Physikalische Kartierung eines Genorts für das Senior ...

Aus dem Zentrum für Kinderheilkunde und Jugendmedizin

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.

Physikalische Kartierung eines Genorts für das Senior-Løken Syndrom (SLS) auf

Chromosom 15q22-q26

INAUGURAL-DISSERTATION zur

Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.

vorgelegt von Sonia Cristina Briese

geboren in Bukarest Freiburg 2002

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. M. Schumacher 1. Gutachter: Prof. Dr. med. F. Hildebrandt 2. Gutachter: PD Dr. G. Scherer Jahr der Promotion: 2002

Meinen Eltern, Bobi, Icu, Bunica und

meinem Vorbild Ica

Inhaltsverzeichnis 4

ABKÜRZUNGEN ....................................................................................................... 7

1. EINLEITUNG......................................................................................................... 9

1.1. Das Senior-Løken Syndrom ........................................................................................ 9

1.2. Epidemiologie ............................................................................................................. 10

1.3. Die Renale Manifestation des Senior-Løken Syndroms ......................................... 11

1.3.1. Klinik der familiären juvenilen Nephronophthise................................................ 11 1.3.2. Pathologie und Histopathologie ........................................................................... 12

1.4. Die okuläre Manifestation des Senior-Løken Syndroms ........................................ 13

1.4.1. Klinik und pathologische Befunde der Retinitis Pigmentosa............................... 13 1.4.2. Histopathologie der Retinitis pigmentosa ............................................................ 14

1.5. Einteilung des SLS in eine juvenile und eine adulte Form..................................... 15

1.6. Pathogenese des Senior-Løken Syndroms................................................................ 16

1.7. Diagnostik und Differentialdiagnose ........................................................................ 16

1.8. Therapie des Senior-Løken Syndroms ..................................................................... 18

1.9. Molekulargenetische Forschungsergebnisse............................................................ 19

1.9.1. Strategien der Identifizierung von Krankheitsgenen............................................ 19 1.9.2. Molekulargenetik der familiären juvenilen Nephronophthise ............................. 24 1.9.3. Molekulargenetik des Senior-Løken Syndroms................................................... 26

1.10. Ziele dieser Arbeit ...................................................................................................... 27

2. PATIENTEN, MATERIAL UND METHODEN...................................................... 28

2.1. Familien mit Senior-Løken Syndrom....................................................................... 28

2.2. Yeast Artificial Chromosomes (YACs) .................................................................... 33

2.2.1 Herkunft der YAC-Klone......................................................................................... 34 2.2.2. Anzüchten der YAC-Klone.................................................................................. 35 2.2.3. Herstellung von Flüssigkulturen und Glycerin-Stocks ........................................ 35

2.3. Erstellung eines YAC-Contigs................................................................................... 35

2.3.1. Polymerasekettenreaktion (PCR) ......................................................................... 36 2.3.2. Agarose-Gelelektrophorese.................................................................................. 38 2.3.3. Interpretation von PCR-Ergebnissen.................................................................... 39

2.4. Erstellung von PAC-Contigs ..................................................................................... 39

2.4.1. PACs..................................................................................................................... 40 2.4.2. YAC-DNA-Präparation zur Durchsuchung einer PAC-Bibliothek ..................... 40 2.4.3. Bestimmung der Konzentration der DNA-Lösung .............................................. 42


2.4.4. Inter-Alu-PCR mit der YAC-DNA als Template ................................................. 42 2.4.5. Herstellung von weiteren Hybridisierungssonden mit ESTs ............................... 43 2.4.6. Herkunft der PAC-Klone ..................................................................................... 44 2.4.7. Anzüchten der PAC-Klone................................................................................... 44 2.4.8. Isolation der Plasmid-DNA.................................................................................. 45 2.4.9. Rückkartierung der PAC-Klone auf das YAC-Contig......................................... 45

2.5. Weitere Materialien und Geräte............................................................................... 46

2.6. Verwendete Lösungen und Substanzen.................................................................... 46

3. ERGEBNISSE ..................................................................................................... 48

3.1. Generierung von STS – Markern in der SLS-Region............................................. 48

3.1.1. Nicht-polymorphe STS-Marker ........................................................................... 48 3.1.2. Polymorphe STS-Marker ..................................................................................... 49 3.1.3. Marker zu exprimierten Sequenzen (ESTs) ......................................................... 51

3.2. Aufbau eines YAC-Contigs in der SLS-Region....................................................... 52

3.2.1. Erstellung einer YAC-Karte................................................................................. 52 3.2.2. Kartierung von ESTs auf dem Contig .................................................................. 53 3.2.3. STS-content-mapping mit Hilfe von 5’EST der SLS-Region.............................. 55 3.2.4. Erstellung eines minimalen Contigs..................................................................... 56

3.3. Aufbau einer PAC-Karte der SLS-Region............................................................... 58

3.3.1. Erstellung von Hybridisierungssonden zur PAC-Suche ...................................... 58 3.3.2. Rückkartierung der PAC-Klone auf das YAC-Contig......................................... 59 3.3.3. Lücken im PAC-Contig........................................................................................ 59

3.4. Haplotypenanalyse mit 3 weiteren SLS-Familien ................................................... 61

3.4.1. Neue Familien mit Senior-Løken Syndrom ......................................................... 61 3.4.2. Haplotypenanalyse der Familien.......................................................................... 62

4. DISKUSSION ...................................................................................................... 65

4.1. Chronologische Abfolge der Experimente ............................................................... 65

4.2. Erstellung einer physikalischen Karte in der SLS-Region..................................... 65

4.2.1. Interpretation der Ergebnisse des YAC-Contigs für SLS .................................... 66 4.2.2. Vergleich zum Whitehead-Contig........................................................................ 66 4.2.3. Schwierigkeiten der YAC-Kartierung.................................................................. 67 4.2.4. Probematik bei der Erstellung des kompletten YAC-Contigs für SLS................ 68 4.2.5. Orientierung der kartierten ESTs ......................................................................... 69 4.2.6. Einbeziehung der betroffenen Familien in das YAC-Contig ............................... 70 4.2.7. Erstellung mehrerer PAC-Contigs in der SLS-Region ........................................ 70 4.2.8. Interpretation der Ergebnisse der PAC-Karte für SLS......................................... 71

4.3. Haplotypenanalyse der SLS-Familien...................................................................... 72

4.3.1. Problematik der klinischen Einteilung der SLS-Familien.................................... 72 4.3.2. Generierung von weiteren Kandidatenregionen................................................... 72


4.4. Molekulargenetik der Retinitis Pigmentosa ............................................................ 74

4.4.1. Bereits identifizierte Gene und Genloci für Retinitis Pigmentosa ....................... 75 4.4.2. Syndromale Formen der Retinitis Pigmentosa..................................................... 77 4.4.3. Metabolische Erkrankungen assoziiert mit einer RP ........................................... 79

4.5. Kandidatengene für das Senior-Løken Syndrom.................................................... 80

4.5.1. Funktionelle Kandidatengene für SLS ................................................................. 81 4.5.2. Positionelle Kandidatengene für SLS auf Chromosom 15................................... 82

4.6. Weiteres Vorgehen bei der Kartierung eines Genlocus für SLS ........................... 84

5. ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................... 85

6. LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................ 86

7. DANKSAGUNG .................................................................................................. 99

8. LEBENSLAUF .................................................................................................. 100

Abkürzungen 7

ABKÜRZUNGEN

Abb. Abbildung

bp Basenpaare

cDNA “complementary DNA”

cM centi Morgan

CRABP “cellular retinoic acid-binding protein”

CRALBP “cellular retinol-binding protein”

ddNTP Didesoxynukleosidtriphosphat

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynukleosidtriphosphat

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EOG Elektrookulogramm

ERG Elektroretinogramm

EST “expressed sequence tag”

Fa. Firma

FISH Fluoreszenz in-situ Hybridisierung

g Erdbeschleunigung

Kap. Kapitel

kb Kilobase

LAC Leber’sche Amaurosis congenita

LOD-Score “logarithm odds ratio”

Mb Megabase

MCD “medullary cystic disease”

mRNA “messenger RNA”

MS-Marker Mikrosatellitenmarker

NPH Nephronophthise

PAC “P1-related artificial chromosome”

PCR “polymerase chain reaction”

RNA Ribonukleinsäure

s. siehe

S. Seite

SLS Senior-Løken Syndrom

SLS-E “early-onset” SLS

Abkürzungen 8

SLS-L “late-onset” SLS

SSCP “single strand conformation polymorphism”

STS “sequence-tagged site”

Tab. Tabelle

Taq Thermus aquaticus

TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer

TEMED Tetramethylaminomethan

TIGR “The Institute of Genome Research”

Tm “annealing” Temperatur

Tris Trishydroxymethylaminomethan

U Internationale Enzymeinheit

ugf. ungefähr

UT untranslatierte Sequenz

UV Ultraviolett

YAC “yeast artificial chromosome”

Einleitung 9

1. EINLEITUNG

1.1. Das Senior-Løken Syndrom

Das Senior-Løken Syndrom ist eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung. Sie ist durch die

Assoziation der familiären juvenilen Nephronophthise (NPH) mit einer Retinitis pigmentosa

(RP) gekennzeichnet. Diese Erkrankung führt zu zystischen Nierenveränderungen, die

durchschnittlich im Alter von 13 Jahren ein terminales Nierenversagen auslösen. Außerdem

verursacht sie eine Netzhautpigmentschichtdegeneration, welche letztendlich zur Erblindung

führt.

Im Jahre 1961 beobachtete Løken et al. zwei Geschwister, die eine renale Dysplasie sowie

eine Aplasie der Retina aufwiesen. Im selben Jahr beschrieb Senior et al. eine südafrikanische

Familie mit einem occulo-renalem Syndrom, bei der 6 von 13 Kindern eine Nephropathie im

Sinne einer familiären juvenilen Nephronophthise und gleichzeitig eine Retinadystrophie

zeigten. Er benannte das gekoppelte Vorliegen beider Krankheiten als Senior-Løken Syndrom

(Løken et al., 1961; Senior et al., 1961).

Die familiäre juvenile Nephronophthise (NPH) ist eine hereditäre Form einer progressiven

Niereninsuffizienz. Sie stellt die häufigste genetisch bedingte Ursache für ein chronisches

Nierenversagen in den ersten beiden Lebensdekaden dar. Der erste Fall von NPH wurde 1945

von Smith und Graham beschrieben (Smith and Graham, 1945). Der Begriff der “familiären

juvenilen Nephronophthise” wurde dann 1951 von Fanconi eingeführt (Fanconi et al., 1951).

Seitdem sind über 300 weitere Fälle von NPH in der Literatur beschrieben worden (Waldherr

et al., 1982).

Die familiäre juvenile Nephronophthise kann in Verbindung mit vielen extrarenalen

Organveränderungen vorkommen. Neben dem Senior-Løken Syndrom wurden zerebelläre

Ataxie (Steele et al., 1980), mentale Retardierung (Fanconi et al., 1951), bilaterale

Schwerhörigkeit (Clarke et al., 1992), Ptosis, Enophthalmus und eine Hypophyseninsuffizienz

(Di Rocco et al., 1997), Skelettanomalien wie zum Beispiel Zapfenepiphysen (Mainzer et al.,

1970), und eine kongenitale hepatische Fibrose (Boichis et al., 1973; Proesmans et al., 1975;

Delaney et al., 1978) beschrieben.

Einleitung 10

Eine weitere Erkrankung, die ein ähnliches Krankheitsbild wie die juvenile Nephronophthise

zeigt, ist die “medullary cystic disease” (MCD). Die MCD weist einen autosomal-dominanten

Vererbungsmodus auf, und unterscheidet sich von der Nephronophthise nur durch den

Zeitpunkt des Auftretens der renalen Symptomatik. Während bei der juvenilen

Nephronophthise das terminale Nierenversagen in der zweiten Lebensdekade eintritt, kommt

es bei der “medullary cystic desease” erst im Alter von 30 bis 40 Jahren zur terminalen

Niereninsuffizienz. Es gibt jedoch keinen markanten Unterschied in der Dauer und dem

Verlauf der Nierenerkrankung, sowie in der Histopathologie (Gardner, 1971).

Sowohl die autosomal-rezessive Nierenerkrankung und ihre Kombination mit retinalen und

extrarenalen Manifestationen, als auch die autosomal-dominante Form, welche alle durch

Zystenbildung an der Rinden-Mark-Grenze in den ersten drei Lebensdekaden zum

chronischen Nierenversagen führen, werden unter dem Begriff Nephronophthise-Komplex

zusammengefaßt (Waldherr et al., 1982).

1.2. Epidemiologie

Bisher wurden in der Literatur über Erkrankungen des Nephronophthise-Komplexes in der

ganzen Welt berichtet, unter anderem über Fälle aus Europa, Nordamerika, Südamerika, aus

Arabischen Staaten, Iran, Indien, Israel, Türkei und Japan (Kleinknecht et al., 1989). Beide

Geschlechter sind gleich häufig betroffen. Die Inzidenz wurde für die USA auf 9

Neuerkrankungen pro 8,3 Mio. Einwohner pro Jahr geschätzt (Potter et al., 1980).

Über die Inzidenz des Senior-Løken Syndroms gibt es keine genauen Daten. Man nimmt an,

daß die familiäre juvenile Nephronophthise in 12 % der Fälle zusammen mit einer Retinitis

pigmentosa auftritt (Gardner und Evan, 1979), und in 2-5 % der Fälle außer der RP andere

extrarenale Manifestationen wie Ataxie, Leberfibrose und sog. “Zapfenepiphysen”

vorkommen.

Einleitung 11

1.3. Die Renale Manifestation des Senior-Løken Syndroms

Im Bezug auf die Klinik sowie den histopathologischen Veränderungen der Niere entspricht

das Krankheitsbild des Senior-Løken Syndroms dem der familiären juvenilen

Nephronophthise.

1.3.1. Klinik der familiären juvenilen Nephronophthise

Die familiäre juvenile Nephronophthise wird auch als “Salzverlustnephritis” bezeichnet.

Diesen Namen verdankt sie ihrem Frühsymptom, der Einschränkung der Konzentrations-

fähigkeit der Niere auf unter 800 mosm/l (Waldherr et al., 1982). Dieser Konzentrierungs-

defekt führt zu einem starken Salzverlust und geht mit Salzhunger einher. Auch bei noch

ausreichendem Glomerulumfiltrat führt dies zu einem Rückgang der Diurese, welche sich mit

dem Ersatz des Salzdefizites bessert. Als Folge der osmotischen Diurese treten im Alter von 2

bis 6 Jahren weitere Symptome wie Polyurie, Polydipsie, Nykturie und sekundäre Enuresis

auf (Hildebrandt et al., 1992).

Im weiteren Verlauf kommt es zu einer Wachstumsretardierung und Minderwuchs begleitet

von einer schweren Anämie (Hb < 10 g/dl). Diese ist wahrscheinlich durch einen Mangel an

Erythropoetin auf der Basis der tubulo-interstitiellen Nephropathie bedingt. Die Anämie

entspricht dem Schweregrad der Niereninsuffizienz (Gardner und Evan, 1979).

Durch den anfänglichen Salzverlust fehlen charakteristischerweise Ödeme und eine arterielle

Hypertonie in der Phase des kompensierten Nierenversagens. Die rechtzeitige Diagnose wird

weiterhin durch das Fehlen einer Hämaturie, Proteinurie oder Bakteriurie erschwert.

Weiterhin wurden bislang auch keine rezidivierende Harnwegsinfekte oder Malformationen

der Harnwege beschrieben. Das führt dazu, daß die Diagnose einer Nephronophthise sehr

spät, oft erst beim Vorliegen eines Nierenversagens gestellt wird.

Der klinische Verlauf wird durch einen eher langsam fortschreitenden Verlust der

glomerulären Funktion charakterisiert. Zur terminalen Niereninsuffizienz kommt es im Alter

von 5 bis 18 Jahren (Waldherr et al., 1982; Hildebrandt et al., 1992). Neben den erhöhten

Serumkreatininwerten von über 1,5 mg/dl kommt es in diesem Spätstadium zu einer

ausgeprägten Proteinurie, Hypertonie, metabolischen (urämischen) Azidose und einer renalen

Einleitung 12

Osteodystrophie, bedingt durch einen Calcitriolmangel und einen Parathormonüberschuß. Die

Zeit zwischen den ersten Symptomen einer chronischen Niereninsuffizienz und dem

terminalen Nierenversagen beträgt in der Regel 3 Jahre (Pistor et al., 1985).

1.3.2. Pathologie und Histopathologie

Das typische Merkmal der Nephronophthise-Komplex Erkrankungen ist die Bildung von

zahlreichen Zysten an der Rinden-Mark-Grenze beider Nieren. Es wird angenommen, daß der

exzessive renale Kaliumverlust die Ursache dieser zystischen Veränderungen sei. Die Zysten

weisen einen Durchmesser von 1-15 mm auf und enthalten eine klare, bernsteinfarbene

Flüssigkeit. Charakteristischerweise gibt es keine weiteren zystischen Veränderungen an

anderen Organen. Erst im Spätstadium der Erkrankung kommt es zu einer Verkleinerung der

Nieren mit einer feinen Granulierung der Oberfläche (Waldherr et al., 1982).

Histologisch findet man im Frühstadium eine peritubuläre Lymphozyten- und

Histiozyteninfiltration, die später in eine fokale bis diffus sklerosierende tubulo-interstitielle

Nephropathie übergeht. Das charakteristische Zeichen der NPH ist eine stark verdickte

tubuläre Basalmembran, die eine starke PAS-Positivität zeigt, wobei der Nachweis von

Immunkomplexen stets negativ ausfällt. Besonders am kortiko-medullären Übergang, sind

vor allem die distalen Tubulusabschnitte teils atrophisch, teils zystisch erweitert. Die Zysten

gehen meist von den Sammelrohren und vom distalen Konvolut aus. Die Glomeruli sind bis

auf eine leichte periglomeruläre Fibrose unauffällig. Vaskuläre Läsionen sind normalerweise

nicht vorhanden. Eine extratubuläre Ansammlung von Tamm-Horsfall Protein ist in der

Literatur beschrieben worden, welche eine Antwort auf den kontinuierlichen inflammatori-

schen Prozeß und eine progressive Nierenschädigung zeigt (Resnick et al., 1978).

Im elektronenmikroskopischen Bild dominieren die Veränderungen der tubulären

Basalmembran. Man beobachtet eine für die Erkrankung charakteristische Verdickung mit

einer unregelmäßigen Faltung, Aufsplitterung in mehreren Lagen und granuläre

Desintegration, wobei die Übergänge zwischen den einzelnen Veränderungen sehr abrupt

sind. Im Bereich der desintegrierten tubulären Basalmembran kommt es zur Einsprossung von

Fibroblasten.

Immunhistochemisch findet Cohen eine konstante morphologische Veränderung der tubulären

Basalmembran (TBM) durch eine verminderte immunfluoreszente Anfärbbarkeit mit einem

Einleitung 13

Anti-TBM-Antikörper in allen Nephron-Segmenten, sowohl mit als auch ohne zystischen

Veränderungen. Antikörper gegen Laminin und Typ IV Kollagen präsentieren hingegen eine

normale Intensität (Cohen und Hoyer, 1986).

1.4. Die okuläre Manifestation des Senior-Løken Syndroms

Zusätzlich zu den renalen Symptomen findet man beim Senior-Løken Syndrom das klinische

Bild einer Retinitis pigmentosa. Das Auftreten der Augensymptomatik manifestiert sich in

den meisten Fällen wesentlich früher als die Niereninsuffizienz.

1.4.1. Klinik und pathologische Befunde der Retinitis Pigmentosa

Die Retinitis pigmentosa gehört zu den verschiedenen Formen der hereditären Netzhaut-

pigmentschichtdegeneration. Sie bezeichnet eine Gruppe progressiver Netzhautveränderun-

gen, die eine hohe Variabilität der klinischen Symptome sowie der Augenhintergrundbefunde

zeigt. Das Auftreten der Retinitis pigmentosa wird alleine oder im Zusammenhang mit

anderen Erkrankungen, so wie beim Senior-Løken Syndrom, beobachtet.

Bei der tapetoretinalen Degeneration steht der Untergang von Photorezeptoren (Stäbchen und

Zapfen) der Retina im Vordergrund, der in der mittleren Netzhautperipherie beginnt und

langsam nach zentral und peripher fortschreitet. Hierbei werden meistens beide Augen

gleichzeitig betroffen. Es kommt bereits früh zu einer Dunkeladaptationsstörung bis hin zu

einer Nachtblindheit (Nyctalopie) und zu einer hochgradigen, konzentrischen Einschränkung

des Gesichtsfeldes. Durch den peripheren Gesichtsfeldausfall bleibt dem Patienten nur noch

ein röhrenförmiges zentrales Gesichtsfeld erhalten, was man als “Flintenrohrgesichtsfeld”

bezeichnet. Dabei bleibt der Visus noch erstaunlich gut erhalten, bis es in einem späteren

Stadium zur vollständigen Erblindung kommt.

Die ophthalmologische Beurteilung des Augenhintergrundes zeigt folgende Veränderungen:

von der Peripherie zum Zentrum fortschreitende intraretinale Pigmentablagerungen

sogenannte “knochenkörperchenartige Pigmentverklumpungen”. Außerdem sind stark

verengte retinale Gefäße und eine wachsgelbe Papillenatrophie zu sehen (Bunker et al., 1984).

Einleitung 14

Im Falle des Senior-Løken Syndroms sind die Schwere der Symptome sowie der Zeitpunkt

ihres Auftretens bei den einzelnen Individuen sehr unterschiedlich. Von ihnen ist auch die

Einteilung in eine “juvenile” und eine “adulte” Form des SLS abhängig (s. Kap. 1.5.). Man

unterscheidet zwischen vier Erscheinungsformen der Retinitis pigmentosa, die mit dem

Senior-Løken Syndrom im Zusammenhang gebracht werden:

1. Leber’sche Amaurosis congenita (LAC):

Diese atypische Form der Retinitis pigmentosa wurde zuerst 1869 von Leber beschrieben. Sie

besteht entweder von Geburt an oder entwickelt sich im Verlauf der ersten beiden

Lebensjahre. Die LAC kennzeichnet sich durch eine fehlende Lichtperzeption des Kindes.

Der Augenhintergrund sieht in der frühen Kindheit noch normal aus, entwickelt später aber

eine typische Pigmentretinopathie (Leber, 1869). Typisch für die LAC ist auch die häufige

Assoziation mit einer starken Hypermetropie.

2. “klassische” Retinitis pigmentosa:

Auf die Symptomatik dieser Form wurde oben eingegangen. Sie zeigt einen unterschiedlichen

Verlauf, wobei 75 % der Patienten im Alter von 30 Jahren symptomatisch sind.

3. Sektor-Retinitis pigmentosa:

Bei dieser Form werden nur Teile der Netzhaut befallen, wobei der infranasale Quadrant

besonders betroffen ist (Amster 1986). Die Erkrankung beginnt in der zweiten Lebensdekade

und verläuft langsam progredient oder bleibt sogar stationär (Kanski 1994).

4. Retinitis punctata albescens:

Wie bei der “klassischen” Retinitis pigmentosa stehen progressive Gesichtsfeldverluste,

Sehschärfenachlaß und Nachtblindheit im Vordergrund. Der Augenfundus zeigt multiple

weiße Pünktchen vorzugsweise am Äquator und mit Aussparung der Makula ohne

Pigmentveränderungen (Amster 1986).

1.4.2. Histopathologie der Retinitis pigmentosa

Die histologischen Veränderungen der Retina entsprechen den Veränderungen des

Augenfundus. Die “knochenkörperchenartigen Pigmentverklumpungen” werden durch

pigmentierte Makrophagen hervorgerufen, welche in die Retina migrieren und oft um retinale

Einleitung 15

Gefäße kongregieren (Cogan, 1950). Das histologische Präparat eines an SLS verstorbenen

Jungen zeigt, daß die Sinnesrezeptoren der Retina in der äußeren Peripherie vollständig

verschwunden sind. An ihrer Stelle ist eine amorphe Masse wiederzufinden (Senior et al.,

1961). Der Untergang der Sinnesepithelzellen der Netzhaut verursacht eine Reduktion des

Blutflusses in den Choriokapillaren, welche die Verengung der Netzhautgefäße durch eine

Autoregulation erklärt. Die Verblassung und Atrophie der Papille entspricht einer

Gliazellproliferation in Form einer epiretinalen Membran an der Oberfläche des Sehnerves.

1.5. Einteilung des SLS in eine juvenile und eine adulte Form

Die unterschiedliche klinische Ausprägung der Symptome der an SLS erkrankten Kindern

zeigt eine gewisse Regelmäßigkeit, die schon früh zur Einteilung in eine juvenile SLS-“early”

(SLS-E) und eine adulte SLS-“late” Form (SLS-L) veranlaßte (Fillastre et al., 1976). Diese

unterschiedliche Symptomatik der beiden SLS-Formen ist aus Tabelle 1 zu entnehmen.

Nierensymptomatik Augensymptomatik

juvenile Form

(SLS-“early”)

● sehr frühes Einsetzen

(2-6 Lebensjahr) der

Nierenfunktionsstörung

● Nierenversagen vor dem

10. Lebensjahr

● schlechte Prognose oft

tödlicher Verlauf

● Leber’sche Amaurosis

congenita (LAC)

(blind seit der Geburt oder

Erblindung innerhalb der

ersten beiden Lebensjahre)

adulte Form

(SLS-“late”)

● späteres Einsetzen der

Nierensymptomatik

● langsames Fortschreiten

● die Niereninsuffizienz tritt

erst im mittleren Alter von

28,5 Jahren

● leichtere Ausprägung der

Augensymptomatik wie

z.B.: Sektor-RP, Retinitis

punctata albescens oder

auch nur durch ein

pathologisches ERG.

Tabelle 1: Klinische Unterschiede zwischen dem juvenilen und dem adulten SLS. In der linken Spalte werden die typischen Nierenmanifestationen, in der rechten die typischen Augenmanifestationen beschrieben, zunächst von SLS-E (erste Zeile), dann von SLS-L (zweite Zeile).

Einleitung 16

1.6. Pathogenese des Senior-Løken Syndroms

Der Pathomechanismus des Senior-Løken Syndroms ist nicht bekannt. Die Degeneration des

Neuroepithels sowie des Nierenepithels, die beide ektodermalen Ursprungs sind, könnte ein

Hinweis auf ein genetisch determinierter Enzymdefekt darstellen (Senior et al., 1961; Fillastre

et al., 1976).

Für die Entstehung der Zysten bei den Erkrankungen des Nephronophthise-Komplexes

werden weitere Hypothesen in Betracht gezogen. Die charakteristischen histologischen

Veränderungen und die verminderte immunhistochemische Anfärbbarkeit der tubulären

Basalmembran (TBM) lassen als primären Defekt an eine Anlagestörung der TBM denken

(Cohen und Hoyer, 1986). Eine solche strukturelle Veränderung könnte zu einer verminderten

Compliance der Tubuli und somit zunächst zu einer Erweiterung und Zystenbildung im

Bereich der Tubuli führen. Außerdem kann diese strukturelle Anomalie der Basalmembran zu

einer tubulären Transportstörung führen (Chamberlin et al., 1977; Fillastre et al., 1977). Ein

tubulärer Enzymdefekt könnte eine endogene Akkumulation nephrotoxischer Substanzen zur

Folge haben (Chamberlin et al., 1977).

Die Pathogenese der Retinitis Pigmentosa ist sehr vielfältig. Diskutiert wird ein Defekt des

Pigmentepithels oder eine Störung der Regeneration der Photorezeptorzellen. Mittlerweile

sind über 20 verschiedene Gene auf unterschiedlichen Chromosomen kartiert worden, die für

die Retinitis pigmentosa verantwortlich sein können (Dryja et al., 1995). Auf die Pathogenese

der Retinitis pigmentosa im Rahmen des Senior-Løken Syndroms wurde nicht eingegangen.

Es fällt jedoch auf, daß sowohl bei der NPH als auch bei der RP die Basalmembran am

Krankheitsgeschehen mitbeteiligt ist.

1.7. Diagnostik und Differentialdiagnose

Die Diagnose eines Senior-Løken Syndroms wird gestellt, wenn bei den betroffenen

Individuen sowohl eine Augensymptomatik im Sinne einer Retinitis pigmentosa oder einer

Leber’schen Amaurosis congenita (LAC) vorliegt als auch die Klinik einer familiären

juvenilen Nephronophthise mit Polyurie, Polydipsie, Salzverlust und Wachstumsretardierung

wiederzufinden ist. Eine wichtige Rolle in der Stellung der Diagnose spielt auch das

Manifestationsalter. Dabei muß man beachten, daß das Auftreten der Augensymptomatik den

Einleitung 17

renalen Zeichen vorausgeht. Weiterhin sollte aus den Stammbaumdaten der betroffenen

Familie hervorgehen, daß es sich um einen autosomal-rezessiven Vererbungsmodus handelt.

Ein wichtiges diagnostisches Hilfsmittel für die tapetoretinale Degeneration ist das

Elektroretinogramm (ERG). Die typischen Veränderungen im ERG sind eine verzögerte

Antwort auf Lichtblitze sowie eine verminderte Amplitude. Im Falle des Senior-Løken

Syndroms findet man bei den erkrankten Kindern ein abnormes Stäbchen-

Elektroretinogramm, oft auch wenn noch keine klinischen Zeichen wie eine

Gesichtsfeldeinschränkung oder ein Visusverlust bemerkbar sind (Fillastre et al., 1976).

Weiterhin sind typische ophthalmoskopische Befunde wie eine Hyperpigmentierung des

Augenfundus, eine Ausdünnung der retinalen Gefäße und ein Abblassen der Papille

diagnostisch wegweisend.

Bei der familiären juvenilen Nephronophthise betrachtet man die laborchemischen Parameter.

Oft sind ein Anämie, eine Azotämie, eine Hypokaliämie und eine metabolische Azidose zu

finden. Der Morgenurin zeigt charakteristischerweise ein zu niedriges spezifisches Gewicht.

Eine Proteinurie ist selten und wenn vom tubulären Typ (Gieselson et al., 1970) und eine

Hämaturie oder Leukozyturie sind nicht vorhanden. Die sonographische Untersuchung zeigt

eine vermehrte Echogenität der Nieren mit einer Aufhebung der Rinden-Mark-Grenze. Die

kortiko-medullären Zysten sind jedoch erst im Spätstadium nachweisbar.

Das wichtigste diagnostische Hilfsmittel ist die Nierenbiopsie. Sie zeigt eine diffus

sklerosierende tubulo-interstitielle Nephropathie mit medullären Zysten in Abwesenheit einer

interstitiellen Entzündungsreaktion. Die Nierenbiopsie gehört jedoch zu den invasiven

Verfahren und wird unter anderem auch wegen der fehlenden therapeutischen Konsequenz

selten durchgeführt. Wenn sie ein positives Ergebnis bei einem erkrankten Kind einer Familie

ergab, wird bei den anderen Kindern dieser Familie keine Nierenbiopsie mehr durchgeführt.

Eine weitere nicht-invasive Diagnosemöglichkeit, die bei der NPH Anwendung findet, ist der

molekulargenetische Nachweis einer homozygoten Deletion oder von Punktmutationen im

NPHP1-Gen. Dieser Befund ist beweisend für eine Nephronophthise vom Typ 1. Da man

jedoch für das Senior-Løken Syndrom noch keine genetische Lokalisation gefunden hat und

gleichzeitig der NPHP1-Locus für SLS ausgeschlossen wurde (Antignac et al., 1993), kann

Einleitung 18

man auf diese Diagnosemöglichkeit nicht zurückgreifen. Eine Ausnahme stellt der Befund

einer Spätform des SLS dar, die in NPHP1 Mutationen aufweisen (Caridi et al., 1998).

Differentialdiagnostisch für das Senior-Løken Syndrom kommen folgende Nieren- und

Augenerkrankungen in Betracht. Die Tabelle 2 stellt diese Erkrankungen sowie ihre

unterschiedlichen klinischen Zeichen zusammen.

Erkrankung differentialdiagnostische Klinik

polyzystische Nephropathien

(autosomal-rezessiv oder –dominant)

- Vergrößerung der Nieren

- rezidivierende Harnwegsinfektionen

- Hämaturie

chronische Pyelonephritis - Parenchymnarben

- positive Infektionsanamnese

Oligomeganephronie - Verkleinerung der Nieren

- andere Histologie

Markschwammniere - Nachweis einer Nephrokalzinose

- selten Niereninsuffizienz.

idiopathische Nachtblindheit - keine Gesichtsfeldeinschränkung

- normaler Augenhintergrund

- kein progredienter Verlauf Tabelle 2: Die wichtigsten Differentialdiagnosen des SLS. Die linke Spalte stellt die Erkrankung vor, die rechte Spalte beschreibt die typische Klinik dieser Erkrankungen, welche sie von SLS unterscheiden.

1.8. Therapie des Senior-Løken Syndroms

Für die hereditären Erkrankungen des Nephronophthise-Komplexes ist bisher keine Therapie

bekannt, die die Gesichtsfeldeinschränkung und Visusverschlechterung oder das terminale

Nierenversagen aufhalten können. Die Therapie ist folglich rein symptomatisch. Zunächst

sollte durch eine NaCl-, Kalium und Bikarbonatsubstitution der Salzverlust, die Azidose und

die Dehydratation ausgeglichen werden. Die Kaliumsubstitution führt auch zu einer

Verminderung der Polyurie. Im späteren Fortschreiten der Niereninsuffizienz wird eine

Nierenersatztherapie mit Hämodialyse oder Peritonealdialyse angestrebt. Außerdem müssen

die sekundären Folgen der chronischen Niereninsuffizienz behandelt werden. Eine supportive

Therapie der Anämie wird durch die Gabe von Erythropoetin und durch eine Eisensubstitu-

tion erreicht. Weiterhin werden die arterielle Hypertonie mit Antihypertensiva, die renale

Einleitung 19

Osteopathie mit Vitamin D und Phosphatbindner sowie die Wachstumsretardierung mit

Wachstumshormone behandelt.

Die Nierentransplantation wird bei den Erkrankungen des Nephronophthise-Komplexes

immer angestrebt, denn sie ist sehr erfolgsversprechend. Bislang wurden keine Rezidive einer

Nephronophthise oder eines Senior-Løken Syndroms bei einem erfolgreich nierentransplan-

tierten Patienten beschrieben (Steele et al., 1980).

1.9. Molekulargenetische Forschungsergebnisse

Zwischen Genen und klinischen Syndromen gibt es leider keine Eins-zu-Eins-Beziehung.

Manchmal führen verschiedene Mutationen in demselben Gen zu verschiedenen Phänotypen,

häufig ist jedoch, daß derselbe krankheitsbedingte Phänotyp eine Folge von Mutationen in

verschiedenen Genen sein kann.

1.9.1. Strategien der Identifizierung von Krankheitsgenen

Eine mögliche Vorgehensweise zur Identifizierung eines Krankheitsgens beginnt damit,

mehrere Kandidatengene zu identifizieren und diese anschließend zu prüfen, ob sie für die

Krankheit in Frage kommen. Zur Ermittlung von Kandidatengenen kann man verschiedene

Verfahren anwenden. Der sinnvollste erste Schritt ist die spezifische Zuordnung eines

Krankheitsgens zu einem bestimmten chromosomalen Abschnitt, sozusagen eine

chromosomale Kartierung. Die Methoden, die man dabei anwenden kann, sind davon

abhängig, ob das pathogenetische Prinzip dieser Krankheit bereits bekannt ist oder nicht. Ist

ein defektes Genprodukt bekannt, so ist es möglich einen Genort für die Erkrankung mit Hilfe

der sogenannten Funktionsklonierung zu kartieren. Dabei wird die Aminosäurensequenz des

defekten Proteins untersucht, und anhand der daraus abgeleiteten Basensequenz das

verantwortliche Gen identifiziert.

Ist aber die Pathogenese und somit auch das verantwortliche defekte Protein unbekannt, kann

man das Verfahren der Positionsklonierung benutzen (Collins et al., 1995). Hierfür muß

zuvor eine grobe Zuordnung des krankheitsverursachenden Gens zu einer bestimmten

chromosomalen Teilregion erfolgen, durch die sogenannte Kopplungsanalyse.

Einleitung 20

Das Prinzip der Kopplungsanalyse beruht auf die Rekombination von Genen oder anderen

DNA-Sequenzen. Liegen zwei Gene auf dem gleichen Chromosom, werden sie häufig

gemeinsam vererbt, im Gegensatz zu welchen die auf unterschiedlichen Chromosomen liegen.

Man spricht dann von Genkopplung. Je weiter jedoch zwei Gene auf einem Chromosom

voneinander entfernt liegen, desto unabhängiger werden sie vererbt, weil mit der Entfernung

die Wahrscheinlichkeit von Crossing-over Prozessen zunimmt. Das heißt, je enger zwei Gene

auf einem Chromosom nebeneinander liegen, desto häufiger werden sie gekoppelt vererbt.

Dieses Prinzip kann man auch für Mikrosatellitenmarker (MS-Marker; s. Kap. 3.1.2.)

anwenden. Hierbei wird die Rekombination zwischen einer durch einen MS-Marker

definierten Lokalisation im Genom und dem Krankheitslocus beurteilt. Die

Rekombinationsfraktion θ errechnet man aus der Anzahl der Rekombinationen zwischen zwei

Genloci, geteilt durch die Anzahl der betrachteten Meiosen. Wenn zwei Gene unabhängig von

einander vererbt werden, beträgt θ = 0,5; wenn diese jedoch direkt benachbart sind, ist θ~0,0.

Mit Hilfe der Rekombinationsfraktion wird auch die genetische Distanz zwischen Genen

bestimmt, wobei θ = 0,01 einem Centimorgan (cM) entspricht.

Die Bewertung von Kopplungsanalysen erfolgt statistisch, mit Hilfe von sog. LOD-Score

(logarithmus of the odds ratio). Der LOD-Score ist der dekadische Logarithmus der “odds

ratio”, welche durch die untere Formel ausgerechnet wird:

Wahrscheinlichkeit, daß zwei Loci bei einer Rekombinationsfraktion θ

“odds ratio” = miteinander gekoppelt sind

Wahrscheinlichkeit, daß zwei Loci nicht miteinander gekoppelt sind

Eine Kopplung wird als signifikant betrachtet, wenn der LOD-Wert über 3,0 liegt. Ein LOD-

Wert von –2,0 oder weniger spricht dafür, daß keine Kopplung vorliegt.

Für eine erste Kopplungsanalyse des gesamten Genoms verwendet man im allgemeinen

Mikrosatellitenmarker (MS-Marker), die durch verhältnismäßig große Abstände von ca.

10 cM voneinander getrennt sind. Auf diese Weise läßt sich nur eine relativ große

Kandidatenregion definieren. Hat man einen solchen Bereich einmal bestimmt, so muß man

ihn mit polymorphen Marker absättigen. Diese MS-Marker werden in einem Abstand von 1

bis 2 cM aus der Généthon-Karte des CEPH-Instituts ausgewählt. Mit diesen Markern wird

dann eine sogenannte Haplotypenanalyse zur weiteren Eingrenzung der Kandidatenregion

Einleitung 21

durchgeführt werden. Bei der Haplotypenanalyse der betroffenen Familien kann durch den

Nachweis von Crossing-over die Kandidatenregion zwischen zwei Mikrosatellitenmarker

eingegrenzt werden, die man dann als flankierende Marker bezeichnet.

Schließlich wird eine physikalische Kartierung der Kandidatenregion durchgeführt. Das

Endziel dieser Vorgehensweise ist die Erstellung einer endgültigen physikalischen Karte, also

der Beschreibung der vollständigen Nukleotidsequenz dieser Region. Zu diesem Zweck wird

ein sogenanntes Klon-Contig hergestellt, welches aus sich überlappenden DNA-

Sequenzstücken besteht. Die humanen DNA-Sequenzen sind in Vektoren eingebracht, wie

z.B. YACs, PACs, Plasmide, Bakteriophagen und Cosmide. Zunächst wird ein YAC-Contig

der Kandidatenregion angestrebt, da YACs bis zu 2000 kb große humane DNA-Fragmente

aufnehmen können (s. Kap. 2.3.). Danach erstellt man ein vollständiges PAC-Contig, das

letztendlich die Sequenzierung der Kandidatenregion ermöglicht (s. Kap. 2.4.). Neuerdings

(nach Abschluß der Arbeit) hat sich die Erstellung einer physikalischen Karte in den meisten

chromosomalen Regionen durch den Fortschritt im humanen Genomprojekt erübrigt.

Sobald in der Kandidatenregion ein vollständiges Contig zur Verfügung steht, werden

exprimierte Sequenzen in den genomischen DNA-Klonen gesucht. Dazu stehen mehrere

Methoden zur Verfügung:

• Durchsuchen von cDNA-Banken: Klone mit genomischer DNA aus der

Kandidatenregion dienen dabei als Sonden.

• cDNA-Selektion: Hybridisierung einer klonierten DNA-Sequenz (z.B. das

Insertionsfragment eines YACs) mit einem Gemisch aus zahlreichen cDNAs (Lovett,

1994).

• Zoo-Blots: ein DNA-Klon wird mit einem Southern-Blot von DNA-Proben aus mehreren

verschiedenen Tierarten hybridisiert. Diese Methode beruht auf die stärkere

Konservierung von kodierenden DNA-Sequenzen in der Evolution.

• Identifizierung von CpG-Inseln: CpG-Inseln (untermethylierte GC-reiche DNA-

Bereiche) sind oft mit Gene gekoppelt. Zur Identifizierung dieser Sequenzen kann man

eine Restriktionkartierung mit selten schneidenden Restriktionsenzymen oder eine CpG-

Insel-spezifische PCR durchführen (Cross und Bird, 1995).

Einleitung 22

• Gezielte Identifizierung von Exons: nach dem Prinzip des künstlichen Spleißsystems.

Hierbei werden genomische Sequenzen aufgesucht, die von funktionsfähigen

Spleißsignalsequenzen flankiert sind (Church et al., 1994).

• Sequenzanalyse: Computeranalyse der DNA-Sequenzen, wobei homologe Sequenzen in

allen genomischen Datenbanken gesucht werden, oder mögliche Exons identifiziert

werden können.

• Hybridisierung mit mRNA/cDNA: ein genomischer DNA-Klon wird mit einem

Northern-Blot von mRNA, welche in verschiedenen Zelllinien exprimiert wurde,

hybridisiert.

Für jedes der in der Kandidatenregion identifizierten Gene muß im einzelnen überprüft

werden, ob sie bei den betroffenen Patienten einen Defekt aufweisen und zusätzlich eine

entscheidende Rolle in der Pathogenese dieser Erkrankung spielen könnten. Die

Mutationsdetektion durch das Verfahren der SSCP (single strand conformation

polymorphism) ist eine Möglichkeit für die Untersuchung von Patienten-DNA auf Mutationen

in bestimmten Kandidatengenen (Orita et al., 1989). Anschließend muß das PCR-Produkt

sequenziert und die Sequenzen eines gesunden und eines kranken Individuums miteinander

verglichen werden. Weiterhin wird untersucht, ob die gefundene Punktmutation eine

entscheidende Strukturveränderung des Proteins verursacht, welche zu einem

Funktionsverlust führt und somit eine pathogenetische Rolle für die Erkrankung spielen

könnte. Cytogenetische Anomalien in der Kandidatenregion, wie Deletionen, Translokationen

oder Inversionen, können die Suche eines geeigneten Kandidatengens wesentlich erleichtern.

Weiterhin sollten Kandidatengene ein Expressionsmuster zeigen, das zu dem Phänotyp der

Krankheit paßt.

Die Positionsklonierung ist eine recht arbeitsaufwändige Vorgehensweise, um

Krankheitsgene zu identifizieren. Bei einer selten auftretenden Krankheit kann es auf Grund

der geringen Probenzahl schwierig sein, Crossing-over zu finden, die das zugehörige Gen in

einem relativ kleinen Bereich von 1 bis 2 Mb lokalisieren. Die Wahrscheinlichkeit, einen

Patienten mit einer zytogenetischen Anomalie zu finden, die mit der untersuchten Krankheit

gekoppelt ist, um so die Position des Krankheitslokus bestimmen zu können, ist sehr gering.

In solchen Fällen kann nur die Suche nach Kandidatengenen mit Hilfe des positionellen

Kandidatengenverfahrens weiterhelfen.

Einleitung 23

Gene, die in derselben chromosomalen Region lokalisiert sind wie das Krankheitsgen, sind

die stärksten Kandidaten. Das positionelle Kandidatengenverfahren beruht auf der Suche von

Genen, die in Datenbanken auf sogenannte Transkriptionskarten gespeichert wurden. Neben

der Funktions- und Positionsklonierung ist die direkte Untersuchung von Kandidatengenen

mittels Mutationsanalyse eine weitere Möglichkeit der Identifikation von Krankheitsgenen.

Das “Human Genome Project” ist ein internationales Vorhaben, dessen Ziel die vollständige

Beschreibung des menschlichen Genoms mit Hilfe der DNA-Sequenzierung ist. Mehrere

unterschiedliche Konsortien arbeiten an Transkriptionskarten des menschlichen Genoms

sowie verschiedener anderen Genome wie z.B. von Bakterien, Hefen etc. Hierbei wurden mit

Hilfe von genomischen cDNAs sogenannte expressed sequence tags (ESTs; s. Kap.3.1.3.)

hergestellt und auf somatische Zellhybride oder Bestrahlungshybride (RH) zurückkartiert

(Boguski und Schuler, 1995). Die Ergebnisse dieser Kartierungen wurden in GenBank

database der Öffentlichkeit zur Verfügung gestellt (Schuler et al., 1996). Immer mehr ESTs

werden vom “Human Genome Project” generiert, was zu einer Vervollständigung der

Transkriptionskarten führt. Allerdings lassen sich nicht alle Gene durch EST-Sequenzen

identifizieren, da manche Gene starke gewebe- oder zellenspezifische Expressionsmuster

zeigen oder nur während ganz bestimmten Entwicklungsstadien exprimiert werden.

defektes Genprodukt

bekannt nicht bekannt

Funktionsklonierung Positionsklonierung

AS-Sequenz des defekten Proteins Kopplungsanalyse → LOD-Score > 3 +

Haplotypenanalyse der Familien

Identifizierung des Gens ═ Kandidatenregion

Positionelles Kandidatengenverfahren Physikalische Karte der Kandidatenregion

Aufsuchen bekannter exprimierter Untersuchung der DNA-Klone

Gene → Kandidatengene auf exprimierte Sequenzen

Mutationsanalyse mit SSCP der gefundenen Gene + Sequenzierung

Identifizierung des Gens

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Vorgehensweise zur Identifizierung von Krankheitsgenen

Einleitung 24

1.9.2. Molekulargenetik der familiären juvenilen Nephronophthise

1993 wurde zunächst von der Forschungsgruppe von Corinne Antignac am Hôpital Necker

Enfants Malades in Paris eine Kopplungsanalyse mit 18 Familien durchgeführt, die zwei oder

mehr Betroffene vorwiesen (sog. Multiplexfamilien). Dabei wurde eine Kandidatenregion für

das Nephronophthisegen zwischen den flankierenden MS-Markern D2S48 und D2S51 auf

dem Chromosom 2p23-cen festgelegt. Der Marker D2S160 zeigte einen signifikanten LOD-

Score von 4,78 (bei theta = 0.05). Ein Lokus für SLS wurde hier jedoch ausgeschlossen

(Antignac et al., 1993).

Die Forschungsgruppe von Friedhelm Hildebrandt an der Universitätskinderklinik in

Freiburg, in der auch diese Arbeit entstanden ist, führte eine Haplotypenanalyse mit weiteren

an NPH erkrankten Familien durch, und engte die Kandidatenregion immer mehr ein. Hierbei

wurde die kritische Region von den Marker D2S293 und D2S363 flankiert und auf 6,9 cM auf

dem langen Arm von Cromosom 2 (2q12-2q13) kartiert. Außerdem wiesen vier Familien, die

an Nephronophthise erkrankt waren, keine Kopplung mit der Region auf Chromosom 2. Das

ist beweisend dafür, daß für die familiäre juvenile Nephronophthise mindestens ein weiterer

Genort existiert und somit Genlocus-Heterogenie vorliegt. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde

der Begriff “Nephronophthise Typ 1” (NPH1) eingeführt (Hildebrandt et al., 1993;

Medhioub et al., 1994; Hildebrandt et al., 1995).

Eine physikalische Karte der NPH1-Region wurde anschließend erstellt (Hildebrandt et al.,

1995). Hierfür wurden 8 YAC-Klone aus der CEPH YAC-Bibliothek verwendet, die aus der

Region 2q13 abstammten. Außerdem erfolgte ein “STS content mapping” mit 39 STS-

Marker. Das Contig umfaßte eine genetische Distanz von 5 bis 7 cM. Mit Hilfe des

kompletten YAC-Contigs konnte eine maximale physikalische Distanz von 6,41 Mb

berechnet werden. In der von den Marker D2S340 und D2S121 flankierten Region (Medhioub

et al., 1994) wurden insgesamt 32 STS-Marker, wovon 14 Mikrosatellitenmarker, 10

nichtpolymorphe STS und 8 ESTs kartiert (Hildebrandt et al., 1996).

1996 fand die Forschungsgruppe aus Paris eine 250 kb große homozygote Deletion, welche

bei 80 % der untersuchten NPH1-Familien (Multiplex- oder konsanguine Familien) und bei

65 % der sporadischen Fälle, das Krankheitsbild der Nephronophthise auslöste (Konrad et al.,

Einleitung 25

1996). Die Kandidatenregion wurde somit weiter eingegrenzt, wobei die Marker D2S1890

und D2S1888 diese flankierten. Diese Deletion weist eine 100 kb große umgekehrte

Duplikation (inverted duplication) auf.

Weiterhin wurde eine bessere Auflösung der Kandidatenregion durch die Herstellung eines

integrierten YAC/PAC-Contigs und einer partiellen Transkriptionskarte der Region 2q13

erreicht. Insgesamt wurden 18 neue ESTs durch Ansequenzieren der Enden bestimmter PAC-

Klone generiert, wovon 7 innerhalb der flankierenden Marker und 2 in der Deletionsregion im

Contig zurückkartiert werden konnten (Nothwang et al., 1998). Diese zwei ESTs verhalfen

zur Identifizierung der Gene NPHP1 und MALL (T-lymphocyte maturation-associated

protein-like) (Hildebrandt et al., 1997). Außerdem konnte festgestellt werden, daß bei

heterozygot deletierten Patienten zusätzlich eine Punktmutation im NPHP1-Gen aber nicht im

MALL-Gen wiederzufinden war. Es ist davon auszugehen, daß es sich bei NPHP1 um das für

Nephronophthise-Typ1 verantwortliche Gen handelt.

Das NPHP1-Gen hat ein 4,5 kb langes Transkript und kodiert für ein Protein, dessen SH3-

Domäne in der Evolution hochkonserviert wurde. Durch Sequenzieren auf PAC-Klonen

konnte die Exon/Intron-Struktur des NPHP1-Gens gezeigt werden, welches 20 Exone besitzt.

Außerdem zeigt das NPHP1-Gen keine Ähnlichkeit mit bekannten Genfamilien, was den

aufwändigen Weg der Positionsklonierung rechtfertigt (Hildebrandt et al., 1997; Saunier et

al., 1997).

Das Genprodukt des NPHP1-Gens wurde als Nephrocystin bezeichnet. Dieses Protein besitzt

eine SH3-Domäne sowie eine Leucin-reiche Sequenz, welche eine Rolle in der Protein-

Protein-Interaktion haben könnte. Außerdem könnte Nephrocystin wegen der

Sequenzverwandtschaft zur SH3-Domäne des Protoonkogens c-crk ebenfalls eine Rolle bei

der Signaltransduktion fokaler Adhäsionen zukommen (Otto et al., 2000).

Mitterweile sind zwei weitere für die NPH verantwortliche Genloci bekannt. Die

Arbeitsgruppe von Haider lokalisierte das Gen für die infantile Nephronophthise NPH2 auf

dem Chromosom 9q22-q31 (Haider et al., 1998). Ein dritter Genlocus für die adoleszente

Nephronophthise NPH3 wurde anhand einer venezuelanischen Familie von der Freiburger

Forschungsgruppe auf Chromosom 3q21-q22 lokalisiert (Omran et al., 2000).

Einleitung 26

1.9.3. Molekulargenetik des Senior-Løken Syndroms

Zunächst wurde ein Genlocus für das Senior-Løken Syndrom am NPH1-Locus

ausgeschlossen (Medhioub et al., 1994). Dies ist ein weiteres Argument für das Vorliegen

einer Genlocus-Heterogenie bei den Erkrankungen des Nephronophthise-Komplexes. Um

eine chromosomale Kartierung eines SLS-Gens zu erreichen, wurde zunächst eine

Kopplungsanalyse, später dann eine Haplotypenanalyse mit 10 Multiplex- und 6 einfach

betroffene konsanguine Familien durchgeführt. Hierbei wurden ca. 257 Mikrosatellitenmarker

mit einem Heterozygotieindex von über 0,7 aus der Généthon-Karte herangezogen, wobei

kein signifikanter LOD-Score von > 3,0 erreicht werden konnte. Aufgrund dieser Ergebnisse

wird auch beim SLS eine Genlocus-Heterogenie angenommen, welche die Suche nach einem

verursachenden Krankheitsgen erschwert (Wiedensohler 1998; Haller 1998).

Die interessanteste Region anhand der Haplotypenanalyse ist auf Chromosom 15q lokalisiert.

Hier sind die Haplotypen von 5 SLS-Early Familien mit Kopplung vereinbar. Diese Region

von 3,3 cM wird von den MS-Marker D15S1030 und D15S1045 flankiert. Den höchsten

LOD-Wert ergab der MS-Marker D15S1046 bei theta 0,06. Dieser LOD-Score beträgt 2,55

und ist ein starker Hinweis auf Kopplung. Deswegen wurde diese Region näher in Betracht

gezogen und mit Mikrosatellitenmarker im Abstand von 1-2 cM abgesättigt, um enge

Bereiche von Kopplung nicht zu übersehen (Besenthal 1999).

In dem kritischen Intervall auf Chromosom 15q kartiert das Kandidatengen CRALBP (cellular

retinaldehyde binding protein), welches bei der autosomal-rezessiven Retinitis pigmentosa

Mutationen vorweist. CRALBP konnte somit auch für das Senior-Løken Syndrom

verursachend sein. Durch SSCP und direkte Sequenzierung aller 8 Exone von CRALBP

konnten jedoch keine spezifischen Mutationen in diesem Gen bei den 5 SLS-Early Patienten

nachgewiesen werden (Haffner 1998).

Einleitung 27

1.10. Ziele dieser Arbeit

Die vorher durchgeführten Haplotypenanalysen wiesen auf die Region auf Chromosom 15q

als interessanteste Region hin, da hier 5 SLS-Early Familien gekoppelt waren. Diese 3,3 cM

große Region wird von den Mikrosatellitenmarkern D15S1030 und D15S1045 eingegrenzt.

Zur besseren Untersuchung dieser Region sollte ein physikalische Karte hergestellt werden.

Daraus ergaben sich folgende Ziele:

1. Herstellung eines vollständigen YAC-Contigs der kritischen Region.

2. Kartierung weiterer STS-Marker und vor allem ESTs auf dem Contig.

3. Kartierung sowohl der 3’- als auch der 5’-EST-Sequenzen zur Orientierung auf dem

Chromosom.

4. Herstellung eines PAC-Contigs in der interessanten Region.

5. Ein weiteres Ziel war die Suche nach weiteren SLS-Familien, sowie deren Einbeziehung

in die Haplotypenanalyse zur Generierung neuer Kandidatenregionen.

Patienten, Material und Methoden 28

2. Patienten, Material und Methoden

2.1. Familien mit Senior-Løken Syndrom

Die Familien, die in dieser Arbeit auf das Senior-Løken Syndrom untersucht wurden, wurden

über das Forschungsziel aufgeklärt und gaben ihr Einverständnis zur Blutabnahme und zur

Erhebung ihrer Stammbaumdaten.

Die Diagnose von Senior-Løken Syndrom wurde anhand von folgenden Kriterien erhoben:

Kriterien für die Nierenbeteiligung:

• NPH typische Anamnese mit Polyurie, Polydipsie, Anämie und Wachstumsretardierung

• Entwicklung einer chronischen Niereninsuffizienz vor dem 14. Lebensjahr (SLS-E) oder

erst in der zweiten Lebensdekade (SLS-L)

• NPH-typische Nierenbiopsie: chronisch sklerosierende, tubulo-interstitielle Nephropathie

und multiple Zysten an der Rinden-Markgrenze

Kriterien für die Augenbeteiligung:

• Nachtblindheit, pathologischem oder erloschenem ERG und typische

Fundusveränderungen der tapetoretinale Degeneration (blasse Papille, diffuse

Pigmentierung der Netzhaut)

• Erblindung seit der Geburt bzw. bis zum vollendeten zweiten Lebensjahr für SLS-Early

Patienten oder erst zu einem späteren Zeitpunkt für SLS-Late Patienten

Zur Sicherung der Diagnose erlitt nur das älteste erkrankte Kind der Familie eine

Nierenbiopsie. Auf eine Biopsie der jüngeren Geschwister wurde in allen Fällen verzichtet.

Außerdem wurden zunächst nur Familien mit mindestens zwei erkrankten Kindern in

Betracht gezogen. Wichtig war zusätzlich der autosomal-rezessive Vererbungsmodus

innerhalb der untersuchten Familien.

Die DNA der meisten Familien wurde bereits in früheren Dissertationen untersucht. Die

Arbeitsgruppe der Frau Dr. Antignac (Frankreich) stellte uns die DNA der Familien SLS-14,

SLS-15, SLS-16, SLS-18, SLS-59 sowie weiterer Familien wie SLS-319, SLS-335 und SLS-

353 zur Verfügung. Die DNA-Proben der Familien SLS-3, SLS-4 und SLS-64 wurden uns


von der Arbeitsgruppe der Frau Dr. Polak (Niederlande) überlassen. Dr. Guay-Woodford

(USA) stellte die Familie SLS-159 zur Verfügung.

Die untersuchten Familien sind entweder sog. Multiplexfamilien mit zwei oder mehreren

betroffenen Kinder oder konsanguine Familien, welche bei rezessiv vererbten Erkrankungen

eine besondere Rolle spielen. Die folgenden Stammbaumdarstellungen in Abbildung 2 zeigen

zwei Generationen dieser Familien. Konsanguinität wird durch einen Doppelstrich zwischen

den Eltern dargestellt. Die erkrankten Individuen sind schwarz hervorgehoben. Personen, die

nicht untersucht werden konnten, sind durch einen Strich durch das Symbol gekennzeichnet,

der normalerweise bedeutet, daß diese Personen verstorben sind. Das Geburtsjahr der

Individuen ist soweit bekannt angegeben. Außerdem werden klinische Besonderheiten der

betroffenen Individuen erörtert.

’36

SLS-3’36 ’31

’51 ’53 ’55 ’56 ’57 ’61 ’66 ’67

I

II

Besonderheiten der Familie: türkische Familie, fragliche Konsanguinität (Polak et al., 1983) alle Familienmitglieder haben ein pathologisches ERG Individuum II 1 : Niere: Transplantation vor dem 32. Lebensjahr Augen: Leber’sche congenitale Amaurose (LAC) Individuum II 3: Niere: Transplantation vor dem 28. Lebensjahr Augen: LAC

Besonderheiten der Familie: Familie aus Portugal Individuum II 2: Nieren: Transplantation mit 11 Jahren Augen: LAC; kongenitaler Nystagmus Individuum II 3: Nieren: Transplantation mit 14 Jahren

Augen: LAC

SLS-14’51 ’52

’74 ’71 ’76

I

II

SLS-Early Familien


’63’72 ’69 ’64

SLS-15I

II

Besonderheiten der Familie: aus Frankreich Individuum II 1: Nieren: Transplantation mit 11 Jahren Augen: LAC; kongenitaler Nystagmus Individuum II 4: Nieren: Dialysebeginn mit 15 Jahren Augen: LAC

’59 ’56 ’53

SLS-16I

II

’30

Besonderheiten der Familie: aufgrund der Augensymptomatik keine Einteilung in SLS-E oder SLS-L möglich (Fillastre et al., 1976) Individuum II 1: Nieren: Kreatinin von 1,6 mg % mit 20 J. Biopsie typisch für NPH

Augen: Visus mit 20 J: 0,2 re; 0,1 li; kongenitaler Nystagmus

Individuum II 3: Nieren: Transplantation mit 11 Jahren Augen: LAC, Nystagmus

’62

SLS-59I

II

’64 ’67

Besonderheiten der Familie: intrafamiliäre Dissoziation (Fillastre et al., 1976) des Individuums II 3, wurde von Amster 1986, nicht bestätigt. Individuum II 1: Nieren: Transplantation mit 9 Jahren Augen: mit 6 Jahren Retinitis pigmentosa (Fundus) (Visus: 0,5 re; 0,4 li) Individuum II 2: Nieren: Transplantation mit 8 Jahren Augen: LAC; kongenitaler Nystagmus Individuum II 3: Nieren: mit 11 Jahren normale Funktion

Augen: mit 2 Jahren RP zusätzlich : mentale Retardierung


SLS-64I

II

’39 ’42

’73 ’77 ’82

Besonderheiten der Familie: keine genauen klinischen Daten, mündlich von dem behandelnden niederländischen Pädiater als SLS-Early Familie eingestuft.

SLS-335 I

II

Besonderheiten der Familie: aus Saudi-Arabien Individuum II 2: Nieren: Transplantation mit 13 Jahren Augen: LAC Individuum II 5: Nieren: bei der letzten Untersuchung

(1997) keine Nephronophthise Augen: LAC

Besonderheiten der Familie: Individuum II 3: Niere: chronisch Niereninsuffizient mit 6 LJ

Augen: LAC seit Geburt.

’80 ’83 ’88 ’90 ’94

’91

SLS-353 I

II


SLS-Late Familien

’65

SLS-4 I

II

’66 ’69 ’71

’37 ’46

SLS-18I

II

’64 ’74

SLS-159I

II

Besonderheiten der Familie: Individuum II 1: Niere: Nierentransplantation mit 10 Jahren Augen: path. ERG/ EOG im Alter von 3 Jahren Individuum II 2: Niere: Nierentransplantation mit 12 Jahren Augen: path. ERG/ EOG im Alter von 2 Jahren

Besonderheiten der Familie: Individuum II 1: Nieren: NPH Augen: path. ERG, Visus stark herabgesetzt Individuum II 2: Nieren: NPH Augen: Blind im Alter von ?

Besonderheiten der Familie: Individuum II 1: Nieren: NPH, Transplantation mit 11 Jahren Augen: RP-Diagnose mit 7 Jahren Individuum II 2: Nieren: NPH Augen: mit 6 Jahren normal


Abbildung 2: Stammbäume der untersuchten SLS-Familien. Die Stammbäume zeigen zwei Generationen der betroffenen Familien. Die bekannten Geburtsdaten sind neben oder unter den Individuen angegeben. Konsanguinität wird durch einen Doppelstrich, nicht untersuchte Individuen durch einen Strich durch das Symbol gekennzeichnet. Unterhalb der Stammbäume werden klinische Besonderheiten der betroffenen Individuen hervorgehoben.

2.2. Yeast Artificial Chromosomes (YACs)

YACs, auch künstliche Hefechromosome genannt, sind Vektoren, in die ein 200 bis 2000 kb

langes Stück eines menschlichen Chromosoms einkloniert wurde. Sie haben den

entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Vektoren, wie Plasmide, Bakteriophagen λ,

Cosmide, PACs und BACs, daß sie sehr große DNA-Fragmente einklonieren und

eukaryotische Sequenzen mit repetitiven Elementen problemlos vermehren können. YACs

haben sich zu einem unerläßlichen Hilfsmittel für die physikalische Kartierung entwickelt.

Die physikalische Karte eines bestimmten Chromosomenabschnittes beruht nicht auf dem

Nachweis von Rekombinationen (genetische Karte), sondern auf die genaue Angabe von

Distanzen zwischen den STS-Markern in Basenpaaren. Die Erstellung einer physikalischen

Karte mit hoher Auflösung als Vorarbeit für die vollständige Sequenzierung des gesamten

menschlichen Genoms ist die Zielsetzung des Human Genome Projects. Zu diesem Zweck

wurden in einigen wenigen internationalen Kartierungszentren sogenannte YAC-Contigs

hergestellt.

’86

SLS-319I

II

’89 ’93

’63 ’67

Besonderheiten der Familie: Individuum II 1: Nieren: Nierentransplantation mit 9 Jahren Augen: RP-Diagnose


2.2.1 Herkunft der YAC-Klone

An der Herstellung eines YAC-Contigs beteiligten sich mehrere Konsortien, unter anderem

zwei große Forschungszentren wie das Centre d´Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) in

Paris und das Whitehead Institute/ MIT Center for Genome Research (WICGR) in Boston. Im

CEPH wurde aus zehn haploiden Genomäquivalenten eine genomische DNA-Bank

hergestellt. Die genomische DNA wurde mit selten schneidenden Restriktionsendonukleasen

partiell verdaut, und somit nur ein kleiner Teil der potentiellen Schnittstellen gespalten. Auf

diese Weise können eine Reihe von Restriktionsfragmenten entstehen, die, wenn sie von

demselben Locus abstammen, bestimmte DNA-Sequenzen gemeinsam haben und sich somit

überlappen. Diese DNA-Fragmente werden zur Vermehrung ihrer Kopienzahl in Vektoren

eingebaut. Im Falle von YACs ist dieser Vektor die Hefe Saccharomyces cerevisiae.

Die CEPH-Mega-YAC-Genbank enthält 33.000 Klone mit Insertionsfragmenten von 0,9 Mb

im Durchschnitt, und deckt 75% des menschlichen Genoms ab (Chumakov et al., 1995). Die

Überlappung zwischen den einzelnen Fragmenten wurde mit Hilfe der Kartierung von STS-

Marker vom Whitehead-Institut ermittelt. Die CEPH YAC-Bibliothek wurde von insgesamt

10.850 STS-Markern durchsucht, die bereits auf genetischen Karten lokalisiert worden waren.

Diese veröffentlichte physikalische Karte ist nicht vollständig, denn die hergestellten YAC-

Klone überlappen sich nur zum Teil (Hudson et al., 1995).

Um eine zunehmend feinere Auflösung der physikalischen Karte zu erzielen, wurden in dieser

Arbeit weitere STS-Marker, vor allem ESTs, auf den YACs zurückkartiert. Dadurch

verbessert sich die Aussagekraft über die Festlegung der Markerreihenfolge und man erreicht

zunehmend eine Überlappung der Klone. Diesen Vorgang bezeichnet man auch als

“Markerkartierung” oder STS content mapping.

Die von uns bearbeiteten YAC-Klone wurden direkt beim CEPH bestellt. Es handelt sich um

25 Klone aus der Kopplungsregion für das Senior-Løken Syndrom auf dem Chromosom 15.

Informationen über dieses sogenannte Contig WC15.3 sowie Angaben über die

Fragmentlänge, Chimerität und die Lokalisation mit Hilfe von FISH (Fluoreszenz-in-situ-

Hibridisation) auf den Chromosomen findet man unter der Internetadresse:

http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/

http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/


2.2.2. Anzüchten der YAC-Klone

Die YAC-Klone wurden zunächst auf Agar-Platten gezüchtet und aufbewahrt. Die Agar-

Nährböden wurden folgendermaßen hergestellt: in 1 l Aqua dest. löst man unter sterilen

Bedingungen 43,7 g DOBA (1,7 g Yeast Nitrogen Base, 20 g Dextrose, 5 g Ammonium

Sulfat, 17 g Agar; Fa. BIO 101,Vista CA) und 0,72 g CSM-TRP-URA (“complete supplement

mixture minus TRP and URA”; Fa. BIO 101, Vista CA). Das Gemisch wird anschließend bei

120°C eine halbe Stunde lang autoklaviert. In flüssigem Zustand wird das Agar-Medium auf

einer sterilen Werkbank in die dafür bestimmten Petrischalen 5-7 mm hoch gegossen. Nach

dem Erkalten werden die YAC-Klone unter sterilen Bedingungen mit einer ausgeglühten Öse

auf den Agar-Platten ausgestrichen und im Brutschrank bei 30°C 3 bis 6 Tage lang inkubiert.

Die herangewachsenen YAC-Kulturen kann man auf den Agar-Platten in einem Kühlschrank

bei 6°C ein paar Wochen lang aufbewahren, dies ist jedoch wegen der großen

Kontaminationsgefahr der Kolonien nicht zu empfehlen.

2.2.3. Herstellung von Flüssigkulturen und Glycerin-Stocks

Für eine längerfristige Lagerung der YACs sollten Glycerin-Stocks angelegt werden. Hierfür

wurde jeweils eine Kolonie von jedem YAC-Klon in 10 ml flüssiges Nährmedium (27 g DOB

(1,7 g Yeast Nitrogen Base, 20 g Dextrose, 5 g Ammonium Sulfat; Fa. BIO 101, Vista CA)

und 0,72 g CSM-TRP-URA (s.o.) in 1 l Aqua dest. gelöst und autoklaviert) gegeben und im

Rüttelgerät bei 30°C 2 bis 3 Tage lang geschüttelt. Von der hochkonzentrierten YAC-

Suspension wurden 1,4 ml genommen und mit 0,6 ml sterilem Glycerin (Fa. Karl-Roth GmbH

+ Co, Karlsruhe) vermischt. Anschließend wurde das Gemisch in flüssigem Stickstoff

gegeben und dadurch “schockgefroren”. Die YAC-Glycerin-Stocks bewahrte man im

Gefrierschrank bei – 80°C auf. Diese konnten jederzeit wieder aufgetaut und auf Agar-Platten

neu ausgestrichen werden.

2.3. Erstellung eines YAC-Contigs

Zur Erstellung eines YAC-Contigs wurden die einzelnen YAC-Klone auf Positivität mit den

entsprechenden Markern getestet. Dazu verwendete man die PCR-Methode (Le Paslier,


persönliche Mitteilung). Ist ein YAC-Klon mit zwei verschiedenen STS-Markern positiv, so

wird die bekannte Länge des YAC-Klons als die maximal mögliche physikalische Distanz

zwischen den zwei Markern angenommen.

2.3.1. Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktion wurde zum ersten Mal 1985 eingeführt (Saiki et al., 1985;

Mullis et al., 1986). Sie dient zur exponentiellen Vervielfältigung von Nukleinsäuren in vitro.

Das Prinzip der PCR beruht auf die Herstellung zweier Oligonukleotidprimer von jeweils 20

Nukleotiden Länge, die komplementär zu den Ziel-DNA-Endfragmenten sind. Diese

sogenannten Amplimere gibt man zu einer denaturierten genomischen DNA, welche die

gesuchte Region einrahmen. Durch die Zugabe einer hitzestabilen DNA-Polymerase sowie

von einem Gemisch von Desoxynucleosidtriphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) kann

die gesuchte Ziel-Sequenz vervielfältigt werden. Die neu synthetisierten DNA-Stränge dienen

in den folgenden Reaktionszyklen immer wieder als Matrize. Somit findet eine exponentielle

Synthese von DNA-Fragmenten statt, die man später, nach einer Agarose-Gelelektrophorese,

als diskrete Bande mit einer bestimmten Größe erkennen kann.

Die PCR-Reaktion läuft in drei Schritten ab:

1. Denaturierung der doppelstängigen template-DNA bei 94°C

2. Renaturierung: Hybridisierung der Primer (“annealing”) bei einer optimalen

“annealing”-Temperatur für die Primerpaare

3. DNA-Synthese: sie erfolgt bei der optimalen Arbeitstemperatur der DNA-

Polymerase, in der Regel bei etwa 70-75°C

Die Annealing-Temperatur ist u.a. von der Länge des Primers und seinem Gehalt an Guanin

und Cytosin abhängig. Für die Bestimmung der optimalen Annealing-Temperatur (Tm) gilt

die Faustregel:

Tm (°C) = 4x(C+G) + 2x(A+T)

Wichtig bei der Gestaltung von Oligonukleotid-Primern ist, daß sowohl der F´- Primer, für

den Hinstrang, als auch der R´- Primer, für den Rückstrang, eine nahezu gleiche Länge sowie

“annealing”-Temperatur (Tm) haben sollten. Außerdem sollte man auch vermeiden , daß die


beiden Basen am aüßersten 3´-Ende der Primer komplementär zueinander sind, sonst können

sie Dimere bilden und die Effizienz der Reaktion vermindern. Die von uns verwendeten

Primer wurden von der Fa. Birsner u. Grob (Denzlingen) wie auch von der Fa. MWG als

Auftragssynthese geliefert.

Für die physikalische Kartierung benutzten wir als Template die YAC-DNA. Von jeder YAC-

Kultur wurden zwei einzelnstehende Kolonien in 200 µl sterilem Wasser suspendiert. Jede

dieser YAC-Lösungen war Bestandteil eines Reaktionsansatzes.

Als Erstes wurde in jede Vertiefung (“well”) der Mikrotiterplatte (96 well, Fa. Techne,

Cambridge) 10 µl der YAC-Suspension vorgelegt. Außerdem wurde zur Kontrolle ein well

mit 10 µl sterilem H2O und ein weiteres mit 10 µl einer 0,1 molaren genomischen DNA-

Lösung eines Kontrollindividuums gefüllt. Weiterhin wurden auch die SLS-Early Familien

F3, F15, F16, F59 und F64 auf Positivität mit den STS-Markern getestet, indem wir 10 µl

einer 5 ng/µl genomischen DNA-Lösung als PCR-Ansatz verwendeten.

Der “Master-Mix”-Ansatz für jedes well wurde wegen der hohen Empfindlichkeit der DNA-

Polymerase (Taq-Polymerase) auf Eis angesetzt, und bestand aus:

• 2 µl 10xPCR Puffer

• 2 µl einer 4 dNTP-Stammlösung (je 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP)

• 2 µl des 0,1 M F´-Primers

• 2 µl des 0,1 M R´-Primers

• 1,9 µl Aqua bidest.

• 0,1 µl Taq-Polymerase (Thermus aquaticus)

Die Taq-Polymerase wurde als letzte zu dem “Master-Mix”-Ansatz gegeben, anschließend

wurde der Ansatz gemischt und auf Eis in den Mikrotiterwells zu den YAC- bzw. Kontroll-

Proben gegeben. Um ein Verdunsten des Reaktionsgemisches während der PCR-Reaktion zu

vermeiden, wurde jeder Ansatz mit Mineralöl (Fa. Sigma) überschichtet. Die Mikrotiterplatte

wurde dann abgedeckt und in den bereits auf 94°C aufgeheizten Thermal Cycler (Cyclogene

PHC-3, Techne/Genius) gestellt. Diesen Vorgang bezeichnet man als ”hot start”, und dient

zur Vermeidung eine unspezifischen Primerhybridisierung an die DNA-Matrize.


Ein typischer PCR-Reaktionszyklus im Thermal Cycler sah folgendermaßen aus (Tabelle 3):

Vorgang Temperatur Zeit

1.Initiale Denaturierung 94°C 4 min

2. 30 Zyklen: a) Denaturierung b) Hybridisierung der Primer (“Annealing”) c) DNA-Synthese (“Extension”)

94°C Tm 72°C

30 sec 30 sec 1 min

3. “Final Extension” 72°C 10 min

Tabelle 3: PCR-Reaktionszyklus

Die Ergebnisse der PCR-Reaktion konnte man anschließend durch eine Agarose-

Gelelektrophorese veranschaulichen.

2.3.2. Agarose-Gelelektrophorese

Die Ergebnisse der PCR-Reaktion wurden letztendlich anhand eines 2%igem Agarosegels

veranschaulicht. Je nach Anzahl der PCR-Proben wurde ein 50 oder 300 ml Agarosegel

hergestellt. Für ein kleines Agarosegel lösten wir 1 g Agarose in 50 ml 1xTBE-Puffer (oder in

5 ml 10xTBE und 45 ml Aqua dest). Das Gemisch wurde dann in der Mikrowelle aufgekocht,

bis die weiße klumpige Flüssigkeit klar wurde. Anschließend kühlte man das Gemisch etwas

ab, und fügte unter besonderen Vorsichtsmaßnahmen 2,5 µl einer 1 % Ethidiumbromid-

Lösung ( Fa. Merck, Darmstadt) hinzu. Dann wurde das Gel in die dafür bestimmten

Gelschlitten mit passenden Kämmen gegossen, so daß keine Luftblasen entstehen konnten.

Die Elektrophoresekammer (Pharmacia LKB GNA 100 bzw. 200) wurden auch mit 1xTBE-

Puffer gefüllt.

Die PCR-Proben wurden vor dem Auftragen auf das Gel mit 5 µl eines Ladepuffers

(“6xLoading-Buffer”: 0,25 % Xylencyanol FF und 30 % Glycerin in H2O) vermischt. 10

bzw. 20 µl dieser Proben wurden in die Geltaschen eingegeben. Am Ende jeder Reihe wurde

zusätzlich 1 bzw. 5 µl einer 100-bp-Leiter-DNA (1 µg/µl; Fa. GIBCOBRL, Karlsruhe) als

Längenmarker aufgetragen. Je nach Größe des Gels und der erwarteten Fragmentlängen

dauerte die Gelelektrophorese bei 70 (kleines Gel) bzw. 120 V (großes Gel) etwa 30 min bis

1½ h. Die aufgetrennten Banden wurden mit Hilfe eines automatischen


Videodokumentationssystems (Fa. LTF-Labortechnik) nach UV-Anregung bei 312 nm

fotographiert.

2.3.3. Interpretation von PCR-Ergebnissen

Waren bei der Auftrennung im Gel keine Banden sichtbar, bedeutete dies, daß die

“annealing”-Temperatur zu hoch gewählt wurde oder ein anderer Fehler im Reaktionsgemisch

vorlag. Um eine optimale “annealing”-Temperatur zu ermitteln, wurde diese schrittweise um

2°C reduziert. Bei zu vielen Banden wurde die “annealing”-Temperatur um 2°C erhöht, und

somit die PCR optimiert. Falls die Wasserspur (Negativkontrolle) eine Bande zeigte und

somit kontaminiert war, wurde der ganze Versuch wiederholt. Für die genomische Kontroll-

DNA mußte ein positives Signal vorliegen (Positivkontrolle). Schließlich wurden die

Ergebnisse unabhängig von zwei Untersuchern interpretiert, wobei die gezeigten YAC-

Banden eine mindestens halb so hohe Intensität aufweisen mußten wie die genomische DNA-

Bande. Jedes Positivergebnis mußte mindestens in einer weiteren PCR bestätigt werden.

Die PCR-Methode ist eine sehr empfindliche Methode um winzige Mengen einer Ziel-DNA

zu vervielfältigen, ohne sie vorher in anderen Vektoren einkloniert zu haben. Die

außergewöhnliche Empfindlichkeit dieser Methode hat jedoch den Nachteil, daß extrem leicht

Kontaminationen entstehen können. Deshalb ist sorgfältiges arbeiten unerlässlich. Zu

weiteren Fehlern kann die Taq-Polymerase beitragen, die keine korrigierende 3´-5´

Exonuklease (“proof-reading activity”) besitzt.

2.4. Erstellung von PAC-Contigs

Das Erstellen eines PAC-Contigs ist der nächste Schritt im Rahmen einer Feinkartierung einer

bestimmten chromosomalen Region. Die STS-Marker, die auf dem YAC-Contig kartiert

wurden, werden auf Positivität mit den ausgewählten PACs überprüft. Diesen Vorgang

bezeichnet man als STS content mapping. Im Anschluß daran können die Endsegmente der

klonierten DNA-Insertionen leichter ansequenziert werden im Sinne einer sog.

Chromosomenwanderung. Somit können neue STS-Marker generiert werden, die die

physikalische Karte vervollständigen und zu weiteren Überlappungen der PAC-Klone

beitragen.


2.4.1. PACs

Das “P1-abgeleitete künstliche Chromosom” (PAC) ist ein weiterer Klonierungsvektor,

welcher vom Bakteriophagen P1 abstammt. Sie können DNA-Fragmente in einer Größe von

130 bis 150 kb aufnehmen. Die rekombinierte P1-Phagen-DNA wird dann in eine Wirtszelle

(in diesem Fall ein cre+-Stamm von E.coli) injiziert, sie schließt sich dort zu einem Ring und

wird dann amplifiziert (Sternberg, 1992; Iouannou et al., 1994). PACs haben den Vorteil

gegenüber YACs, daß sie selten chimerisch sind und durch ihre Länge leichter sequenziert

werden können. Sie sind auch gut für die Analyse von Exon-Intron Strukturen innerhalb eines

Gens geeignet.

Es gibt mehrere PAC Bibliotheken, die von unterschiedlichen Forschungszentren zur

Verfügung gestellt wurden. In dieser Arbeit wurde die PAC Bibliothek des Max-Planck-

Instituts für molekulare Genetik aus Berlin (Ressource Center of the German Human Genome

Project) durchsucht. Die vom Pieter de Jong hergestellte PAC-Sammlung verwendet als

Vektor den pPAC4 und als Wirtszelle den E.coli DH10B.

Mit Hilfe der Inter-Alu-PCR Methode kann man von einem bestimmten YAC verschiedene

Inter-Alu-PCR-Produkte herstellen. Diese Methode basiert auf Alu-Wiederholungen, die im

menschlichen Genom etwa alle 4 kb in entgegengesetzter Orientierung auftreten. In diesem

Fall kann ein einziger Primer an beide entgegengesetzte Sequenzen binden und das

dazwischenliegende nichtrepetitive Produkt amplifizieren. Diese PCR-Produkte lassen sich

als Hybridisierungssonden für die Durchsuchung von PAC-Filtern verwenden. Die Alu-

Repeats findet man häufig in nicht kodierenden Abschnitten von Genen, vor allem in Introns.

Somit haben die mit den Inter-Alu-PCR-Produkten herausgesuchten PACs einen sehr guten

informativen Gehalt.

2.4.2. YAC-DNA-Präparation zur Durchsuchung einer PAC-Bibliothek

Mit der oben beschriebenen Methode wurden die zum minimalen Contig für das Senior-

Løken Syndrom gehörenden YAC-Klone 913-E-2 und 964-F-8 untersucht. Hierfür mußte die

YAC-DNA isoliert und aufgereinigt werden, um anschließend nach Berlin zum Max-Planck-

Institut eingeschickt zu werden. Zunächst wurden von den oben genannten YAC-Klonen


Flüssigkulturen (s. Kap. 2.2.3.) hergestellt. Anschließend wurde mit Hilfe eines Qiagen®-

Midi-Präp (Fa. Diagen GmbH, Hilden) die YAC-DNA nach folgendem Verfahren isoliert:

1. Reinigung der YAC-Lösung: 15-20 ml der YAC-Suspension wurden bei 3000-5000 x g,

4°C, 10 min lang zentrifugiert, der Überschuß dann verworfen. Im ersten Waschvorgang

entfernt man Verunreinigungen aus der Lösung, indem man die Zellen in je 4 ml TE-

Puffer resuspendiert, und anschließend wieder bei 3000-5000 x g, 4°C, 10 min lang

zentrifugiert, und den Überschuß dann verwirft.

2. Lyticase-Verdau der Zellwand: Das verbliebene Pellet konnte weiterhin mit 4 ml

Puffer Y1 (“Yeast Lysis Buffer”) versetzt werden und wurde dann bei

Maximalgeschwindigkeit gevortext. Zu der erhaltenen homogenen Lösung gab man

anschließend 25 µl Zymolase-Stocklösung (10.000 U/ml, Fa. Sigma, bei – 20°C gelagert).

Das Gemisch wurde dann im Wasserbad bei 37°C 2 h lang inkubiert. Schließlich wurden

die Spheroblasten bei 5000 x g, 4°C, 10 min lang zentrifugiert und der Überschuß

verworfen.

3. Lyse der YAC-Spheroblasten: Das gewonnene Zellpellet wurde mit 5 ml G2-Puffer

versetzt (“General Lysis Buffer”) und sehr gut durchmischt, so daß eine homogene

Suspension der Spheroblasten entstand. Puffer G2 lysiert den Zellkern und denaturiert

Nukleasen, Histone und DNA-bindende Proteine. Die RNase A sichert die saubere

Auftrennung der genomischen DNA aus den Hefezellen.

4. Verdau der denaturierten Proteine: Anschließend wurden die denaturierten Proteine mit

Hilfe von 100 µl Quiagen Protease oder der Proteinkinase K (Stocklösung 20 mg/ml) in

kleinere Fragmente verdaut. Wir inkubierten die Lösung bei 30°C über Nacht. Am

nächsten Tag zentrifugierten wir das Gemisch bei 5000 x g, 4°C, 10 min lang und trennten

den klaren Überstand vom weißen Pellet, der aus Zellüberstandsresten bestand.

5. Die Equilibrierung der Qiagen®-Midi-Präp Säulen (Genomic-tip 100/G) erfolgte mit

Hilfe von 4 ml QBT-Puffer (“Equilibrierungspuffer”).

6. Aufreinigung der gewonnenen DNA: Anschließend wurde der Überstand aus Schritt 5

auf den Säulen aufgetragen. Nach Bindung der DNA an die Säulenmatrix reinigte man

diese zwei Mal mit 7,5 ml QC-Puffer (“Waschpuffer”).

7. Elution der genomischen DNA von der Säulenmatrix: In diesem letzten Schritt der

DNA-Isolierung wurden die “Midi-Tips” auf ein autoklaviertes Zentrifugenröhrchen

gesetzt. Die Elution der DNA erfolgte mit 5 ml bei 50°C vorgewärmtem QF-Puffer

(“Elutionspuffer”).


8. Die DNA-Präzipitation erreichte man durch die Zugabe des 0,7 fachen Volumens (3,5 ml)

Isopropanol. Das Gemisch wurde dann bei 5000 x g, 4°C, 15 min lang zentrifugiert und

der Überstand verworfen. Das DNA-Pellet wurde mit 2 ml kaltem 70% Ethanol

gewaschen und unter den selben Bedingungen 10 min lang zentrifugiert. Der Überstand

wurde dann vorsichtig verworfen, das DNA-Pellet 10 min lang an der Luft getrocknet,

und anschließend in 2 ml TE-Puffer, pH 8.0 gelöst.

2.4.3. Bestimmung der Konzentration der DNA-Lösung

Die Konzentration und die Reinheit der doppelsträngigen DNA-Lösung wurde mit Hilfe eines

Spektralphotometers (Modell PM QII mit einem Monochrometer M4 QIII, Fa. Carl Zeiss)

bestimmt. Es wurden 5 µl der DNA-Lösung zu 495 µl Aqua dest. gegeben was einen

Verdünnungsfaktor von 100 ergab. Eine DNA-Konzentration von 50 µg/ml entspricht einer

optischen Dichte von 1 bei einer Wellenlänge von 260 nm (OD260, optical density). Die

Berechnung der Probenkonzentration wurde mit der folgenden Formel ausgerechnet:

YAC-DNA (µg/ml) = gemessene OD260 x 50 x 100 (Verdünnungsfaktor)

Der Quotient OD260/ OD280, sollte zwischen 1,7 und 2,0 liegen um eine hohe Reinheit der

Probe nachzuweisen. Ist der Quotient kleiner so spricht dies für Verunreinigungen zum

Beispiel durch Proteine.

2.4.4. Inter-Alu-PCR mit der YAC-DNA als Template

Die aufgereinigte YAC-DNA wurde als Template für die Inter-Alu-PCR verwendet. Die Inter-

Alu-PCR ist ein ungewöhnliches PCR-Verfahren mit nur einem Primer, welches dem

Wiederholungselement entspricht. Das Verfahren beruht darauf, daß bei einem sehr häufigen

Wierderholungselement (wie das Alu-Repeat, welches im menschlichen Genom etwa alle 4 kb

auftretet) zwei dieser Elemente oftmals eng benachbart und in entgegengesetzter Orientierung

auftreten. Somit kann ein Primer beide Sequenzen binden, so daß eine Amplifizierung des

dazwischenliegenden Abschnitts möglich ist. Mit Hilfe von drei unterschiedlichen Alu-

Primern konnten von der YAC-DNA Hybridisierungssonden für die Durchsuchung von PAC-


Filtern hergestellt werden. Die Sequenzen der verwendeten Alu-Primern sind aus der Tabelle

4 zu entnehmen. Die Inter-Alu-PCR verlief wie in Kap. 2.3.1. beschrieben.

Alu-Primer

Primersequenz

Annealing Temperatur

(in °C)

Alu 1 5´-ctgggattacaggcctgagc-3´

52

Alu 2

5´-cagaattcgcgacagagcgagactccgtct-3´

52

Alu Cl1

5´-ctgcactccagcctggg-3´

52

Tabelle 4: Verwendete Alu-Primer. Die zweite Spalte zeigt die Sequenz des Primers, der an beide entgegengesetzte DNA-Stränge bindet, und die dritte Spalte ihre Annealing Temperatur.

2.4.5. Herstellung von weiteren Hybridisierungssonden mit ESTs

Weitere Hybridisierungssonden wurden mit Hilfe von ESTs, die auf dem YAC-Contig

kartieren, hergestellt. Die EST-Primern WI 18649-5´, stSG 3629-3´, A007F16-5´, SGC30075-

3’ und stSG 1459-3´ wurden zur Sondenherstellung verwendet. Die PCR-Reaktion wurde in

PCR-Caps durchgeführt. Als Template benutzte man pro Reaktionsansatz 7,5µl einer 0,1

molaren genomischen DNA. Der auf Eis pipettierte “Master-Mix”-Ansatz bestand aus:

• 5 µl 10xPCR Puffer

• 5 µl einer 40 mM dNTP-Stammlösung (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

• 5 µl jeweils des 0,1 molaren F´- bzw. R´-Primers

• 22,1 µl Aqua dest.

• 0,4 µl Taq-Polymerase

Der Thermal Cycler (Cyclogene PHC-3, Fa. Techne/Genius) wurde auf “Deckelheizung”

verwendet. Bei dieser PCR-Reaktion wurden nur 27 Zyklen durchgeführt, um eine höhere

Spezifität zu erzielen. Ansonsten sah der PCR-Reaktionszyklus wie in Tabelle 3 (Kap. 2.3.1.)

beschrieben aus.

Anschließend wurden die PCR-Proben folgendermaßen aufgereinigt:

1. Zu 40 µl PCR-Probe wurden 250 µl PB-Puffer gegeben.


2. Das Gemisch wurde zentrifugiert (1 min bei 10.000 x g) in einer QIA®-“quick-spinn-

column” über einen 2 ml Sammelbehälter.

3. Mit 0,75 ml PE-Puffer wurde die Probe anschließend gewaschen und wieder zentrifugiert.

4. Die Elution erfolgte mit 50 µl EB-Puffer.

Anschließend wurde mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese (s. Kap. 2.3.2.) untersucht, ob

die aufgereinigten PCR-Proben der richtigen EST-Länge entsprechen.

2.4.6. Herkunft der PAC-Klone

Die Inter-Alu-PCR-Produkte sowie die hergestellten und aufgereinigten EST-Proben wurden

im Rahmen dieser Arbeit nach Berlin an das Max-Planck Institut für molekulare Genetik

geschickt. Dort wurde ihre auf high-density Filtern gespottete PAC-Bibliothek auf Positivität

mit den eingeschickten Sonden untersucht. Aufgrund positiver Signale erhielten wir 21 PACs

für die SLS-Region auf Chromosom 15.

2.4.7. Anzüchten der PAC-Klone

Im Gegensatz zu den YACs wurden die PAC-Klone auf LB (Luria-Bertani) Nährböden

ausgestrichen und kultiviert. Die LB-Platten wurden folgendermaßen hergestellt: 200 ml LB-

Nährmedium (10 g Tryptone, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl; Fa. BIO 101, Vista CA) wurden mit

15 mg Agar vermischt und bei 120°C 30 Minuten lang autoklaviert. Anschließend, nachdem

der LB-Agar etwas abgekühlt war, fügten wir 10 µg/ml Kanamycin zu. Im weiteren wurde

wie bei der Agar-Platten Herstellung für die YACs vorgegangen. Schließlich beimpften wir

die LB-Nährböden mit den einzelnen PACs und inkubierten diese bei 37°C 1 bis 3 Tage lang

im Brutschrank bis einzelne Kolonien sichtbar wurden.

Die Herstellung von Flüssigkulturen wurde wie folgt durchgeführt: 25 g LB-Broth-Medium

(10 g Tryptone, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl; Fa. BIO 101, Vista CA) wurde mit 5 M NaOH-

Lösung auf ein pH von 7,0 eingestellt und dann mit Aqua dest. auf 1 l gefüllt und schließlich

autoklaviert (s.o.). Zu jeweils 5 ml LB-Medium wurden 12,5 µl/ml Kanamycin (Konz. 25

µg/ml) gegeben. Je eine Einzelkolonie der hochgezüchteten PACs wurde mit einer

ausgeglühten Öse von den LB-Agar-Oberfläche abgetragen und in je 5 ml LB-


Flüssignährmedium gelöst. Die Flüssigkulturen wurden anschließend bei 37°C über 24

Stunden geschüttelt.

Aus Flüssigkulturen wurden zunächst Glycerin-Stocks, für eine längerfristige Aufbewahrung,

hergestellt. Wie bei der Herstellung von YAC-Glycerin-Stocks (Kap. 2.2.3) wurden 1,4 ml

PAC-Kultur zu 0,6 ml Glycerol (Fa. Karl-Roth GmbH + Co, Karlsruhe) gegeben und nach

kurzem schütteln in flüssigem Stickstoff “schockgefroren”. Die Proben wurden bei –80°C

aufbewahrt.

2.4.8. Isolation der Plasmid-DNA

Für die Rückkartierung der PACs auf das YAC-Contig mußte zunächst die Plasmid-DNA

isoliert werden. Zu diesem Zweck wurde eine Phenol-Chloroform Extraktion mit der “One

step Miniprep-Methode” durchgeführt:

1. In einem Ependorf-Cap wurden 0,5 ml der PAC-Flüssigkultur mit 0,5 ml Phenol/

Chloroform/ Isoamylalkohol (25/24/1) eine Minute lang gevortext, und

anschließend bei 15.000 rpm 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde

verworfen.

2. Das Pellet wurde mit 0,5 ml 70%igem kalten Ethanol gewaschen.

3. Anschließend wurde das Pellet 5 min lang und in 150 µl TER (TE-Puffer (s. Kap.

2.6) mit 20 mg/ml RNAse) für 2 h auf dem Rüttler (Frequenz 300/min) gelöst.

Die Plasmid-DNA der einzelnen PACs wurde anschließend photometrisch gemessen

(s.Kap.2.4.3) und auf eine Konzentration von 10 µg/ml verdünnt.

2.4.9. Rückkartierung der PAC-Klone auf das YAC-Contig

Der nächste Schritt bei der Herstellung eines vollständigen PAC-Contigs ist die Bestätigung

der Positivität der PAC-Klone mit den STS-Markern des YAC-Contigs (STS-Content-

Mapping). Zu diesem Zweck wurden PCR-Reaktionen mit der gewonnenen Plasmid-DNA

durchgeführt. Es wurde der gleiche Ansatz wie für die YACs genommen (s. Kap. 2.3.1). Die

Ergebnisse der PCR-Reaktion wurden gleichermaßen durch eine Agarose-Gelelektrophorese

veranschaulicht (s. Kap. 2.3.2) und interpretiert (s. Kap. 2.3.3).


2.5. Weitere Materialien und Geräte

Agar-Platten: Fa. Greiner Labortechnik

Autoklaviergerät: Fa. Getinge

Brutschrank: Fa. Heraeus Instruments, Stuttgart

Elektrophoresekammer 100 / 200: Fa. Pharmacia LKB GNA

Rüttler: Fa. Braun

Photometer: Pharmacia LKB, Ultraspec III

Spannungsquelle 200 / 400: Pharmacia LKB GPS

Sterile Werkbank: Fa. BDK, Sonnenbühl-Genkingen

Ultrapure Water System: Fa. Millipore

2.6. Verwendete Lösungen und Substanzen

Folgende Substanzen und Lösungen wurden angefertigt bzw. verwendet:

PCR-Reaktion:

10xPCR Puffer - 500 mM KCl

- 15 mM MgCl2

- 100 mM Tris-HCl; pH 9,0 (Fa. Pharmacia Biotech)

dNTP-Stammlösung Ultrapure dNTP Set, 100 mM Solutions (Fa. Pharmacia)

Taq-Polymerase Thermus aquaticus, 5000 U/ml (Fa. Pharmacia)

Agarose-Gelelektrophorese:

Agarose: paq GOLD Universal Agarose, Fa. PEQLAB, Erlangen

TBE-Puffer (10x) - 108 g Tris Base

(Tris-Borat-EDTA) - 55 g Borsäure (Fa. Merck)

- 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)

- ad Aqua dest 1000 ml

100-bp-Leiter-Lösung:. - 20 µl konzentrierte 100-bp-DNA-Ladder

(Fa. GIBCOBRL, Karlsruhe)

- 150 µl Agarose-Ladepuffer

- 430 µl Aqua bidest.


Isolation der YAC-DNA (Qiagen®-Midi-Präp, Fa. Qiagen, Hilden):

TE-Puffer - 10 mM Tris-HCl

- 1 mM EDTA, pH 8,0

- Aqua dest.

Puffer Y1 - 1 M Sorbitol

(“Yeast Lysis Buffer”) - 100 mM EDTA

- 14 mM ß-Mercaptoethanol (bei 4°C gelagert)

G2-Puffer - 1 mg RNAse A,

(“General Lysis Buffer”) - 800 mM Guanidine HCl

- 30 mM EDTA

- 30 mM Tris-HCl

- 5% Tween-20

- 0,5% Triton X-100, pH 8,0

QBT-Puffer - 750 mM NaCl

(“Equilibrierungspuffer”) - 50 mM MOPS

- 15% Ethanol

- 0,15% Triton X-100, pH 7,0.

QC-Puffer - 1,0 M NaCl

(“Waschpuffer”) - 50 mM MOPS

- 15% Ethanol, pH 7,0

QF-Puffer - 1,25 M NaCl

(“Elutionspuffer”) - 50 mM Tris-HCl

- 15% Ethanol, pH 8,5

Ergebnisse 48

3. ERGEBNISSE

Zu Beginn dieser Arbeit wurde anhand einer Haplotypenanalyse bei 14 SLS-Familien eine

Kopplungsregion für 5 SLS-Early Familien auf Chromosom 15q lokalisiert. Hierbei wies der

Marker D15S1046 den höchsten LOD-Score im gesamten Genom auf. Das Ziel dieser Arbeit

war es, zunächst eine grobe physikalische Karte dieser Kandidatenregion für SLS zu erstellen.

Hierzu sollten zunächst bereits im Internet verfügbare Karten mit den verwendeten Markern

überprüft und anschließend mit neuen Markern aus zum Teil exprimierten Sequenzbereichen

verfeinert werden. Hierfür wurden die folgenden Markertypen verwendet.

3.1. Generierung von STS – Markern in der SLS-Region

Eines der wichtigsten Hilfsmittel für eine physikalische oder genetische Kartierung sind die

sequenzmarkierten Stellen oder sequence-tagged sites (STSs). Sie charakterisieren eine DNA-

Region, für die eine spezifische PCR-Reaktion existiert. STS sind 200 bis 500 bp lange

Sequenzen, die entweder eine ungewöhnliche Restriktionsstelle beinhalten, genetische DNA-

Polymorphismen enthalten oder mit bestimmten cytogenetischen Banden hybridisieren

können. Die STS-Sequenzen stellen eine wichtige Verbindung zwischen den genetischen und

den physikalischen Karten dar, weil sie diese in Beziehung zueinander setzen, indem man

dieselben Loci auf beiden Typen von Karten lokalisiert (Olson et al., 1989).

3.1.1. Nicht-polymorphe STS-Marker

Die meisten STS-Marker sind nicht polymorph, das heißt man kann sie spezifisch einzelnen

chromosomalen Regionen zuordnen, und sie sind bei allen Individuen gleich. In dieser Arbeit

wurden folgende nicht-polymorphe STS-Marker benutzt: WI-9879, WI-4034 und WI-5479

(Tabelle 5). Diese Marker wurden aus der im Internet veröffentlichten YAC-Karte des

Whitehead/MIT-Centers for Genome Research (WICGR) entnommen. Sie sind auf der

folgenden Internetseite zu finden:

http://www.carbon.wi.edu:8000/cgi-bin/contig/sts_info/

http://www.carbon.wi.edu:8000/cgi-bin/contig/sts_info/

Ergebnisse 49

STS-Marker

Primersequenz: Left-Strand Primer (CA)

Right-Strand Primer (TG)

Produktlänge

(in bp)


(in °C) WI-9879

5’-agcagggtgcttcaaaattg-3’ 5’-agatttaaaagtccccggga-3’

199 56°C

WI-4034

5’-tatgggcactttgaagaggg-3’ 5’-ccccaaggagagccatct-3’

154 60°C

WI-5479

5’-agccaaggtcacaccagg-3’ 5’-cagaatgtcctcaaacctattctt-3’

224 52°C

Tabelle 5: Nichtpolymorphe STS–Marker aus dem Whitehead/MIT-Center. Die erste Spalte führt die Bezeichnung der STS-Marker auf. In der zweiten Spalte wird die Sequenz der Hin- und Rückstrangprimer angegeben. Die dritte und vierte Spalte zeigen die erwartete Länge des PCR-Produktes sowie die für diese Primer ermittelte spezifische Annealing Temperatur.

3.1.2. Polymorphe STS-Marker

Eine nützliche Untergruppe von STS-Sequenzen, die einen ausgeprägten Polymorphismus

zeigen, sind die Mikrosatellitenmarker (MS). Diese sind Polymorphismen von kurzen,

tandemförmigen Wiederholungen (short tandem repeat polymorphisms, STRPs). Sie bestehen

in der Regel aus Dinukleotid-Repetitionen (CA repeats), wobei auch Tri- und

Tetranukleotidsequenzen bekannt sind. Innerhalb dieser Regionen ist es während der

Evolution zu Mikroinsertionen bzw. –deletionen gekommen, was zu einem ausgesprochenem

Polymorphismus der Länge der CA-repeats zwischen einzelnen Individuen geführt hat. Die

(CA)n/(TG)n-Wiederholungen eines bestimmten STRP-Locus werden von Sequenzen

flankiert, zu denen man Primer konstruieren kann und somit die polymorphen Allele

amplifizieren kann. Aufgrund dieser Eigenschaft lassen sie sich unter anderem besonders gut

bei der Kopplungsanalyse einsetzen.

Mikrosatellitenmarker haben den Vorteil, daß sie in großer Zahl vorhanden sind und über das

gesamte Genom gleichmäßig verteilt sind. Außerdem besitzen sie einen hohen

Informationsgehalt und sind leicht zu bestimmen. Diese Eigenschaften nutzten das Généthon-

Labor in Paris, die NIH/CEPH Collaborative Mapping Group sowie das Cooperative Human

Linkage Center (CHLC) aus und erstellten weiterentwickelte Kopplungskarten des

menschlichen Genoms. Insgesamt wurde die Position von 813 MS-Marker festgelegt

(Weissenbach et al., 1992). Später erstellte genetische Karten enthielten immer mehr

genetische Marker und zeigten eine zunehmend bessere Auflösung. Inzwischen gibt es eine

Reihe verschiedener Karten, die auf unterschiedlichen Sätzen von Markern basieren.

Problematisch ist dabei, daß sich nicht alle Karten auf dieselbe Gruppe von Referenzfamilien

Ergebnisse 50

beziehen. Zum anderen ist es nicht unbedingt möglich, zwischen den verwendeten

unterschiedlichen Markergruppen der einzelnen genetischen Karten eine Beziehung

herzustellen.

Die zuletzt veröffentlichte genetische Karte ist die neueste Version der Généthon-Karte. Die

Généthon Human Linkage Map präsentiert eine deutlich bessere Auflösung von ugf. 1,6 cM

zwischen den Markern. Auf Chromosom 15 sind 145 Mikrosatellitenmarker kartiert, die

zueinander eine genetische Entfernung von 0.8 cM im Durchschnitt besitzen (Dib et al.,

1996). Hiervon wurden folgende Marker zur Herstellung des YAC-Contigs verwendet:

D15S151, D15S1030, D15S199, D15S1046, D15S979, D15S1045, D15S202 und D15S116.

Außerdem wurde der Trinukleotidrepeat (TTA-Repeat) CHLC.ATA28G05 vom Cooperative

Human Linkage Center (CHLC) zusätzlich auf den YACs zurückkartiert (Tabelle 6).

MS-Marker genetische Distanz (cM)

Het. (%)

Primersequenz: CA-Strand Primer GT-Strand Primer

Produktlänge (in bp)


(in °C) D15S151 (80.3 cM)

51 5’-attccttcacaggtaatggc-3’ 5’-gatgttctgctgacttctaatgg-3’

253-261 55°C

D15S1030 (80.4 cM)

66 5’-tataaaaggcccaacagagg-3’ 5’-ctgaataatgagcagatatgcaag-3’

207-231 55°C

D15S199 (80.9 cM)

44 5’-tgagcactatgccagacac-3’ 5’-agctcaagaagtgcagaag-3’

100-108 57°C

D15S1046 (81.5 cM)

76 5’-cacactaaagttggcctca-3’ 5’-cccttttaacacacagggt-3’

134-148 55°C

D15S979 (81.4 cM)

85 5’-tgctgcccaacatcct-3’ 5’-cagtgctacatccacggaa-3’

135-167 55°C

D15S1045 (83.7 cM)

63 5’-agcaggcaggctaatc-3’ 5’-cctcatcttcacatggc-3’

206-224 57°C

D15S202 (83.7 cM)

83 5’-aacctgggtggcacagtgag-3’ 5’-caggacctttgcacaggc-3’

226-247 60°C

D15S116 (83.7 cM)

86 5’-agcttccaactncgccctcc-3’ 5’-aggggtgttacatcgcgggt-3’

164-184 52°C

CHLC.ATA 28G05

75 5’-cacattggaggggtgattta-3’ 5’-ccctcagaaaagcctttagc-3’

237 56°C

Tabelle 6: Mikrosatellitenmarker von Chromosom 15q. Die genetische Distanz in cM ist ein Durchschnitt aus weiblicher und männlicher Distanz auf dem Chromosom. Der Heterozygotieindex (Het) gibt an wieviel Prozent der Referenzfamilien des Centre d´Etude des Polymorphismes Humanes (CEPH-Familien) für den Marker heterozygot sind. Die dritte Spalte gibt die Sequenz der Hin- und Rückstrangprimer an. Die letzten zwei Spalten führen die erwartete PCR-Produktlänge und ermittelte Annealing Temperatur auf.

Ergebnisse 51

3.1.3. Marker zu exprimierten Sequenzen (ESTs)

Exprimierte sequenzmarkierte Stellen oder expressed sequence tags (ESTs) sind kurze

Teilsequenzen von zahlreichen, zufällig ausgewählten cDNA-Klonen, die man mit einer PCR-

Reaktion testet und auf bestimmten YAC-Klonen zurückkartieren kann. 1996 waren 600.000

Sequenzen bekannt, von denen 450.000 menschliche ESTs. Diese wurden in der dbEST-

Datenbank von mehreren Konsortien der Öffentlichkeit zur Verfügung gestellt, unter anderem

vom TIGR-Institute (The Institute of Genomic Research), von der Washington University in

St.Louis und vom pharmazeutischen Konzern MERCK (Adams et al., 1995; Goodfellow,

1995). Das NCBI-Center stellte eine genetische Karte der ESTs zusammen (The human gene

map) welche im Laufe der Zeit immer mehr vervollständigt wurde.

Ein Gen kann durch mehrere ESTs repräsentiert werden, die ihrerseits von unterschiedlichen

Teilregionen der zugehörigen cDNA abstammen oder durch alternatives spleißen entstehen

können. Somit können mehrere ESTs ein Gen repräsentieren, und bilden ein sogenanntes

EST-Cluster. Damit die Genkartierung effizienter wird, sollte man eine einzige repräsentative

Sequenz eines Gens auswählen, am besten aus der 3' nicht translatierten Region der mRNA

(3'UTR). Die Vorteile dieser 3' Region sind erstens, daß sie selten Introns beinhalten, und

zweitens, daß man in dieser Region weniger Sequenzkonservierung als in codierenden

Regionen findet. Somit können sie mit Sicherheit durch die PCR-Methode nachgewiesen und

von anderen Mitgliedern von Genfamilien unterschieden werden, die eine hohe Ähnlichkeit in

kodierenden Regionen aufweisen (Wilcox et al.,1991).

In dieser Arbeit wurden folgende ESTs der 3'UTR auf das YAC-Contig kartiert: SHGC-

12481, stSG 3398, WI 18649, WI 10178, SGC30075, SHGC-15202, WI 15965, A007F16, X-

12433, WI 7222 ex. 1, WI 7222 ex. 8b und A002B10. Im weiteren Verlauf des STS-Content-

Mappings wurden weitere ESTs isoliert und auf dem YAC-Contig zurückkartiert: stSG 1459,

SHGC-30089, stSG 3629, stSG 3479, KIAA0051, stSG 151, stSG 4057 und stSG 28.

Informationen über die zytogenetische Lokalisation der ESTs, sowie über das Gen, welches

sie kodieren, erhielten wir vom NCBI-Center (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap99/).

Unsere Auswahlkriterien für diese ESTs waren ihre günstige Lokalisation sowie ihre

Genbeschreibung. Die Tabelle 7 (Kap. 3.2.2.) stellt diese Angaben zusammen.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap99/

Ergebnisse 52

3.2. Aufbau eines YAC-Contigs in der SLS-Region

3.2.1. Erstellung einer YAC-Karte

Als Vorlage für diese Arbeit diente die bereits vom Whitehead Institute veröffentlichte

physikalische Karte (http://www.carbon.wi.mit.edu:8000/cgi-bin/contig/lookup_contig). Das

Whitehead YAC-Contig WC15.3 singly-linked enthält in der kritischen Region für SLS 28

YAC-Klone aus der CEPH-Mega-YAC-Genbank und 13 STS-Marker, die auf genetischen

Karten bereits lokalisiert wurden (Dausset et al., 1992). Diese veröffentlichte physikalische

Karte ist jedoch nicht vollständig, denn die Überlappung der YAC-Klone ist teilweise unklar

(Hudson et al., 1995). Außerdem wollten wir weitere STS-Marker und ESTs aus dieser

Region kartieren, welche anschließend als Kandidatengene für das Senior-Løken Syndrom in

Frage kommen könnten.

Zunächst wurde ein Contig von 14 YACs erstellt, welches alle gekoppelten

Mikrosatellitenmarker aus der Haplotypenanalyse mit SLS Familien enthält. Es handelte sich

um folgende YACs: 944-F-11, 917-E-8, 826-A-8, 746-B-11, 957-B-4, 913-E-2, 921-A-10,

802-B-4, 709-B-4, 805-F-5, 851-E-2, 964-F-8, 966-A-2, 759-H-8. Zu den bereits im

Whitehead Contig kartierten MS-Marker D15S151, D15S199, CHLC.ATA 28G05, D15S202,

D15S116 konnten zusätzlich 4 Marker neu kartiert werden: D15S1030, D15S979, D15S1046

und D15S1045. Mit den YAC-Klonen 964-F-8 und 966-A-2 konnte allerdings keine

Überlappung bestätigt werden. Diese vorausgehenden Ergebnisse wurden bereits von der

Vorgänger-Doktorantin R. Haffner (1998) erhalten und im Rahmen dieser Arbeit nochmals

überprüft.

Zur Vervollständigung des Contigs wurden weitere STS-Marker und ESTs benötigt, um die

Markerdichte zu erhöhen, sowie weitere YAC-Klone aus der kritischen Region einbezogen.

Folgende 11 YACs wurden neu hinzugezogen: 830-E-8, 781-G-3, 881-C-4, 664-F-8, 899-F-1,

793-B-4, 765-H-1, 747-A-12, 739-D-8, 883-C-4, 876-A-1. Insgesamt wurde ein Contig von

25 YAC-Klonen hergestellt, welche eine Größe zwischen 220 und 1780 kb zeigten. Genaue

Angaben über die Länge der einzelnen YACs sind der Abbildung 3 (Kap. 3.2.4.) zu

entnehmen.

http://www.carbon.wi.mit.edu:8000/cgi-bin/contig/lookup_contig

Ergebnisse 53

Die bereits oben erwähnten 9 MS-Marker (s. auch Tab. 6, Kap 3.1.2.) wurden auf Positivität

mit den neuen YACs getestet. Auch die im Whitehead Contig kartierten nichtpolymorphen

STS-Marker WI-9879, WI-4034 und WI-5479 (Tab. 5, Kap. 3.1.1.) wurden überprüft. Hierbei

zeigten alle getesteten Marker in der PCR-Reaktion ein eindeutig positives Signal mit den

verwendeten YACs. Von den 25 einbezogenen YAC-Klonen waren nur 18 mit mindestens

einem Marker positiv. Abbildung 3 (Kap. 3.2.4.) stellt diese Ergebnisse zusammen. Bei den 7

YAC-Klonen, die nicht auf dem Contig kartiert werden konnten, handelte sich um die YACs

830-E-8, 805-F-5, 781-G-3, 664-F-8, 899-F-1, 881-C-4 und 883-C-4.

3.2.2. Kartierung von ESTs auf dem Contig

Nach dem Überprüfen der Angaben aus dem Whitehead Contig und dem Kartieren der

Mikrosatellitenmarker wurden 20 ESTs aus der Human Gene Map auf das Contig kartiert

(Schuler et al., 1996). Diese ESTs sind zytogenetisch in der Region 15q22-q26

zurückzuführen.

Tabelle 7 stellt die im Contig kartierten 3’-ESTs zusammen, sowie ihr Genprodukt, wenn

dieses bekannt ist. Diese Angaben erhielten wir vom NCBI-Center unter der folgenden

Internetadresse: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap99/ .

Von den 20 untersuchten ESTs zeigten 16 mindestens ein positives Signal in der PCR-

Reaktion mit den 25 untersuchten YACs. Folgende 4 ESTs: SHGC-12481, stSG 151, stSG

4057 und stSG 28 konnten folglich nicht auf diesen YACs zurückkartiert werden.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap99/

Ergebnisse 54

EST-Marker

Anneal. Temp.

(°C)

Prod. länge (bp)

Primersequenzen

Genbeschreibung

SHGC-12481 (15q22-qter)

60 236 L:5´-cagctggcttgctcctactt-3´ R:5´-acgtctaaccagtttaatgacttcg-3´

Cellular Retinoic Acid-Binding Protein 1 (CRABP1)

stSG3398 56 164 L:5´-caagactgtaagaacgtagg-3´ R:5´-agtctctatttatttgtcctctt-3´

Nicht identifiziertes Genprodukt

WI-18649 52 129 L:5´-ttttattaaagtcaatgcatttccg-3´ R:5´-aggtcagaaaagggccttgt-3´


stSG 1459 62 156 L:5´-gcaccattggggtctacagt-3´ R:5´-agaggaattcagaggcccat-3´


WI-10178 49 283 L:5´-aggaggatacaggtctacacacg-3´ R:5´-gttaatcacctacaggaaggcg-3´


SGC30075 (15q25)

62 150 L:5´-tttcagtgttgtatgtgtagcagg-3´ R:5´-tagtggtggctggtggtcat-3´

NeurotrophischerTyrosine-Kinase Receptor C (NTRK3)

SHGC-30089 60 150 L:5´-tttagggtaatggctgagaagt-3´ R:5´-aacgcaacagtagcttaggg-3´


stSG 3629 58 269 L:5´-tcagtaatagactcgtttatttc-3´ R:5´-actgctattaactggagactt-3´


SHGC-15202 60 130 L:5´-tctaatcccagacttgtctgagc-3´ R:5´-tgtgggtcactaaggatgagc-3´


WI-15965 52 108 L:5´-ctttcatctgaggcctcacc-3´ R:5´-atctgtacctgtcataattttg-3´

KIAA0714-Protein

A007F16 52 223 L:5´-tttattgtccaaagtacacac-3´ R:5´-cacctctacttctctgtga-3´


X-12433 49 235 L:5´-cgccaacgccatttgc-3´ R:5´-ctgcctactccgagacaggtg-3´

Humanes pHPS1-2 mRNA mit ORF homo...

WI-7222 Ex. 1:

(15q26) Ex. 8b:

52

52

196

250

L:5´-tgtgtccattacatttcataac-3´ R:5´-ccaaaaaatagccagggatc-3´ L:5´-gctgaactgtagttagaatc-3´ R:5´-aaccttacacaaaaatcactg-3´

Cellular Retinaldehyde-binding Protein 1 (CRALBP1)

A002B10 52 217 L:5´-taagtgtatgggaaagaaagt-3´ R:5´-atgagtatgtgggttatagtc-3´


stSG 3479

54 230 L:5´-gtattttaaacttgggaagagt-3´ R:5´-attgtcctagtcccagtt-3´

Adaptor Complex Sigma 3B (AP3S3)

KIAA0051 (15q26.1)

62 237 L:5´-gctacagtatgaaggagttgc-3´ R:5´-tgtggcatcgggagtgtatca-3´

RAS GTPase-Activating-Like Protein (IQGAP1)

stSG 151 62 141 L:5´-ctcagtgagatgcaggcatc-3´ R:5´-tatcctgggagcaggaagtg-3´

Nicht identifiziertes Genprodukt (ähnlich zu vakuoläre Proteine)

stSG 4057 62 137 L:5´-tttcacaactgtgcagtcactg-3´ R:5´-acttgaggagggacccaact -3´


stSG 28 65 115 L:5´-cactaaactcccaaagtcctgg-3´ R:5´-ctccaccttaggcctcagc-3´


Tabelle 7: Kartierte 3’-ESTs aus der kritischen Region für SLS auf Chromosom 15q. Alle Marker sind der transkriptionellen Karte “Science Map” 96 (Schuler et al. 1996) entnommen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/SCIENCE96/). Die hier aufgeführten Marker amplifizieren Transkripte für die bisher nur teilweise ein Genprodukt zugeordnet werden konnte. In der ersten Spalte sind die Namen der EST(Expressed Sequence Tags)-Marker dargestellt. Die zweite Spalte zeigt die Annealingtemperatur, bei der die PCR-Reaktionen durchgeführt wurden. Die dritte Spalte gibt die Länge der PCR-Produkte an. Die Primersequenz für den sense und antisense Primer ist jeweils in 5’-3’-Richtung angegeben In der letzten Spalte sind eventuell die Bezeichnungen für die Genprodukte angegeben.

Ergebnisse 55

3.2.3. STS-content-mapping mit Hilfe von 5’EST der SLS-Region

Da EST-Sequenzen verhältnismäßig kurz sind (ugf. 200 bis 300 Nukleotide) und eine

vollständige menschliche cDNA aber durchschnittlich ugf. 2 kb lang ist, kann dasselbe Gen

durch verschiedene ESTs detektiert werden. Eine sog. EST-Wanderung, mit deren Hilfe sich

überlappende Sequenzen ermitteln und zu einer Gesamtsequenz zusammensetzen lassen, wird

dabei angestrebt (Adams et al., 1995). Durch Datenbankvergleiche der innerhalb den

flankierenden Marker D15S1030 und D15S1045 kartierten 3´-ESTs, mit dem Programm

BLAST Search dbEST-NCBI, konnten überlappende EST-Cluster gefunden werden. Um die

gesamte Gensequenz einzurahmen wurden zu den äußeren 5’-Enden Primer konzipiert (siehe

Tabelle 8) und diese mit den YAC-Klonen auf Positivität getestet.

5’-EST-Marker


(°C)

Produktlänge

(bp)

Primersequenzen Left-Strand Primer (CA) Right-Strand Primer (TG)

WI-18649-5’ 58 96 5’-ggtcttaaggataaaatgcag-3’ 5’-ggctgatgtcaagagaagag-3’

stSG 1459-5’ 60 92 5’-cccacggagaaatgtttctga-3’ 5’-ctgtaaatgacagaatactgtga-3’

WI-10178-5’ 60 97 5’-gttttaaactaagtgctacttta-3’ 5’-gtccagtaggaaacaaatcat-3’

SGC30075-5’ trkC

53 60 5’-catacacatagagaactggc-3’ 5’-tagagctccatgtccacg-3’

stSG 3629-5’ (SHGC-15202)

58 94 5’-ccagcgactggcaaagaag-3’ 5’-ctgctcccacatatcttcc-3’

WI-15965-5’ 58 109 5’-aattcaagtcatgcaggctg-3’ 5’-gcagatggtcccggccg-3’

A007F16-5’ 60 102 5’-caaacagaacccaatgcctc-3’ 5’-gaaccctccagaagcccac-3’

Tabelle 8: Kartierte 5’-ESTs aus der kritischen Region für SLS auf Chromosom 15q. Die hier vorgestellten 5’-EST-Sequenzen wurden nach der Suche von überlappenden EST-Cluster mit Hilfe des Programms BLAST-Search dbEST-NCBI gefunden. In der ersten Spalte sind die Namen der EST-Marker dargestellt. Die zweite Spalte zeigt die Annealingtemperatur, bei der die PCR-Reaktionen durchgeführt wurden. Die dritte Spalte gibt die Länge der PCR-Produkte an. Die Primersequenz für den sense und antisense Primer ist jeweils in 5’-3’-Richtung angegeben.

Insgesamt kartierten 9 ESTs im kritischen Bereich des YAC-Contigs. Es handelte sich um

folgende ESTs: WI-18649, stSG1459, WI-10178, SGC30075, SHGC30089, stSG3629,

SHGC15202, WI-15965 und A007F16. Durch eine Sequenzanalyse mit Hilfe des oben

erwähnten Programmes (BLAST Search dbEST-NCBI) konnte festgestellt werden, daß die

ESTs SHGC15202 und stSG3629 von der gleichen cDNA abstammen müssen und somit vom

Ergebnisse 56

gleichen EST-Cluster. Für SHGC30089 konnte kein 5’-Ende des EST-Clusters gefunden

werden. Somit konnten wir nur sieben 5’-ESTs in der kritischen Region zurückkartieren.

Diese Ergebnisse werden in Abbildung 3 (Kap. 3.2.4.) graphisch dargestellt.

3.2.4. Erstellung eines minimalen Contigs

In der kritischen Region des Senior-Løken Syndroms auf Chromosom 15 (15q22-15q26)

wurde ein komplettes YAC-Contig erstellt. Das Contig umfaßt eine genetische Distanz von

3,3 cM und wird von den Mikrosatellitenmarkern D15S1030 und D15S1045 flankiert. Von

insgesamt 25 YAC-Klonen, die anhand der Whitehead-Karte in dieser Region lokalisiert sind,

zeigten in der vorliegenden Arbeit nur 18 Klone ein positives PCR-Ergebnis mit den

verwendeten STS- und EST-Markern. Weiterhin zeigten 16 YACs eine Positivität mit

mindestens zwei Markern, und 13 davon kartierten im Intervall zwischen den flankierenden

Markern. Insgesamt wurden folgende 4 YAC-Klone benötigt, um diese Distanz zu klonieren:

913-E-2, 964-F-8, 793-B-4 und 966-A-2. Die maximale Distanz für die kritische Region

errechnet sich aus der Länge dieser 4 YACs und beträgt 4,385 Mb.

Das Contig wird durch insgesamt 39 kartierten Markern definiert (Abbildung 3). Hierbei

wurden alle 9 bei der Haplotypenanalyse von SLS-Familien verwendeten

Mikrosatellitenmarker sowie 3 nicht-polymorphe STS-Marker kartiert. Außerdem wurden

zwanzig 3’-ESTs kartiert, von denen sich nur 9 im flankierten Intervall befanden, sowie

sieben 5’-ESTs dieser Region. Diese 9 im Intervall kartierten ESTs sind Kandidatengene für

das Senior-Løken Syndrom.

SHG

C-1

2481

stSG

3398

WI 9

879

D15

S151

D15

S103

0

WI 1

8649

-3'

WI 1

8649

-5'

D15

S199

ATA2

8G05

D15

S104

6

WI 4

034

stSG

1459

-5'

stSG

1459

-3'

WI 1

0178

-5'

WI 1

0178

-3'

SGC

3007

5-3'

SGC

3007

5-5'

SHG

C-3

0089

D15

S979

stSG

362

9-5'

SHG

C 1

5202

stSG

362

9-3'

WI 1

5965

-5'

WI 1

5965

-3'

A007

F16-

5'

A007

F16-

3'

D15

S104

5

X124

33

WI 5

479

WI 7

222

ex.1

WI 7

222e

x.8b

D15

S202

D15

S116

A002

B10

stSG

347

9

KIA

A00

51

stSG

151

stSG

405

7

stSG

28

cen qterCRABP1 trkC

Minimal Contig < 4,385 Mb< 1410 kb

< 1710 kb< 710 kb < 555 kb

944- F-11

917-E- 8

826-A-8

957-B-4

913-E-2

921-A-10

746-B-11

709-B-4

802-B-4

964-F-8

793-B-4

765-H-1

747-A-12

759-H-8

876-A-1

966-A-2

PHPS1-2 CRALBP Sigma 3B

IQGAP1(1480 kb)

(1780 kb)

(1710 kb)

(640 kb)

(710 kb)

(1590 kb)

(720-1510 kb)

(790 kb)

(1410 kb)

(1710 kb)

(1410 kb)

(830 kb)

(555 kb)

(no size)

(1300 kb)

(940 kb)

Abbildung 3: YAC-Karte für die SLS-Region auf Chromosom 15q.Die horizontale Skala führt alle Marker auf, welche durch PCR-Reaktionen mit allen YAC-Klonen auf Positivität getestet wurden. Die flankierenden Marker sind durch einen Rahmen markiert. Die telomerische (qter) und centromerische (cen) Orientierung ist angegeben. Rechtecke symbolisieren Mikrosatellitenmarker, senkrechte Linien stehen für nicht-polymorphe STS-Marker und Dreiecke für ESTs. Die bekannten Gene sind in Kursivschrift unter den einzelnen ESTs angegeben. Im Diagramm werden die YAC-Klone als horizontale Balken dargestellt. Links an den Balken werden die Namen der YACs angeführt, rechts in Klammern ihre Länge in kb. Positive PCR Ergebnisse der einzelnen Markemit den YACs werden durch die Symbole auf den YACs dargestellt. Negative PCR Ergebnisse innerhalb eines YACs werden durch eine gestrichelte Linie im YAC-Balken angezeigt. Unten im Diagramm wird nochmals die Ausdehnung der 4 YACs, die das minimale Contig (mit seiner Länge in Mb) bilden, gezeigt.

Ergebnisse 58

3.3. Aufbau einer PAC-Karte der SLS-Region

Zur Verfeinerung der physikalischen Karte werden PAC-Contigs generiert. PACs sind

Klonierungsvektoren, die im Vergleich zu den YACs ein kürzeres DNA-Fragment beinhalten

(s. Kap. 2.5.1.). Das Max-Planck-Institut für molekulare Genetik / Berlin durchsuchte im

Rahmen dieser Arbeit die auf high-density Filtern gespottete PAC-Bibliothek mit

Hybridisierungssonden aus der SLS-Region.

3.3.1. Erstellung von Hybridisierungssonden zur PAC-Suche

Zwei der vier zum minimalen Contig gehörenden YACs (913-E-2 und 964-F-8) wurden

aufgereinigt als Template für eine Inter-Alu-PCR verwendet. Alu-Wiederholungen sind

hochrepetitive verstreute DNA-Sequenzen von etwa 280 bp Länge, und stellen mit einer

Kopienzahl von 750.000 die häufigste Sequenz im menschlichen Genom dar (Deininger,

1988). Sie haben eine unbekannte Funktion und sind in den transkriptionell aktivsten

Bereichen des Genoms enthalten (Korenberg und Rykowski, 1988). Da Alu-Repeats häufig in

Introns wiederzufinden sind, haben die mit Inter-Alu-PCR herausgesuchten PACs oft einen

sehr hohen informativen Gehalt.

Außerdem wurden 5 aufgereinigte DNA-Proben der ESTs WI-18649-5’, stSG 3629-3’,

A007F16-5’, SGC30075-3’ und stSG 1459-3’ als Hybridisierungssonden für die PAC-

Bibliothek benutzt.

Mit diesen Hybridisierungssonden erhielten wir folgende 22 PACs als positives Signal:

K0718 B1941 O2447 K0885 F0792 I06124

B09128 C07130 E12134 F06136 G22174 A11176

B11179 C12180 J03186 J07187 M23201 F04202

E19203 H09205 C23210 K0818

Ergebnisse 59

3.3.2. Rückkartierung der PAC-Klone auf das YAC-Contig

Im weiteren Verlauf der Herstellung einer kompletten physikalischen Karte der SLS-Region

mußte zunächst überprüft werden, ob die erhaltenen PACs auch wirklich aus dieser Region

abstammen. Sie wurden daher mittels PCR auf Positivität mit den STS-Markern des YAC-

Contigs untersucht. Von den 22 PACs zeigten 13 Klone ein positives PCR-Ergebnis mit

mindestens einem Marker, hiervon 6 PACs (B09128, C07130, A11176, C23210, K0818 und

B1941) mit einem einzigen Marker und die restlichen 7 Klone (E19203, H09205, F04202,

O2447, K0885, M23201 und F0792) mit zwei oder mehreren STS-Markern. Die Ergebnisse

der PAC-Kartierung werden in Abbildung 4 (Kap. 3.3.3.) dargestellt.

3.3.3. Lücken im PAC-Contig

13 PACs konnten im Sinne eines STS content mappings in der kritischen Region für SLS

innerhalb der flankierenden Marker D15S1030 und D15S1045 kartiert werden. Leider zeigte

kein PAC-Klon ein positives Ergebnis mit den flankierenden Markern. In dem erhaltenen

PAC-Contig gibt es insgesamt 4 Lücken und zwar zwischen C23210 und E19203, F04202

und O2447, O2447 und K0885 und zwischen M23201 und F0792. Die Reihenfolge und

Orientierung der im YAC-Contig kartierten STS-Marker konnte weiterhin im PAC-Contig

beibehalten werden, ohne daß dadurch Lücken innerhalb der PACs entstanden.

SHG

C-1

2481

CR

AB

P1

stSG

3398

WI 9

879

D15

S151

D15

S103

0

WI 1

8649

-3'

WI 1

8649

-5'

D15

S199

ATA2

8G05

D15

S104

6

WI 4

034

stSG

1459

-5'

stSG

1459

-3'

WI 1

0178

-5'

WI 1

0178

-3'

SGC

3007

5-3'

SGC

3007

5-5'

SHG

C-3

0089

D15

S979

stSG

362

9-5'

stSG

362

9-3'

SHG

C 1

5202

WI 1

5965

-5'

WI 1

5965

-3'

A007

F16-

5'

A007

F16-

3'

D15

S104

5

X124

33

WI 5

479

WI 7

222

ex.1

WI 7

222e

x.8b

D15

S202

D15

S116

A002

B10

stSG

347

9

KIAA

0051

stSG

151

stSG

405

7

stSG

28

cen qterCRABP1 Sigma 3B

IQGAP1

< 710 kb < 555 kb

trkC CRALBPPHPS1-2

PAC-Contig für die SLS-Region auf Chromosom 15q

Minimal YAC-Contig < 4,385 Mb< 1410 kb

< 1710 kb

B09128

C07130

A11176

C23210

E19203

H09205

F04202

K0818

O2447

F0792

B1941

M23201

K0885

Abbildung 4: PAC-Contig für die SLS-Region auf Chromosom 15qDie horizontale Skala führt alle Marker auf, welche durch PCR-Reaktionen mit allen PAC-Klonen auf Positivität getestet wurden. Die flankierenden Marker sind durch einen Rahmen markiert. Die telomerischeund centromerische (cen) Orientierung ist angegeben. Rechtecke symbolisieren Mikrosatellitenmarker, senkrechte Linien stehen für nicht-polymorphe STS-Marker und Dreiecke für ESTs. Die bekannten Gene sind in Kursivschrift unter den einzelnen ESTs angegeben. Im Diagramm werden die PACs als horizontale Balken dargestellt. Links an den Balken werden die Namen der PACs angeführt. Positive PCR Ergebnisse der einzelnen Markern mit den PACs werden durch die Symbole auf den PACs dargestellt. Unten im Diagramm wird nochmals die Ausdehnung der 4 YACs, die das minimale Contig (mit seiner Länge in Mb) bilden, gezeigt

Ergebnisse 61

3.4. Haplotypenanalyse mit 3 weiteren SLS-Familien

Die Haplotypenanalyse ist eine Methode zur Kartierung eines Krankheitsgens im Genom.

Hierbei werden die Genotypen von MS-Markern verschiedener Familien analysiert und im

Vergleich zu den anderen Familien graphisch dargestellt (Abbildung 5, Kap. 3.4.2.). Ein

Haplotyp ist eine Abfolge von Allelen benachbarter Mikrosatellitenmarker. Durch diese

Abfolge von MS-Markern kann man eine Kandidatenregion definieren.

Für die ursprünglich vorhandenen SLS-Familien wurde bei Vorarbeiten bereits eine

genomweite Haplotypenanalyse mit 257 Mikrosatellitenmarker aus der Généthon-Karte

durchgeführt (Wiedensohler 1998; Haller 1998). Bei den Berechnungen der LOD-Score

konnte damals kein signifikanter Wert von >3,0 erreicht werden, was ein Argument für das

Vorliegen einer Genolocusheterogenie ist.

Die interessanteste Region war auf Chromosom 15q lokalisiert. Diese wurde durch sehr eng

benachbarte MS-Marker weiter eingegrenzt, wodurch auch die flankierenden Marker

D15S1030 und D15S1045 bestimmt werden konnten. Der Marker D15S1046 ergab bei den

SLS-Early Familien einen LOD-Score von 2,545 bei theta 0,06 (Haffner, 1998).

3.4.1. Neue Familien mit Senior-Løken Syndrom

Die 3 im Laufe dieser Arbeit hinzugekommenen SLS-Familien wurden in zwei SLS-Early

und eine SLS-Late Form eingeteilt. Alle drei wurden uns freundlicherweise von Dr. C.

Antignac am Hôpital Necker Enfants Malades / Paris überlassen.

Familie SLS-335 ist eine Multiplexfamilie aus Saudi-Arabien mit fünf Kindern. Das zweite

Kind dieser Familie ist 1983 geboren und zeigt schon kurz nach der Geburt das klinische Bild

einer Leber’schen Amaurosis (LAC). Außerdem wurde schon früh bei diesem Kind die

Diagnose einer Nephronophthise (NPH) gestellt, und es wurde im Alter von 13 Jahren

nierentransplantiert. Das fünfte Kind dieser Familie ist 1994 geboren, und bald nach der

Geburt ist auch bei ihm eine LAC diagnostiziert worden. Es wurde als betroffen gewertet,

obwohl zum Zeitpunkt der Untersuchung bei diesem Kind keine Nephronophthise

festzustellen war. Eine Nierenbiopsie wurde nicht durchgeführt.

Ergebnisse 62

Familie SLS-353 ist eine konsanguine einfach betroffene Familie, welche auch das klinische

Bild einer LAC und einer NPH vorweist. Das dritte von vier Kinder zeigte eine chronische

Niereninsuffizienz im Alter von 6 Jahren. Bislang wurde keine Nierentransplantation

durchgeführt.

Familie SLS-319 ist ebenfalls eine konsanguine Familie mit drei Kindern. Die ersten beiden

Individuen wurden in Paris als SLS-Late diagnostiziert. Beim ersten Kind erfolgte im neunten

Lebensjahr eine Nierentransplantation und weist gleichzeitig eine Retinitis Pigmentosa auf.

Es gibt keine weiteren klinischen Angaben zu dieser Familie. (Siehe hierzu auch die

Familienstammbäume in Abbildung 2, Kap. 2.1.)

3.4.2. Haplotypenanalyse der Familien

Die Haplotypenanalyse der drei Familien wurde in Berlin im Max-Delbrück-Centrum für uns

durchgeführt. Für 7 betroffene und 13 nicht betroffene Individuen der oben erwähnten

Familien wurde ein sogenanntes “Total Genome Screening” mit 297 Mikrosatellitenmarker

aus dem MDC-Mikrosatelliten-Set. Diese sind auf der Généthon-Karte zurückzufinden.

In dieser Arbeit wurden die Ergebnisse der genomweiten Haplotypenanalyse der drei neuen

SLS-Familien in Bezug auf die schon vorhandenen Haplotypenanalysen der Familien 3, 14,

15, 16, 59, 64, 4, 18 und 159 graphisch dargestellt. Weder die als SLS-Early eingestuften

Familien 335 und 353, noch die SLS-Late Familie 319 sind in der kritischen Region auf

Chromosom 15q mit Kopplung vereinbar (siehe Abbildung 5).

Die Haplotypenanalyse ergab weitere interessante Regionen auf anderen Chromosomen, in

denen fünf Familien eine Kopplung zeigten. Diese Regionen sind auf den Chromosomen 1, 2,

3, 4,10 und 17 lokalisiert. Die Region auf Chromosom 15q zeigt eine Kopplung allein der

SLS-Early Familien. Im Gegensatz dazu sind die weiteren Regionen nicht auf die klinische

Einteilung der SLS-Familien in early und late begrenzt.

Diskussion 65

4. DISKUSSION 4.1. Chronologische Abfolge der Experimente

Vor Beginn dieser Arbeit wurde eine Haplotypenanalyse mit 16 neuen MS-Markern 14 SLS-

Familien aus der interessanten Region auf Chromosom 15q durchgeführt, um den gekoppelten

Bereich einzuengen. Damit konnte die gekoppelte Region auf eine genetische Distanz von 3,3

cM eingeengt werden, welche von den flankierenden Markern D15S1030 und D15S1045

eingegrenzt wird. Anhand der LOD-Score Berechnungen zeigte der Marker D15S1046 mit

2,545 bei theta 0,06 einen Hinweis auf eine Kopplung, jedoch kein signifikantes Ergebnis.

Da der Marker D15S1046 den höchsten LOD-Score im gesamten Genom aufweist, ist die

Region auf Chromosom 15 somit bislang die beste Kandidatenregion für SLS. Um in dieser

Region Kandidatengene zu identifizieren, mußte eine physikalische Karte hergestellt werden.

Zunächst wurde ein komplettes YAC-Contig hergestellt, wobei neue STS-Marker, vor allem

ESTs, auf das Contig kartiert werden konnten. Durch die Kartierung der 5’-Enden der ESTs

konnte die Markerreihenfolge sowie ihre Orientierung auf dem Chromosom festgelegt

werden. Anschließend wurde mit der YAC-DNA eine PAC-Bibliothek durchsucht, um PACs

aus der kritischen Region zu generieren und eine PAC-Karte mit überlappenden Klonen zu

bekommen. Dies war notwendig, da PACs besser zur Sequenzierung und zur Isolierung von

exprimierten Sequenzen geeignet sind. Erst gegen Ende der Untersuchungen stand das DNA-

Material der Familien SLS-335, SLS-353 und SLS-319 zur Verfügung. Mit diesen Proben

konnte eine Haplotypenanalyse durchgeführt werden. Anschließend konnten diese Ergebnisse

mit den Haplotypenanalysen der schon untersuchten SLS-Familien (Wiedensohler 1998;

Haller 1998) verglichen werden, um weitere Kandidatenregionen zu bestimmen.

4.2. Erstellung einer physikalischen Karte in der SLS-Region

Das menschliche Genom besteht nur zu 3 % aus codierender DNA-Sequenz. Um gezielt

transkribierte Sequenzen zu finden, hat man eine Reihe von Kartierungsverfahren entwickelt,

unter anderem die physikalische Kartierung. Sie beruht auf der Herstellung von in Vektoren

klonierten DNA-Fragmenten, die sich überlappen. Durch Kartierung von STS-Markern im

Sinne eines STS-Content-Mappings können genaue Angaben von Distanzen zwischen

Diskussion 66

Markern in Basenpaar gemacht werden. Die dabei vorkommenden Schwierigkeiten werden

im Folgenden diskutiert.

4.2.1. Interpretation der Ergebnisse des YAC-Contigs für SLS

Diese Arbeit stellt ein komplettes YAC-Contig in der minimalen genetischen Region des

Senior-Løken Syndroms vor. Ein STS-Content-Mapping von insgesamt 39 Markern wurde

mit 25 YAC-Klonen dieser Region durchgeführt. Das Contig dient zur Bestimmung der

Reihenfolge der kartierten Marker sowie einer maximalen physikalische Distanz von

4,385 Mb zwischen den flankierenden Mikrosatellitenmarkern D15S1030 und D15S1045.

Die in die physikalische Kartierung einbezogenen 25 YACs zeigten eine durchschnittliche

Insertlänge von 1105 kb. Von den 25 YACs zeigten 18 Klone ein positives Ergebnis mit

mindestens einem STS-Marker. Die durchschnittliche Tiefe des Contigs liegt bei 3,17 YAC-

Klonen/STS mit einem Maximum von 6 Klonen in der Region für die Marker ATA28G05

und D15S1046. Die maximale physikalische Distanz des Contigs zwischen den flankierenden

Markern wurde anhand des Kriteriums des kürzesten mehrfach positiven Klons festgelegt. Sie

wurde für das SLS Contig von den folgenden 4 YAC-Klonen bestimmt: 913-E-2, 964-F-8,

793-B-4 und 966-A-2. Sie Summe der Länge dieser vier YACs ergibt eine maximale

physikalische Distanz von 4385 kb. Diese physikalische Distanz entspricht einer genetischen

Distanz von 3,3 cM zwischen den MS-Markern D15S1030 und D15S1045.

4.2.2. Vergleich zum Whitehead-Contig

Als Grundlage für diese Arbeit diente das Whitehead YAC-Contig WC15.3 (singly linked)

welches 28 YAC-Klone aus der CEPH-YAC-Genbank und 13 STS-Marker enthält. Im

Rahmen dieser Arbeit sollten die Markerdichte der YAC-Karte erhöht werden, indem mehrere

STS-Marker auf das Contig kartiert wurden. Abbildung 6 zeigt zusammenfassend das

Whitehead-Contig in der kritischen Region für SLS auf Chromosom 15q22-15q26. Einige der

Whitehead Angaben beruhten auf zweifelhafte Positivität von Markern mit den getesteten

YACs. Viele YAC-Klone zeigten ein positives Ergebnis mit nur einem einzigen Marker. Es

gab keine Lücken im Contig, wobei die Überlappung der Klone 964-F-8 und 966-A-2 mit

Diskussion 67

dem Marker GATA88C02 zweifelhaft war. Diese Überlappung konnte durch Experimente in

der Abreitsgruppe nicht bestätigt werden (Haffner, 1998).

YACs WI-9879

D15S199

ATA28G05

WI-10178

WI-4034

GATA88C0

WI-7222

D15S202

D15S116

944-F-11 917-E-8 826-A-8 746-B-11 957-B-4 913-E-2 830-E-8 921-A-10 802-B-4 709-B-4 964-F-8 851-E-2 966-A-2 793-B-4 765-H-1 759-H-8 747-A-12 739-D-8 876-A-1 805-F-5 781-G-3 664-F-8 899-F-1 881-C-4 883-C-4 Abbildung 6: Das Whitehead YAC-Contig WC 15.3 singly linked. Die oberste Zeile gibt die untersuchten STS-Marker an, die linke Spalte führt die in der Region kartierten YACs auf. Legende: verifizierter YAC/STS Treffer von anderen Laboren verifizierter Treffer unklarer YAC/STS Treffer

4.2.3. Schwierigkeiten der YAC-Kartierung

YACs sind Hefezellen, die ein langes DNA-Fragment von 200 kb bis 2 Mb einklonieren

können (Schlessinger, 1990). Sie haben gegenüber anderen Vektoren den Vorteil, daß sie

problemlos eukaryotische Sequenzen mit repetitiven Elementen (z.B. Alu-Repeats) vermehren

können. Ihr Nachteil ist jedoch, daß sie häufig (in 40-50% der Fälle) Insertchimären enthalten,

also zwei oder mehrere Fragmente von nicht zusammenhängenden Stellen des Genoms

beinhalten (Cohen et al., 1993). Es können diskontinuierliche Segmente eines einzigen

Chromosoms sein, oder auch von unterschiedlichen Chromosomen abstammen. Weiterhin

können Insertchimäre auch durch homologe Rekombinationen in den YACs selbst entstehen.

Die langen DNA-Inserts der YACs enthalten zahlreiche Alu-Repeats, welche sich aneinander

lagern können und somit Rekombinationen begünstigen (Green et al., 1991). Homologe

Diskussion 68

Rekombinationen können auch zu Deletionen oder kompletten Insertverlusten in den YACs

führen. Eine falsche Lagerung bei zu hohen Temperaturen sowie eine zu lange Lagerung kann

solche Rekombinationen und somit falsche Ergebnisse der physikalischen Kartierung

begünstigen. Die Chimerität der YACs kann durch die Fluoreszenz in-situ Hybridisierung

(FISH) ausgeschlossen werden, wodurch auch die zytogenetische Lokalisation der Klone

festgelegt werden kann (Wirth et al., 1999).

Ein weiterer Nachteil der YAC-Klone ist, daß sie zu große Inserts haben, um problemlos

sequenziert werden zu können (Chumakov et al., 1995). Hierfür eignet sich besser ein PAC-

Contig.

4.2.4. Probematik bei der Erstellung des kompletten YAC-Contigs für SLS

Die ausgewählten 25 YACs zeigten eindeutige Ergebnisse bei ihrer Untersuchung. Folgende 7

YAC-Klone konnten auf dem Contig nicht kartiert werden, da mit keinem der untersuchten

STS-Marker ein positives Ergebnis erzielt werden konnte. Es handelte sich um die YACs

830-E-8, 805-F-5, 781-G-3, 664-F-8, 899-F-1, 881-C-4, 883-C-4. Im Whitehead-Contig sind

diese YACs mit nur einen einzigen STS positiv, außer den YACs 830-E-8 und 805-F-5 auf

welchen drei bzw. zwei STS kartiert waren. Wir konnten diese Daten auch mit mehreren

unabhängigen PCR-Ansätzen nicht bestätigen. Ursächlich dafür könnte eventuell, wie oben

erwähnt, ein Verlust des YAC-Inserts bereits beim bestellten Klon sein, oder ein fehlerhaftes

Ergebnis der Whitehead-Karte.

Um ein möglichst korrektes STS-Content-Mapping zu erreichen, wurden die Experimente

mindestens einmal wiederholt. Wenn widersprüchige Ergebnisse erzielt wurden, wurde das

Experiment mehrfach wiederholt. Drei YAC-Klone zeigten hierbei problematische

Ergebnisse, welche hier diskutiert werden sollen.

Entsprechend der konstruierten Karte (Abbildung 3, Kap. 3.2.4) zeigt der YAC-Klon 826-A-8

eine Lücke zwischen den STS-Markern WI 9879 und WI 18649. Mit diesen zwei Markern

erhielten wir vier positive YAC/STS Treffer und ein negatives Ergebnis, also eine 80%-ige

Positivität. Die dazwischen liegenden MS-Markern D15S151 und D15S1030 konnten auch

nach mehrmaligen Versuchen nicht auf diesem YAC zurückkartiert werden. Man könnte

annehmen, daß der Marker WI 9879 distal von D15S1030 lokalisiert sein könnte und somit

Diskussion 69

innerhalb der flankierenden Markern liegt. Dies ist jedoch unwahrscheinlich, weil dadurch

zusätzliche Lücken innerhalb der YACs 957-B-4 und 913-E-2 entstehen würden. Außerdem

konnte WI 9879 auf den YACs 944-F-11 und 917-E-8 zurückkartiert werden. Eine Deletion

innerhalb des YAC-Klons 826-A-8 könnte die entstandene Lücke erklären. Hierfür spricht

auch die Größe des Inserts dieses Klons von 1710 kb, welche Rekombinationen innerhalb

eines YACs begünstigt.

Auch YAC-Klon 746-B-11 zeigt eine Lücke in der physikalischen Karte (Abbildung 3).

Schwierigkeiten ergeben sich schon aus der unklaren Länge dieses Klons, welche zwischen

720 und 1510 kb angegeben ist. Die ESTs WI 18649-3’ und WI 18649-5’ konnten auf dem

YAC nicht zurückkartiert werden. Der MS-Marker D15S1030 zeigt jedoch nur einen

schwachen STS/YAC Treffer von 33 %, was die Existenz dieser Lücke innerhalb des YAC-

Klons weniger wahrscheinlich macht.

Eine weitere Lücke in der Karte zeigt YAC 964-F-8. Dieser YAC gehört zum Minimal

Contig und wird in der Berechnung der maximalen physikalischen Distanz einbezogen. Die

Lücke befindet sich zwischen dem 5’-Ende des ESTs WI 10178 und dem 5’-Ende von

SGC30075. Die ESTs WI 10178-3’ und SGC30075-3’ konnten auch nach mehrmaligen

Versuchen nicht auf den YAC kartiert werden. Die Lücke des YACs befindet sich innerhalb

zweier Gene, die in unterschiedlicher Richtung auf dem Chromosom 15 lokalisiert sind.

Wichtig ist jedoch, daß die Marker SHGC30089 und D15S979 mit einer 100%igen

Wahrscheinlichkeit auf dem YAC zurückkartieren und somit die Überlappung der YACs

913-E-2 und 964-F-8 nicht beeinträchtigt ist.

4.2.5. Orientierung der kartierten ESTs

Durch das STS-Content-Mapping konnte die Reihenfolge der schon bekannten Gene sowie

ihre Orientierung auf dem Chromosom 15 festgelegt werden:

cen - CRABP1 - trkC - PHPS1/2 - CRALBP - Sigma3B - IQGAP1 - qter.

Die Kartierung der 3’- und 5’-Enden der ESTs auf dem Contig diente zur Orientierung der

Sequenzen dieser Gene auf dem Chromosom. Von den 9 innerhalb der flankierenden Markern

kartierten 3’-ESTs konnten nur sieben 5’-Enden der EST-Cluster generiert werden. Folgende

drei ESTs konnten definitiv orientiert werden: WI-10178, SGC30075 und A007F16. Die

Diskussion 70

anderen ESTs: WI 18649, stSG 1459, stSG 3629 und WI 15965 zeigten sowohl für 3’- als

auch für 5’-Sequenzen Positivität mit den gleichen YACs, und erlauben somit keine

Orientierung. Eine graphische Darstellung dieser Ergebnisse ist der Abbildung 3 (Kap. 3.2.4.)

zu entnehmen.

4.2.6. Einbeziehung der betroffenen Familien in das YAC-Contig

Bei der Erstellung des YAC-Contigs wurde gleichzeitig zur YAC-DNA auch die genomische

DNA der betroffenen Individuen der SLS-Early Familien: SLS-3, SLS-15, SLS-16, SLS-59

und SLS-64 mit den Markern des Contigs getestet. Dabei sollte überprüft werden, ob es bei

diesen Kandidaten eine homozygote Deletion für den untersuchten Marker gibt, welche ein

wichtiger Hinweis für die Gensuche sein würde. Es konnte jedoch keine solche Deletion

gefunden werden.

4.2.7. Erstellung mehrerer PAC-Contigs in der SLS-Region

Ein Contig aus YACs gewährleistet eine Karte mit einer Genauigkeit von ugf. 1000 kb. Gene

haben jedoch eine Größe von 0,1 bis 200 kb, weswegen der Aufbau eines weiteren

genomischen Contigs aus PAC-Klonen, die eine Insertlänge von ugf. 150 kb haben,

unabdingbar ist. Im Gegensatz zu YACs erlauben PACs die direkte Sequenzierung ihrer

Enden, welche dazu beiträgt, neue STS-Marker zu generieren und die ganze Region im Sinne

eines sogenannten “chromosome walking” vollständig zu klonieren.

Im weiteren Verlauf dieser Arbeit konnte ein integriertes YAC/PAC-Contig mit 39 STS-

Markern und 22 PAC-Klonen errichtet werden. Die 22 identifizierten PACs wurden durch

Screening einer PAC-Genbank des Max-Planck-Instituts für Molekularbiologie in Berlin mit

5 auf dem YAC-Contig kartierten ESTs generiert. Die ESTs WI 18649-5’, stSG1459-3’,

SGC30075-3’, stSG3629-3’ und A007F16-5’ spannen den ganzen Bereich des YAC-Contigs.

Bis auf den Marker WI18649-5’ konnten für alle ESTs PACs isoliert und anschließend auf

den PACs zurückkartiert werden. Außerdem wurden Hybridisierungssonden durch Inter-Alu-

PCR der zum minimal Contig gehörenden YACs 913-E-2 und 964-F-8 hergestellt. Da

ungefähr alle 4 kb mit einer Alu-Wiederholung zu rechnen ist, und sie häufig in Bereich von

Diskussion 71

Genen wiederzufinden sind, haben die damit gewonnenen PACs einen besonders hohen

informativen Gehalt (siehe Kap. 3.3.1).

4.2.8. Interpretation der Ergebnisse der PAC-Karte für SLS

Von den 22 isolierten PACs konnten 13 Klone auf das YAC-Contig zurückkartiert werden. 7

PAC-Klone konnten wahrscheinlich durch Hybridisierung mit den EST-Sequenzen gewonnen

werden, denn die oben aufgezählten ESTs kartierten auf diese Klone zurück. Die anderen 6

Klone zeigten positive Ergebnisse mit weiteren im YAC-Contig kartierten STS-Markern, und

wurden wahrscheinlich durch die YAC-Sonden generiert.

Weitere 9 PAC-Klone zeigten keine STS-Treffer. Diese nicht auf dem Contig

zurückkartierten PACs könnten YAC-Fragmente der SLS-Region darstellen, für die es noch

keine STS-Marker gibt. Sie könnten eventuell zu einem späteren Zeitpunkt, nach Generierung

neuer STS-Marker, im YAC/PAC-Contig kartiert werden. Eine weitere Möglichkeit wäre,

daß diese nichtkartierten PACs mit Sonden aus den chimärischen Anteilen der YAC-Klone

generiert wurden, und somit nicht aus der SLS-Region auf Chromosom 15q abstammen.

Im Gegensatz zum YAC-Contig gibt es vier Lücken im PAC-Contig, wobei eine der Lücken

sich zwischen dem 3’- und dem 5’-Ende des ESTs SGC30075 befindet. Die auf den PACs

kartierten STS-Markern zeigten die gleiche Reihenfolge und Orientierung wie im YAC-

Contig. Außerdem sind bei der Kartierung der Marker keine Lücken innerhalb der PAC-

Klone entstanden. PACs sind im Gegensatz zu YACs nicht chimärisch und begünstigen keine

Rekombinationen. Somit würden Lücken innerhalb PAC-Klonen eher auf fehlerhafte

Anordnung der Marker hindeuten.

Somit konnte unter anderem die Zuverlässigkeit des YAC-Contigs erwiesen werden, da die

durch das YAC-Contig erstellte Reihenfolge und Orientierung der Marker weiterhin im PAC-

Contig beibehalten werden konnte.

Diskussion 72

4.3. Haplotypenanalyse der SLS-Familien

Das Senior-Løken Syndrom ist eine sehr seltene Erkrankung, und somit ist auch die Suche

nach einer genügend großen Anzahl von Familien für eine genetische Kartierung erschwert.

Für die genetische Kartierung und die Eingrenzung einer Kandidatenregion ist die Auswahl

und die klinische Einteilung der SLS-Familien sehr wichtig.

4.3.1. Problematik der klinischen Einteilung der SLS-Familien

In der vorliegenden Arbeit wurden entweder Multiplexfamilien oder konsanguine Familien

bei der Haplotypenanalyse berücksichtigt. Multiplexfamilien sind Familien in denen mehrere

Geschwisterkinder von der Erkrankung betroffen sind. Sie haben eine höhere Aussagekraft im

Vergleich zu einfach betroffenen Familien, dadurch daß sie das familiäre Auftreten der

Erkrankung wahrscheinlicher machen. Bei einfach betroffenen Familien könnte auch eine

Spontanmutation einen Gendefekt und somit SLS verursachen. Bei konsanguinen Familien

kann der gleiche Haplotyp einmal von der Mutter und einmal vom Vater vererbt werden,

wodurch eine homozygote Deletion des autosomal-rezessiv vererbten SLS-Gens verursacht

werden könnte.

Die Stammbäume und wichtige klinischen Daten der untersuchten Familien sind in

Abbildung 2, Kap. 2.1., dargestellt. Die Zuordnung der Familien in SLS-Early und SLS-Late

erfolgte schon früher in anderen Dissertationen (Haller, 1997; Wiedensohler, 1997; Haffner,

1998; Besenthal, 1999). Die klinischen Daten bezüglich dieser Einteilung wurden da schon

kritisch betrachtet und werden in Abbildung 2 zusammengefaßt. Die neuen SLS-Familien

319, 335 und 353, welche im Max-Delbrück-Zentrum in Berlin einer Haplotypenanalyse

unterzogen wurden, sind bereits im Kap. 3.4.2. näher vorgestellt worden.

4.3.2. Generierung von weiteren Kandidatenregionen

Die Haplotypenanalyse der SLS-Familien dient durch die graphische Darstellung von

Rekombinationsereignissen zur Bestimmung von Kandidatenregionen für das Senior-Løken

Syndrom.

Diskussion 73

Durch die Einbeziehung der neuen SLS-Familien sollte die Kandidatenregion auf Chromosom

15q noch mehr eingegrenzt werden. Dies war nicht der Fall, denn sowohl die SLS-Early

Familien 335 und 353 als auch die SLS-Late Familie 319 zeigten keine Kopplung in diesem

Bereich.

Im Max-Delbrück-Zentrum in Berlin erfolgte ein “Total Genome Screen” der 3 neuen SLS-

Familien mit 297 polymorphen Markern aus dem MDC-Mikrosatelliten-Set. Die Ergebnisse

dieser Untersuchung wurden anschließend in dieser Arbeit in Bezug zu den schon bekannten

Ergebnissen der Haplotypenuntersuchungen der SLS-Early Familien 3, 14, 15, 16, 59 und 64

sowie der SLS-Late Familien 4, 18 und 159 (Haller, 1997; Wiedensohler, 1997) gestellt. Sie

werden in Abbildung 5, Kap. 3.4.2., wiedergegeben. Die Tabelle 9 stellt die flankierenden

Marker der wichtigsten Kopplungsregionen, in denen mindestens 4 Familien Kopplung

zeigen, zusammen.

Chr. Kopplungsbereich Gekoppelte Familien Bemerkungen

1 D1S468-D1S160 D1S228

14, 16, 335, 353, 18 14, 16, 335, 18

Fam. 335 zeigt Kopplung aber keine Homozygotie.

2 D2S286 D2S139

15, 59, 64, 4, 319 59, 64, 4, 319

Fam. 64 wurde unzureichend untersucht.

3 D3S1292-D3S1309 D3S1569 SSTMfd4

14, 59, 64, 353, 319 14, 59, 64, 319 14, 15, 59, 64, 4, 319

Fam. 319 zeigt Kopplung aber keine Homozygotie. Dieser Marker ist nicht voll informativ; Fam. 319 ist jedoch gekoppelt und homozygot.

4 D4S415-D4S408 D4S243-D4S1595

14, 15, 64, 4, 159 16, 64, 353, 159

Fam. 159 ist in beiden Bereichen fraglich gekoppelt.

10 D10S191 D10S213

14, 64, 353, 159 15, 59, 64, 159

Fam. 64 wurde unzureichend untersucht.

15 D15S1030-D15S1045 3, 15, 16, 59, 64 Die neuen SLS-Familien sind nicht gekoppelt.

16 D16S515 14, 16, 59, 319 17 D17S953-D17S798

D17S787 D17S784

14, 59, 18, 159 14, 59, 18, 159 14, 59, 64, 353, 18, 159

Tabelle 9: Kandidatenregionen der SLS-Familien auf 22 Chromosomen.

Die Kopplungsbereiche sowie einzelne gekoppelte Marker sind hier aufgeführt. Unter “gekoppelte Familien” sind entsprechend der Abbildung 5 (Kap. 3.4.2.) Multiplex- und konsanguine Familien aufgeführt. Fett gedruckte Zahlen entsprechen den “early-onset” SLS-Familien, normal gedruckte Zahlen den “late-onset” SLS-Familien. Chr. steht für Chromosom.

Diskussion 74

Bei der Haplotypenanalyse wurden Regionen berücksichtigt, in denen mindestens 4 Familien

Kopplung zeigen (s. Abb. 5, Kap. 3.4.2.). Es gibt insgesamt 6 Kopplungsbereiche und 10

gekoppelte STS-Marker auf 8 Chromosomen, die dieses Kriterium erfüllen. Die Region auf

Chromosom 15q ist die einzige Kandidatenregion mit nur “early-onset” Familien. Sie konnte

von den anderen SLS-Early Familien 59, 335 und 353 nicht bestätigt werden, da diese

Familien in dieser Region keine Kopplung zeigten. Weitere interessante Kandidatenregionen

befinden sich auf den Chromosomen 1, 3 und 4. Die früher durchgeführte Haplotypenanalyse

ergab auf Chromosom 3 für den MS-Marker SSTMfd4 einen LOD-Score von 2,245.

Allerdings war dieser Marker nur bei zwei Familien voll informativ (Haller 1998). Die neue

Familie 319 zeigte für diesen Marker sowohl Kopplung als auch Homozygotie, was umso

mehr diese Region auf Chromosom 3 als eine mögliche Kandidatenregion unterstützt.

Außerdem zeigen mittlerweile 6 Familien eine Kopplung für diesen Marker.

4.4. Molekulargenetik der Retinitis Pigmentosa

Die Retinitis pigmentosa zeigt eine große Vielfalt an klinischen Erscheinungsformen mit

einer großen Variabilität des Ausbruchs der Erkrankung sowie unterschiedlichen

Ausprägungen der Augenhintergrundveränderungen. Sie zeigt außerdem eine große

molekulargenetische Heterogenität. Molekulargenetische Analysen haben ergeben, daß diese

genetische Erkrankung sehr komplex vererbt werden kann, und zwar:

• autosomal dominant:

Typ 1: Ist eine diffuse Form charakterisiert durch den frühzeitigen Ausbruch der

Nachtblindheit (frühzeitiger Befall der Stäbchen).

Typ 2: Ist eine regionale Form der RP mit gleichzeitigem Befall von Stäbchen und

Zapfen dieser “skotomalen” Region.

Typ 3 (Fishman): Sektorielle Form der RP

Wie bei jeder autosomal dominanten Erkrankung gibt es auch hier unterschiedliche

Penetranzmuster.

• autosomal rezessiv:

Typischerweise beginnt diese Form der RP in der zweiten Lebensdekade und hat eine

schnellere und schlimmere Evolution als die dominante Form der RP. Außerdem findet

man den rezessiven Vererbungsmodus in den meisten systemischen Formen der RP.

Diskussion 75

• X-chromosomal:

Diese Vererbungsform ist selten und zeigt einen sehr schweren Verlauf. Die

Nachtblindheit tretet schon im Alter von 10 Jahren auf, wobei mit 25 die Patienten blind

sind. Die Trägerinnen können Fundus- sowie ERG-Veränderungen vorweisen, zeigen

jedoch keine Sehschwierigkeiten.

• Y-chomosomal:

Über diese neu entdeckte Vererbungsform gibt es noch wenige klinische Daten.

• maternal (Mitochondrial):

Diese Form zeigt hauptsächlich Veränderungen des Pigmentepithels und weniger der

Photorezeptoren. Hierzu gehört zum Beispiel eine systemische Form der RP und zwar

das Kearns-Sayre Syndrom.

4.4.1. Bereits identifizierte Gene und Genloci für Retinitis Pigmentosa

Die Retinitis pigmentosa illustriert sehr gut die genetische Vielfalt, dadurch daß Mutationen

in verschiedenen Genen den gleichen Phänotyp zeigen können. Die schon identifizierten Gene

betreffen hauptsächlich Proteine, welche im Sehvorgang eine Rolle spielen, wie zum Beispiel

Rhodopsin, die ß-Untereinheit der Phosphodiesterase-Guanylat-Cyclase, oder auch

Strukturproteine des Photorezeptors wie ROM-1 und Peripherine.

Alle für Retinitis pigmentosa identifizierten Gene stellen funktionelle Kandidatengene

(s. Kap. 4.5.1.) des Senior-Løken Syndroms dar. Bisher wurden ca. 40 Gene bzw. Genloci für

RP gefunden. Tabelle 10 stellt bislang publizierte Gene sowie ihren Vererbungsmodus

zusammen.

Genname Lokalisation Proteinbezeichnung Vererbung Referenz

RP 1 8q11-q13 Oxygen-regulated Photorezeptorprotein 1

AD Blanton et al., 1991

RHO (RP 4) 3q21-q24 Rhodopsin OPSD

AD Dryja et al., 1990 Nathans , 1984

RDS (RP 7) 6p21.1-cen Peripherin (Retinal degeneration slow protein)

AD Farrar et al., 1991 Kajiwara., 1994

RP 9 7p15.1-p13 AD Inglehearn, 1993

RP 10 7q31-q35 AD Jordan, 1993

RP 11 19q13.4 AD Vithana, 1998

Diskussion 76


RP 13 17p13.3 AD Greenberg, 1994

RP 17 17q22-q24 AD Bardien, 1995

RP 18 1p13-q23 AD Xu et al., 1996

ROM1 11q13 Retinal outer segment membrane protein1-ROSP1

AD Bascom et al., 1992

PDE6B 4p16.3 Phosphodiesterase 6B, cGMP-specific, rod, beta; kongenitale Nachtblindheit

AD Bateman JB et al. 1992

NRL 14q11.1-q11.2 Neural retina leucine zipper AD Bessant et al., 1999RP 22 16p12.1-p12.3 AR Finckh et al., 1998 RP 25 6q14-q21 AR Ruiz et al., 1998 TULP1 (RP 14)

6p21.3 Tubby-like protein 1 AR Banerjee, 1998 Hagstrom, 1998

RP 26 2q31-q33 AR Bayes et al., 1998 RP 28 2p15-p11 AR Gu et al., 1999 RP 29 4q32-q34 AR Santangelo, 1991 RLBP1 15q26 Retinaldehyde-binding

protein 1 (CRALBP1) AR Maw et al., 1997

Sparkes et al., 1992RGR 10q23 Retinal G protein coupled

receptor (RGR) AR Chen et al., 1996

PDE6A 5q31.2-q34 Phosphodiesterase-6A, cGMP-specific, rod, alpha

AR Pittler et al., 1990

CRX 19q13.3 Cone-rod homeobox (Leber’sche Amausose 3/ LCA 3)

AR, AD Freund et al., 1998

ABCA4 (RP 19)

1p22.1-p21 ATP-binding cassette, subfamilyA (ABC1)

AR Nasonkin, 1998

RPE65 (RP 20) (LCA 2)

1p31 Retinal pigment epithelium-specific Protein (65 kD) (LCA 2)

AR Gu et al., 1997 Marlhens, 1997

LCA 1 17p13 Retinal guanylate cyclase ? Camuzat, 1995 Perrault, 1996

AIPL1 (LCA 4)

17p13.1 Arylhydrocarbon Rezeptor –interacting Protein

Sohocki, 2000

CRB1 (RP 12)

1q31-q32.1 Crumbs (Drosophila) homolog 1

AR den Hollander et al., 1999

RPGRIP1 (RP 16)

14q11 Retinitis pigmentosa GTPase regulator interacting protein 1

? Roepman, 2000

NR2E3 15q22.3-q24 Photoreceptor-specific nuclear receptor (RP-late)

? Kobayashi, 1999

CNGA1 4p12-cen Cyclic nuceotid gated channel alpha 1

AR Griffin et al., 1993

CNGB1 16q13 Cyclic nuceotid gated channel beta 1

AR Ardell et al., 1996

Diskussion 77


RPGR (RP 3)

Xp21.1 Retinitis pigmentosa GTPase regulator

X-Chr. Meindl, 1996

RP 2 Xp11.4-p11.21

X-Chr. Schwahn, 1998

RP 24 Xq26-q27 X-Chr. Gieser et al., 1998 RP 15 Xp22.13-

p22.11 X-Chr. McGuire, 1995

RP 6 Xp21.3-p21.2 X-Chr. Musarella, 1990 SRPX Xp21.1 Sushi-repeat-containing

protein (ETX1) X-Chr. Meindl et al., 1995

RP 23 X-- X-Chr. Hardcastle, 2000 COD1 Xp11.4 Cone dystrophy 1 (PCDX) X-Chr. Hardcastle, 1997 RPY Y-- RP, Y-linked Y-Chr. Zhao et al.,1995 Tabelle 10: Bekannte Gene und Genloci der Retinitis pigmentosa. Die Einteilung der Genaufzählung erfolgt nach dem Vererbungsmodus in autosomal dominant (AD), autosomal rezessiv (AR), X- und Y-chromosomal. Die linke Spalte führt den Namen der Gene auf, dann folgt ihre zytogenetische Lokalisation. Wenn ein Proteinname bekannt ist, wird dieses in der mittleren Spalte vorgestellt. Die letzte Spalte führt die wichtigsten Publikationen dieser Gene auf.

4.4.2. Syndromale Formen der Retinitis Pigmentosa

Die syndromalen Formen der Retinitis pigmentosa haben neben einer tapetoretinalen

Degeneration weitere systemische Anomalien assoziiert und definieren somit ein Syndrom.

Das Senior-Løken Syndrom ist ein Beispiel dafür. Hierzu gehören aber auch andere

Erkrankungen, welche hauptsächlich autosomal-rezessiv vererbt werden.

Das Usher-Syndrom ist die Assoziation einer Retinitis pigmentosa zu einer neurosensoriellen

Taubheit. Es gibt drei Formen des Usher-Syndroms, welche alle autosomal-rezessiv vererbt

werden. Bisher sind folgende 10 Genorte für das Usher-Syndrom gefunden worden.

Genname Lokalisation Proteinbezeichnung Referenz

Usher Syndrom Typ 1A 14q32 Echinoderm microtubule assoc. protein

Kaplan et al., 1991Eudy et al., 1997

Usher Syndrom Typ 1B 11q13.5 Myosine VII A Weil et al., 1997 Usher Syndrom Typ 1C 11p15.2-p14 Bitner-G, 2000 Usher Syndrom Typ 1D 10q21-q22 CDH23 Wayne et al., 1996 Usher Syndrom Typ 1E 21q21 Chaib et al., 1997 Usher Syndrom Typ 1F 10q21-q22 Wayne et al., 1997 Usher Syndrom Typ 2A 1q41 Estrogen-rel. receptor γ Eudy et al., 1998 Usher Syndrom Typ 2B 3p24.2-p23 Hmani M, 1999 Usher Syndrom Typ 2C 5q14-q21 Pieke-Dahl, 2000 Usher Syndrom Typ 3A 3q21-q25 Sankila et al., 1995Tabelle 11: Bereits bekannte Genloci des Usher Syndroms.

Diskussion 78

Das Bardet-Biedl-Syndrom zeigt folgende charakteristische Merkmale: tapetoretinale

Degeneration (in 95% der Fälle), fasziotrukuläre Adipositas (95%), postaxiale Polydaktilie

(80%), geistige Behinderung (70%), Hypogonadismus (50%) und Nierenfunktionsstörungen

(40%). Die okkuläre Symptomatik fängt meistens in der Kindheit an und zeigt

unterschiedliche Formen der Retinitis pigmentosa. Auch dieses Syndrom zeigt eine

Genlokusheterogenie. Die schon bekannten Genorte werden in Tabelle 12 aufgeführt.

Differentialdiagnostisch sollte das Bardet-Biedl-Syndrom vom viel seltener vorkommenden

Laurence-Moon-Syndrom und vom Alström-Syndrom unterschieden werden.

Genname Lokalisation Vererbung Referenz

Bardet-Biedl-Sd. (BBS) 1 11q13 AR Beales et al., 1997 BBS 2 16p12.1-p12.3 AR Wright et al., 1995 BBS 3 3p13-p12 AR Ghadami, 2000 BBS 4 15q22.3-q23 AR Carmi et al., 1995 BBS 5 2q31 AR Woods et al., 1999 BBS 6/MKKS 20p12 AR Slavotinek, 2000 Tabelle 12: Gene und bekannte Genloci des Bardet-Biedl-Syndroms. Das Laurence-Moon-Syndrom zeigt das klinische Bild einer Retinitis pigmentosa assoziiert

einem Hypogonadismus, einer geistigen Behinderung, einer Adipositas und einer spastischen

Paraparese. Hierfür ist noch kein Genlokus bekannt.

Das Alström-Syndrom ist gekennzeichnet durch eine progrediente Innenohrschwerhörigkeit,

Adipositas, insulinabhängigen Diabetes mellitus, Niereninsuffizienz und eine früh einsetzende

Retinitis pigmentosa. Dieses Syndrom wurde auf Chromosom 2p13 bereits lokalisiert (Collin

et al., 1997).

Das Cockayne-Syndrom ist eine weitere systemische Erkrankung, welche eine Retinitis

pigmentosa mit Minderwuchs, Muskelatrophien, Mikroenzephalie mit geistiger Behinderung,

Taubheit, Ohrmuscheldysplasie und einer erhöhten Sensibilität der Haut für

Ultraviolettstrahlen assoziiert. Dieser autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung liegt eine

DNA-Reparationsanomalie zugrunde. Für das Cockayne-Syndrom sind bereits 4 Genloci

bekannt, welche in Tabelle 13 zusammengefaßt werden.

Genname Lokalisation Proteinbezeichnung Referenz

CKN1 Chr. 5 CSA Henning, 1995 ERCC5 13q33 XPGC Samec et al., 1994 Ercc5 9q22.3 XPA Henning et al., 1990 ERCC6 10q11 CSB Hoeijmakers et al., 1989 Tabelle 13: Gene und Genorte sowie Proteinbezeichnungen des Cockayne-Syndroms.

Diskussion 79

Das Kearns-Sayre-Syndrom zeigt einen mitochondrialen Vererbungsmodus und präsentiert

folgende klinische Symptomatik: externe Ophthalmoplegie mit Ptosis, Myopathie,

Erregungsleitungsstörungen des Herzens mit Kardiomegalie und Herzinsuffizienz sowie

Retinitis pigmentosa (Lestienne und Ponsot, 1988).

Das Joubert-Syndrom ist eine weitere autosomal rezessive erbliche Erkrankung mit Aplasie

des Vermis cerebelli und Ataxie, Tachydyspnoe, Entwicklungsretardierung. Der Typ B ist

assoziiert mit Retinitis pigmentosa und Nephronophthise. Ein Genort hierfür wurde schon auf

Chromosom 9q34.3 veröffentlicht (Saar et al., 1999).

4.4.3. Metabolische Erkrankungen assoziiert mit einer RP

Es gibt auch eine Reihe metabolischer Erkrankungen, welche neben Retinitis pigmentosa

zahlreiche Symptome zeigen können. Die wichtigsten dieser Erkrankungen sollten hier kurz

erwähnt werden.

Das Bassen-Kornzweig-Syndrom (Abetalipoproteinemie) zeigt einen autosomal-rezessiv

vererbten Verlust des Apoproteins B. Neben einer Retinitis pigmentosa wird eine

spinocerebellöse Ataxie, eine periphere Neuropathie, ein Malabsobtionssyndrom mit einer

Steatorrhoe und eine Akantholyse beschrieben. Ein Genlokus für das Mikrosomal triglyceride

Transferprotein wurde auf Chromosom 4q22-q24 beschrieben (Narcisi et al., 1995).

In der Klasse der Zeroidlipofuszinosen kommen mehrere Erkrankungsformen vor, welche alle

einen autosomal rezessiven Vererbungsmodus zeigen. Die juvenile amaurotische Idiotie,

Batten-Spielmeyer-Vogt-Syndrom, beginnt im 6-7 Lebensjahr mit Sehstörungen im Sinne

einer RP, um später auch eine psychomotorische Retardierung, Myoklonien sowie eine Ataxie

zu präsentieren. Hierfür ist bereits ein Genlocus für das Gen CLN3 auf Chromosom 16p12.1

beschrieben worden (Callen et al.,1991).

Eine weitere autosomal rezessiv vererbte Lipidstoffwechselstörung ist das Refsum-Syndrom,

bei der der Abbau von Phytansäure durch einen Pyhtansäure-Alpha-Hydroxylase-Mangel

gestört ist und es zur Speicherung von Tetramethylhexadekansäure kommt. Die Klinik

manifestiert sich im Alter von 10-20 Jahren mit einer Retinitis pigmentosa, einer

progredienter Schwerhörigkeit, einer Ichthyose der Haut, Knochenanomalien, Ataxie und

Diskussion 80

einer Polyneuropathie. Durch eine Diät ohne Gemüse, Obst, Butter und einer Reduktion

tierischer Fette ist die weitgehende Rückbildung der Symptome möglich. Das Refsum-

Syndrom zeigt eine Genlocusheterogenie mit bislang drei bekannten Genen. Auf Chromosom

7q21-q22 ist das PEX-Gen lokalisiert (Portsteffen et al., 1997), das PEX2-Gen liegt auf

8q21.1 (Shimozawa et al., 1993) sowie auf Chromosom 10pter-p11.2 das RDPA-Gen (Nadal

et al., 1995).

Unter den Mukopolysaccaharid-Speicherkrankheiten gibt es einige Formen, welche unter

anderem das klinische Bild einer Retinitis pigmentosa vorweisen. Die Pfaundler-Hurler-

Krankheit weist einen autosomal-rezessiv vererbten Alpha-L-Iduronidase (IDUA) Mangel

vor. Die betroffenen Kinder zeigen eine Dysmorphie (Gargolismus) und einen Minderwuchs,

eine geistige Retardierung, eine Dysostose, eine Hepatomegalie, eine Hornhauttrübung und

eine RP. Das hier betroffene Gen für IDUA liegt auf Chomosom 4q16.3 (Koizumi et al.,

1992).

Die Hunter-Krankheit zeigt einen X-chromosomal-rezessiv vererbten Iduronatsulfatase

Mangel. Neben einer RP werden eine mäßige geistige Retardierung, Knochendysplasien und

eine frühe Taubheit beobachtet. Ein Genort hier auf Chomosom Xq28 betroffen (Mossman et

al., 1983).

Die Anzahl der Erkrankungen, welche das klinische Bild einer Retinitis pigmentosa

präsentieren, ist wie oben gezeigt sehr groß, was die Suche eines bestimmten Genlokus für

das Senior-Løken Syndrom deutlich erschwert.

4.5. Kandidatengene für das Senior-Løken Syndrom

Bei der Suche nach Kandidatengenen für das Senior-Løken Syndrom muß man zwischen

funktionellen und positionellen Kandidatengenen unterscheiden. Die funktionellen

Kandidatengene sind Gene, die aufgrund ihrer Funktion die Nieren- oder Augenpathologie

des SLS erklären können, wie zum Beispiel alle Gene, die mit Retinitis pigmentosa oder

Nephronophthise in Zusammenhang gebracht werden können. Unter positionelle

Kandidatengene versteht man Gene, welche aufgrund ihrer günstigen Lokalisation zu einer

Kandidatenregion für das Krankheitsbild in Frage kämen.

Diskussion 81

4.5.1. Funktionelle Kandidatengene für SLS

Es gibt eine große Anzahl von funktionellen Kandidatengene, welche für das Senior-Løken

Syndrom in Frage kommen. Hierzu gehören die bereits für Retinitis pigmentosa

identifizierten Gene, welche in der Tabelle 9 (Kap. 4.4.1.) aufgelistet wurden. Es handelt sich

zum einen um Mutationen, die das Pigmentepithel direkt betreffen und somit die Sehfunktion

beeinflussen. Zum anderen können pathologische Mutationen in Enzymen des Sehvorganges

wiedergefunden werden.

Die erste Mutation fand man in dem Gen des Sehfarbstoffes Rhodopsin. Rhodopsin ist ein

transmembranäres Protein des äußeren Diskussegmentes der Stäbchen, welches die Kaskade

der visuellen Transduktion anleitet. Das zweite Gen, welches Mutationen aufwies, ist das

Peripherin, ein Glykoprotein welches die Stabilität der aüßeren Diskussegmente der

Photorezeptoren beeinflußt. Hierzu gehört auch das Gen des Proteins ROM1 (rod outer

segment membrane protein 1), ein weiteres Strukturprotein des Photorezeptors.

Unter den mutierten Enzymen, welche eine Retinitis pigmentosa zur Folge haben, gehört die

cGMP-Phosphodiesterase (PDE). Sie reguliert den zytoplasmatischen cGMP-Verbrauch im

Bezug auf das einfallende Licht. In der Dunkelheit ist der cGMP-Bestand der Stäbchen hoch

und der zytoplasmatische cGMP-abhängige Kanal offen. Alle drei Untereinheiten der PDE, α

und β, welche aktivierend sind, sowie γ, welche inhibierend ist, können Mutationen

aufweisen. Mutationen welche den cGMP kontrollierten Kationenkanal betreffen, sind auch

beschrieben worden. Weiterhin sind Mutationen in der Retina spezifischen Guanylatcyclase

beschrieben worden. Von vielen durch Mutationen veränderte Proteinen, welche eine Rolle in

der Pathologie der Retinitis pigmentosa spielen, ist die Funktion und somit ihr

Pathomechanismus noch nicht bekannt. Leider zeigen alle bislang gefundenen Mutationen in

Genen der Retinitis pigmentosa keine Nierensymptomatik im Sinne einer Nephronophthise.

Die syndromalen und metabolischen Formen der Retinitis pigmentosa sind auch gute

funktionelle Kandidatengene für das SLS. Vor allem das Joubert-Syndrom mit seiner

Lokalisation auf Chromosom 9q34.3 ist durch seine Klinik (Nephronophthise, RP und

Vermisaplasie) ein wichtiges funktionelles Kandidat. Leider liegt diese Region nicht in einer

durch die Haplotypenanalyse bestimmten Kandidatenregion für SLS.

Diskussion 82

Weiterhin gehören zu den funktionellen Kandidatengenen die bereits publizierten Genloci für

Nephronophthise auf den Chromosomen 2q13 (Hildebrandt et al., 1997), 9q22-q31 (Haider et

al., 1998) und 3q21-q22 (Omran et al., 2000) (s. Kap. 1.9.2.) sowie der für die “Medullary

cystic disease” publizierte Genlokus auf Chromosom 1q21 (Christodoulou et al., 1998).

Auf Chromosom 2q13 zeigten nur zwei SLS-Familien Kopplung und bei keiner der Familien

liegt eine Deletion vor. Der Genort für die infantile NPH auf Chromosom 9q22-31 liegt auch

nicht in einer Kandidatenregion für SLS. Die Region auf Chromosom 3q21-q22, welche von

der Freiburger Forschungsgruppe zwischen den Markern D3S1292 und D3S1238 kartiert

wurde, liegt innerhalb einer Kandidatenregion für SLS. In dem Intervall von D3S1292 und

D3S1309 zeigten fünf Familien Kopplung: die SLS early-onset Familien 14, 59, 64, 353

sowie die SLS late-onset Familie 319. In diesem Intervall kartiert auch der STS-Marker

D3S1273, welcher einen LOD-Score von 5,90 für NPH3 gezeigt hatte (Omran et al., 2000).

Interessant ist auch, daß in dieser Kandidatenregion auf Chromosom 3q21-q22 das Gen

CRBP2 (cellular retinol-binding protein 2) kartiert.

4.5.2. Positionelle Kandidatengene für SLS auf Chromosom 15

Wie wir weiter oben feststellen mußten, zeigt das Senior-Løken Syndrom eine Genlokus-

Heterogenie. Von den 12 in der Haplotypenanalyse untersuchten Familien zeigten 5 eine

Kopplung mit der Region auf Chromosom 15q22-q26. Diese Region bleibt weiterhin die

interessanteste Region für ein SLS-Gen. Leider ist diese Region noch sehr groß und enthält

viele mögliche positionelle Kandidatengene. Aus diesem Grund sollen nur einige wichtige

Kandidatengene dieser Region vorgestellt werden.

Das Cellular Retinaldehyde-binding Protein

Das CRALBP (cellular-retinaldehyde-binding protein) ist eins der wichtigsten

Kandidatengene der Region 15q22-q26. Es ist ein Protein aus dem Zytosol des

Pigmentepithels der Retina, welches die Oxidation des 11-cis-Retinol stimuliert , und somit

eine wichtige Rolle bei der Regeneration des Sehfarbstoffes übernimmt. Dieses Gen wurde

auf Chromosom 15q26 lokalisiert (Sparkes et al., 1992). CRALBP hat eine mRNA von 1,4

bis 1,6 kb Länge und liegt im menschlichen Genom nur in einfacher Kopie vor. Das Gen

Diskussion 83

enthält 8 Exons und 7 Introns, wobei das gesamte Exon 1 sowie Teile von Exon 2 und 8

transkribiert aber nicht translatiert werden (Intres et al., 1994).

Neben seiner günstigen Lokalisation konnte gezeigt werden, daß Defekte in diesem Gen eine

autosomal-rezessive Form der Retinitis pigmentosa hervorrufen (Maw et al., 1997). Somit ist

dieses Gen sowohl ein positionelles als auch ein funktionelles Kandidat für das Senior-Løken

Syndrom. Dieses Kandidatengen wurde von uns auf der physikalischen Karte der Region

15q22-q26 kartiert, und wir mußten feststellen, daß es sich außerhalb der flankierenden

Markern befand, und somit nicht in der für SLS kritischen Region. Außerdem wurde in einer

früheren Dissertation eine SSCP-Analyse als Mutationsscreening für CRALBP durchgeführt,

deren Ergebnisse dieses Gen als krankheitsverursachendes Gen für SLS mit großer

Wahrscheinlichkeit ausschließt (Haffner, 1998).

Das Cellular Retinoic acid-binding Protein

Ein weiteres Kandidatengen der Region ist das für CRABP1 kodierende Gen RBP1, welches

der zytogenetischen Bande 15q24 zugeordnet wurde (Flagiello et al., 1997). Das “cellular

retinoic acid-binding protein” interagiert intrecellulär mit Retinolsäure, ein Vitamin A-

Derivat. Retinolsäure beeinflußt das Wachstum und die Differenzierung der Epithelzellen,

und spielt auch eine nicht unerhebliche Rolle in der Embryogenese (Eller et al., 1992). Ob

CRABP in der Niere oder in der Retina exprimiert wird ist nicht bekannt. Leider kartierte

RBP1 außerhalb der flankierenden Markern, was ihn als Kandidat für SLS in Frage stellt.

Das Neurotrophic Tyrosinkinase-Rezeptor Typ 3

Das positionell interessanteste Kandidatengen der Region auf Chromosom 15q ist das

Thyrosinkinase Rezeptor C (trkC) Gen. Dieses Gen kartierte innerhalb der flankierenden

Markern und ist somit besonders interessant. Lamballe et al. zeigte, daß das trkC-Gen ein 145

kD großes Glykoprotein bildet, welches als Rezeptor für Neurotrophin-3 fungiert. Somit

spielt es eine besondere Rolle in der Entwicklung bestimmter Areale des

Zentralnervensystems (Lamballe et al., 1991). Anschließend fand Segal et al., daß die trkC

Expression ein prognostischer Indikator für Medulloblastompatienten ist (Segal et al., 1994).

TrkC wurde durch FISH auf Chromosom 15q24-q25 lokalisiert (McGregor et al., 1994). Über

Diskussion 84

eine Exspression im Nierengewebe sowie in der Retina ist nichts bekannt, was dieses

Kandidat für SLS in Frage stellt.

4.6. Weiteres Vorgehen bei der Kartierung eines Genlocus für SLS

Das weitere Vorgehen bei der Suche eines SLS-Gens könnte sich auf folgende Punkte richten:

• Eine Vervollständigung des PAC-Contigs auf Chromosom 15q mit Ansequenzierung der

PAC-Enden. Dadurch Generierung weiterer STS-Marker.

• Suche nach weiteren SLS-Familien sowie Vervollständigung der klinischen Daten unserer

Familien zur besseren Einteilung in “early-onset” und “late-onset” Familien.

• Mutationsscreening der im YAC/PAC-Contig kartierten Kandidatengene.

• Weitere Eingrenzung der Kandidatenregion auf Chromosom 3q21.

Zusammenfassung 85

5. ZUSAMMENFASSUNG

Das Senior-Løken Syndrom ist eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung, bei der die

Nephronophthise, eine zystische Nierenerkrankung, mit einer Retinitis pigmentosa assoziiert

ist. Anhand der Nieren- bzw. Augensymptomatik unterscheidet man zwischen eine “early-

onset” und eine “late-onset” SLS-Form.

Grundlage dieser Arbeit war ein zuvor durchgeführtes “total genome screen” mit MS-Marker,

welche die Region auf Chromosom 15q als beste Kandidatenregion für SLS herausstellte. Bei

einer Haplotypenanalyse mit SLS-Multiplexfamilien konnte die Region durch neue MS-

Marker eingegrenzt werden. Die Marker D15S1030 und D15S1045 flankieren diese

Kandidatenregion, welche eine genetische Distanz von 3,3 cM umfaßt. Der Marker D15S1046

liegt innerhalb dieser Region und ergibt bei den SLS-E Familien einen LOD-Score von 2,545

bei θ = 0,06.

Eine physikalische Karte mit Hilfe von YAC-Klonen wurde zunächst in der Kandidatenregion

hergestellt. Das minimale Contig, welches die flankierenden Marker enthält, besteht aus 4

YACs und hat eine maximale Größe von 4,385 Mb. Insgesamt konnten 19 ESTs auf dem

YAC-Contig kartiert werden, wovon sich 9 innerhalb der flankierenden Markern befinden.

Unter anderem wurden auch die Kandidatengene RLBP1 sowie RBP1 auf dem YAC-Contig

kartiert, welche außerhalb der flankierenden Markern lokalisiert werden konnten. Durch das

STS-Content-Mapping konnte die Reihenfolge sowie die Orientierung der kartierten ESTs auf

dem Chromosom festgelegt werden.

Eine PAC-Bibliothek wurde anschließend durchsucht, um PAC-Klone der Region auf

Chromosom 15q22-q26 zu generieren. Das erstellte PAC-Contig enthält vier Lücken und

besteht aus 13 PAC-Klonen. Die auf dem PAC-Contig kartierten STS-Marker zeigten die

gleiche Reihenfolge und Orientierung wie im YAC-Contig, womit die Zuverlässigkeit des

YAC-Contigs bestätigt werden konnte.

Drei neue SLS-Familien wurden einer Haplotypenanalyse unterzogen, wodurch einige weitere

interessante Regionen mit Kopplung für mehrere Familien gefunden werden konnten. Eine

wichtige Kandidatenregion wäre die Region auf Chromosom 3q21, in welche auch das

NPH3-Gen kartiert.

Literaturverzeichnis 86

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Danksagung 99

7. DANKSAGUNG

An dieser Stelle möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die mir bei dieser Arbeit

geholfen haben.

Mein besonderer Dank gilt Professor Dr. Friedhelm Hildebrandt für die Möglichkeit, diese

Arbeit durchzuführen. Seine intensive und engagierte Betreuung durch zahlreiche

Anregungen und Diskussionen begeisterten mich für die wissenschaftliche Forschung.

Herzlichen Dank schulde ich auch Dr. Martin Vollmer, der mir jederzeit bei der Lösung von

Fragen und Problemen hilfreich zur Seite stand. Er hat mich auch in schwierigen Zeiten

motiviert und schließlich seine konstruktive Hilfe beim Verfassen dieser Arbeit geboten.

Ohne ihn wäre eine Arbeit in dieser Form nicht möglich gewesen.

Bedanken möchte ich mich auch bei Anita Imm und Marion Ziebert für die Durchführung der

DNA-Extraktion sowie für viele organisatorische Aufgaben, die sie für mich übernommen

haben. Danken möchte ich auch Edgar Otto und Cornelia Rensing für ihre Geduld und

Unterstützung in jegliche Art von Fragen, aber auch für die angenehme Athmosphäre, die sie

und alle Mitarbeiter des Labors verbreitet haben.

Ich danke sehr Martin Vollmer und Friedhelm Hildebrandt für das Korrekturlesen meiner

Arbeit sowie Rainer Ruf, der mir während der ganzen Studienjahre mit Rat und Tat zur Seite

stand.

Mein ganz besonderer Danz gilt schließlich meinen Eltern, ohne deren Unterstützung ich es

nie soweit geschafft hätte. Für den Rückhalt während meiner gesamten Ausbildung möchte

ich ihnen von ganzem Herzen danken.

Lebenslauf 100

8. LEBENSLAUF Persönliche Daten Sonia Cristina Briese

Engelbergerstr. 41B / 204 79106 Freiburg geb.am 19.11.1974 in Bukarest

Eltern: Marius Briese (52), Architekt Dr. Maria Anca Briese (50), Diplom Chemikerin Bruder Robert Briese (25), Wirtschaftsinformatiker

Schulbildung 1981-1989 Deutsches Lyzeum Bukarest, Rumänien 1989-1994 Gymnasium „am Rosterberg“, Siegen 1991-1992 Turners-Falls High School, Massachussetts, USA 1994 Abitur am Gymnasium „am Rosterberg“, Siegen

Studium 1994-2001 Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg 09/1996 Ärztliche Vorprüfung (Physikum) seit 10/1996 Stipendium der Friedrich-Naumann Stiftung 08/1997 1. Staatsexamen 1998-1999 Studium an der Universität René-Descartes Paris, Frankreich 09/2000 2. Staatsexamen 11/2001 3. Staatsexamen

Praktika und Famulaturen 03-04/1997 Universitätsklinik Bukarest/Rumänien; Innere Medizin (Kardiologie) 04/1998 St. Josefskrankenhaus Freiburg; Gynäkologie 09/1998 Hôpital Cochin Port-Royal, Paris; Urgence Médicales 10/1998-01/1999 Hôpital St. Vincent de Paul, Paris; Pädiatrie 02-05/1999 Hôpital St. Anne, Paris; Neurologie 06-09/1999 Hôpital Cochin Port-Royal, Paris; Innere Medizin (Infektiologie)

Praktisches Jahr 10/2000-01/2001 Viszeralchirurgie (Prof. Dr. Dousset) Hôpital Cochin Port-Royal, Paris 01-04/2001 Innere Medizin: Infektiologie (Prof. Dr. Sicard) und Rheumatologie

(Prof. Dr. Dougados) in Hôpital Cochin Port-Royal, Paris 05-08/2001 Pädiatrie (Prof. Dr. Brandis) an der Universitätskinderklinik Freiburg

Physikalische Kartierung eines Genorts für das Senior ...

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