Praktikum Spezielle Bakteriologie - TU Dresden · Standardisierte Testsysteme wie die api-Systeme...

Studiengang Biologie

Praktikum Spezielle Bakteriologie Dresden, 08.-19. April 2013

Sandro Wolf 03.04.2013

INHALT Kursinhalte .............................................................................................................................................. 1

Ziel und Ablauf des Kurses ...................................................................................................................... 1

Inhalt erste kurswoche ........................................................................................................................ 2

Inhalt zweite kurswoche...................................................................................................................... 3

Arbeitsanleitungen .................................................................................................................................. 3

Aufgabe A - Identifizierung von auf Agarplatten wachsenden Bakterien ............................................... 4

1. Fraktionierter Ausstrich ............................................................................................................... 4

2. Auswertung der fraktionierten Ausstriche, Durchführung biochemischer Tests ....................... 4

3. Differenzierung gram-negativer Stäbchen mit Hilfe von api-Systemen ...................................... 5

Aufgabe B - Differenzierung von Bakterien aus einer Suspension .......................................................... 6

1. Quantitative Analyse ................................................................................................................... 6

2. Qualitative Analyse ...................................................................................................................... 6

Aufgabe S - Identifizierung einer Bakterienart auf Schrägagar ............................................................... 7

Kauffmann - White - Schema .......................................................................................................... 8

zur serologischen Differenzierung von Salmonellen (Auszug) ........................................................ 8

Aufgabe L - Differenzierung von Keimen aus der Luft ............................................................................. 9

1. Erfassung der Keime in der Luft mit Hilfe des Sedimentationsverfahrens ................................. 9

2. Differenzierung von Bakterien aus der Luft von Sedimentationsplatten .................................... 9

Aufgabe PCR .......................................................................................................................................... 11

A- Nachweis von Sulfatreduzierern mittels spezifischer PCR ............................................................ 11

DNA-Extraktion .............................................................................................................................. 12

Herstellung des Mastermixes ........................................................................................................ 12

PCR................................................................................................................................................. 12

Gelektrophorese und Visualisierung ............................................................................................. 12

B - Genetische Identifizierung ausgesuchter Isolate mittels Sequenzierung von PCR-Fragmenten . 13

DNA-Extraktion .............................................................................................................................. 13

Herstellung des Mastermixes ........................................................................................................ 13

PCR................................................................................................................................................. 14

Gelektrophorese und Visualisierung ............................................................................................. 14

Aufreinigen des PCR-Produktes ..................................................................................................... 14

Nachweis und Quantifizierung von E. coli/Coliformen ......................................................................... 15

Begriffsbestimmung: ......................................................................................................................... 15

Quantifizierung von E. coli nach dem MPN-Verfahren ..................................................................... 15

ii Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2013

Aufgabenstellung............................................................................................................................... 15

Vorgehensweise ................................................................................................................................ 16

Auswertung ....................................................................................................................................... 16

Aufgabe H - Identifizierung von Mikroorganismen mittels CARD-FISH................................................. 18

Theoretischer Teil .............................................................................................................................. 18

Aufgabenstellungen ....................................................................... Fehler! Textmarke nicht definiert.

Durchführung ................................................................................. Fehler! Textmarke nicht definiert.

Verwendete Reagenzien/Geräte: ............................................... Fehler! Textmarke nicht definiert.

Probenvorbereitung (bereits durchgeführt): ............................. Fehler! Textmarke nicht definiert.

Hybridisierung und CARD Signalamplifikation (von den Kursteilnehmern durchzuführen): . Fehler! Textmarke nicht definiert.

Anhang: Tabellen zur bakterienidetifizierung ....................................................................................... 27

Tabelle 1 - Koloniemorphologie ........................................................................................................ 27

Tabelle 2 - Überblick Bakteriendifferenzierung ................................................................................ 29

Tabelle 3 - Differenzierung gramnegativer Stäbchen ........................................................................ 30

Tabelle 4 - Differenzierung grampositiver Kokken ........................................................................... 31

Tabelle 5 - Differenzierung grampositiver Stäbchen ........................................................................ 32

Tabelle 6a - Übersicht zum Wachstum ausgewählter Gram-Negativer Keime auf Nährmedien ...... 33

Tabelle 6b - Wachstum ausgewählter Gram-Positiver Keime auf den verwendeten Nährmedien .. 34

1 Praktikum Spezielle Bakteriologie / Mikrobentaxonomie 2011

KURSINHALTE

• Identifizierung von 3 Bakterienarten auf einer Agarplatte (A)

• Identifizierung von 2 Bakterienarten in einer Bouillon (B)

• Identifizierung einer Bakterienart auf Schrägagar (S)

• Differenzierung von Keimen aus der Luft (L)

• Identifizierung von Isolaten mittels PCR/Sequenzierung (PCR A/B)

• Identifizierung von Mikroorganismen mittels in situ Hybridisierung

mit rRNA-gerichteten Oligonukleotidsonden (CARD-FISH-Technik) (H)

• Demonstration ausgewählter Mikroorganismengruppen: Mycoplasmen

ZIEL UND ABLAUF DES KURSES

Im Kurs werden Bakterien von verschiedenen Medien bzw. aus verschiedenen

Umweltproben isoliert, differenziert und identifiziert. Dabei werden von den

Kursteilnehmern grundlegende Arbeitstechniken, die aus dem Grundkurs Mikrobiologie

bekannt sind, selbstständig angewendet sowie verschiedene Testverfahren zur

Identifizierung von Bakterien kennen gelernt. Weiterhin wird die in situ Hybridisierung mit

rRNA-gerichteten Oligonukleotidsonden als kultivierungsunabhängiges Verfahren der

Analyse von mikrobiellen Gemeinschaften in Umweltproben durchgeführt. Ergänzend

werden einige ausgewählte Mikroorganismengruppen von Mitarbeitern des Instituts für

Medizinische Mikrobiologie vorgestellt.

Neben dem Anfertigen eines Protokolls wird von jedem Kursteilnehmer ein Kurzvortrag zu

kursrelevanten Keimen (Themen werden ausgegeben) und das Bestehen eines kurzen

Abschlusstestats (ca. 30 Minuten, schriftlich) erwartet. In der folgenden Tabelle ist der

zeitliche Ablauf des Kurses charakterisiert, wobei dieser in großem Maße von der

erfolgreichen Kultivierung abhängt und demzufolge entsprechend der Testergebnisse

variieren kann.


INHALT ERSTE KURSWOCHE

Tag Aufgabe A

Agarplatte

Aufgabe B

Bouillon

Aufgabe S

Schrägagar

Aufgabe L

Luftplatte

Aufgabe PCR

Sonstiges

Mo

4 DS Gramtest,

fraktioniert

überimpfen

Quantifiz.

(KbE),

Ausstrich

Kolonien

makroskop. +

mikrosk.

charakteris.,

abimpfen

PCR A:

Nukleins.-

extraktion

Di

2 DS Kontrolle auf

Reinkultur,

Auswertung

KbE,

Differenz. wie

Aufg. A

Kontrolle

sonst weiter

am Mittwoch

PCR A:

Ansatz PCR

(läuft über

Nacht)

Mi

3 DS Biochem. Tests,

api-System

Biochem.

Tests, api-

System

Gramtest,

fraktioniert

überimpfen

Kontrolle auf

Reink.,

Biochem. Tests

Gelektro-

phorese und

Detektion

Do

2 DS auswerten od.

fortsetzen

auswerten od.

fortsetzen

Biochem. Tests,

api-System

Biochem.

Tests, ggf. api-

System

PCR B:

Ansatz PCR

(läuft über

Nacht)

Quantifizierung

von E.coli und

Coliformen

mittels Colilert

Fr

4 DS Auswertung

Protokoll

Auswertung

Protokoll

Auswertung

Serologie

testen

Auswertung

oder fortsetzen

PCR B:

Gelelektro-

phorese und

Aufreinigung.

Abschicken der

Proben an GATC

Auswertung

Colilert;

Demonstration

Mycoplasmen


INHALT ZWEITE KURSWOCHE

Mo

4 DS

Einführung und Durchführung der in situ

Hybridisierung mit rRNA-gerichteten

Oligonukleotidsonden (CARD-FISH)

Biochem. Test,

ggf. api-System

Di

2 DS

13:00-16:20 Uhr

CARD-FISH-Auswertung (3 Gruppen)

Auswertung zur Aufgabe

A, B, S, L

Mi

3 DS

11:10 Uhr-16:20 Uhr

Gemeinsame Auswertung Aufgabe PCR B (bis Mittag)


Do

2 DS

13:00-16:20 Uhr


Fr

4 DS

Vorträge; Testat

ARBEITSANLEITUNGEN

Im Folgenden wird die Vorgehensweise bei der Bearbeitung der verschiedenen Aufgaben

beschrieben. Hinsichtlich der Zusammensetzung und Wirkungsweise der verschiedenen

Nährmedien sowie der zu erwartenden Koloniemorphologie sei auf den Grundkurs bzw.

ausliegende Nährmedien-Handbücher verwiesen! Auch die Anleitungen zur Durchführung

verschiedener biochemischer Tests ist dem Arbeitsmaterial zum Grundkurs zu entnehmen.

Differenzierungsschemata bzw. Anleitungen für das Arbeiten mit den api-Systemen sind im

Anhang aufgeführt.


AUFGABE A - IDENTIFIZIERUNG VON AUF AGARPLATTEN WACHSENDEN BAKTERIEN

Auf einer Agarplatte liegt eine Mischkultur von drei Bakterienarten vor. Voraussetzung für

deren Identifizierung ist die Erzielung von Reinkulturen. Dafür müssen einzeln liegende

Kolonien, je nach mikroskopischem Erscheinungsbild, auf verschiedene Selektiv-Nährböden

abgeimpft werden. Überprüfen Sie das GRAM-Verhalten neben der GRAM-Färbung noch

zusätzlich mit alternativen Schnelltests, wie z.B. KOH-Test und/oder L-Aminopeptidase-Test.

1. FRAKTIONIERTER AUSSTRICH

• Kokken: Blut-Agar, Äsculin-Agar, TTC-Azid-Agar, Baird-Parker Agar

• Gram-positive Stäbchen: Nähragar und MOSSEL-Agar

• Gram-negative Stäbchen: Nähragar, ENDO-Agar, MACCONKEY-Agar, LEIFSON-Agar und

Cetrimid-Agar

Bebrütung 24h bei 30°C (Kokken bei 37°C)

2. AUSW ERTUNG DER FRAKTIONIERT EN AUSSTRICHE, DURCHFÜHR UN G B IOCHEMISCHER TESTS

• Zur Kontrolle der Reinheit Tests zur Gram-Differenzierung durchführen (Mikroskopieren!)

Mischkulturen: nochmals gezielt fraktioniert auf (Selektiv-) Nährmedien

abimpfen

Reinkulturen: biochemische Leistung prüfen, z.B. Oxidase-Test, IMVoC-

Reaktionen, Harnstoffspaltung, OF-Test nach Hugh-Leifson, Wachstum auf

Kligler-Schrägagar, Katalase-Test, Plasmakoagulase, Wachstum bei pH 9,6 und

6,5% NaCl (i.d.R. bei 37°C bebrüten!)

Siehe Differenzierungstabellen im Anhang!

für Pseudomonas-verdächtige Kolonien (Wachstum auf Cetrimid-Agar)

Farbstoffnachweis durchführen:

• Platte unter UV-Licht betrachten Fluoreszenz weist auf den Farbstoff Fluorescein hin.

• Chloroformausschüttellung zur Pigmenttrennung


• Beimpfen des Teststammes in Nährbouillon; Bebrütung bei Raumtemperatur im Licht (Fensterbrett)

• Bei Trübung und sichtbarer Grünfärbung (nach mind. 1 Tag) 2 ml Chloroform zugeben (unter dem Abzug arbeiten)

• Testansatz wiederholt gut vortexen und nachfolgend ca. 3 h stehen lassen (Fensterbrett)

• Trennung der Farbpigmente:

Pyocyanin: bläulich; löslich in Chloroform und Wasser

Fluorescein: gelblich fluoreszierend; wasserlöslich

Selten treten auch noch der braunschwarze Farbstoff Pyomelanin

und der rote Farbsstoff Pyrubin auf. Beide Farbstoffe sind ebenfalls

wasserlöslich.

3. DIFFERENZIERUNG G RAM-NEGATIVER STÄB CHEN MIT HILFE VON API-SYSTEMEN

Standardisierte Testsysteme wie die api-Systeme der Firma api bioMerieux basieren auf

physiologischen Tests, die in miniaturisierten Reaktionsgefäßen (hier: Streifen mit

Kunststoffbechern) durchgeführt werden. Die Teststreifen werden mit der Suspension einer

(von einem Selektivnährboden stammenden) Einzelkolonie entsprechend der jeweiligen

Gebrauchsanleitung beimpft. Wichtigste Voraussetzung dafür ist das Vorliegen einer

Reinkultur. Durch gleichzeitiges Ausstreichen auf einem Selektivnährboden wird die Reinheit

der Kolonie überprüft und dafür Sorge getragen, dass das Untersuchungsmaterial

aufbewahrt bleibt.

Folgende Teststreifen zur Differenzierung Gram-negativer Stäbchen stehen zur Verfügung:

api-20-E für Enterobacteriaceae, Anwendung wenn Oxidase-Test negativ und

Glucose fermentativ verwertet wird (Ausschluss von Acinetobacter sp.)

api-20-NE für sog. „Nonfermenter“, Anwendung wenn Oxidase-Test positiv und/

oder Glucose nicht fermentativ verwertet werden kann

Die Teststreifen werden 24h (48h) inkubiert und danach die Reaktionen entsprechend dem

beiliegenden Schema ausgewertet. Mit Hilfe des dabei erhaltenen numerischen Codes

erfolgt die Identifizierung mit Hilfe des Profilindex.


AUFGABE B - DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN AUS EINER SUSPENSION

In einer Nährbouillon liegt ein Gemisch von zwei Bakterienarten vor. Der Bakteriengehalt

dieser Suspension ist quantitativ (Koloniebildende Einheiten-KbE pro ml) zu bestimmen und

die darin enthaltenen Bakterienspezies zu differenzieren (qualitative Analyse). Für die

Differenzierung ist wiederum das Vorliegen von Reinkulturen Voraussetzung.

1. QUANTITATIVE ANALYSE

• Die Bouillon (B) wird mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) von 10-1 bis 10-6 verdünnt [0,5 ml Bouillon (B) + 4,5 ml PBS = 1 : 10 = 10-1 ; weiter verdünnen durch Überpipettieren].

• Von 10-4, 10-5 und 10-6 werden je 0,1 ml auf eine Nähragarplatte ausgespatelt.

• Bebrütung 24h bei 37°C

• Auszählung einer geeigneten Verdünnungsstufe (Koloniezahlen zwischen 20 und 300) und Berechnung der KbE je ml Bouillon

2. QUALITATIVE ANALYSE

Zur Differenzierung der in der unverdünnten Bouillon enthaltenen Bakterien wird diese auf

folgenden (Selektiv-)Nährböden fraktioniert ausgestrichen:

• Nähragar / Blut-Agar / ENDO-Agar / MacConkey-Agar / LEIFSON-Agar / TTC-Azid-Agar / Äsculin-Agar / Baird Parker-Agar

• Bebrütung 24h bei 37°C

Zur Kontrolle der Reinheit und zur Planung der weiteren Vorgehensweise werden von den

fraktionierten Ausstrichen Gram-Präparate angefertigt (bzw. weitere Tests zur Gram-

Differenzierung durchgeführt).

Die weitere Vorgehensweise entspricht der für die Probe A dargelegten, siehe daher Aufgabe A-2 und A-3.


AUFGABE S - IDENTIFIZIERUNG EINER BAKTERIENART AUF SCHRÄGAGAR

Es ist eine auf Schrägagar gewachsene Reinkultur zu identifizieren. Nach Durchführung der

Tests zur Gram-Differenzierung werden folgende Nährmedien fraktioniert beimpft:

• Gram-negative Stäbchen auf Nähragar, ENDO-Agar und LEIFSON-Agar abimpfen

Sollten die Gram-Tests zu anderen Ergebnissen führen, siehe Aufgabe A bzw. Kurs-assistenten konsultieren!

• Bebrütung 24h bei 37°C,

• weitere biochemischen Differenzierung (inkl. Oxidase-Test),

• ggf. api-20E-Streifen beimpfen (wenn Oxidase neagtiv)

• Bebrütung 24 h bei 37°C, Auswertung siehe A-3 bzw. Anhang

• bei Salmonella verdächtigen Stämmen serologische Differenzierung entsprechend dem Kauffmann-White-Schema durchführen:

• angewendet werden zwei polyspezifische Antiseren (Antisalmonella I und II),

• auf einem Objektträger nebeneinander einen Tropfen Antiserum und einen Tropfen physiol. Kochsalzlösung (Negativkontrolle) geben,

• den nachzuweisende Stamm in beiden Tropfen suspendieren bis eine homogene, leicht milchig trübe Suspension entstanden ist ,

• den Objektträger nachfolgende mehrfach leicht schwenken,

• Die Reaktion muss positiv gewertet werden, wenn innerhalb von ca. 2 min eine sichtbare Agglutination (Flockenbildung) im Ansatz mit dem Testreagenz sichtbar wird (gegen einen dunklen Hintergrund prüfen).

• Im negativen Fall bleibt die Suspension gleichmäßig trüb.

• Im Zweifelsfall muss das Ergebnis bei schwacher Vergrößerung mit dem Mikroskop ausgewertet werden.

• Antisalmonella I agglutiniert Salmonellen der Gruppe A-E,

• Antisalmonella II agglutiniert Salmonellen der Gruppe F-67

Hinweis:

Bei einer positiven Reaktion der Kolonien könnte eine weitergehende Typisierung mit gruppen- und monospezifischen Testseren entsprechend dem Kauffmann-White-Schema durchgeführt werden. Dies ist im Kurs jedoch nicht vorgesehen.


KAUFFMANN - WHITE - SCHEMA ZUR SEROLOGISCHEN DIFFERENZIERUN G VON SALMON ELLEN (AUSZUG)

Serogruppe Serotyp O-Antigene H-Antigene

(Serovar) Phase 1 Phase 2

A S. paratyphi A 1, 2, 12 a -

B S. paratyphi B

S. typhimurium

1, 4, 5, 12

1, 4, 5, 12

b

i

1, 2

1, 2

C S. paratyphi C 6, 7 c 1, 5

D S. typhi

S. enteritidis

9, 12

1, 9, 12

d

g m

-

-

E S. anatum 3, 10 e h 1, 6

Nähere Informationen zur serologischen Differenzierung der Salmonellen werden in der Praktikumseinführung vermittelt.


AUFGABE L - DIFFERENZIERUNG VON KEIMEN AUS DER LUFT

1. ERFASSUNG DER KEIME IN D ER LUFT MIT HILFE D ES SEDIMENTATION SVERFAHR ENS

Im Vorfeld des Praktikums wurden an unterschiedlichen Standorten (Liste liegt aus) jeweils

zwei Nähragarplatten mit geöffnetem Deckel 60 Minuten exponiert. Nach Schließen des

Deckels wurden die Petrischalen zwei Tage bei 22°C bzw. 37°C bebrütet.

Die nach zwei Tagen angewachsenen Bakterienkolonien sollen gezählt (quantitative Analyse)

und charakterisiert werden (s. nächsten Abschnitt).

2. DIFFERENZIERUNG VON BAKTERIEN AUS DER LUFT VON SED IMENTATION SPLATTEN

Jeder Kursteilnehmer sollte von einer der beiden Sedimentationsplatten ca. 5 verschiedene

(Bakterien-)Kolonien charakterisieren und auf eine Nähragarplatte abimpfen (Bebrütung bei

der Temperatur, bei der die jeweilige Kolonie gewachsen war).

Charakterisierung der Bakterienkolonien nach folgenden Merkmalen:

• Koloniefarbe

• Kolonierand

• Kolonieprofil

• Kolonieoberfläche

• Konsistenz

• Größe

• Geruch

Siehe dazu die Hinweise zur Beschreibung der Makromorphologie von Bakterienkolonien im Anhang.

1. Von den ausgewählten Kolonien Gram-Eigenschaften feststellen und die Mikromorphologie der Bakterien beschreiben (z.B. Form, Größe, Sporen, Säurefestigkeit)

2. Nach ein- bis zweitägiger Inkubation der von den Sedimentationsplatten abgeimpften Bakterien:

• Tests zur Gramdifferenzierung durchführen (Reinheit überprüfen)

• Überimpfung auf Selektivnährmedien (entsprechend Aufgabe A-1)


• Von den Reinkulturen einige biochemische Eigenschaften prüfen,

z.B. - Oxidase, Katalase

- IMVOC-Reaktionen

- Urease-Test (Harnstoffabbau)

- O/F-Test

Eine weitere Differenzierung kann entsprechend der bei der Aufgabe A-2 und A-3 dargelegten Vorgehensweise versucht werden. Weiterhin können ein Isolate durch PCR/Sequenzierung näher charakterisiert werden (siehe Aufgabe PCR B)


AUFGABE PCR

A- NACHWEIS VON SULFATREDUZIERERN MITTELS SPEZIFISCHER PCR

Die Reduktion oxidierter Schwefelverbindungen (Sulfat, Sulfid, Schwefelwasserstoff) durch

sogenannte Desulfurizierer stellt ein wichtiges Element im Schwefelkreislauf dar. Bakterien

die zu dieser biochemischen Leistung befähigt sind nutzen verschiedene organische Stoffe

und Wasserstoff (meist organische Stoffe die im fermentativen Abbau von organischen

Stoffen durch fermentative Bakterien entstehen und von diesen ausgeschieden werden) als

Reduktionsmittel und übertragen die Elektronen verschiedene oxidierte

Schwefelverbindungen. Diese Redoxreaktionen sind exergon und dienen diesen

Mikroorgansimen als Energiequelle.

Zu Ökologie und Bedeutung von Desulfurikanten sei auf die Vorlesung Mikrobentaxonomie verwiesen. Eine kurze Einführung wird zusätzlich im Kurs gegeben.

Die PCR ist eine molekularbiologische Methode zur Amplifikation spezifischer Genabschnitte.

Das PCR-Produkt kann anschließend elektrophoretisch aufgetrennt und mittels

verschiedener DNA-Farbstoffe (z.B. Ethidiumbromid oder SYBR-Safe) unter UV-Licht (oder

anderen spezifischen Wellenlängen) visualisiert werden.

Zum Nachweis von Desulfurikanten mittels PCR existieren verschiedene Primersysteme. Im

Kurs wird ein Primersystem verwendet, das spezifisch an hochkonservierte Bereiche des

dsrA-Gens, welches die dissimilatorische Sulfatreduktase (das Schlüsselenzym der

Dissimilatorischen Sulfatreduktion) kodiert, bindet. Die Primer amplifizieren ein 514 bp

langes Fragment.

Für den Kurs stehen Ihnen pro Gruppe (je 2 Studenten) 2 Sedimentproben zur Verfügung

(Probe A und Probe B). Eine der Proben wurde im Vorfeld mit PCR positiv auf

Sulfatreduzierer getestet. Ihre Aufgabe ist es diese Probe zu identifizieren. Probe C (Wasser)

wird als Negativkontrolle genutzt. Weiterhin ist es ratsam, Verdünnungsstufen (z.B. 1:10) der

extrahierten Proben-DNA in der PCR mit zu untersuchen, um mögliche inhibitorische Effekte

der Probenmatrix auf die PCR zu überprüfen und das Risiko falsch-negativer Befunde zu

minimieren.


DNA-EXTRAKTION

Die DNA Isolierung erfolgt mittels des PowerSoil DNA Isolation Kit (Mo BIO Laboratories, Inc).

Kopien des Nutzerhandbuches werden für jede Gruppe bereitgestellt.

HERSTELLUNG DES MASTERMIXES

Nutzen Sie folgendes Schema für die Herstellung Ihres Mastermixes für jeweils 2xProben-

DNA, 2xProben-DNA 1:10, 1xPositivkontrolle, 1xNegativkontrollen + 1 extra für

Pipettierfehler:

Reagens Endkonzentration Vol. / 25 µL PCR-Reaktion

[µl]

Gesamt Vol. Mastermix

[µl]

GoTaq Green Mix (2.5x) 1x 12.5

SH1 vorwärts Primer (10 µM) 0.4 µM 1

SH2 rückwärts Primer (10 µM) 0.4 µM 1

RNase freies Wasser 9.5

Gesamt Mastermix Volumen 24

NB : 1 µL DNA (oder Wasser) zu 24 µL aliquotiertem Mastermix

PCR

PCR Aktivierung/Template Denaturierung: 95°C, 3 min

PCR: 40 x (94°C - 30s, 62°C - 30s, 72°C - 45s ), 72°C, 3 min

GELEKTROPHORESE UND VISUALISIERUN G

Legen Sie auf einem Stück Parafilm 1-2 µl 6xLadepuffer pro Probe, sowie für die DNA Leiter

vor. Geben Sie auf den Ladepuffer 8 µl PCR Produkt bzw. 1,5 µl DNA Leiter und mischen Sie

Ladepuffer und PCR Produkt (bzw. DNA Leiter) mit der Pipette. Geben Sie diese Mischung

jeweils in eine Tasche eines bereitgestellten Agarosegels (2% Agarose wt/vol) in einer

Elektrophoresekammer mit TAE-Puffer. Lassen Sie das Gel für 45 min bei 110 V laufen.

Visualisieren Sie das Gel entsprechend den Anweisungen des Kursbetreuers. Die

Sulfatreduzierer-spezifische PCR amplifiziert ein ~510 bp langes Fragment.


B - GENETISCHE IDENTIFIZIERUNG AUSGESUCHTER ISOLATE MITTELS SEQUENZIERUNG VON PCR-FRAGMENTEN

Neben der biochemischen Identifizierung ist der Nachweis spezifischer

Nukleinsäuresequenzen mittels PCR eine alternative/ergänzende Nachweismethode.

Zusätzlichen können die gewonnen PCR-Fragmente kloniert und sequenziert (bei erwarteten

Mischsequenzen) oder direkt sequenziert werden. Die dadurch gewonnene

Nukleinsäuresequenz kann mit entsprechenden Datenbanken abgeglichen werden.

Pro Student soll ein vom Studenten ausgesuchtes Isolat mittels PCR/Sequenzierung näher

charakterisiert werden. Die verwendeten Primer binden spezifisch an alle Bacteria (früher

„Eubakterien“) und generieren ein ca. 1,5 kb langes Amplikon. Die PCR-Produkte werden

aufgereinigt und an die Firma GATC (Konstanz) zum Sequenzieren (Sanger-Sequenzierung)

gesandt.

DNA-EXTRAKTION

Eine Alternative zu relativ teuren und zeitaufwändigen Extraktionskits wird in diesem Fall die

schnelle (jedoch weniger effiziente) Methode des „heat-release“ verwendet. Dazu wird eine

kleine Menge Bakterienmaterial bei 95°C für 3-5 min inkubiert. Die Bakterienzellen platzen

und ihre Nukleinsäure wird freigesetzt.

HERSTELLUNG DES MASTERMIXES

Nutzen Sie analog zu den Sulfatreduzierern folgendes Schema für die Herstellung Ihres

Mastermixes (jeweils für eine Probe und eine Negativkontrolle + 1 extra für Pipettierfehler):

Reagens Endkonzentration Vol. / 25 µL PCR-Reaktion

[µl]

Gesamt Vol. Mastermix

[µl]

GoTaq Green Mix (2.5x) 1x 12.5

27F Vorwärtsprimer (10 µM) 5´-AGAGTTTGATCCTGGCTGAG

0.4 µM 1

1492r Rückwärtsprimer (10 µM) 5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT

0.4 µM 1

RNase freies Wasser 10.5

Gesamt Mastermix Volumen 25

NB : Bakterienmaterial (sehr wenig!) + 25 µL aliquotiertem Mastermix


PCR

Heat Release/Aktivierung/Template Denaturierung: 95°C, 3 min, gefolgt von (95°C - 30s,

66°C - 45s, 72°C - 1 min, 30s) x 35, finale Extension bei 72°C, 5 min

GELEKTROPHORESE UND VISUALISIERUN G

Erfolgt analog zur Sulfatreduzierer PCR. Das PCR Produkt ist ca. 1,5 kb groß.

AUFREINIGEN UND SEQUENZIERUNG DES PCR-PROD UKTES

Es besteht die Möglichkeit ausgwählte PCR-Produkte von interessanten Umweltkeimen

sequenzieren zu lassen. Dies erfolgt in Absprache mit dem Kursbetreuer. Die Aufreinigung

erfolgt mittels Hi-Yield PCR Clean-up kit entsprechend den Angaben des Herstellers (wird

ausgegeben). Aufgereinigte PCR-Produkte werden zusammen mit einem oder mehreren

Sequenzierprimern an die Firma GATC zum Sequenzieren gesendet. Die von GATC

zugesandten Sequenzdaten stehen in aller Regel am übernächsten Werktag zur Verfügung

und werden gemeinsam im Kurs analysiert/editiert und mit den anderen Kursteilnehmern

mit Sequenzen aus entsprechenden Datenbanken (NCBI) abgeglichen.


NACHWEIS UND QUANTIFIZIERUNG VON E. COLI/COLIFORMEN

BEGRIFFSBESTIMMUNG:

E. coli und coliforme Bakterien gehören zur Familie der Enterobacteriaceae. Es sind

gramnegative stäbchenförmige Bakterien, die keine Sporen bilden. Es gibt sowohl

bewegliche als auch unbewegliche Vertreter. Physiologisch zeichnen sie sich durch einen

aeroben und anaeroben Laktose-Abbau aus. Sie sind Cytochromoxidase-negativ.

Mit der nachfolgenden Methode werden sowohl E. coli (direkt) als auch viele

unterschiedliche Vertreter der Enterobacteriaceae (Coliforme), z.B. Vertreter der Gattungen

Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter u.v.a., nachgewiesen. E.coli/Coliforme werden als

Indikatorkeime für das Vorliegen von Verunreinigungen mit Warmblüterfäkalien gewertet.

Nach Trinkwasserverordnung dürfen E.coli/Coliforme in 100 ml Trinkwasser nicht

nachweisbar sein.

QUANTIFIZIERUNG VON E. COLI NACH DEM MPN-VERFAHREN

Das Colilert-System basiert auf der Defined Substrate Technology® (DST®) zum Nachweis von

E.coli und Coliformen in Wasser. Die Nachweis-Reaktionen beruhen auf der Aktivität der

Enzyme β-Glucuronidase (E.coli) und β-Galactosidase (Coliforme).

Während der Inkubationszeit verstoffwechseln die coliformen Bakterien mit Hilfe des

Enyzms β-Galactosidase den im Colilert-Test enthaltenen spezifischen Indikatornährstoff

ONPG und bewirken so eine Farbänderung von farblos nach gelb.

Bei Anwesenheit von E.coli wird zusätzlich durch die Aktivitität der β-Glucuronidase aus dem

Substrat Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid (MUG) das fluoreszierende 4-

Methylumbelliferon freigesetzt. Die Fluoreszenz wird mittels einer UV-Lampe sichtbar

gemacht. Die Quantifizierung erfolgt nach dem MPN-Verfahren.

AUFGABENSTELLUNG

Quantifizieren Sie E. coli/Coliforme in einer bereit gestellten Oberflächenwasserprobe

mittels Colilert. Setzen Sie hierfür eine Originalprobe und eine 10-1 verdünnte Probe ein.


VORGEHENSWEISE

100 mL der zu analysierenden Wasserprobe (bzw. Verdünnung) in einen Messzylinder

abfüllen

• Die Wasserprobe in eine sterile 100 oder 250 ml Schott-Flasche geben und den Inhalt des Colilert-Testkits hinzugeben und lösen (+ 2 Tropfen Antifoam-Lösung)

• Die aus Probe und Reagenz bestehende Mischung in ein Quanti Tray 2000 gießen. Dabei ist folgendes zu beachten:

- Den oberen Teil des Quanti Trays etwas zusammendrücken

- Die Frontlasche von der Seite mit den Vertiefungen abziehen. Dabei darf die Innenseite der Folie oder des Trays nicht berührt werden.

- Eingießen der Mischung; Berührung mit Folienlasche vermeiden.

- Seitlich 2-3mal an die kleinen Vertiefungen klopfen, um evl. Luftblasen zu entfernen.

• Den mit Probe gefüllten Quanti Tray auf die Gummi-Trägerunterlage des Versiegelungsgerätes legen. Die Seite mit den Vertiefungen muss dabei nach unten zeigen

• Verschweißen des Trays/Beschriften

• Inkubation der Ansätze bei 35°C für 24h

AUSWERTUNG

• Die Ergebnisse anhand der nachstehenden Ergebnisauswerte-Tabelle ablesen

• Die Anzahl der positiven Vertiefungen zählen (Gelbfärbung und Fluoreszenz):

- Prüfung auf Fluoreszenz mit einer 6-Watt, 365 nm UV-Lampe aus einem Abstand von 13 cm in einer dunklen Umgebung

- Colilert18 Ergebnisse sind nach 18 Stunden definitiv.

• die wahrscheinlichste Zahl (MPN; Most Probable Number) anhand der MPN-Tabelle bzw. des MPN Calculators ermitteln.


TABELLE 1: ERGEBNISAUSWERTUNG DES COLILERT-VERFAHRENS.

Erscheinungsbild der Probe Ergebnis

keine Gelbfärbung Negativ für Gesamtcoliforme und

E. coli

Gelbfärbung Positiv für Gesamtcoliforme

Gelbfärbung und Fluoreszenz Positiv für E. coli


AUFGABE H - IDENTIFIZIERUNG VON MIKROORGANISMEN MITTELS CARD-FISH

THEORETISCHER TEIL

Bei der Untersuchung von Mikroben in der Umwelt bestand lange Zeit das Problem, dass die

Bakterien auf Grund fehlender morphologischer Diversität nicht in situ identifiziert werden

konnten. Deshalb mussten die Bakterien kultiviert, isoliert (Erzielen von Reinkulturen) und

an Hand von physiologischen und biochemischen Tests identifiziert werden.

Durch Kultivierung kann das Vorhandensein verschiedener Mikroorganismen in

verschiedenen Habitaten nachgewiesen werden, doch die meisten freilebenden Bakterien

sind nicht kultivierbar (<1-15%). Weiterhin ist mit einer erheblichen

Populationsverschiebung mit selektiver Begünstigung leicht kultivierbarer Arten zu rechnen.

Um die wirkliche Populationsstruktur zu erfassen, empfiehlt sich eine direkte Erkennung und

Identifizierung in situ. Dafür können markierte Antikörper oder Oligonukleotidsonden

eingesetzt werden. Voraussetzung für den Einsatz phylogenetischer Oligonukleotidsonden

ist die Kenntnis der Sequenz der ribosomalen RNA (16S bzw. 23S).

Die rRNA stellt aus den folgenden Gründen ein ideales Zielmolekül für die in situ

Identifizierung dar:

• die rRNA ist ubiquitär in lebenden Zellen verbreitet (Proteinsynthese!)

• Die Sequenzen der 16S und 23S rRNA bilden die Grundlage zur phylogenetischen

Taxonomie

• Es gibt sowohl hoch konservative als auch sehr variable Regionen in den

Sequenzen der 16S und der 23S rRNA. Somit lässt sich die Spezifität der

Oligonukleotidsonden variieren.

• Die rRNA liegt in hoher Kopienzahl in den Zellen vor (zwischen 5.000 und 50.000

Kopien), wodurch eine ausreichende Signalstärke der Fluoreszenz erreichbar ist.

• Die rRNA ist als Zielmolekül für die Oligonukleotidsonden gut zugänglich.

Um die Zellwand der Mikroorganismen für die Oligonukleotidsonden durchlässig zu machen,

werden die Zellen abhängig von ihren Gram-Verhalten fixiert (siehe auch Versuchsablauf).


Durch die Fixierung der Zellen wird die Tertiärstruktur der Ribosomen nicht vollständig

denaturiert. Deshalb müssen Zielregionen auf der rRNA, die bei isolierter rRNA (vgl. Dot-Blot)

gut zugänglich sind, sich nicht auch zwingend für die in situ Hybridisierung eignen. Durch

Vorversuche können geeignete die Regionen, die durch Oligonukleotidsonden hybridisiert

werden können, identifiziert werden.

BACTERIA EUKARYA

ARCHAEA

Thermotoga

Flavobakterien

Cyanobakterien

Proteo - bakterien

Gram-positive Bakterien

grüne Schwefel-

freie- Bakterien

Tiere Ciliaten Pilze

Pflanzen

Flagellaten

Microsporidia

extrem halophile Methanogene

extrem thermophile

ABBILDUNG 1: PHYLOGENETISCHER STAMMBAUM DER DREI DOMÄNEN DES LEBENS AUF GRUNDLAGE DER RIBOSOMALEN RNA.


ABBILDUNG 2: PHYLOGENETISCHER STAMMBAUM DER BACTERIA AUF GRUNDLAGE DER RIBOSOMALEN RNA

Als Gensonden werden Oligonukleotide bezeichnet, mit deren Hilfe bestimmte genetische

Informationen detektiert werden können. Taxonomische Sonden werden auf der Grundlage

von rRNA-Sequenzen, die die Basis der taxonomischen Einordnung von Bakterien unter

phylogenetischen Gesichtspunkten darstellen (siehe Abbildung 1 und 2), konstruiert. Dafür

werden zunächst alle verfügbaren Sequenzen einer Organismengruppe im Hinblick auf

identische Sequenzabschnitte und mögliche Unterschiede zwischen nahe verwandten Arten

untersucht. Im nächsten Schritt muss die mögliche Zielsequenz mit den homologen

Sequenzen aller verfügbaren rRNA-Sequenzen verglichen werden (Datenbanken). Die

Sequenz der Zielregion muss bei allen Mitgliedern der spezifischen Gruppe gleich und

verschieden von allen anderen Organismen sein.


Die Gensonden können an ihren Enden unterschiedlich markiert werden, z.B. mit:

• Radioaktiv markierten Elementen: 32P, 3H, 35S, 125I

• Fluoreszenzfarbstoffe: Fluorescein und Tetramethylrhodamin, Nitrobenzofuran, Cy3, Cy5

• Enzymen: alkalische Phosphatase, Mikroperoxidase mit Nachweis durch Chemilumineszenz.

Als Hybridisierung wird die Reassoziation von DNA- oder RNA-Einzelsträngen zu DNA-DNA-

oder DNA-RNA–Doppelsträngen bezeichnet.

Eine bedeutende Größe für die Stabilität der Doppelstränge ist der Schmelzpunkt Tm. Er ist

definiert als der Punkt, bei dem die Hälfte der Doppelstrang-Struktur als Einzelstränge

vorliegt. Tm ist abhängig von:

• der Ionenstärke; Tm [in °C] steigt linear mit dem Logarithmus der Ionenstärke

• dem G+C-Gehalt

• der Sondenlänge

• der Formamid-Konzentration; 1% Anstieg der Formamidkonzentration reduziert Tm um 0,6°C. Dadurch wird eine Hybridisierung bei niedrigeren Temperaturen möglich und eine Degeneration oder Lösung von Nukleinsäure bei hohen Temperaturen vermieden.

Die Stringenz beschreibt die Bedingungen bei der Hybridisierung und beim folgenden

Waschschritt. Je stringenter die Bedingungen, desto weniger Sonden mit Fehlbindungen

(mismatches) zur Zielsequenz verbleiben als Hybrid.

Für eine korrekte Auswertung müssen die Bedingungen bei der Hybridisierung so gewählt

werden, dass nur perfekte Basenpaarungen stabil bleiben. Die Stabilität der Hybride ist von

der Stringenz und von der Anzahl und der Lage der Fehlpaarungen abhängig.

Durch den Einsatz von Formamid und NaCl werden die Hybridisierungsbedingungen der

verschiedenen Gensonden auf eine Hybridisierungstemperatur von 46°C bzw. einer

Waschtemperatur von 48°C eingestellt.

Die Permeabilisierung der Zellen für die Sonde erfolgt durch einen Fixierungsschritt. Dieser

erfolgt bei Reinkulturen in Abhängigkeit von den Gram-Eigenschaften: bei Gram-negativen

Bakterien mit Paraformaldehyd und bei Gram-positiven mit Ethanol. Bei Umweltproben

werden beide Fixierungsverfahren angewendet, um beide Bakteriengruppen erfassen zu


können. Zur weiteren Untersuchung werden die fixierten Zellen zuerst auf Glasobjektträgern

immobilisiert und einer Dehydratisierung unterworfen. Anschließend wird die Probe mit der

Hybridisierungslösung, welche die markierten Sonden enthält, überschichtet. Zur

Hybridisierung werden die Objektträger dann in einer feuchten Kammer für 2-3 Stunden bei

der für die Sonden empfohlenen Temperatur inkubiert.

Durch mehrere Waschschritte werden nicht oder falsch gebundene Sonden wieder von den

Proben entfernt. Nach einer Gegenfärbung aller Zellen mit dem DNA-Farbstoff DAPI wäscht

man die Objektträger mit dest. Wasser und trocknet sie an der Luft. Zum Schluss bettet man

die Proben in Citifluor ein. Die Auswertung erfolgt an einem Epifluoreszenzmikroskop durch

die parallele Zählung der Sonden- und der DAPI-Signale. Als Ergebnis erhält man die

prozentualen Anteile der hybridisierten Zellen an der Gesamtzellzahl.

Vorteile der in situ Hybridisierung:

• es wird keine Kultivierung und Isolierung der Mikroorganismen benötigt, d.h. auch nicht kultivierbare Organismen können nachgewiesen werden

• die in situ Identifikation erfolgt auf phylogenetischer Ebene

• die Relevanz der isolierten Stämme kann in situ kontrolliert werden

• die räumliche Verteilung der Bakterien im System, d.h. in situ, kann untersucht werden

• pathogene Keime in Umweltproben können sehr schnell und spezifisch quantifiziert werden

• bakterielle Endosymbionten können untersucht werden

Nachteile der in situ Hybridisierung:

• die in situ Identifizierung lässt keine Aussagen über das physiologische Potential und die Aktivität der nachgewiesenen Organismen zu.

• Es stehen nur eine beschränkte Anzahl an getesteten Gensonden zur Analyse bereit (Abhängigkeit von vorhandenen Sequenzdaten)

• Gruppen oder Arten, die weniger als ca. 2-3% der Gesamtpopulation ausmachen, können nicht mehr sicher quantifiziert werden.

• Probleme mit der Probenmatrix, insbesondere bei Boden- und Sedimentproben

Als Fluoreszenz wird die Emission von Licht durch ein Atom oder Molekül nach einer

erfolgten Anregung bezeichnet. Nach Beendigung der Anregung klingt die Fluoreszenz sehr


schnell ab. Dabei hat das emittierte Licht eine größere Wellenlänge als das absorbierte Licht

(Stokes’sche Regel).

ABBILDUNG 3: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES STRAHLENGANGS UND DER FILTERANORDNUNG IM

FLUORESZENZMIKROSKOP AM BEISPIEL DES FARBSTOFFES DAPI

Bei der Epifluoreszenzmikroskopie wird das Präparat in Abhängigkeit vom verwendeten

Farbstoff mit Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt und das emittierte Licht als Signal

beobachtet. Die Abbildung zeigt das Prinzip des Strahlengangs und der Filteranordnung im

Fluoreszenzmikroskop am Beispiel von DAPI.


AUFGABENSTELLUNGEN

Quantifizieren Sie ausgewählte Bakteriengruppen (EUB, NONEUB, Archaea, alpha-, beta-

Proteobakterien, CF, SRB, GNSB) in Sedimentproben aus der Trinkwassertalsperre

Saidenbach.

Ihnen werden zum Kurs mit Agarose beschichten Objektträger, auf denen die zu

untersuchenden Proben bereits aufgetragen sind zur Verfügung gestellt. Weiterhin sind die

Proben bereits mit Lysozym und Acromopeptidase behandelt.

DURCHFÜHRUNG

VERWENDETE REAGENZIEN/GERÄTE:

• Objektträger mit Proben (je 1 Objektträger pro Gruppe)

• Sonden

• Hybridisierungspuffer

• Waschpuffer

• Amplifikationspuffer

• FITC-Substrat

• Ethanol 96%ig

• PBS

• H2O2

• Propidiumiodid

PROBENVORB EREITUNG (BEREITS DURCHGEFÜHRT):

• Homogenisieren der Proben mittels Ultraschallsonde

• Proben auf den beschichteten Objektträger (OT) auftragen

• Probe bei Raumtemperatur trocknen lassen

• Dehydrieren der Probe in einer aufsteigenden Alkoholreihe (je 1 min in 50, 80 und 96%igem Ethanol)

• Probe lufttrocknen

• Lysozymbehandlung: Inkubation mit 10mg/mL Lysozym für 1 h bei 37°C


• OT waschen mit Aqua dest.

• Acromopeptidasebehandlung: Inkubation für 30 min bei 37°C mit Acromopetidase-Lsg. (60 U/ml)

• OT waschen mit Aqua dest.

• Inaktivierung der endogenen Peroxidasen: Inkubation für 30 min in Methanol mit 0,15% H2O2

• In viel Aqua dest. Waschen

• in 96% Ethanol dehydrieren (1 min)

• Lufttrocknen, (OT können bei –20°C gelagert werden)

HYBRIDISIERUNG UND CARD SIG NALAMPLIFIKATION (VON DEN KURSTEILNEHMERN DURCHZUFÜHREN):

• Je Probenfeld 1 µl Sonde zu 10 µl Hybridisierungspuffer der richtigen Formamid Konzentration (siehe Tabelle) geben und vorsichtig mischen

• Hybridisierung für mind. 2h bei 46°C

Achtung: Nach der Hybridisierung darf die Probe nicht mehr trocken werden.

• 10 min mit Waschpuffer (der entsprechenden Konzentration, siehe Tabelle) bei 48°C waschen

• Inkubation in 1 x PBS (10 ml, RT, 15 min)

• Substratreaktion: Herstellung: 1. 1 µl H2O2 (30%) und 200 µl 1xPBS mischen (End-konz.: 0.0015% H2O2) 2. davon 5 µl mit 500 µl Amplifikationspuffer mischen 3. 1 µl Substrat (FITC markiert) mit 500 µl vorbereitetem Amplifikationspuffer mischen

• Inkubation für 30 min, 46°C, DUNKEL

• waschen in 1x PBS (10 min, RT)

• 2x in 50 ml of Aqua dest. waschen (RT, im dunkeln)

• in 50 ml 96% Ethanol (RT, im dunkeln)

• Lufttrocknen


• Gegenfärbung mit Propidiumjodid (15min im Dunkeln bei RT)

TABELLE 2: VERWENDETE SONDEN UND FORMAMIDKONZENTRATIONEN ZUR HYBRIDISIERUNG

Sonde Spezifität Formamidkonzentration

im

Hybridisierungspuffer

EUB Bacteria 0-40%

NONEUB Negativkontrolle 0-40%

Alpha Alphaproteobacteria 20%

Beta Btaproteobacteria 35%

Gamma Gammaproteobacteria 35%

CF most Flavobacteria, some Bacteroidetes, some

Sphingobacteria

20%

HGC Actinobacteria 20%

GNSB Chloroflexi 35%

TABELLE 3: PROBENVERTEILUNG (SEDIMENTPROBEN E1/ E3 AUS DER TALSPERRE SAIDENBACH) UND SONDEN FÜR DIE CARD-FISH

Gruppe Probe Hybridisierung mit

Sonde

Formamid-

konzentration

OT 1 E1 EUB, NONEUB,Arch 0%

OT 2 E1 Beta, Gamma, CF,

GNSB

35%

OT 3 E3 EUB, NONEUB,Arch 0%

OT 4 E3 Beta, Gamma, CF,

GNSB

35%


ANHANG: TABELLEN ZUR BAKTERIENIDETIFIZIERUNG

TABELLE 1 - KOLONIEMORPHOLOGIE

1. Farbe:

• Insbesondere auf den Luftplatten treten häufig pigmentierte Kolonien auf.

• Die Farbstoffe (gelb bis rosarot) sind Carotinoide; Sie haben eine Schutzfunktion

gegenüber sichtbarem und ultraviolettem Licht

2. Geruch:

• falls ein spezifischer Geruch vorhanden ist (z.B. nach Erde – Streptomyceten; nach

Milchsäure – Lactobacillus)

3. Form (Umriss): 4. Profil (Erhebung über dem Nährboden):


5. Rand (Betrachtung mit dem Mikroskop (10fache Vergrößerung)

6. Oberfläche:

• glänzend oder stumpf

• faltig

• filamentös

• unregelmäßig – krümelig

7. Konsistenz (mit der Impföse prüfen)

• butterartig / bröckelig / schleimig / knorpelig

8. Größe

• klein /mittel /groß (besser gemessenen Durchmesser angeben)

29

TABELLE 2 - ÜBERBLICK BAKTERIENDIFFERENZIERUNG

z.B.•Escherichia•Klebsiella•Proteus•Salmonella•Shigella•Serratia

Gram negativ Gram positiv

Stäbchen Kokken

aerob Fakultativ / obligat anaerob

sporulierend Nicht sporulierend sporulierend Nicht sporulierend

z.B.• Lactobacillus• Eubacterium

z.B.• Clostridium• z.T. Bacillus

z.B.• Cellulomonas• Arthrobacter• Corynebacterium• Nocardia• Mycobacterium

z.B.• Bacillus

Tab.: 4

Tab.: 3

Tab.: 4

Tab.: 2

Oxidase-Test

EnterobakterienNonfermenter

z.B.•Pseudomonas•Acinetobacter

AnaerobeGlukosereaktion

AnaerobeGlukosereaktion

- -+

+ - + -

Nonfermenter

z.B.•Pseudomonas•Alcaligenes•Flavobacterium

z.B.•Aeromonas•Vibrio

API 20-E API 20-NEAPI 20-NEAPI 20-NE

Tab.: 3

Tab.: 5 Tab.: 5

Tab.: 4


TABELLE 3 - DIFFERENZIERUNG GRAMNEGATIVER STÄBCHEN

E.coli Klebsiella

oxytoca

Proteus

vulgaris

Morganella

morganii

Salmonella

havana

Citrobacter

freundii

Serratia

marcescens

Pseudom.

aeruginosa

Pseudom.

fluorescens

Pseudom.

stutzeri

Aeromonas

hydrophila

Acinetobacter

junii

Oxidase — — — — — — — + + + + — Lactose + + — — — variabel — — — — — — Glucose (OF) F F F F F F F O O O F O Kligler: Schrägfläche Stich Gas

gelb gelb

+

rot/gelb

gelb +

rot

gelb +

rot

gelb (+)

rot

gelb meist +

rot/gelb

gelb +

rot

gelb (—)

rot rot —

rot rot —

rot rot —

rot rot —

rot rot (+)

H2 S — — + — + + — — — — — — I Indol + + + + — — — — — — + — M Methylrot + + + + + + + — — — — — Vo Voges- Proskauer — + — — — — + — — — + —

C Citrat — + — — + + + + + + — +

Urease — + + + — — — — + — — —

Nitratreduktion + (bis NO2) + (bis NO2) + (bis NO2) + (bis NO2) + (bis NO2) + (bis NO2) + (bis NO2) + (bis N2) + (bis N2) + (bis N2) + (bis NO2) —

Proteolyse — — + — — — + — — — — —

Äsculinspaltung — + — +— — — — — — — — —

Beweglichkeit + — + + + + + + + + + —

Wachst. auf

Cetrimidagar — + — +— + — — — + — — + — —

Legende: —kein Wachstum / negative Reaktion, +— lediglich im Anstrich Wachstum / variable Reaktion, + sehr zartes Wachstum über den Anstrich hinaus / pos. Reaktion, ++ gutes Wachstum, +++ üppiges Wachstum


TABELLE 4 - DIFFERENZIERUNG GRAMPOSITIVER KOKKEN

Paketkokken Haufenkokken Kettenkokken

Micrococcus Staphylococcus Streptococcus Enterococcus

luteus aureus epider -midis

sapro-phyticus

pyogenes agalactiae faecalis

Katalase + + + + Katalase - - - Hämolyse (Blutagar)

−

+

−

−

Hämolyse (Blutagar)

+

+

±

Plasma-koagulase (clumping factor)

−

+

−

−

CAMP-Test

-

+

-

Koloniefarbe (Fleischagar)

zitronengelb goldgelb weiß weiß Äsculin- Spaltung

- - +

Baird-Parker: Tellurit-Red. Proteolyse

± ± −

+ + +

± ± −

± − +

Wachstum b. 10°C u. 45°C

-

-

+

Glucose-Abbau obligat aerob (oxidativ)

anaerob (fermentativ)

37°C + + +

Mannit — + — + 6,5% NaCl - - + Lysostaphin Wachstum kein Wachstum pH 9,6 - - + Auf TTC-Azid- Agar:

− ± dunkelrote Kolonien

± farblos

± dunkelrote Kolonien

Auf TTC-Azid- Agar:

- - ++ dunkelrote Kolonien

Legende: —kein Wachstum / negative Reaktion, +— lediglich im Anstrich Wachstum / variable Reaktion, + sehr zartes Wachstum über den Anstrich hinaus / pos. Reaktion, ++ gutes Wachstum, +++ üppiges Wachstum


TABELLE 5 - DIFFERENZIERUNG GRAMPOSITIVER STÄBCHEN

Ze

lldur

ch-m

esse

r [µ

m]

Spor

e*

Glu

cose

verw

ertu

ng**

Ana

erob

es W

achs

tum

Wac

hstu

m b

ei 7

% N

aCl

Voge

s-Pr

oska

uer

Man

nit

Leci

thin

ase

Citr

atve

rwer

tung

Indo

lbild

ung

Ure

ase

Stär

keab

bau

B. cereus ≥ 1 Z S + + + − + ± − ± +

B. mycoides ≥ 1 Z S + ± + − + ± − ± +

B. thuringiensis ≥ 1 Z S + + + − ± ± − ± +

B. anthracis ≥ 1 Z S + + + − + ± − − +

B. megaterium ≥ 1 Z S − ± − ± − ± − ± +

B. subtilis < 1 Z S − + + + − + − − +

B. pumilus < 1 Z S − + + + − ± − − −

B. licheniformis < 1 Z S + + + + − ± − − +

B. polymyxa < 1 Z(T)/ S

S/G + − + + − − − − +

B. macerans < 1 T/S S/G + − − + − ± − − +

B. alvei < 1 Z(T)/ S

S + − + − − − + − +

B. circulans < 1 T/S S ± ± − + − − − ± +

B. laterosporus < 1 Z/L/ S

S + − − + − − ± − −

B. brevis < 1 Z(T)/ S

(±S) − − − ± − − − − ±

B. firmus < 1 Z (±S) − + − ± − − − − +

B. lentus < 1 Z (±S) − ± − ± − − − ± +

B. sphaericus < 1 T/R − − ± − − − ± − ± −

Legende: * Z zentrale Spore ** S Säurebildung T terminale Spore G Gasbildung R runde Spore S Zelle durch Spore aufgetrieben Anmerkung: Alle aufgeführten Bacillus-Arten sind Katalase-positiv.


TABELLE 6A - ÜBERSICHT ZUM WACHSTUM AUSGEWÄHLTER GRAM-NEGATIVER KEIME AUF NÄHRMEDIEN

Laktose Nähr- (Fleisch)-Agar

Blut- agar

Hämo-lyse

TTC-Acid Agar

Äsculin Agar

ENDO Agar

Leifson Agar

Mac Conkey-Agar

Cetrimid Agar

Mossel Agar

Baird Parker-Agar

E. coli +++ +++ +++ — — —

+++ rote Kolonien

+++ rote Kolonien

+++ rote Kolonien

— + gelb —

Klebsiella oxytoca +

+++ feucht, schleimig

+++ — + rote Kolonie

+ große schwarze Kol.; Hof

+

++ gelb

+— schwarze Kol.

Citrobacter freundii ++ +++ +++ — — +++

farblose Kol.

+—

++ gelb, Hof +—

Proteus vulgaris - +++ +++ — +—

rote Kolonie +— farblose K.

+++ farblose Kolonien

+++ farblose Kol.

+++ farblose Kolonien

— +++ + schwarze Kol.

Morganella morganii - +++ +++ — +—

rote Kolonie

+ braune Kol., Hof

+++ farblose Kol. +— + —

Salmonella havana - +++ +++ — +—

rote Kolonie + farblose K.

+++ schwarze Kol.

+— ++ gelb, Hof

+— schwarze Kol.

Serratia marcescens - +++

rötliche Kol. +++ — +— rote Kolonie — +++ farblose

Kol +— ++

+— braun-schwarze Kol. Pseudomonas

stutzeri - +++ +++ — +—

rote Kolonie +— farblose Kol.

+++ farblose Kol. — + —

P. aeruginosa -

+++ braun-grüne Kol.

+++ ß +— rote Kolonie

+++ farblose Kol.

+++ farblose Kol.

+++ blaugrüne Kol.

+++ blaugrüne Kol.

—

P. fluorescens - +++

gelbliche Kol. +++ — +— rote Kolonie

+— farblose Kol.

+++ farblose Kol.

++ gelb, fluoresz. Kol.

+++ —

Acinetobacter junii - +++

gelbliche Kol. +++ — + rote Kolonie — +—

rote Kolonie — ++ +— schwarze Kol


TABELLE 6B - WACHSTUM AUSGEWÄHLTER GRAM-POSITIVER KEIME AUF DEN VERWENDETEN NÄHRMEDIEN

Nähr- (Fleisch-) Agar

Blut Agar

Hämolyse TTC-Acid Agar

Äsculin Agar

ENDO Agar

Leifson Agar

Mac Conkey Agar

Cetrimid Agar

Mossel Agar

Baird Parker Agar

Grampositive Stäbchen Bacillus. cereus +++

matte Kolonien +++ ß +—

rote Kol. +— farblose Kolonien

+ farblose Kol.

— — +— ++ Hof

+ schwarze Kolonien

Bacillus. mycoides +++ +++ — — — —+ farblose Kol.

— — — +—

Bacillus subtilis +++ matte Kolonien

+++ — — — —+ farblose Kol.

— — — ++ gelbe Kol.

+—

Grampositive Kokken Staphylococcus

aureus +++ goldgelbe/beige Kol.

+++ ß +— rote Kol.

++ weiße Kol.

+— rosa Kol.

+— orange-rote Kol.

+— rosa Kol.

— +++ gelb, Hof

+ schwarze Kol. Aufklarung

Staphylococcus

epidermidis ++ weiße Kol. ++ — +— rote

Kol. + — +—

rosa Kol.

— — ++ +— schwarz-graue Kol.

Micrococcus luteus ++ zitronengelbe Kol.

++ — — +— + +— — — — +— Kol. Klein, schwarz

Streptococcus

agalactiae

+ + leicht ß — + farblose Kol.

— — — — + —

Enterococcus

faecalis

+ + α; — ++ rote Kol.

++ schwarze Kol.; scwarzer Hof

+— rosa Kol.

+— rosa Kol.

+— rosa Kol.

— ++ gelb, Hof

+ schwarze Kol.

Praktikum Spezielle Bakteriologie - TU Dresden · Standardisierte Testsysteme wie die api-Systeme...

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