 mM CaCl2 0,1 % (w/v) BSA durch 0,45‐µm‐Filter filtrieren

Lösung B: Lösung A 1,5 % (w/v) Cellulase R10 (Serva) 0,4 % (w/v) Macerozyme R10 (Serva)

W5‐Lösung: 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5,7) 5 mM Glukose


2.14.2 ROS‐Visualisierung

Die aliquoten Anteile der Protoplasten‐Suspension (siehe Kapitel 2.14.1) wurden für 7 h

unter moderaten Bedingungen inkubiert, danach mit 1 µM des membrandurchlässigen

Färbemittels 5 (und 6)‐Chloromethyl‐2´,7‐dichlorodihydrofluorescein‐Diacetat (CM‐

H2DCFDA, Invitrogen, Karlsruhe) versetzt und weitere 15 min bei RT im Dunkeln

inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert (100 x g, 3 min, RT), drei‐ bis viermal mit W5‐

Lösung (siehe Kapitel 2.14.1) gewaschen und letztlich in ca. 500 µl W5‐Lösung

resuspendiert. Die bildliche Darstellung der Protoplasten erfolgte durch ein konfokales

laser scanning‐Mikroskopsystems (LSM 510 META; Zeiss, Göttingen) mit einem

20 bzw. 40 x EC Plan Neofluor (N.A. 1.3) Öl Objektiv. CM‐H2DCFDA‐Fluoreszenz bzw. die

Autofluoreszenz des Chlorophylls wurden nach Anregung mit Licht der Wellenlänge

488 nm und durch Emission von Licht der Wellenlänge 500 ‐ 530 nm (CM‐H2DCFDA‐

Fluoreszenz) bzw. 650 ‐ 710 nm (Chlorophyll Autofluoreszenz) visualisiert. Um

standardisierte Bedingungen zu schaffen, wurden alle Bilder unter Verwendung

derselben Parameter gescannt.

Die Mitochondrien wurden mit 50 nM MitoTracker Orange CMTMRos (Invitrogen,

Karlsruhe) sichtbar gemacht, wobei die Färbelösung direkt zu den belichteten

Protoplasten zugegeben und weitere 15 min im Dunkeln bei RT inkubiert wurden.

Hierbei erfolgte die Anregung mit Licht der Wellenlänge von 554 nm und die Emission

wurde bei 576 nm detektiert.

2.15 Lokalisationsstudien

Für die Lokalisationsstudien (siehe Kapitel 3.3.2) wurden mit einem FdC1‐GFP‐

Fusionskonstrukt transformierte Protoplasten verwendet. Die Visualisierung erfolge

mittels Fluoreszenzmikroskopie.

2.15.1 Klonierung des FdC1‐GFP‐Fusionsproteins

Alle im Rahmen der Klonierung des FdC1‐GFP‐Fusionsproteins verwendeten Materialien

und Lösungen wurden soweit möglich autoklaviert oder sterilisiert. Mittels spezifischer

Oligonukleotide (siehe Tab. 2.2) wurde ein Volllängenklon von FdC1 mit den

Restriktionsschnittstellen XbaI und KpnI aus isolierter cDNA (siehe Kapitel 2.8) von

A. thaliana mittels PCR (siehe Kapitel 2.8.5) amplifiziert und in den geöffneten Vektor

pGEMTeasy (Promega, Mannheim) mit der T4‐Ligase (Fermentas, St. Leon‐Rot) nach

Herstellerangaben ligiert. Es folgte eine Transformation des Vektors

(siehe Kapitel 2.15.1.1) in chemisch kompetente (vgl. Hanahan, 1983) E. coli‐Zellen


(E. coli XL1‐Blue; vgl. Bullock et al., 1987). Nach der Vermehrung der Zellen wurden die

Plasmid‐DNA mittels einer Minipräperation isoliert (siehe Kapitel 2.15.1.2) und der

codierende Bereich von FdC1 über die Restriktionsschnittstellen XbaI und KpnI nach

Herstellerangaben (Fermentas, St. Leon‐Rot) ausgeschnitten. Die Visualisierung der

einzelnen DNA‐Fragmente des geschnittenen Vektors erfolgte hierbei im Agarosegel

(siehe Kapitel 2.8.6) im UV‐Licht (λ = 302 nm), aus welchem das FdC1‐Fragment mit den

NucleoSpin Extract‐Kit (Macherey‐Nagel, Düren) nach Herstellerangaben aufgereinigt

wurde. Das aufgereinigte FdC1‐Fragment wurde unter Verwendung der T4‐Ligase

(Fermentas, St. Leon‐Rot) nach Herstellerangaben über die Restriktionsschnittstellen

XbaI und KpnI in Leserichtung in den Vektor pGFP‐2 (vgl. Kost et al., 1998) ligiert, in

kompetente E. coli‐Zellen transformiert (siehe Kapitel 2.15.1.1) und vermehrt. Für die

Transformation der isolierten Protoplasten (siehe Kapitel 2.14.1) wurde das pGFP‐2

Plasmid mit dem enthaltenden FdC1‐Fragment mittels einer Maxipräperation

(siehe Kapitel 2.15.1.3) isoliert.

2.15.1.1 Transformation von Plasmid‐DNA in kompetente E. Coli Zellen

Die Transformation der E. coli‐Zellen erfolgte über eine Hitzeschock‐Transformation

(vgl. Chohen et al., 1972). Ein aliquoter Anteil kompetenter E. coli‐Zellen (200 µl) wurde

auf Eis aufgetaut, dann 1 µl Plasmid‐DNA zugegeben und vorsichtig untergemischt. Der

Transformationsansatz wurde für 30 min auf Eis vorinkubiert. Nach einem kurzen

Hitzeschock (45 s) bei 42 °C wurde der Ansatz weitere 5 min auf Eis inkubiert, mit 1 ml

LB‐Medium versetzt und für 1 h bei 37 °C leicht geschüttelt. Ein aliquoter Anteil von

70 µl des Transformationsansatzes wurde direkt auf YT‐Agarplatten mit den zur

Selektion notwendigen Antibiotika (200 µg/ml Ampicillin für pGEMTeasy sowie pGFP‐2)

ausplattiert. Daraufhin wurde die Restkultur abzentrifugiert (4.000 x g, 2 min, RT),

500 µl des Überstandes verworfen und der restliche Ansatz homogenisiert. Von dieser

Suspension wurden erneut 70 µl auf Selektionsplatten ausgestrichen. Die

Selektionsplatten wurden über Nacht im Brutschrank bei 37 °C inkubiert. YT‐Agarplatten: 0,8 % (w/v) Pepton

0,5 % (w/v) Hefeextrakt 0,25 % (w/v) NaCl mit NaOH auf pH 7 einstellen 1,5 % (w/v) Agar

LB‐Medium 1 % (w/v) Pepton 0,5 % (w/v) Hefeextrakt 1 % (w/v) NaCl mit NaOH auf pH 7 einstellen


2.15.1.2 Minipräparation von Plasmid‐DNA

Zur Isolierung von pGEMTeasy‐Plasmiden aus E. coli‐Zellen wurden aus der

Transformation auf den YT‐Agarplatten gewachsene Kulturen steril abgenommen, in

5 ml LB‐Medium (siehe Kapitel 2.15.1.1) mit 200 µg/ml Ampicillin überimpft und über

Nacht bei 37 °C vermehrt. Von dieser Kultur wurden 3 ml abgenommen, zentrifugiert

(2470 x g, 2 min, RT) und in 200 µl ribonukleasehaltiger Lösung P1 resuspendiert. Mit

der Zugabe von 200 µl Lösung P2 wurden die Bakterienzellen lysiert. Die dabei frei

werdenden Proteine, sowie die chromosomale DNA, wurden durch Natronlauge

denaturiert. Anschließend wurde das Bakterien‐Lysat mit 200 µl Lösung P3 versetzt und

für 10 min auf Eis inkubiert. Nach einer Zentrifugation (8518 x g, 20 min, 4 °C) wurde

der Überstand mit 0,7 Volumeneinheiten Isopropanol versetzt und zentrifugiert

(8518 x g, 15 min, RT). Das Plasmid‐Pellet wurde mit 250 µl 70 % Ethanol gewaschen

(8518 x g, 10 min, RT), getrocknet und in 30 µl Merck‐H2O aufgenommen. Lösung P1: 50 mM Tris,

10 mM EDTA 0,1 mg/ml RNAse mit HCl auf pH 8 einstellen

Lösung P2: 5 M NaOH

1 % (w/v) SDS Lösung P3: 3 M Kaliumacetat (pH 4,8)

2.15.1.3 Maxipräparation von Plasmid‐DNA

Um ausreichende Mengen an pGFP‐2‐Plasmiden für die Transformation isolierter

Protoplasten zu erhalten wurde eine Maxipräparation durchgeführt. Auf den YT‐

Agarplatten gewachsene, mit pGFP‐2‐Plasmiden transformierte Kulturen wurden steril

abgenommen, in 200 ml LB‐Medium (siehe Kapitel 2.15.1.1) mit 200 µg/ml Ampicillin

überimpft und über Nacht bei 37 °C vermehrt. Die 200 ml Kultur wurden in vier

Schritten nacheinander in einem 50 ml Falcon‐Röhrchen zentrifugiert (3200 x g, 8 min,

RT). Das Pellet wurde daraufhin in 4,5 ml Lösung 1 resuspendiert, mit 450 µl

Lysozymlösung (100 mg/ml) sowie 20 ml Lösung 2 versetzt, einige Male invertiert und

10 min bei RT inkubiert. Nach der Zugabe von 10 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,2) wurde

die Suspension einige Male invertiert, 10 min auf Eis inkubiert und zentrifugiert

(3200 x g, 15 min, 4 °C). Der Überstand wurde durch vier Lagen Miracloth (Calbiochem,

Darmstadt) filtriert und das Filtrat wurde mit Isopropanol auf 50 ml aufgefüllt, 10 min

bei RT inkubiert und zentrifugiert (3200 x g, 20 min, RT). Der Überstand wurde

verworfen, das Pellet in 1,5 ml TE‐Puffer vorsichtig gelöst, mit 1,5 ml 5 M Lithiumchlorid

versetzt und wiederum zentrifugiert (3200 x g, 20 min, 4 °C), Der Überstand wurde in


ein 15 ml Falcon‐Röhrchen überführt und mit dem gleichen Volumen Isopropanol

versetzt. Das Gemisch wurde zentrifugiert (4000 x g, 20 min, RT) und das Pellet mit 5 ml

70 % Ethanol gewaschen (10 min, 3200 x g, RT). Der Überstand wurde vollständig

entfernt, das Pellet getrocknet und schließlich in 600 µl TE‐Puffer mit 20 µg/ml RNAse

resuspendiert und einer Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Plasmid‐DNA wurde mit 400 µl

PEG‐Lösung über Nacht bei 4 °C gefällt und danach zentrifugiert (16100 x g, 5 min, 4 °C).

Das Pellet wurde in 400 µl TE‐Puffer aufgenommen. Die Lösung wurde mit 400 µl

Phenol‐Chloroform‐Isoamylalkohol (25:24:1) versetzt, gut gemischt und zentrifugiert

(16100 x g, 5 min, RT). Die obere, wässrige Phase wurde abgenommen, mit 400 µl

Chloroform versetzt und zentrifugiert (16100 x g, 5 min, RT). Die obere, wässrige Phase

wurde wieder abgenommen und mit 0,25 Volumeneinheiten 10 M Ammoniumacetat

sowie 2 Volumeneinheiten 100 % Ethanol versetzt, 10 min bei RT inkubiert und

zentrifugiert (16100 x g, 5 min, 4 °C). Das Pellet wurde mit 1 ml 70 % Ethanol gewaschen

(16100 x g, 5 min, RT). Der Überstand wurde vollständig entfernt, das Pellet an der Luft

getrocknet und in 50 µl Merck‐H2O gelöst. Der Gehalt an Plasmid‐DNA wurde

photometrisch bei 260 nm im Biophotometer (Eppendorf, Hamburg) bestimmt. Eine

Extinktion von 1 entspricht hierbei 40 µg/ml DNA (vgl. Lottspeich und Zobras, 1998). Lösung 1: 50 mM Glukose 25 mM Tris 10 mM EDTA mit HCl auf pH 8 einstellen Lösung 2: 0,2 M NaOH 1 % SDS PEG‐Lösung: 20 % PEG 8000 2,5 M NaCl EB‐Puffer: 10 mM Tris mit HCl auf pH 8 einstellen TE‐Puffer: 10 mM Tris 1 mM EDTA mit HCl auf pH 8 einstellen

2.15.2 Transformation isolierter Protoplasten

Für die Transformation der isolierten Protoplasten, modifiziert nach Seidel et al. (2004),

mit dem GFP‐FdC1‐Fusionsprotein wurden alle verwendeten Materialien zuvor steril

autoklaviert bzw. die Lösungen steril filtriert. In eine Glaspetrischale (Ø = 60 mm)

wurden nacheinander 20 µl Plasmid‐DNA (2,5 µg/µl) aus der Maxipräparation

(siehe Kapitel 2.15.1.3), 200 µl isolierte Protoplasten (siehe Kapitel 2.14.1) und

220 µl PEG‐Lösung durch Zutropfen vermischt und für 15 min bei RT inkubiert. In


angegebener Reihenfolge wurde dem Ansatz 0,5 ml, 1 ml, 2 ml und 4 ml W5‐Lösung

zugetropft, wobei jeweils eine Inkabation für 15 min bei RT zwischen den einzelnen

Zugaben lag. Nach der letzten Zugabe von 4 ml W5‐Lösung wurde die Suspension in ein

50 ml Falcon‐Röhrchen überführt und bei geöffneten Deckel bei 16 °C über Nacht im

Dunkeln inkubiert.

PEG‐Lösung: 40 % PEG 4000 0,2 M Mannitol 100 mM CaCl2

W5‐Lösung: 154 mM NaCl

125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES 5 mM Glukose auf pH 5,7 einstellen

2.15.3 Fluoreszenzmikroskopie transformierter Protoplasten

Die Lokalisation des GFP‐FdC1‐Fusionsproteins in den damit transformierten

Protoplasten wurde mittels des konfokalen laser scanning‐Mikroskopsystems (LSM 510

META; Zeiss, Göttingen) mit dem 40 x EC Plan Neofluor (N.A. 1.3) Öl Objektiv sichtbar

durchgeführt. Hierfür wurden 30 µl der transformierten Protoplasten

(siehe Kapitel 2.15.2) auf einem speziell erstellten Objektträger so präpariert, dass die

Protoplasten vom Deckglas nicht zerquetscht wurden. Die Visualisierung des GFP‐FdC1‐

Fusionsproteins erfolgte hierbei über die Fluoreszenz‐Emission des GFP (green

fluorescent protein) unter Anregung mit Licht der Wellenlänge von 488 nm. Die

Fluoreszenz‐Emission des GFP‐FdC1‐Fusionsproteins wurde bei 500 – 530 nm

aufgezeichnet, während die Chlorophyll‐Autofluoreszenz bei 650 – 700 nm detektiert

wurde. Um standardisierte Bedingungen zu schaffen, wurden alle Bilder unter

Verwendung derselben Parameter gescannt.

2.16 Bestimmung der Enzymaktivitäten

Die Bestimmung der Enzymaktivitäten der NADP‐MDH und der G6PDH wurde an

Blattextrakten durchgeführt und im SpeCord 50‐Photometer (Analytik Jena, Jena)

anhand der Zu‐ bzw. Abnahme von NADPH im Testansatz bei λ = 340 nm detektiert. Zur

Herstellung der Blattextrakte wurde Blattmaterial direkt nach der Ernte in flüssigem

Stickstoff gefroren und anschließend pulverisiert.


2.16.1 NADP‐MDH

Die Herstellung des Blattextraktes sowie die photometrische Bestimmung der Kapazität

und der in‐situ‐Aktivität der NADP‐MDH erfolgte nach Scheibe und Stitt (1988). Für die

Bestimmung der Kapazität wurde der Blattextrakt für 15 min mit 20 mM DTT (in

100 mM Tris‐HCl, pH 8) vorreduziert. Die Detektion der in‐situ‐Aktivität erfolgte

hingegen direkt am erstellten Blattextrakt. Es wurde zunächst die in‐situ‐Aktivität und

danach am gleichen Blattextrakt die Kapazität bestimmt. Als Bezugsgröße wurde der

Proteingehalt im isolierten Blattextrakt nach Bradford (1976) ermittelt

(siehe Kapitel 2.6).

2.16.2 G6PDH

Die Herstellung des Blattextraktes und die photometrische Bestimmung der G6PDH‐

Kapazität erfolgte nach der Methode von Hauschild und van Schaewen (2003). Hierbei

wurde zunächst die Gesamtaktivität direkt im Rohextrakt bestimmt. Für die

Bestimmung der Kapazität der cytosolischen G6PDH‐Isoformen wurde der Blattextrakt

vor der Messung für 8 min mit 1 M DTT (in 300 mM Tris‐HCl, pH 8) reduziert. Die

Kapazität der plastidären G6PDH wurde aus der Differenz der ermittelten

Gesamtkapazität und der cytosolischen Kapazität abgeleitet. Die Bestimmung der

Gesamtkapazität sowie der cytosolischen Kapazität erfolgte an dem gleichem

Blattextrakt. Als Bezugsgröße wurde der Proteingehalt im isolierten Blattextrakt nach

Bradford (1976) ermittelt (siehe Kapitel 2.6).

Glutathion‐Bestimmung mittels HPLC 2.17

Der Gehalt an Gesamt‐Glutathion als auch der Gehalt an GSSG wurden modifiziert nach

Schulte et al. (2002) mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC) bestimmt.

Die GSH‐Konzentration wurde dabei indirekt aus der Differenz beider Komponenten

ermittelt.

Die Bestimmung wurde an in flüssigem Stickstoff pulverisierten Blattmaterial

(ca. 100 mg) durchgeführt. Das gefrorene Blattpulver wurde in 1 ml

2 %ige Perchlorsäure aufgenommen und homogenisiert. Nach einer Zentrifugation

(7258 x g, 10 min, RT) wurde der Überstand in ein neues Eppendorf‐Reaktionsgefäß

überführt und mittels gesättigter K2CO3‐Lösung neutralisiert (pH 7). Der Überstand aus

einer weiteren Zentrifugation (7258 x g, 10 min, RT) wurde in ein neues Eppendorf‐

Reaktionsgefäß überführt und als Rohextrakt für die HPLC‐Probenvorbereitung


verwendet, wobei folgende Ansätze für die Gesamt‐Glutathion‐ und die GSSG‐

Bestimmung verwendet wurden:

Gesamt‐Glutathion‐Bestimmung: 160 µl Rohextrakt 240 µl 200 mM CHES‐Puffer pH 9,2

20 µl 5 mM DTT 20 µl H2O

GSSG‐Bestimmung: 160 µl Rohextrakt 240 µl 200 mM CHES‐Puffer pH 9,2 20 µl 5 mM NEM

Inkubation für 10 min bei RT 20 µl 5 mM DTT

Beide Probenansätze wurden jeweils für 1 h bei RT inkubiert. Die reduzierten

Thiolgruppen wurden anschließend durch Zugabe von 20 µl Monochlorobimane

(Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt) zur späteren Detektion derivatisiert. Es folgte

eine weitere Inkubation für 15 min im Dunkeln. Die Proben wurden daraufhin mit 260 µl

10 %ige Essigsäure versetzt. Nach einer Zentrifugation (7258 x g, 10 min, RT) wurden

jeweils 50 µl des Überstandes in 1 ml‐HPLC‐Vials (Supelco, Bad Homburg) überführt.

Die in den Proben enthaltenen Glutathion‐Monochlorobimane‐Derivate wurden mittels

einer SupelcosilTM LC‐18‐Säule (Supelco, Bad Homburg) im HPLC‐System der LC‐10A –

Serie (Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg) aufgetrennt, wobei ein

Laufmittelgemisch aus Puffer A und Puffer B als Eluent diente und innerhalb eines

Laufmittel‐Gradienten bei einer Flussrate von 1 ml / min über die Säule gepumpt wurde.

Bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm erfolgte die Detektion der Glutathion‐

Monochlorobimane‐Derivate, mit einer Fluoreszenz‐Emission bei 480 nm mit dem SPD‐

10AV‐Fluoreszenzdetektor (Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg). Mit der Software

Shimadzu Class‐VP 5.0 (Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg) wurden die

Chromatogramme ausgewertet. Die Eichung der HPLC und die Quantifizierung der für

die Kalkulation benötigten Referenzwerte wurden zuvor anhand geeigneter Glutathion‐

Standards vorgenommen. Die ursprünglich in der Probe enthaltenen GSH‐

Konzentrationen wurden indirekt nach folgender Gleichung berechnet: GSH = Gesamt‐

Glutathion‐Gehalt – 2*GSSG‐Gehalt.

Laufmittel‐Gradient: 0 min – 1 min 100 % Puffer A 1 min – 18 min 80 % Puffer A, 20 % Puffer B 19 min – 30 min 100 % Puffer B 30 min – 40 min 100 % Puffer A Puffer A: 10 % (v/v) Methanol Puffer B: 90 % (v/v) Methanol

0,25 % (v/v) Essigsäure 0,25 % (v/ Essigsäure Mit KOH auf pH 4,3 einstellen Mit KOH auf pH 3,9 einstellen

58 Ergebnisse

3 Ergebnisse

Fd2‐KO‐Pflanzen als Modellorganismus zur Untersuchung von Regulations‐ und Akklimationsvorgängen

3.1

Nach Hanke et al. (2004) nimmt Fd2 (AGI‐Code: At1g60950) mit ca. 90 % Anteil am

gesamten Gehalt der Blatt‐Fds (Fd1 und Fd2) in A. thaliana eine zentrale Rolle in der

photosynthetischen Elektronentransportkette ein. Ein stabiler knock‐out von Fd2 in den

Fd2‐KO‐Pflanzen führt zu einer Akzeptorlimitierung am PSI, da ca. 90 % der Blatt‐Fds im

Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen nicht gebildet werden. Die zweite photosynthetisch

aktive Fd‐Isoform, Fd1 (AGI‐Code: At1g10960), ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen unter

moderaten Bedingungen (siehe Kapitel 2.2) nicht vermehrt akkumuliert (siehe Abb. 3.1).

Abb. 3.1: Gehalt an Blatt‐Fd in Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Der Gehalt an Fd1 und Fd2 in Noe‐WT‐ sowie Fd2‐KO‐Pflanzen wurde mittels RT‐PCR (A) sowie Western‐Blot Analysen (B) bestimmt. Hierfür wurden die Pflanzen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) kultiviert. Für die RT‐PCR Analysen wurden spezifische Primer für Fd1, Fd2 und UBQ10 als housekeeping‐gene verwendet. Für die Western‐Blot Analysen wurde Rohextrakt aus Blattmaterial gewonnen und ein Antikörper gegen Fd I aus Mais (Hanke et al., 2004) eingesetzt, welcher sowohl Fd1 als auch Fd2 aus A. thaliana detektiert. Die dargestellten Ergebnisse sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Die Fd2‐KO‐Pflanzen können demnach als Modellorganismus zur Untersuchung von

Anpassungs‐ und Regulationsmechanismen in Folge einer Akzeptorlimitierung am PSI

heran gezogen werden. In den folgenden Kapiteln (3.1.1 ‐ 3.1.4) werden die

Auswirkungen einer stromalen Akzeptorlimitierung am PSI in den Fd2‐KO‐Pflanzen im

Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen dargestellt. Die in diesem Zusammenhang

aufgeführten Ergebnisse sind zum Teil von Voss et al. (2008) publiziert und werden mit

bislang unveröffentlichten Daten vervollständigt. Soweit nicht anders vermerkt, wurden

Ergebnisse 59

neun bis zehn Wochen unter moderaten Bedingungen (siehe Kapitel 2.2) kultivierte

Pflanzen verwendet, wobei die Versuche jeweils nach einer Stunde in der Lichtphase

durchgeführt wurden.

3.1.1 Phänotyp

Der verringerte Gehalt an Blatt‐Fds in den Fd2‐KO‐Pflanzen führt unter moderaten

Bedingungen zu einer um ca. 14 Tage verzögerten Entwicklung, einer veränderten

Blattmorphologie sowie einer schwächeren Pigmentierung (siehe Abb. 3.2).

Abb. 3.2: Entwicklungsstadien von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Die dargestellten Bilder dokumentieren die Entwicklung von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag ‐ Durchmesser der Töpfe: 5 cm). Die gezeigten Pflanzen sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Anzuchten.

Fd2‐KO‐Pflanzen weisen ein verringertes spezifisches Frischgewicht und Trockengewicht

auf (siehe Tab. 3.1). Anzumerken ist, dass das spezifische Blattfrischgewicht der Fd2‐KO‐

Pflanzen im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen nur um ca. 21 % verringert ist,

wohingegen das spezifische Trockengewicht um ca. 46 % reduziert vorliegt. Der

spezifische Proteingehalt ist ebenfalls um 26 % reduziert, was die deutliche Abnahme

des spezifischen Trockengewichtes neben dem verringerten Gehalt an transitorischer

Stärke (siehe Abb. 3.10‐B) erklärt.

Die signifikant schwächere Pigmentierung der Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den

Noe‐WT‐Pflanzen ist auf einen insgesamt verminderten Gehalt an Chlorophyll und

60 Ergebnisse

Carotinoiden zurückzuführen (siehe Tab. 3.1). Der Gehalt an Carotinoiden ist um 49 %

und der Chlorophyllgehalt um 43 % verringert, wobei sowohl Chla (um 33 % reduziert)

als auch Chlb (um 59 % reduziert) in verminderten Mengen vorkommen. Die geringere

Akkumulation von Chlb in den Fd2‐KO‐Pflanzen, im Vergleich zu Chla, schlägt sich in

einem erhöhten Verhältnis von Chla zu Chlb nieder. Chlb ist hauptsächlich in den LHCs

zu finden (vgl. Buchanan, Gruissem und Jones, 2000). Verringerte Mengen an Chlb

deuten demnach auf eine verminderte Akkumulation von LHCs in den Fd2‐KO‐Pflanzen

hin.

Tab. 3.1: Physiologische P rameter der Noe‐ T‐ und Fd ‐KO‐P lanzen unter mod raten Bedingungen. Die dargestellten Parameter wurden an Blättern von neun Wochen alten Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen bestimmt. Die Mengenangaben der Pigmente sind auf die Blattfläche bezogen. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).

a W 2 f e

3.1.2 Photosynthetischer Elektronentransport und CO2‐Assimilation

Photosynthetisch aktive Fds sind die zentrale Verteilerstelle zwischen dem

photosynthetischen Elektronentransport in der Thylakoidmembran und den

verschiedenen Elektronenakzeptoren im Stroma (siehe Kapitel 1.2.1). Ein Mangel an

Blatt‐Fds am PSI sollte sich demnach vor allem auf dem PET der Primärreaktion sowie

die CO2‐Assimilation in der photosynthetischen Sekundärreaktion auswirken. Dies

würde auch das eingeschränkte Wachstum, sowie die verminderten Gehalte an

Proteinen und Pigmenten erklären. Die Auswirkungen einer stromalen

Akzeptorlimitierung am PSI auf den photosynthetischen Elektronentransport und der

Ergebnisse 61

CO2‐Assimilation werden in den folgenden Kapiteln (3.1.2.1 ‐ 3.1.2.4) am Beispiel der

Fd2‐KO‐Pflanzen dargestellt.

3.1.2.1 Photosystem I

PSI ist im photosynthetischen Elektronentransport Elektronendonator für oxidiertes Fd

im Stroma. Durch eingestrahlte Lichtenergie wird das aktive Zentrum des PSI, das P700,

in den angeregten Zustand P700* überführt. P700* ist ein starkes Reduktionsmittel und

reduziert den primären Elektronenakzeptor A0 im PSI. Es entsteht ein stabil reduziertes

A0 (A0‐) sowie oxidiertes P700 (P700+). Vom A0

‐ wird das Elektron über die einzelnen

Elektronenüberträger im PSI auf Fd im Stroma übertragen und P700+ wird durch vom

PSII kommende Elektronen re‐reduziert (für Details zum photosynthetischen

Elektronenfluss siehe Kapitel 1.1). Die Auswirkungen einer Akzeptorlimitierung am PSI

sollte sich demnach zunächst auf den Elektronenfluss im und am PSI auswirken. Um dies

zu zeigen, wird in diesem Kapitel vor allem auf Ergebnisse aus P700‐

Absorptionsmessungen eingegangen, welche ein geeignetes Werkzeug zur

Charakterisierung des Elektronenflusses im und am PSI darstellen (für Details zur

Methodik der P700‐Absorptionsmessungen siehe Kapitel 2.11).

Werden P700‐Moleküle durch Lichtenergie in den oxidierten Zustand P700+ überführt,

so ändert sich das Absorptionsverhalten bei 830 nm. Mittels P700‐

Absorptionsmessungen bei 830 nm (A830 nm) und zusätzlich 860 nm (A860 nm) kann die

lichtinduzierte Oxidation von P700 zu P700+ sichtbar gemacht werden (vgl. Schreiber et

al., 1988; Klughammer und Schreiber, 1994; Backhausen et al., 1998). Die gemessene

P700‐Absorptionsänderung im Licht (ΔAP700) wird aus der Differenz von A830 nm und

A860 nm bestimmt (ΔAP700 = A830 nm ‐ A860 nm). Durch diese Korrektur wird eine

Verfälschung der Ergebnisse durch ebenso bei 830 nm absorbierendes Fd und PC

vermieden. Um ΔAP700 und somit die Menge an P700+ bzw. P700 quantitativ einordnen

zu können, wird die maximale P700‐Absorptionsänderung (ΔAP700‐MAX) ermittelt. Hierbei

wird das P700 ausschließlich mit Licht im nahen Infrarot‐Bereich (NIR, λ > 700 nm –

siehe Kapitel 2.11.1) angeregt. Im PSII erfolgt im NIR keine Ladungstrennung, so dass an

Stelle einer Re‐Reduzierung von P700+ über den linearen photosynthetischen

Elektronentransport eine stabile Oxidation von P700 zu P700+ erfolgt (siehe Abb. 3.3).

62 Ergebnisse

Abb. 3.3: Schematische Darstellung der P700‐Anregung im NIR. Schematisch dargestellt sind die Absorptionskurven für PSI und PSII im Wellenlängenbereich von 690 bis 730 nm (A). Im PSII erfolgt im NIR keine Ladungstrennung und Elektronen aus dem linearen Transport von PSII zu PSI schließen die Elektronenlücke am PSI nicht (B).

Für die exakte Bestimmung von ΔAP700‐MAX ist es erforderlich, zunächst alle P700‐

Moleküle in den reduzierten Zustand zu überführen. Unter moderaten Bedingungen, bei

vollständiger Lichtlimitierung der Photosynthese, bzw. bei Dunkelheit, liegen die P700‐

Moleküle zu 100 % im reduzierten, nicht angeregtem Zustand vor (vgl. Baker et al.,

2007). Bei Pflanzen, die eine Akzeptor‐ bzw. Donorlimitierung am PSI aufweisen, kann

dieser Zusammenhang allerdings abweichen (vgl. Klughammer und Schreiber, 1994;

Holtgrefe et al., 2003). Da es sich bei den Fd2‐KO‐Pflanzen um Pflanzen handelt, die

wahrscheinlich eine starke Akzeptorlimitierung am PSI aufweisen, wurden diese vor

jeder Messung 15 – 30 min im Dunkeln gehalten, um eine vollständige Reduzierung aller

P700‐Moleküle sicher zu stellen. In Fd2‐KO‐Pflanzen ist die durchschnittliche Kapazität

P700‐Moleküle im NIR anzuregen, um 73 % geringer als in Noe‐WT‐Pflanzen

(siehe Abb. 3.4). Wird davon ausgegangen, dass in dunkel‐adaptierten Pflanzen das

P700 zu 100 % reduziert vorliegt (s. o.), würde dies bedeuten, dass in den Fd2‐KO‐

Pflanzen die Menge an P700‐Molekülen, welche im oxidierbaren Zustand vorliegen,

deutlich niedriger ist als in den Noe‐WT‐Pflanzen.

Die verminderte Fähigkeit der Oxidation von P700‐Molekülen im NIR in den Fd2‐KO‐

Pflanzen können verschiedene Ursachen zu Grunde liegen. Endo et al. (2005) zeigten,

dass im Zuge eines stark reduzierten Stromas und der damit einhergehenden

Akzeptorlimitierung am PSI eine Verringerung von ∆AP700‐MAX eintritt. Diese ist auf einen

vermehrten ZET um PSI sowie auf Ladungsrekombination im PSI (vgl. hierzu Brettel,

Ergebnisse 63

1997; Brettel und Setif, 1987) zurückzuführen. Ladungsrekombination im PSI kann als

Folge einer Akzeptorlimitierung im oder am PSI auftreten. Hierbei kommt es in Folge

eines beeinträchtigten Elektronenabtransportes an der Stromaseite von PSI zu einem

Elektronenrückfluss. Daraus resultierend ist der Elektronentransfer von A0‐ auf den

nächsten Akzeptor A1 blockiert, da A1 durch den Elektronenrückfluss bereits in

reduzierter Form vorliegt. In Folge dessen tritt Ladungsrekombination zwischen dem

primären Donor‐Akzeptor‐Paar P700+ und A0‐ auf (vgl. Brettel, 1997). Aus dieser

Situation heraus entstehen Singulett‐ und Triplett‐Zustände von P700 (vgl. Goldbeck

und Bryant, 1991). Eine weitere Ursache für eine Reduzierung von ∆AP700‐MAX könnte

eine verringerte absolute Menge an P700‐Molekülen und damit PSI‐Proteinkomplexen

in den Fd2‐KO‐Pflanzen sein. In Folge einer Langzeitakklimation wäre somit eine

effektiver Schutz vor einer Überreduktion der photosynthetischen

Elektronentransportkette gegeben, indem, angepasst auf an den Akzeptormangel im

Stroma, im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen geringere Mengen an PSI gebildet

werden. ZET, Ladungsrekombination und ein verminderte Menge an P700‐Molekülen

sind Mechanismen, welche vor Photoinhibition am PSI (vgl. Barth, 2001) schützen

können. Allerdings resultieren Photoinhibition und Schädigungen am PSI‐

Proteinkomplex letztendlich ebenso in einen verringerten ∆AP700‐MAX.

Abb. 3.4: ΔAP700‐MAX von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

Analysen der P700‐Oxidationskinetiken im NIR machen es möglich, genauere Aussagen

zur Ursache des verringerten ∆AP700‐MAX in den Fd2‐KO‐Pflanzen zu treffen. In Noe‐WT‐

Pflanzen ist eine charakteristische zweiphasige Oxidationskinetik zu beobachten (vgl.

Joliot und Joliot, 2006; Breyton et al., 2006; Joliot und Joliot, 2005; Siebke et al., 1991).

In Phase 1 kommt es in dunkel‐adaptierten Pflanzen im NIR zu einer schnellen P700‐

64 Ergebnisse

Oxidation, während in Phase 2 eine langsame P700 Oxidation unterbrochen von einer

lag‐Phase auftritt (siehe Abb. 3.5).

Abb. 3.5: Schematische Darstellung einer typischen P700‐Oxidationskinetik im NIR. Dargestellt ist eine typische P700‐Oxidationskinetik im NIR (grau unterlegter Bereich) einer WT‐Pflanze der Art A. thaliana. Vor jeder Messung müssen die Pflanzen mind. 15 ‐ 30 im Dunkeln gehalten werden. Der Länge der Phasen kann abhängig von den Anzuchtbedingungen variieren. Dies gilt vor allem für die lag‐Phase sowie für Phase 2.

Die P700‐Oxidation in Phase 1 verläuft vergleichsweise schnell (0,7 ± 0,1 s in Noe‐WT)

und spiegelt die Oxidation von PSI‐Reaktionszentren wieder, die Elektronen im Zuge des

LET auf stromale Akzeptoren übertragen (Joliot und Joliot, 2005; Breyton et al., 2006;

Nandha et al., 2007). In Fd2‐KO‐Pflanzen ist diese erste Phase nicht zu detektieren, was

auf eine Akzeptorlimitierung im initialen LET hindeutet (siehe Abb. 3.6).

Abb. 3.6: P700‐Oxidationskinetik im NIR von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt sind P700‐Oxidationskinetiken im NIR von Noe‐WT‐ bzw. Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Kurven sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Ergebnisse 65

In Phase 2 der P700‐Oxidierung ist kein signifikanter zeitlicher Unterschied zwischen

Fd2‐KO‐ und Noe‐WT‐Pflanzen festzustellen. In dieser Phase erfolgt eine kontinuierliche

P700‐Oxidation bis ∆AP700‐MAX erreicht ist. Im Gegensatz zur Phase 1 verläuft die P700‐

Oxidation langsamer, da zusätzlich PSI‐Reaktionszentren beteiligt sind, die Elektronen

für den ZET donieren (vgl. Joliot et al., 2005; Breyton et al., 2006; Nandha et al., 2007).

Im Zuge des ZET werden angeregte P700‐Moleküle re‐reduziert, was die P700‐Oxidation

im NIR verlangsamt. Ein signifikant erhöhter Anteil an ZET ist demnach als

hauptsächliche Ursache des verringerten ∆AP700‐MAX in den Fd2‐KO‐Pflanzen

auszuschließen (siehe auch Kapitel 3.1.2.2), da dies auch einen signifikanten

Unterschied im zeitlichen Ablauf der zweiten Phase zur Folge hätte.

Abb. 3.7: P700‐Oxidation im NIR von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen mit Methylviologen als alternativen Elektronenakzeptor. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX (A) und die P700‐Oxidationskinetiken im NIR (B) von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Die Blattscheiben wurden vor der Messung für fünf Stunden im Dunkeln zum einen in Wasser (‐MV) und zum anderen in 100 µM Methylviologen (+MV) inkubiert. Die gezeigten Daten für ΔAP700‐MAX sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE). Die P700‐Oxidationskinetiken sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

66 Ergebnisse

Die Daten für ∆AP700‐MAX der Fd2‐KO‐Pflanzen, welche zuvor mit Methylviologen

behandelt wurden, belegen dies zusätzlich. Methylviologen ist ein äußerst effektiver

Elektronenakzeptor am PSI, der Elektronen direkt vom [4Fe‐4S]‐Zentrum auf

molekularen Sauerstoff überträgt (vgl. Izawa et al., 1980, Trebst et al., 1980; Häder,

1999). Eine Verringerung von ∆AP700‐MAX in Folge eines signifikant erhöhten ZET wäre

mit Methylviologen reversibel (vgl. Munekage et al., 2004). Dies ist in den Fd2‐KO‐

Pflanzen nicht der Fall (siehe Abb. 3.7‐A).

Die Dauer der sich an Phase 1 anschließenden lag‐Phase wird als die Zeit beschrieben,

die benötigt wird, um den PSI‐Donor‐Pool (PET vor PSI) zu oxidieren (vgl. Breyton et al.,

2007). Hierbei werden die in Phase 1 angeregten P700‐Moleküle durch Elektronen aus

dem PSI‐Donor‐Pool re‐reduziert. Eine verlängerte lag‐Phase, wie sie in Fd2‐KO‐

(3,48 ± 0,79 s) im Vergleich zu Noe‐WT‐Pflanzen (1,83 ± 0,34 s) zu beobachten ist, weist

in der Regel auf einen verstärkt reduzierten PSI‐Donor‐Pool hin. In den Fd2‐KO‐Pflanzen

ist hingegen eine Blockade des Elektronenflusses vom PSI auf stromale Akzeptoren,

bedingt durch nicht vorhandene oxidierte Akzeptoren (vgl. Siebke et al., 1991), die

Ursache für die verlängerte lag‐Phase, da bereits in Phase 1 keine initiale P700‐

Oxidierung zu detektieren ist. Demnach ist diese verlängerte lag‐Phase ein deutliches

Anzeichen für eine verstärkte Ladungsrekombination im PSI (vgl. Breyton et al., 2007).

Die Kinetiken der P700‐Oxidation im NIR von Pflanzen, welche zuvor mit Methylviologen

behandelt wurden, bestätigen diese Tatsache. Mit Methylviologen als alternativem

Akzeptor am PSI ist eine im PSI auftretende Ladungsrekombination in Folge mangelnder

stromaler Akzeptoren reversibel und sowohl in Noe‐WT‐Pflanzen als auch in Fd2‐KO‐

Pflanzen ist unter diesen Bedingungen keine Phasentrennung der P700‐Oxidation im

NIR zu detektieren (siehe Abb. 3.7‐B). Die vermehrte Ladungsrekombination im PSI der

Fd2‐KO‐Pflanzen kann die Ursache für die Reduzierung von ∆AP700‐MAX in Folge fehlender

Elektronenakzeptoren im und am PSI sein (s. o.). Die Analysen der P700‐Absorption in

den Fd2‐KO‐Pflanzen nach einer Inkubation mit Methylviologen zeigen allerdings, dass

ein alternativer Akzeptor am PSI nicht zur Erhöhung von ∆AP700‐MAX in den Fd2‐KO‐

Pflanzen führt (siehe Abb. 3.7‐A). Ladungsrekombination ist demnach ebenso wie ZET

nicht die Ursache für die signifikante Reduzierung von ∆AP700‐MAX in den Fd2‐KO‐

Pflanzen.

Wie bereits oben in diesem Kapitel aufgeführt, könnte auch Photoinhibition am PSI die

Ursache für eine Reduzierung von ∆AP700‐MAX in den Fd2‐KO‐Pflanzen sein. Endo et al.

(2005) zeigten, dass ein linearer Zusammenhang zwischen Photoinhibition am PSII und

einer Verringerung von ∆AP700‐MAX besteht. Weiter demonstrierten Sonoike et al. (1996),

dass unter anderem dynamische Photoinhibition am PSII sowie ein erhöhter

Ergebnisse 67

Protonengradient über die Thylakoidmembran im Zuge von Photoinhibition am PSI als

„Schutzmechanismus“ auftreten. Demnach könnte eine Reduzierung von ∆AP700‐MAX auf

eine Inaktivierung des PSI‐Proteinkomplexes in Folge gesteigerter Photoinhibition

zurückzuführen sein, um eine unkontrollierte Überreduktion auf Grund fehlender

stromaler Akzeptoren vorzubeugen. In Kapitel 3.1.2.2 wird gezeigt, dass nur sehr geringe

Anzeichen für Photoinhibition am PSII zu beobachten sind. Des Weiteren sind eine

Verringerung des photosynthetischen Elektronenflusses (siehe Kapitel 3.1.2.2) sowie die

qualitative Zusammensetzung der Thylakoidmembran (siehe folgende Absätze)

deutliche Anzeichen, die gegen eine verstärkt auftretende Photoinhibition am PSI

sprechen. Zusätzlich werden verschiedene Mechanismen diskutiert, die effektiv

Photoinhibition am PSI vorbeugen (vgl. Barth et al., 2001). Ein vermehrtes Auftreten von

Photoinhibition am PSI als Ursache für die massive Reduzierung von ∆AP700‐MAX in den

Fd2‐KO‐Pflanzen kann somit ausgeschlossen werden.

Da ZET, Ladungsrekombination und auch Photoinhibition als primäre Ursachen für die

massive Reduktion von ∆AP700‐MAX nicht in Frage kommen, ist ein reduzierter Gehalt an

P700‐Molekülen in den Fd2‐KO‐Pflanzen sehr wahrscheinlich. Die Pigment‐ sowie

Proteinmengen deuten auf einen insgesamt reduzierten Gehalt an Photosystemen und

LHCs hin (siehe Tab. 3.1). Des Weiteren weisen Fd2‐KO‐Pflanzen einen um 30 %

geringeren Thylakoidgehalt in den Chloroplasten auf (Hier ist zu erwähnen, dass im Zuge

der ROS‐Detektion (siehe Kapitel 3.1.3.2) kein signifikant veränderter Gehalt an

Chloroplasten in den Blatt‐Protoplasten von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen festgestellt

werden konnte). Qualitativ zeigt sich die Zusammensetzung der aktiven Thylakoide

hingegen nicht verändert, sowohl LHCs als auch PSI und PSII liegen in vergleichbaren

Mengen in der Membran vor (siehe Abb. 3.8).

Die um ca. 30 % verringerte Thylakoidmenge in den Fd2‐KO‐Pflanzen erklärt demnach

einen um ca. 30 % verringerten Gehalt an Chla, welches das hauptsächlich an den

Photosystemen und LHCs assoziierte Pigment darstellt (vgl. Buchanan, Gruissem und

Jones, 2000). Die in Fd2‐KO‐Pflanzen deutliche Verringerung von Carotinoiden (um ca.

49 %) und Chlb (um ca. 59 %), das nur in den LHCs vorkommt (vgl. Buchanan, Gruissem

und Jones, 2000), ist zudem auf die eine geringere Akkumulation von LHCII im Vergleich

zu den Photosystemen zurückzuführen (vgl. hierzu Ben‐Shem et al., 2003). Dies ist

anhand der Saccharosegradienten allerdings nicht eindeutig zu klären. In Anbetracht

der verringerten Mengen an aktiven Thylakoiden bei nicht signifikant veränderter

qualitativer Zusammensetzung zeigt, dass das deutlich verminderte ∆AP700‐MAX in den

Fd2‐KO‐Pflanzen zu großen Teilen auf eine Reduzierung der Menge an aktiven

Thylakoiden zurückzuführen ist.

68 Ergebnisse

Abb. 3.8: Auftrennung der Protein‐Pigment‐Komplexe der Thylakoidmembran von Noe‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen im Saccharosegradienten. Dargestellt sind die im Saccharosegradienten aufgetrennten aktiven Thylakoide von Noe‐WT‐ sowie Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Der Gradient wurde aus acht Stufen von 0,16 M (oben) bis 1,87 M (unten) Saccharose aufgebaut. Aus der Thylakoidisolierung wurden je 250 µg Chlorophyll eingesetzt. Die gezeigten Ergebnisse sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Zusammenfassung – Photosystem I (Kapitel 3.1.2.1)

In den Fd2‐KO‐Pflanzen kommt es in Folge fehlender Fds bereits unter moderaten

Bedingungen zu einer Akzeptorlimitierung am PSI. Eine signifikante Reduzierung von

∆AP700‐MAX ist hauptsächlich auf eine verringerte Menge an aktiven Thylakoiden in

den Chloroplasten zurückzuführen, wobei die qualitative Zusammensetzung der

vorhandenen Membranen nicht signifikant verändert ist. In den Fd2‐KO‐Pflanzen tritt

in Folge der Akzeptorlimitierung zusätzlich Ladungsrekombination im PSI auf. Ein

vermehrter ZET um PSI sowie dynamische Photoinhibition am PSI sind hingegen als

mögliche „Schutzmechanismen“ nicht zu beobachten und für die Reduzierung von

∆AP700‐MAX nicht von Bedeutung.

3.1.2.2 Photosystem II

Fd2‐KO‐Pflanzen sind durch eine Akzeptorlimitierung am PSI, zunehmende

Ladungsrekombination und verringerte Mengen an aktiven Thylakoiden gekennzeichnet

(siehe Kapitel 3.1.2.1). Die Auswirkungen einer Akzeptorlimitierung im Stroma auf den

Redox‐Zustand des PSII und der photosynthetischen Elektronentransportkette in den

vorhandenen aktiven Thylakoiden werden anhand der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission

am PSII im Folgenden charakterisiert.

Ergebnisse 69

Anregungsenergie in Form von Photonen wird im photosynthetischen System entweder

für photochemische Prozesse genutzt oder in Form von Wärme oder Fluoreszenz

emittiert. Diese drei Prozesse konkurrieren um die eingestrahlte Lichtenergie. Für

photochemische Prozesse wird das reaktive Zentrum in den Photosystemen durch

Anregungsenergie in Form von Lichtquanten in den angeregten Zustand überführt und

der primäre Akzeptor wird dabei reduziert. Hierbei ist es erforderlich, dass sowohl das

reaktive Zentrum im reduzierten, nicht angeregten, als auch der primäre Akzeptor im

neutralen, nicht reduzierten Zustand, vorliegen. Dieser Zustand kennzeichnet ein

offenes Reaktionszentrum. Ist hingegen das reaktive Zentrum oder der primäre

Akzeptor im nicht neutralen Zustand, liegt ein geschlossenes Reaktionszentrum vor.

Quantenenergie wird in diesem Falle nicht für photochemische Prozesse genutzt,

sondern in Form von Wärme oder Fluoreszenz emittiert. Die Messung der

Chlorophyllfluoreszenz‐Emission ist demnach eine geeignete Methode zur Bestimmung

des physiologischen Zustandes des Photosyntheseapparates. Erwähnenswert ist die

Tatsache, dass die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission in der Regel im Zusammenhang mit

PSII diskutiert und interpretiert wird, obwohl mehr als die Hälfte der Chla‐Moleküle,

welche für die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission verantwortlich sind, mit PSI assoziiert

sind (vgl. Buchanan, Gruissem und Jones, 2000). Letztendlich ist dies möglich, da die

Chlorophyllfluoreszenz‐Emission bei geschlossenen PSII‐Reaktionszentren ansteigt.

Geschlossene PSI‐Reaktionszentren erhöhen die Fluoreszenz‐Emission hingegen nicht

(vgl. Oxborough, 2004 und Dau, 1994). In den letzten 50 Jahren wurden zahlreiche

Arbeiten zur Methodik und Interpretation von Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen

veröffentlicht (als Beispiel siehe folgende Reviews und darin zitierte Primärliteratur:

Baker, 2008; Baker und Oxborough, 2004; Maxwell und Johnson, 2000). Die in diesem

Kapitel beschriebenen Parameter wurden nach der in Kapitel 2.12.2 erläuterten

Methode aus den Rohdaten der Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen berechnet und

erlauben eine Einordnung des Aktivitätszustandes der photosynthetischen

Elektronentransportkette. Da diese Parameter relative Zusammenhänge darstellen

steht deren Interpretation nicht im Zusammenhang mit der absoluten Menge an aktiven

Thylakoiden. Durch die Tatsache, dass die qualitative Zusammensetzung der aktiven

Thylakoide in den Fd2‐KO‐Pflanzen nicht signifikant verändert ist (siehe Kapitel 3.1.2.1),

ist die Messung der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission am PSII ein geeignetes Mittel zur

Charakterisierung der photosynthetischen Lichtnutzung im Vergleich zu den Noe‐WT‐

Pflanzen.

70 Ergebnisse

Der Reduktionsgrad von QA, dem primären Elektronenakzeptor im PSII, ist in den

Fd2‐KO‐Pflanzen signifikant erhöht. Dies ist an der im Vergleich zu den Noe‐WT‐

Pflanzen um 30 % geringeren Quantenausbeute am PSII (ΦII) abzulesen (siehe Tab. 3.2).

Der lineare Zusammenhang von ΦII zum Reduktionsgrad des primären Akzeptors QA ist

allerdings nur dann gegeben, wenn Reaktionszentren mit LHCs assoziiert sind, die nur

auf dieses Reaktionszentrum Quantenenergie übertragen (vgl. Baker et al., 2001,

Kramer et al, 2004a). In Blättern von höheren Pflanzen ist dies nicht der Fall und

Anregungsenergie kann von einem Antennenkomplex auf unterschiedliche reaktive

Zentren übertragen werden (vgl. Baker und Oxborough, 2004; Kramer et al., 2004a).

Kramer et al. (2004a) führten aus diesem Grund den Parameter qL ein, der sich

tatsächlich linear zum Redox‐Zustand von QA verhält. In Fd2‐KO‐Pflanzen ist qL um 16 %

niedriger als in den Noe‐WT‐Pflanzen und bestätigt einen erhöhten Reduktionsgrad des

primären Akzeptors QA im PSII (siehe Tab. 3.2).

Tab. 3.2: Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt sind die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten Parameter von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) bei einer aktinischen Lichtintensität von 150 µE m‐2 s‐1. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).

Ebenso ist der Anteil an absorbierter Energie, welcher photochemisch genutzt wird, in

den Fd2‐KO‐Pflanzen signifikant geringer. Dies ist an einer reduzierten

photochemischen Lichtnutzung (qP) festzumachen. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist qP um

28 % geringer als in den Noe‐WT‐Pflanzen. Die Parameter qP, qL und ΦII indizieren, dass

sowohl der QA‐ als auch der PQ‐Pool signifikant stärker reduziert vorliegen als in Noe‐

WT‐Pflanzen. Hieraus ist auf einen erhöhten Reduktionsgrad der photosynthetischen

Elektronentransportkette zwischen PSII und PSI zu schließen. Obwohl ein signifikant

erhöhter Reduktionsgrad von QA sowie des PQ‐Pools in den Fd2‐KO‐Pflanzen vorliegt, ist

am PSII der Fd2‐KO‐Pflanzen keine Photoinhibition zu beobachten. Als Maß für

Photoinhibition am PSII kann die maximale Quantenausbeute FV/FM verwendet werden.

Ergebnisse 71

Für ein nicht photoinhibiertes PSII in höheren Pflanzen nimmt FV/FM Werte um 0,8 an

(vgl. Björkmann und Demmig, 1987; Werner et al., 2002). Fd2‐KO‐Pflanzen zeigen somit

keine Anzeichen von Photoinhibition am PSII, allerdings ist die Elektronentransportrate

(ETR) am PSII in den Fd2‐KO‐Pflanzen signifikant um 30 % geringer als in den

entsprechenden Noe‐WT‐Pflanzen (siehe Tab. 3.2). Dies deutet auf einen insgesamt

verringerten photosynthetischen Elektronenfluss hin. Dies ist wahrscheinlich eine Folge

signifikant verringerter Mengen an LHCs, was aus der deutlichen Reduzierung von Chlb‐

Molekülen in den Fd2‐KO‐Pflanzen zu schließen ist (siehe Kapitel 3.1.1).

Weiter ist zu beachten, dass NPQ in den Fd2‐KO‐Pflanzen trotz der verminderten qP

nicht signifikant erhöht vorliegt. NPQ wird durch drei Faktoren bestimmt, die

Fluoreszenzlöschung durch Energieabgabe in Form von Wärme (qE), durch

Photoinhibition (qI) und state transitions (qT), wobei vor allem qE, unter hohen

Lichtintensitäten allerdings auch qI, in höheren Pflanzen den größten Anteil an NPQ

ausmachen (vgl. Baker et al., 2007). In der Regel ist qT hauptsächlich unter geringen

Lichtintensitäten und qI vornehmlich unter hohen Lichtintensitäten zu beachten (vgl.

Krause und Jahns, 2004). Photoinhibition ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen nicht zu

beobachten und state transition kann auf Grund des Akzeptormangels am PSI, welche

eine Starklichtsituation simuliert, ebenso ausgeschlossen werden. Unter moderaten

Lichtintensitäten wird NPQ demnach zu großen Teilen von qE bestimmt und steht als

Indikator für den Energetisierungszustand der Thylakoidmembran. Ein gesteigertes qE

zeigt einen erhöhten pH‐Gradienten an (vgl. Krause et al., 1982). Ein Protonengradient

über die Thylakoidmembran stellt sich in Folge des photosynthetischen

Elektronentransportes ein, wobei sowohl der lineare als auch der zyklische Transport

zur Generierung beitragen (vgl. Munekage et al., 2004). In den Fd2‐KO‐Pflanzen wird

kein signifikant erhöhter Protonengradient generiert. Ein in Folge einer

Akzeptorlimitierung gesteigerter ZET, der für einen erhöhten Anteil an NPQ durch einen

gesteigerten Protonengradienten über die Thylakoidmembran essenziell ist (vgl.

Munekage et al., 2004), ist demnach auszuschließen (siehe auch Kapitel 3.1.2.1). Da

eingestrahlte Lichtenergie entweder für photochemische Prozesse genutzt oder in Form

von Wärme bzw. Fluoreszenz emittiert wird (s. o.), ist den Fd2‐KO‐Pflanzen bei

verringerter qP und nicht signifikant verändertem NPQ eine gesteigerte Fluoreszenz‐

Emission zu erwarten. Dieses Phänomen kann bei den Fd2‐KO‐Pflanzen beobachtet

werden. Die Fluoreszenz‐Emission im Licht bezogen auf die maximale

Fluoreszenzemission (F/FM) liegt mit 0,35 ± 0,02 ca. 34 % höher als in den Noe‐WT‐

Pflanzen (0,23 ± 0,03). Dies verhält sich nahezu linear zur Abnahme von qP, welche bei

ca. 28 % liegt (siehe Tab. 3.2). In den Fd2‐KO‐Pflanzen wird in Folge mangelnder

72 Ergebnisse

Akzeptoren am PSI überschüssige Lichtenergie in Form von Fluoreszenz emittiert. Eine

photochemische Nutzung sowie die nicht‐photochemische Löschung der

Quantenenergie sind auf Grund des Mangels des zentralen Elektronenakzeptors nicht

möglich.

Dies wird auch durch das Ausmaß an Chlororespiration in den Fd2‐KO‐Pflanzen

bestätigt. Ein Protonengradient zum Schutz der photosynthetischen

Elektronentransportkette vor einer Überreduktion wird in höheren Pflanzen neben den

LET und dem Fd‐abhängigen ZET auch durch den NDH‐abhängigen ZET (siehe

Kapitel 1.4.1) generiert (vgl. Munekage et al., 2004; Qilles, 2006). Der NDH‐abhängige

ZET läuft auch im Dunkeln ab und kann über den transienten Anstieg der Fluoreszenz‐

Emission nach einer Belichtung mit aktinischem Licht sichtbar gemacht werden (vgl.

Shikanai et al., 1998 und für Details zur Methodik siehe Kapitel 2.12.3) und wird als

Chlororespiration bezeichnet. Der Anstieg der Fluoreszenz‐Emission im Dunkeln wird

durch im Licht reduzierte, akkumulierende Elektronendonatoren verursacht (Schreiber

et al., 1986) und führt im Dunkeln zur Reduktion des PQ‐Pools und damit einhergehend

auch des primären Akzeptors QA (vgl. Asada et al., 1998; Quilles, 2006). Für eine

statistische Absicherung der Intensität der Chlororespiration in den Versuchspflanzen

wird mit FC ein neuer Fluoreszenz‐Parameter eingeführt. FC beschreibt den Anteil der

chlororespiratorischen Chlorophyllfluoreszenz‐Emission eines Licht‐adaptierten Blattes

im Dunkeln, bezogen auf die Fluoreszenz‐Emission im Licht. Eine erhöhte Intensität der

Chlororespiration spiegelt sich hierbei in höheren Werten für FC wieder. Die Berechnung

von FC ist in Kapitel 2.12.3 im Detail beschrieben.

In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist FC signifikant geringer als in Noe‐WT‐Pflanzen

(siehe Abb. 3.9‐B). Dies deutet wiederum auf eine verringerte Menge an reduzierten

Elektronendonatoren im Stroma hin, welche im Zuge der Chlororespiration den PQ‐Pool

im Dunkeln reduzieren. Ebenso bestätigen die Werte für FC, dass überschüssige

Quantenenergie in den Fd2‐KO‐Pflanzen nicht über Wärme‐Emission als Folge eines

erhöhten Protonengradienten über die Thylakoidmembran gelöscht, sondern als

Fluoreszenz emittiert wird (s. o.). Auffällig ist, dass in Noe‐WT‐Pflanzen die Steigerung

der Fluoreszenz‐Emission im Dunkeln nach einigen Sekunden wieder auf F0’‐Niveau fällt,

was auf eine Re‐Reduzierung der P700‐Moleküle im PSI und damit einhergehender Re‐

Oxidation des PQ‐Pools zurückzuführen ist (vgl. Shikanai et al., 1998). In den Fd2‐KO‐

Pflanzen hingegen fällt die Fluoreszenz‐Emission im Dunkeln auch nach mehreren

Sekunden nicht und die zunehmende Reduzierung des PQ‐Pools im Zuge der

Chlororespiration bleibt stabil hoch (siehe Abb. 3.9‐A). Dies deutet auf eine verminderte

Ergebnisse 73

Fähigkeit der Re‐Reduktion von P700‐Molekülen auf Grund zunehmender

Ladungsrekombination im PSI sowie Akzeptormangel am PSI hin (siehe Kapitel 3.1.2.1).

Abb. 3.9: Chlororespiration von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen.Dargestellt ist die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission (A) sowie der kalkulierte Fluoreszenz‐Parameter FC (B) von Fd2‐KO‐ und Noe‐WT‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Die Blattscheiben wurden für 15 min mit aktinischem Licht (AL – Lichtintensität: 150 µE m‐2 s‐1) bestrahlt (in der Abb. sind nur einige Sekunden dargestellt), bevor die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission im Dunkeln aufgezeichnet wurde. Die dargestellten Kinetiken der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten. Die gezeigten Daten für FC sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

Zusammenfassung – Photosystem II (Kapitel 3.1.2.2):

In den Fd2‐KO‐Pflanzen kommt es unter moderaten Bedingungen zu einer

verringerten Nutzung der Lichtenergie sowohl für photochemische als auch für nicht‐

photochemische Prozesse. Dies resultiert in einer höheren Fluoreszenz‐Emission.

Insgesamt ist der photosynthetische Elektronenfluss signifikant verringert, wobei der

PET stärker reduziert vorliegt. Photoinhibition oder Schädigungen in Folge des

erhöhten Reduktionsgrades der photosynthetischen Elektronentransportkette sind

in den Fd2‐KO‐Pflanzen nicht zu beobachten. In Folge stärker auftretender

Ladungsrekombination im PSI ist eine Re‐Reduzierung von P700‐Molekülen auch im

Dunkeln nur bedingt möglich und Elektronen fließen lediglich zum Teil aus dem

photosynthetischen Elektronentransport ab.

74 Ergebnisse

3.1.2.3 CO2‐Assimilation

Um die Auswirkungen einer Akzeptorlimitierung am PSI weiter zu charakterisieren,

wurden Untersuchungen an der Sekundärreaktion der Photosynthese durchgeführt.

Anhand der in den vorherigen Kapiteln dargestellten Daten sollte deutlich werden, dass

in Folge des verminderten photosynthetischen Elektronentransportes auch die CO2‐

Assimilationsraten und somit die Netto‐Photosynthese in den Fd2‐KO‐Pflanzen

beeinflusst sind. Um dies zu zeigen, wurden Messungen zum CO2‐Gaswechsel (siehe

Kapitel 2.13.2) an Blättern von Noe‐WT‐ sowie Fd2‐KO‐Pflanzen durchgeführt.

Noe‐WT Fd2‐KO0

1

2

3

4

5

6

Noe‐WT Fd2‐KO

1 h Belichtung

6 h Belichtung

CO2‐Assim

ilation

[µmol m

‐2s‐1 ]

Noe‐WT Fd2‐KO

1

3

7

Belichtun

gszeit [h

]

BA

Noe‐WT Fd2‐KO0

1

2

3

4

5

6

Noe‐WT Fd2‐KO

1 h Belichtung

6 h Belichtung

CO2‐Assim

ilation

[µmol m

‐2s‐1 ]

Noe‐WT Fd2‐KO

1

3

7

Belichtun

gszeit [h

]

BA

Abb. 3.10: CO2‐Assimilation und Stärkeakkumulation in den Blättern von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist die CO2‐Assimilation (A) sowie die Stärkeakkumulation (B) in den Blättern von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die CO2‐Assimilationsraten wurden an Blättern von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen nach einer Stunde (links) und nach sechs Stunden (rechts) in der Lichtphase bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE). Um die Stärkeassimilation zu bestimmen wurden Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) mit Iod‐Kaliumiodid Lösung nach einer, drei und sieben Stunden in der Lichtphase angefärbt. Die dargestellten Blattscheiben sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Unter moderaten Bedingungen nach einer Stunde in der Lichtphase ist die

durchschnittliche CO2‐Assimilationsrate in den Fd2‐KO‐Pflanzen um 46 % geringer als in

den Noe‐WT‐Pflanzen (siehe Abb. 3.10‐A). Dies ist zum einen auf den geringeren Gehalt

an aktiven Thylakoiden (siehe Kapitel 3.1.2.1), zum anderen auf einen verminderten

photosynthetischen Elektronenfluss zurückzuführen (siehe Kapitel 3.1.2.2). Nach sechs

Stunden in der Lichtphase ist dieser Effekt noch signifikanter. Die CO2‐Assimilation ist

Ergebnisse 75

sowohl in den Noe‐WT‐Pflanzen als auch in Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zur

Photosyntheserate nach einer Stunde im Licht deutlich reduziert, wobei Fd2‐KO‐

Pflanzen eine signifikant stärkere Abnahme der CO2‐Assimilation um 40 % aufweisen (in

den Noe‐WT‐Pflanzen lediglich um 20 %). Diese Verringerung der Photosyntheserate am

Ende der Lichtphase ist auf dynamische Photoinhibition am PSII zurückzuführen, wie sie

für C3‐Pflanzen im Tagesverlauf unter sättigenden Lichtintensitäten üblicherweise

vorkommt (vgl. Häder, 1999). Die verminderten CO2‐Assimilationsraten in den Fd2‐KO‐

Pflanzen sind auch durch die verringerte Akkumulation von Stärke in den Blättern belegt

(siehe Abb. 3.10‐B). Insgesamt ist die geringe CO2‐Assimilationsrate die Ursache für die

signifikant verlangsamte Entwicklung der Fd2‐KO‐Pflanzen (siehe Kapitel 3.1.1).

3.1.2.4 Licht‐ und CO2‐Abhängigkeit der Photosynthese

Die in diesem Kapitel dargestellten Experimente wurden mit dem Ziel durchgeführt,

kurzzeitige Anpassungen und Veränderungen in Folge wechselnder abiotischer

Bedingungen (Lichtintensität, CO2‐Partialdruck) auf die photosynthetische Lichtnutzung

zu testen, sowie die maximale Kapazität der Photosynthesereaktion zu bestimmen.

Hierfür wurden Messungen zur Lichtabhängigkeit (Lichtsättigungskurven) sowie zur

CO2‐Abhängigkeit (A/Ci‐Kurven) der Nettophotosynthese in‐vitro an Blättern von Noe‐

WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen durchgeführt. Zeitgleich aufgezeichnete

Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen dokumentieren zusätzlich kurzzeitige Änderungen

im photosynthetischen Elektronenfluss. Um die tatsächliche minimale sowie maximale

Kapazität der Photosynthese und des photosynthetischen Elektronenflusses in den

Pflanzen zu bestimmen, wurden „schnelle“ Lichtsättigungs‐ bzw. A/Ci‐Kurven erstellt

(eine detaillierte Beschreibung der Experimente und der entscheidenden Parameter für

„schnelle“ Lichtsättigungskurven bzw. A/Ci‐Kurven ist in Kapitel 2.13 aufgeführt).

Hierbei wird vermieden, dass die Stomata auf die veränderten äußeren Bedingungen

reagieren können. Der Öffnungszustand bleibt während der Messungen nahezu

konstant. Dies ist vor allem für die A/Ci‐Kurven von entscheidender Bedeutung, da Ci

eine berechnete Größe darstellt und auf Mess‐ und Aufnahmefehler, die von der

stomatären Leitfähigkeit ausgehen, reagieren (vgl. Häder, 1999).

In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist die maximale CO2‐Assimilationsrate 40 % geringer als in den

Noe‐WT‐Pflanzen. Dies entspricht ungefähr der verringerten CO2‐Assimilation in‐vivo

unter moderaten Bedingungen, welche um 46 % reduziert abläuft (siehe

Kapitel 3.1.2.3). Im Vergleich ist zu beachten, dass in den Noe‐WT‐Pflanzen die

Lichtsättigung der Photosynthese bereits bei einer Lichtintensität von

76 Ergebnisse

ca. 250 ‐ 500 µE m‐2 s‐1 erreicht ist. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist dies erst bei ca.

2000 µE m‐2 s‐1 (siehe Abb. 3.11‐A).

Abb. 3.11: Lichtsättigungskurven der Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist die CO2‐Assimilation (A) sowie die Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter (B) bei unterschiedlichen Lichtintensitäten von Noe‐WT‐ (durchgezogene Linie, gefüllte Kreise) und Fd2‐KO‐Pflanzen (gestrichelte Linie, offene Kreisen), angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Gaswechselmessungen sowie die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission wurden zeitgleich an gleichen Blättern durchgeführt. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen zehn Minuten dunkel gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

Die Phase der Lichtsättigung ist charakterisiert durch die „Trägheit“ des Calvin‐Zyklus.

Stitt (1986) sowie Scheibe (1996) zeigten, dass der photosynthetische

Elektronentransport im entkoppelten, isolierten Thylakoid‐System schneller abläuft als

Ergebnisse 77

der Calvin‐Zyklus. Unter hohen Lichtintensitäten kommt es demnach zu einer

Limitierung im Calvin‐Zyklus, bei der es sich in der Regel um eine CO2‐Limitierung

handelt (vgl. Häder, 1999). In den Fd2‐KO‐Pflanzen liegt diese Limitierung bis zu einer

Lichtintensität von 2000 µE m‐2 s‐1 nicht vor, so dass der Calvin‐Zyklus ausreichend

Kapazität aufweist, um NADPH bzw. ATP für die CO2‐Assimilation zu nutzen. In den Fd2‐

KO‐Pflanzen ist in Abhängigkeit der Lichtintensität eine stete Steigerung der CO2‐

Assimilation und der Elektronentransportrate zu detektieren, welche allerdings immer

unter denen der Noe‐WT‐Pflanzen liegen.

Insgesamt sind sowohl für Noe‐WT‐Pflanzen als auch in den Fd2‐KO‐Pflanzen mit

steigenden Lichtintensitäten typische Tendenzen einer Lichtakklimation bezogen auf

den photosynthetischen Elektronentransport zu beobachten (vgl. Kramer et al., 2004;

Nedbal et al., 2003; Holt et al., 2004; Avenson et al., 2005). So verringert sich qP, ΦII,

wobei NPQ und ETR ansteigen. In den Fd2‐KO‐Pflanzen sind diese Tendenzen jedoch

deutlich geringer ausgeprägt als in den Noe‐WT‐Pflanzen (siehe Abb. 3.11‐B). Dies ist

damit zu begründen, dass die Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen

bereits im steady‐state Zustand unter moderaten Bedingungen deutliche Anzeichen

einer Lichtakklimation aufweisen (siehe Kapitel 3.1.2.2).

Es wurde bereits gezeigt, dass Fd2‐KO‐Pflanzen keine Limitierung im Calvin‐Zyklus

aufweisen und ausreichend Kapazitäten vorhanden sind, um CO2 zu fixieren (s. o.).

Anhand von A/Ci‐Kurven, bestimmt bei einem „normalen“ O2‐Gehalt von 21 %, wird

deutlich, dass unter steigendem CO2‐Partialdruck sowohl bei Noe‐WT‐ als auch bei Fd2‐

KO‐Pflanzen eine erhöhte Photosyntheserate bis zum Eintritt der CO2‐Sättigung zu

beobachten ist. Der annähernd gesättigte Bereich der CO2‐Assimilation unter hohem Ci

in den Fd2‐KO‐Pflanzen ist hierbei signifikant geringer als in den Noe‐WT‐Pflanzen

(siehe Abb. 3.12). Dies ist auf die insgesamt verminderte Elektronentransportrate

zurückzuführen (siehe Kapitel 3.1.2.2), die somit die Carboxylierungsrate limitiert (vgl.

Häder, 1999). Unter geringerem Ci (bis ca. 200 µmol mol‐1) reagiert die CO2‐

Assimilationsrate linear zu Ci. In‐vitro‐Untersuchungen zeigten, dass die Steigung in

diesem Bereich überwiegend durch die Aktivität der RubisCO bestimmt ist und somit

den Induktionszustand des Photosyntheseapparates anzeigt (vgl. Craemmerer und

Farquhar, 1981). In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist diese Steigung mit

22 ± 0,57 nmol CO2 m‐2 s‐1 / µmol CO2 mol‐1 um 37 % geringer als in den Noe‐WT‐

Pflanzen mit 35,5 ± 3,1 nmol CO2 m‐2 s‐1 / µmol CO2 mol‐1. Der Induktionszustand des

Photosyntheseapparates ist hier ähnlich signifikant verringert wie auch die CO2‐

Assimilationsrate unter moderaten Bedingungen (siehe Kapitel 3.1.2.3). Das deutet

auch auf eine Anpassung der RubisCO‐Aktivität bezogen auf die Reduktionskraft der

78 Ergebnisse

photosynthetischen Primärreaktion hin, da die Aktivität der RubisCO direkt über das

Fd‐Trx‐System und indirekt über das metabolische fine‐tuning an die Primärreaktion

gekoppelt ist (siehe Kapitel 1.3). Die konstant verringerten CO2‐Assimilationsraten in

den Fd2‐KO‐Pflanzen sowohl unter niedrigen als auch hohen Ci‐Werten belegen eine

Limitierung der Netto‐Photosynthese durch die Primärreaktion, wobei NADPH und ATP

in signifikant geringerem Maße synthetisiert werden. Zudem zeigt der somit verringerte

Induktionszustand der RubisCO ein vermehrt oxidiertes Stroma auf Grund des Mangels

an NADPH aus dem LET in den Fd2‐KO‐Pflanzen an.

Abb. 3.12: A/Ci‐Kurven von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderate Bedingungen. Dargestellt ist die CO2‐Assimilation in Abhängigkeit zum CO2‐Partialdruck im substomatären Raum (Ci) von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen wurden direkt an den Blättern der Pflanzen bei einer Lichtintensität von 150 µE m‐2 s‐1

durchgeführt. An gleichen Blättern wurden zunächst die CO2‐Assimilationsraten bei 21 % O2 und danach ohne O2 im anliegenden Gasgemisch bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

Abgesehen von den insgesamt verringerten CO2‐Assimilationsraten ist der Verlauf der

A/Ci‐Kurven von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen ähnlich. Bei genauer Betrachtung sind

allerdings Abweichungen zu erkennen. In den Fd2‐KO‐Pflanzen sind die CO2‐

Assimilationsraten unter geringen Ci deutlicher reduziert als unter hohen Ci. Diese

Abweichungen sind jedoch nicht konträr zu den oben in diesem Kapitel getroffenen

Aussagen. Sie sind auf einen geringfügig erhöhten Anteil an Photorespiration bezogen

auf die maximale RubisCO‐Verbrauchsrate zurückzuführen. Photorespiration ist vor

allem unter geringem CO2‐Partialdruck bei einer erhöhten RubisCO‐Oxigenierungsrate

Ergebnisse 79

zu beobachten. CO2‐Sättigungskurven in einem O2‐freien Gasgemisch zeigen die

maximale Carboxylierungsrate der RubisCO (siehe Abb. 3.12), welche vor allem in C3‐

Pflanzen bei einem geringem CO2‐Partialdruck höher liegt als die Netto‐Assimilationrate

unter „normalen“ Bedingungen (21 % O2). Unter O2‐freien Bedingungen kann

Photorespiration nahezu komplett ausgeschlossen werden (Ganz auszuschließen ist

Photorespiration auch unter O2‐freien Bedingungen nicht, da im Blatt freiwerdendes O2

einen vermutlich kleinen Anteil an Photorespiration begünstigt). Der Vergleich der

maximalen Carboxylierungsrate (O2‐freie Bedingungen) mit der Netto‐Assimilationsrate

(21 % O2) erlaubt es, den Parameter APR zu bestimmen. Dieser Parameter zeigt den

Anteil der apparenten Photorespiration an der maximalen RubisCO‐Verbrauchsrate

(maximale Carboxylierungsrate der RubisCO unter O2‐freien Bedingungen) an (für

Details zur Methodik siehe Kapitel 2.13.5). Demnach ist APR ein Indikator den

photorespiratorischen Anteil am photosynthetischen Elektronenfluss. In den Fd2‐KO‐

Pflanzen ist der photorespiratorische Anteil vor allem unter geringen Ci leicht erhöht

(siehe Abb. 3.13).

Abb. 3.13: Anteil der apparenten Photorespiration an der maximalen RubisCO‐Verbrauchsrate in den Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist der photoresipratorische Anteil am photosynthetischen Elektronenfluss in Form des Parameters APR in Noe‐WT‐ (durchgezogenen Linie, gefüllte Kreise) und Fd2‐KO‐Pflanzen (gestrichelte Linie, offene Kreisen), angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen wurden direkt an den Blättern der Pflanzen durchgeführt und APR wurde aus den A/Ci‐Kurven (siehe Abb. 3.12) kalkuliert. Die Messungen erfolgten bei einer Lichtintensität von 150 µE m‐2 s‐1. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

80 Ergebnisse

In den Fd2‐KO‐Pflanzen tritt im Zuge einer Akzeptorlimitierung am PSI ein reduzierter

Elektronenfluss in der Primärreaktion auf. Unter gesteigerten Lichtintensitäten

hingegen setzt ein erhöhter photosynthetischer Elektronenfluss ein. Ebenso steigen

die CO2‐Assimilationsraten in den Fd2‐KO‐Pflanzen, allerdings in einem signifikant

geringeren Maße als in den Noe‐WT‐Pflanzen. Die reduzierte Photosyntheserate der

Fd2‐KO‐Pflanzen ist auf eine Limitierung der Primärreaktion und auf einen Mangel an

deren Produkten, ATP und NADPH, zurückzuführen. Obwohl der NADPH‐Gehalt im

Stroma limitiert scheint, ist ein erhöhter photorespiratorischer Anteil in den Fd2‐KO‐

Pflanzen zu beobachten.

Zusammenfassung – CO2‐Assimilation (Kapitel 3.1.2.3 und 3.1.2.4)

3.1.3 Reduktionsgrad und Redoxregulation im Stroma

Fd2‐KO‐Pflanzen weisen an den aktiven Thylakoiden eine stromale Akzeptorlimitierung

am PSI auf. Der Reduktionsgrad des PET ist bei einem verringerten Elektronenfluss

erhöht und im PSII tritt Ladungsrekombination auf (siehe Kapitel 3.1.2). In den

vorangegangenen Kapiteln wurde bereits gezeigt, dass ein Mangel an

Reduktionsäquivalenten im Stroma eine Limitierung der CO2‐Assimilation zur Folge hat.

Demnach ist ein zunehmend oxidiertes Stroma zu erwarten, was anhand von NADP‐

MDH Aktivitätsmessungen im folgenden Kapitel (3.1.3.1) weiter belegt wird. Da der PET

verstärkt reduziert vorliegt (siehe Kapitel 3.1.2.2) liegt eine Entkopplung des

Reduktionsgrades der Thylakoidmembran und des Stromas vor, was die Fd2‐KO‐

Pflanzen zu einem optimalen Modell für das Studium der Redoxregulation in den

Chloroplasten macht. In den folgenden Kapiteln (3.1.3.1 – 3.1.3.2) wird gezeigt, wie der

stromale Metabolismus auf diese Situation reagiert und welche metabolischen

Anpassungen auftreten.

3.1.3.1 Redoxregulierte Stroma‐Enzyme in Fd2‐KO‐Pflanzen

Viele im Stroma lokalisierte und in den Chloroplasten‐Metabolismus involvierte Enzyme

sind redox‐reguliert, u.a. einige Enzyme des Calvin‐Zyklus (vgl. Buchanan et al., 1979;

Buchanan, 1980). Ebenso ist gezeigt worden, dass photosynthetische Redox‐Reaktionen

nicht nur wichtig für die Optimierung der Photosynthese‐Reaktion sind, sondern auch

ein Signal für die Zelle darstellen, um auf wechselnde abiotische Bedingungen zu

reagieren (vgl. Kruse, 2001; Dietz et al., 2002; Pfannschmidt et al., 2003). Anhand zweier

Ergebnisse 81

Beispiele, NADP‐MDH sowie G6PDH, wird in diesem Kapitel gezeigt, inwieweit ein

Mangel an Fd als Elektronenakzeptor am PSI Auswirkungen auf den stromalen

Metabolismus und die Redoxregulation hat. Sowohl die chloroplastidäre NADP‐MDH als

auch die plastidäre G6PDH werden u.a. posttranslational über das Fd‐Trx‐System

aktiviert (NADP‐MDH) bzw. inaktiviert (G6PDH) (vgl. Buchanan, 1980; Scheibe und

Jacquot, 1983; Scheibe et al., 1990; Scheibe, 2004; Buchanan und Balmer, 2005). Ein

Mangel an Fd als Elektronendonator im Fd‐Trx‐System sollte regulatorische

Anpassungen im stromalen Metabolismus nach sich ziehen.

Abb. 3.14: Enzymaktivität der NADP‐MDH in Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist die Kapazität (A), die in‐situ‐Aktivität (B) sowie der Aktivierungszustand (C) der NADP‐MDH in den Blättern von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Enzymaktivitäten für die Kapazität und in‐situ‐Aktivität wurden an gleichen Blattproben bestimmt und auf den Proteingehalt bezogen. Die Blattproben wurden direkt nach der Dunkelphase (0) und nach drei Stunden in der Lichtphase (3) geerntet. Der Aktivierungszustand der NAD‐MDH ist als prozentualer Anteil der in‐situ‐Aktivierung an der Kapazität angegeben. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

82 Ergebnisse

Becker et al. (2006) zeigten, dass unter erhöhten Lichtintensitäten das

Expressionsniveau der NADP‐MDH steigt. Überschüssige Elektronen aus der

Primärreaktion der Photosynthese werden über das Malat‐Ventil abgeführt (vgl.

Scheibe, 2004). Dementsprechend ist auch in den Fd2‐KO‐Pflanzen nach drei Stunden in

der Lichtphase eine erhöhte Kapazität der NADP‐MDH zu beobachten

(siehe Abb. 3.14‐A). Die in‐situ‐Aktivität der NADP‐MDH ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen in

der Lichtphase allerdings nur geringfügig erhöht und verbleibt wie in den Noe‐WT‐

Pflanzen auf einem relativ geringen Niveau (siehe Abb. 3.14‐B). Der Aktivierungszustand

hingegen ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen signifikant

verringert (siehe Abb. 3.14‐C). Die Aktivierung der NADP‐MDH durch das Fd‐Trx‐System

unterliegt auch einem fine‐tuning und einer feedback‐Regulation, wobei ein Überschuss

an NADP+ die Inaktivierung fördert, was eine Konkurrenz um NADPH mit dem Calvin‐

Zyklus verhindert (vgl. Scheibe und Jacquot, 1983; Scheibe et al., 1991; Faske et al.,

1994; Scheibe, 2004). Demnach ist der Aktivierungszustand dieses Enzyms auch ein

geeigneter Indikator, um den Reduktionsgrad des Stromas zu bestimmen. Dieser ist

folglich in den Fd2‐KO‐Pflanzen verringert, so dass ein Mangel an

Reduktionsäquivalenten in Form von NADPH anzunehmen ist (siehe hierzu

Kapitel 3.1.2.4 zur Limitierung des Calvin‐Zyklus). Die erhöhte Kapazität der NADP‐MDH

im Licht ist folglich nicht abhängig vom Reduktionsgrad des Stromas. Eine über Redox‐

Signale, die von einer verstärkt reduzierten Elektronentransportkette in der

Thylakoidmembran ausgehen, vermittelte Expressionssteigerung ist wahrscheinlich

(siehe Kapitel 4.1.2).Der verringerte Aktivitätszustand der NADP‐MDH sowie die in

Kapitel 3.1.2.4 dargestellten Daten belegen einen Mangel an Reduktionsäquivalenten

im Stroma der Fd2‐KO‐Pflanzen.

Über den OPP (siehe Kapitel 1.3.3) ist es möglich, im Cytosol und im Stroma bei Bedarf

Reduktionsäquivalente in Form von NADPH bereitzustellen. In WT‐Pflanzen wird hierbei

das Auftreten eines futile cycle vermieden, wobei bei gleichzeitigem Ablauf von OPP und

Calvin‐Zyklus letztlich ATP verbraucht wird. Dies wird durch eine gegenläufige

Aktivierung/Inaktivierung der Schlüsselenzyme des OPP und des Calvin‐Zyklus erreicht.

Das Schlüsselenzym des OPP, die chloroplastidäre G6PDH, wird über das Fd‐Trx‐System,

im Gegensatz zu den Enzymen des Calvin‐Zyklus, inaktiviert (vgl. Buchanan, 1980;

Scheibe, 1990; Wenderoth et al., 1997). In den Fd2‐KO‐Pflanzen hingegen ist der Fluss

von Elektronen auf Grund des Mangels an Fd über die photosynthetische

Elektronentransportkette ins Stroma limitiert. Die Gesamtkapazität der G6PDH

(plastidäre und cytosolische Isoformen) ist sowohl im Dunkeln (0‐h Wert) als auch im

Licht (nach drei bzw. sieben Stunden) signifikant erhöht (siehe Abb. 3.14‐A). Die erhöhte

Ergebnisse 83

Gesamtkapazität der G6PDH ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen zu einem großen Anteil auf die

signifikante Kapazitätssteigerung der plastidären G6PDH‐Isoform zurückzuführen

(siehe Abb. 3.14‐C).

Abb. 3.15: Enzymaktivität der G6PDH in Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt ist die Kapazität der G6PDH‐Isoformen in den Blättern von Noe‐WT‐ sowie Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Gesamtaktivität (A) sowie die cytosolische (B) und plastidäre (C) Kapazität wurden in denselben Blattproben bestimmt und auf den Proteingehalt bezogen. Die Blattproben wurden direkt nach der Dunkelphase (0) und nach drei (3) bzw. sieben (7) Stunden in der Lichtphase geerntet. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

3.1.3.2 Akkumulation von ROS

Sowohl der Aktivierungszustand der NADP‐MDH als auch Messungen zum

photosynthetischen Gaswechsel (siehe Kapitel 3.1.2.3 und Kapitel 3.1.2.4) belegen, dass

der Elektronenfluss von PSI auf NADP+ in den Fd2‐KO‐Pflanzen in verringertem Maße

abläuft. Das Stroma weist, im Gegensatz zur photosynthetischen

Elektronentransportkette in der Thylakoidmembran, einen erhöhten Oxidationsgrad

84 Ergebnisse

auf. Die verringerte Kapazität, Elektronen mittels Fd auf stromale Akzeptoren zu

übertragen, führt in den Fd2‐KO‐Pflanzen zu einer vermehrten Akkumulation von ROS.

ROS sind stark reaktive Moleküle, die zu irreversiblen Schädigungen in der Zelle führen,

jedoch auch als Signalstoffe fungieren können (vgl. Mittler et al., 2004). Mittels des

Fluoreszin‐Derivates CM‐H2DCFDA (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) ist es möglich,

isolierte Protoplasten anzufärben und ROS über Laser‐Scanning Mikroskopie sichtbar zu

machen. CM‐H2DCFDA fluoresziert im reduzierten Zustand nicht. Wird über

interzelluläre Esterasen die Acetat‐Gruppe abgespalten und die Chemikalie über ROS

oxidiert, ist eine Fluoreszenz‐Emission zu beobachten, welche indirekt das Vorkommen

von ROS anzeigt. In den Fd2‐KO‐Pflanzen zeigen 46 % der Protoplasten aus grünem

Blattgewebe nach sieben Stunden unter moderaten Lichtbedingungen eine vermehrte

Akkumulation von ROS. In Noe‐WT‐Pflanzen sind lediglich 4 % der Zellen betroffen

(siehe Abb. 3.16). In dunkel‐adaptierten Protoplasten ist in Fd2‐KO‐Pflanzen hingegen

keine vermehrte ROS‐Akkumulation zu beobachten (Daten nicht gezeigt).

Abb. 3.16: Akkumulation von ROS in Blatt‐Protoplasten von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt ist die Akkumulation von ROS in Protoplasten von Noe‐WT‐ bzw. Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Protoplasten wurden aus Blättern isoliert und sieben Stunden unter moderaten Bedingungen inkubiert. Vor der Untersuchung im Konfokalen Laser Scanning Mikroskop wurden die Protoplasten 15 min mit 1 µM CM‐H2DCFDA behandelt. Die Chlorophyll‐Autofluoreszenz wird in rot und ROS (sichtbar durch die Fluoreszenz‐Emission von CM‐H2DCFDA) in grün dargestellt. Zusätzlich sind die überlagerten Signale und DIC (differential interference contrast) abgebildet. Die gezeigten Bilder sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Die Akkumulation von ROS ist hauptsächlich in den Chloroplasten der Zellen lokalisiert

(siehe Abb. 3.17‐A). Zum Teil allerdings weisen auch an den Chloroplasten assoziierte

Mitochondrien eine vermehrte ROS‐Akkumulation auf (siehe Abb. 3.17‐B). Die Identität

Ergebnisse 85

der Mitochondrien wurde durch MitoTracker Orange CMTMRos (Invitrogen, Karlsruhe,

Deutschland) sichtbar. MitoTracker Orange CMTMRos fluoresziert im reduzierten

Zustand nicht. Im oxidierten Zustand kann eine Fluoreszenz‐Emission beobachtet

werden. Der MitoTracker Orange CMTMRos ROS akkumuliert in den Mitochondrien

lebender Zellen und wird dort oxidiert.

Abb. 3.17: Lokalisation von ROS in den Protoplasten der Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt sind einzelne Protoplasten von Fd2‐KO‐Pflanzen, welche zum einen eine typische Akkumulation von ROS in den Chloroplasten (A), zum anderen die zum Teil vorkommende Akkumulation von ROS in an Chloroplasten assoziierte Mitochondrien (B) zeigt. Die Protoplasten wurden aus Blättern der Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag), isoliert. Vor der Untersuchung im Konfokalen Laser Scanning Mikroskop wurden die Protoplasten 15 min mit 1 µM CM‐H2DCFDA behandelt. Die Chlorophyll‐Autofluoreszenz wird in rot und ROS (sichtbar durch die Fluoreszenz‐Emission von CM‐H2DCFDA) in grün dargestellt. Zusätzlich wurden die Protoplasten in 50 nM MitoTracker® Orange CMTMRos zur Visualisierung der Mitochondrien inkubiert. Die in (A) gezeigten Bilder sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten, wobei die in B dargestellte ROS‐Akkumulation in den Mitochondrien nur zum Teil zu beobachten war.

Die Atmungskette in den Mitochondrien von Pflanzen ist neben den Chloroplasten und

anderen Organellen mit einer hohen oxidativen, metabolischen Aktivität eine Quelle für

die Entstehung von ROS (vgl. Mittler et al., 2008), wobei hier angenommen wird, dass

unter abiotischen Stressbedingungen Chloroplasten und Peroxysomen die

hauptsächlichen Quellen für die Bildung von ROS sind (vgl. Mittler et al., 2004). Die

Tatsache, dass in den Protoplasten der Fd2‐KO‐Pflanzen ROS in Mitochondrien vor allem

86 Ergebnisse

dann beobachtet werden kann, wenn diese am Chloroplasten assoziiert vorliegen,

deutet in diesem Zusammenhang auf die Funktion von ROS als Signalmolekül hin (vgl.

Mittler et al. 2008) und belegt eine enge Interaktion von Chloroplasten und

Mitochondrien (vgl. Hanke et al., 2009).

ROS entstehen u.a. direkt durch die Reduzierung von molekularem Sauerstoff am PSI,

wobei Superoxid gebildet wird. Dies passiert zunehmend unter hohen Lichtintensitäten

(vgl. Mittler, 2002), sofern am PSI keine alternativen Akzeptoren zur Verfügung stehen.

Fds sind als Elektronendonator für die Reduzierung von O2 am PSI nicht notwendig,

vielmehr erfolgt die Reduzierung direkt oder über einen bislang nicht endgültig

aufgeklärten stromalen Faktor (vgl. Asada, 1999). Superoxide werden durch die

Superoxiddismutase zu Wasserstoffperoxid reduziert, wobei O2 entsteht. Die

Entsorgung von Wasserstoffperoxiden kann in den Chloroplasten über verschiedene

Wege ablaufen. Zur weiteren Reduzierung von H2O2 werden in der Regel

Reduktionsäquivalente in Form von reduziertem Fd oder NADPH aus der

Photosynthesereaktion benötigt (vgl. Mittler, 2002; Asada, 1999). Dies hat den

Nebeneffekt, dass durch die vermehrte Oxidierung von NADPH wieder NADP+ entsteht

und die Bildung von ROS am PSI präventiv verhindert wird. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist

die Generierung von reduziertem Fd sowie NADPH aus der Photosynthesereaktion nur

begrenzt möglich und ROS akkumulieren in den Chloroplasten (s. o.). Zu beachten ist,

dass die Akkumulation von ROS in den Fd2‐KO‐Pflanzen nicht zu sichtbaren Schäden an

den Blättern führt (siehe Kapitel 3.1.1). Demnach sind die Fd2‐KO‐Pflanzen in der Lage,

die Akkumulation von ROS auf ein Ausmaß zu begrenzen, welches die Vitalität der

Pflanzen nicht beeinflusst. In diesem Zusammenhang ist die signifikant geringere Menge

an Glutathion in den Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen zu

erwähnen (siehe Abb. 3.18), obwohl vermehrt ROS akkumuliert wird.

Glutathion übernimmt abhängig vom Reduktionszustand im pflanzlichen Organismus

die unterschiedlichsten Funktionen (vgl. Rouhier et al., 2008; Noctor und Foyer, 1998

sowie May et al., 1998). Unter anderem spielt Glutathion eine entscheidende Rolle als

Redox‐Puffer, um das intrazelluläre Milieu im reduzierten Zustand zu halten. Ferner ist

Glutathion ein wichtiges Reduktionsmittel für die Detoxifikation von ROS (vgl. Rouhier

et al., 2008; Noctor und Foyer, 1998 sowie May et al., 1998). Zum Beispiel wird

Wasserstoffperoxid mittels Glutathion‐Peroxidase durch GSH reduziert oder reduziertes

Asc wird mittels DHAR über GSH regeneriert. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist auf Grund der

signifikant verringerten Menge an Glutathion davon auszugehen, dass die Funktion von

Glutathion sowohl als Redox‐Puffer als auch zur Detoxifizierung von ROS nicht erfüllt

wird, obwohl durch das oxidierte Stroma bzw. akkumulierende ROS ein gesteigerter

Ergebnisse 87

Bedarf vorhanden ist. Im Gegensatz zu anderen Redox‐Paaren wie NADPH/NADP+ oder

Ascorbat/Dehydroascorbat, ist für das Redoxpotential sowohl die Glutathion‐

Konzentration als auch das Verhältnis von GSH zu GSSG entscheidend (vgl. Gomez et al.,

2006). Dies ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen verglichen mit den Noe‐WT‐Pflanzen nicht

verändert. Die Tatsache eines deutlich verringerten Gehaltes an Glutathion sowie keine

signifikante Veränderung im Verhältnis von GSH zu GSSG belegen wiederum, dass das

Stroma im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen stärker oxidiert vorliegt. Für die

Detoxifizierung von ROS in den Chloroplasten mittels GSH wird NADPH als

Reduktionsäquivalent zur Regenerierung von GSH aus GSSG mittels GR benötigt. In den

Fd2‐KO‐Pflanzen besteht ein Mangel an Reduktionsäquivalenten im Stroma. Dies

könnte der Grund für die signifikante Verringerung des Glutathion‐Gehalts sein.

Noe‐WT Fd2‐KO0

20

40

60

80

100

120GSH

GSSG

A B

Anteil am Noe

‐WT [%

]

Noe‐WT Fd2‐KO0.0

2.5

5.0

7.5GSH

/ GSSG

Noe‐WT Fd2‐KO0

20

40

60

80

100

120GSH

GSSG

A B

Anteil am Noe

‐WT [%

]


2.5

5.0

7.5GSH

/ GSSG


2.5

5.0

7.5GSH

/ GSSG

Abb. 3.18: Glutathion‐Gehalt in den Blättern der Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt ist der Glutathion‐Gehalt (A) sowie das Verhältnis von GSH zu GSSG (B) in den Blättern von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Der Gehalt an Glutathion ist bezogen auf den Gesamtgehalt in den Noe‐WT‐Pflanzen, wobei hierbei das arithmetische Mittel aus den Daten als 100 % angenommen wurde. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

3.1.4 NTRC als Fd‐unabhängiges antioxidatives System

In Kapitel 3.1.3.2 wird gezeigt, dass die Fd2‐KO‐Pflanzen über einen signifikant

verringerten Gehalt an Glutathion verfügen und der Mechanismus zur Entgiftung von

ROS im Stroma daher wahrscheinlich verringert abläuft. In den Fd2‐KO‐Pflanzen werden

auftretende ROS unabhängig vom photosynthetischen Elektronentransport über aus

dem OPP generierten NADPH (siehe Kapitel 3.1.3.1) reduziert und mittels NTRC

abgebaut (siehe Kapitel 1.4.3). Die NTRC hat eine Trx‐Domäne und überträgt Elektronen

von NADPH auf deren Zielenzyme. Ein mögliches Zielenzym ist das 2‐Cys‐Prx

88 Ergebnisse

(vgl. Pérez‐Ruíz et al., 2006), welches als antioxidatives Molekül beschrieben wird (vgl.

Baier und Dietz, 1997; König et al., 2002; Horling et al., 2003; Dietz, 2003). In A. thaliana

sind im Chloroplasten mit 2‐Cys‐Prx‐A und 2‐Cys‐Prx‐B bislang zwei Isoformen

beschrieben (vgl. Dietz et al., 2006).

Abb. 3.19: Expressions‐ sowie Translationsniveau von NTRC und 2‐Cys‐Prx in Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Das Transkriptionslevel von NTRC und 2‐Cys‐Prx‐B (A) und der Proteingehalt von NTRC (B) und 2‐Cys‐Prx (C) wurde mittels RT‐PCR bzw. Western‐Blot Analysen in den Blättern von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag), bestimmt. Für die RT‐PCR Analysen wurden spezifische Primer für NTRC, 2‐Cys‐Prx‐B sowie UBQ10 als housekeeping‐gene verwendet. Für die Western‐Blot Analysen wurde 25 µg Protein aus dem Rohextrakt verwendet im SDS‐Gel aufgetrennt und auf eine PVDF‐Membran geblottet. Die Immundetektion erfolgte mit einen Antikörper gegen NTRC aus Reis (Serrato et al., 2004; Pérez‐Ruíz et al., 2006) sowie gegen das 2‐Cys‐Prx BAS1 aus Gerste (Baier und Dietz, 1997). Die dargestellten Daten sind Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Versuchen.

Mittels NTRC und 2‐Cys‐Prx ist der Abbau von ROS heterotroph und nicht direkt

abhängig vom photosynthetischen Elektronentransport. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist

sowohl im Licht als auch nach der Dunkelphase (0‐h) ein signifikant erhöhtes

Expressionsniveau sowohl an NTRC als auch an 2‐Cys‐Prx‐B zu detektieren

Ergebnisse 89

(siehe Abb. 3.19‐A). Ebenso ist der Proteingehalt von NTRC (siehe Abb. 3.19‐B) und

2‐Cys‐Prx (siehe Abb. 3.19‐C) in den Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den Noe‐WT‐

Pflanzen vor allem nach sieben Stunden unter moderaten Bedingungen signifikant

erhöht. Die simultan erhöhten Mengen an 2‐Cys‐Prx sowie NTRC in den Fd2‐KO‐Pflanzen

belegen, dass akkumulierende ROS über die Fd‐unabhängige NTRC detoxifiziert werden.

Die benötigten Reduktionsäquivalente in Form von NADPH werden bei Bedarf über den

OPP bereitgestellt (siehe Kapitel 3.1.3.1), welcher auf Grund des Mangels an Fd in den

Fd2‐KO‐Pflanzen auch im Licht aktiv ist.

Zusammenfassung – Redoxregulation im Stroma (Kapitel 3.1.3 und 3.1.4)

In den Fd2‐KO‐Pflanzen herrscht ein Mangel an Reduktionsäquivalenten im Stroma.

Die gesteigerte Aktivität der G6PDH weist auf eine Generierung von

Reduktionsäquivalenten über den OPP im Licht hin. Dies ist eine Folge der

veränderten Redoxregulation, die durch den Mangel an Fds als Elektronendonator im

Stroma verursacht wird. Obwohl ein Mangel an NADPH im Stroma vorliegt, ist die

Transkriptmenge der NADP‐MDH erhöht, was auf den erhöhten Reduktionsgrad des

PET zurückzuführen ist. Weiter kommt es zur verstärkten Akkumulation von ROS in

den Chloroplasten. Die Detoxifizierung über antioxidative Systeme in den Fd2‐KO‐

Pflanzen verläuft zusätzlich über NTRC und 2‐Cys‐Prx, wobei hierfür bei Bedarf

benötigte Reduktionsäquivalente in den Chloroplasten heterotroph über den OPP

bereitgestellt werden.

Fd2‐KO‐Pflanzen im Hochlicht 3.2Fd2‐KO‐Pflanzen weisen Anpassungen auf, die Schädigungen am Photosyntheseapparat

in Folge einer unkontrollierten Überreduktion der photosynthetischen

Elektronentransportkette vorbeugen (siehe Kapitel 3.1). Trotz dieser Anpassungen ist

der Reduktionsgrad der photosynthetischen Elektronentransportkette erhöht,

Ladungsrekombination am PSI tritt ein und ROS entstehen. Unter moderaten

Bedingungen sind in Folge dessen allerdings keine sichtbaren Schäden an den Fd2‐KO‐

Pflanzen zu beobachten. Die unterschiedlichen Anpassungen in den Fd2‐KO‐Pflanzen

gewährleisten somit deren Vitalität. In Folge dieser Ergebnisse stellt sich zum einen die

Frage, inwieweit der Reduktionsgrad der photosynthetischen Elektronentransportkette

kurzzeitig erhöht werden kann, ohne dass dies zu Schädigungen am

Photosyntheseapparat führt. Um dies zu ermitteln, wurden Fd2‐KO‐Pflanzen, nach einer

Anzucht unter moderaten Bedingungen, einige Stunden im Hochlicht gehalten, um den

photosynthetischen Elektronentransport zu erhöhen und die vorliegende

90 Ergebnisse

Akzeptorlimitierung am PSI zu verschärfen. Zum anderen ist es von Interesse, ob durch

langfristige Anpassungen in den Fd2‐KO‐Pflanzen auch unter extremeren

Anzuchtbedingungen Schädigungen vermieden werden. Hierzu wurden Fd2‐KO‐

Pflanzen im Hochlicht angezogen. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den folgenden

zwei Kapiteln (3.2.1 und 3.2.2) dargestellt.

3.2.1 Kurzzeitakklimation im Hochlicht

Unter moderaten Bedingungen ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den Noe‐WT‐

Pflanzen der Reduktionsgrad der photosynthetischen Elektronentransportkette bereits

deutlich erhöht (siehe Kapitel 3.1.2.2). Im Folgenden wird gezeigt, welche Auswirkungen

eine kurzzeitig verstärkte Reduktion des PET zur Folge hat und inwieweit eine

Kurzzeitakklimation bzw. poising (siehe Kapitel 1.4.1) in diesen Pflanzen stattfinden

kann. Hierzu werden in diesem Kapitel Studien an Fd2‐KO‐ bzw. Noe‐WT‐Pflanzen

vorgestellt, welche acht bis zehn Wochen unter moderaten Bedingungen angezogen

und für einige Stunden unter Hochlicht‐Bedingungen gehalten wurden.

3.2.1.1 Anpassungen im photosynthetischen Elektronentransport

Um den Reduktionsgrad sowie Akklimationsvorgänge am photosynthetischen

Elektronenfluss zu dokumentieren, werden im Folgenden Daten zum

photosynthetischen Elektronenfluss am PSI und PSII sowie CO2‐Assimilationsraten nach

einigen Stunden im Hochlicht vorgestellt. Die hierfür durchgeführten Bestimmungen der

P700‐Absorptionsänderung, der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission und der CO2‐

Assimilationsraten beruhen auf den in Kapitel 3.1.2 beschriebenen Prinzipien.

Detaillierte Angaben zur Methodik dieser Messungen sind in den Kapiteln 2.11, 2.12

sowie 2.13 ausführlich beschrieben.

Unter moderaten Bedingungen ist ΔAP700‐MAX in den Fd2‐KO‐Pflanzen signifikant

reduziert, was im Wesentlichen auf eine verminderte Menge an aktiven Thylakoiden

zurückzuführen ist (siehe Kapitel 3.1.2.1). Nach einer zweistündigen Inkubation im

Hochlicht ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen keine P700‐Absorptionsänderung mehr

festzustellen und ΔAP700‐MAX ist nicht mehr detektierbar (siehe Abb. 3.20).

Im Gegensatz zu den Noe‐WT‐Pflanzen weisen Fd2‐KO‐Pflanzen keine typische

zweiphasige P700‐Oxidationskinetik (siehe Abb. 3.21‐B) auf, sondern ausschließlich eine

verlängerte lag‐Phase, so dass ΔAP700‐MAX prinzipiell negative Werte annehmen würde.

Ergebnisse 91

Abb. 3.20: ΔAP700‐MAX der Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht (HL) und anschließender „Erholung“ unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Für die Messungen wurden die Pflanzen zwei Stunden im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) und danach wieder unter moderaten Bedingungen gehalten. Die Messungen wurden vor der Hochlichtphase (0), direkt danach (2) und anschließend wieder unter moderaten Bedingungen (6, 24 und 74) über insgesamt 74 Stunden durchgeführt. Die Versuche erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Die Blattscheiben wurden vor jeder Messung für 15 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus abhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als treuu gsindikator (n ≥ 3, ± SE). Für Fd2‐KO‐Pflanzen konnte zum Teil (2 und 6 Stunden) kein ΔAP700‐MAX kalkuliert werden (*), hier war keine Oxidation von P700‐Molekülen im NIR zu beobachten.

un S n

Die anhaltende lag‐Phase deutet auf eine verstärkt auftretende Ladungsrekombination

im PSI nach zwei Stunden im Hochlicht hin. Die Oxidation von P700‐Molekülen im NIR

ist allerdings auch nach einer Inkubation mit Methylviologen als alternativem

Elektronenakzeptor am PSI praktisch nicht möglich. Zu erkennen ist lediglich, dass die

lag‐Phase in den Fd2‐KO‐Pflanzen weniger stark ausgeprägt und eine verstärkt

auftretende Ladungsrekombination durch den alternativen Elektronenakzeptor

Methylviologen umkehrbar ist (siehe Abb. 3.21‐B).

In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist ΔAP700‐MAX, nach einer Inkubation für zwei Stunden im

Hochlicht, erst nach 72 Stunden unter moderaten Lichtbedingungen wieder komplett

reversibel (siehe Abb. 3.20). Dies deutet auf eine Neusynthese von PSI‐

Proteinkomplexen hin, welche im Gegensatz zum PSII einige Tage dauert (vgl. Sonoike

et al., 1996). Demnach ist eine Degradation von PSI‐Komplexen, wahrscheinlich in Folge

von Photoinhibition am PSI, die Ursache für die ausbleibende Oxidation der P700‐

Moleküle im NIR nach zwei Stunden im Hochlicht. ZET um PSI sowie

Ladungsrekombination im PSI sind demnach als primäre Ursache auszuschließen.

92 Ergebnisse

In diesem Zusammenhang ist allerdings zu beachten, dass die CO2‐Assimilationsrate in

den Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht nicht signifikant verringert ist

(siehe Abb. 3.22). Trotz des gesteigerten Elektronendrucks in Folge kurzfristig erhöhter

Lichtintensitäten bleibt der Anteil an PSI‐Proteinkomplexen, die Elektronen für die CO2‐

Fixierung im Calvin‐Zyklus liefern, nahezu gleich. Erst nach sechs Stunden im Hochlicht

fällt die CO2‐Assimilationsrate in den Fd2‐KO‐Pflanzen um 41 %.

Abb. 3.21: P700‐Oxidation im NIR von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht mit Methylviologen als alternativem Elektronenakzeptor. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX (A) und die P700‐Oxidationskinetiken im NIR (B) von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Vor der Messung wurden die Pflanzen für zwei Stunden im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) gehalten. Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Die Blattscheiben wurden vor der Messung für fünf Stunden im Dunkeln zum einen in Wasser (‐MV) und zum anderen in 100 µM Methylviologen (+MV) inkubiert. Die gezeigten Daten für ΔAP700‐MAX sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Sta dard ehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE). Die P700‐Oxidationskinetiken sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

n f

Ergebnisse 93

Werden darüber hinaus Parameter der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission am PSII

betrachtet, fällt auf, dass im Vergleich zu den Werten unter moderaten Bedingungen

(siehe Tab. 3.2 in Kapitel 3.1.2.2) sowohl qP als auch ΦII in den Fd2‐KO‐Pflanzen nach

zwei Stunden unter Hochlicht signifikant um 86 % verringert sind (siehe Tab. 3.3). Dies

ist auf einen hohen Reduktionsgrad des PQ‐Pools sowie des primären

Elektronenakzeptor OA im PSII und folglich der kompletten photosynthetischen

Elektronentransportkette zurückzuführen. Ebenso tritt Photoinhibition am PSII auf.

FV/FM ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht mit 0,70 ± 0,01

signifikant geringer als unter moderaten Bedingungen (siehe Tab. 3.3). Photoinhibition

am PSII geht einher mit Photoinhibition am PSI (vgl. Sonoike et al., 1996). Dies bestätigt

die oben beschriebenen Phänomene, wobei die signifikante Reduktion von ΔAP700‐MAX in

den Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht auf Photoinhibition am PSI und

folgende Degradation vom PSI zurückzuführen ist. Nach sechs Stunden im Hochlicht ist

chronische Photoinhibition am PSII zu beobachten, wobei FV/FM auf 0,56 fällt. Ebenso ist

NPQ in den Fd2‐KO‐Pflanzen nun im Vergleich zu moderaten Wachstumsbedingungen

um 79 % erhöht, was auf Photoinhibition am PSII zurückzuführen ist. Da bereits nach

zwei Stunden im Hochlicht der maximale Reduktionsgrad des primären Akzeptors sowie

des PQ‐Pools erreicht ist (sowohl φII als auch qP tendierten gegen Null) ist nach sechs

Stunden chronische Photoinhibition und daraus resultierende Schädigung am PSII‐

Proteinkomplex die Folge. Dies und eine Inaktivierung bzw. Degradation vom PSI führen

zur Verringerung der CO2‐Assimilationsraten in den Fd2‐KO‐Pflanzen (siehe Abb. 3.22).

Abb. 3.22: CO2‐Assimilation von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei bzw. sechs Stunden im Hochlicht. Dargestellt ist die CO2‐Assimilation in den Blättern von Noe‐WT‐ sowie Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die CO2‐Assimilationsraten wurden an Blättern vor (0), nach zwei Stunden (2) und nach sechs Stunden (6) im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C) bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

94 Ergebnisse

In den Noe‐WT‐Pflanzen ist NPQ nach zwei Stunden im Hochlicht signifikant erhöht,

wobei FV/FM mit 0,8 ein nicht photoinhibiertes anzeigt (vgl. Björkmann und Demmig,

1987). Der gesteigerte Anteil NPQ in den Noe‐WT‐Pflanzen ist typisch für eine

kurzzeitige Akklimation im Hochlicht. Es tritt ein erhöhter Protonengradient über die

Thylakoidmembran in Folge eines vermehrten ZETs um PSI auf. Weiter stellt sich eine

zunehmende Reduzierung des primären Akzeptors und des PQ‐Pools ein (ΦII und qP

verringern sich nach zwei Stunden im Hochlicht um 50 bzw. 33 %). Auch dies sind

typische Auswirkungen einer Hochlicht‐Anpassung. Auf Grund der erhöhten

Lichtintensität steigt die CO2‐Assimilationsrate nach zwei Stunden im Hochlicht an.

Demnach werden absolut betrachtet mehr Elektronen für die CO2‐Assimilation

verwendet. Sowohl ZET als auch LET laufen in den Noe‐WT‐Pflanzen unter Hochlicht‐

Bedingungen mit zunehmendem Ausmaß ab. In den Fd2‐KO‐Pflanzen hingegen ist

weder eine signifikante Steigerung des ZET noch des LET in Folge fehlender Fds als

Elektronenakzeptor am PSI festzustellen. Im Gegensatz zu den Fd2‐KO‐Pflanzen, welche

nach einigen Stunden im Hochlicht signifikante Schädigungen der Photosysteme

aufweisen, sind Noe‐WT‐Pflanzen zu diesem Zeitpunkt an das Hochlicht angepasst.

Tab. 3.3: Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter der Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei bzw. sechs Stunden im Hochlicht (HL). Dargestellt sind die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten Parameter von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1

bei 20 °C im Kurztag). Die Pflanzen wurden vor der Messung für zwei bzw. sechs Stunden im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) gehalten. Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) bei einer aktinischen Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Ex

perimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).

Ergebnisse 95

3.2.1.2 CO2‐Assimilation und Photorespiration

In Kapitel 3.1.2.4 wurde anhand von A/Ci‐Kurven (bei 21 % O2) bereits gezeigt, dass

unter moderaten Lichtbedingungen angezogene Fd2‐KO‐Pflanzen einen in Vergleich zu

Noe‐WT‐Pflanzen geringeren Induktionszustand des Photosyntheseapparates

aufweisen. Des Weiteren ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen eine typische Lichtlimitierung

festzustellen, wobei der Mangel an Produkten der Primärreaktion die CO2‐Assimilation

im Calvin‐Zyklus limitiert. Nach zwei Stunden im Hochlicht ist dieser Effekt in

verstärktem Maße zu beobachten. Anhand von A/Ci‐Kurven (bei 21 % O2) sind typische

Anzeichen einer Lichtlimitierung in der Sättigungsphase unter hohen Ci in den Fd2‐KO‐

Pflanzen zu erkennen (siehe Abb. 3.23).

Abb. 3.23: A/Ci‐Kurven von Noe‐WT‐ un Fd2‐KO‐Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht. Dargestellt ist die CO2‐Assimilation in Abhängigkeit zum CO2‐Partialdruck im substomatären Raum (Ci) von Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Pflanzen wurden vor der Messung für zwei Stunden im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) gehalten. Die Messungen wurden direkt an den Blättern der Pflanzen bei einer Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1 durchgeführt. An gleichen Blättern wurden zunächst die CO2‐Assimilationsraten bei 21 % O2 und danach ohne O2 im anliegenden Gasgemisch bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimente mit em Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

d

n d

Sowohl unter geringen als auch unter hohen Ci ist die CO2‐Assimilationsrate geringer als

in den Noe‐WT‐Pflanzen. Die Reduzierung der Assimilationsrate ist dabei nach zwei

Stunden im Hochlicht signifikanter als unter moderaten Bedingungen (siehe

Kapitel 3.1.2.4). Hierbei sind zum einen die Assimilationsraten der Noe‐WT‐Pflanzen

deutlich höher und zum anderen sind die CO2‐Assimilationsraten der Fd2‐KO‐Pflanzen,

vor allem in der Sättigungsphase, geringer als unter moderaten Bedingungen. Die

96 Ergebnisse

Steigung der A/Ci‐Kurve im linearen Bereich in den Noe‐WT‐Pflanzen ist mit

50,23 ± 7,86 nmol CO2 m‐2 s‐1 / µmol CO2 mol‐1 signifikant höher als in den Fd2‐KO‐

Pflanzen mit 19,65 ± 1,34 nmol CO2 m‐2 s‐1 / µmol CO2 mol‐1. Demnach ist der

Induktionszustand des Photosyntheseapparates (siehe Kapitel 3.1.2.4) in den Noe‐WT‐

Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht im Vergleich zu moderaten Bedingungen

um 50 % erhöht. In den Fd2‐KO‐Pflanzen hingegen ist der Induktionszustand nach zwei

Stunden im Hochlicht nicht signifikant verändert. Eine Erhöhung der Lichtintensität

fördert die Steigerung des Induktionszustandes nicht. Es wird deutlich, dass auch nach

zwei Stunden im Hochlicht die Photosyntheserate durch den Mangel an Produkten der

Primärreaktion limitiert bleibt.

Die Erstellung von A/Ci‐Kurven unter O2‐freien Bedingungen (siehe Abb. 3.23)

ermöglicht es, die maximale Carboxylierungsrate der RubisCO zu bestimmen, da

Photorespiration unter diesen Bedingungen nahezu ausgeschlossen werden kann (siehe

Kapitel 3.1.2.4). Der Parameters APR beschreibt den Anteil der apparenten

Photorespiration an der maximalen RubisCO‐Verbrauchsrate (siehe Kapitel 2.13.5 und

Kapitel 3.1.2.4) und gibt somit den Anteil der Photorespiration an der

Photosynthesereaktion an.

Abb. 3.24: Anteil der apparenten Photorespiration an der maximalen RubisCO‐Verbrauchsrate in den Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen nach wei Stunden Hochlicht Dargestellt ist der photoresipratorische Anteil am photosynthetischen Elektronenfluss in Form des Parameters APR in Noe‐WT‐ (durchgezogene Linie mit ausgefüllten Kreisen) und Fd2‐KO‐Pflanzen (gestrichelte Linie mit offenen Kreisen), angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Pflanzen wurden vor der Messung für zwei Stunden im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) gehalten. Die Messungen wurden direkt an den Blättern der Pflanzen durchgeführt und APR wurde aus den A/Ci‐Kurven (siehe Abb. 3.23) kalkuliert. Gemessen wurde bei einer Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

z im

Ergebnisse 97

In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist APR nach zwei Stunden im Hochlicht im Vergleich zu den Noe‐

WT‐Pflanzen sowohl unter geringen als auch bei hohen Ci signifikant gesteigert

(siehe. Abb. 3.24). In der Regel ist unter hohen Ci das Auftreten von Photorespiration

minimal. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist jedoch selbst unter einer hohen Ci ein gesteigerter

Anteil an Photorespiration festzustellen.

Die Fd2‐KO‐Pflanzen sind unter moderaten Wachstumsbedingungen gut an den

Mangel an Elektronenakzeptoren angepasst (siehe Kapitel 3.1). Allerdings weist die

PET nach zwei Stunden einen maximalen Reduktionszustand auf. Dies wiederum

führt zu einer nicht mehr detektierbaren P700‐Absorptionsänderung im NIR,

wahrscheinlich in Folge einsetzender Photoinhibition am und Degradation vom PSI.

Die schon unter moderaten Bedingungen signifikant verringerte CO2‐

Assimilationsrate ist zunächst nicht beeinflusst. Hingegen ist die Limitierung der

Photosyntheserate durch den Mangel an Produkten der Primärreaktion signifikant

stärker ausgeprägt als unter moderaten Bedingungen. Vor allem ist der hohe Anteil

an Photorespiration bemerkenswert, obwohl NADPH als Produkt der Primärreaktion

bereits limitierender Faktor in den Fd2‐KO‐Pflanzen ist. Nach sechs Stunden im

Hochlicht verstärken sich die Anzeichen von chronischer Photoinhibition und

Schädigungen vor allem am PSII. Der maximale Reduktionsgrad der

photosynthetischen Elektronentransportkette wird überschritten, Schädigungen an

den Komponenten der Elektronentransportkette treten auf und die

Photosyntheseraten verringern sich signifikant.

Zusammenfassung – Fd2‐KO‐Pflanzen im Hochlicht (Kapitel 3.2)

3.2.2 Langzeitakklimation im Hochlicht

In den vorangegangenen Kapiteln wurden die Anpassungen von Fd2‐KO‐Pflanzen unter

moderaten Bedingungen sowie die kurzzeitigen Auswirkungen im Hochlicht dargestellt.

Hierbei wird deutlich, dass langfristige Anpassungen unter moderaten Bedingungen zu

einer eingeschränkten, aber vitalen Entwicklung führen. Der maximale Reduktionsgrad

der photosynthetischen Elektronentransportkette wird nicht überschritten. Kurze

„Stresssituationen“ (bis zu sechs Stunden im Hochlicht) dagegen führen zu einer

extremen Überreduktion der photosynthetischen Elektronentransportkette (siehe

Kapitel 3.2.1), so dass es zur chronischen Photoinhibition und daraus folgender

Degradation der Photosysteme kommt. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage,

ob eine Langzeitakklimation in der Entwicklung der Pflanzen einer solchen

Überreduktion des PET vorbeugen kann. Zu diesem Zweck wurden Noe‐WT‐ und Fd2‐

98 Ergebnisse

KO‐Pflanzen zunächst zwei Wochen unter moderaten Bedingungen und anschließend

sechs Wochen im Hochlicht angezogen (siehe Kapitel 2.2). In den folgenden Kapiteln

(3.2.2.1 ‐ 3.2.2.3) werden diese Pflanzen charakterisiert und die Auswirkungen einer

Anzucht im Hochlicht auf die Fd2‐KO‐Pflanzen werden analysiert. Soweit nicht anders

vermerkt, erfolgten die Experimente jeweils nach einer Stunde in der Lichtphase.

3.2.2.1 Phänotyp

Im Hochlicht angezogene Fd2‐KO‐Pflanzen weisen einen ähnlichen Phänotyp auf

(siehe Abb. 3.25), wie die unter moderaten Bedingungen angezogenen Fd2‐KO‐Pflanzen

(siehe Kapitel 3.1.1). Hierbei sind auch im Hochlicht an den Fd2‐KO‐Pflanzen ein um ca.

zwei Wochen verzögertes Wachstum sowie eine im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen

geringere Ausbildung von Blattbiomasse zu detektieren.

Abb. 3.25: Phänotyp der im Hochlicht angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt sind typische im Hochlicht angezogene (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C im Kurztag) Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen (Durchmesser der Töpfe: 5 cm). Die Pflanzen wurden nach der Aussaat zunächst für zwei Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) und dann nach der Vereinzelung für weitere sechs Wochen im Hochlicht kultiviert. Die gezeigten Pflanzen sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Anzuchten.

Nach der Anzucht im Hochlicht sind die Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den

entsprechenden Noe‐WT‐Pflanzen weniger stark pigmentiert. Auch in diesem Falle

zeichnen sich ähnliche Tendenzen ab, wie es unter moderaten Bedingungen der Fall ist

(siehe Kapitel 3.1.1). Sowohl der Gehalt an Chlorophyll als auch Carotinoiden ist

signifikant verringert (siehe Tab. 3.4). Insbesondere ist der Gehalt an Chlb in den Fd2‐

KO‐Pflanzen stark verringert, was auf eine verminderte Akkumulation von LHCs

schließen lässt. Zu beachten ist, dass bei der Anzucht im Hochlicht in den Noe‐WT‐

Pflanzen vermehrt Anthocyane akkumulieren. Anthocyane gehören zur Stoffklasse der

Flavonoide und bilden sich vermehrt in Blättern, die abiotischen Stressbedingungen

Ergebnisse 99

(UV‐Licht, vermindertes Nährstoffangebot und Kälte) ausgesetzt sind (vgl. Winkel‐

Shirley, 2001; Teng et al., 2005; Cominelli et al., 2008; Lillo et al., 2008; Olsen et al.,

2009; Rowan et al., 2009). In den Fd2‐KO‐Pflanzen wird hingegen im Vergleich zu den

Noe‐WT‐Pflanzen ca. 83 % weniger Anthocyan akkumuliert. Die insgesamt verringerte

Pigmentierung in den Fd2‐KO‐Pflanzen im Vergleich zu den WT‐Pflanzen deutet auf

einen verminderten Gehalt an aktiven Thylakoiden hin, was bereits unter moderaten

Bedingungen der Fall war (siehe Kapitel 3.1.2.1).

Tab. 3.4: Physiologische Parameter der im Hochlicht angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Die dargestellten Parameter wurden an Blättern von zunächst für zwei Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) und danach für sechs Wochen im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C im Kurztag) angezogenen Fd2‐KO‐ und Noe‐WT‐Pflanzen bestimmt. Die Mengenangaben der Pigmente beziehen sich auf die Blattfläche. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).

3.2.2.2 Anpassungen im photosynthetischen Elektronentransport

Unter moderaten Anzuchtbedingungen weisen die Fd2‐KO‐Pflanzen signifikante

Anpassungen in Folge einer Akzeptorlimitierung am PSI auf, welche die Pflanze vor einer

zu starken Überreduktion der photosynthetischen Elektronentransportkette und daraus

resultierenden Schädigungen schützen (siehe Kapitel 3.1.2). Eine kurze Inkubation im

Hochlicht führt hingegen zu einer extremen Überreduktion der photosynthetischen

Elektronentransportkette. Schließlich tritt chronische Photoinhibition an den

Photosystemen und folglich eine Degradation ein (siehe Kapitel 3.2.1). Werden Fd2‐KO‐

Pflanzen hingegen sechs Wochen im Hochlicht kultiviert, sind zunächst keine sichtbaren

Schädigungen an den Blättern zu beobachten (siehe Kapitel 3.2.2.1). Es kann also davon

ausgegangen werden, dass langfristige Hochlicht‐Anpassungen einer schädigenden

100 Ergebnisse

Überreduktion der photosynthetischen Elektronentransportkette vorbeugen. Anhand

von P700‐Absorptionsmessungen sowie von Messungen der Chlorophyllfluoreszenz‐

Emission (zur grundlegenden Theorie siehe Kapitel 3.1.2; für Details zur Methodik siehe

Kapitel 2.11 und Kapitel 2.12) wird im Folgenden der Zustand der photosynthetischen

Elektronentransportkette analysiert.

Im Gegensatz zu den Fd2‐KO‐Pflanzen nach einer kurzen Zeit im Hochlicht ist in den

Fd2‐KO‐Pflanzen, welche im Hochlicht angezogen wurden, eine Oxidierung von P700‐

Molekülen im NIR möglich. Im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen ist ΔAP700‐MAX in den

Fd2‐KO‐Pflanzen um 78 % verringert (siehe Abb. 3.26‐A). Dies ist vergleichbar mit der

Reduzierung von ΔAP700‐MAX, die auch unter moderaten Bedingungen in den Fd2‐KO‐

Pflanzen auftritt (siehe Kapitel 3.1.2.1). Vergleichbar ist ebenso die veränderte Kinetik

der P700‐Oxidation im NIR in den im Hochlicht kultivierten Fd2‐KO‐Pflanzen. Eine

schnelle erste Phase der P700‐Oxidierung ist nicht zu detektieren und eine signifikant

verlängerte lag‐Phase tritt ein (siehe Abb. 3.26‐B). Dies lässt auf eine zunehmende

Ladungsrekombination im PSI im Zuge einer Akzeptorlimitierung am PSI schließen.

Abb. 3.26: P700‐Oxidation im NIR von im Hochlicht angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX (A) und die Kinetiken der P700‐Oxidation im NIR (B) von zwei Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) und darauf folgend sechs Wochen im Hochlicht angezogenen (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C im Kurztag) Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten für ΔAP700‐MAX sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE). Die P700‐Oxidationskinetiken sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Ergebnisse 101

Diese vergleichbaren Ergebnisse für Fd2‐KO‐Pflanzen, zum einen unter moderaten

Bedingungen und zum anderen im Hochlicht kultiviert, lassen auf die gleiche Ursache

für das signifikant verringerte ΔAP700‐MAX schließen: eine Verringerung der absoluten

Menge an aktiven Thylakoiden. Dies erklärt auch, wie bereits für Fd2‐KO‐Pflanzen unter

moderaten Bedingungen gezeigt, die insgesamt verringerte Pigmentierung der Fd2‐KO‐

Pflanzen. Schließlich treten auch bei im Hochlicht kultivierten Fd2‐KO‐Pflanzen, wie

bereits für Fd2‐KO‐Pflanzen moderaten Bedingungen beschrieben (siehe Kapitel 3.1.2),

signifikante Anpassungen im photosynthetischen Elektronentransport auf.

Anhand der Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter sind im Hochlicht sowohl für Noe‐WT‐ als

auch für Fd2‐KO‐Pflanzen typische Anzeichen einer Akklimation an erhöhte

Lichtintensitäten zu beobachten. In den aktiven Thylakoiden ist im Vergleich zu den

unter moderaten Bedingungen angezogenen Pflanzen die Elektronentransportrate

signifikant erhöht (siehe Tab. 3.5). Dies führt zu einer verstärkten Reduktion des

primären Elektronenakzeptors QA im PSII, angezeigt durch eine Verringerung von ΦII.

Ebenso ist ein erhöhter Protonengradient über die Thylakoidmembran, angezeigt durch

gesteigerten NPQ, eine Folge des verstärkten Elektronenflusses. Im Vergleich zu den

Pflanzen unter moderaten Bedingungen belegen die Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter

einen im Hochlicht zunehmenden Reduktionsgrad der photosynthetischen

Elektronentransportkette. Zu beachten ist hierbei, dass die Auswirkung der Anzucht im

Hochlicht auf den photosynthetischen Elektronenfluss in den Fd2‐KO‐Pflanzen

signifikanter ist als unter moderaten Bedingungen. So weisen die Fd2‐KO‐Pflanzen im

Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen eine um 50 % geringere Elektronentransportrate, um

50 % geringere Quantenausbeuten am PSII sowie 50 % weniger photochemische

Fluoreszenzlöschung auf. Bei der Anzucht unter moderaten Bedingungen sind diese

Parameter in den Fd2‐KO‐Pflanzen nur um jeweils ca. 30 % verringert. Dies deutet auf

einen signifikant erhöhten Reduktionsgrad der photosynthetischen

Elektronentransportkette nach einer Anzucht im Hochlicht in den Fd2‐KO‐Pflanzen

verglichen mit den entsprechenden Noe‐WT‐Pflanzen hin. In Folge dessen kommt es

auch verstärkt zur Photoinhibition am PSII, da sich eine signifikante Verringerung von

FV/FM einstellt. Weiter ist sowohl in Noe‐WT‐ als auch in Fd2‐KO‐Pflanzen auch ein

erhöhter Anteil NPQ verglichen mit dem unter moderaten Bedingungen zu detektieren.

Ein im Vergleich zum Noe‐WT‐ unter Hochlicht erhöhten NPQ in den Fd2‐KO‐Pflanzen ist

hingegen nicht der Fall. Wie bereits unter moderaten Anzuchtbedingungen ist in den

Fd2‐KO‐Pflanzen in Folge der stromalen Akzeptorlimitierung kein erhöhter

Protonengradient über die Thylakoidmembran zu detektieren. Da NPQ neben qE auch

signifikant durch qI bestimmt ist (siehe Kapitel 3.1.2.2), ist davon auszugehen, dass bei

102 Ergebnisse

auftretender Photoinhibition am PSII in den Fd2‐KO‐Pflanzen nach der Anzucht im

Hochlicht ein im Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen verringerter Protonengradient

generiert wird. Bei einem vergleichbaren Gradienten würde auftretende

Photoinhibition am PSII NPQ signifikant erhöhen.

Tab. 3.5: Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter von im Hochlicht angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt sind die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten Parameter von zunächst zwei Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) und darauf folgend sechs Wochen im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C im Kurztag) angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) bei einer aktinischen Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).

ΦII qP NPQ ETR Fv/Fm qL

Noe‐WT 0,52 ± 0,02 0,95 ± 0,02 0,79 ± 0,03 207 ± 6 0,75 ± 0,01 1,09 ± 0,07

Fd2‐KO 0,23 ± 0,02 0,49 ± 0,05 0,77 ± 0,03 91 ± 8 0,70 ± 0,01 0,58 ± 0,05


Noe‐WT 0,52 ± 0,02 0,95 ± 0,02 0,79 ± 0,03 207 ± 6 0,75 ± 0,01 1,09 ± 0,07

Fd2‐KO 0,23 ± 0,02 0,49 ± 0,05 0,77 ± 0,03 91 ± 8 0,70 ± 0,01 0,58 ± 0,05


Unter moderaten Bedingungen ist die CO2‐Assimilationsrate in den Fd2‐KO‐Pflanzen in

Folge der Akzeptorlimitierung am PSI verringert. Anhand von Lichtsättigungskurven wird

zudem deutlich, dass in Folge erhöhter Lichtintensitäten die Elektronentransportrate

und damit einhergehend die CO2‐Assimilationsrate gesteigert ist (siehe Kapitel 3.1.2.4).

Dies ist zunächst auch bei den unter moderaten Bedingungen angezogenen Fd2‐KO‐

Pflanzen nach zwei Stunden im Hochlicht zu beobachten (siehe Kapitel 3.2.1.1). Obwohl

die photosynthetische Elektronentransportkette einen erhöhten Reduktionszustand

aufweist, geht mit kurzfristig erhöhten Lichtintensitäten auch eine gesteigerte CO2‐

Assimilation einher. Dies ist auch bei im Hochlicht angezogenen Fd2‐KO‐Pflanzen der

Fall. Wie in Kapitel 3.2.2.2 beschrieben, ist der Reduktionszustand der

photosynthetischen Elektronentransportkette der im Hochlicht angezogenen Fd2‐KO‐

Pflanzen im Vergleich zu den moderaten Bedingungen signifikant erhöht, so dass erste

Anzeichen von Photoinhibition am PSII auftreten. Die CO2‐Assimilationsrate ist hingegen

in Folge der erhöhten Elektronentransportrate ebenfalls signifikant höher als unter

moderaten Bedingungen (siehe Abb. 3.27).

Ergebnisse 103

Bezogen auf die im Hochlicht angezogenen Noe‐WT‐Pflanzen ist die Photosyntheserate

bei den entsprechenden Fd2‐KO‐Pflanzen hingegen um 47 % verringert. Dies entspricht

in etwa dem Verhältnis, welches auch unter moderaten Bedingungen zwischen

Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen auftritt (siehe Kapitel 3.1.2.3). Diese Daten belegen die

Aussage, dass die Kapazität der Photosynthesereaktion unter moderaten Bedingungen

nicht ausgeschöpft ist und kurzzeitig erhöhte Lichtintensitäten (siehe

Lichtsättigungskurven in Kapitel 3.1.2.4 sowie die Versuche nach einigen Stunden im

Hochlicht in Kapitel 3.2.1) auch eine erhöhte CO2‐Assimilation zur Folge haben. In

Anbetracht der Tatsache, dass bei im Hochlicht angezogenen Fd2‐KO‐Pflanzen

Photoinhibition am PSII auftritt, ist davon auszugehen, dass unter diesen Bedingungen

der maximale Reduktionsgrad der photosynthetischen Elektronentransportkette und

damit einhergehend der Photosynthese erreicht ist.

Abb. 3.27: CO2‐Assimilation der im Hochlicht angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Dargestellt ist die Rate der CO2‐Assimilation von zunächst zwei Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) und darauf folgend sechs Wochen im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C im Kurztag) angezogenen Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Die CO2‐Assimilationsraten wurden an Blättern nach einer Stunde in der Lichtphase bei einer Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1 bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

Im Hochlicht angezogene Fd2‐KO‐Pflanzen weisen verringerte Mengen an aktiven

Thylakoiden auf. Der Reduktionsgrad des PET ist signifikant höher als unter

moderaten Bedingungen. Dies und die verringerte Fähigkeit, einen

Protonengradienten über die Thylakoidmembran zu generieren, führen zu ersten

Anzeichen von Photoinhibition am PSII. Im Gegensatz dazu sind die Fd2‐KO‐Pflanzen

im Zuge Ihrer Entwicklung an das Hochlicht akklimatisiert und weisen eine höhere

Photosyntheserate als unter moderaten Bedingungen auf. Dies stellt einen

signifikanten Unterschied zu den Fd2‐KO‐Pflanzen dar, die nur kurze Zeit im Hochlicht

standen (siehe Kapitel 3.2.1), wobei es in Folge des signifikant erhöhten

Reduktionsgrades des PET zur Degradation vom PSI kommt.

Zusammenfassung – Langzeitakklimation im Hochlicht (Kapitel 3.2.2)

104 Ergebnisse

Charakterisierung der alternativen Fd‐Isoform FdC1 3.3

In A. thaliana sind bis dato zwei photosynthetisch aktive Fd‐Isoformen beschrieben, Fd1

und Fd2 (siehe Kapitel 1.2.2) sowie Hanke et al., 2004; Hanke und Hase, 2008). Neben

der Wurzel‐Isoform, Fd3 (AGI‐Code: At2g27510), und einer Fd3‐ähnlichen Isoform, Fd4

(AGI‐Code: At5g10000), sind im Genom von A. thaliana zusätzlich zwei weitere Fd‐

ähnliche Peptide codiert (vgl. Hanke et al., 2004), die bislang nicht genauer

charakterisiert wurden. In unveröffentlichten Untersuchen wird das Genprodukt von

At1g14890 als Ferredoxin C1 (FdC1) und von At1g32550 als Ferredoxin C2 (FdC2)

bezeichnet (Hanke, unpubl.). Diese Bezeichnung beruht auf einer C‐terminalen

Verlängerung der AS‐Sequenz gegenüber den bis dato beschriebenen Fd‐Isoformen in

A. thaliana (siehe Kapitel 3.3.1).

Fd2‐KO Noe‐WT0

5

10

15

Fd2‐KO Noe‐WT0

5

10

15

UBQ10

FdC1

Fd2‐KO Noe‐WT

FdC2

A B

Expression

niveau

[ % UBQ

10]

FdC1

FdC2

Fd2‐KO Noe‐WT0

5

10

15

Fd2‐KO Noe‐WT0

5

10

15

UBQ10

FdC1

Fd2‐KO Noe‐WT

FdC2

A B

Expression

niveau

[ % UBQ

10]

FdC1

FdC2

Abb. 3.28: Expressionsniveau der Fd‐ähnlichen Proteine FdC1 und FdC2 in Noe‐WT‐ und Fd2‐KO‐Pflanzen. Der Gehalt an FdC1 bzw. FdC2 in Noe‐WT‐ sowie Fd2‐KO‐Pflanzen wurde mittels RT‐PCR bestimmt. Hierfür wurden die Pflanzen neun Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1bei 20 °C im Kurztag) kultiviert. Für die RT‐PCR Analysen wurden spezifische Primer für FdC1, FdC2 und UBQ10 als housekeeping‐gene verwendet. Dargestellt ist ein typisches Beispiele der RT‐PCR Produkte im Agarosegel (A) sowie eine auf UBQ10 bezogenen prozentuale Auswertung der RT‐PCR Produkte (B), wobei UBQ10 jeweils als 100 % festgelegt wurde. Die dargestellten Agarosegele sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten mit jeweils zwei aufgetragenen Proben. Die gezeigte prozentuale Auswertung sind arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

In den Fd2‐KO‐Pflanzen wird unter moderaten Bedingungen die zweite

photosynthetisch aktive Isoform nicht vermehrt akkumuliert (siehe Kapitel 3.1). Mit

einem knock‐out von Fd2 sind demnach ca. 90 % der photosynthetisch relevanten Fds

im Blatt nicht exprimiert bzw. translatiert. Obwohl diverse Anpassungen in den Fd2‐KO‐

Pflanzen in Folge von fehlenden Elektronenakzeptoren am PSI stattfinden, wirft dieser

Ergebnisse 105

4,1661911,08103Fdc1

3,8452210,4197Fd2

3,9152110,5497Fd1

theoretischerpI

Negativ geladene AS‐Reste

Positiv geladene AS‐Reste

Molekulargewicht[kDA]

AS‐Reste

massive Mangel die Frage nach alternativen Akzeptoren am PSI auf. In den Fd2‐KO‐

Pflanzen sind die Fd‐ähnlichen Peptide FdC1 und FdC2 im Blatt vermehrt exprimiert

(siehe Abb. 3.28). Fastabend (2006) zeigte zudem eine verstärkte Zunahme des

Expressionsniveau von FdC1 im Hochlicht.

In den folgenden Kapiteln werden Teile einer grundsätzlichen Charakterisierung von

FdC1 dargestellt, welche zusammen mit unveröffentlichten Ergebnissen (Hanke,

unpubl.) FdC1 als alternative photosynthetische Fd‐Isoform mit möglicherweise

speziellen Funktionen charakterisieren. Die für die Versuche verwendeten Pflanzen

wurden, soweit nicht anders vermerkt, neun Wochen unter moderaten Bedingungen

(siehe Kapitel 2.2) angezogen.

3.3.1 Bioinformatische Einordnung von FdC1

Das für FdC1 codierende Gen At4g14890 weist in seiner genomischen Sequenz, wie es

auch für At1g10960 (Fd1) und At1g60950 (Fd2) der Fall ist, keine Introns auf (siehe

http://www.arabidospsis.org). Das komplett translatierte Protein hat eine Länge von

154 AS‐Resten. Analysen der Primärstruktur von FdC1 mit dem Programm ChloroP

(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/index.html) deuten mit einer hohen

Wahrscheinlichkeit (Score: 0,570) auf eine Lokalisation im Chloroplasten bei einer Länge

des Transidpeptids von 56 AS hin. Verglichen mit den Primärsequenzen von Fd1 und Fd2

wird deutlich, dass das Transidpeptid wahrscheinlich 51 AS‐Reste lang ist, da die

Positionen 52 – 55 hoch konserviert vorliegen und im nativen Protein für Fd1 und Fd2

vorhanden sind. Das demnach aus 103 AS bestehende native Protein FdC1 weist nahezu

identische theoretische Eigenschaften auf, wie es für Fd1 bzw. Fd2 der Fall ist

(siehe Tab. 3.6).

4,1661911,08103Fdc1

3,8452210,4197Fd2

3,9152110,5497Fd1

theoretischerpI

Negativ geladene AS‐Reste

Positiv geladene AS‐Reste

Molekulargewicht[kDA]

AS‐Reste

Tab. 3.6: Theoretische Peptideigenschaften von Fd1, Fd2 und FdC1. Dargestellt sind die theoretisch anhand der Primärsequenz kalkulierten Eigenschaften der Proteine Fd1, Fd2 und FdC1. Die Simulation wurde anhand der Primärsequenz der nativen Proteine mit dem Programm ProtParam (http://www.expasy.org/cgi‐bin/protparam) durchgeführt.

http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/index.html

106 Ergebnisse

Abb. 3.29: Alignment photosynthetischer Fd‐ und FdC1‐Isoformen. Dargestellt sind die Proteinsequenzen ausgewählter Fd‐ und FdC1‐Isoformen aus verschiedenen höheren Pflanzen, Algen und Cyanobakterien. Die Sequenzen stammen aus der NCBI‐Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) und wurden mit ClustalW aligned (www.ebi.ac.uk/Tools/clustalW2/index.html). Die AS‐Reste, die zu mehr als 50 % konserviert vorliegen, sind für alle dargestellten Fd‐Isoformen (weiß mit schwarzem Hintergrund), für die dargestellten typischen photosynthetischen Fd‐Isoformen (weiß auf grauem Hintergrund) und für die argestellten FdC1‐Isoformen (schwarz auf grauem Hintergrund) entsprechend hervorgehoben. Abkürzungen: PETF: Fd‐Isoform des PET; AtFd2: Fd2 aus A. thaliana.

d

Ergebnisse 107

Eine Funktion von FdC1 als Elektronenakzeptor am PSI erscheint demnach als möglich.

Die Analyse der Primärsequenz mit ProtParam (http://www.expasy.org/cgi‐

bin/protparam) zeigt allerdings für FdC1 zusätzlich eine Instabilität auf, was für die

übrigen Fd‐Isoformen sowie für FdC2 nicht der Fall ist. Diese Instabilität des Proteins

konnte auch in‐vitro am rekombinanten Protein beobachtet werden (Hanke, unpubl.).

FdC1 zeigt eine ausreichend hohe Sequenzähnlichkeit zu den klassischen Fd‐Isoformen,

so dass von der Bildung eines [2F‐2S]‐Zentrums ausgegangen werden kann

(siehe Abb. 3.29). Zu beachten ist jedoch, dass FdC1 eine höhere Homologie zu Fd‐

Isoformen mit C‐terminaler Sequenzerweiterung in anderen höheren Pflanzen sowie zu

Fd‐ähnlichen Proteinen in Cyanobakterien aufweisen als zu den photosynthetischen

sowie nicht‐photosynthetischen Fd‐Isoformen in A. thaliana (siehe Abb. 3.30).

Abb. 3.30: Phylogenetischer Stammbaum photosynthetischer Fd‐ und FdC1‐Isoformen. Dargestellt ist ein phylogenetischer Stammbaum verschiedener typischer photosynthetischer Fd‐ und FdC1‐Isoformen aus höheren Pflanzen, Algen und Cyanobakterien. Der Stammbaum wurde aus dem Aligment der Proteinsequenzen (siehe Abb. 3.29) mit der Software Phylodendron (http://iubio.bio.indiana.edu/treeapp/treeprint‐form.html) erstellt.

108 Ergebnisse

Der phylogenetische Zusammenhang der Fd‐Isoformen in höheren Pflanzen und

Cyanobakterien ist in Abb. 3.30 anhand eines Stammbaums dargestellt. Die hierbei

relevanten konservierten AS‐Reste sind im Alignment in Abb. 3.29 grau hinterlegt. Die

phylogenetisch am engsten mit FdC1 verwandten Fd‐Isoformen anderer höherer

Pflanzen sowie Fd‐ähnliche Proteine aus Cyanobakterien weisen ausnahmslos eine

C‐terminale Sequenzerweiterung auf. Diese C‐terminale Sequenzerweiterung, welche

auf Struktur sowie Funktion eines Proteins großen Einfluss hat (vgl. Bertini et al., 2002),

ist der Anlass die zwei Fd‐ähnlichen Proteine in A. thaliana als FdC1 sowie FdC2 zu

bezeichnen (s. o.).

3.3.2 Lokalisationsstudien

Aus einem Abgleich der Internet‐Datenbanken Genevestigator

(http://www.genevestigator.com) und Weigelworld (http://www.weigelworld.org)

resultiert die vorrangige Expression von FdC1 in photosynthetischem Gewebe,

allerdings in deutlich geringerem Ausmaß als dies für die klassischen

photosynthetischen Fd‐Isoformen Fd1 und Fd2 der Fall ist. Zusätzliche bioinformatische

Analysen der Sequenz des Präproteins von FdC1 und die Homologie zu den Fd‐ähnlichen

Proteinen in Cyanobakterien machen eine Lokalisation im Chloroplasten sehr

wahrscheinlich (siehe Kapitel 3.3.1).

Abb. 3.31: FdC1‐Lokalisationsstudien mittels GFP‐Fluoreszenzmikroskopie. Dargestellt sind Protoplasten aus A. thaliana, welche zuvor mit dem FdC1‐GFP Fusionsprotein transformiert wurden. Die Lokalisation von FdC1 wurde anhand der GFP‐Fluoreszenz im konfokalen Laser Scanning Mikroskop sichtbar gemacht. Die Chlorophyll‐Autofluoreszenz wird in rot und die FdC1‐GFP Fluoreszenz in grün dargestellt. Zusätzlich wurden die Signale der Chlorophyll‐Autofluoreszenz mit denen der FdC1‐GFP Fluoreszenz überlagert und der DIC (differential interference contrast) dargestellt. Die gezeigten Bilder sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Um die vermutete Lokalisation in den Chloroplasten abzusichern, wurden FdC1‐GFP

Fusionsproteine erstellt und über einen Vektor in isolierte Protoplasten von A. thaliana

transformiert (siehe Kapitel 2.15.1). In Abb. 3.31 ist zu sehen, dass das Fusionsprotein

Ergebnisse 109

eindeutig in den Chlorplasten lokalisiert ist. Die Chlorophyll‐Autofluoreszenz und das

GFP‐Signal überlagern sich. Diese Tatsache beweist die chloroplastidären Lokalisation

von FdC1 und stützt die These, dass FdC1 eine alternative photosynthetisch aktive Fd‐

Isoform darstellen und als Elektronenakzeptor am PSI fungieren kann.

3.3.3 Die Funktion von FdC1 im photosynthetischen Elektronentransport

In den vorangegangenen Kapiteln wurde gezeigt, dass FdC1 als möglicher

Elektronenakzeptor am PSI wahrscheinlich ist. Die signifikant gesteigerte Expression von

FdC1 im photosynthetisch aktiven Gewebe der Fd2‐KO‐Pflanzen ist ein Hinweis auf eine

wichtige Funktion von FdC1 im photosynthetischen Elektronentransport bei

auftretender stromaler Akzeptorlimitierung. Bis dato unveröffentlichte in‐vitro

Untersuchungen belegen, dass natives FdC1 Elektronen von PSI akzeptiert, allerdings

nicht mittels FNR auf NADP+ übertragen kann (Hanke, unpubl.). Dies schließt FdC1 als

alternativen Elektronenakzeptor am PSI für den linearen Transport von Elektronen auf

NADP+ aus. Im Folgenden sind Ergebnisse dargestellt, die eine Funktion von FdC1 im ZET

um PSI sowie in der Photorespiration aufklären sollen. Hierzu wurden zwei FdC1‐RNAi‐

Linien (A. thaliana, Ökotyp Columbia – siehe Kapitel 2.2) verwendet, die eine im

Vergleich zu den entsprechenden WT‐Pflanzen (Col‐WT) um mehr als 50 % verringerte

Transkript‐ sowie Proteinmenge an FdC1 aufweisen (Hanke, unpubl.).

In den Fd2‐KO‐Pflanzen könnte Fd1 den Mangel an Fd2 zum Teil kompensieren und den

LET auf NADP+ gewährleisten. In diesem Falle könnte postuliert werden, dass FdC1 im

Fd‐abhängigen ZET um PSI als Elektronenakzeptor bzw. ‐donor fungiert (siehe hierzu

auch Kapitel 3.4). Die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten

Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter (siehe Kapitel 3.1.2.2 für eine theoretische und

Kapitel 2.12 für eine methodische Beschreibung) zeigen auf, dass in den

unterschiedlichen Linien der FdC1‐RNAi‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen NPQ

geringfügig erhöht ist (siehe Tab. 3.7). Dies ist auch im Experiment unter kurzzeitig

erhöhten Lichtbedingungen (800 µE m‐2 s‐1 aktinisches Licht) zu beobachten. Gleichzeitig

ist weder Photoinhibition am PSII (FV/FM ist in den FdC1‐RNAi‐Pflanzen im Vergleich zu

den Col‐WT‐Pflanzen nicht signifikant verändert) noch ein erhöhter Reduktionsgrad des

PQ‐Pools festzustellen (qP ist in den FdC1‐RNAi‐Pflanzen im Vergleich zu den Col‐WT‐

Pflanzen nicht signifikant verändert). In den FdC1‐RNAi‐Pflanzen ist demnach kein

signifikant verringerter ZET, auch nach kurzer Zeit im Hochlicht, zu detektieren. Der

leicht erhöhte Protonengradient über die Thylakoidmembran, angezeigt durch eine

110 Ergebnisse

Erhöhung von NPQ in den FdC1‐RNAi‐Pflanzen, deutet vielmehr auf eine zunehmende

Induktion des ZET hin.

Die Ergebnisse der Messungen zur Chlorophyllfluoreszenz‐Emission belegen allerdings,

dass ein Mangel an FdC1 Anpassungen im photosynthetischen Elektronentransport zur

Folge hat. Es treten Anzeichen einer Lichtakklimation im Zuge einer Akzeptorlimitierung

auf, welche in einem erhöhten Protonengradienten über die Thylakoidmembran sowie

einer Verringerung des Elektronenflusses und geringfügig erhöhten Reduktionsgrad des

primären Elektronenakzeptors resultieren. Diese Anpassungen indizieren demnach eine

wichtige Funktion von FdC1 als stromaler Elektronenakzeptor im photosynthetischen

Elektronentransport.

Tab. 3.7: Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter von Col‐WT‐ und FdC1‐RNAi‐Pflanzen. Dargestellt sind die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten Parameter von Col‐WT‐ und FdC1‐RNAi‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) bei einer aktinischen Lichtintensität von zunächst 150 µE m‐2 s‐1 und darauf folgend von 800 µE m‐2 s‐1. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 ‐ 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).


150 µEm‐2 s‐1

Col‐WT 0,61 ± 0,04 0,91 ± 0,03 0,34 ± 0,05 46 ± 3 0,75 ± 0,02 0,94 ± 0,01

FdC1‐RNAi‐1 0,56 ± 0,03 0,89 ± 0,02 0,4 ± 0,02 42 ± 2 0,74 ± 0,02 0,96 ± 0,01

FdC1‐RNAi‐2 0,57 ± 0,01 0,91 ± 0,02 0,44 ± 0 43 ± 0 0,74 ± 0,01 0,96 ± 0,01

800 µEm‐2 s‐1

Col‐WT 0,39 ± 0,03 0,76 ± 0,02 0,94 ± 0,08 157 ± 11 0,75 ± 0,02 0,96 ± 0,03

FdC1‐RNAi‐1 0,34 ± 0,04 0,71 ± 0,03 1,01 ± 0,04 137 ± 15 0,74 ± 0,02 0,9 ± 0,04

FdC1‐RNAi‐2 0,37 ± 0,01 0,76 ± 0,04 0,99 ± 0,08 148 ± 5 0,74 ± 0,01 0,93 ± 0,02


150 µEm‐2 s‐1

Col‐WT 0,61 ± 0,04 0,91 ± 0,03 0,34 ± 0,05 46 ± 3 0,75 ± 0,02 0,94 ± 0,01

FdC1‐RNAi‐1 0,56 ± 0,03 0,89 ± 0,02 0,4 ± 0,02 42 ± 2 0,74 ± 0,02 0,96 ± 0,01

FdC1‐RNAi‐2 0,57 ± 0,01 0,91 ± 0,02 0,44 ± 0 43 ± 0 0,74 ± 0,01 0,96 ± 0,01

800 µEm‐2 s‐1

Col‐WT 0,39 ± 0,03 0,76 ± 0,02 0,94 ± 0,08 157 ± 11 0,75 ± 0,02 0,96 ± 0,03

FdC1‐RNAi‐1 0,34 ± 0,04 0,71 ± 0,03 1,01 ± 0,04 137 ± 15 0,74 ± 0,02 0,9 ± 0,04

FdC1‐RNAi‐2 0,37 ± 0,01 0,76 ± 0,04 0,99 ± 0,08 148 ± 5 0,74 ± 0,01 0,93 ± 0,02

In den Fd2‐KO‐Pflanzen tritt vor allem nach zwei Stunden im Hochlicht ein signifikant

erhöhter Anteil an Photorespiration auf (siehe Kapitel 3.2.1.1). Zusammen mit der

erhöhten Expression von FdC1 in den Fd2‐KO‐Pflanzen, vor allem im Hochlicht (vgl.

Fastabend, 2006), scheint eine Funktion von FdC1 im Metabolismus der

Photorespiration möglich. Hierbei könnte FdC1 Elektronendonator für die Fd‐abhängige

Glutamat‐Synthase in den Chloroplasten sein. Bei dieser in den Chloroplasten

Ergebnisse 111

lokalisierten Reaktion des photorespiratorischen Metabolismus wird Glutamat aus α‐

Ketogluterat und Glutamin regeneriert.

Abb. 3.32: A/Ci‐Kurven von Col‐WT‐ und FdC1‐RNAi‐1‐Pflanzen. Dargestellt ist die Rate der CO2‐Assimilation in Abhängigkeit vom CO2‐Partialdruck im substomatären Raum (Ci) von Col‐WT‐ und FdC1‐RNAi‐1‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen wurden direkt an den Blättern der Pflanzen bei einer Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1 durchgeführt. An gleichen Blättern wurden zunächst die CO2‐Assimilationsraten bei 21 % O2 und danach ohne O2 im anliegenden Gasgemisch bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

Die Anzeichen einer Akzeptorlimitierung in den FdC1‐RNAi‐Pflanzen und ein

möglicherweise erhöhter ZET (s. o.) könnten in Folge einer verringerten

photorespiratorischen Aktivität auftreten.

Abb. 3.33: Anteil der apparenten Photorespiration an der maximalen RubisCO‐Verbrauchsrate in den Col‐WT‐ und FdC1‐RNAi‐1‐Pflanzen. Dargestellt ist der photoresipratorische Anteil am photosynthetischen Elektronenfluss in Form des Parameters APR in Col‐WT‐ (gefüllte Kreise) und Fd1‐RNAi‐1 Pflanzen (offene Kreise), angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen wurden direkt an den Blättern der Pflanzen durchgeführt und APR wurde aus den A/Ci‐Kurven (siehe Abb. 3.32) nach in Kapitel 2.13.5 dargestellter Methode kalkuliert. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

112 Ergebnisse

Anhand von A/Ci‐Kurven (siehe Abb. 3.32) unter „normalen“ (21 % O2) sowie unter

nicht‐photorespiratorischen Bedingungen (ohne O2) sind keine signifikanten

Unterschiede in den CO2‐Assimilationsraten der FdC1‐RNAi‐ und der entsprechenden

Col‐WT‐Pflanzen zu detektieren. Der photorespiratorische Anteil, gemessen in APR

(siehe Kapitel 2.13.5 und Kapitel 3.1.2.4), ist in den FdC1‐RNAi‐Pflanzen sogar leicht

erhöht (siehe Abb. 3.33).

Die in den Chloroplasten lokalisierte alternative Fd‐Isoform FdC1 kommt als

Elektronendonator im LET auf Grund der verringerten Affinität zur FNR nicht in Frage.

In den FdC1‐RNAi‐Pflanzen ist weder ein verringerter Anteil an ZET noch ein

verringerter Anteil an Photorespiration zu beobachten. Eine photosynthetische Rolle

von FdC1 in diesen Stoffwechselwegen scheint demnach unwahrscheinlich. Auch auf

Grund der möglichen Redundanz der Fd‐Isoformen in A. thaliana ist eine klare

Aussage in Bezug auf eine Funktion von FdC1 im ZET bzw. der Photorespiration

schwierig (siehe Kapitel 4.3).

Zusammenfassung – Die alternative Fd‐Isoform FdC1 (Kapitel 3.3)

Fd1‐KO‐Pflanzen als Modell zur Aufklärung unterschiedlicher Funktionen photosynthetischer Fd‐Isoformen

3.4

In den Fd2‐KO‐Pflanzen werden ca. 90 % der Blatt‐Fds nicht exprimiert bzw. translatiert.

Eine vermehrte Synthese von Fd1 in Folge dessen tritt nicht ein (siehe Kapitel 3.1). Trotz

des massiven Mangels an Blatt‐Fds sind die Pflanzen vital und können photoautotroph

wachsen. Dies deutet auf eine redundante Funktion von Fd1 in den Fd2‐KO‐Pflanzen

hin, wobei Fd1 als Elektronenakzeptor am PSI fungiert und Elektronen auf FNR

überträgt. Die hierbei geringen Mengen an Fd1 führen zu einer Akzeptorlimitierung am

PSI und dem daraus resultierenden Phänotyp der Fd2‐KO‐Pflanzen (siehe Kapitel 3.1.1).

Die Ergebnisse von Hanke et al. (2004) stützen die Hypothese der Redundanz von Fd1

und Fd2, wobei beide Fd‐Isoformen eine vergleichbare Affinität zur FNR besitzen. In

diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, warum mit Fd1 eine redundante Blatt‐Fd

Isoform existiert, welche einen Mangel an Fd als Elektronenakzeptor jedoch nur zum

Teil ausgleichen kann. Eine zusätzliche, spezifische Funktion der unterschiedlichen Blatt‐

Fd Isoformen im PET ist daher anzunehmen. In A. thaliana wurden anhand von Fd1‐

RNAi‐Pflanzen Hinweise gefunden, die eine spezifische Funktion von Fd1 als

Elektronendonator bzw. ‐akzeptor im Fd‐abhängigen ZET um PSI aufzeigen (vgl. Hanke

und Hase, 2008).

Ergebnisse 113

Abb. 3.34: Knock‐Out Screening homozygoter Fd1‐KO‐Pflanzen. Mittels RT‐PCR‐Analyse wurden putative homozygote Fd1‐KO‐Pflanzen (GT150) auf ein Fd1‐Transkript überprüft. Die Pflanzen wurden für neun Wochen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag) angezogen. Für die RT‐PCR Analysen wurden spezifische Primer für Fd1 verwendet. Als Kontrollen wurde zusätzlich mit spezifischen Primern für Fd2 und UBQ10 gearbeitet. Als zusätzliche Positiv‐Kontrolle wurde cDNA einer Col‐WT‐Pflanze verwendet. Die Linien GT150‐8.1 sowie GT150‐8.2 wurden als Fd1‐KO‐Pflanzen identifiziert.

In den folgenden Kapiteln werden Ergebnisse dargestellt, die eine spezifische Funktion

von Fd1 im Fd‐abhängigen ZET um PSI belegen und weiter verdeutlichen. Hierzu wurden

knock‐out Mutanten der Art A. thaliana Ökotyp Landsberg erecta mit einer

homozygoten T‐DNA‐Insertion (Fd1‐KO) im Gen At1g10960, codierend für Fd1

(siehe Abb. 3.34), als Modellorganismen im Vergleich zu den entsprechenden Lae‐WT‐

Pflanzen verwendet (siehe Kapitel 2.2).

3.4.1 Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Anzuchtbedingungen

In C3‐Pflanzen nimmt der ZET vor allem unter Stressbedingungen eine wichtige Funktion

ein (vgl. Johnson, 2005). Um eine möglichst umfassende funktionelle Einordnung von

Fd1 in diesem Zusammenhang vornehmen zu können, wird im Rahmen dieses Kapitels

zunächst die Charakterisierung der Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen

vorgestellt. Soweit nicht anders vermerkt, wurden die Pflanzen für acht Wochen unter

moderaten Bedingungen (siehe Kapitel 2.2) angezogen. Die Messungen erfolgten

jeweils nach drei Stunden in der Lichtphase.

114 Ergebnisse

3.4.1.1 Phänotyp

Fd1‐KO‐Pflanzen weisen in den ersten drei Wochen nach der Aussaat unter moderaten

Bedingungen kein signifikant beeinträchtigtes Wachstum auf. Ebenso ist die

Morphologie der Blätter unverändert (siehe Abb. 3.35‐A). Ältere Fd1‐KO‐Pflanzen (fünf

Wochen nach der Aussaat) sind im Gegensatz zu den Lae‐WT‐Pflanzen im Wachstum

inhibiert (siehe Abb. 3.35‐B). In späteren Stadien (acht bis zehn Wochen nach der

Aussaat) kommt es zu Nekrosenbildung und schließlich zum Absterben der betroffenen

Blätter (siehe Abb. 3.35‐C). Detaillierte Pigmentanalysen (siehe Tab. 3.8) belegen eine

insgesamt verringerte Pigmentierung der Fd1‐KO‐Pflanzen, wobei der Chlorophyllgehalt

um 37 %, der Carotinoidgehalt um 36 % und der Gehalt an Anthocyanen um 38 %

gleichermaßen reduziert sind. Diese Tatsache deutet auf einen verminderten Gehalt an

Elementen des Photosyntheseapparates, wie Photosysteme und LHCs, hin. Möglich ist

auch ein verminderter Gehalt an aktiven Thylakoiden, wie es in den Fd2‐KO‐Pflanzen

der Fall ist (siehe Kapitel 3.1.2.1).

Insgesamt wird anhand der verminderten Pigmentierung sowie des eingeschränkten

Wachstums der Fd1‐KO‐Pflanzen deutlich, dass ein knock‐out von Fd1 signifikante

Einschränkungen im photoautotrophen Wachstum der Fd1‐KO‐Pflanzen nach sich zieht.

Tab. 3.8: Physiologische Parameter der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Die dargestellten Parameter wurden an Blättern von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag), bestimmt. Die Mengenangaben der Pigmente sind auf die Blattfläche bezogen. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).

Ergebnisse 115

Abb. 3.35: Entwicklungsstadien der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen.Dargestellt ist der Phänotyp der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen in den ersten drei Wochen (A), nach fünf Wochen (B) und nach neun Wochen (C), Bildung von ersten Nekrosen (links) bis zum Absterben ganzer Blätter (rechts), unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag – Durchmesser der Töpfe: 5 cm). Die gezeigten Bilder sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Anzuchten.

116 Ergebnisse

3.4.1.2 Photosynthetischer Elektronenfluss und CO2‐Assimilation

Der reduzierte Pigmentgehalt sowie das leicht eingeschränkte Wachstum der Fd1‐KO‐

Pflanzen deuten auf Anpassungen im photosynthetischen Elektronenfluss und in der

CO2‐Assimilation im Zuge fehlender Fd1‐Moleküle am PSI hin. Im Folgenden werden

Ergebnisse dargestellt, welche den photosynthetischen Elektronenfluss am PSI und PSII

sowie die CO2‐Assimilation im Calvin‐Zyklus in den Fd1‐KO‐Pflanzen detailliert

charakterisieren. Hierbei werden Messungen zur P700‐Absorptionsänderung, zur

Chlorophyllfluoreszenz‐Emission sowie CO2‐Gaswechselanalysen zur Einordnung der

photosynthetischen Lichtnutzung der Fd1‐KO‐Pflanzen herangezogen

(siehe Kapitel 3.1.2 und Kapitel 2.13).

Abb. 3.36: P700‐Oxidation im NIR von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX (A) sowie die Kinetiken der P700‐Oxidation im NIR (B) von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 ‐ 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten für ΔAP700‐MAX sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE). Die P700‐Oxidationkinetiken sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

In den Fd2‐KO‐Pflanzen kommt es im Zuge fehlender Elektronenakzeptoren zu

verstärkter Ladungsrekombination im PSI, nachdem bereits der absolute Gehalt an

aktiven Thylakoiden, und somit auch Photosystemen, deutlich verringert vorliegt (siehe

Kapitel 3.1.2.1). Ein Mangel an Fd1 hingegen führt unter moderaten Bedingungen zu

keinem signifikant veränderten Elektronenfluss im und am PSI. Sowohl ΔAP700‐MAX als

auch die Kinetiken der P700‐Oxidation im NIR sind in den Fd1‐KO‐Pflanzen, bezogen auf

Ergebnisse 117

die Lae‐WT‐Pflanzen, unverändert (siehe Abb. 3.36). Obwohl ein Mangel an Fd1 am PSI

vorliegt, sind keine Anzeichen einer Akzeptorlimitierung mit einhergehender

Ladungsrekombination im PSI oder ein verringerter Gehalt an PSI, wie es bei den

Fd2‐KO‐Pflanzen der Fall ist, detektierbar.

Anhand der kalkulierten Parameter der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission wird deutlich,

dass die photosynthetische Lichtnutzung der Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten

Bedingungen nicht signifikant verändert ist, abgesehen von einem verringerten

Protonengradienten über die Thylakoidmembran, angezeigt durch um ca. 31 %

geringere Werte für NPQ (siehe Tab. 3.9). Kurzzeitig für die Messungen erhöhte

aktinische Lichtintensitäten von 800 µE m‐2 s‐1 bestätigen diese Tendenz. Hanke und

Hase (2008) zeigten eine mögliche spezifische Funktion für Fd1 im Fd‐abhängigen ZET,

welcher unter anderem an der Generierung eines Protonengradienten über die

Thylakoidmembran u.a. beteiligt ist (vgl. Munekage et al., 2004). In Anbetracht der

Tatsache, dass weder qP, qL, ΦII und ETR in den Fd1‐KO‐Pflanzen signifikant von denen

der Lae‐WT‐Pflanzen abweichen (siehe Tab. 3.9) sowie dass keine Anzeichen

gesteigerter Photoinhibition am PSII zu beobachten sind, da FV/FM bei ca. 0,8 liegt (vgl.

Björkmann und Demmig, 1991), ist davon auszugehen, dass der vermindert generierte

Protonengradient im Zuge einer Beeinträchtigung des ZETs um PSI zustande kommt.

Tab. 3.9: Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt sind die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten Parameter von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) zunächst bei einer Lichtintensität von 150 µE m‐2 s‐1 und darauf folgend von 800 µE m‐2 s‐1. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für 15 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).


150 µEm‐2 s‐1

Lae‐WT 0,65 ± 0,02 0,87 ± 0,02 0,35 ± 0,05 49 ± 1 0,82 ± 0,01 0,93 ± 0,01

Fd1‐KO 0,6 ± 0,02 0,85 ± 0,02 0,24 ± 0,06 45 ± 1 0,77 ± 0,01 0,91 ± 0,02

800 µEm‐2 s‐1

Lae‐WT 0,37 ± 0,02 0,64 ± 0,02 1,32 ± 0,05 148 ± 1 0,82 ± 0,01 0,85 ± 0,01

Fd1KO 0,4 ± 0,02 0,72 ± 0,04 0,9 ± 0,08 162 ± 8 0,77 ± 0,01 0,91 ± 0,04


150 µEm‐2 s‐1

Lae‐WT 0,65 ± 0,02 0,87 ± 0,02 0,35 ± 0,05 49 ± 1 0,82 ± 0,01 0,93 ± 0,01

Fd1‐KO 0,6 ± 0,02 0,85 ± 0,02 0,24 ± 0,06 45 ± 1 0,77 ± 0,01 0,91 ± 0,02

800 µEm‐2 s‐1

Lae‐WT 0,37 ± 0,02 0,64 ± 0,02 1,32 ± 0,05 148 ± 1 0,82 ± 0,01 0,85 ± 0,01

Fd1KO 0,4 ± 0,02 0,72 ± 0,04 0,9 ± 0,08 162 ± 8 0,77 ± 0,01 0,91 ± 0,04

118 Ergebnisse

Eine Analyse der Chlororespiration in Fd1‐KO‐ sowie Lae‐WT‐Pflanzen, welche dem

NDH‐abhängigen ZET zugeschrieben wird (vgl. Munekage et al., 2004), macht deutlich,

dass diese in den Fd1‐KO‐Pflanzen nicht signifikant verändert ist. Der Parameter FC, ein

Indikator für Chlororespiration (siehe Kapitel 3.1.2.2), ist in Fd1‐KO‐Pflanzen im

Vergleich zu den Lae‐WT‐Pflanzen nicht signifikant verändert (siehe Abb. 3.37). Der

geringere Protonengradient in den Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen

scheint demnach in einem gestörten Fd‐abhängigen ZET um PSI begründet zu liegen.

Abb. 3.37: Chlororespiration der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen. Dargestellt ist die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission (A) sowie der kalkulierte Fluoreszenz‐Parameter FC (B) von Fd1‐KO‐ und Lae‐WT‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Die Blattscheiben wurden für 15 min mit aktinischem Licht (AL) von 150 µE m‐2 s‐1 bestrahlt (in der Abb. sind nur einige Sekunden dargestellt) bevor die Fluoreszenzemission im Dunkeln aufgezeichnet wurde. Die dargestellten Kinetiken der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhän igen Experimenten. Die gezeigten Daten für FC sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

g

0 100 200 300100

150

200

250

Lae‐WT Fd1‐KO0

1

2

3

4

0 100 200 300

Fd1‐KOLae‐WT

AL aus AL aus

F C

A

Chloroph

yllfluo

reszen

z‐Em

ission

[mV]

Zeit [s] Zeit [s]

B

0 100 200 300100

150

200

250

Lae‐WT Fd1‐KO0

1

2

3

4

0 100 200 300

Fd1‐KOLae‐WT

AL aus AL ausAL aus

F C

A

Chloroph

yllfluo

reszen

z‐Em

ission

[mV]

Zeit [s] Zeit [s]

B

Der knock‐out von Fd1 führt in den Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen zu

einer leicht verringerten CO2‐Assimilationsrate, welche im Vergleich zu den Lae‐WT‐

Pflanzen bei ca. 91 % liegt (siehe Abb. 3.38). Dies geht einher mit der Beobachtung der

verringerten Fähigkeit zum photoautotrophen Wachstum bei dem Fd1‐KO‐Pflanzen

(siehe Kapitel 3.4.1.1).

Ergebnisse 119

Abb. 3.38: CO2‐Assimilation der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen.Dargestellt ist die CO2‐Assimilation der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die CO2‐Assimilationsraten wurden an Blättern nach einer Stunde in der Lichtphase bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

Die Ergebnisse deuten auf einen inhibierten Fd‐abhängigen ZET in den Fd1‐KO‐

Pflanzen hin. Fd1‐KO‐Pflanzen zeigen unter moderaten Bedingungen ein

beeinträchtigtes photoautotrophes Wachstum. Ältere Blätter weisen Nekrosen auf,

was schließlich zum Absterben führt. Die photosynthetische Lichtnutzung ist nahezu

unverändert, allerdings wird in den Fd1‐KO‐Pflanzen ein signifikant geringerer

Protonengradient über die Thylakoidmembran generiert. Dies lässt auf eine

Inhibierung des Fd‐abhängigen ZET schließen. Da angenommen wird, dass der ZET in

C3‐Pflanzen nur einen geringen Faktor zur Regulation der Photosynthese darstellt

(vgl. Johnson et al, 2005; Joët et al., 2002) sind die Auswirkungen des knock‐outs von

Fd1 unter diesen Bedingungen zunächst gering.

Zusammenfassung – Fd1‐KO‐Pflanzen (Kapitel 3.4.1)

3.4.2 Induktion des ZET in den Fd1‐KO‐Pflanzen

Der ZET ist in C3‐Pflanzen vor allem unter Stressbedingungen ein entscheidender Faktor

zur Regulation der Photosynthesereaktion sowie zum Schutz vor Überreduktion und

Schädigung der Komponenten des photosynthetischen Elektronentransports (vgl.

Johnson, 2005). Um die Auswirkungen eines knock‐outs von Fd1 in A. thaliana unter

solchen Bedingungen in Bezug auf den ZET zu dokumentieren, wurden Fd1‐KO‐ sowie

Lae‐WT‐Pflanzen, soweit nicht anders vermerkt, acht Wochen unter moderaten

Bedingungen angezogen (siehe Kapitel 2.2) und vor jedem Versuch eine Stunde im

Hochlicht einer „Stresssituation“ ausgesetzt. Zusätzlich zu den Fd1‐KO‐Pflanzen werden

zum Teil Messdaten von Fd1‐RNAi‐Pflanzen (folgende Fd1‐RNAi‐Linien wurden

120 Ergebnisse

verwendet: Fd1‐RNAi‐2, Fd1‐RNAi‐5 und Fd1‐RNAi‐6) als Vergleichswerte herangezogen.

Eine exakte Quantifizierung des verbleibenden Fd1‐Proteingehaltes in den Fd1‐RNAi‐

Pflanzen ist auf Grund des nahezu gleichen Trennungsverhaltens der

photosynthetischen Fd‐Isoformen nicht möglich, da die vielfach höhere Menge an Fd2

im Blattextrakt die Bande für Fd1 überlagert (vgl. Hanke und Hase, 2008). Alle Fd1‐RNAi‐

Pflanzen weisen sich allerdings durch eine signifikant reduzierte Menge an Fd1 bei

unveränderten Mengen an Fd2 aus (vgl. Hanke und Hase, 2008). Eine grundlegende

Charakterisierung der Fd1‐RNAi‐Pflanzen ist in Hanke und Hase (2008) gegeben.

3.4.2.1 Der photosynthetische Elektronenfluss

Nach einer Stunde im Hochlicht ist ∆AP700‐MAX (siehe Kapitel 3.1.2.1 und Kapitel 2.11.2)

der Fd1‐KO‐ im Vergleich zu den Lae‐WT‐Pflanzen nicht signifikant abweichend

(siehe Abb. 3.39‐A). Ein Mangel an Fd1 wirkt sich demnach auch im Hochlicht nicht auf

die Kapazität von PSI bzw. der Anregbarkeit von P700‐Molekülen im NIR aus. Zu

beachten ist, dass die Kinetik der P700‐Oxidation im NIR in den Fd1‐KO‐Pflanzen

signifikante Abweichungen aufweist (siehe Abb. 3.39‐B).

aus. Zu

beachten ist, dass die Kinetik der P700‐Oxidation im NIR in den Fd1‐KO‐Pflanzen

signifikante Abweichungen aufweist (siehe Abb. 3.39‐B).

Abb. 3.39: P700‐Oxidation im NIR von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen im Hochlicht. Dargestellt ist ΔAP700‐MAX (A) sowie die Kinetik der P700‐Oxidation im NIR (B) von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Vor jeder Messung wurden die Pflanzen zunächst für eine Stunde im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1) und darauf folgend für 15 – 30 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten für ΔAP700‐MAX sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE). Die Kinetiken der P700‐Oxidation sind typische Beispiele von mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Ergebnisse 121

In den Lae‐WT‐Pflanzen ist nach einer Stunde im Hochlicht die in Kapitel 3.1.2.1

beschriebene typische zweiphasige Kinetik zu beobachten. In den Fd1‐KO‐Pflanzen tritt

hingegen eine direkte, nicht in unterschiedlichen Phasen ablaufende P700‐Oxidation im

NIR auf. Sowohl die lag‐Phase als auch die zweite, langsame Phase der P700‐Oxidation

sind nicht zu detektieren. Wie in Kapitel 3.1.2.1 dargestellt, ist die zweite Phase der

P700‐Oxidation neben den PSI‐Reaktionszentren, welche Elektronen für den LET

donieren, von PSI‐Reaktionszentren geprägt, welche Elektronen für den ZET donieren.

Vielmehr erfolgt die komplette Oxidation bis zum Erreichen von ∆AP700‐MAX in Phase 1 in

nur 1,21 ± 0,34 s (n = 3), während die komplette Oxidation der P700‐Moleküle im NIR

der Lae‐WT‐Pflanzen zweiphasig, unterbrochen durch die lag‐Phase, in 4,95 ± 0,28 s

(n = 3) abläuft. Die P700‐Oxidation im NIR ist demnach in den Fd1‐KO‐Pflanzen nach

einer Stunde im Hochlicht nicht durch einsetzenden ZET verlangsamt.

Die kalkulierten Parameter der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission zeigen nach einer

Stunde im Hochlicht für die Fd1‐KO‐Pflanzen ebenfalls ein deutliches Bild. Wie schon

unter moderaten Bedingungen ist ein verringerter Protonengradient über die

Thylakoidmembran in den Fd1‐KO‐Pflanzen verglichen mit den entsprechenden Lae‐

WT‐Pflanzen auch nach einer Stunde im Hochlicht zu detektieren (siehe Tab. 3.10). Im

Gegensatz zu den moderaten Bedingungen zeichnet sich in den Fd1‐KO‐Pflanzen ein

verringerter Elektronentransport ab. Der Reduktionsgrad der photosynthetischen

Elektronentransportkette bleibt hingegen unverändert (ΦII und qP zeigen im Vergleich

zu den Lae‐WT‐Pflanzen keine signifikanten Veränderungen auf), allerdings sind erste

Anzeichen von Photoinhibition zu erkennen (FV/FM ist signifikant verringert). Obwohl

Photoinhibition am PSII auftritt ist NPQ in den Fd1‐KO‐ gegenüber den Lae‐WT‐Pflanzen

um 12 % verringert (verstärkte Photoinhibition am PSII erhöht die Werte für NPQ in

Form von qI signifikant – siehe Kapitel 3.1.2.2). Zusätzlich zeigt sich in den Fd1‐KO‐

Pflanzen sich ein erhöhter Anteil an Chlororespiration (siehe Abb. 3.40).

Chlororespiration ist zu großen Teilen auf den NDH‐abhängigen ZET zurückzuführen (vgl.

Munekage et al., 2004) und trägt zur Erhöhung des Protonengradienten über die

Thylakoidmembran bei. Ein im Vergleich zu den Lae‐WT‐Pflanzen erhöhter Anteil an

Chlororespiration hätte demnach ebenso wie Photoinhibition am PSII einen Anstieg von

NPQ zur Folge. Dies ist in den Fd1‐KO‐Pflanzen nicht der Fall (s. o.), so dass davon

ausgegangen werden kann, dass ein verringertes NPQ nach einer Stunde im Hochlicht

bei gesteigerter Photoinhibition und erhöhtem chlororespiratorischen Anteil auf einen

signifikant gestörten Fd‐abhängigen ZET in Folge eines Mangels an Fd1 zurückzuführen

ist.

122 Ergebnisse

Tab. 3.10: Chlorophyllfluoreszenz‐Parameter der Fd1‐KO‐ und Fd1‐RNAi‐Pflanzen im Hochlicht. Dargestellt sind die aus den Chlorophyllfluoreszenz‐Emissionen kalkulierten Parameter der Lae‐WT, Fd1‐KO, Col‐WT‐ und Fd1‐RNAi‐Pflanzen (Linie 2,5 und 6), angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm) bei einer Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1. Vor jeder Messung wurden die Pflanzen für eine Stunde im Hochlicht und anschließend für 15 min im Dunkeln gehalten. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit der Standardabweichung als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SD).

In den Fd1‐RNAi‐Pflanzen sind nach einer Stunde im Hochlicht im Vergleich zu den

entsprechenden Col‐WT‐Pflanzen ähnliche Tendenzen zu beobachten. Es wird ein

verringerter Protonengradient über die Thylakoidmembran generiert, allerdings sind

keine Anzeichen von Photoinhibition zu detektieren (FV/FM liegt bei Werten um 0,8).

Abweichend zu den Fd1‐KO‐Pflanzen sind allerdings ETR, ФII sowie qP signifikant

erhöht. Dies zeigt, dass ein verringerter Gehalt an Fd1 in den Fd1‐RNAi‐Pflanzen zu

einem erhöhten linearen photosynthetischen Transport von Elektronen bei

verringertem Reduktionsgrad der photosynthetischen Elektronentransportkette führt.

Dies kann die Folge eines vermindert ablaufenden Fd‐abhängigen ZET sein, wobei

Elektronen nicht in die photosynthetische Elektronentransportkette zurückgeschleust

werden und eine zunehmende Reduzierung selbiger ausbleibt. Werden Fd1‐KO‐Pflanzen

unter moderaten Bedingungen angezogen und wird die Chlorophyllfluoreszenzemission

bei einer aktinischen Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1 bestimmt, ohne vorher für eine

0,97 ± 0,050,8 ± 0,02200 ± 90,8 ± 0,010,79 ± 00,5 ± 0,02Ai‐6

0,96 ± 0,050,79 ± 0200 ± 40,8 ± 0,040,8 ± 0,010,5 ± 0,01Ai‐5

0,96 ± 0,060,8 ± 0,01209 ± 80,83 ± 0,030,82 ± 00,52 ± 0,02Ai‐2

0,9 ± 0,020,77 ± 0,02154 ± 30,9 ± 0,140,68 ± 0,010,39 ± 0,01

0,9 ± 0,030,71 ± 0,05137 ± 140,87 ± 0,120,74 ± 0,020,34 ± 0,04

0,92 ± 0,040,78 ± 0,01152 ± 160,99 ± 0,110,68 ± 0,050,38 ± 0,04

qLFv/FmETRNPQqPΦII

Fd1‐RN

Fd1‐RN

Fd1‐RN

Col‐WT

Fd1‐KO

Lae‐WT

0,97 ± 0,050,8 ± 0,02200 ± 90,8 ± 0,010,79 ± 00,5 ± 0,02Ai‐6

0,96 ± 0,050,79 ± 0200 ± 40,8 ± 0,040,8 ± 0,010,5 ± 0,01Ai‐5

0,96 ± 0,060,8 ± 0,01209 ± 80,83 ± 0,030,82 ± 00,52 ± 0,02Ai‐2

0,9 ± 0,020,77 ± 0,02154 ± 30,9 ± 0,140,68 ± 0,010,39 ± 0,01

0,9 ± 0,030,71 ± 0,05137 ± 140,87 ± 0,120,74 ± 0,020,34 ± 0,04

0,92 ± 0,040,78 ± 0,01152 ± 160,99 ± 0,110,68 ± 0,050,38 ± 0,04

qLFv/FmETRNPQqPΦII

Fd1‐RN

Fd1‐RN

Fd1‐RN

Col‐WT

Fd1‐KO

Lae‐WT

Ergebnisse 123

Stunde im Hochlicht zu inkubieren, sind ähnliche Tendenzen wie in den Fd1‐RNAi‐

Pflanzen nach einer Stunde im Hochlicht zu beobachten (siehe Tab. 3.10).

Abb. 3.40: Chlororespiration in den Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen im Hochlicht. Dargestellt ist die Chlorophyllfluoreszenz‐Emission (A) sowie der kalkulierte Fluoreszenz‐Parameter FC (B) von Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Vor den Messungen wurden die Pflanzen für eine Stunde im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) gehalten. Die Messungen erfolgten an Blattscheiben (Ø = 1,3 cm). Die Blattscheiben wurden für 15 min mit aktinischem Licht (AL) von 800 µE m‐2 s‐1 bestrahlt (in der Abb. sind nur einige Sekunden dargestellt) bevor die Fluoreszenzemission im Dunkeln aufgezeichnet wurde. Die dargestellten Kinetiken der Chlorophyllfluoreszenz‐Emission sind typische Beispiele aus mindestens drei unabhängigen Experimenten. Die gezeigten Daten für FC sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).


Unter moderaten Bedingungen ist die CO2‐Assimilation in den Fd1‐KO‐Pflanzen bereits

leicht verringert. Nach einer Stunde im Hochlicht ist diese Tendenz im Vergleich zu den

Lae‐WT‐Pflanzen noch deutlicher, wobei die CO2‐Assimilationsrate der Fd1‐KO‐Pflanzen

bei nur noch 72 % bezogen auf die Lae‐WT‐Pflanzen liegt (siehe Abb. 3.41). Im Vergleich

zu den moderaten Bedingungen (siehe Abb. 3.41) ist bei den Fd1‐KO‐Pflanzen nach

einer Stunde im Hochlicht lediglich eine Erhöhung der CO2‐Assimilation um 21 % zu

detektieren. In Lae‐WT‐Pflanzen hingegen ist die Co2‐Assimilationsrate um 53 %

gesteigert. Dieses Ergebnis belegt die Tatsache, dass in den Fd1‐KO‐Pflanzen ein Mangel

an Fd1 vor allem im Hochlicht entscheidende Auswirkungen hat und wahrscheinlich auf

einen stark beeinträchtigten Fd‐abhängigen ZET zurückzuführen ist.

124 Ergebnisse

Zusammenfassung – Induktion des ZET in Fd1‐KO‐Pflanzen (Kapitel 3.4.2)

Ein Mangel an Fd1 führt zu einem vermindert ablaufenden Fd‐abhängigen ZET. Dies

ist vor allem im Hochlicht zu beobachten. Je nach Ausprägung des Fd1‐Mangels

kommt es zu signifikanten Anpassungen im photosynthetischen Elektronenfluss. In

Folge eines vermindert ablaufenden Fd‐abhängigen ZET ist der LET in den Fd1‐RNAi‐

Pflanzen erhöht. In den Fd1‐KO‐Pflanzen hingegen tritt in Folge des knock‐outs von

Fd1 nach einer Stunde im Hochlicht bereits Photoinhibition am PSII auf und

verringerte Elektronentransport‐ und Photosyntheseraten sind die Folge. Insgesamt

zeigt sich, dass Fd1 eine wichtige Funktion im Fd‐abhängigen ZET einnimmt.

Abb. 3.41: CO2‐Assimilation der Lae‐WT‐ und Fd1‐KO‐Pflanzen im Hochlicht. Dargestellt ist die CO2‐Assimilation der Lae‐WT‐ sowie Fd1‐KO‐Pflanzen, angezogen unter moderaten Bedingungen (150 µE m‐2 s‐1 bei 20 °C im Kurztag). Die CO2‐Assimilationsraten wurden an Blättern nach einer Stunde im Hochlicht (800 µE m‐2 s‐1 bei 16 °C) bei einer Lichtintensität von 800 µE m‐2 s‐1 bestimmt. Die gezeigten Daten sind die arithmetischen Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten mit dem Standardfehler als Streuungsindikator (n ≥ 3, ± SE).

L ae‐WT Fd1‐KO0

2

4

6

8

10

12

CO2‐Assim

ilation

[µmol m

‐2s‐1 ] 10

8

6

4

2

12

CO2‐Assim

ilation

[µmol m

‐2s‐1 ]

0L ae‐WT Fd1‐KO

Diskussion 125

4 Diskussion

4.1 Fd2‐KO‐Pflanzen – Gleichzeitige Simulation von Hoch‐ und Schwachlichtbedingungen im Chloroplasten

Fd2‐KO‐Pflanzen weisen einen um ca. 90 % verringerten Gehalt an Blatt‐Fd auf (siehe

Kapitel 3.1). Damit ist die zentrale Schaltstelle zwischen dem PET in der

Thylakoidmembran und den stromalen Akzeptoren zu großen Teilen unterbrochen. Dies

führt zu einem stark reduzierten PET, was anhand der Chlorophyllfluoreszenz‐

Parameter deutlich belegt ist (siehe Kapitel 3.1.2.2). Außerdem ist das Stroma

zunehmend oxidiert, was sich u.a. am niedrigen Aktivierungszustand der NADP‐MDH

(siehe Kapitel 3.1.3.1), der verringerten Chlororespiration (siehe Kapitel 3.1.2.2) sowie

der verringerten Aktivität der RubisCO (siehe Kapitel 3.1.2.4) dokumentiert. Diese

gegenläufigen Redoxzustände des thylakoidären PET und des Stromas signalisieren zum

einen ein Lichtüberangebot, zum anderen allerdings einen Lichtmangel. Dadurch eignen

sich die Fd2‐KO‐Pflanzen als Modell, um neue Erkenntnisse in der lichtabhängigen

Regulation und Akklimation zu erlangen.

4.1.1 Langzeitakklimation und poising

Im Palisadenparenchym von Spinatblättern konnte gezeigt werden, dass der Blatt‐Fd‐

Gehalt den PSI‐Gehalt um das zwei‐ bis dreifache übersteigt (vgl. Terashima und Inoue,

1985). Holtgrefe et al. (2003) legten an transgenen Kartoffeln (Fd‐antisense‐Kartoffeln)

dar, dass ein um 60 % verringerter Gehalt an Blatt‐Fds letal ist und dass das Fd/PSI‐

Verhältnis mindestens eins betragen muss. Diese Tatsache macht es umso

erstaunlicher, dass die Fd2‐KO‐Pflanzen vital sind und zudem photoautotroph wachsen

(siehe Kapitel 3.1.1). An Fd2‐RNAi‐Pflanzen konnte ebenfalls ein signifikant geringerer

Gehalt an Blatt‐Fd beobachtet werden (vgl. Hanke und Hase, 2008). In diesem

Zusammenhang ist zu beachten, dass Fd2‐KO‐Pflanzen bei dem um 90 % verringerten

Gehalt an Blatt‐Fds auch einen um ca. 30 % reduzierten Anteil an aktiven Thylakoiden

und somit auch an PSI aufweisen (siehe Kapitel 3.1.2.1). Das Fd/PSI‐Verhältnis beträgt

somit wahrscheinlich mindestens eins, so dass ein vitales und photoautotrophes

Wachstum gewährleistet ist. Diese Anpassung ist die Folge einer Langzeitakklimation an

erhöhte Lichtintensitäten in den Fd2‐KO‐Pflanzen, die von der Keimung an bereits unter

moderaten Bedingungen auftritt und signifikante phänotypische Anpassungen nach sich

zieht. So ist neben der reduzierten Menge aktiver Thylakoide vor allem ein verringerter

Anteil LHCs auffällig (siehe Kapitel 3.1.1). Diese phänotypischen Anpassungen in den

Fd2‐KO‐Pflanzen sind vergleichbar mit einer Langzeitakklimation an erhöhte

126 Diskussion

Lichtintensitäten, welche bereits in den Fd‐antisense‐Kartoffeln beobachtet wurde (vgl.

Holtgrefe et al., 2003). Hierbei setzen im Hochlicht zunächst die klassischen poising‐

Mechanismen ein; nach einigen Tagen allerdings erfolgt ein kontrollierter Abbau aktiver

Thylakoide und eine Verringerung der LHCs (vgl. Voss, 2005). Langzeitakklimation in

Folge erhöhter Strahlungsenergien tritt dann auf, wenn der PET in der

Thylakoidmembran zunehmend reduziert vorliegt und die Redox‐Homöostase über

poising‐Mechanismen nicht aufrecht erhalten werden kann (vgl. Scheibe et al., 2005;

Hanke et al., 2009). Es kommt zu einem kontrollierten Abbau der Komponenten des

PET, was in den Fd2‐KO‐Pflanzen folglich zu einer signifikant verringerten

Photosyntheserate führt (siehe Kapitel 3.1.2.3). In ähnlicher Weise ist dies auch an

weiteren transgenen Pflanzen der Art A. thaliana mit Mutationen in den Genen für

NTRC, plastidäre ATP‐ADP‐Transporter, der Stärkesynthese und den Triosephosphat‐

Translokatoren gezeigt worden, wobei der Reduktionsgrad der PET jeweils signifikant

erhöht war (vgl. Reiser et al., 2004; Pérez‐Ruíz et al., 2006; Häusler et al., 2009).

Es wird demnach deutlich, dass die Fd2‐KO‐Pflanzen unter anhaltend erhöhtem

Elektronendruck im PET die Absorption von Lichtenergie im Zuge einer

Langzeitakklimation minimieren, um oxidativen Stress und eine vollständige Blockierung

des PET zu vermeiden. Das Ausmaß der Überreduktion im PET in den Fd2‐KO‐Pflanzen

ist allerdings nicht maximal, da anhand von schnellen Lichtsättigungskurven ein Anstieg

der Elektronentransportrate sowie der CO2‐Assimilationsrate zu beobachten ist (siehe

Kapitel 3.1.2.4). Hierbei treten poising‐Mechanismen auf, die im Vergleich zu den Noe‐

WT‐Pflanzen allerdings signifikant schwächer ausgeprägt sind. Ein schnelles und

effizientes poising ist somit nach eingesetzter Langzeitakklimation in den Fd2‐KO‐

Pflanzen nur bedingt möglich, da der PET weiter einen hohen Reduktionsgrad aufweist

und eine Limitierung an freien Elektronenakzeptoren am PSI vorliegt.

Nach zwei Stunden im Hochlicht zeigen die Fd2‐KO‐Pflanzen bereits einen stark

überreduzierten und blockierten PET. In Folge dessen kommt es zur Photoinhibition am

PSII und der Elektronenfluss ist signifikant herabgesetzt, während dagegen in den Noe‐

WT‐Pflanzen z. B. ZET und NPQ für eine effektive Ableitung überschüssiger Lichtenergie

sorgen (siehe Kapitel 3.2.1.1). Hingegen kommt es in den Fd2‐KO‐Pflanzen bereits nach

kurzer Zeit in Folge eingesetzter Photoinhibition am PSI zur Degradation gesamter PSI‐

Komplexe (siehe Kapitel 3.2.1.1). Scheller und Haldrup (2005) gehen hierbei von einem

Prozess aus, der nicht in Folge akkumulierender ROS als toxische Intermediate abläuft,

sondern kontrolliert gesteuert ist und somit auch eine Art extremen poisings darstellt,

um die Pflanze vor Schädigungen zu schützen. Dies kann anhand der Fd2‐KO‐Pflanzen

bestätigt werden, da die PSI‐Degradation bereits nach kurzer Erholungsphase unter

Diskussion 127

moderaten Bedingungen reversibel ist (siehe Kapitel 3.2.1.1). Dieses Phänomen der

Photoinhibition und Degradation vom PSI als kontrollierter Schutzmechanismus ist auch

an den Fd‐antisense‐Kartoffeln beobachtet worden (vgl. Voss, 2005), wobei dieser

Effekt ebenso unter moderaten Bedingungen reversibel ist.

In diesem Zusammenhang zeigt sich zudem, dass der photorespiratorische Anteil an der

Photosynthesereaktion in den Fd2‐KO‐Pflanzen nach kurzer Zeit im Hochlicht signifikant

erhöht ist, während dies unter moderaten Bedingungen im Vergleich zu den Noe‐WT‐

Pflanzen nicht der Fall ist. Dies belegt, dass die Photorespiration ein alternativer

Mechanismus sein kann, um freie stromale Elektronenüberträger zu generieren (vgl.

Niyogi, 2000; Igamberdiev et al., 2001; Foyer et al., 2009; Strodtkötter, unpubl.). Zu

beachten ist, dass die Primärreaktion unter optimalen Bedingungen in WT‐Pflanzen

einen NADPH‐Überschuss generiert, welcher im Calvin‐Zyklus nicht verbraucht wird (vgl.

Heber und Kirk, 1975; Ort und Melandri, 1982; Badger, 1985), und poising‐

Mechanismen wie der ZET oder die NADP‐MDH für die Optimierung des ATP/NADPH‐

Verhältnisses essentiell sind (siehe Kapitel 1.4.1). In der Photorespiration hingegen

werden mehr ATP‐Moleküle als Reduktionsäquivalente benötigt. Dies bestätigt die

These, dass die Photorespiration einen Überlaufmechanismus darstellt, der unter

extremsten Bedingungen einer Akzeptorlimitierung sowohl ATP als auch NADPH

verbraucht, um freie Akzeptoren zu generieren. In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist davon

auszugehen, dass das ATP/NADPH‐Verhältnis auf Grund des Mangels von Fd als

Elektronenüberträger am PSI höher liegt als in den Noe‐WT‐Pflanzen. Demnach wäre

die Photorespiration als Überlaufmechanismus zum Abbau von ATP und NADPH absolut

sinnvoll, um freie Akzeptoren in den Fd2‐KO‐Pflanzen zu generieren. Ebenso könnte hier

auch reduziertes Fd direkt als Elektronendonator für Fd‐GOGAT für die Refixierung von

Ammonium fungieren und somit wiederum oxidiert als Elektronenakzeptor am PSI zur

Verfügung zu stehen.

Erfolgt die Anzucht der Fd2‐KO‐Pflanzen hingegen nach der Keimung direkt im

Hochlicht, so findet eine Langzeitakklimation statt, die den Pflanzen ein vitales,

photoautotrophes Wachstum ermöglicht (siehe Kapitel 3.2.2), ähnlich wie dies auch

schon unter moderaten Bedingungen der Fall ist (siehe Kapitel 3.1). Allerdings weist der

PET einen signifikant erhöhten Reduktionsgrad auf und es sind erste Anzeichen von

Photoinhibition am PSII, im abgeschwächten Ausmaß auch in den entsprechenden Noe‐

WT‐Pflanzen, zu erkennen (siehe Kapitel 3.2.1.1). In diesem Fall ist der maximale

Reduktionsgrad des PET erreicht, bei welchem noch ein photoautotrophes und vitales

Wachstum gewährleistet ist. Dies macht deutlich, dass Pflanzen in der Lage sind, sich im

Zuge einer Langzeitakklimation an extremste externe Bedingungen anzupassen. Die

128 Diskussion

Redox‐Homöostase bei kurzzeitig erhöhten Lichtintensitäten in den Fd2‐KO‐Pflanzen

kann hingegen nicht über die klassischen poising‐Mechanismen, wie z. B. ZET und NPQ,

aufrechterhalten werden; vielmehr kommt es zum Schutz der Pflanze dann bereits zur

Degradation von Photosystemen (s. o.).

Abschließend sind folgende Aussagen bezüglich der Langzeitakklimation und des poising

in den Fd2‐KO‐Pflanzen zu treffen:

1. Eine Langzeitakklimation ermöglicht den Fd2‐KO‐Pflanzen auch unter extremer

Akzeptorlimitierung am PSI ein vitales und photoautotrophes Wachstum, wobei

es bezogen auf die Akzeptorverfügbarkeit am PSI zu einer Verringerung der

Komponenten des Photosyntheseapparates kommt.

2. Klassische poising‐Mechanismen zur Aufrechterhaltung der Redox‐Homöostase

sind auf Grund des stark reduzierten PET nicht ausreichend, vielmehr ist eine

extreme Form des poising mit einem erhöhten Anteil an Photorespiration und

der Degradation von PSI zu beobachten.

4.1.2 Signalling

In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist der Reduktionszustand des PET in der Thylakoidmembran

von dem des Stromas entkoppelt (siehe Kapitel 3.1). Diese Tatsache macht die Fd2‐KO‐

Pflanzen zu einem idealen Modell, um Signale zu lokalisieren, welche im Zuge erhöhter

Strahlungsenergien eine Änderung der Genexpression im Kern und somit eine

Lichtakklimation auslösen. Der Ursprung solcher Signale ist Mittelpunkt einer

kontroversen Diskussion (vgl. Kleine et al., 2009), wobei Scheibe et al. (2005) ein Redox‐

Signal aus dem Chloroplasten zur Induktion einer Lichtakklimation annehmen.

Die Fd2‐KO‐Pflanzen zeigen eine Langzeitakklimation an erhöhte Strahlungsenergien

(siehe Kapitel 4.1.1). Die hierfür erforderlichen Änderungen der Genexpression (siehe

Kapitel 1.4.2) scheinen vom Reduktionsgrad des PET abzuhängen. Am Beispiel der

NADP‐MDH wird diese Verknüpfung deutlich. Obwohl der metabolische Bedarf auf

Grund des vermehrt oxidierten Stromas nicht vorliegt, ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen eine

deutliche Steigerung der Kapazität in Folge einer Anpassung des Expressionsniveaus der

NADP‐MDH zu beobachten (siehe Kapitel 3.1.3.1). Dies ist auf den erhöhten

Reduktionszustand des PET in der Thylakoidmembran zurückzuführen, wodurch ein

Elektronenüberschuss signalisiert wird. Ähnliche Tendenzen konnten bereits an

Tabakpflanzen mit einem verringerten Gehalt an FNR (vgl. Palatnik et al., 2003)

beobachtet werden, wobei trotz des oxidierten Stromas die Kapazität der NADP‐MDH

Diskussion 129

unter moderaten Wachstumsbedingungen signifikant erhöht ist (vgl. Hajirezaei und

Scheibe, unpubliziert).

Im Falle der NADP‐MDH deutet somit einiges darauf hin, dass eine Änderung der

Genexpression durch den Redox‐Zustand des PET in der Thylakoidmembran kontrolliert

wird. Ebenso scheint die Langzeitakklimation in Folge erhöhter Lichtintensitäten in den

Fd2‐KO‐Pflanzen (siehe Kapitel 3.2.2) über den Reduktionsgrad des PET induziert zu

sein. Eine Kontrolle der Genexpression zur Induktion einer Langzeitakklimation an

erhöhte Lichtintensitäten aus dem Metabolismus des Stromas heraus hätte einen

gegenteiligen Effekt zur Folge haben müssen, da das Stroma eher oxidiert vorliegt und

somit ein Mangel an Produkten der Primärreaktion signalisiert (siehe Kapitel 3.1.2.4).

Somit sind die häufig für ein Signalling aus dem Stroma der Chloroplasten

angenommenen Prozesse, wie z. B. die Tetrapyrrolbiosynthese (vgl. Johanningmeier

und Howell, 1984; Kropat et al., 1995; Strand et al., 2003; Ankele et al., 2007) oder die

Proteinbiosynthese (vgl. Gray et al., 2003; Pesaresi et al., 2006) als Redox‐Sensor in der

Langzeitakklimation auf erhöhte Lichtintensitäten zunächst auszuschließen. Ebenso

erscheint auf Grund des oxidiert vorliegenden Stromas eine Beteiligung von stromalen

Redoxüberträgern, wie Trx, Glutaredoxinen (vgl. Meyer et al., 1999; Marchand et al.,

2004) oder Glutathion (vgl. Wingate et al., 1988), an der Signalweiterleitung als fraglich.

So ist z. B. der Gesamtgehalt an Glutathion (GSH + GSSG) in den Fd2‐KO‐Pflanzen

signifikant verringert, wobei das Verhältnis von GSH/GSSG kaum verändert ist (siehe

Kapitel 3.1.3.2). Der Reduktionsgrad des Glutathion‐Pools ist aus diesem Grund als

Redox‐Sensor wahrscheinlich nicht entscheidend.

Eine exakte Lokalisation des Signalursprungs aus dem PET ist allerdings auch weiterhin

schwierig. Zum einen wird der PQ‐Pool als Redox‐Sensor angenommen (vgl. Pogson et

al., 2008), zum anderen könnte die Verfügbarkeit von stromalen Akzeptoren am PSI

ausschlaggebend sein (vgl. Baier et al., 2004; Piippo et al., 2006), wobei auch die

Akkumulation von ROS als Signal diskutiert wird (vgl. Mittler et al., 2004; Foyer und

Noctor, 2005; Fujita et al., 2006; Bailey‐Serres und Mittler, 2006). In den Fd2‐KO‐

Pflanzen geben akkumulierende ROS den Redox‐Zustand des PET ins Stroma weiter, so

dass ROS ein mögliches Signalmolekül an der PSI‐Akzeptorseite darstellt, welches eine

Änderung der Genexpression induzieren könnte. Die Rolle von ROS als Signal‐Molekül

und Faktor in der Expression diverser Gene konnte anhand von Microarray‐Analysen an

transgenen Pflanzen mit inhibierten antioxidativen Systemen bereits gezeigt werden

(vgl. Pnueli et al., 2003; Rizhsky et al., 2003; Vandenabeele et al., 2004; Davletova et al.,

2005; Vanderauwera et al., 2005; Lee et al., 2007). Hierbei ist allerdings zu beachten,

dass akkumulierende ROS als sehr unspezifisches Signal eingeordnet werden müssen, da

130 Diskussion

ROS in Folge von exogenem Stress an vielen Stellen des Metabolismus auftreten und die

Spezifität für die Stressantwort somit nicht gewährleistet erscheint (vgl. Kleine et al.,

2009). In den Fd2‐KO‐Pflanzen ist hingegen eine verstärkte ROS‐Akkumulation zu

beobachten (siehe Kapitel 3.1.3.2), die keine sichtbaren Schäden nach sich zieht. Aus

diesem Grund kann ROS als mögliches Signal nicht ausgeschlossen werden.

An der Akzeptorseite vom PSI könnte außer der ROS‐Akkumulation auch die neue Fd‐

Isoform FdC1 (siehe Kapitel 4.3) als Redox‐Signal fungieren. FdC1 wird in den Fd2‐KO‐

Pflanzen stärker exprimiert und ist in den Chloroplasten lokalisiert (siehe Kapitel 3.3).

FdC1 kann als Elektronenakzeptor am PSI fungieren (Hanke, unpubl.) und könnte daher

eine Rolle beim Redox‐Signalling spielen.

Neben ROS und FdC1 als mögliche Redox‐Signale an der Akzeptorseite des PSI wird der

Reduktionsgrad des PQ‐Pools häufig als Redox‐Sensor angenommen, wobei gezeigt

werden konnte, dass das Expressionsniveau verschiedener Gene vom Reduktionsgrad

des PQ‐Pools abhängig ist (vgl. Maiwald et al., 2003). Der PQ‐Pool ist in den Fd2‐KO‐

Pflanzen stärker reduziert (siehe Kapitel 3.1.2.2) und käme somit als Redox‐Sensor für

die Induktion einer Langzeitakklimation an erhöhte Lichtintensitäten in Frage. Sind die

poising‐Mechanismen für eine Abführung überschüssiger Lichtenergie nicht

ausreichend, verbleibt der PQ‐Pool in Folge des erhöhten photosynthetischen

Elektronenflusses (LET und ZET) stärker reduziert und wäre somit ein idealer Redox‐

Sensor für die dann notwendige Induktion einer Langzeitakklimation an erhöhte

Lichtintensitäten.

Neben der Reduktion von O2 am PSI im Zuge der Mehler‐Reaktion kommt es auch zur

Bildung von ROS direkt im bzw. am PQ‐Pool (vgl. Khorobrykh und Ivanov, 2002;

Khorobrykh et al., 2004). Somit könnte ROS als Folge eines vermehrt reduzierten PQ‐

Pools eine zentrale Rolle in der Weiterleitung eines Redox‐Signals vom PET einnehmen

(vgl. Escoubas et al., 1995; Durnford und Falkowski, 1997). Hierfür spricht auch die

Tatsache, dass vor allem unter erhöhten Lichtintensitäten sowohl O2‐ aus dem PQ‐Pool,

als auch O2‐ von der Akzeptorseite des PSI mittels PQH2 als Reduktionsmittel zu H2O2

reduziert werden kann (vgl. Khorobrykh und Ivanov, 2002; Khorobrykh et al., 2004;

Ivanov et al., 2008). Entstehendes H2O2 könnte somit ein kombiniertes Signal sowohl

aus dem PQ‐Pool als auch von der Akzeptorseite des PSI in Folge eines zunehmend

reduzierten PET weiterleiten.

Die Induktion der Langzeitakklimation an erhöhte Lichtintensitäten ist in den Fd2‐KO‐

Pflanzen eindeutig auf den erhöhten Reduktionsgrad des PET zurückzuführen. Ebenso

ist dies z. B. auch für die Regulation der Genexpression der NADP‐MDH, welche einen

Diskussion 131

wichtigen poising‐Mechanismus darstellt (vgl. Scheibe et al., 2005), der Fall. Für eine

Änderung der Genexpression bezogen auf den „Dunkel‐Metabolismus“ in den

Chloroplasten hingegen scheint eine gegenteilige Situation vorzuliegen. So ist zum

Beispiel das Schlüsselenzym des OPP, die chloroplastidäre G6PDH, in den Fd2‐KO‐

Pflanzen vermehrt exprimiert (vgl. Koelmann, 2008; Fastabend, 2009) und auch eine

Aktivitätssteigerung kann eindeutig nachgewiesen werden (siehe Kapitel 3.1.3.1). Auch

die NTRC, welche vor allem im Dunkeln eine essentielle Rolle in der Detoxifizierung von

ROS einnimmt (vgl. Pérez‐Ruíz et al., 2006), unterliegt in den Fd2‐KO‐Pflanzen einer

erhöhten Expression (siehe Kapitel 3.1.4). In diesem Zusammenhang scheint eine

Änderung der Genexpression über Komponenten des oxidierten Stromas reguliert zu

sein, wobei hier nun wieder u.a. Trx, Glutaredoxine oder Glutathion (vgl. Wingate et al.,

1988; Meyer et al., 1999; Marchand et al., 2004) sowie die Intermediate stromaler

Stoffwechselwege in Frage kommen, z. B. die Tetrapyrrolbiosynthese (vgl.

Johanningmeier und Howell, 1984; Kropat et al., 1995; Strand et al., 2003; Ankele et al.,

2007) oder die plastidäre Proteinbiosynthese (vgl. Gray et al., 2003; Pesaresi et al.,

2006). Für die Kapazitätssteigerung der NTRC wäre allerdings auch eine direkte Rolle

von H2O2 als Ursprung und Transportform des Signals denkbar (vgl. Mittler et al., 2004;

Foyer und Noctor, 2005; Fujita et al., 2006; Bailey‐Sorres und Mittler, 2006). Das hierbei

gerade in den Fd2‐KO‐Pflanzen beteiligte 2‐Cys‐Prx hingegen scheint wiederum einer

Regulation abhängig von der Akzeptorverfügbarkeit am PSI zu unterliegen. Dies konnte

zwar nicht für das in dieser Arbeit getestete 2‐Cys‐Prx‐B, aber für die verwandte Isoform

2‐Cys‐Prx‐A gezeigt werden, wobei die Promotoraktivität abhängig von Signalen aus

dem PET an der Akzeptorseite des PSI ist (vgl. Baier et al., 2004).

Insgesamt lassen sich anhand der Fd2‐KO‐Pflanzen folgende Aussagen zum Signalling

treffen:

1. Der Auslöser für die Induktion einer Langzeitakklimation bzw. einer Anpassung

des chloroplastidären Stoffwechsels an erhöhte Lichtintensitäten liegt im

erhöhten Reduktionsgrad des PET.

2. Eine Änderung der Genexpression zur Optimierung der in den Chloroplasten im

Dunkeln ablaufenden Prozesse ist an den metabolischen Bedarf im Stroma

gekoppelt.

132 Diskussion

4.1.3 Posttranslationale Regulation

Außer auf der Ebene der Genexpression wird der Metabolismus im Chloroplasten auch

durch schnelle und effektive posttranslationale Regulation angepasst, wobei die

Aktivität bestimmter Enzyme über das Fd‐Trx‐System (vgl. Buchanan, 1980) und

spezifisch in jedem Fall über das metabolische fine‐tuning gesteuert wird (siehe

Kapitel 1.3.2). Dies verhindert u.a. das Auftreten von futile cycles, wobei z. B. ein

Abschalten des OPP im Licht gewährleistet ist, so dass kein zum Calvin‐Zyklus

gegenläufiger Prozess abläuft (vgl. Kapitel 1.3.3). Diese Situation ist in den Fd2‐KO‐

Pflanzen auf Grund des gegenläufigen Reduktionsgrades des PET in der

Thylakoidmembran und im Stroma (siehe Kapitel 4.1.2) differenzierter zu betrachten.

Das oxidiert vorliegende Stroma, wobei ein Mangel an NADPH anzunehmen ist (siehe

Kapitel 3.1.2.4 und Kapitel 3.1.3), führt in den Fd2‐KO‐Pflanzen bereits im Licht zum

Anschalten des OPP (siehe Kapitel 3.1.3.1), wodurch NADPH über den Abbau

transitorischer Stärke generiert wird. Hierbei handelt es sich nicht um einen pleiotropen

Effekt, sondern um eine an die Bedarfssituation des Stromas angepasste

posttranslationale Regulation. So kommt es in Folge des Fd‐Mangels am PSI weder zu

einer lichtabhängigen Inaktivierung des OPP über das Fd‐Trx‐System noch zu einer

Inaktivierung über Intermediate mittels fine‐tuning oder feedback‐Regulation, da

NADPH nur in geringen Mengen akkumuliert und das Stroma vermehrt oxidiert vorliegt.

Die ROS‐Akkumulation in den Fd2‐KO‐Pflanzen (siehe Kapitel 3.1.3.2) fördert den

erhöhten Oxidationsgrad des Stromas. Eine Aktivierung des OPP und die damit

verbundene Generierung von NADPH sind demnach zur Detoxifikation von ROS in den

Chloroplasten absolut erforderlich. Hierbei erfolgt der Abbau wahrscheinlich über NTRC

und 2‐Cys‐Prx (siehe Kapitel 1.4.3), die in den Fd2‐KO‐Pflanzen vermehrt akkumulieren

(siehe Kapitel 3.1.4). Pérez‐Ruís et al. (2006) zeigten, dass der ROS‐Abbau über NTRC

und Prx vor allem im Dunkeln, also bei oxidiertem Stroma, in WT‐Pflanzen ein

entscheidender Faktor zur Detoxifizierung ist. In den Fd2‐KO‐Pflanzen wird demnach

bestätigt, dass außer über den Beck‐Halliwell‐Asada‐Weg (siehe Kapitel 1.4.3) die

Detoxifizierung von ROS bei oxidiertem Stroma hauptsächlich über den OPP, sowie

NTRC und Prx abläuft. In diesem Zusammenhang muss allerdings beachtet werden, dass

die Aktivierung des OPP im Licht bei den Fd2‐KO‐Pflanzen nur phasenweise nach Bedarf

erfolgt. Ein ständig aktiver OPP in den Chloroplasten der Fd2‐KO‐Pflanzen würde ein

photoautotrophes Wachstum unmöglich machen. Es ist davon auszugehen, dass eine

gesteigerte NADPH‐Konzentration, im Zuge des im Licht aktiven OPP auch eine

Inaktivierung des OPP und eine Aktivierung des Calvin‐Zyklus fördert. Die Aktivierung

bzw. Inaktivierung erfolgt hierbei allerdings nicht ausschließlich über die Intermediate

Diskussion 133

im Stroma, sondern ebenso über das Fd‐Trx‐System. Die Elektronenverteilung am PSI

unterliegt einer strengen Hierarchie (vgl. Backhausen et al., 2000) und resultiert somit

bei verringerter Konzentration an Akzeptoren im Stroma (NADP+) in einem verstärkten

Elektronenfluss auf Trx, soweit die stark verringerte Menge an Fds dies möglich macht.

Demnach könnte im Licht ein ständiger Wechsel zwischen Calvin‐Zyklus und OPP

vorliegen, um die Vitalität zum einen und das photoautotrophe Wachstum zum anderen

sicher zu stellen. In der Gesamtbilanz liegt hierbei die Netto‐Aktivität des Calvin‐Zyklus

über der des OPP, was u.a. durch die Akkumulation von transitorischer Stärke im Licht in

den Fd2‐KO‐Pflanzen dokumentiert wird (siehe Kapitel 3.1.2.3). Die Teilaktivierung des

OPP im Licht ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen bei geringen NADPH‐Konzentrationen im

Stroma demnach eine Folge des metabolischen Bedarfs und vor allem zur Generierung

von NADPH für die Detoxifizierung von ROS erforderlich. Hierbei gewährleistet die

posttranslationale Regulation der Schlüsselenzyme des Calvin‐Zyklus und des OPP eine

sehr schnelle und effektive Inaktivierung bzw. Aktivierung je nach aktuellem Bedarf und

Redox‐Zustand des stromalen Metabolismus.

Sowohl RubisCO als auch NADP‐MDH sind gute Beispiele für eine posttranslationale

Regulation, die an den metabolischen Bedarf angepasst ist. Hierbei ist die Aktivität der

RubisCO in den Fd2‐KO‐Pflanzen signifikant geringer als in den entsprechenden WT‐

Pflanzen (siehe Kapitel 3.1.2.4), obwohl der Reduktionsgrad des PET in den Fd2‐KO‐

Pflanzen erhöhte Strahlungsintensitäten signalisiert und dies in WT‐Pflanzen zu einer

gesteigerten RubisCO‐Kapazität führt (vgl. Bailey et al., 2001). Ebenso ist der im

Vergleich zu den Noe‐WT‐Pflanzen verringerte Aktivierungszustand der NADP‐MDH in

den Fd2‐KO‐Pflanzen an das oxidierte Stroma angepasst, obwohl in den Fd2‐KO‐

Pflanzen in Folge des vermehrt reduzierten PET eine signifikant erhöhte Kapazität

vorliegt (siehe Kapitel 3.1.3.1). Ähnliche Ergebnisse konnten auch an transgenen

Pflanzen der Art A. thaliana beobachtet werden, wobei der Aktivierungszustand der

NADP‐MDH auch an das oxidiert vorliegende Stroma angepasst ist, obwohl der

Reduktionsgrad des PET einen erhöhten Elektronendruck signalisiert (vgl. Haldrup et al.,

2003; Lintala et al., 2007). Die NADP‐MDH und die RubisCO sind demnach gute Beispiele

einer gekoppelten Kontrolle, da sie zum einen einer Regulation der Genexpression über

den Reduktionsgrad des PET in der Thylakoidmembran unterliegen und zum anderen

die Aktivität in‐vivo mittels einer übergeordneten posttranslationalen Regulation über

den metabolischen Bedarf im Stroma kontrolliert ist.

Insgesamt lassen sich folgende Aussagen zur posttranslationalen Lichtregulation in den

Fd2‐KO‐Pflanzen treffen:

134 Diskussion

1. Viele Enzyme des Chloroplasten‐Metabolismus (z. B. die NADP‐MDH)

unterliegen einer lichtabhängigen Regulation über die Genexpression, werden

aber posttranslational abhängig vom metabolischen Bedarf über Intermediate

und das lichtabhängige Fd‐Trx‐System aktiviert bzw. inaktiviert.

2. Die lichtabhängige Regulation der Genexpression der NADP‐MDH erfolgt über

den Reduktionszustand des PET, während der Aktivierungszustand einer

metabolischen Kontrolle aus dem Stroma unterliegt.

3. Der OPP ist in den Fd2‐KO‐Pflanzen auch im Licht bei Bedarf zur Generierung von

NADPH aktiv.

4. OPP und Calvin‐Zyklus unterliegen einer schnellen und effizienten gegenläufigen

posttranslationalen Regulation, die zum einen die Vitalität und zum anderen das

photoautotrophe Wachstum in den Fd2‐KO‐Pflanzen gewährleistet, wobei die

Netto‐Aktivität des Calvin‐Zyklus höher ist als die des OPP.

Die klassischen Blatt‐Fds Fd1 und Fd2 in A. thaliana – redundant, funktionell differenziert oder beides?

4.2

Die meisten höheren Pflanzen enthalten zwei Blatt‐Fd, so auch A. thaliana (siehe

Kapitel 1.2.2). Ungeklärt ist, welche Funktionen die Blatt‐Fds im photosynthetischen

Elektronentransport übernehmen. In der C4‐Pflanze Mais konnte für FdII eine

verminderte Affinität für die Bindung von FNR nachgewiesen werden (vgl. Matsumura

et al., 1999). FdII wird demnach in Mais eine Rolle als Elektronenüberträger im Fd‐

abhängigen ZET zugeschrieben, während FdI im LET eine essentielle Funktion besitzt

(vgl. Kimata‐Ariga et al., 2000). Die verminderte Bindefähigkeit von FdII an FNR ist auf

einen fehlenden Asparaginsäure‐Rest am C‐Terminus zurückzuführen (vgl. Kimata‐Ariga

et al., 2000; Hanke et al., 2004). In A. thaliana ist dieser Asparaginsäure‐Rest in der AS‐

Sequenz beider Blatt‐Fds konserviert, so dass eine vergleichbare Affinität zur FNR

besteht (vgl. Hanke et al., 2004). Der C‐Terminus der Fd‐Isoformen ist entscheidend für

ihre Bindung an PsaD (vgl. Pizzitutti et al., 2003), da die AS‐Sequenz und folglich die

Struktur am C‐Terminus die Fähigkeit des Fd, Elektronen von PSI aufzunehmen,

beeinflussen (vgl. Gou et al., 2006). In A. thaliana weisen die C‐Termini von Fd1 und Fd2

eine hohe Sequenzähnlichkeit auf, die bei ca. 77 % liegt. (Hierbei wurden für den

C‐Terminus nach Gou et al. (2006) 30 AS‐Reste angenommen und für das Alignment

verwendet). Insgesamt sind die physikalischen Eigenschaften von Fd1 und Fd2

vergleichbar, so auch die Fähigkeit, Elektronen am PSI zu akzeptieren (vgl. Hanke et al.,

2004). Die Tatsache, dass der ZET in C3‐Pflanzen maximal bei 15 % des LET liegt (vgl.

Diskussion 135

Genty et al., 1990; Herbert et al., 1990; Klughammer und Schreiber, 1994; Kramer und

Crofts, 1994; Sacksteder und Kramer, 2000; Joët et al., 2001; Ort und Baker, 2002) und

somit der hauptsächliche Anteil der absorbierten Lichtenergie für den LET genutzt wird,

macht die essentielle Rolle von Fd2, welches mit einen Anteil von ca. 90 % die

dominierende Fd‐Isoform im Chloroplasten ist (vgl. Hanke et al., 2004 und Kapitel 3.1),

für den LET deutlich. In den Fd2‐KO‐Pflanzen, welche trotz des knock‐outs von Fd2

photoautotroph wachsen (siehe Kapitel 3.1), übernimmt wahrscheinlich die

verbleibende Blatt‐Fd‐Isoform Fd1 diese Funktion. Demnach kann sowohl Fd1 als auch

Fd2 in A. thaliana Elektronen im LET übertragen, so dass in diesem Fall die beiden Blatt‐

Fd‐Isoformen redundant sind. Die im Vergleich zu Fd2 geringen Mengen an Fd1, sowie

die Tatsache, dass Fd1 in den Fd2‐KO‐Pflanzen keiner erhöhten Expression unterliegt

(siehe Kapitel 3.1) und eine Akzeptorlimitierung am PSI phänotypische Anpassungen

nach sich zieht, verdeutlichen hingegen, dass Fd1 einen Ausfall von Fd2 nicht

kompensieret. Aus diesem Grund wird für Fd1 eine spezifische Funktion in der

photosynthetischen Elektronenverteilung angenommen.

Hanke und Hase (2008) zeigten erste Hinweise auf, die für Fd1 eine essentielle Rolle im

Fd‐abhängigen ZET indizieren. Die geringen Raten an ZET in C3‐Pflanzen gehen einher

mit dem ebenso geringeren Anteil von Fd1 an den Blatt‐Fds in A. thaliana und deuten

somit auf Fd1 als spezifischen Elektronendonator im Fd‐abhängigen ZET hin. In

Bündelscheidenzellen von C4‐Pflanzen, in welchem dem ZET eine essentielle Funktion in

der Energieversorgung zugeschrieben wird (vgl. Anderson et al., 1971; Chapman et al.,

1980; Woo et al., 1983, Asada et al., 1993; Kubicki et al., 1996; Ivanov et al., 2001), liegt

der Anteil von FdII, welches dem ZET zugeschrieben wird (s. o.), an den Blatt‐Fds mit

ca. 60 % entsprechend hoch, während in den Mesophyllzellen, in welchen hauptsächlich

der LET abläuft, der Anteil an FdII mit ca. 3 % vergleichsweise gering ist (vgl. Kimata und

Hase, 1989). Dieser geringe Anteil an FdII in den Chloroplasten der Mesophyllzellen

entspricht dem geringen Fd1‐Anteil in den Chloroplasten von A. thaliana und

verdeutlicht, dass dem ZET in C3‐Pflanzen nicht die essentielle Funktion zukommt, wie

es für C4‐Pflanzen in den Bündelscheidenzellen der Fall ist.

Werden in den Fd2‐KO‐Pflanzen die geringen Mengen an Fd1 für den LET genutzt, ist

trotz des zunehmend reduzierten PET ein nicht signifikant erhöhter Anteil des ZET (siehe

Kapitel 3.1.2.2, Kapitel 3.2.1.1 und Kapitel 3.2.2.2) auch durch den Mangel an Fd für

diesen Elektronentransportweg zu begründen. Dies verdeutlicht zum einen, dass die

Raten des ZET und des LET über die Verfügbarkeit und den Reduktionsgrad von

Elektronenakzeptoren am PSI reguliert sind (vgl. Bendall und Manasse, 1995; Joët et al.,

136 Diskussion

2001; Joliot und Joliot, 2002), und zum anderen, dass der LET mit einer höheren

Priorität abläuft als der ZET (vgl. Backhausen et al., 2000).

Untersuchungen an Fd1‐KO‐ (siehe Kapitel 3.4) sowie Fd1‐RNAi‐Pflanzen (vgl. Hanke

und Hase, 2008) verdeutlichen zudem die essentielle Rolle von Fd1 im Fd‐abhängigen

ZET in A. thaliana. Ein knock‐out bzw. eine Verringerung des Gehaltes von Fd1 führt

bereits unter moderaten Bedingungen zu signifikanten phänotypischen Anpassungen,

Wachstumsinhibierung und Nekrosenbildung in älteren Blättern (siehe Kapitel 3.4.1.1).

Unter Hochlichtbedingungen kommt es nach kurzer Zeit zur Photoinhibition am PSII und

einer deutlich verringerten Elektronentransporte, was letztlich die CO2‐

Assimilationsraten deutlich herabsetzt (siehe Kapitel 3.4.2.1). Diese Auswirkungen in

den Fd1‐KO‐Pflanzen sind die Folge der verringerten Fähigkeit, einen

Protonengradienten über die Thylakoidmembran zu generieren (siehe Kapitel 3.4.1.2

und Kapitel 3.4.2.1). Allerdings ist dies vor allem im Hochlicht für das poising essentiell

und wird zu großen Teilen dem Fd‐abhängigen ZET zugeschrieben (vgl. Munekage et al.,

2002; Munekage et al., 2004). In den Fd1‐KO‐Pflanzen ist somit von einem inhibierten

bzw. blockierten Fd‐abhängigen ZET auszugehen. Unter moderaten Bedingungen

angezogene transgene Pflanzen der Art A. thaliana mit vollständig blockiertem Fd‐

abhängigen ZET (PGR5‐KO‐Pflanzen) weisen einen ähnlichen Phänotyp auf, wie es für

die Fd1‐KO‐Pflanzen der Fall ist (vgl. Munekage et. al., 2008). Diese signifikant

veränderten Phänotypen der Fd1‐KO‐ und PGR5‐KO‐Pflanzen machen in C3‐Pflanzen

insgesamt die essentielle Funktion des ZETs und im Besonderen die des Fd‐abhängigen

ZETs sowohl unter moderaten Bedingungen als auch im Hochlicht deutlich. Zu beachten

ist hierbei allerdings, dass die Inhibierung im Wachstum in den PGR5‐KO‐ stärker als in

den Fd1‐KO‐Pflanzen ausgeprägt ist. Auch sind die CO2‐Assimilationsraten in den Fd1‐

KO‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen nicht signifikant von denen der

entsprechenden Lae‐WT‐Pflanzen abweichend (siehe Kapitel 3.4.1.2), während sie in

den PGR5‐KO‐Pflanzen deutlich verringert sind. Erst im Hochlicht ist dies auch in den

Fd1‐KO‐Pflanzen der Fall (siehe Kapitel 3.4.2.2). Dies macht deutlich, dass in den Fd1‐

KO‐Pflanzen auf Grund des beschriebenen Phänotyps davon ausgegangen werden muss,

dass der Fd‐abhängige ZET unter moderaten Bedingungen zum Teil noch ablaufen kann,

und somit die Auswirkungen im Vergleich zu den PGR5‐KO‐Pflanzen mit vollständig

blockiertem Fd‐abhängigen ZET vergleichsweise weniger ausgeprägt sind. Hierfür

spricht auch die im Vergleich zu den Lae‐WT‐Pflanzen unter moderaten Bedingungen

unveränderte Kinetik der P700‐Oxidation im NIR (siehe Kapitel 3.4.1.2), wobei die

zweite Phase der P700‐Oxidation im NIR durch den ZET verlangsamt ist (vgl. Joliot et al.,

2005; Breyton et al., 2006; Nandha et al., 2007). Eine redundante Funktion des

Diskussion 137

NDH‐abhängigen ZET wurde bereits von Munekage et al. (2008) als nicht signifikant

postuliert. Dies ist auch in den Fd1‐KO‐Pflanzen zu beobachten, wobei weder unter

moderaten Bedingungen noch im Hochlicht eine signifikant verstärkte Aktivität des

NDH‐abhängigen ZET zu beobachten ist (siehe Kapitel 3.4.1.2 und Kapitel 3.4.2.1). Eine

Redundanz zum Fd‐abhängigen ZET liegt demnach nicht vor. Vielmehr ist der

NDH‐abhängige ZET in C4‐Pflanzen vor allem in den Bündelscheidenzellen zur

Bereitstellung von ATP erforderlich und in den Mesophyllzellen kaum vorhanden (vgl.

Kubicki et al., 1996; Takabayashi et al., 2005; Darie et al., 2006). Demnach kann in den

Fd1‐KO‐Pflanzen trotz des knock‐outs von Fd1 nur von einer Teilinhibierung des Fd‐

abhängigen ZET ausgegangen werden. Somit stellt sich die Frage nach einem zu Fd1

alternativen Elektronenüberträger im Fd‐abhängigen ZET. Es konnte bereits gezeigt

werden, dass Fd1 eine funktionelle Ähnlichkeit zu Fd2 aufzeigt und partiell redundant

im LET fungiert (s. o.), daher ist eine mögliche Funktion von Fd2 und eine Redundanz

der beiden Blatt‐Fds im Fd‐abhängigen ZET sehr wahrscheinlich. So scheint Fd2 unter

moderaten Bedingungen zum Teil die Funktion von Fd1 im Fd‐abhängigen ZET zu

übernehmen, so dass die Folgen eines knock‐outs von Fd1 im Vergleich zu den PGR5‐

KO‐Pflanzen weniger ausgeprägt sind.

Im Hochlicht liegt jedoch eine andere Situation vor. So ist die P700‐Oxidationskinetik im

NIR in Phase 2 nicht, wie in den Lae‐WT‐Pflanzen, durch den ZET verlangsamt (siehe

Kapitel 3.4.2.1). In Folge der signifikant verminderten Fähigkeit der Fd1‐KO‐Pflanzen,

gerade nach kurzer Zeit im Hochlicht einen erhöhten Protonengradienten über die

Thylakoidmembran im Zuge des poising zu generieren, ist der Reduktionsgrad der

Elektronentransportkette deutlich erhöht, was zur Photoinhibition am PSII, signifikant

verringerten Elektronentransport‐ und letztlich verminderten CO2‐Assimilationsraten

führt (siehe Kapitel 3.4.2.2). Die deutlichen Auswirkungen auf den photosynthetischen

Elektronenfluss sind durch den im Hochlicht entstandenen erhöhten Bedarf an ZET (vgl.

Johnson et al., 2005) zu erklären. Wenn das Verhältnis von ZET zu LET über die

Verfügbarkeit an freien Elektronenakzeptoren am PSI bestimmt wird (vgl. Bendall und

Manasse, 1995; Joët et al., 2001; Joliot und Joliot, 2002) und der LET in der

Elektronenverteilung hierarchisch über dem ZET eingeordnet ist (vgl. Backhausen et al.,

2000), so fungiert Fd2 bei erhöhtem Elektronenfluss im Hochlicht nicht mehr bzw. nur in

signifikant geringerem Ausmaß als Elektronendonator für den Fd‐abhängigen ZET.

An älteren Blättern sind die Auswirkungen eines inhibierten ZET bereits unter

moderaten Bedingungen extrem und es kommt in den Fd1‐KO‐Pflanzen zur Bildung von

Nekrosen (siehe Kapitel 3.4.1.1). Es ist bekannt, dass der ATP‐Bedarf in älteren

photosynthetischen Geweben erhöht ist. So fallen z. B. beim Abbau des Chlorophylls

138 Diskussion

Katabolite an, welche aktiv in die Vakuole transportiert werden (vgl. Hörtensteiner und

Kräutler, 2000; Hörtensteiner, 2009). Demnach deuten die Ergebnisse aus den Fd1‐KO‐

Pflanzen darauf hin, dass dem Fd‐abhängigen ZET in A. thaliana in älteren

photosynthetischen Gewebe eine essentielle Funktion zur Einstellung des ATP/NADPH‐

Verhältnisses zukommt und eine Inhibierung des Fd‐abhängigen ZET nicht kompensiert

werden kann.

Die elementare Rolle des Fd‐abhängigen ZET in der Generierung eines erhöhten

Protonengradienten und somit für das poising wird anhand eines Vergleichs der

Fd1‐KO‐ mit den Fd1‐RNAi‐Pflanzen (vgl. Hanke und Hase, 2008) deutlich. Im Gegensatz

zu den Fd1‐KO‐Pflanzen weisen Fd1‐RNAi‐Pflanzen noch restliche Mengen an Fd1 auf

(vgl. Hanke und Hase, 2008), welche somit für den Fd‐abhängigen ZET zur Verfügung

stehen. In Folge dessen kommt es im Hochlicht nicht direkt zur Photoinhibition am PSII,

sondern zunächst zu signifikant erhöhten Elektronentransportraten (siehe

Kapitel 3.4.2.1). Dies ist für die Fd1‐KO‐Pflanzen in ähnlicher Weise nach sehr kurzen

Zeiten im Hochlicht zu beobachten (siehe Kapitel 3.4.1.2). Aus diesem Zusammenhang

wird deutlich, dass die Generierung eines erhöhten Protonengradienten mittels des Fd‐

abhängigen ZET bereits vor einer auftretenden Akzeptorlimitierung am PSI einsetzt. So

kommt es in den Fd1‐RNAi‐Pflanzen im Zuge vermehrt absorbierter Lichtenergie,

welche nicht über poising‐Mechanismen abgeführt wird, zunächst zu erhöhten

Elektronentransportraten, die in den LET fließen. Photoinhibition am PSII tritt vorerst

nicht auf. Hingegen könnten der erhöhte Elektronenfluss und die verminderte Fähigkeit

zum poising zur Bildung von ROS am PSI führen. In den Fd1‐KO‐Pflanzen setzt auf Grund

der Akzeptorlimitierung am PSI sehr schnell Photoinhibition am PSII ein und die

Elektronentransportraten sinken (siehe Kapitel 3.4.2.1). Der Fd‐abhängige ZET ist

demnach für die Herabsetzung der Elektronentransportraten im Zuge einer

Akzeptorlimitierung am PSI essentiell, um frühzeitig Photoinhibition am PSII und die

Akkumulation von ROS zu vermeiden.

Es zeigt sich, dass Fd1 und Fd2 spezifische Funktionen im ZET bzw. LET einnehmen,

allerdings unter bestimmten Bedingungen zum Teil redundant fungieren können, so

lange am PSI keine Akzeptorlimitierung auftritt. Dies begründet auch das Verhältnis von

Fd1 zu Fd2 in den Chloroplasten von A. thaliana, da der Bedarf an Fd1 für den

Fd‐abhängigen ZET weit unter dem Bedarf an Fd2 für den LET liegt. Ein Überschuss an

Fd1 im Chloroplasten könnte einen unkontrolliert hohen Anteil an Fd‐abhängigem ZET

nach sich ziehen und somit einen hohen Protonengradienten über die

Thylakoidmembran generieren, was poising und somit einen verringerten LET nach sich

zieht (vgl. Kramer et al., 1996). Letztlich sind allerdings Verfügbarkeit und der

Diskussion 139

Reduktionsgrad der stromalen Elektronenakzeptoren für das Verhältnis von ZET zu LET

entscheidend (vgl. Bendall und Manasse, 1995; Joët et al., 2001; Joliot und Joliot, 2002).

Insgesamt lassen sich demnach folgende Aussagen in Bezug auf die Funktion der

klassischen Blatt‐Fd Isoformen in A. thaliana treffen (siehe Abb. 4.1):

1. Fd1 nimmt eine essentielle Rolle im Fd‐abhängigen ZET ein.

2. Fd2 ist hauptsächlich Elektronenüberträger im LET der Photosynthese.

3. Fd1 und Fd2 sind in ihren Funktionen zum Teil redundant.

Zusätzlich konnte bestätigt werden, dass der Fd‐abhängige ZET in C3‐Pflanzen unter

moderaten Bedingungen, vor allem aber im Hochlicht, essentiell ist und der NDH‐

abhängige ZET nur sehr bedingt eine redundante Funktion besitzt. Zudem scheint der

Fd‐abhängige ZET auch in älteren photosynthetischen Geweben eine entscheidende

Rolle in der Abdeckung des erhöhten ATP‐Bedarfs einzunehmen.

Abb. 4.1: Schematische Darstellung der Funktionen der klassischen Blatt‐Fds in A. thaliana. Es sind die hypothetischen Funktionen von Fd1 und Fd2 im LET und ZET aufgezeigt, wobei Fd2 hauptsächlich im LET und Fd1 im ZET involviert ist. Die gestrichelten Linien kennzeichnen die redundanten Funktionen von Fd1 und Fd2 im ZET und LET (siehe Text).

140 Diskussion

Neue FdC1‐Isoform als alternativer Elektronenakzeptor am PSI 4.3

Mit FdC1 konnte im Rahmen dieser Arbeit eine neue Fd‐Isoform identifiziert werden,

welche im Vergleich zu den klassischen Fds eine C‐terminale Sequenzerweiterung um

acht AS aufweist (siehe Kapitel 3.3.1). Diese neue Fd‐Isoform ist im Chloroplasten

lokalisiert (siehe Kapitel 3.3.2) und zeigt signifikante Homologien zu Fd‐Isoformen in

Cyanobakterien und Algen auf, welche ebenfalls durch eine C‐terminale

Sequenzerweiterung charakterisiert sind (siehe Kapitel 3.3.1). Frühere Studien am

Proteom der Chloroplasten bestätigen die Existenz von FdC1‐Peptiden (vgl. Zybailov et

al., 2008).

Die Tatsache, dass FdC1 in vielen Pflanzen konserviert ist (siehe Kapitel 3.3.1) sowie das

Vorkommen homologer Proteine in Algen und Cyanobakterien weist auf eine

konservierte, essentielle Funktion von FdC1 hin. Hierbei ist die C‐terminale

Sequenzerweiterung zwar nicht vollständig konserviert von Cyanobakterien zu höheren

Pflanzen, allerdings innerhalb der höheren Pflanzen hoch konserviert (siehe

Kapitel 3.3.1). Diese C‐terminale Sequenzerweiterung verursacht im Vergleich zu den

klassischen Blatt‐Fds eine Einschränkung in der Interaktion mit PSI (vgl. Pizzitutti et al.,

2003). Demnach scheint eine Funktion von FdC1 als Elektronenakzeptor im

photosynthetischen Elektronentransport zunächst als unwahrscheinlich. In‐vitro‐

Untersuchungen machten allerdings deutlich, dass FdC1 als Elektronenakzeptor am PSI

fungieren kann (Hanke, unpubl.) und somit eine Alternative zu den klassischen Blatt‐Fds

in A. thaliana darstellen könnte.

In A. thaliana ist der photosynthetische Elektronentransport nicht allein abhängig von

einer zentralen Fd‐Isoform, vielmehr können beide bis dato beschriebenen Blatt‐Fd‐

Isoformen als Elektronenverteiler am PSI zum Teil redundant fungieren

(siehe Kapitel 4.2). Erst diese Tatsache ermöglicht das photoautotrophe Wachstum der

Fd2‐KO‐Pflanzen, wobei auf Grund des Fehlens von Fd2 eine Akzeptorlimitierung am PSI

auftritt und es in Folge dessen zur Lichtakklimation kommt (siehe Kapitel 3.1). Gerade

bei der auftretenden Akzeptorlimitierung am PSI in Folge des knock‐outs von Fd2 wäre

eine erhöhte Expression der redundanten Fd‐Isoform Fd1 zu erwarten gewesen. Dies

erfolgt in den Fd2‐KO‐Pflanzen allerdings nicht (siehe Kapitel 3.1). Hingegen ist die

Transkriptmenge der FdC1‐Isoform in den Fd2‐KO‐Pflanzen signifikant erhöht (siehe

Kapitel 3.3). Die Tatsache, dass die Genexpression diverser Proteine, welche in der

Lichtreaktion involviert sind, über den Reduktionsgrad des PET in der

Thylakoidmembran kontrolliert werden (vgl. Maiwald et al., 2003 und Kapitel 4.1.2), legt

für die erhöhte Transkriptmenge von FdC1 in den Fd2‐KO‐Pflanzen ein Signal aus dem

verstärkt reduzierten PET nahe. Pflanzen mit einer Mutation in der у‐Untereinheit der

Diskussion 141

plastidären ATPase (DPA‐Mutanten), in denen kein funktionierender ATPase‐Komplex

gebildet wird, wachsen dagegen nicht photoautotroph (vgl. dal Bosco et al., 2004).

Diese Pflanzen sind nicht in der Lage, den Protonengradienten über die

Thylakoidmembran abzubauen, so dass ein signifikant gesteigerter Anteil an NPQ

eintritt. Das Expressionsniveau vieler photosynthetischer Gene ist in Folge dessen

signifikant verändert, z. B. sind einige PSI‐ und PSII‐Untereinheiten verstärkt bzw.

schwächer exprimiert. Des Weiteren ist das Transkript von FdC1 in diesen Pflanzen um

60 % verringert, obwohl der Reduktionsgrad des PET signifikant erhöht vorliegt. Wie in

Kapitel 4.1.2 beschrieben, kommt als Signalursprung für die Änderung des

Expressionsniveaus von Genen, die über den Reduktionsgrad des PET reguliert werden,

der PQ‐Pool in Frage (vgl. Pogson et al., 2008). Sowohl die Fd2‐KO‐Pflanzen (siehe

Kapitel 3.1.2.2) als auch die DPA‐Mutanten weisen einen signifikant erhöhten

Reduktionsgrad des PQ‐Pools auf. Allerdings ist die Regulation der Genexpression

gegenläufig (s. o.), so dass im Fall von FdC1 ein Signalursprung am PQ‐Pool

unwahrscheinlich ist. Ist FdC1 ein ebenfalls über den Reduktionsgrad des PET reguliertes

Protein, so könnte die Kontrolle in diesem Fall über die Verfügbarkeit von

Elektronenakzeptoren am PSI erfolgen (vgl. Baier et al., 2004; Piippo et al., 2006).

FdC1 kann Elektronen vom PSI akzeptieren, zeigt allerdings eine leicht verringerte

Affinität zum PSI und eine signifikant schwächere Bindungsfähigkeit zur FNR im

Vergleich zu den klassischen Blatt‐Fds auf (s. o.). Die Elektronenverteilung am PSI

unterliegt einer hierarchischen Ordnung, wobei Elektronen zunächst auf Blatt‐Fds für

assimilatorische Prozesse doniert werden und zuletzt, im Falle einer starken

Akzeptorlimitierung, Elektronen auf O2 übertragen werden (vgl. Backhausen et al.,

2000). FdC1 könnte als alternativer Elektronenakzeptor am PSI in dieser Hierarchie eine

Rolle spielen, wobei die leicht geringere Affinität zum PSI gewährleistet, dass FdC1 als

Elektronenakzeptor nicht in Konkurrenz zu den klassischen Blatt‐Fds steht. Sind Fd1 und

Fd2 unter bestimmten Bedingungen vollständig reduziert, z. B. in Folge eines Mangels

an stromalen Akzeptoren oder durch einen erhöhten Elektronenfluss im PET in Folge

extrem gesteigerter Lichtintensitäten, wäre eine Interaktion von FdC1 mit PSI

vorstellbar, um überschüssige Elektronen aus dem PET abzuführen. Eine Rolle von FdC1

im Fd‐abhängigen ZET kann anhand der Untersuchungen an den FdC1‐RNAi‐ (siehe

Kapitel 3.3.3) und der Fd1‐KO‐Pflanzen (siehe Kapitel 3.4) wahrscheinlich

ausgeschlossen werden. Ebenso zeigen die Analysen an den FdC1‐RNAi‐Pflanzen, dass

eine Funktion von FdC1 in der Photorespiration unwahrscheinlich ist. Die erhöhte

Transkriptmenge von FdC1 in den Fd2‐KO‐Pflanzen bei gleich bleibender

Photorespiration unter moderaten Bedingungen ist hierfür ein weiterer Hinweis. Es ist

142 Diskussion

allerdings zu beachten, dass auf Grund der möglichen Redundanz der Fd‐Isoformen

weitere Untersuchungen notwendig sind, um klare Aussagen treffen zu können.

Alternativ wäre auch denkbar, dass FdC1 einen schnellen Elektronentransfer von PSI auf

O2 im Zuge der Mehler‐Reaktion fördert. Die Generierung von ROS im Stroma in Folge

eines überschüssigen Elektronentransportes würde in diesem Fall einer völligen

Blockierung des PET vorbeugen und den Elektronendruck verringern. ROS kann effektiv

über antioxidative Systeme detoxifiziert werden (siehe Kapitel 1.4.3). In den Fd2‐KO‐

Pflanzen ist sowohl eine erhöhte Bildung von ROS als auch eine verstärkte Aktivität

alternativer antioxidativer Systeme zu beobachten (siehe Kapitel 3.1.4), was mit der

verstärkten Expression von FdC1 einhergeht. Zudem ist in den FdC1‐RNAi‐Pflanzen vor

allem im Hochlicht eine verringerte Elektronentransportrate und ein erhöhter Anteil

NPQ zu detektieren (siehe Kapitel 3.3.3). Dies sind diesem Falle im Zuge des Mangels an

Elektronenakzeptoren und speziell FdC1 erste Anzeichen einer Blockierung des PET

durch Überreduktion. ROS nicht nur ein toxisches Intermediat dar, sondern wird auch

als regulatorischer Faktor in der Genexpression vieler Proteine, z. B. auch

photosynthetischer Gene, diskutiert (vgl. Mittler et al., 2004; Foyer und Noctor, 2005;

Fujita et al., 2006 und Kapitel 4.1.2). Eine durch FdC1 erhöhte und schnellere

Akkumulation von ROS würde zu einem veränderten Signalling in den Chloroplasten

führen, so dass FdC1 als möglicher Ursprung eines Redox‐Signals aus dem PET an der

Akzeptorseite des PSI in Frage kommt (siehe Kapitel 4.1.2). Hierbei ist anzunehmen,

dass sowohl der Redoxzustand von FdC1 als auch die Menge an reduzierten FdC1 für

eine Signalweiterleitung entscheidende Faktoren sind.

Insgesamt lassen sich folgende Aussagen über die neue FdC1‐Isoform treffen

(siehe Abb. 4.2):

1. FdC1 ist in den Chloroplasten lokalisiert.

2. FdC1 kann als Elektronenakzeptor am PSI Elektronen aufnehmen, allerdings

nicht zur Reduktion von NADP+ auf FNR übertragen.

3. Die Bindungsaffinität der klassischen Blatt‐Fds zum PSI liegt höher als die von

FdC1, so dass keine Konkurrenz entstehen kann.

4. Es erscheint möglich, dass FdC1 im Falle einer Akzeptorlimitierung am PSI

Elektronen auf O2 überträgt und somit einer Überreduktion und Blockierung des

PET vorbeugt oder auch als Redox‐Signal dient.

Diskussion 143

Abb. 4.2: Hypothetische Funktion von FdC1 als Elektronenakzeptor am PSI. Schematisch dargestellt ist die mögliche Funktion von FdC1 im PET. Auf Grund der geringeren Affinität zum PSI ist dies vor allem bei einer Akzeptorlimitierung am PSI, z. B. bei extremen Strahlungsintensitäten, gegeben.

144 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung In Rahmen dieser Arbeit sollten an transgenen Pflanzen der Art A. thaliana die

Mechanismen zur Anpassung an stark erhöhte Strahlungsintensitäten und die Funktion

unterschiedlicher Fd‐Isoformen aufgeklärt werden. Fd2‐KO‐Pflanzen stellen im Zuge der

drastischen Akzeptorlimitierung am PSI ein ideales Modell zur Simulation der Situation

unter extremen Strahlungsintensitäten dar. Hierbei konnte gezeigt werden, dass

Pflanzen in der Lage sind, normales und photoautotrophes Wachstum selbst unter

extremsten Bedingungen zu ermöglichen. Dies geschieht im Zuge einer

Langzeitakklimation, wobei Komponenten des Photosyntheseapparates zur

Aufrechterhaltung der Redox‐Homöostase kontrolliert abgebaut werden. Eine solche

Langzeitakklimation, welche sich bereits in der Entwicklung der Pflanzen zeigt, stellt

einen effektiven Schutz‐Mechanismus bei extremen Strahlungsintensitäten dar, sobald

die Kapazität der klassischen poising‐Mechanismen ausgeschöpft ist. Hierbei zeigte sich,

dass in diesen akklimatisierten Pflanzen eine kurzfristige Justierung der Redox‐

Homöostase über die klassischen poising‐Mechanismen nur begrenzt funktioniert.

Stattdessen setzen extreme Formen des poisings ein, wie z. B. eine erhöhte Rate an

Photorespiration oder die kontrollierte Degradation des PSI. Die Regulation dieser

Mechanismen und die Induktion einer Langzeitakklimation sind hierbei abhängig vom

Reduktionsgrad der photosynthetischen Elektronentransportkette, der als Indikator für

die Kapazität der Photosynthese herangezogen werden kann. Der Reduktionsgrad des

photosynthetischen Elektronentransportes kann hierbei als Signal für die Änderung der

Genexpression im Kern gesehen werden, was zu einer Langzeitakklimation an erhöhte

Lichtintensitäten führt. Ebenso wird die Kapazität von im Licht bedeutenden Enzymen,

z. B. die Expression von RubisCO als Schlüsselenzym im Calvin‐Zyklus oder von NADP‐

MDH als poising‐Mechanismus, über den Reduktionsgrad des photosynthetischen

Elektronentransportes kontrolliert. Hingegen ist eine Änderung der Genexpression zur

Optimierung der in den Chloroplasten im Dunkeln ablaufenden Prozesse an den

metabolischen Bedarf im Stroma gekoppelt.

Die Fd2‐KO‐Pflanzen weisen einen gegenläufigen Reduktionszustand vom

photosynthetischen Elektronentransport und Stroma auf, wobei die photosynthetische

Elektronentransportkette stark reduziert und das Stroma oxidiert vorliegt. Diese

Tatsache ermöglichte eine weitergehende Untersuchung der Regulationsvorgänge von

Enzymen im Stroma. Die Schlüsselenzyme des stromalen Metabolismus unterliegen

einer lichtabhängigen Regulation ihrer Kapazität und gleichzeitig einer

posttranslationalen Regulation über Intermediate und das lichtabhängige Fd‐Trx‐

System, welche übergeordnet die Aktivität der Enzyme an den metabolischen Bedarf

Zusammenfassung 145

anpassen. So war in den Fd2‐KO‐Pflanzen auf Grund des oxidiert vorliegenden Stromas

G6PDH, ein lichtinaktiviertes Enzym des oxidativen Pentosephosphatwegs, im Licht

aktiv. Dies dient der Generierung von NADPH zum Abbau von ROS, das vermehrt im

Zuge der stark reduzierten photosynthetischen Elektronentransportkette in den Fd2‐

KO‐Pflanzen gebildet wird und auf Grund des Mangels an Fd am PSI nicht mit der

Reduktionskraft aus der Photosynthese abgebaut werden kann. Oxidativer

Pentosephosphatweg und Calvin‐Zyklus unterliegen einer sehr schnellen, gegenläufigen,

posttranslationalen Regulation, um zum einen die Vitalität und zum anderen das

photoautotrophe Wachstum zu gewährleisten. Die Aktivität des Calvin‐Zyklus ist hierbei

allerdings insgesamt größer als die des oxidativen Pentosephosphatwegs, was daher

dennoch in einem Nettogewinn an Assimilaten resultiert.

Neben der Aufklärung regulatorischer Prozesse in den Chloroplasten stand im Rahmen

dieser Arbeit die Funktionsanalyse unterschiedlicher Fd‐Isoformen im Fokus. Anhand

von Fd1‐KO‐, Fd2‐KO‐ und Fd1‐RNAi‐Pflanzen wurde für Fd1 eine spezifische Funktion

im Fd‐abhängigen zyklischen Elektronentransport und für Fd2 eine spezifische Funktion

im linearen Elektronentransport aufgezeigt. Fd1 und Fd2 sind jedoch zum Teil

redundant, wobei die Verfügbarkeit an freien Akzeptoren am PSI entscheidend ist und

der lineare Transport mit höherer Priorität abläuft. In diesem Zusammenhang konnte

gezeigt werden, dass der zyklische Elektronentransport in C3‐Pflanzen kein Artefakt ist,

sondern auch unter moderaten Bedingungen eine essentielle Funktion zur

Aufrechterhaltung der Redox‐Homöostase besitzt.

Mit FdC1 wurde eine alternative Fd‐Isoform charakterisiert, welche in den

Chloroplasten lokalisiert ist und im photosynthetischen Elektronentransport involviert

ist. Bei einer Akzeptorlimitierung kann FdC1 Elektronen am PSI aufnehmen, allerdings

nicht auf FNR zur Generierung von NADPH übertragen. Ebenso konnte eine Funktion

von FdC1 im zyklischen Elektronentransport und in der Photorespiration ausgeschlossen

werden. Es ist allerdings wahrscheinlich, dass FdC1 Elektronen vom PSI auf O2 überträgt,

um eine Blockade des photosynthetischen Elektronentransportes zu vermeiden.

Außerdem kann der Redoxzustand bzw. die Menge an FdC1 als Signal für eine

veränderte Genexpression im Zuge eines stark reduzierten photosynthetischen

Elektronentransportes postuliert werden.

Um ein detailliertes Bild über die Regulationsvorgänge und Anpassungsmechanismen in

den Chloroplasten bezogen auf erhöhte Lichtintensitäten zu bekommen, sind weitere

Untersuchungen notwendig. Die im Rahmen dieser Arbeit gesammelten Erkenntnisse

bieten eine gute Grundlage, um anhand der Fd2‐KO‐Pflanzen die photosynthetischen

Regulationsmechanismen als Modell weiter aufzuklären. Dies trifft ebenso auf die

146 Zusammenfassung

Funktionen der Fd‐Isoformen im photosynthetischen Elektronentransport zu.

Aufbauend auf die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Ergebnisse bieten die

verwendeten transgenen Pflanzen ein perfektes Tool zur weiteren Funktionsaufklärung

der photosynthetischen Fd‐Isoformen. Hierbei sollte vor allem die Charakterisierung der

zweiten neuen Fd‐Isoform FdC2 und die Einordnung der Funktionen von FdC1 und FdC2

im photosynthetischen Elektronentransport eine Rolle spielen. Erkenntnisse in diesem

Zusammenhang würden zum besseren Verständnis der molekularen Abläufe der

Photosynthesereaktion beitragen und letztlich deren Optimierung ermöglichen.

Abstract 147

6 Abstract Ferredoxins are the major distributors for electrons to the various acceptor systems in

plastids. In green tissues, ferredoxins are reduced by photosynthetic electron flow in

the light, while in heterotrophic tissues, NADPH, generated in the oxidative pentose

phosphate pathway, is the reductant. In higher plants different ferredoxin isoforms,

containing two leaf‐type ferredoxins involved in photosynthetic electron flow, are

currently known. In this work Ds‐T‐DNA‐insertion line of Arabidopsis thaliana for the

coding region of the major leaf ferredoxin (Fd2, At1g60950) is used to create a situation

of high electron pressure in the thylakoids. Although these plants possess only the

second, minor photosynthetic ferredoxin isoform (Fd1, At1g10960), they grow

photoautotrophically on soil, but with a lower growth rate and less chlorophyll. The

highly reduced photosynthetic electron transport chain causes an extreme form of

acclimation to high light, while the oxidized stroma leads to a re‐adjustment of the

chloroplast metabolism helping the plants to survive under these light‐stress conditions.

Redox homeostasis is achieved by regulation at both, the post‐transcriptional and the

transcriptional level. Alterations in gene expression due to acclimation steps and also

the expression of NADP‐dependent malate dehydrogenase, on of the poising

mechanisms, via retrograte signalling are caused by a signal originating from the

reduced photosynthetic electron flow.

Using additionally Ds‐T‐DNA‐insertion lines of A. thaliana for the coding region of Fd1

and transgenic approaches for gene silencing of Fd1, different functions of the two

photosynthetic isoforms in A. thaliana are observed. Thereby Fd1 plays a significant role

in Fd‐dependent cyclic electron flow, and Fd2 predominantly drives the linear elelctron

flow to generate NADPH. However, these specific functions are partly redundant. Using

these transgenic lines of A. thaliana the essential function of ferredoxin‐dependent

cyclic electron flow in C3‐plants became clear. In addition to the known ferredoxin

isoforms in A. thaliana, the genome contains sequences coding for novel, unstudied

ferredoxin‐like proteins (FdC1 and FdC2) with extended C‐termini, for which there are

homologues in other photosynthetic organisms. In the Ds‐T‐DNA‐insertion line of

A. thaliana for the coding region of Fd2, the transcript level of FdC1 is increased.

Moreover, FdC1 is located in the chloroplasts and able to accept electrons from PSI. This

implies an important role for FdC1 under conditions of high‐electron pressure in the

photosynthetic electron transport chain. An involvement of FdC1 in linear and cyclic

flow or photorespiration is not likely, but FdC1 might act as electron carrier for

reduction of O2 and/or as a signalling molecule.

148 Literaturverzeichnis

7 Literaturverzeichnis Adir, N., Zer, H., Shochat, S. und Ohad, I. (2003) Photoinhibition: A historical perspective. Photosynth. Res.

76: 343‐370. Ahn, J.H. (2002) Noncompetitive RT‐PCR. In: Arabidopsis. A Laboratory Manual (Weigel, D. und

Glazebrook, J, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York: 174‐176. Albertsson, P.A. (2001) A quantitative model of the domain structure of the photosynthetic membrane.

Trends Plant Sci. 6: 349‐358. Allakhverdiev, S.I. und Murata, N. (2004) Environmental stress inhibits the synthesis de novo of proteins

involved in the photodamagerepair cycle of photosystem II in Synechocystis sp. PCC 6803. Biochim. Biophys. Acta 1657: 23–32.

Allen, J.F. (2003) Cyclic, pseudocyclic and noncyclic photophosphorylation: New links in the chain. Trends Plant Sci. 8: 15‐19.

Andersen, B., Kock, B. und Scheller, H.V. (1992) Structural and functional analysis of the reducing side of photosystem I. Physiol. Plant. 84: 154‐161.

Anderson, J.M. (1999) Insight into consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: A personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26: 625–639.

Anderson, J.M. und Osmond, C.B. (1987) Shade‐sun responses: Compromises between acclimation and photoinhibition. In: Photoinhibition (Kyle, D.J., Osmond, C.B. und Arntzen, C.J., eds.), Elsevier, Amsterdam: 1‐36.

Anderson, J.M., Boardman, N.K. und Spencer, D. (1971) Phosphorylation by intact bundle sheath chloroplasts from maize. Biochim. Biophys. Acta 245: 253–258.

Ankele, E., Kindgren, P., Pesquet, E. und Strand, Å. (2007) In vivo visualization of Mg‐protoporphyrin IX, a coordinator of photosynthetic gene expression in the nucleus and the chloroplast. Plant Cell 19: 1964–1979.

Aro, E.‐M., Virgin, I. und Andersson, B. (1993) Photoinhibition of photosystem II: Inactivation, protein damage and turnover. Biochim. Biophys. Acta 1143: 113–134.

Aroca, R., Irigoyen, J.J. und Sánchez‐Díaz, M. (2001) Photosynthetic characteristics and protective mechanisms against oxidative stress during chilling and subsequent recovery in two maize varieties differing in chilling sensitivity. Plant Sci. 161: 719–726.

Arrigoni, O. und De Tullio, M.C. (2002) Ascorbic acid: Much more than just an antioxidant. Biochim. Biophys. Acta 1569: 1–9.

Asada, K. (1999) The water‐water cycle in chloroplasts: Scavenging of active oxygen and dissipation of excess photons. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 601–639.

Asada, K. (2000) The water‐water cycle as alternative photon and electron sinks. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B 355: 1419‐1431.

Asada, K., Heber, U. und Schreiber, U. (1993) Electron flow to the intersystem chain from stromal components and cyclic electron flow in maize chloroplasts, as detected in intact leaves by monitoring redox change of P700 and chlorophyll fluorescence. Plant Cell Physiol. 34: 39–50.

Avenson, T.J., Kanazawa, A., Cruz, J.A., Takizawa, K., Ettinger, W.E. und Kramer, D.M. (2005) Integrating the proton circuit into photosynthesis: Progress and challenges. Plant Cell Environ. 28: 97‐109.

Backhausen, J.E., Emmerlich, A., Holtgrefe, S., Horton, P., Nast, G., Rogers, J.J.M., Müller‐Röber, B. und Scheibe, R. (1998) Transgenic potato plants with altered expression levels of chloroplast NADP‐malate dehydrogenase: Interactions between photosynthetic electron transport and malate metabolism in leaves and in isolated intact chloroplasts. Planta 207: 105‐114.

Backhausen, J.E., Kitzmann, C. und Scheibe, R. (1994) Competition between electron acceptors in photosynthe‐sis: Regulation of the malate valve during CO2 fixation and nitrite reduction. Photosynth. Res. 42: 75‐86.

Backhausen, J.E., Kitzmann, C., Horton, P. und Scheibe, R. (2000) Electron acceptors in isolated intact spinach chloroplasts act hierarchically to prevent over‐reduction and competition for electrons. Photosynth. Res. 64: 1‐13.

Backhausen, J.E., Vetter, S., Baalmann, E., Kitzmann, C. und Scheibe, R. (1998) NAD‐dependent malate dehydrogenase and glyceraldehyde 3‐phosphate dehydrogenase isoenzymes play an important role in dark metabolism of various plastid types. Planta 205: 359‐366.

Badger, M.R. (1985) Photosynthetic oxygen exchange. Ann. Rev. Plant Physiol. 36: 27‐53.

Literaturverzeichnis 149

Baier, M. und Dietz, K.‐J. (1997) The plant 2‐Cys peroxiredoxin BAS1 is a nuclear encoded chloroplast protein. Its expressional regulation, phylogenetic origin, and implications for its specific physiological function in plants. Plant J. 12: 179‐190.

Baier, M. und Dietz, K.‐J. (1999) Alkyl hydroperoxide reductases: The way out of the oxidative breakdown of lipids in chloropasts. Trends Plant Sci. 4: 166‐168.

Baier, M., Noctor, G., Foyer, C.H. und Dietz, K.‐J. (2000) Antisense suppression of 2‐Cys peroxiredoxin in Arabidopsis thaliana specifically enhances the activities and expression of enzymes associated with ascorbate metabolism, but not glutathione metabolism. Plant Physiol. 124: 823‐832.

Baier, M., Ströher, E. und Dietz, K.‐J. (2004) The acceptor availability at photosystem I and ABA control nuclear expression of 2‐Cys peroxiredoxin‐A in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 45: 997‐1006.

Bailey, S., Walters, R.G., Jansson, S. und Horton, P. (2001) Acclimation of Arabidopsis thaliana to the light environment: The existence of separate low light and high light responses. Planta 213: 794‐801.

Bailey‐Serres, J. und Mittler, R. (2006) The roles of reactive oxygen species in plant cells. Plant Physiol. 141: 311.

Baker ,N.R. und Oxborough, K. (2004) Chlorophyll fluorescence as a probe of photosynthetic productivity. In: Chlorophyll a Fluorescence: A Signature of Photosynthesis, (Papageorgiou, G.C. and Govindjee, eds.), pp. 65‐82, Springer, Dordrecht, The Netherlands.

Baker, N.R. (2008) Chlorophyll fluorescence: A probe of photosynthesis in vivo. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 89‐113.

Baker, N.R., Harbinson, J. und Kramer, D.M. (2007) Determining the limitations and regulation of photosynthetic energy transduction in leaves. Plant Cell Environ. 30: 1107‐1125.

Barber, J. (2002) Photosystem II: A multisubunit membrane protein that oxidises water. Curr. Opin. Struct. Biol. 12: 523‐530.

Barth, C., Krause, G.H. und Winter, K. (2001) Responses of photosystem I compared with photosystem II to high‐light stress in tropical shade and sun leaves. Plant Cell Environ. 24: 163‐176.

Becker, B., Holtgrefe, S., Jung, S., Wunrau, C., Kandlbinder, A., Baier, M., Dietz, K.‐J., Backhausen, J.E. und Scheibe, R. (2006) Influence of the photoperiod on redox regulation and stress responses in Arabidopsis thaliana L. (Heynh.) plants under long‐ and short‐day conditions. Planta 224: 380‐393.

Ben Shem, A., Frolow, F. und Nelson, N. (2003) Crystal structure of plant photosystem I. Nature 426: 630‐635.

Bendall, D.S. und Manasse, R.S. (1995) Cyclic photophosphorylation and electron transport. Biochim. Biophys. Acta 1229: 23‐38.

Björkman, O. und Demmig, B. (1987) Photon yield of O2 evolution and chlorophyll fluorescence at 77 K among vascular plants of diverse origins. Planta 170: 489‐540.

Boudreaux, B.F., MacMillan, C., Teutloff, R., Agalarov, F., Gu, S., Grimaldi, S., Bittl, R., Brettel, K. und Redding, K. (2001) Mutations in both sides of the photosystem I reaction center identify the phylloquinone observed by electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 276: 37299‐37306.

Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein‐dye binding. Anal. Biochem. 72: 248–254.

Brettel, K. (1997) Electron transfer and arrangement of the redox cofactors in photosystem I. Biochim. Biophys. Acta 1318: 322‐373.

Brettel, K. und Sétif, P. (1987) Magnetic‐field effects on primary reactions in photosystem I. Biochim. Biophys Acta 893: 109‐114.

Breyton, C., Nandha, B., Johnson, G.N., Joliot, P. und Finazzi, G. (2006) Redox modulation of cyclic electron flow around photosystem I in C3 plants. Biochemistry 45: 13465‐13475.

Broin, M., Cuine, S., Eymery, F. und Rey, P. (2002) The plastidic 2‐cysteine peroxiredoxin is a target for a thioredoxin involved in the protection of the photosynthetic apparatus against oxidative damage. Plant Cell 14: 1417‐1432.

Buchanan, B., Gruissem, W. und Jones, R.J. (2000) Biochemistry & Molecular Biology of Plants. Courier Companies, USA.

Buchanan, B.B. (1980) Role of light in the regulation of chloroplast enzymes. Annu. Rev. Plant Physiol. 31: 341‐374.

Buchanan, B.B. und Balmer, Y. (2005) Redox regulation: A broadening horizon. Annu. Rev. Plant Biol. 56: 187‐220.

Buchanan, B.B., Wolosiuk, R.A. und Schürmann, P. (1979) Thioredoxin and enzyme regulation. Trends Biochem. Sci. 4: 93‐96.


Bullock, W.O., Fernandez, J.M. und Short, J.M. (1987) XL1‐Blue: A high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta‐galactosidase selection. Biotechniques 5: 376‐378.

Burnette, W.N. (1981) “Western blotting": Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate‐polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112: 195‐203.

Burrows, P.A., Sazanov, L.A., Svab, Z., Maliga, P. und Nixon, P.J. (1998) Identification of a functional respiratory complex in chloroplasts through analysis of tobacco mutants containing disrupted plastid ndh genes. EMBO J. 17: 868‐876.

Chapman, K.S.R., Berry, J.A. und Hatch, M.D. (1980) Photosynthetic metabolism in bundle sheath cells of the C4 species Zea mays: Sources of ATP and NADPH and the contribution of photosystem II. Arch. Biochem. Biophys. 201: 330‐341.

Chen, W.J. und Zhu, T. (2004) Networks of transcription factors with roles in environmental stress response. Trends Plant Sci. 9: 591‐596.

Chitnis, P.R. (1996) Photosystem I. Plant Physiol. 111: 661‐669. Chitnis, P.R. (2001) Photosystem I. Function and physiology. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52:

593‐626. Chitnis, V.P. und Chitnis, P.R. (1993) PsaL subunit is required for the formation of photosystem I trimers in

the cyanobacterium Scynechocystis sp. PCC 6803. FEBS Lett. 336: 330–334. chlorophyll fluorometer. Photosynth. Res. 9: 261‐272.

Chomczynski, P. und Mackey, K. (1995) Modification of the Tri reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide‐ and proteoglycan‐rich sources. Biotechniques 19: 924‐925.

Chomczynski, P. und Sacchi, N. (1987) Single‐step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate‐phenol‐chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156‐159.

Clarke, J.E. und Johnson, G.N. (2001) In vivo temperature dependence of cyclic and pseudocyclic electron transport in barley. Planta 212: 808‐816.

Cleland, R.E. und Bendall, D.S. (1992) Photosystem I cyclic electron transport: Measurement of ferredoxin‐plastoquinone reductase activity. Photosynth. Res. 34: 409‐418.

Cohen, R.O., Shen, G., Golbeck, J.H., Xu, W., Chitnis, P.R.,Valieva, A.I., van der Est, A., Pushkar, Y. und Stehlik, D. (2004) Evidence for asymmetric electron transfer in cyanobacterial photosystem I: Analysis of a methionine to leucine mutation of the ligand to the primary electron acceptor A0. Biochemistry 43: 4741‐4754.

Cohen, S.N., Chang, A.C.Y. und Hsu, L. (1972) Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of Escherichia coli by R‐factor DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110‐2114.

Collin, V., Issakidis‐Bourguet, E., Marchand, C., Hirasawa, M., Lancelin, J.M., Knaff, D.B. und Miginiac‐Maslow, M. (2003) The Arabidopsis plastidial thioredoxins: New functions and new insights into specificity. J. Biol. Chem. 278: 23747‐23752.

Cominelli, E., Gusmaroli, G., Allegra, D., Galbiati, M., Wade, H.K., Jenkins, G.I. und Tonelli, C. (2008) Expression analysis of anthocyanin regulatory genes in response to diVerent light qualities in Arabidopsis thaliana. J. Plant Physiol. 165: 886‐894.

Cox, G.B., Den Venish, R.J., Gibson, F., Howitt, S.M. und Nagley, P. (1992) The structure and assembly of ATP synthase. In: Molecular Mechanisms in Bioenergetics (Enster, L., ed.), Elsevier, Amsterdam: 121‐143.

Dal Bosco, C., Lezhneva, L., Biehl, A., Leister, D., Strotmann, H., Wanner, G. und Meurer, J. (2004) Inactivation of the chloroplast ATP synthase γ subunit results in high non‐photochemical fluorescence quenching and altered nuclear gene expression in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 279: 1060‐1069.

DalCorso, G., Pesaresi, P., Masiero, S., Aseeva, E., Schünemann, D., Finazzi, G., Joliot, P., Barbato, R. und Leister, D. (2008) A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell 132: 273‐285.

Darie, C.C., De Pascalis, L., Mutschler, B. und Haehnel, W. (2006) Studies of the Ndh complex and photosystem II from mesophyll and bundle sheath chloroplasts of the C‐4‐type plant Zea mays. J. Plant Physiol. 163: 800‐808.

Dau, H. (1994) Molecular mechanisms and quantitative models of variable photosystem II fluorescence. Photochem. Photobiol. 60: 1‐23.

Davletova, S., Rizhsky, L., Liang, H., Shengqiang, Z., Oliver, D.J., Coutu, J., Shulaev, V., Schlauch, K. und Mittler, R. (2005) Cytosolic ascorbate peroxidase 1 is a central component of the reactive oxygen gene network of Arabidopsis. Plant Cell 17: 268‐281.


Dekker, J.P. und Boekema, E.J. (2005) Supramolecular organization of thylakoid membrane proteins in green plants. Biochim. Biophys. Acta 1706: 12‐39.

Dietz, K.‐J. (2003) Plant peroxiredoxins. Ann. Rev. Plant Biol. 54: 93‐107. Dietz, K.‐J., Jacob, S., Oelze, M.‐L., Laxa, M., Tognetti, V., de Miranda, S.M.N., Baier, M. und Finkemeier, I.

(2006) The function of peroxiredoxins in plant organelle redox metabolism. J. Exp. Bot. 57: 1697‐1709. Dietz, K.‐J., Link, G., Pistorius, E.K. und Scheibe, R. (2002) Redox regulation in oxygenic photosynthesis.

Progr. Bot. 63: 207‐245. Droux, M., Miginiac‐Maslow, M., Jacquot, J.P., Gadal, P., Crawford, N.A., Kosower, N.S und Buchanan, B.B.

(1987) Ferredoxin‐thioredoxin reductase: A catalytically active dithiol group links photoreduced ferredoxin to thioredoxin functional in photosynthetic enzyme regulation. Arch. Biochem. Biophys. 256: 372‐380.

Durnford, D.G. und Falkowski, P.G. (1997) Chloroplast redox regulation of nuclear gene transcription during photoacclimation. Photosynth. Res. 53: 229‐241.

Ehrenberg, L., Fedorcsak, I. und Solymosy, F. (1966) Diethyl pyrocarbonate in nucleic acid research. Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 16: 189‐262.

Endo, T., Kawase, D. und Sato, F. (2005) Stromal over‐reduction by high‐light stress as measured by decreases in P700 oxidation by far‐red light and its physiological relevance. Plant Cell Physiol. 46: 775–781.

Escoubas, J.M., Lomas, M., Laroche, J. und Falkowski, P.G. (1995) Light‐intensity regulation of cab gene‐transcription is signaled by the redox state of the plastoquinone pool. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10237‐10241.

Fairclough, W.V., Forsyth, A., Evans, M.C., Rigby, S.E., Purton, S. und Heathcote, P. (2003) Bidirectional electron transfer in photosystem I: Electron transfer on the PsaA side is not essential for phototrophic growth in Chlamydomonas. Biochim. Biophys. Acta 1606: 43‐55.

Farah, J., Rappaport, F., Choquet, Y., Joliot, P. und Rochaix, J.‐D. (1995) Isolation of a psaF‐deficient mutant of Chlamydomonas reinhardtii: Efficient interaction of plastocyanin with the photosystem I reaction center is mediated by the PsaF subunit. EMBO J. 14: 4976‐4984.

Faske, M., Holtgrefe, S., Ocheretina, O., Meister, M., Backhausen, J.E. und Scheibe, R. (1994) Redox equilibria between the regulatory thiols of light/dark‐modulated enzymes and dithiothreitol: Fine‐tuning by me‐tabolites. Biochim. Biophys. Acta 1247: 135‐142.

Fastabend, M. (2009): Strategien der Starklichtakklimation: Vergleichende Untersuchungen an Wildtyp‐ und Fd2‐knockout Pflanzen von Arabidopsis thaliana. Diplomarbeit, Universität Osnabrück.

Fedoroff, N.V. und Smith, D.L. (1993) A versatile system for detecting transposition in Arabidopsis. Plant J. 3: 273‐289.

Ferreira, K.N., Iverson, T.M., Maghlaoui, K., Barber, J. und Iwata, S. (2004) Architecture of the photosynthetic oxygen‐evolving center. Science 303: 1831‐1838.

Ferté, N., Meunier, J.C., Sauve, P. und Ricard, J. (1984) Control of chloroplastic NADP‐malate dehydrogenase activity by thioredoxins. Plant Sci. Lett. 35: 175‐179.

Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R.P. und Forti, G. (1999) State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta 1413: 117‐129.

Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E. und Mello, C.C. (1998) Potent and specific genetic interference by double‐stranded RNA in interference by double‐stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806‐811.

Fischer, N., Boudreau, E., Hippler, M., Drepper, F., Haehnel, W. und Rochaix, J.D. (1999) A large fraction of PsaF is non‐functional in photosystem I complexes lacking the PsaJ subunit. Biochemistry 38: 5546‐5552.

Foyer, C. H., Bloom, A. J., Queval, G. und Noctor, G. (2009) Photorespiratory metabolism: Genes, mutants, energetic, and redox signaling. Annu. Rev. of Plant Biol. 60: 455‐484.

Foyer, C., Furbank, R., Harbinson, J. und Horton, P. (1990) The mechanisms contributing to photosynthetic control of electron transport by carbon assimilation in leaves. Photosynth. Res. 25: 83‐100.

Foyer, C.H, Lelandais, M. und Harbinson, J. (1992) Control of the quantum efficiencies of photosystem I and II, electron flow, and enzyme activation following dark‐to‐light transitions in pea leaves. Relationship between NADP/NADPH ratios and NADP‐malate dehydrogenase activation state. Plant Physiol. 99: 979‐986.

Foyer, C.H. und Halliwell, B. (1976) The presense of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts: A proposed role in ascorblc acid metabolism. Planta 133: 21‐25.


Foyer, C.H. und Noctor, G. (2005) Redox homeostasis and antioxidant signaling: A metabolic interface between stress perception and physiological responses. Plant Cell 17: 1866‐1875.

Fujita, M., Fujita, Y., Noutoshi, Y., Takahashi, F., Narusaka, Y., Yamaguchi‐Shinozaki, K. und Shinozaki, K. (2006) Crosstalk between abiotic and biotic stress responses: A current view from the points of convergence in the stress signalling networks. Curr. Opin. Plant Biol. 9: 436‐442.

Genty, B., Briantais, J.M. und Baker, N.R. (1989) The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochim. Biophys. Acta 990: 87–92.

Genty, B., Harbinson, J. und Baker, R.N. (1990) Relative quantum efficiencies of the two photosystems of leaves in photorespiratory and non‐photorespiratory conditions. Plant Physiol. Biochem. 28: 1‐10.

Golbeck, J.H. (1992) Structure and function of photosystem I. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 293‐324.

Golbeck, J.H. und Bryant, D.A. (1991) Photosystem I. Curr. Top. Bioenerg. 267: 65‐79. Golding, A.J. und Johnson, G.N. (2003) Down‐regulation of linear and activation of cyclic electron

transport during drought. Planta 218: 107‐114. Golding, A.J., Finazzi, G. und Johnson, G.N. (2004) Reduction of the thylakoid electron transport chain by

stromal reductants ‐ evidence for activation of cyclic electron transport upon dark adaptation or under drought. Planta 220: 356‐363.

Gomez, L.D., Noctor, G., Knight, M.R. und Foyer, C.H. (2004) Regulation of calcium signalling and gene expression by glutathione. J. Exp. Bot. 55: 1851‐1859.

Gong, X.M., Agalarov, R., Brettel, K. und Carmeli, C. (2003) Control of electron transport in photosystem I by the iron‐sulfur cluster FX in response to intra‐ and intersubunit interactions. J. Biol. Chem. 278: 19141‐19150.

Gou, P., Hanke, G.T., Kimata‐Ariga, Y., Standley, D.M., Kubo, A., Taniguchi, I., Nakamura, H. und Hase, T. (2006) Higher order structure contributes to specific differences in redox potential and electron transfer efficiency of root and leaf ferredoxins. Biochemistry 45: 14389‐14396.

Gray, J.C., Sullivan, J.A., Wang, J., Jerome, C.A. und MacLean, D. (2003) Coordination of plastid and nuclear gene expression. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 358: 135‐144.

Green, B.R. und Durnford, D.G. (1996) The chlorophyll‐carotenoid proteins of oxygenic photosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 685‐714.

Groden, D. und Beck, E. (1979) H202 destruction by ascorbate dependent systems of chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta 546: 426‐435.

Guergova‐Kuras, M., Boudreaux, B., Joliot, A., Joliot P. und Redding, K. (2001) Evidence for two active branches for electron transfer in photosystem I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 4437‐4442.

Häder, D.P. (1999) Photosynthese. Georg Thieme Verlag, Stuttgart. Häusler, R. E., Geimer, S., Kunz, H. H., Schmitz, J., Dörmann, P., Bell, K., Hetfeld, S., Guballa, A. und Flügge,

U.‐I. (2009) Chlororespiration and grana hyperstacking: How an Arabidopsis double mutant can survive despite defects in starch biosynthesis and daily carbon export from chloroplasts. Plant Physiol. 149: 515‐533.

Haldrup, A., Naver, H. und Scheller, H.V. (1999) The interaction between plastocyanin and photosystem I is inefficient in transgenic Arabidopsis plants lacking the PSI‐N subunit of photsystem I. Plant J. 17: 689‐698.

Haldrup, A., Simpson, D.J. und Scheller, H.V. (2000) Down‐regulation of the PSI‐F subunit of photosystem I (PSI) in Arabidopsis thaliana: The PSI‐F subunit is essential for photoautotrophic growth and contributes to the antenna function. J. Biol. Chem. 275: 31211‐31218.

Hameister, S., Becker, B., Holtgrefe, S., Linke, V., Backhausen, J.E. und Scheibe, R. (2007) Transcriptional regulation of the NADP‐dependent malate dehydrogenase: Comparative genetics and identification of DNA‐binding proteins. J. Mol. Evol. 65: 437‐455.

Hanahan, D. (1983) Studies of transformation of Escherichia coli with plants. J. Mol. Biol. 166: 557‐580. Hanke, G.T. und Hase, T. (2008) Variable photosynthetic roles of two leaf‐type ferredoxins in Arabidopsis,

as revealed by RNA Interference. Phytochem. Photobiol. 84: 1302‐1309. Hanke, G.T., Holtgrefe, S., König, N., Strodtkötter, I., Voss, I. und Scheibe, R. (2009) Use of transgenic

plants to uncover strategies for maintenance of redox homeostasis during photosynthesis. Adv. Bot. Res. 52: 207‐251.

Hanke, G.T., Kimata‐Ariga, Y., Taniguchi, I. und Hase, T. (2004) A post genomic characterization of Arabidopsis ferredoxins. Plant Physiol. 134: 255‐264.


Harbinson, J. und Foyer, C.H. (1991) Relationships between the efficiencies of photosystems I and II and stromal redox state in CO2‐free air: Evidence for cyclic electron flow in vivo. Plant Physiol. 97: 41‐49.

Hase, T., Kimata, Y., Yonekura, K., Matsumura, T. und Sakakibara, H. (1991) Molecular cloning and differential expression of the maize ferredoxin gene family. Plant Physiol. 96: 77‐83.

Hauschild, R. und von Schaewen, A. (2003) Differential regulation of glucose‐6‐phosphate dehydrogenase isoenzyme activities in potato. Plant Physiol. 133: 47–62.

Havaux, M., Greppin, H. und Strasser, R.J. (1991) Functioning of photosystem I and photosystem II in pea leaves exposed to heat stress in the presence or absence of light ‐ analysis using in‐vivo fluorescence, absorbency, oxygen and photoacoustic measurements. Planta 186: 88‐98.

Heber, U. und Kirk, M.R. (1975) Flexibility of coupling and stoichiometry of ATP formation in intact chloroplasts. Biochim. Biophys. Acta 376: 136‐150.

Held, H.W. (1979): Light dependent changes of stromal H+ and Mg2+ concentrations controlling CO2 fixation. In: Photosynthesis II (enzyclopedia of plant physiology. New Series, Vol. 6) (Gibbs, M und Latzko, E., eds.), Springer, Berlin: 202‐207.

Herbert, S.K., Fork, D.C. und Malkin, S. (1990) Photoacoustic measurements in vivo of energy storage by cyclic electron flow in algae and higher plants. Plant Physiol. 94: 926‐934.

Hieber, A.D., Bugos, R.C. und Yamamoto, H.Y. (2000) Plant lipocalins: Violaxanthin de‐epoxidase and zeaxanthin epoxidase. Biochim. Biophys. Acta 1482: 84‐91.

Hörtensteiner (2009) Stay‐green regulates chlorophyll and chlorophyll‐binding protein degradadation during senescence. Trends Plant Sci. 14: 155‐162.

Hörtensteiner und Kräutler (2000) Chlorophyll breakdown in oilseed rape. Photosynth. Res. 64: 137‐146. Hofmann, B., Hecht, H.J. und Flohé, L. (2002) Peroxiredoxins. Biol. Chem. 383: 347‐364. Holt, N.E., Fleming, G.R. und Niyogi, K.K. (2004) Toward an understanding of the mechanism of non‐

photochemical quenching in green plants. Biochemistry 43: 8281‐8289. Holtgrefe, S., Bader, K.P., Horton, P., Scheibe, R., von Schaewen, A. und Backhausen, J.E. (2003)

Decreased content of leaf ferredoxin changes electron distribution and limits photosynthesis in transgenic potato plants. Plant Physiol. 133: 1768‐1778.

Holtgrefe, S., Gohlke, J., Druce, S., Starmann, J., Klocke, S., Altmann, B., Wojtera, J., Linke, V., Lindermayr, C. and Scheibe, R. (2008) Regulation of plant cytosolic glyceraldehyde 3‐phosphate dehydrogenase isoforms by thiol modification. Physiol. Plant. 133: 211‐228.

Horling, F., Lamkemeyer, P., König, J., Finkemeier, I., Baier, M., Kandlbinder, A. und Dietz, K.‐J. (2003) Divergent light‐, ascorbate‐ and oxidative stress‐dependent regulation of expression of the peroxiredoxin gene family in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 131: 317‐325.

Horton, P., Ruban, A.V. und Walters, R.G. (1996) Regulation of light harvesting in green plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 655‐684.

Igamberdiev, A.U., Bykova, N.V., Lea, P.J. und Gardeström, P. (2001) The role of photorespiration in redox and energy balance of photosynthetic plant cells: A study with a barley mutant deficient in glycine decarboxylase. Physiol. Plant. 111: 427‐438.

Ingenhousz, J. (1779) Experiments upon vegetables, discovering their great power of purifying the common air in the sunshine and of injuring it in the shade and at night, to which is joined a new method of examining the accurate degree of the atmosphere. P. Elmsly, London.

Ivanov, B., Kobayashi, Y., Bukhov, N.G. und Heber, U. (1998) Photosystem I‐dependent cyclic electron flow in spinach chloroplasts: Occurrence, dependence on redox conditions and electron acceptors and inhibition by antimycin A. Photosynth. Res. 57: 61‐70.

Ivanov, B.N. (2008) Cooperation of photosystem I with the plastoquinone pool in oxygen reduction in higher plant chloroplasts. Biochemistry (Moscow) 73: 112‐118.

Ivanov, B.N., Sacksteder, C.A., Kramer, D.M. und Edwards, E.G. (2001) Light‐induced ascorbate dependent electron transport and membrane energization in chloroplasts of bundle sheath cells of the C4 plant maize. Arch. Biochem. Biophys. 385: 145‐153.

Izawa, S. (1980) Acceptors and donors and chloroplast electron transport. Methods Enzymol. 69: 413‐434. Jabs, T., Dietrich, R.A. und Dangl, J.L. (1996) Initiation of runaway cell death in Arabidopsis mutant by

extracellular superoxide. Science 273: 1853‐1856. Jakob, B. und Heber, U. (1996) Photoproduction and detoxification of hydroxyl radicals in chloroplasts

and leaves and relation to photoinactivation of photosystems I and II. Plant Cell Physiol. 37: 629‐635. Jansson, S., Andersen, B. und Scheller, H.V. (1996) Nearest neighbor analysis of higher‐plant

photosystem I holocomplex. Plant Physiol. 12: 409‐420.


Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A. und Bevan, M.W. (1987) GUS fusions: Beta‐glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6: 3901‐3907.

Jensen, P.E., Haldrup, A., Rosgaard, L. und Scheller, H.V. (2003) Molecular dissection of photosystem I in higher plants: Topology, structure and function. Physiol. Plant. 119: 313‐321.

Jensen, P.E., Haldrup, A., Zhang, S. und Scheller, H.V. (2004) The PSI‐O subunit of plant photosystem I is involved in balancing the excitation pressure between the two photosystems. J. Biol. Chem. 279: 24212‐24217.

Joët, T., Cournac, L., Horvath, E.M., Medgyesy, P. und Peltier, G. (2001) Increased sensitivity of photosynthesis to antimycin A induced by inactivation of the chloroplast ndhB gene. Evidence for a participation of the NADH‐dehydrogenase complex to cyclic electron flow around photosystem I. Plant Physiol. 125: 1919‐1929.

Joët, T., Cournac, L., Peltier, G., und Havaux, M. (2002) Cyclic electron flow around photosystem I in C3 plants. In vivo control by the redox state of chloroplasts and involvement of the NADH‐dehydrogenase complex. Plant Physiol. 128: 760‐769.

Johanningmeier, U. und Howell, S.H. (1984) Regulation of lightharvesting chlorophyll‐binding protein mRNA accumulation in Chlamydomonas reinhardii. Possible involvement of chlorophyll synthesis precursors. J. Biol. Chem. 259: 13541‐13549.

Johnson, G.N. (2005) Cyclic electron transport in C3 plants: fact or artifact? J. Exp. Bot. 56: 407‐416. Joliot, P. und Joliot, A. (1999) In vivo analysis of the electron transfer within photosystem I: Are the two

phylloquinones involved? Biochemistry 38: 11130‐11136. Joliot, P. und Joliot, A. (2002) Cyclic electron transfer in plant leaf. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 10209‐

10214. Joliot, P. und Joliot, A. (2005) Quantification of cyclic and linear flows in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

102: 4913‐4918. Joliot, P. und Joliot, A. (2006) Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta 1757: 362‐368. Joliot, P., Béal, D. und Joliot, A. (2004) Cyclic electron flow under saturating excitation of dark‐adapted

Arabidopsis leaves. Biochim. Biophys. Acta 1656: 166‐176. Jolley, C., Ben Shem, A., Nelson, N. und Fromme, P. (2005) Structure of plant photosystem I revealed by

theoretical modeling. J. Biol. Chem. 280: 33627‐33636. Jordan, P., Fromme, P., Witt, H.‐T., Klukas, O., Saenger, W. und Krauß, N. (2001) Three‐dimensional

structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 Å resolution. Nature 411: 909‐917. Junge, W. (1989) Protons, the thylakoid membrane, and the chloroplast ATP synthase. Ann. N. Y. Acad.

Sci. 574: 268‐286. Kagawa, T. und Wada, M. (2002) Blue light‐induced chloroplast relocation. Plant Cell Physiol. 43: 367‐371. Karplus, P.A., Daniels, M.J. und Herriott, J.R. (1991) Atomic structure of ferredoxin‐NADP+ reductase:

Prototype for a structurally novel flavoenzyme family. Science 251: 60‐66. Khorobrykh, S.A. und Ivanov, B.N. (2002) Oxygen reduction in a plastoquinone pool of isolated pea

thylakoids. Photosynth. Res. 71: 209‐219. Khorobrykh, S.A., Mubarakshina, M.M. und Ivanov, B. N. (2004) Photosystem I is not solely responsible

for oxygen reduction in isolated thylakoids. Biochim. Biophys. Acta 1657: 164‐167. Kim, E.H., Chow, W.S., Horton, P. und Anderson, J.M. (2005) Entropy‐assisted stacking of thylakoid

membranes. Biochim. Biophys. Acta 1708: 187‐195. Kimata, Y. und Hase, T. (1989) Localization of ferredoxin isoproteins in mesophyll and bundle sheath cells

in maize leaf. Plant Physiol. 89: 1193‐1197. Kimata‐Ariga, Y., Matsumura, T., Kada, S., Fujimoto, H., Fujita, Y., Endo, T., Mano, J., Sato, F. und Hase, T.

(2000) Differential electron flow around photosystem I by two C4‐photosynthetic‐cell‐specific ferredoxins. EMBO J. 19: 5041‐5050.

Kleine, T., Voigt, C. und Leister, D. (2009) Plastid signalling to the nucleus: Messengers still lost in the mists? Trends Genet. 25: 185‐192.

Klughammer, C. und Schreiber, U. (1994) An improved method, using saturating light pulses, for the determination of photosystem I quantum yield via P700‐absorbance chances at 830 nm. Planta 192: 261–268.

Knaff, D. B. (1996) Ferredoxin and Ferredoxin‐dependent enzymes. In: Advances in Photosynthesis. Oxygenic Photosynthesis: The Light Reactions (Ort, D.R. und Yocum, D.R., eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht: 333‐336.

Knoetzel, J., Mant, A., Haldrup, A., Jensen, P.E. und Scheller, H.V. (2002) PSI‐O, a new 10‐kDa subunit of eukaryotic photosystem I. FEBS Lett. 510: 145‐148.


Kobayashi, M., Ohura, I., Kawakita, K., Yokota, N., Fujiwara, M., Shimamoto, K., Doke, N. und Yoshioka, H. (2007) Calcium‐dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. Plant Cell 19: 1065‐1080.

Koelmann, M. (2008) Funktionsanalyse von Ferredoxin‐Isoformen mit Hilfe von T‐DNA Insertionsmutanten von Arabidopsis thaliana. Diplomarbeit, Universität Osnabrück.

Koller, D. (1990) Light‐driven leaf movements. Plant Cell Environ. 13: 615‐632. König, J., Baier, M., Horling, F., Kahmann, U., Harris, G., Schürmann, P. und Dietz, K.‐J. (2002) The plant‐

specific function of 2‐Cys peroxiredoxin‐mediated detoxification of peroxides in the redox hierarchy of photosynthetic electron flux. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5738‐5743.

Kost B., Spielhofer P., Chua N.H. (1998) A GFP‐mouse talin fusion protein labels plant actin filaments in vivo and visualizes the actin cytoskeleton in growing pollen tubes. Plant J. 16: 393‐401.

Kramer D.M., Johnson G., Kiirats, O. und Edwards, G.E. (2004a) New fluorescence parameters for determination ofQA redox state and excitation energy fluxes. Photosynth. Res. 79, 209‐218.

Kramer, D.M. und Crofts, A.R. (1996) Control of photosynthesis and measurement of photosynthetic reactions in intact plants. In: Photosynthesis and the Environment. Advances in Photosynthesis (Baker, N., ed.), Kluwer Academic Press, Dordrecht: 25‐66.

Kramer, D.M., Avenson, T.J und Edwards, G.E. (2004). Dynamic flexibility in the light reactions of photosynthesis governed by both electron and proton transfer reactions. Trends Plant Sci. 9: 349‐357.

Kramer, D.M., Sacksteder, C.A. und Cruz, J.A. (1999) How acidic is the lumen? Photosynth. Res. 60: 151‐163.

Krause G.H. & Jahns P. (2004) Non‐photochemical energy dissipation determined by chlorophyll fluorescence quenching: Characterization and function. In: Chlorophyll a Fluorescence: A Signature of Photosynthesis (Papageorgiou, G.C. und Govindjee, eds.), Springer, Dordrecht: 463‐495.

Krause, H. und Behrend, U. (1986) ΔpH‐dependent chlorophyll fluorescence quenching indicating a mechanism of protection against photoinhibition of chloroplasts. FEBS Lett. 200: 298‐302.

Krauss, N. (2003) Mechanisms for photosystems I and II. Curr. Opin. Chem. Biol. 7: 540‐550. Krauss, N., Hinrichs, W., Witt, I., Fromme P., Pritzkow, W., Dauter, Z., Betzel, C., Wilson, S., Witt, H.T. und

Saenger, W. (1993) Three‐dimensional structure of system I of photosynthesis at 6 Å resolution. Nature 361: 326‐331.

Krieger, A. und Weis, E. (1993) The role of calcium in the pH‐dependent control of photosystem II. Photosynth. Res. 37: 117‐130.

Kropat, J., von Gromoff, E.D., Müller, F.W. und Beck, C.F. (1995) Heat shock and light activation of a Chlamydomonas HSP70 gene are mediated by independent regulatory pathways. Mol. Gen. Genet. 248: 727‐734.

Kruger, N.J. und von Schaewen, A. 2003) The oxidative pentose phosphate pathway: Structure and organisation. Curr. Opin. Plant Biol. 6: 236‐246.

Kruse, O. (2001) Light‐induced short‐term adaptation mechanisms under redox control in the PSII‐LHCII supercomplex: LHC II state transitions and PSII repair cycle. Naturwissenschaften 88: 284‐292.

Kubicki, A., Funk, E., Westhoff, P. und Steinmüller, K. (1996) Differential expression of plastome‐encoded ndh genes in the mesophyll and bundle‐sheath chloroplasts of the C4 plant Sorgum bicolor indicates that the complex I‐homologous NAD(P)H–plastoquinone oxidoreductase is involved in cyclic electron transport. Planta 199: 276‐281.

Kudoh, H. und Sonoike, K. (2002) Irreversible damage to photosystem I by chilling in the light: Cause of the degradation of chlorophyll after returning to normal growth temperature. Planta 215: 541‐548.

Kurisu, G., Zhang, H., Smith, J.L. und Cramer, W.A. (2003) Structure of the cytochrome b6f complex of oxygenic photosynthesis: Tuning the cavity. Science 302: 1009‐1014.

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during assembly of bacteriophage T4. Nature 227: 680‐685.

Laxa, M., König, J., Dietz, K.‐J. und Kandlbinder, A.(2007) Role of the cysteine residues in Arabidopsis thaliana cyclophilin CYP20‐3 in peptidyl‐prolyl cis‐trans isomerase and redox‐related functions. Biochem. J. 401: 287‐297.

Lee, K.P., Kim, C., Landgraf, F. und Apel, K. (2007) EXECUTER1‐ and EXECUTER2‐dependent transfer of stress‐related signals from the plastid to the nucleus of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 10270‐10275.

Lillo, C., Lea, U.S. und Ruo,V.P. (2008) Nutrient depletion as a key factor for manipulating gene expression and product formation in different branches of the flavonoid pathway. Plant Cell Environ. 31: 587‐601.

Lottspeich, F. und Zobras, H. (1998) Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.


Lunde, C., Jensen, P.E., Haldrup, A., Knoetzel, J. und Scheller, H.V. (2000) The PSI‐H subunit of photosystem I is essential for state transition in plants. Nature 408: 613‐615.

Lunde, C., Jensen, P.E., Rosgaard, L., Haldrup, A., Gilpin, M.J. und Scheller, H.V. (2003) Plants impaired in state transitions can to a large degree compensate for their defect. Plant Cell Physiol. 44: 44‐54.

Maiwald, D., Dietzmann, A., Jahns, P., Pesaresi, P., Joliot, P., Joliot, A., Levin, J. Z., Salamini, F. und Leister, D. (2003) Knock‐out of the genes coding for the Rieske protein and the ATP‐synthase δ‐subunit of Arabidopsis. Effects on photosynthesis, thylakoid protein composition, and nuclear chloroplast gene expression. Plant Physiol. 133: 191‐202.

Marchand, C., Le Maréchal, P., Meyer, Y., Miginiac‐Maslow, M., Issakidis‐Bourguet, E. und Decottignies, P. (2004) New targets of Arabidopsis thioredoxins revealed by proteomic analysis. Proteomics 4: 2696‐2706.

Marder, J.B. und Barber, J. (1989) The molecular anatomy and function of thylakoid proteins. Plant Cell Environ. 12: 595‐614.

Matsumura, T., Kimata‐Ariga, Y., Sakakibara, H., Sugiyama, T., Murata, H., Takao, T., Shimonishi, Y. und Hase, T. (1999) Complementary DNA cloning and characterization of ferredoxin localized in bundle‐sheath cells of maize leaves. Plant Physiol. 119: 481‐488.

Maxwell, K. und Johnson, G.N. (2000) Chlorophyll fluorescence ‐ a practical guide. J. Exp. Bot. 51: 659‐668.

May, M.J., Vernoux, T., Leaver, C., van Montagu, M. und Inzé, D. (1998) Glutathione homeostasis in plants: Implications for environmental sensing and plant development. J. Exp. Bot. 49: 649‐667.

Mehler, H.A. (1951): Studies on reactions of illuminated chloroplasts. I. Mechanism of the reduction of oxygen and other Hill reagents. Arch. Biochem. Biophys. 3: 65‐77.

Merati, G. und Zanetti, G. (1987) Chemical cross‐linking of ferredoxin to spinach thylakoids – evidence for two independent binding‐sites of ferredoxin to the membrane. FEBS Lett. 215: 37‐40.

Meyer, Y., Reichheld, J.P. und Vignols, F. (2005) Thioredoxins in Arabidopsis and other plants. Photosynth. Res. 86: 419‐433.

Meyer, Y., Verdoucq, L. und Vignols, F. (1999) Plant thioredoxins and glutaredoxins: Identity and putative roles. Trends Plant Sci. 4: 388‐394.

Mi, H., Endo, T., Schreiber, U., Ogawa, T. und Asada, K. (1994) NAD(P)H dehydrogenase‐dependent cyclic electron flow around photosystem I in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803: A study of dark‐starved cells and spheroplasts. Plant Cell Physiol. 35: 163‐173.

Mi, H.L., Endo, T., Ogawa, T. und Asada, K. (1995) Thylakoid membrane‐bound, NADPH‐specific pyridine nucleotide dehydrogenase complex mediates cyclic electron transport in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. 36: 661‐668.

Mikkelsen, R., Mutenda, K.E., Mant, A., Schürmann, P. und Blennow, A. (2005) α‐Glucan, water dikinase (GWD): A plastidic enzyme with redox‐regulated and coordinated catalytic activity and binding affinity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 1785‐17.

Miller, G., Shulaev, B. und Mittler, R. (2008) Reactive oxygen signaling and abiotic stress. Physiol. Plant. 133: 481–489.

Mittler, R. (2002) Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. 7: 405‐410. Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M. und Van Breusegem, F. (2004) Reactive oxygen gene network of

plants. Trends Plant Sci. 9: 390‐398. Montrichard, F., Alkhalfioui, F., Yano, H., Vensel, W.H., Hurkman, W.J. und Buchanan, B. B. (2009)

Thioredoxin targets in plants: The first 30 years. Proteomics 72: 452‐474. Mora‐Garcia, S., Stolowisz, F. und Wolosiuk, R.A. (2006) Redox signal transduction in plant metabolism.

Control of primary metabolism in plants. Annu. Plant Rev. 22: 150‐186. Mortenson, L.E., Valentine, C. und Carnaham, J.E. (1962) An electron transport factor from Clostridium

pasteuranium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 7: 448‐552. Moss, D.A. und Bendall, D.S. (1984) Cyclic electron transport in chloroplasts: The Q‐Cycle and the site of

action of antimycin. Biochim. Biophys. Acta 767: 389‐395. Muhiuddin, I.P., Heathcote, P., Carter, S., Purton, S., Rigby, S.E.J. und Evans, M.C.W. (2001) Evidence from

time resolved studies of the P700•+/A•1‐radical pair for photosynthetic electron transfer on both the

PsaA and PsaB branches of the photosystem I reaction centre. FEBS Lett. 503: 56‐60. Mullis, K.B. und Faloona, F.A. (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase‐catalyzed chain

reaction. Methods Enzymol. 155: 335‐350. Mulo, P., Laaskso, S., Maenpaa, P. und Aro, E.M. (1998) Stepwise photoinhibition of photosystem II. Plant

Physiol. 117: 483‐490.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15352244?ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum







Munekage Y., Hashimoto M., Miyake C., Tomizawa K.I., Endo T., Tasaka M. und Shikanai, T. (2004) Cyclic electron flow around photosystem I is essential for photosynthesis. Nature 429: 579‐582.

Munekage, Y., Hojo, M., Meurer, J., Endo, T., Tasaka, M. und Shikanai, T. (2002) PGR5 is involved in cyclic electron flow around photosystem I and is essential for photoprotection in Arabidopsis. Cell 110: 361‐371.

Munekage, Y.N., Genty, B. und Peltier, G. (2008) Effect of PGR5 impairment on photosynthesis and growth in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 49: 1688‐1698.

Nandha, B., Finazzi, G., Joliot, P., Hald, S. und Johnson, G.N. (2007) The role of PGR5 in the redox poising of photosynthetic electron transport. Biochim. Biophys. Acta 1767: 1252‐1259. natural CO2 springs acclimates sulfur, nitrogen and carbohydrate metabolism of the progeny to elevated CO2. Plant Cell Envir. 25: 1715‐1727.

Nedbal, L., Březina, V., Adamec, F., Štys, D., Oja, V., Laisk, A. und Govindjee (2003) Negative feedback regulation is responsible for the non‐linear modulation of photosynthetic activity in plants and cyanobacteria exposed to a dynamic light environment. Biochim. Biophys. Acta 1607: 5‐17.

Neill, S., Desikan, R. und Hancock, J. (2002) Hydrogen peroxide signalling. Curr. Opin. Plant Biol. 5: 388‐395.

Nelson, N. und Yocum, C.F. (2006) Structure and Function of photosystems I and II. Annu. Rev. Plant Biol. 57: 521‐565.

Nield, J., Orlova, E.V., Morris, E.P., Gowen, B., van Heel, M. und Barber, J. (2000) 3D map of the plant photosystem II supercomplex obtained by cryoelectron microscopy and single particle analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 7: 44‐47.

Nishiyama, Y., Allakhverdiev, S.I. und Murata N (2006) A new paradigm for the action of reactive oxygen species in the photoinhibition of photosystem II. Biochim. Biophys. Acta 1757: 742‐749.

Nishiyama, Y., Allakhverdiev, S.I. und Murata, N. (2005) Inhibition of the repair of photosystem II by oxidative stress in cyanobacteria. Photosynth. Res. 84: 1‐7.

Nishiyama, Y., Allakhverdiev, S.I., Yamamoto, H., Hayashi, H. und Murata, N. (2004) Singlet oxygen inhibits the repair of photosystem II by suppressing the translation elongation of the D1 protein in Synechocystis sp. PCC 6803. Biochemistry 43: 11321‐11330.

Nishiyama, Y., Yamamoto, H., Allakhverdiev, S.I., Inaba, M., Yokota, A. und Murata, N. (2001) Oxidative stress inhibits the repair of photodamage to the photosynthetic machinery. EMBO J. 20: 5587‐5594.

Niyogi, K.K. (1999) Potoprotection revisted: Genetic and molecular approaches. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 333‐359.

Niyogi, K.K. (2000). Safety valves for photosynthesis. Curr. Opin. Plant Biol. 3: 455‐460. Noctor, G. und Foyer, C.H. (1998) Ascorbate and glutathione: Keeping active oxygen under control. Annu.

Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 249‐279. Okegawa, Y., Tsuyama, M., Kobayashi, Y. und Shikanai, T. (2005). The pgr1 mutation in the Rieske subunit

of the cytochrome b6f complex does not affect PGR5‐dependent cyclic electron transport around photosystem I. J. Biol. Chem. 280: 28332‐28336.

Olsen, K.M., Slimestad, R., Lea, U.S., Brede, C., Løvdal, T., Ruo V.P., Verheul, M. und Lillo, C. (2009) Temperature and nitrogen effects on regulators and products of the flavonoid pathway: Experimental and kinetic model studies. Plant Cell Environ. 32: 286‐299.

Onda, Y., Matsumura, T., Kimata‐Ariga, Y., Sakakibara, H., Sugiyama, T. und Hase, T. (2000) Differential interaction of maize root ferredoxin:NADP+ oxidoreductase with photosynthetic and non‐photosynthetic ferredoxin isoproteins. Plant Physiol. 123: 1037‐1045.

Ort, D.R. und Baker, N.R. (2002) A photoprotective role for O2 as an alternative electron sink in photosynthesis? Curr. Opin. Plant Biol. 5: 193‐198.

Ort, D.R. und Melandri, B.A. (1982) Mechanism of ATP synthesis. In: Cell Biology. Photosynthesis: Energy Conversion by Plants and Bacteria (Vol. I) (Govindjee, ed.), Academic Press, New York: 537‐587.

Oxborough, K. (2004) Imaging of chlorophyll a fluorescence: Theoretical and practical aspects of an emerging technique for the monitoring of photosynthetic performance. J. Exp. Bot. 55: 1195‐1205.

Oxborough, K. und Baker, N.R. (1997) Resolving chlorophyll a fluorescence images of photosynthetic efficiency into photochemical and non‐photochemical components – calculation of qP and Fv'/Fm' without measuring Fo'. Photosynth. Res. 54: 135‐142.

Oxborough, K., Lee, P. und Horton, P. (1987) Regulation of thylakoid protein phosphorylation by high‐energy‐state quenching. FEBS Lett. 221: 211‐214.

Palatnik, J.F., Tognetti, V.B., Poli, H.O., Rodríguez, R.E., Blanco, N., Gattuso, M., Hajirezaei, M.‐R., Sonnewald, U., Valle, E.M. und Carillo, N. (2003) Transgenic tobacco plants expressing antisense




ferredoxin‐NADP(H) reductase transcripts display increased susceptibility to photo‐oxidative damage. Plant J. 35: 332‐341.

Pandini, V., Aliverti, A. und Zanetti, G. (1999) Interaction of the soluble recombinant PsaD subunit of spinach photosystem I with ferredoxin I. Biochemistry 38: 10707‐10713.

Pérez‐Ruíz, J.M., Spínola, M.C., Kirchsteiger, K., Moreno, J., Sahrawy, M. and Cejudo, F.J. (2006) Rice NTRC is a high‐efficiency redox system for chloroplast protection against oxidative damage. Plant Cell 18: 2356‐2368.

Pesaresi, P., Masiero, S., Eubel, H., Braun, H.‐P., Bhushan, S., Glaser, E., Salamini, F. und Leister, D. (2006) Nuclear photosynthetic gene expression is synergistically modulated by rates of protein synthesis in chloroplasts and mitochondria. Plant Cell 18: 970‐991.

Pfannschmidt, T., Schutze, K., Fey, V., Sherameti, I. und Oelmuller, R. (2003) Chloroplast redox control of nuclear gene expression – a new class of plastid signals in interorganellar communication. Antioxid. Redox Signal. 5: 95‐101.

Piippo, M., Allahverdiyeva, Y., Paakkarinen, V., Suoranta, U.‐M., Battchikova, N. und Aro, E.‐M. (2006) Chloroplast‐mediated regulation of nuclear genes in Arabidopsis thaliana in the absence of light stress. Physiol. Genomics 25: 142‐152.

Pizzitutti, F., Setif, P. und Marchi, M. (2003) Theoretical investigation of the “CO in”‐“CO out” isomerization in a [2Fe‐2S] ferredoxin: Free energy profiles and redox states. J. Am. Chem. Soc. 125: 15224‐15232.

Pnueli, L., Liang, H., Rozenberg, M. und Mittler, R. (2003) Growth suppression, altered stomatal responses, and augmented induction of heat shock proteins in cytosolic ascorbate peroxidase (Apx1)‐deficient Arabidopsis plants. Plant J. 34: 187‐203.

Pogson, B.J., Woo, N.S., Förster, B. und Small, I.D. (2008) Plastid signalling to the nucleus and beyond. Trends Plant Sci. 13: 602‐609.

Porra, R.J., Thomson, W.A. und Kriedemann, P.E. (1989) Determination of the accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents. Biochim. Biophys. Acta 975: 384‐394.

Portis, A.R. (1992) Regulation of ribulose 1,5‐bisphosphate carboxylase/oxygenase activity. Annu. Rev. Plant Purton, S., Stevens, D.R., Muhiuddin, I.P., Evans, M.C.M., Carter, S., Rigby, S.E.J. und Heathcote, P. (2001)

Site‐directed mutagenesis of PsaA residue W693 affects phylloquinone binding and function in the photosystem I reaction center of Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry 40: 2167‐2175.

Pushkar, Y.N., Karyagina, I., Stehlik, D., Brown, S. und van der Est, A. (2005) Recruitment of a foreign quinone into the A1 site of photosystem I. Consecutive forward electron transfer from A0 to A1 to FX with anthraquinone in the A1 site as studied by transient EPR. J. Biol. Chem. 280: 12382‐12390.

Quiles, M.J. (2006) Stimulation of chlororespiration by heat and high light intensity in oat plants. Plant Cell Environ. 29: 1463‐1470.

Ramesh, V.M., Gibasiewicz, K., Lin, S., Bingham, S.E. und Webber, A.N. (2004) Bidirectional electron transfer in photosystem I: Accumulation of A0

‐ in A‐side or B‐side mutants of the axial ligand to chlorophyll A0. Biochemistry 43: 1369‐1375.

Ravenel, J., Peltier, G. und Havaux, M. (1994) The cyclic electron pathways around photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii as determined in‐vivo by photoacoustic measurements of energy storage. Planta 193: 251‐259.

Reiser, J., Linka, N., Lemke, L., Jeblick, W. und Neuhaus, H.E. (2004) Molecular physiological analysis of the two plastidic ATP/ADP transporters from Arabidopsis. Plant Physiol. 136: 3524‐3536.

Rey, P., Cuiné, S., Eymery, F., Garin, J., Court, M., Jacquot, J.‐P., Rouhier, N. und Broin, M. (2005) Analysis of the proteins targeted by CDSP32, a plastidic thioredoxin participating in oxidative stress responses. Plant J. 41: 31‐42.

Rizhsky, L., Hallak‐Herr, E., Van Breusegem, F., Rachmilevitch, S., Barr, J.E., Rodermel, S., Inzé, D. und Mittler, R. (2002) Double antisense plants lacking ascorbate peroxidase and catalase are less sensitive to oxidative stress than single antisense plants lacking ascorbate peroxidase or catalase. Plant J. 32: 329‐342.

Rouhier, N. und Jacquot, J.‐P. (2002) Plant peroxiredoxins: Alternative hydroperoxide scavenging enzymes. Photosynth. Res. 74: 93‐107.

Rowan, D.D., Cao, M., Lin‐Wang, K., Cooney, J.M., Jensen, D.J., Austin, P.T., Hunt, M.B., Norling, C., Hellens, R.P., Schaffer, R.J. und Allan, A.C. (2009) Environmental regulation of leaf colour in red 35S:PAP1 Arabidopsis thaliana. New Phytol. 182: 102–115.


Ruban, A.V., Lee, P.J., Wendeworth, M., Young, A.J. und Horton, P. (1999) Determination of the stoichiometry and strength of binding of xanthophylls to the photosystem II light harvesting complexes. J. Biol. Chem. 274: 10458‐10465.

Rumeau, D., Becuwe‐Linka, N., Beyly, A., Louwagie, M., Garin, J. und Peltier, G. (2005) New subunits NDH‐M, ‐N, and ‐O, encoded by nuclear genes, are essential for plastid Ndh complex functioning in higher plants. Plant Cell 17: 219‐232.

Sacksteder, C.A. und Kramer, D.M. (2000) Dark interval relaxation kinetics of absorbance changes as a quantitative probe of steady‐state electron transfer. Photosynth. Res. 66: 145‐158.

Salvucci, M.E. und Ogren, W.L. (1996) The mechanism of Rubisco activase: Insights from studies of the properties and structure of the enzyme. Photosynth. Res. 47: 1‐11.

Scheibe, R. (1986): Regulation of photosynthetic electron flow by light‐dependent metabolism. In: Progress in Photosynthesis Research (Vol. III) (Biggins, J., ed.), Martinus Nijhoff, Dordrecht: 233‐240.

Scheibe, R. (1987) NADP+‐malate dehydrogenase in C3‐plants: Regulation and role of a light‐activated enzyme. Physiol. Plant. 71: 393‐400.

Scheibe, R. (1991) Redox‐modulation of chloroplast enzymes. Plant Physiol. 96: 1‐3. Scheibe, R. (1995) Light modulation of stromal enzymes. In: Carbon Partitioning and Source‐Sink

Interactions in Plants (Madore, M.A. and Lucas, W.J.,eds.), pp. 13‐22, Am. Soc. Plant Physiol., Rockville.

Scheibe, R. (2004) Malate valves to balance cellular energy supply. Physiol. Plant. 120: 21‐26. Scheibe, R. und Jacquot, J.‐P. (1983) NADP regulates the light activation of NADP‐dependent malate

dehydrogenase. Planta 157: 548‐553. Scheibe, R. und Stitt, M. (1988) Comparison of NADP‐malate dehydrogenase activation, QA reduction and

O2 evolution in spinach leaves. Plant Physiol. Biochem. 26: 473‐481. Scheibe, R., Backhausen, J.E., Emmerlich, V. und Holtgrefe, S. (2005) Strategies to maintain redox

homeostasis during photosynthesis under changing conditions. J. Exp. Bot. 56: 1481‐1489. Scheibe, R., Geissler, A. und Fickenscher, K. (1989) Chloroplast glucose‐6‐P dehydrogenase: Km‐shift upon

light modulation and reduction. Arch. Biochem. Biophys. 274: 290‐297. Scheller, H.V. und Haldrup, A. (2005) Photoinhibition of photosystem I. Planta. 221: 5‐8. Scheller, M.V., Jensen, P.E., Haldrup, A., Lunde, C. und Knoetzel, J. (2001) Role of subunits in eukaryotic

photosystem I. Biochem. Biophys. Acta 1507: 41‐60. Schreiber, U. (1986) Detection of rapid induction kinetics with a new type of high‐frequency modulated Schreiber, U., Schliwa, U. und Bilger, W. (1986) Continuous recording of photochemical and non‐

photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10: 51‐62.

Schubert, W.‐D., Klukas, O., Krauß, N., Saenger, W., Fromme, P. und Witt, H.‐T. (1997) Photosystem I of Synechococcus elongatus at 4 angstrom resolution: Comprehensive structure analysis. J. Mol. Biol. 272: 741‐769.

Schulte, M., van Ballmoos, P., Rennenberg, H. und Herschbach, C. (2002): Live‐long growth of Quercus ilex L. at natural CO2 springs acclimates sulfur, nitrogen and carbohydrate metabolism of the progeny to elevated CO2. Plant Cell Envir. 25: 1715‐1727.

Schürmann, P. und Buchanan, B.B. (2008) The ferredoxin/thioredoxin system of oxygenic photosynthesis. Antioxid. Redox Signal. 10: 1235‐1274.

Seidel, T., Kluge, C., Hanitzsch, M., Roß, J., Sauer, M., Dietz, K.J. und Golldack, D. (2004) Colocalization and FRET‐analysis of subunits c and a of the vacuolar H1‐ATPase in living plant cells. J. Biotechnol. 112: 165–175.

Serrato, A.J., Pérez‐Ruíz, J.M., Spínola, M.C. und Cejudo, F.J. (2004) A novel NADPH thioredoxin reductase, localized in the chloroplast, which deficiency causes hypersensitivity to abiotic stress in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 279: 43821‐43827.

Shi, Y. und Shi, Y. (2004) Metabolic enzymes and coenzymes in transcription ‐ a direct link between metabolism and transcription? Trends Genet. 20: 445‐452.

Shikanai, T. (2007) Cyclic electron transport around photosystem I: Genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58: 199‐217.

Shikanai, T., Endo, T., Hashimoto, T., Yamada, Y., Asada, K. und Yokota, A. (1998) Directed disruption of the tobacco ndhB gene impairs cyclic electron flow around photosystem I. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: 9705‐9709.

Shin, M., und Arnon, D.I. (1965) Enzymic mechanism of pyridine nucleotide reduction in chloroplasts. J. Biol. Chem. 240: 1405‐1411.


Siebke, K., Laisk, A., Neimanis, S. und Heber, U. (1991) Regulation of chloroplast metabolism in leaves. Evidence that NADP‐dependent glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, but not ferredoxin‐NADP reductase, controls electron flow to phosphoglycerate in the dark‐light transition. Planta 185: 337‐343.

Sims, D.A. und Gamon, J.A. (2002) Relationship between leaf pigment content and spectral reflectance across a wide range of species, leaf structures and developmental stages. Remote Sens. Environ. 81: 337–354.

Sonoike, K. (1996) Photoinhibition of photosystem I: Its physiological significance in the chilling sensitivity of plants. Plant Cell Physiol. 37: 239‐247.

Stitt, M. (1986) Limitation of photosynthesis by carbon metabolism. 1. Evidence for excess electron transport capacity in leaves carrying out photosynthesis in saturating light and CO2. Plant Physiol. 81: 1115‐1122.

Strand, Å., Asami, T., Alonso, J., Ecker, J.R. und Chory, J. (2003) Chloroplast to nucleus communication triggered by accumulation of Mg‐protoporphyrin IX. Nature 421: 79‐83.

Stroebel, D., Choquet, Y., Popot, J.L. und Picot, D. (2003) An atypical haem in the cytochrome b6f complex. Nature 426: 413‐418.

Sundaresan, V., Springer, P., Volpe, T., Haward, S., Jones, J. D., Dean, C., Ma, H., und Martienssen, R. (1995) Patterns of gene action in plant development revealed by enhancer trap and gene trap transposable elements. Genes Developm. 9: 1797‐1810.

Takabayashi, A., Kishine, M., Asada, K., Endo, T. und Sato, F. (2005) Differential use of two cyclic electron flows around photosystem I for driving CO2‐concentration mechanism in C4 photosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 16898‐16903.

Takahashi, S., Seki, M., Ishida, J., Satou, M., Sakurai, T., Narusaka, M., Kamiya, A., Nakajima, M., Enju, A., Akiyama, K., Yamaguchi‐Shinozaki, K. und Shinozaki, K. (2004) Monitoring the expression profiles of genes induced by hyperosmotic, high salinity, and oxidative stress and abscisic acid treatment in Arabidopsis cell culture using a full‐length cDNA microarray. Plant Mol. Biol. 56: 29‐55.

Teng, S., Keurentjes, J., Bentsink, L., Koornneef, M. und Smeekens, S. (2005) Sucrose‐speciWc induction of anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis requires the MYB75/PAP1 gene. Plant Physiol. 139: 1840‐1852.

Terashima, I. und Inoue, Y. (1985) Palisade tissue chloroplasts and spongy tissue chloroplasts in spinach: Biochemical and ultrastructural differences. Plant Cell. Physiol. 26: 63‐75.

Terashima, I., Funayama, S. und Sonoike, K. (1994) The site of photoinhibition in leaves of Cucumis sativus L. at low temperatures in photosystem I, not photosystem II. Planta 193: 300‐306.

Tjus, S.E., Møller, B.L. und Scheller, H.V. (1998) Photosystem I is an early target of photoinhibition in barley illuminated at chilling temperatures. Plant Physiol. 116: 755‐764.

Tjus, S.E., Møller, B.L. und Scheller, H.V. (1999) Photoinhibition of photosystem I damages both reaction centre proteins PSI‐A and PSI‐B and acceptor‐side located small photosystem I polypeptides. Photosynth. Res. 60: 75‐86.

Tjus, S.E., Scheller, H.V., Andersson, B. und Møller, B.L. (2001) Active oxygen produced during selective excitation of photosystem I is damaging not only to photosystem I but also to photosystem II. Plant Physiol. 125: 2007‐2015.

Trebst, A. (1980) Inhibitors in electron flow: Tools for the functional and structural localization of carriers and energy conservation sites. Methods Enzymol. 69: 675‐715.

Vandenabeele, S., Vanderauwera, S., Vuylsteke, M., Rombauts, S., Langebartels, C., Seidlitz, H.K., Zabeau, M., Van Montagu, M., Inzé, D. und Van Breusegem, F. (2004) Catalase deficiency drastically affects gene expression induced by high light in Arabidopsis thaliana. Plant J. 39: 45‐58.

Vanderauwera, S., Zimmermann, P., Rombauts, S., Vandenabeele, S., Langebartels, C., Gruissem, W., Inzé, D. und VanBreusegem, F. (2005) Genome‐wide analysis of hydrogen peroxide‐regulated gene expression in Arabidopsis reveals a high light‐induced transcriptional cluster involved in anthocyanin biosynthesis. Plant Physiol. 139: 806‐821.

Vassiliev, S. und Bruce, D. (2008) Toward understanding molecular mechanisms of light harvesting and charge separation in photosystem II. Photosynth. Res. 97: 75‐89.

von Caemmerer, S. und Farquhar, G.D. (1981) Some relationships between the biochemistry of photosynthesis and the gas exchange of leaves. Planta 153: 376‐387.

Voss, I. (2005) Ferredoxine am Photosystem I: Charakterisierung in Solanum tuberosum und Arabidopsis thaliana. Diplomarbeit, Universität Osnabrück.


Voss, I., Koelmann, M., Wojtera, J., Holtgrefe, S., Kitzmann, C., Backhausen, J.E. und Scheibe, R. (2008) Knock‐out of major leaf ferredoxin reveals new redox‐regulatory adaptations in Arabidopsis thaliana. Physiol. Plant. 133: 584‐598.

Wakao, S. und Benning, C. (2005) Genome‐wide analysis of glucose‐6‐phosphate dehydrogenases in Arabidopsis. Plant J. 41: 243‐256.

Walker, D. (1988) The Use of the Oxygen Electrode and Fluorescence Probes in simple Measurements of photosynthesis. Oxygraphics Limited, Sheffield.

Wang, C.L. und Oliver, D.J. (1997) Identification of a putative flexible loop in Arabidopsis glutathione synthetase. Biochem. J. 322: 241‐44.

Wendehenne, D., Durner, J. und Klessig, D.F. (2004) Nitric oxide: A new player in plant signalling and defense responses. Curr. Opin. Plant Biol. 7: 449‐455.

Wenderoth, I., Scheibe, R. und von Schaewen, A. (1997) Identification of the cysteine residues involved in redox modification of plant plastidic glucose‐6‐phosphate dehydrogenase. J. Biol. Chem. 272: 26985‐26990.

Wendt, U.K., Hauschild, R., Lange, C., Pietersma, M., Wenderoth, I. und von Schaewen, A. (1999) Evidence for functional convergence of redox regulation in G6PDH isoforms of cyanobacteria and higher plants. Plant Mol. Biol. 40: 487‐494.

Wingate, V.P.M., Lawton, M.A. und Lamb, C.J. (1988) Glutathione causes a massive and selective induction of plant defense genes. Plant Physiol. 87: 206‐210.

Winkel‐Shirley, B. (2001) Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology and biotechnology. Plant Physiol. 126: 485‐493.

Wolosiuk, R.A., Ballicora, M.A. und Hagelin, K. (1993) The reductive pentose phosphate cycle for photosynthetic CO2 assimilation: Enzyme modulation. FASEB J. 7: 622‐637.

Woo, K.C., Gerbaud, A. und Furbank, R.T. (1983) Evidence for endogenous cyclic photophosphorylation in intact chloroplasts. 14CO2 fixation with dihydroxyacetone phosphate. Plant Physiol. 72: 321‐325.

Xu, Q., Hoppe, D., Chitnis, V.P., Odom, W.R., Guikema, J.A. und Chitnis, P.R. (1995) Mutational analysis of photosystem I polypeptides in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC‐6803. Targeted inactivation of psaI reveals the function of PsaI in the structural organization of PsaL. J. Biol. Chem. 270: 16243‐16250.

Xu, Q., Yu, L., Chitnis, V.P. und Chitnis, P.R. (1994) Function and organization of photosystem I in a cyanobacterial mutant strain that lacks PsaF and PsaJ subunits. J. Biol. Chem. 269: 3205‐3211.

Xu, W., Chitnis, P.R., Valieva, A., van der Est, A., Brettel, K., Guergova‐Kuras, M., Pushkar, Y.N., Zech, S.G., Stehlik, D., Shen, G., Zybailov, B. und Golbeck, J.H. (2003) Electron transfer in cyanobacterial photosystem I. II. Determination of forward electron transfer rates of site‐directed mutants in a putative electron transfer pathway from A0 through A1 to FX. J. Biol. Chem. 278: 27876‐27887.

Yachandra, V.K., Sauer, K. und Klein, M.P. (1996) Manganese cluster in photosynthesis: Where plants oxidize water to dioxigen. Chem. Rev. 96: 2927‐2950.

Yu, T.S., Kofler, H., Häusler, R.E., Hille, D., Flügge, U.‐I., Zeeman, S.C., Smith, A.M., Kossmann, J., Lloyd, J., Ritte, G., Steup, M., Lue, W.L., Chen, J. und Weber, A. (2001) The Arabidopsis sex1 mutant is defective in the R1 protein, a general regulator of starch degradation in plants, and not in the chloroplast hexose transporter. Plant Cell 13: 1907‐1918.

Zeng, M.‐T., Gong, X.‐M., Evans, M.C.W., Nelson, N. und Carmeli, C. (2002) Stabilization of iron−sulfur cluster FX by intra‐subunit interactions unraveled by suppressor and second site‐directed mutations in PsaB of Photosystem I. Biochim. Biophys. Acta 1556: 254‐264.

Zhang, H., Whitelegge, J.P. und Cramer, W.A. (2001) Ferredoxin:NADP+ oxidoreductase is a subunit of the chloroplast cytochrome b6f complex. J. Biol. Chem. 276: 38159‐38165.

Zhang, R. und Portis, Jr., A.R. (1999) Mechanism of light regulation of Rubisco: A specific role of the larger Rubisco activase isoform involving reductive activation by thioredoxin‐f. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 9438‐9443.

Zhang, S. und Scheller, H.V. (2004) Photoinhibition of PSI at chilling temperature and subsequent recovery in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 45: 1595‐1602.

Zilber, A.L. und Malkin, R. (1988) Organization and topology of photosystem I subunits. Plant Physiol. 88: 810‐814.

Zouni, A., Witt, H.A.T., Kern, J., Fromme, P., Krauss, N., Saenger, W. und Orth, P. (2001) Crystal structure of photosystem II from Synechococcus elongatus at 3.8 Å resolution. Nature 409: 739‐743.

Zybailov, B., Rutschow, H., Friso, G., Rudella, A., Emanuelsson, O., Sun, Q. und van Wijk, K.J. (2008) Sorting signals, N‐terminal modifications and abundance of the chloroplast proteome. PLoS ONE 3: e1994.



162 Abkürzungsverzeichnis

8 Abkürzungsverzeichnis ΔAP700‐D arithmetische Mittelwerte von ΔAP700 im Dunkeln ΔAP700‐MAX maximale Änderung von ΔAP700 im NIR ΔAP700‐N arithmetische Mittelwerte von ΔAP700 im NIR °C Grad Celsius [2Fe‐2S]‐Zentrum 2‐Eisen‐2‐Schwefel‐Zentrum [4Fe‐4S]‐Zentrum 4‐Eisen‐4‐Schwefel‐Zentrum [CO2R] Referenz‐Wert der CO2‐Konzentration [CO2S] Sample‐Wert der CO2‐Konzentration [H2OR] Referenz‐Wert der H2O‐Konzentration [H2OS] Sample‐Wert der H2O‐Konzentration A Photosyntheserate A0 primärer Elektronenakzeptor im PSI A830 nm P700‐Absorption bei 830 nm A860 nm P700‐Absorption bei 860 nm Abb. Abbildung AL aktinisches Licht AN Photosyntheserate in O2‐freier Atmosphäre AO Photosyntheserate bei 21 % O2 im Referenzgas APR apparenter prozentualer Anteil der Photorespiration an der maximalen

RubisCO‐Verbrauchsrate APX Askorbat‐Peroxidase AS Aminosäure Asc Askorbat bzw. beziehungsweise BSA Rinderserumalbumin ca. circa cDNA copy‐DNA Chla Chlorophyll a Chlb Chlorophyll b Ci CO2‐Konzentration im substomatären Raum cm Zentimeter CM‐H2DCFDA 5 (und 6)‐Chloromethyl‐2´,7‐dichlorodihydrofluorescein‐Diacetat CO2 Kohlenstoffdioxid Col‐WT Columbia‐Wildtyp Cyt‐b6f Cytochrom‐b6f‐Komplex d Tag DEPC Diethylpyrocarbonat dNTP 2`‐Desoxynukleotidtriphosphat DTT Dithiothreitol E Einstein ET Transpirationsrate EST expressed sequence tag ETR Elektronentransportrate F steady‐state Fluoreszenz im AL F/FM Fluoreszenz‐Emission im Licht bezogen auf die maximale Fluoreszenzemission

im Dunkeln F0 Grundfluoreszenz im Dunkel‐adaptierten Blatt F0’ Grundfluoreszenz im Licht‐adaptierten Zustand F‐ATPase F‐ATP Synthase FBPase Fructose‐1,6‐Bisphosphat‐Phosphatase FC Anteil der chlororespiratorischen Chlorophyllfloureszenz‐Emission eines Licht‐

adaptierten Blattes im Dunkeln, bezogen auf die Chlorophyllfloureszenz‐Emission im Licht

Fd Ferredoxin

Abkürzungsverzeichnis 163

Fd1 Ferredoxin 1 aus A. thaliana Fd1‐KO Fd1 knock‐out Fd1‐RNAi Fd1 RNA‐inteference Fd2 Ferredoxin 2 aus A. thaliana Fd2‐KO Fd2 knock‐out Fd3 Ferredoxin 3 aus A. thaliana Fd4 Ferredoxin 4 aus A. thaliana FdC1 Ferredoxin C1 aus A. thaliana FdC1‐RNAi FdC1 RNA‐inteference FdC2 Ferredoxin C2 aus A. thaliana FdI Ferredoxin I aus Mais FdII Ferredoxin II aus Mais FdOX oxidiertes Ferredoxin FdRED reduziertes Ferredoxin Fd‐Trx‐System Ferredoxin‐Thioredoxin‐System FM maximale Fluoreszenz im Dunkel‐adaptierten Blatt FM’ maximale Fluoreszenz im Licht‐adaptierten Zustand FNR Ferredoxin‐NADP+‐Reduktase FV/FM Maximale Quantenausbeute des PSII g Erdbeschleunigung g Gramm G1P Glukose‐1‐Phosphat G6PDH Glukose‐6‐Phosphat‐Dehydrogenase GFP green fluorescent protein GR Glutathion‐Reduktase GSH reduziertes Glutathion GSSG oxidiertes Glutathion gtw Blattleitfähigkeit GWD Glukan‐Wasser‐Dikinase h Stunde H2O Wasser H2O2 Wasserstoffperoxid H2Obidest doppelt destilliertes Wasser HCl Chlorwasserstoff (Salzsäure) HEPES 4‐(2‐Hydroxyethyl)‐piperazin‐1‐ethan‐sulfonsäure HL Hochlicht HPLC High Performance Liquid Chromatography i.d.R. in der Regel kDa Kilodalton KO knock‐out Lae‐WT Landsberg erecta‐Wildtyp LED lichtemittierende Diode LET linearer Elektronentransport LHC Lichtsammelkomplex LHCII Lichtsammelkomplex‐II LHCs Lichtsammelkomplexe M Molar MDA Monodehydroaskorbat MDHR Monodehydroaskorbat‐Reduktase MES Morpholinoethansulfonat min Minute mind. mindestens ML Messlichtimpuls mRNA messengerRNA MV Methylviologen MW Molekulargewicht NAD(P)‐GAPDH NAD(P)‐Glycerinaldehyd‐3‐Phosphat‐Dehydrogenase

164 Abkürzungsverzeichnis

NADP(H) (reduziertes) Nicotinamidadenindinukleotid NADP‐MDH NADP‐abhängige Malatdehydrogenase Noe‐WT Noessen‐Wildtyp NPQ nicht‐photochemische Fluoreszenzlöschung NTR NADPH‐Thioredoxin‐Reduktase NTRC chloroplastidäre NTR O2

‐ Superoxid O2 Sauerstoff OAA Oxalacetat OPP oxidativer Pentosphophatweg P(T7) T7‐Promotor P680 reaktives Zentrum des PSII P680* angeregtes reaktives Zentrum des PSII P680+ oxidiertes reaktives Zentrum des PSII P700 reaktives Zentrum des PSI P700+ oxidiertes reaktives Zentrum des PSI PAGE Polyacrylamid‐Gelelektrophorese PC Plastocyanin PCR Polymerase‐Kettenreaktion PET photosythetischer Elektronentransport PQ Plastochinon PQH2 Plastohydrochinon PQ‐Pool Plastochinon‐Pool PRK Phosphoribulokinase Prx Peroxiredoxine PsaA‐PsaO Proteinuntereinheiten von PSI PSI Photosystem I PSI‐Core PSI‐Core Proteinkomplex PSII Photosystem II PVDF Polyvinylidenfluorid PVP Polyvinylpyrrolidon QA primärer Akzeptor im PSII QB sekundärer Elektronenakzeptor qE Fluoreszenzlöschung durch Energieabgabe in Form von Wärme qI Fluoreszenzlöschung durch Photoinhibition qL Fluoreszenzparameter linear zum Redox‐Zustand von QA qP photochemische Fluoreszenzlöschung qT Fluoreszenzlöschung durch state transitions (LHCII) RNAi RNA‐interference ROS reaktive Sauerstoffspezies RPP reduktiver Pentosephosphatweg RT Raumtemperatur RT‐PCR Reverse‐Transkriptase‐PCR RubisCO Ribulose‐1,5‐Bisphosphat‐Carboxylase/Oxygenase s Sekunde S Blattfläche s.o. siehe oben s.u. siehe unten SBPase Sedoheptulose‐1,7‐Bisphosphat‐Phosphatase SD standard diviation SDS Natriumdodecylsulfat SDS‐PAGE Natriumdodecylsulfat‐Polyacrylamid‐Gelelektrophorese SE standard error SF stromaler Faktor SOD Superoxid‐Dismutase SP Sättigungspuls T‐DNA Transfer‐DNA

Abkürzungsverzeichnis 165

Tab. Tabelle Tris Tris‐Hydroxymethylaminomethan Trx Thioredoxin TrxOX oxidiertes Thioredoxin TrxRED reduziertes Thioredoxin u Flussrate unpubl. unpubliziert UV‐Licht ultraviolettes Licht vgl. vergleiche WT Wildtyp ZET zyklischer Elektronentransport ΔAP700 P700‐Absorptionsänderung ΔpH Protonengradient фII Quantenausbeute am PSII

166 Danksagung

9 Danksagung

Mein großer Dank gilt Prof. Renate Scheibe für die Aufnahme in die Arbeitsgruppe, die

Bereitstellung des interessanten Themas und die stets kompetente Betreuung während

meiner Promotionszeit. Zusätzlich bin ich Prof. Dr. Renate Scheibe sehr dankbar für die

vielen interessanten Diskussionen und Hilfestellungen während meiner gesamten

Studienzeit.

Für die Übernahme des Koreferates möchte ich mich ganz herzlich bei Prof. Dr.‐Ing.

Richard Wagner bedanken.

Ein besonderer Dank gilt Dr. Jan Backhausen, der mich in die Geheimnisse der

Chlorophyllfluoreszenz‐Analytik einweihte. Vor allem möchte ich Dr. Jan Backhausen

aber für seine Freundlichkeit und Hilfsbereitschaft danken, auf die ich jederzeit

ausnahmslos bauen konnte.

Dr. Simone Holtgrefe möchte ich ganz herzlich für unendlich viele Hilfestellungen

sowohl im inhaltlichen als auch in praktischen Teilen meiner Arbeit danken. Die

jederzeit kritischen und konstruktiven Diskussionen waren eine große Hilfe und haben

maßgeblich zu einer erfolgreichen Entwicklung der Thematik beigetragen. Zusätzlich gilt

ihr ein ganz besonderer Dank für die schöne und freundschaftliche Zusammenarbeit in

den letzten Jahren.

Für die gute Zusammenarbeit möchte ich mich auch bei Dr. Guy Thomas Hanke

bedanken. Der stete Austausch und die fachlichen Diskussionen waren eine große

Bereicherung und haben mich immer ein Stück weiter gebracht. Mit seiner

unkomplizierten und freundlichen Art hat er immer zu einer tollen Arbeitsatmosphäre

beigetragen (Guy, thank you for everything!).

Einen besonderen Dank für ein immer absolut freundschaftliches und kollegiales

Verhältnis verdienen Inga Strodtkoetter (für die tolle Studienzeit und vor allem für die

Doktorandenzeit, in der ich mich immer absolut auf sie verlassen konnte und sie mir ein

großer Halt war), Joanna Wojtera (für eine schöne freundschaftliche Zeit und die vielen

wunderbaren sprachlichen Missverständnisse), Nikolas König (für seine Hilfe immer und

überall, für die ich mich nicht genug bedanken kann) und Hans‐Martin Leffers (für

Buddy!).

Bei Silke Walter möchte ich mich für die Hilfe im Rahmen der Glutathion‐Bestimmung

herzlich bedanken.

Danksagung 167

Der gesamten Arbeitsgruppe, vor allem Heike Schwiderski (für die vielen Hilfestellungen

und die Versorgung mit Nahrung über die letzten Jahre ☺), den Gärtnerinnen Heike

Wolf‐Wibbelmann, Kirsten Jäger und Sabine Steinbach (für die Anzucht von optimalem

Pflanzenmaterial) und allen Studenten, die ich betreut oder mit denen ich

zusammengearbeitet habe (Patricia Lehmkuhl, Katharina Bollig, Meike Koehlmann,

Wiebke Hansen und Mike Fastabend) möchte ich herzlich für die schönen letzten Jahre

danken.

Meinen Freunden und Bekannten, die ich in letzter Zeit häufig vernachlässigt habe, gilt

ein besonderer Dank für Ihr Verständnis.

Das größte Dankeschön gilt meiner Familie und ganz besonders meinen Eltern. Ohne

ihre ständige Unterstützung, Hilfe, Anteilnahme und ihr Verständnis wäre dies alles

niemals möglich gewesen. Aus diesem Grund widme ich ihnen diese Arbeit.

Am meisten unter der Situation zu leiden hatte sicherlich meine Freundin Rahel. Ich

kann nicht ausdrücken wie dankbar ich ihr bin. Die Geduld, das Verständnis und die

Hilfe und Unterstützung in so vielen Bereichen, die sie mir entgegengebracht hat, waren

unglaublich. In all der Zeit war sie Stütze und Motivation gleichermaßen. Vielen lieben

Dank dafür.

168 Eidesstattliche Erklärung

10 Eidesstattliche Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und

ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus

anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter

Angabe der Quelle gekennzeichnet.

Bei der Auswahl und Auswertung folgenden Materials haben mir die nachstehend

aufgeführten Personen in der jeweils beschriebenen Weise unentgeltlich geholfen.

1. Dr. Guy Thomas Hanke half bei der Erstellung des Alignments und des

phyllogenetischen Stammbaums in Kapitel 3.3.1.

2. Joanna Wojtera half bei der Erstellung der Bilder mit dem konfokalen

laser scanning‐Mikroskop im Rahmen der ROS‐Bestimmung (siehe

Kapitel 3.1.3.2) und den Lokalisationsstudien (siehe Kapitel 3.3.2)

3. Silke Walter half bei der Glutathion‐Bestimmung mittels HPLC (3.1.3.2).

Weitere Personen waren an der inhaltlichen materiellen Erstellung der vorliegenden

Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von

Vermittlungs‐ bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder andere Personen) in

Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar geldwerte

Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten

Dissertation stehen.

Die Arbeit wurde bisher weder im In‐ noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form

einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

_______________________ ________________________ (Ort. Datum) (Unterschrift)

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