Polarisation und Phasenkontrast-Verfahren als HiUsmittel bei der photographischen Wiedergabe mikroskopischer

Pr~iparate yon Pflanzengeweben

Von

Ingrid Roth und Jofio O. Nedel

Aus dem Boianischen Instifut der Universit~t Miinchen

Mit 15 Textabbildungen

(Eiugegaugen am 19. Juli 1957)

Fiir diejenigen, die entwieklungsgesehichtlidl arbeiten, ergibt sieh iminer wieder die Notwendigkeit , yon jungen meristematisehen Geweben einwand- f re ie Pr i iparate anzufert igen, die dann spiiter gezeichnet oder photo- graphier t werden kbnnen. So gut sieh aueh junges welches Gewebe schnei- dell lassen 1nag, so sehwierig ist doeh oft eine kontrastreiehe Fiirbung und mehr noeh eine klare photographisehe Dars te l lung zu erzie|en. Die plasma- reiehen Meristemzellen nehmen zwar Farbstoff raseh und in gro[~er Menge auf, fiirben sieh abet meistens fast vbllig homogen an. Bei solehen Pr-a- para ten ist manehmal sogar eine Identifizierung der einzelnen Zellen sehwierig, gesehweige denn, dal~ auf mikrophotographisehen Aufnahmen noeh besondere Einzelheiten zu erkennen wiiren. Urn eine kontrastreiche Fiirbung auszuarbeiten, die vor allem fiir solehe hisfogenetisehe Pr i ipara te g'eeignet ist, bei denen gewisse Zel lgruppierungen - - wie etwa im u tationskegel - - siehtbar gemaehf werden sollen, haben wi t zuniiehst ver- sehiedene Fiirbungen versuehI. Es kommt dabei in erster Linie meist da rauf an, die Zellw~inde miSgliehst klar hervorzuheben (siehe aueh yon S f o s c h /955). Hierfi i r werden eine Reihe yon spezifisehen Zel lwandfarbstoffen an- empfohlen, wie beispielsweise Tannin-Eisenehlorid und Gentianaviolet t ; auch in der , ,Mikrotechnique" yon J o b a n s e n finder sich eine Liste versehiedener Zellwandfiirbemittel , darunter etwa Fastgreen. Dabei ist abet yon vornherein zu erwiihnen, daft sieh blaue und schwarze Tbne fiir

Abb. 2. Wie 1, im Hellf.eld aufgenommen. Mikr. vergr. 12 X 42.

Abb. 4. Dasselbe wie 3, im Hellfeld. Mikr. vergr. 12 X 42.

Abb. 6. Dasselbe wie 5, im Hellfeld. Mikr. ver,gr. 12 )< 42.

:298 Ingrid Roth und J. O. Nedeh Polarisation und Phasenkontrast-Verfahren

mikrophotographisehe Zweeke weitaus am besten eignen. [n dieser Hinsieht scheinf die Tannin-Eisenchlorid-F~irbung eine der wenigen Fiirbemethoden zu sein, mif der sich aueh bei meristematisehem Gewebe nur die Zellw~inde anfiirben lassen. Mit vielen anderen Farbstoffen, die sonst noeh als typisdle Zellwandfarbstoffe gelten, fiirbf sieh hiiufig aueh das Plasma der jungen Gewebe etwas 'mit. Selbstverstiindlieh ist eine gleiehzeitige Plasma- und Kernfiirbung sehr wiinsehenswerf, da man auf histogenetisehen Priiparaten ja vor allem aueh Kern- und Zellteilungen sowie die Verteilung des Plasmas in den verschiedenen Teilungszonen erkennen will, andererseits wird da- dureh aber wieder die Deutlichkeif des Zellnetzes verwiseht und das Naeh- zeiehnen "con gewissen Zellbildern sehr ersehwert. Die Tannin-Eisenchlorid- Fiirbung allein kann daher nur in solehen Fiillen befriedigen, wo lediglieh gewisse Gewebestrukturen hervorgehoben werden sollen, was an sieh selten der Fall ist. Man greift daher meist zu einer Gegenfiirbung und verwendet dann wohl am besten Safranin. Auf diese Weise lassen sieh unter Um- stiinden ganz gute Konfraste erzielen: Die Zellw~inde erseheinen intensiv grausehwarz, Plasma und Kern rot. In sehr jungen, stark fiirbbaren Ge- weben, wie etwa yon Embryonen, wird aber auch dieser Untersehied - - vor- nehmlieh bei der mikrophmographisehen Wiedergabe - - nut wenig zum Ausdruck ko,mmen. Dies trifft besonders fiir die Schwarzweifi-Mikrophoto- graphie zu, da bier keine Farbnuancen zur Geltung kommen, sondern lediglieh die Farbintensitiit eine Rolle spielt (man vergleiehe hierzu die Abb. 2, 4, 6 und 12).

Naehdem sieh dutch das Variieren der Fiirbemethoden keine allzu wesentliehen Untersehiede in der mikrophotographisehen Wiedergabe der Priiparate erzielen liel~en, versuehten wir uns gewisse optisehe ErseheinmI- gen in der Mikroskopie zunutze zu maehen. Fiir solche Versuehe ersehien in erster Linie das Phasenkontrastverfahren geeignet. Wit fertigten des- halb Vergleiehsaufnahmen im gewbhnliehen Hellfeld und mit dem Phasen- kontrastverfahren an. Die Abb. 1, 3, 5 und 2, 4, 6 bringen eine derartige Gegeniiberstellung. Auf den Abb. 2, 4 und 6 sind lichtmikroskopisehe Aufnahmen im Hellfeld wiedergegeben, die yon Gentianapriiparaten angefertigt wurden. Die Genfianafiirbung, so wie wit sie ausfiihrten, erwies sieh als eine reeht dauerhafte und gute Fiirbung, die sieh iv kiirzester Zeit ohne weitere Vorbereitungen bewerksteltigen liil3t. Wir benutzten hierzu eine konz. wiisserige Liisung yon Gentianaviolett, die mif 2 Teilen Wasser auf ein DrKtel verdiinnt wurde. Eine Fiirbedauer yon 10--30 Minuten - - je naeh Objekt - - geniigte in den meisten Fiillen; differenziert wurde dann jeweils init sehwaeh angesiiuertem 70%igem Alkohol. Die Abb. 2, 4 und 6 zeigen zwar, dal3 sieh Kerne, Plasma und

Abb. 1. Junge Blattanlage eines Triticum-Embryos mit Phasenkontrasf aufgenom- men, medianer L~ingssehnitt. F/irbun:g: Gentianaviolett. Optovar 2,5.

Abb. 5. Etwas ~iltere Bla~tanlage yen Triticum. Phasenkontrast. Gentianaviolett. Optovar 2,5.

Abb. 5. Triticum, noch ~.eiter entwiekelte Blattanlage. Phasenkontrast. Gentiana- violett. Optovar 2,5.

300 Ingrid Roth und J. O. Nes

Zellw~inde durch diese Fiirbung ganz gut herausheben lassen, doeh wiire es gerade in diesem Falle sehr wiinsehenswert gewesen, wean die Zellwiinde auf den Aufnahmen distinkt hervorgetreten w~ren. Die Priiparate stellen niimlieh mediane Liingssehnitte dureh versehieden alte Blattanlagen eines Weizenkeimlings dar. Da die Blattanlagen Spitzeninitialen besitzen, die sieh naeh einem ganz bestimlnien Rhythmus teilen, w~ire hier die Hervor- hebung der ZellvAinde -- vor allem auf der mikrophotographisehen Auf- nahme -- yon besonderer Bedeutung gewesen. Dies ist nun tats~iehlieh mit Hilfe des Phasenkontrastverfahrens gelungen. Dutch PhasenverziSgerung des Liehts kann man hier vor allem gute Phasendifferenzen zwischen dent Zellinneren und der Zellwand erzeugen, da die Liehtbeugung bekanntlieh an den Riindern am stiirksten ist. Auf diese Weise maeht sieh der Bild- kontras{ hauptsiiehlieh an den Zellgrenzen bemerkbar. Die Abb. 1, 3, und 5 zeigen solehe Aufnahmen, auf denen die Zellw~inde infolge ihres hohen Liehtbre&ungsindexes hell leuehtend hervortreten. Der Zellumrifl wird dadureh unvergleiehlieh deutlieher als bet den e benstehenden Aufnahmen im gew~ihnliehen Hellfeld, obwohl die Phasenkontrastaufnahmen etwa um zwei Drittel stiirker vergriSl~ert wurden, wodureh sie eigentlich an Sehiirfe verlieren miil3ten. Die Abb.ildungen 3 und 5 sind aus Raumersparnisgrtinden horizontal gelegt worden. I)ie kleine Zellgruppe an der Spitze der Blatt- anlage, die in Abb. 5 besonders gut erkennbar ist, stellt die Initialgruppe dar. Man kann an ihr noeh deutlieh die Segmentierungsart der Spitzenzelle feststellen. Die Initialzelle gibt jeweils naeh reehts, naeh rtiekwiirts und naeh links Segmente ab und offenbart sieh hierdurch als epidermale Initiale, die nach dem Schema des Zwei-Zell-Rhythmus arbeitet.

Eine iihnliehe Yergleichsm~igliehkeit bieien die Abb. 9--12. So stellt Abb. 12 einen Teilaus:sehnitt aus dem Blattstielquerschnitt yon Anthurium dar. Aueh dieses Priiparat wurde mit Gentianaviolett angef~irbt. Dem un- gesehulten Auge werden auf diesem Priiparat, das im Hellfeld auf- genommen wurde, alle Zellen gleieh erseheinen und keine besonderen Gewebestrukturen auffallen. Auf der Phasenkontrastaufnah'me (Abb. 9) treten dagegen die Zellwiinde wieder viel sehiirfer hervor und man kann nun deutlieh erkennen, daft die dieht unter der Epidermis liegenden Zellen in Stoekwerken iibereinander angeordnet sind; offensiehtlieh sind diese Etagen dureh Periklinalteilungen yon subepidermalen Zellen entstanden. Die wetter nach innen gelegenen Zellen scheinen dagegen regellos und ohne besondere Ordnungsprinzipien tiber den Quersehnitt verteilt zu sein. Noeh deutlieher triti die Reihenanordnung der subepidermalen Zellen vielleieht bet stiirkerer Vergriiflerung hervor (Abb. 11).

Liei~en sieh im Phasenkontrastverfahren alle Zellwiinde gleiehmiil3ig hervorheben, so kann man dureh Anwendung yon polarisiertem Lieht noeh zusiitzlieh einen weiteren Effekt erzielen: Bet bestimmter Einstellung der Priiparate kiSnnen hier niimlieh ganz besondere Gewebestrukturen siehtbar gemaeht werden. Ein Beispiel hierftir bringen Abb. r und 8, auf denen Aus- sehnitte aus Blattstielquersehnitten yon Gingko biloba dargestellt sind. Aueh bier wurde die Gentianaviolettf~rbung angewandt. BeideAufnahmenwurden in polarisiertem Lieht bet Zwisehensehaltung eines Kompensators (Rot I)

Polarisatien und Pha:senkontrast-Verfahren als Hilfsmittei 301

hergestellt . Bei einer gewissen Einstel!ung im Polar i sa t ionsmikroskop zeigt sich dann, da[~ die auf der Abbi ldung senkrecht ve r l au fenden Zellwhnde

Abb. 7. Aussehnitt aus einem Stielquersdmitt vcn Ginkgo biloba; der Ausschnitt zeigt ein Zellbild aus der Dorsalseite des Blattstiels 1nit einer teilungsftihigen sub- epiderlnalen Zellage. Die Zelle:n der ersten subeioidermalen S&i&t fallen durdl ihre geringere Grtil3e auf; sie haben sieh kiirzlich periklinal durchgeteilf. Die PeriklinaIw~inde stechen als helle Linien hervor. In polar'isiertem Li&t aug

genommen. Gentianaviolett. Optovar 16.

Abb. 8. Dasselbe Bild wie oben, bei Drehung des Pr~iparates um 90 Grad. Optovar 1,6.

dunke l erscheinen, die quergestel l ten dagegen hell (Abb. 7). D a die Zellen bier ziemlich regelmhfiig angeordnet sind, ergibt sich ein ganz besti inmtes

302 lngrid Roth und J. O. Nedel: Polarisation und Phasenkontrast-Verfahren

Slrukturbild. Es fallen vor a]lem die kIeinzelligen Zellgruppen unter der Epidermis auf; sie bestehen aus Zweiergruppen yon Zellen, die iiber/ einander liegen und nur dureh eine diinne Querwand getrennt sind. Man sieht auf den ersten Bli&, daft sie aus einer einzigen Zelle dutch Quer- teilung hervorgegangen sind. Besonders die vier Zweiergruppen direk~ unter der Epidermis auf der reehten Seite der Abbildung heben sieh sehr deutlieh heraus. ]Den entgegengesetzten Effekf kann man dureh Drehung des Priiparafes um 9t3 o erreiehen. Es erseheinen dam~ die urspriinglieh dunklen W~inde hell, die Querw~inde dagegen dunkel (Abb. 8). Die neu eingezogenen Querwiinde in den Zweiergruppen unter der Oberhaut werden dann als zarte, hauehdiinne Membranen kennt]ieh. In diesem Falle befindet sieh n~imlieh ein subepidermales Meristem unter der Oberhaut, das si& st~indig periklinal weiterteilt und auf diese Weise dauernd neue Zellen naeh innen abgibt. Da abet relativ selten Teilungen statffinden und die Toehterzellen raseh heranwachsen, verwiseht sieh die stoekwerkartige Anordnung der Zellen bald und ist nur in direkter N~ihe der Epidermis erkennbar.

Noeh eindrueksvoller lassen sieh aber die Vorteile des Polarisations- verfahrens bei Betraehtung sogenannter Reihemneristeme demonstrieren. Abb. 14 und 15 zeigen Querschnitte dureh die ventrale Kielbildung der Schlauehbliiiter yen Sarracenia. Die Zellw~inde die ser Priiparate wurden mit Tannin-Eisenchlorid behandelt und fiirbten sieh intensiv dunkelgrau. Auf eine Gegenf~irbung mit Safranin, wie sie F o s t e r emp- fiehlt (siehe J o h a n s e n, S. 91), wurde in diesem Falle verziehtef, da es uns lediglieh auf die Anordnung der Zellen ankam. Photographiert man die Priiparate im gewiihnliehen Hellfeld, so erseheint der Sehnitt wiederum ziemlieh homogen grau, obwohl Plasma und Kerne kaum angefiirbt wurden. Aueh mit Phasenkontrast ist kein besonderer Effekt zu erzielen (Abb. 13). Die Abb. 14 und 15 zeigen dagegen auf den ersten Bliek eine bestimmte Gewebestruktur. Die Zellen im Kiel sind alle in deutlichen L~ingsreihen angeordnet. Die Liingsvdinde erseheinen auf den Mikrophotographien schwarz, die Querwiinde weiR. Ein umgekehrtes Bild liifit sieh wieder dureh Drehung des Pr~iparates um 9130 errei&en. Doeh werden dadureh die Strukturen wieder e~was undeutlieher. Die Reihenstruktur in dem unter der Epidermis liegenden Gewebe kommt dadureh zustande, daft aueh bier die Zellen unter der Epidermis teilungsfiihig bleiben und sfiindig naeh innen neue Zellelemente abgeben, in ~ihnlieher Weise, wie dies oben ftir Ginglr besehrieben wurde. Dadureh, dal~ sieh das Gewebe abet bei Sarra- ceuia viel raseher teilt und als Ganzes l~ingere Zeit meristematiseh bleibt,

Abb. 9. Dorsaler Aussdmitt aus einem Blattstielquersehnitt yon Anthurium. Phas,enkontrast. Gentianaviolett. Optovar 1,6.

Abb. 10. Dorsaler Auss&nitt aus demselben Pr~parat, in polarisiertem Lieht. Die Zellreihen treten besonders d,eutli& hervor, da die Liingsw~inde sehwarz, die

Querw/inde dagegen weil~ erseheinen. Optovar 1, 5 Min. beliehtet.

Abb. 11. Das,selbe st~irker ~ergr5t~ert. Phasenkontrast. Optovar 2,5.

Abb. 12, gergleichsaufnahme im Hellfeld.

304 Ingrid Roth und ]. O. Nedei: Polarisation und Phasenkontrast-Verfahren

so daf sieh die Zellen in ihrer Lage und GrSfle zun~ichst kaum ver~indern, ergeben sich deutliehe Lhngsreihen, die dur& diinnere Querw~inde unter- l~roehen sin& Da diese Querwiinde bet bestimmter Einstellung in geriehte- tern Licht hell erseheinen, heben sieh die dunklen l~ingsgeriehteten Zell- w~inde besonders kontrastreieh hervor. Damit ist ein fiir die Beurteilung der Histogenese dieses Blattkieles wesentlicher Effekt erzielt. Man erkennt sofort, da~ es sich hierbei um ein sogenann~es Ventrahneristem handeln mull. Auf der Vergleiehsabbildung (Abb. 13) ist dies nieht ohne weiteres zu erkennen. Damit kann gezeigt werden, daft die gesamte Kielbildung des Sehlauehblattes yon Sarraeenia dureh ein subepidermales Reiheu- meristem gebildet wird, das hier sogar besonders eharakteristiseh aus- gepr~igt ist.

Die bier beschriebene Erscheinung, die kambiale Gewebestrukturen im photographisehen Bild so deutlieh werden l~flt, beruht natiirlich auf der Tatsaehe, daf die Zellulosew~inde infolge ihrer besonderen submikroskopi- sehen Struktur doppelbreehend sin& Auf unseren Abbildungen seheint der Hintergrund deshalb hell, weil dutch Zwisehensehaltung eines Quarz- pl~ittehens ein Kompensationseffekt erreieht wurde. Steht nun die Zell- wand parallel zur Sehwingungsebene des Polari,sators, so erseheint sie dunkel, senkreeht dazu abet hell. Dureh Drehung des Objekttisehes um 90 o kann dann der entgegengesetzte Effekt erzielt werden. Da die Zellen in kambialen Meristemen mehr oder weniger streng in Reihen gelagert sind, erseheinen die Liingswiinde -- bet Einstellung der Zellreihen in Rich- tung der Sehwingungsebene des Polarisators -- dunkel und werden dadureh besonders stark hervorgehoben.

Im Falle von S~rraeenia kommt zu dem Kompensationseffekt noeh ein weiteres giinstiges Moment hinzu, indem die Querw~inde der Meristem- zellreihen bier viel stiirker doppelbrechend sind als die Liingsw~inde. Es folgt daraus, dal3 das Mikrofibrillengefleeht in den L~ingsw~inden viel weniger entwiekelt ist als in den Querwiinden. Dies kSnnte entweder vom Streekungswaehstum der Zellen herrahren, dutch welches die Mikrofibrillen- textur der Prim~irwand pas,siv iiberdehnt wird, oder es kSnnte aber aueh eine Ringtextur vorliegen, so daft die meisten Mikrofibrillen auf dem Sehnitt dutch die Liingswand quer getroffen warden. Inwieweit diese Be- obaehtung verallgemeinert werden kann, mii13te allerdings noeh untersueht werden 1.

Herrn Professor F r e y - W y s s l i n g ~erdanke ieh die Priifnng der Pr~i- parate und die Deutung der Erscheinung.

Abb. 13. Quers&nitt durch die ventrale Kielbildung yon Sarrace~ia. Phasen- kontrast. Ffirbung: Tannin-Eisendllorid. Die Zellreihen treten ni&t sehr deutlidt

hervcr. Optovar 1. �89 Sek. b,elidatet.

Abb. 14k E*wa gleiehalte Kielbildung, in polarisiertem Licht. D~e Zellreiben heben sieh ganz besonders deutli& ab. Tannin-Eisenchlorid.

Abb. 15. Wie o5.en, Negativ starker vergr6~ert.

306 Ingrid Roth u. J. O. Nedel: Polaris,ation und Phasenkontrast-Yerfahren

I Z u s a m m e n f a s s u n g

1. Ein kontrastreiches Anfi i rben der Zellwiinde sehr junger ~neriste- matischer Gewebe kann mit den gewbhnlichen FiJrbemefhoden nicht zu-

�9 1

fr ledenstel lend erreicht werden. Die F i i rbever fahren geniigen vor alle~r~ dann d e n Anforde rungen meist nichf, wenn mikrophotographische Auf - nahm~n yon den Pr i ipa ra ten gemacht werden sollen. Es wurde deshalb. versucht, gewisse optische Effekte in der Mikroskopie ftir diese Zwecke nu tzba r zu machen.

2. Sehr kontrastreich treten die Zellwiinde hervor, wenn das Phasen- kon t r a s tve r f ah ren angewendet wird. D a sich die ZellwiJnde hierdurch a u f den Mikrophotos als hellgliinzende U m r a h m u n g e n der Zellen hervorheberr las,sen und dadurch auch Unterschiede in der Zel lwanddicke deutl icher werden, kSnnen zusammengehSrige Ze l lgruppen besser idenfifiziert werden.

3. Zel lgruppen, die in E tagen oder ganzen Zellreihen angeordnet sind, kSnnen durch das Polar i sa t ionsver fahren besonders gut sichtbar gemach~c werden. Bei Einstel lung der Zellreihen in der Schwingungsebene des Polar i - sators erscheinen - - unter Anwendung eines Kompensat ionseffektes - - die, l~ingsgerichteten Zellwiinde auf der Mikropho tograph ie schwarz, die quer- gestellten dagegen weil~. Durch diese Methode kann man die Zel lanordnung auf den Pr i ipara ten sehr m a r k a n t hervorheben. Alle Ar ten Yon Kambien, lassen sich auf diese Weise sehr eindrucksvoll darstellen.

Die Untersuchungen wurden am Zeiss-Standard,mikrosko,p mit K P L - O k u l a r 12,5 und Achromatobjek t iv 60 durchgefiihrt.

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